CN114306639A - 一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂及制备方法与应用。本发明所述脂质纳米制剂具有三层有序结构，核层为疏水性药物纳米晶，中间层为共载荷siRNA，最外层为脂质双分子膜及功能性修饰分子。本发明所述脂质纳米制剂可以有效地载荷疏水性药物和siRNA等核酸药物，结构有序稳定，生物相容性好，且能提高所载荷的疏水性药物溶出速率，促进其从制剂中释放，有利于快速达到药物作用浓度，为相关疾病的疏水性药物和基因药物的联合递送和治疗提供了一种新的制剂。

Description

一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂 及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物输送技术领域，特别是一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂及制备方法与应用。

背景技术

目前临床上多种天然来源的抗肿瘤药物都属于疏水的难溶性药物，例如紫杉烷类、喜树碱类和长春碱类等。解决这些药物的溶解性并提高其肿瘤递送效果一直是目前肿瘤治疗的研究重点。如属于紫杉烷类的紫杉醇(paclitaxel,PTX)是从太平洋紫杉(Taxusbrevifolia)的树皮中分离出来的，被认为是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物之一，目前主要有以下三种剂型：聚氧乙烯蓖麻油和乙醇1:1作为溶剂的紫杉醇注射剂(TAXOL)、紫杉醇脂质体、白蛋白结合型紫杉醇注射液，临床上已被广泛用于多种癌症的治疗，在肺癌、卵巢癌和乳腺癌中都有明显的抗癌效用。紫杉醇主要作用于细胞分裂过程中组成纺锤体的微管系统，通过促进微管蛋白聚合并抑制解聚从而抑制细胞的分裂和增殖。然而，其极低的水溶性很大程度上影响了它的药效发挥，并且因不具备靶向性而具有多种明显的毒副作用。同时，紫杉醇等化疗药物在治疗过程中会诱导肿瘤细胞对化疗药物形成耐药性，而且肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药后会对其他不同结构、作用机制和作用靶点的药物产生交叉耐药，从而形成多药耐药性(MDR)，使化疗效果大大减弱。多药耐药性的分子机制很复杂，主要分为五类：1)诱导药物转运蛋白的改变；2)增强DNA修复；3)改变药物代谢途径；4)目标蛋白的基因扩增或突变；5)存活/凋亡途径的改变。通常，MDR是多种机制(如：凋亡受阻和药物外排增加)的组合、累积作用。肿瘤细胞膜上P-糖蛋白(P-gp)的过度表达是多药耐药的最主要发生机制，而紫杉醇是P-糖蛋白的底物，肿瘤细胞可通过该蛋白将紫杉醇主动泵出细胞并诱导耐药性。为了克服该问题，一些P-gp抑制剂(如维拉帕米和PSC833)被用于与紫杉醇共同给药，但由于其毒性或药代动力学和生物分布的改变，治疗效果并不理想。而利用包括反义核酸，小干扰RNA(siRNA)等基因药物降低P-糖蛋白的表达，从而逆转肿瘤细胞的耐药是一种有潜力的策略。

siRNA与化学药物的共同递送为克服肿瘤耐药性提供了新的方向，但目前已开发的各种纳米载体仍存在各种问题或应用限制。理想的纳米载体系统应能很好的载荷这两种药物并保护其不受体内生物环境的影响，并将治疗药物有效地递送至肿瘤细胞。此外，还需要研究在体内使用各纳米载体的安全性、毒性和免疫反应。然而，目前研究开发的各类纳米载体仍然存在许多问题，例如，以两亲性嵌段共聚物通过胶束形式载荷紫杉醇并单纯基于电荷作用负载siRNA的载体，其在体内的稳定性并不理想；而通过阳离子脂质体包载siRNA并将紫杉醇负载于脂质部分的载体，其结构较为无序，且存在药物难以控释的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种同时载荷难溶性化学药物纳米晶和基因药物的内部结构有序的纳米药物制剂来解决现有载体稳定性差、结构无序和药物控释困难的问题。

为达到此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，所述脂质纳米制剂包括脂质膜和位于脂质膜内的疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒；所述疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒包括疏水性药物纳米晶、两亲性三嵌段聚合物、功能性siRNA；所述脂质膜为阳离子脂质膜。

进一步地，所述阳离子脂质膜可以形成脂质双分子膜；所述脂质纳米制剂中包括有序的三层结构：内核结构为两亲性三嵌段聚合物包裹疏水性药物形成的疏水性药物纳米晶，中间层为两亲性三嵌段聚合物形成的静电吸附层及负载的功能性siRNA，最外层为脂质双分子膜及双分子膜上修饰的脂质-聚乙二醇和/或脂质-聚乙二醇-功能性分子。

进一步地，所述两亲性三嵌段聚合物包裹疏水性药物形成的疏水性药物纳米晶为两亲性三嵌段聚合物的疏水链包裹疏水性药物形成的疏水性药物纳米晶类胶束结构。

进一步地，所述两亲性三嵌段聚合物静电吸附层为两亲性三嵌段聚合物的正电性亲水链所形成的静电吸附层。

本发明中所述功能性siRNA为动物siRNA或其表达载体、植物siRNA或其表达载体、或微生物siRNA或其表达载体、或其组合；或所述的功能性siRNA为天然的siRNA或其表达载体、人工合成的siRNA或其表达载体、或其组合。在本发明的一些实施例中，所述功能性siRNA为沉默MDR1基因siRNA。

本发明中所述疏水性药物选自紫杉烷类、喜树碱类或长春碱类等。优选地，所述疏水性药物为紫杉醇。

在本发明的一些实施例中，所述脂质-聚乙二醇-功能性分子中功能性分子为能够与肿瘤细胞特异性结合的分子，包括蛋白，多肽，核酸适配体和功能性小分子等等。在本发明的一些优选实施例中，所述功能性分子为GE11肽，能够靶向A549细胞表面过表达的EGFR受体。

在本发明的一些实施例中，脂质-聚乙二醇(PEG)-功能性分子中，聚乙二醇可以为PEG2000、PEG3400、PEG5000。

在本发明的一些实施例中，所述两亲性三嵌段聚合物包裹疏水性药物形成的疏水性药物纳米晶的水合粒径为258.46±10nm，电位为12.16±3mV。

在本发明的一些实施例中，所述两亲性三嵌段聚合物包裹疏水性药物形成的疏水性药物纳米晶的载药量大于1.54％，包封率大于66％。

在本发明的一些实施例中，所述阳离子脂质膜至少含有一种阳离子脂质；所述阳离子脂质选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、脂质多聚-L-赖氨酸、或硬脂胺中的任一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述阳离子脂质膜由至少一种阳离子脂质和辅助脂质制备而成。所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂(DPPC)、酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱胆固醇(Chol)中的一种或多种。可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

在本发明的一些实施例中，所述两亲性三嵌段共聚物与所述功能性siRNA的氮磷比为5～9:1；更优选为8:1。

本发明中，所述两亲性三嵌段共聚物为亲水链-疏水链-亲水链结构，两端亲水链或之一的末端接枝有正电性分子。在本发明的一些实施方式中，所述三嵌段共聚物中的疏水链为泊洛沙姆聚合物F68、P123、F127的PPO链或其他结构的疏水性分子；所述亲水链为泊洛沙姆聚合物F68、P123、F127的PEO链或其他结构的亲水性分子；所述三嵌段共聚物中末端接枝的正电性分子为聚乙烯亚胺及壳聚糖、树枝状聚合物、碱性氨基酸等正电性亲水化合物。

在本发明的优选实施例中，所述两亲性三嵌段共聚物为F127-PEI₁₈₀₀。与其他两亲性三嵌段共聚物相比较，其所制备的疏水性药物纳米晶胶束粒径更小、电位更低，对siRNA的荷载效果更好，更符合后续的制剂制备条件。

本发明第二方面提供一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将疏水性药物纳米晶类胶束与功能性siRNA混合孵育，得到疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒；

步骤二、将步骤一所得疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒与阳离子脂质的有机溶液混合，于去离子水中透析过夜，得到疏水性药物纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒；

步骤三、对步骤二所得疏水性药物纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒进行修饰，得到疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂。

在本发明的一些实施例中，步骤一中所述孵育条件为室温。

在本发明的一些实施例中，步骤一中疏水性药物纳米晶类胶束与功能性siRNA的氮磷比为5～9:1，优选为8:1。

在本发明的一些实施例中，步骤一中所述疏水性药物纳米晶类胶束由以下方法制备：

S1、将疏水性药物的有机溶液与荷正电的三嵌段聚合物的水溶液混合，超声乳化，液氮速冻，真空干燥，得到粉末状样品；

S2、将S1所得粉末状样品复溶，除去游离的荷正电的三嵌段聚合物，得到疏水性药物纳米晶类胶束。

进一步地，S1中疏水性药物的有机溶液中疏水性药物与荷正电的三嵌段聚合物的水溶液中荷正电的三嵌段聚合物的质量比为1～4％，优选为2％。

进一步地，S1中所述超声强度为50～150W，优选为100W。优选地，所用超声仪为探头型超声仪。

进一步地，S2中除去游离的荷正电的三嵌段聚合物的方式为超滤。

在本发明的一些实施例中，步骤二中所述阳离子脂质的乙醇溶液中阳离子脂质与所述疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的质量比为1～8:1，更优选为8:1。

在本发明的一些实施例中，步骤三中所述修饰具体为用脂质-聚乙二醇和/或脂质-聚乙二醇-功能性分子修饰步骤二所得疏水性药物纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒，得到疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂或功能化的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂。当用脂质-聚乙二醇修饰时，得到产物为疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂；当用脂质-聚乙二醇-功能性分子修饰或者用脂质-聚乙二醇和脂质-聚乙二醇-功能性分子共同修饰时，得到产物为功能化的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂。

进一步地，所述脂质-聚乙二醇-功能性分子中功能性分子为能够与肿瘤细胞特异性结合的蛋白、多肽、核酸适配体或小分子等，例如所述功能性分子为GE11肽，能够靶向A549细胞表面过表达的EGFR受体。

本发明通过将疏水性药物的有机溶液与荷正电的三嵌段聚合物的水溶液均匀混合后再利用超声乳化与液氮速冻相结合的方法制备得到疏水性药物纳米晶类胶束，后通过静电吸附作用依次装载功能性siRNA、包裹脂质膜和修饰功能性分子，得到具有多层有序结构的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂。

本发明第三方面提供一种上述疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂在制备疏水性药物和基因药物共递送制剂中的应用；作为优选，所述疏水性药物为紫杉醇，所述基因药物为靶向肿瘤多药耐药基因siRNA。

本发明第四方面提供一种上述疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂在制备治疗多药耐药性肿瘤药物中的应用。

本发明提供的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂体系具有更好的稳定性，能高效地将药物递送至肿瘤组织，并通过内吞作用进入肿瘤细胞，当载药纳米颗粒从内体逃逸后，siRNA首先被释放出来，通过对耐药基因的抑制，减少紫杉醇等疏水性药物的外排，以此提高化疗药物的抗肿瘤效果，从而实现对耐药肿瘤的有效治疗。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1、本发明提出一种具有新型药物和制剂结构的疏水性化学药物和基因药物共载荷递送系统，内核为疏水性药物纳米晶，中间层为siRNA药物，外层为生物相容性良好并可保护内部药物的脂质双分子膜及功能性分子，得到稳定共递送难溶性药物和siRNA、并通过功能性基团靶向和治疗的药用载体。

2、本发明首先制备了核心为疏水性药物纳米晶的载疏水性药物纳米晶类胶束，疏水性药物纳米晶类胶束表面的正电荷可通过静电作用荷载siRNA，并通过阳离子脂质对siRNA的静电作用实现药物纳米晶和siRNA的依次包裹，实现对siRNA和疏水性药物的稳定共递送。

3、本发明提供的脂质纳米制剂通过疏水性药物和基因药物纳米制剂的多层有序结构实现对不同药物的序贯释放，且有效提高疏水性药物的释放速率，发挥生物学作用，实现更好的治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中两亲性聚合物泊洛沙姆-PEI的合成反应示意图。

图2为本发明实施例1中两亲性三嵌段聚合物F127-PEI₁₈₀₀的H¹NMR图谱。

图3为本发明实施例1中两亲性三嵌段聚合物F127-PEI₁₈₀₀的元素分析结果。

图4为本发明实施例1中两亲性三嵌段聚合物F127-PEI₁₈₀₀通过芘荧光法测定临界胶束浓度的结果。

图5A为本发明实施例2中F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束的粒径分布图。

图5B为本发明实施例2中F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束的电位示意图。

图6A为本发明实施例2中F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束120kV透射电镜形貌观测图。

图6B为本发明实施例2中F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束120kV透射电镜衍射结果。

图6C为本发明中实施例2中通过常规制备方法所得F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇胶束120kV透射电镜120kV透射电镜衍射结果。

图7A为本发明实施例3中F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束以不同氮磷比(N/P)与siRNA混合后所得的复合纳米颗粒的粒径、电势图。

图7B为本发明实施例3中F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束以不同氮磷比(N/P)与siRNA混合后所得的复合的琼脂糖凝胶电泳结果。

图8A为本发明实施例4中以不同质量比(L/N)与阳离子脂质复合后所得紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂粒径、电势图。

图8B为本发明实施例4中以阳离子脂质与紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒以质量比(L/N)为8复合所得紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂的琼脂糖凝胶电泳结果。

图9为本发明实施例5中靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂的稳定性情况考察结果。PBS、生理盐水、去离子水、1640培养基曲线分别表示EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒在PBS、生理盐水、去离子水、1640培养基中的粒径随时间变化情况。

图10为本发明实施例6中F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束及载紫杉醇胶束在1％Tween-80的PBS(pH＝7.4)释放介质中的体外释放情况。

图11为本发明实施例7中EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂对耐紫杉醇A549细胞沉默MDR1基因的效果。

图12为本发明实施例8中EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂及各组分对耐紫杉醇A549细胞的毒性作用结果。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

以下实施例以紫杉醇作为疏水性药物，利用末端修饰阳离子基团的两亲性三嵌段共聚物F127-PEI₁₈₀₀包裹紫杉醇纳米晶制备疏水核心，并将靶向编码P-gp蛋白基因的siRNA通过静电作用负载于其表面，在形成复合纳米颗粒后，再包覆以阳离子脂质双分子膜，并在表面进行功能性修饰。

以下实施例中所用到的实验试剂和实验仪器如下：

实验试剂：泊洛沙姆F127购自BASF公司；泊洛沙姆P123、F68购自Sigma-Aldrich公司；PEI购自麦克林公司；紫杉醇购自阿拉丁公司；甲醇(分析纯)，无水乙腈(色谱纯)，购自上海国药集团试剂有限公司；二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺DOTAP均购自Avanti公司。

实验仪器：旋转蒸发仪：上海鲁伊工贸有限公司；水浴超声仪：昆山超声仪器厂；激光散射粒度分析仪：英国马尔文仪器公司；生物型透射电镜：Centrifuge 5418R离心机：Eppendorf公司；超净工作台、4℃冰箱：海尔公司；BS 210S电子天平：Sartorius公司；高效液相色谱仪(HPLC)、色谱柱ZORBAX SB-C18(5um,4.6×150mm)：安捷伦科技有限公司。

实施例1：荷正电的两亲性三嵌段聚合物泊洛沙姆-PEI的合成与表征

1.1、荷正电的两亲性聚合物泊洛沙姆-PEI的合成方法

荷正电的两亲性聚合物泊洛沙姆-PEI的合成反应示意图如图1所示：

合成方法具体包括如下步骤：

S1、将适量泊洛沙姆与CDI溶解于无水乙腈中，于20℃活化24小时。

S2、将适量PEI溶解在20％乙醇溶液中，于室温下搅拌，将已活化的泊洛沙姆溶液慢速滴加至PEI溶液中，于氮气保护下反应48小时。

S3、使用透析袋在去离子水中透析48小时，后将其冻干得到纯化后的产物泊洛沙姆-PEI。

本实施例中所合成的泊洛沙姆-PEI中泊洛沙姆聚合物包括F127、F68、P123，所得PEI的分子量为800、1800、10K、25KDa。

1.2、荷正电的两亲性聚合物泊洛沙姆-PEI的表征

1.2.1、H¹NMR表征聚合物的化学结构

以F127-PEI₁₈₀₀为例，F127-PEI₁₈₀₀在D₂O中的1HNMR谱图(如图2所示)与预期结构一致。δ＝1.20和3.68ppm处的信号分别对应于PPO嵌段中的甲基质子和亚甲基质子，PEO嵌段中的亚甲基质子对应δ＝3.6ppm。对于亚甲基质子，δ＝2.61-2.86ppm处的信号证实了PEI的存在。δ＝4.25ppm的信号为酰胺基团的亚甲基质子，这表明F127被PEI的氨基封端。

1.2.2、元素分析表征聚合物的接枝率

以F127-PEI₁₈₀₀为例，由元素分析结果(如图3所示)可以看到，各化合物的元素比例与理论值相近，证明F127与PEI₁₈₀₀的接枝比接近1:1。

1.2.3、芘荧光法测定聚合物的临界胶束浓度

将1mL芘的丙酮溶液(6×10⁶)分别添加到一系列10mL容量瓶中，然后将丙酮蒸发过夜。之后，制备含有聚合物空白胶束的新鲜储备液。将10mL不同浓度的储备液(1×10-4^{- 5}mg/ml)添加到上述容量瓶中，与芘孵育。荧光光谱的检测在338和333nm处进行，发射波长为390nm，由I338/I333的交叉点计算临界胶束浓度(CMC)。

F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束的粒径分布图如图4所示，计算得到F127-PEI₁₈₀₀的临界胶束浓度为4.25×10^-3mM。

实施例2：F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束及F127-PEI载紫杉醇胶束的制备与表征

2.1、F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束及F127-PEI载紫杉醇胶束的制备

2.1.1、F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束的制备

F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束的制备方法，包括如下步骤：

将含紫杉醇(20mg/mL)的二氯甲烷(20μL)快速注入含F127-PEI₁₈₀₀(1.0wt％)的水溶液(2mL)中，使用探针型超声在一定强度下将其超声转化成O/W乳液，立即将其置于液氮中迅速冷冻，并进行真空冻干。然后使用去离子水复溶，超滤除去游离F127-PEI₁₈₀₀，即得到F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束，并用于后续实验。

2.1.2、F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇胶束的制备

F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇胶束的制备方法，包括如下步骤：

将紫杉醇(2mg)与F127-PEI₁₈₀₀(50mg)溶于10mL乙腈置于圆底烧瓶中，将溶剂在40℃下旋转蒸发约30min，得到混合物薄膜。通过过夜真空将残留的乙腈去除。用去离子水(5ml)在一定超声强度(100W)下对其进行薄膜水合，得到F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇胶束。

本实施例中所合成的F127-PEI中F127的分子量为12500Da，PEI的分子量为1800Da。

2.2、F127-PEI₁₈₀₀载紫杉醇纳米晶类胶束的性能测定

2.2.1、粒径、电位的测定

在常温下，使用激光散射粒度分析仪测定F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束的粒径和电位。

F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束的粒径、电位见图5A、5B，F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束的水合粒径为258.46nm，电位为12.16mV。

2.2.2、包封率及载药量的测定

为考察胶束的包封率和实际载药量，对紫杉醇纳米晶类胶束建立了以下液相条件进行探究：

色谱柱：ZORBAX SB-C18(5um,4.6×150mm),流动相：乙腈：水(50:50，V/V),柱温：30℃，流速：1mL/min,进检测波长：227nm。

具体过程为：精密称取紫杉醇纳米晶类胶束的冻干粉末适量，用乙腈涡旋充分溶解后，经0.22μm微孔膜过滤后取20μL进样分析，代入标准曲线计算实际紫杉醇含量，代入以下公式：

包封率(％)＝纯化后纳米晶类胶束中紫杉醇质量/紫杉醇投药质量*100

载药量(％)＝纳米晶类胶束中紫杉醇质量/纳米晶类胶束总质量*100

经计算得F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束的紫杉醇实际载药量为1.55％，包封率为66.99％。

2.2.3、透射电镜(TEM)及衍射

采用透射电镜对前期制备的紫杉醇纳米晶类胶束进行形态学观察。

具体方法为使用去离子水作为分散介质稀释上述胶束至0.5-1mg/ml，然后取10μl稀释后的纳米晶类胶束滴加到铺有碳膜的铜网上，5min后用滤纸将多余的胶束溶液吸干，放置过夜后使用120kV透射电镜仪观察其形貌和衍射环，测定结果见图6A(F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束)可见制剂均以胶束形态呈现，分布均匀。通过衍射结果可知，通过我们所探索的制备方法所制得的F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束可见明显衍射环，说明类胶束内部的紫杉醇呈多晶态(图6B)，而通过常规制备方法所制得F127-PEI载紫杉醇胶束未见明显衍射环(图6C)，说明其内部紫杉醇非晶态。

实施例3：紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的制备和性能测定

3.1紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的制备

将等体积不同浓度的siRNA溶液于涡旋状态下加入至等体积同浓度F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束溶液中，并在室温下孵育30分钟，得到紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒。

3.2紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的性能测定

3.2.1、粒径、电位的测定

在常温下，使用激光散射粒度分析仪测定紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的粒径和电位，结果见图7A，以不同氮磷比(N/P)制备的紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的粒径均在200-300nm，且电位因siRNA的荷载均呈负电性，并随氮磷比(N/P)的增大而上升。

3.2.2、琼脂糖凝胶电泳

通过琼脂糖凝胶电泳考察以氮磷比(N/P)5～9所制备的F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束对siRNA的载荷效果，结果见图7B，可见随着N/P的增大，F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束对siRNA包封效果更好。

实施例4：EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂的制备及性能测定

4.1、EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂的制备

将质量比为1:1的DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，后旋转蒸发制备成乙醇储备液，按质量比4:1-8:1(L/N)将脂质与前述制备的紫杉醇纳米晶/siRNA复合物混合，涡旋，常温放置30分钟，于3.5K透析袋中，于去离子水透析过夜，得到纳米晶/siRNA脂质纳米制剂。

按照脂质摩尔比98:2插入EGFR功能性分子GE11修饰的DSPE-PEG(DSPE-PEG-GE11)，将二者混合，过夜孵育，后通过超滤除去游离的DSPE-PEG-GE11。

4.2、EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂的性能测定

4.2.1、粒径、电位的测定

在常温下，使用激光散射粒度分析仪测定紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒的粒径和电位，见图8A，其粒径范围在100-300nm，其中，以L/N＝8所制备的紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒粒径最小，电位最高。

4.2.2、琼脂糖凝胶电泳

通过琼脂糖凝胶考察L/N为8时脂质对复合纳米颗粒的包封效果，结果见图8B，可见脂质对紫杉醇纳米晶/siRNA复合物有较好的包封效果。

以L/N＝8所制备的紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒已有效地包裹紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒，从阳离子脂质自身毒性及阳离子脂质的利用率考虑，L/N＝8已为最优选，无需再考察更高比例的脂质纳米制剂。

实施例5：EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂的稳定性研究

将实施例4中以脂质与紫杉醇纳米晶/siRNA复合纳米颗粒质量比为8制备的EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒重新分别分散于去离子水、PBS、生理盐水和RPMI1640培养基中。在不同时间点使用动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径，考察其稳定性。

结果如图9，EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒的粒径去离子水、PBS、生理盐水和RPMI1640培养基中均没有明显变化，且形貌在48小时内一直保持稳定，说明EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂稳定性良好，且无明显药物泄漏。

实施例6：F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束及载紫杉醇胶束的体外释放研究

采用透析袋法考察F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束、F127-PEI载紫杉醇胶束的体外释放行为，并与市售紫杉醇注射剂

进行对比。用含1％Tween-80的PBS 7.4作为释放介质来模拟体内循环系统。

具体步骤如下：精密称取含有90μg PTX的三种剂型分散在500μL的释放介质中，补充至4mL后加入透析管(MWCO：10000Da)。将透析管完全浸没于4mL的释放介质中，在37℃、120rpm条件下进行释放实验。在预定的时间点吸取200μL透析外液，同时补充200μL的新鲜预热过的释放介质，采用HPLC方法测定上清液中的PTX含量，计算不同剂型的累积释放率。

结果如图10所示，可以看出，与F127-PEI载紫杉醇胶束相比，F127-PEI载紫杉醇纳米晶类胶束具有更快的溶出速率，可以快速地从制剂中释放，达到药物作用浓度。

实施例7：EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂对耐紫杉醇A549细胞MDR1基因表达的影响

A549细胞为人非小细胞肺癌细胞，细胞表面过表达EGFR受体，采用1640培养基加10％FBS和1％双抗培养，本实验中的A549细胞经紫杉醇诱导耐药，IC50为3.5μM。

取对数生长期的耐紫杉醇A549细胞，按照每孔2×10⁴个细胞加入12孔板中，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中过夜培养。随后用PBS洗涤，加入不同的制剂(空白对照组：等体积培养基；阴性对照组：荷载阴性对照siRNA的纳米制剂；实验组：荷载沉默MDR1基因siRNA的纳米制剂)，孵育4小时，用PBS进行洗涤，并换为1640完全培养基，继续培养44小时。随后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，采用试剂盒(Hieff

Power qPCR SYBR GreenMaster Mix)逆转录、采用试剂盒(

III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix forqPCR)进行实时定量PCR测定。

如图11可以看出，与空白、阴性对照siRNA组相比较，载荷靶向MDR1基因的siRNA纳米制剂实验组有效抑制了耐紫杉醇A549细胞中MDR1基因的表达。

实施例8:EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂不同组分对耐紫杉醇A549细胞的毒性作用

取对数生长期的耐紫杉醇A549细胞按照每孔5×103个细胞加入96孔板中，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养24h。随后加入不同组分的制剂，继续培养48h，其中紫杉醇浓度为500ng/ml。之后，每孔加入20ul的CCK-8试剂，37℃避光孵育1.5小时，使用酶标仪测定450nm波长下的吸光度，代入公式计算细胞的存活率：

细胞存活率＝(A-Ab)/(Ap-Ab)*100％

其中：A：实验组；Ab：空白对照组(不接种细胞，仅加入等体积培养基)；Ap:阳性对照组(每孔细胞中仅加入与实验组制剂等体积的培养基)

如图12可以看出，实验剂量下，空白胶束、空白阳离子脂质体、载siRNA阳离子脂质体对细胞无明显毒性作用；载紫杉醇纳米晶胶束、EGFR靶向紫杉醇纳米晶/阴性对照siRNA脂质纳米制剂、EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂对细胞产生明显毒性，且EGFR靶向紫杉醇纳米晶/siRNA脂质纳米制剂对细胞的毒性显著增强，可见其荷载的siRNA有效地沉默了MDR1基因，抑制了P-糖蛋白的表达，从而增强了耐紫杉醇A549细胞对紫杉醇的敏感性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述脂质纳米制剂包括脂质膜和位于脂质膜内的疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒；所述疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒包括疏水性药物纳米晶、两亲性三嵌段聚合物、功能性siRNA；所述脂质膜为阳离子脂质膜。

2.如权利要求1所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质膜可以形成脂质双分子膜；所述脂质纳米制剂中包括有序的三层结构：内核结构为两亲性三嵌段聚合物包裹疏水性药物形成的疏水性药物纳米晶，中间层为两亲性三嵌段聚合物静电吸附层及负载的功能性siRNA，最外层为脂质双分子膜及双分子膜上修饰的脂质-聚乙二醇和/或脂质-聚乙二醇-功能性分子。

3.如权利要求2所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：

(ⅰ)所述两亲性三嵌段共聚物为亲水链-疏水链-亲水链结构，两端亲水链或之一的末端接枝有正电性分子；

(ⅱ)所述功能性分子为能够与肿瘤细胞特异性结合的蛋白、多肽、核酸适配体或小分子。

4.如权利要求1或2所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质膜至少含有一种阳离子脂质。

5.如权利要求4所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述脂质纳米制剂中所述阳离子脂质膜中阳离子脂质与所述疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的质量比为1～8:1。

6.如权利要求1或2所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述疏水性药物选自紫杉烷类、喜树碱类或长春碱类。

7.如权利要求1或2所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述两亲性三嵌段共聚物与所述功能性siRNA的氮磷比为5～9:1。

8.如权利要求3所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，所述特征(ⅰ)中还包括以下特征中的一项或几项：

1)所述三嵌段共聚物中的疏水链为泊洛沙姆聚合物F68、P123、F127中任一种的PPO链；

2)所述亲水链为泊洛沙姆聚合物F68、P123、F127中任一项的PEO链；

3)所述三嵌段共聚物中末端接枝的正电性分子为聚乙烯亚胺及壳聚糖、树枝状聚合物、碱性氨基酸中任一种。

9.一种疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将疏水性药物纳米晶类胶束与功能性siRNA混合孵育，得到疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒；

步骤二、将步骤一所得疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒与阳离子脂质的有机溶液混合，于去离子水中透析过夜，得到疏水性药物纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒；

步骤三、对步骤二所得疏水性药物纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒进行修饰，得到疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂。

10.如权利要求9所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：

(a)步骤一中所述孵育条件为室温；

(b)步骤一中疏水性药物纳米晶类胶束与功能性siRNA的氮磷比为5～9:1；

(c)步骤一中所述疏水性药物纳米晶类胶束由以下方法制备：

S1、将疏水性药物的有机溶液与荷正电的三嵌段聚合物的水溶液混合，超声乳化，液氮速冻，真空干燥，得到粉末状样品；

S2、将S1所得粉末状样品复溶，除去游离的荷正电的三嵌段聚合物，得到疏水性药物纳米晶类胶束；

(d)步骤二中所述阳离子脂质的乙醇溶液中阳离子脂质与所述疏水性药物纳米晶/siRNA复合纳米颗粒的质量比为1～8:1；

(e)步骤三中所述修饰具体为用脂质-聚乙二醇和/或脂质-聚乙二醇-功能性分子修饰步骤二所得疏水性药物纳米晶/siRNA脂质纳米颗粒，得到疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂或功能化的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂。

11.如权利要求10所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：

(c1)所述S1中超声功率范围为50～150W；

(c2)所述S2中除去游离的荷正电的三嵌段聚合物的方式为超滤；

(e1)所述脂质-聚乙二醇-功能性分子中功能性分子为能够与肿瘤细胞特异性结合的蛋白、多肽、核酸适配体或小分子。

12.如权利要求1～8任一项所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂或权利9～11中任一项所述的制备方法制得的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂在制备疏水性药物和基因药物共递送制剂中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疏水性药物为紫杉醇，所述基因药物为靶向肿瘤多药耐药基因siRNA。

14.如权利要求1～8任一项所述的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂或权利9～11中任一项所述的制备方法制得的疏水性药物纳米晶/siRNA共载荷有序结构脂质纳米制剂在制备治疗多药耐药性肿瘤药物中的应用。

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