WO2022030646A1

WO2022030646A1 - 薬物送達制御可能なリポソーム

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Publication number: WO2022030646A1
Application number: PCT/JP2021/029550
Authority: WO
Inventors: 堅次杉林; 浩明藤堂; 祥子板倉; 一郎土黒
Original assignee: 株式会社ファルネックス
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-08-10
Publication date: 2022-02-10
Also published as: JPWO2022030646A1

Abstract

本発明は、薬物送達を制御可能なリポソーム、特に、ラメラ形成脂質とイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質とを膜構成脂質として含むリポソームに関する。

Description

薬物送達制御可能なリポソーム

　本発明は、薬物送達制御可能なリポソームに関する。

　脂質二重膜を有する閉鎖小胞体であるリポソームは、親水性薬物、疎水性薬物のいずれをも内包することができ、一般的に生体適合性や生分解性にも優れることから、薬物送達（ドラッグデリバリー）ツールとしてのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）への利用が注目されてきた。

　リポソームは、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）により、腫瘍組織に集積することが知られている。腫瘍組織では血管内皮細胞間に隙間ができており、正常組織に比べて血管透過性が著しく亢進しているため、正常の血管壁は透過しない高分子物質が血管外に漏出し、腫瘍組織に蓄積するというのがＥＰＲ効果である。したがってリポソームは腫瘍組織への薬物送達機能を有している。しかし一般的なリポソームにおけるＥＰＲ効果のみによる腫瘍組織への集積性はそれほど高いものではない。

　効果的なＤＤＳの実現のため、薬物送達や薬物放出の精密な制御が望まれている。特許文献１は、カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種とを構成脂質として含む、塩基性環境下で目的物質を放出するｐＨ応答性リポソームを開示している。特許文献２は、リポソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分及び疎水性部分を有する高分子化合物と、ＰＥＧとから構成される温度感受性リポソームを開示している。しかし従来のリポソームでは薬物送達量等の点でなお改善の余地が大きい。

　非ラメラ液晶（ＮＬＬＣ）は、従来のＤＤＳキャリアと比して、高い薬物含有率、調製容易性、さらには高分子医薬における高い安定性などの利点を有することが報告されている。しかし非ラメラ液晶形成脂質には溶血作用が報告されており、全身投与は困難と考えられてきた。

　特許文献３には、低粘度の非ラメラ液晶形成脂質を含み、非ラメラ液晶内に薬物を保持し徐放させる皮膚外用剤が報告されている。しかし特許文献３には、そのような製剤について、薬物送達をより高度に制御する手法については記載されていない。

特開２０１０－２０９０１２号公報特開２００６－３０６７９４号公報国際公開ＷＯ　２０２０／０５０４２３

　本発明は、薬物送達を制御可能なリポソームを提供することを課題とする。あるいは本発明は、抗腫瘍効果を示すリポソームを提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を用いて、細胞内や細胞核への効果的な薬物送達が可能であるリポソームや、さらに温度応答性であることによって薬物送達を制御可能なリポソーム、また抗腫瘍効果を示すリポソームを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下の態様を包含する。

［１］ラメラ形成脂質とイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質とを膜構成脂質として含むリポソーム。

［２］イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質が、下記一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物である、上記［１］に記載のリポソーム。

（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子を表すか又は一緒になって酸素原子を表し、ｎは０～２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、

は一重結合又は二重結合を表し、Ｒは１つ以上の水酸基を有する親水性基を表す）

［３］　前記式中のＲがグリセロール、ソルビタン、又はプロピレングリコールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表す、上記［２］に記載のリポソーム。

［４］　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質が、モノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロール、モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカノイル）グリセロール、モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタン、又はモノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）プロピレングリコールである、上記［１］～［３］のいずれかに記載のリポソーム。

［５］　ラメラ形成脂質がリン脂質、ステロイド及びカチオン性脂質からなる群から選択される少なくとも１つを含む、上記［１］～［４］のいずれかに記載のリポソーム。

［６］　ラメラ形成脂質が水溶性高分子で修飾されたリン脂質を含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載のリポソーム。

［７］　ラメラ形成脂質が、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミンを含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載のリポソーム。

［８］　ラメラ形成脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、及び１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－モノ、ジ又はトリアルキルアンモニウムプロパンを含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載のリポソーム。

［９］　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を、膜構成脂質総量に対するモル分率で５～４０ｍｏｌ％となる量で含む、上記［１］～［８］のいずれかに記載のリポソーム。

［１０］　温度応答性である、上記［１］～［９］のいずれかに記載のリポソーム。

［１１］　薬物をさらに含む、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のリポソーム。

［１２］　薬物が核酸である、上記［１１］に記載のリポソーム。

［１３］　核酸とリポソームが複合体を形成している、上記［１２］に記載のリポソーム。

［１４］　上記［１１］～［１３］のいずれかに記載のリポソームを含む、細胞内への薬物送達用製剤。

［１５］　上記［１２］又は［１３］に記載のリポソームを含む、細胞の核内への核酸送達用製剤。

［１６］　細胞が腫瘍細胞である、上記［１４］又は［１５］に記載の製剤。

［１７］　上記［１］～［１３］のいずれかに記載のリポソームを含む、医薬製剤。

［１８］　抗腫瘍製剤である、上記［１７］に記載の医薬製剤。

　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２０－１３５３３０号の開示内容を包含する。

　本発明によれば、薬物送達を制御可能であり好ましくは温度応答性を有するリポソームや、抗腫瘍効果を示すリポソームを提供することができる。

図１は微粒子製剤Ｎｏ．４のクライオＴＥＭによる倍率１５，０００倍での撮影画像を示す写真である。バーは１００ｎｍを表す。図２は、膜流動性評価指標としての、微粒子製剤Ｎｏ．６～１２の温度に応じた蛍光強度比Ｆ／Ｆ_０の変化を示すグラフである。図３は微粒子製剤Ｎｏ．１～４の温度応答性（温度感受性）を示す写真である。図４は微粒子製剤Ｎｏ．１～５と生体膜との相互作用（溶血性）を示すグラフである。Ａ：３７℃、Ｂ：４５℃。図５は微粒子製剤Ｎｏ．１３又は１４の静脈内投与後の担癌マウスの経時的な蛍光観察結果を示す写真である。Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．１３、Ｂ：微粒子製剤Ｎｏ．１４。図６は微粒子製剤Ｎｏ．１３又は１４の静脈内投与後の腫瘍部位の蛍光強度の経時的変化を示すグラフである。図７は微粒子製剤Ｎｏ．１３又は１４を投与したマウスからの摘出臓器の蛍光画像を示す写真である。図８は微粒子製剤Ｎｏ．２７のクライオＴＥＭによる倍率１５，０００倍での撮影画像を示す写真である。バーは１００ｎｍを表す。図９は微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３添加群と無処置（未処理）群における蛍光標識分子の細胞内取り込み効率を示すグラフである。Ａ：蛍光検出された細胞数とその蛍光強度の関係、Ｂ：無処置群における平均蛍光強度と比較した、微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３添加群の平均蛍光強度の相対値（平均蛍光強度比）。図１０は微粒子製剤Ｎｏ．１５又は２０由来の核酸－微粒子複合体における核酸複合状態を示す電気泳動像の写真である。図１１は核酸－微粒子複合体から遊離した核酸（ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ）のバンドの輝度強度の比を示すグラフである。Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．１５、Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．２０。図１２は各製剤で処理した細胞の蛍光画像を示す写真である。Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．１５（ＬＣ_ＭＧＥ）、Ｂ：微粒子製剤Ｎｏ．１６（ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ）、Ｃ：微粒子製剤Ｎｏ．２０（ＭＧＥ／ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ（ＬＮＰ_ＭＧＥ））、Ｄ：微粒子製剤Ｎｏ．２３（ＭＧＥ／ＤＯＴＡＰ）、Ｅ：ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体、Ｆ：ＬＦＮ２０００－核酸混合物。蛍光：ＧＦＰ、バー：１００μｍ。倍率１０倍。図１３はＦＡＣＳ解析により得られたドットプロットを示す。Ａ：ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体、Ｂ：微粒子製剤Ｎｏ．１６、Ｃ：微粒子製剤Ｎｏ．１７、Ｄ：微粒子製剤Ｎｏ．１８、Ｅ：微粒子製剤Ｎｏ．１９、Ｆ：微粒子製剤Ｎｏ．２０。図１４はＦＡＣＳ解析により得られたドットプロットを示す。Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．２１、Ｂ：微粒子製剤Ｎｏ．２２、Ｃ：微粒子製剤Ｎｏ．２３、Ｄ：微粒子製剤Ｎｏ．２４、Ｅ：微粒子製剤Ｎｏ．２５。図１５はＦＡＣＳ解析により得られたドットプロットを示す。Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．２６、Ｂ：微粒子製剤Ｎｏ．２７、Ｃ：微粒子製剤Ｎｏ．２８、Ｄ：微粒子製剤Ｎｏ．２９、Ｅ：微粒子製剤Ｎｏ．３０。図１６は製剤Ｎｏ．３７～４０の静脈内投与後の担癌マウスの経時的な蛍光観察結果を示す写真である。Ａ：微粒子製剤Ｎｏ．３７、Ｂ：微粒子製剤Ｎｏ．３８、Ｃ：製剤Ｎｏ．３９、Ｄ：製剤Ｎｏ．４０。矢印は腫瘍を示す。図１７は製剤投与後の加温処理あり又は加温処理なしの担癌マウスにおける、腫瘍細胞量の指標である発光強度の経時的変化を示す。Ａ：背部左側腫瘍、加温あり。Ｂ：背部右側腫瘍、加温なし。

　以下、本発明を詳細に説明する。

　本発明は、ラメラ形成脂質とイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質とを膜構成脂質として含むリポソームに関する。

　本発明においてリポソームとは、脂質二重膜を有する閉鎖小胞を指す。本発明のリポソームの脂質二重膜は、主として脂質から構成されるが、脂質以外の成分をさらに含んでもよい。本発明のリポソームは、シングルラメラ構造であってもよいし、２つ又は３つ以上の脂質二重膜を有するマルチラメラ構造であってもよい。なお本発明では、リポソームを微粒子と称することがある。

　本発明のリポソームは、主に、ラメラ形成脂質とイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質（一実施形態では、イソプレノイド型脂肪鎖を有する非ラメラ液晶形成脂質）とを含む脂質二重膜によって構成される。リポソームの膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、リポソーム構成脂質とも呼ばれることがある。本発明で用いる膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、特に限定されないが、リン脂質、ステロイド及びカチオン性脂質からなる群から選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。一実施形態では、本発明で用いる膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、リン脂質、ステロイド、及びカチオン性脂質からなる群から選択される１つを含むか、又はその１つからなるものであってもよい。別の実施形態では、本発明で用いる膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、リン脂質とステロイドを含むか、又はリン脂質とステロイドからなるものであってもよい。別の実施形態では、本発明で用いる膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、リン脂質とカチオン性脂質を含むか、又はリン脂質とカチオン性脂質からなるものであってもよい。別の実施形態では、本発明で用いる膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、ステロイドとカチオン性脂質を含むか、又はステロイドとカチオン性脂質からなるものであってもよい。別の実施形態では、本発明で用いる膜構成脂質としてのラメラ形成脂質は、リン脂質とステロイドとカチオン性脂質を含むか、又はリン脂質とステロイドとカチオン性脂質からなるものであってもよい。本発明のリポソームは、１種又は２種以上（例えば、２種、３種、４種、５種、又は６種以上）のラメラ形成脂質を、膜構成脂質として含んでもよい。

　本発明のリポソームに用いるラメラ形成脂質は、１種又は２種以上のリン脂質を含んでもよい。リン脂質としては、以下に限定するものではないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジン酸、及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される１種若しくは２種以上のリン脂質が挙げられる。ホスファチジルコリンの例として、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ；大豆レシチンとも称される）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ；水素添加大豆レシチンとも称される）、及び卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ；卵黄レシチンとも称される）等が挙げられるが、これらに限定されない。ホスファチジルエタノールアミンの例として、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられるが、これに限定されない。ホスファチジルグリセリンの例として、ジオレイルホスファチジルグリセリンナトリウム（ＤＯＰＧ－Ｎａ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、クロリド（塩化物）やブロミド（臭化物）などのハロゲン化物、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、硫酸塩、硝酸塩等の塩の形態のリン脂質も使用することができ、それらは上に列挙したような個々の対応するリン脂質の範囲に包含される。本発明のリポソームは、リン脂質をその塩の形態で含んでもよい。リン脂質の塩は、製薬上許容される塩であってよい。リン脂質をその塩の形態で含むリポソームも、本発明に係るリポソームの範囲に含まれる。

　本発明で用いるリン脂質は、水溶性高分子で修飾されたリン脂質であってもよい。水溶性高分子は、以下に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等であってよい。好ましい一実施形態では、水溶性高分子で修飾されたリン脂質は、ＰＥＧ化リン脂質である。ＰＥＧ化リン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体が付加（結合）されたリン脂質を指す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体は、任意の官能基及び／又はマルチアームを有するＰＥＧであってもよい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体は、末端に官能基を有するポリエチレングリコール、例えば、アルコキシエチレングリコール（モノアルコキシポリエチレングリコール）であってもよい。アルコキシエチレングリコールとしては、例えば、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、エトキシポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールは、任意の分子量を有するものであってよく、例えば、分子量１００，０００以下、２００～８００，０００、３００～１５，０００、又は５００～５，０００（例えば、２，０００）のポリエチレングリコールであってもよい。水溶性高分子で修飾されるリン脂質は上記の任意のリン脂質であってよい。水溶性高分子で修飾されたリン脂質は、例えば、ＰＥＧ化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンをはじめとするＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミンであってよく、好ましい例では、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本発明で用いるリン脂質は、合成物であっても、天然由来であってもよい。一実施形態では、本発明で用いるリン脂質は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、又は卵黄ホスファチジルコリンなどのホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミンであってよい。一般的に、水溶性高分子により修飾されたリン脂質を用いたリポソーム、すなわち水溶性高分子により修飾され表面が水和したリポソームは、高い血中滞留性を示す一方、細胞と相互作用しにくく細胞に取り込まれにくい。しかし、本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を、ラメラ形成脂質とともに膜構成成分として用いることにより、水溶性高分子により修飾されていても、細胞との相互作用が促進される。

　本発明のリポソームに用いるラメラ形成脂質は、１種又は２種以上のステロイドを含んでもよい。ステロイドとしては、以下に限定するものではないが、ステロール、胆汁酸、ステロイドホルモン等の任意のステロイドが挙げられるが、ステロールが好ましい。ステロールとしては、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール等が挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明のリポソームに用いるラメラ形成脂質は、１種又は２種以上のカチオン性脂質を含んでもよい。カチオン性脂質としては、以下に限定するものではないが、１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－モノ、ジ又はトリアルキルアンモニウムプロパン（１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－アルキルアンモニウムプロパン、１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－ジアルキルアンモニウムプロパン、又は１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－トリアルキルアンモニウムプロパン）、例えば、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）（例えば、クロリド）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン又は１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジミリストイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）（例えば、クロリド）等が挙げられる。本発明では、クロリド（塩化物）やブロミド（臭化物）などのハロゲン化物、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、硫酸塩、硝酸塩等の塩の形態のカチオン性脂質も使用することができ、それらは上に列挙したような個々の対応するカチオン性脂質の範囲に包含される。本発明のリポソームは、カチオン性脂質をその塩の形態で含んでもよい。カチオン性脂質の塩は、製薬上許容される塩であってよい。カチオン性脂質をその塩の形態で含むリポソームも、本発明に係るリポソームの範囲に含まれる。本発明のリポソームは、後述の薬物として核酸を含む場合には、カチオン性脂質を含むことがより好ましいが、それ以外の場合にカチオン性脂質を含んでもよい。

　本発明のリポソームに用いるラメラ形成脂質は、相転移温度が２０℃を超えるものであることが好ましく、例えば、２１℃～４２℃、２３℃～４２℃、又は２３℃～４０℃のものであってよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームに用いるラメラ形成脂質は、ホスファチジルコリン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン）、コレステロール、及びＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＰＥＧ化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）を含み得る。

　一実施形態では、本発明のリポソームに用いるラメラ形成脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、及び１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－モノ、ジ又はトリアルキルアンモニウムプロパン（例えば、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリドなど）を含み得る。

　本発明のリポソームは、ラメラ形成脂質に加えて、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を含む。一実施形態では、本発明におけるイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質は、水存在下で他の脂質を必要とせずに単独で非ラメラ液晶を形成する能力を有する脂質（非ラメラ液晶形成脂質）であってよい。

　好ましい実施形態では、本発明のリポソームにおいて用いるイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質は、下記一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物である。

　一般式（Ｉ）中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子を表すか又は一緒になって酸素原子を表す。一般式（Ｉ）中、ｎは０～２の整数（好ましくは、１又は２）を表し、ｍは１又は２を表す。一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物において、ｎとｍの組み合わせは、ｎ＝０、ｍ＝１；ｎ＝０、ｍ＝２；ｎ＝１、ｍ＝１；ｎ＝１、ｍ＝２；ｎ＝２、ｍ＝１；又はｎ＝２、ｍ＝２のいずれであってもよい。

　式中の：

は一重結合又は二重結合を表す。

　一般式（Ｉ）中のＲは１つ以上の水酸基（１つ又は２つ以上の水酸基）を有する親水性基を表し、以下に限定するものではないが、例えば、グリセロール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ジグリセロール、グリセリン酸、トリグリセロール、キシロース、ソルビトール、アスコルビン酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、ジペンタエリスリトール、マルトース、マンニトール、キシリトール、ソルビタン、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、及びイソソルバイドからなる群から選択されるいずれか１つから１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基が挙げられる。なお、グリセリン酸から１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基は、グリセリン酸のカルボキシル基に含まれるＯＨ（水酸基）が除かれた基であってもよい。

　本発明に関して、グリコールとは、２個の水酸基が、２個の異なる炭素原子に結合している鎖状または環状の炭素、酸素、水素からなる化合物を意味する。本発明で用いるイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質に関して、グリコールの好ましい例として、プロピレングリコール、エチレングリコール、ブチレングリコール、イソプレングリコール（別名：３－メチル－１，３－ブタンジオール）、ジエチレングリコール、及びイソソルバイドが挙げられるが、これらに限定されない。

　なお本発明において、一般式（Ｉ）中の表記：

は当該両親媒性化合物が幾何異性体のＥ体（シス体）若しくはＺ体（トランス体）又はそれらの混合物であることを意味する。

　なお一般式（Ｉ）中のＲとして、例えば、グリセロール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ジグリセロール、グリセリン酸、キシロース、ソルビトール、アスコルビン酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、キシリトール、ソルビタン、及びイソソルバイドからなる群から選択されるいずれか１つから１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基を有する上記両親媒性化合物は、非ラメラ液晶形成脂質である。

　本発明のリポソームの好ましい一実施形態では、一般式（Ｉ）中、ｍ＝１である。本発明のリポソームのさらに好ましい一実施形態では、一般式（Ｉ）中、ｍ＝１であり、かつ、Ｒがグリセロールから１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基である。

　一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物の例としては、下記一般式（ＩＩ）で表される両親媒性化合物が挙げられる。

　一般式（ＩＩ）中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子を表すか又は一緒になって酸素原子を表し、ｎは０～２の整数（０、１又は２）を表し、ｍは１又は２を表す。

　一般式（ＩＩ）中のＲは１つ以上の水酸基（１つ又は２つ以上の水酸基）を有する親水性基を表し、以下に限定するものではないが、例えば、グリセロール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ジグリセロール、グリセリン酸、トリグリセロール、キシロース、ソルビトール、アスコルビン酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、ジペンタエリスリトール、マルトース、マンニトール、キシリトール、ソルビタン、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、及びイソソルバイドからなる群から選択されるいずれか１つから１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基を表す。グリセリン酸から１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基は、グリセリン酸のカルボキシル基に含まれるＯＨ（水酸基）が除かれた基であってもよい。

　一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物の別の例としては、下記一般式（ＩＩＩ）で表される両親媒性化合物が挙げられる。

　一般式（ＩＩＩ）中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子を表すか又は一緒になって酸素原子を表し、ｎは０～２の整数（好ましくは、１又は２）を表し、ｍは１又は２を表す。

　一般式（ＩＩＩ）中のＲは１つ以上の水酸基（１つ又は２つ以上の水酸基）を有する親水性基を表し、以下に限定するものではないが、例えば、グリセロール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ジグリセロール、グリセリン酸、トリグリセロール、キシロース、ソルビトール、アスコルビン酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、ジペンタエリスリトール、マルトース、マンニトール、キシリトール、ソルビタン、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、及びイソソルバイドからなる群から選択されるいずれか１つから１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基が挙げられる。グリセリン酸から１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基は、グリセリン酸のカルボキシル基に含まれるＯＨ（水酸基）が除かれた基であってもよい。

　一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物のさらに別の例としては、下記一般式（ＩＶ）で表される両親媒性化合物が挙げられる。

　一般式（ＩＶ）中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子を表すか又は一緒になって酸素原子を表し、ｎは０～２の整数（好ましくは、１又は２）を表し、ｍは１又は２を表す。

　一般式（ＩＶ）中のＲは１つ以上の水酸基（１つ又は２つ以上の水酸基）を有する親水性基を表し、以下に限定するものではないが、例えば、グリセロール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ジグリセロール、グリセリン酸、トリグリセロール、キシロース、ソルビトール、アスコルビン酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、ジペンタエリスリトール、マルトース、マンニトール、キシリトール、ソルビタン、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、及びイソソルバイドからなる群から選択されるいずれか１つから１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基が挙げられる。グリセリン酸から１つの水酸基（ＯＨ）が除かれた親水性基は、グリセリン酸のカルボキシル基に含まれるＯＨ（水酸基）が除かれた基であってもよい。

　一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物としては、例えばグリセロール系、ソルビタン系、又はプロピレングリコール系化合物の例として：
モノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロール、
モノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカノイル）グリセロール、
モノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４，８，１２－トリエノイル）グリセロール、
モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）グリセロール、
モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカノイル）グリセロール、
モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４，８，１２，１６－テトラエノイル）グリセロール、
モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタン、及び
モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）プロピレングリコール
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　本発明に係る両親媒性脂質として、一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物の塩、例えば、クロリド（塩化物）やブロミド（臭化物）などのハロゲン化物、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、硫酸塩、硝酸塩等も使用することができる。それらの塩は、上に列挙したような個々の対応する両親媒性化合物の範囲に含まれる。本発明のリポソームは、一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物を、その塩の形態で含んでもよい。一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物の塩は、製薬上許容される塩であってよい。一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物をその塩の形態で含むリポソームも、本発明に係るリポソームの範囲に含まれる。

　本発明で用いる一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物は、後述の実施例の記載を参照して、又は国際公開ＷＯ２０１４／１７８２５６又は国際公開ＷＯ２０２０／０５０４２３（特許文献３）に記載された合成法に従って合成することができる。あるいは、一般式（ＩＩＩ）で表される両親媒性化合物は、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／０７８３８３に記載された合成法に従って合成することができる。さらに、一般式（ＩＶ）で表される両親媒性化合物は、例えば、国際公開ＷＯ２００６／０４３７０５に記載された合成法に従って合成することができる。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、５０ｍｏｌ％以下、４０ｍｏｌ％以下、３５ｍｏｌ％以下、３０ｍｏｌ％以下、２５ｍｏｌ％以下、又は２０ｍｏｌ％以下となる量で含んでもよい。本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質（２種以上の当該両親媒性脂質を用いる場合は合計量）を、膜構成脂質総量に対するモル分率で、例えば、５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～２５ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～３０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～３０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～２５ｍｏｌ％、又は２０ｍｏｌ％～２５ｍｏｌ％となる量で含んでもよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、ラメラ形成脂質として、リン脂質を含んでもよい。本発明のリポソームはリン脂質（２種以上のリン脂質を用いる場合は合計量）を、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、例えば、５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、又は２０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％となる量で含んでもよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、ラメラ形成脂質として、ステロイドを含んでもよい。本発明のリポソームはステロイド（２種以上のステロイドを用いる場合は合計量）を、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、例えば、５ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、又は３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％となる量で含んでもよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、カチオン性脂質（２種以上のカチオン性脂質を用いる場合は合計量）、例えば、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）を、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、例えば、４０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％、又は４５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％となる量で含んでもよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質（例えば、Ｃ１７ＭＧＥ）とリン脂質（例えば、ＤＯＰＥ）を、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）に基づいて、好ましくは１：２～２：１、より好ましくは１：１．５～１．５：１、さらに好ましくは１：１．１～１．１：１の比率で含むものであってよい。

　好ましい一実施形態では、本発明のリポソームは、ラメラ形成脂質として、カチオン性脂質を含んでもよい。本発明のリポソームは、カチオン性脂質、例えば、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）を、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で４５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％（例えば、５０ｍｏｌ％）含む場合、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質（例えば、Ｃ１７ＭＧＥ）を、膜構成脂質総量に対するモル分率（ｍｏｌ％）で２０ｍｏｌ％～２５ｍｏｌ％、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥ）を、２０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％含むものであってよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールと、ラメラ形成脂質であるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、コレステロール、及びＰＥＧ化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを含むものであり得る。このような本発明のリポソームは、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールを５ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、ＤＭＰＣを２５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、コレステロールを３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、及びＰＥＧ化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）を４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％含んでもよい。このような本発明のリポソームはまた、膜構成脂質総量に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールを５ｍｏｌ％～２５ｍｏｌ％又は２０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、ＤＭＰＣを３５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、コレステロールを３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、及びＰＥＧ化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）を４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％含んでもよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールと、ラメラ形成脂質であるジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）を含むものであり得る。このような本発明のリポソームは、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールを５ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％又は２０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥを１５ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、及びＤＯＴＡＰを４０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％含んでもよい。このような本発明のリポソームはまた、膜構成脂質総量に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールを５ｍｏｌ％～３０ｍｏｌ％又は１０ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、ＤＯＰＥを１０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、及びＤＯＴＡＰを５５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％含んでもよい。

　一実施形態では、本発明のリポソームは、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールと、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）を含むものであり得る。このような本発明のリポソームは、膜構成脂質総量（ラメラ形成脂質のモル数＋イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質のモル数）に対するモル分率（ｍｏｌ％）で、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質、例えばモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールを４０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、及びＤＯＴＡＰを５０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％含んでもよい。このような本発明のリポソームは、リン脂質やステロイドを含まなくてもよい。

　本発明のリポソームは、ラメラ形成脂質、及びイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質に加えて、他の物質を含んでもよいし含まなくてもよい。

　本発明のリポソームは、界面活性剤を含んでも含まなくてもよいが、界面活性剤を含む必要はない。界面活性剤の例として、親水性のエチレンオキシドと疎水性のプロピレンオキシドのブロック共重合体（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油をはじめとする、非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、分子量が１０００以上（より好ましくは、５０００以上）のものがより好ましい。エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロック共重合体としては、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１２０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコールなどが挙げられる。これらエチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロック共重合体は、プルロニック^（Ｒ）、ポロキサマー^（Ｒ）、ユニルーブ^（Ｒ）、プロノン^（Ｒ）などの様々な名称で市販されている。非イオン性界面活性剤の特に好ましい例として、ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（別名：プルロニック^（Ｒ）Ｆ１２７；ユニルーブ７０ＤＰ－９５０Ｂ、ポロキサマー^（Ｒ）４０７）等が挙げられる。界面活性剤の別の例として、Ｐ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）も挙げられる。

　本発明のリポソームは、通常、リポソームの内部に水性溶媒を含む内水相を有する。そのような水性溶媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、クエン酸-リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、低張リン酸緩衝液等の緩衝液、水等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、水性溶媒中には後述の薬物などの他の物質を含み得る。

　本発明のリポソームは、非ラメラ液晶を含まないことが好ましい。一実施形態では、本発明のリポソームは、非ラメラ液晶形成脂質を膜構成脂質として含むが、非ラメラ液晶を含まないものであり得る。本発明のリポソームは、非ラメラ液晶微粒子ではない。

　本発明のリポソームは、通常のリポソーム製造方法により調製することができる。具体的には、本発明のリポソームは、例えば、ラメラ形成脂質、及びイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質等の、膜構成脂質を、有機溶媒（好ましくは、エタノール、クロロホルム等）に溶解し、それらを均一に混合した後、減圧濃縮等の処理により有機溶媒（アルコールなど）を除去し、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）や水などのリポソーム調製に適した水性溶媒を加えた後、超音波ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー等で、分散させる（例えば、超音波処理する）ことにより、調製することができる。超音波処理は、例えば、１０～３０％（２０％）の振幅で２０～６０秒間（例えば、２０～４０秒間、好ましくは３０秒間）を１～５回（例えば、２回）行うことにより、実施してもよい。超音波処理による分散などの分散工程は、温度が上がり過ぎないような範囲で行うことが好ましい。

　本発明のリポソームは、好ましくは、温度応答性であり、所定の温度範囲で細胞膜不安定化作用を発揮することができる。好ましい実施形態では、本発明のリポソームは、正常な体温（およそ３５～３８℃）では細胞膜にほとんど影響を及ぼさないが、それよりも高い温度、例えば３９～６０℃、例えば、４４～４８℃において、細胞膜の不安定化をもたらす。本発明において、細胞膜不安定化とは、細胞膜と相互作用し、細胞膜の膜流動性を高め、それにより、細胞内への物質導入効率の向上、細胞の溶解促進などをもたらすことを意味する。温度応答性である本発明のリポソームは、細胞膜不安定化作用に基づき、細胞内への物質送達や細胞溶解誘導のために有利に使用できる。温度応答性である本発明のリポソームは、加温を利用して腫瘍増殖を抑制するためにも有利に使用できる。

　本発明のリポソームは、典型的には、５０ｎｍ～５００ｎｍ、好ましくは８０ｎｍ～４００ｎｍ、より好ましくは８０ｎｍ～３００ｎｍ、さらに好ましくは１００ｎｍ～３００ｎｍの平均粒子径を有する。

　本発明のリポソームは、典型的には、０．０５～０．４、好ましくは０．０５～０．３５、又は０．１～０．３５、より好ましくは０．０５～０．３、又は０．１～０．３、例えば０．１５～０．２５のＰｄＩを有する。

　本発明のリポソームは、全身投与の際、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）により、腫瘍部位に集積する性質を有することが好ましい。本発明のリポソームはまた、全身投与により、肝臓及び脾臓にも集積する。本発明のリポソームは、通常の体温で溶血を引き起こすことはなく、安全に全身投与することができる。

　本発明のリポソームは、薬物をさらに含むことが好ましい。本発明において、薬物とは、リポソーム中に含有させるか又はリポソームに固定し、好ましくはリポソームの内部又は膜中に保持して細胞内に送達するための任意の物質（有効成分）である。薬物は、有機化合物であっても無機化合物であってもよい。薬物は、水溶性薬物であっても脂溶性（親油性、水不溶性又は水難溶性）薬物であってもよい。典型的には、水溶性薬物はリポソーム内部の内水相に保持され、脂溶性薬物はリポソームの膜内に埋め込まれて保持される。薬物は、生理活性物質であってよいが、それに限定されない。薬物は、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸等であってよいが、これらに限定されない。薬物は、治療又は予防効果をもたらすものであってよいが、それに限定されない。

　薬物は、蛍光タンパク質等の蛍光物質、色素物質、放射性同位元素のような標識物質であってもよい。薬物として標識物質を含む本発明のリポソームは、標識物質を細胞に送達することにより、細胞を標識するための標識剤（画像化剤）としても使用できる。

　薬物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド、又は人工塩基や修飾核酸等を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの任意の核酸であってもよい。核酸は、任意の遺伝子を含むものであってよい。核酸は、導入遺伝子を発現プロモーターの制御下に含む、発現ベクター又は発現カセットであってもよい。発現ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター等であってよい。導入遺伝子は任意の遺伝子であってよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ等であってよい。導入遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子、細胞増殖制御因子遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子等の抗腫瘍効果をもたらす遺伝子であってもよいし、毒素タンパク質遺伝子であってもよい。核酸はまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等であってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のＲＮＡ干渉誘導核酸は、発現を抑制すべき遺伝子に対して設計されたものであり得る。本発明のリポソームは、そのような核酸の細胞の核内への核酸送達を促進することもできる。核酸は、任意の疾患の治療又は予防用のものであってよい。一実施形態では、本発明のリポソームと核酸が結合し、当該核酸と当該リポソームが複合体を形成していることが好ましい。リポソームと核酸の結合は、特に限定されないが、例えば、静電的相互作用によるものであってよい。本発明に係る核酸－リポソーム複合体は、核酸の細胞への送達のために特に有用である。好ましい実施形態では、本発明に係る核酸－リポソーム複合体は、膜構成脂質として、上記のイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質と、ラメラ形成脂質とを含む。核酸－リポソーム複合体に用いるラメラ形成脂質は、リン脂質、ステロイド、及びカチオン性脂質からなる群から選択される少なくとも１つを含むが、カチオン性脂質を含むことが好ましく、カチオン性脂質とリン脂質を含むことがより好ましい。カチオン性脂質については上記のとおりであるが、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）が特に好ましい。リン脂質についても上記のとおりであるが、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などのホスファチジルエタノールアミンが特に好ましい。

　一実施形態では、薬物は、抗腫瘍剤であってよい。別の実施形態では、薬物は、肝臓疾患（例えば、肝炎など）又は脾臓疾患の治療薬であってよい。抗腫瘍剤は、特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン塩酸塩（ＤＸＲ）等が挙げられる。

　本発明のリポソームは、細胞内への薬物送達用に有利に使用できる。本発明は、本発明のリポソームを含む、細胞内への薬物送達用製剤も提供する。薬物を送達する細胞は、任意の細胞であってよいが、例えば全身投与の場合には、腫瘍細胞である。薬物を送達する細胞はまた、肝細胞又は脾細胞であってもよい。

　上記核酸を含む本発明のリポソームは、細胞内、特に細胞の核内への核酸送達用に有利に使用できる。本発明は、上記核酸を含む本発明のリポソームを含む、細胞の核内への核酸送達用製剤も提供する。核酸を送達する細胞は、任意の細胞であってよいが、好ましくは腫瘍細胞である。核酸を送達する細胞はまた、肝細胞又は脾細胞であってもよい。

　本発明は、薬物、例えば遺伝子等の核酸についてのドラッグデリバリーシステムを提供する。

　本発明の細胞内への薬物送達用製剤や、細胞の核内への核酸送達用製剤は、製薬上許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、着色剤、着香剤、噴射剤等）をさらに含んでもよい。

　本発明の細胞内への薬物送達用製剤や、細胞の核内への核酸送達用製剤は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ等での試験用の試薬（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ核酸導入試薬）であってもよいし、医薬製剤であってもよい。

　本発明は、本発明のリポソームを含む医薬製剤を提供する。本発明における「医薬製剤」は、医薬組成物であり得る。本発明の医薬製剤は、リポソーム形態を維持できる限り、製薬上許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、着色剤、着香剤、噴射剤等）を含んでもよい。なお本発明のリポソームは、薬物（例えば、抗腫瘍剤）を含まない場合でも、抗腫瘍効果を示すことができる。したがって本発明のリポソームを含む医薬製剤は、薬物（例えば、抗腫瘍剤）を含むか含まないかにかかわらず、抗腫瘍製剤であり得る。

　本発明に係る医薬製剤は、任意の剤形であってよいが、好ましくは、液剤、カプセル剤、スプレー剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤、又はデポ剤等であり得る。本発明に係る医薬製剤は、任意の疾患の治療又は予防用のものであってよく、例えば、癌や良性腫瘍などの新生物疾患、皮膚疾患、肝障害等の様々な疾患の治療又は予防用のものであってよい。

　本発明はまた、本発明に係る上記製剤を、対象（例えば、患者）などの体内（特に、体内の生体組織）に適用することを含む、体内に薬物を徐放送達する方法も提供する。ここで体内への適用は、非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与等の全身投与、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、又は皮内等）により行うことが好ましいが、投与経路はそれに限定されない。非経口投与は、例えば、全身投与又は局所投与により行うことができるが、全身投与により行うことがより好ましい。本発明に係る上記製剤を投与する対象は、哺乳動物、鳥等を含む任意の動物（例えば、上記疾患を有する動物）であってよく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン等の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、パンダ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット等であってよい。対象は、本発明のリポソーム又はそれを含む医薬製剤の投与を必要とする対象であることが好ましい。

　本発明のリポソームは、好ましくは温度応答性であり、より好ましくは、体温よりも高い所定の温度条件下でリポソームの膜流動性が向上し、また細胞膜に作用する。そのため、対象への投与後、目的の部位を所定の温度条件下で加温処理することにより、当該部位特異的にリポソームからの薬物放出を促進し、また、細胞膜不安定化を誘導することができる。すなわち、本発明のリポソームは、加温処理を併用することにより、細胞死を促進することができる。本発明のリポソームは高い腫瘍集積性を示すことから、加温処理と組み合わせることで、より高い抗腫瘍効果をもたらすことができる。加温処理は、体温（およそ３５～３８℃）よりも高い温度、例えば３９～６０℃、例えば、４４～４８℃で行うことができる。加温処理は、例えば、患部を集中的に（好ましくは患部特異的に）加温できる任意の手段を用いて行えばよいが、例えば、目的とする温度まで加温可能な超音波処理や近赤外線照射（波長６５０～２，５００ｎｍ、例えば、波長７００～１０００ｎｍ）等により行うことができる。なお加温処理は本発明において必ず必要というわけではなく、加温処理なしでも本発明のリポソームを用いた薬物送達は可能である。特に核酸送達に関しては加温処理なしで本発明のリポソームを投与することも十分に可能である。本発明の温度応答性リポソームは、特に、抗腫瘍効果をもたらすための医薬製剤、すなわち腫瘍（癌）治療薬に用いることができる。本発明のリポソームを含む医薬製剤の投与量は、当業者であれば、リポソーム中の薬物の含有量に基づいて適宜決定することができる。

　本発明はまた、本発明のリポソーム又はそれを含む医薬製剤を、対象（例えば、患者）に投与することを含む、腫瘍増殖を抑制する方法、又は腫瘍の治療方法も提供する。本発明のリポソーム又はそれを含む薬物送達用製剤、核酸送達用製剤、医薬製剤などの製剤の投与経路は、特に限定されないが、非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与等の全身投与、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、又は皮内等）が好ましく、非経口投与は、例えば、全身投与又は局所投与によるものであってもよい。本発明のリポソーム又はそれを含む上記製剤を投与する対象は、本発明のリポソーム又はそれを含む上記製剤の投与を必要とする対象であることが好ましく、腫瘍を有するか又は腫瘍を有することが疑われる対象であることがより好ましい。あるいは、対象は、例えば、肝臓又は脾臓に疾患を有する対象などの、肝臓又は脾臓への薬物送達が望まれる対象であってもよい。対象は、哺乳動物、鳥等を含む任意の動物（例えば、上記疾患を有する動物）であってよく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン等の霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、パンダ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット等であってよい。本発明のリポソーム又は上記製剤の投与量は、当業者が適宜定めることができるが、例えばヒトの場合、０．０００１ｍｇ～１００ｇ又は１ｍｇ～５０ｇのリポソーム量に相当する量であり得るが、これに限定されない。

　本発明において「腫瘍」は、悪性又は良性の新生物疾患を包含する。本発明のリポソームが薬剤送達又は抗腫瘍効果をもたらす標的となる腫瘍（癌）としては、以下に限定するものではないが、例えば、乳癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頚部癌、脳腫瘍、胆道癌、膀胱癌、子宮癌（子宮体癌、子宮頸癌など）、卵巣癌、卵管癌、前立腺癌、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げられる。本発明のリポソームが薬剤送達の標的となる臓器としては、例えば、肝臓、脾臓が挙げられ、標的となる疾患としては肝臓又は脾臓の疾患（例えば、肝炎）が挙げられる。

　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質の合成
（１）モノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールの合成

　グリセロール０．６５ｇ（７．１ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム０．５９ｇ（４．３ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．５ｍＬ）溶液に、８０℃で５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エン酸メチル（テトラヒドロファルネシル酢酸メチル）１．０ｇ（３．５ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。１００℃で１８時間撹拌した後、反応液に１Ｍ塩酸を添加し、エーテルで抽出した。抽出液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：酢酸エチル／ヘキサン混液）で精製することにより、表題の化合物を無色透明液体として得た。得られた化合物について、^１Ｈ－ＮＭＲ測定及び粘度測定を行った結果は以下の通りである。

　^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ：０．８０－０．９０（ｍ，９Ｈ），１．００－１．７０（ｍ，１５Ｈ），１．９７（ｔｄ，Ｊ＝７．８，１７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），２．２５－２．４５（ｍ，４Ｈ），２．５５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），３．５０－４．００（ｍ，３Ｈ），４．１０－４．２５（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）　粘度：０．４８Ｐａ・ｓ（せん断速度９２　１／ｓ）
　合成されたモノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロールを、Ｃ１７ＭＧＥとも称する。

（２）モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）グリセロールの合成

　６０～７０ｍｍＨｇの減圧かつ窒素気流下、グリセロール２３．５ｇ（２５５ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム０．５５ｇ（４．０ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４８ｍＬ）溶液に、８０℃で５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エン酸メチル２８．２ｇ（８０．０ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し、同一温度で３時間撹拌した。得られた反応溶液を酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒（１：１，２００ｍＬ）で希釈し、水、飽和重曹水、飽和食塩水（２回）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後濃縮することによって得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００：０～３０：７０）で精製することにより、表題の化合物１３．３ｇ（収率４０％）を微黄色透明液体として得た。得られた化合物について、^１Ｈ－ＮＭＲ測定を行った結果は以下の通りである。

　^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ：０．８０－０．９５（ｍ，１２Ｈ），１．００－１．７０（ｍ，２２Ｈ），１．８５－２．１５（ｍ，２Ｈ），２．１５－２．５５（ｍ，４Ｈ），３．５３－３．７８（ｍ，３Ｈ），３．８０－４．００（ｍ，１Ｈ），４．１０－４．２５（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｄｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）
　合成されたモノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）グリセロールを、Ｃ２２ＭＧＥとも称する。

［実施例２］　微粒子製剤の調製
　後掲の表１に示す組成に従って、リポソームの調製方法として知られる薄膜水和法を用いて微粒子製剤を調製した。

　具体的には、まず、脂質として、イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質であるＣ１７ＭＧＥ（実施例１で合成）、ホスファチジルコリンの一種であるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ；　ＣＯＡＴＳＯＭＥ^（Ｒ）　ＭＣ－４０４０、日油株式会社）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ^（Ｒ）　ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、日油株式会社）、及びコレステロール（和光特級、富士フイルム和光純薬株式会社）をそれぞれ、脂質濃度１０ｍＭのエタノール溶液として調製し、それらを均一に混合することにより混合溶液を調製した。なおＤＳＰＥはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧはポリエチレングリコールである。得られた混合溶液を減圧濃縮してエタノールを完全に除去した後、上記脂質（総量）の最終濃度が１ｍＭとなるようにｐＨ　７．４のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ（－））を加えて、室温で１０分間静置した。その溶液を、超音波洗浄器（５５１０、ＢＲＡＮＳＯＮ社）を用いて室温で数分間超音波処理して、粗分散液を調製した。さらに、この粗分散液を超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｃｓ　Ｖｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ　ＶＣＸ－７５０、Ｓｏｎｉｃｓ　＆　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．）を用いて２０％の振幅で３０秒間を２回の超音波処理をすることによって、薄く白濁した微粒子製剤Ｎｏ．１～５を調製した。これら微粒子製剤は、それぞれ１～５ｍＬの量で調製された。

［実施例３］　微粒子製剤の物性評価
　実施例２で調製した微粒子製剤Ｎｏ．１～５の粒子径分布、及びゼータ電位をゼータサイザーＮａｎｏ－ＺＳ（マルバーン社）を使用した動的光散乱法により測定した。測定サンプルは各エマルションをＰＢＳで１０００倍希釈することにより調製した。各測定サンプルについて、５～６回測定の平均値として得られた平均粒子径（ｎｍ）（Ｚ－Ａｖｅｒａｇｅ）、ＰｄＩ（多分散指数）、及びゼータ電位（ｍＶ）を表１に示す。

　得られた微粒子製剤の平均粒子径は１１２～１６８ｎｍの範囲にあり、適度なＰｄＩとゼータ電位を有していた。これらの微粒子製剤は、いずれも実験過程を通して目視可能な凝集物がなく安定であった。

　さらに、微粒子製剤Ｎｏ．１～５について、ＮＡＮＯ　Ｖｉｅｗｅｒナノスケールエックス線構造評価装置（Ｒｉｇａｋｕ社）を使用して、小角エックス線散乱（ＳＡＸＳ）による構造解析を行った。各微粒子製剤Ｎｏ．１～５を大気圧下にてキャピラリーに導入し、減圧状態の装置内（試料自体は大気圧下）で測定を行った。その結果、いずれの微粒子製剤においても、非ラメラ液晶に特有のピークは観測されなかった。したがって微粒子製剤Ｎｏ．１～５は非ラメラ液晶を形成していないことが示された。

　微粒子製剤Ｎｏ．４について、低温透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）（ＪＥＭ－３１００ＦＥＦ、日本電子株式会社）を用いて微粒子形態の観察を行った。具体的には、まず、微粒子製剤Ｎｏ．４を総脂質濃度０．５ｍＭとなるようＰＢＳで希釈した。親水化処理を施したＣｕマイクログリッド（製品番号：１６４３、２００メッシュ、日本電子株式会社）に本希釈液を１μＬ滴下し、ブロットした。クライオ試料作製装置（ＥＭ－ＣＰＣ、Ｌｅｉｃａ社）を用いて、得られたグリッドを液化エタンで瞬時に凍結した後、液体窒素温度下においてクライオＴＥＭで明視野観察した。デフォーカスは５～１０μｍで、観察倍率によって適宜変更した。図１に、倍率１５，０００倍での撮影画像を示す。図１に示されるように、直径１００ｎｍ前後のリポソーム様の膜構造（シングルラメラ）を有する微粒子が観察された。

　なお微粒子製剤Ｎｏ．５は、クライオＴＥＭによる同様の観察により、安定性の低下傾向を示した。

［実施例４］　温度変化による微粒子の物性変化（膜流動性）
　表１に示す微粒子製剤Ｎｏ．１～５の成分比で各脂質のエタノール溶液を混合し、さらに脂質総量（Ｃ１７ＭＧＥ＋ＤＭＰＣ＋Ｃｈｏ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）に対して蛍光色素として０．０１ｍｏｌ％分の１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）のエタノール溶液（０．０２５ｍＭ）を添加し、前記脂質（Ｃ１７ＭＧＥ＋ＤＭＰＣ＋Ｃｈｏ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）とＤＰＨの合計の最終濃度が１ｍＭとなるよう実施例２と同様に操作することによって、微粒子製剤Ｎｏ．１～５にそれぞれ対応するＤＰＨ含有微粒子製剤Ｎｏ．６～１０を調製した。また、コントロールとして、微粒子製剤Ｎｏ．６におけるＤＭＰＣをジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；　ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＣ－６０６０、日油株式会社）、又はジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ；　ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＣ－８１８１、日油株式会社）に置き換えることによって、それぞれ、リン脂質としてＤＰＰＣ又はＤＯＰＣを用いたＣ１７ＭＧＥ無添加のＤＰＨ含有微粒子製剤Ｎｏ．１１及び１２を調製した。

　微粒子製剤Ｎｏ．６～１２の各１ｍＬに対して、消光剤として１Ｍの２，２，６，６－テトラメチルピペリジン１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）のエタノール溶液５μＬを添加し、温度２５℃から６０℃まで昇温させた際の蛍光強度の変化を観測することによって、温度変化に伴う微粒子の膜流動性を評価した。微粒子の脂質二重膜に局在するＤＰＨは、一定強度の蛍光を示すが、脂質二重膜にゆるみが生じて外部に存在するＴＥＭＰＯと化学反応するとＤＰＨの蛍光が消失する。この原理（蛍光消光法）を利用し、蛍光強度比［Ｆ（消光剤存在下の蛍光強度）／Ｆ_０（消光剤非存在下の蛍光強度）］が低いほど、膜流動性が高いと判断される。

　この蛍光強度の測定では、蛍光分光光度計（ＲＦ－６０００、株式会社島津製作所、日本）を用い、測定サンプルを温度２５℃から６０℃まで昇温させながら、励起波長３５３ｎｍ、蛍光波長４３０ｎｍで観測した。

　図２に、横軸を温度（℃）、縦軸を蛍光強度比Ｆ／Ｆ_０として、微粒子製剤Ｎｏ．６～１２の温度に応じた蛍光強度比の変化を示す。

　図２に示されるように、Ｃ１７ＭＧＥ無添加で相転移温度が４２℃のＤＰＰＣをベースとした微粒子製剤Ｎｏ．１１では、３５℃から蛍光強度比の減少が始まり５０℃までに蛍光強度の消失進行が完了し、蛍光強度が下げ止まった。また、Ｃ１７ＭＧＥ無添加で相転移温度が２０℃のＤＯＰＣをベースとした微粒子製剤Ｎｏ．１２では、測定開始の２５℃で蛍光強度比はほぼ下げ止まっており、その後は６０℃までほぼ一定の蛍光強度比であった。一方、Ｃ１７ＭＧＥ無添加で相転移温度が２３℃のＤＭＰＣをベースとした微粒子製剤Ｎｏ．６では、２５℃から６０℃までの間、蛍光強度比の低下はゆるやかに継続して進行した。

　Ｃ１７ＭＧＥを所定の割合で含むＤＭＰＣをベースとした微粒子製剤Ｎｏ．７～１０では、Ｃ１７ＭＧＥ無添加でＤＭＰＣをベースとした微粒子製剤Ｎｏ．６と同様に、２５℃から６０℃までの間、蛍光強度比の低下はゆるやかに継続して進行したが、Ｃ１７ＭＧＥの添加割合が大きいほど各温度での蛍光強度比が低い傾向があった。

　以上の結果から、ＤＰＨを含む微粒子製剤Ｎｏ．６～１２において、膜流動性が変化する温度と微粒子製剤に配合したホスファチジルコリンの相転移温度は近い相関関係にあること、また、Ｃ１７ＭＧＥの添加割合が大きいほど各温度での膜流動性が高い傾向にあることが明らかとなった。イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質の添加により、微粒子の膜流動性を温度に応答して増加させることができることが示された。

［実施例５］　温度変化に応じた微粒子製剤と細胞膜との相互作用の評価
　本発明の微粒子製剤と細胞膜の相互作用を可視化するために赤血球を用いて凝集試験を行った。

　まず、以下のようにして赤血球溶液を調製した。抗凝固剤として、クエン酸三ナトリウム二水和物を２２ｍｇ／ｍＬ、クエン酸一水和物を８ｍｇ／ｍＬ、グルコースを２２ｍｇ／ｍＬとなる量で精製水に溶解し、クエン酸－デキストロース溶液（ＡＣＤ液）を調製した。ＷＢＮ／ＩＬＡ－Ｈｔヘアレスラット（雄、８週齢）の左心室より、ヘパリン溶液（１０００単位／ｍＬ）でコートしたシリンジで採血した。得られた血液に対し、速やかに１／５体積量のＡＣＤ液を加え、転倒混和した。その後、ハイブリッド高速冷却遠心機（Ｍｏｄｅｌ６２００、久保田商事株式会社）で３０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離し、続いて、卓上遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ５２００、久保田商事株式会社）で３０００ｒｐｍ、１０分間、室温で遠心分離した後、上清及び赤血球画分上部の白色沈殿（白血球、血小板）を可能な限り除去した。得られた赤血球画分に対して、３倍体積量のＰＢＳ（－）を加え、転倒混和し、４，０００ｒｐｍ、１０分間、室温で遠心分離し、上清を除去した。この操作を３回繰り返すことで、洗浄した赤血球画分を得た。当該赤血球画分が２％となるようＰＢＳ（－）を加え、赤血球溶液とした。なお本明細書では、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳを、ＰＢＳ（－）と表記している。

　上記赤血球溶液５０μＬを入れたマイクロチューブ（容量１．５ｍＬ、エッペンドルフ社）を６０個準備した。このマイクロチューブを１２個ずつの５つのグループに分割して、それぞれのグループに、実施例２で調製した微粒子製剤Ｎｏ．１～４、又はコントロールとしてのＰＢＳ（－）のいずれかをマイクロチューブ１個当たり１００μＬ添加した後、ピペッティングにより撹拌した。このようにして得た微粒子製剤Ｎｏ．１～４又はＰＢＳ（－）と赤血球溶液とを混合した５種類の溶液（各１２個）について、アルミブロック恒温槽（ドライサーモユニットＤＴＵ－１Ｂ、タイテック株式会社）を用いて、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、又は４８℃の１２点の温度で１５分間加熱した。各マイクロチューブ中の溶液全量を９６穴丸底プレートの各ウェルに移し替え、１２０分間静置した後、各ウェル内の赤血球の状態を目視で観察した。なお、赤血球は、混在する成分と相互作用しない場合、ウェル底部の中心に凝集して沈殿するが、混在する成分と相互作用した場合、当該成分と赤血球が会合して生じたコロイドが分散状態となってウェル全体に観察される。

　図３に、上記温度１２点で加熱処理した溶液の状態をデジタルカメラで撮影した画像を示す。図３に見られるように、赤血球が微粒子と相互作用してウェル全体にコロイドが分散した状態が、Ｃ１７ＭＧＥのモル分率がより小さい微粒子製剤Ｎｏ．２、３を用いた場合には４７℃以上で観察されたのに対して、Ｃ１７ＭＧＥのモル分率がより大きい微粒子製剤Ｎｏ．４を用いた場合にはより低温の４４℃から観察された。一方、Ｃ１７ＭＧＥを含まない微粒子製剤Ｎｏ．１を用いた場合には、単にＰＢＳ（－）を用いたコントロールと同様に、３７℃から少なくとも４８℃までは、赤血球が微粒子製剤と相互作用してウェル全体にコロイドが分散した状態は観察されなかった。

　この結果から、微粒子製剤に配合したイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質により、細胞膜と微粒子との相互作用（会合）が引き起こされることが示された。

［実施例６］　温度変化に応じた微粒子製剤の細胞膜不安定化作用の評価
　本発明の微粒子製剤による細胞膜の不安定化作用を可視化するために赤血球を用いて溶血試験を行った。

　まず、以下のように適切な吸光度を有する赤血球試験液を調製した。実施例５と同様にして得られた洗浄した赤血球画分に等量のＰＢＳ（－）を加え、赤血球懸濁液とした。赤血球懸濁液２５０μＬに４倍量（１ｍＬ）の低張緩衝液（ＰＢＳ（－）の１０倍希釈液）を加えて溶血させ、３，０００ｒｐｍ、５分間で遠心分離した。得られた上清について、５４０ｎｍ（ヘモグロビンの吸光波長）における吸光度を測定し、吸光度が２．０～２．５になるようＰＢＳ（－）で希釈した。吸光度が２．０～２．５になるようこの時の希釈倍率で前記赤血球懸濁液をＰＢＳ（－）で希釈することによって、赤血球試験液とした。

　上記赤血球試験液４０μＬを入れたマイクロチューブ（容量１．５ｍＬ、エッペンドルフ社）を４５個準備した。このマイクロチューブを９個ずつの５グループに分割して、それぞれのグループに、実施例２で調製した微粒子製剤Ｎｏ．１～５のいずれかをマイクロチューブ１個当たり４倍量（１６０μＬ）添加した後、ピペッティングにより撹拌した。このようにして得た微粒子製剤Ｎｏ．１～５のいずれかと赤血球試験液を混合した５種類の溶液（各９個）について、アルミブロック恒温槽（ドライサーモユニットＤＴＵ－１Ｂ、タイテック株式会社）を用いて、３７℃又は４５℃の温度で１５分間、３０分間、４５分間、又は６０分間加熱した。グループ毎に各１個を加熱せずに「加熱時間０分間」の試料溶液とした。

　続いて、各溶液を遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分）した後、その上清を９６穴プレートの各ウェルに移し替えて、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｍａｘ^（Ｒ）Ｍ２ｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＤＥＶＩＣＥＳ社）を用いて５４０ｎｍでの吸光度を測定し、各ウェル内の赤血球の溶血率（％）を求めた。なお、溶血率（％）は、各溶液で得られた吸光度を、各溶液の代わりに低張緩衝液（ＰＢＳ（－）の１０倍希釈液）を用いて得られた吸光度で除算することによって算出した。

　図４に、３７℃（図４Ａ）と４５℃（図４Ｂ）における微粒子製剤Ｎｏ．１～５のいずれかと赤血球試験液を含む５種類の溶液の溶血率の加熱時間に応じた変化のグラフを示す。横軸は加熱時間［分］、縦軸は溶血率［％］を示す。溶血率の値は３回測定の平均値±標準偏差である。

　３７℃の加熱温度では、Ｃ１７ＭＧＥを含まない微粒子製剤Ｎｏ．１とＣ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．２～４の間で、溶血率はほとんど変化しなかった。Ｃ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．５では、３７℃の加熱時間に応じて溶血率が上昇する傾向を示した。一方、４５℃の加熱温度では、Ｃ１７ＭＧＥを含まない微粒子製剤Ｎｏ．１とＣ１７ＭＧＥをより低いモル分率で含む微粒子製剤Ｎｏ．２、３との間で、３７℃の場合と同様に溶血率はほとんど変化しなかったのに対し、Ｃ１７ＭＧＥをより高いモル分率で含む微粒子製剤Ｎｏ．４、５では加熱時間に応じて溶血率が上昇した。このことは、微粒子製剤へのイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質の配合により、加温条件下での細胞膜破壊作用がもたらされることを示している。

　実施例４～６の結果より、Ｃ１７ＭＧＥのようなイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を含む微粒子製剤は、加温処理することにより、製剤自体の膜流動性を増加させることができるとともに、微粒子と細胞膜との相互作用を促進し、とりわけ細胞膜の不安定化を誘発することが示された。Ｃ１７ＭＧＥのようなイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を含まない微粒子製剤は、製剤自体の膜流動性は増加しても、細胞膜との相互作用は示さず細胞膜の不安定化を誘発しなかった。

［実施例７］　微粒子製剤のｉｎ　ｖｉｖｏ投与による薬物動態
　Ｃ１７ＭＧＥを添加した微粒子製剤Ｎｏ．１及び４に、疎水性の近赤外蛍光色素である１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤｉＲ）を配合し、それを用いてマウスへの全身投与による微粒子製剤の薬物動態を評価した。

　まず、表１に示す微粒子製剤Ｎｏ．１及び４の成分比で各脂質のエタノール溶液を混合し、さらに脂質総量（Ｃ１７ＭＧＥ＋ＤＭＰＣ＋Ｃｈｏ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）に対して０．５ｍｏｌ％分のＤｉＲのエタノール溶液を添加し、前記脂質（Ｃ１７ＭＧＥ＋ＤＭＰＣ＋Ｃｈｏ＋ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）とＤｉＲの合計の最終濃度が１．５ｍＭとなるよう実施例２と同様に操作することによって、微粒子製剤Ｎｏ．１及び４にそれぞれ対応するＤｉＲ含有微粒子製剤Ｎｏ．１３及び１４を調製した。なお微粒子製剤Ｎｏ．１３及び１４は非ラメラ液晶を含まない。

　次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）にマウス乳癌細胞でありルシフェラーゼ安定発現株である４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク（日本）からＪＣＲＢ番号ＪＣＲＢ１４４７の下で入手、１．２ｘ１０^６細胞）を腫瘍細胞として皮下移植して１２日間経過した担癌マウスに対して、イソフルランを用いて全身麻酔を施行した後、２７Ｇの針を備えたシリンジ（テルモシリンジ１ｍＬ）を用いて、微粒子製剤Ｎｏ．１３又は１４　１００μＬを尾に静脈投与した。投与の０．５、１、３、６、１８、２４、及び４５時間後に全身麻酔を施行した状態のマウス全体を蛍光イメージング装置（ＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒａｍ）で観察して、腫瘍部位の蛍光強度の経時的変化を追跡した。投与４５時間後、マウスを安楽死させ、腹部から各臓器（心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、膵臓、腫瘍）を摘出して蛍光イメージング装置で観察した。本観察では、励起波長７４５ｎｍ、蛍光波長８００ｎｍのフィルターセットを用いた。データ解析にはＬｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅ^（Ｒ）（パーキンエルマー社）を用いた。

　図５に、微粒子製剤Ｎｏ．１３又は１４の投与後各時間のマウス全体の蛍光イメージング画像を示す。図６に、図５の各蛍光イメージング画像に基づき、ＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ　Ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ）機能を用いて腫瘍部位の蛍光強度を数値化した結果を示す。図６の横軸は時間［ｈ］、縦軸は総放射効率［ｐ／ｓ］／［μＷ／ｃｍ^２］を示す（ｎ＝２～３）。図７に、微粒子製剤Ｎｏ．１３又は１４を投与したマウス腹部から摘出した臓器（投与４５時間後）の蛍光イメージング画像を示す。

　その結果、Ｃ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．１４は、Ｃ１７ＭＧＥを含まない典型的なリポソーム製剤に当たる微粒子製剤Ｎｏ．１３と同様の臓器への集積挙動を示すことが明らかとなった。すなわち、マウスに投与された微粒子製剤Ｎｏ．１３、１４はともに、腫瘍部位への集積の経時的増加を示し、約２４時間後に腫瘍部位への集積はピークに達するが、４５時間後でも引き続き腫瘍部位への高い集積性を示し、さらに、肝臓にも高い集積性を示すとともに、脾臓にわずかな集積性を示した。なお、いずれの微粒子製剤も、副作用の原因となり得る肺など他臓器への集積は見られなかった。また、本評価試験を通じてマウスの外観的な異常は観察されなかった。

　よって、Ｃ１７ＭＧＥを配合したリポソームを含む微粒子製剤（非ラメラ液晶を含まない）は、生体に安全に投与可能であり、腫瘍部位に集積させることができることが示された。本発明の微粒子製剤の腫瘍部位への集積は、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）によるものと考えられる。また本発明の微粒子製剤は、上記の実施例で示されたとおり、体温（３７℃前後）では細胞と相互作用せず、４４～４８℃に加温することで細胞と相互作用して細胞膜を不安定化する。そのため、本発明の微粒子製剤は、温度刺激によって腫瘍細胞に薬物を送達させることができると考えられた。

［実施例８］　微粒子製剤の調製
　マイナスに荷電した核酸を複合体化できるようカチオン性脂質を加えた、非ラメラ液晶を含む微粒子製剤Ｎｏ．１５及び非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０を調製した。微粒子製剤Ｎｏ．１５の場合、非ラメラ液晶を形成するように、Ｃ１７ＭＧＥの配合比を大きくし、分散させるために界面活性剤（プルロニック^（Ｒ）Ｆ１２７）を配合した。微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０の場合、リポソーム形成にも寄与するカチオン性（正電荷）脂質の配合比を大きくし、界面活性剤（プルロニック^（Ｒ）Ｆ１２７）を配合しなかった。

　具体的には、非ラメラ液晶分散体を含む微粒子製剤Ｎｏ．１５の調製では、後掲の表２に示す重量分率［ｗｔ％］に従って、イソプレノイド型脂肪鎖を有するＣ１７ＭＧＥ、ホスファチジルエタノールアミンの一種であるジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ；　ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＥ－８１８１、日油株式会社）、カチオン性脂質である１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ；　ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＣＬ－８１８１ＴＡ、日油株式会社）、及びプルロニック^（Ｒ）Ｆ１２７（ユニルーブ^（Ｒ）７０ＤＰ－９５０Ｂ、日油、又はＡｌｄｒｉｃｈ　Ｐ２４４３）を合計５０ｍｇとなるよう５～２０ｍＬ丸底フラスコ内に加え、クロロホルム０．５ｍＬを加え均一に溶解した。なお、脂質に相当するＣ１７ＭＧＥ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰのモル分率［ｍｏｌ％］は９１．３ｍｏｌ％：４．２ｍｏｌ％：４．５ｍｏｌ％である。

　一方、非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０の調製では、後掲の表３に示すモル分率［ｍｏｌ％］に従って、それぞれ１０ｍＭのエタノール溶液としたＣ１７ＭＧＥ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰをエタノール除去後の重量として合計５０ｍｇとなるよう５～２０ｍＬ丸底フラスコ内に均一に混合した。微粒子製剤における脂質中の各成分比は、ＤＯＴＡＰを適度な範囲のモル分率として５０ｍｏｌ％又は６０ｍｏｌ％とし、Ｃ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ比を０：１００～１００：０とした。

　得られた各溶液を減圧濃縮することでクロロホルム又はエタノールを完全に除去した後、前記脂質を合わせた最終濃度が２ｍＭとなるようｐＨ　７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて、室温で１０分間静置した。超音波洗浄器（５５１０、ＢＲＡＮＳＯＮ社）を用いて室温で数分間処理して、粗分散液とした。さらに、この粗分散液を超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｃｓ　Ｖｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ　ＶＣＸ－７５０、Ｓｏｎｉｃｓ　＆　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．）を用いて２０％の振幅で３０秒間、２回超音波処理することによって、白濁又は薄く白濁した微粒子製剤Ｎｏ．１５～３０を調製した。これら微粒子製剤は、それぞれ０．５～１ｍＬの量で調製した。

　なお、同様な手順を用いて、Ｃ１７ＭＧＥの代わりにグリセリルモノオレート（ＧＭＯ、リケマールＸＯ－１００、日油株式会社）を用いること以外は微粒子製剤Ｎｏ．２０と同じ組成及び調製方法に従って、微粒子製剤（ＧＭＯ微粒子製剤）を調製した。しかしながら、このＧＭＯ微粒子製剤は、調製後少なくとも半日以内に凝集物が沈殿し、層分離した。したがって、本発明の微粒子製剤の調製において、Ｃ１７ＭＧＥに代わる脂質としてＧＭＯは適さないことが示された。

［実施例９］　微粒子製剤の物性評価
　実施例８で調製した微粒子製剤Ｎｏ．１５～３０の粒子径分布とゼータ電位を実施例３と同様に測定した。各測定サンプルについて、３回測定の平均値として得られた平均粒子径（ｎｍ）（Ｚ－Ａｖｅｒａｇｅ）、ＰｄＩ（多分散指数）、及びゼータ電位（ｍＶ）を表２、３に示す。

　非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０において、ＤＯＴＡＰの脂質中モル分率が５０ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％のいずれの場合も、Ｃ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ比でＣ１７ＭＧＥの割合が大きくなるほど、平均粒子径は大きくなる傾向にあり、またＰｄＩは大きくなり実際の製剤は不安定化する傾向にあった。ＤＯＴＡＰの脂質中モル分率が６０ｍｏｌ％でＣ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ＝１００：０の製剤Ｎｏ．３０は、前記傾向に反して、平均粒子径はより小さく、製剤はより安定であった。

　また、微粒子製剤Ｎｏ．１５～３０について、実施例３と同様に、小角エックス線散乱（ＳＡＸＳ）による構造解析を行った。Ｎｏ．１５の微粒子製剤から得られた散乱強度分布では、少なくとも３本の散乱ピークが観測された。ピークの比は逆ヘキサゴナル液晶に特有の比１：√３：２を示したことから、本製剤は逆ヘキサゴナル液晶の微粒子が水相に分散した液晶エマルション（ヘキサソーム）であることが示された。最も小角側に位置するピークの散乱ベクトル値は１．４２ｎｍ－１であった。一方、Ｎｏ．１６～３０の微粒子製剤においては、いずれも非ラメラ液晶に特有のピークは観測されなかった。

　微粒子製剤Ｎｏ．２７について、実施例３と同様に、クライオＴＥＭを用いて観察した。図８に微粒子製剤Ｎｏ．２７の倍率１５，０００倍における撮影画像を示した。１００ｎｍ以上のリポソーム様の膜構造（マルチラメラ）を有する微粒子が観察された。

［実施例１０］　蛍光色素による細胞内導入効果の検証
　ヒト表皮角化細胞株であるＨａＣａＴ細胞（３００４９３－ＳＦ、セルラインサービス社）を用いて、蛍光色素による薬物の細胞内導入効果を試験した。

　具体的には、まず、表３に示す微粒子製剤Ｎｏ．１６、２０、及び２３の成分比で各脂質のエタノール溶液を混合し、さらに脂質総量（Ｃ１７ＭＧＥ＋ＤＯＰＥ＋ＤＯＴＡＰ）に対して蛍光標識分子として０．５ｍｏｌ％分のローダミン－ＰＥ（８１０１５０、Ａｖａｎｔｉ　ｐｏｌａｒ　ｌｉｐｉｄ社）を添加し、ローダミン－ＰＥと前記脂質（Ｃ１７ＭＧＥ＋ＤＯＰＥ＋ＤＯＴＡＰ）の合計最終濃度が２ｍＭとなるよう実施例８と同様に操作することによって、微粒子製剤Ｎｏ．１６、２０、及び２３にそれぞれ対応する蛍光標識化した微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３を調製した。

　次いで、２４穴プレートの予めＨａＣａＴ細胞（４ｘ１０^４細胞／ウェル）を入れた４ウェルのうち３ウェルに対して、微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３のいずれかの各１０μＬを添加した。微粒子製剤を添加しない１ウェル（無処置）を合わせた４ウェルについて、３７℃、３時間インキュベート（５％ＣＯ_２雰囲気下）した後、蛍光標識分子の細胞内取り込み効率をフローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、ベックマンコールター社）で測定した。各測定において細胞数１０，０００カウントのデータを取得した。

　図９Ａは、横軸を蛍光標識分子による細胞内の蛍光強度［ａ．ｕ］、縦軸を細胞数とした、微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３添加群と無処置群における蛍光標識分子の細胞内取り込み量を示すグラフである。図９Ｂに、図９Ａから算出した無処置群の細胞内取り込み量に対する微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３添加群の蛍光標識分子の細胞内取り込み量の比率（細胞内取り込み効率）を示す。細胞内取り込み効率は、平均蛍光強度比＝製剤の蛍光強度/無処置の蛍光強度、として算出した。

　その結果、微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３添加群はいずれも無処置群に対して２倍程度、蛍光標識分子の細胞内取り込み効率が向上していた。よって、微粒子製剤Ｎｏ．３１～３３は、実施例２で調製した微粒子製剤同様に、細胞内に効率よく薬物を送達できることが示された。

［実施例１１］　核酸－微粒子複合体の調製及びその複合状態の評価
　実施例８で調製した微粒子製剤Ｎｏ．１５～３０に対して、ＥＧＦＰ遺伝子を含むプラスミド発現ベクター（ｐＤＮＡ）であるｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ（米国ＡｄｄｇｅｎｅよりＭＴＡ下にて供与された）をＮ／Ｐ比＝０．５、１、又は２で混和することにより、核酸－微粒子複合体を調製した。なお、Ｎ／Ｐ比は、微粒子製剤への核酸の導入割合を示し、微粒子製剤中のカチオン性脂質（ここでは、ＤＯＴＡＰ）量（ｍｏｌ）を核酸量（ｍｏｌ）で除算した値で表す。すなわち、Ｎ／Ｐ比が大きいほど、核酸に対するカチオン性脂質の割合が高い。

　Ｎ／Ｐ比０．５、１、又は２で核酸を混和した微粒子製剤Ｎｏ．１５由来の核酸－微粒子複合体及び微粒子製剤Ｎｏ．２０由来の核酸－微粒子複合体における核酸複合状態を、水平型電気泳動装置（Ｍｕｐｉｄ－ｅｘＵ、ミューピッド社）を使用した電気泳動により評価した。具体的には、核酸０．８μｇに相当する量でｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体と各核酸－微粒子複合体をロードし、０．７％アガロースゲルを用いて１００ｍＶで３０分泳動した後、エチジウムブロマイドで染色し、電気泳動像を得た。さらに、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いて、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体と、各核酸－微粒子複合体から遊離した核酸のバンドの輝度強度を求めた。

　図１０に、核酸－微粒子複合体の電気泳動像を示す。図１１に、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体のバンドの輝度強度に対する、核酸－微粒子複合体から遊離した核酸（ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ）のバンドの輝度強度の比を示す。この輝度強度比は小さいほど、核酸と微粒子の複合状態が強固であることを意味する。

　図１０及び１１に示されるように、微粒子製剤Ｎｏ．１５（Ａ）及びＮｏ．２０（Ｂ）由来の核酸－微粒子複合体のいずれも、Ｎ／Ｐ比の増大につれて複合状態で保持される核酸量が増加する傾向を示した。微粒子製剤Ｎｏ．１５由来の核酸－微粒子複合体は、複合状態の核酸を半分以上の割合で保持したことから、微粒子と核酸の相互作用は強いと考えられた。一方、微粒子製剤Ｎｏ．２０由来の核酸－微粒子複合体は、微粒子製剤Ｎｏ．１５由来の核酸－微粒子複合体と比べて遊離した核酸が多く検出されたことから、微粒子製剤Ｎｏ．１５由来の核酸－微粒子複合体よりも微粒子と核酸の相互作用は弱いことが示された。

　Ｃ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．１５及び２０由来の核酸－微粒子複合体は、核酸と微粒子の相互作用に強弱はあるものの、電気泳動後に複合体として保持されていることから、いずれも一定の環境下において生体利用性を有することが示された。

［実施例１２］　遺伝子発現による核内核酸導入効果の評価
　ヒト表皮角化細胞株であるＨａＣａＴ細胞（３００４９３－ＳＦ、セルラインサービス社）を用いて、遺伝子発現による核内核酸導入効果を評価した。

　この評価には、実施例１１で調製した、Ｎ／Ｐ比２でｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰを混和した微粒子製剤Ｎｏ．１５～３０由来の核酸－微粒子複合体（０．８μｇのｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰを含む量）、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体（０．８μｇ）、及び、市販の核酸導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^（Ｒ）２０００（１１６６８０２７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体の混合物（０．８μｇのｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^（Ｒ）４μＬを混合；　以下、ＬＦＮ２０００－核酸混合物と称する）を用いた。

　２４穴プレート中の予めＨａＣａＴ細胞を入れた各ウェル（４ｘ１０^４細胞／ウェル）に対して、微粒子製剤Ｎｏ．１５～３０由来の核酸－微粒子複合体、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体、又はＬＦＮ２０００－核酸混合物を添加し、３７℃で４０時間インキュベートした後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の一種であるＥＧＦＰの発現状態を蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、キーエンス社。レンズとしてＰｌａｎ　Ｆｌｕｏｒｉｔｅ　４×ＰＨを搭載）で観察した。

　図１２に、各製剤で処理した細胞の蛍光画像を示す。ネガティブコントロールであるｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体で処理した細胞ではＧＦＰが発現せず、ポジティブコントロールであるＬＦＮ２０００－核酸混合物で処理した細胞ではＧＦＰが強く発現した。非ラメラ液晶を含む微粒子製剤Ｎｏ．１５由来の核酸－微粒子複合体ではＧＦＰの発現はほとんど認められなかった。また、Ｃ１７ＭＧＥとＤＯＰＥのいずれかを含まず非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤Ｎｏ．１６及び２３由来の核酸－微粒子複合体ではＬＦＮ２０００－核酸混合物よりＧＦＰの発現強度は低かった。それに対して、Ｃ１７ＭＧＥとＤＯＰＥの両方を含み非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤Ｎｏ．２０由来の核酸－微粒子複合体ではＬＦＮ２０００－核酸混合物と同等のＧＦＰ発現強度が認められた。

　さらに、微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０由来の核酸－微粒子複合体のそれぞれ、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体については、処理細胞でのＧＦＰの発現状態を定量的に捉えるために、フローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、ベックマンコールター社）を用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析を行った。この解析では、４８８ｎｍのレーザー波長を使用し、データ解析ソフトＣｙｔｏＥｘｐｅｒｔを用いて、上述のように処理した各ウェル内のＨａＣａＴ細胞のＧＦＰ発現状態を調べた。

　図１３～１５に、横軸をＦＩＴＣの蛍光強度［ａ．ｕ］（ＧＦＰの蛍光を検出できる波長のフィルターによる蛍光強度）、縦軸にＦＳＣ（前方散乱光）強度［ａ．ｕ］として、各微粒子製剤由来の核酸－微粒子複合体又はｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体で処理したＨａＣａＴ細胞から得られたドットプロットを示す。ＦＳＣ強度は、細胞の直径に比例し、細胞の大きさを表す。ＦＩＴＣの蛍光強度が一定強度（閾値）以上のドットはＧＦＰを発現した細胞、一定強度（閾値）未満のドットはＧＦＰを発現していない細胞を表している。閾値は、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体については４０００、微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０由来については５０００とした。細胞固有の母集団から大きく外れたドットは死細胞など状態が悪い細胞としてＧＦＰ発現有無のカウントから除外した。

　ＦＡＣＳ解析の結果、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体で処理したＨａＣａＴ細胞におけるＧＦＰ発現の割合（ＧＦＰ発現細胞割合）は０．０４％であったのに対し、微粒子製剤Ｎｏ．１６～３０由来の核酸－微粒子複合体で処理したＨａＣａＴ細胞におけるＧＦＰ発現細胞割合は向上した（表４）。

　脂質中モル分率が５０ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰを含む微粒子製剤Ｎｏ．１６～２３由来の核酸－微粒子複合体においては、Ｃ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ＝５０：５０の微粒子製剤Ｎｏ．２０由来の核酸－微粒子複合体のＧＦＰ発現細胞割合が最も高く（１７．２％）、ｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単体と比べて格段に向上した。一方、Ｃ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ＝０：１００の微粒子製剤Ｎｏ．１６由来の核酸－微粒子複合体のＧＦＰ発現細胞割合は低かった（７．９％）。

　また、脂質中モル分率が６０ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰを含む微粒子製剤Ｎｏ．２４～３０由来の核酸－微粒子複合体においては、Ｃ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ＝５０：５０の微粒子製剤Ｎｏ．２７由来の核酸－微粒子複合体、及び、平均粒子径が小さく安定なＣ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ＝１００：０の微粒子製剤Ｎｏ．３０由来の核酸－微粒子複合体のＧＦＰ発現細胞割合が高く、それぞれ、１８．８％、２２．６％であった。一方、平均粒子径が小さく安定なもののＣ１７ＭＧＥ：ＤＯＰＥ＝０：１００の微粒子製剤Ｎｏ．２４由来の核酸－微粒子複合体のＧＦＰ発現細胞割合は低かった（９．０％）。

　よって、ＤＯＴＡＰの脂質中モル分率が５０ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％のいずれの場合も、細胞中でのＧＦＰ発現の誘導にはＣ１７ＭＧＥが必須であるとともに、小さい平均粒子径と高い製剤安定性が重要であることが示された。

　実施例１１、１２の結果より、Ｃ１７ＭＧＥを含み非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤（例えば、特に、Ｎｏ．１９～２２、２６、２７、及び３０）は、遺伝子発現の誘導に有用であることが示された。他の微粒子製剤由来の核酸－微粒子複合体では、核内への核酸導入効果（遺伝子発現効果）はないかほとんどなかった。

　以上の結果から、Ｃ１７ＭＧＥのようなイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を含み非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤は、複合体化した核酸を細胞内（特に、細胞核内）に導入することができ、遺伝子送達及び遺伝子発現に有用であることが明らかとなった。したがって、Ｃ１７ＭＧＥのようなイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を含み非ラメラ液晶を含まない微粒子製剤は、核酸送達システムに利用することができ、例えば遺伝子治療用の医薬製剤の製造に有用である。

［実施例１３］　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質の合成
（１）モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカノイル）グリセロールの合成

　窒素雰囲気下、モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）グリセロール２０．６ｇ（５０．０ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（６２ｍＬ）溶液に５％パラジウム炭素２．５ｇを添加した。系内の窒素を水素で置換した後、常圧水素雰囲気下、室温で４２時間撹拌した。系内の水素を窒素で置換した後、５％パラジウム炭素をろ別した。ろ液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精製することにより、表題の化合物２０．２ｇ（収率９８％）を無色透明液体として得た。得られた化合物について、^１Ｈ－ＮＭＲ測定を行った結果は以下の通りである。

　^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ：０．７－０．９（ｍ，１５Ｈ），０．９５－１．７５（ｍ，２６Ｈ），２．１３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＯＨ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．５６（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，ＯＨ），３．５５－３．７５（ｍ，２Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）

　モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカノイル）グリセロールを、飽和Ｃ２２ＭＧＥとも称する。

（２）モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタンの合成

　５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エン酸メチル７０．５ｇ（２００ｍｍｏｌ）及び９０重量％ソルビタン水溶液５４．７ｇ（３００ｍｍｏｌ、ソルビタンＭ－９０、三光化学工業株式会社、固形分９０％に水分１０％を含む、固形分中の含有量：ソルビタン７９～８４％、イソソルバイド１５～１８％）を反応容器に室温で添加した後、１２０℃、８ｋＰａで１時間撹拌した。窒素で減圧解除してナトリウムメトキシド２．２ｇ（４０ｍｍｏｌ）及びホスフィン酸ナトリウム一水和物０．０４ｇを加えた後、１６０℃、８ｋＰａで１時間撹拌した。窒素で減圧解除してナトリウムメトキシド１．１ｇ（２０ｍｍｏｌ）を添加した後、さらに１６０℃、８ｋＰａで１時間撹拌した。窒素で減圧解除して再びナトリウムメトキシド１．１ｇ（２０ｍｍｏｌ）を添加した後、さらに１６０℃、８ｋＰａで１．５時間撹拌した。６０℃まで冷却した後、酢酸エチル２００ｍＬ、０．５Ｍ塩酸２００ｍＬを撹拌しながら添加した。得られた反応液に酢酸エチル６００ｍＬを添加して、抽出した。抽出液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：酢酸エチル／ヘキサン混液）で精製することにより、表題の化合物を含む画分３６．１ｇ（収率３７％）を薄茶色透明液体として得た。得られた画分は、約８：２の割合（重量比）でモノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタンとモノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）イソソルバイドを含んでいた（イオンモードＥＩ＋でのＧＣ－ＭＳ測定によるＴＩＣの面積値から算出）。得られた画分は、さらに、ソルビタン由来のジエステル体を少量含んでいた（ＧＣ－ＭＳ測定とＴＬＣ分析による推測）。得られた画分について、^１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果は以下の通りである。

　^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ：０．７－０．９（ｍ，１２Ｈ），０．９－１．８（ｍ，２２Ｈ），１．８５－２．０（ｍ，２Ｈ），２．０－２．５（ｍ，４Ｈ），３．５－４．９（ｍ，６．４Ｈ），５．０４（ｍ，１Ｈ），５．０－５．２（ｍ，０．６Ｈ）

　モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタンを、Ｃ２２ＳＯＥとも称する。

　得られた画分を、後述の実施例においてモノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタン画分（Ｃ２２ソルビタンエステル画分）として用いた。

（２）モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）プロピレングリコールの合成

　６０～７０ｍｍＨｇの減圧かつ窒素気流下、プロピレングリコール２０．６ｇ（２７１ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム０．２１１ｇ（１．５３ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６０ｍＬ）溶液に、８５℃で５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エン酸メチル３０．０ｇ（８５．０ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し、同一温度で３時間撹拌した。得られた反応溶液を酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒（１：１，１２０ｍＬ）で希釈し、水、飽和重曹水、飽和食塩水（２回）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後濃縮することによって得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：ヘキサン／酢酸エチル＝１００：０～７０：３０）で精製することにより、表題の化合物２１．６ｇ（収率６３％）を薄黄色透明液体として得た。得られた化合物について、^１Ｈ－ＮＭＲ測定を行った結果は以下の通りである。

　^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ：０．８０－０．９５（ｍ，１２Ｈ），０．９５－１．７０（ｍ，２５Ｈ），１．９６（ｔｄ，Ｊ＝７．５，１８Ｈｚ，２Ｈ），２．１（ｂｒｓ，ＯＨ），２．２５－２．４２（ｍ，４Ｈ），３．５５－３．７０（ｍ，０．７Ｈ），３．８５－４．１５（ｍ，１．９５Ｈ），４．９８（ｍ，０．３５Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）

　モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）プロピレングリコールを、Ｃ２２ＰＧＥとも称する。

［実施例１４］　微粒子製剤の調製及び物性評価
　微粒子製剤Ｎｏ．４の組成（表１）中のＣ１７ＭＧＥを飽和Ｃ２２ＭＧＥ、Ｃ２２ＳＯＥ、又はＣ２２ＰＧＥ（いずれもイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質）に置き換えたこと以外は、実施例２に記載した微粒子製剤Ｎｏ．４の調製方法に従って、後掲の表５に示す微粒子製剤Ｎｏ．３４～３６を調製した。

　さらに、実施例３と同様の方法で、微粒子製剤Ｎｏ．３４～３６の粒子径分布、及びゼータ電位を、ゼータサイザーＮａｎｏ－ＺＳ（マルバーン社）を使用した動的光散乱法により測定した。各測定サンプルについて、５～６回測定の平均値として得られた平均粒子径（ｎｍ）（Ｚ－Ａｖｅｒａｇｅ）、ＰｄＩ（多分散指数）、及びゼータ電位（ｍＶ）を表５に示す。

［実施例１５］　微粒子製剤の加温による細胞障害性への影響の評価
　微粒子製剤Ｎｏ．４及び３４～３６のいずれかの存在下、加温あり又は加温なしの条件下で、細胞から培地中に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定することによって、それらの微粒子製剤の加温による細胞障害性への影響を評価した。ＬＤＨ活性の測定には、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ＬＤＨ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ－ＷＳＴ（同仁化学研究所）を用いた。

　具体的には、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（ＪＣＲＢ１４４７、ルシフェラーゼ発現乳癌細胞株）を、１０枚の３５ｍｍディッシュに播種（１．５ｘ１０^５細胞／ディッシュ）し、３７℃で一終夜インキュベートした。次いで、微粒子製剤Ｎｏ．４及び３４～３６を製剤当たりディッシュ２枚ずつ、各１００μＬ添加した。各微粒子製剤を添加した２枚のディッシュのうち、一方のディッシュには近赤外線（波長９８０ｎｍ、出力１．５Ｗ。レーザーＦＣ－Ｗ－９８０－１．５Ｗ（Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｎｅｗ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｔｅｃｈ．　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．）を使用）を２０分間照射して「加温あり」のサンプルとし、他方のディッシュには当該照射をせずに３７℃でのインキュベートのみをさらに２０分間実施して「加温なし」のサンプルとした。なお、近赤外線を少なくとも２０分間照射することでディッシュ内の液体培地の温度は４５℃以上に上昇した。

　続いて、各ディッシュの上清１００μＬを９６穴プレートの別々のウェルに移し替えた。発色反応のため、上記キットの使用説明書に従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。各ウェルに上記キットに付属のＳｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬずつ加えて発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｍａｘ^（Ｒ）Ｍ２ｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＤＥＶＩＣＥＳ社）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。また、コントロールとして、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞に微粒子製剤を添加せず、上記の近赤外線による加温も行わない試料（微粒子製剤無添加で、加温なし）、及び、４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞に微粒子製剤の代わりにＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、上記の近赤外線による加温を行わない試料（細胞中の全ＬＤＨ活性を示す）についても、上記と同様にしてＬＤＨ活性を測定した。

　細胞障害割合［％］は以下の式で算出した。
細胞障害割合［％］＝［（微粒子製剤を添加した、加温あり又はなしの試料の吸光度）－（微粒子製剤無添加で、加温なしの試料の吸光度）］／［（Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを添加した、加温なしの試料の吸光度）－（微粒子製剤無添加で、加温なしの試料の吸光度）］ｘ１００

　加温による細胞障害性の増加量は、以下の式で算出した。
加温による細胞障害性の増加量［ｐｔ］＝（微粒子製剤を添加した、加温ありの試料の細胞障害割合［％］）－（微粒子製剤を添加した、加温なしの試料の細胞障害割合［％］）

　結果を表６に示す。

　以上の結果に示されるように、実施例６の結果と同様に、Ｃ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．４では、加温によって、細胞障害割合が顕著に増加した。また、飽和Ｃ２２ＭＧＥ、Ｃ２２ＳＯＥ、又はＣ２２ＰＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．３４～３６でも、加温による細胞障害割合の増加が認められた。本願発明の微粒子製剤は抗腫瘍剤を封入しなくてもリポソームのみで抗腫瘍効果をもたらすことが示された。

［実施例１６］　微粒子製剤のｉｎ　ｖｉｖｏ投与による抗腫瘍効果
　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質としてＣ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤に、抗腫瘍剤としてドキソルビシン塩酸塩（ＤＸＲ）を封入して、担癌マウスに対するその抗腫瘍効果を評価した。

　具体的には、以下のようにして、ＤＸＲを封入した、Ｃ１７ＭＧＥを含まない又はＣ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．３７及び３８（表６）を調製した。まず、表１の微粒子製剤Ｎｏ．１又は４と同じ成分比に従い、各脂質のエタノール溶液を混合した後、減圧濃縮することによりエタノールを除去し、薄膜を作製した。次いで、上記脂質（総量）の最終濃度が１ｍＭとなるように２５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加えて、室温で１０分間静置した。得られた試料溶液を、実施例２と同様にして超音波処理をすることによって、薄く白濁した各微粒子製剤を調製した。次いで、各微粒子製剤を８０，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離（ＣＳ１２０ＧＸ、日立工機）し、分離した水溶液を除去した後、上記脂質（総量）の濃度が１０ｍＭとなるよう１０％スクロース水溶液で再分散させ、さらに、得られた再分散液の０．７倍量のＤＸＲ（２ｍｇ／ｍＬ）の１０％スクロース水溶液を添加して、６０℃で１時間インキュベートした。ＤＸＲを添加した再分散液を、再度、８０，０００ｒｐｍ、３０分間、室温で遠心分離し、分離した水溶液（「水溶液Ａ」）を除去した後、上記脂質（総量）の最終濃度が１０ｍＭとなるようにＰＢＳ（－）で再分散させることによって、微粒子製剤Ｎｏ．３７及び３８を調製した。実施例３と同様の方法で、微粒子製剤Ｎｏ．３７及び３８の粒子径分布、及びゼータ電位を、ゼータサイザーＮａｎｏ－ＺＳ（マルバーン社）を使用した動的光散乱法により測定した。微粒子製剤Ｎｏ．３７及び３８のＤＸＲ濃度（ｍｇ／ｍＬ）、平均粒子径（ｎｍ）（Ｚ－Ａｖｅｒａｇｅ）、ＰｄＩ（多分散指数）、及びゼータ電位（ｍＶ）を表７に示す。

　また、コントロールとして、ＤＸＲ濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ（－）溶液を製剤Ｎｏ．３９、及びＤＸＲを含まない単なるＰＢＳ（－）溶液を製剤Ｎｏ．４０として調製した。

　なお微粒子製剤Ｎｏ．３７及び３８中のＤＸＲ濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、上記のとおり分離・除去した水溶液（「水溶液Ａ」）中のＤＸＲ量をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて定量し、その定量値を添加したＤＸＲ量から差し引いた値に基づき算出した。分離・除去した水溶液（「水溶液Ａ」）中のＤＸＲ量は、内部標準物質としてパラオキシ安息香酸ブチルの移動相溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を１／２０容量添加し、内部標準物質のピーク面積に対するＤＸＲのピーク面積の比を用い、検量線に基づいて定量した。分析条件は、以下の通りである。

・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ^（Ｒ）　ＯＤＳ－３　内径４．６ｍｍ，長さ２５ｃｍ，粒子径５μｍ（ジーエルサイエンス株式会社）
・移動相：０．３％ラウリル硫酸ナトリウム／０．１４％リン酸水溶液：アセトニトリル＝１：１
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃、注入量：１０μＬ
・検出器；紫外吸光光度計（２５４ｎｍ）

　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢）に腫瘍細胞として４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞（ＪＣＲＢ１４４７、１ｘ１０^６細胞）を背部の左右２カ所に皮下移植して１２日間経過した担癌マウスを用意した。この担癌マウスに対して、製剤Ｎｏ．３７～４０を投与するとともに、腫瘍移植部位を加温し、抗腫瘍効果を評価した（ｎ＝３）。

　具体的には、試験の初日（０日目）に腫瘍移植部位の発光強度の測定を行い、試験の１、４、７、及び１０日目に製剤を投与し、２、５、８、及び１１日目に腫瘍移植部位の加温を行い、３、６、９、及び１２日目に腫瘍移植部位の発光強度の測定を行った。また試験期間中、腫瘍移植部位の腫瘍体積の測定、マウスの体重測定、及び外観の観察を行った。

　製剤投与は、担癌マウスにイソフルランで全身麻酔を施行した後、２９ゲージ（Ｇ）の針を備えたシリンジ（テルモシリンジ１ｍＬ）を用いて、１００μＬの製剤を尾に静脈投与（１日１回）することにより行った。

　腫瘍移植部位の腫瘍体積の測定は、腫瘍の短径と長径をノギスで測定し、下記式に従って各マウスの背部左右２カ所の腫瘍移植部位の腫瘍体積（ｍｍ^３）を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝［（短径）^２ｘ（長径）］／２

　腫瘍移植部位の加温は、全身麻酔を施行した状態の各マウス背部左側の腫瘍移植部位に対して、実施例１５と同様の方法で近赤外線（波長９８０ｎｍ、出力１．５Ｗ）を３０秒間照射して約４５℃まで加温することによって行った。各マウス背部右側の腫瘍移植部位には加温しなかった。

　抗腫瘍効果の評価のための、腫瘍移植部位の発光強度の測定は、ＶｉｖｏＧｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐ１０４３、プロメガ社）の３０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水溶液１００μＬをマウスの腹腔内に投与し、その１６分後に蛍光発光イメージング装置（ＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で、背部左右２カ所の腫瘍移植部位における発光強度（Ｔｏｔａｌ　Ｆｌｕｘ［ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ］）を測定した。測定条件は、オープンフィルター（全波長域）、ｂｉｎｎｉｎｇ＝ｍｅｄｉｕｍ、ｆ／ｓｔｏｐ＝１であった。この方法で測定される発光強度は、細胞が発現するルシフェラーゼの活性レベルを示しており、すなわち、生存細胞の量を示す。

　図１６に、製剤Ｎｏ．３７～４０を投与したマウスの試験６日目のマウス全体の発光イメージング画像を示す。図１７に、背部左右２カ所の腫瘍移植部位の発光強度を経時的に測定した結果を表したグラフを示す。

　表８に、背部左右２カ所の腫瘍移植部位の発光強度の初日（０日目）から１２日目までの増加量を示す。表８に示した加温による増加抑制率（％）は以下のように算出した：
加温による増加抑制率（％）＝［（加温なしの増加量）－（加温ありの増加量）］／（加温なしの増加量）ｘ１００

　表８に示されるとおり、ＤＸＲ及びＣ１７ＭＧＥを含む微粒子製剤Ｎｏ．３８は、背部左右２カ所の腫瘍移植部位のいずれにおいても腫瘍増殖を大きく抑制し、特に、加温した背部左側の腫瘍移植部位において腫瘍増殖を最も大きく抑制した。ＤＸＲ単独を含むＰＢＳ溶液の製剤Ｎｏ．３９も腫瘍増殖を抑制したが、微粒子製剤Ｎｏ．３８よりも抑制レベルは低かった。ＤＸＲを含むがＣ１７ＭＧＥを含まない微粒子製剤Ｎｏ．３７は腫瘍増殖を十分抑制しなかった。そして加温による増加抑制率に示されるとおり、腫瘍増殖抑制に対する加温効果は、微粒子製剤Ｎｏ．３８で顕著に大きかった。

　腫瘍体積の測定結果から見ても、微粒子製剤Ｎｏ．３８を投与した場合、試験の初日（０日目）から１２日目までの腫瘍移植部位の腫瘍体積の増加量（ｍｍ^３）は、背部左（加温あり）の腫瘍移植部位で１１０ｍｍ^３、背部右（加温なし）の腫瘍移植部位で３２３ｍｍ^３であり、加温により腫瘍体積の増加量が大きく抑制されたことが示された。製剤Ｎｏ．３９はＤＸＲにより正常細胞も強く攻撃してしまうのに対し、製剤Ｎｏ．３８はＤＸＲがリポソーム内に保持されており、また腫瘍細胞に集積しやすい性質を有するため、正常細胞に対する安全性がより高いという点でも、高い優位性を有する。

　なお、本評価試験を通じてマウスの体重及び外観的な異常は観察されなかった。

　以上の結果より、ＤＸＲのような抗腫瘍剤とＣ１７ＭＧＥのようなイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を含む微粒子製剤は、ｉｎ　ｖｉｖｏ投与において、腫瘍細胞への組織集積性を有するだけでなく（実施例７）、腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を示し、加温を併用することによってその抗腫瘍効果をより顕著に増強できることが示された。

　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

　ラメラ形成脂質とイソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質とを膜構成脂質として含むリポソーム。
　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質が、下記一般式（Ｉ）で表される両親媒性化合物である、請求項１に記載のリポソーム。

（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子を表すか又は一緒になって酸素原子を表し、ｎは０～２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、

は一重結合又は二重結合を表し、Ｒは１つ以上の水酸基を有する親水性基を表す）
　前記式中のＲがグリセロール、ソルビタン、又はプロピレングリコールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表す、請求項２に記載のリポソーム。
　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質が、モノＯ－（５，９，１３－トリメチルテトラデカ－４－エノイル）グリセロール、モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカノイル）グリセロール、モノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）ソルビタン、又はモノＯ－（５，９，１３，１７－テトラメチルオクタデカ－４－エノイル）プロピレングリコールである、請求項１～３のいずれか１項に記載のリポソーム。
　ラメラ形成脂質がリン脂質、ステロイド及びカチオン性脂質からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のリポソーム。
　ラメラ形成脂質が水溶性高分子で修飾されたリン脂質を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のリポソーム。
　ラメラ形成脂質が、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のリポソーム。
　ラメラ形成脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、及び１，２－ジアルキルカルボニルオキシ－３－モノ、ジ又はトリアルキルアンモニウムプロパンを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のリポソーム。
　イソプレノイド型脂肪鎖を有する両親媒性脂質を、膜構成脂質総量に対するモル分率で５～４０ｍｏｌ％となる量で含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のリポソーム。
　温度応答性である、請求項１～９のいずれか１項に記載のリポソーム。
　薬物をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のリポソーム。
　薬物が核酸である、請求項１１に記載のリポソーム。
　核酸とリポソームが複合体を形成している、請求項１２に記載のリポソーム。
　請求項１１～１３のいずれか１項に記載のリポソームを含む、細胞内への薬物送達用製剤。
　請求項１２又は１３に記載のリポソームを含む、細胞の核内への核酸送達用製剤。
　細胞が腫瘍細胞である、請求項１４又は１５に記載の製剤。
　請求項１～１３のいずれか１項に記載のリポソームを含む、医薬製剤。
　抗腫瘍製剤である、請求項１７に記載の医薬製剤。