CN110740985B - 用于siRNA细胞内递送的脂质膜结构体 - Google Patents

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Abstract

该脂质膜结构体是含有式(I)：(R1)(R2)C(OH)‑(CH2)a‑(O‑CO)b‑X的脂质化合物作为脂质成分的脂质膜结构体。式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1的整数；R1和R2分别独立地表示可具有‑CO‑O‑的直链状烃基；X表示5～7元非芳族杂环基或下述的式(B)所示的基团，式(B)中，d表示0～3的整数，R3和R4分别独立地表示C1‑4烷基或C2‑4烯基，R3和R4可彼此键合形成5～7元非芳族杂环(该环上可被1个或2个的C1‑4烷基或C2‑4烯基取代)。

Description

用于siRNA细胞内递送的脂质膜结构体
技术领域
本发明涉及用于siRNA(short interfering RNA)等的细胞内递送(送達)的脂质膜结构体。更具体而言，本发明涉及可容易地将siRNA等递送至免疫细胞的核内、特别是树突细胞的细胞内的脂质体等的脂质膜结构体。
本申请根据于2017年6月15日在日本申请的特愿2017-117708号要求优先权，并将其内容引用于此。
背景技术
作为将药物特异性地输送到患部的手段，提出了将药物包封作为脂质膜结构体的脂质体中的方法。特别是在恶性肿瘤的治疗领域中，有很多包封抗肿瘤剂的脂质体的有效性的报道。另外，作为可用于基因表达的脂质膜结构体，提出了多功能信封式纳米结构体(MEND：Multifunctional envelope-type nano device，以下，在本说明书中，有时简称为“MEND”。例如参照非专利文献1等)。已知该结构体可用作将基因等选择性地递送到特定的细胞内的药物递送系统(Drug Delivery System)，例如，在肿瘤的基因治疗等中是有用的。
作为使用脂质膜结构体用于将药物、核酸、肽、多肽、糖等目标物质递送至靶器官或肿瘤组织等特异性部位的手段，提出了许多用功能性分子修饰脂质膜结构体的表面的方法。若内封有抗肿瘤剂等药物的脂质膜结构体到达靶细胞，则通过胞吞作用被摄入到细胞内，从而形成被包含在内体中的状态，其后，受到溶酶体的酶的水解作用等，将内封的药物释放到细胞质内。为了提高从被摄入到内体中的脂质体的药物释放性，提出了将脂质体的表面用肽(GALA：非专利文献2)修饰而得的脂质体(非专利文献3)或MEND(专利文献4)。
另外，作为用于使内封核酸等目标物质的脂质膜结构体转运至靶细胞的核内的手段，例如，提出了将脂质体的外侧表面用八聚精氨酸修饰而得的脂质体(专利文献1、非专利文献4)、具有用核转运肽修饰的脂质膜的两层膜脂质体(专利文献2)、用半乳糖或甘露糖等单糖修饰表面而得的脂质体(专利文献3)。据报道，用单糖修饰的多脂质膜结构体(T-MEND)显示与脂质膜和核膜的融合性，在体外的试验结果中，可改善基因表达效率。而且，报道了通过KALA肽(非专利文献5)修饰的脂质膜结构体可有效地将核酸等物质递送至细胞的核内(专利文献5)。
另一方面，由于树突细胞是担负免疫应答的关键作用的抗原呈递细胞，因此是癌症免疫疗法的重要的靶细胞之一。也有人进行了：从癌症患者采取树突细胞，在体外进行抗原导入或活化之后，再对该患者进行给予的免疫细胞疗法(树突细胞疗法)。近年来，由于发现树突细胞中的免疫抑制因子，因此树突细胞作为siRNA药物的靶也备受关注，通过将树突细胞疗法与免疫疗法组合，可期待进行更强力的癌症免疫诱导。
以往，关于将RNA导入至树突细胞的核内，有使用表达shRNA的慢病毒载体敲减免疫抑制因子的报道(非专利文献6、非专利文献7)。但是，几乎没有使用人工递送系统向树突细胞导入siRNA的报道。病毒载体的使用可实现靶基因的高效率敲减，但在安全方面存在问题。
作为siRNA导入用的人工递送系统，报道了R8/GALA-D-MEND(D-MEND)(非专利文献8)。D-MEND是用作为细胞亲和性成分(element)的八聚精氨酸(R8)肽和作为内体逃逸成分(element)的GALA肽对MEND进行修饰，并且控制MEND的包被膜层数的纳米载体。D-MEND在通常使用的癌细胞即HeLa细胞中，在siRNA浓度为12nM的低浓度下，显示约70％的敲减，该活性与被广泛用作一般导入试剂的脂质转染胺(Lipofectamine)2000(LFN2000)进行比较，显示2倍以上的活性。
然而，在用D-MEND转染由小鼠骨髓细胞诱导的树突细胞的情况下，为了达到70-80％的敲减效率需要使siRNA浓度为高浓度(80-120nM)，并且根据siRNA的靶因子还存在敲减效率保持在40％左右的问题(NPL9)。这样，在使用以往的人工递送系统的情况下，与一般的癌细胞相比，树突细胞的敲减效率有大幅降低的倾向，妨碍了siRNA药物向免疫疗法领域的拓展。
迄今为止，为了达到可抑制功能性核酸、尤其是特定的靶基因的表达的siRNA的有效的体内递送，开发了许多的阳离子性脂质。特别是，在生理性pH下为电中性、在内体等的弱酸性pH环境下变成阳离子性的pH敏感性阳离子性脂质的开发显著。Jayaraman等人开发了DLin-MC3-DMA，在小鼠肝脏的第7因子(F7)敲减中，在ED50下达到0.005mg siRNA/kg(非专利文献10)。本发明人迄今为止也开发了独特的pH敏感性阳离子性脂质YSK05和YSK-C3，作为F7敲减中的ED50分别达到0.06、0.015mg siRNA/kg(非专利文献11、非专利文献12、非专利文献13)。另外，Maier等人开发了对MC3-DMA赋予生物降解性的L319，并报道了在ED50下兼具0.01mg siRNA/kg和高安全性(非专利文献14、非专利文献15、非专利文献16)。然而，明确了这些含有上述脂质的脂质纳米颗粒的内体逃逸效率仍然仅为百分之几左右(非专利文献17)，期望开发出可进一步提高生物利用度的技术。
而且，Dong等人通过高通量筛选(High-throughput screening)发现了独特的脂质样物质cKK-E12，在F7敲减中，在ED50下达到0.002mg siRNA/kg(非专利文献18)。该技术在活性方面是文献中最好的，但在高给予量的毒性或脂质的生物降解性等安全方面尚无任何见解。
近年来，逐渐阐明了：许多的癌组织、特别是人患者的癌组织，以胶原为代表的间质成分非常丰富，这些成分显著妨碍了纳米颗粒在癌组织内的渗透性。纳米颗粒的小型化被认为是用于解决该问题的非常有效的策略。实际上，Cabral等人报道了通过将内封铂制剂的高分子胶束的直径控制为小至约30nm，癌组织内渗透性提高，抗肿瘤效果提高(非专利文献19)。尽管同样的策略被认为在siRNA递送中也是非常有效的，但在技术上很难将脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle：LNP)控制得很小，且报道是非常缺乏的。近年来报道了通过使用可达到两种液体的瞬时混合的内置微混合器的微流路，可再现性良好地制造直径为30nm左右的LNP(非专利文献20、非专利文献21)。另一方面，发现了通过使LNP小型化，其siRNA递送活性显著减少(非专利文献22、非专利文献23)。克服该问题在实现优异的癌治疗用siRNA递送技术方面是极其重要的，而目前还没有关于其克服法的见解。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2005/32593号；
专利文献2：国际公开第2006/101201号；
专利文献3：国际公开第2007/102481号；
专利文献4：日本特开2006-28030号公报；
专利文献5：国际公开第2011/132713号；
专利文献6：国际公开第2015/178343号；
非专利文献
非专利文献1：Drug Delivery System,22-2卷,115-122页,2007；
非专利文献2：Biochemistry,26卷,2964-2972页,1987；
非专利文献3：Biochemistry,43卷,5618-5628页,2004；
非专利文献4：Journal of Controlled Release,98卷,317-323页,2004；
非专利文献5：Biochemistry,36卷,3008-3017页,1997；
非专利文献6：Nature Biotechnology,22卷,1546-1553页,2004；
非专利文献7：Nature Medicine,14卷,258-265页,2008；
非专利文献8：Journal of Controlled Release,143卷,311-317页,2010；
非专利文献9：Biological and Pharmaceutical Bulletin,34卷,1348-1351页,2011；
非专利文献10：AngewandteChemie International Edition,51卷,8529-8533页,2012；
非专利文献11：Scientific Reports,4:4750,DOI:10.1038/srep04750,2014；
非专利文献12：Journal of Hepatology,64卷,547-555页,2016；
非专利文献13：Molecular Therapy,24卷,788-795页,2016；
非专利文献14：Molecular Therapy,21(8)卷,1570-1578页,2013；
非专利文献15：Nature Biotechnology,33(8)卷,870-876页,2015；
非专利文献16：Molecular Pharmaceutics,11卷,1424-1434页,2014；
非专利文献17：Nature Biotechnology,31(7)卷,638-646页,2013；
非专利文献18：Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,111(11)卷,3955-3960页,2014；
非专利文献19：Nature Nanotechnology,6卷,815-823页,2011；
非专利文献20：Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces,116(34)卷,18440-18450页,2012；
非专利文献21：Molecular Therapy-Nucleic Acids,1卷,e37,2012；
非专利文献22：Journal of Controlled Release,229卷,48-57页,2016；
非专利文献23：Journal of Controlled Release,235卷,236-244页,2016；
非专利文献24：Journal of Controlled Release,225卷,183-191页,2016；
非专利文献25：American Association of Pharmaceutical ScientistsJournal,14(2)卷,303-315页,2012。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供用于将siRNA等有效地递送至细胞、特别是具有抗原呈递能力的树突细胞之类的免疫细胞的细胞内的手段。更具体而言，本发明的课题在于提供可将siRNA有效地递送至以树突细胞等的免疫细胞为代表的各种细胞的细胞内的脂质膜结构体、和在该脂质膜结构体的制造中有用的新型化合物。
特别是，本发明的课题在于提供兼具siRNA等的优异的递送效率和高安全性、并且可克服LNP的粒径减少所伴随的siRNA等的递送活性的降低的新型化合物和脂质膜结构体。
用于解决课题的手段
首先，本发明人为了实现在免疫细胞、特别是具有抗原呈递能力的树突细胞中的靶基因的有效敲减，深入研究了用于将siRNA有效地递送至细胞内的手段。其结果，发现了：在MEND等脂质膜结构体的形成中，若使用YSK12等脂质化合物作为脂质成分，则可达到非常高的内体逃逸性，所述脂质化合物是在两条脂肪酸链中具有两个不饱和键，并且通过延长亲水部的碳链来提高pKa。而且，还发现了：在由含有该脂质化合物的脂质组合物调制的脂质膜结构体中，可以极其有效地进行通过siRNA的靶基因敲减(非专利文献24、专利文献6)。在使用该脂质膜结构体敲减SOCS1的树突细胞中，观察到细胞因子产生的显著增强，在给予该树突细胞的小鼠组中，移植的肿瘤的植入/增殖被完全抑制。
本发明人为了进一步根据YSK12的结构提供兼具siRNA等向细胞递送的目标物质(以下，有时称为“递送对象物质”)的更优异的递送效率和高安全性、并且可克服LNP的粒径减少所伴随的递送对象物质的递送活性降低的新型化合物和脂质膜结构体，深入研究了可赋予生物降解性、优异的内体逃逸能力和LNP的稳定化能力的新型化合物。作为其手段，首先，从YSK12的叔羟基部位使两条适当长度的烃链延长，经由酯键使中～长链脂肪酸键合。由此，尝试了通过增加疏水性支架(疎水性足場)的链长来提高内体逃逸能力、通过增加脂质分子间的疏水性相互作用来赋予LNP稳定化能力、以及赋予生物降解性。而且，为了调节作为对LNP的动力学赋予较大影响的参数的pH敏感性脂质的酸解离常数(pKa)，尝试了优化作为亲水性部位的氨基周围的化学结构。其结果，确认下述的式(I)所示的化合物具有所期望的性质，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供下述的式(I)所示的脂质化合物或其盐：
[化学式1]
(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X…(I)
式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1的整数；R1和R2分别独立地表示下述的式(A)所示的基团：
[化学式2]
CH3-(CH2)q-(CH＝CH)r-(CH2)s-(CH＝CH)t-(CH2)u-(CO-O)c-(CH2)v-…(A)
式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；s表示1～3的整数；t表示0或1；u表示1～8的整数；c表示0或1；v表示4～12的整数，但在b与c同时为0的情况下，q为3～5的整数、r和t为1、s为1、且u+v为6～10的整数的情况除外；
X表示5～7元非芳族杂环基(其中，该基团通过碳原子与(O-CO)b-键合，该环上可被1个或2个的C1-4烷基或C2-4烯基取代)或下述的式(B)所示的基团：
[化学式3]
-(CH2)d-N(R3)(R4)…(B)
式(B)中，d表示0～3的整数，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基或C2-4烯基(该C1-4烷基或C2-4烯基可被1个或2个苯基取代)，R3和R4可彼此键合形成5～7元非芳族杂环(该环上可被1个或2个的C1-4烷基或C2-4烯基取代)。
根据上述发明的优选方案提供：上述的脂质化合物或其盐，其中，上述的式(A)中，r和t为0，q+s+u为8～18的整数、优选为10～16的整数；上述的脂质化合物或其盐，其中，r为1，t为0，q为5～9的整数、优选为6～8的整数，s+u为5～9的整数、优选为6～8的整数；上述的脂质化合物或其盐，其中，v为5～12的整数、优选为6～10的整数。更优选提供：上述的脂质化合物或其盐，其中，上述的式(A)中，r和t为0，q+s+u为8～18的整数、优选为10～16的整数，v为5～12的整数、优选为6～10的整数；上述的脂质化合物或其盐，其中，r为1，t为0，q为5～9的整数、优选为6～8的整数，s+u为5～9的整数、优选为6～8的整数，v为5～12的整数、优选为6～10的整数。
根据上述发明的优选方案，提供上述的脂质化合物或其盐，其中，上述的式(I)中，a为4，b为0或1。作为更优选的方案，提供上述的脂质化合物或其盐，其中，上述的式(I)中，a为4；b为0或1；R1和R2分别独立地为式(A)所示的基团中，是r和t为0，q+s+u为8～18的整数、优选为10～16的整数，v为5～12的整数、优选为6～10的整数的基团，或者是r为1，t为0，q为5～9的整数、优选为6～8的整数，s+u为5～9的整数、优选为6～8的整数，v为5～12的整数、优选为6～10的整数的基团。
另外，根据另一个优选的方案提供：上述的脂质化合物或其盐，其中，上述的式(I)中，b为0，X为式(B)所示的基团(其中，d为0，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基(R3所示的C1-4烷基可被1个苯基取代)，或者在R3和R4彼此键合的情况下，形成1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基(该1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基可被1个C1-4烷基取代)；上述的脂质化合物或其盐，其中，b为1，X为式(B)所示的基团(其中，d为1～3的整数，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基(R3所示的C1-4烷基可被1个苯基取代)，或者在R3和R4彼此键合的情况下，形成1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基(该1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基可被1个或2个相同或不同的C1-4烷基取代)；上述的脂质化合物或其盐，其中，X所示的5～7元非芳族杂环基(该基团通过碳原子与(O-CO)b-键合)为吡咯烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基(该吡咯烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基可被1个或2个相同或不同的C1-4烷基取代)。
从另一个观点出发，根据本发明，提供上述的式(I)所示的脂质化合物或其盐，其用作用于将siRNA等的递送对象物质递送至细胞内的脂质膜结构体的脂质成分。根据该发明的优选方案提供：上述的脂质化合物，其中，该细胞为免疫细胞或癌细胞，更优选为树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或癌细胞；上述的脂质化合物或其盐，其中，该脂质膜结构为脂质体；以及上述的脂质化合物或其盐，其中，该脂质膜结构体为多功能信封式纳米结构体(MEND)。
从又一个观点出发，根据本发明，提供脂质膜结构体，其含有上述的式(I)所示的脂质化合物作为脂质成分。该脂质膜结构体例如为脂质体。另外，根据该发明的优选方案，该脂质膜结构体是用于将物质、优选siRNA递送至细胞内的脂质膜结构体，并且使siRNA等的递送对象物质包封在内部。该脂质膜结构体可用于敲减细胞内的靶基因。根据该发明的优选方案，该细胞为免疫细胞或癌细胞，更优选为树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或癌细胞。例如，该脂质膜结构体可用于敲减具有抗原呈递能力的树突细胞中的靶基因。因此，从上述的观点出发，根据本发明，还提供上述的脂质膜结构体，其用于敲减细胞、优选免疫细胞或癌细胞，更优选树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或癌细胞中的靶基因。
另外，根据另一个优选的方案提供：脂质膜结构体，其含有1种或2种以上选自上述式(I)的脂质化合物、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、胆固醇(Chol)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油和甲氧基聚乙二醇2000二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG2000)的化合物作为脂质成分；脂质膜结构体，其含有1种或2种以上选自上述式(I)的脂质化合物、胆固醇(Chol)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油和甲氧基聚乙二醇2000二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG2000)的化合物作为脂质成分；上述的的脂质膜结构体，其中，细胞为免疫细胞，优选为树突细胞、单核细胞或巨噬细胞；上述的脂质膜结构体，其为脂质体；以及上述的脂质化合物，其为多功能信封式纳米结构体(MEND)。
另外，根据本发明，提供将siRNA等的递送对象物质递送至细胞、优选免疫细胞、特别优选树突细胞的细胞内的方法，所述方法包括下述的步骤：使递送对象物质包封在内部，并且使含有上述的式(I)所示的脂质化合物作为脂质成分的上述的脂质膜结构体与细胞接触。该方法可在包括人在内的哺乳类动物的生物体内进行，也可使用从生物体分离/采取的细胞在体外进行。
例如，在使用树突细胞的情况下，对于从患者分离/采取的树突细胞，通过上述的方法将递送对象物质导入至细胞内之后，通过将靶基因被敲减的树突细胞给予该患者，可进行树突细胞疗法。因此，根据本发明，提供免疫疗法，该方法包括：从患者分离/采取树突细胞，在体外将递送对象物质导入至树突细胞的细胞内之后，将靶基因被敲减的树突细胞给予该患者。另外，根据本发明，还提供上述的脂质膜结构体，其用于在免疫疗法中敲减树突细胞中的靶基因，所述免疫疗法是：从患者分离/采取树突细胞，在体外将递送对象物质导入至树突细胞的细胞内之后，将靶基因被敲减的树突细胞给予该患者。
发明效果
本发明的脂质化合物可提供下述的脂质膜结构体，其兼具siRNA等的递送对象物质的优异的递送效率和高安全性，并且可克服LNP的粒径减小所伴随的siRNA等的递送活性的降低。另外，对于该脂质膜结构体可赋予生物降解性、优异的内体逃逸能力和LNP的稳定化能力。根据发明所提供的脂质膜结构体，可有效地转运到含有树突细胞的免疫细胞等、难以导入siRNA等的递送对象物质的任意细胞的细胞内，并且可有效地从内体逃逸。由此，该脂质膜结构体可在细胞内有效地释放被包封的递送对象物质，通过该递送对象物质敲减靶基因。因此，使用本发明的脂质膜结构体，可在例如癌症治疗中进行利用siRNA等物质的有效免疫疗法、优选树突细胞疗法。另外，若将本发明所提供的脂质化合物用作脂质成分来调制脂质体等的脂质膜结构体，则可达到非常高的内体逃逸性，可从含有该脂质化合物的脂质膜结构体向细胞质中高效地递送siRNA等的递送对象物质。
附图说明
[图1]是通过醇稀释法进行的LNP的调制顺序的示意图。
[图2]是显示例2中、含有亲水性部位的化学结构各自不同的脂质化合物的各LNP的pKa的图。
[图3A]是显示例2中、含有亲水性部位的化学结构各自不同的脂质化合物的各LNP的体内F7敲减活性的图。
[图3B]是显示例2中、含有亲水性部位的化学结构各自不同的脂质化合物的各LNP的体外敲减活性的图。
[图3C]是显示例2中、含有亲水性部位的化学结构各自不同的脂质化合物的各LNP的溶血活性的图。
[图4A]是显示例3中、含有疏水性支架结构各自不同的脂质化合物(CL4系列)的LNP的pKa的图。
[图4B]是显示例3中、含有疏水性支架结构各自不同的脂质化合物(CL15系列)的LNP的pKa的图。
[图5]是显示例3中、疏水性支架结构为各自不同的CL15-LNP的体外敲减活性的图。
[图6A]是显示例3中、含有疏水性支架结构各自不同的脂质化合物(CL4系列)的LNP的体内F7敲减活性的图。
[图6B]是显示例3中、含有疏水性支架结构各自不同的脂质化合物(CL15系列)的LNP的体内F7敲减活性的图。
[图7A]是显示例3中、以CL4H6-LNP的体内F7敲减活性为指标的制剂配方的脂质组成的优化结果的图。
[图7B]是显示例3中、以CL4H6-LNP的体内F7敲减活性为指标的制剂配方的脂质/siRNA电荷比的优化结果的图。
[图8]是显示例3中、最佳组成CL4H6-LNP的体内F7敲减效率的给予量依赖性的图。
[图9A]是显示例4中、评价CL4H6-LNP的安全性的结果、给予24时间后的血浆中ALT/AST值的图。
[图9B]是显示例4中、评价CL4H6-LNP的安全性的结果、从临给予前至给予24时间后的小鼠体重变化的图。
[图10]是显示例4中、控制为平均粒径35nm左右的CL15-LNP的体外敲减活性的图。
[图11]是显示例5中、含有疏水性支架结构各自不同的脂质化合物(CL4H系列)的LNP的pKa的图。
[图12]是显示例5中、含有疏水性支架结构各自不同的脂质化合物(CL4H系列)的LNP的体内F7敲减活性的图。
[图13A]是显示例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、给予后30分钟后的肝脏中的siRNA量(ng/g肝脏)的测定结果的图。
[图13B]是显示例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、给予后24时间后的肝脏中的siRNA量(ng/g肝脏)的测定结果的图。
[图13C]是将例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、给予后24时间后的肝脏中的siRNA量(ng/g肝脏、24小时)与F7敲减的ED50的关系制图而得的图。
[图14]是例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、给予后1小时后的肝脏的血管(FITC)、脂质(DiI)、和siRNA(Cy5)的荧光染色图像。
[图15A]是显示例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、相对血浆中F7蛋白量(将各回收日的未给予LNP小鼠(NT)的血浆中F7蛋白量设为100)的经时性变化的图。
[图15B]是将例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、相对血浆中F7蛋白量为50的LNP给予后经过时间(Durability，耐久性)(day，天)与F7敲减的ED50的关系制图而得的图。
[图16A]是显示例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、肝脏中的各阳离子性脂质的含量的经时性变化的图。
[图16B]是显示例6中、给予了装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP、YSK05-LNP、和YSK13-C3-LNP的小鼠的、脾脏中的各阳离子性脂质的含量的经时性变化的图。
[图17]是显示例7中、给予了PEG-DSG修饰CL4H6-LNP的小鼠的相对血中PEG-DSG修饰CL4H6-LNP量(给予小鼠的PEG-DSG修饰CL4H6-LNP量(ID)为100％)的经时性变化的图。
[图18A]是显示例7中、给予了装载有针对PLK1的siRNA的PEG-DSG修饰CL4H6-LNP和PEG-DSG修饰YSK05-LNP的OSRC2细胞皮下移植小鼠的、给予后24时间后的癌组织中的相对PLK1表达量(将未给予siRNA的OSRC2细胞皮下移植小鼠(NT)的癌组织中的PLK1表达量设为1)的测定结果的图。
[图18B]是显示例7中、给予了装载有针对PLK1的siRNA的PEG-DSG修饰CL4H6-LNP和PEG-DSG修饰YSK05-LNP的OSRC2细胞皮下移植小鼠的、从给予前至给予后24时间后的体重变化率(％)的测定结果的图。
[图19]是显示例8中、将针对CD45的siRNA转染至由ICR小鼠骨髄细胞诱导的巨噬细胞、并培养24小时后的各巨噬细胞的相对CD45表达量(将未给予siRNA的肿瘤相关巨噬细胞(NT)的CD45表达量设为100％)的测定结果的图。
[图20]是显示例9中、对OSRC2细胞皮下移植小鼠给予装载有针对CD45的siRNA的CL4H6-LNP或YSK05-LNP、给予后24时间后的肿瘤相关巨噬细胞的相对CD45表达量(％)(将未给予针对CD45的siRNA的肿瘤相关巨噬细胞(NT)中的CD45表达量设为100％)的测定结果的图。
[图21]是显示例10中、在从给予开始起的第0、4、7、11、14、18、21、和23天、在静脉内以0.3mg siRNA/kg或1mg siRNA/kg重复给予CL4H6-LNP的小鼠的、将给予开始第0天的体重设为100％的体重变化率(％)的经时性变化的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方案进行具体地说明。本申请说明书中，“X1～X2(X1与X2满足X1＜X2的实数)”是指“X1以上且X2以下”。
本发明的实施方案所涉及的脂质化合物(本发明的脂质化合物)由下述的式(I)所示。
[化学式4]
(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X…(I)
式(I)中，a表示3～5的整数、优选为4。
b表示0或1的整数。在b为0的情况下，不存在-O-CO-基团，是指单键。
式(I)中，R1和R2分别独立地表示下述的式(A)所示的基团。
[化学式5]
CH3-(CH2)q-(CH＝CH)r-(CH2)s-(CH＝CH)t-(CH2)u-(CO-O)c-(CH2)v-…(A)
式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；s表示1～3的整数；t表示0或1；u表示1～8的整数；v表示4～12的整数。c表示0或1。优选b为0、c为1的情况，或者b为1、c为0的情况。
在优选的一个方案中，r和t为0，q+s+u为8～18的整数、优选为10～16的整数。另外，在另一个优选的方案中，r为1，t为0，且q为5～9的整数、优选为6～8的整数，s+u为5～9的整数、优选为6～8的整数。在又一个优选的方案中，v为4～12的整数、优选为6～10的整数、更优选为6。还优选a为4、b为0或1的方案。
其中，在b与c同时为0的情况下，q为3～5的整数、r和t为1、s为1、且u+v为6～10的整数的情况除外。
式(I)中，X表示5～7元非芳族杂环基或下述的式(B)所示的基团。
[化学式6]
-(CH2)d-N(R3)(R4)…(B)
X为所示的5～7元非芳族杂环基通过碳原子与(O-CO)b-键合，该环上可被1个或2个的C1-4烷基(碳数1～4的烷基)或C2-4烯基(碳数2～4的烯基)取代。作为5～7元非芳族杂环基所包含的杂原子，可举出：氮原子、氧原子或硫原子等。构成环的杂原子可为1个、或者也可含有2个以上相同或不同的杂原子。构成杂环基的杂环中可含有1个或2个以上双键，但杂环不是芳环。有时优选饱和的杂环。另外，在该5～7元非芳族杂环基中的1个或2个氢原子被取代的取代基中，作为C1-4烷基，可举出：甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、叔丁基等，作为C2-4烯基，可举出：乙烯基(ethenyl group,vinyl group)、丙烯基、丁烯基等。
式(B)中，d表示0～3的整数，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基或C2-4烯基。作为C1-4烷基和C2-4烯基，可举出与上述所列举的基团为相同的基团。R3和R4所示的C1-4烷基或C2-4烯基可分别被1个或2个苯基取代。另外，R3和R4可彼此键合形成5～7元非芳族杂环。该5～7元非芳族杂环可被1个或2个的C1-4烷基或C2-4烯基取代。
根据另一个优选的方案，在式(I)所示的脂质化合物中，b为0，X表示式(B)所示的基团。在该方案的情况下，d优选为0，R3和R4分别独立地可表示C1-4烷基(R3所示的C1-4烷基可被1个苯基取代)，且可彼此键合形成5～7元非芳族杂环。在R3和R4彼此键合的情况下，优选形成1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基，该1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基可被1个C1-4烷基取代。
根据又一个优选的方案，b为1，X表示式(B)所示的基团。在该方案的情况下，d优选为1～3的整数，R3和R4分别独立地可表示C1-4烷基(R3所示的C1-4烷基可被1个苯基取代)，且可彼此键合形成5～7元非芳族杂环。在R3和R4彼此键合的情况下，优选形成1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基，该1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基可被1个或2个相同或不同的C1-4烷基取代。
另外，根据另一个优选的方案，b为1，X为5～7元非芳族杂环基(该基团通过碳原子与(O-CO)b-键合)，且该5～7元非芳族杂环基优选为吡咯烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基，该吡咯烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基可被1个或2个相同或不同的C1-4烷基取代。
式(I)所示的脂质化合物有时作为酸加成盐存在。对构成盐的酸的种类没有特别限定，可以是无机酸类或有机酸类等的任意一种。例如可示例：盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐等无机酸盐；或酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐等有机酸盐等，但并不限定于这些。式(I)所示的脂质化合物或其盐有时也以水合物或溶剂合物的形式存在，这些物质也包括在本发明的范围内。而且，在R1和R2不同的情况下，有时也存在光学异构体，纯形式的光学异构体、任意的光学活性体的混合物、或外消旋体等也包括在本发明的范围内。
作为式(I)的化合物中特别优选的化合物，可举出R1和R2相同、a为4的化合物。包括该化合物在内，式(I)的化合物可通过本说明书的实施例中具体所示的方法容易地制造。参照该实施例的制造方法，通过适当选择原料化合物、试剂和反应条件等，本领域技术人员可容易地制造式(I)的范围所包含的任意化合物。对式(I)的化合物的pKa没有特别限定，例如可在4.0～9.0左右、优选4.5～8.5左右选择，优选以赋予该范围的pKa的方式选择各取代基的种类。通过胞吞作用将脂质体等的脂质膜结构体摄入到细胞中受到脂质膜结构体的pKa的影响。容易通过胞吞作用摄入的脂质膜结构体的pKa根据细胞的种类而不同。因此，优选调整式(I)的化合物的pKa，使得脂质膜结构体的pKa在容易被摄入到靶细胞中的范围内。
作为构成本发明的脂质膜结构体的脂质，例如可举出：磷脂、糖脂、固醇(甾醇)、饱和或不饱和脂肪酸酯、或者饱和或不饱和脂肪酸等。
作为磷脂和磷脂衍生物，例如可举出：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘磷脂、神经酰胺磷酰乙醇胺、神经酰胺磷酰甘油、神经酰胺磷酰甘油磷酸酯、1,2-二肉豆蔻酰基-1,2-脱氧磷脂酰胆碱、缩醛磷脂、磷脂酸等，这些可使用1种或将2种以上组合使用。对这些磷脂中的脂肪酸残基没有特别限定，例如可举出：碳数12～20的饱和或不饱和的脂肪酸残基，具体而言，可举出：来自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等脂肪酸的酰基。另外，还可使用卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂等来自天然物的磷脂。
作为糖脂，例如可举出：甘油糖脂(例如，磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosylglyceride)、二糖基甘油二酯、二半乳糖基甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、糖基甘油二酯)、鞘糖脂(例如，半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂)等。
作为固醇(甾醇)，例如可举出：来自动物的固醇(例如，胆固醇、琥珀酸胆固醇酯、羊毛固醇、二氢羊毛固醇、链固醇、二氢胆固醇)、来自植物的固醇(植物固醇)(例如，豆固醇、谷固醇、菜油固醇、菜籽固醇)、来自微生物的固醇(例如，酵母固醇、麦角固醇)等。
作为饱和或不饱和的脂肪酸，例如可举出：棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等碳数12～20的饱和或不饱和脂肪酸。
作为饱和或不饱和脂肪酸酯，可举出：甘油的1个或2个羟基与脂肪酸形成酯键而得的甘油脂肪酸酯。该甘油脂肪酸酯中的脂肪酸残基，例如可举出：来自棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等碳数12～20的饱和或不饱和脂肪酸的酰基。具体而言，可举出：二肉豆蔻酰基甘油(DMG)、二硬脂酰基甘油(DSG)等。
对脂质膜结构体的形态没有特别限定，作为分散于水性溶剂(水系溶媒，水类溶剂)中的方式，例如可举出：单层膜脂质体、多层脂质体、O/W型乳液、W/O/W型乳液、球状胶束，绳状胶束、或不规则(不定型)的层状结构物等。作为本发明的脂质膜结构体的优选方式可举出脂质体。以下，作为本发明的脂质膜结构体的优选方案，有对脂质体进行说明的情况，但本发明的脂质膜结构体不限定于脂质体。
本发明的脂质膜结构体是用于将siRNA等的递送对象物质递送至细胞内的脂质膜结构体，其特征在于，递送对象物质被包封在内部，并且含有上述的式(I)所示的脂质化合物作为脂质成分。对通过本发明的脂质膜结构体使递送对象物质进行递送的细胞(靶细胞)的种类没有特别限定。本发明的脂质膜结构体可将递送对象物质递送至免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞(肝实质细胞)、胰腺细胞、神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等的构成动物的各种细胞，或者这些细胞癌变的癌细胞、具备分化能力的干细胞等的多种多样的细胞中。另外，靶细胞可以是存在于动物体内的细胞，也可以是培养细胞或原代培养细胞等的在生物体外培养的细胞。作为免疫细胞，可举出：树突细胞、巨噬细胞、淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、粒细胞、单核细胞等。作为本发明的脂质膜结构体所递送的细胞，优选可举出：免疫细胞和癌细胞，特别优选可举出：树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和癌细胞。
以下，作为要递送的物质(递送对象物质)的优选例，对siRNA进行说明，但递送对象物质不限于siRNA。例如，除了微小RNA、mRNA、质粒等的核酸类之外，还可将抗肿瘤剂、抗炎剂、抗菌剂、抗病毒剂等的任意药物的活性成分或者糖类、肽类、低分子化合物、金属化合物等的任意物质包封本发明的脂质膜结构体中。
siRNA(small interfering RNA)是由21～23个碱基对构成的低分子双链RNA，参与RNA干扰(RNAi)，通过mRNA的破坏而序列特异性地抑制基因的表达。已报道合成的siRNA在人的细胞中引起RNA干扰，由于使用siRNA的RNA干扰可敲减基因，因此期待在作为药物的利用或癌症等治疗领域中应用。对本发明中可使用的siRNA的种类没有特别限定，只要可引起RNA干扰，则可使用任意的siRNA，一般而言，可使用21～23个碱基对的双链RNA、且RNA链的3’部分采取突出2个碱基的结构、各自的链在5’末端具有磷酸基和在3’末端具有羟基的结构的RNA作为本发明中的siRNA。另外，还包括核糖骨架的2’位的羟基被甲氧基、氟基或甲氧基乙基部分取代、磷酸二酯键被硫代磷酸酯键部分取代的siRNA。
使用本发明的脂质膜结构体可将siRNA递送至细胞、优选免疫细胞或癌细胞、特别优选树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或癌细胞的细胞内。该方法可在包括人在内的哺乳类动物的生物体内进行，也可使用从生物体分离/采取的细胞在体外进行。例如，在使用树突细胞的情况下，对于从患者分离/采取的树突细胞，使用本发明的脂质膜结构体将siRNA导入至细胞内之后，通过将靶基因被敲减的树突细胞给予该患者，可进行树突细胞疗法。不受任何特定理论的束缚，通过本发明的脂质膜结构体递送至细胞内的双链siRNA，受到被称为解旋酶的酶的作用，解离成单链，与对靶mRNA显示核酸内切酶活性的Argonaute蛋白等形成复合物(RISC)，并且可通过RNA干扰使靶基因敲减。
作为本发明的脂质膜结构体的脂质成分，可单独使用式(I)的脂质化合物，但一般优选将前面说明的脂质的1种或2种以上与式(I)的脂质化合物组合而形成脂质膜结构体。对多种脂质的组合及其配合比例没有特别限定，如实施例中具体所示，例如可将以针对靶基因的敲减活性等为指标而使用的脂质的种类和配合比例优化。例如，作为脂质成分，对于式(I)的化合物、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、胆固醇(Chol)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇2000二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG2000)的组合，式(I)化合物的含有比例为80～90摩尔％、优选为85摩尔％左右，PEG-DMG2000为约1～2摩尔％、优选为1摩尔％左右，和/或将式(I)的化合物为85摩尔％时的POPE/Chol的比例(摩尔比)设为0/15～4/11左右、优选为0/15，由此可使敲减活性上升，但并不限定于这些特定的脂质及其配合比例。
对本发明的脂质膜结构体的粒径没有特别限定，作为优选的方案，平均粒径为60～140nm左右、更优选为80～120nm左右；作为另一个优选的方案，平均粒径为20～50nm左右，这从敲减效率的观点出发有时是优选的。多分散度指数(PDI，多分散指数)为0.05～0.1左右、优选为0.06～0.08左右、进一步优选为约0.07左右。Z-电位可以为5.5mV～6.0mV的范围、优选为5.8mV左右。
本发明的脂质膜结构体，根据需要可进行适当的表面修饰等。
例如，为了促进本发明的脂质膜结构体的核内转运，例如，也可以用3糖以上的寡糖化合物对脂质膜结构体进行表面修饰。对3糖以上的寡糖化合物的种类没有特别限定，例如可使用3个-10个左右的糖单元结合而得的寡糖化合物，优选可使用3个-6个左右的糖单元结合而得的寡糖化合物。
作为寡糖化合物，更具体而言，例如可举出：纤维三糖(Cellotriose：β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)、马铃薯三糖(Chacotriose：α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-D-葡萄糖)、龙胆三糖(Gentianose：β-D-呋喃果糖基β-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖苷)、异麦芽三糖(Isomaltotriose：α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-D-葡萄糖)、异葡糖基麦芽糖(Isopanose：α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-[α-D-吡喃葡糖基-(1→6)]-D-葡萄糖)、麦芽三糖(Maltotriose：α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)、甘露三糖(Manninotriose：α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-D-葡萄糖)、松三糖(Melezitose：α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-β-D-呋喃果糖基＝α-D-吡喃葡糖苷)、潘糖(Panose：α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)、车前糖(Planteose：α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-β-D-呋喃果糖基＝α-D-吡喃葡糖苷)、棉籽糖(Raffinose：β-D-呋喃果糖基＝α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖苷)、茄三糖(Solatriose：α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)]-D-半乳糖)、伞形糖(Umbelliferose：β-D-呋喃果糖基＝α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃半乳糖苷)等3糖化合物；石蒜四糖(Lycotetraose：β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-半乳糖)、麦芽四糖(Maltotetraose：α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)、水苏四糖(Stachyose：β-D-呋喃果糖基＝α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖苷)等4糖化合物；麦芽五糖(Maltopentaose：α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)、毛蕊花糖(Verbascose：β-D-呋喃果糖基＝α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖苷)等5糖化合物；麦芽六糖(Maltohexaose：α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖)等6糖化合物，但不限于这些。
可优选使用作为葡萄糖的3聚体-6聚体的寡糖化合物，可进一步优选使用作为葡萄糖的3聚体或4聚体的寡糖化合物。更具体而言，可适合使用异麦芽三糖、异葡糖基麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖等，这些之中，进一步优选葡萄糖以α1-4键合而得的麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。特别优选的是麦芽三糖或麦芽四糖、最优选的是麦芽三糖。寡糖化合物对脂质膜结构体的表面修饰量没有特别限定，例如，相对于总脂质量为1～30摩尔％左右、优选为2～20摩尔％左右、更优选为5～10摩尔％左右。
对将脂质膜结构体用寡糖化合物进行表面修饰的方法没有特别限定，例如，已知将脂质膜结构体用半乳糖或甘露糖等单糖进行表面修饰而得的脂质体(专利文献3)，因此可采用该出版物中记载的表面修饰方法。上述出版物的全部公开内容通过参照包含在本说明书的公开内容中。该手段是使单糖化合物与聚亚烷基二醇化脂质键合来进行脂质膜结构体的表面修饰的方法，通过该手段，可同时通过聚亚烷基二醇修饰脂质膜结构体的表面，因此优选。
通过将脂质膜结构体的表面用聚亚烷基二醇等的亲水性聚合物进行修饰，可提高脂质体的血中滞留性等稳定性。关于该手段，例如记载于日本特开平1-249717号公报、日本特开平2-149512号公报、日本特开平4-346918号公报、日本特开2004-10481号公报等中。作为亲水性聚合物，优选聚亚烷基二醇。作为聚亚烷基二醇，例如可使用聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亚甲基二醇、聚六亚甲基二醇等。聚亚烷基二醇的分子量例如为300～10,000左右、优选为500～10,000、进一步优选为1,000～5,000左右。
聚亚烷基二醇对脂质膜结构体的表面修饰，例如可通过使用聚亚烷基二醇修饰脂质作为脂质膜构成脂质，构建脂质膜结构体而容易地进行。例如，在通过聚乙二醇进行修饰的情况下，可使用硬脂基化聚乙二醇(例如硬脂酸PEG45(STR-PEG45)等)。此外，还可使用N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、n-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺等的聚乙二醇衍生物等，但聚亚烷基二醇化脂质不限定于这些。
另外，通过使寡糖化合物与聚亚烷基二醇键合，可同时达到通过聚亚烷基二醇和寡糖化合物进行的表面修饰。不过，将脂质膜结构体用聚亚烷基二醇或寡糖化合物进行表面修饰的方法不限定于上述的方法，例如，也可使用硬脂基化的聚亚烷基二醇或寡糖化合物等脂质化的化合物作为脂质膜结构体的构成脂质，由此进行表面修饰。
在制造本发明的脂质膜结构体时，作为用于提高血中滞留性的脂质衍生物，例如也可利用血型糖蛋白、神经节苷脂GM1、磷脂酰肌醇、神经节苷脂GM3、葡萄糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物等。另外，作为用于提高血中滞留性的亲水性聚合物，除了聚亚烷基二醇之外，还可将葡聚糖、茁霉多糖、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、卡拉胶等用于表面修饰。
本发明的脂质膜结构体可含有选自下述的1种或2种以上的物质：固醇、或甘油或其脂肪酸酯等膜稳定剂；生育酚、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯或丁基化羟基甲苯等抗氧化剂；荷电(带电)物质；和膜多肽等。作为赋予正电荷的荷电物质，例如可举出：硬脂胺、油胺等饱和或不饱和脂族胺；二油酰基三甲基铵丙烷等的饱和或不饱和阳离子性合成脂质；或者阳离子性聚合物等。作为赋予负电荷的荷电物质，例如可举出：磷酸二鲸蜡基酯、半琥珀酸胆固醇酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。作为膜多肽，例如可举出：膜外在多肽和膜内在多肽等。对这些物质的配合量没有特别限定，可根据目的适当选择。
另外，本发明的脂质膜结构体例如可赋予温度变化敏感性功能、膜透过功能、基因表达功能和pH敏感性功能等的任意1种或2种以上的功能。通过适当附加这些功能，例如可提高内封含有基因的核酸等的脂质膜结构体在血液中的滞留性，可降低肝脏或脾脏等网状内皮系组织的捕获率。而且，通过胞吞作用摄入到靶细胞之后的该脂质膜结构体可从内体有效地逃逸并转运到核内，可在核内达到高的基因表达活性。
作为可赋予温度变化敏感性功能的温度变化敏感性脂质衍生物，例如可举出二棕榈酰基磷脂酰胆碱等。另外，作为可赋予pH敏感性功能的pH敏感性脂质衍生物，例如可举出二油酰基磷脂酰乙醇胺等。
另外，本发明的脂质膜结构体也可用可与细胞表面的受体或抗原特异性结合的抗体等的物质实施修饰。通过该修饰，可改善物质向细胞的核内的递送效率。例如，优选将针对在靶组织或器官中特异性表达的生物成分的单克隆抗体配置于脂质膜结构体的表面上。该方法例如记载于非专利文献25等中。作为脂质膜结构体的构成成分，通过含有可与单克隆抗体或其片段(例如，Fab片段、F(ab’)2片段，或Fab’片段等)中的巯基反应的脂质衍生物、例如聚(乙二醇)-α-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-ω-马来酰亚胺、α-[N-(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰基-乙基)氨基甲酰基)-ω-[3-[2-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)乙烷甲酰胺]丙基}-聚(氧基-1,2-亚烷乙基)等的具有马来酰亚胺结构的脂质衍生物，可使单克隆抗体与脂质膜结构体的膜表面结合。
可将本发明的脂质膜结构体的表面用含有连续的多个精氨酸残基的多肽(以下称为“聚精氨酸”)修饰。作为聚精氨酸，可优选使用含有4-20个连续的精氨酸残基的多肽、更优选使用仅由4-20个连续的精氨酸残基构成的多肽、特别优选使用八聚精氨酸等。通过将脂质体等的脂质膜结构体的表面用八聚精氨酸等的聚精氨酸进行修饰，可提高包封脂质体中的目标物质的细胞内递送效率(非专利文献4，专利文献1)。聚精氨酸对脂质膜结构体表面的修饰可按照上述出版物中记载的方法、例如通过使用脂质修饰聚精氨酸(例如硬脂基化八聚精氨酸等)作为脂质膜结构体的构成脂质，而容易地进行。上述出版物的公开内容和在该出版物中引用的所有文献的公开内容通过参照包含在本说明书的公开内容中。
另外，在将siRNA包封本发明的脂质膜结构体中时，根据需要也可加入具有核酸导入功能的化合物。作为这样的化合物，例如可举出：O,O’-N-双十二烷酰基-N-(α-三甲基氨乙酰基)-二乙醇胺氯化物、O,O’-N-双十四烷酰基-N-(α-三甲基氨乙酰基)-二乙醇胺氯化物、O,O’-N-双十六烷酰基-N-(α-三甲基氨乙酰基)-二乙醇胺氯化物、O,O’-N-双十八烷酰基(ジオクタデセノイル)-N-(α-三甲基氨乙酰基)-二乙醇胺氯化物、O,O’,O”-十三烷酰基-N-(ω-三甲基氨癸酰基)氨基甲烷溴化物和N-[α-三甲基氨乙酰基]-双十二烷基-D-谷氨酸盐、二甲基双十八烷基溴化铵、2,3-二油氧基-N-[2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、3-β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇等。这些具有核酸导入功能的化合物可配置于脂质膜结构体的膜的任意位置和/或可被填充在脂质膜结构体的内部。
已知附加有多功能的信封式纳米结构体(MEND)，并且可适合用作本发明的脂质膜结构体。作为MEND，例如报道了具有如下结构的MEND：将质粒DNA等核酸与鱼精蛋白等阳离子性聚合物的复合物作为芯，该芯被包封脂质体形态的脂质包被膜的内部。另外，还报道了，在MEND的脂质包被膜上根据需要可配置用于调节pH响应性或膜透过性的肽，并且脂质包被膜的外侧表面可用聚乙二醇等亚烷基二醇修饰。还已知一种MEND，其被设计成在MEND的脂质包被膜的内部包封有凝缩的DNA和阳离子性聚合物，使得可有效地达到基因表达。关于MEND，例如可参照非专利文献1等的综述。上述出版物的公开内容和该综述中引用的所有文献的公开内容通过参照包含在本说明书的公开内容中。
对脂质膜结构体的形态没有特别限定，例如可举出：分散于水性溶剂(例如，水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水等)中的形态或将该水性分散物冷冻干燥的形态等。
对脂质膜结构体的制造方法也没有特别限定，可采用本领域技术人员可利用的任意方法。举一个例子，可如下制造：将所有的脂质成分溶解于氯仿等有机溶剂中，通过用蒸发器进行减压干固或用喷雾干燥机进行喷雾干燥，形成脂质膜之后，将水性溶剂添加到经干燥的上述混合物中，再用均化器等乳化机、超声波乳化机或高压喷射乳化机等进行乳化。另外，也可以通过作为制造脂质体的方法而公知的方法、例如反相蒸发法等来制造。在要控制脂质膜结构体的尺寸的情况下，可使用具有孔径统一的膜滤器等，在高压下进行挤出(挤出过滤)。对分散状态的脂质膜结构体的尺寸没有特别限定，例如，在脂质体的情况下，平均粒径为60～140nm左右、优选为80～120nm左右，作为又一个优选的方案，从敲减效率的观点出发，有时优选平均粒径为20～50nm左右。粒径例如可通过DLS(dynamic lightscattering)法进行测定。在本申请说明书中，脂质膜结构体的平均粒径是指通过DLS测定的个数平均粒径。DLS的测定可使用市售的DLS装置等通过常规方法进行。
对水性溶剂(分散介质)的组成没有特别限定，例如可举出：磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水等缓冲液、生理盐水、细胞培养用的培养基等。这些水性溶剂(分散介质)可使脂质膜结构体稳定地分散，还可加入葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类，乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类，棉籽糖、松三糖等三糖类，环糊精等多糖类；赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等的糖醇等糖(水溶液)，或者甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇，乙二醇单烷基醚、二甘醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇(水溶液)等。为了稳定地长期保存分散于该水性溶剂中的脂质膜结构体，从抑制凝聚等物理稳定性的方面出发，期望尽量排除水性溶剂中的电解质。另外，从脂质的化学稳定性的方面出发，期望将水性溶剂的pH设定为弱酸性至中性附近(pH3.0-8.0左右)、和/或通过氮鼓泡等除去溶解氧。
在将所得的脂质膜结构体的水性分散物进行冷冻干燥或喷雾干燥的情况下，例如，如果使用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类；乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类；棉籽糖、松三糖等三糖类；环糊精等多糖类；赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等的糖醇等糖(水溶液)，则可改善稳定性。另外，在将上述水性分散物冷冻的情况下，例如，如果使用上述的糖类或甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二甘醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇(水溶液)，则可改善稳定性。
在本发明的脂质膜结构体的内部，在不阻碍siRNA功能的范围内可包封其他物质。对可包封的物质的种类没有特别限定，除了抗肿瘤剂、抗炎剂、抗菌剂、抗病毒剂等任意的药物的有效成分之外，还可以包封糖类、肽类、核酸类、低分子化合物、金属化合物等任意的物质。作为核酸，例如可列举：含有基因的核酸，更具体而言，例如可列举：掺入到质粒中的基因等，但不限于该特定的方案。
在专利文献6中，具体公开了含有YSK12的脂质化合物的合成方法；使用该脂质化合物的脂质膜结构体的调制方法；和对于所得的脂质膜结构体，对THP-1细胞(人单核细胞株)的基因表达抑制作用和对Jurkat细胞(人T细胞株)的基因表达抑制作用。专利文献6的所有公开内容通过参照包含在本说明书的公开内容中。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明的范围并不限定于下述的实施例。
例1
按照以下的方案合成本发明的脂质化合物。在疏水性支架与YSK12(专利文献6)相同的情况下，即在合成通式(A)中的c为0的脂质的情况下，使用亚油酸(化合物A)作为起始原料。用氢化锂铝还原亚油酸后(化合物B)，通过使羟基甲磺酰化而活化(化合物C)，通过使溴化镁作用而溴化(化合物D)。将δ-戊内酯作为底物进行格氏反应，从而将2条(2本)来自亚油酸的疏水性支架连接(化合物E)。在使叔氨基与烃链直接键合的情况下，将伯羟基通过甲苯磺酰化而活化(化合物F)，通过亲核取代反应导入氨基。
另一方面，在经由酯键使叔氨基键合的情况下，通过使氨基酸与伯羟基脱水缩合而连接。在疏水性支架中含有酯键的脂质、例如通式(A)中的c为1且R1和R2中含有酯键的脂质的合成中，使用与直链烷烃(碳数6～10)的两末端碳原子键合的氢原子在溴原子和羟基上各取代了1个的物质(化合物G)作为起始原料。通过叔丁基二甲基甲硅烷基醚化来保护羟基(化合物H)，与上述同样地通过格氏反应使2个分子连接(化合物I)。与上述同样地，在伯羟基部分直接或经由酯键导入叔氨基后(化合物J、M)，将甲硅烷基醚脱保护(化合物K、N)，通过脱水缩合连结任意的直链脂肪酸。
[化学式7]
Figure BDA0002313561310000251
[化学式8]
Figure BDA0002313561310000252
在以下的实施例中，脂质化合物的命名按照以下的部分结构标记为“阳离子性脂质(Cationic Lipid，CL)-亲水性部位编号-疏水性支架2编号-疏水性支架1编号”。例如，专利文献6所公开的YSK12标记为“CL1A6”。
[化学式9]
Figure BDA0002313561310000261
[化学式10]
Figure BDA0002313561310000262
(1)((6-溴己基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷
将20.0g(110.5mmol)的6-溴己烷-1-醇溶解于150mL的1,2-二氯乙烷中，冷却至4℃。在添加18.0g(120mmol)的叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)之后，滴加19.5mL(140mmol)的三乙胺(TEA)，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂，加入300mL的己烷使其悬浮，通过硅藻土过滤除去不溶物，由此得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到26.0g(88.0mmol)的无色油状的((6-溴己基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷。收率为80％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,6H),0.89(s,9H),1.31-1.54(m,6H),1.86(m,2H),3.40(t,2H),3.96(t,2H).
(2)11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)十一烷-1,5-二醇
将1.2g(4.06mmol)的((6-溴己基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷溶解于4mL的二乙醚中，加入2.43g(100mmol)的刮下的屑状镁，接着，加入1片碘碎片。在室温下静置10分钟后，在油浴中一边加热至40℃一边进行搅拌，滴加24.8g(83.94mmol)的溶解于21mL二乙醚中的((6-溴己基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷。在40℃下反应2小时后，冷却至4℃。接着，添加3.67mL(39.6mmol)的δ-戊内酯，在室温下反应过夜。然后，冷却至4℃，通过滴加5％硫酸使残留的镁溶解。用二乙醚稀释，用水和饱和食盐水分液洗涤有机层。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到14.0g(26.3mmol)的无色油状的11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)十一烷-1,5-二醇。得自δ-戊内酯的收率为66％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),1.25-1.56(m,26H),3.59(t,4H),3.65(t,2H).
(3)4-甲基苯磺酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯
将14.0g(26.3mmol)的11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)十一烷-1,5-二醇溶解于50mL的二氯甲烷中，加入321mg(2.63mmol)的DMAP(N,N-二甲基-4-氨基吡啶)和5.50mL(39.5mmol)的二异丙基乙胺(DIPEA)，冷却至4℃。接着，缓慢加入6.02g(31.6mmol)的对甲苯磺酰氯(pTsCl)后，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂，用乙酸乙酯悬浮，用水和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到12.4g(28.0mmol)的无色油状的4-甲基苯磺酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯。收率为69％。
(4)11-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,19,19,20,20-八甲基-4,18-二氧杂-3,19-二硅杂二十一烷(ジシラヘニコサン)-11-醇
将12.4g(18.0mmol)的4-甲基苯磺酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯加入到30mL的四氢呋喃中，冷却至4℃。接着，加入7.38mL(54.0mmol)的二丙胺后，在室温下反应11天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到7.27g(11.8mmol)的淡黄色油状的11-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,19,19,20,20-八甲基-4,18-二氧杂-3,19-二硅杂二十一烷-11-醇。收率为66％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),1.24-1.64(m,30H),2.30-2.43(m,6H),3.58(t,4H).
(5)7-(4-(二异丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇
向7.27g(11.8mmol)的11-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,19,19,20,20-八甲基-4,18-二氧杂-3,19-二硅杂二十一烷-11-醇中加入2.23mL(39mmol)的乙酸和26mL的1.0M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，通过供于反相硅胶色谱{洗脱溶剂；水(0.1％三氟乙酸)：乙腈(0.1％三氟乙酸)(连续梯度)}进行纯化，得到3.43g(8.85mmol)的淡黄色油状的7-(4-(二异丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇。收率为75％。
(6)二油酸7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL4H6)
将388mg(1.0mmol)的7-(4-(二异丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇溶解于5mL的二氯甲烷中，接着，加入900mg(3.0mmol)的油酰氯后，冷却至4℃。滴加697μL(5.0mmol)的TEA，在室温下反应3小时。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到570mg(0.622mmol)的淡黄色油状的二油酸7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL4H6)。收率为62％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,12H),1.18-1.71(m,74H),2.01(m,8H),2.24-2.30(t,4H),2.32-2.42(m,6H),4.04(t,4H),5.32(m,4H).
[化学式11]
Figure BDA0002313561310000291
(7)双十四烷酸7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL4C6)
将77.5mg(0.20mmol)的7-(4-(二异丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇溶解于1mL的二氯甲烷中，接着，加入197mg(0.80mmol)的肉豆蔻酰氯后，冷却至4℃。滴加205μL(1.2mmol)的DIPEA，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到93mg(0.115mmol)的淡黄色油状的双十四烷酸7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL4C6)。收率为58％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,12H),1.18-1.68(m,74H),2.27(t,4H),2.42-2.53(br,6H),4.04(t,4H).
[化学式12]
Figure BDA0002313561310000301
(8)二棕榈酸7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL4D6)
将77.5mg(0.20mmol)的7-(4-(二异丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇溶解于1mL的二氯甲烷中，接着，加入220mg(0.80mmol)的棕榈酰氯后，冷却至4℃。滴加205μL(1.2mmol)的DIPEA，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到143mg(0.164mmol)的淡黄色油状的二棕榈酸7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL4D6)。收率为82％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,12H),1.18-1.68(m,82H),2.27(t,4H),2.45-2.53(br,6H),4.04(t,4H).
[化学式13]
Figure BDA0002313561310000302
1-甲基哌啶-4-甲酸酯
(9)1-甲基哌啶-4-甲酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯
将5.33g(10.0mmol)的11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)十一烷-1,5-二醇溶解于50mL的二氯甲烷中，加入122mg(1.0mmol)的DMAP和2.16g(12.0mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸盐酸盐。接着，缓慢加入2.49g(13.0mmol)的EDCI后，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到5.01g(7.61mmol)的无色油状的1-甲基哌啶-4-甲酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯。收率为76％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),1.25-2.01(m,26H),2.23(br.s,4H),2.78(m,2H),3.58(t,4H),4.08(t,2H).
(10)1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯
向5.01g(7.61mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯中加入1.43mL(25mmol)的乙酸和20mL的1.0M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，通过供于反相硅胶色谱{洗脱溶剂；水(0.1％三氟乙酸)：乙腈(0.1％三氟乙酸)(连续梯度)}进行纯化，得到2.34g(5.45mmol)的淡黄色油状的1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯。收率为72％。
1H NMR；400MHzδ＝1.25-1.45(m,20H),1.52(m,4H),1.62(m,2H),1.86(m,2H),2.05(m,2H),2.50-2.70(m,6H),3.16(m,2H),3.53(t,4H),4.11(t,2H).
(11)二油酸7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15H6)
将430mg(1.00mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于10mL的二氯甲烷中。接着，加入706mg(2.50mmol)的油酸、24.4mg(0.20mmol)的DMAP和671mg(3.5mmol)的EDCI，在室温下反应2小时。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到569mg(0.594mmol)的淡黄色油状的二油酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15H6)。收率为59％。
1H NMR；400MHz)数据δ＝0.88(t,6H),1.20-2.05(m,78H),2.28(m,8H),2.82(m,2H),4.07(m,6H),5.33(m,4H).
[化学式14]
Figure BDA0002313561310000321
(12)双十二烷酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15B6)
将85.9mg(0.20mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于1.5mL的二氯甲烷中，接着，加入143mg(0.60mmol)的月桂酰氯后，冷却至4℃。滴加139μL(1.00mmol)的TEA，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到101.2mg(0.127mmol)的淡黄色油状的双十二烷酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15B6)。收率为64％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.20-2.13(m,70H),2.28(m,8H),2.84(m,2H),4.06(m,6H).
[化学式15]
Figure BDA0002313561310000322
(13)双十四烷酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15C6)
将85.9mg(0.20mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于1.5mL的二氯甲烷中，接着，加入163mg(0.60mmol)的肉豆蔻酰氯后，冷却至4℃。滴加139μL(1.00mmol)的TEA，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到116mg(0.136mmol)的淡黄色固体状的双十四烷酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15C6)。收率为68％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.20-2.10(m,78H),2.28(m,8H),2.82(m,2H),4.06(m,6H).
[化学式16]
Figure BDA0002313561310000331
(14)二棕榈酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15D6)
将85.9mg(0.20mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于1.5mL的二氯甲烷中，接着，加入181mg(0.60mmol)的棕榈酰氯后，冷却至4℃。滴加139μL(1.00mmol)的TEA，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到114mg(0.126mmol)的淡黄色固体状的二棕榈酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15D6)。收率为63％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.20-2.11(m,86H),2.28(m,8H),2.83(m,2H),4.06(m,6H).
[化学式17]
Figure BDA0002313561310000341
(15)二硬脂酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15E6)
将85.9mg(0.20mmol)的1-甲基哌啶-4-甲酸5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于1.0mL的二氯甲烷中，接着，加入181mg(0.80mmol)的硬脂酰氯后，冷却至4℃。滴加139μL(1.00mmol)的TEA，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到141mg(0.146mmol)的淡黄色固体状的二硬脂酸7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基酯(CL15E6)。收率为73％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.20-2.10(m,94H),2.28(m,8H),2.83(m,2H),4.06(m,6H).
[化学式18]
Figure BDA0002313561310000342
(16)(9z,12z)-辛二烯-1-醇
在190mL的冷却至4℃的四氢呋喃(THF)中，悬浮2.73g(72mmol)的氢化锂铝。向其中滴加10g(36mmol)的亚油酸，搅拌10分钟。其后，在油浴中一边加热一边回流过夜。将其冷却后，加入100mL的1mol/L氢氧化钠水溶液，使反应停止。然后，加入100mL的乙酸乙酯进行稀释后，过滤，使用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤滤液。接着，回收有机层，向其中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到8.68g(32.6mmol)的无色油状的(9z,12z)-辛二烯-1-醇。收率为91％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,3H),1.25-1.36(m,16H),1.53-1.58(m,2H),2.02-2.06(m,4H),2.76(t,2H),3.62(t,2H),5.29-5.40(m,4H).
(17)(9z,12z)-辛二烯-1-甲磺酸酯
将8.68g(32.6mmol)的(9z,12z)-辛二烯-1-醇溶解于100mL的二氯甲烷中后，加入366mg(3.26mmol)的N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)、6.8mL(48.9mmol)的三乙胺(TEA)。接着，使用滴液漏斗，滴加用50mL的二氯甲烷稀释的3.03mL(39.1mmol)的甲磺酰氯(MsCl)，在室温下搅拌过夜。回收反应液，用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到10.64g(30.9mmol)的无色油状的(9z,12z)-辛二烯-1-甲磺酸酯。收率为95％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,3H),1.06-1.18(m,18H),1.70-1.90(m,2H),2.00-2.19(m,4H),2.79(t,2H),3.06(s,3H),4.20(t,2H),5.21-5.42(m,4H).
(18)18-溴-十八碳-6z,9z-二烯
将10.64g的(9z,12z)-辛二烯-1-甲磺酸酯溶解于140mL的二乙醚中后，加入16.0g(61.8mmol)的乙醚溴化镁，在室温下搅拌过夜。回收反应液，使用100mL的饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到8.85g(26.9mmol)的无色油状的18-溴-十八碳-(6z,9z)-二烯。收率为87％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,3H),1.27-1.46(m,18H),1.80-1.88(m,2H),2.00-2.09(m,4H),2.77(t,2H),3.40(t,2H),4.20(d,2H),5.29-5.41(m,4H).
(19)4-[(9z,12z)-辛二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇
将50g(1.52mmol)的18-溴-十八碳-(6z,9z)-二烯溶解于1.5mL的二乙醚中，加入609mg(25.1mmol)的刮下的屑状镁，接着，加入1片碘碎片。在室温下静置10分钟后，在油浴中一边加热至45℃一边进行搅拌，滴加5.0g(15.2mmol)的溶解于6mL二乙醚中的18-溴-十八碳-(6z,9z)-二烯。在45℃下反应1小时后，冷却至室温。接着，加入300μL(3.23mmol)的δ-戊内酯，在室温下反应1小时。然后，冷却至4℃，过滤后，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤滤液。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到1.64g(2.73mmol)的无色油状的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇。得自δ-戊内酯的收率为85％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,6H),1.25-1.1.46(m,46H),2.02-2.06(m,8H),2.77(t,4H),3.66(t,2H),5.30-5.40(m,8H).
(20)4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇
将301mg(0.50mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于5.0mL的二氯甲烷中，加入6.11mg(0.05mmol)的DMAP和83.6μL(0.60mmol)的TEA，接着加入95.3mg(0.50mmol)的对甲苯磺酰氯(pTsCl)后，在室温下搅拌过夜。接着，向反应液中加入硅胶，使用旋转蒸发器馏去溶剂。其后，通过供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到293mg(0.39mmol)的无色油状物。收率为78％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,3H),1.25-1.49(m,46H),2.03-2.05(m,8H),2.44(s,3H),2.77(t,4H),4.03(t,2H),5.31-5.39(m,8H),7.34(d,2H),7.78(d,2H).
(21)1-N,N-二甲基氨基-4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇
向293mg(0.39mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇中加入10mL的2.0M二甲胺的THF溶液，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入100mL的二氯甲烷，用100mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到155mg(0.25mmol)的淡黄色油状物。收率为64％。
1H NMR；500MHzδ＝0.87(t,6H),1.23-1.40(m,46H),2.02-2.07(m,8H),2.26(s,6H),2.33(t,2H),2.77(t,4H),5.31-5.39(m,8H).
[化学式19]
Figure BDA0002313561310000371
(22)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(乙基(甲基)氨基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将650mg(0.86mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于4mL的二氯甲烷中，加入0.86mL(10mmol)的乙基甲胺，在40℃下反应3天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到432mg(0.673mmol)的浅黄色油状物。收率为78％。
1H NMR；400MHzδ＝0.87(t,6H),1.20-1.67(m,49H),2.03(m,8H),2.38-2.75(m,7H),2.77(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式20]
Figure BDA0002313561310000372
(23)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(二乙基氨基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将603mg(0.80mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于4mL的二氯甲烷中，加入1.04mL(10mmol)的二乙胺，在40℃下反应3天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到401mg(0.611mmol)的浅黄色油状物。收率为77％。
1H NMR；400MHzδ＝0.87(t,6H),1.20-1.67(m,52H),2.03(m,8H),2.38-2.75(m,6H),2.77(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式21]
Figure BDA0002313561310000381
(24)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(二丙基氨基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将189mg(0.25mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于1.5mL的1,2-二氯乙烷中，加入41μL(0.3mmol)的二丙胺，在室温下反应8天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到81mg(0.118mmol)的淡黄色油状物。收率为47％。
1H NMR；500MHzδ＝0.87(t,6H),1.22-1.60(m,50H),2.03(m,8H),2.30-2.48(m,6H),2.77(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式22]
Figure BDA0002313561310000382
(25)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(苄基(甲基)氨基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将189mg(0.25mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于1.5mL的1,2-二氯乙烷中，加入39μL(0.3mmol)的N-苄基甲胺，在室温下反应8天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到97.4mg(0.138mmol)的浅黄色油状物。收率为55％。
1H NMR；500MHzδ＝0.87(t,6H),1.23-1.60(m,46H),2.03(m,8H),2.18(s,3H),2.37(t,2H),2.77(t,4H),3.47(s,2H),5.35(m,8H),7.30(m,5H).
[化学式23]
Figure BDA0002313561310000391
(26)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(哌啶-1-基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将189mg(0.25mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于1.5mL的1,2-二氯乙烷中，加入30μL(0.3mmol)的哌啶，在室温下反应8天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到85.0mg(0.127mmol)的浅黄色油状物。收率为51％。
1H NMR；500MHzδ＝0.87(t,6H),1.22-1.68(m,52H),2.03(m,8H),2.30-2.52(m,6H),2.77(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式24]
Figure BDA0002313561310000392
(27)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-吗啉代丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将227mg(0.30mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于2mL的1,2-二氯乙烷中，加入87.1mg(1.0mmol)的吗啉，在室温下反应7天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的二氯甲烷，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到60.0mg(0.09mmol)的淡黄色油状物。收率为30％。
1H NMR；500MHzδ＝0.87(t,6H),1.22-1.65(m,46H),2.03(m,8H),2.34(t,2H),2.42(br,4H),2.77(t,4H),3.71(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式25]
Figure BDA0002313561310000401
(28)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将227mg(0.30mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于2mL的1,2-二氯乙烷中，加入100.2mg(1.0mmol)的1-甲基哌嗪，在室温下反应7天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的二氯甲烷，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到79.0mg(0.116mmol)的浅黄色油状物。收率为39％。
1H NMR；500MHzδ＝0.87(t,6H),1.22-1.65(m,46H),2.03(m,8H),2.26-2.65(m,13H),2.77(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式26]
Figure BDA0002313561310000402
(29)(6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)丁基)三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇
将189mg(0.25mmol)的4-[(9z,12z)-辛二烯基]-1-对甲苯磺酰基-(13z,16z)-二十三碳二烯-4-醇溶解于2mL的1,2-二氯乙烷中，加入42.7μL(0.3mmol)的1-异丙基哌嗪，在室温下反应8天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到116mg(0.163mmol)的浅黄色油状物。收率为65％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,6H),1.05(d,6H),1.20-1.60(m,46H),2.03(m,8H),2.31-2.68(m,11H),2.76(t,4H),5.35(m,8H).
[化学式27]
Figure BDA0002313561310000411
(30)(14Z,17Z)-5-羟基-5-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十三碳-14,17-二烯-1-基2-(吡咯烷-1-基)乙酸酯
将120.2mg(0.20mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于1.0mL的1,2-二氯乙烷中，加入38.7mg(0.30mmol)的1-吡咯烷乙酸，接着，加入6.1mg(0.05mmol)的DMAP和57.5mg(0.30mmol)的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)后，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到117mg(0.164mmol)的淡黄色油状物。收率为82％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,6H),1.22-1.69(m,46H),1.82(br,4H),2.03(m,8H),2.65(br,4H),2.77(t,4H),3.33(s,2H),4.13(t,2H),5.35(m,8H).
[化学式28]
Figure BDA0002313561310000412
(31)(14Z,17Z)-5-羟基-5-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十三碳-14,17-二烯-1-基2-(哌啶-1-基)乙酸酯
将120.2mg(0.20mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于1.0mL的1,2-二氯乙烷中，加入43.0mg(0.30mmol)的1-哌啶乙酸，接着，加入6.1mg(0.05mmol)的DMAP和57.5mg(0.30mmol)的EDCI后，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到130mg(0.179mmol)的浅黄色油状物。收率为90％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,6H),1.22-1.67(m,52H),2.03(m,8H),2.50(br,4H),2.77(t,4H),3.18(s,2H),4.12(t,2H),5.35(m,8H).
[化学式29]
Figure BDA0002313561310000421
(32)(14Z,17Z)-5-羟基-5-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十三碳-14,17-二烯-1-基3-(二甲基氨基)丙酸酯
将601mg(1.0mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于5.0mL的二氯甲烷中，加入153.6mg(1.0mmol)的3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐，接着，加入12.2mg(0.1mmol)的DMAP和230mg(1.2mmol)的EDCI后，在室温下搅拌过夜。加入50mL的二氯甲烷，用50mL的1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到351mg(0.501mmol)的浅黄色油状物。收率为50％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.22-1.72(m,46H),2.03(m,8H),2.24(s,3H),2.50(t,2H),2.62(t,2H),2.78(t,4H),4.09(t,2H),5.35(m,8H).
[化学式30]
Figure BDA0002313561310000431
(33)3-(二乙基氨基)丙酸(14Z,17Z)-5-羟基-5-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十三碳-14,17-二烯-1-基酯
将180mg(0.30mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于2.0mL的1,2-二氯乙烷中，加入72.7mg(0.40mmol)的3-(二乙基氨基)丙酸盐酸盐，接着，加入6.0mg(0.05mmol)的DMAP和96mg(0.50mmol)的EDCI后，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的二氯甲烷，用5mL的1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到151mg(0.207mmol)的淡黄色油状物。收率为69％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.03(t,6H),1.22-1.44(m,46H),1.62(m,2H),2.03(m,8H),2.41-2.56(m,6H),2.78(m,6H),4.07(t,2H),5.35(m,8H).
[化学式31]
Figure BDA0002313561310000432
(34)(14Z,17Z)-5-羟基-5-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十三碳-14,17-二烯-1-基3-(哌啶-1-基)丙酸酯
将120.2mg(0.20mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于1.0mL的1,2-二氯乙烷中，加入47.2mg(0.30mmol)的1-哌啶丙酸，接着，加入6.1mg(0.05mmol)的DMAP和57.5mg(0.30mmol)的EDCI后，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入5mL的乙酸乙酯，用5mL的0.5M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到80.4mg(0.109mmol)的淡黄色油状物。收率为55％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,6H),1.22-1.66(m,52H),2.04(m,8H),2.40(br,4H),2.51(br,2H),2.66(br,2H),2.78(t,4H),4.09(t,2H),5.35(m,8H).
[化学式32]
Figure BDA0002313561310000441
(35)1-甲基哌啶-4-甲酸(14Z,17Z)-5-羟基-5-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十三碳-14,17-二烯-1-基酯
将842mg(1.40mmol)的4-[(9z,12z)-十八碳二烯基]-(13z,16z)-二十三碳二烯-1,4-二醇溶解于10mL的1,2-二氯乙烷中，加入200mg(1.40mmol)的1-甲基-4-哌啶甲酸，接着，加入17.1mg(0.14mmol)的DMAP和383mg(2.0mmol)的EDCI后，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，加入50mL的乙酸乙酯，用50mL的1M氢氧化钠水溶液进行洗涤。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}纯化，得到877mg(1.21mmol)的无色油状物。收率为86％。
1H NMR；500MHzδ＝0.88(t,6H),1.23-1.45(m,46H),1.55-2.08(m,17H),2.25(s,3H),2.79(t,4H),4.08(t,2H),5.30-5.40(m,8H).
[化学式33]
Figure BDA0002313561310000442
(36)11-(4-(二甲基氨基)丁基)-2,2,3,3,19,19,20,20-八甲基-4,18-二氧杂-3,19-二硅杂二十一烷-11-醇
向8.78g(12.78mmol)的4-甲基苯磺酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯中加入50mL的2.0M二甲胺的THF溶液，在室温下反应6天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到6.20g(11.07mmol)的无色油状物。收率为87％。
(37)7-(4-(二甲基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇
向6.20g(11.07mmol)的11-(4-(二甲基氨基)丁基)-2,2,3,3,19,19,20,20-八甲基-4,18-二氧杂-3,19-二硅杂二十一烷-11-醇中加入1.90mL(33.21mmol)的乙酸和24.4mL的1.0M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，在室温下反应2小时。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，通过供于反相硅胶色谱{洗脱溶剂；水(0.1％三氟乙酸)：乙腈(0.1％三氟乙酸)(连续梯度)}进行纯化，得到2.86g(8.63mmol)的淡黄色油状物。收率为80％。
1H NMR；400MHzδ＝1.20-1.60(m,26H),2.80(s,6H),3.02(t,2H),3.62(t,4H).
(38)二肉豆蔻酸7-(4-(二甲基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL1C6)
将431mg(1.30mmol)的7-(4-(二甲基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇溶解于5mL的二氯甲烷中，加入713mg(3.12mmol)的肉豆蔻酸和31.8mg(0.26mmol)的DMAP，接着，加入748mg(3.90mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到472mg(0.627mmol)的淡黄色油状的二肉豆蔻酸7-(4-(二甲基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL1C6)。收率为48％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,6H),1.16-1.70(m,70H),2.22(s,6H),2.28(m,6H),4.04(t,4H).
[化学式34]
Figure BDA0002313561310000461
(39)二棕榈酸7-(4-(二甲基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL1D6)
将431mg(1.30mmol)的7-(4-(二甲基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇溶解于5mL的二氯甲烷中，加入800mg(3.12mmol)的棕榈酸和31.8mg(0.26mmol)的DMAP，接着，加入748mg(3.90mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到557mg(0.689mmol)的淡黄色油状的二棕榈酸7-(4-(二甲基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL1D6)。收率为53％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,6H),1.16-1.70(m,78H),2.22(s,6H),2.28(m,6H),4.04(t,4H).
[化学式35]
Figure BDA0002313561310000462
(40)双十四烷酸7-(4-(二甲基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL1C6)
将1.99g(6.0mmol)的7-(4-(二甲基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇溶解于20mL的二氯甲烷中，加入4.07g(14.4mmol)的油酸和147mg(1.20mmol)的DMAP，接着，加入3.45g(18.0mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到2.56g(2.98mmol)的淡黄色油状的二油酸7-(4-(二甲基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL1H6)。收率为50％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,6H),1.16-1.75(m,66H),2.01(m,8H),2.21-2.35(m,12H),4.04(t,4H),5.32(m,4H).
[化学式36]
Figure BDA0002313561310000471
(41)3-(二甲基氨基)丙酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯
将12.73g(23.9mmol)的11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)十一烷-1,5-二醇用50mL的二氯甲烷溶解，加入4.04g(26.3mmol)的3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐和293mg(2.4mmol)的DMAP，接着，加入5.50g(28.7mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，用0.5M氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到6.66g(10.54mmol)的浅黄色油状物。收率为44％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),1.23-1.66(m,26H),2.22(s,6H),2.47(t,2H),2.62(t,2H),3.60(t,4H),4.08(t,2H).
(42)3-(二甲基氨基)丙酸5,11-二羟基-5-(6-羟基己基)十一烷基酯
向6.66g(10.54mmol)的3-(二甲基氨基)丙酸11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)己基)-5-羟基十一烷基酯中加入1.82mL(31.6mmol)乙酸和21.1mL的1.0M四丁基氟化铵的THF溶液，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，通过供于反相硅胶色谱{洗脱溶剂；水(0.1％三氟乙酸)：乙腈(0.1％三氟乙酸)(连续梯度)}进行纯化，得到2.40g(5.95mmol)的淡黄色油状物。收率为57％。
1H NMR；400MHzδ＝1.22-1.50(m,20H),1.52-1.70(m,6H),2.81(s,6H),2.87(t,2H),3.33(t,2H),3.63(t,4H),4.12(t,2H).
(43)双十四烷酸7-(4-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL12C6)
将800mg(2.0mmol)的3-(二甲基氨基)丙酸5,11-二羟基-5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于5mL的二氯甲烷中，加入1.005g(4.4mmol)的肉豆蔻酸和48.9mg(0.40mmol)的DMAP，接着，加入959mg(5.0mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到737mg(0.894mmol)d1白色固体状物。收率为45％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.18-1.70(m,70H),2.22-2.31(m,10H),2.48(t,2H),2.61(t,2H),4.05(m,6H).
[化学式37]
Figure BDA0002313561310000481
(44)二棕榈酸7-(4-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL12D6)
将800mg(2.0mmol)的3-(二甲基氨基)丙酸5,11-二羟基-5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于5mL的二氯甲烷中，加入1.128g(4.4mmol)的棕榈酸和48.9mg(0.40mmol)的DMAP，接着，加入959mg(5.0mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到690mg(0.784mmol)的白色固体状物。收率为39％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.18-1.70(m,78H),2.22-2.31(m,10H),2.48(t,2H),2.61(t,2H),4.05(m,6H).
[化学式38]
Figure BDA0002313561310000491
(45)二油酸7-(4-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基酯(CL12H6)
将800mg(2.0mmol)的3-(二甲基氨基)丙酸5,11-二羟基-5-(6-羟基己基)十一烷基酯溶解于5mL的二氯甲烷中，加入1.243g(4.4mmol)的油酸和48.9mg(0.40mmol)的DMAP，接着，加入959mg(5.0mmol)的EDCI，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到874mg(0.937mmol)的无色油状物。收率为47％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(t,6H),1.11-1.68(m,66H),2.01(m,8H),2.22-2.31(m,10H),2.48(t,2H),2.62(t,2H),4.04(m,6H),5.32(m,4H).
[化学式39]
Figure BDA0002313561310000501
(46)((8-溴辛基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷
将17.78g(85.0mmol)的8-溴辛烷-1-醇溶解于100mL的1,2-二氯乙烷中，冷却至4℃。在加入13.86g(92.0mmol)的TBSCl之后，滴加15.33mL(110mmol)的TEA，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂，加入300mL的己烷使其悬浮，通过硅藻土过滤除去不溶物，由此得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到14.0g(44.3mmol)的无色油状物。收率为51％。
1H NMR；400MHzδ＝0.04(s,6H),0.89(s,9H),1.31(m,6H),1.42(m,2H),1.50(m,2H),1.85(tt,2H),3.40(t,2H)3.59(t,2H).
(47)13-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(8-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)辛基)十三烷-1,5-二醇
将0.70g(2.17mmol)的((8-溴辛基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷溶解于4mL的二乙醚中，加入1.26g(52mmol)的刮下的屑状镁，接着，加入1片碘碎片。在室温下静置10分钟后，在油浴中一边加热至40℃一边进行搅拌，滴加13.3g(41.13mmol)的溶解于11mL二乙醚中的((8-溴辛基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷。在40℃下反应2小时后，冷却至4℃。接着，加入1.81mL(19.5mmol)的δ-戊内酯，在室温下反应过夜。然后，冷却至4℃，通过滴加5％硫酸使残留的镁溶解。用二乙醚稀释，用水和饱和食盐水分液洗涤有机层。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到8.00g(13.58mmol)的无色油状物。得自δ-戊内酯的收率为70％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),1.25-1.60(m,34H),3.59(t,4H),3.65(t,2H).
(48)4-甲基苯磺酸13-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(8-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)辛基)-5-羟基十三烷基酯
将8.00g(13.58mmol)的13-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(8-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)辛基)十三烷-1,5-二醇溶解于30mL的1,2-二氯乙烷中，加入183mg(1.50mmol)的DMAP和2.79mL(20.0mmol)的TEA，冷却至4℃。接着，缓慢加入2.86g(15.0mmol)的pTsCl后，在室温下反应2小时。使用旋转蒸发器馏去溶剂，用乙酸乙酯悬浮，用水和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到无色油状物。
(49)13-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,23,23,24,24-八甲基-4,22-二氧杂-3,23-二硅杂二十五烷-13-醇
向10.09g(13.58mmol)的4-甲基苯磺酸13-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(8-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)辛基)-5-羟基十三烷基酯中加入30mL的1,2-二氯乙烷，冷却至4℃。接着，加入3.71mL(27.2mmol)的二丙胺后，在室温下反应10天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到5.86g(8.72mmol)的淡黄色油状物。收率为64％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),0.98(t,6H),1.22-1.80(m,38H),2.98(m,6H),3.58(t,4H).
(50)9-(4-(二异丙基氨基)丁基)十七烷-1,9,17-三醇
向4.50g(6.70mmol)的13-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,23,23,24,24-八甲基-4,22-二氧杂-3,23-二硅杂二十五烷-13-醇中加入1.72mL(30mmol)的乙酸和20mL的1.0M四丁基氟化铵的THF溶液，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，通过供于反相硅胶色谱{洗脱溶剂；水(0.1％三氟乙酸)：乙腈(0.1％三氟乙酸)(连续梯度)}进行纯化，得到2.03g(4.57mmol)的淡黄色油状物。收率为68％。
(51)二油酸9-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十七烷-1,17-二基酯(CL4H8)
将222mg(0.50mmol)的9-(4-(二异丙基氨基)丁基)十七烷-1,9,17-三醇溶解于2.5mL的1,2-二氯乙烷中，冷却至4℃。接着，加入451mg(1.50mmol)的油酰氯后，滴加836μL(6.0mmol)的TEA，在室温下反应3小时。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.2N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到68.4mg(0.070mmol)的淡黄色油状物。收率为14％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,12H),1.20-1.68(m,82H),2.01(m,8H),2.27(t,4H),2.32-2.45(m,6H),4.04(t,4H),5.32(m,4H).
[化学式40]
Figure BDA0002313561310000521
(52)((10-溴癸基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷
将25.0g(105.4mmol)的10-溴癸烷-1-醇溶解于100mL的1,2-二氯乙烷中，冷却至4℃。在加入17.3g(115mmol)的TBSCl之后，滴加19.5mL(140mmol)的TEA，在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂，加入300mL的己烷使其悬浮，通过硅藻土过滤除去不溶物，由此得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到21.0g(59.8mmol)的无色油状物。收率为57％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,6H),0.89(s,9H),1.24-1.34(m,10H),1.42(tt,2H),1.51(tt,2H),1.72-1.88(m,2H),3.40(t,2H),3.59(t,2H).
(53)15-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)癸基)十五烷-1,5-二醇
将1.05g(2.99mmol)的((10-溴癸基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷溶解于4mL的二乙醚中，加入1.75g(72.0mmol)的刮下的屑状镁，接着加入1片碘碎片。在室温下静置10分钟后，在油浴中一边加热至40℃一边进行搅拌，滴加19.95g(56.81mmol)的溶解于11mL二乙醚中的((10-溴癸基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷。在40℃下反应2小时后，冷却至4℃。接着，添加3.67mL(39.6mmol)的δ-戊内酯，在室温下反应过夜。然后，冷却至4℃，通过滴加5％硫酸使残留的镁溶解。用二乙醚稀释，用水和饱和食盐水分液洗涤有机层。接着，在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到11.95g(18.52mmol)的无色油状物。得自δ-戊内酯的收率为69％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(s,18H),1.22-1.60(m,42H),3.59(t,4H),3.66(t,2H).
(54)4-甲基苯磺酸15-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)癸基)-5-羟基十五烷基酯
将6.00g(9.30mmol)的15-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)癸基)十五烷-1,5-二醇溶解于30mL的1,2-二氯乙烷中，加入114mg(0.93mmol)的DMAP和3.24mL(23.25mmol)的TEA，冷却至4℃。接着，缓慢加入2.13g(11.16mmol)的pTsCl后，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂，用乙酸乙酯悬浮，用水和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；己烷：乙酸乙酯(连续梯度)}进行纯化，得到无色油状物。
(55)15-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,27,27,28,28-八甲基-4,26-二氧杂-3,27-二硅杂二十九烷-15-醇
向1.66g(2.08mmol)的4-甲基苯磺酸15-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-(10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)癸基)-5-羟基十五烷基酯中加入5mL的THF，冷却至4℃。接着，加入569μL(4.16mmol)的二丙胺后，在室温下反应21天。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，用1M氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到1.80g(2.47mmol)的淡黄色油状物。收率为27％。
1H NMR；400MHzδ＝0.05(s,12H),0.89(m,24H),1.23-1.62(m,46H),2.30-2.44(m,6H),3.58(t,4H).
(56)11-(4-(二异丙基氨基)丁基)二十一烷-1,11,21-三醇
向1.80g(2.47mmol)的15-(4-(二异丙基氨基)丁基)-2,2,3,3,27,27,28,28-八甲基-4,26-二氧杂-3,27-二硅杂二十九烷-15-醇中加入515μL(9.0mmol)的乙酸和6mL的1.0M四丁基氟化铵的THF溶液，在室温下反应过夜。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，通过供于反相硅胶色谱{洗脱溶剂；水(0.1％三氟乙酸)：乙腈(0.1％三氟乙酸)(连续梯度)}进行纯化，得到1.01g(2.02mmol)的淡黄色油状物。收率为82％。
1H NMR；400MHzδ＝0.99(t,6H),1.20-1.79(m,46H),3.00(m,6H),3.63(t,4H).
(57)二油酸11-(4-(二异丙基氨基)丁基)-11-羟基二十一烷-1,21-二基酯(CL4H10)
将250mg(0.50mmol)的11-(4-(二异丙基氨基)丁基)二十一烷-1,11,21-三醇溶解于4mL的二氯甲烷中，冷却至4℃。接着，加入602mg(2.0mmol)的油酰氯后，滴加12.2mg(0.10mmol)的DMAP和322μL(4.0mmol)的吡啶，在室温下反应3小时。使用旋转蒸发器馏去溶剂后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氢氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液洗涤。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器馏去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱{洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)}进行纯化，得到42.5mg(0.041mmol)的淡黄色油状物。收率为8.3％。
1H NMR；400MHzδ＝0.88(m,12H),1.17-1.65(m,90H),2.01(m,8H),2.28(t,4H),2.30-2.45(m,6H),4.05(t,4H),5.32(m,4H).
例2
对疏水性支架为来自亚油酸且具有各种亲水性部位的pH敏感性阳离子性脂质进行评价。LNP是依据专利文献6的实施例(例2)的方法，将各pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇、甲氧基聚乙二醇2000二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG 2000)设为摩尔比50:50:0.75-1.5，通过醇稀释法(图1)进行调制。利用相光散射法计算的平均粒径为80-120nm，siRNA装载率为90％以上。
使用对甲苯磺酸(TNS)求出各LNP的pKa。将TNS(终浓度：0.75μM)和LNP(终浓度：30μM)在调整至各pH的缓冲液中混合，用微孔板读数仪测定荧光强度。将最高值和最低值分别设为100％和0％荷电，将显示50％荷电率的pH设为pKa进行计算。其结果，根据叔氨基周边的化学结构，在4.5以下至8.2的宽范围内显示出各种pKa(图2)。
测定作为内体逃逸活性的指标的溶血活性、体外敲减活性和体内F7敲减活性。关于溶血活性，将小鼠红细胞和LNP在调整为pH6.5的缓冲液中混合，在37℃下培育30分钟后进行离心，测定上清的545nm下的吸光度。将不加入LNP的样品和加入终浓度0.5％的TritonX-100的样品分别作为阴性、阳性对照，计算各样品的溶血效率。关于体外敲减活性，向双荧光素酶(dual-luciferase)稳定表达的HeLa(HeLa-dluc)细胞中以各种浓度添加装载有针对荧光素酶的siRNA的LNP，24小时后通过双荧光素酶分析计算敲减效率。将目标荧光素酶表达量相对于添加浓度制图，将抑制50％的siRNA浓度作为IC50进行计算。关于体内F7敲减活性，将装载有针对F7的siRNA的LNP以0.1mg siRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，测定24小时后的血浆中F7酶活性。将相对于pKa的各活性制图(图3)。
体内F7敲减活性显示以pKa6.4左右为最大活性的钟型pKa依赖性(图3A)，这是与既往报道为同样的结果(非专利文献10；非专利文献13)。发现了多个显示比基准CL1A6(YSK12)更优异的敲减活性的衍生物。结果体外敲减活性随着pKa的上升而提高(图3B)。结果溶血活性也随着pKa的上升而提高(图3C)。由于任一活性均大致显示出所预测的pKa依赖性，因此提示了叔氨基周围的化学结构变化对pH敏感性阳离子性脂质的pKa产生较大影响，而对除此以外的部分的性质的影响相对较少。换言之，提示了通过改变叔氨基周边的化学结构，可以仅将pKa调节至目标值。
例3
将亲水性部位固定为CL4和CL15的2种，与例2同样地评价使疏水性支架的化学结构变化时的影响。当使用TNS测定pKa时，CL4为6.25-6.40、CL15为6.80-7.25，未观察到疏水性支架结构变化所带来的影响(图4A和4B)。关于体外敲减活性，除CL15B以外的其他衍生物优于以往的具有疏水性支架的CL15A(图5)。特别是在疏水性支架具有油酸的CL15H中，与CL15A相比，显示出约3倍左右的高活性。关于体内F7敲减活性，CL4和CL15的疏水性支架C、D的活性均低，而疏水性支架H显示出与疏水性支架A为相同程度以上的活性(图6A和图6B)。
特别是，对于显示高F7敲减活性的CL4H，着眼于脂质组成和脂质/siRNA电荷比，从敲减活性的观点出发，进行了制剂配方的优化。通过将CL4H：胆固醇的摩尔比从30:70改变至70:30调制了LNP。实验的结果，在CH4H：胆固醇比为60:40时显示出最大活性(图7A)。通过在2.375-14.25的范围内改变脂质/siRNA电荷比调制了LNP。实验的结果，随着电荷比的上升，敲减活性上升，在电荷比为7左右达到平稳状态(图7B)。根据该结果，将电荷比14.25作为最佳电荷比。根据以上的研究，用优化的配方调制CL4H-LNP，研究了F7敲减的给予量依赖性，结果显示出ED50为0.002mg siRNA/kg(图8)。
例4
研究了CL4H-LNP的体内的安全性。以7mg siRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，进行了24小时后的血浆中的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)值和给予前后的体重变化的测定。作为比较对象，使用开发人员先前开发的pH敏感性阳离子性脂质YSK13-C3，并且脂质组成为YSK13-C3-LNP优化的pH敏感性脂质：胆固醇：PEG-DMG2000＝70:30:3(摩尔比)。YSK-C3-LNP在ALT和AST二者中均显示出超过10,000的强肝毒性，而CL4H-LNP保持与PBS给予组为相同水平的轻微肝毒性(图9A)。另外，关于体重变化，在YSK13-C3-LNP给予组中观察到体重降低，而在CL4H-LNP中则导致体重增加(图9B)。由以上的结果显示出，CL4H是安全性优异的脂质化合物。
研究了疏水性支架对于平均粒径为35nm左右的小的LNP的siRNA导入活性的影响。将脂质组成设为pH敏感性阳离子性脂质：胆固醇：PEG-DMG2000＝70:30:3(摩尔比)，使用内置微型混合器的微流路制造了装载有针对荧光素酶的siRNA的LNP。测定HeLa-dluc细胞中的荧光素酶敲减活性的结果，在具有以往的来自亚油酸的疏水性支架的CL15A中，在以30nMsiRNA保持30％以下的敲减效率的条件下，CL15C、CL15D和CL15H以10nM siRNA均显示出50％以上的高敲减效率(图10)。该结果显示出，通过具有长的疏水性支架的pH敏感性阳离子性的脂质化合物，可克服LNP的小型化所伴随的siRNA导入效率的降低。
例5
使用将亲水性部位固定于CL4的3种脂质化合物(CL4H6、CL4H8和CL4H10)，与例2同样地评价了使上述疏水性支架1的化学结构变化时的影响。当使用TNS测定pKa时，CL4H6为6.35、CL4H8为6.10、CL4H10为5.85，疏水性支架1的碳链的长度越长则pKa越低(图11)。关于体内F7高敲活性，在从将装载有针对F7的siRNA的LNP静脉内给予ICR小鼠起24小时后，测定了血浆中的F7酶活性。其结果，3种类的衍生物均具有活性。其中，CL4H6显示出最优异的活性(图12)。
例6
对于CL4H6、以及非专利文献11等中记载的脂质化合物YSK05和YSK13-C3，测定体内F7敲减活性，研究了与从给予起24小时后的siRNA的残留量的关系。关于体内F7高敲活性，与例2同样地，使用各脂质化合物调制装载有针对F7的siRNA的LNP，将各LNP以0.01mgsiRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，在给予后30分钟后和24小时后，从各小鼠中回收肝脏，通过qRT-PCR法定量了肝脏中的siRNA。给予后30分钟后的肝脏中的siRNA，在使用任意的脂质化合物的LNP中均为相同程度，确认到肝脏转移量为大致相同(图13A)。另一方面，就投予后24小时后的肝脏中的siRNA残留量而言，观察到较大的差异(图13B)。给予CL4H6-LNP的肝脏的siRNA残留量是给予YSK05-LNP的肝脏的17.3倍、是给予YSK13-C3-LNP的肝脏的4.8倍。另外，求出给予各LNP的小鼠的F7敲减中的ED50，该值与给予后24小时后的肝脏中的siRNA的残留量呈反比例的关系(图13C)。这些结果提示了CL4H6-LNP有效地逃逸内体并将siRNA递送至细胞质中。
另外，将各LNP以1mg siRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，切除给予后1小时后的小鼠的肝脏，分别对核(Hoechst33342)、血管(FITC)、脂质(DiI)和siRNA(Cy5)进行荧光染色，利用共聚焦激光显微镜(CLSM)进行了观察。其结果，在给予CL4H6-LNP的小鼠中，肝实质细胞的细胞质中的siRNA的荧光量最大，并且观察到CL4H6-LNP有效地将siRNA递送至细胞质中的状态(图14)。
将各LNP以0.3mg siRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，经时地定量了血浆中F7蛋白的量。将各回收日的未给予LNP的小鼠(NT)的血浆中F7蛋白量设为100的相对血浆中F7蛋白量的经时性变化示于图15A。给予了CL4H6-LNP的小鼠可以在最长时间内将相对血浆中F7蛋白抑制在低水平。另外，当求出给予了LNP的小鼠的F7敲减中的ED50时，该值与相对血浆中F7蛋白含量为50的LNP给予后经过时间(Durability，耐久性)(day，天)呈负的相关关系(图15B)。即，在相同siRNA给予量下，CL4H6-LNP比YSK05-LNP和YSK13-C3-LNP更长时间地持续基因敲减活性。
通过使用Biophen FVII assay kit(Hypen BioMed制)的显色反应定量了血浆中F7蛋白。该显色反应是首先使FVII蛋白与试剂盒中的组织因子(TF)形成复合物。通过所得的FVII-TF复合物，使试剂盒中的因子X(FX)活化(FXa)，通过该酶活性产生显色底物。测定405nm下的吸光度，定量所产生的显色底物的量。
将各LNP以1mg siRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，经时性地回收肝脏和脾脏，用LC/MS定量了各阳离子性脂质。其结果，确认到：至给予后72小时经过的时间点，肝脏和脾脏中的YSK05和YSK13-C3几乎恒定，相对于此，在肝脏和脾脏中，CL4H6的组织内含量均经时性地减少(图16A和16B)。根据这些结果，显示出CL4H6富有生物降解性，并认为有助于高安全性。
例7
通过用甲氧基聚乙二醇2000二硬脂酰基甘油(PEG-DSG 2000)进一步修饰CL4H6-LNP来延长血中的滞留时间，并且进一步评价了癌细胞中的敲减活性。
具体而言，首先，与例2同样地，使用CL4H6-LNP调制了装载有针对PLK1的siRNA的LNP。将所得的CL4H6-LNP与PEG-DSG 2000一起分散于pH6.0的10％EtOH水溶液中，在60℃下培育30分钟，由此用PEG-DMG 2000进一步修饰了CL4H6-LNP。将该PEG-DSG修饰CL4H6-LNP以0.5mg siRNA/kg静脉内给予ICR小鼠(4周龄、雌性)，经时性地定量了血中PEG-DSG修饰CL4H6-LNP量。将给予小鼠的PEG-DSG修饰CL4H6-LNP的量(ID)设为100％的相对血中PEG-DSG修饰CL4H6-LNP量的经时性变化示于图17。
与PEG-DSG修饰CL4H6-LNP同样地，调制了PEG-DSG修饰YSK05-LNP。然后，将各LNP以2mg siRNA/kg静脉内给予OSRC2细胞(来自人肾细胞癌)皮下移植小鼠，用qRT-PCR法测定了给予后24小时后的癌组织中的PLK1基因的表达量。其结果，以未给予LNP的对照小鼠(NT)的癌组织中的PLK1表达量为1的相对PLK1表达量，在给予了PEG-DSG修饰CL4H6-LNP的小鼠和给予了PEG-DSG修饰YSK05-LNP的小鼠两者中均显著地降低。特别是，PEG-DSG修饰CL4H6-LNP与PEG-DSG修饰YSK05-LNP相比，相对血中PLK1表达量低，观察到优异的敲减活性(图18A)。
另外，在将各LNP给予后的24小时后，测定OSRC2细胞皮下移植的小鼠的体重，研究了相对于给予前的体重的变化率(％)(图18B)。在给予PEG-DSG修饰YSK05-LNP的小鼠中，在给予后观察到体重的略微减少，而在给予PEG-DSG修饰CL4H6-LNP的小鼠中，在给予PEG-DSG修饰YSK05-LNP的小鼠中，几乎没有体重的变动。根据这些结果，提示了PEG-DSG修饰的YSK05-LNP的安全性高、并且能够以多种方式使用。
例8
将含有装载有针对CD45的siRNA的CL4H6的LNP导入至来自骨髓的巨噬细胞中，测定了CD45基因的敲减活性。
首先，除了脂质组成是将阳离子性脂质(CL4H6)、胆固醇和PEG-DMG 2000的摩尔比设为60:40:2，并且使用针对CD45的siRNA之外，与例2同样地，调制了以各种浓度装载有针对CD45的siRNA的CL4H6-LNP。
在由ICR小鼠骨髓细胞诱导的巨噬细胞的培养培养基中，添加装载有针对CD45的siRNA的CL4H6-LNP，培养24小时。作为比较对象，使用脂质转染胺试剂(LipofectamineRNAiMAX、Thermo Fisher Scientific公司制)将针对CD45的siRNA转染至该巨噬细胞，培养24小时。通过qRT-PCR法测定了在各巨噬细胞培养24小时后的CD45基因的表达量。将未给予针对CD45的siRNA的巨噬细胞(NT)中的CD45的表达量设为100％的各巨噬细胞的相对CD45表达量(％)的结果示于图19。针对CD45的siRNA装载至CL4H6-LNP进行转染的巨噬细胞，相比使用脂质转染胺试剂将针对CD45的siRNA进行转染的巨噬细胞，以10倍以上的高效率诱导了基因敲减。
例9
将装载有针对CD45的siRNA的LNP给予OSRC2细胞皮下移植小鼠，测定了CD45基因的敲减活性。
首先，除了脂质组成是将阳离子性脂质(CL4H6或YSK05)、胆固醇和PEG-DSG2000设为摩尔比70:30:2，并且使用针对CD45的siRNA之外，与例2同样地，调制了装载有针对CD45的siRNA的LNP。
将各LNP以2mg siRNA/kg/剂量连续2天静脉内给予OSRC2细胞皮下移植小鼠。通过流式细胞术测定了从最终给予起48小时后的肿瘤相关巨噬细胞的CD45基因表达量。将未给予siRNA的肿瘤相关巨噬细胞(NT)中的CD45表达量设为100％时的各肿瘤相关巨噬细胞的相对CD45表达量(％)的结果示于图20。将针对CD45的siRNA装载至CL4H6-LNP进行给予的小鼠，相比装载至YSK05-LNP进行给予的小鼠，肿瘤相关巨噬细胞中的CD45的相对表达量低。即，CL4H6在肿瘤相关巨噬细胞中诱导了优异的基因敲减。
例10
将含有CL4H6的LNP重复给予小鼠，评价了安全性。作为装载于LNP的siRNA，使用了对小鼠没有药理活性的siRNA。
首先，使用CL4H6作为pH敏感性阳离子性脂质，与例2同样地，调制了装载有针对人PLK1的siRNA的LNP(CL4H6-LNP)。将所得的CL4H6-LNP以0.3mg siRNA/kg或1mg siRNA/kg每隔3或4天静脉内重复给予ICR小鼠(4周龄、雌性)。具体而言，在给予开始日(第0天)、从给予开始日起的第4、7、11、14、18、21和23天，静脉内给予了CL4H6-LNP。0.3mg siRNA/kg是装载有针对F7的siRNA的CL4H6-LNP的ED50(0.0025mg siRNA/kg)(参见例6)的120倍的给予量，1mg siRNA/kg是其400倍的给予量。
在给予开始第0、4、7、11、14、18、21、23和28天测定各小鼠的体重，与未给予组进行比较。将0.3mg siRNA/kg给予组(n＝3)、1mg siRNA/kg给予组(n＝3)和未给予组(n＝3)的、以给予开始第0天的体重为100％时的体重变化率(％)的经时性变化示于图21。0.3mgsiRNA/kg给予组和1mg siRNA/kg给予组的体重变化的推移、与未给予组大致相同，未观察到由CL4H6-LNP的反复给予引起的全身毒性。
在从CL4H6-LNP的重复给予开始起的第28天，采取0.3mg siRNA/kg给予组、1mgsiRNA/kg给予组、和未给予组的各小鼠的血清，测定了血液学参数，具体而言测定了总蛋白(TP：g/dL)、白蛋白(ALB：g/dL)、尿素氮(BUN：mg/dL)、肌酸酐(CRE：mg/dL)、钠(Na：mEq/L)、钾(K：mEq/L)、氯化物(Cl：mEq/L)、钙(Ca：mg/dL)、无机磷(IP：mg/dL)、天冬氨酸氨基转移酶(AST：IU/L)，丙氨酸氨基转移酶(ALT：IU/L)、乳酸脱氢酶(LDH：IU/L)、淀粉酶(AMY：IU/L)、g-谷氨酰基转移酶(γ-GT：IU/L)、总胆固醇(T-CHO：mg/dL)、中性脂肪(TG：mg/dL)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C：mg/dL)、总胆红素(T-BIL：mg/dL)、和葡萄糖(GLU：mg/dL)。各测定通过常规方法进行。
[表1]
测定项目 未给予组 0.3mg/kg给予组 1mg/kg给予组
TP(g/dL) 5.2±0.1 5.3±0.2 5.1±0.1
ALB(g/dL) 3.4±0.1 3.4±0.1 3.3±0.1
BUN(mg/dL) 27.8±5.4 30.0±1.2 24.7±2.4
CRE(mg/dL) 0.12±0.03 0.15±0.02 0.10±0.03
Na(mEq/L) 151±1 152±1 152±3
K(mEq/L) 5.5±0.8 5.4±0.7 4.5±0.1
Cl(mEq/L) 111±1 111±1 113±3
Ca(mg/dL) 9.8±0.5 10.4±0.4 9.4±0.4
IP(mg/dL) 7.9±1.1 8.1±1.3 7.0±1.1
AST(IU/L) 80±28 73±35 75±15
[表2]
测定项目 未给予组 0.3mg/kg给予组 1mg/kg给予组
ALT(IU/L) 34±6 34±14 27±1
LDH(IU/L) 195±59 250±103 301±20
AMY(IU/L) 2850±473 3518±454 3294±1034
γ-GT(IU/L) く3 く3 く3
T-CHO(mg/dL) 100±7 80±13 103±18
TG(mg/dL) 194±54 219±27 224±45
HDL-C(mg/dL) 60±3 49±8 60±7
T-BIL(mg/dL) 0.06±0.02 0.09±0.02 0.12±0.06
GLU(mg/dL) 185±21 199±5 184±14
将测定结果示于表1和表2。与未给予组进行比较，在0.3mg siRNA/kg给予组和1mgsiRNA/kg给予组中，任一项目均未观察到显著的变化。
在从CL4H6-LNP的重复给予开始起的第28天，从各组的小鼠采取血清后，回收肝脏和脾脏，实施了病理组织学检查(HE染色法)。
[表3]
Figure BDA0002313561310000621
Figure BDA0002313561310000631
将结果示于表3。与未给予组相比，在0.3mg siRNA/kg给予组和1mg siRNA/kg给予组中，未确认到明显的观察结果。由这些结果明确，CL4H6-LNP的安全性优异。
工业实用性
本发明的脂质化合物可提供兼具对于siRNA等的递送对象物质可达到优异的递送效率和高安全性、并且可克服LNP的粒径的减少所伴随的siRNA等递送活性的降低的脂质膜结构体。另外，含有本发明的脂质化合物的脂质膜结构体具有生物降解性、优异的内体逃逸能力和LNP的稳定化能力，可有效地将siRNA等递送至树突细胞等免疫细胞的细胞内。

Claims (16)

1.下述的式(I)所示的脂质化合物或其盐：
[化学式1]
(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X …(I)
式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1的整数；R1和R2分别独立地表示下述的式(A)所示的基团：
[化学式2]
CH3-(CH2)q-(CH＝CH)r-(CH2)s-(CH＝CH)t-(CH2)u-(CO-O)c-(CH2)v- …(A)
式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；当r为0时，t表示0或1，当r为1时，t表示0；s表示1～3的整数；u表示1～8的整数；c表示0或1；v表示4～12的整数，但在b与c同时为0的情况下，q为3～5的整数、r和t为1、s为1、且u+v为6～10的整数的情况除外；
X表示5～7元非芳族杂环基，其中，该基团通过碳原子与(O-CO)b-键合，该环上可被1个或2个的C1-4烷基或C2-4烯基取代，或者，X表示下述的式(B)所示的基团：
[化学式3]
-(CH2)d-N(R3)(R4) …(B)
式(B)中，d表示0～3的整数，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基或C2-4烯基，该C1-4烷基或C2-4烯基可被1个或2个苯基取代，R3和R4可彼此键合形成5～7元非芳族杂环，该环上可被1个或2个的C1-4烷基或C2-4烯基取代。
2.权利要求1所述的脂质化合物或其盐，其中，r和t为0，q+s+u为8～18的整数。
3.权利要求1或2所述的脂质化合物或其盐，其中，r为1，t为0，q为5～9的整数，s+u为5～9的整数。
4.权利要求1～3中任一项所述的脂质化合物或其盐，其中，v为5～12的整数。
5.权利要求1～4中任一项所述的脂质化合物或其盐，其中，a为4，b为0或1。
6.权利要求1～5中任一项所述的脂质化合物或其盐，其中，b为0；
X为式(B)所示的基团，其中，d为0，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基，R3所示的C1-4烷基可被1个苯基取代，或者在R3和R4彼此键合的情况下，形成1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基，该1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基可被1个C1-4烷基取代。
7.权利要求1～5中任一项所述的脂质化合物或其盐，其中，b为1；
X为式(B)所示的基团，其中，d为0～3的整数，R3和R4分别独立地表示C1-4烷基，R3所示的C1-4烷基可被1个苯基取代，或者在R3和R4彼此键合的情况下，形成1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基，该1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基可被1个或2个相同或不同的C1-4烷基取代。
8.权利要求1～5中任一项所述的脂质化合物或其盐，其中，b为1；
X为5～7元非芳族杂环基，该基通过碳原子与(O-CO)b-键合，该5～7非芳族杂环基为吡咯烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基，该吡咯烷基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基可被1个或2个相同或不同的C1-4烷基取代。
9.权利要求1～8中任一项所述的脂质化合物或其盐，其用作用于将siRNA递送至细胞内的脂质膜结构体的脂质成分。
10.脂质膜结构体，其含有权利要求1～8中任一项所述的脂质化合物或其盐作为脂质成分。
11.权利要求10所述的脂质膜结构体，其为脂质体。
12.权利要求10或11所述的脂质膜结构体，siRNA被包封在内部。
13.权利要求12所述的脂质膜结构体，其用于敲减细胞内的靶基因。
14.权利要求13所述的脂质膜结构体，其中，上述细胞为免疫细胞或癌细胞。
15.权利要求14所述的脂质膜结构体，其用于在免疫疗法中敲减树突细胞中的靶基因，所述免疫疗法是：从患者分离/采取树突细胞，在体外将siRNA导入该树突细胞的细胞内之后，将靶基因被敲减的树突细胞给予该患者。
16.权利要求1所述的脂质化合物或其盐，其中，r和t为0，q+s+u为10～16的整数。
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