JP7220472B2

JP7220472B2 - リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット

Info

Publication number: JP7220472B2
Application number: JP2019504598A
Authority: JP
Inventors: 淳宮▲崎▼; 博之西山; 喬之吉野; 英之赤座
Original assignee: University of Tsukuba NUC
Current assignee: University of Tsukuba NUC
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2023-02-10
Anticipated expiration: 2038-03-06
Also published as: WO2018164116A1; JPWO2018164116A1

Description

本発明は、リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キットに関する。本願は、２０１７年３月６日に、日本に出願された特願２０１７－０４２２２８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

膀胱癌は再発が多い癌として知られている。このため、筋層に浸潤していない筋層非浸潤性膀胱癌の治療法として、内視鏡手術で癌組織を切除した後に、再発を抑制するためにカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を膀胱内に注入する治療法が標準的に行われている。膀胱内に投与されたＢＣＧは、患者の癌細胞に侵入し、患者の免疫系を活性化して癌細胞を傷害させると考えられている。ＢＣＧは、膀胱癌以外の上皮内癌の治療にも用いられる場合がある。

ＢＣＧは、抗酸菌の一種であるマイコバクテリウム・ボビス由来の弱毒株であり、結核の予防ワクチン等としても使用されるものである。ＢＣＧを含む抗酸菌の免疫活性化成分として、細胞壁に存在するミコール酸が考えられている（例えば、非特許文献１を参照）。

ミコール酸は、抗酸菌に特徴的な細胞壁機能分子であり、炭素数６０～９０の長鎖脂肪酸である。ミコール酸は、結核菌をはじめ、抗酸菌細胞壁を構成する特徴的な大長鎖分子脂肪酸であり、その疎水性が細胞壁の安定性に寄与するとともに、抗酸性の保持に必須であると考えられている。

一方、ミコール酸及びその誘導体（遊離ミコール酸を含め、トレハロース、グルコース、グリセロール等の糖エステル等）は、結核菌の病原因子として動物に投与したときに、肺に結核性病変（肉芽腫）を形成することから、病原因子としても注目されてきた。最近、ミコール酸及びその誘導体はすべての抗酸菌に分布し、サブクラスや炭素鎖の違いにより病原性が異なることが明らかにされつつある。

ミコール酸には、極性の異なるα－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸、ワックスエステルミコール酸、エポキシミコール酸、ジヒドロキシミコール酸等の多数のサブクラスが存在することが知られている。結核菌やＢＣＧ菌のミコール酸は、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の３種類のサブクラスからなる。

Korf J., et al., The Mycobacterium tuberculosis cell wall component mycolic acid elicits pathogen-associated host innate immune responses, Eur. J. Immunol., 35, 890-900, 2005.

ＢＣＧは強力な抗腫瘍性を示すことが認められているにもかかわらず、生菌であるため、生体に投与すると感染症を引き起こす場合がある。また、バイオハザードの問題から、管理、供給搬送、廃棄等が煩雑である。一方、抗酸菌の免疫活性化成分と考えられているミコール酸そのものを使用すれば、バイオハザードの問題は生じないものの、ミコール酸をそのまま生体に投与しても免疫系を活性化することが困難である。このため、ミコール酸を臨床応用した例は知られていない。そこで、本発明は、ミコール酸を臨床応用する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソーム。
［２］カチオン性脂質を更に含有する、［１］に記載のリポソーム。
［３］前記ミコール酸がケトミコール酸を含む、［１］又は［２］に記載のリポソーム。
［４］ゼータ電位がプラスである、［１］～［３］のいずれかに記載のリポソーム。
［５］直径が２００ｎｍ以下である、［１］～［４］のいずれかに記載のリポソーム。
［６］多分散指数が０．３以下である、［１］～［５］のいずれかに記載のリポソーム。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載のリポソームを有効成分とする抗癌剤。
［８］［７］に記載の抗癌剤と免疫チェックポイント阻害剤とを備える、癌治療用キット。

本発明によれば、ミコール酸を臨床応用する技術を提供することができる。

実験例１における、ミコール酸の薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例２における、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の質量分析の結果を示すマススペクトルである。（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実験例５において、対照リポソーム、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム、ケトミコール酸含有リポソームを接触させたＴ２４細胞の蛍光顕微鏡写真である。実験例５において、対照リポソームを接触させたＴ２４細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例６における、Ｔ２４細胞、ＭＢＴ－２細胞、ＭＢ４９細胞の結果を示すグラフである。実験例７の実験スケジュールを説明する図である。実験例７において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。実験例８において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。実験例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。実験例１１において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例１２における、マウスの腫瘍組織の免疫染色の結果を示す代表的な写真である。（ｃ）は、実験例１２において、マウスの腫瘍組織に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例１２における、マウスの腫瘍組織の免疫染色の結果を示す代表的な写真である。（ｃ）は、実験例１２において、マウスの腫瘍組織に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。実験例１３の実験スケジュールを説明する図である。実験例１３において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。実験例１５において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。（ａ）～（ｄ）は、実験例１６において、骨髄由来樹状細胞の培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。（ａ）～（ｃ）は、実験例１６において、骨髄由来マクロファージの培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。実験例１８において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。

［リポソーム］
１実施形態において、本発明は、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームを提供する。

実施例において後述するように、本実施形態のリポソームを生体に投与することにより、免疫系を活性化させ、癌細胞を傷害させることができる。したがって、本実施形態のリポソームは、抗癌剤、免疫活性化剤、アジュバント等として使用することができる。

ミコール酸は、抗酸菌の菌表層バリアーを形成する疎水性分子であり、一方、宿主生体側には強力な免疫活性化を誘導する成分と考えられているものの、そのまま生体に投与しても免疫系を活性化することが困難である。これは、ミコール酸が疎水性が強く、細胞親和性が低いためであると考えられる。

これに対し、実施例において後述するように、本実施形態のリポソームは、細胞親和性が高く、ミコール酸を効率的に宿主細胞質内に送達することができる。その結果、ミコール酸を癌細胞に送達し、癌細胞に対する免疫を活性化し、癌細胞を傷害することができる。

（リポソーム）
リポソームとは、両親媒性物質により構成される人工的な小胞の１種である。両親媒性物質としては、リン脂質、糖脂質、界面活性剤等が挙げられる。

リン脂質としては、炭素数３～３０の飽和又は不飽和脂肪酸を構成成分に有する、ホスファチジルコリン類（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）等）、ホスファチジルグリセロール類（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン類（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン類（例えば、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン等）、ホスファチジン酸類、ホスファチジルイノシトール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、及びこれらの水素添加物等が挙げられる。中でも、ＤＯＰＣは安価であり、生体に対する毒性が低いため好適である。

糖脂質としては、例えば、スルホキノボシルジグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質等が挙げられる。また、界面活性剤としては、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。両親媒性物質は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

リポソームは、超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法等の従来公知の任意の方法により製造することができる。

（ミコール酸）
本実施形態のリポソームにおいて、ミコール酸としては、免疫系を活性化できるものであれば特に制限なく用いることができる。一般的に、ミコール酸は化学合成することが困難である。このため、抗酸菌から精製して用いることが好適である。

結核菌やＢＣＧ菌のミコール酸には、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の３種類のサブクラスが存在する。また、非結核性抗酸菌ミコール酸にはα－ミコール酸、ケトミコール酸、ワックスエステルミコール酸が含まれ、いずれもトレハロースエステルの形で強力な免疫増強活性を示すことが知られている。実施例において後述するように、中でも、ケトミコール酸は、インビボにおいて癌を傷害する活性が高い傾向にあるため好適である。ミコール酸は、遊離ミコール酸の形態であってもよく、例えばトレハロースモノエステル、トレハロースジエステル、グルコースモノエステル、グリセロールモノエステル等のミコール酸の糖エステルの形態であってもよい。本実施形態のリポソームにおいて、ミコール酸としては、これらのいずれか１種を用いてもよいし、２種以上の混合物を用いてもよい。

ミコール酸の含有量は、リポソームを基準とした乾燥重量で５～２０質量％であることが好ましく、１０～１５質量％であることがより好ましい。

（ステロール化合物）
本実施形態のリポソームは、ステロール化合物を含有する。発明者らは、ミコール酸含有リポソームにステロール化合物を含有させることにより、リポソームの粒径を小さく揃え、安定性を高めることができることを明らかにした。

ステロール化合物としては、コレステロール、３β－［Ｎ－（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、Ｎ－（トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール等が挙げられる。中でも、コレステロールを好適に用いることができる。

ステロール化合物の含有量は、リポソームを基準とした乾燥重量で５～２０質量％であることが好ましく、１０～１５質量％であることがより好ましい。

（ゼータ電位）
本実施形態のリポソームは、ゼータ電位がプラスであることが好ましい。ゼータ電位がプラスであることにより、細胞親和性が向上し、細胞内にミコール酸を送達することが容易になる。リポソームのゼータ電位は１～２０ｍＶであることが好ましく、５～２０ｍＶであることがより好ましい。リポソームのゼータ電位は、例えば、電気泳動光散乱測定法等により測定することができる。

リポソームのゼータ電位をプラスにする方法として、リポソームを構成する両親媒性物質にカチオン性を有するものを添加することが挙げられる。例えば、リポソームの材料として、カチオン性脂質を添加してもよい。

カチオン性脂質としては、コレステロール骨格を有するもの、グルタミン酸骨格を有するもの、４級アンモニウム塩、デンドロン脂質等が挙げられる。

コレステロール骨格を有するカチオン性脂質としては、例えば、［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）等が挙げられる。

グルタミン酸骨格を有するカチオン性脂質としては、例えば、塩化Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）－ジドデシル－Ｄ－グルタミン酸（ＴＭＡＧ）等が挙げられる。

４級アンモニウム塩としては、例えば、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイロキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、２，３－ジオレイロキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオレオイル－Ｄ－グルタメート－Ｎ－２（スペルミンカルボキシアミド）エチル（ＤＯＧＳ）、１，２－ジミリストイロキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）等が挙げられる。

デンドロン脂質としては、例えば、デンドロン脂質（型式「Ｄ１」、「Ｄ２」、「Ｄ３」、「Ｄ１２」、「Ｄ２２」、「Ｄ３２」、いずれもヒュギエイアバイオサイエンス社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。中でも、デンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）が好ましい。

カチオン性脂質の含有量は、リポソームを基準とした乾燥重量で１～１０質量％であることが好ましく、２～５質量％であることがより好ましい。

（直径）
本実施形態のリポソームは、カチオン性であることが好ましく、直径が２００ｎｍ以下であることが好ましい。リポソームの直径は、例えば動的光散乱法により測定することができる。リポソームの直径が２００ｎｍ以下であること、フィルター滅菌により簡便に滅菌することが可能である。このため、生体に投与しやすい。

（多分散指数）
本実施形態のリポソームは、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙｉｎｄｅｘ）が０．３以下であることが好ましい。多分散指数が小さいことはリポソームの粒径が揃っていることを意味する。リポソームの粒径が揃っていると、フィルター滅菌した場合等にロスを最小限に抑制することができる。

［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、上述したリポソームを有効成分とする抗癌剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の抗癌剤を生体に投与することにより、免疫系を活性化させ、癌細胞を傷害させることができる。したがって、本実施形態の抗癌剤は、免疫活性化剤、アジュバント等といいかえることもできる。

本実施形態の抗癌剤は、従来のＢＣＧ生菌と異なり、感染症を引き起こす心配がなく、管理、供給搬送、廃棄等も簡便である。

本実施形態の抗癌剤が治療対象とする癌としては、薬剤を局所投与することが容易な癌が挙げられ、具体的には、膀胱癌、乳癌、メラノーマ等が挙げられる。本実施形態の抗癌剤を膀胱内に投与、あるいは局所注射等により局所投与することにより、本実施形態の抗癌剤が癌細胞に取り込まれる。その結果、本実施形態の抗癌剤を取り込んだ癌細胞が、免疫系により傷害される。これにより、癌を効果的に治療することができる。

［癌治療用キット］
１実施形態において、本発明は、上述した抗癌剤と、免疫チェックポイント阻害剤とを備える、癌治療用キットを提供する。

上述した抗癌剤を免疫チェックポイント阻害剤と併用して患者に投与することにより、患者の免疫系を活性化し、癌の治療効果を更に向上させることができる。免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。抗ＰＤ－１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ等が挙げられる。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのリポソームであって、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームを提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。

１実施形態において、本発明は、抗癌剤を製造するためのリポソームの使用であって、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームの使用を提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。

１実施形態において、本発明は、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。本実施形態の治療方法が治療対象とする癌は上述したものと同様である。また、ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。

１実施形態において、本発明は、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームの有効量、及び、免疫チェックポイント阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。本実施形態の治療方法が治療対象とする癌は上述したものと同様である。また、ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。また、免疫チェックポイント阻害剤としては上述したものと同様のものを用いることができる。

以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
（ＢＣＧからのミコール酸の精製）
《ＢＣＧの培養》
マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧＴｏｋｙｏ１７２株を、ソートン培地を用いて３７℃で９日間表面培養した。続いて、培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した後遠心分離し、ＢＣＧ加熱死菌を回収した。

《粗ミコール酸の抽出》
続いて、ＢＣＧ加熱死菌２０ｇに５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを加え、１２１℃で２０分間オートクレーブした。続いて、冷却後５Ｎ塩酸を加え、ｐＨを２に調整した。続いてヘキサンを加え、ヘキサン層を回収して純水で洗浄後、乾固することにより、総脂肪酸を得た。続いて、総脂肪酸を１ｍＬクロロホルムに溶解し、メタノール５０ｍＬを加え、粗ミコール酸の沈殿物を形成して回収した。

《ミコール酸の精製》
続いて、粗ミコール酸１００ｍｇに、ヘキサン・メタノール（ヘキサン：メタノール＝２０：１，ｖ／ｖ）１０ｍＬ、１０％トリメチルシリルジアゾメタン２５０μＬを加え、室温に３０分静置し、ミコール酸をメチルエステル化した。得られたメチルエステルミコール酸を、シリカゲルコートガラス薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（２０×２０ｃｍ）、ヘキサン・酢酸エチル溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１，ｖ／ｖ）で４回展開し、ヨウ素で呈色させた。

続いて、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の３つのメチルエステル分画を回収した。続いて、回収した各ミコール酸メチルエステルに、トルエン３ｍＬ、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液５ｍＬ、エタノール２ｍＬをそれぞれ加え、１２１℃で２０分間オートクレーブした。続いて、冷却後５Ｎ塩酸で酸性化し、ヘキサンを加え、ヘキサン層の精製ミコール酸をそれぞれ回収した。

図１は、４回展開したミコール酸メチルエステルの薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。図１中、レーン１はヒトの結核菌であるマイコバクテリウム・ツベルクローシスから精製したミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン２はＢＣＧから精製したミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン３はＢＣＧから精製したα（Ａｌｐｈａ）－ミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン４はＢＣＧから精製したメトキシ（Ｍｅｔｈｏｘｙ）－ミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン５はＢＣＧから精製したケト（Ｋｅｔｏ）－ミコール酸メチルエステルの結果である。

［実験例２］
（質量分析によるミコール酸のサブクラスの確認）
実験例１で精製した各サブクラスのミコール酸メチルエステルの分子量を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析装置（型式「ＶｏｙａｇｅｒＤＥ－ＳＴＲ」、アプライドバイオシステムズ社）により解析した。

各サンプルをクロロホルム・メタノール（クロロホルム：メタノール＝２：１，ｖ／ｖ）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、０．７５ｍＬの液滴としてサンプルプレートにアプライした。マトリックスとして、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（２．５－ＤＨＢ）を使用した。ポジティブリフレクションモードでＴＯＦイオントラッピングを行い、加速電圧は２０ｋＶに設定した。

図２（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の解析結果を示すマススペクトルである。下記表１に、各サブクラスのミコール酸のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析の結果をまとめた。

薄層クロマトグラフィーと質量分析の結果から、精製した各サブクラスのミコール酸が、炭素数７８中心のα－ミコール酸、炭素数８５中心のメトキシミコール酸、炭素数８４及び８６中心のケトミコール酸であることが確認された。

［実験例３］
（ミコール酸含有リポソームの作製１）
実験例１で精製した、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸を用いて、表２に示す組成で製造例１～７のリポソームをそれぞれ作製した。表２中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。また、カチオン性脂質として、下記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を使用した。

具体的には、まず、表２に示す組成で、ミコール酸、ＤＯＰＣ、コレステロール及びカチオン性脂質を、クロロホルム・メタノール（２：１、ｖ／ｖ）混合溶媒中で混合して６０℃で加熱し、溶解した。続いて、減圧下で溶媒を完全に除去した。続いて、窒素気流下で乾固させ、脂質を薄層化させた。続いて、リン酸バッファー（ＰＢＳ）１ｍＬを加えて超音波破砕装置（型式「Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ」、コスモバイオ社）で破砕した。続いて、得られた懸濁液を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ペレットを回収した。続いて、回収したペレットを５００μＬのＰＢＳに溶解した。

続いて、液体窒素を用いて凍結融解を１０回繰り返した。続いて、得られた液体を、６０℃に加熱したヒートブロック上で、エクストルーダー装置（型式「ＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒ」、アバンティポーラリピッド社）を用いて、２１回ポリカーボネート膜（ポアサイズ２００ｎｍ）を通過させ、均一なリポソームを得た。作製したリポソームは使用するまで４℃で保存した。

［実験例４］
（ミコール酸含有リポソームの解析）
実験例３で作製した各リポソームについて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＮ３６００」、マルバーン社）を用いて、直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。

表３に測定結果を示す。表３中、「α」はα－ミコール酸を表し、「メトキシ」はメトキシミコール酸を表し、「ケト」はケトミコール酸を表す。また、「作製後の時間」は、リポソームの作製後何日目に測定したかを表す。

その結果、製造例１～３のリポソームの結果から明らかなように、ミコール酸含有リポソームがコレステロールを含まない場合、製造から２日後よりも製造から７日後の方が、直径が増大することが明らかとなった。

これに対し、製造例４～６のリポソームの結果から明らかなように、ミコール酸含有リポソームがコレステロールを含む場合、直径が安定しており、製造から７日後の測定においても直径２００ｎｍ以下を維持できることが明らかとなった。

また、製造例４～６のリポソームの結果から明らかなように、ミコール酸、コレステロール及びカチオン性脂質を含有するリポソームは、直径２００ｎｍ以下で、ゼータ電位がプラスであり、多分散指数が０．３以下となることが明らかとなった。多分散指数が小さいことは、リポソームの粒径が揃っていることを意味する。

また、発明者らは、ミコール酸、コレステロール及びカチオン性脂質の組成を変えることにより、ミコール酸含有リポソームのゼータ電位、直径を調整し、目的に応じたリポソームを作製できることも明らかにした。

［実験例５］
（ミコール酸含有リポソームの細胞への取り込みの検討１）
コレステロールとして、蛍光色素であるＮＢＤで標識されたコレステロール（アバンティポーラリピッド社）を使用した以外は実験例３と同様にして、下記表４の組成で製造例８～１１のリポソームを作製した。以下、製造例８のリポソームを「α－ミコール酸含有リポソーム」といい、製造例９のリポソームを「メトキシミコール酸含有リポソーム」といい、製造例１０のリポソームを「ケトミコール酸含有リポソーム」といい、製造例１１のリポソームを「対照リポソーム」という場合がある。

続いて、各リポソームを、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４の培地に５０μｇ／ｍＬの終濃度で添加して３７℃で２時間静置し、共焦点顕微鏡で観察することにより、リポソームが細胞に取り込まれたか否かを検討した。ＮＢＤの蛍光はリポソームの局在を示す。また、細胞の核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で蛍光染色した。

図３（ａ）～（ｄ）は、各リポソームを接触させたＴ２４細胞の蛍光顕微鏡写真である。図３（ａ）は対照リポソームの結果を示し、図３（ｂ）はα－ミコール酸含有リポソームの結果を示し、図３（ｃ）はメトキシミコール酸含有リポソームの結果を示し、図３（ｄ）はケトミコール酸含有リポソームの結果を示す。その結果、いずれのリポソームもＴ２４細胞の細胞質に取り込まれたことが明らかとなった。

また、図４は、対照リポソームを接触させたＴ２４細胞（リポソームあり）をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。比較のために、リポソームを接触させなかったＴ２４細胞（リポソームなし）を同様に解析した。その結果、対照リポソームの蛍光を示す細胞のピークが観察され、対照リポソームがＴ２４細胞に取り込まれたことが確認された。

［実験例６］
（ミコール酸含有リポソームの細胞傷害活性の検討）
実験例５と同様にして作製した、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム、ケトミコール酸含有リポソーム及び対照リポソームを、５０μｇ／ｍＬの終濃度でヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４、マウス膀胱癌細胞株ＭＢＴ－２及びマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９の培地にそれぞれ添加し、細胞傷害活性を検討した。

具体的には、血清不含培地に、ＰＢＳ、対照リポソーム又は各ミコール酸含有リポソームをそれぞれ添加し、２４時間後及び４８時間後に生細胞数をそれぞれ測定した。生細胞数の測定は、水溶性テトラゾリウム塩であるＷＳＴ－８を使用したキット（同仁化学）を使用して行った。

図５（ａ）～（ｃ）は生細胞数の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）はＴ２４細胞の結果を示し、図５（ｂ）はＭＢＴ－２細胞の結果を示し、図５（ｃ）はＭＢ４９細胞の結果を示す。図５（ａ）～（ｃ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加した結果を示し、「対照」は対照リポソームを添加した結果を示し、「α」はα－ミコール酸含有リポソームを添加した結果を示し、「メトキシ」はメトキシミコール酸含有リポソームを添加した結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソームを添加した結果を示す。

その結果、いずれのリポソームもインビトロでは細胞傷害活性をほとんど有しないことが明らかとなった。

［実験例７］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討１）
マウス皮下腫瘍モデルを用いてミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果を検討した。図６は、実験スケジュールを説明する図である。まず、実験初日（０日目）に、実験例５と同様にして作製した、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム若しくはケトミコール酸含有リポソーム０．４４ｍｇ、対照リポソーム０．５ｍｇ、又はＰＢＳ０．１ｍＬを、それぞれ５００，０００個のマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背側の皮下に投与した（ｎ＝５又は６）。続いて、腫瘍体積を継時的に測定した。また、実験開始後３日目、５日目及び７日目に、各試薬のみ（実験例５と同様にして作製した、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム、ケトミコール酸含有リポソーム、対照リポソーム又はＰＢＳ）をそれぞれ追加で同じ部位に皮下投与した。

図７は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図７中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「α」はα－ミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「メトキシ」はメトキシミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示す。

その結果、実験開始後１４日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．００６７）。また、ＰＢＳ投与群とメトキシミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１２）。また、対照リポソーム投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．００４４）。

また、実験開始後２１日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１４）。また、ＰＢＳ投与群とメトキシミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０３７）。

また、実験開始後２８日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１４）。

この結果から、実験例６に示すように、ミコール酸含有リポソームは直接細胞傷害活性を有しないが、免疫系が関与する条件下では細胞傷害活性（抗腫瘍活性）を示すことが明らかとなった。また、ケトミコール酸が最も高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。

［実験例８］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討２）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの代わりにＢｅｉｇｅマウスを用いた以外は実験例７と同様にして、マウス皮下腫瘍モデルを用いてミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果（抗腫瘍活性）を検討した。ＢｅｉｇｅマウスはＣｈｅｄｉａｋ－Ｈｉｇａｓｈｉ症候群のモデル動物として知られており、ＮＫ細胞が欠損している。

図８は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図８中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「α」はα－ミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「メトキシ」はメトキシミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示す。

その結果、実験開始後２４日目において、ＰＢＳ投与群とメトキシミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１８）。また、ＰＢＳ投与群とα－ミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４５）。また、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４５）。

この結果から、ミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果発現へのＮＫ細胞の関与は少ないものと考えられた。

［実験例９］
（ミコール酸含有リポソームの作製２）
カチオン性脂質として、下記化学式（２）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた以外は実験例３と同様にして、表５に示す組成で製造例１２のリポソーム（以下、「Ｄ１２リポソーム」という場合がある。）を作製した。表５中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。

続いて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＮ３６００」、マルバーン社）を用いて、Ｄ１２リポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。表６に測定結果を示す。測定は、リポソームの作製後１１日目に行った。その結果、Ｄ１２リポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位は、それぞれ、カチオン性脂質として、上記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた製造例６のリポソーム（以下、「Ｄ２２リポソーム」という場合がある。）の各値と同程度であることが明らかとなった。

［実験例１０］
（ミコール酸含有リポソームの細胞への取り込みの検討２）
コレステロールとして、蛍光色素であるＮＢＤで標識されたコレステロール（アバンティポーラリピッド社）を使用した以外は実験例９と同様にして、下記表７の組成で製造例１３のリポソームを作製した。表７中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。

また、比較のために、実験例５の製造例１０と同様にして調製したリポソーム（以下、「Ｄ２２リポソーム」という場合がある。）を使用した。表７には、製造例１０のリポソームの組成も示す。

続いて、各リポソームを、マウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９の培地に５０μｇ／ｍＬの終濃度で添加して３７℃で２時間静置し、フローサイトメトリーで解析した。図９は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。比較のために、リポソームを接触させなかったＭＢ４９細胞を同様に解析した。図９中、「なし」はリポソームを接触させなかったＭＢ４９細胞の結果であり、「Ｄ１２」はＤ１２リポソームの結果であり、「Ｄ２２」はＤ２２リポソームの結果である。その結果、Ｄ２２、Ｄ１２リポソーム共、蛍光色素の発色の程度は等しく、Ｄ１２リポソームは、Ｄ２２リポソームと同程度にＭＢ４９細胞に取り込まれたことが確認された。

［実験例１１］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討３）
ミコール酸含有リポソームに含有させるカチオン性脂質として、上記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた場合、及び上記化学式（２）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた場合の抗腫瘍効果を検討した。

具体的には、実験例９と同様にして調製した製造例１２のリポソーム（以下、「Ｄ１２リポソーム」という場合がある。）、実験例３の製造例６と同様にして調製したリポソーム（以下、「Ｄ２２リポソーム」という場合がある。）、実験例３の製造例７と同様にして調製したリポソーム（以下、「対照リポソーム」という場合がある。）、及びリン酸バッファー（ＰＢＳ）を、実験例７と同様のマウス皮下腫瘍モデルに投与し、抗腫瘍効果を検討した。下記表８に、各リポソームの組成を示す。表８中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。

図６は、実験スケジュールを説明する図である。まず、実験初日（０日目）に、Ｄ１２リポソーム０．４４ｍｇ、Ｄ２２リポソーム０．４４ｍｇ、対照リポソーム０．５ｍｇ、又はＰＢＳ０．１ｍＬを、それぞれ５００，０００個のマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背側の皮下に投与した（ｎ＝５又は６）。続いて、腫瘍体積を継時的に測定した。また、実験開始後３日目、５日目及び７日目に、各試薬のみ（Ｄ１２リポソーム、Ｄ２２リポソーム、対照リポソーム又はＰＢＳ）をそれぞれ追加で同じ部位に皮下投与した。

図１０は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１０中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ２２」はＤ２２リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ１２」はＤ１２リポソーム投与群の結果を示す。

その結果、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いたＤ２２リポソームのほうが、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いたＤ１２リポソームよりも抗腫瘍効果が高いことが明らかとなった。

［実験例１２］
（腫瘍組織の組織学的検討）
実験例１１のマウス皮下腫瘍モデルにおいて、実験開始後１０日目のＤ２２リポソーム投与群のマウス及び対照リポソーム投与群のマウスを用いて、腫瘍組織へのＴリンパ球の浸潤を検討した。

まず、各マウスから摘出した腫瘍組織を固定してパラフィン包埋し、厚さ４μｍの切片を作製した。続いて、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いた免疫染色を行い、腫瘍組織へのＴリンパ球の浸潤を検討した（ｎ＝３）。

続いて、免疫染色した組織を顕微鏡観察し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤が多い領域を撮影した。続いて、撮影した顕微鏡写真に基づいて、腫瘍組織に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞をカウントした。Ｔ細胞のカウントは一人の観察者が同一の領域について３回ずつ行い、その平均値を統計学的に解析した。

図１１（ａ）は、対照リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ４抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１１（ｂ）は、Ｄ２２リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ４抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１１（ｃ）は、各群のマウスの腫瘍組織におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。図１１（ｃ）中、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ２２」はＤ２２リポソーム投与群の結果を示す。

また、図１２（ａ）は、対照リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ８抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１２（ｂ）は、Ｄ２２リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ８抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１２（ｃ）は、各群のマウスの腫瘍組織におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。図１２（ｃ）中、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ２２」はＤ２２リポソーム投与群の結果を示す。

独立ｔ検定により解析した結果、図１１（ｃ）に示すように、対照リポソーム投与群及びＤ２２リポソーム投与群において、腫瘍組織に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞数には有意差が認められなかった。これに対し、図１２（ｃ）に示すように、対照リポソーム投与群及びＤ２２リポソーム投与群において、腫瘍組織に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞数には有意差が認められた。

この結果から、Ｄ２２リポソーム投与群のマウスでは、対照リポソーム投与群のマウスと比較して、腫瘍組織に浸潤するＣＤ８陽性Ｔ細胞が有意に多いことが明らかとなった。また、この結果は、Ｄ２２リポソームの投与により、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が腫瘍組織に浸潤し、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球依存的に抗腫瘍効果が発揮されることを示す。

［実験例１３］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討４）
実験例７、８、１１のマウス皮下腫瘍抑制効果モデルでは、腫瘍細胞の接種と同時にミコール酸含有リポソームの投与を開始していた。そこで、腫瘍が形成された後にミコール酸含有リポソームの投与を開始した場合に腫瘍抑制効果が認められるか否かについて検討した。

図１３は、実験スケジュールを説明する図である。まず、実験初日（０日目）に、５００，０００個のマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背側の皮下に投与した（ｎ＝５又は６）。続いて、実験開始後７日目以降、１～２日おきに合計９回、ミコール酸含有リポソームを同じ部位に皮下投与し、腫瘍体積を継時的に測定した。

ミコール酸含有リポソームとして、１匹１回の投与あたり、実験例５と同様にして作製したケトミコール酸含有リポソームを０．４４ｍｇ投与した群を用意した。１匹１回の投与あたりのミコール酸の投与量は４０μｇであった。また、比較のために、１匹１回の投与あたり、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．５ｍｇ又はＰＢＳを０．１ｍＬ投与した群も用意した。

図１４は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１４中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示す。

その結果、実験開始後１７日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４８）。また、対照リポソーム投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１５）。

この結果、腫瘍が形成された後にミコール酸含有リポソームの投与を実施した場合においても抗腫瘍効果が認められることが明らかとなった。

［実験例１４］
（ミコール酸含有リポソームの作製３）
ミコール酸として、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ、ミコール酸のトレハロースジエステル）を用いたミコール酸含有リポソーム（以下、「ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）を作製した。

まず、ＢＣＧ（マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧＴｏｋｙｏ１７２株）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｌｅｉ）、及びロドコッカス・テラエ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒａｅ）の各菌を培養し、各菌体からそれぞれトレハロースジミコール酸を精製した。以下、各菌由来のトレハロースジミコール酸を、それぞれ、「ＢＣＧ－ＴＤＭ」、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭ」、「Ｒ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭ」という場合がある。

続いて、実験例３と同様にして、表９に示す組成で、製造例１４のリポソーム（以下、「ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）、製造例１５のリポソーム（以下、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）及び製造例１６のリポソーム（以下、「Ｒ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）を作製した。表９中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。カチオン性脂質としては、上記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）を用いた。

続いて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＮ３６００」、マルバーン社）を用いて、各ＴＤＭポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。その結果、ＴＤＭリポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位は、それぞれ、実験例３で作製した製造例６のリポソームの各値と同程度であることが明らかとなった。

［実験例１５］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討５）
実験例１３と同様のマウス皮下腫瘍モデルを用いて、実験例１４で作製した各ＴＤＭリポソームの抗腫瘍効果を検討した。

ＴＤＭリポソームとしては、実験例１４で作製した、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム、Ｍ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム、Ｒ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソームを、１匹１回の投与あたり０．４４ｍｇ使用した。また、比較のために、１匹１回の投与あたり、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．５ｍｇ又はＰＢＳを０．１ｍＬ投与した群も用意した。

図１５は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１５中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群の結果を示し、「ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム投与群の結果を示し、「ｔｅｒｒａ」はＲ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソーム投与群の結果を示す。

その結果、実験開始後１４日目において、ＰＢＳ投与群とＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４）。一方、ＰＢＳ投与群とＲ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソーム投与群との間、ＰＢＳ投与群とＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム投与群との間には腫瘍抑制傾向は認められるものの有意差が認められなかった。

また、実験開始後１８日目において、ＰＢＳ投与群とＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０２）。また、対照リポソーム投与群とＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群との間においても腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０２）。

以上の結果、ＴＤＭリポソームも抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。また、ミコール酸として、ＢＣＧ由来のトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）を用いたリポソーム、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｌｅｉ）由来のＴＤＭを用いたリポソーム、ロドコッカス・テラエ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒａｅ）由来のＴＤＭを用いたリポソームの中では、ＢＣＧ由来のＴＤＭを用いたリポソームが最も抗腫瘍効果が高いことが明らかとなった。

［実験例１６］
（ＴＤＭリポソームによるＭｉｎｃｌｅ依存的なサイトカイン産生の検討）
Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＣ－ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ（Ｍｉｎｃｌｅ）は、Ｃ型レクチン受容体の１種である。Ｍｉｎｃｌｅのリガンドとしては、損傷自己、真菌、結核菌由来のトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）等が知られている。

ＴＤＭが結合したＭｉｎｃｌｅは、ＦｃＲγ鎖と会合し、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナル伝達を行い、炎症性サイトカインの産生を誘導することが知られている。

本実験例では、野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスから骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）及び骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を調製し、それぞれＴＤＭリポソームで活性化して炎症性サイトカインの産生が誘導されるか否かを検討した。炎症性サイトカインとしては、ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）の産生を検討した。

《骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）の検討１》
野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスから調製した骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）を、それぞれ、９６ウェルプレートに、１×１０^５個／ウェルの細胞密度で播種した。続いて、各細胞の培地に、実験例１４で作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームをそれぞれ１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加し、４８時間培養した。また、比較のために、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加した群、及び何も添加しなかった群も用意した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した。

図１６（ａ）は培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１６（ａ）中、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム添加群の結果を示し、「なし」は何も添加しなかった群の結果を示し、「ＷＴ」は野生型マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示し、「Ｍｉｎｃｌｅ^－／－」はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示す。

その結果、野生型マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームの培地中への添加により、ＴＮＦの産生が誘導されたことが明らかとなった。

一方、Ｍｉｎｃｌｅ^－／－マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームを培地中に添加しても、ＴＮＦの産生誘導が認められなかった。

この結果は、ＴＤＭリポソームの添加によるサイトカイン産生誘導がＭｉｎｃｌｅ依存的であることを示す。

《骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）の検討２》
実験例１４で作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム及びＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームを、９６ウェルプレートに、それぞれ０．３μｇ／ウェルとなるように添加してウェル表面をコートした。また、比較のために、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．３μｇ／ウェルとなるようにコートした群、何もコートしなかった群、市販のＴＤＭ（ナカライテスク社）を１μｇ／ウェルでコートした群、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１０ｎｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した群も用意した。

続いて、各ウェルに、野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスから調製した骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）を、それぞれ１×１０^５個／ウェルの細胞密度で播種し、４８時間培養した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した。

図１６（ｂ）～（ｄ）は培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１６（ｂ）中、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソームコート群の結果を示し、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームコート群の結果を示し、「対照」は対照リポソームコート群の結果を示し、「なし」は何もコートしなかった群の結果を示す。また、図１６（ｃ）は、市販のＴＤＭをコートした群の結果を示す。また、図１６（ｄ）は、ＬＰＳを添加した群の結果を示す。また、図１６（ｂ）～（ｄ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示し、「Ｍｉｎｃｌｅ^－／－」はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示す。

その結果、野生型マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームでウェルをコートすることにより、ＴＮＦの産生が誘導されたことが明らかとなった。一方、Ｍｉｎｃｌｅ^－／－マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームでウェルをコートしても、ＴＮＦの産生誘導が認められなかった。

この結果は、ＴＤＭリポソームによる骨髄由来樹状細胞のサイトカイン産生誘導がＭｉｎｃｌｅ依存的であることを更に支持するものである。

《骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）の検討》
野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスから調製した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を、それぞれ、９６ウェルプレートに、１×１０^５個／ウェルの細胞密度で播種した。続いて、各細胞の培地に、実験例１４で作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームをそれぞれ１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加し、４８時間培養した。また、比較のために、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加した群、何も添加しなかった群、市販のＴＤＭ（ナカライテスク社）を１μｇ／ウェルでコートした群、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１０ｎｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した群も用意した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した。

図１７（ａ）～（ｃ）は培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１７（ａ）中、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム添加群の結果を示し、「なし」は何も添加しなかった群の結果を示す。また、図１７（ｂ）は、市販のＴＤＭをコートした群の結果を示す。また、図１７（ｃ）は、ＬＰＳを添加した群の結果を示す。また、図１７（ａ）～（ｃ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの骨髄由来マクロファージの結果を示し、「Ｍｉｎｃｌｅ^－／－」はＭｉｎｃｌｅ^－／－マウスの骨髄由来マクロファージの結果を示す。

その結果、野生型マウス由来の骨髄由来マクロファージにおいては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームの培地中への添加により、ＴＮＦの産生が誘導されたことが明らかとなった。一方、Ｍｉｎｃｌｅ^－／－マウス由来の骨髄由来マクロファージにおいては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームを培地中に添加しても、ＴＮＦの産生誘導が認められなかった。

この結果は、ＴＤＭリポソームの添加による骨髄由来マクロファージのサイトカイン産生誘導がＭｉｎｃｌｅ依存的であることを示す。

［実験例１７］
（ＴＤＭリポソームの大量調製）
表１０に示す組成で製造例１７のＴＤＭリポソームを工業的に大量調製した。ＴＤＭとしては、実験例１４で精製したＢＣＧ－ＴＤＭを使用した。具体的には、ＢＣＧ－ＴＤＭ１５．０ｍｇ、コレステロール１５．０ｍｇ、カチオン性脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）５．０ｍｇを秤量し、ガラスバイアルへ投入した。

続いて、ＤＯＰＣ－クロロホルム溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）５．４ｍＬを添加し、常温で充分に撹拌して脂質成分を溶解させた。続いて、減圧乾燥により、クロロホルムを除去した。続いて、ｔｅｒｔ－ブチルアルコールを３．０ｍＬ添加し、常温で撹拌して脂質成分を溶解させた。続いて、ＰＢＳ１４ｍＬを添加し、５８℃のウォーターバスで加温・撹拌した。続いて、脂質成分の溶解を確認した後、室温まで冷却した。続いて、０．２μｍと０．１μｍのシリンジフィルターを通過させ、透析液をＰＢＳとして透析を行い、ｔｅｒｔ－ブチルアルコールを除去し、製造例１７のＴＤＭリポソームを得た。

続いて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＴＡＳＩＺＥＲＮａｎｏ－ＺＳ」、マルバーン社）を用いて、製造例１７のＴＤＭリポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。表１１に測定結果を示す。その結果、製造例１７のＴＤＭリポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位は、それぞれ、実験例３で作製した製造例６のリポソームの各値と同程度であることが明らかとなった。

［実験例１８］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討６）
実験例７と同様のマウス皮下腫瘍モデルを用いて、実験例１７で作製した製造例１７のＴＤＭリポソームの抗腫瘍効果を検討した。

製造例１７のＴＤＭリポソームは、１匹１回の投与あたり０．４４ｍｇ使用した。また、比較のために、１匹１回の投与あたり、実験例１４の製造例１４と同様にして作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム（以下、「ＴＤＭ－Ｄ２２」という場合がある。）を０．４４ｍｇ、下記表１２に示す組成で、実験例１４と同様にして作製した製造例１８のＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム（以下、「ＴＤＭ－Ｄ１２」という場合がある。）を０．４４ｍｇ、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．５ｍｇ又はＰＢＳを０．１ｍＬ投与した群も用意した。下記表１２に、各リポソームの組成を示す。下記表１２中、「Ｄ２２」はデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）を表し、「Ｄ１２」はデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）を表す。

図１８は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１８中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「ＴＤＭ－Ｄ２２」は上述したＴＤＭ－Ｄ２２投与群の結果を示し、「ＴＤＭ－Ｄ１２」は上述したＴＤＭ－Ｄ１２投与群の結果を示し、「製造例１７」は製造例１７のＴＤＭリポソーム投与群の結果を示す。

その結果、実験開始後２５日目において、ＰＢＳ投与群とＴＤＭ－Ｄ２２投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０２）。また、ＰＢＳ投与群、対照リポソーム投与群と比較して、製造例１７のＴＤＭリポソーム投与群において、腫瘍体積の減少傾向が認められた。

以上の結果、製造例１７のＴＤＭリポソームが抗腫瘍効果を示すことが確認された。また、ＴＤＭリポソームにおいても、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いたほうが、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた場合よりも抗腫瘍効果が高いことが明らかとなった。

Claims

α－ミコール酸、メトキシミコール酸及びケトミコール酸からなる群から選択される少なくとも１種のミコール酸、コレステロール及び下記化学式（１）で表されるデンドロン脂質を含有するリポソーム。
ゼータ電位がプラスである、請求項１に記載のリポソーム。
直径が２００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
多分散指数が０．３以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のリポソーム。
請求項１～４のいずれか一項に記載のリポソームを有効成分とする抗癌剤。
請求項５に記載の抗癌剤と免疫チェックポイント阻害剤とを備える、癌治療用キット。