KR20200018782A - siRNA 세포 내 송달을 위한 지질막 구조체 - Google Patents

siRNA 세포 내 송달을 위한 지질막 구조체 Download PDF

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히데요시 하라시마
유스케 사토
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국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
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Abstract

이 지질막 구조체는, 지질 성분으로서 식 (I): (R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X〔식 중, a는 3 내지 5의 정수를 나타내고; b는 0 또는 1의 정수를 나타내고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 -CO-O-를 가지고 있어도 되는 직쇄상 탄화수소기를 나타내고; X는 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기 또는 하기의 식 (B)(식 중, d는 0 내지 3의 정수를 나타내고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기를 나타낸다. R3 및 R4는 서로 결합하여 5 내지 7원 비방향족 헤테로환(당해 환 상에는 1 또는 2개의 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기가 치환되어 있어도 됨)을 형성해도 됨)로 표시되는 기를 나타냄〕의 지질 화합물을 포함하는 지질막 구조체이다.

Description

siRNA 세포 내 송달을 위한 지질막 구조체
본 발명은 siRNA(short interfering RNA; 짧은 간섭 RNA) 등의 세포 내 송달을 위한 지질막 구조체에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 면역 세포의 핵 내, 특히 수지상 세포의 세포 내에 siRNA 등을 용이하게 송달할 수 있는 리포솜 등의 지질막 구조체에 관한 것이다.
본원은, 2017년 6월 15일에, 일본에 출원된 일본 특허 출원 제2017-117708호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
약제를 환부에 특이적으로 수송하는 수단으로서 지질막 구조체인 리포솜에 약제를 봉입하는 방법이 제안되어 있다. 특히, 악성 종양의 치료 분야에 있어서 항종양제를 봉입한 리포솜의 유효성이 수많이 보고되어 있다. 또한, 유전자 발현에 이용 가능한 지질막 구조체로서 다기능성 엔벨로프형 나노 구조체(MEND: Multifunctional envelope-type nano device; 이하, 본 명세서에 있어서 「MEND」라고 생략하는 경우가 있다. 예를 들어 비특허문헌 1 등을 참조)가 제안되어 있다. 이 구조체는, 유전자 등을 특정한 세포 내에 선택적으로 송달하기 위한 약물 전달 시스템으로서 사용할 수 있으며, 예를 들어 종양의 유전자 치료 등에 유용하다는 것이 알려져 있다.
지질막 구조체를 사용하여 약물, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 당 등의 목적 물질을 표적 장기나 종양 조직 등 특이적인 부위에 송달하기 위한 수단으로서, 지질막 구조체의 표면을 기능성 분자로 수식하는 방법이 다수 제안되어 있다. 항종양제 등의 약제를 내포한 지질막 구조체는, 표적 세포에 도달하면 엔도사이토시스에 의해 세포 내에 도입되어서 엔도솜 내에 포함된 상태로 되고, 그 후, 리소좀의 효소에 의한 가수분해 작용 등을 받아서 내포되어 있던 약제를 세포질 내에 방출한다. 엔도솜 내에 도입된 리포솜으로부터의 약제 방출성을 높이기 위해서, 리포솜의 표면을 펩티드(GALA: 비특허문헌 2)로 수식한 리포솜(비특허문헌 3)이나 MEND(특허문헌 4)가 제안되어 있다.
또한, 핵산 등의 목적 물질을 내포한 지질막 구조체를 표적 세포의 핵 내로 이행시키기 위한 수단으로서는, 예를 들어 리포솜의 외측 표면을 옥타아르기닌으로 수식한 리포솜(특허문헌 1, 비특허문헌 4), 핵 이행성 펩티드로 수식된 지질막을 갖는 2매 막 리포솜(특허문헌 2), 갈락토오스나 만노오스 등의 단당으로 표면을 수식한 리포솜(특허문헌 3)이 제안되어 있다. 단당으로 수식된 다중 지질막 구조체(T-MEND)는 지질막 및 핵막과 융합성을 나타내고, 시험관내(in vitro)에서의 시험 결과에 있어서 유전자 발현 효율을 개선할 수 있었다고 보고되어 있다. 또한, KALA 펩티드(비특허문헌 5)에 의해 수식된 지질막 구조체가 세포의 핵 내에 핵산 등의 물질을 효율적으로 송달할 수 있다는 것이 보고되어 있다(특허문헌 5).
한편, 수지상 세포는, 면역 응답의 중심을 담당하고 있는 항원 제시 세포라는 점에서, 암 면역 요법의 중요한 표적 세포의 하나다. 암 환자에게서 수지상 세포를 채취하여, 체외에서 항원 도입이나 활성화를 행한 후, 다시 그 환자에게 투여하는 면역 세포 요법(수지상 세포 요법)도 행해지고 있다. 근년, 수지상 세포에 있어서의 면역 제어 인자가 알아내졌다는 점에서, 수지상 세포는 siRNA 의약의 표적으로서도 주목을 모으고 있으며, 수지상 세포 요법을 면역 요법과 조합함으로써, 보다 강력한 암 면역 유도를 실시할 수 있다고 기대되고 있다.
종래, 수지상 세포의 핵 내로의 RNA 도입에 관해서, shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 면역 제어 인자를 녹다운하였다는 보고(비특허문헌 6, 비특허문헌 7)는 있다. 그러나, 인공 전달 시스템을 사용한 수지상 세포로의 siRNA 도입의 보고는 거의 없다. 바이러스 벡터의 사용은 표적 유전자의 고효율 녹다운을 실현 가능하지만, 안전면에 문제가 있다.
siRNA 도입용의 인공 전달 시스템으로서 R8/GALA-D-MEND(D-MEND)가 보고되어 있다(비특허문헌 8). D-MEND는, 세포 친화성 소자인 옥타아르기닌(R8) 펩티드와 엔도솜 탈출성 소자인 GALA 펩티드를 MEND에 수식하고, MEND의 엔벨로프막 매수를 제어한 나노 캐리어이다. D-MEND는, 일반적으로 사용되는 암세포인 HeLa 세포에 있어서는 siRNA 농도가 12 nM이라는 저농도에서 약 70％의 녹다운을 나타내어, 그 활성은 일반 도입 시약으로서 범용되고 있는 리포펙타민 2000(LFN2000)과 비교하여 2배 이상의 활성을 나타낸다.
그러나, 마우스 골수 세포로부터 유도된 수지상 세포에 D-MEND로 트랜스펙션을 행하는 경우에는, 70-80％의 녹다운 효율을 달성하기 위해서 siRNA 농도를 고농도(80-120 nM)로 할 필요가 있고, siRNA의 표적 인자에 따라서는 40％ 정도의 녹다운 효율에 머무른다는 문제도 있다(비특허문헌 9). 이와 같이 종래의 인공 전달 시스템을 사용한 경우에는, 일반적인 암세포에 비해서 수지상 세포에 있어서의 녹다운 효율은 크게 저하되는 경향이 있어, siRNA 의약의 면역 요법 분야로의 전개를 방해하고 있다.
지금까지, 기능성 핵산, 특히 특정한 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 siRNA의 효율적인 생체내(in vivo) 송달을 달성할 목적으로, 많은 양이온성 지질이 개발되어 있다. 특히, 생리적 pH에서는 전기적으로 중성이며, 엔도솜 등의 약산성 pH 환경 하에서는 양이온성으로 변화되는 pH 감수성 양이온성 지질의 개발은 현저하다. Jayaraman 등은 DLin-MC3-DMA를 개발하고, 마우스 간장에 있어서의 제7 인자(F7) 녹다운에 있어서 ED50에서 0.005 ㎎ siRNA/kg을 달성하였다(비특허문헌 10). 본 발명자들도 지금까지 독자의 pH 감수성 양이온성 지질 YSK05 및 YSK13-C3을 개발하고 있으며, F7 녹다운에 있어서의 ED50으로서 각각 0.06, 0.015 ㎎ siRNA/kg을 달성하고 있다(비특허문헌 11, 비특허문헌 12, 비특허문헌 13). 또한, Maier 등은 MC3-DMA에 생분해성을 부여한 L319를 개발하여, ED50에서 0.01 ㎎ siRNA/kg과 높은 안전성의 양립에 대해서 보고하고 있다(비특허문헌 14, 비특허문헌 15, 비특허문헌 16). 그러나, 이들 상기 지질을 포함하는 지질 나노 입자의 엔도솜 탈출 효율은 아직 수％ 정도에 불과하다는 것이 밝혀져 있어(비특허문헌 17), 생체이용률을 더욱 향상시키는 것이 가능한 기술의 개발이 요망되고 있다.
또한, Dong 등은 고처리량 스크리닝을 통하여 독자의 지질 유사 물질 cKK-E12를 알아내어, F7 녹다운에 있어서 ED50에서 0.002 ㎎ siRNA/kg을 달성하였다(비특허문헌 18). 당해 기술은 활성의 면에서는 문헌상 가장 우수하지만, 고투여량에 있어서의 독성이나 지질의 생분해성 등의 안전면에 있어서의 지견은 없다.
근년, 많은 암 조직, 특히 인간 환자 암 조직은, 콜라겐을 비롯한 간질 성분이 매우 풍부하고, 그것들 성분이 암 조직 내에 있어서의 나노 입자의 침투성을 현저하게 방해한다는 것이 밝혀지고 있다. 나노 입자의 소형화는 이 문제를 해결하기 위한 매우 유효한 전략으로서 생각되고 있다. 실제로, Cabral 등은, 백금 제제 내봉 고분자 미셀의 직경을 약 30 ㎚로 작게 제어함으로써 암 조직 내 침투성이 향상되고, 항종양 효과가 향상된다는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 19). siRNA 송달에 있어서도 마찬가지의 전략이 매우 유효하다고 생각되지만, 지질 나노 입자(Lipid Nanoparticle: LNP)를 작게 제어하는 것은 기술적으로 어렵고, 보고는 매우 부족하다. 2액의 순간 혼합을 달성 가능한 마이크로 믹서 내장 마이크로 유로를 사용함으로써 직경 30 ㎚ 정도의 LNP를 고재현으로 제조 가능한 것이, 근년 보고되었다(비특허문헌 20, 비특허문헌 21). 한편, LNP를 소형화함으로써, 그 siRNA 송달 활성은 현저하게 감소한다는 것이 알아내져 있다(비특허문헌 22, 비특허문헌 23). 이 문제를 극복하는 것은 우수한 암 치료용 siRNA 송달 기술을 실현하는 데 있어서 극히 중요한 한편, 그 극복법에 관한 지견은 현시점에서 전무하다.
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본 발명의 과제는, 세포, 특히 항원 제시능을 갖는 수지상 세포와 같은 면역 세포의 세포 내에 siRNA 등을 효율적으로 송달하기 위한 수단을 제공하는 데 있다. 보다 구체적으로는, 수지상 세포 등의 면역 세포를 비롯한 각종 세포의 세포 내에, siRNA를 효율적으로 송달할 수 있는 지질막 구조체, 및 당해 지질막 구조체의 제조에 유용한 신규 화합물을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
특히, siRNA 등의 우수한 송달 효율과 높은 안전성을 양립시켜, LNP의 입자경의 감소에 수반하는 siRNA 등의 송달 활성의 저하의 극복을 가능하게 하는 신규 화합물 및 지질막 구조체를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
본 발명자들은, 우선, 면역 세포, 특히 항원 제시능을 갖는 수지상 세포에 있어서의 표적 유전자의 효율적인 녹다운을 실현하기 위해, 세포 내에 siRNA를 효율적으로 송달하기 위한 수단을 예의 검토하였다. 그 결과, MEND 등의 지질막 구조체의 형성에 있어서, 2개의 지방산쇄에 2개의 불포화 결합을 갖고, 친수부의 탄소쇄를 신장함으로써 pKa를 높인 YSK12 등의 지질 화합물을 지질 성분으로서 사용하면 매우 높은 엔도솜 탈출성이 달성된다는 것을 알아냈다. 또한, 이 지질 화합물을 포함하는 지질 조성물로 조제한 지질막 구조체에서는 siRNA에 의한 표적 유전자 녹다운을 극히 효율적으로 행하는 것이 가능하다는 것도 알아냈다(비특허문헌 24, 특허문헌 6). 이 지질막 구조체를 사용하여 SOCS1을 녹다운한 수지상 세포에서는, 사이토카인 산생의 현저한 증강이 보이고, 이 수지상 세포를 투여한 마우스 군에서는, 이식한 종양의 생착·증식이 완전히 억제된다.
본 발명자들은, 또한 YSK12의 구조를 기초로 하고, siRNA 등의 세포로 송달하는 목적의 물질(이하, 「송달 대상 물질」이라고 하는 경우가 있음)의 더욱 우수한 송달 효율과 높은 안전성을 양립시켜, LNP의 입자경의 감소에 수반하는 송달 대상 물질의 송달 활성의 저하의 극복을 가능하게 하는 신규 화합물 및 지질막 구조체를 제공하기 위해, 생분해성과 우수한 엔도솜 탈출능, 및 LNP의 안정화능을 부여할 수 있는 신규 화합물을 예의 검토하였다. 그 수단으로서, 먼저, YSK12의 제3급 수산기 부위로부터 2개의 적당한 길이의 탄화수소쇄를 신장시켜, 에스테르 결합을 통해 중쇄 내지 장쇄 지방산을 결합시켰다. 이에 의해, 소수성 기반의 쇄 길이의 증대에 의한 엔도솜 탈출능의 향상, 지질 분자 간의 소수성 상호 작용의 증대에 의한 LNP 안정화능의 부여, 및 생분해성의 부여를 도모하였다. 또한, LNP의 동태에 큰 영향을 주는 파라미터로서의 pH 감수성 지질의 산 괴리 상수(pKa)를 조절하기 위해서, 친수성 부위인 아미노기 주위의 화학 구조의 최적화를 도모하였다. 그 결과, 하기의 식 (I)로 표시되는 화합물이 원하는 성질을 가지고 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 의해, 하기의 식 (I):
Figure pct00001
〔식 중, a는 3 내지 5의 정수를 나타내고; b는 0 또는 1의 정수를 나타내고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기의 식 (A):
Figure pct00002
(식 중, q는 1 내지 9의 정수를 나타내고; r은 0 또는 1을 나타내고; s는 1 내지 3의 정수를 나타내고; t는 0 또는 1을 나타내고; u는 1 내지 8의 정수를 나타내고; c는 0 또는 1을 나타내고: v는 4 내지 12의 정수를 나타내지만, b와 c가 동시에 0이 되는 경우에는, q가 3 내지 5의 정수이며, r 및 t가 1이며, s가 1이며, 또한 u＋v가 6 내지 10의 정수인 경우를 제외함)로 표시되는 기를 나타내고; X는 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기(단, 당해 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합하고, 당해 환 상에는 1 또는 2개의 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기가 치환되어 있어도 됨), 또는 하기의 식 (B):
Figure pct00003
(식 중, d는 0 내지 3의 정수를 나타내고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기(당해 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기는 1개 또는 2개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내지만, R3 및 R4는 서로 결합하여 5 내지 7원 비방향족 헤테로환(당해 환 상에는 1 또는 2개의 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기가 치환되어 있어도 됨)을 형성해도 됨)로 표시되는 기를 나타냄〕
로 표시되는 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다.
상기의 발명의 바람직한 양태에 의하면, 상기의 식 (A)에 있어서, r 및 t가 0이며, q＋s＋u가 8 내지 18의 정수, 바람직하게는 10 내지 16의 정수인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염; r이 1이며, t가 0이며, q가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이며, s＋u가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염; v가 5 내지 12의 정수, 바람직하게는 6 내지 10의 정수인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다. 보다 바람직하게는, 상기의 식 (A)에 있어서, r 및 t가 0이며, q＋s＋u가 8 내지 18의 정수, 바람직하게는 10 내지 16의 정수이며, v가 5 내지 12의 정수, 바람직하게는 6 내지 10의 정수인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염; r이 1이며, t가 0이며, q가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이며, s＋u가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이며, v가 5 내지 12의 정수, 바람직하게는 6 내지 10의 정수인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다.
상기의 발명의 바람직한 양태에 의하면, 상기의 식 (I)에 있어서, a가 4이며, b가 0 또는 1인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다. 보다 바람직한 양태로서는, 상기의 식 (I)에 있어서, a가 4이며; b가 0 또는 1이며; R1 및 R2가 각각 독립적으로 식 (A)로 표시되는 기 중, r 및 t가 0이며, q＋s＋u가 8 내지 18의 정수, 바람직하게는 10 내지 16의 정수이며, v가 5 내지 12의 정수, 바람직하게는 6 내지 10의 정수인 기, 또는 r이 1이며, t가 0이며, q가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이며, s＋u가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이며, v가 5 내지 12의 정수, 바람직하게는 6 내지 10의 정수인 기;인, 상기의 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다.
또한, 다른 바람직한 양태에 의하면, 상기의 식 (I)에 있어서, b가 0이며, X가 식 (B)로 표시되는 기〔단, d는 0이며, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기(R3이 나타내는 C1-4 알킬기는 1개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내거나, 혹은 R3 및 R4가 서로 결합하는 경우에는, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기(당해 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기는 1개의 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 됨)를 형성함)인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염; b가 1이며, X가 식 (B)로 표시되는 기(단, d는 1 내지 3의 정수이며, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기(R3이 나타내는 C1-4 알킬기는 1개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내거나, 혹은 R3 및 R4가 서로 결합하는 경우에는, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기(당해 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기는 1 또는 2개의 동일하거나 또는 상이한 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 됨)를 형성함)인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염; X가 나타내는 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기(당해 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합함)가 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리닐기, 또는 피페라지닐기(당해 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리닐기, 또는 피페라지닐기는 1 또는 2개의 동일하거나 또는 상이한 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 됨)인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다.
다른 관점에서는, 본 발명에 의해, 세포 내에 siRNA 등의 송달 대상 물질을 송달하기 위한 지질막 구조체의 지질 성분으로서 사용하기 위한 상기의 식 (I)로 표시되는 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다. 본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 당해 세포가 면역 세포 또는 암세포, 보다 바람직하게는 수지상 세포, 단구, 마크로파지, 또는 암세포인 상기의 지질 화합물; 당해 지질막 구조체가 리포솜인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염; 및 당해 지질막 구조체가 다기능성 엔벨로프형 나노 구조체(MEND)인 상기의 지질 화합물 또는 그의 염이 제공된다.
또 다른 관점에서는, 본 발명에 의해, 지질 성분으로서 상기의 식 (I)로 표시되는 지질 화합물을 포함하는 지질막 구조체가 제공된다. 이 지질막 구조체는, 예를 들어 리포솜이다. 또한, 본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 당해 지질막 구조체는, 세포 내에 물질, 바람직하게는 siRNA를 송달하기 위한 지질막 구조체이며, siRNA 등의 송달 대상 물질이 내부에 봉입되어 있다. 당해 지질막 구조체는, 세포 내의 표적 유전자를 녹다운하기 위해서 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 당해 세포가 면역 세포 또는 암세포, 보다 바람직하게는 수지상 세포, 단구, 마크로파지, 또는 암세포이다. 예를 들어, 당해 지질막 구조체는, 항원 제시능을 갖는 수지상 세포에 있어서의 표적 유전자를 녹다운하기 위해서 사용할 수 있다. 따라서, 상기의 관점에서, 본 발명에 의해, 세포, 바람직하게는 면역 세포 또는 암세포, 보다 바람직하게는 수지상 세포, 단구, 마크로파지, 또는 암세포에 있어서의 표적 유전자의 녹다운에 사용하기 위한 상기의 지질막 구조체도 제공된다.
또한, 다른 바람직한 양태에 의해, 지질 성분으로서 상기 식 (I)의 지질 화합물, 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 콜레스테롤(Chol), 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 및 메톡시폴리에틸렌글리콜 2000 디미스토일글리세롤(PEG-DMG 2000)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는 지질막 구조체; 지질 성분으로서 상기 식 (I)의 지질 화합물, 콜레스테롤(Chol), 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 및 메톡시폴리에틸렌글리콜 2000 디미스토일글리세롤(PEG-DMG 2000)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는 지질막 구조체; 세포가 면역 세포, 바람직하게는 수지상 세포, 단구, 또는 마크로파지인 상기의 지질막 구조체; 리포솜인 상기의 지질막 구조체; 및 다기능성 엔벨로프형 나노 구조체(MEND)인 상기의 지질 화합물이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 세포, 바람직하게는 면역 세포, 특히 바람직하게는 수지상 세포의 세포 내에 siRNA 등의 송달 대상 물질을 송달하는 방법이며, 송달 대상 물질이 내부에 봉입되어 있고, 또한 지질 성분으로서 상기의 식 (I)로 표시되는 지질 화합물을 포함하는 상기의 지질막 구조체를 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법은 인간을 포함하는 포유류 동물의 생체 내에서 행해도 되지만, 생체로부터 분리·채취된 세포를 사용하여 시험관내에서 행해도 된다.
예를 들어, 수지상 세포를 사용하는 경우에는, 환자에게서 분리·채취된 수지상 세포에 대해서 상기의 방법에 의해 세포 내에 송달 대상 물질을 도입한 후, 표적 유전자가 녹다운된 수지상 세포를 그 환자에게 투여함으로써 수지상 세포 요법을 행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 면역 요법이며, 환자에게서 수지상 세포를 분리·채취하고, 시험관내에서 수지상 세포의 세포 내에 송달 대상 물질을 도입한 후, 표적 유전자가 녹다운된 수지상 세포를 그 환자에게 투여하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명에 의해, 환자에게서 수지상 세포를 분리·채취하고, 시험관내에서 수지상 세포의 세포 내에 송달 대상 물질을 도입한 후, 표적 유전자가 녹다운된 수지상 세포를 그 환자에게 투여하는 면역 요법에 있어서, 수지상 세포에 있어서의 표적 유전자를 녹다운하기 위해서 사용하는 상기의 지질막 구조체가 제공된다.
본 발명의 지질 화합물은, siRNA 등의 송달 대상 물질의 우수한 송달 효율과 높은 안전성을 양립시켜, LNP의 입자경의 감소에 수반하는 siRNA 등의 송달 활성의 저하의 극복을 가능하게 하는 지질막 구조체를 제공할 수 있다. 또한, 당해 지질막 구조체에 대해서 생분해성과 우수한 엔도솜 탈출능, 및 LNP의 안정화능을 부여할 수 있는 것이 가능하다. 발명에 의해 제공되는 지질막 구조체는, 수지상 세포를 포함하는 면역 세포 등, siRNA 등의 송달 대상 물질의 도입이 곤란한 임의의 세포의 세포 내로 효율적으로 이행하여, 엔도솜으로부터 효율적으로 탈출할 수 있다. 이것으로부터, 당해 지질막 구조체는, 봉입된 송달 대상 물질을 세포 내에 있어서 효율적으로 방출하여 당해 송달 대상 물질에 의해 표적 유전자를 녹아웃할 수 있다. 따라서, 본 발명의 지질막 구조체를 사용하여, 예를 들어 암 치료에 있어서 siRNA 등의 물질을 이용한 유효한 면역 요법, 바람직하게는 수지상 세포 요법을 행할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 지질 화합물을 지질 성분으로서 사용하여 리포솜 등의 지질막 구조체를 조제하면, 매우 높은 엔도솜 탈출성이 달성되어, 당해 지질 화합물을 포함하는 지질막 구조체로부터 세포질 중으로 siRNA 등의 송달 대상 물질을 효율적으로 송달하는 것이 가능해진다.
도 1은 알코올 희석법에 의한 LNP의 조제 수순의 모식도이다.
도 2는 예 2에 있어서, 친수성 부위의 화학 구조가 각각 상이한 지질 화합물을 포함하는 각 LNP의 pKa를 나타낸 도면이다.
도 3a는 예 2에 있어서, 친수성 부위의 화학 구조가 각각 상이한 지질 화합물을 포함하는 각 LNP의 생체내 F7 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 3b는 예 2에 있어서, 친수성 부위의 화학 구조가 각각 상이한 지질 화합물을 포함하는 각 LNP의 시험관내 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 3c는 예 2에 있어서, 친수성 부위의 화학 구조가 각각 상이한 지질 화합물을 포함하는 각 LNP의 용혈(hemolysis) 활성을 나타낸 도면이다.
도 4a는 예 3에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 지질 화합물(CL4 시리즈)을 포함하는 LNP의 pKa를 나타낸 도면이다.
도 4b는 예 3에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 지질 화합물(CL15 시리즈)을 포함하는 LNP의 pKa를 나타낸 도면이다.
도 5는 예 3에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 CL15-LNP의 시험관내 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 6a는 예 3에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 지질 화합물(CL4 시리즈)을 포함하는 LNP의 생체내 F7 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 6b는 예 3에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 지질 화합물(CL15 시리즈)을 포함하는 LNP의 생체내 F7 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 7a는 예 3에 있어서, CL4H6-LNP의 생체내 F7 녹다운 활성을 지표로 한 제제 처방의 지질 조성의 최적화 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 예 3에 있어서, CL4H6-LNP의 생체내 F7 녹다운 활성을 지표로 한 제제 처방의 지질/siRNA 전하비의 최적화 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 예 3에 있어서, 최적 조성 CL4H6-LNP의 생체내 F7 녹다운 효율의 투여량 의존성을 나타낸 도면이다.
도 9a는 예 4에 있어서, CL4H6-LNP의 안전성을 평가한 결과이며, 투여 24시간 후에 있어서의 혈장 중 ALT/AST값을 나타낸 도면이다.
도 9b는 예 4에 있어서, CL4H6-LNP의 안전성을 평가한 결과이며, 투여 직전으로부터 투여 24시간 후까지의 마우스 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 10은 예 4에 있어서, 평균 입자경 35 ㎚ 정도로 제어된 CL15-LNP의 시험관내 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 11은 예 5에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 지질 화합물(CL4H 시리즈)을 포함하는 LNP의 pKa를 나타낸 도면이다.
도 12는 예 5에 있어서, 소수성 기반 구조가 각각 상이한 지질 화합물(CL4H 시리즈)을 포함하는 LNP의 생체내 F7 녹다운 활성을 나타낸 도면이다.
도 13a는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의, 투여 후 30분 후의 간장에 있어서의 siRNA양(ng/g 간장)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 13b는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의, 투여 후 24시간 후의 간장에 있어서의 siRNA양(ng/g 간장)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 13c는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의, 투여 후 24시간 후의 간장에 있어서의 siRNA양(ng/g 간장, 24h)과, F7 녹다운에 있어서의 ED50의 관계를 플롯한 도면이다.
도 14는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의 투여 후 1시간 후의 간장의 혈관(FITC), 지질(DiI), 및 siRNA(Cy5)의 형광 염색 화상이다.
도 15a는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의 상대 혈장 중 F7 단백질량(각 회수일의 LNP 미투여 마우스(NT)의 혈장 중 F7 단백질량을 100으로 함)의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
도 15b는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의 상대 혈장 중 F7 단백질량이 50으로 되는 LNP 투여 후 경과 시간(지속성(Durability))(일)과, F7 녹다운에 있어서의 ED50의 관계를 플롯한 도면이다.
도 16a는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의 간장 중의 각 양이온성 지질의 함유량의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
도 16b는 예 6에 있어서, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP, YSK05-LNP, 및 YSK13-C3-LNP를 투여한 마우스의 비장 중의 각 양이온성 지질의 함유량의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
도 17은 예 7에 있어서, PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP를 투여한 마우스의 상대 혈중 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP양(마우스에게 투여한 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP양(ID)이 100％)의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
도 18a는 예 7에 있어서, PLK1에 대한 siRNA를 탑재한 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP, 및 PEG-DSG 수식 YSK05-LNP를 투여한 OSRC2 세포 피하 이식 마우스의, 투여 후 24시간 후의 암 조직에 있어서의 상대 PLK1 발현량(siRNA 미투여의 OSRC2 세포 피하 이식 마우스(NT)의 암 조직에 있어서의 PLK1 발현량을 1로 함)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 18b는 예 7에 있어서, PLK1에 대한 siRNA를 탑재한 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP 및 PEG-DSG 수식 YSK05-LNP를 투여한 OSRC2 세포 피하 이식 마우스의, 투여 전으로부터 투여 후 24시간 후의 체중의 변화율(％)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 예 8에 있어서, ICR 마우스 골수 세포로부터 유도한 마크로파지에, CD45에 대한 siRNA를 트랜스펙션하고, 24시간 배양 후의 각 마크로파지의 상대 CD45 발현량(siRNA 미투여의 종양 관련 마크로파지(NT)의 CD45 발현량을 100％로 함)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 예 9에 있어서, CD45에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP 또는 YSK05-LNP를 OSRC2 세포 피하 이식 마우스에게 투여하고, 투여 후 24시간 후의 종양 관련 마크로파지의 상대 CD45 발현량(％)(CD45에 대한 siRNA 미투여의 종양 관련 마크로파지(NT)에 있어서의 CD45 발현량을 100％로 함)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 예 10에 있어서, CL4H6-LNP를, 투여 개시로부터 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21 및 23일째에 정맥 내에 0.3 ㎎ siRNA/kg 또는 1 ㎎ siRNA/kg으로 반복 투여한 마우스의, 투여 개시 0일째의 체중을 100％로 하는 체중 변화율(％)의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 양태에 대해서 구체적으로 설명한다. 본원 명세서에 있어서, 「X1 내지 X2(X1과 X2는, X1＜X2를 만족시키는 실수)」는, 「X1 이상 X2 이하」를 의미한다.
본 발명의 실시 형태에 관한 지질 화합물(본 발명의 지질 화합물)은, 하기의 식 (I)로 표시된다.
Figure pct00004
식 (I)에 있어서, a는 3 내지 5의 정수를 나타내고, 바람직하게는 4이다.
b는 0 또는 1의 정수를 나타낸다. b가 0인 경우에는 -O-CO-기가 존재하지 않고, 단결합이라는 것을 의미한다.
식 (I)에 있어서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 하기의 식 (A)로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure pct00005
식 (A)에 있어서, q는 1 내지 9의 정수를 나타내고; r은 0 또는 1을 나타내고; s는 1 내지 3의 정수를 나타내고; t는 0 또는 1을 나타내고; u는 1 내지 8의 정수를 나타내고; v는 4 내지 12의 정수를 나타낸다. c는 0 또는 1을 나타낸다. b가 0이며, c가 1인 경우, 또는 b가 1이며, c가 0인 경우가 바람직하다.
바람직한 일 양태에서는, r 및 t가 0이며, q＋s＋u가 8 내지 18의 정수, 바람직하게는 10 내지 16의 정수이다. 또한, 다른 바람직한 양태에서는, r이 1이며, t가 0이며, 또한 q가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이며, s＋u가 5 내지 9의 정수, 바람직하게는 6 내지 8의 정수이다. 또 다른 바람직한 양태에서는, v는 4 내지 12의 정수, 바람직하게는 6 내지 10의 정수, 보다 바람직하게는 6이다. a가 4이며, b가 0 또는 1인 양태도 바람직하다.
단, b와 c가 동시에 0으로 되는 경우에는, q가 3 내지 5의 정수이며, r 및 t가 1이며, s가 1이며, 또한 u＋v가 6 내지 10의 정수인 경우를 제외한다.
식 (I)에 있어서, X는, 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기, 또는 하기의 식 (B)로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure pct00006
X가 나타내는 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기는, 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합하고, 당해 환 상에는 1 또는 2개의 C1-4 알킬기(탄소수 1 내지 4의 알킬기) 또는 C2-4 알케닐기(탄소수 2 내지 4의 알케닐기)가 치환되어 있어도 된다. 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기에 포함되는 헤테로 원자로서는, 질소 원자, 산소 원자, 또는 황 원자 등을 들 수 있다. 환 구성 헤테로 원자는 1개여도 되고, 혹은 동일하거나 또는 상이한 헤테로 원자를 2개 이상 포함하고 있어도 된다. 헤테로환기를 구성하는 헤테로환에는 1개 또는 2개 이상의 이중 결합이 포함되어 있어도 되지만, 헤테로환이 방향환으로 되는 경우는 없다. 포화의 헤테로환이 바람직한 경우가 있다. 또한, 당해 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기 중의 1개 또는 2개의 수소 원자가 치환되어 있는 치환기 중, C1-4 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, n-부틸기, 이소프로필기, 이소부틸기, tert-부틸기 등을 들 수 있고, C2-4 알케닐기로서는, 에테닐기(비닐기), 프로페닐기, 부테닐기 등을 들 수 있다.
식 (B)에 있어서, d는 0 내지 3의 정수를 나타내고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기를 나타낸다. C1-4 알킬기 및 C2-4 알케닐기로서는, 상기에서 들어진 것과 마찬가지의 것을 들 수 있다. R3 및 R4가 나타내는 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기는, 각각 1개 또는 2개의 페닐기로 치환되어 있어도 된다. 또한, R3 및 R4는 서로 결합하여 5 내지 7원 비방향족 헤테로환을 형성해도 된다. 당해 5 내지 7원 비방향족 헤테로환은, 1 또는 2개의 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기로 치환되어 있어도 된다.
다른 바람직한 양태에 의하면, 식 (I)로 표시되는 지질 화합물에 있어서, b가 0이며, X가 식 (B)로 표시되는 기를 나타낸다. 이 양태의 경우, d는 0인 것이 바람직하고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기(R3이 나타내는 C1-4 알킬기는 1개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내도 되고, 서로 결합하여 5 내지 7원 비방향족 헤테로환을 형성해도 된다. R3 및 R4가 서로 결합하는 경우에는, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기를 형성하는 것이 바람직하고, 당해 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기는 1개의 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 된다.
또 다른 바람직한 양태에 의하면, b가 1이며, X가 식 (B)로 표시되는 기를 나타낸다. 이 양태의 경우, d는 1 내지 3의 정수인 것이 바람직하고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기(R3이 나타내는 C1-4 알킬기는 1개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내도 되고, 서로 결합하여 5 내지 7원 비방향족 헤테로환을 형성해도 된다. R3 및 R4가 서로 결합하는 경우에는, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기를 형성하는 것이 바람직하고, 당해 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기는 1 또는 2개의 동일하거나 또는 상이한 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 된다.
또한, 다른 바람직한 양태에 의하면, b가 1이며, X가 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기(당해 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합함)이며, 당해 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기가 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리닐기, 또는 피페라지닐기인 것이 바람직하고, 당해 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리닐기, 또는 피페라지닐기는 1 또는 2개의 동일하거나 또는 상이한 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 된다.
식 (I)로 표시되는 지질 화합물은 산 부가염으로서 존재하는 경우가 있다. 염을 구성하는 산의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 무기산류 또는 유기산류 등의 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 염산염, 질산염, 황산염 등의 무기산염, 또는 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염, 말산염, p-톨루엔술폰산염, 메탄술폰산염 등의 유기산염 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 식 (I)로 표시되는 지질 화합물 또는 그의 염은 수화물 또는 용매화물로서 존재하는 경우도 있고, 이들의 물질도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, R1 및 R2가 상이한 경우에는 광학 이성체가 존재하는 경우도 있고, 순수한 형태의 광학 이성체, 임의의 광학 활성체의 혼합물, 또는 라세미체 등도 본 발명의 범위에 포함된다.
식 (I)의 화합물 중 특히 바람직한 화합물로서, R1 및 R2가 동일하고, a가 4인 화합물을 들 수 있다. 이 화합물을 포함하여 식 (I)의 화합물은, 본 명세서의 실시예에 구체적으로 나타낸 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 이 실시예의 제조 방법을 참조하여, 원료 화합물, 시약, 및 반응 조건 등을 적절히 선택함으로써, 당업자는 식 (I)의 범위에 포함되는 임의의 화합물을 용이하게 제조할 수 있다. 식 (I)의 화합물의 pKa는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 4.0 내지 9.0 정도, 바람직하게는 4.5 내지 8.5 정도로 선택할 수 있고, 이 범위의 pKa를 부여하도록 각 치환기의 종류를 선택하는 것이 바람직하다. 리포솜 등의 지질 구조체의 엔도사이토시스에 의한 세포로의 도입은, 지질 구조체의 pKa에 영향을 받는다. 세포의 종류에 따라, 엔도사이토시스에 따라 도입되기 쉬운 지질 구조체의 pKa가 상이하다. 이 때문에, 지질 구조체의 pKa가 표적 세포로 도입되기 쉬운 범위로 되도록, 식 (I)의 화합물의 pKa를 조정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 지질막 구조체를 구성하는 지질로서는, 예를 들어 인지질, 당지질, 스테롤, 포화 혹은 불포화의 지방산에스테르, 또는 포화 혹은 불포화의 지방산 등을 들 수 있다.
인지질 및 인지질 유도체로서는, 예를 들어 포스파티딜에탄올아민, 포스파리딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 스핑고미엘린, 세라마이드포스포릴에탄올아민, 세라마이드포스포릴글리세롤, 세라마이드포스포릴글리세롤포스페이트, 1,2-디미리스토일-1,2-데옥시포스파티딜콜린, 플라스마로겐, 포스파티딘산 등을 들 수 있고, 이들은 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이들 인지질에 있어서의 지방산 잔기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 탄소수 12 내지 20의 포화 또는 불포화의 지방산 잔기를 들 수 있고, 구체적으로는, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 등의 지방산 유래의 아실기를 들 수 있다. 또한, 난황 레시틴, 대두 레시틴 등의 천연물 유래의 인지질을 사용할 수도 있다.
당지질로서는, 예를 들어 그리세로당지질(예를 들어, 술폭시리보실글리세리드, 디글리코실디글리세리드, 디갈락토실디글리세리드, 갈락토실디글리세리드, 글리코실디글리세리드), 스핑고당지질(예를 들어, 갈락토실세레브로시드, 락토실세레브로시드, 강글리오시드) 등을 들 수 있다.
스테롤로서는, 예를 들어 동물 유래의 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤, 콜레스테롤 숙신산, 라노스테롤, 디히드로라노스테롤, 데스모스테롤, 디히드로콜레스테롤), 식물 유래의 스테롤(피토스테롤)(예를 들어, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 브라시카스테롤), 미생물 유래의 스테롤(예를 들어, 티모스테롤, 에르고스테롤) 등을 들 수 있다.
포화 또는 불포화의 지방산으로서는, 예를 들어 팔미트산, 올레산, 스테아르산, 아라키돈산, 미리스트산 등의 탄소수 12 내지 20의 포화 또는 불포화의 지방산을 들 수 있다.
포화 또는 불포화의 지방산에스테르로서는, 글리세롤의 1 또는 2개의 수산기가 지방산과 에스테르 결합한 글리세린 지방산에스테르를 들 수 있다. 당해 글리세린 지방산에스테르 내의 지방산 잔기는, 예를 들어 팔미트산, 올레산, 스테아르산, 아라키돈산, 미리스트산 등의 탄소수 12 내지 20의 포화 또는 불포화의 지방산 유래의 아실기를 들 수 있다. 구체적으로는, 디미리스토일글리세롤(DMG), 디스테아로일글리세롤(DSG) 등을 들 수 있다.
지질막 구조체의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 수계 용매에 분산된 형태로서 1매 막 리포솜, 다중 층 리포솜, O/W형 에멀션, W/O/W형 에멀션, 구상 미셀, 끈상 미셀, 또는 부정형의 층상 구조물 등을 들 수 있다. 본 발명의 지질막 구조체의 바람직한 형태로서 리포솜을 들 수 있다. 이하, 본 발명의 지질막 구조체의 바람직한 양태로서 리포솜에 대해서 설명할 경우가 있지만, 본 발명의 지질막 구조체는 리포솜에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 지질막 구조체는, 세포 내에 siRNA 등의 송달 대상 물질을 송달하기 위한 지질막 구조체이며, 송달 대상 물질이 내부에 봉입되어 있고, 또한 지질 성분으로서 상기의 식 (I)로 표시되는 지질 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 지질막 구조체에 따라 송달 대상 물질이 송달되는 세포(표적 세포)의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 지질막 구조체는, 면역 세포, 내피세포, 상피세포, 섬유아세포, 간세포(간실질 세포), 췌장 세포, 신경 세포, 평활근 세포, 심근 세포 등의 동물을 구성하는 각종 세포나, 이들 세포가 암화된 암세포, 분화능을 구비하는 줄기 세포 등의 다종다양한 세포에 송달 대상 물질을 송달할 수 있다. 또한, 표적 세포는, 동물의 체내에 있는 세포여도 되고, 배양 세포나 초대 배양 세포 등의 생체 외에서 배양되는 세포여도 된다. 면역 세포로서는, 수지상 세포, 마크로파지, 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포), 과립구, 단구 등을 들 수 있다. 본 발명의 지질막 구조체가 송달되는 세포로서는, 바람직하게는 면역 세포 및 암세포를 들 수 있고, 특히 바람직하게는 수지상 세포, 단구, 마크로파지, 및 암세포를 들 수 있다.
이하, 송달해야 할 물질(송달 대상 물질)의 바람직한 예로서 siRNA에 대해서 설명하지만, 송달 대상 물질은 siRNA에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 마이크로RNA, mRNA, 플라스미드 등의 핵산류 외에, 항종양제, 항염증제, 항균제, 항바이러스제 등의 임의의 의약의 유효 성분이나, 당류, 펩티드류, 저분자 화합물, 금속 화합물 등 임의의 물질을 본 발명의 지질막 구조체에 봉입할 수 있다.
siRNA(small interfering RNA; 소형 간섭 RNA)는 21 내지 23염기쌍으로 이루어지는 저분자 이중쇄 RNA이며, RNA 간섭(RNAi)에 관여하여, mRNA의 파괴에 의해 배열 특이적으로 유전자의 발현을 억제한다. 합성의 siRNA가 인간의 세포에 있어서 RNA 간섭을 야기하는 것이 보고되어 있으며, siRNA를 사용한 RNA 간섭에 의해 유전자를 녹다운할 수 있다는 점에서, 의약으로서의 이용이나 암 등의 치료 분야에 있어서 응용이 기대되고 있다. 본 발명에 있어서 사용 가능한 siRNA의 종류는 특별히 한정되지 않으며, RNA 간섭을 야기할 수 있는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 되지만, 일반적으로는, 21 내지 23염기쌍의 이중쇄 RNA이며, RNA쇄의 3' 부분이 2 염기분 돌출된 구조를 취하고, 각각의 쇄는 5' 말단에 인산기와 3' 말단에 히드록실기를 갖는 구조의 RNA를 본 발명에 있어서의 siRNA로서 사용할 수 있다. 또한, 리보오스 골격의 2' 위치의 히드록실기가 메톡시기, 플루오로기, 혹은 메톡시에틸기로, 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 일부 치환된 siRNA도 포함된다.
본 발명의 지질막 구조체를 사용하여, 세포, 바람직하게는 면역 세포 또는 암세포, 특히 바람직하게는 수지상 세포, 단구, 마크로파지, 또는 암세포의 세포 내에 siRNA를 송달할 수 있다. 이 방법은, 인간을 포함한 포유류 동물의 생체 내에 있어서 행할 수도 있고, 생체로부터 분리·채취된 세포를 사용하여 시험관내에서 행해도 된다. 예를 들어, 수지상 세포를 사용하는 경우에는, 환자에게서 분리·채취된 수지상 세포에 대해서 본 발명의 지질막 구조체를 사용하여 세포 내에 siRNA를 도입한 후, 표적 유전자가 녹다운된 수지상 세포를 그 환자에게 투여함으로써 수지상 세포 요법을 행할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 구애되는 것은 아니지만, 본 발명의 지질막 구조체에 의해 세포 내에 송달된 이중쇄 siRNA는 헬리카제라고 불리는 효소의 작용을 받아서 단일쇄로 해리되고, 표적 mRNA에 대한 엔도뉴클레아제 활성을 나타내는 아르고노트(Argonaute) 단백질 등과 복합체(RISC)를 형성하여, 표적 유전자를 RNA 간섭에 의해 녹다운할 수 있다.
본 발명의 지질막 구조체의 지질 성분으로서 식 (I)의 지질 화합물을 단독으로 사용해도 되지만, 일반적으로는 먼저 설명한 지질의 1종 또는 2종 이상과 식 (I)의 지질 화합물을 조합하여 지질막 구조체를 형성하는 것이 바람직하다. 복수의 지질의 조합 및 그의 배합 비율은 특별히 한정되지 않지만, 실시예에 구체적에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 표적 유전자에 대한 녹다운 활성 등을 지표로서 사용하는 지질의 종류 및 배합 비율을 최적화 할 수 있다. 예를 들어, 지질 성분으로서 식 (I)의 화합물, 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 콜레스테롤(Chol), 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜 2000 디미리스토일글리세롤(PEG-DMG 2000)의 조합에 대해서는, 식 (I)의 화합물의 함유 비율을 80 내지 90몰％, 바람직하게는 85몰％ 정도로 하고, PEG-DMG 2000을 약 1 내지 2몰％, 바람직하게는 1몰％ 정도로 하고/하거나 식 (I)의 화합물을 85몰％로 하였을 때의 POPE/Chol의 비율(몰비)을 0/15 내지 4/11 정도, 바람직하게는 0/15로 함으로써 녹다운 활성을 상승시킬 수 있지만, 이들 특정한 지질 및 그의 배합 비율로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 지질막 구조체의 입자경은 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 양태로서 평균 입자경 60 내지 140 ㎚ 정도, 보다 바람직하게는 80 내지 120 ㎚ 정도, 다른 바람직한 양태로서 평균 입자경 20 내지 50 ㎚ 정도인 것이 녹다운 효율의 점에서 바람직한 경우가 있다. 다분산도 지수(PDI)는 0.05 내지 0.1 정도, 바람직하게는 0.06 내지 0.08 정도, 더욱 바람직하게는 약 0.07 정도이다. 제타 전위는 5.5 ㎷ 내지 6.0 ㎷의 범위, 바람직하게는 5.8 ㎷ 정도로 할 수 있다.
본 발명의 지질막 구조체에는, 필요에 따라 적당한 표면 수식 등을 행할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 지질막 구조체의 핵 내 이행을 촉진하기 위해서, 예를 들어 지질막 구조체를 3당 이상의 올리고당 화합물로 표면 수식할 수도 있다. 3당 이상의 올리고당 화합물의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 3개 내지 10개 정도의 당 유닛이 결합한 올리고당 화합물을 사용할 수 있고, 바람직하게는 3개 내지 6개 정도의 당 유닛이 결합한 올리고당 화합물을 사용할 수 있다.
올리고당 화합물로서 보다 구체적으로는, 예를 들어 셀로트리오스(Cellotriose: β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코오스), 카코트리오스(Chacotriose: α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→4)]-D-글루코오스), 겐티아노오스(Gentianose: β-D-프룩토프라노실 β-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노시드), 이소말토트리오스(Isomaltotriose: α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-D-글루코오스), 이소파노오스(Isopanose: α-D-글루코피라노실-(1→4)-[α-D-글루코피라노실-(1→6)]-D-글루코오스), 말토트리오스(Maltotriose: α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코오스), 만니노트리오스(Manninotriose: α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-갈락토피라노실-(1→6)-D-글루코오스), 멜레지토오스(Melezitose: α-D-글루코피라노실-(1→3)-β-D-프룩토프라노실＝α-D-글루코피라노시드), 파노오스(Panose: α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코오스), 플란테오스(Planteose: α-D-갈락토피라노실-(1→6)-β-D-프룩토프라노실＝α-D-글루코피라노시드), 라피노오스(Raffinose: β-D-프룩토프라노실＝α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노시드), 솔라트리오스(Solatriose: α-L-람노피라노실-(1→2)-[β-D-글루코피라노실-(1→3)]-D-갈락토오스), 움벨리페로오스(Umbelliferose: β-D-프룩토프라노실＝α-D-갈락토피라노실-(1→2)-α-D-갈락토피라노시드) 등의 3당 화합물; 리코테트라오스(Lyco테트라ose: β-D-글루코피라노실-(1→2)-[β-D-크실로피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-갈락토오스), 말토테트라오스(Malto테트라ose: α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코오스), 스타키오스(Stachyose: β-D-프룩토프라노실＝α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노시드) 등의 4당 화합물; 말토펜타오스(Maltopentaose: α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코오스), 베르바스코스(Verbascose: β-D-프룩토프라노실＝α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-갈락토피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노시드) 등의 5당 화합물; 말토헥사오스(Maltohexaose: α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-D-글루코오스) 등의 6당 화합물을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 글루코오스의 삼량체 내지 육량체인 올리고당 화합물을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 글루코오스의 삼량체 또는 사량체인 올리고당 화합물을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 이소말토트리오스, 이소파노오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 또는 말토헥사오스 등을 적합하게 사용할 수 있고, 이들 중, 글루코오스가 α1-4 결합한 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 또는 말토헥사오스가 더욱 바람직하다. 특히 바람직한 것은 말토트리오스 또는 말토테트라오스이며, 가장 바람직한 것은 말토트리오스이다. 올리고당 화합물에 의한 지질막 구조체의 표면 수식량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 총 지질량에 대해서 1 내지 30몰％ 정도, 바람직하게는 2 내지 20몰％ 정도, 보다 바람직하게는 5 내지 10몰％ 정도이다.
올리고당 화합물로 지질막 구조체를 표면 수식하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 지질막 구조체를 갈락토오스나 만노오스 등의 단당으로 표면을 수식한 리포솜(특허문헌 3)이 알려져 있으므로, 이 간행물에 기재된 표면 수식 방법을 채용할 수 있다. 상기 간행물의 개시의 모두를 참조에 의해 본 명세서의 개시로서 포함한다. 이 수단은 폴리알킬렌글리콜화 지질에 단당 화합물을 결합하여 지질막 구조체의 표면 수식을 행하는 방법이며, 이 수단에 의해 지질막 구조체의 표면을 폴리알킬렌글리콜에 의해 동시에 수식할 수 있으므로 바람직하다.
지질막 구조체의 표면을 폴리알킬렌글리콜 등의 친수성 폴리머로 수식함으로써 리포솜의 혈중 체류성 등의 안정성을 높일 수 있는 경우가 있다. 이 수단에 대해서는, 예를 들어 일본 특허 공개 평1-249717호 공보, 일본 특허 공개 평2-149512호 공보, 일본 특허 공개 평4-346918호 공보, 일본 특허 공개 제2004-10481호 공보 등에 기재되어 있다. 친수성 폴리머로서는 폴리알킬렌글리콜이 바람직하다. 폴리알킬렌글리콜로서는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리테트라메틸렌글리콜, 폴리헥사메틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 폴리알킬렌글리콜의 분자량은, 예를 들어 300 내지 10,000 정도, 바람직하게는 500 내지 10,000, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 5,000 정도이다.
폴리알킬렌글리콜에 의한 지질막 구조체의 표면 수식은, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜 수식 지질을 지질막 구성 지질로서 사용하여 지질막 구조체를 구축함으로써 용이하게 행할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜에 의한 수식을 행하는 경우에는 스테아릴화 폴리에틸렌글리콜(예를 들어 스테아르산 PEG45(STR-PEG45) 등)을 사용할 수 있다. 그 밖에, N-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000]-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, n-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000]-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-750]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 등의 폴리에틸렌글리콜 유도체 등을 사용할 수도 있지만, 폴리알킬렌글리콜화 지질은 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 폴리알킬렌글리콜에 올리고당 화합물을 결합시킴으로써, 폴리알킬렌글리콜 및 올리고당 화합물에 의한 표면 수식을 동시에 달성할 수 있다. 단, 지질막 구조체를 폴리알킬렌글리콜이나 올리고당 화합물로 표면 수식하는 방법은 상기의 방법에 한정되지 않고, 예를 들어 스테아릴화된 폴리알킬렌글리콜이나 올리고당 화합물 등 지질화된 화합물을 지질막 구조체의 구성 지질로서 사용함으로써, 표면 수식을 행할 수 있는 경우도 있다.
본 발명의 지질막 구조체의 제조에 있어서, 혈중 체류성을 높이기 위한 지질 유도체로서, 예를 들어 글리코포린, 강글리오시드 GM1, 포스파티딜이노시톨, 강글리오시드 GM3, 글루쿠론산 유도체, 글루탐산 유도체, 폴리글리세린 인지질 유도체 등을 이용할 수도 있다. 또한, 혈중 체류성을 높이기 위한 친수성 폴리머로서, 폴리알킬렌글리콜 외에, 덱스트란, 풀루란, 피콜, 폴리비닐알코올, 스티렌-무수 말레산 교호 공중합체, 디비닐에테르-무수 말레산 교호 공중합체, 아밀로스, 아밀로펙틴, 키토산, 만난, 시클로덱스트린, 펙틴, 카라기난 등을 표면 수식에 사용할 수도 있다.
본 발명의 지질막 구조체는, 스테롤, 또는 글리세린 혹은 그의 지방산에스테르 등의 막 안정화제; 토코페롤, 갈산 프로필, 팔미트산 아스코르빌, 또는 부틸화 히드록시톨루엔 등의 항산화제; 하전 물질; 및 막 폴리펩티드; 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 포함하고 있어도 된다. 양하전을 부여하는 하전 물질로서는, 예를 들어 스테아릴아민, 올레일아민 등의 포화 또는 불포화 지방족 아민; 디올레오일트리메틸암모늄프로판 등의 포화 또는 불포화 양이온성 합성 지질; 또는 양이온성 폴리머 등을 들 수 있다. 음전하를 부여하는 하전 물질로서는, 예를 들어 디세틸포스페이트, 콜레스테릴헤미숙시네이트, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산 등을 들 수 있다. 막 폴리펩티드로서는, 예를 들어 막 표재성 폴리펩티드, 또는 막 내재성 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 이들 물질의 배합량은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 지질막 구조체에는, 예를 들어 온도 변화 감수성 기능, 막 투과 기능, 유전자 발현 기능, 및 pH 감수성 기능 등의 어느 하나 또는 둘 이상의 기능을 부여할 수 있다. 이들 기능을 적절히 부가함으로써, 예를 들어 유전자를 포함하는 핵산 등을 내포하는 지질막 구조체의 혈액 중에서의 체류성을 향상시켜, 간장이나 비장 등의 세망내피계 조직에 의한 포착율을 저하시킬 수 있다. 이들에 더하여, 표적 세포에 엔도사이토시스에서 도입된 후의 당해 지질막 구조체를, 엔도솜으로부터 효율적으로 탈출시켜서 핵 내로 이행시킬 수 있어, 핵 내에 있어서 높은 유전자 발현 활성을 달성하는 것이 가능해진다.
온도 변화 감수성 기능을 부여할 수 있는 온도 변화 감수성 지질 유도체로서는, 예를 들어 디팔미토일포스파티딜콜린 등을 들 수 있다. 또한, pH 감수성 기능을 부여할 수 있는 pH 감수성 지질 유도체로서는, 예를 들어 디올레오일포스파티딜에탄올아민 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 지질막 구조체는, 세포 표면의 수용체나 항원에 대해서 특이적으로 결합 가능한 항체 등의 물질로 수식을 실시할 수도 있다. 당해 수식에 의해, 세포의 핵 내로의 물질 송달 효율을 개선할 수 있다. 예를 들어, 표적 조직 또는 장기에 특이적으로 발현하는 생체 성분에 대한 모노클로날 항체를 지질막 구조체의 표면에 배치하는 것이 바람직하다. 이 방법은, 예를 들어 비특허문헌 25 등에 기재되어 있다. 지질막 구조체의 구성 성분으로서, 모노클로날 항체나 그의 프래그먼트(예를 들어, Fab 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, 또는 Fab' 프래그먼트 등) 중의 머캅토기와 반응할 수 있는 지질 유도체, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜)-α-디스테아로일포스파티딜에탄올아민-ω-말레인이미드, α-[N-(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포릴-에틸)카르바밀)-ω-[3-[2-(2,5-디히드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)에탄카르복사미드]프로필}-폴리(옥시-1,2-에탄딜) 등의 말레인이미드 구조를 갖는 지질 유도체를 함유시킴으로써, 모노클로날 항체를 지질막 구조체의 막의 표면에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 지질막 구조체의 표면을, 연속한 복수개의 아르기닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드(이하, 「폴리아르기닌」이라고 칭함.)로 수식해도 된다. 폴리아르기닌으로서는, 바람직하게는 4 내지 20개의 연속된 아르기닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 4 내지 20개의 연속된 아르기닌 잔기만으로 이루어지는 폴리펩티드, 특히 바람직하게는 옥타아르기닌 등을 사용할 수 있다. 리포솜 등의 지질막 구조체의 표면을 옥타아르기닌 등의 폴리아르기닌으로 수식함으로써, 리포솜에 봉입된 목적 물질의 세포 내 송달 효율을 향상시킬 수 있다(비특허문헌 4; 특허문헌 1). 폴리아르기닌에 의한 지질막 구조체 표면의 수식은, 상기의 간행물에 기재된 방법에 따라서, 예를 들어 지질 수식 폴리아르기닌, 예를 들어 스테아릴화 옥타아르기닌 등을 지질막 구조체의 구성 지질로서 사용함으로써 용이하게 행할 수 있다. 상기 간행물의 개시 및 이 간행물에 있어서 인용된 모든 문헌의 개시를 참조에 의해 본 명세서의 개시로서 포함한다.
또한, 본 발명의 지질막 구조체에 siRNA를 봉입할 때, 필요에 따라 핵산 도입 기능을 갖는 화합물을 첨가할 수도 있다. 이와 같은 화합물로서는, 예를 들어 O,O'-N-디도데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디에탄올아민 클로라이드, O,O'-N-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디에탄올아민 클로라이드, O,O'-N-디헥사데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디에탄올아민 클로라이드, O,O'-N-디옥타데세노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디에탄올아민 클로라이드, O,O',O"-트리데카노일-N-(ω-트리메틸암모니오데카노일)아미노메탄 브로마이드 및 N-[α-트리메틸암모니오아세틸]-디도데실-D-글루타메이트, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복사미드)에틸)-N,N-디메틸-1-프로판암모늄 트리플루오로아세테이트, 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸암모늄 브로마이드, 3-β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 등을 들 수 있다. 이들 핵산 도입 기능을 갖는 화합물은, 지질막 구조체의 막의 임의의 위치에 배치되어 있어도 되고／되거나 지질막 구조체의 내부에 충전되어 있어도 된다.
다기능성을 부가한 엔벨로프형 나노 구조체(MEND)가 알려져 있으며, 본 발명의 지질막 구조체로서 적합하게 사용할 수 있다. MEND로서는, 예를 들어 플라스미드 DNA 등의 핵산과 프로타민 등의 양이온성 폴리머의 복합체를 코어로 하고, 이 코어가 리포솜 형태의 지질 엔벨로프막의 내부에 봉입된 구조를 갖는 것이 보고되어 있다. 또한, MEND의 지질 엔벨로프막에는, 필요에 따라 pH 응답성이나 막 투과성을 조절하기 위한 펩티드를 배치할 수 있고, 지질 엔벨로프막의 외측 표면은 폴리에틸렌글리콜 등의 알킬렌글리콜로 수식할 수 있다는 것도 보고되어 있다. MEND의 지질 엔벨로프의 내부에 응축화된 DNA 및 양이온성 폴리머가 봉입되고, 효율적으로 유전자 발현을 달성할 수 있도록 설계된 MEND도 알려져 있다. MEND에 대해서는, 예를 들어 비특허문헌 1 등의 총설을 참조할 수 있다. 상기 간행물의 개시 및이 총설에 있어서 인용된 모든 문헌의 개시를 참조에 의해 본 명세서의 개시로서 포함한다.
지질막 구조체의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 수계 용매(예를 들어 물, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 등)에 분산된 형태나 이 수성 분산물을 동결 건조한 형태 등을 들 수 있다.
지질막 구조체의 제조 방법도 특별히 한정되지 않으며, 당업자에게 이용 가능한 임의의 방법을 채용할 수 있다. 일례를 들면, 모든 지질 성분을 클로로포름 등의 유기 용매에 용해하고, 증발기에 의한 감압 건고나 분무 건조기에 의한 분무 건조를 행함으로써 지질막을 형성한 후, 수계 용매를 건조한 상기의 혼합물에 첨가하고, 또한 호모지나이저 등의 유화기, 초음파 유화기, 또는 고압 분사 유화기 등에 의해 유화함으로써 제조할 수 있다. 또한, 리포솜을 제조하는 방법으로서 잘 알려져져 있는 방법, 예를 들어 역상 증발법 등에 의해서도 제조할 수 있다. 지질막 구조체의 크기를 제어하고 싶은 경우에는, 구멍 직경이 정렬된 멤브레인 필터 등을 사용하여, 고압하에서 익스트루전(압출 여과)을 행하면 된다. 분산된 상태의 지질막 구조체의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 리포솜의 경우에는 평균 입자경 60 내지 140 ㎚ 정도, 바람직하게는 80 내지 120 ㎚ 정도, 또 다른 바람직한 양태로서 평균 입자경 20 내지 50 ㎚ 정도인 것이 녹다운 효율의 점에서 바람직한 경우가 있다. 입자경은, 예를 들어 DLS(dynamic light scattering)법에 의해 측정할 수 있다. 본원 명세서에 있어서, 지질막 구조체의 평균 입자경이란, DLS에 의해 측정된 개수 평균 입자경을 의미한다. DLS에 의한 측정은, 시판하고 있는 DLS 장치 등을 사용하여 통상의 방법에 의해 행할 수 있다.
수계 용매(분산매)의 조성은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 인산 완충액, 시트르산 완충액, 인산 완충 생리 식염액 등의 완충액, 생리 식염수, 세포 배양용의 배지 등을 들 수 있다. 이들 수계 용매(분산매)는 지질막 구조체를 안정적으로 분산시킬 수 있지만, 또한 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스, 이노시톨, 리보오스, 크실로오스당의 단당류, 유당, 자당, 셀로비오스, 트레할로오스, 말토오스 등의 이당류, 라피노오스, 메레디노오스 등의 삼당류, 시클로덱스트린 등의 다당류, 에리트리톨, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말티톨 등의 당알코올 등의 당(수용액)이나, 글리세린, 디글리세린, 폴리글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜모노알킬에테르, 디에틸렌글리콜모노알킬에테르, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올(수용액) 등을 첨가해도 된다. 이 수계 용매에 분산된 지질막 구조체를 안정적으로 장기간 보존하기 위해서는, 응집 억제 등의 물리적 안정성의 면에서, 수계 용매 중의 전해질을 최대한 배제하는 것이 바람직하다. 또한, 지질의 화학적 안정성의 면에서, 수계 용매의 pH를 약산성으로부터 중성 부근(pH3.0 내지 8.0 정도)으로 설정하고／하거나 질소 버블링 등에 의해 용존 산소를 제거하는 것이 바람직하다.
얻어진 지질막 구조체의 수성 분산물을 동결 건조 또는 분무 건조하는 경우에는, 예를 들어 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스, 이노시톨, 리보오스, 크실로오스당의 단당류; 유당, 자당, 셀로비오스, 트레할로오스, 말토오스 등의 이당류; 라피노오스, 메레디노오스 등의 삼당류, 시클로덱스트린 등의 다당류; 에리트리톨, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말티톨 등의 당알코올; 등의 당(수용액)을 사용하면 안정성을 개선할 수 있는 경우가 있다. 또한, 상기 수성 분산물을 동결하는 경우에는, 예를 들어 상기의 당류나 글리세린, 디글리세린, 폴리글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜모노알킬에테르, 디에틸렌글리콜모노알킬에테르, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올(수용액)을 사용하면 안정성을 개선할 수 있는 경우가 있다.
본 발명의 지질막 구조체의 내부에는, siRNA의 기능을 저해하지 않는 범위에서 다른 물질을 봉입할 수 있다. 봉입 가능한 물질의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 항종양제, 항염증제, 항균제, 항바이러스제 등의 임의의 의약의 유효 성분 이외에, 당류, 펩티드류, 핵산류, 저분자 화합물, 금속 화합물 등 임의의 물질을 봉입할 수 있다. 핵산으로서는, 예를 들어 유전자를 포함하는 핵산을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 예를 들어 플라스미드에 혼입된 유전자 등을 들 수 있지만, 이 특정한 양태에 한정되는 것은 아니다.
특허문헌 6에는, YSK12를 포함하는 지질 화합물의 합성 방법, 당해 지질 화합물을 사용한 지질막 구조체의 조제 방법, 및 얻어진 지질막 구조체에 대해서 THP-1 세포(인간 단구주)에 대한 유전자 발현 억제 작용 및 Jurkat 세포(인간 T 세포주)에 대한 유전자 발현 억제 작용이 구체적으로 나타나 있다. 특허문헌 6의 개시의 모두를 참조에 의해 본 명세서의 개시에 포함한다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
예 1
본 발명의 지질 화합물을 이하의 스킴에 따라서 합성하였다. 소수성 기반이 YSK12(특허문헌 6)와 동일한 경우, 즉 일반식 (A) 중의 c가 0인 지질을 합성하는 경우에는, 출발로서 리놀레산(화합물 A)을 사용하였다. 리놀레산을 수소화 리튬알루미늄으로 환원 후(화합물 B), 수산기를 메실화함으로써 활성화하고(화합물 C), 브롬화마그네슘을 작용시킴으로써 브롬화하였다(화합물 D). δ-발레로락톤을 기질로서 그리냐르 반응을 행함으로써 2개의 리놀레산 유래 소수성 기반을 연결하였다(화합물 E). 제3급 아미노기를 탄화수소쇄에 직접 결합시키는 경우에는, 제1급 수산기를 토실화에 의해 활성화하고(화합물 F), 친핵 치환 반응에 의해 아미노기를 도입하였다.
한편, 에스테르 결합을 통해 제3급 아미노기를 결합시키는 경우에는, 제1급 수산기에 대해서 아미노산을 탈수 축합함으로써 연결하였다. 소수성 기반에 에스테르 결합을 포함하는 지질, 예를 들어 일반식 (A) 중의 c가 1이며, R1 및 R2 중에 에스테르 결합을 포함하는 지질의 합성에는, 직쇄 알칸(탄소수 6 내지 10)의 양 말단 탄소 원자에 결합하는 수소 원자가 브롬 원자와 수산기로 하나씩 치환된 물질(화합물 G)을 출발 원료로서 사용하였다. 수산기를 tert-부틸디메틸실릴에테르화함으로써 보호하고(화합물 H), 상술과 마찬가지로 그리냐르 반응에 의해 2분자를 연결시켰다(화합물 I). 상술과 마찬가지로, 제1급 수산기 부분에 직접 혹은 에스테르 결합을 통해 제3급 아미노기를 도입 후(화합물 J, M), 실릴에테르를 탈보호하고(화합물 K, N), 탈수 축합에 의해 임의의 직쇄 지방산을 연결하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
이하의 실시예에 있어서, 지질 화합물의 명명은 이하의 부분 구조에 따라서 「양이온성 지질(Cationic Lipid(CL))-친수성 부위 번호-소수성 기반 2번호-소수성 기반 1번호」라고 표기하였다. 예를 들어, 특허문헌 6에 개시되어 있는 YSK12는 「CL1A6」이라고 표기된다.
Figure pct00009
Figure pct00010
(1) ((6-브로모헥실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란
6-브로모헥산-1-올 20.0 g(110.5 mmol)을 150 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 4℃로 냉각하였다. tert-부틸디메틸클로로실란(TBSCl) 18.0 g(120 mmol)을 첨가한 후, 트리에틸아민(TEA) 19.5 mL(140 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 헥산 300 mL를 첨가하여 현탁시켜, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거함으로써 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여, ((6-브로모헥실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 26.0 g(88.0 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 80％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.31-1.54 (m, 6H), 1.86 (m, 2H), 3.40 (t, 2H), 3.96 (t, 2H).
(2) 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)운데칸-1,5-디올
4 mL의 디에틸에테르에 ((6-브로모헥실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 1.2 g(4.06 mmol)을 용해하고, 절삭칩상 마그네슘 2.43 g(100 mmol)을 첨가하여, 계속해서 요오드 1절편 첨가하였다. 실온에서 10분 정치한 후, 오일 배스에서 40℃로 가열하면서 교반하고, 21 mL의 디에틸에테르에 용해한 ((6-브로모헥실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 24.8 g(83.94 mmol)을 적하하였다. 40℃에서 2시간 반응시킨 후, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, δ-발레로락톤 3.67 mL(39.6 mmol)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 다음으로, 4℃로 냉각하고, 5％ 황산을 적하함으로써 잔류된 마그네슘을 용해시켰다. 디에틸에테르로 희석하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)운데칸-1,5-디올 14.0 g(26.3 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. δ-발레로락톤으로부터의 수율은 66％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.25-1.56 (m, 26H), 3.59 (t, 4H), 3.65 (t, 2H).
(3) 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 4-메틸벤젠술포네이트
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)운데칸-1,5-디올 14.0 g(26.3 mmol)을 50 mL의 디클로로메탄에 용해하고, DMAP(N,N-디메틸-4-아미노피리딘) 321 ㎎(2.63 mmol)과 디이소프로필에틸아민(DIPEA) 5.50 mL(39.5 mmol)를 첨가하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, p-톨루엔술포닐 클로라이드(pTsCl) 6.02g(31.6 mmol)을 서서히 첨가해 간 후, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 아세트산에틸로 현탁하고, 물 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 4-메틸벤젠술포네이트 12.4 g(28.0 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 69％였다.
(4) 11-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,19,19,20,20-옥타메틸-4,18-디옥사-3,19-디실라헤니코산-11-올
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 4-메틸벤젠술포네이트 12.4 g(18.0 mmol)에 30 mL의 테트라히드로푸란을 첨가하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, 디프로필아민 7.38 mL(54.0 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 11일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 11-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,19,19,20,20-옥타메틸-4,18-디옥사-3,19-디실라헤니코산-11-올 7.27 g(11.8 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 66％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.24-1.64 (m, 30H), 2.30-2.43 (m, 6H), 3.58 (t, 4H).
(5) 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올
11-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,19,19,20,20-옥타메틸-4,18-디옥사-3,19-디실라헤니코산-11-올 7.27 g(11.8 mmol)에 아세트산 2.23 mL(39 mmol) 및 26 mL의 1.0 M 테트라부틸암모늄플루오라이드의 테트라히드로푸란 용액을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 역상 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 물(0.1％ 트리플루오로아세트산):아세토니트릴 0.1％ 트리플루오로아세트산)(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 3.43 g(8.85 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 75％였다.
(6) 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디올레에이트(CL4H6)
7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 388 ㎎(1.0 mmol)을5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 올레일 클로라이드 900 ㎎(3.0 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. TEA 697 μL(5.0 mmol)를 적하하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디올레에이트(CL4H6) 570 ㎎(0.622 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 62％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 12H), 1.18-1.71 (m, 74H), 2.01 (m, 8H), 2.24-2.30 (t, 4H), 2.32-2.42 (m, 6H), 4.04 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
Figure pct00011
(7) 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL4C6)
7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 77.5 ㎎(0.20 mmol)을 1 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 미리스토일 클로라이드 197 ㎎(0.80 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. DIPEA 205 μL(1.2 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL4C6) 93 ㎎(0.115 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 58％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 12H), 1.18-1.68 (m, 74H), 2.27 (t, 4H), 2.42-2.53 (br, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure pct00012
(8) 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL4D6)
7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 77.5 ㎎(0.20 mmol)을 1 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 팔미토일 클로라이드 220 ㎎(0.80 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. DIPEA 205 μL(1.2 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL4D6) 143 ㎎(0.164 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 82％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 12H), 1.18-1.68 (m, 82H), 2.27 (t, 4H), 2.45-2.53 (br, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure pct00013
(9) 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)운데칸-1,5-디올 5.33 g(10.0 mmol)을 50 mL의 디클로로메탄에 용해하고, DMAP 122 ㎎(1.0 mmol)과 1-메틸피페리딘-4-카르복시산 염산염 2.16 g(12.0 mmol)을 첨가하였다. 계속해서, EDCI 2.49 g(13.0 mmol)을 서서히 첨가해 간 후, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 5.01 g(7.61 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 76％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.25-2.01 (m, 26H), 2.23 (br.s, 4H), 2.78 (m, 2H), 3.58 (t, 4H), 4.08 (t, 2H).
(10) 5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 5.01 g(7.61 mmol)에 아세트산 1.43 mL(25 mmol) 및 20 mL의 1.0 M 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 테트라히드로푸란 용액을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 역상 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 물(0.1％ 트리플루오로아세트산):아세토니트릴 0.1％ 트리플루오로아세트산)(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 2.34 g(5.45 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 72％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝1.25-1.45 (m, 20H), 1.52 (m, 4H), 1.62 (m, 2H), 1.86 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 2.50-2.70 (m, 6H), 3.16 (m, 2H), 3.53 (t, 4H), 4.11 (t, 2H).
(11) 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디올레에이트(CL15H6)
5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 430 ㎎(1.00 mmol)을 10 mL의 디클로로메탄에 용해하였다. 계속해서, 올레산 706 ㎎(2.50 mmol), DMAP 24.4 ㎎(0.20 mmol) 및 EDCI 671 ㎎(3.5 mmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디올레에이트(CL15H6) 569 ㎎(0.594 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 59％였다.
1H NMR;400 MHz) 데이터 δ＝0.88 (t, 6H), 1.20-2.05 (m, 78H), 2.28 (m, 8H), 2.82 (m, 2H), 4.07 (m, 6H), 5.33 (m, 4H).
Figure pct00014
(12) 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디도데카노에이트(CL15B6)
5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 85.9 ㎎(0.20 mmol)을 1.5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 라우로일 클로라이드 143 ㎎(0.60 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. TEA 139 μL(1.00 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디도데카노에이트(CL15B6) 101.2 ㎎(0.127 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 64％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.20-2.13 (m, 70H), 2.28 (m, 8H), 2.84 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure pct00015
(13) 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL15C6)
5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 85.9 ㎎(0.20 mmol)을 1.5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 미리스토일 클로라이드 163 ㎎(0.60 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. TEA 139 μL(1.00 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL15C6) 116 ㎎(0.136 mmol)을 박황색 고체로서 얻었다. 수율은 68％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.20-2.10 (m, 78H), 2.28 (m, 8H), 2.82 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure pct00016
(14) 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL15D6)
5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 85.9 ㎎(0.20 mmol)을 1.5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 팔미토일 클로라이드 181 ㎎(0.60 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. TEA 139 μL(1.00 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL15D6) 114 ㎎(0.126 mmol)을 박황색 고체로서 얻었다. 수율은 63％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.20-2.11 (m, 86H), 2.28 (m, 8H), 2.83 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure pct00017
(15) 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디스테아레이트(CL15E6)
5,11-디히드록시5-(6-히드록시헥실)운데실 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 85.9 ㎎(0.20 mmol)을 1.0 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 계속해서 스테아로일 클로라이드 181 ㎎(0.80 mmol)을 첨가한 후, 4℃로 냉각하였다. TEA 139 μL(1.00 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-히드록시7-(4-((1-메틸피페리딘-4-카르보닐)옥시)부틸)트리데칸-1,13-디일 디스테아레이트(CL15E6) 141 ㎎(0.146 mmol)을 박황색 고체로서 얻었다. 수율은 73％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.20-2.10 (m, 94H), 2.28 (m, 8H), 2.83 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure pct00018
(16) (9z,12z)-옥타디엔-1-올
4℃로 냉각한 테트라히드로푸란(THF) 190 mL에, 수소화 리튬알루미늄 2.73 g(72 mmol)을 현탁하였다. 거기에 리놀레산 10 g(36 mmol)을 적하하고, 10분간 교반하였다. 그 후, 오일 배스에서 가열하면서 하룻밤 환류하였다. 이것을 냉각한 후, 1 mol/L의 수산화나트륨 수용액 100 mL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 다음으로, 아세트산에틸 100 mL를 첨가하여 희석한 후, 여과하고, 여액을 포화 탄산수소나트륨 수용액을 사용하여 세정하였다. 계속해서, 유기층을 회수하고, 거기에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하고, (9z,12z)-옥타디엔-1-올 8.68 g(32.6 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 91％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 3H), 1.25-1.36 (m, 16H), 1.53-1.58 (m, 2H), 2.02-2.06 (m, 4H), 2.76 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 5.29-5.40 (m, 4H).
(17) (9z,12z)-옥타디엔-1-메탄술포네이트
(9z,12z)-옥타디엔-1-올 8.68 g(32.6 mmol)을 100 mL의 디클로로메탄에 용해한 후, N,N-디메틸-4-아미노피리딘(DMAP) 366 ㎎(3.26 mmol), 트리에틸아민(TEA) 6.8 mL(48.9 mmol)를 첨가하였다. 계속해서, 적하 깔때기를 사용하여, 50 mL의 디클로로메탄으로 희석한 메탄술포닐 클로라이드(MsCl) 3.03 mL(39.1 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응액을 회수하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 사용하여 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하고, (9z,12z)-옥타디엔-1-메탄술포네이트 10.64 g(30.9 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 95％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 3H), 1.06-1.18 (m, 18H), 1.70-1.90 (m, 2H), 2.00-2.19 (m, 4H), 2.79 (t, 2H), 3.06 (s, 3H), 4.20 (t, 2H), 5.21-5.42 (m, 4H).
(18) 18-브로모-옥타데크-(6z,9z)-디엔
(9z,12z)-옥타디엔-1-메탄술포네이트 10.64 g을 140 mL의 디에틸에테르에 용해한 후, 브롬화마그네슘에틸에테레이트 16.0 g(61.8 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응액을 회수하고, 100 mL의 포화 탄산수소나트륨 수용액을 사용하여 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하고, 18-브로모-옥타데크-(6z,9z)-디엔 8.85 g(26.9 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 87％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 3H), 1.27-1.46 (m, 18H), 1.80-1.88 (m, 2H), 2.00-2.09 (m, 4H), 2.77 (t, 2H), 3.40 (t, 2H), 4.20 (d, 2H), 5.29-5.41 (m, 4H).
(19) 4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올
1.5 mL의 디에틸에테르에 18-브로모-옥타데크-(6z,9z)-디엔 50 g(1.52 mmol)을 용해하고, 절삭칩상 마그네슘 609 ㎎(25.1 mmol)을 첨가하고, 계속해서 요오드 1절편을 첨가하였다. 실온에서 10분간 정치한 후, 오일 배스에서 45℃로 가열하면서 교반하고, 6 mL의 디에틸에테르에 용해한 18-브로모-옥타데크-(6z,9z)-디엔 5.0 g(15.2 mmol)을 적하하였다. 45℃에서 1시간 반응시킨 후, 실온에 냉각하였다. 계속해서, δ-발레로락톤 300 μL(3.23 mmol)를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다음으로, 4℃로 냉각하고, 여과한 후, 여액을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하고, 4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 1.64 g(2.73 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. δ-발레로락톤으로부터의 수율은 85％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.25-1.1.46 (m, 46H), 2.02-2.06 (m, 8H), 2.77 (t, 4H), 3.66 (t, 2H), 5.30-5.40 (m, 8H).
(20) 4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 301 ㎎(0.50 mmol)을 5.0 mL의 디클로로메탄에 용해하고, DMAP 6.11 ㎎(0.05 mmol)과 TEA 83.6 μL(0.60 mmol)를 첨가하고, 계속해서 p-톨루엔술포닐 클로라이드(pTsCl) 95.3 ㎎(0.50 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 계속해서, 반응액에 실리카겔을 첨가하고, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 293 ㎎(0.39 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 78％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 3H), 1.25-1.49 (m, 46H), 2.03-2.05 (m, 8H), 2.44 (s, 3H), 2.77 (t, 4H), 4.03 (t, 2H), 5.31-5.39 (m, 8H), 7.34 (d, 2H), 7.78 (d, 2H).
(21) 1-N,N-디메틸아미노-4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 293 ㎎(0.39 mmol)에 10 mL의 2.0 M 디메틸아민의 THF 용액을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 100 mL의 디클로로메탄을 첨가하고, 100 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 155 ㎎(0.25 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 64％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.23-1.40 (m, 46H), 2.02-2.07 (m, 8H), 2.26 (s, 6H), 2.33 (t, 2H), 2.77 (t, 4H), 5.31-5.39 (m, 8H).
Figure pct00019
(22) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(에틸(메틸)아미노)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 650 ㎎(0.86 mmol)을 4 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 에틸메틸아민 0.86 mL(10 mmol)을 첨가하고, 40℃에서 3일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 432 ㎎(0.673 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 78％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.20-1.67 (m, 49H), 2.03 (m, 8H), 2.38-2.75 (m, 7H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00020
(23) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(디에틸아미노)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 603 ㎎(0.80 mmol)을 4 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 디에틸아민 1.04 mL(10 mmol)를 첨가하고, 40℃에서 3일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 401 ㎎(0.611 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 77％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.20-1.67 (m, 52H), 2.03 (m, 8H), 2.38-2.75 (m, 6H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00021
(24) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(디프로필아미노)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 189 ㎎(0.25 mmol)을 1.5 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 디프로필아민 41 μL(0.3 mmol)를 첨가하고, 실온에서 8일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 81 ㎎(0.118 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 47％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.22-1.60 (m, 50H), 2.03 (m, 8H), 2.30-2.48 (m, 6H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00022
(25) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(벤질(메틸)아미노)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 189 ㎎(0.25 mmol)을 1.5 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, N-벤질메틸아민 39 μL(0.3 mmol)를 첨가하고, 실온에서 8일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 97.4 ㎎(0.138 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 55％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.23-1.60 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 2.37 (t, 2H), 2.77 (t, 4H), 3.47 (s, 2H), 5.35 (m, 8H), 7.30 (m, 5H).
Figure pct00023
(26) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(피페리딘-1-일)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 189 ㎎(0.25 mmol)을 1.5 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 피페리딘 30 μL(0.3 mmol)를 첨가하고, 실온에서 8일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 85.0 ㎎(0.127 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 51％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.22-1.68 (m, 52H), 2.03 (m, 8H), 2.30-2.52 (m, 6H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00024
(27) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-모르폴리노부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 227 ㎎(0.30 mmol)을 2 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 모르폴린 87.1 ㎎(1.0 mmol)을 첨가하고, 실온에서 7일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 디클로로메탄을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 60.0 ㎎(0.09 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 30％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.22-1.65 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.34 (t, 2H), 2.42 (br, 4H), 2.77 (t, 4H), 3.71 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00025
(28) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(4-메틸피페라진-1-일)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 227 ㎎(0.30 mmol)을 2 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 1-메틸피페라진 100.2 ㎎(1.0 mmol)을 첨가하고, 실온에서 7일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 디클로로메탄을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 79.0 ㎎(0.116 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 39％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.87 (t, 6H), 1.22-1.65 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.26-2.65 (m, 13H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00026
(29) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(4-이소프로필피페라진-1-일)부틸)헵타트리콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올
4-[(9z,12z)-옥타디에닐]-1-p-톨루엔술포닐-(13z,16z)-트리코사디엔-4-올 189 ㎎(0.25 mmol)을 2 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 1-이소프로필피페라진 42.7 μL(0.3 mmol)를 첨가하고, 실온에서 8일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 116 ㎎(0.163 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 65％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.05 (d, 6H), 1.20-1.60 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.31-2.68 (m, 11H), 2.76 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00027
(30) (14Z,17Z)-5-히드록시-5-((9Z,12Z)-옥타데크-9,12-디엔-1-일)트리코사-14,17-디엔-1-일 2-(피롤리딘-1-일)아세테이트
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 120.2 ㎎(0.20 mmol)을 1.0 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 1-피롤리딘아세트산 38.7 ㎎(0.30 mmol)을 첨가하고, 계속해서 DMAP 6.1 ㎎(0.05 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDCI) 57.5 ㎎(0.30 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 117 ㎎(0.164 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 82％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.22-1.69 (m, 46H), 1.82 (br, 4H), 2.03 (m, 8H), 2.65 (br, 4H), 2.77 (t, 4H), 3.33 (s, 2H), 4.13 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00028
(31) (14Z,17Z)-5-히드록시-5-((9Z,12Z)-옥타데크-9,12-디엔-1-일)트리코사-14,17-디엔-1-일 2-(피페리딘-1-일)아세테이트
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 120.2 ㎎(0.20 mmol)을 1.0 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 1-피페리딘아세트산 43.0 ㎎(0.30 mmol)을 첨가하고, 계속해서 DMAP 6.1 ㎎(0.05 mmol) 및 EDCI 57.5 ㎎(0.30 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 130 ㎎(0.179 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 90％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.22-1.67 (m, 52H), 2.03 (m, 8H), 2.50 (br, 4H), 2.77 (t, 4H), 3.18 (s, 2H), 4.12 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00029
(32) (14Z,17Z)-5-히드록시-5-((9Z,12Z)-옥타데크-9,12-디엔-1-일)트리코사-14,17-디엔-1-일 3-(디메틸아미노)프로파노에이트
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 601 ㎎(1.0 mmol)을 5.0 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 3-(디메틸아미노)프로피온산 염산염 153.6 ㎎(1.0 mmol)을 첨가하고, 계속해서 DMAP 12.2 ㎎(0.1 mmol) 및 EDCI 230 ㎎(1.2 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 50 mL의 디클로로메탄을 첨가하고, 50 mL의 1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 351 ㎎(0.501 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 50％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.22-1.72 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.24 (s, 3H), 2.50 (t, 2H), 2.62 (t, 2H), 2.78 (t, 4H), 4.09 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00030
(33) (14Z,17Z)-5-히드록시-5-((9Z,12Z)-옥타데크-9,12-디엔-1-일)트리코사-14,17-디엔-1-일 3-(디에틸아미노)프로파노에이트
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 180 ㎎(0.30 mmol)을 2.0 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 3-(디에틸아미노)프로피온산 염산염 72.7 ㎎(0.40 mmol)을 첨가하고, 계속해서 DMAP 6.0 ㎎(0.05 mmol) 및 EDCI 96 ㎎(0.50 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 디클로로메탄을 첨가하고, 5 mL의 1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 151 ㎎(0.207 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 69％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.03 (t, 6H), 1.22-1.44 (m, 46H), 1.62 (m, 2H), 2.03 (m, 8H), 2.41-2.56 (m, 6H), 2.78 (m, 6H), 4.07 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00031
(34) (14Z,17Z)-5-히드록시-5-((9Z,12Z)-옥타데크-9,12-디엔-1-일)트리코사-14,17-디엔-1-일 3-(피페리딘-1-일)프로파노에이트
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 120.2 ㎎(0.20 mmol)을 1.0 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 1-피페리딘프로피온산 47.2 ㎎(0.30 mmol)을 첨가하고, 계속해서 DMAP 6.1 ㎎(0.05 mmol) 및 EDCI 57.5 ㎎(0.30 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 5 mL의 0.5 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 80.4 ㎎(0.109 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 55％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.22-1.66 (m, 52H), 2.04 (m, 8H), 2.40 (br, 4H), 2.51 (br, 2H), 2.66 (br, 2H), 2.78 (t, 4H), 4.09 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure pct00032
(35) (14Z,17Z)-5-히드록시-5-((9Z,12Z)-옥타데크-9,12-디엔-1-일)트리코사-14,17-디엔-1-일 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트
4-[(9z,12z)-옥타데카디에닐]-(13z,16z)-트리코사디엔-1,4-디올 842 ㎎(1.40 mmol)을 10 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 1-메틸-4-피페리딘카르복실산 200 ㎎(1.40 mmol)을 첨가하고, 계속해서 DMAP 17.1 ㎎(0.14 mmol) 및 EDCI 383 ㎎(2.0 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 50 mL의 아세트산에틸을 첨가하고, 50 mL의 1 M 수산화나트륨 수용액으로 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 877 ㎎(1.21 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 86％였다.
1H NMR;500 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.23-1.45 (m, 46H), 1.55-2.08 (m, 17H), 2.25 (s, 3H), 2.79 (t, 4H), 4.08 (t, 2H), 5.30-5.40 (m, 8H).
Figure pct00033
(36) 11-(4-(디메틸아미노)부틸)-2,2,3,3,19,19,20,20-옥타메틸-4,18-디옥사-3,19-디실라헤니코산-11-올
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 4-메틸벤젠술포네이트 8.78 g(12.78 mmol)에 50 mL의 2.0 M 디메틸아민의 THF 용액을 첨가하고, 실온에서 6일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 6.20 g(11.07 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 87％였다.
(37) 7-(4-(디메틸아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올
11-(4-(디메틸아미노)부틸)-2,2,3,3,19,19,20,20-옥타메틸-4,18-디옥사-3,19-디실라헤니코산-11-올 6.20 g(11.07 mmol)에 아세트산 1.90 mL(33.21 mmol) 및 24.4 mL의 1.0 M 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 테트라히드로푸란 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 역상 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 물(0.1％ 트리플루오로아세트산):아세토니트릴 0.1％ 트리플루오로아세트산)(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 2.86 g(8.63 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 80％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝1.20-1.60 (m, 26H), 2.80 (s, 6H), 3.02 (t, 2H), 3.62 (t, 4H).
(38) 7-(4-(디메틸아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL1C6)
7-(4-(디메틸아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 431 ㎎(1.30 mmol)을 5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 미리스트산 713 ㎎(3.12 mmol) 및 DMAP 31.8 ㎎(0.26 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 748 ㎎(3.90 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디메틸아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL1C6) 472 ㎎(0.627 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 48％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 6H), 1.16-1.70 (m, 70H), 2.22 (s, 6H), 2.28 (m, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure pct00034
(39) 7-(4-(디메틸아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL1D6)
7-(4-(디메틸아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 431 ㎎(1.30 mmol)을 5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 팔미트산 800 ㎎(3.12 mmol) 및 DMAP 31.8 ㎎(0.26 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 748 ㎎(3.90 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디메틸아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL1D6) 557 ㎎(0.689 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 53％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 6H), 1.16-1.70 (m, 78H), 2.22 (s, 6H), 2.28 (m, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure pct00035
(40) 7-(4-(디메틸아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL1C6)
7-(4-(디메틸아미노)부틸)트리데칸-1,7,13-트리올 1.99 g(6.0 mmol)을 20 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 올레산 4.07 g(14.4 mmol) 및 DMAP 147 ㎎(1.20 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 3.45 g(18.0 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 7-(4-(디메틸아미노)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디올레이트(CL1H6) 2.56 g(2.98 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 50％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 6H), 1.16-1.75 (m, 66H), 2.01 (m, 8H), 2.21-2.35 (m, 12H), 4.04 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
Figure pct00036
(41) 11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 3-(디메틸아미노)프로파노에이트
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)운데칸-1,5-디올 12.73 g(23.9 mmol)을 50 mL의 디클로로메탄에서 용해하고, 3-(디메틸아미노)프로판산 염산염 4.04 g(26.3 mmol) 및 DMAP 293 ㎎(2.4 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 5.50 g(28.7 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 0.5 M 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 6.66 g(10.54 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 44％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.23-1.66 (m, 26H), 2.22 (s, 6H), 2.47 (t, 2H), 2.62 (t, 2H), 3.60 (t, 4H), 4.08 (t, 2H).
(42) 5,11-디히드록시-5-(6-히드록시헥실)운데실 3-(디메틸아미노)프로파노에이트
11-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(6-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)헥실)-5-히드록시운데실 3-(디메틸아미노)프로파노에이트 6.66 g(10.54 mmol)에 아세트산 1.82 mL(31.6 mmol) 및 21.1 mL의 1.0 M 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 THF 용액을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 역상 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 물(0.1％ 트리플루오로아세트산):아세토니트릴 0.1％ 트리플루오로아세트산)(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 2.40 g(5.95 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 57％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝1.22-1.50 (m, 20H), 1.52-1.70 (m, 6H), 2.81 (s, 6H), 2.87 (t, 2H), 3.33 (t, 2H), 3.63 (t, 4H), 4.12 (t, 2H).
(43) 7-(4-((3-(디메틸아미노)프로파노일)옥시)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디테트라데카노에이트(CL12C6)
5,11-디히드록시-5-(6-히드록시헥실)운데실 3-(디메틸아미노)프로파노에이트 800 ㎎(2.0 mmol)을 5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 미리스트산 1.005 g(4.4 mmol) 및 DMAP 48.9 ㎎(0.40 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 959 ㎎(5.0 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 737 ㎎(0.894 mmol)을 백색 고체로서 얻었다. 수율은 45％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.18-1.70 (m, 70H), 2.22-2.31 (m, 10H), 2.48 (t, 2H), 2.61 (t, 2H), 4.05 (m, 6H).
Figure pct00037
(44) 7-(4-((3-(디메틸아미노)프로파노일)옥시)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디팔미테이트(CL12D6)
5,11-디히드록시-5-(6-히드록시헥실)운데실 3-(디메틸아미노)프로파노에이트 800 ㎎(2.0 mmol)을 5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 팔미트산 1.128 g(4.4 mmol) 및 DMAP 48.9 ㎎(0.40 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 959 ㎎(5.0 mmol)을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 690 ㎎(0.784 mmol)을 백색 고체로서 얻었다. 수율은 39％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.18-1.70 (m, 78H), 2.22-2.31 (m, 10H), 2.48 (t, 2H), 2.61 (t, 2H), 4.05 (m, 6H).
Figure pct00038
(45) 7-(4-((3-(디메틸아미노)프로파노일)옥시)부틸)-7-히드록시트리데칸-1,13-디일 디올레이트(CL12H6)
5,11-디히드록시-5-(6-히드록시헥실)운데실 3-(디메틸아미노)프로파노에이트 800 ㎎(2.0 mmol)을 5 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 올레산 1.243 g(4.4 mmol) 및 DMAP 48.9 ㎎(0.40 mmol)을 첨가하고, 계속해서 EDCI 959 ㎎(5.0 mmol)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 874 ㎎(0.937 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 47％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (t, 6H), 1.11-1.68 (m, 66H), 2.01 (m, 8H), 2.22-2.31 (m, 10H), 2.48 (t, 2H), 2.62 (t, 2H), 4.04 (m, 6H), 5.32 (m, 4H).
Figure pct00039
(46) ((8-브로모옥틸)옥시)(tert-부틸)디메틸실란
8-브로모옥탄-1-올 17.78 g(85.0 mmol)을 100 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 4℃로 냉각하였다. TBSCl 13.86 g(92.0 mmol)을 첨가한 후, TEA 15.33 mL(110 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 헥산 300 mL를 첨가하여 현탁시켜, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거함으로써 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하고, 14.0 g(44.3 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 51％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.04 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.31 (m, 6H), 1.42 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.85 (tt, 2H), 3.40 (t, 2H) 3.59 (t, 2H).
(47) 13-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(8-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)옥틸)트리데칸-1,5-디올
4 mL의 디에틸에테르에 ((8-브로모옥틸)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 0.70 g(2.17 mmol)을 용해하고, 절삭칩상 마그네슘 1.26 g(52 mmol)을 첨가하고, 계속해서 요오드 1절편 첨가하였다. 실온에서 10분 정치한 후, 오일 배스에서 40℃로 가열하면서 교반하고, 11 mL의 디에틸에테르에 용해한 ((8-브로모옥틸)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 13.3 g(41.13 mmol)을 적하하였다. 40℃에서 2시간 반응시킨 후, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, δ-발레로락톤 1.81 mL(19.5 mmol)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 다음으로, 4℃로 냉각하고, 5％ 황산을 적하함으로써 잔류된 마그네슘을 용해시켰다. 디에틸에테르로 희석하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 8.00 g(13.58 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. δ-발레로락톤으로부터의 수율은 70％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.25-1.60 (m, 34H), 3.59 (t, 4H), 3.65 (t, 2H).
(48) 13-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(8-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)옥틸)-5-히드록시트리데실 4-메틸벤젠술포네이트
13-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(8-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)옥틸)트리데칸-1,5-디올 8.00 g(13.58 mmol)을 30 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, DMAP 183 ㎎(1.50 mmol)과 TEA 2.79 mL(20.0 mmol)를 첨가하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, pTsCl 2.86 g(15.0 mmol)을 서서히 첨가해 간 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 아세트산에틸로 현탁하고, 물 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 무색 오일로서 얻었다.
(49) 13-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,23,23,24,24-옥타메틸-4,22-디옥사-3,23-디실라펜타코산-13-올
13-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(8-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)옥틸)-5-히드록시트리데실 4-메틸벤젠술포네이트 10.09 g(13.58 mmol)에 30 mL의 1,2-디클로로에탄을 첨가하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, 디프로필아민 3.71 mL(27.2 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 10일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 5.86 g(8.72 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 64％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 0.98 (t, 6H), 1.22-1.80 (m, 38H), 2.98 (m, 6H), 3.58 (t, 4H).
(50) 9-(4-(디이소프로필아미노)부틸)헵타데칸-1,9,17-트리올
13-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,23,23,24,24-옥타메틸-4,22-디옥사-3,23-디실라펜타코산-13-올 4.50 g(6.70 mmol)에 아세트산 1.72 mL(30 mmol) 및 20 mL의 1.0 M 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 THF 용액을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 역상 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 물(0.1％ 트리플루오로아세트산):아세토니트릴 0.1％ 트리플루오로아세트산)(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 2.03 g(4.57 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 68％였다.
(51) 9-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-7-히드록시헵타데칸-1,17-디일 디올레에이트(CL4H8)
9-(4-(디이소프로필아미노)부틸)헵타데칸-1,9,17-트리올 222 ㎎(0.50 mmol)을 2.5 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, 올레일 클로라이드 451 ㎎(1.50 mmol)을 첨가한 후, TEA 836 μL(6.0 mmol)를 적하하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.2 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 68.4 ㎎(0.070 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 14％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 12H), 1.20-1.68 (m, 82H), 2.01 (m, 8H), 2.27 (t, 4H), 2.32-2.45 (m, 6H), 4.04 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
Figure pct00040
(52) ((10-브로모데실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란
10-브로모데칸-1-올 25.0 g(105.4 mmol)을 100 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 4℃로 냉각하였다. TBSCl 17.3 g(115 mmol)을 첨가한 후, TEA 19.5 mL(140 mmol)를 적하하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 헥산 300 mL를 첨가하여 현탁시켜, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거함으로써 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 21.0 g(59.8 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. 수율은 57％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.24-1.34 (m, 10H), 1.42 (tt, 2H), 1.51 (tt, 2H), 1.72-1.88 (m, 2H), 3.40 (t, 2H), 3.59 (t, 2H).
(53) 15-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시) 데실)펜타데칸-1,5-디올
4 mL의 디에틸에테르에 ((10-브로모데실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 1.05 g(2.99 mmol)을 용해하고, 절삭칩상 마그네슘 1.75 g(72.0 mmol)을 첨가하고, 계속해서 요오드 1절편 첨가하였다. 실온에서 10분 정치한 후, 오일 배스에서 40℃로 가열하면서 교반하고, 11 mL의 디에틸에테르에 용해한 ((10-브로모데실)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 19.95 g(56.81 mmol)을 적하하였다. 40℃에서 2시간 반응시킨 후, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, δ-발레로락톤 3.67 mL(39.6 mmol)를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 다음으로, 4℃로 냉각하고, 5％ 황산을 적하함으로써 잔류된 마그네슘을 용해시켰다. 디에틸에테르로 희석하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 계속해서, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 11.95 g(18.52 mmol)을 무색 오일로서 얻었다. δ-발레로락톤으로부터의 수율은 69％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.22-1.60 (m, 42H), 3.59 (t, 4H), 3.66 (t, 2H).
(54) 15-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시) 데실)-5-히드록시펜타데실 4-메틸벤젠술포네이트
15-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)데실)펜타데칸-1,5-디올 6.00 g(9.30 mmol)을 30 mL의 1,2-디클로로에탄에 용해하고, DMAP 114 ㎎(0.93 mmol)과 TEA 3.24 mL(23.25 mmol)를 첨가하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, pTsCl 2.13 g(11.16 mmol)을 서서히 첨가해 간 후, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 아세트산에틸로 현탁하고, 물 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 헥산:아세트산에틸(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 무색 오일로서 얻었다.
(55) 15-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,27,27,28,28-옥타메틸-4,26-디옥사-3,27-디실라노나코산-15-올
15-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(10-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)데실)-5-히드록시펜타데실 4-메틸벤젠술포네이트 1.66 g(2.08 mmol)에 5 mL의 THF를 첨가하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, 디프로필아민 569 μL(4.16 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 21일간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 1 M 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 1.80 g(2.47 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 27％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.05 (s, 12H), 0.89 (m, 24H), 1.23-1.62 (m, 46H), 2.30-2.44 (m, 6H), 3.58 (t, 4H).
(56) 11-(4-(디이소프로필아미노)부틸)헤니코산-1,11,21-트리올
15-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-2,2,3,3,27,27,28,28-옥타메틸-4,26-디옥사-3,27-디실라노나코산-15-올 1.80 g(2.47 mmol)에 아세트산 515 μL(9.0 mmol) 및 6 mL의 1.0 M 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 THF 용액을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 역상 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 물(0.1％ 트리플루오로아세트산):아세토니트릴 0.1％ 트리플루오로아세트산)(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 1.01 g(2.02 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 82％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.99 (t, 6H), 1.20-1.79 (m, 46H), 3.00 (m, 6H), 3.63 (t, 4H).
(57) 11-(4-(디이소프로필아미노)부틸)-11-히드록시헤니코산-1,21-디일 디올레에이트(CL4H10)
11-(4-(디이소프로필아미노)부틸)헤니코산-1,11,21-트리올 250 ㎎(0.50 mmol)을 4 mL의 디클로로메탄에 용해하고, 4℃로 냉각하였다. 계속해서, 올레일 클로라이드 602 ㎎(2.0 mmol)을 첨가한 후, DMAP 12.2 ㎎(0.10 mmol) 및 피리딘 322 μL(4.0 mmol)를 적하하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거한 후, 아세트산에틸로 현탁하고, 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여액을 0.5 N 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 분액 세정하였다. 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하여 탈수하였다. 이것을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증류 제거하고, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피{용리 용매; 디클로로메탄:메탄올(연속 구배)}에 제공함으로써 정제하여 42.5 ㎎(0.041 mmol)을 박황색 오일로서 얻었다. 수율은 8.3％였다.
1H NMR;400 MHz δ＝0.88 (m, 12H), 1.17-1.65 (m, 90H), 2.01 (m, 8H), 2.28 (t, 4H), 2.30-2.45 (m, 6H), 4.05 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
예 2
소수성 기반이 리놀레산 유래이며, 여러 가지 친수성 부위를 갖는 pH 감수성 양이온성 지질의 평가를 행하였다. LNP는 특허문헌 6의 실시예(예 2)의 방법에 준하고, 각 pH 감수성 양이온성 지질, 콜레스테롤, 메톡시폴리에틸렌글리콜 2000 디미리스토일글리세롤(PEG-DMG 2000)을 몰비 50:50:0.75-1.5로 하고, 알코올 희석법(도 1)에 의해 조제하였다. 상적 광산란법에 의해 산출되는 평균 입자경은 80-120 ㎚이며, siRNA 탑재율은 90％ 이상이었다.
p-톨루엔술폰산(TNS)을 사용하여 각 LNP의 pKa를 구하였다. TNS(최종 농도: 0.75 μM)와 LNP(최종 농도: 30 μM)를 각 pH로 조정한 완충액 중에서 혼합하고, 마이크로플레이트 리더로 형광 강도를 측정하였다. 가장 높은 값 및 낮은 값을 각각 100％ 및 0％ 하전으로 하고, 50％ 하전율을 나타내는 pH를 pKa로서 산출하였다. 그 결과, 제3급 아미노기 주변의 화학 구조에 의해 4.5 이하부터 8.2까지의 폭넓은 범위에서 여러 가지 pKa를 나타냈다(도 2).
엔도솜 탈출 활성의 지표로서의 용혈 활성, 시험관내 녹다운 활성 및 생체내 F7 녹다운 활성을 측정하였다. 용혈 활성에 관해서는, 마우스 적혈구와 LNP를 pH6.5에 조정한 완충액 중에서 혼합하고, 37℃, 30 min 인큐베이트 후에 원심하고, 상청의 545 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. LNP를 첨가하지 않은 샘플 및 최종 농도 0.5％의 Triton X-100을 첨가한 샘플을 각각 네거티브, 포지티브 컨트롤로서 각 샘플의 용혈 효율을 산출하였다. 시험관내 녹다운 활성에 관해서는, 듀얼-루시페라제(dual-luciferase) 안정 발현 HeLa(HeLa-dluc) 세포에, 루시페라제에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를 여러 가지 농도로 첨가하고, 24 시간 후에 듀얼-루시페라제 검정에 의해 녹다운 효율을 산출하였다. 첨가 농도에 대한 표적 루시페라제 발현량을 플롯하고, 50％ 억제하는 siRNA 농도를 IC50으로서 산출하였다. 생체내 F7 녹다운 활성에 관해서는, ICR 마우스(4주령, 자성)에 F7에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를 0.1 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 24시간 후에 있어서의 혈장 중 F7 효소 활성을 측정하였다. pKa에 대한 각 활성을 플롯하였다(도 3).
생체내 F7 녹다운 활성은 pKa 6.4 정도를 최대 활성으로 하는 벨형의 pKa 의존성을 나타내고(도 3a), 이것은 기보와 마찬가지의 결과였다(비특허문헌 10; 비특허문헌 13)). 벤치마크인 CL1A6(YSK12)보다도 우수한 녹다운 활성을 나타내는 유도체가 복수 알아내졌다. 시험관내 녹다운 활성은 pKa의 상승에 수반하여 향상되어 가는 결과가 되었다(도 3b). 용혈 활성도 pKa의 상승에 수반하여 향상되어 가는 결과가 되었다(도 3c). 어느 활성도 대략 예측되는 pKa 의존성을 나타낸다는 점에서, 제3급 아미노기 주변의 화학 구조 변화는 pH 감수성 양이온성 지질의 pKa에 크게 영향을 주는 한편, 그 이외의 부분의 성질에 대한 영향은 비교적 적다는 것이 시사되었다. 바꾸어 말하면, 제3급 아미노기 주변의 화학 구조를 바꿈으로써 pKa만을 목적의 값으로 조절하는 것이 가능하다는 것이 시사되었다.
예 3
친수성 부위를 CL4 및 CL15의 2종에 고정하고, 소수성 기반의 화학 구조를 변화시켰을 때의 영향을 예 2와 마찬가지로 하여 평가하였다. TNS를 사용하여 pKa를 측정한바, CL4에서는 6.25-6.40, CL15에서는 6.80-7.25로 소수성 기반 구조 변화에 의한 영향은 보이지 않았다(도 4a 및 4b). 시험관내 녹다운 활성에 관해서는, CL15B를 제외한 다른 유도체에서, 종래의 소수성 기반을 갖는 CL15A보다도 우수하였다(도 5). 특히 올레산을 소수성 기반에 갖는 CL15H에서는 CL15A와 비교하여 약 3배 정도의 높은 활성을 나타냈다. 생체내 F7 녹다운 활성에 관해서는, CL4, CL15 모두 소수성 기반 C, D의 활성은 낮은 한편, 소수성 기반 H가 소수성 기반 A와 동 정도 이상의 활성을 나타냈다(도 6a 및 6b).
특히 높은 F7 녹다운 활성을 나타낸 CL4H에 대해서, 지질 조성 및 지질/siRNA 전하비에 착안하여 녹다운 활성의 관점에서 제제 처방의 최적화를 행하였다. CL4H:콜레스테롤의 몰비를 30:70으로부터 70:30으로 변화시켜서 LNP를 조제하였다. 실험의 결과, CH4H:콜레스테롤비 60:40에서 최대 활성을 나타냈다(도 7a). 지질/siRNA 전하비를 2.375-14.25의 범위에서 변화시켜서 LNP를 조제하였다. 실험의 결과, 전하비의 상승에 수반하여 녹다운 활성은 상승하고, 전하비 7 정도에서 플래토에 달하였다(도 7b). 이 결과로부터, 전하비 14.25를 최적 전하비로 하였다. 이상의 검토로부터 최적화된 처방으로 CL4H-LNP를 조제하고, F7 녹다운의 투여량 의존성을 검토한 결과, ED50에서 0.002 ㎎ siRNA/kg을 나타냈다(도 8).
예 4
CL4H-LNP의 생체내에 있어서의 안전성을 검토하였다. ICR 마우스(4주령, 자성)에 7 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 24시간 후에 있어서의 혈장 중 알라닌 트랜스아미나제(alanin transaminase)(ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase)(AST)값 및 투여 전후의 체중 변화의 측정을 행하였다. 비교 대상으로서, 개발자가 이전에 개발한 pH 감수성 양이온성 지질 YSK13-C3을 사용하고, 지질 조성은 YSK13-C3-LNP에서 최적화된 pH 감수성 지질:콜레스테롤:PEG-DMG 2000＝70:30:3(몰비)로 하였다. YSK13-C3-LNP는 ALT 및 AST 모두 10,000을 초과하는 강한 간독성을 나타낸 한편, CL4H-LNP는 PBS 투여군과 동 레벨의 경미한 간독성에 머물렀다(도 9a). 또한, 체중 변화에 대해서는 YSK13-C3-LNP 투여군에서는 체중 저하가 보이는 한편, CL4H-LNP에서는 체중 증가로 바뀌었다(도 9b). 이상의 결과로부터, CL4H는 안전성이 우수한 지질 화합물이라는 것이 나타났다.
평균 입자경 35 ㎚ 정도의 작은 LNP의 siRNA 도입 활성에 부여하는 소수성 기반의 영향을 검토하였다. 지질 조성을 pH 감수성 양이온성 지질:콜레스테롤:PEG-DMG 2000＝70:30:3(몰비)로 하고, 마이크로 믹서 내장 마이크로 유로를 사용하여 루시페라제에 대한 siRNA를 탑재한 LNP의 제조를 행하였다. HeLa-dluc 세포에 있어서의 루시페라제 녹다운 활성을 측정한 결과, 종래의 리놀레산 유래 소수성 기반을 갖는 CL15A에서는 30 nM siRNA에서 30％ 이하의 녹다운 효율에 머무르는 조건 하에서, CL15C, CL15D 및 CL15H는 10 nM siRNA에서 모두 50％ 이상의 높은 녹다운 효율을 나타냈다(도 10). 이 결과는, 긴 소수성 기반을 갖는 pH 감수성 양이온성의 지질 화합물에 의해, LNP의 소형화에 수반하는 siRNA 도입 효율의 저하를 극복할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
예 5
친수성 부위를 CL4에 고정한 3종의 지질 화합물(CL4H6, CL4H8, 및 CL4H10)을 사용하여, 상기 소수성 기반 1의 화학 구조를 변화시켰을 때의 영향을 예 2와 마찬가지로 하여 평가하였다. TNS를 사용하여 pKa를 측정한바, CL4H6에서는 6.35, CL4H8에서는 6.10, CL4H10에서는 5.85이며, 소수성 기반 1의 탄소쇄의 길이가 길수록 pKa는 저하되었다(도 11). 생체내 F7 녹다운 활성은, ICR 마우스로 F7에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를 정맥 내 투여하고 나서 24시간 후에, 혈장 중 F7 효소 활성을 측정하였다. 이 결과, 3종류의 유도체 모두 활성을 가지고 있었다. 그 중에서도 CL4H6이 가장 우수한 활성을 나타냈다(도 12).
예 6
CL4H6과, 비특허문헌 11 등에 기재되어 있는 지질 화합물 YSK05 및 YSK13-C3에 대해서, 생체내 F7 녹다운 활성을 측정하여, 투여로부터 24시간 후의 siRNA의 잔존량과의 관계를 조사하였다. 생체내 F7 녹다운 활성은, 각 지질 화합물을 사용하여 예 2와 마찬가지로 하여 F7에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를 조제하고, 각 LNP를, ICR 마우스(4주령, 자성)에 0.01 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 투여 후 30분 후와 24시간 후에, 각 마우스로부터 간장을 회수하고, 간장 중의 siRNA를 qRT-PCR법에 의해 정량하였다. 투여 후 30분 후의 간장에 있어서의 siRNA는, 어느 지질 화합물을 사용한 LNP에서도 동 정도이고, 간장 이행량은 거의 동등하다는 것이 확인되었다(도 13a). 한편, 투여 후 24시간 후의 간장에 있어서의 siRNA 잔존량에는 큰 차가 보였다(도 13b). CL4H6-LNP를 투여한 간장의 siRNA 잔존량은, YSK05-LNP를 투여한 간장의 17.3배, YSK13-C3-LNP를 투여한 간장의 4.8배였다. 또한, 각 LNP를 투여한 마우스의 F7 녹다운에 있어서의 ED50을 구하고, 이 값과 투여 후 24시간 후의 간장에 있어서의 siRNA 잔존량은, 반비례의 관계에 있었다(도 13c). 이들 결과는, CL4H6-LNP가 효율적으로 엔도솜을 탈출하여, siRNA를 세포질로 송달하고 있다는 것을 시사하고 있었다.
또한, 각 LNP를, ICR 마우스(4주령, 자성)에 1 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 투여 후 1시간 후의 마우스의 간장을 절제하고, 핵(Hoechst33342), 혈관(FITC), 지질(DiI), 및 siRNA(Cy5)를 각각 형광 염색하고, 공초점 레이저 현미경(CLSM)으로 관찰하였다. 이 결과, 간 실질 세포의 세포질에 있어서의 siRNA의 형광량은, CL4H6-LNP를 투여한 마우스가 가장 많고， CL4H6-LNP가 siRNA를 효율적으로 세포질로 송달하고 있는 모습이 관찰되었다(도 14).
각 LNP를, ICR 마우스(4주령, 자성)에 0.3 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 혈장 중 F7 단백질의 양을 경시적으로 정량하였다. 각 회수일의 LNP 미투여 마우스(NT)의 혈장 중 F7 단백질량을 100으로 한 상대 혈장 중 F7 단백질량의 경시적 변화를 도 15a에 나타낸다. CL4H6-LNP를 투여한 마우스가 가장 장기간, 상대 혈장 중 F7 단백질량을 낮게 억제할 수 있었다. 또한, 각 LNP를 투여한 마우스의 F7 녹다운에 있어서의 ED50을 구한바, 이 값과 상대 혈장 중 F7 단백질량이 50으로 되는 LNP 투여 후 경과 시간(지속성)(일)은, 부의 상관관계에 있었다(도 15b). 즉, CL4H6-LNP는, 동일한 siRNA 투여량에 있어서, YSK05-LNP 및 YSK13-C3-LNP보다도 유전자 녹다운 활성이 장기에 걸쳐서 지속되었다.
혈장 중 F7 단백질은, Biophen FVII 검정 키트(Hypen BioMed제)를 사용한 정색 반응에 의해 정량하였다. 이 정색 반응은, 먼저, FVII 단백질을 키트 중의 조직 인자(TF)와 복합체화시킨다. 얻어진 FVII-TF 복합체에 의해 키트 중의 제X 인자(FX)를 활성화(FXa)시켜, 그 효소 활성으로 발색 기질을 산생시킨다. 산생된 발색 기질의 양을, 405 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하여 정량하였다.
각 LNP를, ICR 마우스(4주령, 자성)에 1 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 경시적으로 간장 및 비장을 회수하고, LC/MS로 각 양이온성 지질을 정량하였다. 이 결과, 간장 및 비장에 있어서의 YSK05 및 YSK13-C3은, 투여 후 72시간 경과 시점까지 거의 일정한 것에 비해서, CL4H6의 조직 내 함유량은, 간장과 비장의 어느 것에 있어서도 경시적으로 감소한다는 것이 확인되었다(도 16a 및 16 b). 이들 결과로부터, CL4H6은 생분해성이 풍부하다는 것이 나타나고, 높은 안전성에 기여하고 있다고 생각되었다.
예 7
CL4H6-LNP를 메톡시폴리에틸렌글리콜 2000 디스테아로일글리세롤(PEG-DSG 2000)로 더 수식함으로써 혈중의 체류 시간을 장기화하고, 또한 암세포에 있어서의 녹다운 활성을 평가하였다.
구체적으로는, 먼저, 예 2와 마찬가지로 하여 CL4H6-LNP를 사용하여 PLK1에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를 조제하였다. 얻어진 CL4H6-LNP를, pH 6.0의 10％ EtOH 수용액에 PEG-DSG 2000과 함께 분산시키고, 60℃에서 30분간 인큐베이트함으로써, CL4H6-LNP를 PEG-DMG 2000로 더 수식하였다. 이 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP를, ICR 마우스(4주령, 자성)에 0.5 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 혈중 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP양을 경시적으로 정량하였다. PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP의 마우스에게 투여한 양(ID)을 100％로 한 상대 혈중 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP양의 경시적 변화를 도 17에 나타낸다.
PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP와 마찬가지로 하여, PEG-DSG 수식 YSK05-LNP를 조제하였다. 이어서, 각 LNP를, OSRC2 세포(인간 신세포 암 유래) 피하 이식 마우스에게 2 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내 투여하고, 투여 후 24시간 후에 있어서의 암 조직 중의 PLK1 유전자의 발현량을 qRT-PCR법으로 측정하였다. 이 결과, LNP 미투여의 컨트롤 마우스(NT)의 암 조직에 있어서의 PLK1 발현량을 1로 한 상대 PLK1 발현량은, PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP를 투여한 마우스와 PEG-DSG 수식 YSK05-LNP를 투여한 마우스의 양쪽에서 유의하게 낮았다. 특히 PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP는, PEG-DSG 수식 YSK05-LNP보다도 상대 혈중 PLK1 발현량이 낮아, 우수한 녹다운 활성이 보였다(도 18a).
또한, 각 LNP를 투여 후 24시간 후의 OSRC2 세포 피하 이식 마우스의 체중을 측정하여, 투여 전의 체중으로부터의 변화율(％)을 조사하였다(도 18b). PEG-DSG 수식 YSK05-LNP를 투여한 마우스에서는, 투여 후에는 약간 체중의 감소가 관찰되었지만, PEG-DSG 수식 CL4H6-LNP를 투여한 마우스에서는, PEG-DSG 수식 YSK05-LNP를 투여한 마우스에서는 거의 체중의 변동은 없었다. 이들 결과로부터, PEG-DSG 수식 YSK05-LNP는 안전성이 높고, 다양하게 사용할 수 있다는 것이 시사되었다.
예 8
CD45에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6을 포함하는 LNP를 골수 유래 마크로파지에 도입하고, CD45 유전자의 녹다운 활성을 측정하였다.
먼저, 지질 조성이 양이온성 지질(CL4H6), 콜레스테롤, 및 PEG-DMG 2000을 몰비 60:40:2로 하고, 또한 CD45에 대한 siRNA를 사용한 것 이외는 예 2와 마찬가지로 하여, CD45에 대한 siRNA를 여러 가지 농도로 탑재한 CL4H6-LNP를 조제하였다.
ICR 마우스 골수 세포로부터 유도한 마크로파지의 배양 배지에, CD45에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP를 첨가하고, 24시간 배양하였다. 비교 대상으로서, 당해 마크로파지에 리포펙타민 시약(Lipofectamine RNAiMAX, Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여 CD45에 대한 siRNA를 트랜스펙션하고, 24시간 배양하였다. 각 마크로파지의 24시간 배양 후에 있어서의 CD45 유전자의 발현량을, qRT-PCR법으로 측정하였다. CD45에 대한 siRNA 미투여의 마크로파지(NT)에 있어서의 CD45의 발현량을 100％로 한 각 마크로파지의 상대 CD45 발현량(％)의 결과를 도 19에 나타낸다. CD45에 대한 siRNA를 CL4H6-LNP에 탑재하여 트랜스펙션한 마크로파지의 쪽이, 리포펙타민 시약을 사용하여 CD45에 대한 siRNA를 트랜스펙션한 마크로파지보다도 10배 이상 높은 효율에서 유전자 녹다운을 유도하였다.
예 9
CD45에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를, OSRC2 세포 피하 이식 마우스에게 투여하고, CD45 유전자의 녹다운 활성을 측정하였다.
먼저, 지질 조성이 양이온성 지질(CL4H6 또는 YSK05), 콜레스테롤, 및 PEG-DSG 2000을 몰비 70:30:2로 하고, 또한 CD45에 대한 siRNA를 사용한 것 이외는 예 2와 마찬가지로 하여, CD45에 대한 siRNA를 탑재한 LNP를 조제하였다.
각 LNP를, OSRC2 세포 피하 이식 마우스에게 2 ㎎ siRNA/kg/용량으로 2일 연속하여 정맥 내 투여하였다. 최종 투여로부터 48시간 후에 있어서의 종양 관련 마크로파지의 CD45 유전자의 발현량을, 플로우 사이토메트리로 측정하였다. siRNA 미투여의 종양 관련 마크로파지(NT)에 있어서의 CD45 발현량을 100％로 한 경우의 각종양 관련 마크로파지의 상대 CD45 발현량(％)의 결과를 도 20에 나타낸다. CD45에 대한 siRNA를 CL4H6-LNP에 탑재하여 투여한 마우스의 쪽이, YSK05-LNP에 탑재하여 투여한 마우스보다도, 종양 관련 마크로파지에 있어서의 CD45의 상대 발현량이 낮았다. 즉, CL4H6은, 종양 관련 마크로파지에 있어서 우수한 유전자 녹다운을 유도하였다.
예 10
CL4H6을 포함하는 LNP를 마우스에 반복 투여하고, 안전성을 평가하였다. LNP에 탑재하는 siRNA로서는, 마우스에 대한 약리 활성이 없는 siRNA를 사용하였다.
먼저, pH 감수성 양이온성 지질로서 CL4H6을 사용하여, 예 2와 마찬가지로 하여 인간 PLK1에 대한 siRNA를 탑재한 LNP(CL4H6-LNP)를 조제하였다. 얻어진 CL4H6-LNP를, ICR 마우스(4주령, 자성)에, 3 또는 4일마다, 0.3 ㎎ siRNA/kg 또는 1 ㎎ siRNA/kg으로 정맥 내에 반복 투여하였다. 구체적으로는, 투여 개시일(0일째), 투여 개시일로부터 4, 7, 11, 14, 18, 21 및 23일째에, CL4H6-LNP를 정맥 내 투여하였다. 0.3 ㎎ siRNA/kg은, F7에 대한 siRNA를 탑재한 CL4H6-LNP의 ED50(0.0025 ㎎ siRNA/kg)(예 6 참조)의 120배의 투여량이며, 1 ㎎ siRNA/kg은 그의 400배의 투여량이다.
투여 개시 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 23 및 28일째에 각 마우스의 체중을 측정하여, 미투여군과 비교하였다. 0.3 ㎎ siRNA/kg 투여군(n＝3), 1 ㎎ siRNA/kg 투여군(n＝3), 및 미투여군(n＝3)의, 투여 개시 0일째의 체중을 100％로 하는 체중 변화율(％)의 경시적 변화를 도 21에 나타낸다. 0.3 ㎎ siRNA/kg 투여군 및 1 ㎎ siRNA/kg 투여군의 체중 변화의 추이는, 미투여군과 거의 동등하며, CL4H6-LNP의 반복 투여에 의한 전신 독성은 보이지 않았다.
CL4H6-LNP의 반복 투여 개시로부터 28일째에, 0.3 ㎎ siRNA/kg 투여군, 1 ㎎ siRNA/kg 투여군, 및 미투여군의 각 마우스의 혈청을 채취하고, 혈액학적 파라미터, 구체적으로는, 총 단백질(TP:g/dL), 알부민(ALB:g/dL), 요소질소(BUN:mg/dL), 크레아티닌(CRE:mg/dL), 나트륨(Na:mEq/L), 칼륨(K:mEq/L), 염화물(Cl:mEq/L), 칼슘(Ca:mg/dL), 무기 인(IP:mg/dL), 아스파르트산 아미노기 전이 효소(AST:IU/L), 알라닌 아미노기 전이 효소(ALT:IU/L), 락트산 탈수소 효소(LDH:IU/L), 아밀라아제(AMY:IU/L), g-글루타밀기 전이 효소(γ-GT:IU/L), 총 콜레스테롤(T-CHO:mg/dL), 중성 지방(TG:mg/dL), 고밀도 리포단백질-콜레스테롤(HDL-C:mg/dL), 총 빌리루빈(T-BIL:mg/dL), 및 글루코오스(GLU:mg/dL)를 측정하였다. 각 측정은 통상의 방법에 의해 행하였다.
Figure pct00041
Figure pct00042
측정 결과를 표 1 및 2에 나타낸다. 어느 항목도, 0.3 ㎎ siRNA/kg 투여군 및 1 ㎎ siRNA/kg 투여군에서는, 미투여군과 비교하여 유의한 변화는 보이지 않았다
CL4H6-LNP의 반복 투여 개시로부터 28일째에, 각 군의 마우스로부터 혈청 채취 후, 간장 및 비장을 회수하여, 병리 조직학적 검사(HE 염색법)를 실시하였다.
Figure pct00043
결과를 표 3에 나타낸다. 0.3 ㎎ siRNA/kg 투여군 및 1 ㎎ siRNA/kg 투여군에서는, 미투여군과 비교하여 두드러진 소견은 보이지 않았다. 이들 결과로부터, CL4H6-LNP는 안전성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 지질 화합물은, siRNA 등의 송달 대상 물질에 대해서 우수한 송달 효율을 달성할 수 있고, 높은 안전성을 양립시키면서, LNP의 입자경의 감소에 수반하는 siRNA 등의 송달 활성의 저하의 극복을 가능하게 하는 지질막 구조체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 지질 화합물을 포함하는 지질막 구조체는, 생분해성과 우수한 엔도솜 탈출능, 및 LNP의 안정화능을 가지고 있으며, 수지상 세포 등의 면역 세포의 세포 내에 siRNA 등을 효율적으로 송달할 수 있다.

Claims (15)

  1. 하기의 식 (I):
    Figure pct00044

    〔식 중, a는 3 내지 5의 정수를 나타내고; b는 0 또는 1의 정수를 나타내고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기의 식 (A):
    Figure pct00045

    (식 중, q는 1 내지 9의 정수를 나타내고; r은 0 또는 1을 나타내고; s는 1 내지 3의 정수를 나타내고; t는 0 또는 1을 나타내고; u는 1 내지 8의 정수를 나타내고; c는 0 또는 1을 나타내고: v는 4 내지 12의 정수를 나타내지만, b와 c가 동시에 0이 되는 경우에는, q가 3 내지 5의 정수이며, r 및 t가 1이며, s가 1이며, 또한 u＋v가 6 내지 10의 정수인 경우를 제외함)로 표시되는 기를 나타내고; X는 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기(단, 당해 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합하고, 당해 환 상에는 1 또는 2개의 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기가 치환되어 있어도 됨), 또는 하기의 식 (B):
    Figure pct00046

    (식 중, d는 0 내지 3의 정수를 나타내고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기(당해 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기는 1개 또는 2개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내지만, R3 및 R4는 서로 결합하여 5 내지 7원 비방향족 헤테로환(당해 환 상에는 1 또는 2개의 C1-4 알킬기 또는 C2-4 알케닐기가 치환되어 있어도 됨)을 형성해도 됨)로 표시되는 기를 나타냄〕
    로 표시되는 지질 화합물 또는 그의 염.
  2. 제1항에 있어서, r 및 t가 0이며, q＋s＋u가 8 내지 18의 정수, 바람직하게는 10 내지 16의 정수인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, r이 1이며, t가 0이며, q가 5 내지 9의 정수이며, s＋u가 5 내지 9의 정수인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, v가 5 내지 12의 정수인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, a가 4이며, b가 0 또는 1인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, b가 0이며, X가 식 (B)로 표시되는 기〔단, d는 0이며, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기(R3이 나타내는 C1-4 알킬기는 1개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내거나, 혹은 R3 및 R4가 서로 결합하는 경우에는, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기(당해 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기는 1개의 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 됨)를 형성함〕인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, b가 1이며, X가 식 (B)로 표시되는 기〔단, d는 0 내지 3의 정수이며, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-4 알킬기(R3이 나타내는 C1-4 알킬기는 1개의 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내거나, 혹은 R3 및 R4가 서로 결합하는 경우에는, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기(당해 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기, 또는 1-피페라지닐기는 1 또는 2개의 동일하거나 또는 상이한 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 됨)를 형성함〕인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, b가 1이며, X가 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기(당해 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합함)이며, 당해 5 내지 7원 비방향족 헤테로환기가 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리닐기, 또는 피페라지닐기(당해 피롤리디닐기, 피페리디닐기, 모르폴리닐기, 또는 피페라지닐기는, 1 또는 2개의 동일하거나 또는 상이한 C1-4 알킬기로 치환되어 있어도 됨)인, 지질 화합물 또는 그의 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내에 siRNA를 송달하기 위한 지질막 구조체의 지질 성분으로서 사용되는, 지질 화합물 또는 그의 염.
  10. 지질 성분으로서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 지질 화합물 또는 그의 염을 포함하는 지질막 구조체.
  11. 제10항에 있어서, 리포솜인, 지질막 구조체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, siRNA가 내부에 봉입되어 있는, 지질막 구조체.
  13. 제12항에 있어서, 세포 내의 표적 유전자를 녹다운하기 위해서 사용되는, 지질막 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포가, 면역 세포 또는 암세포인, 지질막 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 환자에게서 수지상 세포를 분리·채취하고, 시험관내(in vitro)에서 당해 수지상 세포의 세포 내에 siRNA를 도입한 후, 표적 유전자가 녹다운된 수지상 세포를 그 환자에게 투여하는 면역 요법에 있어서, 수지상 세포에 있어서의 표적 유전자를 녹다운하기 위해서 사용되는, 지질막 구조체.
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