WO2006101201A1 - 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム - Google Patents

目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム Download PDF

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WO2006101201A1
WO2006101201A1 PCT/JP2006/305994 JP2006305994W WO2006101201A1 WO 2006101201 A1 WO2006101201 A1 WO 2006101201A1 JP 2006305994 W JP2006305994 W JP 2006305994W WO 2006101201 A1 WO2006101201 A1 WO 2006101201A1
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membrane
lipid
ribosome
lipid membrane
bilayer
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PCT/JP2006/305994
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kentaro Kogure
Takashi Nakamura
Hidetaka Akita
Hideyoshi Harashima
Shiroh Futaki
Original Assignee
National University Corporation Hokkaido University
Kyoto University
Shionogi & Co., Ltd.
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • Ribosome capable of efficiently delivering the target substance into the nucleus
  • the present invention relates to non-viral vectors, particularly ribosomes.
  • viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses have been developed as vectors for introducing a target gene into target cells.
  • viral vectors have problems such as difficulty in mass production, antigenicity, and toxicity
  • non-viral vectors for example, ribosome vectors
  • non-viral vectors into which various functional molecules have been introduced have been actively developed.
  • ribosomes in which a hydrophilic polymer for example, polyalkylene glycol such as polyethylene glycol
  • Patent Document 1 Patent Document 2, Patent Document 3, and Patent Document 4
  • the directionality of the ribosome to tumor cells can be improved by improving the retention of the ribosome in blood.
  • Ribosomes have been developed (see Patent Document 3 and Patent Document 4). This ribosome can improve the efficiency of endocytosis of ribosome.
  • Non-patent Document 1 a liposome in which stearyl-octaarginine is introduced on the outer surface of a ribosome membrane has been developed. According to this ribosome, the intracellular delivery efficiency of the target substance encapsulated in the ribosome can be improved.
  • Patent Document 1 JP-A-1-249717
  • Patent Document 2 JP-A-2-149512
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 4-346918
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-10481
  • Non-Patent Document l Kogure, K. et al., “Journal of Controlled Release”, 2004, No. 98, ⁇ .3 17-323
  • the present inventor has a target cell in the case where the target cell is a non-dividing cell such as a rod-shaped cell.
  • the efficiency of delivery of the target substance into the nucleus is significantly reduced compared to the case where is a mitotic cell (see Reference Example 1). ).
  • the present invention provides a non-viral vector that can efficiently deliver a target substance into the nucleus of a target cell even when the target cell is a non-dividing cell such as a rod-shaped cell.
  • the purpose is to provide.
  • the present invention provides the following bilayer ribosomes (1) to (11).
  • a bilayer ribosome having a first lipid membrane and a second lipid membrane in order from the outside
  • the bilayer ribosome wherein the first lipid membrane has membrane fusion ability and the second lipid membrane has a nuclear translocation peptide on its surface.
  • the amount of membrane-fusible lipid contained in the first lipid membrane is 50% (molar ratio) or more of the total amount of lipid contained in the first lipid membrane.
  • Sheet ribosome is 50% (molar ratio) or more of the total amount of lipid contained in the first lipid membrane.
  • the target substance to be delivered into the nucleus of the target cell is encapsulated inside the second lipid membrane.
  • the bilayer ribosome according to any one of (1) to (4).
  • the bilayer ribosome according to (5) which is a vector for delivering the target substance into the nucleus of the target cell.
  • a plurality of negatively charged SUV-type ribosomes which contain a fusogenic lipid as a constituent of the lipid membrane and have a nuclear translocation peptide on the surface of the lipid membrane, are brought into contact with the positively charged particles.
  • the bilayer ribosome according to any one of (1) to (7), obtained by membrane fusion of negatively charged SUV ribosomes electrostatically bound to particles.
  • a plurality of positively charged SUV-type ribosomes that contain a fusogenic lipid as a constituent component of the lipid membrane and have a nuclear translocation peptide on the surface of the lipid membrane are brought into contact with negatively charged particles, and are negatively charged.
  • a bilayer ribosome capable of efficiently delivering a target substance into the nucleus of a target cell even when the target cell is a non-dividing cell such as a rod-shaped cell. It is done.
  • FIG. 1 is a diagram showing the measurement results of luciferase gene expression activity (RLU / mg protein).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confocal laser microscope observation.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of confocal laser microscope observation.
  • FIG. 4 (a) is a diagram showing the measurement results of the DNA content in each fraction, and (b) is a diagram showing the measurement results of the rhodamine content in each fraction.
  • FIG. 5 (a) is a diagram showing the results of electron microscopic observation of the bilayer ribosome of the present invention, (b) FIG. 3 is a schematic diagram of the bilayer ribosome of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the measurement results of CTL activity.
  • FIG. 7 is a graph showing measurement results of luciferase gene expression activity (RLU / mg protein).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of confocal laser microscope observation.
  • the ribosome of the present invention is a bilayer ribosome having a first lipid membrane and a second lipid membrane in order from the outside.
  • the size of the ribosome of the present invention is not particularly limited, but usually a diameter of 50 to 5
  • the diameter is OOnm, preferably 100 to 300 nm, more preferably 100 to 200 nm.
  • the first and second lipid membranes each have a lipid bilayer structure.
  • the constituent components of the first and second lipid membranes are not particularly limited as long as they do not inhibit the formation of the lipid bilayer structure.
  • lipids, membrane stabilizers, antioxidants, charged substances, membranes Examples include proteins.
  • Lipid is an essential component of the lipid membrane, and the amount of lipid contained in each lipid membrane is usually 30 to 100% (molar ratio), preferably 50% of the total amount of substances contained in each lipid membrane. ⁇ 100% (molar ratio), more preferably 70 ⁇ : LOO% (molar ratio).
  • lipids include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like.
  • Examples of the phospholipid include phosphatidylcholine (for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine), phosphatidylglycerol (for example, Leoyl phosphatidyl glycerol, dilauroyl phosphatidyl glycerol, dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol, etc.), phosphatidyl ethanolamine (eg dioleoyl phosphatidyl ethanolamine) Dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, Palmitoyl
  • glycolipids examples include glyce mouth glycolipids (for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalatatosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), sphingoglycolipids (for example, galactosyl celeb mouth side, ratato Sil celeb mouth side, Gandario side) and the like.
  • glyce mouth glycolipids for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalatatosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride
  • sphingoglycolipids for example, galactosyl celeb mouth side, ratato Sil celeb mouth side, Gandario side
  • sterols examples include animal-derived sterols (eg, cholesterol, cholesterol cholesterol succinic acid, lanostero monore, dihydrolanostero monore, desmostero monore, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterols) (For example, stigmasterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol), sterols derived from microorganisms (for example, timosterol, ergosterol) and the like.
  • animal-derived sterols eg, cholesterol, cholesterol cholesterol succinic acid, lanostero monore, dihydrolanostero monore, desmostero monore, dihydrocholesterol
  • plant-derived sterols e.g, stigmasterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol
  • sterols derived from microorganisms for example, timosterol, ergosterol
  • saturated or unsaturated fatty acid examples include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • Lipids are classified into neutral lipids, cationic lipids (basic lipids), and eron lipids (acidic lipids).
  • neutral lipids include diacylphosphatidylcholine and diacylphosphatidylethanol.
  • cationic lipids such as dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC), N- (2,3-dioleoyloxy), and the like.
  • DODAC dioctadecyldimethylammonium chloride
  • the membrane stabilizer is an optional component of the lipid membrane that can be contained to physically or chemically stabilize the lipid membrane or to regulate the fluidity of the lipid membrane.
  • the amount of membrane stabilizer contained in each lipid membrane is usually 10 to 50% (molar ratio), preferably 20 to 50% (molar ratio) of the total amount of substances contained in each lipid membrane. Preferably, it is 30 to 50% (molar ratio).
  • Examples of the film stabilizer include sterol, glycerin or fatty acid ester thereof.
  • Specific examples of the sterol are the same as those described above, and examples of the glycerin fatty acid ester include triolein and trioctanoin.
  • the antioxidant is an optional component of the lipid membrane that can be contained to prevent lipid membrane acidification.
  • the amount of the antioxidant contained in each lipid membrane is The total amount of substances contained in the lipid membrane is usually 5-30% (molar ratio), preferably 10-30% (molar ratio), more preferably 20-30% (molar ratio).
  • antioxidants examples include tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene and the like.
  • the charged substance is an optional component of the lipid film that can be contained to impart a positive charge or negative charge to the lipid film.
  • the amount of the charged substance contained in each lipid film is The total amount of substances contained in the lipid membrane is usually 5 to 30% (molar ratio), preferably 10 to 20% (molar ratio), more preferably 10 to 15% (molar ratio).
  • Examples of the charged substance imparting a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine, oleylamine, and saturated oils such as dioleoyltrimethylammonium propane. Examples thereof include unsaturated cationic synthetic lipids, and examples of the charged substance imparting a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • a membrane protein is an optional component of a lipid membrane that can be contained to maintain the structure of the lipid membrane or to impart functionality to the lipid membrane, and is contained in each lipid membrane.
  • the amount of membrane protein produced is usually 0.1-2% (molar ratio), preferably 0.5-2% (molar ratio), more preferably 1-2% of the total amount of substances contained in each lipid membrane. (Molar ratio).
  • membrane proteins include membrane surface proteins, membrane integral proteins, and the like.
  • the first lipid membrane has membrane fusion ability.
  • the lipid membrane capable of membrane fusion with the first lipid membrane is not particularly limited as long as it has a lipid bilayer structure.
  • Examples of lipid membranes capable of membrane fusion with the first lipid membrane include biological membranes such as cell membranes and endosomal membranes.
  • the method for imparting membrane fusion ability to the first lipid membrane is not particularly limited.
  • membrane fusion ability can be imparted to the first lipid membrane by incorporating a membrane-fusible lipid as a component of the first lipid membrane.
  • membrane-fusible lipids include neutral lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine; cationic lipids such as cholesterol succinic acid and cardiolipin (acidic lipids); and cationic lipids such as dialkylammonium bromide ( Basic lipids).
  • pH neutral lipids can exhibit fusogenic ability, usually from 6.0 to 7 5, preferably from 6.0 to 7 0, ⁇ -.. P on-lipids can exhibit fusogenic ability H is usually 5.0 to 6.5, preferably 5.5 to 6.0, and the pH at which the cationic lipid can exert membrane fusion ability is usually 7.5 to 8.5, preferably 8. 0 to 8.5.
  • a cationic lipid capable of exhibiting membrane fusion ability when placed in an acidic environment and a cationic lipid capable of exhibiting membrane fusion ability when placed in an alkaline environment are also referred to as pH-sensitive lipids.
  • the amount of the fusogenic lipid contained in the first lipid membrane is not particularly limited as long as membrane fusion ability can be imparted to the first lipid membrane.
  • the amount of the fusogenic lipid contained in the first lipid membrane is usually 50 to 100% (molar ratio), preferably 60 to 60% of the total lipid content contained in the first lipid membrane. 100% (molar ratio), more preferably 70 to: L00% (molar ratio).
  • the first lipid membrane can efficiently fuse with a biological membrane such as a cell membrane or an endosomal membrane, so the ribosome of the present invention. Can be efficiently introduced into cells.
  • the ratio of cation lipids is 5 to 50% (molar ratio). 10 to 30% (molar ratio) More preferably.
  • the first lipid membrane can efficiently fuse with a biological membrane such as a cell membrane or an endosomal membrane when the ribosome of the present invention is placed in an acidic environment. Can do.
  • the fusogenic lipid other than the key lipid contained in the first lipid membrane may be either a neutral lipid or a cationic lipid, or both.
  • membrane fusion ability can be imparted to the first lipid membrane.
  • the membrane fusion molecule that modifies the surface of the first lipid membrane include succi-louis polyglycidol, a membrane fusion peptide (eg, H2 peptide, GM225.1), and the like.
  • the first lipid membrane may contain, as its constituent components, a lipid or lipid derivative having a blood retention function, a temperature change sensitivity function, and the like.
  • a blood retention function to the liposome of the present invention
  • the retention of the ribosome of the present invention in blood is improved, and the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen is reduced. Is possible.
  • a temperature change sensitivity function to the ribosome of the present invention, it is possible to enhance the releasability of the target substance encapsulated in the ribosome of the present invention.
  • Examples of the blood-retaining lipid or lipid derivative capable of imparting a blood-retaining function include, for example, glycophorin, gandarioside GM1, phosphatidylinositol, gandarioside GM3, glucuronic acid derivative, glutamic acid derivative, polyglycerin phosphorus Lipid derivatives, N- ⁇ Carbon-methoxypolyethyleneglycol-2000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycephine-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ Carbo-methoxypolyethyleneglycol-5000 ⁇ 1,2-dipalmitoyl-sn-glyce mouth-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbole-methoxy Cypolyethylene glycol- 750 ⁇ -l, 2-distearoyl-sn-glyce mouth- 3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbol-methoxypolyethylene glycol-2000 ⁇ -1,2-distearoyl- sn-g
  • the second lipid membrane has a nuclear translocation peptide on its surface.
  • the nuclear transmissible peptide is not particularly limited as long as it has the ability to translocate from the cytoplasm into the nucleus, and examples thereof include a peptide having a nuclear translocation signal.
  • a nuclear translocation signal is a specific amino acid sequence possessed by a protein or peptide that is selectively transported into the nucleus.
  • a simian virus 40-derived nuclear translocation signal (SV40—NLS) (SEQ ID NO: 2), Adenovirus-derived core peptide mu (SEQ ID NO: 3), Simian virus 40 large T (Large T) antigen-derived nuclear translocation signal (SEQ ID NO: 4), repeated sequences thereof (for example, SEQ ID NO: 1 (simian virus 40 large T And a repeat sequence of an antigen-derived nuclear translocation signal)).
  • the nuclear transmissible peptide may be a natural peptide having a nuclear translocation signal or a mutant peptide fused with a nuclear translocation signal.
  • the total number of amino acid residues constituting the nuclear translocation peptide is not particularly limited, but is usually 5 to 30, preferably 5 to 25, and more preferably 5 to 20.
  • the amount of the nuclear migratory peptide present on the surface of the second lipid membrane is not particularly limited. Force Usually 1 to 5% (molar ratio) of the total amount of substances contained in the second lipid membrane, preferably Is 1 to 3% (molar ratio), more preferably 1 to 2% (molar ratio). When the amount of the nuclear translocating peptide present on the surface of the second lipid membrane is within the above range, the target substance encapsulated in the ribosome of the present invention can be efficiently delivered into the nucleus.
  • the nuclear translocation peptide As long as the nuclear translocation peptide is present on the outer surface of the second lipid membrane, it may be present on the inner surface of the second lipid membrane. Of the surfaces of the second lipid membrane, the surface on the first lipid membrane side is the outer surface, and the surface on the opposite side is the inner surface.
  • the nuclear translocation peptide is l may be present on the outer surface and the Z or inner surface of the lipid membrane.
  • Examples of the mode of presence of the nuclear migratory peptide on the surface of the second lipid membrane include, for example, a functional group or a compound (for example, a hydrophobic group, a hydrophobic compound, etc.) in which the nuclear migratory peptide can be a constituent of the lipid membrane. And the functional group or compound is inserted into the second lipid membrane, and the nuclear translocation peptide is exposed from the second lipid membrane. In this state, as long as the nuclear translocating peptide can exhibit cytoplasmic force and ability to move into the nucleus, the entire nuclear translocating peptide may be exposed from the second lipid membrane. Part of it is exposed from the second lipid membrane.
  • a functional group or a compound for example, a hydrophobic group, a hydrophobic compound, etc.
  • the functional group or compound that can be a component of the lipid membrane that modifies the nuclear translocation peptide is not particularly limited.
  • a saturated or unsaturated fatty acid group such as a stearyl group; a cholesterol group or a derivative thereof; Phospholipids, glycolipids or sterols; long-chain aliphatic alcohols (eg, phosphatidylethanolamine, cholesterol, etc.); polyoxypropylene alkyls; glycerin fatty acid esters, etc.
  • fatty acids having 10 to 20 carbon atoms A group eg, palmitoyl group, oleyl group, stearyl group, arachidoyl group, etc.
  • the method for producing the ribosome of the present invention is not particularly limited.
  • the ribosome of the present invention can be produced by bringing negatively charged SUV-type ribosomes into contact with positively charged particles and membrane-fusion of negatively charged SUV-type ribosomes electrostatically bound to the positively charged particles. it can.
  • a plurality of positively charged SUV-type liposomes that contain a membrane-fusible lipid as a component of the lipid membrane and have a nuclear translocation peptide on the surface of the lipid membrane are brought into contact with the negatively charged particles.
  • the ribosome of the present invention can be produced by membrane fusion of positively charged SUV-type ribosomes electrostatically bound to the charged particles.
  • the zeta potential of the positively chargeable particles is not particularly limited as long as it is positive, but is usually 10 to 60 mV, preferably 20 to 50 mV, and more preferably 20 to 40 mV.
  • Negatively charging property The zeta potential of the particles is not particularly limited as long as it is negative, but is usually 10 to 1-60 mV, preferably 1 20 to 1 50 mV, more preferably 1 20 to 1 40 mV.
  • Positive charge When the zeta potential of the conductive particles and the negatively charged particles is in the above range, the ribosome of the present invention can be produced efficiently.
  • the zeta potential measurement conditions are not particularly limited, but the temperature conditions are usually 25 ° C.
  • the particle size of the positively charged particles and the negatively charged particles is not particularly limited, but the lower limit of the particle size is preferably 50 nm, more preferably 70 nm, and the upper limit of the particle size is It is preferably 500 nm, more preferably 200 nm.
  • the particle size of the positively charged particles and the negatively charged particles is in the above range, the ribosome of the present invention can be produced efficiently.
  • the positively chargeable particles may contain a neutral substance and a Z or ionic substance in addition to the cationic substance as long as it is positively charged as a whole.
  • the negatively chargeable particles may contain a neutral substance and Z or a cationic substance in addition to the eron substance as long as it is negatively charged as a whole.
  • the positively or negatively charged particles for example, an aggregate of a target substance to be delivered into the nucleus of a target cell can be used. If aggregates of the target substance are used as positively or negatively charged particles, a bilayer liposome in which the target substance is enclosed inside the second lipid membrane can be produced.
  • the aggregate of the target substance may be composed only of the target substance, or contains a substance other than the target substance (for example, a carrier that holds the target substance).
  • an aggregate of the target substance is prepared by electrostatically binding the target substance and the ionic substance to form a composite.
  • an aggregate of the target substance can be prepared by electrostatically binding the target substance and the cationic substance to form a composite. If the target substance is not negatively or positively charged, the target substance and the cationic substance are combined in an appropriate manner (for example, physical adsorption, hydrophobic bond, chemical bond, etc.) to form a complex. Thus, an aggregate of the target substance can be prepared.
  • an aggregate of the target substance that is positively or negatively charged as a whole can be prepared by adjusting the mixing ratio of the target substance and the cationic substance or the ionic substance.
  • the target substance is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids, peptides, proteins, drugs, sugars, and complexes thereof.
  • Nucleic acid includes DNA or RNA. And analogs or derivatives thereof (eg, peptide nucleic acids (PNA), phosphorothioate DNA, etc.).
  • the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be linear or circular! / Or shifted.
  • an aggregate of nucleic acids can be prepared by electrostatically binding the nucleic acid and the cationic substance to form a complex.
  • an aggregate of nucleic acids that are positively or negatively charged as a whole can be prepared.
  • the cationic substance used in preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having a cationic group in the molecule.
  • the cationic substance include cationic lipids (for example, manufactured by Lipofectamine dnvitrogen); polymers having cationic groups; polylysine, polyarginine, homopolymers of basic amino acids such as lysine and arginine copolymers, and the like.
  • Copolymers or copolymers or derivatives thereof eg stearyl derivatives
  • polycationic polymers such as polyethyleneimine, poly (arylamine), poly (diallyldimethylammonium chloride), darcosamine
  • protamine or derivatives thereof examples thereof include protamine sulfate), among which protamine or a derivative thereof is particularly preferable.
  • Aggregates of the target substance prepared using protamine or a derivative thereof have a very soft structure, so that the aggregate of the target substance can efficiently pass through the nuclear membrane pores.
  • the number of cationic groups possessed by the cationic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
  • the cationic group is not particularly limited as long as it can be positively charged.
  • an amino group For example, an amino group; a monoalkylamino group such as a methylamino group or an ethylamino group; a dialkylamino group such as a dimethylamino group or a jetylamino group; an imino group; Groups and the like.
  • the anionic substance used in preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having an anionic group in the molecule.
  • the ionic substance include ionic lipids, polymers having ionic groups, homopolymers or copolymers of acidic amino acids such as polyaspartic acid or derivatives thereof, xanthan gum, strength Polyone-on polymers such as noreboxibininorepolymer, canoleboxymethinoresenorelose polystyrene sulphonate, polysaccharide and carrageenan can be used.
  • the number of arion groups possessed by the eron substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
  • the terionic group is not particularly limited as long as it can be negatively charged, for example, a functional group having a terminal carboxyl group (for example, a succinic acid residue, a malonic acid residue, etc.), a phosphoric acid group, a sulfuric acid group, etc. Is mentioned.
  • the SUV (small unilamellar vesicle) type ribosome is a single membrane ribosome having a particle size (diameter) of lOOnm or less.
  • the particle size (diameter) of the SUV-type ribosome is not particularly limited as long as it is lOOnm or less, but is usually 30 to: LOOnm, preferably 30 to 80 nm, more preferably 30 to 60 nm.
  • Multilamellar ribosomes (MLV) and single-membrane ribosomes other than SUV eg, LUV (large unila mellar vesicle), GUV (giant unilamellar vesicle), etc.
  • LUV large unila mellar vesicle
  • GUV giant unilamellar vesicle
  • lOOnm Lipid membranes having a particle size of lOOnm or more are considered as planar membranes), and aggregation of ribosomes with low lipid membrane curvature and surface energy is unlikely to occur.
  • SUV-type ribosomes have a particle diameter of less than lOOnm, so that aggregation of ribosomes with large lipid membrane curvature and surface energy tends to occur. Therefore, SUV-type ribosomes containing a membrane-fusible lipid as a component of the lipid membrane can be efficiently membrane-fused.
  • An SUV-type ribosome containing a membrane-fusible lipid as a component of the lipid membrane and having a nuclear translocation peptide on the surface of the lipid membrane can be produced, for example, as follows.
  • the components of the lipid membrane (including membrane-fusible lipids) and the nuclear migratory peptide modified with a functional group or compound that can be a component of the lipid membrane are dissolved in an organic solvent, and then the organic solvent is evaporated. A lipid membrane is obtained by removing.
  • examples of the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, and aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene. ; Lower alcohols such as methanol and ethanol; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; ketones such as acetone and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the lipid membrane is hydrated, and multilamellar ribosomes are prepared by stirring or ultrasonic treatment using an ultrasonic bath.
  • the multilamellar ribosome is further sonicated with a probe-type ultrasonic device to prepare SUV-type ribosomes, which are small single-membrane ribosomes.
  • a functional group or compound that can be a component of the lipid membrane is inserted into the lipid membrane, and an SUV-type ribosome in which the nuclear translocating peptide is exposed from the surface of the lipid membrane can be prepared.
  • a nuclear translocation peptide modified with a functional group or compound that can be a component of the lipid membrane in the outer solution thereof As a result, functional groups or compounds that can be constituents of the lipid membrane are inserted into the lipid membrane, and an SUV-type liposome in which the nuclear translocation peptide is exposed from the surface of the lipid membrane can be prepared.
  • lipid membrane constituents of positively charged SUV-type ribosomes are adjusted so that the SUV liposomes are positively charged as a whole, and the type of lipid membrane constituents of negatively charged SUV-type ribosomes And the amount is adjusted so that the SUV-type ribosome is negatively charged as a whole.
  • lipid membrane constituents that impart a positive charge include cationic lipids, force thione membrane stabilizers, etc.
  • lipid membrane constituents that impart a negative charge include aon lipids
  • examples of such a film include a film-on film stabilizer.
  • Positively charged SUV-type liposomes as long as they are positively charged as a whole, in addition to lipid membrane components that impart positive charges, lipid membrane components that impart negative charges and z or neutral lipid membrane components
  • the negatively chargeable SUV ribosome which may contain a component, as long as it is negatively charged as a whole, in addition to a lipid membrane component that imparts a negative charge, a lipid membrane component that imparts a positive charge and Z or May contain neutral lipid membrane components.
  • the content of the cationic lipid is usually 5-30% (molar ratio), preferably 10- It is 25% (molar ratio), more preferably 10 to 20% (molar ratio).
  • the content of the cation lipid is usually 5-30% (molar ratio) of the total lipid content. The content is preferably 10 to 25% (molar ratio), more preferably 10 to 20% (molar ratio).
  • the type and amount of the fusogenic lipid contained in the lipid membrane in the SUV-type ribosome are the same as the kind and amount of the fusogenic lipid contained in the second lipid membrane in the ribosome of the present invention.
  • nuclear translocation signals present on the lipid membrane surface The type and amount are the same as the type and amount of the nuclear translocation signal present on the surface of the second lipid membrane in the ribosome of the present invention.
  • the zeta potential of the SUV-type ribosome is not particularly limited as long as it is positive, but it is usually 10 to 60 mV, preferably 20 to 50 mV, more preferably 20 to 30 mV.
  • the zeta potential of the SUV-type ribosome is not particularly limited as long as it is negative, but is usually from 1 to 10 to 60 mV, preferably from 1 to 20 to 50 mV, and more preferably from 1 to 20 to 30 mV.
  • the zeta potential measurement conditions are not particularly limited, but the temperature conditions are usually 25 ° C.
  • the conditions for contacting the positively or negatively charged particles with the negatively or positively charged SUV ribosome are not particularly limited, but the temperature is usually 10 to 40 ° C, preferably It is 20-30 ° C, the pH is usually 6.5-8.0, preferably 7.0-7.5, and the time is usually 1-20 minutes, preferably 5-10 minutes.
  • the solvent used for the contact is not particularly limited, and for example, HEPES buffer, physiological saline, sucrose solution, etc. can be used.
  • the amount of negatively charged or positively charged SUV-type ribosomes dispersed in a solvent is usually an excessive amount with respect to positively charged or negatively charged particles, for example, for inclusion of positively charged or negatively charged particles. 2 to 4 times the amount of negatively charged or positively charged SUV-type liposomes, which is the minimum theoretically required.
  • a negatively charged SUV ribosome When a negatively charged SUV ribosome is brought into contact with a positively charged particle, the negatively charged SUV liposome is electrostatically bound to the positively charged particle and electrostatically bound to the positively charged particle.
  • Negatively charged SUV-type ribosomes fuse with each other, and positively charged particles are covered with two lipid membranes.
  • positively charged SUV ribosomes when positively charged SUV ribosomes are brought into contact with negatively charged particles, positively charged SUV ribosomes are electrostatically bound to negatively charged particles and positively bound to negatively charged particles.
  • Chargeable SUV-type ribosomes fuse with each other, and negatively charged particles are covered with two lipid membranes.
  • the first and second lipid membranes have their constituents. It contains a membrane-fusible lipid as a component and has a nuclear translocation signal on its surface.
  • bilayer ribosomes in which the aggregate of the target substance is encapsulated inside the second lipid membrane are produced.
  • the proportion of neutral lipids is 50% (molar ratio) or higher, preferably 70% (molar ratio) or higher.
  • the bilayer ribosome in which the target substance is encapsulated inside the second lipid membrane can be used as a vector for delivering the target substance into the nucleus of the target cell.
  • the target cell may be either a dividing cell or a non-dividing cell, but the bilayer ribosome in which the target substance is encapsulated inside the second lipid membrane is a non-dividing cell. It is particularly useful in some cases.
  • mitotic cells include NIH3T3 cells, HeLa cells, and COS7 cells.
  • non-dividing cells include rod-shaped cells and brain neural cells.
  • the ribosome of the present invention can be transferred into a target cell via endocytosis.
  • the ribosome of the present invention that has migrated into the target cell via endocytosis is taken into the endosome, but the endosomal force can also escape by membrane fusion between the endosomal membrane and the first lipid membrane. it can.
  • the endosome is acidic (pH 5.5 to 6.5) when the ratio of arion lipids is 5 to 50% (molar ratio). By changing, the first lipid membrane and the endosomal membrane can be efficiently fused.
  • the first lipid membrane is lost, but the second lipid membrane is retained.
  • the nuclear translocation peptide on the surface of the second lipid membrane of the liposome that also escaped the endosomal force forms a nuclear pore targeting complex with the importin, and is transported into the nucleus.
  • the second lipid membrane is broken, and the target substance enclosed inside the second lipid membrane is released and delivered to the nucleus.
  • the nuclear delivery efficiency of the target substance is improved. Eyes prepared using protamine or its derivatives When the aggregate of the target substance is encapsulated, the aggregate of the target substance can efficiently pass through the nuclear membrane pores, so that the intranuclear delivery efficiency of the target substance is particularly improved.
  • the ribosome of the present invention can be transferred into the target cell via membrane fusion between the first lipid membrane and the cell membrane.
  • the membrane-fusible lipids contained in the first lipid membrane when the ratio of the phospholipid is 5 to 50% (molar ratio), the ribosome of the present invention and the target cell are bound under acidic conditions. By bringing them into contact, the first lipid membrane and the cell membrane can be efficiently membrane-fused. In the ribosome that has migrated into the target cell, the first lipid membrane is lost, but the second lipid membrane is retained.
  • the nuclear translocation peptide possessed by the ribosome that has migrated into the target cell on the surface of the second lipid membrane forms a nuclear pore targeting complex together with importins oc and ⁇ , and is transported into the nucleus.
  • the second lipid membrane is broken, and the target substance encapsulated inside the second lipid membrane is released and delivered into the nucleus.
  • the efficiency of delivery of the target substance into the nucleus is improved.
  • aggregates of the target substance prepared using protamine or its derivatives are encapsulated, the aggregates of the target substance can efficiently pass through the nuclear membrane pores. Especially improved.
  • the biological species from which the cell to which the target substance is delivered is derived is not particularly limited, and may be any animal, plant, microorganism, etc., but is preferably a mammal that is preferably an animal. More preferably it is. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, hidges, sheep, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs and the like.
  • the type of cell to which the target substance is delivered is not particularly limited, and examples thereof include somatic cells, germ cells, stem cells, or cultured cells thereof.
  • the ribosome of the present invention can be formulated according to a conventional method and used as a pharmaceutical composition.
  • the ribosome of the present invention can be used, for example, in the state of a dispersion.
  • a dispersion solvent for example, a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer solution, queen buffer solution, and acetate buffer solution can be used.
  • additives such as saccharides, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, rhodium regulators, and hydration accelerators may be added to the dispersion.
  • the ribosome of the present invention can be used both in vivo and in vitro.
  • examples of the route of administration include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration, and the dosage and frequency of administration are the type and amount of the target substance encapsulated in the ribosome. It can adjust suitably according to etc.
  • plasmid DNA various vectors containing plasmid DNA were prepared using luciferase gene expression plasmid pcDNA3.1 (+) luc.
  • the plasmid pcDNA3.l (+) luc is a plasmid DNA having a total length of about 7 kbp containing the CMV promoter and the luciferase gene linked downstream thereof.
  • the luciferase gene was inserted into plasmid pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).
  • Vector 1 (conventional single membrane ribosome)
  • DOPE dioleoyl phosphatidyl et hanolamine
  • CHEMS cholesteryl hemisuccinate
  • a lipid membrane was obtained by evaporating and removing the black mouth form.
  • Concentrated plasmid DNA suspension 0.25 mL (aggregated plasmid DNA concentration: 0.04 mg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)) was added to the lipid membrane (137.5 ⁇ mol) and water was added. By mixing, the condensate plasmid was electrostatically bound to the lipid membrane surface.
  • Vector 1 a single membrane ribosome in which plasmid DNA was encapsulated was prepared.
  • Stearyl-ized octaarginine solution 0.09 mL (stearyl-ized octaarginine concentration: 0.1 mg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)), plasmid DNA solution 0.18 mL (plasmid DNA concentration: 0.1. lmg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)) was added dropwise under vortex conditions to cause the stearylated octaarginine to interact with the plasmid DNA electrostatically. 2)) was prepared.
  • Stearyl-ized octaarginine solution 0.09 mL (stearyl-ized octaarginine concentration: 0.1 mg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)), plasmid DNA solution 0.18 mL (plasmid DNA concentration: 0.1. lmg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)) was added dropwise under vortex conditions to cause the stearylated octaarginine and the plasmid DNA to interact electrostatically to condense the plasmid DNA.
  • the aggregated plasmid DNA thus prepared was coated with a lipid membrane in the same manner as in (1) above to prepare a single membrane ribosome (hereinafter referred to as “Vector 3”) in which the plasmid DNA was encapsulated.
  • Vector 3 a single membrane ribosome
  • the condensed plasmid DNA was coated with the lipid membrane in the same manner as in (1) above to prepare plasmid DNA-encapsulated ribosomes.
  • stearyl nucleophilic peptide N-terminal stearyl nucleated peptide (SEQ ID NO: 1) solution 0.05 mL (stearyl nucleophilic peptide concentration: lmgZmL, solvent: By adding 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)) and incubating at room temperature for a certain period of time, stearyl-octaarginine was distributed on the surface of the ribosome. mole 0/0).
  • vector 4" (conventional single membrane ribosome)
  • Stearyl-ized nuclear translocation peptide N-terminally stealylated nuclear translocation peptide (SEQ ID NO: 1)) solution 0.09 mL (stearyl dinuclear translocation peptide concentration: 0.1 mg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer ( To pH7.4)), 0.18mL of plasmid DNA solution (plasmid DNA concentration: 0.1mg / mL, solvent: 10mM HEPES buffer (pH7.4)) was added dropwise under vortex conditions to transfer stearylated nuclei. The agglutinated plasmid DNA was prepared by electrostatic interaction between the sex peptide and the plasmid DNA.
  • the aggregated plasmid DNA thus prepared was coated with a lipid membrane in the same manner as in (1) above to prepare a single membrane ribosome (hereinafter referred to as “Vector 5”) in which the plasmid DNA was encapsulated.
  • Vector 5 a single membrane ribosome
  • Ribosomes were prepared by hydrating the lipid membrane with 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) and then sonicating in an ultrasonic bath. By adding 0.125 mL of plasmid DNA solution (plasmid DNA concentration: 0.1 mg / mL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)) to the ribosome suspension (lipid amount: 137.5 ⁇ mol).
  • Vector 6 A single membrane ribosome complexed with plasmid DNA
  • Vector 7 (conventional single membrane ribosome)
  • the condensed plasmid DNA was coated with the lipid membrane in the same manner as in (1) above to prepare plasmid DNA-encapsulated liposomes.
  • Steadylyactor arginine solution 0.12 mL (stearyl lyoctaarginine concentration: lmgZmL, solvent: 10 mM HEPES buffer (pH 7.4)) is added to the plasmid DNA-encapsulated ribosome suspension, and constant at room temperature.
  • Ribosome 8 (the bilayer ribosome of the present invention)
  • stearylated nuclear transfer peptide nuclear transfer peptide with N-terminal stearylation (SEQ ID NO: 1)
  • addition amount fat 2 mol% of the mass
  • desiccator for 1 hour and dried.
  • the obtained lipid membrane (275 ⁇ mol) was hydrated with 0.25 mL of HEP ES buffer previously warmed to 25 ° C., and the lipid membrane was peeled off by sonication in an ultrasonic bath.
  • SUV-type ribosomes containing a membrane-fusible lipid in the lipid membrane and a nuclear translocation peptide on the lipid membrane surface were prepared by sonicating with a probe type ultrasonic device for 10 minutes.
  • the SUV ribosome thus prepared has a particle size of about 58 nm and a zeta potential of about 2 mV (this measurement is likely to be inaccurate. If there is no nuclear translocation peptide on the lipid membrane surface, the SUV type Since the ribosome has a zeta potential of about 4 OmV, the SUV-type liposome has a zeta potential of about -10 to -20 mV when there is a nuclear translocation peptide on the lipid membrane surface. .
  • a plurality of SUV-type ribosomes are electrostatically bound to the aggregated plasmid DNA, the SUV-type ribosomes are fused with each other, and the aggregated plasmid is covered with a lipid membrane.
  • a ribosome encapsulated in is prepared.
  • the thus prepared plasmid DNA-encapsulated ribosome (hereinafter referred to as “ribosome 8”) had a particle size of about 160 nm and a zeta potential of about 4 mV.
  • ribosome 9 A plasmid DNA-encapsulated ribosome (hereinafter referred to as “ribosome 9” t) was prepared in the same manner as in (8) above, except that no stearyl nucleophilic peptide was added to the lipid mixture.
  • Bone marrow precursor cells of C57BLZ6 male mice were treated with GM—CSF (granulocyte macrophage The cells were cultured for 6 to 7 days in the presence of a single stimulating factor to induce immature rod cells. Inoculate immature rod cells at a density of 2 ⁇ 10 5 cells Zwell on a 48-well plate, add 0.8 / z gDNA equivalent vector, and add 0.2 mL of serum-free medium (RPMI1640 medium) or Weakly acidic buffer (10 mM HEPES / 2.
  • GM—CSF granulocyte macrophage The cells were cultured for 6 to 7 days in the presence of a single stimulating factor to induce immature rod cells. Inoculate immature rod cells at a density of 2 ⁇ 10 5 cells Zwell on a 48-well plate, add 0.8 / z gDNA equivalent vector, and add 0.2 mL of serum-free medium (RPMI1640 medium) or Weakly acidic buffer (10 mM HEPES / 2.
  • Example 1 Vector 8 was used as the vector, and a weakly acidic buffer was used for the culture. In Example 2, vector 8 was used as the vector, and a serum-free medium was used for the culture. In Example 1, vector 8 is introduced into cells by membrane fusion of cholesterol succinic acid with the cell membrane. In Example 2, vector 8 is introduced into cells by endocytosis. .
  • Vector 1 was used as the vector, and a weakly acidic buffer was used for the culture.
  • vector 1 was used as a vector, and a weakly acidic buffer solution to which lipopolysaccharide (LPS) was added was used for culture.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Comparative Example 3 vector 1 was used as the vector, and a serum-free medium was used for the culture.
  • Comparative Example 4 vector 3 was used as the vector, and a serum-free medium was used for the culture.
  • vector 3 was used as the vector, and a weakly acidic buffer was used for the culture.
  • vector 4 was used as a vector, and a serum-free medium was used for culture.
  • Comparative Example 7 Vector 5 was used as the vector, and a weakly acidic buffer was used for the culture.
  • Comparative Example 8 vector 6 was used as the vector, and a serum-free medium was used for the culture.
  • Comparative Example 9 vector 7 was used as the vector, and a serum-free medium was used for the culture.
  • vector 9 was used as the vector, and a weakly acidic buffer was used for the culture.
  • Comparative Example 11 vector 9 was used as the vector, and a serum-free medium was used for the culture.
  • FIG. 1 shows the measurement results of luciferase gene expression activity (RLU / mg protein) in L0.
  • the gene expression in Example 1 The current activity (ie, gene delivery efficiency in the nucleus) was about 100 times higher than the gene expression activity in Comparative Examples 1-10.
  • the gene expression activity in Example 2 was lower than the gene expression activity in Example 1. This is considered to be caused by the low endocytic efficiency of ribosome 8. Therefore, modifying the lipid membrane surface of ribosome 8 with an appropriate functional molecule to improve endocytosis efficiency can improve gene expression activity (i.e., nuclear gene delivery efficiency). Conceivable
  • Example 3 Vector 8 was transfected into immature rod cells in the same manner as Example 1. In Comparative Example 12, vector 7 was transferred to immature rod cells in the same manner as Comparative Example 9.
  • FIGS. The results of confocal laser microscope observation in Example 3 are shown in FIGS. As shown in Fig. 2, cells with plasmid DNA (red) as particles in the nucleus (green) were confirmed. In addition, as shown in FIG. 3, cells in which plasmid DNA (red) was dispersed in the nucleus (green) were also confirmed. On the other hand, in Comparative Example 12, cells having plasmid DNA (red) in the cytoplasm were confirmed, but cells having plasmid DNA (red) in the nucleus (green) were not confirmed.
  • the ribosome suspension was layered on a discontinuous sucrose density gradient (0 to 60%), and ultracentrifugation was performed for 2 hours at 20 ° C and 160,000 g. LmL fractions were collected from the top. each The DNA content in the fraction was measured by agarose gel electrophoresis, and the rhodamine content (%) was calculated by measuring the fluorescence intensity of rhodamine in each fraction.
  • the fraction containing ribosome 8 is considered to have a high DNA content!
  • rhodamine was present together with DNA. Therefore, SUV-type ribosomes electrostatically bound to the aggregated plasmid DNA are fused together while retaining the inner aqueous phase containing rhodamine, and ribosome 8 is prepared. It was shown that there is a space that is retained by the inner aqueous phase containing water.
  • ribosome 8 is a single membrane ribosome, the inner aqueous phase containing rhodamine and the aggregated plasmid DNA are retained in the same space, and fluorescence energy transfer is observed between NBD and rhodamine. It should be.
  • the aggregated plasmid DNA is coated with two lipid membranes by the membrane fusion of the SUV-type ribosome that is electrostatically bound to the aggregated plasmid DNA, and the inner aqueous phase contains rhodamine.
  • the inner aqueous phase contains rhodamine.
  • vector 8 was introduced into immature rod cells, treated 6 hours after introduction with lipopolysaccharide (LPS), and administered subcutaneously to mice of the same series (injection). Dose: 1 ⁇ 10 5 cells). The same mice were repeatedly administered weekly, and cytotoxicity (CTL) activity was measured after 5 weeks.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the CTL activity was measured as follows. Five weeks after immunization, the spleen was removed from C57BLZ6 male mice and spleen cells were collected. Adjust the concentration of the collected cells to 5 ⁇ 10 5 cells ZmL, seed them in a 12-well plate, add 50 ⁇ g ZmL of antigen protein (luciferase), incubate at 37 ° C for 4 days, and present in splenocytes. Activated cells (effector cells). Antigen protein (luciferase) -expressing mouse-derived P815 cells that have been incorporated with radioisotope 51 Cr are used as target cells, and effector cells are added at various ratios, and antigen-specific target cell strength by effector cells is added. Specific cytocidal activity (CTL activity) was assessed by counting the 51 Cr leaks.
  • CTL activity Specific cytocidal activity
  • Ribosome 8 was prepared in the same manner as (8) except that plasmid DNA was used.
  • An immature rod cell is treated with an energy metabolism inhibitor (Antimycine A, NaN and NaF).
  • Antimycine A, NaN and NaF an energy metabolism inhibitor
  • FIG. 8 shows the results of confocal laser microscope observation.
  • (a) shows the result of immature rod cells not treated with an energy metabolism inhibitor
  • (b) shows the result of immature rod cells treated with an energy metabolism inhibitor.
  • the white frame represents the outer edge of the nucleus.
  • the white arrow represents plasmid DNA (red).
  • vector 7 was transfected into immature rod cells, NIH3T3 cells or HeLa cells, and luciferase gene expression activity (RLU / mg protein) was measured.
  • RLU / mg protein luciferase gene expression activity

Abstract

　標的細胞が樹状細胞等の非分裂性細胞である場合であっても、目的物質を標的細胞の核内に効率よく送達することができる非ウイルス性ベクターを提供することを目的とし、この目的を達成するために、本発明は、外側から順に第１の脂質膜及び第２の脂質膜を有する２枚膜リポソームであって、前記第１の脂質膜が膜融合能を有し、前記第２の脂質膜がその表面に核移行性ペプチドを有する前記２枚膜リポソームを提供する。

Description

明 細 書
目的物質を効率的に核内に送達可能なリボソーム
技術分野
[0001] 本発明は、非ウィルス性ベクター、特にリボソームに関する。
背景技術
[0002] 近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等の目的物質を標的部位に確実に送 達するためのベクターの開発が盛んに行われている。例えば、 目的の遺伝子を標的 細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ゥ ィルス等のウィルス性ベクターが開発されている。し力しながら、ウィルス性ベクター は、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少な い非ウィルス性ベクター（例えば、リボソームベクター）が注目を集めており、 目的物 質の細胞内送達効率を向上させるために、様々な機能性分子が導入された非ウィル ス性ベクターの開発が盛んに行われて 、る。
[0003] 例えば、リボソーム膜の外表面に親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール 等のポリアルキレングリコール）が導入されたリボソームが開発されている（特許文献 1 、特許文献 2、特許文献 3及び特許文献 4参照)。このリボソームによれば、リボソーム の血中滞留性を向上させることにより、腫瘍細胞に対するリボソームの指向性を向上 させることがでさる。
[0004] また、リボソーム膜の外表面に、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結 合できる物質 (例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はそ の断片、糖鎖)が導入されたリボソームが開発されている (特許文献 3及び特許文献 4 参照）。このリボソームによれば、リボソームのエンドサイト一シス効率を向上させること ができる。
[0005] また、リボソーム膜の外表面にステアリルィ匕ォクタアルギニンが導入されたリポソ一 ムが開発されている（非特許文献 1)。このリボソームによれば、リボソームに封入され た目的物質の細胞内送達効率を向上させることができる。
特許文献 1：特開平 1― 249717号公報 特許文献 2 :特開平 2— 149512号公報
特許文献 3：特開平 4 - 346918号公報
特許文献 4：特開 2004— 10481号公報
非特許文献 l : Kogure, K.等.，「Journal of Controlled Release] , 2004年，第 98卷， ρ.3 17-323
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明者は、従来の非ウィルス性ベクターを使用した目的物質の標的細胞内への デリバリーシステムにお 、て、標的細胞が榭状細胞等の非分裂性細胞である場合、 標的細胞が分裂性細胞である場合と比較して、 目的物質の核内送達効率（目的物 質が核酸である場合には核酸の細胞内発現効率)が著しく低下することを見出した（ 参考例 1参照)。
[0007] そこで、本発明は、標的細胞が榭状細胞等の非分裂性細胞である場合であっても 、 目的物質を標的細胞の核内に効率よく送達することができる非ウィルス性ベクター を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 上記目的を達成するために、本発明は、下記（1)〜（11)の 2枚膜リボソームを提供 する。
(1)外側から順に第 1の脂質膜及び第 2の脂質膜を有する 2枚膜リボソームであって
、前記第 1の脂質膜が膜融合能を有し、前記第 2の脂質膜がその表面に核移行性べ プチドを有する前記 2枚膜リボソーム。
(2)前記第 1の脂質膜がその構成成分として膜融合性脂質を含有する前記（1)記載 の 2枚膜リボソーム。
(3)前記第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質量が、前記第 1の脂質膜に含有さ れる総脂質量の 50% (モル比）以上である前記（2)記載の 2枚膜リボソーム。
(4)前記第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、ァ-オン性脂質の割合が 5 〜50% (モル比）である前記（2)又は（3)記載の 2枚膜リボソーム。
(5)標的細胞の核内に送達すべき目的物質が、前記第 2の脂質膜の内側に封入さ れて 、る前記（1)〜 (4)の 、ずれかに記載の 2枚膜リボソーム。
(6)前記目的物質を前記標的細胞の核内に送達するためのベクターである前記（5) 記載の 2枚膜リボソーム。
(7)前記標的細胞が非分裂性細胞である前記 (6)記載の 2枚膜リボソーム。
(8)脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性べ プチドを有する複数の負帯電性 SUV型リボソームを正帯電性粒子に接触させ、正帯 電性粒子に静電的に結合した負帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることに より得られる前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の 2枚膜リボソーム。
(9)前記正帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である 前記（8)記載の 2枚膜リボソーム。
(10)脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性べ プチドを有する複数の正帯電性 SUV型リボソームを負帯電性粒子に接触させ、負帯 電性粒子に静電的に結合した正帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることに より得られる前記（1)〜（7)の 、ずれかに記載の 2枚膜リボソーム。
(11)前記負帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体であ る前記（10)記載の 2枚膜リボソーム。
発明の効果
[0009] 本発明により、標的細胞が榭状細胞等の非分裂性細胞である場合であっても、 目 的物質を標的細胞の核内に効率よく送達することができる 2枚膜リボソームが提供さ れる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]ルシフェラーゼ遺伝子発現活性 (RLU/mgタンパク質)の測定結果を示す図であ る。
[図 2]共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
[図 3]共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
[図 4] (a)は、各フラクションにおける DNA含量の測定結果を示す図であり、（b)は、 各フラクションにおけるローダミン含量の測定結果を示す図である。
[図 5] (a)は、本発明の 2枚膜リボソームの電子顕微鏡観察結果を示す図であり、 (b) は、本発明の 2枚膜リボソームの模式図である。
[図 6]CTL活性の測定結果を示す図である。
[図 7]ルシフェラーゼ遺伝子発現活性 (RLU/mgタンパク質)の測定結果を示す図であ る。
[図 8]共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のリボソームは、外側から順に第 1の脂質膜及び第 2の脂質膜を有する 2枚 膜リボソームである。
本発明のリボソームのサイズは特に限定されるものではないが、通常は直径 50〜5
OOnm、好ましくは直径 100〜300nm、さらに好ましくは直径 100〜200nmである。
[0012] 本発明のリボソームにおいて、第 1及び第 2の脂質膜はそれぞれ脂質二重層構造 を有する。第 1及び第 2の脂質膜の構成成分は、脂質二重層構造の形成を阻害しな い限り特に限定されるものではなぐ例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物 質、膜タンパク質等が挙げられる。
[0013] 脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、各脂質膜に含有される脂質量は、各脂質 膜に含有される総物質量の通常 30〜 100% (モル比）、好ましくは 50〜100% (モル 比）、さらに好ましくは 70〜： LOO% (モル比）である。
[0014] 脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸 等が挙げられる。
[0015] リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン (例えば、ジォレオイルホスファチジ ルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパ ルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジ ルグリセロール（例えば、ジォレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホス ファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホ スファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジ ルエタノールァミン（例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン、ジラウロイ ルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジ パルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジエタノール アミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、力 ルジオリピン、スフインゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物 等が挙げられる。
[0016] 糖脂質としては、例えば、グリセ口糖脂質 (例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジ グリコシルジグリセリド、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシル ジグリセリド）、スフインゴ糖脂質 (例えば、ガラクトシルセレブ口シド、ラタトシルセレブ 口シド、ガンダリオシド)等が挙げられる。
[0017] ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレ ステローノレコハク酸、ラノステロ一ノレ、ジヒドロラノステロ一ノレ、デスモステロ一ノレ、ジヒ ドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマス テロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のス テロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。
[0018] 飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、ォレイン酸、ステアリン 酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数 12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙 げられる。
[0019] 脂質は、中性脂質、カチオン性脂質 (塩基性脂質)及びァ-オン性脂質 (酸性脂質 )に分類され、中性脂質としては、例えば、ジァシルホスファチジルコリン、ジァシルホ スファチジルエタノールァミン、コレステロール、セラミド、スフインゴミエリン、セフアリン 、セレブロシド等が挙げられ、カチオン性脂質としては、例えば、ジォクタデシルジメ チルアンモ -ゥムクロリド（dioctadecyldimethylammonium chloride： DODAC)、 N- (2, 3-ジォレイルォキシ)プロピル- Ν,Ν,Ν-トリメチルアンモ -ゥム（N- (2,3- dioleyloxy)prop yl-N,N,N-trimethylammonium： DOTMA)、ジドデシルアンモ-ゥムブロミド（didodec ylammonium bromide： DDAB)、 1,2-ジォレオイルォキシ -3-トリメチルアンモ-ォプロ ノ ン（1,2— dioleoyloxy— 3— trimethylammonio propane： DOTAP)、 3 β— Ν— (Ν',Ν',—ジメ チル-アミノエタン)-力ルバモルコレステロール（3 β -Ν-(Ν' ,Ν' ,-dimethyl-aminoethan e)- carbamol cholesterol : DC - Choi)、 1,2-ジミリストイルォキシプロピル- 3-ジメチル ヒドロォキシェチノレアンモ -ゥム ( 1 ,2— dimyristoyloxypropy卜 3— dimethylhydroxyethyl a mmonium: DMRIE)、 2,3-ジォレイルォキシ- N-[2(スペルミネカルボキシアミド)ェチ ル]- Ν,Ν-ジメチル- 1-プロパナミゥムトリフルォロアセテート（2,3- dioleyloxy- N- [2 (spe rminecarboxamido) ethyl] -N , N-dimethyl- 1 -propanaminum trifluoroacetate： DO SPA )等が挙げられ、ァ-オン性脂質としては、例えば、カルジォリピン、ジァシルホスファ チジルセリン、ジァシルホスファチジン酸、 N—スクシ-ルホスファチジルエタノールァ ミン（N—スクシ-ル PE)、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチ ジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が 挙げられる。
[0020] 膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調 節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂 質膜に含有される膜安定化剤量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常 10〜5 0% (モル比）、好ましくは 20〜50% (モル比）、さらに好ましくは 30〜50% (モル比） である。
[0021] 膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が 挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪 酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
[0022] 抗酸化剤は、脂質膜の酸ィ匕を防止するために含有させることができる、脂質膜の任 意の構成成分であり、各脂質膜に含有される抗酸化剤量は、各脂質膜に含有される 総物質量の通常 5〜30% (モル比）、好ましくは 10〜30% (モル比）、さらに好ましく は 20〜30% (モル比）である。
[0023] 抗酸化剤としては、例えば、トコフエロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸ァスコ ルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
[0024] 荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができ る、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂質膜に含有される荷電物質量は、各脂質 膜に含有される総物質量の通常 5〜30% (モル比）、好ましくは 10〜20% (モル比） 、さらに好ましくは 10〜 15% (モル比）である。
[0025] 正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルァミン、ォレイルァミン等の 飽和又は不飽和脂肪族ァミン；ジォレオイルトリメチルアンモ -ゥムプロパン等の飽和 又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては 、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルへミスクシネート、ホスファチジルセリン 、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
[0026] 膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするた めに含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂質膜に含有され る膜タンパク質量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常 0. 1〜2% (モル比）、 好ましくは 0. 5〜2% (モル比）、さらに好ましくは 1〜2% (モル比）である。
[0027] 膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げ られる。
[0028] 本発明のリボソームにおいて、第 1の脂質膜は膜融合能を有する。
[0029] 第 1の脂質膜が膜融合可能な脂質膜は、脂質二重層構造を有する限り特に限定さ れるものではない。第 1の脂質膜が膜融合可能な脂質膜としては、例えば、細胞膜、 エンドソーム膜等の生体膜が挙げられる。
[0030] 第 1の脂質膜に膜融合能を付与する方法は特に限定されるものではない。
例えば、第 1の脂質膜に、その構成成分として膜融合性脂質を含有させることにより 、第 1の脂質膜に膜融合能を付与することができる。膜融合性脂質としては、例えば 、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン等の中性脂質；コレステロールコハク 酸、カルジォリピン等のァ-オン性脂質（酸性脂質）；ジアルキルアンモ-ゥムブロミド 等のカチオン性脂質 (塩基性脂質)が挙げられる。
[0031] 中性脂質が膜融合能を発揮できる pHは、通常 6. 0〜7. 5、好ましくは 6. 0〜7. 0 であり、ァ-オン性脂質が膜融合能を発揮できる PHは、通常 5. 0〜6. 5、好ましくは 5. 5〜6. 0であり、カチオン性脂質が膜融合能を発揮できる pHは、通常 7. 5〜8. 5 、好ましくは 8. 0〜8. 5である。酸性環境下に置かれると膜融合能を発揮できるァ- オン性脂質及びアルカリ性環境下に置かれると膜融合能を発揮できるカチオン性脂 質は、 pH感受性脂質とも呼ばれる。
[0032] 第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質量は、第 1の脂質膜に膜融合能を付与で きる限り特に限定されるものではない。第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質量は 、第 1の脂質膜に含有される総脂質量の通常 50〜100% (モル比）、好ましくは 60〜 100% (モル比）、さらに好ましくは 70〜： L00% (モル比）である。第 1の脂質膜に含有 される膜融合性脂質量が上記範囲にあると、第 1の脂質膜は細胞膜、エンドソーム膜 等の生体膜と効率よく膜融合することができるので、本発明のリボソームを細胞内に 効率よく導入することができる。
[0033] 第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、ァ-オン性脂質の割合が 5〜50 % (モル比）であることが好ましぐ 10〜30% (モル比）であることがさらに好ましい。ァ ユオン性脂質の割合が上記範囲にあると、本発明のリボソームが酸性環境下に置か れたときに、第 1の脂質膜が細胞膜、エンドソーム膜等の生体膜と効率よく膜融合す ることができる。第 1の脂質膜に含有されるァ-オン性脂質以外の膜融合性脂質は、 中性脂質及びカチオン性脂質のうちの 、ずれか一方であってもよ 、し両方であって ちょい。
[0034] また、第 1の脂質膜表面を膜融合性分子で修飾することにより、第 1の脂質膜に膜 融合能を付与することができる。第 1の脂質膜表面を修飾する膜融合性分子としては 、例えば、スクシ-ルイ匕ポリグリシドール、膜融合性ペプチド (例えば、 H2ペプチド、 G M225.1)等が挙げられる。
[0035] 第 1の脂質膜には、その構成成分として、血中滞留性機能、温度変化感受性機能 等を有する脂質又は脂質誘導体を含有させてもよい。これにより、上記機能のうち 1 種又は 2種以上の機能を本発明のリボソームに付与することができる。本発明のリポ ノームに血中滞留性機能を付与することにより、本発明のリボソームの血液中での滞 留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることが できる。また、本発明のリボソームに温度変化感受性機能を付与することにより、本発 明のリボソームに封入された目的物質の放出性を高めることができる。
[0036] 血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質又は脂質誘導体としては 、例えば、グリコフォリン、ガンダリオシド GM1、ホスファチジルイノシトール、ガンダリオ シド GM3、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール- 2000}-1,2-ジパルミトイル -sn-グリセ 口- 3-ホスフォエタノールァミン、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール- 5000} -1,2-ジパルミトイル -sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノールァミン、 N-{カルボ-ル-メトキ シポリエチレングリコール- 750}-l,2-ジステアロイル -sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノー ルァミン、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール- 2000}-1,2-ジステアロイル- sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノールァミン、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコー ル- 5000}-1,2-ジステアロイル -sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノールァミン等のポリェチ レンダリコール誘導体等が挙げられ、温度変化感受性機能を付与することができる温 度変化感受性脂質又は脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジル コリン等が挙げられる。
[0037] 本発明のリボソームにおいて、第 2の脂質膜は、その表面に核移行性ペプチドを有 する。
[0038] 核移行性ペプチドは、細胞質から核内への移行能を有する限り特に限定されるも のではなぐ例えば、核移行シグナルを有するペプチド等が挙げられる。核移行シグ ナルは、核内に選択的に輸送されるタンパク質又はペプチドが有する特異的なアミノ 酸配列であり、例えば、シミアンウィルス 40由来核移行シグナル（SV40— NLS) (配 列番号 2)、アデノウイルス由来コアペプチド mu (配列番号 3)、シミアンウィルス 40の ラージ T (Large T)抗原由来核移行シグナル (配列番号 4)、これらの繰り返し配列（ 例えば、配列番号 1 (シミアンウィルス 40のラージ T抗原由来核移行シグナルの繰り 返し配列））等が挙げられる。核移行性ペプチドは、核移行シグナルを有する天然型 のペプチドであってもよ 、し、核移行シグナルを融合させた変異型のペプチドであつ てもよ ヽ。核移行性ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるもので はないが、通常 5〜30個、好ましくは 5〜25個、さらに好ましくは 5〜20個である。
[0039] 第 2の脂質膜表面に存在する核移行性ペプチド量は特に限定されるものではない 力 第 2の脂質膜に含有される総物質量の通常 1〜5% (モル比）、好ましくは 1〜3% (モル比）、さらに好ましくは 1〜2% (モル比)である。第 2の脂質膜表面に存在する 核移行性ペプチド量が上記範囲にあると、本発明のリボソームに封入された目的物 質を効率よく核内に送達することができる。
[0040] 核移行性ペプチドは第 2の脂質膜の外表面に存在する限り、第 2の脂質膜の内表 面に存在していてもよい。なお、第 2の脂質膜の表面のうち、第 1の脂質膜側の表面 が外表面であり、それと反対側の表面が内表面である。また、核移行性ペプチドは第 lの脂質膜の外表面及び Z又は内表面に存在して 、てもよ 、。
[0041] 第 2の脂質膜表面における核移行性ペプチドの存在態様としては、例えば、核移 行性ペプチドが脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物 (例えば、疎水性基 、疎水性化合物等)で修飾されており、当該官能基又は化合物が第 2の脂質膜内に 挿入され、核移行性ペプチドが第 2の脂質膜から露出した態様が挙げられる。この態 様において、核移行性ペプチドが細胞質力 核内への移行能を発揮できる限り、核 移行性ペプチドの全体が第 2の脂質膜から露出して 、てもよ 、し、核移行性ペプチド の一部が第 2の脂質膜から露出して 、てもよ 、。
[0042] 核移行性ペプチドを修飾する、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物は 特に限定されるものではなぐ例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基 ；コレステロール基又はその誘導体;リン脂質、糖脂質又はステロール;長鎖脂肪族ァ ルコール（例えば、ホスファチジルエタノールァミン、コレステロール等）；ポリオキシプ ロピレンアルキル;グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる力 これらのうち特に、炭 素数 10〜20の脂肪酸基 (例えば、パルミトイル基、ォレイル基、ステアリル基、ァラキ ドイル基等）が好ましい。
[0043] 本発明のリボソームの作製方法は特に限定されるものではないが、例えば、脂質膜 の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有 する複数の負帯電性 SUV型リボソームを正帯電性粒子に接触させ、正帯電性粒子 に静電的に結合した負帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることにより、本発 明のリボソームを作製することができる。また、脂質膜の構成成分として膜融合性脂 質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の正帯電性 SUV型リ ポソ一ムを負帯電性粒子に接触させ、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることにより、本発明のリボソームを作製すること ができる。
[0044] 正帯電性粒子のゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常 1 0〜60mV、好ましくは 20〜50mV、さらに好ましくは 20〜40mVである。負帯電性 粒子のゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常 10〜一 60 mV、好ましくは一 20〜一 50mV、さらに好ましくは一 20〜一 40mVである。正帯電 性粒子及び負帯電性粒子のゼータ電位が上記範囲にあると、本発明のリボソームを 効率よく作製することができる。なお、ゼータ電位の測定条件は特に限定されるもの はないが、温度条件は通常 25°Cである。
[0045] 正帯電性粒子及び負帯電性粒子の粒径は特に限定されるものではないが、粒径 の下限値は、好ましくは 50nm、さらに好ましくは 70nmであり、粒径の上限値は、好 ましくは 500nm、さらに好ましくは 200nmである。正帯電性粒子及び負帯電性粒子 の粒径が上記範囲にあると、本発明のリボソームを効率よく作製することができる。
[0046] 正帯電性粒子は、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質 及び Z又はァ-オン性物質を含んでいてもよい。負帯電性粒子は、全体として負に 帯電する限り、ァ-オン性物質に加え、中性物質及び Z又はカチオン性物質を含ん でいてもよい。
[0047] 正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、標的細胞の核内に送達すべき目的 物質の凝集体を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質 の凝集体を使用すれば、第 2の脂質膜の内側に目的物質が封入された 2枚膜リポソ ームを作製することができる。目的物質の凝集体は、目的物質のみ力も構成されてい てもよいし、目的物質以外の物質 (例えば、目的物質を保持する担体)を含んでいて ちょい。
[0048] 目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とァ-オン性物質とを静電 的に結合させて複合体ィ匕することにより、目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電 的に結合させて複合体ィ匕することにより、目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質とカチオン性物 質とを適当な様式 (例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等)で結合させて複合 体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目 的物質とカチオン性物質又はァ-オン性物質との混合比率を調整することにより、全 体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。
[0049] 目的物質は特に限定されるものではなぐ例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬 物、糖、これらの複合体等が挙げられる。なお、「核酸」には、 DNA又は RNAに加え 、これらの類似体又は誘導体 (例えば、ペプチド核酸 (PNA)、ホスホロチォエート D NA等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線 状又は環状の!/、ずれであってもよ 、。
[0050] 目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体 化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチ オン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸 の凝集体を調製することができる。
[0051] 目的物質の凝集体を調製する際に使用するカチオン性物質は、分子中にカチオン 性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質としては 、例えば、カチオン性脂質 (例えば、 Lipofectamine dnvitrogen社製)）；カチオン性基 を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩 基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体 (例えばステアリル 化誘導体）；ポリエチレンィミン、ポリ（ァリルァミン）、ポリ（ジァリルジメチルアンモ-ゥ ムクロライド）、ダルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；プロタミン又はその誘導体（ 例えば硫酸プロタミン)等が挙げられるが、この中でも特にプロタミン又はその誘導体 が好ましい。プロタミン又はその誘導体を使用して調製した目的物質の凝集体は非 常に柔らかな構造を有しているため、 目的物質の凝集体は核膜孔を効率よく通過す ることができる。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるもので はないが、好ましくは 2個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定 されるものではなぐ例えば、アミノ基;メチルァミノ基、ェチルァミノ基等のモノアルキ ルァミノ基；ジメチルァミノ基、ジェチルァミノ基等のジアルキルアミノ基;イミノ基；グァ -ジノ基等が挙げられる。
[0052] 目的物質の凝集体を調製する際に使用するァニオン性物質は、分子中にァニオン 性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。ァ-オン性物質としては 、例えば、ァ-オン性脂質;ァ-オン性基を有する高分子;ポリアスパラギン酸等の酸 性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、力 ノレボキシビニノレポリマー、カノレボキシメチノレセノレロースポリスチレンスノレホン酸塩、ポ リサッカライド、カラギーナン等のポリア-オン性ポリマー等を使用することができる。 ァ-オン性物質が有するァ-オン性基の数は特に限定されるものではな 、が、好ま しくは 2個以上である。ァ-オン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものでは なぐ例えば、末端カルボキシル基を有する官能基 (例えば、コハク酸残基、マロン酸 残基等)、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。
[0053] SUV (small unilamellar vesicle)型リボソームは、粒径（直径）が lOOnm以下である 1枚膜リボソームである。 SUV型リボソームの粒径（直径）は lOOnm以下である限り 特に限定されるものではないが、通常 30〜： LOOnm、好ましくは 30〜80nm、さらに 好ましくは 30〜60nmである。
[0054] 多重膜リボソーム（MLV)、 SUV以外の 1枚膜リボソーム（例えば LUV (large unila mellar vesicle)、 GUV (giant unilamellar vesicle)等）は、粒子径が lOOnm以上であ るため（一般的に lOOnm以上の粒子径を有する脂質膜は平面膜として考えられる） 、脂質膜の曲率及び表面エネルギーが小さぐリボソーム同士の凝集が生じ難い。こ れに対して、 SUV型リボソームは、粒子径が lOOnm未満であるため、脂質膜の曲率 及び表面エネルギーが大きぐリボソーム同士の凝集が生じ易い。したがって、脂質 膜の構成成分として膜融合性脂質を含有する SUV型リボソーム同士は効率よく膜融 合することができる。
[0055] 脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ぺプ チドを有する SUV型リボソームは、例えば、次のようにして作製することができる。脂 質膜の構成成分 (膜融合性脂質を含む)と、脂質膜の構成成分となり得る官能基又 は化合物で修飾された核移行性ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸 発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、 へキサン、ヘプタン、シクロへキサン等の炭化水素類;塩化メチレン、クロ口ホルム等 のハロゲンィ匕炭化水素類;ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類;メタノール、ェ タノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類；アセトン 等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は 2種以上を組み合わせて使用するこ とができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波槽を用いた超音波処理に より多重膜リボソームを作製する。次いで、多重膜リボソームをさらにプローブ型超音 波装置によって超音波処理し、小さい 1枚膜リボソームである SUV型リボソームを調 製する。こうして、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物が脂質膜内に挿 入され、核移行性ペプチドが脂質膜表面カゝら露出した SUV型リボソームを作製する ことができる。
[0056] また、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有しない SUV型リボソームを作製した 後、その外液に、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物で修飾された核移 行性ペプチドを添加することにより、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物 が脂質膜内に挿入され、核移行性ペプチドが脂質膜表面カゝら露出した SUV型リポソ ームを作製することができる。
[0057] 正帯電性 SUV型リボソームの脂質膜構成成分の種類及び量は、 SUV型リポソ一 ムが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性 SUV型リボソームの脂質膜 構成成分の種類及び量は、 SUV型リボソームが全体として負に帯電するように調節 される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチオン性脂質、力 チオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、 ァ-オン性脂質、ァ-オン性膜安定化剤等が挙げられる。正帯電性 SUV型リポソ一 ムは、全体として正に帯電する限り、正の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、 負の電荷を付与する脂質膜構成成分及び z又は中性の脂質膜構成成分を含んで いてもよぐ負帯電性 SUV型リボソームは、全体として負に帯電する限り、負の電荷 を付与する脂質膜構成成分に加え、正の電荷を付与する脂質膜構成成分及び Z又 は中性の脂質膜構成成分を含んで 、てもよ 、。正帯電性 SUV型リボソームが正の 電荷を付与する脂質膜構成成分としてカチオン性脂質を含む場合、カチオン性脂質 の含有量は総脂質量の通常 5〜30% (モル比）、好ましくは 10〜25% (モル比）、さ らに好ましくは 10〜20% (モル比）である。負帯電性 SUV型リボソームが負の電荷を 付与する脂質膜構成成分としてァ-オン性脂質を含む場合、ァ-オン性脂質の含有 量は総脂質量の通常 5〜30% (モル比）、好ましくは 10〜25% (モル比）、さらに好ま しくは 10〜20% (モル比）である。
[0058] SUV型リボソームにおいて脂質膜に含有される膜融合性脂質の種類及び量は、 本発明のリボソームにおいて第 2の脂質膜に含有される膜融合性脂質の種類及び量 と同様である。 SUV型リボソームにお 、て脂質膜表面に存在する核移行シグナルの 種類及び量は、本発明のリボソームにおいて第 2の脂質膜表面に存在する核移行シ グナルの種類及び量と同様である。
[0059] 正帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位は正である限り特に限定されるものでは ないが、通常 10〜60mV、好ましくは 20〜50mV、さらに好ましくは 20〜30mVであ り、負帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位は負である限り特に限定されるものでは ないが、通常一 10〜一 60mV、好ましくは一 20〜一 50mV、さらに好ましくは一 20 〜一 30mVである。正帯電性 SUV型リボソーム及び負帯電性 SUV型リボソームの ゼータ電位が上記範囲にあると、本発明のリボソームを効率よく作製することができる 。なお、ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常 25 °Cである。
[0060] 正帯電性又は負帯電性粒子にそれぞれ負帯電性又は正帯電性 SUV型リボソーム を接触させる条件は特に限定されるものではないが、温度は通常 10〜40°C、好まし くは 20〜30°Cであり、 pHは通常 6. 5〜8. 0、好ましくは 7. 0〜7. 5であり、時間は 通常 1〜20分間、好ましくは 5〜10分間である。接触させる際に用いる溶媒は特に 限定されるものではないが、例えば、 HEPES緩衝液、生理食塩水、ショ糖溶液等を用 V、ることができる。溶媒中に分散させる負帯電性又は正帯電性 SUV型リボソームの 量は、通常、正帯電性又は負帯電性粒子に対して過剰量であり、例えば、正帯電性 又は負帯電性粒子の封入に理論上最低限必要な負帯電性又は正帯電性 SUV型リ ポソーム量の 2〜4倍量である。
[0061] 正帯電性粒子に負帯電性 SUV型リボソームを接触させると、負帯電性 SUV型リポ ノームが正帯電性粒子に静電的に結合し、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯 電性 SUV型リボソーム同士が膜融合し、正帯電性粒子が 2枚の脂質膜で被覆される 。また、負帯電性粒子に正帯電性 SUV型リボソームを接触させると、正帯電性 SUV 型リボソームが負帯電性粒子に静電的に結合し、負帯電性粒子に静電的に結合し た正帯電性 SUV型リボソーム同士が膜融合し、負帯電性粒子が 2枚の脂質膜で被 覆される。これにより、正帯電性又は負帯電性粒子の外側には、正帯電性又は負帯 電性粒子を被覆する 2枚の脂質膜が形成され、本発明のリボソームが作製される。こ うして作製された本発明のリボソームにおいて、第 1及び第 2の脂質膜は、その構成 成分として膜融合性脂質を含有し、その表面に核移行シグナルを有する。正帯電性 又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用した場合、 目的物質の凝集体が 第 2の脂質膜の内側に封入された 2枚膜リボソームが作製される。
[0062] 負帯電性 SUV型リボソームの脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、中性脂質 の割合が 50% (モル比）以上、好ましくは 70% (モル比）以上であると、正帯電性粒 子に負帯電性 SUV型リボソームを接触させた後、正帯電性粒子に静電的に結合し た負帯電性 SUV型リボソーム同士の膜融合を迅速かつ効率よく誘起させることがで きる。正帯電性 SUV型リボソームについても同様である。
[0063] 第 2の脂質膜の内側に目的物質が封入された 2枚膜リボソームは、 目的物質を標 的細胞の核内に送達するためのベクターとして使用することができる。
標的細胞は、分裂性細胞及び非分裂性細胞のいずれであってもよいが、第 2の脂 質膜の内側に目的物質が封入された 2枚膜リボソームは、標的細胞が非分裂性細胞 である場合に特に有用である。分裂性細胞としては、例えば、 NIH3T3細胞、 HeLa 細胞、 COS7細胞等が挙げられ、非分裂性細胞としては、例えば、榭状細胞、脳神 経細胞等が挙げられる。
[0064] 本発明のリボソームは、エンドサイト一シスを介して標的細胞内に移行することがで きる。エンドサイト一シスを介して標的細胞内に移行した本発明のリボソームは、ェン ドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム膜と第 1の脂質膜とが膜融合することにより 、エンドソーム力も脱出することができる。第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質の うち、ァ-オン性脂質の割合が 5〜50% (モル比）である場合、エンドソーム内が酸性 (pH5. 5〜6. 5)に変化することにより、第 1の脂質膜とエンドソーム膜とは効率よく 膜融合することができる。エンドソーム力も脱出したリボソームにおいて、第 1の脂質 膜は消失しているが、第 2の脂質膜は保持されている。エンドソーム力も脱出したリポ ノームが第 2の脂質膜表面に有する核移行性ペプチドは、インポーチンひ， ととも に核膜孔ターゲッティング複合体を形成し、核内に運搬される。この際、第 2の脂質 膜が壊れて、第 2の脂質膜の内側に封入されていた目的物質は放出され、核内に送 達される。第 2の脂質膜の内側に目的物質の凝集体が封入されている場合、 目的物 質の核内送達効率は向上する。プロタミン又はその誘導体を使用して調製された目 的物質の凝集体が封入されている場合、目的物質の凝集体は核膜孔を効率よく通 過することができるので、目的物質の核内送達効率は特に向上する。
[0065] また、本発明のリボソームは、第 1の脂質膜と細胞膜との膜融合を介して標的細胞 内に移行することができる。第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、ァ-ォ ン性脂質の割合が 5〜50% (モル比)である場合、酸性条件下で本発明のリボソーム と標的細胞とを接触させることにより、第 1の脂質膜と細胞膜とは効率よく膜融合する ことができる。標的細胞内に移行したリボソームにおいて、第 1の脂質膜は消失して いるが、第 2の脂質膜は保持されている。標的細胞内に移行したリボソームが第 2の 脂質膜表面に有する核移行性ペプチドは、インポーチン oc , βとともに核膜孔ターゲ ッティング複合体を形成し、核内に運搬される。これに伴って、第 2の脂質膜が壊れ、 第 2の脂質膜の内側に封入されていた目的物質は放出され、核内に送達される。第 2の脂質膜の内側に目的物質の凝集体が封入されている場合、目的物質の核内送 達効率は向上する。プロタミン又はその誘導体を使用して調製された目的物質の凝 集体が封入されている場合、目的物質の凝集体は核膜孔を効率よく通過することが できるので、目的物質の核内送達効率は特に向上する。
[0066] 目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなぐ動 物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましぐ哺乳動物 であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャ ギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、 目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、体細胞 、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
[0067] 本発明のリボソームは、常法に従って製剤化し、医薬組成物として使用することが できる。本発明のリボソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散 溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クェン緩衝液，酢酸緩衝液等の 緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶 性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、 ρΗ調節剤、水和促進剤等の添加剤を 添加して使用してもよい。
[0068] 本発明のリボソームは、 in vivo及び in vitroのいずれにおいても使用することもでき る。 in vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下 、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リボソームに封入され た目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
実施例
[0069] 〔実施例 1〜2,比較例 1〜11〕
1.各種ベクターの調製
プラスミド DNAとして、ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミド pcDNA3. l(+)lucを 使用して、プラスミド DNAを含有する各種ベクターを調製した。なお、プラスミド pcD NA3. l(+)lucは、 CMVプロモーター及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺 伝子を含有する全長約 7kbpのプラスミド DNAであり、 pGL3プラスミド（Promega社 製)力も制限酵素によって切り出したルシフェラーゼ遺伝子をプラスミド pcDNA3. 1( +) (Invitrogen社製）に挿入することによって作製した。
[0070] (1)ベクター 1 (従来の 1枚膜リボソーム）
硫酸プロタミン溶液 0. 15mL (硫酸プロタミン濃度： 0. lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )に、プラスミド DNA溶液 0. lmL (プラスミド DNA濃度： 0 . lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )をボルテックス条件下で滴 下し、硫酸プロタミンとプラスミド DNAとを静電的に相互作用させ、プラスミド DNAを 凝縮化させた。凝集化プラスミド DNAの粒子径は約 106nmであり、ゼータ電位は約 39mVであった。なお、流体力学的直径は準弾性光散乱方法によって測定し、ゼー タ電位は、電気泳動的光散乱分光測光器 (ELS— 8000)によって分析した (以下同 様)。
[0071] 脂質混合物（ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン（dioleoyl phosphatidyl et hanolamine： DOPE)：コレステロ一ノレコノヽク酸 (cholesteryl hemisuccinate： CHEMS) = 9 : 2 (モル比））をクロ口ホルムに溶解した後、クロ口ホルムを蒸発除去することにより 脂質膜を得た。脂質膜 (137.5ηモル）に、凝縮ィ匕プラスミド DNA懸濁液 0. 25mL ( 凝集化プラスミド DNA濃度： 0. 04mg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) )を添加して水和することにより、脂質膜表面に凝縮ィ匕プラスミドを静電的に結合さ せた。次いで、穏ゃカゝな超音波で処理し、凝縮ィ匕プラスミド DNAを脂質膜で被覆す ることにより、プラスミド DNAが内部に封入された 1枚膜リボソーム（以下「ベクター 1」 という）を調製した。
[0072] (2)ベクター 2 (従来のキャリアペプチド）
ステアリル化ォクタアルギニン溶液 0. 09mL (ステアリル化ォクタアルギニン濃度： 0 . lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )に、プラスミド DNA溶液 0. 18mL (プラスミド DNA濃度： 0. lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )をボルテックス条件下で滴下し、ステアリル化ォクタアルギニンとプラスミド DNAと を静電的に相互作用させ、凝集化プラスミド DNA (以下「ベクター 2」という）を調製し た。
[0073] (3)ベクター 3 (従来の 1枚膜リボソーム）
ステアリル化ォクタアルギニン溶液 0. 09mL (ステアリル化ォクタアルギニン濃度： 0 . lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )に、プラスミド DNA溶液 0. 18mL (プラスミド DNA濃度： 0. lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )をボルテックス条件下で滴下し、ステアリル化ォクタアルギニンとプラスミド DNAと を静電的に相互作用させ、プラスミド DNAを凝縮化させた。こうして調製した凝集化 プラスミド DNAを上記（1)と同様にして脂質膜で被覆することにより、プラスミド DNA が内部に封入された 1枚膜リボソーム (以下「ベクター 3」 ヽぅ）を調製した。
[0074] (4)ベクター 4 (従来の 1枚膜リボソーム）
脂質混合物（DOPE：コレステロール = 7： 3 (モル比））をクロ口ホルムに溶解した後 、クロ口ホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。こうして得た脂質膜を使用し、 上記（1)と同様にして凝縮ィ匕プラスミド DNAを脂質膜で被覆し、プラスミド DNA封入 リボソームを調製した。プラスミド DNA封入リボソーム懸濁液に、ステアリル化核移行 性ペプチド (N末端をステアリル化した核移行性ペプチド (配列番号 1)溶液 0. 05m L (ステアリルィ匕核移行性ペプチド濃度： lmgZmL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（ pH7. 4) )を添加し、室温で一定時間インキュベートすることにより、リボソーム表面に ステアリルィ匕ォクタアルギニンを分配させた (ステアリル化ォクタアルギニンの分配量： 脂質量の 2モル0 /0)。このようにして、ォクタアルギニンを表面に有し、プラスミド DNA が内部に封入された 1枚膜リボソーム (以下「ベクター 4」 、う）を調製した。 [0075] (5)ベクター 5 (従来の 1枚膜リボソーム）
ステアリル化核移行性ペプチド (N末端をステアリル化した核移行性ペプチド (配列 番号 1) )溶液 0. 09mL (ステアリルィ匕核移行性ペプチド濃度: 0. lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )に、プラスミド DNA溶液 0. 18mL (プラスミド DN A濃度： 0. lmg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) )をボルテックス条 件下で滴下し、ステアリル化核移行性ペプチドとプラスミド DNAとを静電的に相互作 用させ、凝集化プラスミド DNAを調製した。こうして調製した凝集化プラスミド DNAを 上記（1)と同様にして脂質膜で被覆することにより、プラスミド DNAが内部に封入さ れた 1枚膜リボソーム (以下「ベクター 5」 、う）を調製した。
[0076] (6)ベクター 6 (従来の 1枚膜リボソーム）
脂質混合物（DOTAP： DOPE = 1： 1 (モル比））をクロ口ホルムに溶解した後、クロ 口ホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。脂質膜を 10mM HEPES緩衝液（ pH7. 4)で水和した後、超音波槽で超音波処理することにより、リボソームを調製し た。リボソーム懸濁液 (脂質量 137.5ηモル）に、プラスミド DNA溶液 0. 125mL (プラ スミド DNA濃度： 0. 1 mg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) )を添カロ することにより、プラスミド DNAと複合体形成した 1枚膜リボソーム（以下「ベクター 6」 という）を調製した。
[0077] (7)ベクター 7 (従来の 1枚膜リボソーム）
脂質混合物（DOPE： CHEMS = 9 : 2 (モル比） )をクロ口ホルムに溶解した後、クロ 口ホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。こうして得た脂質膜を使用し、上記 (1)と同様にして凝縮ィ匕プラスミド DNAを脂質膜で被覆し、プラスミド DNA封入リポ ソームを調製した。プラスミド DNA封入リボソーム懸濁液に、ステアリルィ匕ォクタアル ギニン溶液 0. 12mL (ステアリルィ匕ォクタアルギニン濃度： lmgZmL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液 (pH7. 4) )を添カ卩し、室温で一定時間インキュベートすることにより 、リボソーム表面にステアリルィ匕ォクタアルギニンを分配させた (ステアリルィ匕ォクタァ ルギニンの分配量：脂質量の 5モル0 /0)。このようにして、ォクタアルギニンを表面に 有し、プラスミド DNAが内部に封入された 1枚膜リボソーム（以下「ベクター 7」という） を調製した。 [0078] (8)リボソーム 8 (本発明の 2枚膜リボソーム）
脂質混合物（DOPE： CHEMS = 9 : 2 (モル比））に、ステアリル化核移行性べプチ ド (N末端をステアリル化した核移行性ペプチド (配列番号 1) )を添加し (添加量：脂 質量の 2モル％)、クロ口ホルム 0. 25mLに溶解した後、溶解液をガラス試験管に収 容した。窒素ガスの吹き付けにより溶媒を除去した後、デシケーター内に 1時間収納 して乾燥させた。得られた脂質膜（275ηモル）を、予め 25°Cまで温めておいた HEP ES緩衝液 0. 25mLを用いて水和させ、超音波槽で超音波処理することにより脂質 膜を剥離した。さらにプローブ型超音波装置により 10分間超音波処理を行うことによ つて、脂質膜に膜融合性脂質を含有し、脂質膜表面に核移行性ペプチドを有する S UV型リボソームを調製した。こうして調製された SUV型リボソームの粒径は約 58nm であり、ゼータ電位は約 2mV (この測定値は不正確である可能性が高い。脂質膜 表面に核移行性ペプチドを有しない場合、 SUV型リボソームのゼータ電位は約 4 OmVであることから、脂質膜表面に核移行性ペプチドを有する場合、 SUV型リポソ ームのゼータ電位は約— 10〜― 20mVであると考えられる。）であった。
[0079] 上記（1)と同様にして調製した凝集化プラスミド DNA溶液 0. 25mL (凝集化プラス ミド DNA濃度： 0. 04mg/mL,溶媒： 10mM HEPES緩衝液（pH7. 4) )に、 SUV 型リボソーム溶液 0. 25mL (SUV型リボソーム濃度： 1. 1 モル ZmL,溶媒： 10m M HEPES緩衝液 (pH7. 4) )を添カ卩し、室温 (約 25°C)で 10分間放置した。この過 程において、複数の SUV型リボソームが凝集化プラスミド DNAに静電的に結合し、 SUV型リボソーム同士が膜融合し、凝集化プラスミドが脂質膜で被覆されることにより 、凝集化プラスミドが内部に封入されたリボソームが調製される。こうして調製したブラ スミド DNA封入リボソーム（以下「リボソーム 8」という）の粒径は約 160nmであり、ゼ ータ電位は約 4mVであった。
[0080] (9)リボソーム 9
脂質混合物にステアリルィ匕核移行性ペプチドを添加しない点を除き、上記 (8)と同 様にしてプラスミド DNA封入リボソーム（以下「リボソーム 9」 t、う)を調製した。
[0081] 2.榭状細胞へのトランスフエクシヨン
C57BLZ6雄マウスの骨髄前駆体細胞を GM— CSF (顆粒球マクロファージコ口- 一刺激因子)存在下で 6〜7日間培養し、未成熟榭状細胞を誘導した。 48ゥ ルプレ ートに未成熟榭状細胞を 2 X 105細胞 Zゥエルの密度で播き、 0. 8 /z gDNA相当の ベクターを添カ卩し、無血清培地 (RPMI1640培地） 0. 2mL又は弱酸性緩衝液（10 mM HEPES/2. 5%グルコース（pH6. 0) 0. 2mL中、 37°Cで 1時間培養した後、 血清含有培地 0. 5mLを添カ卩し、さらに 37°Cで 23時間培養した。培養後、細胞を回 収して溶解し、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬（luciferase assay system, Promega社製）をカ卩え、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（LuminescencerPSN、 AT TO)を用いて測定した。細胞溶解液中のタンパク質量は BCAタンパク質定量キット（ PIERCE,ロックフォード (IL))を使用して測定した。
[0082] 実施例 1では、ベクターとしてベクター 8を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用し た。実施例 2では、ベクターとしてベクター 8を使用し、培養には無血清培地を使用し た。なお、実施例 1では、コレステロールコハク酸が細胞膜と膜融合することにより、ベ クタ一 8が細胞内に導入され、実施例 2では、エンドサイト一シスによりベクター 8が細 胞内に導入される。
[0083] 比較例 1では、ベクターとしてベクター 1を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用し た。比較例 2では、ベクターとしてベクター 1を使用し、培養にはリポ多糖 (lipopolysac charide:LPS)を添加した弱酸性緩衝液を使用した。比較例 3では、ベクターとしてべ クタ一 2を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例 4では、ベクターとしてべ クタ一 3を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例 5では、ベクターとしてべ クタ一 3を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例 6では、ベクターとして ベクター 4を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例 7では、ベクターとして ベクター 5を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例 8では、ベクターとし てベクター 6を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例 9では、ベクターとし てベクター 7を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例 10では、ベクターと してベクター 9を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例 11では、ベクタ 一としてベクター 9を使用し、培養には無血清培地を使用した。
[0084] 実施例 1〜2及び比較例 1〜： L0におけるルシフェラーゼ遺伝子発現活性 (RLU/mg タンパク質)の測定結果を図 1に示す。図 1に示すように、実施例 1における遺伝子発 現活性 (すなわち、遺伝子の核内送達効率）は、比較例 1〜10における遺伝子発現 活性よりも約 100倍以上高カゝつた。なお、実施例 2における遺伝子発現活性は、実施 例 1における遺伝子発現活性よりも低かった力 これは、リボソーム 8のエンドサイト一 シス効率が低いことが原因であると考えられる。したがって、リボソーム 8の脂質膜表 面を適当な機能性分子で修飾してエンドサイト一シス効率を向上させれば、遺伝子 発現活性 (すなわち、遺伝子の核内送達効率)を向上させることができると考えられる
[0085] 〔実施例 3,比較例 12〕
ローダミン (赤色)標識ィ匕プラスミド DNAを使用してベクターを調製し、核を CYTO 24 (緑色)で染色した未成熟榭状細胞にトランスフ クシヨンし、 3時間後に共焦点レ 一ザ一顕微鏡による観察を行った。
実施例 3では、ベクター 8を実施例 1と同様にして未成熟榭状細胞にトランスフエク シヨンした。比較例 12では、ベクター 7を比較例 9と同様にして未成熟榭状細胞にトラ ンスフエクシヨンした。
[0086] 実施例 3における共焦点レーザー顕微鏡観察結果を図 2及び図 3に示す。図 2に 示すように、核内（緑色）にプラスミド DNA (赤色）が粒子として存在する細胞が確認 された。また、図 3に示すように、核内（緑色）にプラスミド DNA (赤色）が分散した細 胞も確認された。一方、比較例 12では、細胞質内にプラスミド DNA (赤色）が存在す る細胞は確認されたが、核内（緑色）にプラスミド DNA (赤色）が存在する細胞は確 認されなかった。
[0087] 〔実施例 4〕
NBD (4- nitrobenzo- 2- oxa- 1 ,3- diazole)標識化プラスミド DNAを使用した点、ポリ L—リジンを使用して凝集化プラスミド DNAを調製した点、及び、 SUV型リボソーム を調製する際、脂質膜の水和に使用する HEPES緩衝液に水相マーカーとしてロー ダミンを添加した (すなわち、ローダミンを含有する内水相を保持する SUV型リポソ一 ムを調製した)点を除き、上記 (8)と同様にしてリボソーム 8を調製した。
[0088] リボソーム懸濁液を不連続ショ糖密度勾配 (0〜60%)上に重層し、 20°C、 160, 0 00gの条件で 2時間、超遠心分離を行った。上部から lmLずつ画分を回収した。各 フラクションにおける DNA含量をァガロースゲル電気泳動によって測定するとともに 、各フラクションにおけるローダミンの蛍光強度を測定してローダミン含量（％)を算出 した。
[0089] 各フラクションにおける DNA含量の測定結果を図 4 (a)に示し、各フラクションにお けるローダミン含量の測定結果を図 4 (b)に示す。
リボソーム 8を含有するフラクションと考えられる、 DNA含量が多!、フラクション 6〜9 には、 DNAとともにローダミンが共存していた。このことから、凝集化プラスミド DNA に静電的に結合した SUV型リボソーム同士が、ローダミンを含有する内水相を保持 したまま融合することによりリボソーム 8が調製され、リボソーム 8の内部には、ローダミ ンを含有する内水相が保持する空間が存在することが示された。
[0090] また、フラクション 6〜9において、 NBDとローダミンとの間の蛍光エネルギー移動 は観察されなかった。このこと力ら、リボソーム 8において、 NBD標識化プラスミド DN Aとローダミンを含有する内水相とは接触していないこと、すなわち、リボソーム 8にお いて、ローダミンを含有する内水相が保持されている空間と、凝集化プラスミド DNA が保持されている空間とは脂質膜を介して隔離されていることが示された。したがつ て、リボソーム 8は、 1枚膜リボソームではないと考えられる。仮に、リボソーム 8が 1枚 膜リボソームであるとすれば、ローダミンを含有する内水相及び凝集化プラスミド DN Aは同一の空間に保持され、 NBDとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察 されるはずである。
[0091] さらに、ベクター 8を電子顕微鏡で観察した結果、図 5 (a)に示すように、コアとして 存在する凝集化プラスミド DNAを取り巻く 2枚の脂質膜が観察された。
[0092] 以上の結果から、凝集化プラスミド DNAに静電的に結合した SUV型リボソーム同 士の膜融合により、凝集化プラスミド DNAは 2枚の脂質膜で被覆され、ローダミンを 含有する内水相は、凝集化プラスミド DNAの外側に新たに形成された 2枚の脂質膜 の間の空間に保持されることが示された（図 5 (b)参照)。
[0093] 〔実施例 5〕
実施例 1と同様にして、未成熟榭状細胞にベクター 8を導入し、導入 6時間後にリポ 多糖 (lipopolysaccharide： LPS)で 1時間処理し、同系列マウスの皮下に投与した（投 与量：1 X 105細胞)。同一のマウスに毎週投与を繰り返し、 5週間後に細胞傷害 (CT L)活性を測定した。
また、比較例 9と同様にして、未成熟榭状細胞にベクター 7を導入し、上記と同様に して CTL活性を測定した。
[0094] CTL活性の測定は次のようにして行った。免疫 5週間後、 C57BLZ6雄マウスから 脾臓を摘出し、脾細胞を採取した。採取した細胞の濃度を 5 X 105細胞 ZmLに調整 して 12wellプレートに播き、抗原タンパク質 (ルシフェラーゼ） 50 μ gZmLを添カロし、 4日間 37°Cで培養し、脾細胞中に存在する T細胞を活性化した (エフェクター細胞） 。予め抗原タンパク質 (ルシフェラーゼ)を発現させたマウス由来 P815細胞に放射性 同位元素51 Crを取り込ませたものを標的細胞として、種々の比率でエフェクター細胞 を添加し、エフェクター細胞による抗原特異的な標的細胞力もの51 Cr漏出をカウント すること〖こよって、特異的殺細胞活性 (CTL活性)を評価した。
[0095] CTL活性の測定結果を図 6に示す。図 6に示すように、ベクター 8を導入した場合 には、ベクター 7を導入した場合よりも有意に高 、CTL活性が誘導された。
[0096] 〔実施例 6〕
脂質混合物に NBD (4- nitrobenzo- 2- oxa- 1 ,3- diazole) (緑色）標識化 DOPEを添 加した点（添加量：総脂質の 0. 45%モル）、及びローダミン (赤色)標識ィ匕プラスミド DNAを使用した点を除き、上記（8)と同様にしてリボソーム 8を調製した。
[0097] 未成熟榭状細胞をエネルギー代謝阻害剤 (Antimycine A、 NaN及び NaFをそ
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れぞれ最終濃度が l / gZmL 0. 1%及び 10mMになるように添加）存在下で 30 分間インキュベートした後、エネルギー代謝阻害剤で処理した未成熟榭状細胞 (核 をへキスト (青色)で染色）にベクター 8をトランスフエクシヨンし (実施例 1参照）、共焦 点レーザー顕微鏡による観察を行った。また、エネルギー代謝阻害剤で処理してい ない未成熟榭状細胞にも同様にベクター 8をトランスフエクシヨンし、共焦点レーザー 顕微鏡による観察を行った。
[0098] 共焦点レーザー顕微鏡観察結果を図 8に示す。なお、図 8中、（a)はエネルギー代 謝阻害剤で処理していない未成熟榭状細胞の結果を、 (b)はエネルギー代謝阻害 剤で処理した未成熟榭状細胞の結果を示す。また、図 8中、白枠は核の外縁を表し 、白色矢印はプラスミド DNA (赤色）を表す。
[0099] 図 8に示すように、エネルギー代謝阻害剤で処理して ヽな 、未成熟榭状細胞にお いては、核内（青色）にプラスミド DNA (赤色）が存在していた。但し、核内（青色）に 脂質 (緑色）は存在しなカゝつた。一方、エネルギー代謝阻害剤で処理した未成熟榭 状細胞においては、核内（青色）にプラスミド DNA (赤色)も脂質 (緑色)も存在してお らず、プラスミド DNA (赤色)及び脂質 (緑色）は細胞質に存在していた。この結果か ら、ベクター 8による遺伝子の核内送達は、エネルギーに依存した現象であること、す なわち、核膜に存在する核膜孔複合体を介した能動的な現象であることが示唆され た。
[0100] 〔参考例 1〕
比較例 9と同様にして、ベクター 7を未成熟榭状細胞、 NIH3T3細胞又は HeLa細 胞にトランスフエクシヨンし、ルシフェラーゼ遺伝子発現活性 (RLU/mgタンパク質)を 測定した。結果を図 7に示す。図 7に示すように、非分裂性細胞である榭状細胞にお ける遺伝子発現活性 (すなわち、遺伝子の核内送達効率）は、分裂性細胞である NI H3T3細胞又は HeLa細胞における遺伝子発現活性 (すなわち、遺伝子の核内送達 効率)よりも著しく低力つた。

Claims

請求の範囲
[I] 外側力 順に第 1の脂質膜及び第 2の脂質膜を有する 2枚膜リボソームであって、 前記第 1の脂質膜が膜融合能を有し、前記第 2の脂質膜がその表面に核移行性べ プチドを有する前記 2枚膜リボソーム。
[2] 前記第 1の脂質膜がその構成成分として膜融合性脂質を含有する請求項 1記載の 2枚膜リボソーム。
[3] 前記第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質量が、前記第 1の脂質膜に含有され る総脂質量の 50% (モル比）以上である請求項 2記載の 2枚膜リボソーム。
[4] 前記第 1の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、ァ-オン性脂質の割合が 5
〜50% (モル比）である請求項 2又は 3記載の 2枚膜リボソーム。
[5] 標的細胞の核内に送達すべき目的物質が、前記第 2の脂質膜の内側に封入され て 、る請求項 1〜4の 、ずれかに記載の 2枚膜リボソーム。
[6] 前記目的物質を前記標的細胞の核内に送達するためのベクターである請求項 5記 載の 2枚膜リボソーム。
[7] 前記標的細胞が非分裂性細胞である請求項 6記載の 2枚膜リボソーム。
[8] 脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ぺプ チドを有する複数の負帯電性 SUV型リボソームを正帯電性粒子に接触させ、正帯電 性粒子に静電的に結合した負帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることによ り得られる請求項 1〜7のいずれかに記載の 2枚膜リボソーム。
[9] 前記正帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である請 求項 8記載の 2枚膜リボソーム。
[10] 脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ぺプ チドを有する複数の正帯電性 SUV型リボソームを負帯電性粒子に接触させ、負帯電 性粒子に静電的に結合した正帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることによ り得られる請求項 1〜7のいずれかに記載の 2枚膜リボソーム。
[II] 前記負帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である請 求項 10記載の 2枚膜リボソーム。
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