WO2007132790A1 - 細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリポソーム - Google Patents

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bcg
lipid
peptide
lipid membrane
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Homhuan Atthachai
Kentaro Kogure
Hideyoshi Harashima
Ikuya Yano
Yoshio Hatakeyama
Hidehiro Yokomizo
Hideyuki Akaza
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National University Corporation Hokkaido University
Japan Bcg Laboratory
University Of Tsukuba
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Definitions

  • Ribosomes with lipid membranes containing bacterial cell components Ribosomes with lipid membranes containing bacterial cell components
  • the present invention relates to a liposome having a lipid membrane containing a bacterial cell component insoluble in water and an organic solvent, and a pharmaceutical composition containing the ribosome.
  • betaters and carriers for reliably delivering drugs, nucleic acids, peptides, proteins, sugars and the like to target sites has been actively conducted.
  • viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses have been developed as vectors for introducing a target gene into target cells.
  • virus vectors have problems such as difficulty in mass production, antigenicity, and toxicity
  • ribosome vectors and peptide carriers with few such problems are attracting attention.
  • Liposome vectors also have the advantage that the directivity to the target site can be improved by introducing functional molecules such as antibodies, proteins, and sugar chains on the surface.
  • BCG Mycobacterium bovis bacillus Calmette—Guerin, attenuated bovine tuberculosis
  • BCG Mycobacterium bovis bacillus Calmette—Guerin, attenuated bovine tuberculosis
  • This tumor regression effect is considered to be due to the so-called tumor immunotherapy effect that cell immunity is activated by the powerful adjuvant (immunostimulation) action of BCG.
  • BCG-CW Bacterial cell components against this side-effect problem
  • BCG-CW Bacterial cell components against this side-effect problem
  • bacterial cell components such as BCG-CW are insoluble in water and organic solvents because of their special structure and physicochemical properties.
  • it since it has a negative charge, it has a problem that the efficiency of uptake into a cell having a low affinity with a cell membrane having the same negative charge is low.
  • bacterial cell components such as BCG-CW need to be soluble by surfactants, but side effects such as stimulation by surfactants can be problematic, and bacteria solubilized by surfactants can be problematic. Since the bacterial cell component has a large particle size (about 300 nm or more) and is negatively charged, the efficiency of cellular uptake is still low, and the problem still remains.
  • Patent Document 1 International Publication WO2005Z032593 Pamphlet
  • Non-patent literature l Kogure et al., “Journal of Controlled Release”, 2004, 98 ⁇ , 317-323
  • Non-Patent Document 2 Rikiru Ikurami et al., RYAKUGAKU ZASSHIJ, 2004, 124 ⁇ , Suppl. 4, 1 13-116
  • a bacterial cell component insoluble in water and an organic solvent can be applied to a living body without using a surfactant (dispersible in an aqueous solvent, It is an object of the present invention to provide a ribosome that can be formulated into a size-controlled form) and a pharmaceutical composition containing the liposome.
  • the present invention provides a ribosome having a lipid membrane containing a bacterial cell component insoluble in water and an organic solvent, and a pharmaceutical composition containing the ribosome.
  • a bacterial cell component insoluble in water and an organic solvent can be applied to a living body without using a surfactant (a form that can be dispersed in an aqueous solvent and has a controlled size). ) Can be formulated.
  • the bacterial cell component is a cell wall fraction of Mycobacterium, Nocardia, Corynebata, or Rhodococcus. It is preferable that the Mycobacterium having a cell wall skeletal fraction is BCG.
  • the ribosome of the present invention preferably has a peptide containing a plurality of continuous arginine residues on the ribosome surface.
  • the ribosome of the present invention can be transferred into cells mainly via macrophage pinosis, so that bacterial cell components insoluble in water and organic solvents can be efficiently introduced into cells. it can.
  • the peptide is preferably a peptide having a force of 4 to 35 amino acid residues including a continuous 4 to 20 arginine residue.
  • the peptide has only an arginine residue.
  • the amount of the peptide is preferably 2% (molar ratio) or more with respect to the total lipid constituting the ribosome.
  • the peptide is modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound, and the hydrophobic group or the hydrophobic compound is inserted into a lipid membrane forming the surface of the ribosome.
  • the peptide is exposed from the lipid membrane that forms the surface of the ribosome! /.
  • the bacterial cell component has an immunostimulatory action
  • the pharmaceutical composition is an immunostimulatory agent.
  • a bacterial cell component insoluble in water and an organic solvent can be applied to a living body without using a surfactant (dispersible in an aqueous solvent and has a size.
  • a surfactant dispenserible in an aqueous solvent and has a size.
  • Is provided in a controlled form), and pharmaceutical compositions containing the liposomes are provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a functional domain included in BCG-CW.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • FIG. 5 shows intracellular localization of R8-modified BCG ribosome incorporated into MBT-2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the measurement results of the activity of rod cells using CD86, CD80 and MHCII as indices.
  • the ribosome of the present invention is a closed vesicle having a lipid membrane (lipid bilayer membrane), and the number of lipid membranes possessed by the liposome of the present invention is not particularly limited.
  • the ribosome of the present invention may be a multilamellar ribosome (MLV), or a single-film rifonosome such as SUV (small unilamellar vesicle), LUV (large unilamellar vesicle), or GUV giant unilamellar vesicle. May be.
  • the size of the ribosome of the present invention is not particularly limited, but a diameter of 50 to 300 nm is preferable, and a diameter of 100 to 200 nm is more preferable.
  • lipid membrane examples include lipids, membrane stabilizers, antioxidants, charged substances, membrane proteins, and the like.
  • Lipid is an essential constituent of the lipid membrane, and the amount of lipid contained in the lipid membrane is usually 70% (molar ratio) or more, preferably 75% (molar ratio) of the total amount of the substance constituting the lipid membrane. ) Or more, more preferably 80% (molar ratio) or more.
  • the upper limit of the amount of lipid contained in the lipid membrane is 100% of the total amount of substances constituting the lipid membrane.
  • lipids examples include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids exemplified below.
  • Phosphatidylcholine eg, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, etc.
  • phosphatidylglycerol eg, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylcholine
  • Myristoylphosphatidylglycerol dipalmitoylphosphatidylglycerol , Distearoyl phosphatidylglycerol, etc.
  • phosphatidylethanolamine eg, dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, di
  • Glycose glycolipid for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), Sphingo glycolipid (for example, galactosyl celeb oral side, latatosyl celeb oral side, gandarioside), etc.
  • Animal-derived sterols eg, cholesterol, cholesterol succinic acid, cholestanol, lanostero monore, dihydrolanostero monore, desmostero monore, dihydrocholesterol
  • plant-derived sterols eg, stigmasterol, Sitosterol, campesterol, brassicasterol
  • sterols derived from microorganisms eg, timosterol, ergosterol.
  • Saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as normitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid and myristic acid.
  • the membrane stabilizer is an optional component of the lipid membrane that can be included to physically or chemically stabilize the lipid membrane or to regulate the fluidity of the lipid membrane.
  • the amount of membrane stabilizer contained in the lipid membrane is usually 30% (molar ratio) or less, preferably 25% (molar ratio) or less, more preferably 20% (molar ratio) of the total amount of substances constituting the lipid membrane. ) Note that the lower limit of the content of the membrane stabilizer is zero.
  • Examples of the film stabilizer include sterol, glycerin or fatty acid esters thereof. Can be mentioned. Specific examples of the sterol are the same as those described above, and examples of the glycerin fatty acid ester include triolein and trioctanoin.
  • the antioxidant is an optional component of the lipid membrane that can be contained to prevent lipid membrane acidification, and the amount of antioxidant contained in the lipid membrane is Is usually 30% (molar ratio) or less, preferably 25% (molar ratio) or less, and more preferably 20% (molar ratio) or less.
  • the lower limit of the antioxidant content is 0.
  • antioxidants examples include tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene and the like.
  • the charged substance is an optional component of the lipid membrane that can be contained to impart positive charge or negative charge to the lipid membrane, and the amount of the charged substance contained in the lipid membrane is determined by the lipid membrane. It is usually 30% (molar ratio) or less, preferably 25% (molar ratio) or less, and more preferably 20% (molar ratio) or less of the total amount of the substances constituting the above. The lower limit of the charged substance content is zero.
  • Examples of the charged substance imparting a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane and the like.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • a membrane protein is an optional component of a lipid membrane that can be contained in order to maintain the structure of the lipid membrane or to impart functionality to the lipid membrane, and is contained in the lipid membrane.
  • the amount of membrane protein is usually 10% (molar ratio) or less, preferably 5% (molar ratio) or less, more preferably 2% (molar ratio) or less of the total amount of substances constituting the lipid membrane.
  • the lower limit of the membrane protein content is zero.
  • membrane proteins include membrane surface proteins and membrane integral proteins.
  • lipid constituting the lipid membrane a lipid derivative having a blood retention function, a temperature change sensitivity function, a pH sensitivity function, or the like may be used.
  • one or more of the above functions can be imparted to the ribosome.
  • Retention mechanism in blood in ribosome By imparting the ability, the retention of ribosomes in the blood can be improved, and the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen can be reduced.
  • the ribosome a temperature change-sensitive function and a Z- or PH-sensitive function, the release of the target substance encapsulated in the ribosome can be enhanced.
  • Examples of the blood-retaining lipid derivative capable of imparting the blood-retaining function include, for example, glycophorin, gandarioside GM1, phosphatidylinositol, gandarioside GM3, glucuronic acid derivative, glutamic acid derivative, and polyglycerin phospholipid derivative.
  • Examples of the temperature change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature change sensitive function include dipalmitoylphosphatidylcholine and the like.
  • Examples of the pH sensitive lipid derivative capable of imparting a pH sensitive function include, for example, di And oleoylphosphatidylethanolamine.
  • the ribosome of the present invention has a lipid membrane containing bacterial cell components insoluble in water and organic solvents.
  • bacterial cell components are contained in one lipid membrane of the ribosome, and when the ribosome is a multilamellar ribosome, one or more of the plurality of lipid membranes of the ribosome
  • the lipid membrane contains bacterial cell components.
  • the amount of bacterial cell components contained in the lipid membrane is usually 1 to 15% (weight ratio), preferably 2 to 10% (weight ratio), more preferably 3 to 7 of the total amount of substances constituting the lipid membrane. % (Weight ratio).
  • Bacterial cell components are insoluble in water and organic solvents (eg, black mouth form, dichloroacetic acid, methanol, ethanol, ether, jetyl ether, hexane, tetrahydrofuran, etc.).
  • organic solvents eg, black mouth form, dichloroacetic acid, methanol, ethanol, ether, jetyl ether, hexane, tetrahydrofuran, etc.
  • cell wall fractions or cell wall skeleton fractions of Mycopacteria bacteria, Nocardia bacteria, Corynebatarum bacteria, Rhodococcus bacteria and the like can be mentioned as long as they are soluble.
  • the cell wall of the genus Mycopacteria contains mycolic acid (fatty acid), arabinogalatatan (polysaccharide), and a polymer that has the power of peptide darlicans, and this polymer constitutes the basic structure of the cell wall. .
  • This basic structure is called “Cell-Wall Skeleton (CWS)”.
  • the composition and preparation method of the cell wall fraction are not particularly limited as long as the cell wall skeleton is the main component.
  • the cell wall fraction can be prepared by the following method. Suspend the heated dead cells in 10 volumes of purified water and crush the cells by French press treatment. Subsequently, the cell disruption solution is centrifuged at 6760 X g to remove unbroken cells, and the centrifuged supernatant is further centrifuged at 18000 X g to obtain a cell wall fraction as a sediment.
  • the median diameter of micelles formed by suspending a cell wall fraction (for example, BCG-CW) in water, buffer, etc. is usually 120 to 320 nm, preferably 170 to 270, more preferably 220. . The median diameter is measured with a particle size distribution meter, for example.
  • the cell wall skeleton fraction is a fraction obtained by purifying the cell wall skeleton from the cell wall fraction, and can be prepared, for example, by the following method.
  • the cells were suspended wall fraction in a phosphate buffer, thereby decomposing and removing the cell wall bound nucleic acid (e.g. oligo DNA) by DNase treatment, pronase (pronase) and trypsin (trypsin) decomposition to remove cell wall bound protein by treatment.
  • the lipid is extracted and removed by extraction with an organic solvent (for example, tetrahydrofuran).
  • an organic solvent for example, tetrahydrofuran
  • the median diameter of micelles formed by suspending a cell wall skeletal fraction (for example, BCG-CWS) in water, a buffer solution or the like is usually 80 to 180 nm, preferably 100 to 150 nm, more preferably 130 nm.
  • the median diameter is measured with a particle size distribution meter, for example.
  • Mycobacterium bacteria, Nocardia bacteria, Corynebatarum bacteria, Rhodococcus The cell wall fraction or cell wall skeleton fraction of the genus bacteria and the like is insoluble in water and organic solvents and has an immune activation action (adjuvant activity, immunostimulation action).
  • the peptide darican part and the mycolic acid part are important for immune activity.
  • Components other than the cell wall skeleton contained in the cell wall fraction for example, lipomannan, trehalo monomycolate) also contribute to the immune activity.
  • Mycobacterium bacteria include tuberculosis groups such as M. tuberculosis, M. bo vis, M. africanum, M. microti, M. canettii, and M. bovis BCG.
  • Nocardia bacteria examples include N. asteroides, N. brasiliensis, and N. rubra.
  • Corynebacterium bacteria examples include C. diphtheriae and C. ulcerans.
  • BCG-CW cell wall fraction
  • BCG-CWS cell wall skeleton fraction
  • BCG is an attenuated bacterium produced by repeated laboratory cultures of Mycobacterium bovis, and is hardly pathogenic to humans.
  • the functional domains contained in BCG CW or BCG-CWS include the structure shown in Fig. 1, lipomannan (LM), lipoarabinomannan (LAM), diphosphatidylinositol (PIM2) or hexamanoside (PIM6) and Contains code factor (TDM).
  • the ribosome of the present invention preferably has a peptide containing a plurality of continuous arginine residues on its surface.
  • the number of consecutive arginine residues is not particularly limited as long as it is plural, but it is usually 4 to 20, preferably 6 to 12, and more preferably 7 to 10.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide is not particularly limited, but is usually 4 to 35, preferably 6 to 30, and more preferably 7 to 23. It is preferable that the peptide is capable of including an arbitrary amino acid sequence at the C-terminal and Z- or N-terminal of a plurality of consecutive arginine residues.
  • the amino acid sequence added to the C-terminal or N-terminal of a plurality of consecutive arginine residues is preferably an amino acid sequence having rigidity (for example, polyproline).
  • Polyproline is Unlike polyethylene glycol (PEG), which is soft and irregularly shaped, it is linear and retains a certain degree of rigidity.
  • the amino acid residue contained in the amino acid sequence added to the C-terminal or N-terminal of a plurality of consecutive arginine residues is preferably an amino acid residue other than acidic amino acids. This is because an acidic amino acid residue having a negative charge may electrostatically interact with a positively charged arginine residue and attenuate the effect of the arginine residue.
  • the amount of the peptide present on the surface of the ribosome is usually 0.1 to 30% (molar ratio), preferably 0.2 to 25% (molar ratio), more preferably the total lipid constituting the ribosome. 0.5 to 20% (molar ratio).
  • the ribosome of the present invention can be transferred into the cell via the peptide present on the surface (WO2005Z032593). reference).
  • the amount of peptide present on the surface of the ribosome Less than 2% (molar ratio), preferably less than 1.5% (molar ratio), more preferably less than 1% (molar ratio) based on the total lipid constituting the ribosome.
  • the ribosome can be transferred into the cell mainly via endocytosis (see WO2005Z032593).
  • the lower limit of the peptide amount at this time is usually 0.1% (molar ratio), preferably 0.5% (molar ratio), more preferably 0.7% (molar ratio) with respect to the total lipid constituting the ribosome. Ratio).
  • the amount of peptide present on the surface of the ribosome is 2% (molar ratio) or higher, preferably 3% (molar ratio) or higher, more preferably 4% (molar ratio) or higher, with respect to the total lipid constituting the ribosome.
  • Ribosomes can be transferred into cells mainly via macropinocytosis (see WO2005Z032593).
  • the upper limit of the amount of peptide is usually 30% (molar ratio), preferably 25% (molar ratio), more preferably 20% (molar ratio) with respect to the total lipid constituting the ribosome.
  • the ribosome In macropinocytosis, extracellular substances are taken up into cells as a fraction called macropinosome, and unlike macrosomes, macropinosomes do not fuse with lysosomes. Can be avoided. Therefore, when the liposome is transferred into the cell via macropinocytosis, the ribosome can be transferred into the cell efficiently. [0050] When the ribosome translocation pathway depends on endocytosis, the lipid membrane must contain cationic lipid as its main component, but the ribosome translocation pathway does not depend on endocytosis In some cases, it is not necessary for the lipid membrane to contain a cationic lipid, and the cytotoxicity due to the cationic lipid can be reduced.
  • the ratio of the cationic lipid to the total lipid constituting the liposome is preferably 0 to 40% (molar ratio), and more preferably 0 to 20% (molar ratio).
  • Examples of the cationic lipid include DODAC (dioctadecyldimethylammonium chlori de), DOTMA (N- (2,3-dioleyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium), DDAB (did odecylammonium bromide), DOTAP (l , 2-dioleoyloxy- 3-trimethylammonio propane), DC— Choi (3 ⁇ — N— ( ⁇ ', ⁇ ', — dimethy) aminoethane) — carbamol cholesterol), DM RIE (1, 2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium ), DOSPA (2,3-dioleyloxy—N— [2 (sperminecarboxamido) ethyl] —N, N—dimethyl— 1—propanaminum trifluo roacetate), etc., and non-power thionic lipids (neutral
  • a peptide containing a plurality of consecutive arginine residues is modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound, and the hydrophobic group or hydrophobic compound is inserted into the lipid membrane forming the surface of the ribosome.
  • the peptide is preferably present on the surface of the ribosome by being exposed from the lipid membrane forming the surface of the ribosome.
  • Peptides containing multiple consecutive arginine residues maintain a certain orientation and are present on the ribosome surface, so that liposomes can be efficiently transferred into cells via macropinocytosis. it can.
  • the hydrophobic group or the hydrophobic compound is not particularly limited as long as it can be inserted into the lipid membrane.
  • the lipid membrane is composed of a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, and the hydrophobic group or the hydrophobic compound is inserted into the lipid membrane in a state of being hydrophobically bonded to the hydrophobic portion of the lipid membrane.
  • a hydrophobic group examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid groups such as stearyl groups, cholesterol groups or derivatives thereof, among which fatty acid groups having 10 to 20 carbon atoms (for example, normitoyl group, oleyl group, stearyl group). Group, arachidoyl group and the like).
  • hydrophobic compound examples include phospholipids, glycolipids or sterols exemplified above, long-chain aliphatic alcohols (for example, phosphatidylethanolamine, cholesterol, etc.), polyoxypropylene alkyl, glycerin.
  • long-chain aliphatic alcohols for example, phosphatidylethanolamine, cholesterol, etc.
  • polyoxypropylene alkyl examples include fatty acid esters.
  • the lipid that is a component of the lipid membrane, a predetermined bacterial cell component, and a predetermined peptide modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound are mixed, and the organic solvent is removed by evaporation.
  • the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; aromatic carbonization such as benzene and toluene.
  • the lipid membrane is hydrated, stirred or sonicated to produce a ribosome having a lipid membrane containing a predetermined bacterial cell component and having a predetermined peptide on the surface.
  • a lipid that is a component of the lipid membrane and a predetermined bacterial cell component are mixed, and the organic solvent is evaporated and removed to obtain a lipid membrane.
  • the lipid membrane is hydrated and stirred or superhydrated.
  • a ribosome having a lipid membrane containing a predetermined bacterial cell component is produced.
  • a predetermined peptide modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound is added to the external solution of the ribosome, and the predetermined peptide is introduced onto the ribosome surface.
  • a ribosome having a certain particle size distribution By passing the ribosome through a filter having a predetermined pore size, a ribosome having a certain particle size distribution can be obtained.
  • conversion to multilamellar liposome force single membrane ribosome and conversion to single membrane ribosome force multilamellar ribosome can be performed.
  • a bacterial cell component without using a surfactant can be formulated into a form that can be applied to a living body (a form that can be dispersed in an aqueous solvent and has a controlled size).
  • bacterial cell components can be efficiently introduced into the cell.
  • the types of cells into which bacterial cell components should be introduced are not particularly limited. Examples include rod-shaped cells, macrophages (macrophages), ⁇ lymphocytes, mononuclear cells, polymorphonuclear leukocytes, and tumor cells. It is done.
  • the pharmaceutical composition containing the ribosome of the present invention can be used for pharmaceutical use according to the action of bacterial cell components.
  • the pharmaceutical composition containing the ribosome of the present invention can be used as an immunostimulator (adjuvant).
  • the immune activator can activate humoral immunity (antibody production) and cellular immunity by activating immune cells such as rod-shaped cells (antigen-presenting cells).
  • the immune activator may activate the immune cell by being taken up by the immune cell, or may activate the immune cell by acting on the external force of the immune cell.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include a ribosome dispersion or a dried product thereof (eg, a lyophilized product, a spray-dried product, etc.).
  • a ribosome dispersion or a dried product thereof eg, a lyophilized product, a spray-dried product, etc.
  • the dispersion solvent for example, a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer solution, queen buffer solution, and acetate buffer solution can be used.
  • additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH adjusters, hydration accelerators may be added to the dispersion.
  • the pharmaceutical composition can also be used in any case, both in vivo and in vitro.
  • the administration route includes, for example, parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration. It can be appropriately adjusted according to the amount and the like.
  • ribosome suspension was prepared by rotating the rotary evaporator with air pressure (no vacuum).
  • ImM rhodamine red
  • the obtained ribosome suspension is permeated through the 0.8 m, 0.4 m, and 0.1 m membranes multiple times (etastruder treatment), so that ribosome with a small particle diameter (about 120 nm) Prepared.
  • This ribosome has a lipid membrane containing BCG-CW and has STR-R8 on its surface (hereinafter referred to as “R8-modified BCG ribosome”).
  • BCG-CW was prepared by Nippon Bijijichi Manufacturing Co., Ltd. using the following method. BCG heated dead cells were suspended in 10 volumes of purified water, and the cells were disrupted by French press treatment. Subsequently, the cell disruption solution was centrifuged at 6760 X g to remove unbroken cells, and the supernatant obtained by centrifuging the supernatant at 18000 X g was lyophilized to obtain BCG-CW.
  • the median diameter of micelles formed by suspending BCG-CW thus obtained in purified water or the like is usually 120 to 320 nm, preferably 170 to 270 nm, more preferably 220 nm as measured with a particle size distribution meter. .
  • Lipid? 701 0 1 7: 3 (molar ratio)) in a chloroform solution (lipid amount: 10 mol) and FTSC-labeled BCG—CW (BCG—CW amount) suspended in chloroform Z-ethanol (2: 1): 0.4 mg), and dried under reduced pressure on a rotary evaporator to prepare a lipid thin film containing BCG-CW but not STR-R8, and then treating in the same manner as above.
  • Liposomes having a lipid membrane containing BCG—CW and no STR—R8 on the surface were prepared (hereinafter “R8 unmodified BCG ribosome” t).
  • NIH3T3 cells 2.5 ⁇ 10 5 cells Z60 mm dish
  • NIH3T 3 cells are then treated with blood containing R8 modified or unmodified BCG ribosomes (final lipid concentration 50 ⁇ ).
  • Incubation was performed in a clean DMEM culture medium. Incubation was for 1 hour at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells were washed and then observed with a confocal laser microscope without fixation.
  • BCG ribosome or R8-modified BCG ribosome was added in an amount of 3.3 mg and cultured at 37 ° C for 1 hour. Analysis of the amount of intracellular fluorescence using flow cytometry (BD Biosciences) showed that the amount of intracellular fluorescence increased in the R8-modified BCG ribosome, and the increase in the amount of intracellular uptake by STR-8 modification was confirmed. (Fig. 4).
  • STR-R8 solution (STR-R8 amount: the amount of lipid 0.8 or 5 moles 0/0) were mixed and vacuum dryness in a rotary evaporator, BCG CW and STR —
  • a lipid thin film containing R8 was prepared and treated in the same manner as in Example 1 to prepare a ribosome having a lipid membrane containing BCG-CW and STR-R8 on the surface (the amount of STR-R8 was following what is 0.8 mol 0/0 of the amount of lipid is referred to as "low-density R8 qualified BCG ribosome", following what is 5 mol 0/0 and "high density R8 qualified BCG ribosome"!, U).
  • Lipid? 701 0 1 7: 3 (molar ratio)) in a chloroform solution (lipid amount: 10 mol) and FTSC-labeled BCG—CW (BCG—CW amount) suspended in chloroform Z-ethanol (2: 1): 0.4 mg) and then dried under reduced pressure on a rotary evaporator to prepare a lipid film containing BCG-CW but not STR-R8, and then treating in the same manner as in Example 1. V and ribosomes having a lipid membrane containing BCG-CW and STR-R8 on the surface were prepared (hereinafter referred to as “R8 non-modified BCG ribosome”).
  • Lipid? 701 0 1 7: 3 (molar ratio)) chloroform solution (lipid amount: 10 mol) and ST 1 ⁇ 1 ⁇ 8 aqueous solution (3 1 1 ⁇ 1 ⁇ 8 amount: 0.8 mol 0 of lipid amount) / 0 ) and drying under reduced pressure using a rotary evaporator, a lipid thin film containing STR-R8 but not BCG-CW is prepared and treated in the same manner as in Example 1.
  • a ribosome having a lipid membrane not containing BCG-CW and having STR-R8 on its surface was prepared (hereinafter referred to as “low density R8-modified BCG-free ribosome”!).
  • Lipid? Flip 701 0 1 7: 3 (molar ratio)) chloroform solution (the amount of lipid: 10 mol), under reduced pressure to dryness at mouth one rotary evaporator, 8 Ji 0 Ji 1 ⁇ ⁇ also 3-chome 1
  • a lipid thin film not containing ⁇ 1 ⁇ 8 was prepared and treated in the same manner as in Example 1.
  • a lipid membrane containing BCG-CW, a STR-R8 on the surface, and a ribosome containing BCG-CW were prepared. (Hereinafter referred to as “R8 non-modified BCG-free ribosome”!).
  • Various ribosomes were added to a serum-free medium of rod-shaped cells (DC) isolated from mouse bone marrow, incubated at 37 ° C for 2 hours, and then cultured in the presence of serum for 22 hours. The presence or absence of activity was examined. As markers of DC activity, superficial marker proteins CD86 and CD80, and MHCII involved in antigen presentation, were selected. Using a fluorescent labeled antibody against each protein, a flow cytometer (FACS) was used to control the markers in each treatment group. The amount of protein per force was measured.
  • DC rod-shaped cells
  • Spider cells treated with modified BCG ribosomes ⁇ LowR8 Lip / BCG-CW '' are spider cells treated with low density R8 modified BCG ribosomes, ⁇ HighR8 Lip / BCG-CWJ are treated with high density R8 modified BCG ribosomes As shown in Fig. 5, high-density R8-modified BCG ribosome exerted high immune cell activity ability similar to LPS which is a typical adjuvant.
  • the bladder cancer cell line MBT-2 (RIKEN) was cultured at 37 ° C, 5% CO. 7 week old C3HZ
  • mice (Charles River) were divided into groups A to G, and 0.7 ⁇ 10 ⁇ MBT-2 and each of the following samples were transplanted on the right side of the back of each group of mice.
  • Group A 100 ⁇ 1 PBS buffer (6 animals)
  • Group B lmg BCG (BCG Corporation) ZlOO ⁇ 1 PBS buffer (6 mice)
  • Group C lmg BCG prepared in Example 1—CWZ 100 ⁇ 1 PBS buffer (18 mice)
  • Group D 0. lmg BCG—CWZlOO ⁇ 1 PBS buffer prepared in Example 1 (6 mice)
  • Group E PBS buffer solution (18 mice) of R8-modified BCG-rich ribosome Z 100 ⁇ 1 having a lipid membrane containing lmg of BCG—CW prepared in Example 1 and STR-R 8 on the surface
  • Group F 0. lmg BCG prepared in Example 1 with a lipid membrane containing CW and STR — R8 on the surface R8-modified BCG low ribosome ZlOO ⁇ 1 in PBS buffer (6 mice)
  • Group G BCG — Without CW! /, With lipid membrane, STR—With no R8 on the surface! /, R8 unmodified BCG-free ribosome ZlOO ⁇ 1 in PBS buffer (6 mice)
  • the above ribosome is the production of the low-density R8-modified BCG ribosome described in Example 2. In the method, it was prepared by changing the content of BCG-CW. The R8-unmodified BCG-free ribosome was prepared in the same manner as described in Example 2.
  • mice After each group of mice was bred for 4 weeks, the tumor tissue derived from the transplanted cancer cells was excised and the size (mm 2 ) was measured to confirm the tumor regression effect of each sample. The results are shown in Table 1.

Abstract

　水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分（例えばＢＣＧ－ＣＷ）を、界面活性剤を用いることなく、生体に適用可能な形態（水系溶媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができるリポソームを提供する。 　水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分（例えばＢＣＧ－ＣＷ）を含む脂質膜を有するリポソームを提供する。

Description

明 細 書
細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリボソーム
技術分野
[0001] 本発明は、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリポ ノーム、並びに該リボソームを含有する医薬組成物に関する。
背景技術
[0002] 薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するためのベタ ターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、 目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウ ィルス、アデノ関連ウィルス等のウィルスベクターが開発されている。し力しながら、ゥ ィルスべクタ一は、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このよう な問題点が少ないリボソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポ ソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入するこ とにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。
[0003] 最近、凝縮ィ匕 DNA封入リボソームの表面をステアリルィ匕ォクタアルギニンで修飾す ることにより、凝縮ィ匕 DNAの細胞導入効率が 1000倍、凝縮ィ匕 DNA封入リボソーム の細胞への導入効率が 100倍向上したことが報告されている（特許文献 1,非特許 文献 1及び 2)。また、表面をステアリルィ匕ォクタアルギニンで修飾したリボソームは、 原形を保ったまま (インタタト (intact)な状態で)細胞内に導入できることが報告されて いる (特許文献 1,非特許文献 1及び 2)。
[0004] BCG (Mycobacterium bovis bacillus Calmette— Guerin、弱毒牛型結核菌） は、結核に対するワクチン作用の他に、腫瘍退縮効果を有することが知られている。 この腫瘍退縮効果は、 BCGの持つ強力なアジュバント (免疫賦活化)作用によって 細胞性免疫が活性化される、いわゆる腫瘍免疫治療効果が発揮されることによるもの と考えられている。
[0005] し力しながら、生きた結核菌をヒトに投与することで生じる副作用が、 BCGの腫瘍治 療への臨床応用への妨げとなっていた。この副作用の問題に対して、細菌菌体成分 、例えば BCGの細胞壁画分である BCG— CWをアジュバントとする方法が着目され ている。しカゝしながら、 BCG— CW等の細菌菌体成分は、特殊な構造及び物理化学 的性質を有しているため、水及び有機溶媒に不溶である。また、負電荷を有するため 、同じ負電荷を有する細胞膜との親和性が低ぐ細胞への取込効率が低いという問 題を有している。さらに、 BCG— CW等の細菌菌体成分は界面活性剤により可溶ィ匕 する必要があるが、界面活性剤による刺激等の副作用が問題となり得る他、界面活 性剤により可溶化された細菌菌体成分は、粒子径が大きく（約 300nm以上）、負電 荷を帯びて 、るため、細胞への取込効率が依然として低 、と 、う問題は依然として解 消されない。
特許文献 1：国際公開 WO2005Z032593号パンフレット
非特許文献 l : Kogure等，「Journal of Controlled Release] , 2004年， 98卷， 317-323 頁
非特許文献 2 :力リル'イクラミ等， rYAKUGAKU ZASSHIJ , 2004年， 124卷， Suppl.4, 1 13-116頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分 (例えば BCG— CW)を、界 面活性剤を用いることなぐ生体に適用可能な形態 (水系溶媒に分散可能であり、か つサイズが制御された形態）に製剤化することができるリボソーム、並びに該リポソ一 ムを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上記課題を解決するために、本発明は、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成 分を含む脂質膜を有するリボソーム、及び該リボソームを含有する医薬組成物を提供 する。本発明のリボソームによれば、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を、 界面活性剤を用いることなぐ生体に適用可能な形態 (水系溶媒に分散可能であり、 かつサイズが制御された形態）に製剤化することができる。
[0008] 本発明のリボソームにおいて、前記細菌菌体成分が、ミコバタテリゥム属細菌、ノカ ルジァ属細菌、コリネバタテリゥム属細菌又はロドコッカス属細菌の細胞壁画分又は 細胞壁骨格画分であることが好ましぐ前記ミコパクテリゥム属細菌が BCGであること が好ましい。
[0009] 本発明のリボソームは、リボソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含 むペプチドを有することが好ましい。これにより、本発明のリボソームは、主としてマク 口ピノサイト一シスを介して細胞内に移行することができるので、水及び有機溶媒に 不溶性の細菌菌体成分を細胞内に効率よく導入することができる。
[0010] 本発明のリボソームにおいて、前記ペプチドが、連続した 4〜20個のアルギニン残 基を含む 4〜35個のアミノ酸残基力もなるペプチドであることが好ましい。
[0011] 本発明のリボソームにおいて、前記ペプチドがアルギニン残基のみ力もなることが 好ましい。
[0012] 本発明のリボソームにおいて、前記ペプチドの量が、前記リボソームを構成する総 脂質に対して 2% (モル比）以上であることが好ま 、。
[0013] 本発明のリボソームにおいて、前記ペプチドが疎水性基又は疎水性ィ匕合物で修飾 されており、前記疎水性基又は前記疎水性化合物が前記リボソームの表面を形成す る脂質膜に挿入され、前記ペプチドが前記リボソームの表面を形成する脂質膜から 露出して!/、ることが好まし!/、。
[0014] 本発明の医薬組成物において、前記細菌菌体成分が免疫活性化作用を有し、前 記医薬組成物が免疫活性化剤であることが好ましい。
発明の効果
[0015] 本発明により、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分 (例えば BCG— CW)を 、界面活性剤を用いることなぐ生体に適用可能な形態 (水系溶媒に分散可能であり 、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができるリボソーム、並びに該リポ ソームを含有する医薬組成物が提供される。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]BCG— CWに含まれる機能ドメインの構造を示す図である。
[図 2]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
[図 3]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
[図 4]R8修飾 BCGリボソームを取り込んだ膀胱癌細胞株 MBT— 2のフローサイトメト リーを用 ヽた細胞内蛍光量の解析結果を示す。
[図 5]MBT— 2に取り込まれた R8修飾 BCGリボソームの細胞内局在性を示す。左上 の青色は Hoechst33342TMによる発光を、右上の緑色は R8修飾 BCGリボソームに よる発光を、左下の赤色は LyosotrackerRedTMによる発光を、右下は 3種類の発光 の重ね合わせをそれぞれ示す。
[図 6]CD86、 CD80及び MHCIIを指標とした榭状細胞の活性ィ匕の測定結果を示す 図である。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明のリボソームは、脂質膜 (脂質二重膜)を有する閉鎖小胞であり、本発明のリ ポソームが有する脂質膜の数は特に限定されるものではない。本発明のリボソームは 、多重膜リボソーム（ML V)であってもよいし、 SUV (small unilamellar vesicle)、 LUV (large unilamellar vesicle)、 GUV giant unilamellar vesicle)等の 1枚膜リホノ ~~ムで あってもよい。本発明のリボソームのサイズは特に限定されるものではないが、直径 5 0〜300nmであることが好ましぐ直径 100〜200nmであることがさらに好ましい。
[0018] 脂質膜の構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜 タンパク質等が挙げられる。
[0019] 脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、脂質膜に含有される脂質量は、脂質膜を 構成する総物質量の通常 70% (モル比）以上、好ましくは 75% (モル比）以上、さら に好ましくは 80% (モル比)以上である。なお、脂質膜に含有される脂質量の上限値 は、脂質膜を構成する総物質量の 100%である。
[0020] 脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不 飽和の脂肪酸等が挙げられる。
[0021] [リン脂質]
ホスファチジルコリン（例えば、ジォレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホス ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコ リン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、 ジォレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、 ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール 、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールァミン（例え ば、ジラウロイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルェタノ ールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチ ジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファ チジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールァミン、セ ラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、 1,2—ジミリ ストイルー 1,2—デォキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆 レシチン、これらの水素添加物等。
[0022] [糖脂質]
グリセ口糖脂質 (例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジ ガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフインゴ 糖脂質 (例えば、ガラクトシルセレブ口シド、ラタトシルセレブ口シド、ガンダリオシド)等
[0023] [ステロ一ノレ]
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタ ノーノレ、ラノステロ一ノレ、ジヒドロラノステロ一ノレ、デスモステロ一ノレ、ジヒドロコレステロ ール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シト ステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例 えば、チモステロール、エルゴステロール）等。
[0024] [飽和又は不飽和の脂肪酸]
ノルミチン酸、ォレイン酸、ステアリン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数 12 〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸等。
[0025] 膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調 節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質 膜に含有される膜安定化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常 30% (モル比) 以下、好ましくは 25% (モル比）以下、さらに好ましくは 20% (モル比）以下である。な お、膜安定化剤の含有量の下限値は 0である。
[0026] 膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が 挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪 酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
[0027] 抗酸化剤は、脂質膜の酸ィ匕を防止するために含有させることができる、脂質膜の任 意の構成成分であり、脂質膜に含有される抗酸化剤量は、脂質膜を構成する総物質 量の通常 30% (モル比）以下、好ましくは 25% (モル比）以下、さらに好ましくは 20% (モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は 0である。
[0028] 抗酸化剤としては、例えば、トコフエロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸ァスコ ルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
[0029] 荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができ る、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される荷電物質量は、脂質膜を 構成する総物質量の通常 30% (モル比）以下、好ましくは 25% (モル比）以下、さら に好ましくは 20% (モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は 0であ る。
[0030] 正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルァミン、ォレイルァミン等の 飽和又は不飽和脂肪族ァミン；ジォレオイルトリメチルアンモ -ゥムプロパン等の飽和 又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては 、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルへミスクシネート、ホスファチジルセリン 、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
[0031] 膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするた めに含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される 膜タンパク質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常 10% (モル比)以下、好ましく は 5% (モル比）以下、さらに好ましくは 2% (モル比）以下である。なお、膜タンパク質 の含有量の下限値は 0である。
[0032] 膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げ られる。
[0033] 脂質膜を構成する脂質として、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、 pH感受 性機能等を有する脂質誘導体を使用してもよい。これにより、上記機能のうち 1種又 は 2種以上の機能をリボソームに付与することができる。リボソームに血中滞留性機 能を付与することにより、リボソームの血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等 の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。リボソームに温度変化感 受性機能及び Z又は PH感受性機能を付与することにより、リボソームに封入された 目的物質の放出性を高めることができる。
[0034] 血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、 グリコフォリン、ガンダリオシド GM1、ホスファチジルイノシトール、ガンダリオシド GM 3、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、 N—{力 ルポ-ル-メトキシポリエチレングリコール— 2000}— 1,2—ジパルミトイル— sn—グリ セロー 3—ホスフォエタノールァミン、 N—{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール - 5000}— 1,2-ジパルミトイル sn グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン、 N— { カルボ-ル―メトキシポリエチレングリコール— 750}— 1,2—ジステアロイル— sn—グ リセロー 3—ホスフォエタノールァミン、 N—{カルボ-ルーメトキシポリエチレングリコー ル 2000}— 1,2 ジステアロイル sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン、 N - {カルボ-ル—メトキシポリエチレングリコール― 5000}—1,2—ジステアロイル - sn ーグリセロー 3—ホスフォエタノールァミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙 げられる。
[0035] 温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては 、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、 pH感受性機能を付与 することができる pH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジォレオイルホスファチジ ルエタノールァミン等が挙げられる。
[0036] 本発明のリボソームは、水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜 を有する。リボソームが 1枚膜リボソームである場合、リボソームが有する 1枚の脂質膜 に細菌菌体成分が含まれ、リボソームが多重膜リボソームである場合、リボソームが 有する複数の脂質膜のうち、 1又は 2以上の脂質膜に細菌菌体成分が含まれる。脂 質膜に含有される細菌菌体成分量は、脂質膜を構成する総物質量の通常 1〜15% (重量比）、好ましくは 2〜10% (重量比）、さらに好ましくは 3〜7% (重量比）である。
[0037] 細菌菌体成分は、水及び有機溶媒 (例えば、クロ口ホルム、ジクロロ酢酸、メタノー ル、エタノール、エーテル、ジェチルエーテル、へキサン、テトラヒドロフラン等）に不 溶性である限り特に限定されるものではなぐ例えば、ミコパクテリゥム属細菌、ノカル ジァ属細菌、コリネバタテリゥム属細菌、ロドコッカス属細菌等の細胞壁画分又は細 胞壁骨格画分が挙げられる。
[0038] ミコパクテリゥム属細菌の細胞壁は、ミコール酸 (脂肪酸）、ァラビノガラタタン (多糖） 及びペプチドダリカン力 なる高分子を含んでおり、この高分子により細胞壁の基本 構造が構成されている。この基本構造は「細胞壁骨格（Cell— Wall Skeleton ;CW S)」と呼ばれる。ミコパクテリゥム属細菌と分類上関連するノカルジァ属細菌、コリネバ クテリゥム属細菌、ロドコッカス属細菌等も、ミコパクテリゥム属細菌と同様の細胞壁骨 格を有する。
[0039] 細胞壁画分は、細胞壁骨格を主成分とする限り、その組成、調製方法等は特に限 定されるものではないが、例えば、次の方法により調製することができる。加熱死菌体 を 10倍容の精製水に懸濁し、フレンチプレス処理により菌体を破砕する。次いで、菌 体破砕液を 6760 X gで遠心することにより未破砕菌体を除去し、遠心上清をさらに 1 8000 X gで遠心することにより細胞壁画分を沈渣として得ることができる。細胞壁画 分 (例えば BCG— CW)を水、緩衝液等に懸濁することにより形成されるミセルのメジ アン径は、通常 120〜320nm、好ましくは 170〜270應、さらに好ましくは 220應 である。なお、メジアン径は例えば粒度分布計で測定する。
[0040] 細胞壁骨格画分は、細胞壁画分から細胞壁骨格を精製して得られる画分であり、 例えば、次の方法により調製することができる。細胞壁画分をリン酸緩衝液に懸濁し 、 DNase処理により細胞壁結合核酸 (例えばオリゴ DNA)を分解除去するとともに、 プロナーゼ (pronase)及びトリプシン (trypsin)処理により細胞壁結合タンパク質を分 解除去する。次いで、有機溶媒 (例えばテトラヒドロフラン)抽出処理により脂質を抽 出除去する。これにより、細胞壁骨格画分を、上記処理後の水及び有機溶媒に不溶 性の残渣として得ることができる。細胞壁骨格画分 (例えば BCG— CWS)を水、緩衝 液等に懸濁することにより形成されるミセルのメジアン径は、通常 80〜180nm、好ま しくは 100〜150nm、さらに好ましくは 130nmである。なお、メジアン径は例えば粒 度分布計で測定する。
[0041] ミコバタテリゥム属細菌、ノカルジァ属細菌、コリネバタテリゥム属細菌、ロドコッカス 属細菌等の細胞壁画分又は細胞壁骨格画分は、水及び有機溶媒に不溶性であると ともに、免疫活性化作用（アジュバンド活性、免疫賦活作用）を有する。細胞壁骨格 のうち、ペプチドダリカン部分及びミコール酸部分が免疫活性ィ匕作用に関して重要で ある。細胞壁画分に含まれる細胞壁骨格以外の成分 (例えば、リポマンナン、トレハロ 一スミコレート)も免疫活性ィ匕作用に寄与している。
[0042] ミコバタテリゥム属（Mycobacterium)細菌としては、例えば、 M. tuberculosis, M. bo vis, M. africanum, M. microti, M. canettii、 M. bovis BCG等の結核 菌群が挙げられる。
[0043] ノカルジァ属（Nocardia)細菌としては、例えば、 N. asteroides、 N. brasiliensis 、 N. rubra等が挙げられる。
[0044] コリネバタテリゥム属（Corynebacterium)細菌としては、例えば、 C. diphtheriae 、 C. ulcerans等が挙げられる。
[0045] 細菌菌体成分としては、 BCGの細胞壁画分 (BCG— CW)又は細胞壁骨格画分（ BCG— CWS)を使用することが好ましい。 BCGは、ゥシ型結核菌（Mycobacterium b ovis)の実験室培養を繰り返して作製した弱毒性の細菌であり、ヒトに対してほとんど 病原性を示さな ヽ。 BCG CW又は BCG— CWSに含まれる機能ドメインは図 1に示 される構造物の他、リポマンナン（LM)、リポアラビノマンナン（LAM)、ジホスファチ ジルイノシトール（PIM2)又はへキサマンノシド（PIM6)及びコードファクター（TDM )を含有する。
[0046] 本発明のリボソームは、その表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むぺプ チドを有することが好ましい。連続したアルギニン残基の個数は複数個である限り特 に限定されるものではないが、通常 4〜20個、好ましくは 6〜12個、さらに好ましくは 7〜10個である。ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものでは ないが、通常 4〜35個、好ましくは 6〜30個、さらに好ましくは 7〜23個である。ぺプ チドは、連続した複数個のアルギニン残基の C末端及び Z又は N末端に任意のアミ ノ酸配列を含むことができる力 アルギニン残基のみ力もなることが好ましい。連続し た複数個のアルギニン残基の C末端又は N末端に付加されるアミノ酸配列は、剛直 性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン)であることが好ましい。ポリプロリンは、 柔ら力べて不規則な形をとっているポリエチレングリコール (PEG)と異なり、直線的で 、ある程度の堅さを保持している。また、連続した複数個のアルギニン残基の C末端 又は N末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸以外 のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を 有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、アルギニン残基の効果を減弱させる 可能性があるためである。
[0047] リボソーム表面に存在するペプチドの量は、リボソームを構成する総脂質に対して 通常 0. 1〜30% (モル比）、好ましくは 0. 2〜25% (モル比）、さらに好ましくは 0. 5 〜 20% (モル比）である。
[0048] リボソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドが存在する場 合、本発明のリボソームは、その表面に存在するペプチドを介して細胞内へ移行する ことができる（WO2005Z032593号参照）。リボソーム表面に存在するペプチドの 量力 リボソームを構成する総脂質に対して 2% (モル比)未満、好ましくは 1. 5% (モ ル比)未満、さらに好ましくは 1% (モル比)未満であると、リボソームは、主にエンドサ イト一シスを介して細胞内へ移行することができる（WO2005Z032593号参照）。こ のときのペプチド量の下限値は、リボソームを構成する総脂質に対して通常 0. 1% ( モル比）、好ましくは 0. 5% (モル比）、さらに好ましくは 0. 7% (モル比）である。一方 、リボソーム表面に存在するペプチド量力 リボソームを構成する総脂質に対して 2% (モル比）以上、好ましくは 3% (モル比）以上、さらに好ましくは 4% (モル比）以上で あると、リボソームは、主にマクロピノサイト一シスを介して細胞内へ移行することがで きる（WO2005Z032593号参照）。このときのペプチド量の上限値は、リボソームを 構成する総脂質に対して通常 30% (モル比）、好ましくは 25% (モル比）、さらに好ま しくは 20% (モル比）である。
[0049] マクロピノサイト一シスでは、細胞外物質がマクロピノソームという画分として細胞内 に取り込まれ、マクロピノソームはエンドノームと異なりリソノームと融合しないため、マ クロピノソーム内封物はリソソーム〖こよる分解を回避することができる。したがって、リ ポソームがマクロピノサイト一シスを介して細胞内に移行する場合、リボソームは効率 よく細胞内に移行することができる。 [0050] リボソームの細胞内移行経路がエンドサイト一シスに依存する場合、脂質膜はその 主要成分としてカチオン性脂質を含む必要があるが、リボソームの細胞内移行経路 力 エンドサイト一シスに依存しない場合には、脂質膜にカチオン性脂質が含まれて いる必要はなぐカチオン性脂質による細胞毒性を低減させることができる。リポソ一 ムを構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は 0〜40% (モル比)であること が好ましぐ 0〜20% (モル比）であることがさらに好ましい。
[0051] カチオン性脂質としては、例えば、 DODAC (dioctadecyldimethylammonium chlori de)、 DOTMA (N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium)、 DDAB (did odecylammonium bromide)、 DOTAP (l,2- dioleoyloxy- 3- trimethylammonio propane )、 DC— Choi (3 β— N— (Ν',Ν',— dimethy卜 aminoethane)— carbamol cholesterol)、 DM RIE ( 1 ,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium)、 DOSPA (2,3— dioleyloxy—N—[2(sperminecarboxamido)ethyl]—N,N— dimethyl— 1—propanaminum trifluo roacetate)等が挙げられ、非力チオン性脂質（中性脂質又はァニオン性脂質)として は、例えば、ジァシルホスファチジルコリン、ジァシルホスファチジルエタノールァミン 、コレステロール、セラミド、スフインゴミエリン、セフアリン、セレブロシド等の中性脂質 ；カルジオリピン、ジァシルホスファチジルセリン、ジァシルホスファチジン酸、 N—スク シ-ルホスファチジルエタノールァミン（N—スクシ-ル PE)、ホスファチジン酸、ホス ファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコ ール、コレステロールコハク酸等のァ-オン性脂質が挙げられる。
[0052] 連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドは、疎水性基又は疎水性化合物 で修飾されており、疎水性基又は疎水性ィヒ合物がリボソームの表面を形成する脂質 膜に挿入され、ペプチドがリボソームの表面を形成する脂質膜から露出することによ り、リボソーム表面に存在することが好ましい。連続した複数個のアルギニン残基を含 むペプチドが一定の配向性を保持してリボソーム表面に存在することにより、リポソ一 ムはマクロピノサイト一シスを介して効率よく細胞内に移行することができる。
[0053] 疎水性基又は疎水性化合物は、脂質膜に挿入され得る限り特に限定されるもので ない。脂質膜は親水性部分と疎水性部分とからなるが、疎水性基又は疎水性化合物 は、脂質膜の疎水性部分と疎水結合した状態で脂質膜に挿入される。疎水性基とし ては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール基又は その誘導体等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数 10〜20の脂肪酸基 (例えば 、ノルミトイル基、ォレイル基、ステアリル基、ァラキドイル基等）が好ましい。また、疎 水性ィ匕合物としては、例えば、上記に例示したリン脂質、糖脂質又はステロール、長 鎖脂肪族アルコール（例えば、フォスファチジルエタノールァミン、コレステロール等） 、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
[0054] 水和法によるリボソームの製造例を以下に示す。
有機溶媒中で、脂質膜の構成成分である脂質と、所定の細菌菌体成分と、疎水性 基又は疎水性化合物で修飾された所定のペプチドとを混合し、有機溶媒を蒸発除 去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶媒としては、例えば、ペンタン、へキサ ン、ヘプタン、シクロへキサン等の炭化水素類;塩化メチレン、クロ口ホルム等のハロ ゲン化炭化水素類;ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類;メタノール、エタノー ル等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類；アセトン等のケ トン類等が挙げられ、これらを単独で又は 2種以上を組み合わせて使用することがで きる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、所定の細菌 菌体成分を含む脂質膜を備え、所定のペプチドを表面に有するリボソームを製造す ることがでさる。
[0055] 水和法による別の製造例を以下に示す。
有機溶媒中で、脂質膜の構成成分である脂質と、所定の細菌菌体成分とを混合し 、有機溶媒を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は 超音波処理することにより、所定の細菌菌体成分を含む脂質膜を備えたリボソームを 製造する。次いで、このリボソームの外液に、疎水性基又は疎水性化合物で修飾さ れた所定のペプチドを添加し、リボソーム表面に所定のペプチドを導入する。
[0056] リボソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分 布を持ったリボソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソ ーム力 一枚膜リボソームへの転換、一枚膜リボソーム力 多重膜リボソームへの転 換を行うことができる。
[0057] 水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を備えたリボソームによれ ば、界面活性剤を用いることなぐ細菌菌体成分を生体に適用可能な形態 (水系溶 媒に分散可能であり、かつサイズが制御された形態）に製剤化することができる。また 、リボソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを有するリポ ソームによれば、細菌菌体成分を細胞内に効率よく導入することができる。細菌菌体 成分を導入すべき細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、榭状細胞、 マクロファージ (大喰細胞）、 τリンパ球、単核球、多型核白血球、腫瘍細胞等が挙げ られる。
[0058] 本発明のリボソームを含有する医薬組成物は、細菌菌体成分の作用に応じた医薬 用途に使用することができる。例えば、細菌菌体成分が免疫活性化作用を有する場 合、本発明のリボソームを含有する医薬組成物を免疫活性化剤 (アジュバンド)として 使用することができる。免疫活性化剤は、榭状細胞 (抗原提示細胞)等の免疫細胞を 活性化することにより、体液性免疫 (抗体産生)及び細胞性免疫を活性化することが できる。免疫活性化剤は、免疫細胞に取り込まれることにより当該免疫細胞を活性ィ匕 してもよいし、免疫細胞の外部力 作用することにより当該免疫細胞を活性ィ匕しても よい。
[0059] 医薬組成物の剤形としては、例えば、リボソームの分散液又はその乾燥物（例えば 、凍結乾燥物、噴霧乾燥物等)が挙げられる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩 水、リン酸緩衝液，クェン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。 分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤 、抗酸化剤、 pH調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
[0060] 医薬組成物は、 in vivo及び in vitroの!ヽずれにお ヽても使用することもできる。医薬 組成物を in vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、 皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、細菌菌体成分の 種類や量等に応じて適宜調節することができる。
実施例
[0061] 〔実施例 1〕
脂質（卵黄ホスファチジルコリン (EPC) Zコレステロール（Choi) = 7:3 (モル比）） のクロ口ホルム溶液（脂質量： 10 μモル）と、クロ口ホルム Ζエタノール（2:1)に懸濁し た FTSC (Fluorescein- 5- thiosemicarbazide,緑色）標識化 BCG— CW (BCG— CW 量： 0. 4mg)と、ステアリルォクタアルギニン（STR— R8)水溶液（STR— R8量：脂質 量の 0. 8モル0 /0)とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより 、 BCG— CW及び STR— R8を含有する脂質薄膜を調製した。得られた脂質薄膜に 緩衝液（5mM HEPES, 0. 15M NaCl, pH7. 4) lmLをカ卩えて水和させた後、さ らにガラスビーズを添加し、 65°Cで 20分間、通常の空気圧 (減圧なし)でロータリー エバポレーターを回転させることによりリボソーム懸濁液を調製した。なお、リボソーム の水相マーカーとして、脂質薄膜を水和する緩衝液に ImMローダミン (赤色）を溶解 させておいた。得られたリボソーム懸淘液を、 0. 8 m、 0. 4 m、 0. 1 mの膜を 複数回透過させること（エタストリューダー処理）により、粒子径の小さな (約 120nm) リボソームを調製した。このリボソームは、 BCG— CWを含む脂質膜を有し、 STR-R 8を表面に有する（以下「R8修飾 BCGリボソーム」と 、う）。
[0062] なお、 BCG— CWは、次の方法を用いて日本ビーシージ一製造株式会社により調 製されたものを用いた。 BCG加熱死菌体を 10倍容の精製水に懸濁し、フレンチプレ ス処理により菌体を破砕した。次いで、菌体破砕液を 6760 X gで遠心することにより 未破砕菌体を除き、その上清を 18000 X gで遠心することにより得られた沈渣を凍結 乾燥して BCG- CWを得た。こうして得られる BCG— CWを精製水等に懸濁すること により形成されるミセルのメジアン径は、粒度分布計で測定すると、通常 120〜320n m、好ましくは 170〜270nm、さらに好ましくは 220nmである。
[0063] 脂質 ？じ70101= 7:3 (モル比））のクロロホルム溶液(脂質量：10 モル）と、ク ロロホルム Zエタノール（2:1)に懸濁した FTSC標識化 BCG— CW (BCG— CW量： 0. 4mg)とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、 BCG- CWは含有するが STR— R8は含有しない脂質薄膜を調製した後、上記と同様に処 理することにより、 BCG— CWを含む脂質膜を有し、 STR—R8を表面に有しないリポ ソームを調製した (以下「R8非修飾 BCGリボソーム」 t 、う）。
[0064] 共焦点レーザー顕微鏡による観察の下、 NIH3T3細胞（2. 5 X 105細胞 Z60mm ディッシュ）を 10%FBS含有 DMEM中でー晚インキュベートした。次いで、 NIH3T 3細胞を、 R8修飾又は非修飾 BCGリボソーム（最終脂質濃度 50 μ Μ)を含有する血 清不含 DMEM培養液中でインキュベートした。インキュベーションは、 37°Cで 1時間 行った。インキュベーション終了時に細胞を洗浄し、その後、固定することなく共焦点 レーザー顕微鏡により観察した。
[0065] その結果、図 2に示すように、 R8非修飾 BCGリボソームの場合、緑色（リボソームの 脂質膜に含まれる FTSC標識ィ匕 BCG— CW)及び赤色（リボソームの水相マーカー であるローダミン）はほとんど細胞内に観察されな力つた。このことは、 R8非修飾 BC Gリボソームの細胞への取込量が低!、ことを示す。 BCG - CWが負に帯電して!/、る ため、リボソーム表面も負に帯電しており（ゼータ電位：—2. 94mV)、負電荷を有す る細胞膜表面と反発するため、細胞への取込量が低いと考えられる。
[0066] 一方、図 3に示すように、 R8修飾 BCGリボソームの場合、緑色（リボソームの脂質膜 に含まれる FTSC標識ィ匕 BCG— CW)及び赤色（リボソームの水相マーカーである口 ーダミン）が細胞内で観察された。このことは、 R8修飾 BCGリボソームの細胞への取 込量が高いことを示す。 STR—R8修飾により、リボソーム表面が正に帯電しているた め（ゼータ電位： + 25. 59mV)、細胞への取込量が高いと考えられる。なお、 R8非 修飾 BCGリボソームによる細胞の形態学的変化は認められな力つた。
[0067] 次に、 10%仔牛胎児血清を添加した RPMI1640メディウム（Sigma社）を用いて 5 %COで培養した膀胱癌細胞株 MBT— 2 (理化学研究所) 5 X 105個に、 R8非修飾
2
BCGリボソーム又は R8修飾 BCGリボソームを 3. 3mg添カ卩して 37°C、 1時間培養を 行った。フローサイトメトリー（BD Biosciences社）を用いて細胞内蛍光量を解析した ところ、 R8修飾 BCGリボソームにおいて細胞内蛍光量が増加しており、 STR— 8修 飾による細胞内取り込み量の増加が確認された（図 4)。また、蛍光の可視化 30分前 に 75nMの LyosotrackerRed™及び Hoechst33342TMを用いてエンドソーム /リ ソソーム及び核をそれぞれ赤色と青色に発光するように処理したところ、 MBT— 2に 取り込まれた R8修飾 BCGリボソーム（緑色に発光する）、エンドソーム Zリソソーム画 分に局在化していた (図 5)。
[0068] 〔実施例 2〕
脂質 (EPCZChol= 7:3 (モル比））のクロ口ホルム溶液 (脂質量： 10 モル）と、ク ロロホルム Zエタノール（2:1)に懸濁した FTSC標識化 BCG— CW (BCG— CW量： 0. 4mg)と、 STR— R8水溶液（STR— R8量：脂質量の 0. 8又は 5モル0 /0)とを混合 し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、 BCG— CW及び STR— R8を含有する脂質薄膜を調製し、実施例 1と同様に処理することにより、 BCG-CW を含む脂質膜を有し、 STR—R8を表面に有するリボソームを調製した (STR—R8量 が脂質量の 0. 8モル0 /0であるものを以下「低密度 R8修飾 BCGリボソーム」といい、 5 モル0 /0であるものを以下「高密度 R8修飾 BCGリボソーム」と!、う）。
[0069] 脂質 ？じ70101= 7:3 (モル比））のクロロホルム溶液(脂質量：10 モル）と、ク ロロホルム Zエタノール（2:1)に懸濁した FTSC標識化 BCG— CW (BCG— CW量： 0. 4mg)とを混合し、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、 BCG- CWは含有するが STR— R8は含有しない脂質薄膜を調製した後、実施例 1と同様 に処理することにより、 BCG— CWを含む脂質膜を有し、 STR— R8を表面に有しな V、リボソームを調製した（以下「R8非修飾 BCGリボソーム」と 、う）。
[0070] 脂質 ？じ70101= 7:3 (モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：10 モル）と、 ST 1^ 1^8水溶液（3丁1^ 1^8量：脂質量の0. 8モル0 /0)とを混合し、ロータリーエバポレ 一ターにて減圧乾固することにより、 STR—R8は含有するが BCG— CWは含有しな い脂質薄膜を調製し、実施例 1と同様に処理することにより、 BCG— CWを含まない 脂質膜を有し、 STR—R8を表面に有するリボソームを調製した (以下「低密度 R8修 飾 BCG不含リボソーム」と!、う）。
[0071] 脂質 ？じ70101= 7:3 (モル比））のクロロホルム溶液（脂質量：10 モル）を、口 一タリーエバポレーターにて減圧乾固することにより、 8じ0—じ1\^も3丁1^ 1^8も含 有しない脂質薄膜を調製し、実施例 1と同様に処理することにより、 BCG— CWを含 まな 、脂質膜を有し、 STR— R8を表面に有しな 、リボソームを調製した (以下「R8非 修飾 BCG不含リボソーム」と!、う）。
[0072] マウス骨髄から単離した榭状細胞 (DC)の血清不含培養液中に各種リボソームを 添加し、 37°Cで 2時間インキュベートした後、 22時間血清存在下で培養し、 DCの活 性ィ匕の有無を検討した。 DCの活性ィ匕の指標として、表在マーカータンパク質 CD86 及び CD80、さらに抗原提示にかかわる MHCIIを選定し、各タンパク質に対する蛍 光ラベルイ匕抗体を用い、フローサイトメーター（FACS)によって各処理群におけるマ 一力一タンパク質量を測定した。
[0073] 結果を図 6に示す。図 6中、「Cultured DC」は無処理の榭状細胞、「EPC/Chol LipJ は R8非修飾 BCG不含リボソームで処理した榭状細胞、「LD-STR-R8 LipJは低密度 R8修飾 BCG不含リボソームで処理した榭状細胞、「LPS」は代表的免疫細胞活性ィ匕 成分 (アジュバント）であるリポポリサッカライド (ポジティブコントロール)で処理した榭 状細胞、「Lip/BCG- CW」は R8非修飾 BCGリボソームで処理した榭状細胞、「LowR8 Lip/BCG- CW」は低密度 R8修飾 BCGリボソームで処理した榭状細胞、「HighR8 Lip /BCG-CWJは高密度 R8修飾 BCGリボソームで処理した榭状細胞の結果を示す。 図 5に示されるように、高密度 R8修飾 BCGリボソームは、代表的アジュバントである LPSと同様に高い免疫細胞活性ィ匕能を発揮した。
[0074] [実施例 3]
10%仔牛胎児血清を添カ卩した RPMI1640メディウム（Sigma社)を用いて、膀胱 癌細胞株 MBT— 2 (理ィ匕学研究所）を 37°C、 5%COで培養した。 7週令の C3HZ
2
HeNマウス（Charles River社）をグループ A〜Gに分け、 0. 7 X 10?個の MBT— 2 と下記の各試料とを、各グループのマウス背右側に移植した。
[0075] グループ A: 100 μ 1の PBS緩衝液（6匹）
グループ B： lmgの BCG (BCG株式会社） ZlOO μ 1の PBS緩衝液（6匹） グループ C :実施例 1で作製した lmgの BCG— CWZ100 μ 1の PBS緩衝液（18匹
)
グループ D：実施例 1で作製した 0. lmgの BCG— CWZlOO μ 1の PBS緩衝液 (6 匹）
グループ E：実施例 1で作製した lmgの BCG— CWを含む脂質膜を有し、 STR-R 8を表面に有する R8修飾 BCG高含有リボソーム Z 100 ^ 1の PBS緩衝液（ 18匹） グループ F:実施例 1で作製した 0. lmgの BCG— CWを含む脂質膜を有し、 STR — R8を表面に有する R8修飾 BCG低含有リボソーム ZlOO μ 1の PBS緩衝液（6匹） グループ G： BCG— CWを含まな!/、脂質膜を有し、 STR— R8を表面に有しな!/、R8 非修飾 BCG不含リボソーム ZlOO μ 1の PBS緩衝液（6匹）
[0076] 上記のリボソームは、実施例 2に記載された低密度 R8修飾 BCGリボソームの作製 方法において、 BCG— CWの含有量を変化させることによって作製した。また R8非 修飾 BCG不含リボソームは、実施例 2に記載された方法と同様の方法で行った。
[0077] 各グループのマウスを 4週間飼育後、移植した癌細胞に由来する腫瘍組織を摘出 してその大きさ (mm2)を測定して、各試料の腫瘍退縮効果を確認した。その結果を 表 1に示す。
[0078] [表 1]
Figure imgf000019_0001
グループ B ( lmgの BCG)及びグループ C ( lmgの BCG - CW)と同様の腫瘍退縮 効果がグループ E (R8修飾 BCG高含有リボソーム）で認められた。一方、グループ D (0. lmgの BCG— CW)では腫瘍退縮効果は認められなかったが、同量の BCG— CWを含むグループ F (R8修飾 BCG低含有リボソーム）では、強 、腫瘍退縮効果が 認められた。このことから、 R8修飾リボソームに BCG— CWを含有させることにより、 B CGや BCG— CWをそのまま投与するよりも高い腫瘍退縮効果が得られることが確認 された。

Claims

請求の範囲
[1] 水及び有機溶媒に不溶性の細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリボソーム。
[2] 前記細菌菌体成分が、ミコパクテリゥム属細菌、ノカルジァ属細菌、コリネパクテリゥム 属細菌又はロドコッカス属細菌の細胞壁画分又は細胞壁骨格画分である請求項 1記 載のリボソーム。
[3] 前記ミコバタテリゥム属細菌が BCGである請求項 2記載のリボソーム。
[4] リボソーム表面に、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを有する請求 項 1〜3のいずれかに記載のリボソーム。
[5] 前記ペプチドが、連続した 4〜20個のアルギニン残基を含む 4〜35個のアミノ酸残 基力もなるペプチドである請求項 4記載のリボソーム。
[6] 前記ペプチドがアルギニン残基のみ力もなる請求項 4又は 5記載のリボソーム。
[7] 前記ペプチドの量が、前記リボソームを構成する総脂質に対して 2% (モル比）以上 である請求項 4〜6のいずれかに記載のリボソーム。
[8] 前記ペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、前記疎水性基又は 前記疎水性化合物が前記リボソームの表面を形成する脂質膜に挿入され、前記べ プチドが前記リボソームの表面を形成する脂質膜から露出して 、る請求項 4〜7の ヽ ずれかに記載のリボソーム。
[9] 請求項 1〜8のいずれかに記載のリボソームを含有する医薬組成物。
[10] 前記細菌菌体成分が免疫活性化作用を有し、前記医薬組成物が免疫活性化剤で ある請求項 9記載の医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014034669A1 (ja) 2012-08-28 2014-03-06 国立大学法人北海道大学 非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法
US9066971B2 (en) 2010-07-01 2015-06-30 Postech Academy-Industry Foundation Method for treating and diagnosing cancer by using cell-derived microvesicles
WO2018164116A1 (ja) * 2017-03-06 2018-09-13 国立大学法人筑波大学 リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット
US20220175852A1 (en) * 2019-04-24 2022-06-09 Liaoning Greatest Bio-Pharmaceutical Co. Ltd. Use of rhodococcus ruber product in treating thermal injury

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102185682B1 (ko) * 2009-06-04 2020-12-11 고쿠리츠칸센쇼켄쿠죠 마이코플라즈마 감염증용 백신
JP5787323B2 (ja) * 2010-04-28 2015-09-30 国立大学法人北海道大学 脂質膜構造体
CN103393597B (zh) * 2013-07-02 2015-06-17 北京大学 疏水性肽修饰的注射用长循环脂质体给药系统
EP3440187A1 (en) * 2016-04-07 2019-02-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Francisella lipids as broad anti-inflammatory therapeutics and associated methods of use
CN114533764A (zh) * 2021-12-31 2022-05-27 苏州大学 一种脂质膜包被益生菌及其制备和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06507420A (ja) * 1991-11-06 1994-08-25 ゲゼルシャフト・フュア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング　（ゲー・ベー・エフ） 粘膜の病原体に対するワクチンとその製法
JP2002529427A (ja) * 1998-11-06 2002-09-10 シュヴァイツ．ゼールム− ウント インプフインスティトゥート ベルン 薬学的作用物質の調合物および投与器具
WO2004012751A1 (ja) * 2002-08-02 2004-02-12 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited 細菌細胞壁骨格成分製剤
WO2005032593A1 (ja) * 2003-10-01 2005-04-14 Japan Science And Technology Agency 核移行能を有するポリアルギニン修飾リポソーム

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180351A1 (en) * 1998-11-06 2003-09-25 Reinhard Gluck Pharmaceutically active composition and dispensing device
ES2231037B1 (es) * 2003-10-31 2005-12-16 Archivel Technologies, Sl Agente inmunoterapico util para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociacion con otros farmacos.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06507420A (ja) * 1991-11-06 1994-08-25 ゲゼルシャフト・フュア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング　（ゲー・ベー・エフ） 粘膜の病原体に対するワクチンとその製法
JP2002529427A (ja) * 1998-11-06 2002-09-10 シュヴァイツ．ゼールム− ウント インプフインスティトゥート ベルン 薬学的作用物質の調合物および投与器具
WO2004012751A1 (ja) * 2002-08-02 2004-02-12 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited 細菌細胞壁骨格成分製剤
WO2005032593A1 (ja) * 2003-10-01 2005-04-14 Japan Science And Technology Agency 核移行能を有するポリアルギニン修飾リポソーム

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEAUDET, R. ET AL.: "Anti tumor activity of some BCG fractions incorporated in liposomes", MICROBIOS LETTERS, vol. 23, no. 90, 1983, pages 63 - 66, XP008123851
CHUGH, LB. ET AL.: "Immunoprotective behaviour of liposome entrapped cell wall subunit of Mycobacterium tuberculosis against experimental tuberculous infection in mice", EUROPEAN RESPIRATORY JOURNAL, vol. 6, no. 6, 1993, pages 811 - 815, XP008123748
KHALIL IKRAMY ET AL., YAKUGAKU ZASSHI, vol. 124, no. 4, 2004, pages 113 - 116
KOGURE ET AL., JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 98, 2004, pages 317 - 323
ROSENKRANDS I. ET AL.: "Cationic Liposomes Containing Mycobacterial Lipids: a New Powerful Th1 Adjuvant System", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 73, no. 9, 2005, pages 5817 - 5826, XP003019330 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9066971B2 (en) 2010-07-01 2015-06-30 Postech Academy-Industry Foundation Method for treating and diagnosing cancer by using cell-derived microvesicles
WO2014034669A1 (ja) 2012-08-28 2014-03-06 国立大学法人北海道大学 非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法
US9717687B2 (en) 2012-08-28 2017-08-01 National University Corporation Hokkaido University Lipid membrane structure including bacterial cell component having dispersibility in non-polar solvent, and method for producing same
WO2018164116A1 (ja) * 2017-03-06 2018-09-13 国立大学法人筑波大学 リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット
JPWO2018164116A1 (ja) * 2017-03-06 2020-01-30 国立大学法人 筑波大学 リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット
JP7220472B2 (ja) 2017-03-06 2023-02-10 国立大学法人 筑波大学 リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット
US20220175852A1 (en) * 2019-04-24 2022-06-09 Liaoning Greatest Bio-Pharmaceutical Co. Ltd. Use of rhodococcus ruber product in treating thermal injury

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Publication number Publication date
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