WO2012153616A1

WO2012153616A1 - 標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、その製造方法および標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法

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Publication number: WO2012153616A1
Application number: PCT/JP2012/060622
Authority: WO
Inventors: 原島　秀吉; 和昭梶本; 英万秋田; 守兵藤; ナジールホッセン
Original assignee: 国立大学法人北海道大学
Priority date: 2011-05-10
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2012-11-15

Abstract

【課題】　標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、それを用いた肥満抑制／治療剤、脂肪組織炎症抑制／治療剤および非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤、前記脂質膜構造体の製造方法、前記脂質膜構造体を用いた標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法ならびに肥満抑制／治療剤、脂肪組織炎症抑制／治療剤および非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】　標的細胞移行能を有する脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する。

Description

標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、その製造方法および標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法

　本発明は、標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、その製造方法および標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法に関し、より詳細には、標的細胞移行能を有する脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のポリエチレングリコールおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のポリエチレングリコールが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体、それを用いた肥満抑制／治療剤、脂肪組織炎症抑制／治療剤および非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤、前記脂質膜構造体の製造方法、前記脂質膜構造体を用いた標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法ならびに肥満抑制／治療剤、脂肪組織炎症抑制／治療剤および非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤のスクリーニング方法に関する。

　タンパク質、薬剤、あるいは核酸などの物質を生物個体の標的細胞に移行させるための技術（ターゲティング技術）の開発が盛んに行われている。例えば、特許文献１および非特許文献１には、脂肪組織の血管内皮細胞への移行能を有するペプチドが開示されており、このペプチドにアポトーシス誘導性ペプチドを連結したペプチドを投与することにより、脂肪組織の血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導することができることが開示されている。

　一方、リポソームに代表される脂質膜構造体は、（ｉ）物質を内包することができてその内包された物質は生体内の分解作用や代謝作用から保護される、（ｉｉ）物質を内包することができてその内包された物質が標的細胞以外で作用を奏すること（副作用）を防止することができる、（ｉｉｉ）生体適合性や生分解性に優れている、（ｉｖ）その表面にポリエチレングリコール（以下、本明細書において「ＰＥＧ」という場合がある。）、抗体、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの機能性分子を導入することにより、標的細胞への移行能や融合能、ｐＨ応答性など様々な機能を付与することができるなどの利点を有することから、薬物や生理活性物質の理想的なベクターとして期待されている。

　これまでに、標的細胞移行能を有する脂質膜構造体としては、例えば、表面がＰＥＧでコーティングされた腫瘍細胞への移行能を有するリポソーム（ステルスリポソーム）が知られている他、非特許文献２には、本発明者らにより、上述の脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、ＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質を構成脂質として含む脂質膜を有するリポソームが開示されている。

国際公開ＷＯ２００３／０２２９９１号パンフレット

Ｍ．Ｇ．Ｋｏｌｏｎｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１０巻、第６号、第６２５－６３２頁、２００４年Ｍｄ．ＮａｚｉｒＨｏｓｓｅｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、第１４７巻、第２６１－２６８頁、２０１０年

　しかしながら、特許文献１および非特許文献１に記載された脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドにアポトーシス誘導性ペプチドを結合したペプチドは、脂質膜構造体ではないことから、生体内の分解作用や代謝作用から保護されにくく、標的細胞である脂肪組織血管内皮細胞以外での作用を防止することが困難である。また、ステルスリポソームは、血管透過性が亢進している腫瘍組織の細胞に対しては移行能を有するが、血管透過性が亢進していない他の組織の細胞に対しては移行能を有さない。

　さらに、非特許文献２に記載された脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、ＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質を構成脂質として含む脂質膜を有するリポソームは、培養細胞（ｉｎｖｉｔｒｏ）における脂肪組織血管内皮細胞移行能が示されているのみであり、生体（ｉｎｖｉｖｏ）における脂肪組織血管内皮細胞移行能については何ら示されておらず、そのうえ、非特許文献２には、さらにＰＥＧが結合してなる脂質を構成脂質として含む脂質膜を有することの記載はおろか、開示もされていない。なお、後述の本明細書実施例１（２）、図３および図４にリポソームＡおよびＢとして示されているように、本願発明に係る脂質膜構造体と比較しても、生体（ｉｎｖｉｖｏ）における脂肪組織血管内皮細胞移行能および移行特異性が小さいことが分かる。

　本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、標的細胞移行能を有する脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体、それを用いた肥満抑制／治療剤、脂肪組織炎症抑制／治療剤および非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤、前記脂質膜構造体の製造方法、前記脂質膜構造体を用いた標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法ならびに肥満抑制／治療剤、脂肪組織炎症抑制／治療剤および非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、鋭意研究の結果、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体が、生体（ｉｎｖｉｖｏ）において標的細胞へ特異的に移行すること、ならびに脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導剤が封入されたものをマウスに投与することなどにより、体重増加を顕著に抑制、あるいは体重を減少させ、脂肪組織および脂肪細胞の肥大化を抑制、あるいは脂肪組織および脂肪細胞を縮小させ、脂肪細胞の新生を抑制、あるいは新生した脂肪細胞を消失させることができること、脂肪組織におけるマクロファージの浸潤を抑制、あるいはマクロファージを除去することができること、ならびに肝臓や骨格筋における脂肪の蓄積を抑制、あるいは蓄積した脂肪を減少させることができることなどを見出し、下記の各発明を完成した。

（１）標的細胞移行能を有する脂質膜構造体であって、下記（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する、前記脂質膜構造体；（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ポリエチレングリコールおよび脂質がこの順で結合してなる脂質、（ｂ）（ａ）を構成するポリエチレングリコールと比較して数平均分子量が小さいポリエチレングリコールが結合してなる脂質。

（２）（ａ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍａが３５００≦Ｍａ≦６５００のポリエチレングリコールであり、かつ、（ｂ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍｂが５００≦Ｍｂ≦３５００のポリエチレングリコールである、（１）に記載の脂質膜構造体。

（３）負帯電性脂質膜構造体または非帯電性脂質膜構造体である、（１）または（２）に記載の脂質膜構造体。

（４）リポソームである、（１）から（３）のいずれかに記載の脂質膜構造体。

（５）標的細胞移行能を有するペプチドが、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドである、（１）から（４）のいずれかに記載の脂質膜構造体。

（６）脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドが、ＫＧＧＲＡＫＤ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｇはグリシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ａはアラニン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチドである、（５）に記載の脂質膜構造体。

（７）アポトーシス誘導剤が封入された（５）または（６）に記載の脂質膜構造体を有効成分とする、肥満抑制および／または治療剤。

（８）アポトーシス誘導剤が下記（ｉ）および／または（ｉｉ）である、（７）に記載の肥満抑制および／または治療剤；（ｉ）ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｌはロイシン残基を、Ａはアラニン残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）シトクロムｃ。

（９）アポトーシス誘導剤が封入された（５）または（６）に記載の脂質膜構造体を有効成分とする、脂肪組織炎症抑制および／または治療剤。

（１０）アポトーシス誘導剤が下記（ｉ）および／または（ｉｉ）である、（９）に記載の脂肪組織炎症抑制および／または治療剤；（ｉ）ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｌはロイシン残基を、Ａはアラニン残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）シトクロムｃ。

（１１）アポトーシス誘導剤が封入された（５）または（６）に記載の脂質膜構造体を有効成分とする、非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／または治療する剤。

（１２）アポトーシス誘導剤が下記（ｉ）および／または（ｉｉ）である、（１１）に記載の剤；（ｉ）ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｌはロイシン残基を、Ａはアラニン残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）シトクロムｃ。

（１３）標的細胞移行能を有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む１枚膜の脂質膜を調製する工程を有する、前記方法；（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ポリエチレングリコールおよび脂質がこの順で結合してなる脂質、（ｂ）（ａ）を構成するポリエチレングリコールと比較して数平均分子量が小さいポリエチレングリコールが結合してなる脂質。

（１４）（ａ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍａが３５００≦Ｍａ≦６５００のポリエチレングリコールであり、かつ、（ｂ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍｂが５００≦Ｍｂ≦３５００のポリエチレングリコールである、（１３）に記載の方法。

（１５）標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法であって、（１）から（６）のいずれかに記載の脂質膜構造体において１の標的細胞移行能を有するペプチドを選択するとともに対象物質を封入して前記標的細胞へ移行させる工程と、前記対象物質が前記標的細胞において効果を示すか否かを評価する工程とを有する、前記方法。

（１６）肥満抑制および／もしくは治療剤、脂肪組織炎症抑制および／もしくは治療剤または非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／もしくは治療する剤のスクリーニング方法であって、（５）または（６）に記載の脂質膜構造体に対象物質を封入して脂肪組織血管内皮細胞へ移行させる工程と、前記対象物質が脂肪組織血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。

　本発明に係る脂質膜構造体によれば、標的細胞に特異的に移行する脂質膜構造体を得ることができ、封入された物質を損傷させずに標的細胞へ送達して、標的細胞においてその物質の機能を発揮させることができるうえ、毒性が低く、安全に生体に適用することができる。また、本発明に係る脂質膜構造体を用いた肥満抑制／治療剤によれば、通常の成長を阻害することなく、高脂肪食餌による体重増加を有効に抑制することができるうえに、高脂肪食餌を摂取しているにもかかわらず、体重を減少させ、脂肪組織および脂肪細胞の肥大化を抑制、あるいは脂肪組織および脂肪細胞を縮小させ、脂肪細胞の新生および成長を抑制、あるいは新生した脂肪細胞を消失させることができる。また、本発明に係る脂質膜構造体を用いた脂肪組織炎症抑制／治療剤によれば、高脂肪食餌を摂取しているにもかかわらず、脂肪組織の炎症を有効に抑制あるいは消炎することができることから、脂肪組織の炎症が起因の一つとなる疾患、例えば、２型糖尿病やアテローム性動脈硬化症などの炎症性疾患などを予防ないし治療することができる。また、本発明に係る脂質膜構造体を用いた非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する剤によれば、高脂肪食餌を摂取しているにもかかわらず、非脂肪組織における脂肪の蓄積を有効に抑制あるいは蓄積した脂肪を減少させることができることから、非脂肪組織における脂肪の蓄積が起因の一つとなる疾患、例えば、脂肪肝や２型糖尿病や心筋障害などを予防ないし治療することができる。また、本発明に係る脂質膜構造体の製造方法によれば、前記のような効果を有した脂質膜構造体を得ることができる。さらに、本発明に係る標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法によれば、対象物質が標的細胞において効果を示すか否かを簡便かつ効率的に評価することができ、本発明に係る脂質膜構造体を用いた肥満抑制および／もしくは治療剤、脂肪組織炎症抑制および／もしくは治療剤または非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／もしくは治療する剤のスクリーニング方法によれば、対象物質が肥満を抑制することや治療すること、脂肪組織の炎症を抑制することや治療すること、あるいは非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制することや治療することができるか否かを簡便かつ効率的に評価することができる。

本発明に係る標的細胞移行能を有する脂質膜構造体の構造を示す模式図である。移行能ペプチド（アミノ酸配列；ＧＫＧＧＲＡＫＤＧＧＣ－ＮＨ_２；配列番号６）、マレイミド基が付加された数平均分子量５０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ５０００）、および脂質（Ｌ－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ＤＳＰＥ)がこの順で結合してなる脂質（Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ）の構造を示す模式図である。図中、（Ｓ）は、移行能ペプチドのＣ末端であるカルボキシル基がアミド化されたシステインのチオール基を示す。Ｐｅｐ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＡ、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＢ、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＣ、ならびにＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＤをそれぞれマウスに投与し、皮下脂肪組織を観察した結果を示す図である。図中、上段はＦＩＴＣ（緑）の蛍光を、中段はローダミン（赤）の蛍光をそれぞれ観察した結果であり、下段は上段と中段とを重ね合わせて、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン(赤)の蛍光との重複（黄）を観察した結果である。リポソームＡ、ＢおよびＣを投与したマウスにおける、肝臓の観察結果を示す図である。図中、上段はＦＩＴＣ（緑）の蛍光を、中段はローダミン（赤）の蛍光をそれぞれ観察した結果であり、下段は上段と中段とを重ね合わせて、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン(赤)の蛍光との重複（黄）を観察した結果である。Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥについて、質量分析を行った結果を示す図である。図中、横軸は分子量（質量電荷比ｍ／ｚ）を、縦軸は強度（任意単位）をそれぞれ示す。１枚膜リポソームおよび複数膜リポソームを投与したマウスにおける、皮下脂肪組織の観察結果を示す図である。右図および左図において、それぞれ、左列はＦＩＴＣ（緑）の蛍光を、中列はローダミン（赤）の蛍光を観察した結果であり、右列は左列と中列とを重ね合わせて、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン(赤)の蛍光との重複（黄）を観察した結果である。ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにＮＢＤにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＥおよびＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにＮＢＤにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＦをそれぞれマウスに投与し、皮下脂肪組織から間質細胞および血管内皮細胞を分離し、蛍光染色して観察した結果を示す図である。なお下段図は、上段図に示す枠内を拡大した図である。下段図中、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）の蛍光およびＡｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光が検出された箇所を矢印なしの実線で、ＮＢＤ（緑）の蛍光が検出された箇所を矢印付きの実線でそれぞれ示す。空１枚膜リポソーム（Ｉ群）、融合ペプチド（ＩＩ群）またはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（ＩＩＩ群）を投与した肥満マウスにおける、精巣上体脂肪組織の観察結果を示す図である。図中、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光とスルホローダミン（緑）の蛍光との重複（黄）が検出された主な箇所を矢印で示す。健常体マウスに融合ペプチド（ＩＶ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（Ｖ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＶＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら飼育して、体重変化率を算出した結果を示す図である。肥満マウスに空１枚膜リポソーム（ＶＩＩＩ群）、融合ペプチド（ＩＸ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（Ｘ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＶＩＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら飼育して、体重変化量を算出した結果を示す図である。肥満マウスに空１枚膜リポソーム（ＶＩＩＩ群）、融合ペプチド（ＩＸ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（Ｘ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＶＩＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら飼育して、飼育期間終了時点（３０日目）の平均体重について投与開始時点（０日目）の平均体重に対する有意差を検定した結果を示す図である。肥満マウスに空１枚膜リポソーム（ＶＩＩＩ群）、融合ペプチド（ＩＸ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（Ｘ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＶＩＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら飼育して、鼠径部皮下脂肪組織および精巣上体脂肪組織の大きさを比較した結果を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウス、ならびに通常食餌（ＮＤ）を与えて飼育した、何も投与しない健常体マウス（ＸＩ群）の精巣上体脂肪組織における脂肪滴の観察結果を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウス、ならびに通常食餌（ＮＤ）を与えて飼育した、何も投与しない健常体マウス（ＸＩ群）の精巣上体脂肪組織における細胞径の割合を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウス、ならびに通常食餌（ＮＤ）を与えて飼育した、何も投与しない健常体マウス（ＸＩ群）の精巣上体脂肪組織における細胞径の平均値（ｃ）を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスならびにＸＩ群の健常体マウスの精巣上体脂肪組織における、脂肪滴、毛細血管内皮細胞および細胞核の観察結果を示す図である。なお、右図は、左図に示す箇所を拡大した図である。右図中、ＢＯＤＩＰＹ（青）の蛍光、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（緑）の蛍光が検出された箇所を矢印で例示する。健常体マウスに空１枚膜リポソーム（ＸＩＩＩ群）、融合ペプチド（ＸＩＶ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（ＸＶ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＸＩＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら、または何れも投与せずに通常食餌（ＮＤ）を与えながら飼育して（ＸＶＩ群）、体重変化率を算出した結果を示す図である。健常体マウスに空１枚膜リポソーム（ＸＩＩＩ群）、融合ペプチド（ＸＩＶ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（ＸＶ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＸＩＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら、または何れも投与せずに通常食餌（ＮＤ）を与えながら飼育して（ＸＶＩ群）、鼠径部皮下脂肪組織および精巣上体脂肪組織の大きさを比較した結果を示す図である。健常体マウスに空１枚膜リポソーム（ＸＩＩＩ群）、融合ペプチド（ＸＩＶ群）もしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム（ＸＶ群）を３日に１回の間隔で投与し、または何れも投与せずに（ＸＩＩ群）、それぞれ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら、または何れも投与せずに通常食餌（ＮＤ）を与えながら飼育して（ＸＶＩ群）、飼育期間終了時の体重に対する脂肪組織重量の割合を算出した結果を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスならびにＸＩ群の健常体マウスの精巣上体脂肪組織における、マクロファージ、脂肪滴、毛細血管内皮細胞および細胞核の観察結果を示す図である。なお、右図は、左図に示す箇所を拡大した図である。右図中、Ａｌｅｘａ５６８（赤）の蛍光、ＢＯＤＩＰＹ（水色）の蛍光、Ａｌｅｘａ６４７（緑）の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）の蛍光が検出された箇所を矢印で例示する。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスならびにＸＩ群の健常体マウスの肝臓における、脂肪滴、Ｆアクチンおよび細胞核の観察結果を示す図である。図中、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光が検出された箇所を矢印で例示する。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスならびにＸＩ群の健常体マウスの肝臓における、ＢＯＤＩＰＹの相対的蛍光強度を示す図である。図中、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光が検出された箇所を矢印で例示する。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスならびにＸＩ群の健常体マウスの骨格筋における、脂肪滴、Ｆアクチンおよび細胞核の観察結果を示す図である。図中、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光が検出された箇所を矢印で例示する。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスならびにＸＩ群の健常体マウスの骨格筋における、ＢＯＤＩＰＹの相対的蛍光強度を示す図である。図中、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光が検出された箇所を矢印で例示する。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスの２４時間の摂取エネルギー量を算出した結果を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスの脳におけるＡｇｒｐ、Ｎｐｙ、Ｇａｌ、ＰｏｍｃおよびＴｒｈの相対的発現量を示す図である。ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の肥満マウスの血清におけるレプチン、アディポネクチンおよびＡＬＴの濃度をそれぞれ示す図である。ＨＥＰＥＳ緩衝液のみ（Ｇ）、０．６５μｍｏｌ（脂質）量の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液（Ｈ）、それぞれ終濃度が０．５ｎｍｏｌ／ｍＬ、１ｎｍｏｌ／ｍＬ、２ｎｍｏｌ／ｍＬもしくは４ｎｍｏｌ／ｍＬのシトクロムｃを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉ１～４）、またはそれぞれシトクロムｃの終濃度が０．５ｎｍｏｌ／ｍＬ、１ｎｍｏｌ／ｍＬ、２ｎｍｏｌ／ｍＬもしくは４ｎｍｏｌ／ｍＬのシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液＋適量の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液（Ｊ１～４）を脂肪組織毛細血管内皮細胞に添加してインキュベートした後、細胞形態を観察した結果を示す図である。図中、球状の細胞形態が確認された箇所を矢印で示す。健常体マウスに何れのリポソームも投与せずに（ＸＶＩＩ群およびＸＶＩＩＩ群）、またはシトクロムｃ量がそれぞれ０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ（ＸＩＸ群）、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ（ＸＸ群）もしくは０．０２ｍｍｏｌ／ｋｇ（ＸＸＩ）のシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを健常体マウスに３日に１回の間隔で投与し、かつＩＶ群には通常食餌（ＮＤ）を、ＸＶＩＩ群、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群には高脂肪食餌（ＨＦＤ）をそれぞれ与えながら飼育して、体重変化率を算出した結果を示す図である。肥満マウスに何れのリポソームも投与せずに（ＸＸＩＩ群）、またはシトクロムｃ封入複数膜リポソーム（ＸＸＩＩＩ群）、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよび空１枚膜リポソーム（ＸＸＩＶ群）もしくはシトクロムｃおよび空１枚膜リポソーム（ＸＸＶ群）を肥満マウスに３日に１回の間隔で投与し、かつ高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えながら飼育して、体重変化率を算出した結果を示す図である。ＰＥＧ鎖長を入れ替えた本発明のリポソームを投与した健常体マウスにおける、脂肪組織の観察結果を示す図である。移行能ペプチドを持たないリポソームを投与した肥満マウスにおける、脂肪組織の観察結果を示す図である。図中、緑がローダミンの蛍光を、赤がＦＩＴＣの蛍光をそれぞれ示す。移行能ペプチドを持たないリポソームを投与した肥満マウスの脂肪組織におけるａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターの観察結果を示す図である。図中、緑がＡｌｅｘａ６４７の蛍光を、赤がローダミンの蛍光を、青がＢＯＤＩＰＹの蛍光をそれぞれ示す。移行能ペプチドを持たず、ＰＥＧ修飾量を２０ｍｏｌ％として血中滞留性が高められたリポソームを投与した健常体マウスおよび肥満マウスの脂肪組織の観察結果を示す図である。

　以下、本発明に係る標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、その製造方法および標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法について詳細に説明する。本発明に係る脂質膜構造体は、標的細胞移行能を有する脂質膜構造体であって、（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ポリエチレングリコールおよび脂質がこの順で結合してなる脂質、および（ｂ）（ａ）を構成するポリエチレングリコールと比較して数平均分子量が小さいポリエチレングリコールが結合してなる脂質を構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する。

　本発明において「長鎖長のＰＥＧ」とは、上述の（ａ）を構成するＰＥＧをいう。また、本発明において「短鎖長のＰＥＧ」とは、（ａ）を構成するＰＥＧと比較して数平均分子量が小さいＰＥＧをいい、上述の（ｂ）を構成するＰＥＧをいう。従って、本発明において、長鎖長とは（ｂ）を構成するＰＥＧの鎖長と比較して鎖長が長い（数平均分子量が大きい）ことを意味し、短鎖長とは（ａ）を構成するＰＥＧの鎖長と比較して鎖長が短い（数平均分子量が小さい）ことを意味する。発明に係る脂質膜構造体の構造を図１に示す。

　ここで、長鎖長のＰＥＧと短鎖長のＰＥＧとの数平均分子量の差は、特に限定されないが、例えば、１０～１０００００、５０～７５００００、１００～５００００、５００～２５０００、８００～２００００、１０００～１５０００、１２００～１００００、１４００～８０００を挙げることができ、好ましくは１６００～６０００、さらに好ましくは１８００～５０００、よりさらに好ましくは２０００～４０００を挙げることができる。

　なお、本発明における長鎖長のＰＥＧの分子量Ｍａとしては、例えば、１０００≦Ｍａ≦１０００００００、１２００≦Ｍａ≦５００００００、１３００≦Ｍａ≦１００００００、１４００≦Ｍａ≦５０００００、１５００≦Ｍａ≦１０００００、１６００≦Ｍａ≦５００００、１７００≦Ｍａ≦３００００、１８００≦Ｍａ≦２００００、１９００≦Ｍａ≦１５０００、２０００≦Ｍａ≦１２０００、２１００≦Ｍａ≦１００００、２２００≦Ｍａ≦９０００、２３００≦Ｍａ≦８５００、２４００≦Ｍａ≦８０００、２５００≦Ｍａ≦７５００、２６００≦Ｍａ≦７４００、２７００≦Ｍａ≦７３００、２８００≦Ｍａ≦７２００、２９００≦Ｍａ≦７１００、３０００≦Ｍａ≦７０００、３１００≦Ｍａ≦６９００、３２００≦Ｍａ≦６８００を挙げることができ、好ましくは３３００≦Ｍａ≦６７００、さらに好ましくは３４００≦Ｍａ≦６６００、よりさらに好ましくは３５００≦Ｍａ≦６５００を挙げることができる。また、本発明における、短鎖長のＰＥＧの分子量Ｍｂとしては、例えば、５≦Ｍ≦２００００、１０≦Ｍ≦１５０００、５０≦Ｍ≦１００００、１００≦Ｍ≦８０００、２００≦Ｍ≦７０００、３００≦Ｍ≦５０００、４００≦Ｍ≦４５００、４５０≦Ｍ≦４０００、４７０≦Ｍ≦３８００、好ましくは４８０≦Ｍ≦３７００、さらに好ましくは４９０≦Ｍ≦３６００、よりさらに好ましくは５００≦Ｍｂ≦３５００を挙げることができる。

　また、本発明におけるＰＥＧとしては、多くの形状のＰＥＧ、例えば、直鎖状、分枝状、叉状あるいはマルチアーム状のＰＥＧを挙げることができるが、直鎖状のＰＥＧが好ましい。さらに、本発明におけるＰＥＧには、マレイミド基やメトキシ基など、ペプチドや脂質との結合に必要な官能基や保護基などを付加または修飾されたＰＥＧが包含される。

　本発明において、「標的組織」または「標的細胞」とは、本発明に係る脂質膜構造体を移行させる予定の組織または細胞をいう。なお、「標的細胞への移行」または「標的細胞に対する移行能」という場合は、当該「標的細胞を含む組織への移行」または当該「標的細胞を含む組織に対する移行能」をも意味するが、「標的組織への移行」または「標的組織に対する移行能」という場合は、必ずしも「標的組織に含まれる細胞への移行」または「標的組織に含まれる細胞に対する移行能」を意味するとは限らない。本発明において、「標的組織」の種類は特に限定されず、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織に属する組織を挙げることができる。結合組織に属する組織としては、例えば、疎性結合組織、密生結合組織、脂肪組織、細網組織などを挙げることができる。「標的細胞」の細胞種もまた、体細胞、生殖細胞の別を問わずいかなるものでもよく、また、生体から分離した細胞（ｉｎｖｉｔｒｏの細胞）でもよく、生体における細胞（ｉｎｖｉｖｏの細胞）でもよい。細胞種として、具体的には、例えば、脂肪組織血管内皮細胞や上皮細胞、表皮細胞、表皮基底細胞、角化細胞、毛根鞘細胞、毛母細胞、粘膜上皮細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、汗腺細胞、前立腺細胞、子宮内膜細胞、杯細胞、粘液上皮細胞、パネト細胞、ＩＩ型肺胞細胞、脳下垂体前葉細胞、脳下垂体中葉細胞、脳下垂体後葉細胞、副甲状腺細胞、胆嚢上皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、Ｉ型肺胞細胞、膵臓導管細胞、腺房中心細胞、導管細胞、滑液細胞、脈絡叢細胞、角膜内皮細胞、収縮性細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球、巨核球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、シュワン細胞、随伴細胞、ニューロン、グリア細胞、色素細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、胸腺上皮細胞など、およびこれらの腫瘍細胞を挙げることができる。また、本発明において「標的細胞移行能」または「標的組織移行能」とは、標的細胞または標的組織に移行することができる機能をいう。

　本発明における「標的細胞移行能を有するペプチド」は、標的細胞移行能を有することが知られている既知のペプチドを用いることができる他、標的細胞の種類に応じて、ファージディスプレイ法などの常法に従って、適宜同定あるいは設計したものを用いることができる。標的細胞移行能を有することが知られている既知のペプチドとしては、具体的には、例えば、ＫＧＧＲＡＫＤ（配列番号１）やＶＭＧＳＶＴＧ（配列番号２）、ＲＧＥＶＬＷＳ（配列番号３）などのアミノ酸配列からなる脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド（Ｍ．Ｇ．Ｋｏｌｏｎｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１０巻、第６号、第６２５－６３２頁、２００４年）、ＮＧＲ（ＡｒａｐＷ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７９号、第３７７－３８０頁、１９９８年；配列番号４）やＲＧＤ（ＨｉｒａｎｏＹ．ら、Ｊ．ＢｉｏｍｅｄＭａｔｅｒＲｅｓ．、第２５号、第１５２３－１５３４頁、１９９１年；配列番号５）のアミノ酸配列を含む腫瘍組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、ポリアルギニンペプチド（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレット）などの細胞膜透過性ペプチド、ＧＡＬＡペプチド（例えば、Ｔ．Ｋａｋｕｄｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、第４３巻、第５６１８－５６２３頁）などのｐＨ応答性膜融合性ペプチド、トランスサイトーシス誘導性ペプチド（例えば、特願２００６－１７９９５５号）を挙げることができる。

　なお、本発明における「標的細胞移行能を有するペプチド」は、標的細胞移行能を有する限り、そのアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。

　本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＧｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族－ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。

　また、本発明における「標的細胞移行能を有するペプチド」には、標的細胞移行能を有する限り、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、上述した保存的アミノ酸置換を除く置換、挿入および／または付加されたペプチドが包含される。欠失に関する具体的範囲は、通常１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個であり、保存的アミノ酸置換を除く置換に関する具体的範囲は、通常１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個であり、挿入に関する具体的範囲は、通常１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、さらに好ましくは１個であり、付加に関する具体的範囲は、通常１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、さらに好ましくは１個である。

　例えば、後述するように、本発明における「標的細胞移行能を有するペプチド」をＰＥＧ結合脂質に結合させる際に、そのアミノ酸配列のＮ末端側にグリシン残基、Ｃ末端側にグリシン残基およびシステイン残基を付加するなど、標的細胞移行能を保持しつつ、１個もしくは数個のアミノ酸を付加する場合があるが、係るペプチドも依然として本発明のペプチドに含まれる。

　本発明における「標的細胞移行能を有するペプチド」は、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明におけるペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明におけるペプチドをコードするＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。なお、いずれの合成法も、当業者により広く知られている一般的な方法の他、あらゆる方法を利用することができる。

　なお、本発明において、ペプチドのアミノ酸残基数は特に限定されず、例えば、２～４残基、５～７残基、８～１０残基、１１～１５残基、１６～２０残基、２１～３０残基、３１～４０残基、４１～５５残基、５６～７５残基、７６～１００残基、１０１残基以上のアミノ酸残基数を挙げることができるが、その機能に応じて適宜選択される。

　本発明において、「脂質膜」とは、脂質膜構造体が有する、脂質を主な構成成分とする膜をいう。本発明における脂質膜は、脂質分子が疎水性部分同士を会合させて二層に並んで形成する脂質二重層（ｌｉｐｉｄｂｉｌａｙｅｒ）からなるものでもよく、疎水性部分を内側または外側に向けて形成する一重層からなるものでもよい。

　本発明における脂質膜構造体の好ましい形態としては、脂質二重層からなる脂質膜を有する閉鎖小胞を挙げることができ、そのような脂質膜構造体としては、例えば、リポソームを挙げることができる。

　また、本発明における脂質膜構造体は、正帯電性、非帯電性、両（正負）帯電性および負帯電性のいずれでもよいが、負帯電性または非帯電性であることが好ましい。なお、本発明における「負帯電性脂質膜構造体」とは、全体として負帯電性である脂質膜構造体をいい、例えば、脂質膜の構成脂質として正帯電性脂質や両（正負）帯電性脂質、非帯電性脂質を含むため、または正帯電性や両（正負）帯電性、もしくは非帯電性の物質で修飾されているために、局所的に正帯電性や両（正負）帯電性、非帯電性であるものであっても、全体として負帯電性であれば「負帯電性脂質膜構造体」に包含される。

　また、本発明における「非帯電性脂質膜構造体」とは、全体として非帯電性である脂質膜構造体をいい、例えば、脂質膜の構成脂質として正帯電性脂質や負帯電性脂質、両（正負）帯電性脂質を含むため、または負帯電性や正帯電性、もしくは両（正負）帯電性の物質で修飾されているために、局所的に負帯電性や正帯電性、両（正負）帯電性であるものであっても、全体として非帯電性であれば「非帯電性脂質膜構造体」に包含される。なお、当業者における技術常識として、－数ｍＶ～＋数ｍＶ程度の表面電位を有する脂質膜構造体は、生体内においては「非帯電性脂質膜構造体」である（Ｍｄ．ＮａｚｉｒＨｏｓｓｅｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ、第１４７巻、第２６１－２６８頁、２０１０年；ＳｊｏｅｒｄＨａｋら、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第７２巻、第３９７－４０４頁、２００９年；ＱｕｅｎｔｉｎｌｅＭａｓｎｅｄｅＣｈｅｒｍｏｎｔら、ＰＮＡＳ、第２２巻、第１０４号、第９２６６－９２７１頁、２００７年）。さらに、本発明において、「非帯電性」は「中性」と交換可能に用いられる。

　本発明における脂質膜構造体を構成する脂質は、正帯電性脂質、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質、負帯電性脂質のいずれでもよく、脂質の種類としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

　リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンなど）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。

　糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

　ステロールとしては、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させるために、あるいは膜の流動性を調節するために用いることができる。

　長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０～２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

　グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

　正帯電性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ－（２，３－オレイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（Ｎ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β－Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β－Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）－ｃａｒｂａｍｏｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ－Ｎ－［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

　また、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、負帯電性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ－スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコール、コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

　本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜には、上述した脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質、脂質膜構造体に細胞透過能や核移行能を付与するペプチドを結合または含有させることができ、その結合量や含有量は適宜調節することができる。

　本発明に係る脂質膜構造体は、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて製造することができる。

　本発明に係る脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明に係る脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。

　また、本発明に係る脂質膜構造体には、例えば、特異抗体、標的化リガンドその他のドラッグデリバリー用機能性素子を、それぞれ公知の方法に従って含ませてもよい。

　次に、本発明は、本発明に係る脂質膜構造体を用いた肥満抑制および／または治療剤を提供する。本発明に係る肥満抑制および／または治療剤は、アポトーシス誘導剤が封入された、上述の本発明に係る脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチドが脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドである脂質膜構造体を有効成分とし、脂肪組織の血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導することにより、肥満を抑制／治療する。

　本発明において、アポトーシス誘導剤としては、例えば、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫペプチド（配列番号７；ＥｌｌｅｒｂｙＨ．Ｍ．ら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、第５巻、第１０３２－１０３８頁、１９９９年）などのアポトーシスを誘導することが知られている既知のペプチドの他、シトクロムｃ、ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ、Ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ、ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＡ２３１８７、ＡｐｏｐｔｏｓｉｓＡｃｔｉｖａｔｏｒ２、Ａｒｉｓｔｏｆｏｒｉｎ、Ｂｅｔｕｌｉｎｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ、Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、ＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎＨＣｌ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎＨＣｌ、Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、Ｏｋａｄａｉｃａｃｉｄ、Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、ＴａｍｏｘｉｆｅｎＣｉｔｒａｔｅ、Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎなどを挙げることができる。

　なお、本発明におけるアポトーシス誘導剤を構成するペプチドについては、上述した本発明における「標的細胞移行能を有するペプチド」と同様である。

　本発明において、アポトーシス誘導剤が封入された脂質膜構造体は、常法に従って製造することができ、例えば、逆相蒸発法により製造する場合には、脂質を溶解した有機溶媒の溶液とアポトーシス誘導剤を溶解した水溶液とを混合して、超音波処理によりＷ／Ｏエマルジョンを調製した後、有機溶媒を減圧留去させることにより製造することができる。

　脂質を溶解させる有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。

　次に、本発明は、本発明に係る脂質膜構造体を用いた脂肪組織炎症抑制および／または治療剤を提供する。本発明に係る脂肪組織炎症抑制および／または治療剤は、アポトーシス誘導剤が封入された、上述の本発明に係る脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチドが脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドである脂質膜構造体を有効成分とし、脂肪組織の血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導することにより、脂肪組織の炎症を抑制／治療する。なお、本発明に係る脂肪組織炎症抑制および／または治療剤において、上述した本発明に係る脂質膜構造体、肥満抑制／治療剤の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

　次に、本発明は、本発明に係る脂質膜構造体を用いた非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／または治療する剤を提供する。本発明に係る非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／または治療する剤は、アポトーシス誘導剤が封入された、上述の本発明に係る脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチドが脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドである脂質膜構造体を有効成分とし、脂肪組織の血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導することにより、非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する。なお、本発明に係る非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／または治療する剤において、上述した本発明に係る脂質膜構造体、肥満抑制／治療剤および脂肪組織炎症抑制／治療剤の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

　本発明において「非脂肪組織」とは脂肪組織以外の組織をいい、特に、異所性脂肪が蓄積し得る組織をいう。本発明における非脂肪組織として、好ましくは、脂肪成分が移行して蓄積し得る組織すなわち脳以外の組織を挙げることができ、具体的には、例えば、肝臓、骨格筋、膵臓、骨髄、心臓、腎臓、血管などを挙げることができる。なお、本発明における「非脂肪組織」は脂肪成分を含むか否かは問わず、例えば脂肪滴や脂肪細胞などを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。さらに、本発明において、「非脂肪組織」は「非脂肪体組織」、「除脂肪組織」、「除脂肪体組織」と交換可能に用いられる。

　また、異所性脂肪とは、脂肪組織以外の組織に蓄積された脂肪をいう。すなわち、本発明に係る非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／または治療する剤は、異所性脂肪の蓄積を抑制および／または治療することができる。

　次に、本発明は、脂質膜構造体を製造する方法を提供する。本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法は、標的細胞移行能を有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む１枚膜の脂質膜を調製する工程を有する；（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質、（ｂ）（ａ）を構成するＰＥＧと比較して数平均分子量が小さいＰＥＧが結合してなる脂質。なお、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体または肥満抑制／治療剤の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

　上記（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む１枚膜の脂質膜を調製する工程において、（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む１枚膜の脂質膜を調製する方法としては、例えば、（ａ）および（ｂ）の脂質を用いて１枚膜の脂質膜を調製してもよく、あるいは、脂質を用いて１枚膜の脂質膜を調製した後、この脂質膜の構成脂質に標的細胞移行能を有するペプチドおよび長鎖長のＰＥＧと、短鎖長のＰＥＧとを結合してもよい。または、長鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを用いて１枚膜の脂質膜を調製した後、この脂質膜の構成脂質のうち、長鎖長のＰＥＧが結合してなる構成脂質に、標的細胞移行能を有するペプチドを結合するなどしてもよい。

　なお、本発明において、（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質は常法に従い調製することができる。そのような方法としては、例えば、標的細胞移行能を有するペプチドを溶解した溶液とＰＥＧが結合してなる脂質を溶解した溶液とを混合して、振とうしながらインキュベートする方法を挙げることができる。

　次に、本発明は、本発明に係る脂質膜構造体を用いた、標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法を提供する。本発明に係る標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法は、
（ｉ）本発明に係る脂質膜構造体において１の標的細胞移行能を有するペプチドを選択するとともに対象物質を封入して前記標的細胞へ移行させる工程、
（ｉｉ）前記対象物質が前記標的細胞において効果を示すか否かを評価する工程、
以上（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する。なお、本発明に係る標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体、肥満抑制／治療剤または脂質膜構造体の製造方法の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

　（ｉ）の工程において、本発明に係る脂質膜構造体に対象物質を封入する方法としては、上述のアポトーシス誘導剤が封入された脂質膜構造体を製造する方法と同様の方法を挙げることができる。

　（ｉ）の工程において、１の標的細胞移行能を有するペプチドを選択して対象物質を封入した脂質膜構造体を標的細胞へ移行させる方法としては、例えば、標的細胞が生体から分離した組織や細胞（ｉｎｖｉｔｒｏの組織や細胞）である場合は、培養液に脂質膜構造体を添加する方法を挙げることができ、標的細胞が生体における細胞（ｉｎｖｉｖｏの組織や細胞）である場合は、脂質膜構造体をそのまま、あるいは溶解した溶液を経口投与、あるいは静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへ非経口投与する方法を挙げることができる。

　（ｉｉ）の工程において、対象物質が標的細胞において効果を示すか否かを評価する方法は、対象物質に期待する効果に応じて適宜設定することができるが、例えば、標的細胞が生体から分離した組織や細胞（ｉｎｖｉｔｒｏの組織や細胞）である場合は、標的細胞を必要に応じて免疫染色や核染色などにより染色した後、顕微鏡を用いて組織や細胞の形態や発色強度を観察する方法や、ＲＮＡを抽出して遺伝子発現量を解析する方法などを挙げることができる。標的細胞が生体における組織や細胞（ｉｎｖｉｖｏの組織や細胞）である場合は、標的細胞を分離採取して、上述の標的細胞が生体から分離した組織や細胞（ｉｎｖｉｔｒｏの組織や細胞）である場合と同様の方法を行うことができる他、生体から血液を採取して種々のマーカー分子の存在量を解析することや、体重や体脂肪率を測定することなどによって間接的に効果を評価する方法を行うこともできる。

　次に、本発明は、本発明に係る脂質膜構造体を用いた、肥満抑制および／もしくは治療剤、脂肪組織炎症抑制および／もしくは治療剤または非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／もしくは治療する剤のスクリーニング方法を提供する。本発明に係る肥満抑制および／もしくは治療剤、脂肪組織炎症抑制および／もしくは治療剤または非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／もしくは治療する剤のスクリーニング方法は、
（ｉｉｉ）本発明に係る脂質膜構造体であって、標的細胞移行能を有するペプチドが脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドである脂質膜構造体に対象物質を封入して脂肪組織血管内皮細胞へ移行させる工程、
（ｉｖ）前記対象物質が脂肪組織血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導するか否かを評価する工程、
以上（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の工程を有する。なお、本発明に係る肥満抑制および／もしくは治療剤、脂肪組織炎症抑制および／もしくは治療剤または非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／もしくは治療する剤のスクリーニング方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体、肥満抑制／治療剤、脂質膜構造体の製造方法または標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

　以下、本発明に係る標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、その製造方法および標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実施例１＞構成脂質に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の態様が異なるリポソームの標的細胞移行能の検討
（１）リポソームの調製
［１－１］移行能ペプチドの合成
　脂肪組織の血管内皮細胞への移行能を有することが知られているＫＧＧＲＡＫＤペプチド（配列番号１；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２７８３６）のＮ末端に１残基のグリシン（Ｇ）、ならびにＣ末端に２残基のグリシン（Ｇ）および１残基のシステイン（Ｃ）を付加したペプチドであって、Ｃ末端のシステインのカルボキシル基をアミド化したもの（ＧＫＧＧＲＡＫＤＧＧＣ－ＮＨ_２；配列番号６）を、東レ社に委託して化学合成し、これを「移行能ペプチド」とした。

［１－２］移行能ペプチド－ＰＥＧ結合脂質の調製
　本実施例１（１）［１－１］の移行能ペプチド、数平均分子量２０００の短鎖長ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）にマレイミド基が付加されたもの（Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００）がＬ－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に結合してなる脂質（Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ；日本油脂社）および数平均分子量５０００の長鎖長ＰＥＧ（ＰＥＧ５０００）にマレイミド基が付加されたもの（Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００）がＤＳＰＥに結合してなる脂質（Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ；日本油脂社）を、蒸留水に５ｍｍｏｌ／Ｌとなるようそれぞれ添加し、バスソニケーターを用いて室温で１分間、超音波処理を行うことにより溶解して、移行能ペプチド溶液、Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ溶液およびＭａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液を得た。

　モル比がそれぞれ１：１となるよう、Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ溶液またはＭａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液を、移行能ペプチド溶液に穏やかに攪拌しながら添加した。その後、バイオシェイカーを用いて振とうしながら、３０℃で２４時間インキュベートすることにより、移行能ペプチドが結合したＭａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ（Ｐｅｐ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ）の溶液２．５ｍｍｏｌ／Ｌと、移行能ペプチドが結合したＭａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ（Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ）の溶液２．５ｍｍｏｌ／Ｌを調製した。Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥを示す模式図を図２に示す。

［１－３］混合脂質溶液の調製
　卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ；日本油脂社）とコレステロール（Ｃｈｏｌ；アバンティポーラリピッド社）とを、モル比がＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝２：１となるようクロロホルムに溶解し、１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＰＣ／Ｃｈｏｌ溶液を調製した。また、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）にローダミンが結合したローダミン標識ＤＯＰＥ（アバンティポーラリピッド社）を、３．８ｍｍｏｌ／Ｌとなるようクロロホルムに溶解して、ローダミン標識ＤＯＰＥ溶液を調製した。また、メトキシ基が付加されたＰＥＧ２０００が結合したＤＳＰＥ（ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ；日本油脂社）およびメトキシ基が付加されたＰＥＧ５０００が結合したＤＳＰＥ（ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ；日本油脂社）を、それぞれ１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４；ＨＥＰＥＳ緩衝液）に５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう溶解して、ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ溶液およびＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液を調製した。

　ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ溶液、ローダミン標識ＤＯＰＥ溶液、ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ溶液、ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液、本実施例１（１）［１－２］のＰｅｐ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ溶液およびＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液を、各脂質のモル％比が下記に示す比となるよう混合して、ａ、ｂ、ｃおよびｄの計４つの混合脂質溶液（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製した。

ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ
ａ；　９４：１：５：０：０：０
ｂ；　９４：１：０：５：０：０
ｃ；　９３：１：０：５：１：０
ｄ；　９３：１：０：０：１：５

［１－４］逆相蒸発法によるリポソームの調製
　本実施例１（１）［１－３］の混合脂質溶液について、逆相蒸発法により下記Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのリポソームを調製した。なお、逆相蒸発法によって調製されたリポソームは、一般に、脂質膜を１枚膜として有することが知られている（ＤａｎｉｌｏＤ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２５６巻、第１－１１頁、１９８８年）。

　具体的には、本実施例１（１）［１－３］の混合脂質溶液５００μＬとＨＥＰＥＳ緩衝液５００μＬとを混合し、プローブタイプソニケーターを用いて４℃で１５秒間、超音波処理し、エバポレーターを用いて窒素ガス流通によりクロロホルムを蒸発留去した後、バスソニケーターを用いて１分間、超音波処理することにより、リポソームを含む混合脂質溶液（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製した。

　すなわち、混合脂質溶液ａにおいて移行能ペプチド、Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなるＰｅｐ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ（以下、結合の順について同じ。）を構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＡを、混合脂質溶液ｂにおいてＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＢを、混合脂質溶液ｃにおいてＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＣを、混合脂質溶液ｄにおいてＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＤを、それぞれ調製した。

［１－５］平均粒子径、表面電位および粒度分布指数の測定
　本実施例１（１）［１－４］のリポソームＡ、Ｂ、ＣおよびＤについて、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、その平均粒子径、表面電位および粒度分布指数（ＰｈａｓｅＤｏｐｐｌｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ；ＰＤＩ）をそれぞれ測定した。その結果を表１に示す。

　表１に示すように、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのいずれも、平均粒子径は１００ｎｍ前後、表面電位は比較的差の小さいマイナス電位、およびＰＤＩは０．２４前後であった。この結果から、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、同様の物性を有する負帯電性リポソームであることが明らかになった。

（２）リポソームの投与および蛍光観察
　１４週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）４匹を用意し、本実施例１（１）［１－４］の混合脂質溶液ａ、ｂ、ｃおよびｄ、すなわちリポソームＡ、Ｂ、ＣおよびＤをそれぞれ尾静脈に投与した。各混合脂質溶液に含まれるリポソームの投与量はマウス個体の体重（ｋｇ）×０．１ｍｍｏｌ（脂質）量とした。

　混合脂質溶液すなわちリポソームの投与から４．５時間後に、ＦＩＴＣ標識ＧｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａＬｅｃｔｉｎＩ－Ｂ４Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ（ＦＩＴＣ－ＧＳＩ－Ｂ４；ベクターラボラトリーズ社）を溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を尾静脈に投与して、毛細血管内皮細胞を蛍光染色した（ＬａｉｔｉｎｅｎＬ．ら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第１９巻、第２２５－２３４頁、１９８７年）。ＦＩＴＣ－ＧＳＩ－Ｂ４の投与量は、１匹当たり５０μｇとした。

　ＦＩＴＣ－ＧＳＩ－Ｂ４の投与から０．５時間後（混合脂質溶液の投与から５時間後）に、各マウスの肝臓および鼠径部の皮下脂肪組織を摘出して小片を作製し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。また、混合脂質溶液ｃ（リポソームＣ）を投与したマウスについては、心臓や肺などの主要な臓器を摘出して小片を作製し、同様に蛍光観察を行った。混合脂質溶液ａ、ｂ、ｃおよびｄ（リポソームＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）を投与したマウスにおける皮下脂肪組織の観察結果を図３に、混合脂質溶液ａ、ｂおよびｃ（リポソームＡ、ＢおよびＣ）を投与したマウスにおける肝臓の観察結果を図４にそれぞれ示す。

　図３に示すように、皮下脂肪組織においては、リポソームＣを投与したマウスでは、リポソームＡ、ＢおよびＤを投与したマウスと比較して、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン（赤）の蛍光との重複を示す箇所（黄）の面積は顕著に大きかった。すなわち、リポソームＣを投与したマウスでは、リポソームＡ、ＢおよびＤを投与したマウスと比較して、脂肪組織の毛細血管内皮細胞に存在しているリポソームが顕著に多いことが確認された。

　一方、図４に示すように、肝臓においては、リポソームＣを投与したマウスでは、リポソームＡおよびＢを投与したマウスと比較して、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン（赤）の蛍光との重複を示す箇所（黄）の面積が顕著に小さかった。すなわち、リポソームＡおよびＢを投与したマウスと比較して、リポソームＣを投与したマウスでは肝臓の血管内皮細胞に存在しているリポソームが顕著に少ないことが確認された。

　また、心臓や肺などの主要な臓器においても、リポソームＣを投与したマウスでは、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン（赤）の蛍光との重複を示す箇所（黄）はほとんど検出されなかった。すなわち、リポソームＣを投与したマウスでは、心臓や肺などの主要な臓器の血管内皮細胞に存在しているリポソームが顕著に少ないことが確認された（図示しない）。

　これらの結果から、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と、短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を有する脂質膜構造体は、標的細胞へ特異的に移行することが明らかになった。

（３）ＰＥＧの分子量の確認
　本実施例１（１）［１－２］のＭａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥについて、質量分析計を用いて質量分析を行った。その結果を図５に示す。

　図５上段に示すように、Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥは分子量が約１５００～約４５００であった。また、図５中段に示すように、Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥは、分子量が約４５００～約７５００であった。

　ＤＳＰＥの分子量が約７６０、マレイミド基の分子量が約１７０であることから、Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成するＰＥＧの分子量は約５００～約３５００であるとともに、その数平均分子量は約２０００であることが分かり、Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥを構成するＰＥＧの分子量は約３５００～約６５００であるとともに、その数平均分子量は約５０００であることが分かる。

　また、図５下段に示すように、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥは分子量が約５５００～約８５００であった。本実施例１（１）［１－１］の移行能ペプチド（配列番号６）の分子量が約１０００であることから、Ｍａｌ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥの分子量が約４５００～約７５００であることを示す図５中段の結果と一致し、妥当な結果が得られたことが示された。

＜実施例２＞脂質膜枚数が異なるリポソームの標的細胞移行能の検討
（１）リポソームの調製
［１－１］混合脂質溶液の調製
　実施例１（１）［１－１］～［１－３］に記載の方法により、各脂質のモル％比がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９３：１：５：１である混合脂質溶液を調製した。

［１－２］逆相蒸発法によるリポソームの調製
　本実施例２（１）［１－１］の混合脂質溶液について、実施例１（１）［１－４］に記載の方法に基づき、逆相蒸発法によりリポソーム（１枚膜リポソーム）を調製した。

［１－３］単純水和法によるリポソームの調製
　本実施例２（１）［１－１］の混合脂質溶液について、単純水和法によりリポソームを調製した。なお、単純水和法によって調製されたリポソームは、一般に、脂質膜を複数枚有する複数膜リポソームであることが知られている（ＤａｎｉｌｏＤ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２５６巻、第１－１１頁、１９８８年）。

　具体的には、ロータリーエバポレーターを用いて、本実施例２（１）［１－１］の混合脂質溶液５００μＬからクロロホルムを蒸発留去させ、クロロホルム３７５μＬを添加して再溶解し、再度蒸発留去して脂質フィルムを調製した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液５００μＬを添加して脂質フィルムを水和させ、ボルテックスミキサーを用いて２～３分間攪拌することにより、リポソームを含む混合脂質溶液（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製した。

　すなわち、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにローダミンにより蛍光標識された多重の脂質膜を有する複数膜リポソームを調製した。

（２）平均粒子径、表面電位およびＰＤＩの測定
　本実施例２（１）［１－２］の１枚膜リポソームおよび本実施例２（１）［１－３］の複数膜リポソームについて、実施例１（１）［１－５］に記載の方法により、平均粒子径、表面電位およびＰＤＩをそれぞれ測定し、さらに本実施例２（１）［１－１］～前記測定を５～８回繰り返すことによって、それぞれの標準偏差を算出した。その結果を表２に示す。

　表２に示すように、１枚膜リポソームおよび複数膜リポソームのいずれも、平均粒子径は１００ｎｍ前後、表面電位は－５ｍＶ前後およびＰＤＩは０．２５前後であった。この結果から、１枚膜リポソームおよび複数膜リポソームは、同様の物性を有する負帯電性リポソームあるいは非帯電性リポソームであることが明らかになった。

（３）リポソームの投与および蛍光観察
　本実施例２（１）［１－２］の１枚膜リポソームおよび本実施例２（１）［１－３］の複数膜リポソームを、実施例１（２）に記載の方法によりマウスへ投与し、皮下脂肪組織の蛍光観察を行った。ただし、各混合脂質溶液に含まれるリポソームの投与量はマウス個体の体重（ｋｇ）×０．２ｍｍｏｌ（脂質）量とした。また、ＦＩＴＣ－ＧＳＩ－Ｂ４の投与は、混合脂質溶液（リポソーム）の投与から２３．５時間後、４７．５時間後および７１．５時間後とし、皮下脂肪組織の摘出は、混合脂質溶液（リポソーム）の投与から２４時間後、４８時間後および７２時間後とした。その結果を図６に示す。

　図６に示すように、ＦＩＴＣ（緑）の蛍光とローダミン（赤）の蛍光との重複を示す箇所（黄）の面積を、１枚膜リポソームを投与したマウスと複数膜リポソームを投与したマウスとで比較すると、２４時間後ではほとんど同じであったのに対し、４８時間後および７２時間後では、１枚膜リポソームを投与したマウスにおいて顕著に大きかった。すなわち、１枚膜リポソームを投与したマウスでは、複数膜リポソームを投与したマウスと比較して脂肪組織の毛細血管内皮細胞に存在しているリポソームが顕著に多いことが確認された。

　これらの結果から、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と、短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体は、同様の脂質膜を複数膜として有する脂質膜構造体と比較して、標的細胞移行能が高いことが明らかになった。

＜実施例３＞リポソームの標的細胞移行能（標的細胞内への取り込み）の検討
（１）混合脂質溶液の調製
　実施例１（１）［１－１］～［１－３］に記載の方法により混合脂質溶液を調製し、ｅおよびｆとした。ただし、ローダミン標識ＤＯＰＥに代えて、Ｎｉｔｒｏ－２－１，３－Ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ－４－ｙｌ（ＮＢＤ）が結合したＤＯＰＥ（ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ）を用いた。また、ｅおよびｆにおける各脂質のモル％比は下記のとおりとした。

ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ
ｅ；　９３：１：０：１：５
ｆ；　９３：１：５：１：０

（２）逆相蒸発法によるリポソームの調製
　本実施例３（１）の混合脂質溶液について、実施例１（１）［１－４］に記載の方法に基づき、逆相蒸発法により下記ＥおよびＦのリポソームを調製した。すなわち、ｅにおいてＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにＮＢＤにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＥを、ｆにおいてＰｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含むとともにＮＢＤにより蛍光標識された脂質膜を１枚膜として有するリポソームＦを、それぞれ調製した。

（３）リポソームの投与および蛍光観察
　１４週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）２匹を用意し、本実施例３（２）の混合脂質溶液ｅおよびｆ（リポソームＥおよびＦ）をそれぞれ尾静脈に投与した。各混合脂質溶液に含まれるリポソームの投与量は、マウス個体の体重（ｋｇ）×０．１ｍｍｏｌ（脂質）量とした。

　混合脂質溶液（リポソーム）の投与から１時間後に、各マウスの鼠径部の皮下脂肪組織を摘出し、既報（ＫａｊｉｍｏｔｏＫ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３５７巻、第４３－５０頁、２０１０年）に従って、毛細血管内皮細胞を分離した。具体的には、まず、緩衝液｛１２３ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、９．８ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、１．３ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２、５ｍｍｏｌ／ＬＤ－（＋）－ｇｌｕｃｏｓｅ、１００ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ、２％（ｖ／ｗ）ＢＳＡ｝に１ｍｇ／ｍＬとなるようコラゲナーゼを添加してコラゲナーゼ溶液を調製した。皮下脂肪組織１ｇあたり１０ｍＬのコラゲナーゼ溶液を添加して、３７℃で３０分間、振とうしながらインキュベートした。このインキュベート中、５分間経過毎に、ボルテックスミキサーを用いて５秒間攪拌を行った。続いて、１００μｍ孔のセルストレーナーを用いて、組織片を除去した後、室温、１５００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離を行い、上層を除去して下層を回収し、これを間質細胞および血管内皮細胞の細胞画分とした。ハンクス平衡緩衝液を用いてこれらの細胞画分を洗浄した後、全量を直径３５ｍｍの培養皿に播種し、ＥＧＭ２－ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２、相対湿度１００％の環境下で２．５時間インキュベートした。

　続いて、Ａｌｅｘａ６４７標識ＧｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａＬｅｃｔｉｎＩ－Ｂ４Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ（Ａｌｅｘａ６４７－ＧＳＩ－Ｂ４）を５μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、０．５時間インキュベートして毛細血管内皮細胞を蛍光染色した。

　また、インキュベート開始から２．８時間後に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を２．５μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、０．２時間インキュベートして細胞核を蛍光染色した。ハンクス平衡緩衝液を用いて洗浄した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）の蛍光およびＮＢＤ（緑）の蛍光を観察した。観察結果のうち、代表的なものを図７に示す。

　図７に示すように、混合脂質溶液ｆ（リポソームＦ）を投与したマウスでは、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光で示される毛細血管内皮細胞の外形の内部において、ＮＢＤ（緑）の蛍光が検出される箇所が多く確認された。これに対し、混合脂質溶液ｅ（リポソームＥ）を投与したマウスでは、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光で示される毛細血管内皮細胞の外形の内部において、ＮＢＤ（緑）の蛍光が検出される箇所がほとんど確認されなかった。すなわち、リポソームＥを投与したマウスではほとんどのリポソームが脂肪組織毛細血管内皮細胞の内部へ取り込まれていないのに対し、リポソームＦを投与したマウスでは多くのリポソームが脂肪組織毛細血管内皮細胞の内部へ取り込まれていることが確認された。

　この結果から、標的細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体とすることにより、標的細胞の内部への取り込みが促進されることが明らかになった。

＜実施例４＞アポトーシス誘導ペプチドが封入されたリポソームのアポトーシス誘導効果の検討
（１）アポトーシス誘導ペプチドおよび融合ペプチドの化学合成
　腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することが知られているＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫペプチド（ＥｌｌｅｒｂｙＨ．Ｍ．ら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、第５巻、第１０３２－１０３８頁、１９９９年）であって、Ｃ末端のリジンのカルボキシル基をアミド化したもの（配列番号７；ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ－ＮＨ_２）を東レ社に委託して化学合成し、これをアポトーシス誘導ペプチドとした。

　また、実施例１（１）［１－１］の配列番号１のペプチドのＮ末端に１残基のシステイン（Ｃ）、ならびにＣ末端に１残基のシステイン（Ｃ）および２残基のグリシン（Ｇ）を付加し、さらにそのＣ末端に配列番号７のペプチドを付加したペプチドであって、Ｃ－Ｃ間をジスルフィド結合により結合して環状構造を有するもの（配列番号８；ＣＫＧＧＲＡＫＤＣＧＧＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ）を、東レ社に委託して化学合成し、これを「融合ペプチド」とした。

（２）混合脂質溶液の調製
　実施例１（１）［１－１］～［１－３］に記載の方法により、混合脂質溶液を調製した。ただし、混合脂質溶液における各脂質のモル％比は、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９４：５：１とした。

（３）逆相蒸発法によるリポソームの調製
　本実施例４（２）の混合脂質溶液について、実施例１（１）［１－４］に記載の方法に基づき、逆相蒸発法によりリポソームを調製し、これを空１枚膜リポソームとした。また、実施例１（１）［１－４］に記載の方法において、ＨＥＰＥＳ緩衝液に代えて、本実施例４（１）のアポトーシス誘導ペプチドを１９０．４ｍｇ／Ｌ（１２５μｍｏｌ／Ｌ）となるよう溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、逆相蒸発法によりリポソームを調製し、これをアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームとした。すなわち、空１枚膜リポソームは、アポトーシス誘導ペプチドが封入されていない、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有するリポソームであり、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームは、アポトーシス誘導ペプチドが封入された、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有するリポソームである。

（４）平均粒子径、表面電位およびＰＤＩの測定
　本実施例４（３）のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームについて、実施例１（１）［１－５］に記載の方法により、平均粒子径、表面電位およびＰＤＩを測定したところ、平均粒子径は１０９．２±７．８ｎｍ、表面電位は６．０±０．９ｍＶ、ＰＤＩはおよそ０．２～０．３であった。この結果から、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームは非帯電性リポソームであることが明らかになった。

（５）リポソームおよび融合ペプチドの投与
　高脂肪食餌を与えることにより食餌性肥満を誘導することができるモデルマウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＩＯ（ＤＩＯマウス；チャールズリバー社）の雄９匹を用意した。これらのＤＩＯマウスに高脂肪食餌（脂肪３４．９％、タンパク質２３．１％、炭水化物２５．９％；商品番号５８Ｙ１；ＰＭＩ社；以下、「ＨＦＤ」と言う。）を与えることにより体重が約４４ｇとなるまで肥育して肥満を誘導し、肥満マウスとした後、３匹ずつ３群に分けて、Ｉ群、ＩＩ群およびＩＩＩ群とした。Ｉ群には本実施例４（３）の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、ＩＩ群には本実施例４（１）の融合ペプチドを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を、ＩＩＩ群には本実施例４（３）のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、それぞれ１回尾静脈に投与した後、７２時間飼育した。Ｉ群で投与した混合脂質溶液中の空１枚膜リポソーム、ＩＩ群で投与したＨＥＰＥＳ緩衝液中の融合ペプチドおよびＩＩＩ群で投与した混合脂質溶液中のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームの、１回あたりの投与量は下記のとおりである。また、飼育期間中、それぞれに餌としてＨＦＤ（ＰＭＩ社）を与えるとともに水および餌は自由摂取させ、飼育温度は２３℃とした。

Ｉ群：
空１枚膜リポソーム量；（脂質）マウス個体の体重（ｋｇ）×０．２ｍｍｏｌ
ＩＩ群：
融合ペプチド量；（融合ペプチド）マウス個体の体重（ｋｇ）×３ｍｇ（アポトーシス誘導ペプチド１．８ｍｇに相当）
ＩＩＩ群：
アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム量；（アポトーシス誘導ペプチド）マウス個体の体重（ｋｇ）×１ｍｇ、（脂質）マウス個体の体重（ｋｇ）×０．２ｍｍｏｌ

（６）アポトーシス細胞の検出
　本実施例４（５）のＩ群、ＩＩ群およびＩＩＩ群について、混合脂質溶液（空１枚膜リポソームもしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（融合ペプチド）の投与から２４、４８および７２時間後に精巣上体脂肪組織を摘出し、２～３ｍｍ角の組織小片となるよう切り刻んだ。これらの組織小片を洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７－ＧＳＩ－Ｂ４を添加してインキュベートすることにより毛細血管内皮細胞を蛍光染色した。続いて、スルホローダミンで蛍光標識したカスパーゼ阻害剤（ＦＬＩＣＡ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ－ｌａｂｅｌｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｃａｓｐａｓｅ）によるカスパーゼ３，７アッセイキット（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて、活性化カスパーゼを含む細胞すなわちアポトーシスを起こしている細胞を蛍光染色した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光およびスルホローダミン（緑）の蛍光を観察した。観察結果のうち、代表的なものを図８に示す。

　図８に示すように、Ｉ群では、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光とスルホローダミン（緑）の蛍光との重複を示す箇所（黄）が、２４時間後、４８時間後および７２時間後のいずれにおいてもほとんど検出されなかった。また、ＩＩ群では、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光とスルホローダミン（緑）の蛍光との重複を示す箇所（黄）が、２４時間後においては多く観察されたが、４８時間後および７２時間後においてはほとんど検出されなかった。これに対し、ＩＩＩ群では、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光とスルホローダミン（緑）の蛍光との重複を示す箇所（黄）が、２４時間後、４８時間後および７２時間後のいずれにおいても多く観察された。

　すなわち、アポトーシスを起こしている毛細血管内皮細胞は、肥満マウスに空１枚膜リポソームを投与した場合はほとんど観察されず、融合ペプチドを投与した場合は投与から２４時間後においては観察されたがその後はほとんど観察されなかったのに対し、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は投与後、持続的に観察された。

　この結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものは、脂肪組織血管内皮細胞にアポトーシスを誘導することができること、およびそのアポトーシス誘導効果は、融合ペプチドと比較してより持続的であることが明らかになった。

＜実施例５＞アポトーシス誘導ペプチドが封入されたリポソームの肥満抑制／治療効果の検討
（１）リポソームおよび融合ペプチドの調製
　実施例４（１）～（３）に記載の方法に基づいて、融合ペプチド、空１枚膜リポソームおよびアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを調製した。

（２）肥満抑制効果の検討
［２－１］リポソームおよび融合ペプチドの投与
　健常体のマウス（健常体マウス）として、５週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）９匹を用意し、３匹ずつ３群に分けて、ＩＶ群、Ｖ群およびＶＩ群とした。ＩＶ群には本実施例５（１）の融合ペプチドを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を、Ｖ群には本実施例５（１）のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、それぞれ３日に１回の間隔で計４回尾静脈に投与して、１２日間飼育した。ＶＩ群には何れも投与せずに、１２日間飼育した。ＩＶ群またはＶ群で投与したＨＥＰＥＳ緩衝液中の融合ペプチドまたは混合脂質溶液中のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームの、１回あたりの投与量は下記のとおりである。また、飼育期間中、それぞれに餌としてＨＦＤ（ＰＭＩ社）を与えるとともに水および餌は自由摂取させ、飼育温度は２３℃とした。

ＩＶ群：
融合ペプチド量；（融合ペプチド）マウス個体の体重（ｋｇ）×３ｍｇ（融合ペプチド１．１７５μｍｏｌに相当）
Ｖ群：
アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム量；（アポトーシス融合ペプチド）マウス個体の体重（ｋｇ）×１ｍｇ（アポトーシス誘導ペプチド０．６５７μｍｏｌに相当）、（脂質）マウス個体の体重（ｋｇ）×０．２ｍｍｏｌ

［２－２］体重変化率の算出
　本実施例５（２）［２－１］のＩＶ群、Ｖ群およびＶＩ群について、ＨＥＰＥＳ緩衝液（融合ペプチド）または混合脂質溶液（空１枚膜リポソームもしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム）の投与開始から０、３、６、９および１２日目に体重を測定して、下記の式１を用いて体重変化率を算出した。すなわち、体重変化率は、融合ペプチドまたはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームの投与開始時点の体重を１００％として、体重増加または体重減少の割合を示す値である。

式１；体重変化率（％）＝｛（０、３、６、９または１２日目の体重－０日目の体重）／０日目の体重｝×１００

　また、体重変化率について、群毎に平均値および標準偏差を算出し、ＩＶ群およびＶ群の体重変化率について、ＶＩ群の体重変化率に対する有意差検定を行った。その結果を図９に示す。

　図９に示すように、ＩＶ群の体重変化率の値はＶＩ群の体重変化率の値と比較して、０、３、６、９および１２日目のいずれにおいても近似しており、０、３、６、９および１２日目のいずれにおいても有意差はなかった。これに対し、Ｖ群の体重変化率の値は、ＶＩ群の体重変化率の値と比較して、３日目は近似しているものの、６日目はやや小さく、９および１２日目は顕著に小さかった。Ｖ群のＶＩ群に対する有意差は、３および６日目においてはなかったが、９日目においてはｐ＜０．０５、および１２日目においてはｐ＜０．０１であった。すなわち、健常体マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、融合ペプチドを投与した場合と比較して、高脂肪食餌摂食下において、体重増加を抑制する効果が顕著に高いことが明らかになった。

　これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものは、肥満を抑制することができることが明らかになった。

（３）肥満治療効果の検討
［３－１］リポソームおよび融合ペプチドの投与
　ＤＩＯマウス（チャールズリバー社）１２匹にＨＦＤ（ＰＭＩ社）を与えることにより平均体重が４３．７±４．９ｇとなるまで肥育して肥満を誘導し、肥満マウスとした。その後、これらの肥満マウスを３匹ずつ４群に分けて、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群とした。ＶＩＩＩ群には本実施例５（１）の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、ＩＸ群には本実施例５（１）の融合ペプチドを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を、Ｘ群には本実施例５（１）のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、それぞれ３日に１回の間隔で計１０回尾静脈に投与して、３０日間飼育した。ＶＩＩ群には何れも投与せずに、３０日間飼育した。ＶＩＩＩ群で投与した混合脂質溶液中の空１枚膜リポソーム、ＩＸ群で投与したＨＥＰＥＳ緩衝液中の融合ペプチドおよびＸ群で投与した混合脂質溶液中のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームの、１回あたりの投与量は実施例４（５）に記載の投与量と同じである。また、飼育期間中、それぞれに餌としてＨＦＤ（ＰＭＩ社）を与えるとともに水および餌は自由摂取させ、飼育温度は２３℃とした。

［３－２］体重変化量の算出および脂肪組織の大きさの観察
　本実施例５（３）［３－１］のＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群について、混合脂質溶液（空１枚膜リポソームもしくはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソーム）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（融合ペプチド）の投与開始から３日間経過毎に体重を測定して、下記の式２を用いて体重変化量を算出した。すなわち、体重変化量は、空１枚膜リポソーム、融合ペプチドまたはアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームの投与開始時点の体重を基準として、体重の増加量または減少量を示す値である。また、体重変化量について、群毎に平均値および標準偏差を算出し、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の体重変化量について、ＩＩＶ群の体重変化量に対する有意差検定を行った。有意差検定は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）、Ｄｕｎｎｅｔｔ法により行った。その結果を図１０ａに示す。

式２；体重変化量（ｇ）＝各測定時の体重－投与開始時点の体重

　また、飼育期間終了時点（３０日目）の群毎の平均体重について、投与開始時点（０日目）の群毎の平均体重に対する有意差検定を行った。有意差検定はｐａｉｒｅｄＴ検定により行った。その結果を図１０ｂに示す。さらに、飼育期間終了後に鼠径部の皮下脂肪組織および精巣上体脂肪組織を摘出して、大きさを比較した。その結果を図１０ｃに示す。

　図１０ａに示すように、ＶＩＩＩ群の体重変化量はＶＩＩ群の体重変化量と比較して、３－１８日目においては近似しており、２１－３０日目においては小さかった。ＶＩＩＩ群のＶＩＩ群に対する有意差は、３－３０日目のいずれの時点においてもなかった。また、ＩＸ群の体重変化量は、ＶＩＩ群の体重変化量と比較して、３－３０日目のいずれの時点においても小さかった。ＩＸ群のＶＩＩ群に対する有意差は、３－１２日目においてはなかったが、１５日目においてはｐ＜０．０５、および１８－３０日目においてはｐ＜０．００５であった。これに対し、Ｘ群の体重変化量は、ＶＩＩ群の体重変化量と比較して、３－３０日目のいずれの時点においても顕著に小さかった。Ｘ群のＶＩＩ群に対する有意差は、３日目および６日目においてはなかったが、９日目および１２日目においてはｐ＜０．０５、１５日目においてはｐ＜０．００５、ならびに１８－３０日目においてはｐ＜０．０００５であった。

　また、ＶＩＩ群の体重変化量は、３－３０日目のいずれにおいても正であり、飼育日数の経過とともに大きくなったことから、ＶＩＩ群では飼育期間中継続して体重が増加した。また、ＶＩＩＩ群の体重変化量は、３－３０日目のいずれにおいても正であり、３－１２日目では飼育日数の経過とともに大きくなり、１２－３０日目ではほぼ同じ値であったことから、ＶＩＩＩ群では飼育期間中１２日目までは体重が増加し、その後維持された。また、ＩＸ群の体重変化量は、３－９日目においては正、１２日目においては０、および１５－３０日目においては負であり、３－９日目では飼育日数の経過とともに僅かに大きくなり、１２－３０日目では飼育日数の経過とともにやや小さくなったことから、ＩＸ群では飼育期間中９日目までは体重が僅かに増加し、その後体重が緩やかに減少した。これに対し、Ｘ群の体重変化量は、３－３０日目のいずれにおいても負であり、飼育日数の経過とともに小さくなったことから、Ｘ群では飼育期間中継続して体重が減少した。

　また、図１０ｂに示すように、３０日目の体重は０日目の体重に対して、ＶＩＩ群およびＩＸ群では有意な変化がなかったのに対し、ＶＩＩＩ群では有意に増加し、Ｘ群では有意に減少した。すなわち、図１０ａおよびｂに示す結果から、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、高脂肪食餌摂食下であるにもかかわらず、体重が減少することが明らかになった。

　さらに、図１０ｃに示すように、Ｘ群の鼠径部皮下脂肪組織および精巣上体脂肪組織の大きさは、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群と比較して顕著に小さかった。すなわち、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、高脂肪食餌摂食下において、肥満マウスの脂肪組織の肥大化が抑制される、あるいは脂肪組織が縮小することが明らかになった。

［３－３］脂肪細胞の大きさの観察
　健常体マウスとして、通常食（脂肪４．５％、タンパク質２５．０％、炭水化物４９．３％；ＰＭＩ社；商品番号５Ｌ３７；以下「ＮＤ」と言う。）を与えて飼育した５週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）３匹を用意し、これをＸＩ群として、精巣上体脂肪組織を摘出した。また、本実施例５（３）［３－２］で摘出したＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の精巣上体脂肪組織を用意した。これらの精巣上体脂肪組織を、ホルムアルデヒドを用いて固定して小片を作製した後、既報（ＮｉｓｈｉｍｕｒａＳ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５６巻、第１５１７－１５２６頁、２００７年）に従ってｂｏｒｏｎｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ（ＢＯＤＩＰＹ）を用いて脂肪滴を染色し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いてＢＯＤＩＰＹの蛍光を観察した。観察結果のうち、代表的なものを図１１ａに示す。

　また、ＢＯＤＩＰＹの蛍光により示される脂肪滴の大きさを脂肪細胞の細胞径として、各群のマウス１個体につき３００個の脂肪滴について細胞径を計測し、群毎に、どの大きさの細胞がどの程度存在するかの割合（％）を算出して分布図に表した。その結果を図１１ｂに示す。また、細胞径の平均値と標準偏差を群毎に算出して、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群のＩＸ群に対する有意差検定および、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群のＸ群に対する有意差検定を行い、ヒストグラムに表した。有意差検定はｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓＨｏｎｅｓｔｌｙＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＤ）法により行った。その結果を図１１ｃに示す。

　図１１ａ、ｂおよびｃに示すように、Ｘ群の細胞径はＸＩ群と比較してやや大きいものの、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群と比較して有意に小さかった。すなわち、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、高脂肪食餌摂取下において、脂肪細胞の肥大化が抑制される、あるいは脂肪細胞が縮小することが明らかになった。

［３－４］ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造の観察
　本実施例５（３）［３－３］に記載の方法に基づいて、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群、Ｘ群およびＸＩ群の精巣上体脂肪組織の小片を用意した。これらの精巣上体脂肪組織の小片について、既報（ＮｉｓｈｉｍｕｒａＳ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５６巻、第１５１７－１５２６頁、２００７年）に従ってＢＯＤＩＰＹを用いて脂肪細胞中の脂肪滴を、Ａｌｅｘａ６４７－ＧＳＩ－Ｂ４を用いて毛細血管内皮細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて細胞核を、それぞれ蛍光染色した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、ＢＯＤＩＰＹ（青）の蛍光、Ａｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（緑）の蛍光を観察した。観察結果のうち、代表的なものを図１２に示す。なお、ＢＯＤＩＰＹの蛍光色は緑色、Ｈｏｅｃｈｓｔの蛍光色は青色でそれぞれ表示するのが一般的であるが、視野全体が非常に明るい緑色を呈してしまうため、そのまま表示すると血管を示す赤色や核を示す青色の判別が困難となってしまうことから、コンピューター上で疑似彩色処理を施すこととしている。ここでは、ＢＯＤＩＰＹの蛍光色を青色としている。

　図１２に示すように、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群では、ＢＯＤＩＰＹ（青）の蛍光で示される脂肪滴すなわち脂肪細胞の周囲をＡｌｅｘａ６４７（赤）の蛍光で示される毛細血管内皮細胞とＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（緑）の蛍光で示される細胞核とが取り囲んでいる構造（以下、「ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造」という）が多数観察されたのに対し、Ｘ群およびＸＩ群ではほとんど観察されなかった。この結果から、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、高脂肪食餌摂取下において、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造の形成が抑制される、あるいはａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造が消失することが明らかになった。

　ここで、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造は、血管新生と脂肪細胞の新生とが起こっている部位であり、肥大化した脂肪組織に特徴的に出現することが知られている（ＮｉｓｈｉｍｕｒａＳ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５６巻、第１５１７－１５２６頁、２００７年）。このことから、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームは、高脂肪食餌摂取下の肥満マウスの脂肪組織において、血管新生と細胞の新生とを抑制する、あるいは新生した血管や脂肪細胞を消失させることが明らかになった。

　以上の本実施例５（３）［３－２］、［３－３］および［３－４］の結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものは、肥満を治療することができることが明らかになった。

（４）通常食餌摂取下の成長に対する影響の評価
［４－１］リポソームおよび融合ペプチドの投与
　健常体マウスとして、６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）１５匹を用意し、３匹ずつ５群に分けて、ＸＩＩ群、ＸＩＩＩ群、ＸＩＶ群、ＸＶ群およびＸＶＩ群とした。各群について、本実施例５（３）［３－１］に記載の方法に基づいてリポソームおよび融合ペプチドの投与を行って飼育した。ただし、ＸＩＩＩ群には本実施例５（３）の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、ＸＩＶ群には本実施例５（１）の融合ペプチドを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を、ＸＩＶ群には本実施例５（３）のアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、それぞれ投与し、ＸＩＩ群およびＸＶＩ群には何れも投与しなかった。また、飼育期間中、食餌としてＸＩＩ群、ＸＩＩＩ群、ＸＩＶ群およびＸＶ群にはＨＦＤ（ＰＭＩ社）を、ＸＶＩ群にはＮＤ（ＰＭＩ社）をそれぞれ与えた。

［４－２］体重変化率の算出および脂肪組織の大きさの観察
　本実施例５（４）［４－１］のＸＩＩ群、ＸＩＩＩ群、ＸＩＶ群、ＸＶ群およびＸＶＩ群について、本実施例５（２）［２－２］に記載の方法に基づいて、体重変化率の算出を行った。ただし、有意差検定は、ＸＩＩＩ群、ＸＩＶ群、ＸＶ群およびＸＶＩ群のＸＩＩ群に対する有意差検定を行った。その結果を図１３ａに示す。

　また、ＸＩＩ群、ＸＩＶ群およびＸＶ群について、本実施例５（３）［３－２］に記載の方法に基づいて脂肪組織の大きさの観察を行った。その結果を図１３ｂに示す。また、脂肪組織の重量を測定し、飼育期間終了時の体重に対する脂肪組織重量の割合（脂肪組織重量割合）を算出し、群毎に平均値と標準偏差を算出して、ＸＩＶ群およびＸＶ群のＸＩＩ群に対する有意差検定を行った。有意差検定は本実施例５（３）［３－２］に記載の方法により行った。その結果を図１３ｃに示す。

　図１３ａに示すように、ＸＶ群の体重変化率は、ＸＩＩ群、ＸＩＩＩ群およびＸＩＶ群と比較して３－３０日目のいずれの時点においても小さいが、ＸＶＩ群と比較した場合は３－３０日目のいずれの時点においても近似していた。すなわち、健常体マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、高脂肪食餌による体重増加が抑制されるが、通常食餌の摂取下における体重増加に相当する体重増加、すなわち通常の成長による体重増加はほとんど抑制されないことが明らかになった。

　また、図１３ｂに示すように、ＸＶ群の鼠径部皮下脂肪組織および精巣上体脂肪組織の大きさはＸＩＩ群およびＸＩＶ群と比較して顕著に小さく、図１３ｃに示すように、ＸＶ群の脂肪組織重量割合はＸＩＩ群およびＸＩＶ群と比較して有意に小さかった。すなわち、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、高脂肪食餌による脂肪組織の肥大化が抑制されること、および、体重に占める脂肪組織の重量の割合が減少することが明らかになった。

　これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものは、通常の成長を阻害せず、高脂肪食餌の摂取による脂肪組織の肥大化を特異的に抑制することが明らかになった。

＜実施例６＞アポトーシス誘導ペプチドが封入されたリポソームの脂肪組織炎症抑制／治療効果の検討
　実施例５（３）［３－３］に記載の方法に基づいて、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群、Ｘ群およびＸＩ群の精巣上体脂肪組織の小片を用意した。これらの精巣上体脂肪組織の小片について、既報（ＮｉｓｈｉｍｕｒａＳ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５６巻、第１５１７－１５２６頁、２００７年およびＮｉｓｈｉｍｕｒａＳ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第１５巻、第９１４－９２０頁、２００９年）に従って抗Ｆ４／８０抗体を用いてマクロファージを免疫染色した。続いて、実施例５（３）［３－４］に記載の方法に基づいて、脂肪滴、毛細血管内皮細胞および細胞核を蛍光染色し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、Ａｌｅｘａ５６８（赤）の蛍光、ＢＯＤＩＰＹ（水色）の蛍光、Ａｌｅｘａ６４７（緑）の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）の蛍光を観察した。観察結果のうち、代表的なものを図１４に示す。なお、ＢＯＤＩＰＹの蛍光色は緑色、Ａｌｅｘａの蛍光色は赤色でそれぞれ表示するのが一般的であるが、視野全体が非常に明るい緑色を呈してしまうことから、そのまま表示すると血管を示す赤色や核を示す青色の判別が困難となってしまうため、コンピューター上で疑似彩色処理を施すこととしている。ここでは、ＢＯＤＩＰＹの蛍光色を青色としている。特に、マクロファージ、各、血管の蛍光色については、それらの局在をできるだけ判別しやすいように赤色、青色、緑色の三原色を割り当てるため、４色目に当たる脂肪滴の蛍光色は、前記三原色の表示に影響のないような色彩を選択しているのである。なお、ここでは、ＢＯＤＩＰＹの蛍光色を水色と、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光色を緑色としている。

　図１４に示すように、ＶＩＩ群およびＶＩＩＩ群では、ＢＯＤＩＰＹ（水色）の蛍光で示される脂肪滴すなわち脂肪細胞の周囲をＡｌｅｘａ６４７（緑）の蛍光で示される毛細血管内皮細胞とＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）の蛍光で示される細胞核とが取り囲んでいる構造（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造）やその周囲において、Ａｌｅｘａ５６８（赤）の蛍光で示されるマクロファージが多数観察された。また、ＩＸ群およびＸＩ群では、脂肪細胞間の隙間やａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスター構造の周囲において、Ａｌｅｘａ５６８（赤）の蛍光で示されるマクロファージが少数観察された。これに対し、Ｘ群ではＡｌｅｘａ５６８（赤）の蛍光で示されるマクロファージがほとんど観察されなかった。すなわち、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、脂肪組織において、マクロファージの浸潤が抑制される、あるいはマクロファージが除去されることが明らかになった。

　これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものは、脂肪組織における炎症を抑制／治療することができることが明らかになった。

＜実施例７＞アポトーシス誘導ペプチドが封入されたリポソームの非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療する効果の検討
　実施例５（３）［３－１］のＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群、ならびに実施例５（３）［３－３］のＸＩ群から肝臓および骨格筋を摘出して、マイクロスライサーＤＳＫ－１０００を用いておよそ１００μｍ厚さの切片を作製した。これらの切片について、ＢＯＤＩＰＹを用いて脂肪滴を、ローダミン標識ファロイジンを用いてＦアクチンを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて細胞核を、それぞれ蛍光染色した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光、ローダミン（赤）の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）の蛍光を観察した。肝臓についての観察結果を図１５ａに、骨格筋についての観察結果を図１６ａにそれぞれ示す。

　また、既報（ｓｈａｈｅｅｎＳ．Ｍ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、第３９巻、ｅ４８、２０１１年）に従ってＩｍａｇｅ－ＰｒｏＰｌｕｓ－４．５ソフトウェアを用いてＢＯＤＩＰＹおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光強度を測定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光強度に対するＢＯＤＩＰＹの蛍光強度（相対的蛍光強度）を算出した。この相対的蛍光強度について、平均値と標準偏差を群毎に算出して、有意差検定を行いヒストグラムに表した。有意差検定は、実施例５（３）［３－３］に記載の方法により、肝臓においてはＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群のＸ群またはＸＩ群に対する有意差検定ならびにＶＩＩ群およびＶＩＩＩ群のＸ群に対する有意差検定を、骨格筋においてはＶＩＩ群およびＶＩＩＩ群のＸＩ群に対する有意差検定ならびにＶＩＩ群およびＶＩＩＩ群のＩＸ群およびＸ群に対する有意差検定をそれぞれ行った。肝臓についての結果を図１５ｂに、骨格筋についての結果を図１６ｂにそれぞれ示す。

　図１５ａおよびｂに示すように、肝臓においては、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光で示される脂肪滴が、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群では多数観察されたのに対し、Ｘ群およびＸＩ群ではほとんど観察されなかった。肝臓におけるＢＯＤＩＰＹの相対的蛍光強度すなわち脂肪の蓄積量は、Ｘ群およびＸＩ群では、ＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群と比較して有意に小さかった。特に、Ｘ群のＢＯＤＩＰＹの相対的蛍光強度すなわち脂肪の蓄積量は、ＸＩ群と同程度であった。

　また、図１６ａおよびｂに示すように、骨格筋においても肝臓における結果と同様であり、ＢＯＤＩＰＹ（緑）の蛍光で示される脂肪滴が、ＶＩＩ群およびＶＩＩＩ群では多数、ＩＸ群ではある程度観察されたのに対し、Ｘ群およびＸＩ群ではほとんど観察されなかった。骨格筋におけるＢＯＤＩＰＹの相対的蛍光強度すなわち脂肪の蓄積量は、ＩＸ群、Ｘ群およびＸＩ群では、ＶＩＩ群およびＶＩＩＩ群と比較して有意に小さかった。特に、Ｘ群のＢＯＤＩＰＹの相対的蛍光強度すなわち脂肪の蓄積量は、ＸＩ群と同程度であった。

　これらの結果から、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、肝臓および骨格筋において、脂肪の蓄積が抑制される、あるいは蓄積した脂肪が減少することが明らかになった。すなわち、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものは、非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制／治療することができることが明らかになった。

＜実施例８＞アポトーシス誘導ペプチドが封入されたリポソームを投与した場合の影響評価
（１）摂取エネルギー量の検討
　実施例５（３）［３－１］のＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群について、リポソームまたはペプチドを６回投与した後（投与開始から１５日間経過後）、２４時間の間に摂取したＨＦＤ（ＰＭＩ社）の量を計測し、計測した結果から摂取されたエネルギー量（摂取エネルギー量；ｋｃａｌ）を算出した。また、摂取エネルギー量について、群毎に平均値および標準偏差を算出し、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の摂取エネルギー量について、ＶＩＩ群の摂取エネルギー量に対する有意差検定を行った。有意差検定は実施例５（３）［３－２］に記載の方法により行った。その結果を図１７に示す。

　図１７に示すように、ＩＸ群の摂取エネルギー量はＶＩＩ群と比較して有意に小さかったのに対し、ＶＩＩＩ群およびＸ群の摂取エネルギー量はＶＩＩ群と比較して有意な変化はなかった。すなわち、融合ペプチドを投与した場合は、それを投与しない場合と比較して摂取エネルギー量が減少するのに対し、アポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、それを投与しない場合と比較して、摂取エネルギー量は変化しないことが明らかになった。

（２）食欲に関する遺伝子発現量の検討
　実施例５（３）［３－１］のＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群について、飼育期間終了後に脳を摘出してホモジェナイズし、ＴＲＩ試薬（シグマ社）を用いて添付の仕様書に従いトータルＲＮＡを抽出した。続いて、トータルＲＮＡ１０μｇにＴｕｒｂｏＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）を添加して３７℃で３０分間インキュベートすることによりゲノムＤＮＡを除去した。このトータルＲＮＡについて、電気泳動を行ってＲＮＡの質を確認した後、１μｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。続いて、視床下部で発現し、摂食を亢進させることが知られている遺伝子であるＡｇｒｐ、ＮｐｙおよびＧａｌ、ならびに摂食を抑制させることが知られている遺伝子であるＰｏｍｃおよびＴｒｈについて、得られたｃＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。

　Ａｇｒｐ；フォワードプライマー：５’－ａｔｇｃｔｇａｃｔｇｃａａｔｇｔｔｇｃｔｇ－３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’－ｃａｇａｃｔｔａｇａｃｃｔｇｇｇａａｃｔｃｔ－３’（配列番号１０）
　Ｎｐｙ；フォワードプライマー：５’－ａｔｇｃｔａｇｇｔａａｃａａｇｃｇａａｔｇｇ－３’（配列番号１１）、リバースプライマー：５’－ｔｇｔｃｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔａｇｔａｔ－３’（配列番号１２）
　Ｇａｌ；フォワードプライマー：５’－ｇｇｃａｇｃｇｔｔａｔｃｃｔｇｃｔａｇｇ－３’（配列番号１３）、リバースプライマー：５’－ｃｔｇｔｔｃａｇｇｇｔｃｃａａｃｃｔｃｔ－３’（配列番号１４）
　Ｐｏｍｃ；フォワードプライマー：５’－ｃｔｇｇａｇａｃｇｃｃｃｇｔｇｔｔｔｃ－３’（配列番号１５）、リバースプライマー：５’－ｔｇｇａｃｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｃｔｇ－３’（配列番号１６）
　Ｔｒｈ；フォワードプライマー：５’－ｇｇａｇａｃｃｃｃａｃａａａｃｇａｃａｇ－３’（配列番号１７）、リバースプライマー：５’－ｃａｔｃｃａｇｇｇｇａａｇｇａｔｃｇｃ－３’（配列番号１８）

　また、ＱｕａｎｔａｍＲＮＡＣｌａｓｓｉｃＩＩ１８Ｓｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて１８ＳｒＲＮＡを増幅して内部コントロールとした。ＰＣＲ産物はゲル電気泳動を行って分離した後、エチジウムブロマイドを用いてゲルを染色し、イメージアナライザーＬＡＳ－４００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）を用いてシグナルを検出した。検出したシグナルの強度をＭｕｌｔｉ－Ｇａｇｅソフトウェアを用いて測定し、１８ＳｒＲＮＡのシグナル強度により除した値を算出し、これを各遺伝子の相対的発現量とした。相対的発現量について、群毎に平均値および標準偏差を算出し、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の相対的発現量について、ＶＩＩ群の相対的発現量に対する有意差検定を行った。有意差検定は実施例５（３）［３－２］に記載の方法により行った。その結果を図１８に示す。

　図１８に示すように、Ａｇｒｐ、Ｎｐｙ、ＧａｌおよびＰｏｍｃの相対的発現量は、各群間でほとんど変化が見られなかった。これに対し、Ｔｒｈの相対的発現量は、ＶＩＩＩ群およびＸ群でＶＩＩ群と比較して有意な変化が見られなかったが、ＩＸ群でＶＩＩ群と比較した場合は有意に大きかった。すなわち、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、それを投与しない場合と比較して、摂食亢進遺伝子および摂食抑制遺伝子のいずれも発現量はほとんど変化しないことが明らかになった。

　以上の本実施例８（１）および（２）の結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものを投与することは、食欲に対してほとんど影響を及ぼさないことが明らかになった。

（３）血中パラメーターの検討
　実施例５（３）［３－１］のＶＩＩ群、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群について、飼育期間終了後に血清を採取し、ＬｅｐｔｉｎＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡＫｉｔ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてレプチンの濃度を、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ　ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡＫｉｔ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてアディポネクチンの濃度を、（トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー；和光純薬社）を用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の濃度をそれぞれ測定した。測定結果について、群毎に平均値および標準偏差を算出し、ＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群の測定結果について、ＶＩＩ群の測定結果に対する有意差検定を行った。有意差検定は実施例５（３）［３－２］に記載の方法により行った。その測定結果を図１９に示す。なお、レプチンおよびアディポネクチンはいずれも脂肪細胞から分泌されるホルモンであり、肥満に伴って、レプチンの血中濃度は上昇し、アディポネクチンの血中濃度は低下することが知られている。また、ＡＬＴはグルタミン酸ピルビン酸転移酵素（ＧＰＴ）とも呼ばれ、ピルビン酸やグルタミン酸をアラニンやα－ケトグルタル酸に変換する酵素であり、肝細胞に豊富に存在するため、肝細胞の損傷すなわち肝機能障害の進行に伴って血中濃度は上昇することが知られている。

　図１９に示すように、レプチンの濃度は、ＶＩＩＩ群ではＶＩＩ群と比較して有意な変化がなかったのに対し、ＩＸ群およびＸ群ではＶＩＩ群と比較して有意に小さく、特にＸ群では顕著に小さかった。また、アディポネクチンの濃度は、ＶＩＩＩ群およびＩＸ群ではＶＩＩ群と比較して有意な変化がなかったのに対し、Ｘ群ではＶＩＩ群と比較して有意に大きかった。また、ＡＬＴの濃度はＶＩＩＩ群、ＩＸ群およびＸ群のいずれにおいてもＶＩＩ群と比較して有意な変化はなかったが、Ｘ群ではＶＩＩ群と比較して小さい傾向であった。

　すなわち、肥満マウスにアポトーシス誘導ペプチド封入１枚膜リポソームを投与した場合は、それを投与しない場合と比較して、レプチンの血中濃度が低下し、アディポネクチンの血中濃度が上昇すること、およびＡＬＴの血中濃度が低下する傾向であることが明らかになった。これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってアポトーシス誘導ペプチドが封入されたものを投与すると、脂肪細胞から分泌されるホルモンのバランスが正常化することや、肝臓の機能が正常化することが示唆された。

＜実施例９＞シトクロムｃが封入されたリポソームのアポトーシス誘導効果の検討
（１）混合脂質溶液の調製
　実施例１（１）［１－１］～［１－３］に記載の方法により、混合脂質溶液を調製した。ただし、混合脂質溶液における各脂質のモル％比は、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９４：５：１とした。

（２）逆相蒸発法によるシトクロムｃ封入１枚膜リポソームの調製
　本実施例９（１）の混合脂質溶液について、実施例１（１）［１－４］に記載の方法に基づき、逆相蒸発法によりリポソームを調製した。ただし、ＨＥＰＥＳ緩衝液に代えて、シトクロムｃを１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた。すなわち、シトクロムｃが封入された、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有するリポソームを調製し、これをシトクロムｃ封入１枚膜リポソームとした。

（３）逆相蒸発法による空１枚膜リポソームの調製
　本実施例９（１）の混合脂質溶液について、実施例１（１）［１－４］に記載の方法に基づき、逆相蒸発法によりリポソームを調製した。すなわち、シトクロムｃが封入されていない、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有するリポソームを調製し、これを空１枚膜リポソームとした。空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液の脂質濃度は、１０ｍｍｏｌ／Ｌであった。

（４）脂肪組織毛細血管内皮細胞の調製
　９－１０週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから鼠径部の皮下脂肪組織を摘出し、既報（ＫａｊｉｍｏｔｏＫ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３５７巻、第４３－５０頁、２０１０年）に従って、毛細血管内皮細胞を分離して初代培養細胞を調製した。これを５×１０^４個／ウェルとなるよう播種した培養皿を１０枚用意し、Ｇ、Ｈ、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、Ｉ４、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３およびＪ４とした。ＥＧＭ２－ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２、相対湿度１００％の環境下で、これらを一晩インキュベートした。

（５）リポソームの添加および細胞形態の観察
　下記のシトクロムｃの終濃度および脂質の添加量となるように、本実施例９（３）のＧ、Ｈ、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、Ｉ４、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３およびＪ４の培地に、ＨＥＰＥＳ緩衝液のみ、本実施例９（３）の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液、シトクロムｃを溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液または本実施例９（２）のシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を添加した。なお、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３およびＪ４については、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液とともに、脂質の添加量を一定（０．６５μｍｏｌ）とするために必要な量の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を添加した。

　　　　　　　　　　　　　　シトクロムｃの終濃度　　　脂質の添加量
Ｇ　：ＨＥＰＥＳ緩衝液のみ　０　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０　　　μｍｏｌ
Ｈ　：空１枚膜リポソーム　　０　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０．６５μｍｏｌ
Ｉ１：シトクロムｃ　　　　　０．５ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０　　　μｍｏｌ
Ｉ２：シトクロムｃ　　　　　１　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０　　　μｍｏｌ
Ｉ３：シトクロムｃ　　　　　２　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０　　　μｍｏｌ
Ｉ４：シトクロムｃ　　　　　４　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０　　　μｍｏｌ
Ｊ１：シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム＋空１枚膜リポソーム
　　　　　　　　　　　　　　０．５ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０．６５μｍｏｌ
Ｊ２：シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム＋空１枚膜リポソーム
　　　　　　　　　　　　　　１　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０．６５μｍｏｌ
Ｊ３：シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム＋空１枚膜リポソーム
　　　　　　　　　　　　　　２　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０．６５μｍｏｌ
Ｊ４：シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム＋空１枚膜リポソーム
　　　　　　　　　　　　　　４　　ｎｍｏｌ／ｍＬ　　０．６５μｍｏｌ

　その後、本実施例９（４）に記載の環境下で３時間インキュベートした後、光学顕微鏡を用いて細胞の形態を観察した。その結果を図２０に示す。

　図２０に示すように、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３およびＪ４では、アポトーシスが誘導されたことを示す球状の細胞形態（ＦｒｉｉｓＭ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第５６７巻、第４２７－４４３頁、２００５年）が確認された。また、球状の細胞形態を示す細胞数はＪ１＜Ｊ２＜Ｊ３＜Ｊ４であった。これに対し、Ｇ、Ｈ、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３およびＩ４のいずれにおいても、球状の細胞形態は確認されなかった。

　すなわち、脂肪組織血管内皮細胞にシトクロムｃをそのまま添加した場合はアポトーシスが誘導されないものの、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームを添加した場合はアポトーシスが誘導されること、およびその場合のアポトーシスが誘導される細胞数はシトクロムｃの終濃度に依存して多くなることが明らかになった。

　これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってシトクロムｃが封入されたものは、脂肪組織血管内皮細胞にアポトーシスを誘導することができることが明らかになった。

＜実施例１０＞シトクロムｃが封入されたリポソームの肥満抑制／治療効果の検討
（１）逆相蒸発法によるシトクロムｃ封入１枚膜リポソームの調製
　実施例９（２）に記載の方法に基づき、逆相蒸発法によりシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを調製した。

（２）リポソームの投与
　健常体マウスとして５週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）１５匹を用意し、３匹ずつ５群に分けて、ＸＶＩＩ群、ＸＶＩＩＩ群、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群とした。ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群には本実施例１０（１）のシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、３日に１回の間隔で計１０回尾静脈に投与して、３０日間飼育した。ＸＶＩＩ群およびＸＶＩＩＩ群には何れのリポソームも投与せずに、３０日間飼育した。混合脂質溶液中のシトクロムｃの、１回あたりの投与量は下記のとおりである。また、飼育期間中、ＸＶＩＩ群にはＮＤ（ＰＭＩ社）を、ＸＶＩＩＩ群、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群にはＨＦＤ（ＰＭＩ社）をそれぞれ餌として与えるとともに水および餌は自由摂取させ、飼育温度は２３℃とした。

ＸＶＩＩ群：投与したもの；（何れのリポソームも投与しない）
ＸＶＩＩＩ群：投与したもの；（何れのリポソームも投与しない）
ＸＩＸ群：投与したもの；シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム
シトクロムｃ量；マウス個体の体重（ｋｇ）×０．５ｍｍｏｌ（６．１６ｍｇ）
ＸＸ群：投与したもの；シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム
シトクロムｃ量；マウス個体の体重（ｋｇ）×０．１ｍｍｏｌ（１．２３ｍｇ）
ＸＸＩ群：投与したもの；シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム
シトクロムｃ量；マウス個体の体重（ｋｇ）×０．０２ｍｍｏｌ（０．２５ｍｇ）

（３）体重変化率の算出
　本実施例１０（２）のＸＶＩＩ群、ＸＶＩＩＩ群、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群について、混合脂質溶液（シトクロムｃ封入１枚膜リポソーム）の投与開始から０、３、６、７、９、１２、１４、１５、１８、２１、２４、２７、２８および３０日目に体重を測定して、実施例５（２）［２－２］に記載の方法により体重変化率を算出し、ＸＶＩＩ群、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群の体重変化率について、ＸＶＩＩＩ群の体重変化率に対する有意差検定を行った。その結果を図２１に示す。

　図２１に示すように、ＸＶＩＩＩ群、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群の体重変化率の値は、ＸＶＩＩ群の体重変化率と比較して、３、６、７、９、１２、１４、１５、１８、２１、２４、２７、２８および３０日目のいずれにおいても大きかった。この結果から、高脂肪食餌によって体重増加が生じたことが確認された。

　また、ＸＩＸ群の体重変化率の値はＸＶＩＩＩ群の体重変化率の値と比較して、３、６、７、９、１２、１４、１５、１８、２１、２４、２７、２８および３０日目のいずれにおいても小さかった。ＸＩＸ群のＸＶＩＩＩ群に対する有意差は、３、６、７、９、１２および１５日目においてはなかったが、１４および１８日目においてはｐ＜０．０５、ならびに２１、２４、２７、２８および３０日目においてはｐ＜０．０１であった。

　また、ＸＸ群の体重変化率の値は、ＸＶＩＩＩ群の体重変化率の値と比較して、３、６、および１２日目において近似しており、７および９日目において大きく、１４、１５、１８、２１、２４、２７、２８および３０日目において小さかった。ＸＸ群のＸＶＩＩＩ群に対する有意差は、３、６、７、９、１２、１４、１５、１８および２１日目においてはなかったが、２４日目においてはｐ＜０．０５、ならびに２７、２８および３０日目においてはｐ＜０．０１であった。

　また、ＸＸＩ群の体重変化率の値は、ＸＶＩＩＩ群の体重変化率の値と比較して、３、６、１２および１４日目において近似しており、７および９日目において大きく、１５、１８、２１、２４、２７、２８および３０日目において小さかった。ＸＸＩ群のＸＶＩＩＩ群に対する有意差は、３、６、７、９、１２、１４、１５、１８、２１および２４日目においてはなかったが、２７および２８日目においてはｐ＜０．０５、ならびに３０日目においてはｐ＜０．０１であった。

　また、ＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群の間で体重変化率の値を比較すると、３、６、７、９および１２日目においては、ＸＩＸ群＜ＸＸ群／ＸＸＩ群であり、１４、１５、１８、２１、２４、２７、２８および３０日目においてはＸＩＸ群＜ＸＸ群＜ＸＸＩ群であった。すなわち、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームの投与によって高脂肪食餌の摂食による健常体マウスの体重増加を抑制することができること、およびその抑制効果はシトクロムｃの投与量に依存して大きくなることが明らかになった。

　これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってシトクロムｃが封入されたものは、肥満を抑制することができることが明らかになった。

（４）毒性の確認
　本実施例１０（２）のＸＩＸ群、ＸＸ群およびＸＸＩ群について、飼育開始から３０日目に血液検査を行って、投与したシトクロムｃ封入１枚膜リポソームの肝毒性を確認した。その結果、いずれの群においても薬物性肝障害の発生を示す値は検出されなかった。これらの結果から、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームは毒性を有さないことが明らかになった(図示しない)。

＜実施例１１＞シトクロムｃが封入された、脂質膜枚数が異なるリポソームのシトクロムｃ封入率の検討
（１）混合脂質溶液の調製
　実施例１（１）［１－１］～［１－３］に記載の方法により、混合脂質溶液を調製した。ただし、混合脂質溶液における各脂質のモル％比は、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９４：５：１とした。

（２）逆相蒸発法によるシトクロムｃ封入１枚膜リポソームの調製
　本実施例１１（１）の混合脂質溶液について、実施例９（２）に記載の方法に基づき、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームを調製した。

（３）単純水和法によるシトクロムｃ封入複数膜リポソームの調製
　本実施例１１（１）の混合脂質溶液について、実施例２（１）［１－３］に記載の方法により単純水和法によるリポソームの調製を行った。ただし、ＨＥＰＥＳ緩衝液に代えて、シトクロムｃ（シグマアルドリッチ社）が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた。すなわち、Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを構成脂質として含む脂質膜を複数膜として有するとともにシトクロムｃが封入された、シトクロムｃ封入複数膜リポソームを調製した。

（４）平均粒子径、表面電位およびＰＤＩの測定
　本実施例１１（２）のシトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよび本実施例１１（３）のシトクロムｃ封入複数膜リポソームについて、実施例１（１）［１－５］に記載の方法により、平均粒子径、表面電位およびＰＤＩをそれぞれ測定し、さらに本実施例１１（１）～前記測定を３～６回繰り返すことによって、それぞれの標準偏差を算出した。その結果を表３に示す。

　表３に示すように、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよびシトクロムｃ封入複数膜リポソームのいずれも、平均粒子径は１０５ｎｍ前後、表面電位は－９ｍＶ前後およびＰＤＩは０．２５前後であった。この結果から、シトクロムｃ１枚膜リポソームおよびシトクロムｃ複数膜リポソームは、同様の物性を有する負帯電性リポソームあるいは非帯電性リポソームであることが明らかになった。

（５）シトクロムｃ封入率の確認
　本実施例１１（２）のシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液および本実施例１１（３）のシトクロムｃ封入複数膜リポソームを含む混合脂質溶液について、８２０００×ｇで４５分間超遠心分離を行った後、上層を除去して下層を回収した。下層をＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、再度８２０００×ｇで４５分間超遠心分離を行って上層を除去して下層を回収した。回収した下層をそれぞれ１００μＬの蒸留水に懸濁することにより、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよびシトクロムｃ封入複数膜リポソームを回収した。回収した各リポソームについて、ＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いてＢＣＡアッセイを行い、シトクロムｃを定量した。また、回収した各リポソームについて、リン脂質Ｃ－テストワコーキット（和光純薬社）を用いてＥＰＣを定量した。これらの定量結果に基づき、下記の式３、式４および式５を用いて、シトクロムｃ回収率、脂質回収率およびシトクロムｃ封入率をそれぞれ算出した。

式３；シトクロムｃ回収率（％）＝｛定量したシトクロムｃ量／本実施例１１（２）または本実施例１１（３）においてリポソーム調製の際に用いたシトクロムｃ量｝×１００
式４；脂質回収率（％）＝｛定量したＥＰＣ量／本実施例１１（２）または本実施例１１（３）においてリポソーム調製の際に用いたＥＰＣ量｝×１００
式５；シトクロムｃ封入率（％）＝（シトクロムｃ回収率／脂質回収率）×１００

　さらに本実施例１１（１）～（３）および前記測定を３回繰り返すことによって、各サンプルについて得られたシトクロムｃ回収率、脂質回収率およびシトクロムｃ封入率の平均値、ならびにそれぞれの標準偏差を算出した。その結果を表４に示す。

　表４に示すように、シトクロムｃ回収率は、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよびシトクロムｃ封入複数膜リポソームのいずれも約１５％であった。これに対し、シトクロムｃ封入複数膜リポソームの脂質回収率はシトクロムｃ封入１枚膜リポソームと比較して約１．５倍であり、シトクロムｃ封入複数膜リポソームのシトクロムｃ封入率はシトクロムｃ封入１枚膜リポソームと比較して約２／３であった。

　これらの結果から、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよびシトクロムｃ封入複数膜リポソームは、同様の物性（平均粒子径、表面電位およびＰＤＩ）を有するものの、シトクロムｃ封入率は、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームの方がシトクロムｃ封入複数膜リポソームと比較して大きいことが明らかになった。

＜実施例１２＞シトクロムｃが封入された、脂質膜枚数が異なるリポソームの肥満抑制／治療効果の検討
（１）リポソームの調製
　実施例９（２）に記載の方法に基づいてシトクロムｃ封入１枚膜リポソームを調製した。また、実施例９（３）に記載の方法に基づいて空１枚膜リポソームを調製した。また、実施例１１（３）に記載の方法により、シトクロムｃ封入複数膜リポソームを調製した。

（２）リポソームの投与
　４週齢から１６週齢までの１２週間、ＨＦＤ（ＰＭＩ社）を与えることにより、中程度の食餌性肥満としたＤＩＯマウス（チャールズリバー社）の雄１６匹を用意し、肥満マウスとした。これらの肥満マウスを４匹ずつ４群に分けて、ＸＸＩＩ群、ＸＸＩＩＩ群、ＸＸＩＶ群およびＸＸＶ群とした。

　ＸＸＩＩ群には何れのリポソームも投与せず、ＸＸＩＩＩ群には本実施例１２（１）のシトクロムｃ封入複数膜リポソームを含む混合脂質溶液を、ＸＸＩＶ群には本実施例１２（１）のシトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよび空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、またはＸＸＶ群にはシトクロムｃおよび本実施例１２（１）の空１枚膜リポソームを含む混合脂質溶液を、３日に１回の間隔で計７回尾静脈に投与して、２１日間飼育した。混合脂質溶液中のシトクロムｃおよび脂質の、１回あたりの投与量は、ＸＸＩＩＩ群、ＸＸＩＶ群およびＸＸＶ群のいずれにおいても、シトクロムｃが「マウス個体の体重（ｋｇ）×６．１６ｍｇ（シトクロムｃ）量」かつ脂質が「マウス個体の体重（ｋｇ）×０．１９ｍｍｏｌ（脂質）量」となるようにした。飼育期間中、それぞれに餌としてＨＦＤ（ＰＭＩ社）を与えるとともに水および餌は自由摂取させ、飼育温度は２３℃とした。

（３）体重変化率の算出
　本実施例１２（２）のＸＸＩＩ群、ＸＸＩＩＩ群、ＸＸＩＶ群およびＸＸＶ群について、混合脂質溶液（シトクロムｃ封入複数膜リポソーム、シトクロムｃ封入１枚膜リポソームおよび空１枚膜リポソーム、またはシトクロムｃおよび空１枚膜リポソーム）の投与開始から０、３、６、９、１２、１５、１８および２１日目に体重を測定して、実施例５（２）［２－２］に記載の方法により体重変化率を算出し、ＸＸＩＩＩ群、ＸＸＩＶ群およびＸＸＶ群の体重変化率について、ＸＸＩＩ群の体重変化率に対する有意差検定を行った。その結果を図２２に示す。

　図２２に示すように、ＸＸＩＩＩ群の体重変化率の値は、ＸＸＩＶ群の体重変化率の値と比較して、３、６、９、１２、１５、１８および２１日目のいずれにおいても近似しており、ＸＸＩＩＩ群のＸＸＩＶ群に対する有意差は、３、６、９、１２、１５、１８および２１日目のいずれにおいてもなかった。

　また、ＸＸＶ群の体重変化率の値は、ＸＸＩＩ群の体重変化率の値と比較して、３日目において近似しており、６、９、１２、１５、１８および２１日目においてわずかに小さかった。ＸＸＶ群のＸＸＩＩ群に対する有意差は、３、６、９、１２、１５、１８および２１日目のいずれにおいてもなかった。

　これに対し、ＸＸＩＶ群の体重変化率の値は、ＸＸＩＩ群の体重変化率の値と比較して、３、６、９、１２、１５、１８および２１日目のいずれにおいても顕著に小さかった。ＸＸＩＶ群のＸＸＩＩ群に対する有意差は、３日目においてはなかったが、６、９および１２日目においてはｐ＜０．０５、ならびに１５、１８および２１日目においてはｐ＜０．０１であった。

　さらに、ＸＸＩＩ群、ＸＸＩＩＩ群およびＸＸＶ群の体重変化率の値は、３、６、９、１２、１５、１８および２１日目のいずれにおいても正であり、飼育日数の経過とともに大きくなった。すなわち、ＸＸＩＩ群、ＸＸＩＩＩ群およびＸＸＶ群では飼育期間中継続して体重が増加した。これに対し、ＸＸＩＶ群の体重変化率の値は、３および９日目においては正であったが、６、１２、１５、１８および２１日目においては負であり、飼育日数の経過とともに小さくなった。すなわち、ＸＸＩＶ群では飼育期間中継続して体重が減少した。

　これらの結果から、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する脂質膜構造体であってシトクロムｃが封入されたものは、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチド、長鎖長のＰＥＧおよび脂質がこの順で結合してなる脂質と、短鎖長のＰＥＧが結合してなる脂質とを構成脂質として含む脂質膜を複数膜として有する脂質膜構造体であってシトクロムｃが封入されたもの、あるいは脂質膜構造体に封入されていないシトクロムｃと比較して、肥満を抑制および治療する効果が極めて高いことが明らかになった。

＜実施例１３＞ＰＥＧ鎖長を入れ替えたリポソーム
　実施例１に記載した方法に準じ、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ＝９４：１：５：１のリポソーム（以下、リポソームＰとする）を調製した。このリポソームＰは、実施例１のリポソームＣ（ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９４：１：５：１）において、移行能ペプチドに結合するＰＥＧの鎖長を入れ替えたものに相当する。

　リポソームＰおよび実施例１のリポソームＣをそれぞれ０．１ｍｍｏｌ脂質／ｋｇ体重の容量で、健常体マウスである１４週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（チャールズリバー社）４匹に尾静脈投与し、その４．５時間後にＦＩＴＣ標識ＧｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａＬｅｃｔｉｎＩ－Ｂ４Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ（ＦＩＴＣ－ＧＳＩ－Ｂ４；ベクターラボラトリーズ社）を溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液を尾静脈に投与した。さらにその３０分後に各マウスの肝臓および鼠径部の皮下脂肪組織を摘出して小片を作製し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。観察結果を図２３にそれぞれ示す。

　図２３のマージ写真に示されるように、移行能ペプチドに結合するＰＥＧの鎖長を５０００から２０００に変更したリポソームＰも脂肪組織の毛細血管内皮細胞に局在することが確認された。ただしその量は、脂質マーカー写真（赤で示される）で見られるようにリポソームＣと比較して少量であった。以上から、本発明において移行能ペプチドに結合するＰＥＧの分子量Ｍａは３５００≦Ｍａ≦６５００に代わり５００≦Ｍｂ≦３５００とすることもできること、またペプチドに結合するＰＥＧの分子量Ｍａ３５００≦Ｍａ≦６５００がより高められたインビボでの標的指向性を与えること、が確認された。

＜参考例１＞移行能ペプチドを持たないリポソームの脂肪組織への集積
（１）リポソームの調製
　実施例１に記載された移行能ペプチド（ＧＫＧＧＲＡＫＤＧＧＣ）のＣ末端のシステイン残基と５（６）－カルボキシテトラメチルローダミン－Ｃ５－マレイミド（ＴＡＭＲＡ）を反応させて、ＴＡＭＲＡ修飾ペプチド（ＴＡＭＲＡ－Ｐｅｐ）を用意した。ＴＡＭＲＡはローダミンとほぼ同じ蛍光波長を有するラベル化合物である。

　またＨＥＰＥＳ緩衝液を、ローダミンが０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解したＨＥＰＥＳ緩衝液に代えた他は実施例１（１）［１－４］の記載に従い、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：Ｐｅｐ－ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９４：１：５：１のローダミン封入リポソーム（以下、リポソームＱとする）およびＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９４：１：５：１のローダミン封入リポソーム（以下、リポソームＲとする）を調製した。上記リポソームＱは内部にローダミンが封入された本発明の１枚膜リポソームであり、リポソームＲは移行能ペプチドを持たない以外はリポソームＱと同じ構成を、すなわち鎖長の異なる２種のＰＥＧを有する１枚膜リポソームである。

（２）肥満マウスへのリポソーム投与
　実施例４（５）に記載の方法に準じて体重４３ｇ以上の肥満モデルマウス３群を作成した。第１群に（１）で作成したＴＡＭＲＡ－Ｐｅｐのみを０．２μｍｏｌローダミン／ｋｇ体重の容量で尾静脈投与し、第２群と第３群にリポソームＱまたはリポソームＲをそれぞれ０．２μｍｏｌローダミン／ｋｇ体重の容量で尾静脈投与し、その２４時間後に脂肪組織を摘出した。脂肪組織をＡｌｅｘａ６４７－ＧＳＩＢ４溶液に１時間浸漬させて血管を染色後に小片を作製し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。観察結果を図２４にそれぞれ示す。なお、図２４において、Ａｌｅｘａ６４７による血管の染色は赤色で、ＴＡＭＲＡおよびローダミンの蛍光は緑でそれぞれ示される。

　本発明のリポソームＱを投与した第２群における封入されたローダミン（緑）の標的部位（脂肪組織の血管内皮細胞）への送達効率は、移行能ペプチドを持たないリポソームＲを投与した第３群のそれと比較して劇的に向上していた。このことは他の実施例において示された結果と整合する。一方、肥満マウスに対する投与では、移行能ペプチドを持たないリポソームＲも、ある程度は脂肪組織に集積することが観察された。健常体マウスに投与した場合には移行能ペプチドを持たないリポソームは、脂肪組織に集積しないことは先行する実施例で示したとおりであるので、肥満マウスにおけるリポソームＲの脂肪組織への集積は、移行能ペプチドによる能動的ターゲティングとは異なる機構に基づくものであると推認された。

　上記のリポソームＲを投与した肥満マウスの脂肪組織をさらに詳しく解析したところ、リポソームＲは、脂肪組織において血管内皮細胞ではなく、実施例５（３）［３－４］において述べたａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターに集積していることが観察された（図２５）。なお、図２５において、血管を示すＡｌｅｘａ６４７の蛍光は緑色で、リポソームを示すローダミンの蛍光は赤色で、脂肪滴を示すＢＯＤＩＰＹの蛍光は青でそれぞれ示される。肥満の脂肪組織内に形成されるａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターは新しい脂肪細胞の形成と血管新生が生じている部位であり、従って正常血管と比べて血管構造が疎であると予想できる。そのため、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターにおけるリポソームＲの集積は、リポソームＲが疎な血管壁の間隙を通り抜けたことによる受動性ターゲティングの結果であると考えられる。なお、血管構造が疎である組織における血管壁を越えた物質の蓄積は、腫瘍組織においてはＥＰＲ効果（ＥｎｈａｎｃｅｄｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙａｎｄＲｅｔｅｎｔｉｏｎ、Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９８６年）として提唱されている。腫瘍組織は腫瘍細胞の形成と血管新生が生じている部位の例であり、数十～２００ｎｍ程度のナノ粒子が上記ＥＰＲ効果を示すことが報告されている。１００ｎｍ前後の平均粒子径を有するリポソームＲがａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターに集積することから、数十～２００ｎｍの平均粒子径を有するリポソームがａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターへの集積に有利であると考えられる。

＜参考例２＞血中滞留性が高められたリポソームの受動性ターゲティング
　実施例１に記載した方法に準じ、脂質構成がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝９８：１：１のリポソームＳを用意した。同様に、脂質構成がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ：ローダミン標識ＤＯＰＥ：ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝７９：１：２０のリポソームＴを調製した。リポソームＳとリポソームＴは、前者のＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥの修飾量が１ｍｏｌ％で後者のそれが２０ｍｏｌ％である他は、同一の構成を有する。

　実施例４（５）に記載の方法に準じて体重４３ｇ以上の肥満モデルマウス３群を作成した。同時にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに通常の餌を摂餌させた健常体マウス（６週齢）３群を作成した。リポソームＳおよびＴをそれぞれ０．１ｍｍｏｌ脂質／ｋｇ体重の容量で肥満マウスおよび健常体マウスに尾静脈投与し、その２４時間後に脂肪組織を摘出してＡｌｅｘａ６４７－ＧＳＩＢ４溶液に１時間浸漬させて血管を染色後に小片を作製し、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。観察結果を図２６に示す。なお、図２６において、Ａｌｅｘａ６４７による血管の染色は赤色で、ローダミンによる投与された物質の蛍光は緑色でそれぞれ示される。

　健常体マウスでは、ＰＥＧ２０００の修飾量にかかわらず、脂肪組織血管内皮細胞へのリポソームの集積は殆ど認められないのに対して、肥満マウスではＰＥＧ２０００の修飾量を２０ｍｏｌ％としたリポソームＴが脂肪組織に有意に集積しており、かつその部位はａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターであることが確認された。

　一般に、リポソームの表面をＰＥＧで修飾すると、その修飾量に応じてリポソームの血中滞留性が向上することが知られている。このＰＥＧ修飾量と血中滞留性の関係を合わせ考えると、鎖長の異なる２種類のＰＥＧで修飾したリポソームにおいてＰＥＧ修飾量を高めたことがリポソームの血中滞留性を向上させ、その結果としてａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターにおける受動的なリポソームの集積量の増加をもたらしたと考えられる。この様に、鎖長の異なる２種類のＰＥＧで修飾し、かつその両方あるいは一方の修飾量を高くして血中滞留性を高めたリポソームは、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターに対する受動的ターゲティングにおいて有利である。

　上記参考例１（移行能ペプチドを持たず、かつＰＥＧ修飾量が総脂質に対して６ｍｏｌ%以上である１枚膜リポソーム）および参考例２（移行能ペプチドを持たず、かつ１種類のＰＥＧで修飾された１枚膜リポソーム）から、下記１）または２）の脂質膜構造体からなる、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃクラスターに対する受動的ターゲティングリポソームが導かれる。
１）ポリエチレングリコールが結合してなる脂質を構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有し、ＰＥＧの修飾量が総脂質に対して６ｍｏｌ％以上である、標的組織移行能を有する脂質膜構造体。
２）ポリエチレングリコールが結合してなる脂質を構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有し、ＰＥＧの修飾量が総脂質に対して６ｍｏｌ％以上である、血中滞留性が高められた脂質膜構造体。
３）平均粒子径が数十～２００ｎｍである、１）に記載の脂質膜構造体。
　脂肪組織、特に脂肪細胞に対して直接作用する抗肥満薬や脂肪細胞のアポトーシスを引き起こす物質などを封入させた上記リポソームは、脂肪組織血管内皮細胞だけでなく脂肪細胞そのものに前記薬物を送達することができる点で有利である。

Claims

　標的細胞移行能を有する脂質膜構造体であって、下記（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む脂質膜を１枚膜として有する、前記脂質膜構造体；
（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ポリエチレングリコールおよび脂質がこの順で結合してなる脂質、
（ｂ）（ａ）を構成するポリエチレングリコールと比較して数平均分子量が小さいポリエチレングリコールが結合してなる脂質。
　（ａ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍａが３５００≦Ｍａ≦６５００のポリエチレングリコールであり、かつ、（ｂ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍｂが５００≦Ｍｂ≦３５００のポリエチレングリコールである、請求項１に記載の脂質膜構造体。
　負帯電性脂質膜構造体または非帯電性脂質膜構造体である、請求項１または請求項２に記載の脂質膜構造体。
　リポソームである、請求項１から請求項３のいずれかに記載の脂質膜構造体。
　標的細胞移行能を有するペプチドが、脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドである、請求項１から請求項４のいずれかに記載の脂質膜構造体。
　脂肪組織血管内皮細胞移行能を有するペプチドが、ＫＧＧＲＡＫＤ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｇはグリシン残基を、Ｒはアルギニン残基を、Ａはアラニン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項５に記載の脂質膜構造体。
　アポトーシス誘導剤が封入された請求項５または請求項６に記載の脂質膜構造体を有効成分とする、肥満抑制および／または治療剤。
　アポトーシス誘導剤が下記（ｉ）および／または（ｉｉ）である、請求項７に記載の肥満抑制および／または治療剤；
（ｉ）ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｌはロイシン残基を、Ａはアラニン残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｉｉ）シトクロムｃ。
　アポトーシス誘導剤が封入された請求項５または請求項６に記載の脂質膜構造体を有効成分とする、脂肪組織炎症抑制および／または治療剤。
　アポトーシス誘導剤が下記（ｉ）および／または（ｉｉ）である、請求項９に記載の脂肪組織炎症抑制および／または治療剤；
（ｉ）ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｌはロイシン残基を、Ａはアラニン残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｉｉ）シトクロムｃ。
　アポトーシス誘導剤が封入された請求項５または請求項６に記載の脂質膜構造体を有効成分とする、非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／または治療する剤。
　アポトーシス誘導剤が下記（ｉ）および／または（ｉｉ）である、請求項１１に記載の剤；
（ｉ）ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（式中、Ｋはリシン残基を、Ｌはロイシン残基を、Ａはアラニン残基を、それぞれ表す。）のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｉｉ）シトクロムｃ。
　標的細胞移行能を有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）の脂質を構成脂質として含む１枚膜の脂質膜を調製する工程を有する、前記方法；
（ａ）標的細胞移行能を有するペプチド、ポリエチレングリコールおよび脂質がこの順で結合してなる脂質、
（ｂ）（ａ）を構成するポリエチレングリコールと比較して数平均分子量が小さいポリエチレングリコールが結合してなる脂質。
　（ａ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍａが３５００≦Ｍａ≦６５００のポリエチレングリコールであり、かつ、（ｂ）を構成するポリエチレングリコールが、分子量Ｍｂが５００≦Ｍｂ≦３５００のポリエチレングリコールである、請求項１３に記載の方法。
　標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法であって、
　請求項１から請求項６のいずれかに記載の脂質膜構造体において１の標的細胞移行能を有するペプチドを選択するとともに対象物質を封入して前記標的細胞へ移行させる工程と、
　前記対象物質が前記標的細胞において効果を示すか否かを評価する工程と
　を有する、前記方法。
　肥満抑制および／もしくは治療剤、脂肪組織炎症抑制および／もしくは治療剤または非脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制および／もしくは治療する剤のスクリーニング方法であって、
　請求項５または請求項６に記載の脂質膜構造体に対象物質を封入して脂肪組織血管内皮細胞へ移行させる工程と、
　前記対象物質が脂肪組織血管内皮細胞においてアポトーシスを誘導するか否かを評価する工程と
　を有する、前記方法。