JPH01249717A

JPH01249717A - リポソームの製造方法

Info

Publication number: JPH01249717A
Application number: JP7686288A
Authority: JP
Inventors: Mitsunori Ono; 光則小野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1988-03-30
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1989-10-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（発明の分野）本発明は安定なリポソームの製造に有用なコ。

≠−ビス（ポリエチレングリコール）　−ｊ　−を換−
５−１１７ジン誘導体に関する。

（従来の技術）リポソームは、通常水性物質によシ相互に一定の間隔を
保った多数のリン脂質二層からなる（小胞といわれる）
ことが知られている。かようなリポソームを薬剤の運搬
体として応用しようとする試みが多数報告されている。

（例えばＧ。

Ｑｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅ
ｄ、。

λＦ！、７ｔＪ−（／Ｐ７６））しかし薬剤の運搬体として利用するに際し、大きな欠点
が指摘されてきた。即ち、非共有結合性相互作用による
分子集合体であるという宿命ゆえの構造の不安定性、薬
剤のもれ現象である。従来、この点を改良する目的で、
たとえば多糖で被覆したリポソームの製法（特開昭ｔｉ
−ｔ９ｒｏｉ号）や水素結合によって構造強化されたリ
ン脂質（日本化学会誌　！ｔり頁　／り２７年）が開発
されている。しかし未だ充分とは言いがたく新しい方法
の開発が強く望まれているのである。

（発明の目的）本発明の目的は、内包する薬物のもれが少ない安定なリ
ポソームの製造法を提供することである。

（発明の構成）本発明は、リポソーム族を、脂質および式／で示される
λ、弘−ビス（ポリエチレングリコール）−７−ｆｆ換
アξノーＳ−トリアジン誘導体よ多構成することｔ−特
徴とするポリソーム膜の製造方法に関する。

式ｌにおいて、ｎは３〜λ００の整数を表わす。

好ましくはｒ−２００であシ混合物であってもよい。混
合物の場合のポリエチレングリコール部の平均分子量は
３ｊＯ〜ｒｏｏｏが望ましい。

式中Ｒ１、Ｒ２は水素原子、アルキル基、アルキルカル
ボニル基、アルキルスルホニル基ヲ表わす。

アルキル基の場合、直鎖でも分枝状でもよい。

アルキル基上には置換基を有していてもよく、置換基と
してはアルキルカルボキシル基、アルキルカルバモイル
基、アルキルチオ基、アルコキシ基の中から選ばれる。

Ｒ工、Ｒ２がアルキル基を表わす場合、望ましくは炭素
数がｌ〜３０ケのものである。

Ｒ□、Ｒ２がアルキルカルボニル基を表わす場合その炭
素数は望ましくは、ｔ〜３０ケのものである。そのアル
キル基は直鎖、分校状いずれでもよく前記のような置換
基を有していてもよい。

Ｒ，、Ｒ２がアルキルスルホニル基を表わす場合、その
炭素数は、望ましくはｒ〜３０ケのものである。そのア
ルキル基直鎖、分校状いずれでもよく、前記のような置
換基を有していてもよい。

式／においてＲ３、Ｒ４は水素原子又はメチル基を表わ
す。

次に式ｌで示される化合物の具体例を列挙するが、本発
明の範囲はこれらに限定されるものではない。

０＝ＣＣ１１’Ｚ３　Ｕｌｌ”２３Ｃ１４Ｈ２９（１４Ｈ２９合成例トルエンＪＯｘｔ中に（Ｎａ２ＣＯ３／、０１）とアミ
ン体ＩＰを入れ室温下かくはんした。その中に、生化学
工業■製活性ＰＥＧ２　ｌｙを入れ室温で２時間反応さ
せた。濾過濃縮後水を！ゴ加え不溶物を戸別し、ｐ液を
セファロース＋Ｂカラムにかける。（３００ｍｌ）水に
て溶離し、１ｏｒｎｌづつのＦｒａｃｔｉｏｎにわけＦ
ｒａｃｔｉｏｎ　／　Ｉ−λ♂の液を凍結乾燥すると目
的の／が白色粉末として得られた。　ｏ、ｒｙ０構造はＮＭＲによシ確認した。

例示化合物λの合成Ａ　Ｈ（Ｊ聞活性ＰＥＧ２テトラヒドロ７う７ＪＯｘｌの中に人を２Ｐ入れ、室温
でかくはんした。その中に活性化ＰＥＧ２をＩＰ入れ室
温で２時間かくはんした。例示化合物／の合成の分離条
件と同様にセファロースφＢによるゲル濾過を行いＢを
０．７９得た。

化合物Ｂｏ、第１を無水テトラヒドロフランに溶解しト
リエチルアミンを２ゴ加える。その中にＣ□□Ｈ２３Ｃ
−α（ｏ、３ｙ）をテトラヒドロフラン３ｄに溶解した
ものを滴下した。１時間後、テトラヒドロフランを減圧
留去し水を加え、不溶物を戸別しＰ液を濃縮、冷却する
と目的とする化合物λがＯ６≠３Ｆ得られた。

ポリエチレングリコール（平均分子量≠００；和光純薬
製）ｔｏｙを無水テトラヒドロフラン３００ｒｄに加え
冷却下、ＮａＨ（４０％分散物）ｔ。

ＯＦを徐々に加え、室温に戻して１時間かくはんした。

その混合物の中にトリクロルトリアジンをｌｔ。

弘り加え室温で２時間かくはんしその後油温ｔｏ０で１
時間かくはんした。テトラヒドロフランを減圧留去後ク
ロロホルムに再溶解しシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーによシ梢裂すると（シリカゲルＪＫｆ；溶離液クロ
ロホルム）目的とする化合物Ａがｊ３Ｐ油秋物として得
られた。

アミン体１３４４　、７７とトリエチルアミン２Ｆをテ
トラヒドロ７ラン！Ｏ−に溶解した。その中に化合物Ａ
をり、／ｆ加え室温で１時間かくはんした。テトラヒド
ロフランを減圧留去して残渣を、クロロホルムに再溶解
しカラムクロマトグラフィーによシ分離精製すると（シ
リカゲルμｏｏｙ；溶離液クロロホルム）目的とする！
が７．／ｆ得られた。

リポソームを形成させるために用いるリン脂質としては
、卵黄、大豆あるいはその他の動・植物に由来するホス
ファチジルコリン、ホス７アテジルエタノールアミン、
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、
スフィンゴミエリンや、合成によって得られるジパルミ
トイルレシチン、ジステアロイルレシチン、シミリスト
イルレシチン等を挙げることができる。

次にリボリームに取シこませる親水性薬物としては例え
ばアドリアマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシ
ン、／−β−アラビノフラシルシトシン、ブレオマイ゛
シン、シスプラチン等の抗がん剤、インターフェロン等
の抗ウィルス剤、アミノ配糖体（例工ば、ゲンタマイシ
ン）、β−ラクタム系（例えばスルはニジリン、セフオ
チアム、セフメツキシム）等の抗生物質、ＴＲＨｌ　リ
ュウブロライド、インスリン等のはプチドホルモン剤、
リゾ゛チーム、アスパラギナーゼ、グリコシダーゼ等の
酵素剤、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド等
の免疫賦活剤、イムノグロブリン、各攬トキシン等の蛋
白質が挙げられる。

本発明に係るリポソーム展剤中の式ｌで表わされる化合
物の配合量は特に限定はないが、好ましくは、リポソー
ムを形成し得る複合リン脂質／に対しｏ、ｔ−ｔ、ｏ（
重量比）の配合比である。

またステロール等の添加物を混合してもよい（例、ｔば
、コレステロール、β−シトステロール、スチグマステ
ロール、カンペステロールなト）。

式ｌで表わされる化合物とす／脂質を用いてリポソーム
を形成させるには通常のリポソーム形成法すなわちポル
チクスイング法（Ａ、Ｄ、Ｂａｎｇｈａｍ。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、／Ｊ　、２Ｊｌｒ　（／ＰＡ
ｊ）。

ソニケーション法（Ｃ，Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
。

ｒ、３４Ｌｌ／−（／Ｆ４Ｆ）］、プレベシクル法〔Ｈ
ｏＴｒａｕｂｌｅ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、Ｐｒｏ
ｇ。

１３ｕ１１．、　　タ、２７３（ｌり７／）〕、エエタ
ノノール入法（Ｓ、Ｂａｔｚｒｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、、Ｊ５’ｒ　、１０／ｊ（／り７３））、７
１／ンテプレス押出法ＣＹ、　Ｂａｒｅｎｈｏｌｌｚ、
、ＦＥＢＳ。

Ｌｅｔｔ、、ヱヱ、ａｔｏ（／り７り））、コール酸除
去法ＣＹ、Ｋａｇａｗａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

コ弘６．！≠７７（ｌり７１）〕、〕トリトンＸ−１０
０パッチ法Ｗ、Ｊ、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ、Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　♂ｊ、、２！！（／り７Ｆ
））ＩＣａ”＋融合法ＣＤ、ＰａＰａｈａｄｊｏｐｏｕ
ｌｏｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、ｊり＠　
、４Ｌｒ３（／り７ｊ））、エーテル注入法ＣＤ、Ｄｅ
ａｍｅｒ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、弘４４
３．Ａλり（／り７１））、アニーリング法〔ＲｏＬａ
ｗａｃｚｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ。

ＩＩ弘３，３１３（／り７６）〕、凍結融解融合法［Ｍ
、Ｋａｓａｈａｒａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２ｚａ、ｙ３ｒＩＩＬ（ｔｙｙ７）〕、Ｗ１０／ｗエマ
ルジョン法（Ｓ、　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｊ、　Ｃｏ
１１ｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅ　　Ｓｃｉ、、６２　、
／ｕＰ（／り７７）］　ｌ逆相蒸発法ＣＦ、５ｚｏｋａ
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ’。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、７ｊ　、弘／り弘（ｌり
７、ｒ））　　など多くの方法が知られているが、本発
明では上記いずれの調製法を用いてもよくまたこれらに
限定されるものではない。

（発明の効果）本発明の化合物は、脂質を水中に分散させた時に形成さ
れるリポソームの内包物のもれを少なくするのに有効な
化合物である。すなわち式ｌで表わされるポリエチレン
グリコール誘導体をリン脂質と混合することによりリポ
ソームの表面がポリエーテル被覆され、リボンーム内か
ら内包物のもれが少なくなる。式ｌで表わされる化合物
は、クラウンエーテルの基本構造を有しておシ、生体内
子　　　　＋の豊富なＮａ、Ｋ　を取シこみ表面を強固に保護する。

また表面に強い荷電を発生することによシリポソーム自
体の凝集も抑制することができる。

加えてエーテル鎖は、他の脂質の親水性部と直接あるい
は、水分子等を介して水素結合することによシリポゾー
ム内包からの内包物のもれを抑制する。

また式／で表わされる化合物の主要部を占るポリエチレ
ングリコール部は、人工脂質の欠点である主体内毒性と
いう観点でも無害であることがすでに多くの動物実験で
確かめられている（日本癌化学治療雑誌、ｌ１巻、２２
２７頁、ｌりｒ弘年）。

上記の観点においても本発明の効果は大きいのである。

実施例１゜卵黄レシチン３０〜、例示化合物λ（ＺＯＶ）、コレス
テロール（／、≠り）ヲクロロホルム（３ｘｉ　）に溶
解し減圧留去して薄膜を作った。光分に乾燥後カルボキ
シフルオレセインのＢｕｆｆｅｔ　溶液（２００ｍＭ　
；　Ｔｒｉｓ−ＨαＢｕｆｆｅｒ　ｐＨ＝１．１：２０
０ｍＭＮａα宮有）Ｊｄを加えてｌｊ分間ｉルテクシン
グを行いその後プローブ型の超音波発生装置ｆｉｏ分間
ンニケーションを行った。８ｅｐｈａｒｏｓｅ≠Ｂでゲ
ル化濾過後、各フラクションについて平均粒径、リン脂
質濃度を測定した。

次にＪＯ０ＣのＴｒｉｓ−ＨＣｔＢｕｆｆｅＩｊ液中（
ｐＨ＝ｒ、４）で、カルボキシフルオレセインの漏出を
けい光測定で追跡した。その結果を第１図に示した。第
７図において縦軸は漏出し九カルボキシフルオレセイン
のわシアいを示し、横軸は時間を示す。第１図において
線■は卵黄レシチンのみを用いて作ったリポソーム、線
■は卵黄レシチンとコレステロールを３：／の割合で用
りて作ったリポソーム、線■は本実施例のリポソームを
示す。■、■、■ともに平均粒径Ｏ０λｒμｍのフラク
ションを用いて測定したものである。第１図から本発明
の化合物を用いることによシ、リポソーム内容物の漏出
が少なくなることがわかる。

本発明の化合物の種類や量を変えても同様の傾向が得ら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種のリポソームからの内容物（カルボキシフ
ルオレセイン）の漏出度の時間変化を示したグー）７で
ある。線■は卵黄レシチンのみを用いたリポソーム、線■は卵
黄レシチンとコレステロールを３＝７の割合で用いて作
成したリポソーム、線■は実施例１のリポソーム、を表わす。特許出願人　富士写真フィルム株式会社手続補正書＼・− 昭和Ａ３年ｆ月・７７日

Claims

【特許請求の範囲】式〔１〕で表わされる２，４−ビス（ポリエチレングリ
コール）−６−アミノ−ｓ−トリアジン誘導体と脂質を
用いることを特徴とするリポソームの製造方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １式中、ｎは、６〜２００の整数を表わしＲ＿１、Ｒ＿２
は水素原子、アルキル基、アルキルカルボニル基、アル
キルスルホニル基を表わす。Ｒ＿３、Ｒ＿４は水素原子
又はメチル基を表わす。ただし、式１のアミノ基は酵素
、あるいは蛋白質に含まれるアミノ残基を意味しない。