CN115624539A - 一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用，该脂质纳米颗粒包含：阳离子脂质体和包被于阳离子脂质体中的复合物，所述复合物至少由一种反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺复合形成。本发明的技术方案通过采用阳离子脂质体包被由反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺形成的复合物，获得脂质纳米颗粒，以提高反义寡核苷酸作药物的稳定性和递送效率。

Description

一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
VPS9D1-AS1(VPS)在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中高表达，且VPS可作为药物作用靶点用于CRC的治疗。通过抑制VPS一方面可以抑制CRC细胞的增殖和迁移等恶性细胞行为，另一方面抑制CRC细胞中的VPS还将调控癌细胞与CD8+ T细胞间的信号传导，促进CD8+ T细胞的浸润和杀伤。
VPS作为一种长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)适合采用反义寡核苷酸（ASO）对其进行抑制。然而，ASO作为一种小干扰RNA存在稳定性和递送效率不高的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用，通过采用阳离子脂质体包被由反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺形成的复合物，获得脂质纳米颗粒，以提高反义寡核苷酸作药物的稳定性和递送效率。
本发明的第一方面，提供一种脂质纳米颗粒，包含：阳离子脂质体和包被于阳离子脂质体中的复合物，所述复合物至少由一种反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺复合形成。
优选的，所述聚乙烯亚胺：反义寡核苷酸的质量浓度比为（1-1.2）:1。
优选的，所述阳离子脂质体包含：乳化颗粒纤维素、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000中的一种或多种。
优选的，所述乳化颗粒纤维素：二肉豆蔻酰磷脂酰甘油：二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000的质量浓度比为(15-16)：1：（3-4）。
优选的，所述反义寡核苷酸的序列为：
5’-UCCUCCACCCAACUCCUCAA-3’，SEQ ID NO.1。
本发明的第二方面，提供一种上述脂质纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、将聚乙烯亚胺溶液加入反义寡核苷酸溶液中，形成聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸的复合物溶液；
S2、配制阳离子脂质体溶液；
S3、将聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸的复合物溶液加入阳离子脂质体溶液中，形成脂质纳米颗粒。
优选的，步骤S1包括：
S11、称取一定量聚乙烯亚胺，用水稀释后调节pH至7-8；
S12、将反义寡核苷酸进行2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰，以稳定反义寡核苷酸的结构，称取一定量反义寡核苷酸，溶解于DEPC水中；
S13、涡旋状态下将等体积的聚乙烯亚胺溶液滴加到反义寡核苷酸溶液中，高速涡旋后静置形成聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸的复合物溶液；
优选的，步骤S2包括：
S21、称取一定量乳化颗粒纤维素、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000分别溶解于三氯甲烷中，超声充分溶解；
S22、将步骤S21中溶解后的溶液加入茄形瓶，混合均匀，水浴减压旋蒸，至三氯甲烷完全挥发，瓶壁形成一层脂质体薄膜；
优选的，步骤S3包括：
S31、将步骤S13中的聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸形成的复合物溶液加入茄形瓶中，水浴进行薄膜水化，至脂质体薄膜完全从茄形瓶脱落；
S32、将脂质体薄膜进行探针超声破碎，加水定容后获得脂质纳米颗粒。
本发明的第三方面，提供一上述的脂质纳米颗粒或上述的脂质纳米颗粒的制备方法获得的脂质纳米颗粒在癌症，尤其是结直肠癌治疗方面的应用。
有益效果：
本发明的技术方案通过采用阳离子脂质体包被由反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺形成的复合物，获得脂质纳米颗粒，以提高反义寡核苷酸作药物的稳定性和递送效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明化学修饰后的ASO结构示意图；
图2为本发明透射电子显微镜观察的VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒图；
图3为本发明VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒的粒径和Zeta电势检测图；其中，VPS-ASO-PEG代表VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒；PEI-ASO代表PEI-ASO复合物；EPC-DMPG-DMG代表阳离子脂质体对照，检测编号1、2、3代表三个检测样本；
图4A为本发明共聚焦显微镜观察VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒HCT116细胞中的分布图；
图4B为本发明荧光定量PCR检测VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒对靶基因VPS的抑制作用图；其中ASO-NC代表反义寡核苷酸，ASO+Lipo3000代表反义寡核苷酸和转染试剂Lipo3000，VPS-ASO-PEG代表VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒；
图5为本发明VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒对小鼠肿瘤的靶向性示意图；
图6为本发明VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒对HCT116细胞和SW480细胞的抑制作用图；其中，HCT116细胞、SW480细胞是人结肠癌细胞；IC50代表药物半抑制浓度；
图7为本发明VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒对HCT116细胞的杀伤过程图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例提供一种脂质纳米颗粒，包含：阳离子脂质体和包被于阳离子脂质体中的复合物，复合物至少由一种反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺复合形成。
优选的，聚乙烯亚胺：反义寡核苷酸的质量浓度比为（1-1.2）:1；
对于聚乙烯亚胺（PEI）与反义寡核苷酸(ASO)的质量浓度比可根据实际需要选择设计，为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。
例如：PEI：ASO的质量浓度比为1:1。
例如：PEI：ASO的质量浓度比为1.1:1。
例如：PEI：ASO的质量浓度比为1.2:1。
在一个具体实施方式中，称取24.2mg PEI，溶解后调节pH至7.4，定容至50mL，PEI终浓度为0.484 mg/mL。
称取829.26μg ASO，溶解于1.86mL DEPC水中，终浓度为0.446 mg/mL。
优选的，阳离子脂质体包含：乳化颗粒纤维素(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)中的任意一种；或者，阳离子脂质体还可包含：EPC、DMPG、DMG-PEG2000中的任两种或三种的组合。
在一个具体实施方式中，阳离子脂质体包括EPC、DMPG和DMG-PEG2000，其中，EPC：DMPG：DMG-PEG2000的质量浓度比为(15-16)：1：（3-4）。
对于EPC：DMPG：DMG-PEG2000的质量浓度比可根据实际需要选择设计，为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。
例如：EPC：DMPG：DMG-PEG2000的质量浓度比为15：1：3；
EPC：DMPG：DMG-PEG2000的质量浓度比为15.1：1：3.5；
EPC：DMPG：DMG-PEG2000的质量浓度比为15.5：1：3.6；
EPC：DMPG：DMG-PEG2000的质量浓度比为16：1：4；
在一个具体实施方式中，称取68.4 mg EPC、4.52 mg DMPG、16.13 mg DMG-PEG2000溶解于1mL三氯甲烷中。
然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
优选的，反义寡核苷酸的序列为：
5’-UCCUCCACCCAACUCCUCAA-3’，SEQ ID NO.1。
本实施例中，脂质纳米颗粒直径最大约为200nm，平均直径约为133.7nm。
综上，本实施例通过采用阳离子脂质体包被由反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺形成的复合物，从而获得脂质纳米颗粒，提高了反义寡核苷酸作药物的稳定性和递送效率。
实施例二
本实施例在上述实施例一的基础上，提供一种脂质纳米颗粒的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、将PEI溶液加入ASO溶液中，形成PEI与ASO的复合物(PEI-ASO) 溶液。
优选的，步骤S1包括：
S11、称取一定量PEI，用水稀释后调节pH至7-8；
S12、将ASO进行2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰，以稳定ASO的结构，称取一定量ASO，溶解于DEPC水中；
S13、涡旋状态下将等体积的PEI溶液滴加到ASO酸溶液中，高速涡旋后静置形成PEI-ASO复合物溶液；
S2、配制阳离子脂质体溶液；
优选的，步骤S2包括：
S21、称取一定量EPC、 DMPG、 DMG-PEG2000分别溶解于三氯甲烷中，超声充分溶解；
S22、将步骤S21中溶解后的溶液加入茄形瓶，混合均匀，水浴减压旋蒸，至三氯甲烷完全挥发，瓶壁形成一层脂质体薄膜；
S3、将PEI-ASO复合物溶液加入阳离子脂质体溶液中。
优选的，步骤S3包括：
S31、将步骤S13中的PEI-ASO复合物溶液加入茄形瓶中，水浴进行薄膜水化，至脂质体薄膜完全从茄形瓶脱落；
S32、将脂质体薄膜进行探针超声破碎，加水定容后获得脂质纳米颗粒。
下面结合一个具体实施方式进行举例说明：
（1）将5’-UCCUCCACCCAACUCCUCAA-3’，SEQ ID NO.1所示的ASO进行2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰，以稳定ASO的结构，修饰后的ASO结构如图1所示；
（2）取829.26μg修饰后的ASO，溶解于1.86mL DEPC水中，修饰后的ASO溶液终浓度为0.446 mg/mL；
（3）称取24.2mg PEI，用水稀释后调节pH至7.4，定容至50mL，PEI溶液终浓度为0.484 mg/mL；
（4）涡旋状态下将等体积的PEI溶液滴加到修饰后的ASO溶液中，高速涡旋2min后静置15min以上，形成PEI-ASO复合物溶液；
（5）称取68.4 mg EPC、4.52 mg DMPG、16.13 mg DMG-PEG2000分别溶解于1mL三氯甲烷中，超声充分溶解 ；
（6）将步骤（5）中溶解后的溶液加入茄形瓶，混合均匀，转速调至20 rpm，水浴70℃减压旋蒸，至三氯甲烷完全挥发，瓶壁形成一层脂质体薄膜；
（7）将步骤（4）的PEI-ASO复合物溶液加入上述茄形瓶中，转速17 rpm，水浴60 ℃进行薄膜水化30 min，至脂质体薄膜完全从茄形瓶脱落；
（8）将脂质体薄膜进行探针超声破碎15min，加水定容至5 mL，获得VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒；
（9）将VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒储存于4℃备用。
实施例三
通过透射电子显微镜观察构建好VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒，电镜结果如图2所示：PEI-ASO复合物直径约10nm，被EPC、DMPG和DMG-PEG2000包被后形成的VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒直径最大约为200nm。
通过琼脂糖凝胶电泳实验证实：游离的ASO可移动，而构建成功的VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒无法移动，说明VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒以复合体的形式存在。
实施例四
对VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒的粒径和Zeta电势进行检测，检测结果如图3所示：粒径平均约为133.7nm，Zeta电势为-3.15。
实施例五
共聚焦显微镜观察VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒在HCT116细胞中的分布如图4A所示，荧光定量PCR检测结果如图4B所示，图4A和图4B结果显示：在无转染试剂Lipo3000（lipo）时，VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒能够自主进入HCT116细胞且能够抑制靶基因VPS的表达。
实施例六
将VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒经鼠尾静脉注射到皮下已成瘤（MC38-VPS OE）的小鼠中，活体成像观察结果如图5所示：1个小时后即可在小鼠结肠癌细胞中观察到VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒的分布。
实施例七
在第96小时，采用CCK8实验检测肠癌细胞的活力和IC50值，实验结果如图6所示：VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒能够显著抑制HCT116细胞和SW480细胞的生长。
实施例八
通过活细胞工作站观察VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒对HCT116细胞的杀伤过程，结果如图7所示：VPS-ASO-PEG脂质纳米颗粒可自主进入细胞内，在2小时内即可发挥作用，可在24小时内导致细胞的死亡。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包含：阳离子脂质体和包被于阳离子脂质体中的复合物，所述复合物至少由一种反义寡核苷酸与聚乙烯亚胺复合形成。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺：反义寡核苷酸的质量浓度比为（1-1.2）:1。
3.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质体包含：乳化颗粒纤维素、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油和二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述乳化颗粒纤维素：二肉豆蔻酰磷脂酰甘油：二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000的质量浓度比为(15-16)：1：（3-4）。
5.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述反义寡核苷酸的序列为：5’-UCCUCCACCCAACUCCUCAA-3’，SEQ ID NO.1。
6.根据权利要求1-5任一所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将聚乙烯亚胺溶液加入反义寡核苷酸溶液中，形成聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸的复合物溶液；
S2、配制阳离子脂质体溶液；
S3、将聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸的复合物溶液加入阳离子脂质体溶液中，形成脂质纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：
S11、称取一定量聚乙烯亚胺，用水稀释后调节pH至7-8；
S12、将反义寡核苷酸进行2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯修饰，以稳定反义寡核苷酸的结构，称取一定量反义寡核苷酸，溶解于DEPC水中；
S13、涡旋状态下将等体积的聚乙烯亚胺溶液滴加到反义寡核苷酸溶液中，高速涡旋后静置形成聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸的复合物溶液。
8.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：
S21、称取一定量乳化颗粒纤维素、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000分别溶解于三氯甲烷中，超声充分溶解；
S22、将步骤S21中溶解后的溶液加入茄形瓶，混合均匀，水浴减压旋蒸，至三氯甲烷完全挥发，瓶壁形成一层脂质体薄膜。
9.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S3包括：
S31、将步骤S13中的聚乙烯亚胺与反义寡核苷酸形成的复合物溶液加入茄形瓶中，水浴进行薄膜水化，至脂质体薄膜完全从茄形瓶脱落；
S32、将脂质体薄膜进行探针超声破碎，加水定容后获得脂质纳米颗粒。
10.根据权利要求1-5任一所述的脂质纳米颗粒或权利要求6-9任一所述的脂质纳米颗粒的制备方法获得的脂质纳米颗粒在结直肠癌治疗方面的应用。
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