WO2023188830A1 - 脂質ナノ粒子 - Google Patents

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WO2023188830A1 PCT/JP2023/003844 JP2023003844W WO2023188830A1 WO 2023188830 A1 WO2023188830 A1 WO 2023188830A1 JP 2023003844 W JP2023003844 W JP 2023003844W WO 2023188830 A1 WO2023188830 A1 WO 2023188830A1
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lipid
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ttr
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悠介 佐藤
秀吉 原島
はるの 小沼
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国立大学法人北海道大学
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to lipid nanoparticles useful as gene delivery carriers to liver cells and spleen cells and their constituent lipids.
  • Lipid nanoparticles are used as carriers to encapsulate fat-soluble drugs, siRNA (short interfering RNA), mRNA, and other nucleic acids and deliver them to target cells.
  • siRNA short interfering RNA
  • mRNA long interfering RNA
  • lipid nanoparticles that serve as carriers for efficiently delivering nucleic acids such as siRNA into target cells they are electrically neutral at physiological pH and become cationic in weakly acidic pH environments such as endosomes.
  • Lipid nanoparticles containing a changing pH-sensitive cationic lipid as a constituent lipid have been reported (Patent Document 1).
  • MC3 DLin-MC3-DMA
  • F7 knockdown factor 7
  • MC3 DLin-MC3-DMA
  • F7 knockdown factor 7
  • MC3 DLin-MC3-DMA
  • the present inventors have also developed original pH-sensitive cationic lipids YSK05 and YSK13-C3, and achieved ED50 of 0.06 and 0.015 mg siRNA/kg, respectively, in F7 knockdown ( Non-patent documents 2-4).
  • Non-Patent Documents 5 to 7 L319, which is a biodegradable MC3-DMA, and reported that it has both an ED 50 of 0.01 mg siRNA/kg and high safety.
  • Non-Patent Documents 5 to 7 it has been revealed that the endosomal escape efficiency of lipid nanoparticles containing these pH-sensitive cationic lipids is still only about a few percent (Non-Patent Document 8), and it is possible to further improve bioavailability. Development of new technology is desired.
  • lipid nanoparticles containing nucleic acids there is a method based on an alcohol dilution method using a channel.
  • lipid nanoparticles with a diameter of about 30 nm can be produced with good reproducibility by using a microchannel with a built-in three-dimensional micromixer that can achieve instant mixing of two liquids (Non-Patent Document 9).
  • the purpose of the present invention is to provide lipid nanoparticles that serve as gene delivery carriers to liver cells and spleen cells.
  • lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipids with branched hydrocarbon chains as constituent lipids are useful as gene delivery carriers for liver cells and spleen cells, and have developed the present invention. Completed.
  • R 11 and R 12 each independently represent a linear or branched C 1-15 alkyl group; c represents an integer of 1 to 7; e represents 4 to 12 (However, R 11 and R 12 may be connected to each other to form a ring) represents a group represented by;
  • X is the following general formula (B):
  • d represents an integer of 0 to 3;
  • R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group (the C 1-4 alkyl group or a C 2-4 -4 alkenyl group indicates one or two hydrogen atoms may be substituted with a phenyl group), but R 3 and R 4 are bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle (the One or two hydrogen atoms of the ring may be substituted with a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group).
  • a lipid nanoparticle containing a pH-sensitive cationic lipid represented by: [2] The lipid nanoparticle according to [1] above, wherein c is an integer of 4 to 7. [3] The lipid nanoparticle according to [1] or [2] above, wherein the sum of the number of carbon atoms of the group with a larger number of carbon atoms among R 11 and R 12 and the above c is 5 to 17.
  • lipid nanoparticles In the region where the single-stranded oligonucleotide can pair with a part of the guide RNA, 30 to 60% of the bases in the region are complementary to the bases in the guide RNA, [ 7] lipid nanoparticles.
  • the DNA nuclease is a Cas9 protein, The lipid nanoparticle according to [7] or [8], wherein the guide RNA consists of crRNA and tracrRNA.
  • [10] Contains a lipid component, a DNA nuclease, a guide RNA, and a single-stranded oligonucleotide containing a region capable of pairing with a part of the guide RNA, A lipid nanoparticle, wherein in a region where the single-stranded oligonucleotide can pair with a portion of the guide RNA, 30 to 60% of the bases in the region are complementary to the bases in the guide RNA.
  • a pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticles according to any one of [1] to [10] above as an active ingredient.
  • the lipid nanoparticles according to any one of [1] to [10] above, which encapsulate a foreign gene that is intended to be expressed in liver cells or spleen cells, are administered to test animals (however, human A method for expressing a foreign gene, which comprises administering the foreign gene to a test animal (excluding the test animal) and expressing the foreign gene in the liver or spleen of the test animal.
  • test animals however, human A method for expressing a foreign gene, which comprises administering the foreign gene to a test animal (excluding the test animal) and expressing the foreign gene in the liver or spleen of the test animal.
  • a genome editing method which comprises introducing the lipid nanoparticles according to any one of [7] to [10] into cells.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can highly express the encapsulated genes in liver cells and spleen cells. Therefore, the lipid nanoparticles are useful as gene delivery carriers used in gene therapy.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 2.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring the amount of lipid in the liver (ratio to the total amount administered per 1 g of liver; %/g liver) of mice to which each FlucmRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 3.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the TTR activity ( ⁇ g/mL) of mouse serum 7 days after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles in Example 4.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the TTR activity ( ⁇ g/mL) of mouse serum 7 days after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles in Example 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the in vitro DNA cleavage activity of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles in Example 6.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in mouse serum 7 days after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles in Example 6.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in each tissue of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 7.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in each tissue of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 7.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in each tissue of mice to which frozen samples or non-frozen samples were administered in Example 7.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in mouse serum 7 days after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles in Example 8.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in .
  • Example 8 the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in serum of mice was measured 7 days after administration of each TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle with different content ratios of CL4F11- ⁇ -2 and DSPC. It is a figure showing a result.
  • the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in mouse serum 7 days after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 was measured ( Figure 15 (A )) and the gene knockout efficiency (%) determined from the results (FIG. 15(B)).
  • Example 8 1, 4, or 12 weeks after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 or GFP-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2. It is a figure showing the result of measuring the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in the serum of the mouse. In Example 8, the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in mouse serum was measured 7 days after administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2, SM, ALC, or MC3. It is a figure showing the result.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in the serum of .
  • Example 8 DiR of each mouse tissue was measured 1 hour after administration of DiR-labeled TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles or DiR-labeled siTTR-loaded lipid nanoparticles diluted to have the same DiR fluorescence intensity.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of fluorescence intensity.
  • FIG. 21(A) is a diagram showing a plot (FIG.
  • FIG. 21(A) RNPs formed using sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-40%, or ssODN-TTR_3-0% at 37°C
  • FIG. 22(A) RNPs formed using sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-40%, or ssODN-TTR_3-0% at 37°C
  • FIG. 22(A) RNPs formed using sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-40%, or ssODN-TTR_3-0% at 37°C
  • FIG. 22(A) RNPs formed using sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-40%, or ssODN-TTR_3-0% at 37°C
  • X1 to X2 (X1 and X2 are real numbers satisfying X1 ⁇ X2)" means "more than or equal to X1 and less than or equal to X2.”
  • Lipid nanoparticles according to the present invention are lipid nanoparticles containing a pH-sensitive cationic lipid represented by the following general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as "pH-sensitive cationic lipid of the present invention"). It is.
  • the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I) as a constituent lipid of the lipid nanoparticles, the lipid nanoparticles according to the present invention have good introduction efficiency and expression efficiency into liver cells and spleen cells. It is useful as a gene carrier.
  • a represents an integer of 3 to 5, preferably 4.
  • b represents 0 or 1. When b is 0, it means that there is no -O-CO- group and it is a single bond.
  • R 1 and R 2 each independently represent a group represented by the following general formula (A).
  • R 11 and R 12 each independently represent a linear or branched C 1-15 alkyl group (an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms).
  • Examples include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, and tert-butyl group.
  • Examples of the C 2-4 alkenyl group include vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-methylvinyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group.
  • n-pentyl group 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 3-methylbutyl group, 1-ethylpropyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 2,2-dimethylpropyl group; n-hexyl group, 1-methylpentyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 4-methylpentyl group, 1-ethylbutyl group, 1,1-dimethylbutyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 1,2-dimethylbutyl group, 1-methyl-2,2-dimethylbutyl group; n-heptyl group, 1-methylhexyl group, 2-methylhexyl group, 3-methylhexyl group, 4-methylhexyl group, 5-methylhexyl group, 1-ethylpentyl group, 1,1-dimethylpentyl group, 2 , 2-dimethylpentyl group, 3,
  • R 11 and R 12 are each independently preferably a linear or branched C 1-12 alkyl group (an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms); A linear or branched C 1-10 alkyl group (an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms) is more preferable, and a linear or branched C 1-8 alkyl group (an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms) is more preferable. It is more preferable that it is an alkyl group). Furthermore, in the pH-sensitive cationic lipid of the present invention, R 1 and R 2 may be groups represented by the general formula (A), and may be the same group or different groups. .
  • the group with a larger carbon number among R 11 and R 12 is the main chain, the carbon number of the group with a larger carbon number among R 11 and R 12 is Nc L , and both The carbon number of the group having a smaller number of carbon atoms is set as NcS .
  • Nc L and Nc S have the same numerical value.
  • the sum of Nc L +c is preferably from 5 to 17, more preferably from 5 to 12, and more preferably from 6 to 11, since higher delivery efficiency can be achieved. It is even more preferable.
  • the sum of Nc L +c is preferably from 10 to 15, and more preferably from 13 to 15.
  • Nc S is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Nc L is preferably 4 to 8, more preferably 4 to 6.
  • the sum of Nc L +Nc S +c is preferably 10 to 17, more preferably 10 to 15, and even more preferably 11 to 13.
  • R 11 and R 12 may be linked to each other to form a ring.
  • the ring include cycloalkanes having 5 to 15 carbon atoms. Specific examples include cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane, cyclooctane, cyclononane, cyclodecane, cycloundecane, cyclododecane, cyclotridecane, cyclotetradecane, and cyclopentadecane. These cycloalkanes may have an alkyl substituent.
  • c represents an integer of 1 to 7.
  • the pH-sensitive cationic lipid of the present invention requires c to be an integer of 4 or more, that is, in the chain of general formula (A), at the ⁇ -position or a carbon atom farther from this. Preferably, it is branched.
  • e represents an integer of 4 to 12.
  • e is preferably an integer of 4 to 10, more preferably an integer of 6 to 10.
  • X represents a group represented by the following general formula (B) or a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group.
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group represented by X is bonded to (O-CO)b- through a carbon atom.
  • d represents an integer of 0 to 3. When d is 0, it means that there is no --(CH 2 )- group and it is a single bond.
  • R 3 and R 4 each independently represent a C 1-4 alkyl group (alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) or a C 2-4 alkenyl group (alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms). show.
  • the C 1-4 alkyl group or C 2-4 alkenyl group represented by R 3 and R 4 one or two hydrogen atoms may be substituted with a phenyl group.
  • R 3 and R 4 may be a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group, and may be the same group or different groups.
  • Examples of the C 1-4 alkyl group include a methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, and tert-butyl group.
  • Examples of the C 2-4 alkenyl group include vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-methylvinyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group. Examples include groups.
  • R 3 and R 4 may be bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle.
  • Examples of the 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle formed by R 3 and R 4 bonding to each other include 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, and 1-piperazinyl group. .
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle formed by bonding R 3 and R 4 to each other is one in which one or two hydrogen atoms in the ring are a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group. May be replaced. When two hydrogen atoms in the ring are substituted with a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group, they may be substituted with the same group, or may be substituted with different groups. Good too.
  • heteroatom contained in the heterocyclic group examples include a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc. .
  • the number of heteroatoms constituting the heterocycle in the heterocyclic group may be one, or two or more of the same or different heteroatoms.
  • the heterocycle in the heterocyclic group may be a saturated heterocycle and may contain one or more double bonds, but the heterocycle does not become an aromatic ring.
  • R 1 and R 2 are each independently, and in general formula (A), R 11 and R 12 are each independently, linear is a C 1-12 alkyl group having a shape or a branched chain, c is an integer of 1 to 7, e is an integer of 6 to 10, a is an integer of 3 to 5, and b is an integer of 3 to 5.
  • X is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (bonded to (O-CO)b- via a carbon atom in the heterocyclic group), preferably a 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group (bonded to (O-CO)b- by a carbon atom in the ring, one hydrogen atom is a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group) ), or in the general formula (I), R 1 and R 2 are each independently, and in the general formula (A), R 11 and R 12 are each independently is a linear or branched C 1-12 alkyl group, c is an integer of 1 to 7, e is an integer of 6 to 10, and a is an integer of 3 to 5.
  • R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group (R 3 and The C 1-4 alkyl group or C 2-4 alkenyl group represented by R 4 is preferably a compound in which one or two hydrogen atoms may be substituted with a phenyl group.
  • the pH-sensitive cationic lipid of the present invention is such that in general formula (I), R 1 and R 2 are each independently, and in general formula (A), R 11 and R 12 are each independently , a linear or branched C 1-8 alkyl group, c is an integer of 1 to 7, e is an integer of 6 to 10, and a is an integer of 3 to 5.
  • R 1 and R 2 are each independently in general formula (A), R 11 and R 12 are each independently a linear or branched C 1-8 alkyl group, c is an integer from 1 to 7, and e is A group that is an integer of 6 to 10, and a is an integer of 3 to 5, b is 0, X is the general formula (B), d is 0, and R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group.
  • R 1 and R 2 are each independently, and in general formula (A), R 11 and R 12 are each independently is a linear or branched C 1-8 alkyl group, c is an integer of 4 to 7, e is an integer of 6 to 10, and a is an integer of 3 to 5.
  • R 1 and R 2 are each independently In the general formula (A), R 11 and R 12 are connected to each other to form a cycloalkane having 5 to 15 carbon atoms, c is an integer of 4 to 7, and e is an integer of 6 to 10.
  • R 1 and R 2 are each independently, and in general formula (A), R 11 and R 12 are each independently a linear or branched C 1-8 alkyl group.
  • c is an integer of 4 to 7
  • e is an integer of 6 to 10
  • a is an integer of 3 to 5
  • b is 0, and X is a group of the general formula (B )
  • R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group
  • R 1 and R 2 are each independently a C 1-4 alkyl group
  • R 11 and R 12 are connected to each other to form a cycloalkane having 5 to 15 carbon atoms
  • c is an integer of 4 to 7, and e is an integer of 6 to 10
  • a is an integer of 3 to 5
  • b is 0,
  • X is general formula (B), d is 0, and R 3 and R 4 are each independently C 1-4 alkyl A compound that is a group;
  • R 1 and R 2 are the same group, and in the general formula (A), R 11 and R 12 are each independently, directly A chain or branched C 1-8 alkyl group, c is an integer of 4 to 7, e is an integer of 6 to 10, and a is an integer of 3 to 5.
  • R 1 and R 2 are the same group, and
  • R 11 and R 12 are linked to each other to form a cycloalkane having 5 to 15 carbon atoms, c is an integer of 4 to 7, and e is an integer of 6 to 10.
  • R 1 and R 2 are the same group, and in general formula (A), R 11 and R 12 are each independently a linear or branched C 1-8 alkyl group; , c is an integer of 4 to 7, e is an integer of 6 to 10, a is an integer of 3 to 5, b is 0, and X is a group of general formula (B) Among them, a compound in which d is 0 and R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group; in the general formula (I), R 1 and R 2 are the same group, and the general formula ( Among A), R 11 and R 12 are connected to each other to form a cycloalkane having 5 to 15 carbon atoms, c is an integer of 4 to 7, and e
  • R 1 and R 2 are the same group, and in the general formula (A), R 11 and R 12 are each independently , a linear or branched C 1-8 alkyl group, c is an integer of 4 to 7, the sum of Nc L +c is 8 to 12, Nc S is 1 to 6, and e is an integer of 6 to 10, a is an integer of 3 to 5, b is 0, X is the general formula (B), d is 0, R 3 and R A compound in which 4 is each independently a C 1-4 alkyl group is preferred, and in general formula (I), R 1 and R 2 are the same group, and in general formula (A), R 11 and R 12 are Each independently represents a linear or branched C 1-8 alkyl group, c is an integer of 4 to 7, the sum of Nc L +c is 9 to 11, and Nc S is 1 to 3.
  • R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group
  • R 1 and R 2 are the same group
  • R 11 and R 12 are each independently a linear or branched C 1-8 alkyl group
  • c is an integer of 4 to 6
  • the sum of Nc L +c is 9 to 11
  • Nc A group in which S is 1 to 3, e is an integer of 6 to 10, a is an integer of 3 to 5, b is 0, and X is a group in the general formula (B), d is 0, and R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group.
  • the pKa of the pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) is not particularly limited, but can be selected, for example, from about 4.0 to 9.0, preferably from about 4.5 to 8.5; It is preferred to select the type of each substituent to provide a range of pKas.
  • the pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) can be easily produced, for example, by the method specifically shown in the Examples of this specification. By referring to this production method and appropriately selecting raw material compounds, reagents, reaction conditions, etc., those skilled in the art can easily produce any lipid falling within the scope of general formula (I).
  • the group represented by general formula (A) is a group having a branched structure in which two hydrocarbon chains (R 11 and R 12 ) are connected to a -CO-O- group. That is, the pH-sensitive cationic lipid of the present invention has two branched hydrocarbon chains (R 1 and R 2 ), and these hydrocarbon chains are embedded in the lipid membrane of the lipid nanoparticle. becomes a hydrophobic scaffold.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are characterized by high selectivity to the liver by using the pH-sensitive cationic lipid of the present invention, which has a hydrophobic scaffold consisting of a branched chain structure, as a component of the lipid.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention have the pH-sensitive cationic lipid of the present invention as a constituent lipid, that is, two hydrocarbon chains (R 11 and R 12 ) are ⁇ with respect to the -CO-O- group. It has constituent lipids linked to carbon atoms at or more distal than this position. Therefore, the lipid nanoparticles according to the present invention have high selectivity even for the spleen.
  • the number of pH-sensitive cationic lipids of the present invention constituting the lipid nanoparticles of the present invention may be one type or two or more types.
  • the amount of the pH-sensitive cationic lipids of the present invention is determined based on the amount of the pH-sensitive cationic lipids of the present invention among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles. It refers to the total amount of lipid molecules corresponding to the pH-sensitive cationic lipids of the invention.
  • the ratio of the amount of the pH-sensitive cationic lipid of the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles is preferably 20 mol% or more.
  • the proportion of pH-sensitive cationic lipids in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles is more preferably 30 mol% or more, even more preferably 30 to 70 mol%, even more preferably 40 to 60 mol%.
  • lipids other than the pH-sensitive cationic lipid of the present invention lipids generally used when forming liposomes can be used.
  • examples of such lipids include phospholipids, sterols, glycolipids, and saturated or unsaturated fatty acids. These can be used alone or in combination of two or more.
  • phospholipids examples include glycerophospholipids such as phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, cardiolipin, plasmalogen, ceramide phosphorylglycerol phosphate, and phosphatidic acid; sphingomyelin, ceramide phosphorylglycerol, and ceramide phosphorylethanolamine. and sphingophospholipids; Furthermore, phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin can also be used.
  • glycerophospholipids such as phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, cardiolipin, plasmalogen, ceramide phosphorylglycerol phosphate, and phosphati
  • the fatty acid residues in glycerophospholipids and sphingophospholipids are not particularly limited, but examples include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 24 carbon atoms, and saturated or unsaturated fatty acid residues having 14 to 20 carbon atoms. Fatty acid residues are preferred. Specifically, mention may be made of acyl groups derived from fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, and lignoceric acid. I can do it. When these glycerolipids or sphingolipids have two or more fatty acid residues, all the fatty acid residues may be the same group or may be mutually different groups.
  • sterols examples include animal-derived sterols such as cholesterol, cholesterol succinate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, and dihydrocholesterol; plant-derived sterols (phytosterols) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol; Examples include sterols derived from microorganisms such as thymosterol and ergosterol.
  • glycolipids examples include glyceroglycolipids such as sulfoxyribosylglyceride, diglycosyldiglyceride, digalactosyldiglyceride, galactosyldiglyceride, and glycosyldiglyceride; glycosphingolipids such as galactosylcerebroside, lactosylcerebroside, and ganglioside; and the like. It will be done.
  • saturated or unsaturated fatty acids include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms, such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • the constituent lipids of the lipid nanoparticles according to the present invention preferably include a neutral lipid, more preferably a phospholipid or a sterol, and preferably a sterol. It is more preferable, and even more preferable that it contains cholesterol.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention preferably contain a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid component.
  • Polyalkylene glycol is a hydrophilic polymer, and by constructing lipid nanoparticles using polyalkylene glycol-modified lipids as lipid membrane-constituting lipids, the surface of the lipid nanoparticles can be modified with polyalkylene glycol. Surface modification with polyalkylene glycol may improve the stability of lipid nanoparticles, such as their retention in blood.
  • polyethylene glycol for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol, etc.
  • the molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.
  • stearylated polyethylene glycol eg, stearic acid PEG45 (STR-PEG45), etc.
  • stearylated polyethylene glycol can be used to modify lipids with polyethylene glycol.
  • the ratio of the polyalkylene glycol-modified lipid to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles of the present invention determines the liver selectivity of the pH-sensitive cationic lipid of the present invention, specifically, The amount is not particularly limited as long as it does not impair liver-specific gene expression activity when used as a gene carrier.
  • the ratio of polyalkylene glycol-modified lipids to the total amount of lipids constituting lipid nanoparticles is preferably 0.5 to 3 mol%.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be subjected to appropriate surface modification, etc., if necessary.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can have improved blood retention by modifying the surface with a hydrophilic polymer or the like.
  • surface modification can be performed by using lipids modified with these modifying groups as constituent lipids of lipid nanoparticles.
  • examples of lipid derivatives for improving blood retention include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerol phospholipid derivatives, etc.
  • You can also use In addition to polyalkylene glycol, we also use dextran, pullulan, Ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, and divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer as hydrophilic polymers to increase blood retention.
  • amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan, etc. can also be used for surface modification.
  • the lipid nanoparticles can be surface-modified with an oligosaccharide compound having three or more saccharides.
  • the type of oligosaccharide compound having three or more saccharides is not particularly limited, but for example, an oligosaccharide compound having about 3 to 10 sugar units bonded to it can be used, preferably about 3 to 6 sugar units bonded to it. Oligosaccharide compounds can be used. Among these, oligosaccharide compounds that are glucose trimers or hexamers can be preferably used, and oligosaccharide compounds that are glucose trimers or tetramers can be used more preferably.
  • isomaltotriose, isopanose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc. can be suitably used. More preferred are triose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose. Particularly preferred is maltotriose or maltotetraose, most preferred is maltotriose.
  • the amount of surface modification of lipid nanoparticles with oligosaccharide compounds is not particularly limited, but for example, it is about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably about 5 to 10 mol%, based on the total lipid amount. It is.
  • the method of surface-modifying lipid nanoparticles with oligosaccharide compounds is not particularly limited, but for example, liposomes (International Publication No. 2007/102481) in which lipid nanoparticles are surface-modified with monosaccharides such as galactose or mannose are known. Therefore, the surface modification method described in this publication can be adopted.
  • liposomes International Publication No. 2007/102481
  • monosaccharides such as galactose or mannose
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be provided with any one or more functions such as, for example, a temperature change sensitive function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitive function.
  • a temperature change sensitive function e.g., a thermosensitive function
  • a membrane permeation function e.g., a membrane permeation function
  • a gene expression function e.g., a gene expression function
  • a pH sensitive function e.g., a pH sensitive function
  • the lipid nanoparticles according to the present invention include one or more kinds selected from the group consisting of an antioxidant such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene, a charged substance, and a membrane polypeptide. It may contain substances such as Examples of charged substances that impart a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine, and examples of charged substances that impart a negative charge include dicetyl phosphate and cholesteryl hemis. Cusinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and the like can be mentioned. Examples of membrane polypeptides include membrane superficial polypeptides and integral membrane polypeptides. The blending amount of these substances is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the size of the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably 400 nm or less in average particle size, and preferably 300 nm or less in order to easily obtain high delivery efficiency to liver cells in vivo. It is more preferable that the average particle diameter is 200 nm or less, even more preferably 150 nm or less.
  • the average particle diameter of lipid nanoparticles means the number average particle diameter measured by dynamic light scattering (DLS). Measurement by dynamic light scattering can be carried out in a conventional manner using a commercially available DLS device or the like.
  • the polydispersity index (PDI) of the lipid nanoparticles according to the present invention is about 0.01 to 0.7, preferably about 0.01 to 0.6, and more preferably about 0.01 to 0.3.
  • the zeta potential may range from -50 mV to 5 mV, preferably from -10 mV to 5 mV.
  • the form of the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, but examples of forms dispersed in an aqueous solvent include unilamellar liposomes, multilamellar liposomes, spherical micelles, and amorphous layered structures.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are preferably unilamellar liposomes or multilamellar liposomes.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention preferably contain components to be delivered into target cells inside the particles covered with a lipid membrane.
  • the components that the lipid nanoparticles according to the present invention encapsulate inside the particles are not particularly limited as long as they have a size that can be encapsulated.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can encapsulate arbitrary substances such as nucleic acids, saccharides, peptides, low molecular compounds, and metal compounds.
  • Nucleic acids are preferred as the components to be included in the lipid nanoparticles according to the present invention.
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or an analog or derivative thereof (eg, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.).
  • the nucleic acid to be encapsulated in the lipid nanoparticle according to the present invention may be a single-stranded nucleic acid, a double-stranded nucleic acid, a linear shape, or a circular shape.
  • the nucleic acid to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention preferably contains a foreign gene for expression within the target cell, and is a nucleic acid that functions to express the foreign gene within the cell by being taken into the cell. It is more preferable that there be.
  • the foreign gene may be a gene originally contained in the genomic DNA of the target cell (preferably a liver cell), or may be a gene not contained in the genomic DNA.
  • Examples of such nucleic acids include gene expression vectors containing a nucleic acid consisting of a base sequence encoding a gene of interest to be expressed.
  • the gene expression vector may exist as an extrachromosomal gene in the introduced cell, or may be incorporated into genomic DNA by homologous recombination.
  • the gene expression vector to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and vectors commonly used in gene therapy and the like can be used.
  • the gene expression vector to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably a nucleic acid vector such as a plasmid vector.
  • the plasmid vector may remain circular, or may be previously cut into linear forms and encapsulated in the lipid nanoparticles of the present invention.
  • Gene expression vectors can be designed by conventional methods using commonly used molecular biological tools based on the base sequence information of the gene to be expressed, and can be manufactured by various known methods. .
  • the nucleic acid encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is a functional nucleic acid that controls the expression of a target gene present in a target cell.
  • the functional nucleic acids include antisense oligonucleotides, antisense DNA, antisense RNA, siRNA, microRNA, mRNA, and the like.
  • it may be plasmid DNA (pDNA) that serves as an siRNA expression vector for expressing siRNA in cells.
  • the siRNA expression vector can be prepared from a commercially available siRNA expression vector, and may be modified as appropriate.
  • the nucleic acid to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably mRNA or pDNA because it has particularly good selectivity to the liver.
  • the method for producing lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be adopted.
  • all lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and a lipid film is formed by drying under reduced pressure using an evaporator or spray drying using a spray dryer, and then the components are encapsulated in the lipid nanoparticles.
  • it can be produced by adding an aqueous solvent containing a nucleic acid or the like to the dried above-mentioned mixture, and further emulsifying it using an emulsifying machine such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifying machine, a high-pressure injection emulsifying machine, etc.
  • liposomes can also be produced by well-known methods such as reverse phase evaporation. If it is desired to control the size of lipid nanoparticles, extrusion (extrusion filtration) may be performed under high pressure using a membrane filter with uniform pore sizes.
  • composition of the aqueous solvent is not particularly limited, but examples include buffer solutions such as phosphate buffer, citrate buffer, and phosphate buffered saline, physiological saline, and medium for cell culture. I can do it.
  • aqueous solvents can stably disperse lipid nanoparticles, but they also contain monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and melesinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars (aqueous solutions) such as sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol, as well as glycerin, diglycerin, and polyglycerin.
  • monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose, lactose, sucrose, cellobios
  • polyhydric alcohol such as propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, 1,3-butylene glycol, etc. .
  • aqueous solution such as propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, 1,3-butylene glycol, etc.
  • the pH of the aqueous solvent should be set from weakly acidic to around neutral (about pH 3.0 to 8.0), and/or dissolved oxygen should be removed by nitrogen bubbling, etc. is desirable.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can also be produced by an alcohol dilution method using a channel.
  • a solution in which a lipid component is dissolved in an alcohol solvent and a solution in which a water-soluble component to be included in lipid nanoparticles is dissolved in an aqueous solvent are introduced through separate flow channels, and the two are combined.
  • This is a method for producing lipid nanoparticles.
  • baffles baffles having a constant width relative to the channel width are alternately arranged from both sides.
  • aqueous solvent used in the alcohol dilution method those mentioned above can be used.
  • aqueous dispersion of lipid nanoparticles When the obtained aqueous dispersion of lipid nanoparticles is freeze-dried or spray-dried, for example, monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, Stability can be improved by using sugars (aqueous solutions) such as disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and melesinose, polysaccharides such as cyclodextrin, and sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol.
  • sugars aqueous solutions
  • sugars such as disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and melesinose, poly
  • the above-mentioned saccharides, glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether Stability may be improved by using polyhydric alcohols (aqueous solutions) such as , diethylene glycol monoalkyl ether, and 1,3-butylene glycol.
  • the gene expression vector encapsulated in the lipid nanoparticles is selectively expressed in the liver and spleen rather than in other organs.
  • the gene expression vector encapsulated in the lipid nanoparticles is selectively expressed in the liver and spleen rather than in other organs.
  • the foreign gene is expressed in the liver or spleen of the test animal. be able to.
  • the siRNA expression vectors encapsulated in the lipid nanoparticles are selectively expressed in the liver and spleen than in other organs. , the expression of the gene targeted by the expression vector is suppressed.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention function as a gene expression carrier targeting the liver or spleen.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are useful as active ingredients in pharmaceutical compositions used in gene therapy, and are particularly effective in pharmaceutical compositions used in gene therapy that targets the liver or spleen. Useful as an ingredient.
  • the animal to which the lipid nanoparticles according to the present invention are administered is not particularly limited, and may be a human or a non-human animal.
  • non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and birds such as chickens, quail, and ducks.
  • the administration route for administering the lipid nanoparticles according to the present invention to animals is not particularly limited, but includes intravenous administration, enteral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, and nasal administration. Parenteral administration such as intrapulmonary administration is preferred.
  • nucleic acids and the like necessary for genome editing in the lipid nanoparticles of the present invention can also be used as gene carriers for gene therapy using genome editing.
  • RNP which is a complex of crRNA, tracrRNA, and Cas9 protein
  • CRISPR/Cas9 system is used for genome editing using the CRISPR/Cas9 system. It is possible to induce the desired gene knockout by expressing RNP in the target cell or by delivering the RNP itself into the target cell. Furthermore, by simultaneously delivering donor DNA, it is also possible to induce gene knock-in.
  • RNP consisting of guide RNA (gRNA) consisting of crRNA and tracrRNA and Cas9 protein
  • gRNA guide RNA
  • Cas9 protein a DNA nuclease
  • a DNA nuclease carried on a lipid nanoparticle binds to DNA in a gRNA-dependent manner, and recognizes and cleaves double-stranded DNA formed by pairing with a portion of gRNA. It is an enzyme.
  • the DNA nuclease include Cas9 and Cpf1.
  • Cas9 protein is a protein that binds to DNA in a gRNA-dependent manner and has at least one of RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity.
  • the Cas9 protein which has both RuvC and HNH nuclease activities, cuts double strands of genomic DNA.
  • the Cas9 protein used in the present invention may be a wild-type Cas9 protein derived from a bacterium that has a CRISPR system, or a mutant protein obtained by modifying the wild-type protein.
  • bacteria having a CRISPR system include Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, and Geobacillus stearothermophilus. Geobacillus stearothermophilus), Streptococcus thermophilus, Treponema denticola, and the like.
  • mutant proteins obtained by modifying the wild-type Cas9 protein include mutants in which a mutation is introduced that deactivates either RuvC nuclease activity or HNH nuclease activity.
  • mutants include a mutant in which the 10th aspartic acid of the wild-type Cas9 protein is replaced with alanine (Cas9 (D10A)).
  • Cas9 (D10A) is also called Cas9 nickase (Cas9n) because it functions as a DNA nickase.
  • it may be a mutant protein in which a mutation that does not affect the nuclease activity of the wild-type Cas9 protein is introduced.
  • the Cas9 protein used in the present invention may be a wild-type Cas9 protein or a mutant protein thereof with various peptides added thereto, or may be a chimeric protein fused with another protein.
  • the peptide include tag peptides such as His tag, Myc tag, and Flag tag, and signal peptides such as nuclear localization signal peptide.
  • Other proteins to be fused with the wild type or mutant Cas9 protein include, for example, GST, fluorescent protein, and the like.
  • the Cpf1 protein is a protein that binds to DNA in a gRNA-dependent manner and has only RuvC nuclease activity.
  • the Cas9 protein which has both RuvC and HNH nuclease activities, cuts the double strands of genomic DNA to form blunt ends, whereas the Cpf1 protein forms 5' overhanging ends.
  • the Cpf1 protein used in the present invention may be a wild-type Cpf1 protein derived from a bacterium that has a CRISPR/Cpf1 system, or may be a mutant protein obtained by modifying the wild-type protein.
  • bacteria having the CRISPR/Cpf1 system include Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium, and the like.
  • mutant proteins obtained by modifying the wild-type Cpf1 protein include mutants in which mutations that increase nuclease activity are introduced, and mutant proteins in which mutations that do not affect nuclease activity are introduced. .
  • the Cpf1 protein used in the present invention may be a wild-type Cpf1 protein or a mutant protein thereof with various peptides added thereto, or may be a chimeric protein fused with another protein.
  • the peptide and other proteins those similar to those mentioned for Cas9 protein can be used.
  • gRNA is RNA that has a base sequence that can pair with a target sequence (base sequence to be genome edited) on genomic DNA that is cleaved by DNA nuclease.
  • a "base sequence capable of pairing with a target sequence” is usually a base sequence that is homologous (identical) or complementary to the target sequence in order to suppress recognition of regions other than the target sequence.
  • gRNA may be composed of a single RNA, or may be composed of two or more RNAs forming a complex.
  • crRNA and tracrRNA can be used as gRNA.
  • crRNA is derived from bacteria with a CRISPR system, and consists of a region consisting of a base sequence complementary to a part of tracrRNA (binding region with tracrRNA) and a base sequence homologous or complementary to the target sequence on genomic DNA. It is a single-stranded RNA containing a region (genomic DNA binding region).
  • tracrRNA is derived from bacteria that also have a CRISPR system, and has a region (binding region with crRNA) consisting of a base sequence complementary to a part of crRNA, and hybridizes with crRNA in this region to form a hairpin structure. It is a single-stranded RNA that forms Cas9 protein recognizes the hairpin structure and RNP is formed.
  • crRNA and tracrRNA may be independent single-stranded RNAs, or both may be single-stranded RNAs linked via a suitable RNA linker.
  • examples of bacteria having a CRISPR system include those mentioned above.
  • the Cas9 protein, crRNA, and tracrRNA may all be derived from the same type of bacteria, or may be derived from different types of bacteria.
  • crRNA and tracrRNA may consist only of natural RNA, or may contain modified RNA or artificial nucleic acid in part or in whole, as long as the function of the CRISPR/Cas9 system is not impaired.
  • the gRNA may be any RNA containing the target sequence like crRNA, and tracrRNA is not necessary. Therefore, gRNA can be made shorter than when using Cas9 protein. Furthermore, gRNA may consist only of natural RNA, or may contain modified RNA or artificial nucleic acid in part or in whole, as long as it does not impair the function of the CRISPR/Cpf1 system.
  • the target sequence the base sequence in the region immediately following the PAM sequence is usually selected.
  • the PAM sequence is a sequence recognized by a DNA nuclease such as Cas9 protein, and is determined depending on the DNA nuclease such as Cas9 protein used.
  • a PAM sequence recognized by Cas9 protein includes 5'-NGG (N:A, G, C, T)
  • a PAM sequence recognized by Cpf1 protein includes 5'-TTTV (V:A, G, C), 5'-TTTN (N:A, G, C, T).
  • the base length of the target sequence in gRNA such as crRNA is not particularly limited, and can be, for example, about 15 to 30 bases long, preferably 18 to 22 bases long.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention when used as gene carriers for genome editing using the CRISPR/Cas9 system, in order to further improve genome editing efficiency, the lipid nanoparticles according to the present invention further contain a DNA nuclease, It is preferable to contain gRNA and a single-stranded oligonucleotide (ssON) containing a region that can pair with a part of the gRNA.
  • gRNA pairing region A region in ssON that can pair with gRNA
  • ssON pairing region a region in gRNA that pairs with a part of ssON
  • RNP which is a complex of DNA nuclease, gRNA, and ssON
  • ssON may be an oligonucleotide consisting only of DNA, an oligonucleotide consisting only of RNA, or a chimeric oligonucleotide containing both DNA and RNA.
  • ssON may consist only of natural RNA or DNA, or may contain modified nucleic acids or artificial nucleic acids in part or in whole, as long as it does not impair the function of the CRISPR system used. .
  • Cas9 protein and Cpf1 protein are positively charged, and therefore have low loading efficiency on lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipids as lipid components constituting the lipid membrane.
  • the nucleic acids complexed with DNA nucleases such as Cas9 protein include not only gRNA such as crRNA and tracrRNA but also ssON, the amount of nucleic acids contained in RNP is large, and the The charge is suppressed, the negative charge becomes strong, and it can be efficiently loaded onto lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipids.
  • the base length of ssON used in the present invention may be long enough to negatively charge RNP, and may be appropriately determined by considering the base length of gRNA, for example crRNA and tracrRNA, the type of Cas9 protein, etc. can be determined.
  • the length of ssON can be, for example, about 50 to 500 bases.
  • the DNA nuclease carried on the lipid nanoparticle is a Cas9 protein
  • it includes a partial region of crRNA other than the binding region with tracrRNA and a region consisting of a complementary base sequence.
  • ssON and crRNA hybridize through a region complementary to this crRNA (a binding region with crRNA).
  • crRNA and tracrRNA, crRNA and ssON hybridize with each other, and the resulting three-way complex and Cas9 protein form a complex.
  • the region that hybridizes with ssON in crRNA is such that crRNA can hybridize with tracrRNA and ssON simultaneously to form a ternary complex, and this ternary complex is recognized by Cas9 protein.
  • the ssON binding region in crRNA may include part or all of the genomic DNA binding region, or may be the same as the genomic DNA binding region.
  • the double nicking method using Cas9 nickase (Cas9n) in which either RuvC nuclease activity or HNH nuclease activity is inactivated two types of guide RNA are used. Therefore, in the case where the DNA nuclease loaded on the lipid nanoparticle is Cas9n and the lipid nanoparticle loaded with RNP for the double nicking method, two types of ssON are used that hybridize to each guide RNA.
  • ssON When knocking in a gene fragment of interest into cut genomic DNA using the CRISPR system, ssON can also be used as donor DNA to be knocked in.
  • ssON in addition to the binding region with gRNA such as crRNA, ssON is equipped with a region in which 40 to 60 bp homology arms for homologous recombination are added to both ends of the gene fragment to be knocked in. Functions as donor DNA.
  • gRNA base sequences such as crRNA and tracrRNA
  • design of ssON base sequences etc. are commonly used molecular biological tools based on the base sequence information of genomic DNA. This can be done in a conventional manner using .
  • gRNA can be designed using design tools such as CRISPR Design Tool (Horizon Discovery) and TrueDesign Genome Editor (Invitrogen).
  • the lipid nanoparticles that encapsulate RNP which is a complex of DNA nuclease, gRNA, and ssON, may be other than the lipid nanoparticles according to the present invention.
  • it can also be used as a gene carrier suitable for genome editing by encapsulating it in lipid nanoparticles as disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2.
  • the gRNA pairing region in ssON used in the present invention may be a base sequence that is completely complementary to the ssON pairing region in gRNA (perfect match sequence), but it may be a base sequence that is partially non-complementary to the ssON pairing region in gRNA. (mismatched bases) is preferable.
  • RNP which is a complex of DNA nuclease, gRNA, and ssON
  • RNP may be difficult to dissociate within the cells.
  • the gRNA pairing region has a moderate amount of mismatched bases with respect to the ssON pairing region, there is a good balance between stability during RNP production and ease of dissociation within the cell, and production stability and genome editing. It can be used as a gene carrier with both excellent efficiency.
  • the Tm value between the gRNA pairing region in ssON and the ssON pairing region in gRNA is preferably 25 to 40°C, more preferably 25 to 35°C, and 25 to 30°C. It is even more preferable that there be. Note that the Tm value can be determined, for example, by the Wallace method when the base is less than 18 bases, and by the nearest neighbor base pair method when the base is 18 or more.
  • the particles may include a pH-sensitive cationic lipid represented by the following general formula (II) (hereinafter referred to as "pH-sensitive cationic lipid (II)").
  • pH-sensitive cationic lipids represented by the following general formula (III) (hereinafter sometimes referred to as "pH-sensitive cationic lipids (III)"). It is also preferred to use particles. Even when lipid nanoparticles containing these pH-sensitive cationic lipids are used as gene carriers, 30 to 60% of the bases in the gRNA pairing region are complementary to the corresponding bases in the ssON pairing region. More preferably, 35-55% of the bases are complementary to corresponding bases in the ssON pairing region.
  • the Tm value between the gRNA pairing region in ssON and the ssON pairing region in gRNA is preferably 25 to 40°C, more preferably 25 to 35°C, and 25 to 30°C. It is even more preferable that there be.
  • a represents an integer of 3 to 5, preferably 4.
  • b indicates 0 or 1. When b is 0, it means that there is no -O-CO- group and it is a single bond.
  • R 21 and R 22 each independently represent a group represented by the following general formula (A').
  • q represents an integer of 1 to 9; r represents an integer of 0 or 1; s represents an integer of 1 to 3; t represents 0 or 1; u represents an integer of 1 to 8; represents an integer; f represents 0 or 1; v represents an integer from 4 to 12.
  • b and f are 0 at the same time, q is an integer from 3 to 5, r and t are 1, s is 1, and u+v is an integer from 6 to 10. except.
  • the hydrocarbon chains of R 21 and R 22 are relatively long from the viewpoint of stability of the lipid nanoparticles.
  • R 21 and R 22 are groups having 20 or more carbon atoms, that is, in the general formula (A'), q + 2r + s + 2t + u + f + v is an integer of 19 or more. It is preferable.
  • q+2r+s+2t+u+f+v is preferably an integer of 19 to 33, more preferably an integer of 19 to 31, and even more preferably an integer of 21 to 31. , more preferably an integer of 21 to 27.
  • R 21 and R 22 may be groups represented by the general formula (A'), and may be different groups, but are preferably the same group.
  • a is an integer of 3 to 5
  • b is 1
  • X is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (provided that ), preferably a 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group (bonded to (O-CO)b- by a carbon atom in the ring group), preferably a 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group (bonded to O-CO)b-, one hydrogen atom may be substituted with a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group), and R 21 and R 22 are each Independently, in the general formula (A'), r is 1, t is 0, q is an integer of 5 to 11, preferably an integer of 6 to 10, and s+u is an integer of 5 to 11, A
  • a group, a lipid; is preferred.
  • a lipid in which R 21 and R 22 are the same group is more preferable as the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (II), and a lipid in which R 21 and R 22 are the same group, Particularly preferred are lipids in which a is 4.
  • a represents an integer of 3 to 5, preferably 4.
  • b represents 0 or 1. When b is 0, it means that there is no -O-CO- group and it is a single bond.
  • R 31 and R 32 each independently represent a group represented by the following general formula (A").
  • R 33 and R 34 each independently, Represents a linear or branched C 5-15 alkyl group (alkyl group having 5 to 15 carbon atoms); g represents 0 or 1; h represents an integer of 4 to 12.
  • linear or branched C 5-15 alkyl group the same groups as those listed for R 11 can be used.
  • R 33 and R 34 are each independently preferably a linear or branched C 5-12 alkyl group (an alkyl group having 5 to 12 carbon atoms), A linear or branched C 5-10 alkyl group (alkyl group having 5 to 10 carbon atoms) is more preferable, and a linear or branched C 6-9 alkyl group (an alkyl group having 6 to 10 carbon atoms) is more preferable.
  • R 31 and R 32 only need to be groups represented by the general formula (A''), and are mutually the same groups. may be different groups.
  • R 1 and R 2 are each independently, and in the general formula (A''), R 33 and R 34 are each independently is a linear C 6-9 alkyl group, g is 1, h is an integer from 6 to 10, a is an integer from 3 to 5, and b is 1.
  • R 3 and R 4 are each independently C A compound that is a 1-4 alkyl group; in the general formula (III), R 1 and R 2 are each independently, and in the general formula (A''), R 33 and R 34 are each independently a branched is a C 6-9 alkyl group, g is 1, h is an integer of 6 to 10, a is an integer of 3 to 5, b is 0, and X is a general formula Among (B), d is 0, and R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group;
  • R 1 and R 2 are the same group, and in the general formula (A''), R 33 and R 34 are each independently a direct group as the pH-sensitive cationic lipid (III). It is a chain C 6-9 alkyl group, g is 1, h is an integer of 6 to 10, a is an integer of 3 to 5, b is 1, and is a 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group (bonded to (O-CO)b- by a carbon atom in the ring, and one hydrogen atom is C 1- 4 alkyl group or C 2-4 alkenyl group); in general formula (III), R 1 and R 2 are the same group, and in general formula (A''), , R 33 and R 34 are each independently a branched C 6-9 alkyl group, g is 1, h is an integer of 6 to 10, and a is 3 to 5 is an integer of 1, b is 1, and and one hydrogen atom may
  • the pKa of the pH-sensitive cationic lipid (II) and the pH-sensitive cationic lipid (III) is not particularly limited, but is, for example, about 4.0 to 9.0, preferably about 4.5 to 8.5, more preferably about It is possible to select from about 6 to 8, and it is preferable to select the type of each substituent so as to give a pKa in this range.
  • the pH-sensitive cationic lipid (II) and the pH-sensitive cationic lipid (III) can be easily produced, for example, by the method specifically shown in the Examples of this specification. By referring to this production method and appropriately selecting raw material compounds, reagents, reaction conditions, etc., those skilled in the art can easily produce any lipid falling within the scope of general formula (II) or general formula (III). can do.
  • TLC Thin layer chromatography
  • Cholesterol was manufactured by SIGMA Aldrich, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), and polyethylene glycol. 2000 modified 2-dimyristoyl-rac-glycero and polyethylene glycol 2000 modified dimyristoylglycerol (PEG-DMG) were manufactured by NOF Corporation.
  • SM-102 (hereinafter sometimes abbreviated as “SM") is manufactured by Cayman Chemical (catalog number: P/N 33474), and ALC-0315 (hereinafter sometimes abbreviated as “ALC”) is manufactured by Ambeed. (Catalog Number: P/N A1375212) and DLin-MC3-DMA (MC3) manufactured by MedChemExpres (Catalog Number: P/N HY-112251) were used, respectively.
  • mRNA encoding firefly luciferase Fluc
  • CleanCap FLuc mRNA, 5 moU was manufactured by TriLink Biotechnologies.
  • spCas9 nuclease (TrueCut Cas9 Protein v2) was used from Thermo Fisher Scientific, and single guide RNA (sgRNA) and single-stranded oligodeoxyribonucleotide (ssODN) were used from Integrated DNA Technologies.
  • sgRNA single guide RNA
  • ssODN single-stranded oligodeoxyribonucleotide
  • Two types of sgRNA targeting the TTR gene sgTTR-G211 and sgTTR-G269) were used as the sgRNA. Table 1 shows the base sequence of sgRNA.
  • ssODNs that pair with sgTTR-G211, there are seven types listed in Table 2 (ssODN-TTR_3-100%, ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-60%, ssODN-TTR_3-50%, ssODN-TTR_3-40%, ssODN-TTR_3-30%, ssODN-TTR_3-0%) were used.
  • ssODNs that pair with sgTTR-G269 there are four types listed in Table 2 (ssODN-TTR_4-60%, ssODN-TTR_4-50%, ssODN-TTR_4-50%, ssODN-TTR_4-40%, ssODN-TTR_4-30%) were used.
  • ssODNs that pair with sgTTR-G211
  • there are six types of ssODNs listed in Table 3 (ssODN-TTR_3- 10°C-3', ssODN-TTR_3-10°C-5', ssODN-TTR_3-24°C-3', ssODN-TTR_3-24°C-5', ssODN-TTR_3-50°C-3', ssODN-TTR_3- 50°C-5') was also used.
  • sgRNA When measuring the Tm value of sgRNA and ssODN in an RNP complex using a fluorescence quenching method, it is necessary to use sgRNA whose 5' end is modified with a fluorescent substance FAM and whose 3' end is modified with a quencher IBFQ (Iowa Black (registered trademark)). An ssODN modified with (Trademark) FQ) was used.
  • FAM-modified sgRNA RNA in which FAM was linked to the 5' end of sgTTR-G211 (sgTTR-G211-5FAM) was used.
  • IBFQ-modified ssODN includes IBFQ-modified RNA (ssODN-80%-3IBFQ) in which IBFQ is bound to the 3' end of a sequence (ssODN-80%) that matches 80% with the ssON pairing region in sgRNA, and ssON pairing region.
  • lipid nanoparticles were prepared by an alcohol dilution method using a channel.
  • a microfluidic device "iLiNP” manufactured by Lilac Pharma
  • the flow rate of the device was controlled using a syringe pump (Harvard Apparatus).
  • lipid nanoparticles containing only nucleic acids were prepared as follows. First, 0.125 mL of each of an ethanol solution containing each lipid component at a predetermined molar ratio and adjusted to a lipid concentration of 8 mM and an acetate buffer (25 mM, pH 4.0) adjusted to a nucleic acid concentration of 48.9 ng/mL were added. /min and 0.375 mL/min (total flow rate 0.5 mL/min) into the microchannel, and the lipid nanoparticle solution discharged from the channel was collected.
  • the lipid nanoparticle solution was placed in a dialysis membrane (MWCO 12,000-14,000) and dialyzed at 4°C for more than 2 hours using PBS (-) (pH 7.4) as the outer aqueous phase, and then the lipid nanoparticle solution was removed from the dialysis membrane. was recovered.
  • Preparation of lipid nanoparticles containing RNP was performed as follows. First, a Cas protein solution (10 ⁇ M) was added dropwise to an equal amount of sgRNA solution (10 ⁇ M) while vigorously mixing to prepare an RNP solution (5 ⁇ M). The RNP solution was mixed with an equal volume of ssODN solution (5 ⁇ M) to obtain an RNP-ssODN complex (2.5 ⁇ M). Next, an ethanol solution containing each lipid component at a predetermined molar ratio and adjusted to a lipid concentration of 8mM, and an RNP-ssODN solution in which the RNP-ssODN complex was diluted to 160nM with a 20mM MES buffer (pH 6.0, 50mM NaCl).
  • lipid nanoparticle solution discharged from the channel was collected.
  • the lipid nanoparticle solution was placed in a dialysis membrane (MWCO 12,000-14,000) and dialyzed at 4°C for more than 2 hours using PBS (-) (pH 7.4) as the outer aqueous phase, and then the lipid nanoparticle solution was removed from the dialysis membrane. was recovered.
  • the collected lipid nanoparticle solution was concentrated by ultrafiltration using a centrifugal filter unit (“Amicon Ultra-15”, MWCO 100 kDa, manufactured by Millipore).
  • fluorescently labeled RNP-containing lipid nanoparticles When preparing fluorescently labeled RNP-containing lipid nanoparticles, add an appropriate amount of fluorescent molecules, for example, 0.5 mol% in the case of DiR, a near-infrared fluorescent cyanine dye, to the ethanol solution adjusted to a lipid concentration of 8 mM. It was prepared by containing the following.
  • pKa of lipid nanoparticles was measured using p-Toluenesulfonic acid (TNS).
  • TNS p-Toluenesulfonic acid
  • lipid nanoparticles final concentration: 30 ⁇ M
  • a buffer solution 200 mL adjusted to each pH (pH 3.5 to 9.5).
  • As the buffer 20mM citrate buffer, 20mM sodium phosphate buffer, or 20mM Tris-HCl buffer containing 130mM NaCl was used.
  • encapsulation rate of lipid nanoparticles (encapsulation efficiency)> The encapsulation rate of lipid nanoparticles was determined by measuring the amount of encapsulated nucleic acid (in the case of RNP-ssODN, the amount of ssODN) using Ribogreen (manufactured by Life Technologies), which is an RNA intercalator.
  • LC/MS Liquid chromatography-mass spectrometry
  • LC/MS device LTQ-Orbitrap XL (manufactured by Thermo Scientific)
  • Column RP-MS LC column (2.6 ⁇ m, 2.1 mm x 50 mm, manufactured by Thermo Scientific) Temperature: 40°C
  • Solvent A acetonitrile/water (60:40 (v/v)) containing 10 mM ammonium formate and 0.1% formic acid
  • Solvent B isopropanol/acetonitrile containing 10 mM ammonium formate and 0.1% formic acid (60:40 (v/v))). 90:10 (v/v))).
  • lipid nanoparticles encapsulating FlucmRNA were intravenously injected into BALB/c mice (female, 4 weeks old) at a dose of 0.01mg mRNA/kg body weight.
  • mice were euthanized and each tissue was collected, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C.
  • Tissues were homogenized with passive lysis buffer (Promega) using a bead-type cell disruptor (Micro Smash MS-100R, TOMY Seiko). Tissue debris was removed by centrifugation and the supernatant was collected.
  • Fluc activity in the supernatant was measured using a luciferase assay system (E1500, Promega) according to the manufacturer's protocol. Luminescence was measured using a luminometer (Luminescencer-PSN, manufactured by ATTO). The protein concentration was determined using a commercially available measurement kit (BCA Protein Assay Kit, manufactured by Pierce). Fluc activity was expressed as relative light units (RLU) per mg of protein.
  • mice Male, 4 weeks old were intravenously injected with lipid nanoparticles encapsulating Cas9/sgTTR-RNP (Lipid nanoparticles loaded with Cas9/sgTTR-RNP) at the indicated doses.
  • mice were euthanized, blood was collected, and serum was isolated by centrifugation.
  • the TTR protein concentration in the serum was determined using a commercially available ELISA kit (Prealbumin ELISA Kit (mouse), manufactured by Aviva Systems Biology) according to the manufacturer's protocol.
  • the relative value (%) of the serum TTR protein concentration of the mouse to which each lipid nanoparticle was administered was defined as the knockout activity (TTR-KO activity) of the lipid nanoparticle, with the serum TTR protein concentration of the untreated mouse being taken as 100%. .
  • Genomic DNA was collected and purified from BALB/c mouse liver tissue using a commercially available nucleic acid extraction kit (NucleoSpin Tissue, manufactured by MACHEREY-NAGEL) according to the manufacturer's protocol.
  • dsDNA from the TTR gene locus was amplified by PCR (using KAPA HiFi HotStart DNA polymerase (manufactured by KAPA Biosystems)) using the genomic DNA as a template and the primer set listed in Table 4, and using a commercially available nucleic acid purification kit. (ISOSPIN PCR Product, manufactured by Nippon Gene).
  • TTR-RNP-ssODN 5 equivalents to lipid nanoparticles
  • the TTR-RNP-ssODN complex and purified PCR product (0.2 equivalent to RNP) were mixed in reaction buffer (50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9) and incubated at 37°C. and incubated for 30 minutes.
  • reaction buffer 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9
  • the reaction solution was heated at 65° C. for 5 minutes to inactivate Cas9-RNP, and then the dsDNA was run on a 3% agarose gel at 100 V for 40 minutes.
  • the gel after electrophoresis was stained (GelRed, manufactured by Biotium) and visualized using a fluorescent/visible light gel imaging system (Printgraph CMOS I, manufactured by ATTO). Bands were quantified using image analysis software (ImageJ
  • DNA cleavage was calculated using the following formula: In the formula, Int_full and Int_cleaved indicate the intensities derived from full-length (uncleaved) and cleaved DNA, respectively.
  • the resulting solution (10 ⁇ L) was incubated at 10° C., after which the temperature was increased by 1° C. at 10 second intervals. Fluorescence intensity was measured at each temperature from 11 to 70°C using a thermal cycler ("Dice (registered trademark) Real Time System III", manufactured by TaKaRa Bio). The temperature at which the fluorescence intensity became maximum was defined as the measured Tm value (°C).
  • mice Male, 4 weeks old were treated with lipid nanoparticles encapsulating TTR-RNP-ssODN complexes (TTR-RNP-ssODN loaded lipid nanoparticles) at 2 mg RNP/kg body weight for 2 consecutive days. Injected intravenously. One week after the last injection, mice were euthanized and liver tissues were collected, flash frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C. Genomic DNA was collected and purified from the collected liver tissue using a commercially available nucleic acid extraction kit (NucleoSpin Tissue, manufactured by MACHEREY-NAGEL) according to the manufacturer's protocol.
  • NucleoSpin Tissue manufactured by MACHEREY-NAGEL
  • the T7E1 assay was performed using a commercially available genome editing detection kit (Alt-R®, manufactured by Integrated DNA Technologies).
  • Alt-R® commercially available genome editing detection kit
  • the dsDNA treated with T7E1 was electrophoresed on an agarose gel in the same manner as in ⁇ Measurement of in vitro DNA cleavage activity>, and the gel after electrophoresis was stained to quantify the bands.
  • the RNP-ssODN solution was mixed with 3x molar amount of fluorescent molecules (DyLight 650 NHS ester) in DMSO and incubated for 30 min at ambient temperature in the dark. Unreacted fluorescent molecules were removed by ultrafiltration (Amicon Ultra-0.5, MWCO 3 kDa, manufactured by Millipore).
  • the obtained lipid nanoparticles encapsulating fluorescently labeled RNP-ssODN were intravenously injected into BALB/c mice (female, 4 weeks old) at 2 mg RNP/kg body weight.
  • mice were euthanized and various tissues including blood were collected.
  • the collected blood was immediately diluted with 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the collected tissue was immediately weighed and then homogenized in a 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution.
  • a standard curve was created using fluorescently labeled RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles and blood or tissue homogenate prepared in the same manner from untreated mice. Biodistribution was expressed as a percentage of the injected volume per tissue or blood (% injected volume).
  • mice Male, 4 weeks old
  • mice were intravenously injected with TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles at 2 mg RNP/kg body weight for 2 consecutive days.
  • mice were anesthetized, weighed, and blood sampled. Blood was collected from the inferior vena cava and processed into serum. Hematological parameters in serum were measured by Oriental Yeast Industry Co., Ltd.
  • the residue was loaded onto a reverse phase column (HP C18Aq, Teledyne ISCO) and mixed with 0.1% TFA aqueous solution and acetonylyl/2-propanol (1:1 (volume ratio)) containing 0.1% TFA. It was purified by flash chromatography (CombiFlash Rf, manufactured by Teledyne ISCO) using a gradient mobile phase of The residue was placed on a normal phase column (Sfaer Silica HC D, Biotage) and purified by flash chromatography (Slekt, Biotage) using a gradient mobile phase of DCM and MeOH. This gave CL4F10-e-2 (270 mg, 52% yield) as a colorless oil.
  • reaction mixture was quenched with saturated aqueous Na2S2O3 , then diluted with EtOAc , further washed with brine, and dried over anhydrous Na2SO4 .
  • the reaction solution after drying was filtered, and the filtrate was evaporated. This gave 2-propylheptanal (1.46g, 93%) as a colorless oil.
  • the crude product was used in the next reaction without further purification.
  • the residue was loaded onto a reverse phase column (HP C18Aq, Teledyne ISCO) and mixed with 0.1% TFA aqueous solution and acetonylyl/2-propanol (1:1 (volume ratio)) containing 0.1% TFA. It was purified by flash chromatography (CombiFlash Rf, manufactured by Teledyne ISCO) using a gradient mobile phase of The resulting residue was loaded onto a normal phase column (Sfaer Silica HC D, manufactured by Biotage) and purified by flash chromatography (Selekt, manufactured by Biotage) using a gradient mobile phase of DCM and MeOH. This gave CL4F11-e-3 (445 mg, 46% yield) as a colorless oil.
  • reaction mixture was quenched with saturated aqueous NH 4 Cl, then diluted with Et 2 O, washed with brine, and dried over anhydrous Na 2 SO 4 .
  • the reaction solution after drying was filtered, and the filtrate was evaporated.
  • the residue was dissolved in hexane, passed through silica gel and the solvent was evaporated.
  • the residue was loaded onto a normal phase column (Sfaer Silica HC D, Biotage) and purified by flash chromatography (Selekt, Biotage) using a gradient mobile phase of hexane and EtOAc. This gave 6-butyldodeca-4-enoethyl (1.75g) as a colorless oil.
  • the residue was loaded onto a reverse phase column (HP C18Aq, Teledyne ISCO) and mixed with 0.1% TFA aqueous solution and acetonylyl/2-propanol (1:1 (volume ratio)) containing 0.1% TFA. It was purified by flash chromatography (CombiFlash Rf, manufactured by Teledyne ISCO) using a gradient mobile phase of The resulting residue was loaded onto a normal phase column (Sfaer Silica HC D, manufactured by Biotage) and purified by flash chromatography (Selekt, manufactured by Biotage) using a gradient mobile phase of DCM and MeOH. This gave CL4F12-e-4 (85 mg, 18% yield) as a colorless oil.
  • the residue was loaded onto a reverse phase column (HP C18Aq, Teledyne ISCO) and mixed with 0.1% TFA aqueous solution and acetonylyl/2-propanol (1:1 (volume ratio)) containing 0.1% TFA. It was purified by flash chromatography (CombiFlash Rf, manufactured by Teledyne ISCO) using a gradient mobile phase of The resulting residue was loaded onto a normal phase column (Sfaer Silica HC D, manufactured by Biotage) and purified by flash chromatography (Selekt, manufactured by Biotage) using a gradient mobile phase of DCM and MeOH. This gave CL4F12-e-6 (320 mg, 18% yield) as a yellow oil.
  • the residue was loaded onto a reversed phase column (Sfaer C18, manufactured by Biotage) and mixed with 0.1% TFA aqueous solution and acetonylyl/2-propanol containing 0.1% TFA (1:1 (volume ratio)). It was purified by flash chromatography (Slekt, manufactured by Biotage) using a gradient mobile phase with a mixed solvent of The residue was placed on a normal phase column (Sfaer Silica HC D, Biotage) and purified by flash chromatography (Slekt, Biotage) using a gradient mobile phase of DCM and MeOH. This gave CL4F 11- ⁇ -2 (472 mg, 42% yield) as a colorless oil.
  • reaction mixture was quenched with saturated aqueous NH 4 Cl, then diluted with Et 2 O, washed with brine, and dried over anhydrous Na 2 SO 4 .
  • the reaction solution after drying was filtered, and the filtrate was evaporated.
  • the residue was loaded onto a reverse phase column (Sfaer C18, manufactured by Biotage) and subjected to flash chromatography (Slekt (manufactured by Biotage). This gave 8,10,10-trimethylundec-5-enoic acid (0.42 g, 37% yield) as a colorless oil.
  • anhydrous DCM (10 mL), 7-(4-dipropylamino)butyl)tridecane-1,7,13-triol (318 mg, 0.8 mmol), DMAP (10 mg, 0.1 mmol), and EDCI-HCl ( CL4F11- ⁇ -3(3) (251 mg, yield 38%) was obtained as a colorless oil by the same reaction as in Synthesis Example 15 (3) except that a mixture of 383 mg, 2.0 mmol) was used. It was done.
  • Example 1 Lipid nanoparticles were prepared using the lipids synthesized in Synthesis Examples 1 to 14 as constituent lipids. Furthermore, 7-(4-(diisopropylamino)butyl)-7-hydroxytridecane-1,13-diyl dioleate (CL4H6) was also used as a constituent lipid. CL4H6 was synthesized by the method described in Patent Document 1. DSPC, cholesterol (chol), and PEG-DMG were used as neutral lipids.
  • FlucmRNA was loaded by an alcohol dilution method.
  • lipid nanoparticles Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles.
  • Type of pH-sensitive cationic lipid used for preparation encapsulation rate (%) of prepared lipid nanoparticles, ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, ⁇ potential (mV), and pKa was measured.
  • pH-sensitive cationic lipids of the present invention the results of lipid nanoparticles containing a pH-sensitive cationic lipid in which c in the general formula (A) is 1 (pH-sensitive cationic lipid branched at the ⁇ position) are shown below. It is shown in Table 5.
  • lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids could be prepared. It was observed that as the number of carbon atoms in the pH-sensitive cationic lipid increases, the encapsulation rate (%) increases, the particle size decreases, and the pKa decreases.
  • chain type pH-sensitive cationic lipids (CL4F6-b-3, CL4F7-b-4, CL4F8-b-5, CL4F9-b-6, CL4F10-b-7, CL4F11-b-8) and cyclic type
  • CL4F9-b, CL4F14-b, CL4F17-b chain type pH-sensitive cationic lipids
  • cyclic type tended to have a higher pKa than the chain type.
  • lipid nanoparticles containing a pH-sensitive cationic lipid in which c in the general formula (A) is 4 (a pH-sensitive cationic lipid branched at the ⁇ -position). The results are shown in Table 6.
  • lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids could be prepared. Even for pH-sensitive cationic lipids that are branched at the ⁇ -position, it was observed that as the number of carbon atoms increases, the encapsulation rate (%) increases, the particle size decreases, and the pKa decreases.
  • Example 2 Regarding lipid nanoparticles containing CL4F11-e-3 as a pH-sensitive cationic lipid, the influence of the type and content ratio of neutral lipids was investigated.
  • Example 3 Among the FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles prepared in Example 1, lipid nanoparticles containing CL4H6, CL4F6, or CL4F10-e-2 were examined for metabolism in the liver.
  • mice female, 4 weeks old were intravenously injected with lipid nanoparticles encapsulating FlucmRNA (FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles) at a dose of 0.5mg mRNA/kg body weight. 0.5 hours, 4 hours, or 24 hours after the intravenous injection, the mice were euthanized, and the amount of lipid derived from each lipid nanoparticle in the liver was measured. The measurement results are shown in Figure 4. As a result, CL4H6 was metabolized and almost disappeared from the liver within 24 hours after administration, whereas CL4F6 was hardly metabolized and its content in the liver did not change within 24 hours after administration. There wasn't.
  • FlucmRNA FlucmRNA
  • TTR-RNP-ssODN using CL4H6, CL4F6, CL4F8-b-5, CL4F9-b-6, CL4F10-b-7, CL4F11-e-3, or CL4F12-e-6 as the pH-sensitive cationic lipid.
  • Lipid nanoparticles encapsulating the complex (TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles) were prepared.
  • ssODN in the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles ssODN-TTR_3-40% was used.
  • TTR-RNP- We created ssODN-loaded lipid nanoparticles. Measure the type of pH-sensitive cationic lipid used for preparation, encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, and ⁇ potential (mV) of the prepared lipid nanoparticles. did. The measurement results are shown in Table 8.
  • FIG. 5 shows the results of measuring TTR activity (TTR protein amount) ( ⁇ g/mL) in mouse serum 7 days after administration of each lipid nanoparticle.
  • TTR activity TTR protein amount
  • NT indicates the results of mice to which lipid nanoparticles were not administered.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F8-b-5, CL4F9-b-6, CL4F10-b-7, CL4F11-e-3, or CL4F12-e-6 had side chains.
  • the serum TTR activity was lower than that of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F6, whose hydrocarbon chain is branched at the ⁇ -position, and induced high gene knockout.
  • the knockout activity is higher when the pH-sensitive cationic lipid has fewer carbon atoms, and in particular, 90% or more knockout was achieved with CL4F11-e-3.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were similarly prepared using CL4F11-e-3 or CL4F12-e-4 as the pH-sensitive cationic lipid, and the encapsulation rate of the prepared lipid nanoparticles was (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, and ⁇ potential (mV). The measurement results are shown in Table 9.
  • each TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle was administered to mice, and the TTR activity ( ⁇ g/mL) of mouse serum was measured 7 days after administration.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • lipid nanoparticles containing CL4F12-e-4 also showed excellent knockout activity, it became clear that lipid nanoparticles containing CL4F11-e-3 showed the highest knockout activity.
  • the group with the smaller carbon number of R 11 and R 12 should be used as a pH-sensitive cationic lipid. It was suggested that Nc S is preferably 3 to 6, more preferably 3 to 5, and that c is preferably 4 or more. It was also suggested that in the general formula (A), the sum of R 11 , R 12 and c is preferably about 9 to 16, and optimally about 11 to 14.
  • Example 5 The influence of the match rate of the ssODN used with sgRNA on the knockout activity of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles was investigated. Specifically, a TTR-RNP-ssODN complex was prepared using sgTTR-G211 or sgTTR-G269 as gRNA and 11 types listed in Table 2 as ssODN. Lipid nanoparticles were prepared by an alcohol dilution method using CL4H6, DSPC, cholesterol, and PEG-DMG in a molar ratio of 50/10/40/3.5 (mol%).
  • each TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle was administered to mice, and the TTR-KO activity was determined.
  • TTR-KO activity is affected by the Tm value of ssODN and can be improved by using ssODN with a Tm value within the range of 20 to 40°C.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were produced using sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-0%, ssODN-TTR_3-40%, or ssODN-TTR_3-80%.
  • lipid nanoparticles encapsulating TTR-RNP (TTR-RNP-loaded lipid nanoparticles) were manufactured without using ssODN.
  • Lipid nanoparticles were prepared with a composition of CL4H6, DSPC, cholesterol, and PEG-DMG in a molar ratio of 50/10/40/3.5 (mol%).
  • the encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, and ⁇ potential (mV) were measured.
  • the measurement results are shown in Table 11.
  • TTR-RNP-ssODN containing ssODN had lower DNA cleavage activity in vitro than TTR-RNP containing no ssODN (ssODN(-)).
  • TTR-RNP-ssODN containing ssODN-TTR_3-80% had very low DNA cleaving activity
  • TTR-RNP-ssODN containing ssODN-TTR_3-40% had a very low DNA cleavage activity.
  • - DNA cleaving activity was comparable to that of ssODN.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-0%, TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-40%, and ssODN-TTR_3-80%) TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing TTR-RNP-ssODN were administered to mice, and biodistribution was evaluated.
  • TTR-RNP containing no ssODN was similarly administered to mice without being encapsulated in lipid nanoparticles (free RNP), and biodistribution was evaluated. The evaluation results are shown in Table 12.
  • Lipid nanoparticles encapsulating TTR-RNP-ssODN containing ssODN were administered more than when TTR-RNP (free RNP) not containing ssODN was administered as is ("ssODN (-) (free)" in the table).
  • the amount transferred to the liver and spleen was higher in the case of case. It has become clear that the presence or absence of encapsulation in lipid nanoparticles and the presence or absence of ssODN in RNP affect the migration to the liver and spleen.
  • T7E1 assay was performed on TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-40%. Specifically, 2 mg RNP/kg body weight was intravenously injected for 2 consecutive days, and one week after the last injection, the mice were euthanized and blood and liver were collected.
  • Genomic DNA was collected from the collected livers and subjected to T7E1 assay (n 3).
  • T7E1 assay was performed in the same manner on livers collected from mice to which lipid nanoparticles had not been administered.
  • KO activity of 27% was achieved at the DNA level by administration of TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-40%.
  • Serum was prepared from the collected blood, the TTR protein concentration in the serum was measured, and the TTR-KO activity was determined.
  • the TTR protein concentration in the serum of mice to which lipid nanoparticles were not administered was also measured.
  • the TTR protein concentration in the serum of mice administered with TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-40% was 81% lower than that of untreated mice, which was high. TTR-KO activity was confirmed.
  • the encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, and ⁇ potential (mV) were measured for the manufactured lipid nanoparticles. The measurement results are shown in Table 13.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle was administered to mice, and the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in the serum of the mice was measured 7 days after administration.
  • the measurement results are shown in FIG. In the figure, "NT" indicates the results of mice to which lipid nanoparticles were not administered.
  • mice administered with TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing 3' or ssODN-TTR_3-50°C-5' are shown.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-10°C-3' and TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-10°C-5' were comparable.
  • FlucmRNA was loaded by an alcohol dilution method.
  • the composition of the lipid nanoparticles containing MC3 as a pH-sensitive cationic lipid was MC3, DSPC, cholesterol, and PEG-DMG in a molar ratio of 50/10/38.5/1.5 (mol%).
  • TP total protein
  • AST aspartate transaminase
  • ALB albumin
  • LDH lactose dehydrogenase
  • BUN blood urea nitrogen
  • ⁇ -GT ⁇ -glutamyl transpeptidase
  • CRE creatinine
  • T-CHO total cholesterol
  • IP inorganic phosphate
  • TG is triglyceride
  • HDL-C high-density lipoprotein cholesterol
  • T-BIL total bilirubin
  • GLU glucose
  • Collect the solution flowing from the channel transfer an appropriate amount to a dialysis membrane ("Spectra/Por 4 dialysis membrane", MWCO:12000-15000), and add it to a sucrose-containing Tris buffer (20mM Tris-HCl, 9% by mass sucrose, pH 7). .4) was dialyzed twice for 2 hours at 4°C and collected to obtain FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles.
  • Lipid nanoparticles encapsulating TTR-RNP-ssODN complexes were prepared in the same manner as in Example 4 using CL4F13- ⁇ -2 (2) synthesized in Example 4 as a constituent lipid. was prepared.
  • As the ssODN in the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles ssODN-TTR_3-40% was used.
  • DSPC, cholesterol (chol), and PEG-DMG were used as neutral lipids.
  • TTR-RNP- We created ssODN-loaded lipid nanoparticles.
  • the encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, ⁇ potential (mV), and pKa of each prepared lipid nanoparticle were measured.
  • the results are shown in Table 17.
  • the "number of side chain carbons” refers to the total number of carbons that make up the side chains of the pH-sensitive cationic lipids (from the total number of carbons that make up the molecule, the number of carbon atoms from the end of the main chain to the branch position). (number minus number).
  • FIG. 12 shows the results of measuring the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in mouse serum 7 days after administration of each lipid nanoparticle.
  • NT indicates the results of mice to which lipid nanoparticles were not administered. The same applies to "NT” in the subsequent figures.
  • lipids with fewer scaffold carbons had lower serum TTR activity and exhibited higher gene expression knockout activity.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 had the lowest amount of TTR protein in serum and exhibited the highest knockout activity. Therefore, TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 were used in subsequent experiments.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 the content ratio of PEG-DMG is set to 1.5 to 3.5 mol%, and the ratio of RNP to be contained is set to 1.5 to 3.5 mol%.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were prepared in the same manner except that the weight ratio ([weight of RNP]/[total weight of lipid]) was 2, 4, or 5.6% by mass.
  • the encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, ⁇ potential (mV), and pKa of each prepared TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle were measured. The results are shown in Table 18. In the table, "RNP/lipid” represents [weight of RNP]/[total weight of lipid], and "PEG” represents the content ratio (mol%) of PEG-DMG to the total lipid amount.
  • Each TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle was administered to mice (0.2 mg RNP/kg body weight), and the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in the serum of the mice was measured 7 days after administration.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the serum TTR activity was at the same level in mice administered with any of the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles, and the content ratio of PEG-DMG was determined by [weight of RNP]/[total weight of lipid]. It was confirmed that the weight ratio of ] does not have much effect on gene knockout activity.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 the same procedure was carried out except that the content ratio of CL4F11- ⁇ -2 was 40, 50, or 60 mol%, and the content ratio of DSPC was 5 or 10 mol%.
  • Each TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle was administered to mice (0.2 mg RNP/kg body weight), and the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in the serum of the mice was measured 7 days after administration.
  • the measurement results are shown in FIG. In the figure, “CL (mol%)” and “PC (mol%)” are the same as in Table 19.
  • serum TTR activity was at the same level in mice administered with any of the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles, and the content ratio of pH-sensitive cationic lipids and neutral lipids in the lipid nanoparticles was It was confirmed that the effect on gene knockout activity was small.
  • the measurement results of the amount of TTR protein in serum are shown in FIG. 15(A).
  • the results of the knockout efficiency (%) calculated from the amount of TTR protein in serum are shown in FIG. 15(B).
  • Cas9/sgGFP-RNP prepared using sgRNA targeting the GFP gene (sgGFP) instead of sgTTR was similarly loaded on lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 as GFP-RNP-ssODN.
  • TTR is the result of mice administered with TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles
  • GFP GFP-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles
  • the encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, ⁇ potential (mV), and pKa of each prepared TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticle were measured. The results are shown in Table 20. As shown in Table 20, there was no major difference in physical properties such as encapsulation rate (%) among the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 showed significantly superior gene knockout activity than other TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles.
  • FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were also compared between cases in which CL4F11- ⁇ -2 was included as a constituent lipid of the lipid nanoparticles and cases in which SM, ALC, or MC3 were included as constituent lipids of the gene carrier.
  • the encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, ⁇ potential (mV), and pKa of each of the prepared FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were measured. The results are shown in Table 21. As shown in Table 21, there was no significant difference in physical properties such as encapsulation rate (%) among the FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles.
  • the gene expression activity in the spleen is superior to any of the Flucm RNA-loaded lipids containing SM, ALC, or MC3, and the lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 are suitable as gene carriers targeting the spleen. It was confirmed that there is.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2, CL4F11-e-3, or CL4F12-e-4 as pH-sensitive cationic lipids freezing and thawing treatment may affect the physical properties of the lipid nanoparticles themselves. The effect on gene knockout activity when administered to mice was investigated.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were prepared as follows. First, while stirring the 10 ⁇ M gRNA solution with a vortex mixer, the 10 ⁇ M Cas9 solution was added little by little to prepare a 5 ⁇ M RNP solution. An equal amount of the 5 ⁇ M RNP solution was mixed with the 5 ⁇ M ssODN solution to obtain a 2.5 ⁇ M RNP-ssODN solution. A 2.5 ⁇ M RNP-ssODN solution was diluted to 160 nM with MES buffer (pH 6.0) containing 50 mM NaCl, and this was used as an RNP solution.
  • MES buffer pH 6.0
  • a lipid solution was prepared by dissolving each lipid in ethanol to have a desired molar ratio composition with a total lipid concentration of 8 mM.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were obtained by performing dialysis twice for 2 hours at 4° C. in .4) and collecting them.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles A portion of the obtained TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles was frozen at -80°C and then dissolved at room temperature, which was used as a "frozen sample.” In addition, samples that were not subjected to freeze-thaw processing were referred to as “unfrozen samples.” The encapsulation rate (%), ⁇ average particle diameter (nm), number average particle diameter (nm), PdI, ⁇ potential (mV), and pKa of the prepared lipid nanoparticles were measured for frozen samples and non-frozen samples. The results are shown in Table 22. In the table, in the "Freeze” column, "-” indicates the results for unfrozen samples, and “+” indicates the results for frozen samples. For any of the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles, there was no significant difference in physical properties between frozen and non-frozen samples.
  • the tissue distribution of lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 was investigated when administered to mice, loaded with TTR-RNP-ssODN and loaded with sgTTR as siRNA without RNP.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing CL4F11- ⁇ -2 DiR-labeled ones (DiR-labeled TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles) were used.
  • mice Female, 4 weeks old were given DiR-labeled TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles at 0.75 mg RNP/kg body weight or DiR-labeled siTTR diluted to the same DiR fluorescence intensity. Loaded lipid nanoparticles were administered via the tail vein. One hour after administration, blood and organs were collected, and DiR fluorescence intensity was measured using an imaging system IVIS (in vivo imaging system, manufactured by PerkinElmer). The measurement results are shown in FIG.
  • IVIS in vivo imaging system, manufactured by PerkinElmer
  • RNP-LNP is the result of mice administered with DiR-labeled TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles
  • siRNA-LNP is the result of mice administered with DiR-labeled siTTR-loaded lipid nanoparticles. It is.
  • a plot of the fluorescence intensity at each temperature from 11 to 70° C. is shown in FIG. 21(A), and the amount of change in the fluorescence intensity at each temperature is shown in FIG. 21(B).
  • “80%”, “40%”, and “0%” are the results measured using ssODN-80%-3IBFQ, ssODN-40%-3IBFQ, and ssODN-0%-3IBFQ, respectively. be.
  • Tm value is the temperature at which the fluorescence intensity changes the most, it was 62°C for ssODN-80%-3IBFQ and 32°C for ssODN-40%-3IBFQ ( Figure 21(B)). At around 40°C, almost all of ssODN-40%-3IBFQ was dissociated from RNP, whereas almost all of ssODN-80%-3IBFQ formed a complex with RNP. These results suggested that ssODN-40%-3IBFQ rapidly dissociates from RNP within cells (37°C).
  • sgTTR-G211 was used as sgRNA.
  • ssODN-TTR_3-80%, ssODN-TTR_3-40%, or ssODN-TTR_3-0% was used as the ssODN.
  • the Tm value of sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-80% was 50°C, and the Tm value of sgTTR-G211 and ssODN-TTR_3-40% was 26°C.
  • the relative DNA cleavage activity of RNP containing ssODN-TTR_3-40% was comparable to that of RNP containing ssODN-TTR_3-0%.
  • the relative DNA cleaving activity of RNP containing ssODN-TTR_3-80% was only about 20%, which was significantly low.
  • the relative DNA cleavage activity of RNP containing ssODN-TTR_3-40% was higher than that of RNP containing ssODN-TTR_3-80%, but clearly higher than that of RNP containing ssODN-TTR_3-0%. It was low.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were obtained.
  • TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles were administered to mice (2.0 mg RNP/kg body weight), and the amount of TTR protein ( ⁇ g/mL) in the serum of the mice was measured 7 days after administration. did.
  • the measurement results are shown in FIG. In the figure, "30%” and “40%” are the results of mice administered with TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles containing ssODN-TTR_3-30% and ssODN-TTR_3-40%, respectively.
  • both the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles using ssODN-TTR_3-30% and the TTR-RNP-ssODN-loaded lipid nanoparticles using ssODN-TTR_3-40% have serum TTR.
  • the activity was low, and the gene knockout activity was fully demonstrated.
  • the gene knockout activity was not very high when prepared in an environment without temperature control (Table 10), whereas the gene knockout activity was high when prepared at 4°C. This is presumed to be because the ssODN and sgRNA formed a complex and were efficiently loaded onto the lipid nanoparticles because the temperature was below the Tm value.

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Abstract

本発明は、式(I)〔ａは３～５の整数を示し；ｂは０又は１を示し；Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して一般式(A)（Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１５アルキル基を示し；ｃは１～７の整数を示し：ｅは４～１２の整数を示す）で表される基を示し；Ｘは一般式(B)（ｄは０～３の整数を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基を示すが、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成してもよい）で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基を示す〕で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する、脂質ナノ粒子を提供する。 （Ｒ１）（Ｒ２）Ｃ（ＯＨ）－（ＣＨ２）ａ－（Ｏ－ＣＯ）ｂ－Ｘ　（Ｉ） （Ｒ１１）（Ｒ１２）ＨＣ－（ＣＨ２）ｃ－（ＣＯ－Ｏ）－（ＣＨ２）ｅ－　（Ａ） －（ＣＨ２）ｄ－Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）　（Ｂ）

Description

脂質ナノ粒子
　本発明は、肝臓細胞及び脾臓細胞に対する遺伝子送達キャリアとして有用な脂質ナノ粒子及びその構成脂質に関する。
　本願は、２０２２年３月３１日に日本に出願された特願２０２２－０６０９６０号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　脂溶性薬物や、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｍＲＮＡ等の核酸を封入し、標的細胞へ送達するためのキャリアとして、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が利用されている。例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸を効率的に標的細胞内へ送達するためのキャリアとなる脂質ナノ粒子として、生理的ｐＨでは電気的に中性であり、エンドソームなどの弱酸性ｐＨ環境下ではカチオン性に変化するｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子が報告されている（特許文献１）。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質としては、例えば、Jayaramanらは、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（以下、「ＭＣ３」と略すことがある）を開発し、マウス肝臓における第７因子（Ｆ７）ノックダウンにおいてＥＤ５０で０．００５ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇを達成した（非特許文献１）。本発明者らもこれまでに独自のｐＨ感受性カチオン性脂質ＹＳＫ０５及びＹＳＫ１３－Ｃ３を開発しており、Ｆ７ノックダウンにおけるＥＤ５０としてそれぞれ０．０６、０．０１５ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇを達成している（非特許文献２～４）。また、Maierらは、ＭＣ３－ＤＭＡに生分解性を付与したＬ３１９を開発し、ＥＤ５０で０．０１ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇと高い安全性の両立について報告している（非特許文献５～７）。しかしながら、これらのｐＨ感受性カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子のエンドソーム脱出効率は、未だ数％程度に過ぎないことが明らかにされており（非特許文献８）、バイオアベイラビリティを更に向上させることが可能な技術の開発が望まれている。
　一方で、核酸等を内包する脂質ナノ粒子の製造方法としては、流路を用いたアルコール希釈法を原理とするものがある。例えば、２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることで直径３０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を再現良く製造可能であることが報告されている（非特許文献９）。また、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることにより、従来の三次元ミキサーを用いる流路構造体よりも、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることも報告されている（特許文献２）。これらのナノ粒子製剤の製造方法は、近年では主に、脂溶性薬物や、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）又はｍＲＮＡ等の核酸を搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製造に採用されている。
国際公開第２０１８／２３０７１０号 国際公開第２０１８／１９０４２３号
Jayaraman et al., Angewandte Chemie International Edition, 2012, vol.51, p.8529-8533. Watanabe et al., Scientific Reports, 2014, 4:4750, DOI: 10.1038/srep04750. Yamamoto et al., Journal of Hepatology, 2016, vol.64, p.547-555. Sato et al., Molecular Therapy, 2016, vol.24, p.788-795. Maier et al., Molecular Therapy, 2013, vol.21(8), p.1570-1578. Wittrup et al., Nature Biotechnology, 2015, vol.33(8), p.870-876. Xu et al., Molecular Pharmaceutics, 2014, vol.11, p.1424-1434. Gilleron et al., Nature Biotechnology, 2013, vol.31(7), p.638-646. Leung et al.，Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces，2012，vol.116(34)，p.18440-18450.
　本発明は、肝臓細胞及び脾臓細胞に対する遺伝子送達キャリアとなる脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、分岐鎖型の炭化水素鎖を備えるｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子が、肝臓細胞及び脾臓細胞に対する遺伝子送達キャリアとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の脂質ナノ粒子等を提供するものである。
［１］　下記の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
〔式（Ｉ）中、ａは３～５の整数を示し；ｂは０又は１を示し；Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して下記一般式（Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式（Ａ）中、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１５アルキル基を示し；ｃは１～７の整数を示し：ｅは４～１２の整数を示す；ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに連結して環を形成していてもよい）
で表される基を示し；Ｘは、下記一般式（Ｂ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（該Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基に置換されていてもよい）を示すが、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を形成してもよい）
で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を示す〕
で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する、脂質ナノ粒子。
［２］　前記ｃが４～７の整数である、前記［１］の脂質ナノ粒子。
［３］　Ｒ１１と前記Ｒ１２のうちのより炭素数の大きい基の炭素数と前記ｃとの和が５～１７である、前記［１］又は［２］の脂質ナノ粒子。
［４］　さらに、ステロール及びポリアルキレングリコール修飾脂質を含有している、前記［１］～［３］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［５］　核酸を含有する、前記［１］～［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［６］　前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡである、前記［５］の脂質ナノ粒子。
［７］　ＤＮＡヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含有する、前記［１］～［５］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［８］　前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域において、当該領域中の３０～６０％の塩基が前記ガイドＲＮＡ中の塩基と相補的である、前記［７］の脂質ナノ粒子。
［９］　前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとからなる、前記［７］又は［８］の脂質ナノ粒子。
［１０］　脂質成分と、ＤＮＡヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドとを含有し、
　前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域において、当該領域中の３０～６０％の塩基が前記ガイドＲＮＡ中の塩基と相補的である、脂質ナノ粒子。
［１１］　前記［１］～［１０］のいずれかの脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
［１２］　遺伝子治療に用いられる、前記［１１］の医薬用組成物。
［１３］　前記［１］～［１０］のいずれかの脂質ナノ粒子であって、肝臓細胞内又は脾臓細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した脂質ナノ粒子を、被験動物（但し、ヒトを除く）へ投与し、前記被験動物の肝臓内又は脾臓内で前記外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子の発現方法。
［１４］　前記［７］～［１０］のいずれかの脂質ナノ粒子を細胞内へ導入する、ゲノム編集方法。
［１５］　前記の式（Ｉ）で表される、ｐＨ感受性カチオン性脂質。
［１６］　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシ－１３－（（３－プロピルヘキサノイル）オキシ）トリデシル３－エチルヘプタン酸、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ブチルヘプタノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ペンチルオクタノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ヘキシルノナノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ヘプチルデカノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－オクチルウンデカノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロヘプチルアセテート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロドデシルアセテート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロペンタデシルアセテート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－エチルデカノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－プロピルウンデカノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－ブチルドデカノエート、
　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－ヘキシルドデカノエート、
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７－エチルウンデカノエート）、
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８－エチルドデカノエート）、
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８，１０，１０－トリメチルウンデカノエート）、
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７，９，９－トリメチルデカノエート）、
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（９，１１，１１－トリメチルドデカノエート）、
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７，１１－ジメチルドデカノエート）、又は
７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８，１２－ジメチルトリデカノエート）である、
前記［１５］のｐＨ感受性カチオン性脂質。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、封入された遺伝子を、肝臓細胞内及び脾臓細胞内で高発現させることができる。このため、当該脂質ナノ粒子は、遺伝子治療に用いられる遺伝子送達キャリアとして有用である。
実施例１において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例２において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓中の脂質量（肝臓１ｇ当たりの投与量全量に対する割合；％／ｇ　肝臓）を測定した結果を示した図である。 実施例４において、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲ活性（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例４において、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲ活性（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例６において、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ切断活性を測定した結果を示した図である。 実施例６において、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例７において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの各組織におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例７において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの各組織におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例７において、凍結サンプル又は非凍結サンプルを投与したマウスの各組織におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＰＥＧ－ＤＭＧの含有比率と［ＲＮＰの重量］／［脂質の総重量］の重量比が異なる各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２とＤＳＰＣの含有割合が異なる各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果（図１５（Ａ））と、当該結果から求めた遺伝子ノックアウト効率（％）（図１５（Ｂ））を示した図である。 実施例８において、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子又はＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＧＦＰ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから１、４、又は１２週間後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２、ＳＭ、ＡＬＣ、又はＭＣ３を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２、ＳＭ、ＡＬＣ、又はＭＣ３を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓又は脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、又はＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の凍結サンプル又は非凍結サンプルを投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＤｉＲ標識ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子又はこれと同じＤｉＲ蛍光強度となるよう希釈したＤｉＲ標識ｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子を投与してから１時間後のマウスの各組織のＤｉＲ蛍光強度の測定結果を示した図である。 実施例９において、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１－５ＦＡＭと、ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱ、ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱ、又はｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱとを含む反応液の１１～７０℃の各温度の蛍光強度のプロット（図２１（Ａ））と、各温度における蛍光強度の変化量（図２１（Ｂ））を示した図である。 実施例９において、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１と、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％、又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％とを用いて形成されたＲＮＰの３７℃（図２２（Ａ））又は１５℃（図２２（Ｂ））におけるＤＮＡ切断活性を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定した結果を示した図である。 実施例９において、４℃で調製したＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を示した図である
　以下、本発明の実施態様について具体的に説明する。本願明細書において、「Ｘ１～Ｘ２（Ｘ１とＸ２は、Ｘ１＜Ｘ２を満たす実数）」は、「Ｘ１以上Ｘ２以下」を意味する。
［ｐＨ感受性カチオン性脂質］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、下記一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質（以下、「本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質」ということがある。）を含有する、脂質ナノ粒子である。脂質ナノ粒子の構成脂質として、一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質を備えることにより、本発明に係る脂質ナノ粒子は、肝臓細胞及び脾臓細胞に対する導入効率と発現効率が良好であり、遺伝子キャリアとして有用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　一般式（Ｉ）において、ａは３～５の整数を示すが、好ましくは４である。
　ｂは０又は１を示す。ｂが０の場合には－Ｏ－ＣＯ－基が存在せず、単結合であることを意味する。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、下記一般式（Ａ）で表される基を示す。一般式（Ａ）において、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１５アルキル基（炭素数１～１５のアルキル基）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１５アルキル基としては、
メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が挙げられる。Ｃ２－４アルケニル基としては、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチルビニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基；
ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基；
ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、１－エチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１－メチル－２，２－ジメチルブチル基；
ｎ－ヘプチル基、１－メチルヘキシル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、４－メチルヘキシル基、５－メチルヘキシル基、１－エチルペンチル基、１，１－ジメチルペンチル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、４，４－ジメチルペンチル基、１－メチル－３，３－ジメチルブチル基、２－メチル－３，３－ジメチルブチル基；
ｎ－オクチル基、１－メチルヘプチル基、２－メチルヘプチル基、３－メチルヘプチル基、４－メチルヘプチル基、５－メチルヘプチル基、６－メチルヘプチル基、１－エチルヘキシル基、１，１－ジメチルヘキシル基、２，２－ジメチルヘキシル基、３，３－ジメチルヘキシル基、４，４－ジメチルヘキシル基、５，５－ジメチルヘキシル基、１－メチル－４，４－ジメチルペンチル基、２－メチル－４，４－ジメチルペンチル基、３－メチル－４，４－ジメチルペンチル基；
ｎ－ノニル基、１－メチルオクチル基、２－メチルオクチル基、３－メチルオクチル基、４－メチルオクチル基、５－メチルオクチル基、６－メチルオクチル基、７－メチルオクチル基、１－エチルヘプチル基、１，１－ジメチルヘプチル基、２，２－ジメチルヘプチル基、３，３－ジメチルヘプチル基、４，４－ジメチルヘプチル基、５，５－ジメチルヘプチル基、６，６－ジメチルヘプチル基、１－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基、２－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基、３－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基、４－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基；
ｎ－デシル基、１－メチルノニル基、２－メチルノニル基、３－メチルノニル基、４－メチルノニル基、５－メチルノニル基、６－メチルノニル基、７－メチルノニル基、８－メチルノニル基、１－エチルオクチル基、１，１－ジメチルオクチル基、２，２－ジメチルオクチル基、３，３－ジメチルオクチル基、４，４－ジメチルオクチル基、５，５－ジメチルオクチル基、６，６－ジメチルオクチル基、７，７－ジメチルオクチル基、１－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、２－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、３－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、４－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、５－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基；
ｎ－ウンデシル基、１－メチルデシル基、２－メチルデシル基、３－メチルデシル基、４－メチルデシル基、５－メチルデシル基、６－メチルデシル基、７－メチルデシル基、８－メチルデシル基、９－メチルデシル基、１－エチルノニル基、１，１－ジメチルノニル基、２，２－ジメチルノニル基、３，３－ジメチルノニル基、４，４－ジメチルノニル基、５，５－ジメチルノニル基、６，６－ジメチルノニル基、７，７－ジメチルノニル基、８，８－ジメチルノニル基、１－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、２－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、３－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、４－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、５－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、６－メチル－７，７－ジメチルオクチル基；
ｎ－ドデシル基、１－メチルウンデシル基、２－メチルウンデシル基、３－メチルウンデシル基、４－メチルウンデシル基、５－メチルウンデシル基、６－メチルウンデシル基、７－メチルウンデシル基、８－メチルウンデシル基、９－メチルウンデシル基、１０－メチルウンデシル基、１－エチルデシル基、１，１－ジメチルデシル基、２，２－ジメチルデシル基、３，３－ジメチルデシル基、４，４－ジメチルデシル基、５，５－ジメチルデシル基、６，６－ジメチルデシル基、７，７－ジメチルデシル基、８，８－ジメチルデシル基、９，９－ジメチルデシル基、１－メチル－８，８－ジメチルノニル基、２－メチル－８，８－ジメチルノニル基、３－メチル－８，８－ジメチルノニル基、４－メチル－８，８－ジメチルノニル基、５－メチル－８，８－ジメチルノニル基、６－メチル－８，８－ジメチルノニル基、７－メチル－８，８－ジメチルノニル基；
ｎ－トリデシル基、１－メチルドデシル基、２－メチルドデシル基、３－メチルドデシル基、４－メチルドデシル基、５－メチルドデシル基、６－メチルドデシル基、７－メチルドデシル基、８－メチルドデシル基、９－メチルドデシル基、１０－メチルドデシル基、１１－メチルドデシル基、１－エチルウンデシル基、１，１－ジメチルウンデシル基、２，２－ジメチルウンデシル基、３，３－ジメチルウンデシル基、４，４－ジメチルウンデシル基、５，５－ジメチルウンデシル基、６，６－ジメチルウンデシル基、７，７－ジメチルウンデシル基、８，８－ジメチルウンデシル基、９，９－ジメチルウンデシル基、１０，１０－ジメチルウンデシル基、１－メチル－９，９－ジメチルデシル基、２－メチル－９，９－ジメチルデシル基、３－メチル－９，９－ジメチルデシル基、４－メチル－９，９－ジメチルデシル基、５－メチル－９，９－ジメチルデシル基、６－メチル－９，９－ジメチルデシル基、７－メチル－９，９－ジメチルデシル基、８－メチル－９，９－ジメチルデシル基；
ｎ－テトラデシル基、１－メチルトリデシル基、２－メチルトリデシル基、３－メチルトリデシル基、４－メチルトリデシル基、５－メチルトリデシル基、６－メチルトリデシル基、７－メチルトリデシル基、８－メチルトリデシル基、９－メチルトリデシル基、１０－メチルトリデシル基、１１－メチルトリデシル基、１２－メチルトリデシル基、１－エチルドデシル基、１，１－ジメチルドデシル基、２，２－ジメチルドデシル基、３，３－ジメチルドデシル基、４，４－ジメチルドデシル基、５，５－ジメチルドデシル基、６，６－ジメチルドデシル基、７，７－ジメチルドデシル基、８，８－ジメチルドデシル基、９，９－ジメチルドデシル基、１０，１０－ジメチルドデシル基、１１，１１－ジメチルドデシル基、１－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、２－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、３－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、４－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、５－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、６－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、７－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、８－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、９－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基；
ｎ－ペンタデシル基、１－メチルテトラデシル基、２－メチルテトラデシル基、３－メチルテトラデシル基、４－メチルテトラデシル基、５－メチルテトラデシル基、６－メチルテトラデシル基、７－メチルテトラデシル基、８－メチルテトラデシル基、９－メチルテトラデシル基、１０－メチルテトラデシル基、１１－メチルテトラデシル基、１２－メチルテトラデシル基、１３－メチルテトラデシル基、１－エチルトリデシル基、１，１－ジメチルトリデシル基、２，２－ジメチルトリデシル基、３，３－ジメチルトリデシル基、４，４－ジメチルトリデシル基、５，５－ジメチルトリデシル基、６，６－ジメチルトリデシル基、７，７－ジメチルトリデシル基、８，８－ジメチルトリデシル基、９，９－ジメチルトリデシル基、１０，１０－ジメチルトリデシル基、１１，１１－ジメチルトリデシル基、１２，１２－ジメチルトリデシル基、１－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、２－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、３－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、４－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、５－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、６－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、７－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、８－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、９－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、１０－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基等が挙げられる。
　一般式（Ａ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１２アルキル基（炭素数１～１２のアルキル基）であることが好ましく、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１０アルキル基（炭素数１～１０のアルキル基）であることよりが好ましく、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基（炭素数１～８のアルキル基）であることがさらに好ましい。また、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質では、Ｒ１及びＲ２は、一般式（Ａ）で表される基であればよく、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい。
　一般式（Ａ）において、Ｒ１１及びＲ１２のうちのより炭素数の大きい基を主鎖とし、Ｒ１１及びＲ１２のうちのより炭素数の大きい基の炭素数をＮｃＬとし、両者のうちより炭素数の小さい基の炭素数をＮｃＳとする。Ｒ１１及びＲ１２が同じ炭素数の場合には、ＮｃＬとＮｃＳとは同じ数値となる。より高い送達効率を達成可能であることから、一般式（Ａ）のうち、ＮｃＬ＋ｃの和が５～１７であることが好ましく、５～１２であることがより好ましく、６～１１であることがさらに好ましい。ＮｃＬ＋ｃの和は、１０～１５であることも好ましく、１３～１５であることも好ましい。送達効率の点からは、ＮｃＳが、１～８であることが好ましく、１～５であることがより好ましく、１～３であることがさらに好ましい。また、ＮｃＬは、４～８であることが好ましく、４～６であることがより好ましい。送達効率の点からは、ＮｃＬ＋ＮｃＳ＋ｃの和が、１０～１７であることが好ましく、１０～１５であることがより好ましく、１１～１３であることがさらに好ましい。
　一般式（Ａ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、互いに連結して環を構成していてもよい。当該環としては、例えば、炭素数５～１５からなるシクロアルカンが挙げられる。具体的には、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、シクロノナン、シクロデカン、シクロウンデカン、シクロドデカン、シクロトリデカン、シクロテトラデカン、シクロペンタデカンが挙げられる。これらのシクロアルカンは、アルキル基の置換基を有していてもよい。
　一般式（Ａ）において、ｃは１～７の整数を示す。生分解性が向上する点から、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、ｃが４以上の整数であること、すなわち、一般式（Ａ）の鎖において、ε位又はこれより遠い炭素原子で分岐させていることが好ましい。
　一般式（Ａ）において、ｅは４～１２の整数を示す。本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、ｅが４～１０の整数であることが好ましく、６～１０の整数であることがより好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｘは、下記一般式（Ｂ）で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基を示す。Ｘが示す５～７員非芳香族ヘテロ環基は、炭素原子により(O-CO)b-に結合する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　一般式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示す。ｄが０の場合には-(CH２)-基が存在せず、単結合であることを意味する。
　一般式（Ｂ）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基（炭素数１～４のアルキル基）又はＣ２－４アルケニル基（炭素数１～４のアルケニル基）を示す。Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい。Ｒ３及びＲ４は、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基であればよく、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい。
　Ｃ１－４アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が挙げられる。Ｃ２－４アルケニル基としては、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチルビニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基が挙げられる。
　一般式（Ｂ）中、Ｒ３及びＲ４は、互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成していてもよい。Ｒ３及びＲ４が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環としては、例えば、１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、及び１－ピペラジニル基が挙げられる。Ｒ３及びＲ４が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環は、環中の１個又は２個の水素原子がＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい。該環中の２個の水素原子がＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていている場合、互いに同じ基により置換されていてもよく、互いに異なる基により置換されていてもよい。
　一般式（Ｉ）において、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基である場合、該ヘテロ環基に含まれるヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子などを挙げることができる。該ヘテロ環基中のヘテロ環を構成するヘテロ原子は、１個でもよく、同一又は異なるヘテロ原子が２個以上でもよい。該ヘテロ環基中のヘテロ環は、飽和のヘテロ環であってもよく、１個又は２個以上の二重結合が含まれていてもよいが、ヘテロ環が芳香環となることはない。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１２アルキル基であり、ｃが１～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、ヘテロ環基中の炭素原子により(O-CO)b-に結合する。）、好ましくは１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物や、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１２アルキル基であり、ｃが１～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい）である化合物が好ましい。なかでも、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが１～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物や、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが１～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物が好ましい。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、より好ましくは、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２が互いに連結して炭素数５～１５のシクロアルカンを構成しており、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２が互いに連結して炭素数５～１５のシクロアルカンを構成しており、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；である。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２が互いに連結して炭素数５～１５のシクロアルカンを構成しており、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２が互いに連結して炭素数５～１５のシクロアルカンを構成しており、ｃが４～７の整数であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；が特に好ましい。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、特に、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～７の整数であり、ＮｃＬ＋ｃの和が８～１２であり、ＮｃＳが１～６であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物が好ましく、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～７の整数であり、ＮｃＬ＋ｃの和が９～１１であり、ＮｃＳが１～３であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物がより好ましく、一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ）のうち、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－８アルキル基であり、ｃが４～６の整数であり、ＮｃＬ＋ｃの和が９～１１であり、ＮｃＳが１～３であり、ｅが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは特に限定されないが、例えば４．０～９．０程度、好ましくは４．５～８．５程度で選択することができ、この範囲のｐＫａを与えるように各置換基の種類を選択することが好ましい。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質は、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は一般式（Ｉ）の範囲に包含される任意の脂質を容易に製造することができる。
　一般式（Ａ）で表される基は、-CO-O-基に２本の炭化水素鎖（Ｒ１１及びＲ１２）が連結した分岐構造を備える基である。すなわち、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質では、２本の分岐鎖型の炭化水素鎖（Ｒ１及びＲ２）を備えており、これらの炭化水素鎖は、脂質ナノ粒子の脂質膜中に埋め込まれる疎水性足場になる。本発明に係る脂質ナノ粒子は、分岐鎖型構造からなる疎水性足場を備える本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質を脂質の構成成分とすることにより、肝臓への選択性が高いという特徴を有する。
［脂質ナノ粒子］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質とする、すなわち、２本の炭化水素鎖（Ｒ１１及びＲ１２）が、-CO-O-基に対してβ位又はこれより遠い炭素原子に連結している構成脂質を有する。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、脾臓に対しても高い選択性を有する。
　本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質が２種類以上である場合、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。
　脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占める本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が多いほど、標的細胞への脂質ナノ粒子の取り込み効率が高くなる。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子においては、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の量の割合（［本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、２０モル％以上であることが好ましい。一方で、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占めるｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が多すぎると、粒子径を十分に小さくすることが困難な場合がある。標的細胞への脂質ナノ粒子の取り込み効率が十分であり、かつ粒子径が十分に小さい脂質ナノ粒子が得られることから、本発明に係る脂質ナノ粒子における脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の量の割合は、３０モル％以上であることがより好ましく、３０～７０モル％がさらに好ましく、４０～６０モル％がよりさらに好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質以外の脂質としては、一般的にリポソームを形成する際に使用される脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えば、リン脂質、ステロール、糖脂質、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、カルジオリピン、プラスマロゲン、セラミドホスフォリルグリセロールホスファート、ホスファチジン酸等のグリセロリン脂質；スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルエタノールアミン等のスフィンゴリン脂質；などを挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いることもできる。グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質における脂肪酸残基は、特に限定されないが、例えば、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、炭素数１４～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。これらのグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が２以上の脂肪酸残基を有する場合、全ての脂肪酸残基が同一の基であってもよく、互いに異なる基であってもよい。
　ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールなどが挙げられる。糖脂質としては、例えば、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；などが挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数１２～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質としては、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質に加えて、中性脂質を含むことが好ましく、リン脂質又はステロールを含むことがより好ましく、ステロールを含むことがさらに好ましく、コレステロールを含むことがよりさらに好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質成分としてポリアルキレングリコール修飾脂質を含有することが好ましい。ポリアルキレングリコールは親水性ポリマーであり、ポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質ナノ粒子を構築することにより、脂質ナノ粒子の表面をポリアルキレングリコールで修飾することができる。ポリアルキレングリコールで表面修飾することにより、脂質ナノ粒子の血中滞留性などの安定性を高めることができる場合がある。
　ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば３００～１０，０００程度、好ましくは５００～１０，０００程度、さらに好ましくは１，０００～５，０００程度である。
　例えば、脂質のポリエチレングリコールによる修飾には、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸ＰＥＧ４５（ＳＴＲ－ＰＥＧ４５）など）を用いることができる。その他、Ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００]－１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００］－１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル-メトキシポリエチレングリコール－７５０］－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル-メトキシポリエチレングリコール－２０００］－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００]－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＭＧ）などのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。
　本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合は、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質による肝臓選択性、具体的には、本発明に係る脂質ナノ粒子を遺伝子キャリアとして用いる場合の肝臓特異的遺伝子発現活性を損なわない量であれば特に限定されるものではない。例えば、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合は、０．５～３モル％とすることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面を親水性ポリマー等で修飾することにより、血中滞留性を高めることができる。これらの修飾基で修飾された脂質を脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子の核内移行を促進するために、例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３～１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３～６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。中でも、好ましくはグルコースの３量体ないし６量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの３量体又は４量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して１～３０モル％程度、好ましくは２～２０モル％程度、より好ましくは５～１０モル％程度である。
　オリゴ糖化合物で脂質ナノ粒子を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質ナノ粒子をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（国際公開第２００７／１０２４８１号）が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本願明細書の開示として含める。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、脂質ナノ粒子の血液中での滞留性を向上させ、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質ナノ粒子を脱出させて、封入された核酸を肝臓細胞内でより効率よく発現させることができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチドなどからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和若しくは不飽和脂肪族アミンなどを挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の大きさは、生体内の肝臓細胞に高い送達効率が得られやすいことから、平均粒子径が４００ｎｍ以下であることが好ましく、平均粒子径が３００ｎｍ以下であることがより好ましく、平均粒子径が２００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１５０ｎｍ以下であることがよりさらに好ましい。なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は０．０１～０．７程度、好ましくは０．０１～０．６程度、さらに好ましくは０．０１～０．３程度である。ゼータ電位は－５０ｍＶ～５ｍＶの範囲、好ましくは－１０ｍＶ～５ｍＶの範囲とすることができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、球状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソームであることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜で覆われた粒子内部に、標的の細胞内に送達する目的の成分を内包していることが好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子が粒子内部に内包する成分としては、内包可能な大きさであれば特に限定されるものではない。本発明に係る脂質ナノ粒子には、核酸、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる成分としては、核酸が好ましい。核酸としては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やホスホロチオエートＤＮＡなど）であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよく、線状であってもよく、環状であってもよい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内で発現させるための外来遺伝子を含むことが好ましく、細胞内に取り込まれることによって外来遺伝子を細胞内で発現させるために機能する核酸であることがより好ましい。当該外来遺伝子は、標的細胞（好ましくは肝臓細胞）のゲノムＤＮＡ中に本来含まれている遺伝子であってもよく、ゲノムＤＮＡ中に含まれていない遺伝子であってもよい。このような核酸としては、発現させる目的の遺伝子をコードする塩基配列からなる核酸を含む遺伝子発現ベクターが挙げられる。当該遺伝子発現ベクターは、導入された細胞内において、染色体外遺伝子として存在するものであってもよく、相同組換えによりゲノムＤＮＡ中に取り込まれるものであってもよい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されるものではなく、一般的に遺伝子治療等で使用されるベクターを用いることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる遺伝子発現ベクターとしては、プラスミドベクター等の核酸ベクターであることが好ましい。プラスミドベクターは、環状のままであってもよく、予め線状に切断した状態で本発明に係る脂質ナノ粒子に封入させてもよい。遺伝子発現ベクターは、発現させる対象の遺伝子の塩基配列情報に基づいて、一般的に使用される分子生物学的ツールを利用して常法により設計でき、公知の各種の方法で製造することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内に存在する標的遺伝子の発現を制御する機能性核酸であることも好ましい。当該機能性核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるｓｉＲＮＡ発現ベクターとなるプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であってもよい。ｓｉＲＮＡ発現ベクターとしては、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターから調製することができ、また、これを適宜改変してもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸としては、特に肝臓への選択性が良好であることから、ｍＲＮＡ又はｐＤＮＡであることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、当該脂質ナノ粒子に封入させる成分、例えば核酸等を含む水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
　水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質ナノ粒子を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質ナノ粒子を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０～８．０程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、流路を用いたアルコール希釈法により製造することもできる。当該方法は、アルコール溶媒に脂質成分を溶解させた溶液と、水系溶媒に脂質ナノ粒子に包含させる水溶性成分を溶解させた溶液とを、別々の流路から導入し、これを合流させることによって脂質ナノ粒子を製造する方法である。２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることにより、直径３０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を再現良く製造可能である（非特許文献９）。製造に使用する流路としては、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることから、特許文献２に記載されているような、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることが好ましい。アルコール希釈法において用いられる水系溶媒としては、前記のものを用いることができる。
　得られた脂質ナノ粒子の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３－ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。
　遺伝子発現ベクターを封入した本発明に係る脂質ナノ粒子を動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入された遺伝子発現ベクターは、他の臓器よりも肝臓や脾臓において選択的に発現する。例えば、肝臓細胞内又は脾臓細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した本発明に係る脂質ナノ粒子を、被験動物へ投与すると、当該被験動物の肝臓内又は脾臓内で当該外来遺伝子を発現させることができる。同様に、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを封入した本発明に係る脂質ナノ粒子を動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入されたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、他の臓器よりも肝臓や脾臓において選択的に発現し、当該発現ベクターが標的とする遺伝子の発現が抑制される。
　この肝臓又は脾臓に対する高選択的な遺伝子発現活性により、本発明に係る脂質ナノ粒子は、肝臓又は脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして機能する。本発明に係る脂質ナノ粒子に、肝臓細胞内又は脾臓細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した上で、被験動物へ投与することにより、当該被験動物の肝臓内又は脾臓内で当該外来遺伝子が発現する。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、遺伝子治療に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用であり、特に、肝臓又は脾臓を標的臓器とする遺伝子治療に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用である。
　本発明に係る脂質ナノ粒子が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。また、本発明に係る脂質ナノ粒子を動物に投与する際の投与経路は、特に限定されるものではないが、経静脈投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等の非経口投与であることが好ましい。
［ゲノム編集用遺伝子キャリア］
　本発明に係る脂質ナノ粒子に、ゲノム編集に必要な核酸等を内包させることにより、ゲノム編集を利用した遺伝子治療のための遺伝子キャリアとすることもできる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集には、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との複合体であるＲＮＰを使用する。標的細胞内でＲＮＰを発現させる、又はＲＮＰそのものを標的細胞内に送達することによって、目的とする遺伝子ノックアウトを誘導することが可能である。さらに、ドナーＤＮＡを同時に送達することにより、遺伝子ノックインを誘導することも可能となる。そこで、本発明に係る脂質ナノ粒子に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとからなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質とからなるＲＮＰを内包させることにより、肝臓細胞や脾臓細胞を標的細胞としたゲノム編集のための遺伝子キャリアとすることができる。ＲＮＰ自体を直接脂質ナノ粒子に搭載して標的細胞に導入するため、Ｃａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞内に導入して発現させる方法よりも、オフターゲット作用が小さい。
　本発明及び本願明細書において、脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合し、ｇＲＮＡの一部と対合して形成された二本鎖ＤＮＡを認識して切断する酵素である。当該ＤＮＡヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等が挙げられる。
　本発明及び本願明細書において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合し、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質である。ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を備えるＣａｓ９タンパク質は、ゲノムＤＮＡの二本鎖を切断する。ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれか一方のみを備えるＣａｓ９タンパク質は、ゲノムＤＮＡの二本鎖のうちのいずれか一方の鎖のみを切断する。
　本発明において用いられるＣａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来する野生型のＣａｓ９タンパク質であってもよく、野生型タンパク質を改変した変異型タンパク質であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌としては、例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）等が挙げられる。また、野生型のＣａｓ９タンパク質を改変した変異型タンパク質としては、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかを失活させるような変異が導入された変異体が挙げられる。当該変異体としては、例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１０番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された変異体（Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ））が挙げられる。Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）は、ＤＮＡニッカーゼとして機能するため、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）とも呼ばれる。その他、野生型のＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に影響を与えない変異が導入された変異型タンパク質であってもよい。
　本発明において用いられるＣａｓ９タンパク質は、野生型のＣａｓ９タンパク質又はその変異型タンパク質に、各種ペプチドを付加したものであってもよく、他のタンパク質と融合させたキメラタンパク質であってもよい。当該ペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のタグペプチド、核移行シグナルペプチド等のシグナルペプチド等が挙げられる。野生型又は変異型のＣａｓ９タンパク質と融合させる他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ、蛍光タンパク質等が挙げられる。
　本発明及び本願明細書において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合し、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性のみを有するタンパク質である。ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を備えるＣａｓ９タンパク質が、ゲノムＤＮＡの二本鎖を切断して平滑末端を形成するのに対して、Ｃｐｆ１タンパク質は、５’突出末端を形成する。
　本発明において用いられるＣｐｆ１タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを有する細菌に由来する野生型のＣｐｆ１タンパク質であってもよく、野生型タンパク質を改変した変異型タンパク質であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを有する細菌としては、例えば、アシダミノコッカス属菌（Acidaminococcus sp.）、ラクノスピラ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）等が挙げられる。また、野生型のＣｐｆ１タンパク質を改変した変異型タンパク質としては、ヌクレアーゼ活性を増大させるような変異が導入された変異体や、ヌクレアーゼ活性に影響を与えない変異が導入された変異型タンパク質が挙げられる。
　本発明において用いられるＣｐｆ１タンパク質は、野生型のＣｐｆ１タンパク質又はその変異型タンパク質に、各種ペプチドを付加したものであってもよく、他のタンパク質と融合させたキメラタンパク質であってもよい。当該ペプチドや他のタンパク質としては、Ｃａｓ９タンパク質で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
　本発明及び本願明細書において、ｇＲＮＡは、ＤＮＡヌクレーゼによって切断させるゲノムＤＮＡ上の標的配列（ゲノム編集する対象の塩基配列）に対合可能な塩基配列を有するＲＮＡである。「標的配列に対合可能な塩基配列」とは、標的配列以外の領域の認識を抑制するため、通常は、標的配列と相同的（同一）又は相補的な塩基配列である。ｇＲＮＡは、１本のＲＮＡからなるものであってもよく、２本以上のＲＮＡが複合体を形成しているものであってもよい。
　脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質の場合、ｇＲＮＡとしては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを用いることができる。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来し、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる領域（ｔｒａｃｒＲＮＡとの結合領域）と、ゲノムＤＮＡ上の標的配列と相同的又は相補的な塩基配列からなる領域（ゲノムＤＮＡ結合領域）とを含む１本鎖ＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、同じくＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来し、ｃｒＲＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる領域（ｃｒＲＮＡとの結合領域）を有しており、当該領域においてｃｒＲＮＡとハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する１本鎖ＲＮＡである。当該ヘアピン構造をＣａｓ９タンパク質が認識し、ＲＮＰが形成される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、それぞれ独立した１本鎖ＲＮＡであってもよく、両者が適当なＲＮＡリンカーを介して連結された１本鎖ＲＮＡであってもよい。なお、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌としては、前記の通りのものが挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、いずれも同種の細菌由来であってもよく、互いに異種の細菌由来であってもよい。また、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの機能を損なわない限り、天然のＲＮＡのみからなるものであってもよく、その一部又は全部に修飾ＲＮＡや人工核酸が含まれていてもよい。
　脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣｐｆ１タンパク質の場合、ｇＲＮＡとしては、ｃｒＲＮＡと同様に標的配列を含むＲＮＡであればよく、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。このため、ｇＲＮＡを、Ｃａｓ９タンパク質を用いる場合よりもより短いものとすることができる。また、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの機能を損なわない限り、天然のＲＮＡのみからなるものであってもよく、その一部又は全部に修飾ＲＮＡや人工核酸が含まれていてもよい。
　標的配列は、通常、ＰＡＭ配列がその直後にくる領域の塩基配列を選択する。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼに認識される配列であり、用いられるＣａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼに依存して決定される。例えば、Ｃａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列としては、５'－ＮＧＧ（Ｎ：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）が挙げられ、Ｃｐｆ１タンパク質が認識するＰＡＭ配列としては、５'－ＴＴＴＶ（Ｖ：Ａ、Ｇ、Ｃ）、５'－ＴＴＴＮ（Ｎ：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）が挙げられる。ｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡ中の標的配列の塩基長は、特に限定されるものではなく、例えば、１５～３０塩基長程度にすることができ、１８～２２塩基長が好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集のための遺伝子キャリアとして用いる場合、よりゲノム編集効率を向上させるために、本発明に係る脂質ナノ粒子には、さらに、ＤＮＡヌクレアーゼと、ｇＲＮＡと、当該ｇＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＮ）と、を含有させることが好ましい。ｓｓＯＮ中のｇＲＮＡと対合可能な領域を「ｇＲＮＡ対合領域」といい、ｇＲＮＡ中のｓｓＯＮの一部と対合する領域を「ｓｓＯＮ対合領域」という。ｇＲＮＡ対合領域とｓｓＯＮ対合領域が対合することにより、ＤＮＡヌクレアーゼとｇＲＮＡとｓｓＯＮの複合体であるＲＮＰが形成される。
　ｓｓＯＮは、ＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むキメラオリゴヌクレオチドであってもよい。また、ｓｓＯＮは、使用されるＣＲＩＳＰＲシステムの機能を損なわない限り、天然のＲＮＡやＤＮＡのみからなるものであってもよく、その一部又は全部に修飾核酸や人工核酸が含まれていてもよい。
　Ｃａｓ９タンパク質やＣｐｆ１タンパク質は、核酸とは異なり正電荷を帯びているため、脂質膜を構成する脂質成分にｐＨ感受性カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子への搭載効率が低い。これに対して、Ｃａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼと複合体化する核酸が、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡだけではなく、ｓｓＯＮも含まれると、ＲＮＰに含まれている核酸量が多いため、ＲＮＰの正電荷が抑えられて負電荷が強くなり、ｐＨ感受性カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子へ効率よく搭載することができる。
　本発明において用いられるｓｓＯＮの塩基長は、ＲＮＰを負に帯電させるために十分な長さであればよく、ｇＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの塩基長や、Ｃａｓ９タンパク質等の種類等を考慮して適宜決定することができる。ｓｓＯＮの長さは、例えば、５０～５００塩基長程度とすることができる。
　脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質の場合、ｃｒＲＮＡのうち、ｔｒａｃｒＲＮＡとの結合領域以外の部分領域と、相補的な塩基配列からなる領域を含む。このｃｒＲＮＡと相補的な領域（ｃｒＲＮＡとの結合領域）を介して、ｓｓＯＮとｃｒＲＮＡはハイブリダイズする。つまり、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡとｓｓＯＮが互いにハイブリダイズし、形成された３者複合体とＣａｓ９タンパク質が複合体化したものである。ｃｒＲＮＡ中のｓｓＯＮとハイブリダイズする領域（ｓｓＯＮとの結合領域）は、ｃｒＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡとｓｓＯＮと同時にハイブリダイズして３者複合体を形成でき、かつこの３者複合体がＣａｓ９タンパク質が認識するヘアピン構造を形成できるのであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃｒＲＮＡ中のｓｓＯＮとの結合領域は、ゲノムＤＮＡ結合領域の一部又は全部を含んでいてもよく、ゲノムＤＮＡ結合領域と同一であってもよい。また、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の一方を不活化したＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）を使用するダブルニッキング法の場合、ガイドＲＮＡは２種類用いられる。そこで、脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９ｎであり、ダブルニッキング法のためのＲＮＰを搭載した脂質ナノ粒子の場合、ｓｓＯＮは、それぞれのガイドＲＮＡにハイブリダイズする２種類を使用する。
　ＣＲＩＳＰＲシステムにより、切断されたゲノムＤＮＡに目的の遺伝子断片をノックインする場合、ｓｓＯＮは、このノックインされるドナーＤＮＡとして利用することもできる。例えば、ｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡとの結合領域以外に、ノックインされる遺伝子断片の両末端に相同組換えのための４０～６０ｂｐの相同配列領域（homology arms）が付加された領域を備えたｓｓＯＮは、ドナーＤＮＡとして機能する。
　ゲノムＤＮＡ上の標的配列の決定、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡの塩基配列の設計、ｓｓＯＮの塩基配列の設計等は、ゲノムＤＮＡの塩基配列情報に基づき、一般的に使用される分子生物学的ツールを利用して常法により行うことができる。例えば、ｇＲＮＡの設計は、CRISPR Design Tool（Horizon Discovery）、TrueDesign Genome Editor（Invitrogen）等の設計ツールを用いて行うことができる。
　なお、前記のＤＮＡヌクレアーゼとｇＲＮＡとｓｓＯＮの複合体であるＲＮＰを封入する脂質ナノ粒子は、本願発明に係る脂質ナノ粒子以外であってもよい。例えば、特許文献１や特許文献２に開示されている脂質ナノ粒子に封入することによっても、ゲノム編集に適した遺伝子キャリアとして使用できる。
　本発明において用いられるｓｓＯＮ中のｇＲＮＡ対合領域は、ｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域と、完全に相補的な塩基配列（完全マッチ配列）であってもよいが、一部に非相補的な塩基（ミスマッチ塩基）を有する塩基配列であるほうが好ましい。ｇＲＮＡ対合領域がｓｓＯＮ対合領域と完全マッチ配列である場合、ＤＮＡヌクレアーゼとｇＲＮＡとｓｓＯＮの複合体であるＲＮＰの安定性に優れており、当該ＲＮＰを内包する脂質ナノ粒子を安定して製造することができるが、当該脂質ナノ粒子が細胞内に取り込まれた際に細胞内でＲＮＰが乖離し難い場合がある。ｇＲＮＡ対合領域がｓｓＯＮ対合領域に対して適度なミスマッチ塩基を有する場合には、ＲＮＰの製造時の安定性と細胞内における乖離しやすさのバランスが良好であり、製造安定性とゲノム編集効率の両方に優れた遺伝子キャリアとすることができる。
　ｓｓＯＮ中のｇＲＮＡ対合領域としては、３０～６０％の塩基がｓｓＯＮ対合領域中の対応する塩基と相補的であることが好ましく、３５～５５％の塩基がｓｓＯＮ対合領域中の対応する塩基と相補的であることがより好ましい。また、ｓｓＯＮ中のｇＲＮＡ対合領域と、ｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域とのＴｍ値が、２５～４０℃であることが好ましく、２５～３５℃であることがより好ましく、２５～３０℃であることがさらに好ましい。なお、Ｔｍ値は、例えば、１８塩基未満の場合には、Ｗａｌｌａｃｅ法で、１８塩基以上の場合には最近接塩基対法により求めることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集のための遺伝子キャリアとして、前記のＤＮＡヌクレアーゼと、ｇＲＮＡと、当該ｇＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＮ）とを含有させる脂質ナノ粒子としては、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質に代えて、若しくはこれに加えて、下記一般式（ＩＩ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質（以下、「ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）」ということがある。）及び／又は下記一般式（ＩＩＩ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質（以下、「ｐＨ感受性カチオン性脂質（III）」ということがある。）を構成脂質とする脂質ナノ粒子を用いることも好ましい。これらのｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子を遺伝子キャリアとして用いる場合も、ｓｓＯＮとしては、ｇＲＮＡ対合領域の３０～６０％の塩基がｓｓＯＮ対合領域中の対応する塩基と相補的であることが好ましく、３５～５５％の塩基がｓｓＯＮ対合領域中の対応する塩基と相補的であることがより好ましい。また、ｓｓＯＮ中のｇＲＮＡ対合領域と、ｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域とのＴｍ値が、２５～４０℃であることが好ましく、２５～３５℃であることがより好ましく、２５～３０℃であることがさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　一般式（ＩＩ）において、ａは３～５の整数を示すが、好ましくは４である。
　ｂは０又は１を示す。ｂが０の場合にはーＯ－ＣＯ－基が存在せず、単結合であることを意味する。
　一般式（ＩＩ）において、Ｒ２１及びＲ２２はそれぞれ独立に下記一般式（Ａ’）で表される基を示す。一般式（Ａ’）において、ｑは１～９の整数を示し；ｒは０又は１を示し；ｓは１～３の整数を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１～８の整数を示し；ｆは０又は１を示し；ｖは４～１２の整数を示す。ただし、ｂとｆが同時に０となる場合には、ｑが３～５の整数であり、ｒ及びｔが１であり、ｓが１であり、かつｕ＋ｖが６～１０の整数である場合を除く。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）としては、脂質ナノ粒子の安定性の点から、Ｒ２１及びＲ２２の炭化水素鎖が比較的長鎖であることが好ましい。具体的には、ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）では、Ｒ２１及びＲ２２は、炭素数２０以上の基であること、すなわち、一般式（Ａ’）において、ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｆ＋ｖは１９以上の整数であることが好ましい。なかでも、ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）としては、ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｆ＋ｖが１９～３３の整数であることが好ましく、１９～３１の整数であることがより好ましく、２１～３１の整数であることがさらに好ましく、２１～２７の整数であることがよりさらに好ましい。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）のＲ２１及びＲ２２としては、一般式（Ａ’）において、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基；ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基；ｒ及びｔが０であり、ｑ＋ｓ＋ｕが１３～２３の整数、好ましくは１５～２１であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１８以上の整数である基；ｒ及びｔが０であり、ｑ＋ｓ＋ｕが１３～２３の整数、好ましくは１５～２１であり、ｆが１であり、ｖが６～１０の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１８以上の整数である基；が好ましい。 
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）では、Ｒ２１及びＲ２２は、一般式（Ａ’）で表される基であればよく、互いに異なる基であってもよいが、同じ基であるほうが好ましい。
　一般式（ＩＩ）において、Ｘは、前記一般式（Ｉ）におけるＸと同じである。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）としては、一般式（ＩＩ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、ヘテロ環基中の炭素原子により(O-CO)b-に結合する。）、好ましくは１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）であり、Ｒ２１及びＲ２２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ’）のうち、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；一般式（ＩＩ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、ヘテロ環基中の炭素原子により(O-CO)b-に結合する。）、好ましくは１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）であり、Ｒ２１及びＲ２２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ’）のうち、ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；一般式（ＩＩ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）において、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい）であり、Ｒ２１及びＲ２２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ’）のうち、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；一般式（ＩＩ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）において、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい）であり、Ｒ２１及びＲ２２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ’）のうち、ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｆが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；が好ましい。これらの脂質のうち、Ｒ２１及びＲ２２が同一の基である脂質が、一般式（ＩＩ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としてより好ましく、Ｒ２１及びＲ２２が同一の基であり、かつａが４である脂質が特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　一般式（ＩＩＩ）において、ａは３～５の整数を示すが、好ましくは４である。
　ｂは０又は１を示す。ｂが０の場合には－Ｏ－ＣＯ－基が存在せず、単結合であることを意味する。
　一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ３１及びＲ３２はそれぞれ独立に下記一般式（Ａ”）で表される基を示す。一般式（Ａ”）において、Ｒ３３及びＲ３４はそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ５－１５アルキル基（炭素数５～１５のアルキル基）を示し；ｇは０又は１を示し；ｈは４～１２の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　直鎖状又は分岐鎖状のＣ５－１５アルキル基としては、Ｒ１１で列挙されたものと同様の基を用いることができる。
　一般式（Ａ”）において、Ｒ３３及びＲ３４は、それぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ５－１２アルキル基（炭素数５～１２のアルキル基）であることが好ましく、直鎖状又は分岐鎖状のＣ５－１０アルキル基（炭素数５～１０のアルキル基）であることよりが好ましく、直鎖状又は分岐鎖状のＣ６－９アルキル基（炭素数６～９のアルキル基）であることがさらに好ましい。また、ｐＨ感受性カチオン性脂質（III）では、Ｒ３１及びＲ３２は、一般式（Ａ”）で表される基であればよく、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい。
　一般式（ＩＩＩ）において、Ｘは、前記一般式（Ｉ）におけるＸと同じである。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（III）としては、より好ましくは、一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して直鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して分岐鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して直鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して分岐鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；である。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（III）としては、一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して直鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して分岐鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）である化合物；一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して直鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２が同じ基であり、かつ一般式（Ａ”）のうち、Ｒ３３及びＲ３４がそれぞれ独立して分岐鎖状のＣ６－９アルキル基であり、ｇが１であり、ｈが６～１０の整数である基であり、かつ、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）のうち、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基である化合物；が特に好ましい。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）及びｐＨ感受性カチオン性脂質（III）のｐＫａは、特に限定されないが、例えば４．０～９．０程度、好ましくは４．５～８．５程度、より好ましくは６～８程度で選択することができ、この範囲のｐＫａを与えるように各置換基の種類を選択することが好ましい。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質（II）及びｐＨ感受性カチオン性脂質（III）は、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は一般式（ＩＩ）又は一般式（ＩＩＩ）の範囲に包含される任意の脂質を容易に製造することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜ＮＭＲ＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ社のＥＣＡ５００装置又はＥＣＳ４００装置を用いて、テトラメチルシランを内部標準（０ｐｐｍ）として取得した。ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレットの略語である。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの化学シフトは、σスケールで、テトラメチルシランからダウンフィールドで、ｐｐｍで報告された。
＜薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、全ての反応の反応物は、プレコートされたＴＬＣプレート（Millipore社製）を用いたＴＬＣによってモニターされた。ＴＬＣの可視化は、ＵＶ光（２５４ｎｍ）、リンモリブデン酸染色、又はｐ－アニスアルデヒド染色によって行った。反応産物は、自動化されたcombiflash（登録商標） Rf クロマトグラフィーシステム（Teledyne ISCO社製）又はSelektシステム（Biotage社製）によって精製された。
＜脂質ナノ粒子の構成脂質＞
　コレステロールは、SIGMA Aldrich社製を、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びポリエチレングリコール２０００修飾２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ、ポリエチレングリコール２０００修飾ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）は、日油社製を用いた。ＳＭ－１０２（以下、「ＳＭ」と略すことがある）はCayman Chemical社製（カタログ番号：P/N 33474）を、ＡＬＣ－０３１５（以下、「ＡＬＣ」と略すことがある）はAmbeed社製（カタログ番号：P/N A1375212）を、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）はMedChemExpres社製（カタログ番号：P/N HY-112251）を、それぞれ用いた。
＜ｍＲＮＡ＞
　脂質ナノ粒子に内包させる核酸のうち、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡ（CleanCap FLuc mRNA、5moU）は、TriLink Biotechnologies社製を用いた。
＜ＲＮＰ複合体の調製＞
　組換えｓｐＣａｓ９ヌクレアーゼ（TrueCut Cas9 Protein v2）は、Thermo Fisher Scientific社製を、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及び一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、Integrated DNA Technologies社製を、それぞれ用いた。ｓｇＲＮＡとしては、ＴＴＲ遺伝子を標的とした２種類のｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２６９）を用いた。ｓｇＲＮＡの塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１に対合するｓｓＯＤＮとしては、ｓｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域と３０％～１００％マッチ配列である表２に記載の７種類（ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－１００％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－８０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－６０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－５０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－４０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－３０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－０％）を用いた。ｓｇＴＴＲ－Ｇ２６９に対合するｓｓＯＤＮとしても、ｓｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域と３０％～１００％マッチ配列である表２に記載の４種類（ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_４－６０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_４－５０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_４－４０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_４－３０％）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１に対合するｓｓＯＤＮとしては、ｓｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域とのミスマッチ配列が５’側又は３’側のいずれかに存在している表３に記載の６種類（ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－１０℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－１０℃－５’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－２４℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－２４℃－５’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－５０℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－５０℃－５’）も用いた。
　ＲＮＰ複合体中におけるｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮとのＴｍ値を蛍光消光法を用いて測定する際には、５’末端を蛍光物質ＦＡＭで修飾したｓｇＲＮＡと、３’末端を消光物質ＩＢＦＱ（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ）で修飾したｓｓＯＤＮを用いた。ＦＡＭ修飾ｓｇＲＮＡとしては、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１の５’末端にＦＡＭを連結したＲＮＡ（ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１－５ＦＡＭ）を用いた。ＩＢＦＱ修飾ｓｓＯＤＮとしては、ｓｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域と８０％マッチ配列（ｓｓＯＤＮ－８０％）の３’末端にＩＢＦＱを結合させたＩＢＦＱ修飾ＲＮＡ（ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱ）、ｓｓＯＮ対合領域と４０％マッチ配列（ｓｓＯＤＮ－４０％）の３’末端にＩＢＦＱを結合させたＩＢＦＱ修飾ＲＮＡ（ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱ）、又はｓｓＯＮ対合領域と０％マッチ配列（ｓｓＯＤＮ－０％）であるＲＮＡの３’末端にＩＢＦＱを結合させたＩＢＦＱ修飾ＲＮＡ（ｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
＜脂質ナノ粒子の調製＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、脂質ナノ粒子は、流路を用いたアルコール希釈法により調製した。流路としては、ミキサー内蔵マイクロ流体デバイス「ｉＬｉＮＰ」（ライラックファーマ社製）を用いた。当該デバイスの流量は、シリンジポンプ（ハーバード装置）を使用して制御した。
　具体的には、核酸のみを含有する脂質ナノ粒子の調製は、以下のようにして行った。まず、各脂質成分を所定のモル比で含有する脂質濃度８ｍＭに調整したエタノール溶液と、核酸濃度４８．９ｎｇ／ｍＬに調整した酢酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０）とを、それぞれ０．１２５ｍＬ／分及び０．３７５ｍＬ／分（合計流量０．５ｍＬ／分）でマイクロ流路内に送液し、流路から排出された脂質ナノ粒子溶液を回収した。当該脂質ナノ粒子溶液を、透析膜（MWCO 12,000-14,000）に入れ、外水相をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）として、４℃、２時間以上透析した後、透析膜から脂質ナノ粒子溶液を回収した。
　ＲＮＰを含有する脂質ナノ粒子の調製は、以下のようにして行った。まず、Ｃａｓタンパク質溶液（１０μＭ）を激しく混合しながら、等量のｓｇＲＮＡ溶液（１０μＭ）に滴下し、ＲＮＰ溶液（５μＭ）を調製した。当該ＲＮＰ溶液を等量のｓｓＯＤＮ溶液（５μＭ）と混合して、ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体（２．５μＭ）を得た。
　次いで、各脂質成分を所定のモル比で含有する脂質濃度８ｍＭに調整したエタノール溶液と、ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を２０ｍＭ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１６０ｎＭに希釈したＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ溶液とを、それぞれ０．０５０ｍＬ／分及び０．４５０ｍＬ／分（合計流量０．５ｍＬ／分）でマイクロ流路内に送液し、流路から排出された脂質ナノ粒子溶液を回収した。当該脂質ナノ粒子溶液を、透析膜（MWCO 12,000-14,000）に入れ、外水相をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）として、４℃、２時間以上透析した後、透析膜から脂質ナノ粒子溶液を回収した。回収された脂質ナノ粒子溶液は、遠心式フィルターユニット（「Amicon Ultra-15」、MWCO 100 kDa、Millipore社製）を使用した限外濾過により濃縮した。
　蛍光標識したＲＮＰ含有脂質ナノ粒子を調製する場合には、前記の脂質濃度８ｍＭに調整したエタノール溶液に、適量の蛍光分子、例えば近赤外蛍光シアニン色素であるＤｉＲの場合には０．５ｍｏｌ％となるように含有させて調製した。
＜脂質ナノ粒子の平均粒子径とゼータ電位の測定＞
　脂質ナノ粒子のＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）中における平均粒子径（個数平均値）、ζ平均粒子径、及び多分散度指数（ＰｄＩ）、並びに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中におけるゼータ電位を、動的光散乱法を利用した分析装置「Zetasizer Nano ZS ZEN3600」（Malvern社製）を用いて測定した。
＜脂質ナノ粒子のｐＫａの測定＞
　脂質ナノ粒子のｐＫａは、p-Toluenesulfonic acid（ＴＮＳ）を用いて測定した。まず、ＴＮＳ（終濃度：０．７５μＭ）と脂質ナノ粒子（終濃度：３０μＭ）を各ｐＨ（ｐＨ３．５～９．５）に調整した緩衝液（２００ｍＬ）中で混合した。緩衝液としては、２０ｍＭ クエン酸緩衝液、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、又は１３０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いた。調製された混合液の蛍光強度を、分光蛍光光度計（VarioskanLux、Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、λex＝３２１ｎｍ、λem＝４４７ｎｍの設定で測定した。測定値のうち、最も高い値及び低い値をそれぞれ１００％及び０％荷電率とし、５０％荷電率を示すｐＨを見かけのｐＫａとして算出した。カチオン性に帯電したｐＨ感受性カチオン性脂質の含有比率（％）は、ヘンダーソン・ハッセルバルチの式を使用して算出した。
＜脂質ナノ粒子の封入率（カプセル化効率）＞
　脂質ナノ粒子の封入率は、ＲＮＡインターカレーターであるRibogreen（life technologies社製）を用いて封入されている核酸の量（ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮの場合にはｓｓＯＤＮの量）を測定して求めた。
＜脂質ナノ粒子の代謝評価（肝臓中の脂質量の測定）＞
　脂質の定量化のための液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ/ＭＳ）には、分析前に－８０℃で保存された肝臓サンプルを用いた。マウスに、脂質ナノ粒子（０．５ｍｇ　ＲＮＡ／ｋｇ体重）を静脈内注射した後、肝臓組織を回収した。
　組織を２００μＬの水でホモジナイズし、得られた組織ホモジネート（５０μＬ）を４００μＬのアセトニトリル／イソプロパノール（５０：５０（ｖ/ｖ））で抽出した。抽出物を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間）した後、上清を濾過し、濾液を水／アセトニトリル／イソプロパノール（１：８：８（ｖ/ｖ））で５０倍に希釈し、Accucoreを使用したＬＣ/ＭＳ分析用のバイアルに移し、下記の条件でＬＣ/ＭＳを行った。親脂質と予想される代謝物を検出するための最適化された条件下で検出された。各脂質分子は、［Ｍ＋Ｈ］＋→９１６（ＣＬ４Ｈ６）、８６４（ＣＬ４Ｆ６）、９８２（ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７）、７５２（ＣＬ４Ｆ１０－ｅ－２）の質量を使用して、モニターした。
（ＬＣ/ＭＳ分析条件）
ＬＣ/ＭＳ装置：LTQ-Orbitrap XL（Thermo Scientific社製）
カラム：ＲＰ－ＭＳ ＬＣカラム（２．６μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、Thermo Scientific社製）
温度：４０℃
移動相：溶媒Ａ（１０ｍＭ ギ酸アンモニウムと０．１％ ギ酸を含むアセトニトリル／水（６０：４０（ｖ/ｖ）））と溶媒Ｂ（１０ｍＭ ギ酸アンモニウムと０．１％ ギ酸を含むイソプロパノール／アセトニトリル（９０：１０（ｖ/ｖ）））を用いたグラジエント。
グラジエント条件（溶媒Ｂ濃度）：０分（５０％）→２分（９０％）→４分（９０％）→４．５分（５０％）→８分（５０％）
モード：正イオンモード
注入量：１μＬ
流量：１５０μＬ／分
＜Ｆｌｕｃ活性の測定＞
　まず、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、０．０１ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ体重の用量でＦｌｕｃｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を静脈注射した。静脈注射から６時間後に、マウスを安楽死させ、各組織を回収し、液体窒素で凍結させて、－８０℃で保存した。ビーズ式細胞破砕装置（Micro Smash MS-100R、TOMY Seiko社製）を使用して、パッシブ溶解バッファー（Promega社製）で組織をホモジナイズした。組織破片は、遠心分離によって除去し、上清を回収した。当該上清中のＦｌｕｃ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（E1500、Promega社製）を製造元のプロトコルに従って使用して測定した。発光は、ルミノメーター（Luminescencer-PSN、ATTO社製）を使用して測定した。タンパク質濃度は、市販の測定キット（BCA Protein Assay Kit、Pierce社製）を使用して決定した。Ｆｌｕｃ活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの相対光単位（ＲＬＵ）として表した。
＜ＴＴＲ－ＫＯ活性の測定＞
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、Ｃａｓ９／ｓｇＴＴＲ－ＲＮＰを封入した脂質ナノ粒子（Ｃａｓ９／ｓｇＴＴＲ－ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子）を、指定の用量で静脈注射した。 静脈注射の１週間後、マウスを安楽死させ、採血し、遠心分離により血清を単離した。当該血清中のＴＴＲタンパク質濃度は、市販のＥＬＩＳＡキット（Prealbumin ELISA Kit（マウス）、Aviva Systems Biology社製）を使用して、製造元のプロトコルに従って決定した。未処理マウスの血清ＴＴＲタンパク質濃度を１００％とした、各脂質ナノ粒子を投与したマウスの血清ＴＴＲタンパク質濃度の相対値（％）を、当該脂質ナノ粒子のノックアウト活性（ＴＴＲ－ＫＯ活性）とした。
＜ｉｎ　ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ切断活性の測定＞
　ＢＡＬＢ／ｃマウス肝臓組織から、市販の核酸抽出キット（NucleoSpin Tissue、MACHEREY-NAGEL社製）を用いて、製造元のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを回収し精製した。
　ＴＴＲ遺伝子座からのｄｓＤＮＡは、当該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ（KAPA HiFi HotStart DNAポリメラーゼ（KAPA Biosystems社製）を使用）によって増幅し、市販の核酸精製キット（ISOSPIN PCR Product、Nippon Gene社製）を使用して精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　ｓｓＯＤＮ（脂質ナノ粒子に対して５当量）をＣａｓ９／ｓｇＴＴＲ－ＲＮＰに添加して、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を形成した。ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体と精製ＰＣＲ産物（ＲＮＰに対して０．２当量）を反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍ ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９）で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、当該反応液を、６５℃で５分間加熱してＣａｓ９－ＲＮＰを不活化した後、ｄｓＤＮＡを３％ アガロースゲルで１００Ｖ、４０分間泳動した。泳動後のゲルを染色（GelRed、Biotium社製）し、蛍光・可視光ゲル撮影システム（Printgraph CMOS I、ATTO社製）で可視化した。バンドは、画像解析ソフトウェア（ImageJ）を使用して定量化した。
　ＤＮＡ切断は、次の式を使用して計算した。式中、Ｉｎｔ_ｆｕｌｌ及びＩｎｔ_ｃｌｅａｖｅｄは、それぞれ、全長（未切断）及び切断されたＤＮＡに由来する強度を示す。
［ＤＮＡ切断］＝［Intcleaved］／［Intfull］
＜蛍光消光法によるｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮとのＴｍ値の測定＞
　ＲＮＰ複合体中におけるｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮとのＴｍ値を蛍光消光法を用いて測定する場合、蛍光物質ＦＡＭで５’末端が修飾されたＦＡＭ修飾ｓｇＲＮＡと、消光物質ＩＢＦＱで３’末端が修飾された２０塩基長のＩＢＦＱ修飾ｓｓＯＤＮを用いた。
　具体的には、ＩＢＦＱ修飾ｓｓＯＤＮ（ＲＮＰに対して５等量）を、ＦＡＭ修飾ｓｇＲＮＡ（最終ＲＮＰ濃度:２．５μＭ）を含むＣａｓ９ ＲＮＰに添加して、ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を形成した。得られた溶液（１０μＬ）を１０℃でインキュベートし、その後、温度を１０秒間隔で１℃ずつ上昇させた。サーマルサイクラー（「Dice（登録商標） Real Time System III」、TaKaRa Bio社製）を使用して、１１～７０℃の各温度で蛍光強度を測定した。蛍光強度が最大になった温度を、測定Ｔｍ値（℃）とした。
＜Ｔ７Ｅ１アッセイ＞
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を封入した脂質ナノ粒子（ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子）を、２ｍｇ ＲＮＰ／ｋｇ体重で２日間連続して静脈注射した。最後の注射から１週間後、マウスを安楽死させ、肝臓組織を回収し、液体窒素で急速凍結し、－８０℃で保存した。
　回収した肝臓組織から、市販の核酸抽出キット（NucleoSpin Tissue、MACHEREY-NAGEL社製）を用いて、製造元のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを回収し精製した。
　Ｔ７Ｅ１アッセイは、市販のゲノム編集検出キット（Alt-R（登録商標）、Integrated DNA Technologies社製）を使用して実行した。Ｔ７Ｅ１で処理したｄｓＤＮＡは、前記＜ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ切断活性の測定＞と同様にして、アガロースゲルで電気泳動し、泳動後のゲルを染色してバンドを定量化した。
＜生体内分布の評価＞
　脂質ナノ粒子の蛍光標識のために、前記ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ溶液を、ＤＭＳＯ中の３倍モル量の蛍光分子（DyLight 650 NHSエステル）と混合して、暗所で周囲温度で３０分間インキュベートした。未反応の蛍光分子は、限外濾過（Amicon Ultra-0.5、MWCO 3 kDa、Millipore社製）によって除去した。
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、得られた蛍光標識ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮを封入した脂質ナノ粒子（蛍光標識ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子）を、２ｍｇ ＲＮＰ／ｋｇ体重で静脈注射した。静脈注射から１時間後、マウスを安楽死させ、血液を含む各種組織を採取した。採取した血液は直ちに、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液で希釈した。回収した組織は、直ちに秤量した後、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液中でホモジナイズした。得られたホモジネートを、黒色の９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（VarioskanLux、Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、λex＝６５２ｎｍ、λem＝６７２ｎｍの設定で蛍光を測定した。検量線は、蛍光標識ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子と、未処理のマウスから同様にして調製された血液又は組織ホモジネートとを用いて作成した。生体内分布は、組織又は血液当たりの注入量のパーセンテージ（％注入量）として表した。
＜毒性の評価＞
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を、２ｍｇ ＲＮＰ／ｋｇ体重で２日間連続して静脈注射した。最後の注射から１週間後、マウスに麻酔をかけ、体重測定と血液採取を行った。血液は、下大静脈から採取し、血清に処理した。血清中の血液学的パラメーターは、オリエンタル酵母工業株式会社によって測定された。
［合成例１］ＣＬ４Ｆ６［７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）－１３－（（２－ヘキシルノナノイル）オキシ）－７－ヒドロキシトリデシル　２－ヘキシルデカノエート］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　特許文献１に記載の方法で合成された７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（１．０ｍｍｏｌ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、続いて、２－ヘキシルデカノイン酸（２．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン）（０．２０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（３．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。濾液を０．５Ｎ 酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー［溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）］に供することにより精製して、ＣＬ４Ｆ６を得た。
［合成例２］ＣＬ４Ｆ６－ｂ－３［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシ－１３－（（３－プロピルヘキサノイル）オキシ）トリデシル３－エチルヘプタン酸］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（１）３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルの合成
　ＴＨＦ（テトラヒドロフラン、２０ｍＬ）に溶解したホスホノ酢酸トリエチル（２．１ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）に、ＮａＨ（鉱油中６０％、０．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を氷上で３０分間撹拌した。当該反応混合物に４－ヘプタノン（０．５７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈した後、水及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチル（１．７６ｇ、収率１９１％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）３－プロピルヘキサノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチル（１．７６ｇ）を、Ａｒ雰囲気下でＭｅＯＨ（１０ｍＬ）とＤＣＭ（ジクロロメタン、１０ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、Ｐｄ/Ｃ（１７６ｍｇ、１０ｗｔ％）を加えた。得られた混合物を、バルーン圧下、周囲温度で一晩水素化した。反応混合物をセライトの小さなパッドを通して濾過し、ＤＣＭで洗浄した後、濾液を蒸発させた。得られた残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、３－プロピルヘキサノエートエチル（０．５９ｇ、収率６３％）が無色の油として得られた。
（３）３－プロピルヘキサン酸の合成
　３－プロピルヘキサノエートエチル（０．５９ｇ）を２－プロパノール（１０．７ｍＬ）と水（５．３ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．７７ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３－プロピルヘキサン酸（０．４６ｇ、収率９２％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ６－ｂ－３の合成
　３－プロピルヘキサン酸（３４８ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（３８８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）（４７９ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ６－ｂ－３（３４０ｍｇ、収率５２％）が無色の油として得られた。
［合成例３］ＣＬ４Ｆ７－ｂ－４［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ブチルヘプタノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（１）３－ブチルヘプト－２－エノエートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えて５－ノナノン（０．７１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、３－ブチルヘプト－２－エノエートエチル（１．６５ｇ、収率１５５％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）３－ブチルヘプタノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて３－ブチルヘプト－２－エノエートエチル（１．６５ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを１６５ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、３－ブチルヘプタノエートエチル（０．５０ｇ、収率４７％）が無色の油として得られた。
（３）３－ブチルヘプタン酸の合成
　３－ブチルヘプタノエートエチル（０．５４ｇ）を２－プロパノール（７．８ｍＬ）と水（３．９ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．２９ｇ、２３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３－ブチルヘプタン酸（０．４１ｇ、収率９５％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ７－ｂ－４の合成
　３－ブチルヘプタン酸（２６１ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（２４７ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（７．８ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（３０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ７－ｂ－４（１５０ｍｇ、収率３２％）が無色の油として得られた。
［合成例４］ＣＬ４Ｆ８－ｂ－５［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ペンチルオクタノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（１）３－ペンチルオクタ－２－エノエートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えて６－ウンデカン（０．８５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、３－ペンチルオクタ－２－エノエートエチル（３．９４ｇ、収率１６４％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）３－ペンチルオクタノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて３－ペンチルオクタ－２－エノエートエチル（１．６５ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを３９４ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、３－ペンチルオクタノエートエチル（１．１１ｇ、収率４６％）が無色の油として得られた。
（３）３－ペンチルオクタン酸の合成
　３－ペンチルオクタノエートエチル（１．１１ｇ）を２－プロパノール（１５．６ｍＬ）と水（７．８ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（２．５８ｇ、４６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３－ペンチルオクタン酸（０．９４ｇ、収率９７％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ８－ｂ－５の合成
　３－ペンチルオクタン酸（４６１ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（３７９ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（１１．９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（４６９ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ８－ｂ－５（３２０ｍｇ、収率４２％）が無色の油として得られた。
［合成例５］ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ヘキシルノナノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（１）３－ヘキシルノン－２－エノエートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えて９－トリデカノン（０．９９ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、３－ヘキシルノン－２－エノエートエチル（１．６３ｇ、収率１２１％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）３－ヘキシルノナノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて３－ヘキシルノン－２－エノエートエチル（１．６３ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを１６３ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、３－ヘキシルノナノエートエチル（０．５４ｇ、収率４０％）が無色の油として得られた。
（３）３－ヘキシルノナン酸の合成
　３－ヘキシルノナノエートエチル（０．５４ｇ）を２－プロパノール（６．８ｍＬ）と水（３．４ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．１２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３－ヘキシルノナン酸（０．４４ｇ、収率９２％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６の合成
　３－ヘキシルノナン酸（３３９ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（２４７ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（７．８ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（３０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６（２５０ｍｇ、収率４６％）が無色の油として得られた。
［合成例６］ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ヘプチルデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（１）３－ヘプチルデカ－２－エノエートエチルの合成
　ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解したホスホノ酢酸トリエチル（１．２０ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）に、ＮａＨ（鉱油中６０％、０．２２ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を氷上で３時間撹拌した。当該反応混合物に８－ペンタデカノン（１．１３ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加えた後、一晩還流した。当該反応混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈した後、水及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、８－ペンタデカノンと３－ヘプチルデカ－２－エノエートエチルの混合物（１．６３ｇ、収率１１０％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）３－ヘプチルデカノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて３－ヘプチルデカ－２－エノエートエチル（１．６３ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを１６３ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、８－ペンタデカノンと３－ヘプチルデカノエートエチルの混合物（１．１６ｇ、収率４５％）が無色の油として得られた。
（３）３－ヘプチルデカン酸の合成
　８－ペンタデカノンと３－ヘプチルデカノエートエチルの混合物（１．１６ｇ）を２－プロパノール（１５．３ｍＬ）と水（７．７ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．５４ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、８－ペンタデカノンと３－ヘプチルデカン酸の混合物（１．０５ｇ、収率９７％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７の合成
　８－ペンタデカノンと３－ヘプチルデカン酸の混合物（１．０５ｇ、３－ヘプチルデカン酸が２．２０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（３８８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（４９ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７（３６０ｍｇ、収率４０％）が無色の油として得られた。
［合成例７］ＣＬ４Ｆ１１－ｂ－８［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－オクチルウンデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（１）３－オクチルウンデカ－２－エノエートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えて９－ヘプタデカノン（１．２７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、３－オクチルウンデカ－２－エノエートエチル（２，１２ｇ、収率１３１％）が赤褐色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）３－オクチルウンデカノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて３－オクチルウンデカ－２－エノエートエチル（２．１２ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを２１２ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、３－オクチルウンデカノエートエチル（１．０５ｇ、収率６４％）が無色の油として得られた。
（３）３－オクチルウンデカン酸の合成
　３－オクチルウンデカノエートエチル（１．０５ｇ）を２－プロパノール（１０．８ｍＬ）と水（５．４ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．７９ｇ、３２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３－オクチルウンデカン酸（０．８４ｇ、収率８８％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１１－ｂ－８の合成
　３－オクチルウンデカン酸（４１８ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（２４７ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（７．８ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（３０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１１－ｂ－８（３８４ｍｇ、収率６３％）が黄色の油として得られた。
［合成例８］ＣＬ４Ｆ９－ｂ［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロヘプチルアセテート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（１）２－シクロヘプチリデンアセテートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えてシクロヘプタノン（０．５６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、２－シクロヘプチリデンアセテートエチル（１．７２ｇ、収率１８９％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）２－シクロヘプチルアセテートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて２－シクロヘプチリデンアセテートエチル（１．７２ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを１７２ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、２－シクロヘプチルアセテートエチル（０．８０ｇ、収率８７％）が無色の油として得られた。
（３）２－シクロヘプチル酢酸の合成
　２－シクロヘプチルアセテートエチル（０．８０ｇ）を２－プロパノール（１４．８ｍＬ）と水（７．４ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（２．４５ｇ、４３．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、２－シクロヘプチル酢酸（０．６０ｇ、収率７７％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ９－ｂの合成
　２－シクロヘプチル酢酸（６００ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（６７０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（２１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（８３０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ９－ｂ（４３０ｍｇ、収率２７％）が無色の油として得られた。
［合成例９］ＣＬ４Ｆ１４－ｂ［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロドデシルアセテート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（１）２－シクロドデシリデンアセテートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えてシクロドデカノン（０．９１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、２－シクロドデシリデンアセテートエチル（２．０ｇ、収率１６２％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）２－シクロドデシルアセテートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて２－シクロドデシリデンアセテートエチル（２．０ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを２００ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、２－シクロドデシルアセテートエチル（１．０６ｇ、収率８４％）が無色の油として得られた。
（３）２－シクロドデシル酢酸の合成
　２－シクロドデシルアセテートエチル（１．０６ｇ）を２－プロパノール（１４．１ｍＬ）と水（７．１ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（２．３５ｇ、４１．８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、２－シクロドデシル酢酸（０．９２ｇ、収率８２％）が白色固体として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１４－ｂの合成
　２－シクロドデシル酢酸（９２０ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（７２０ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（８９０ｍｇ、４．６６ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１４－ｂ（７７０ｍｇ、収率５２％）が無色の油として得られた。
［合成例１０］ＣＬ４Ｆ１７－ｂ［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロペンタデシルアセテート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（１）２－シクロペンタデシリデンアセテートエチルの合成
　４－ヘプタノンに代えてシクロペンタデカノン（１．１２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例２の（１）と同様に反応させて、２－シクロペンタデシリデンアセテートエチル（２．３ｇ、収率１５６％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）２－シクロペンタデシルアセテートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて２－シクロペンタデシリデンアセテートエチル（２．３ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを２３０ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、２－シクロペンタデシルアセテートエチル（０．８４ｇ、収率５７％）が無色の油として得られた。
（３）２－シクロペンタデシル酢酸の合成
　２－シクロペンタデシルアセテートエチル（０．８４ｇ）を２－プロパノール（７．５ｍＬ）と水（４．７ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．５７ｇ、２８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、２－シクロペンタデシル酢酸（０．６９ｇ、収率９１％）が白色固体として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１７－ｂの合成
　２－シクロペンタデシル酢酸（６９０ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（４５０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（１４．２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（５６０ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１７－ｂ（２８０ｍｇ、収率２７％）が無色の油として得られた。
［合成例１１］ＣＬ４Ｆ１０－ｅ－２［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－エチルデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（１）６－エチルデカ－４－エノエートエチルの合成
　０℃に冷却したＡｒ雰囲気下、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に懸濁させたトリフェニルホスホニウムブロミド（２．７４ｇ、６．０ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（６．０ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を室温で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に２－エチルヘキサナール（０．６４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、ＥｔＯＡｃで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物をヘキサンに溶解させ、シリカゲルを通した後、溶媒を蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、６－エチルデカ－４－エノエートエチル（０．３８ｇ、３４％）が無色の油として得られた。
（２）６－エチルデカノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて６－エチルデカ－４－エノエートエチル（０．３８ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を用い、かつＰｄ/Ｃを３８ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、６－エチルデカノエートエチル（０．３８ｇ、収率９９％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（３）６－エチルデカノン酸の合成
　６－エチルデカノエートエチル（０．３８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を２－プロパノール（５．６ｍＬ）と水（２．８ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（０．９４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、６－エチルデカノン酸（０．３１ｇ、収率９０％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１０－ｅ－２の合成
　６－エチルデカノン酸（３０５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（２６４ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（８．３ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（３２６ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。この残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage）に置き、ＤＣＭとＭｅＯＨのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Slekt、Biotage社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１０－ｅ－２（２７０ｍｇ、収率５２％）が無色の油として得られた。
［合成例１２］ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－プロピルウンデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（１）２－プロピルヘプタナールの合成
　２－プロピルヘプタノール－１－オール（１．５８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解させ、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン １－オキシル）（１５．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＢｕ４ＮＨＳＯ４（０．１７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を氷上で冷却した。次いで、当該混合物にＮａＯＣｌ ５Ｈ２Ｏ（１．９８ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を氷上で３時間撹拌した。当該反応混合物を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液でクエンチした後、ＥｔＯＡｃで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、２－プロピルヘプタナール（１．４６ｇ、９３％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）６－ブチルドデカ－４－エノエートエチルの合成
　－７８℃に冷却したＡｒ雰囲気下、無水ＴＨＦ（８ｍＬ）に懸濁させた（４－エトキシ－４－オキソブチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（５．１２ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（１１．２ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に２－プロピルヘプタナール（１．４６ｇ）を加え、一晩かけて徐々に室温まで温めた。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物をヘキサンに溶解させ、シリカゲルを通した後、溶媒を蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、６－ブチルドデカ－４－エノエートエチル（０．９８ｇ、４１％）が黄色の油として得られた。
（３）６－ブチルドデカノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて６－ブチルドデカ－４－エノエートエチル（０．９８ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）を用い、かつＰｄ/Ｃを９８ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、６－ブチルドデカノエートエチル（０．９１ｇ、収率９２％）がクラウディな白色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）６－ブチルドデカン酸の合成
　６－ブチルドデカノエートエチル（０．９１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を２－プロパノール（１１．８ｍＬ）と水（５．９ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（１．９６ｇ、３５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、６－ブチルドデカン酸（０．７８ｇ、収率９７％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（５）ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３の合成
　６－ブチルドデカン酸（６９２ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（４６０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（１４．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（５７５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。得られた残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ＤＣＭとＭｅＯＨのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３（４４５ｍｇ、収率４６％）が無色の油として得られた。
［合成例１３］ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－ブチルドデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
（１）２－ブチルオクタナールの合成
　２－ブチル－１－ｎ－オクタノール（１．８６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解させ、ＴＥＭＰＯ（１５．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＢｕ４ＮＨＳＯ４（０．１７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を氷上で冷却した。次いで、当該混合物にＮａＯＣｌ ５Ｈ２Ｏ（１．９８ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を氷上で３時間撹拌した。当該反応混合物を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液でクエンチした後、ＥｔＯＡｃで希釈し、さらに水及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、２－ブチルオクタナール（１．８６ｇ、１０１％）が無色の油として得られた。
（２）６－ヘキシルドデカ－４－エノエートエチルの合成
　０℃に冷却したＡｒ雰囲気下で、無水ＴＨＦ（１２ｍＬ）に懸濁させた（４－エトキシ－４－オキソブチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（５．４９ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（１２．０ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を室温で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に２－ブチルオクタナール（１．８６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物をヘキサンに溶解させ、シリカゲルを通した後、溶媒を蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、６－ブチルドデカ－４－エノエートエチル（１．７５ｇ）が無色の油として得られた。
（３）６－ブチルドデカノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて６－ブチルドデカ－４－エノエートエチル（１．７５ｇ）を用い、かつＰｄ/Ｃを１７５ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、６－ブチルドデカノエートエチル（１．７５ｇ）がクラウディな白色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）６－ブチルドデカン酸の合成
　６－ブチルドデカノエートエチル（１．７５ｇ）を２－プロパノール（４．０ｍＬ）と水（２．０ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（０．６７ｇ、１２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、６－ブチルドデカン酸（１．５９ｇ）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（５）ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４の合成
　６－ブチルドデカン酸（１．５９ｇ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（２１０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（６．７ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（２６０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。得られた残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ＤＣＭとＭｅＯＨのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４（８５ｍｇ、収率１８％）が無色の油として得られた。
［合成例１４］ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－ヘキシルドデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（１）２－ヘキシルオクタナールの合成
　２－ブチル－１－ｎ－オクタノールに代えて２－ヘキシル－１－ｎ－オクタノール（２．１４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、合成例１３の（１）と同様に反応させて、２－ヘキシルオクタナール（１．８１ｇ、８５％）が無色の油として得られた。
（２）６－ヘキシルドデカ－４－エノエートエチルの合成
　－７８℃に冷却したＡｒ雰囲気下で、無水ＴＨＦ（８ｍＬ）に懸濁させた（４－エトキシ－４－オキソブチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（４．６７ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（１０．２ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に２－ヘキシルオクタナール（１．８１ｇ）を加え、反応混合物を一晩かけて徐々に室温まで温めた。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物をヘキサンに溶解させ、シリカゲルを通した後、溶媒を蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、６－ヘキシルドデカ－４－エノエートエチル（１．９３ｇ、収率７３％）が無色の油として得られた。
（３）６－ヘキシルドデカノエートエチルの合成
　３－プロピルヘキサ－２－エノエートエチルに代えて６－ヘキシルドデカ－４－エノエートエチル（１．９３ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を用い、かつＰｄ/Ｃを１９３ｍｇ（１０ｗｔ％）用いた以外は合成例２の（２）と同様に反応させて、６－ヘキシルドデカノエートエチル（１．７５ｇ）がクラウディな白色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）６－ヘキシルドデカン酸の合成
　６－ヘキシルドデカノエートエチル（１．９５ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を２－プロパノール（２１ｍＬ）と水（１０．５ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、ＫＯＨ（３．４８ｇ、６２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で一晩撹拌した。当該反応混合物を室温に冷却し、ヘキサンを加えた後、１Ｎ ＨＣｌ水溶液、水、及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、６－ヘキシルドデカン酸（１．７３ｇ、収率９８％）が黄色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（５）ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６の合成
　６－ヘキシルドデカン酸（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（７５７ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）に溶解させた後、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（２４．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（９３０ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。残留物を逆相カラム（HP C18Aq、Teledyne ISCO社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（CombiFlash Rf、Teledyne ISCO社製）で精製した。得られた残留物を順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）にロードし、ＤＣＭとＭｅＯＨのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Selekt、Biotage社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６（３２０ｍｇ、収率１８％）が黄色の油として得られた。
［合成例１５］ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７－エチルウンデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（１）７－エチルウンデカ－５－エン酸の合成
　－７８℃に冷却したＡｒ雰囲気下で、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に懸濁させた４－(カルボキシブチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（２．６６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（１２ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に２－エチルヘキサナール(０．６４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を一晩かけて徐々に室温まで温めた。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、収率６５％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）７－エチルウンデカン酸の合成
　Ａｒ雰囲気下で、エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）とＤＣＭ（１０ｍＬ）の混合溶媒に溶解させた後、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）を加えた。得られた混合物を、バルーン圧下、周囲温度で一晩水素化した。反応混合物をセライトの小さなパッドを通して濾過し、ＤＣＭで洗浄した後、濾液を蒸発させた。これにより、７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、収率１００％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（３）ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）、７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ （６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）の混合物に溶解させた後、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。次いで、当該反応混合物を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、逆相カラム(Sfaer C18、Biotage社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有させたアセトニリル／２－プロパノール（１：１（容量比））の混合溶媒とのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Slekt、Biotage社製）で精製した。残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HC D、Biotage社製）に置き、ＤＣＭとＭｅＯＨのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Slekt、Biotage社製）で精製した。これにより、ＣＬ４Ｆ １１－ζ－２（４７２ｍｇ、収率４２％）が無色の油として得られた。
［合成例１６］ＣＬ４Ｆ１２－η－２［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８－エチルドデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（１）８－エチルドデカ－６－エン酸の合成
　４－(カルボキシブチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（２．６６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）に代えて５－（カルボキシペンチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（２．７４ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例１５の（１）と同様に反応させて、８－エチルドデカ－６－エン酸（０．８５ｇ、収率７５％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）８－エチルドデカン酸の合成
　エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）に代えて－エチルドデカ－６－エン酸（０．８５ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を用い、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）に代えてＰｄ／Ｃ（８５ｍｇ、１０ｗｔ％）を用いた以外は合成例１５の（２）と同様に反応させて、８－エチルドデカン酸（０．８６ｇ、収率１０２％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（３）ＣＬ４Ｆ１２－η－２の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）に代えて８－エチルドデカン酸（０．５５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を用い、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）との混合物に代えて、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（４３０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（５２７ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）との混合物を用いた以外は合成例１５の（３）と同様に反応させて、ＣＬ４Ｆ１２－η－２（２０２ｍｇ、収率２３％）が黄色油として得られた。
［合成例１７］ＣＬ４Ｆ１１－η－３（３）［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８，１０，１０－トリメチルウンデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（１）３，５，５－トリメチルヘキサナールの合成
　３，５，５－トリメチルヘキサナ－１－オール（１．４４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解させ、ＴＥＭＰＯ（１５．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とＢｕ４ＮＨＳＯ４（０．１７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を氷上で冷却した。次いで、当該混合物にＮａＯＣｌ ５Ｈ２Ｏ（１．９８ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を氷上で３時間撹拌した。当該反応混合物を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液でクエンチした後、ＥｔＯＡｃで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。これにより、３，５，５－トリメチルヘキサナール（０．９１ｇ、収率６４％）が黄色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）８，１０，１０－トリメチルウンデカ－５－エン酸の合成
　－７８℃に冷却したＡｒ雰囲気下で、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に懸濁させた５－（カルボキシブチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（２．７４ｇ、６．０ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（１２ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に３，５，５－トリメチルヘキサナール（０．９１ｇ）を加え、反応混合物を一晩かけて徐々に室温まで温めた。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、逆相カラム(Sfaer C18、Biotage社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有させたアセトニリルとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Slekt、Biotage社製）で精製した。これにより、８，１０，１０－トリメチルウンデカ－５－エン酸（０．４２ｇ、収率３７％）が無色の油として得られた。
（３）８，１０，１０－トリメチルウンデカン酸の合成
　エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）に代えて８，１０，１０－トリメチルウンデカ－５－エン酸（０．４２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を用い、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）に代えてＰｄ/Ｃ（４２ｍｇ、１０ｗｔ％）を用いた以外は合成例１５の（２）と同様に反応させて、８，１０，１０－トリメチルウンデカン酸（０．４２ｇ、収率９９％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１１－η－３（３）の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）に代えて８，１０，１０－トリメチルウンデカン酸（０．４２ｇ、１，８ｍｍｏｌ）を用い、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）との混合物に代えて、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（３１８ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（３８３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）との混合物を用いた以外は合成例１５の（３）と同様に反応させて、ＣＬ４Ｆ１１－η－３（３）（２５１ｍｇ、収率３８％）が無色の油として得られた。
［合成例１８］ＣＬ４Ｆ１０－ζ－３（３）［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７，９，９－トリメチルデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
（１）３，５，５－トリメチルヘキサナールの合成
　合成例１７の（１）と同様にして反応させて、３，５，５－トリメチルヘキサナール（１．１８ｇ、収率８３％）が黄色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）７，９，９－トリメチルデカ－４－エン酸の合成
　－７８℃に冷却したＡｒ雰囲気下で、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に懸濁させた３－（カルボキシプロピル)トリフェニルホスホニウム（４．３ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（２０ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に３，５，５－トリメチルヘキサナール（１．１８ｇ）を加え、反応混合物を一晩かけて徐々に室温まで温めた。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、逆相カラム(Sfaer C18、Biotage社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有させたアセトニリルとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Slekt、Biotage社製）で精製した。これにより、７，９，９－トリメチルデカ－４－エン酸（０．５１ｇ、収率２９％）が黄色の油として得られた。
（３）７，９，９－トリメチルデカン酸の合成
　エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）に代えて７，９，９－トリメチルデカ－４－エン酸（０．５１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を用い、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）に代えてＰｄ/Ｃ（５１ｍｇ、１０ｗｔ％）を用いた以外は合成例１５の（２）と同様に反応させて、７，９，９－トリメチルデカン酸（０．５１ｇ、収率９９％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１０－ζ－３（３）の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）に代えて７，９，９－トリメチルデカン酸（０．５１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を用い、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）との混合物に代えて、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（４２６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（５１８ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）との混合物を用いた以外は合成例１５の（３）と同様に反応させて、ＣＬ４Ｆ１０－ζ－３（３）（７５ｍｇ、収率９％）が黄色の油として得られた。
［合成例１９］ＣＬ４Ｆ１２－θ－３（３）［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（９，１１，１１－トリメチルドデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
（１）３，５，５－トリメチルヘキサナールの合成
　合成例１７の（１）と同様にして反応させて、３，５，５－トリメチルヘキサナール（１．３７ｇ、収率９４％）が黄色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）９，１１，１１－トリメチルドデカ－６－エン酸の合成
　－７８℃に冷却したＡｒ雰囲気下で、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に懸濁させた５－（カルボキシペンチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（５．２ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）に、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液）（２３ｍＬ）を滴下し、得られた反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。次に、当該反応混合物に３，５，５－トリメチルヘキサナール（１．３７ｇ）を加え、反応混合物を一晩かけて徐々に室温まで温めた。当該反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした後、Ｅｔ２Ｏで希釈し、さらにブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥後の反応液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、逆相カラム(Sfaer C18、Biotage社製）にロードし、０．１％ ＴＦＡ水溶液と、０．１％ ＴＦＡを含有させたアセトニリルとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィー（Slekt、Biotage社製）で精製した。これにより、９，１１，１１－トリメチルドデカ－６－エン酸（０．４７ｇ、収率２１％）が無色の油として得られた。
（３）９，１１，１１－トリメチルドデカン酸の合成
　エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）に代えて９，１１，１１－トリメチルドデカ－６－エン酸（０．４７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を用い、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）に代えてＰｄ/Ｃ（４７ｍｇ、１０ｗｔ％）を用いた以外は合成例１５の（２）と同様に反応させて、９，１１，１１－トリメチルドデカン酸（０．４７ｇ、収率９６％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１２－θ－３（３）の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）に代えて９，１１，１１－トリメチルドデカン酸（０．４７ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を用い、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）との混合物に代えて、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（３３３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（４１４ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）との混合物を用いた以外は合成例１５の（３）と同様に反応させて、ＣＬ４Ｆ１２－θ－３（３）（２３３ｍｇ、収率３２％）が黄色の油として得られた。
［合成例２０］ＣＬ４Ｆ１２－ζ－２（２）［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７，１１－ジメチルドデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
（１）３，７－ジメチルオクタナールの合成
　３，５，５－トリメチルヘキサナ－１－オール（１．４４ｇ、１０ｍｍｏｌ）に代えて３，７－ジメチルオクタン－１－オール（１．５８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例１７の（１）と同様に反応させて、３，７－ジメチルオクタナール（１．５９ｇ、収率１０２％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）７，１１－ジメチルドデカ－４－エン酸の合成
　５－（カルボキシペンチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（５．２ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）に代えて３－（カルボキシプロピル)トリフェニルホスホニウムブロミド（５．２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を用い、３，５，５－トリメチルヘキサナール（１．３７ｇ）に代えて３，７－ジメチルオクタナール（１．５９ｇ）を用いた以外は合成例１７の（２）と同様に反応させて、７，１１－ジメチルドデカ－４－エン酸（０．９０ｇ、収率４０％）が無色の油として得られた。
（３）７，１１－ジメチルドデカン酸の合成
　エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）に代えて７，１１－ジメチルドデカ－４－エン酸（０．９０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を用い、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）に代えてＰｄ/Ｃ（９０ｍｇ、１０ｗｔ％）を用いた以外は合成例１５の（２）と同様に反応させて、７，１１－ジメチルドデカン酸（０．９０ｇ、収率９９％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１２－ζ－２（２）の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）に代えて７，１１－ジメチルドデカン酸（０．９０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を用い、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）との混合物に代えて、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（６９８ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（２２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（８６１ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）との混合物を用いた以外は合成例１５の（３）と同様に反応させて、ＣＬ４Ｆ１２－ζ－２（２）（３０６ｍｇ、収率２１％）が黄色の油として得られた。
［合成例２１］ＣＬ４Ｆ１３－η－２（２）［７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８，１２－ジメチルトリデカノエート）］の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
（１）３，７－ジメチルオクタナールの合成
　合成例１９の（１）と同様に反応させて、３，７－ジメチルオクタナール（１．６３ｇ、収率１０４％）が無色の油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）８，１２－ジメチルトリデカン酸の合成
　５－（カルボキシペンチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（５．２ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）に代えて４－（カルボキシブチル)トリフェニルホスホニウムブロミド（５．３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を用い、３，５，５－トリメチルヘキサナール（１．３７ｇ）に代えて３，７－ジメチルオクタナール（１．６３ｇ）を用いた以外は合成例１７の（２）と同様に反応させて８，１２－ジメチルトリデカン酸（０．７７ｇ、収率３２％）が無色の油として得られた。
（３）８，１２－ジメチルトリデカン酸の合成
　エチルウンデカ－５－エン酸（０．６９ｇ、３．２ｍｍｏｌ）に代えて７，１１－ジメチルドデカ－４－エン酸（０．９０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を用い、Ｐｄ/Ｃ（６９ｍｇ、１０ｗｔ％）に代えてＰｄ/Ｃ（９０ｍｇ、１０ｗｔ％）を用いた以外は合成例１５の（２）と同様に反応させて、８，１２－ジメチルトリデカン酸（０．７６ｇ、収率９８％）が濁った白色油として得られた。粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（４）ＣＬ４Ｆ１３－η－２（２）の合成
　７－エチルウンデカン酸（０．６９ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）に代えて８，１２－ジメチルトリデカン酸（０．７６ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を用い、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６９０ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）との混合物に代えて、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）と７－（４－ジプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（５５３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６８４ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）との混合物を用いた以外は合成例１５の（３）と同様に反応させて、ＣＬ４Ｆ１３－η－２（２）（５５８ｍｇ、収率４７％）が黄色の油として得られた。
［実施例１］
　合成例１～１４で合成した脂質を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　さらに、７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイル ジオレアート（ＣＬ４Ｈ６）も構成脂質として用いた。ＣＬ４Ｈ６は、特許文献１に記載の方法で合成されたものを用いた。
　中性脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール（ｃｈｏｌ）、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、ｐＨ感受性カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡを搭載させた脂質ナノ粒子（ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を作製した。調製に使用したｐＨ感受性カチオン性脂質の種類、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、一般式（Ａ）中のｃが１であるｐＨ感受性カチオン性脂質（β位で分岐するｐＨ感受性カチオン性脂質）を含有させた脂質ナノ粒子の結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　いずれのｐＨ感受性カチオン性脂質を用いた場合でも、核酸を封入した脂質ナノ粒子を調製することができた。ｐＨ感受性カチオン性脂質の炭素数が多くなるほど、封入率（％）が高くなり、粒子径が小さくなり、ｐＫａが小さくなる傾向が観察された。また、鎖状型のｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ４Ｆ６－ｂ－３、ＣＬ４Ｆ７－ｂ－４、ＣＬ４Ｆ８－ｂ－５、ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６、ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７、ＣＬ４Ｆ１１－ｂ－８）と環状型のｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ４Ｆ９－ｂ、ＣＬ４Ｆ１４－ｂ、ＣＬ４Ｆ１７－ｂ）を比較すると、環状型は鎖状型よりもｐＫａが高くなる傾向が観察された。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図１に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認された。この結果から、今回使用した全てのｐＨ感受性カチオン性脂質が、遺伝子キャリアとして有用な脂質ナノ粒子の構成脂質として適していることが確認された。なかでも、ＣＬ４Ｆ８－Ｂ－５、ＣＬ４Ｆ９－Ｂ－６、及びＣＬ４Ｆ１０－Ｂ－７は、ＣＬ４Ｆ６と同等以上の遺伝子導入能を示した。
　また、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、一般式（Ａ）中のｃが４であるｐＨ感受性カチオン性脂質（ε位で分岐するｐＨ感受性カチオン性脂質）を含有させた脂質ナノ粒子の結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　いずれのｐＨ感受性カチオン性脂質を用いた場合でも、核酸を封入した脂質ナノ粒子を調製することができた。ε位で分岐しているｐＨ感受性カチオン性脂質であっても、炭素数が多くなるほど、封入率（％）が高くなり、粒子径が小さくなり、ｐＫａが小さくなる傾向が観察された。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図２に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認された。この結果から、今回使用した全てのｐＨ感受性カチオン性脂質が、遺伝子キャリアとして有用な脂質ナノ粒子の構成脂質として適していることが確認された。特に、全てのｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子も、ＣＬ４Ｆ６を含有する脂質ナノ粒子と比較して、脾臓で高い遺伝子導入活性を示した。これらの結果から、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ε位で分岐するｐＨ感受性カチオン性脂質を構成成分脂質ナノ粒子は、脾臓を標的とする遺伝子キャリアとして有用であることが示唆された。
［実施例２］
　ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３を含有する脂質ナノ粒子について、中性脂質の種類や含有比率の影響を調べた。
　具体的には、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、ＤＳＰＣ又はＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／０．７５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。調製に使用したｐＨ感受性カチオン性脂質の種類、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びζ電位（ｍＶ）を測定した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
　この結果、ＤＳＰＣを含有させた脂質ナノ粒子とＤＯＰＥを含有させた脂質ナノ粒子のいずれも、その中性脂質の含有比率にかかわらず、核酸を封入した脂質ナノ粒子を調製することができた。ＤＯＰＥを含有させた脂質ナノ粒子の方が、均一かつ高い封入率を示した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図３に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓で高いＦｌｕｃ活性が確認され、肝臓又は脾臓を標的とする遺伝子キャリアとして有用であることが確認された。特に、ＤＯＰＥを含有させた脂質ナノ粒子は、幅広いＤＯＰＥ含量で安定した活性を示した。
［実施例３］
　実施例１で調製したＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のうち、ＣＬ４Ｈ６、ＣＬ４Ｆ６、又はＣＬ４Ｆ１０－ｅ－２を含有させて調製した脂質ナノ粒子について、肝臓での代謝を調べた。
　具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、０．５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ体重の用量でＦｌｕｃｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を静脈注射した。静脈注射から０．５時間後、４時間後、又は２４時間後に、マウスを安楽死させ、肝臓中の各脂質ナノ粒子由来の脂質量を測定した。測定結果を図４に示す。この結果、肝臓中の含有量は、ＣＬ４Ｈ６は代謝されて、投与から２４時間でほぼ肝臓から消失したのに対して、ＣＬ４Ｆ６はほとんど代謝されず、投与から２４時間で肝臓内含有量が変化しなかった。一方で、ＣＬ４Ｆ１０－ｅ－２は、ＣＬ４Ｈ６と同様に生体内で代謝され、投与から２４時間でその多くが分解されていた。これらの結果から、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ε位で分岐させたものは、生分解性が良好であることがわかった。
［実施例４］
　ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＣＬ４Ｈ６、ＣＬ４Ｆ６、ＣＬ４Ｆ８－ｂ－５、ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６、ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、又はＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６を用いて、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を封入した脂質ナノ粒子（ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子）を調製した。ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子中のｓｓＯＤＮとしては、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－４０％を用いた。
　具体的には、ｐＨ感受性カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を作製した。調製に使用したｐＨ感受性カチオン性脂質の種類、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びζ電位（ｍＶ）を測定した。測定結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　次いで、各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与して、ＴＴＲ－ＫＯ活性を測定した。各脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲ活性（ＴＴＲタンパク質量）（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を図５に示す。図中、「ＮＴ」は脂質ナノ粒子未投与のマウスの結果を示す。この結果、ＣＬ４Ｆ８－ｂ－５、ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６、ＣＬ４Ｆ１０－ｂ－７、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、又はＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６を含有させたＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子は、側鎖の炭化水素鎖がα位で分岐しているＣＬ４Ｆ６を含有させたＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子よりも、血清ＴＴＲ活性が小さく、高い遺伝子ノックアウトを誘導した。特に、ｐＨ感受性カチオン性脂質の炭素数が少ないほうが、ノックアウト活性が高く、特にＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３で９０％以上のノックアウトを達成した。
　同様に、ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、又はＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を用いて、同様にしてＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を調製し、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びζ電位（ｍＶ）を測定した。測定結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与し、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲ活性（μｇ／ｍＬ）を測定した。測定結果を図６に示す。ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を含有させた脂質ナノ粒子も優れたノックアウト活性を示したが、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３を含有させた脂質ナノ粒子が最も高いノックアウト活性を示すことが明らかとなった。これらの結果から、脂質ナノ粒子の送達において、送達効率の点から、ｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ａ）において、Ｒ１１及びＲ１２のうちのより炭素数の小さい基の炭素数ＮｃＳは、３～６が好ましく、３～５がより好ましいことや、ｃが４以上が好ましいことが示唆された。また、一般式（Ａ）において、Ｒ１１とＲ１２とｃの和が９～１６程度が好ましく、１１～１４程度が最適であることも示唆された。
［実施例５］
　ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子のノックアウト活性に対する、使用するｓｓＯＤＮのｓｇＲＮＡとのマッチ率の影響を調べた。
　具体的には、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を、ｇＲＮＡとしてｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１又はｓｇＴＴＲ－Ｇ２６９を、ｓｓＯＤＮとして前記表２に記載の１１種類をそれぞれ用いて調製した。脂質ナノ粒子としては、ＣＬ４Ｈ６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって調製した。
　次いで、各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与して、ＴＴＲ－ＫＯ活性を測定し、ＴＴＲ－ＫＯ活性を求めた。得られたＴＴＲ－ＫＯ活性と、使用したｓｓＯＤＮのＧＣ含有率（％）及びＴｍ値を表１０に示す（ｎ＝２）。なお、ｓｓＯＤＮのＧＣ含有率（％）とは、ｓｓＯＤＮ中のｓｇＲＮＡとマッチする塩基中のＧＣ含有率（％）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
　表１０に示すように、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１に対合するｓｇＲＮＡのうち最もＴＴＲ－ＫＯ活性が高かったのは、Ｔｍ値が２６℃のｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％であり、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２６９に対合するｓｇＲＮＡのうち最もＴＴＲ－ＫＯ活性が高かったのは、Ｔｍ値が２４℃のｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿４－４０％であった。これらの結果から、ＴＴＲ－ＫＯ活性は、ｓｓＯＤＮのＴｍ値の影響を受けること、Ｔｍ値が２０～４０℃の範囲内のｓｓＯＤＮを用いることによって向上させられることがわかった。
［実施例６］
　ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１と、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％、又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％とを用いてＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を製造した。対照として、ｓｓＯＤＮを用いずに製造したＴＴＲ－ＲＮＰを封入した脂質ナノ粒子（ＴＴＲ－ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子）を製造した。脂質ナノ粒子は、ＣＬ４Ｈ６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％）の組成で製造した。
　製造された脂質ナノ粒子について、封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びζ電位（ｍＶ）を測定した。測定結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　製造された各ＴＴＲ－ＲＮＰについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ切断活性（％）を測定した（ｎ＝３）。統計解析は、非反復ＡＮＯＶＡとそれに続くＳＮＫテストを用いた。測定結果（％）（平均値±ＳＤ）を図７に示す。図中、「**」は、ｐ＜０．０１を意味する。図中、「ｓｓＯＤＮ（－）」はｓｓＯＤＮを用いずに製造したＴＴＲ－ＲＮＰの結果、「０％」はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮの結果を示す。「４０％」及び「８０％」は、それぞれｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮの結果を示す。
　図７に示すように、ｓｓＯＤＮを含まないＴＴＲ－ＲＮＰ（ｓｓＯＤＮ（－））に対し、ｓｓＯＤＮを含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ切断活性が低下した。ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮは非常にＤＮＡ切断活性が低かったが、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮは、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮと同程度のＤＮＡ切断活性であった。これらの結果から、ｓｓＯＤＮのＴｍ値を制御することにより、ＤＮＡ切断活性を改善できることがわかった。
　製造した各脂質ナノ粒子（ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子、及びｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子）をマウスに投与し、生体内分布を評価した。対照として、ｓｓＯＤＮを含まないＴＴＲ－ＲＮＰを脂質ナノ粒子に内包させずそのまま（フリーＲＮＰ）、同様にマウスに投与し、生体内分布を評価した。評価結果を表１２に示す。ｓｓＯＤＮを含まないＴＴＲ－ＲＮＰ（フリーＲＮＰ）をそのまま投与した場合（表中、「ｓｓＯＤＮ（－）（ｆｒｅｅ）」）よりも、ｓｓＯＤＮを含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮを封入した脂質ナノ粒子を投与した場合のほうが、肝臓と脾臓への移行量が多かった。脂質ナノ粒子への内包の有無やＲＮＰ中のｓｓＯＤＮの有無が、肝臓や脾臓への移行に影響することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
　ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子について、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。具体的には、２ｍｇ ＲＮＰ／ｋｇ体重で２日間連続して静脈注射し、最後の注射から１週間後、マウスを安楽死させ、血液と肝臓を採取した。
　回収した肝臓からゲノムＤＮＡを回収し、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った（ｎ＝３）。対照として、脂質ナノ粒子を投与していないマウスから回収した肝臓に対しても同様にしてＴ７Ｅ１アッセイを行った。この結果、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の投与によって、ＤＮＡレベルで２７%のＫＯ活性を達成できた。
　回収した血液から血清を調製し、血清中のＴＴＲタンパク質濃度を測定し、ＴＴＲ－ＫＯ活性を求めた。対照として、脂質ナノ粒子を投与していないマウスの血清中のＴＴＲタンパク質濃度も測定した。この結果、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの血清中のＴＴＲタンパク質濃度は、未処理のマウスに比べて、８１％も減少しており、高いＴＴＲ－ＫＯ活性が確認された。
　また、ｓｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域中のミスマッチ部位の違いが、遺伝子ノックアウト活性に与える影響を調べた。具体的には、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１と、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－１０℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－１０℃－５’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－２４℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－２４℃－５’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－５０℃－３’、又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－５０℃－５’とを用いて、前記と同様にしてＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子（ＣＬ４Ｈ６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％））を製造した。製造された脂質ナノ粒子について、封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びζ電位（ｍＶ）を測定した。測定結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与し、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。測定結果を図８に示す。図中、「ＮＴ」は脂質ナノ粒子未投与のマウスの結果を示す。また、「１０℃－３’」、「１０℃－５’」、「２４℃－３’」、「２４℃－５’」、「５０℃－３’」、及び「５０℃－５’」はそれぞれ、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－１０℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－１０℃－５’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－２４℃－３’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－２４℃－５’、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－５０℃－３’、又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－５０℃－５’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果を示す。ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－１０℃－３’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子とｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－１０℃－５’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の血清ＴＴＲは同程度であった。同様に、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－２４℃－３’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子とｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－２４℃－５’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－５０℃－３’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子とｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－５０℃－５’を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子も、血清ＴＴＲは同程度であった。これらの結果から、ミスマッチ部位の違いは、遺伝子ノックアウト活性にはほとんど影響せず、Ｔｍ値が重要であることが示唆された。
［実施例７］
　合成例１で合成したＣＬ４Ｆ６、合成例５で合成したＣＬ４Ｆ９－ｂ－６、合成例９で合成したＣＬ４Ｆ１４－ｂ、合成例１３で合成したＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４、合成例１４で合成したＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６、又はＭＣ３を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　中性脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール（ｃｈｏｌ）、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、ｐＨ感受性カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡを搭載させた脂質ナノ粒子（ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を作製した。ただし、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＭＣ３を含む脂質ナノ粒子の組成は、ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％）とした。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のうち、ＣＬ４Ｆ６、ＣＬ４Ｆ９－ｂ－６、ＣＬ４Ｆ１４－ｂ、又はＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を含む脂質ナノ粒子をそれぞれ、Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（ｎ＝２）。結果を図９に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓、脾臓、肺、脳、心臓、腎臓、及び筋肉で、Ｆｌｕｃ活性が確認された。特に、肝臓と脾臓におけるＦｌｕｃ活性が高かった。これらの結果から、今回使用した全てのｐＨ感受性カチオン性脂質が、各組織への遺伝子キャリアとして有用な脂質ナノ粒子の構成脂質として適していること、特に肝臓と脾臓に対する遺伝子キャリアの構成脂質として有用であることが確認された。
　また、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスについては、投与から２４時間後に血液を採取し、各成分について検査した。対照として、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子に代えてＰＢＳを投与したマウスに対しても同様に血液検査を行った。結果を表１４に示す（ｎ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ―ｔｅｓｔ）。表中、ＴＰは総タンパク質、ＡＳＴはアスパラギン酸トランスアミナーゼ、ＡＬＢはアルブミン、ＬＤＨはラクトースデヒドロゲナーゼ、ＢＵＮは血中尿素窒素、γ－ＧＴはγ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ＣＲＥはクレアチニン、Ｔ－ＣＨＯは総コレステロール、ＩＰは無機リン酸塩、ＴＧはトリグリセリド、ＨＤＬ－Ｃは高密度リポタンパク質コレステロール、Ｔ－ＢＩＬは総ビリルビン、ＧＬＵはグルコースを、それぞれ示す。また、＊＊はＰ＜０．０１、＊はＰ＜０．０５を示す.この結果、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、特に毒性は観察されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
　また、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のうち、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６又はＭＣ３を含む脂質ナノ粒子について、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
　ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６又はＭＣ３を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をそれぞれ、Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（ｎ＝２）。結果を図１０に示す。肝臓、脾臓、肺、及び腎臓で、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６を含む脂質ナノ粒子は、ＭＣ３を含む脂質ナノ粒子よりも高いＦｌｕｃ活性が確認された。これらの結果から、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６等の本願発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質とする脂質ナノ粒子は、現在臨床適用されているＭＣ３を含む脂質ナノ粒子よりも高い遺伝子発現活性を持つ、良好な遺伝子キャリアであることが示された。
　ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子については、さらに、凍結融解処理をしたものと未処理のものについて、同様にマウスに投与して各組織での遺伝子発現活性を調べた。
　具体的には、以下の通りにしてＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を調製した。まず、１ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ溶液を、クエン酸バッファー（２５ｍＭ、ｐＨ ４．０）で７３．３ｎｇ／μＬとなるように希釈し、これをｍＲＮＡ溶液とした。総脂質濃度を８ｍＭとして各脂質のモル比組成がＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／１．５（ｍｏｌ％）となるようにエタノールに溶解させて、脂質溶液を調製した（Ｎ／Ｐ＝６）。バッフルミキサー内蔵マイクロ流路に１０ｍＬ容シリンジ（HAMILTON社製）を取り付け、総流速が２．０ｍＬ／分、流速比がｍＲＮＡ溶液：脂質溶液＝３：１（１．５ｍＬ／分：０．５ｍＬ／分）で流した。流路から流れてきた溶液を回収し、適量を透析膜（「Spectra/Por 4 dialysis membrane」、MWCO:12000-15000）に移し、スクロース含有トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、９質量％ スクロース、ｐＨ７．４）中で４℃、２時間で２回透析を行い、回収することで、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を得た。
　得られたＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の一部を、－８０℃で凍結させた後、室温で溶解させたものを、「凍結サンプル」とした。また、凍結融解処理をしていないサンプルを、「非凍結サンプル」とした。凍結サンプルと非凍結サンプルについて、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表１６に示す。「Ｆｒｅｅｓｅ」欄が「－」が非凍結サンプル、「＋」が凍結サンプルの結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　また、凍結サンプルと非凍結サンプルについて、それぞれ、Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（ｎ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ―ｔｅｓｔ）。結果を図１１に示す。図１１に示す通り、凍結サンプルと非凍結サンプルの各組織での遺伝子発現活性には有意な差は観察されず、ＣＬ４Ｆ１２－ｅ－６を含む脂質ナノ粒子は、凍結融解処理の影響をほとんど受けないことが確認された。
［実施例８］
　合成例１２で合成したＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、合成例１５で合成したＣＬ４Ｆ１１－ζ－２、合成例１８で合成したＣＬ４Ｆ１０－ζ－３（３）、合成例１６で合成したＣＬ４Ｆ１２－η－２、合成例１７で合成したＣＬ４Ｆ１１－η－３（３）、合成例２０で合成したＣＬ４Ｆ１２－ζ－２（２）、合成例１９で合成したＣＬ４Ｆ１２－θ－３（３）、及び合成例２１で合成したＣＬ４Ｆ１３－η－２（２）を構成脂質として用いて、実施例４と同様にして、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体を封入した脂質ナノ粒子（ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子）を調製した。ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子中のｓｓＯＤＮとしては、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ_３－４０％を用いた。
　中性脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール（ｃｈｏｌ）、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、ｐＨ感受性カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧをモル比５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を作製した。調製した各脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表１７に示す。表中、「側鎖炭素数」とは、含有するｐＨ感受性カチオン性脂質の側鎖を構成する全ての炭素の数（分子を構成する全ての炭素数から、主鎖末端から分岐位置までの炭素数を差し引いた数）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　次いで、各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与して、ＴＴＲ－ＫＯ活性を測定した。各脂質ナノ粒子を投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した結果を図１２に示す。図中、「ＮＴ」は脂質ナノ粒子未投与のマウスの結果を示す。以降の図中の「ＮＴ」も同様である。この結果、足場炭素数が少ない脂質ほど血清ＴＴＲ活性が小さく、高い遺伝子発現ノックアウト活性を示した。ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含有するＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子（図中、「ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２」）が、血清のＴＴＲタンパク質量が最も少なく、最も高いノックアウト活性を示した。このため、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含有するＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を以降の実験で用いた。
　ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子について、ＰＥＧ－ＤＭＧの含有比率を１．５～３，５ｍｏｌ％とし、脂質ナノ粒子を構成する脂質の総重量に対する含有させるＲＮＰの重量比（［ＲＮＰの重量］／［脂質の総重量］）を２、４、又は５．６質量％とした以外は同様にして、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を調製した。調製した各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表１８に示す。表中、「ＲＮＰ／ｌｉｐｉｄ」が、［ＲＮＰの重量］／［脂質の総重量］を、「ＰＥＧ」が、ＰＥＧ－ＤＭＧの全脂質量に対する含有比率（ｍｏｌ％）を、それぞれ表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　表１８に示すように、ＰＥＧ－ＤＭＧの含有比率を低下させると、封入率が低下する傾向が観察された。一方で、［ＲＮＰの重量］／［脂質の総重量］の重量比は、少ないほうが脂質ナノ粒子の粒子径が小さくなる傾向が観察されたものの、劇的な効果は見られなかった。
　各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与し（０．２ｍｇ　ＲＮＰ／ｋｇ体重）、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。測定結果を図１３に示す。図１３に示すように、いずれのＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでも血清ＴＴＲ活性は同程度であり、ＰＥＧ－ＤＭＧの含有比率と［ＲＮＰの重量］／［脂質の総重量］の重量比は、遺伝子ノックアウト活性にあまり影響しないことが確認された。
　ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子について、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２の含有比率を４０、５０、又は６０ｍｏｌ％、ＤＳＰＣの含有比率を５又は１０ｍｏｌ％とした以外は同様にして、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を調製した。すなわち、調製されたＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の脂質の組成比は、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２の含有比率をｘ％（ｘ＝４０、５０、又は６０）、ＤＳＰＣの含有比率をｙ％（ｙ＝５又は１０）とすると、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝ｘ／ｙ／１００－ｘ－ｙ／３．５（ｍｏｌ％）である。調製した各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表１９に示す。表中、「ＣＬ（ｍｏｌ％）」はＣＬ４Ｆ１１－ζ－２の含有比率（ｍｏｌ％）を示し、「ＰＣ（ｍｏｌ％）」はＤＳＰＣの含有比率（ｍｏｌ％）を示す。表１９に示す通り、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２とＤＳＰＣの含有割合が変化しても、封入率（％）等の物性にはあまり影響がなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与し（０．２ｍｇ　ＲＮＰ／ｋｇ体重）、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。測定結果を図１４に示す。図中、「ＣＬ（ｍｏｌ％）」と「ＰＣ（ｍｏｌ％）」は表１９と同じである。図１４に示すように、いずれのＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでも血清ＴＴＲ活性は同程度であり、脂質ナノ粒子中のｐＨ感受性カチオン性脂質と中性脂質の含有割合が、遺伝子ノックアウト活性に与える影響は小さいことが確認された。
　ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子（ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％））をマウスに投与し（０．２、０．７５、又は２．０ｍｇ　ＲＮＰ／ｋｇ体重）、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。血清のＴＴＲタンパク質量の測定結果を図１５（Ａ）に示す。また、血清のＴＴＲタンパク質量から算出したノックアウト効率（％）の結果を図１５（Ｂ）に示す。図１５（Ａ）に示すように、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を２．０ｍｇ　ＲＮＰ／ｋｇ体重で投与した場合、単回投与でも９８％のＴＴＲ遺伝子発現抑制を達成できた。また、ノックアウト活性は、投与量依存的に高くなることが確認された（図１５（Ｂ））。
　ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子（ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％））をマウスに投与し（２．０ｍｇ　ＲＮＰ／ｋｇ体重）、投与してから１、４、又は１２週間後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。対照として、ｓｇＴＴＲに代えてＧＦＰ遺伝子を標的としたｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ）を用いて調製されたＣａｓ９／ｓｇＧＦＰ－ＲＮＰを同様にしてＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含む脂質ナノ粒子に搭載したＧＦＰ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を同様にしてマウスに投与し、血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。測定結果を図１６に示す。図中、「ＴＴＲ」はＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果であり、「ＧＦＰ」はＧＦＰ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果である。
　ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の遺伝子ノックアウト活性について、脂質ナノ粒子の構成脂質としてＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含む場合と、遺伝子キャリアの構成脂質としてＳＭ、ＡＬＣ、又はＭＣ３を含む場合とを比較した。ＡＬＣとＳＭも、遺伝子キャリアの構成脂質として知られている。
　調製した各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表２０に示す。表２０に示す通り、いずれのＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子も、封入率（％）等の物性に大きな違いはなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
　各ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子をマウスに投与し（２．０ｍｇ　ＲＮＰ／ｋｇ体重）、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した（ｎ＝３）。測定結果を図１７に示す。図１７に示すように、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子は、他のＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子よりも顕著に優れた遺伝子ノックアウト活性を示した。
　ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の遺伝子発現活性についても、脂質ナノ粒子の構成脂質としてＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含む場合と、遺伝子キャリアの構成脂質としてＳＭ、ＡＬＣ、又はＭＣ３を含む場合とを比較した。
　調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表２１に示す。表２１に示す通り、いずれのＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子も、封入率（％）等の物性に大きな違いはなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに投与し（０．０１ｍｇ　ｍＲＮＡ／ｋｇ体重）、投与してから６時間後のマウスのＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（ｎ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ―ｔｅｓｔ）。測定結果を図１８に示す。図１８に示すように、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、他のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子と同程度又はそれ以上の遺伝子発現活性を示した。特に、脾臓における遺伝子発現活性は、ＳＭ、ＡＬＣ、又はＭＣ３を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質のいずれよりも優れており、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含む脂質ナノ粒子は、脾臓を標的とする遺伝子キャリアとして好適であることが確認された。
　さらに、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ４Ｆ１１－ζ－２、ＣＬ４Ｆ１１－ｅ－３、又はＣＬ４Ｆ１２－ｅ－４を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子について、凍結融解処理が脂質ナノ粒子自体の物性やマウスに投与した場合の遺伝子ノックアウト活性に対する影響を調べた。
　具体的には、以下の通りにしてＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を調製した。まず、１０μＭ ｇＲＮＡ溶液をボルテックスミキサーにより攪拌しながら、１０μＭ Ｃａｓ９溶液を少しずつ加えていき、５μＭ ＲＮＰ溶液を調製した。５μＭ ｓｓＯＤＮ溶液へ５μＭ ＲＮＰ溶液を等量混合し、２．５μＭ ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ溶液を得た。２．５μＭ ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ溶液を５０ｍＭ ＮａＣｌ含有ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）で１６０ｎＭに希釈し、これをＲＮＰ溶液とした。総脂質濃度を８ｍＭとして各脂質を所望のモル比組成となるようにエタノールに溶解させて、脂質溶液を調製した。バッフルミキサー内蔵マイクロ流路に１０ｍＬ容シリンジ（HAMILTON社製）を取り付け、総流速が２．０ｍＬ／分、流速比がＲＮＰ溶液：脂質溶液＝９：１（１．８ｍＬ／分：０．２ｍＬ／分）で流した。流路から流れてきた溶液を回収し、適量を透析膜（「Spectra/Por 4 dialysis membrane」、MWCO:12000-15000）に移し、スクロース含有トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、９質量％ スクロース、ｐＨ７．４）中で４℃、２時間で２回透析を行い、回収することで、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を得た。
　得られたＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の一部を、－８０℃で凍結させた後、室温で溶解させたものを、「凍結サンプル」とした。また、凍結融解処理をしていないサンプルを、「非凍結サンプル」とした。凍結サンプルと非凍結サンプルについて、調製した脂質ナノ粒子の封入率（％）、ζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ζ電位（ｍＶ）、及びｐＫａを測定した。結果を表２２に示す。表中、「Ｆｒｅｅｓｅ」欄が「－」が非凍結サンプル、「＋」が凍結サンプルの結果である。いずれのＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子であっても、凍結サンプルと非凍結サンプルで、物性に大きな違いはなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
　また、凍結サンプルと非凍結サンプルについて、それぞれ、Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与し、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した（ｎ＝３）。結果を図１９に示す。図中、「ＣＬ」は、投与したＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子に含まれるｐＨ感受性カチオン性脂質を示す。また、図中、「凍結」欄が「なし」は非凍結サンプルを示し、「あり」は凍結サンプルを示す。図１９に示す通り、凍結サンプルと非凍結サンプルの遺伝子ノックアウト活性には有意な差は観察されず、ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２等を含む脂質ナノ粒子は、凍結融解処理の影響をほとんど受けないことが確認された。
　ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含む脂質ナノ粒子について、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮを搭載した場合と、ＲＮＰにせずｓｇＴＴＲをそのままｓｉＲＮＡとして搭載した場合の、マウスに投与した場合の組織分布を調べた。
　ＣＬ４Ｆ１１－ζ－２を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子としては、ＤｉＲ標識したもの（ＤｉＲ標識ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子）を用いた。
　ｓｇＴＴＲをｓｉＲＮＡとしてそのまま搭載したｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子は、以下の通りにして調製した。まず、１ｍｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ溶液を２５ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０）で４８．９ｎｇ／μＬとなるように希釈し、これをｓｉＲＮＡ溶液とした。総脂質濃度を８ｍＭとして各脂質が所望の組成（ｍｏｌ％）となるようにエタノールに溶解させて、脂質溶液を調製した（Ｎ／Ｐ＝９）。脂質ナノ粒子を蛍光標識するために、当該脂質溶液に０．５ｍｏｌ％となるようにＤｉＲ溶液を加えた。バッフルミキサー内蔵マイクロ流路に１０ｍＬ容シリンジ（HAMILTON社製）を取り付け、総流速が０．５ｍＬ／分、流速比がｓｉＲＮＡ溶液：脂質溶液＝３：１（０．３７５ｍＬ／分：０．１２５ｍＬ／分）で流した。流路から流れてきた溶液を回収し、適量を透析膜（「Spectra/Por 4 dialysis membrane」、MWCO:12000-15000）に移し、ＰＢＳ（－）中で４℃、２時間で２回透析を行い、回収することで、ＤｉＲ標識ｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子を得た。
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、０．７５ｍｇ ＲＮＰ／ｋｇ体重となるようにＤｉＲ標識ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子又はこれと同じＤｉＲ蛍光強度となるよう希釈したＤｉＲ標識ｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子を、尾静脈投与した。投与から１時間後に、血液と臓器を回収し、イメージングシステムＩＶＩＳ（in vivo imaging system、PerkinElmer社製）を用いて、ＤｉＲ蛍光強度を測定した。測定結果を図２０に示す。図中、「ＲＮＰ－ＬＮＰ」は、ＤｉＲ標識ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果であり、「ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ」は、ＤｉＲ標識ｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果である。
　図２０に示すように、ＤｉＲ標識ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子とＤｉＲ標識ｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子は、体内に投与された場合、おおよそ同じような組織分布となったが、詳細には、ＤｉＲ標識ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子はＤｉＲ標識ｓｉＴＴＲ搭載脂質ナノ粒子よりも高い脾臓選択性を持つことが明らかとなった。
［実施例９］
　ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子において、使用されるｓｓＯＤＮのＴｍ値の影響を調べた。
　まず、ｓｇＲＮＡとして、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１－５ＦＡＭを用い、ｓｓＯＤＮとして、ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱ、ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱ、又はｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱを用いて、ｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮのＴｍ値を、蛍光消光法を用いて測定した（ｎ＝３）。１１～７０℃の各温度の蛍光強度のプロットを図２１（Ａ）に、各温度における蛍光強度の変化量を図２１（Ｂ）に、それぞれ示す。図中、「８０％」、「４０％」、及び「０％」は、それぞれ、ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱ、ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱ、及びｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱを用いて測定した結果である。
　ｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱはｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１－５ＦＡＭと常に乖離しているため、ｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱを含む反応液では、図２１（Ａ）に示すように、いずれの温度でも蛍光強度は高く、温度による変化はほとんどない。これに対して、ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱを含む反応液とｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱを含む反応液では、温度が高くなるにつれて蛍光強度が高くなり、ｓｓＯＤＮ－０％－３ＩＢＦＱを含む反応液の蛍光強度に近づいた。つまり、ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体の解離は、温度依存的に起こっていることが確認された。
　Ｔｍ値は最も蛍光強度の変化量が多い温度であるため、ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱは６２℃、ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱは３２℃であった（図２１（Ｂ））。４０℃付近では、ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱはほぼ全てＲＮＰから乖離していたが、ｓｓＯＤＮ－８０％－３ＩＢＦＱはほぼ全てＲＮＰと複合体を形成していた。これらの結果から、ｓｓＯＤＮ－４０％－３ＩＢＦＱは、細胞内（３７℃）では速やかにＲＮＰから解離することが示唆された。
　次いで、ｓｇＲＮＡ中のｓｓＯＮ対合領域とのマッチ率が０、４０、又は８０％であるｓｓＯＤＮを用いた場合のＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ複合体のＤＮＡ切断活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定した。ｓｇＲＮＡとして、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１を用いた。ｓｓＯＤＮとして、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％、又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を用いた。ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１とｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％とのＴｍ値は、５０℃であり、ｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１とｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％とのＴｍ値は、２６℃であった。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＤＮＡ切断活性の測定は、反応温度を３７℃又は１５℃として行った（ｎ＝３）。対照として、ｓｓＯＤＮを反応系に含んでいないＲＮＰのＤＮＡ切断活性も、同様にして測定した。ＤＮＡ切断活性は、ｓｓＯＤＮを含まない場合（ｓｓＯＤＮ（－））の活性を１００％とした相対活性値として求めた。３７℃での測定結果を図２２（Ａ）に、１５℃での測定結果を図２２（Ｂ）に、それぞれ示す。図中、「８０％」、「４０％」、及び「０％」は、それぞれ、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％、及びｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を用いて測定した結果であり、「ｓｓＯＤＮ（－）」はｓｓＯＤＮを含まずに測定した結果である。
　３７℃では、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＲＮＰの相対ＤＮＡ切断活性は、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を含むＲＮＰと同程度であった。ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％を含むＲＮＰの相対ＤＮＡ切断活性は、２０％程度しかなく、顕著に低かった。一方で、１５℃では、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＲＮＰの相対ＤＮＡ切断活性は、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－８０％を含むＲＮＰよりは高いものの、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－０％を含むＲＮＰよりも明らかに低かった。ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を用いた場合のＤＮＡ切断活性が３７℃と１５℃で大きく異なったのは、３７℃はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％のＴｍ値（２６℃）よりも高く、このためｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％の大部分はＲＮＰから乖離しており、ＲＮＰ本来のＤＮＡ切断活性が発揮されたのに対して、Ｔｍ値より低い１５℃では、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％の大部分はＲＮＰと複合体化しており、これによりＤＮＡ切断活性が低下したためと推察された。
　これらの結果から、ｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮのＴｍ値が、動物の体内温度（３７℃程度）よりも低くなるようにｓｓＯＤＮを設計することにより、動物の体内において遺伝子ノックアウト活性をより高められることが示された。
　また、ＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子の調製時温度が、細胞内での遺伝子ノックアウト活性に対する影響を調べた。
　具体的には、まず、ｓｇＲＮＡとしてｓｇＴＴＲ－Ｇ２１１を用い、ｓｓＯＤＮとしてｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－３０％又はｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を用い、バッフルミキサー内蔵マイクロ流路内でＲＮＰ溶液と脂質溶液を混合する際の温度を４℃とした以外は実施例８と同様にして、脂質組成がＣＬ４Ｈ６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／３．５（ｍｏｌ％）であるＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を得た。
　得られたＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を、マウスに投与（２．０ｍｇ ＲＮＰ／ｋｇ体重）して、投与してから７日後のマウスの血清のＴＴＲタンパク質量（μｇ／ｍＬ）を測定した。測定結果を図２３に示す。図中、「３０％」及び「４０％」は、それぞれ、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－３０％及びｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を含むＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果である。図２３に示すように、ｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－３０％を用いたＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子とｓｓＯＤＮ－ＴＴＲ＿３－４０％を用いたＴＴＲ－ＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子は、いずれも血清ＴＴＲ活性が低く、遺伝子ノックアウト活性が充分に発揮されていた。特に温度制御していない環境下で調製した場合には、遺伝子ノックアウト活性はあまり高くなかった（表１０）のに対して、４℃で調製した場合に遺伝子ノックアウト活性が高かったのは、製造時温度がＴｍ値以下であったために、ｓｓＯＤＮとｓｇＲＮＡが複合体を形成した状態で脂質ナノ粒子に効率よく搭載されたためと推察される。これらの結果から、ｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮのＴｍ値が、動物の体内温度（３７℃程度）よりも低くなるようにｓｓＯＤＮを設計し、さらに脂質ナノ粒子に搭載させる際の製造時温度をＴｍ値よりも十分に低くすることによって、遺伝子ノックアウト活性が充分に高いＲＮＰ－ｓｓＯＤＮ搭載脂質ナノ粒子を効率よく得られることが示された。

Claims (16)

  1. 　下記の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式（Ｉ）中、ａは３～５の整数を示し；ｂは０又は１を示し；Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して下記一般式（Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（Ａ）中、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１５アルキル基を示し；ｃは１～７の整数を示し：ｅは４～１２の整数を示す；ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに連結して環を形成していてもよい）
    で表される基を示し；Ｘは、下記一般式（Ｂ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（該Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基に置換されていてもよい）を示すが、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を形成してもよい）
    で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を示す〕
    で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する、脂質ナノ粒子。
  2. 　前記ｃが４～７の整数である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
  3. 　前記Ｒ１１と前記Ｒ１２のうちのより炭素数の大きい基の炭素数と前記ｃとの和が５～１７である、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。
  4. 　さらに、ステロール及びポリアルキレングリコール修飾脂質を含有している、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。
  5. 　核酸を含有する、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。
  6. 　前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡである、請求項５に記載の脂質ナノ粒子。
  7. 　ＤＮＡヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含有する、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。
  8. 　前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域において、当該領域中の３０～６０％の塩基が前記ガイドＲＮＡ中の塩基と相補的である、請求項７に記載の脂質ナノ粒子。
  9. 　前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、
    　前記ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとからなる、請求項７に記載の脂質ナノ粒子。
  10. 　脂質成分と、ＤＮＡヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドとを含有し、
    　前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記ガイドＲＮＡの一部と対合可能な領域において、当該領域中の３０～６０％の塩基が前記ガイドＲＮＡ中の塩基と相補的である、脂質ナノ粒子。
  11. 　請求項１、請求項２、又は請求項１０に記載の脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
  12. 　遺伝子治療に用いられる、請求項１１に記載の医薬用組成物。
  13. 　請求項１、請求項２、又は請求項１０に記載の脂質ナノ粒子であって、肝臓細胞内又は脾臓細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した脂質ナノ粒子を、被験動物（但し、ヒトを除く）へ投与し、前記被験動物の肝臓内又は脾臓内で前記外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子の発現方法。
  14. 　請求項１０に記載の脂質ナノ粒子を細胞内へ導入する、ゲノム編集方法。
  15. 　下記の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式（Ｉ）中、ａは３～５の整数を示し；ｂは０又は１を示し；Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して下記一般式（Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式（Ａ）中、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立して、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－１５アルキル基を示し；ｃは１～７の整数を示し：ｅは４～１２の整数を示す；ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに連結して環を形成していてもよい）
    で表される基を示し；Ｘは、下記一般式（Ｂ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（該Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基に置換されていてもよい）を示すが、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を形成してもよい）
    で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を示す〕
    で表される、ｐＨ感受性カチオン性脂質。
  16. 　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシ－１３－（（３－プロピルヘキサノイル）オキシ）トリデシル３－エチルヘプタン酸、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ブチルヘプタノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ペンチルオクタノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ヘキシルノナノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－ヘプチルデカノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（３－オクチルウンデカノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロヘプチルアセテート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロドデシルアセテート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（２－シクロペンタデシルアセテート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－エチルデカノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－プロピルウンデカノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－ブチルドデカノエート、
    　７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（６－ヘキシルドデカノエート、
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７－エチルウンデカノエート）、
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８－エチルドデカノエート）、
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８，１０，１０－トリメチルウンデカノエート）、
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７，９，９－トリメチルデカノエート）、
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（９，１１，１１－トリメチルドデカノエート）、
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（７，１１－ジメチルドデカノエート）、又は
    ７－（４－（ジプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイルビス（８，１２－ジメチルトリデカノエート）である、
    請求項１５に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質。
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