WO2024018762A1 - ｐＨ感受性カチオン性脂質及び脂質ナノ粒子 - Google Patents

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lipid
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悠介 佐藤
秀吉 原島
裕一 鈴木
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    • C07C237/08—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to a pH-sensitive cationic lipid comprising three hydrophobic chains and lipid nanoparticles containing the pH-sensitive cationic lipid.
  • the present invention claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-115015 filed in Japan on July 19, 2022, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Lipid nanoparticles are used as carriers to encapsulate fat-soluble drugs, siRNA (short interfering RNA), mRNA, and other nucleic acids and deliver them to target cells.
  • siRNA short interfering RNA
  • mRNA long interfering RNA
  • lipid nanoparticles that serve as carriers for efficiently delivering nucleic acids such as siRNA into target cells they are electrically neutral at physiological pH and become cationic in weakly acidic pH environments such as endosomes.
  • Lipid nanoparticles containing a changing pH-sensitive cationic lipid as a constituent lipid have been reported (Patent Document 1). Lipid nanoparticles, which are positively charged in the blood, cause nonspecific interactions with plasma proteins and are rapidly eliminated from the blood by the reticuloendothelial system.
  • lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipids as constituent lipids do not carry an electric charge under neutral conditions in the blood, but become positively charged under weakly acidic conditions in endosomes and are efficiently absorbed into endosomes. You can make an escape.
  • pH-sensitive cationic lipid for example, Jayaraman et al. developed DLin-MC3-DMA and achieved an ED 50 of 0.005 mg siRNA/kg in factor 7 (F7) knockdown in mouse liver (non-patent Reference 1).
  • the present inventors have also developed original pH-sensitive cationic lipids YSK05 and YSK13-C3, and achieved ED50 of 0.06 and 0.015 mg siRNA/kg, respectively, in F7 knockdown ( Non-patent documents 2-4).
  • the present inventors further proposed a pH-sensitive cationic lipid with two hydrocarbon chains such as 7-(4-(diisopropylamino)butyl)-7-hydroxytridecane-1,13-diyl dioleate (CL4H6).
  • CL4H6 pH-sensitive cationic lipid with two hydrocarbon chains
  • a compound having one hydrophilic group was also developed (Patent Document 1).
  • lipid nanoparticles containing nucleic acids there is a method based on an alcohol dilution method using a channel.
  • lipid nanoparticles with a diameter of about 30 nm can be manufactured with good reproducibility by using a microchannel with a built-in three-dimensional micromixer that can achieve instant mixing of two liquids (Non-Patent Document 5).
  • the present invention provides a pH-sensitive cationic lipid that can be easily synthesized in fewer steps without using organometallic reactions or relatively expensive raw materials, and lipid nanoparticles containing the pH-sensitive cationic lipid. With the goal.
  • Tris trishydroxymethylaminomethane
  • R 1 is a hydrocarbon group having 1 to 22 carbon atoms; the three R 1s in one molecule may be the same group or different groups.
  • Z 1 is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, which may be substituted with one hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a single bond
  • X is -N(R 2 ) (R 3 ), or a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (however, the group is bonded to Z 1 through a carbon atom, and on the ring there are 1 or 2 carbon atoms having 1 to 4 carbon atoms)
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, or one or two hydrogen atoms are a phenyl group, a pyrrolyl group, a pyrimidyl group, or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms which may be substituted with an indolyl group, and R 2 and R 3 are bonded to each
  • a pH-sensitive cationic lipid consisting of a compound represented by: [2] In the general formula (I), -Z 1 -X is any of the following formulas (H-1) to (H-8), (H-16) to (H-26), [1] pH-sensitive cationic lipid.
  • R 1 is the same as above.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to any one of [1] to [4] above, which is a compound represented by any one of the above. [6] It has a Tris skeleton, Fatty acid residues are bonded to each of the three oxygen atoms of the Tris skeleton, and the fatty acid residues have 1 to 22 carbon atoms in the hydrocarbon chain portion and have one or more unsaturated bonds.
  • the three fatty acid residues in one molecule may be the same group, or may be two or more different groups
  • a primary to tertiary amine is connected to one nitrogen atom of the tris skeleton via a carbonyl group or a carbonyl group followed by an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and the alkylene group is may be substituted with a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • a pH-sensitive cationic lipid consisting of a compound with a pKa of 4.0 to 9.0.
  • a method for producing a pH-sensitive cationic lipid comprising producing a pH-sensitive cationic lipid comprising a compound.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 22 carbon atoms or an alkenyl group having 2 to 22 carbon atoms]
  • Z 1 is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, which may be substituted with one hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a single bond; N(R 2 )(R 3 ), or a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (however, the group is bonded to Z 1 through a carbon atom, and the ring has 1 or 2 carbon atoms) (optionally substituted with 1 to 4 hydrocarbon groups or amide groups);
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, or one or two hydrogen atoms are a phenyl group, a pyrrolyl group, is a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms that may be substituted with a group, a pyrimidyl group, or an indolyl group, and R 2 and
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, or one or two hydrogen atoms are a phenyl group, a pyrrolyl group, a pyrimidyl group, or an indolyl group.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 22 carbon atoms or an alkenyl group having 2 to 22 carbon atoms; in formula (I') , R 1 are the same as above, and the three R 1s in one molecule may be the same group or different groups]
  • lipid nanoparticle according to any one of [9] to [11] above, which contains a nucleic acid.
  • nucleic acid is siRNA, mRNA, or plasmid DNA.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient lipid nanoparticles containing the pH-sensitive cationic lipid according to any one of [1] to [6] above.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient lipid nanoparticles containing the pH-sensitive cationic lipid and nucleic acid according to any one of [1] to [6] above.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention is relatively easy to synthesize and is suitable for large-scale synthesis. Therefore, the pH-sensitive cationic lipid is useful as a constituent lipid of lipid nanoparticles used as an active ingredient of pharmaceuticals.
  • FIG. 2 is a plot diagram in which the Rf value of each lipid is plotted against the apparent pKa value in Test Example 1.
  • Figure 1 (A) shows the TLC results using dichloromethane:methanol (9:1) as the mobile phase
  • Figure 1 (B) shows the TLC results using dichloromethane: methanol (19:1) as the mobile phase.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles were administered in Example 11.
  • FIG. 1 shows the TLC results using dichloromethane:methanol (9:1) as the mobile phase
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles were administered in Example 11.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 12.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 13.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 14.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 12.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 15.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 16.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 17.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 18.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring Fluc activity (RLU/mg protein) in each tissue of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 19. This is an imaging image obtained by measuring the luciferase-derived luminescence intensity of the entire mouse to which each FlucmRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 20.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the tumor volume over time in mice to which OvamRNA-loaded lipid nanoparticles were intravenously administered 7 and 10 days after tumor cell inoculation in Example 21.
  • FIG. 12 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the livers of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 12 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the lungs of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the brains of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 12 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the hearts of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the lungs of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the brains of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the muscles of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 33.
  • FIG. 12 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered in Example 34.
  • Example 35 FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with a DSPC content of 3 mol% (in the figure, "DSPC-3") and FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with a DSPC content of 15 mol% (in the figure, "DSPC-15”). 20(A)), and a diagram (FIG.
  • Example 36 measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) in the liver and spleen of wild type mice and ApoE-deficient mice to which Flucm RNA-loaded lipid nanoparticles with a DSPC content of 3 mol% or 15 mol% were administered were shown. It is a diagram.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of measuring the fluorescence intensity of DiD in spleens into which DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with different DSPC contents were incorporated, separately for each cell type, in Example 37.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of measuring the fluorescence intensity of DiD in spleens into which DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with different DSPC contents were incorporated, separately for each cell type, in Example 37.
  • FIG. 12 is a diagram showing the measurement results of Fluc activity (RLU/mg protein) of splenic B cells of mice to which Flucm RNA-loaded lipid nanoparticles with various DSPC contents were administered in Example 38.
  • DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with a DSPC content of 3 mol% or 15 mol% were incubated with untreated serum and EDTA-free conditions, untreated serum with EDTA-added conditions, or inactivated serum and EDTA-added conditions.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of the fluorescence intensity of DiD in primary B cells taken up under EDTA-free conditions.
  • Example 40 the results of measuring the DiD fluorescence intensity of B cells, MZB cells, and FOB cells of mice to which DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with a DSPC content of 3 mol % or 15 mol % were administered are shown. It is a diagram.
  • X1 to X2 (X1 and X2 are real numbers satisfying X1 ⁇ X2)" means “more than or equal to X1 and less than or equal to X2.”
  • C X3-X4 (X3 and X4 are integers satisfying X3 ⁇ X4)” means "the number of carbon atoms is X3 or more and X4 or less”.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention is a compound in which a hydrocarbon chain is bonded to each of the three hydroxy groups of Tris, and one hydrophilic group is bonded to the amino group of Tris. It is a compound comprising three hydrocarbon chains and a hydrophilic part, and because of its structural similarity, it has a high affinity with lipids such as phospholipids, and is suitable as a constituent lipid of lipid nanoparticles.
  • a fatty acid residue is bonded to each of the three oxygen atoms of the Tris skeleton, and a primary to tertiary amine is bonded to one nitrogen atom of the Tris skeleton.
  • a carbonyl group or a compound in which a carbonyl group is linked to a carbonyl group followed by an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.
  • One nitrogen atom of the tris skeleton forms an amide bond with the carbonyl group connected thereto.
  • the "tris skeleton” means a structure in which one hydrogen atom is removed from each of the three hydroxy groups and amino groups of trishydroxymethylaminomethane.
  • the three fatty acid residues bonded to the Tris skeleton have 1 to 22 carbon atoms in the hydrocarbon chain portion, and may have one or more unsaturated bonds. Further, the plural fatty acid residues present in one molecule may be the same type of group, or may be two or more different types of groups. In the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention, it is preferable that a plurality of fatty acid residues in one molecule are all the same type of group.
  • One nitrogen atom of the tris skeleton and the amine are connected through a carbonyl group, or through a carbonyl group followed by an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and the alkylene group connected to the carbonyl group is It may be substituted with one hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the groups listed for X below can be used as the amine.
  • the pKa of the compound depends on the structure of the terminal amine, and is preferably about 4.0 to 9.0, preferably about 4.5 to 8.5, more preferably about 5.0 to 8.5. be.
  • pH-sensitive cationic lipid is a compound represented by the following general formula (I).
  • R 1 is a hydrocarbon group having 1 to 22 carbon atoms (C 1-22 hydrocarbon group).
  • the C 1-22 hydrocarbon group may be linear or branched.
  • the hydrocarbon group may be an alkyl group or an alkenyl group.
  • the alkenyl group may be a group having one unsaturated bond, a group having two unsaturated bonds, or a group having three unsaturated bonds.
  • R 1 is a C 1-22 alkyl group
  • the alkyl group is Methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group; n-pentyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 3-methylbutyl group, 1-ethylpropyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 2,2-dimethylpropyl group; n-hexyl group, 1-methylpentyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 4-methylpentyl group, 1-ethylbutyl group, 1,1-dimethylbutyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 1,2-dimethylbutyl group, 1-methyl-2,2-dimethylbutyl group; n-heptyl group
  • R 1 is a C 2-22 alkenyl group
  • the alkenyl group is one in which one to three of the saturated bonds between carbon molecules in the group listed as the C 2-22 alkyl group are replaced with unsaturated bonds.
  • the following groups are mentioned.
  • the three R 1s in one molecule may be the same group or different groups.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention from the viewpoint of ease of synthesis and quality stability, it is preferable that all three R 1 's in one molecule are the same group.
  • R 1 is preferably a linear C 1-22 alkyl group or a linear C 2-22 alkenyl group, and is preferably a linear C 15- More preferably, it is a 22 alkyl group or a linear C 15-22 alkenyl group.
  • three R 1's in one molecule are n-pentadecyl group, n-hexadecyl group, n-heptadecyl group, n-octadecyl group, n-nonadecyl group, n-icosyl group, n-henicosyl group, n-docosyl group, n-pentadecenyl group, n-hexadecenyl group, n-heptadecenyl group, n-octadecenyl group, n-nonadecenyl group, n-icosenyl group, n-henicosenyl group, It is more preferable that they are the same kind of groups or mutually different kinds of groups selected from the group consisting of n-docosenyl group, and all three R 1s present in one molecule are n-pentadecyl group, n-hexadec
  • Z 1 is a C 1-6 alkylene group optionally substituted with one hydroxy group or a single bond.
  • the C 1-6 alkylene group may be linear or branched.
  • the C 1-6 alkylene group includes methylene group, ethylene group, 1-methylmethylene group, 1-hydroxymethylmethylene group, n-propylene group, 1-methylethylene group, 1-hydroxymethylethylene group, 2-methyl Ethylene group, n-butylene group, 1-methylpropylene group, 1-hydroxymethylpropylene group, 2-methylpropylene group, 3-methylpropylene group, 1-ethylethylene group, 2-ethylethylene group, n-pentylene group, 1-methylbutylene group, 2-methylbutylene group, 3-methylbutylene group, 4-methylbutylene group, 1-ethylpropylene group, 2-ethylpropylene group, 3-ethylpropylene group, n-hexylene group, 1-methyl Examples include pentylene group, 2-methylpentylene group,
  • Z 1 is a methylene group, an ethylene group, an n-propylene group, a 1-hydroxymethylmethylene group, a 1-methylmethylene group, a 1-methylethylene group, a 1-hydroxymethyl
  • Z 1 is an ethylene group or a 2-methylethylene group
  • Z 1 is a methylene group, an ethylene group, an n-propylene group, or a 1-hydroxymethylmethylene group are more preferred.
  • X is -N(R 2 )(R 3 ) or a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group.
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group represented by X is bonded to Z 1 through a carbon atom.
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, or one or two hydrogen atoms are phenyl groups.
  • a C 1-4 hydrocarbon group which may be substituted with a pyrrolyl group, a pyrimidyl group, or an indolyl group.
  • the C 1-4 hydrocarbon group may be a linear or branched C 1-4 alkyl group, or a linear or branched C 2-4 alkenyl group. .
  • the C 1-4 alkyl groups include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group. Examples include groups.
  • R 2 and R 3 are C 2-4 alkenyl groups, the C 2-4 alkenyl groups include vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-methylvinyl group, 2-methyl-1 -propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, etc.
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom or a direct
  • the compound is a chain or branched C 1-4 alkyl group, and more preferably, the compound where R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom or a linear C 1-4 alkyl group. More preferred are compounds in which R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, or an n-propyl group.
  • R 2 and R 3 may be bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle .
  • Examples of the 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle formed by R 2 and R 3 bonding to each other include 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, and 1-piperazinyl group. .
  • the formed 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle When X is -N(R 2 )(R 3 ) and R 2 and R 3 are bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle, the formed 5- to 7-membered non-aromatic In the aromatic heterocycle, one or two hydrogen atoms in the ring may be substituted with a C 1-4 hydrocarbon group, an amide group, or a nitrogen-containing cyclic group.
  • the C 1-4 hydrocarbon group is preferably a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group.
  • the nitrogen-containing cyclic group is preferably a group derived from a ring in which a carbonyl group is adjacent to the nitrogen atom, such as benzo[d]oxazol-2(3H)-one, 1,3-dihydro-2H- Benzo[d]imidazol-2-one, indolin-2-one, 1,3-dihydro-2H-pyrrol-2-one, 1,3-dihydro-2H-imidazol-2-one, oxazol-2(3H) -one, oxazolidin-2-one, imidazolidin-2-one, pyrrolidin-2-one, 1,4-dihydroisoquinolin-3(2H)-one, 3,4-dihydro-2H-benzo[e]
  • the 5- to 7-membered non-aromatic One of the carbon atoms constituting the heterocycle may be a carbon atom constituting another nitrogen-containing cyclic group.
  • the other nitrogen-containing cyclic group is preferably a group derived from a ring in which a carbonyl group is adjacent to a nitrogen atom, and specific examples thereof include the same groups as mentioned above.
  • heteroatom contained in the heterocyclic group examples include a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc. .
  • the number of heteroatoms constituting the heterocycle in the heterocyclic group may be one, or two or more of the same or different heteroatoms.
  • the heterocycle in the heterocyclic group may be a saturated heterocycle and may contain one or more double bonds, but the heterocycle does not become an aromatic ring.
  • X is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group
  • the heterocyclic group is bonded to Z 1 through a carbon atom, and on the ring there are 1 or 2 C 1-4 hydrocarbon groups or amide groups.
  • the group may be substituted.
  • the C 1-4 hydrocarbon group may be a linear or branched C 1-4 alkyl group, or a linear or branched C 2-4 alkenyl group. .
  • linear or branched C 1-4 alkyl group and the linear or branched C 2-4 alkenyl group those listed above can be used.
  • -Z 1 -X is preferably a group represented by any of the following formulas (H-1) to (H-8), (H-16), and (H-17).
  • -Z 1 -X is also preferably a group of any of the following formulas (H-18) to (H-26).
  • black circles represent bonds.
  • -Z 1 -X represents formulas (H-1) to (H-8), (H-16), and (H-17).
  • a compound is one of the following groups, and in the general formula (I), R 1 is a linear C 1-22 alkyl group or a linear C 2-22 alkenyl group, and -Z 1 - Compounds in which X is any group of formulas (H-1) to (H-8), (H-16), and (H-17) are more preferred, and in general formula (I), R 1 is is a linear C 15-22 alkyl group or a linear C 15-22 alkenyl group, and -Z 1 -X is a formula (H-1) to (H-8), (H-16), and (H-17) is more preferable, and in the general formula (I), R 1 is a linear C 15-22 alkyl group or a linear C 15-22 alkenyl group.
  • all three R 1s present in one molecule are the same group, and -Z 1 -X is a group of formulas (H-1) to (H-8), (H-16), and (H-17 ) is even more preferred.
  • -Z 1 -X is a group of formulas (H-1) to (H-8), (H-16), and (H-17 ) is even more preferred.
  • all three R1s present in one molecule are n-pentadecyl group, n-hexadecyl group, or n-heptadecyl group.
  • n-octadecyl group n-nonadecyl group, n-icosyl group, n-henicosyl group, n-docosyl group, n-pentadecenyl group, n-hexadecenyl group, n-heptadecenyl group, n-octadecenyl group, n-nonadecenyl group , n-icosenyl group, n-henicosenyl group, and n-docosenyl group, and -Z 1 -X is a formula (H-1) to (H-8), (H-16) , and (H-17) are particularly preferred.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention is preferably a compound in which -Z 1 -X in general formula (I) is any group of formulas (H-18) to (H-26);
  • R 1 is a linear C 1-22 alkyl group or a linear C 2-22 alkenyl group
  • -Z 1 -X is a group of formulas (H-18) to (H-26 ) is more preferable
  • R 1 is a linear C 15-22 alkyl group or a linear C 15-22 alkenyl group
  • -Z Compounds in which 1 -X is any group of formulas (H-18) to (H-26) are more preferred, and in general formula (I), R 1 is a linear C 15-22 alkyl group or a straight chain C 15-22 alkyl group.
  • pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I) compounds represented by the following general formulas (I-1) to (I-8), (I-16), and (I-17) are Can be mentioned.
  • R 1 is the same as in general formula (I).
  • the apparent pKa of each compound is also shown.
  • X is a hydrophilic portion, and the structure of this portion affects the pKa of the pH-sensitive cationic lipid.
  • Examples of the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I) include compounds represented by the following general formulas (I-18) to (I-26). In the formula, R 1 is the same as in general formula (I).
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention a hydrocarbon chain consisting of three R1s extends from one sp3 carbon, and a hydrophilic group consisting of X is further attached to the sp3 carbon via Z1 . connected. Therefore, the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention can take an orientation in which the hydrophilic group consisting of X is sterically shielded by the three hydrocarbon chains consisting of R1 .
  • the pH-sensitive cationic lipids described in Patent Document 1, such as CL4H6, have two hydrophobic chains and a hydrophilic group. It's a positional relationship.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention can be expected to have different properties from conventional pH-sensitive cationic lipids such as CL4H6 when used as a constituent lipid of lipid nanoparticles.
  • the pKa of the pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) is not particularly limited, but is, for example, about 4.0 to 9.0, preferably about 4.5 to 8.5, more preferably 5.0 to It is preferable to select the type of each substituent so as to give a pKa in this range.
  • the pKa of the pH-sensitive cationic lipid is particularly influenced by -Z 1 -X in general formula (I).
  • -Z 1 -X in general formula (I) is set to a group close to the desired pKa from among formulas (H-1) to (H-8) and (H-16) to (H-26). By this, a pH-sensitive cationic lipid with a desired pKa can be obtained.
  • the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention is, for example, a compound represented by the following general formula (A) (hereinafter sometimes referred to as "compound (A)”), a compound represented by the following general formula (B) (hereinafter sometimes referred to as “compound (B)”) and trishydroxymethylaminomethane.
  • R 1 in general formula (A) is the same as R 1 in general formula (I).
  • Z 1 and X in general formula (B) are the same as Z 1 and X in general formula (I), respectively.
  • the carboxylic acid group of compound (A) and the hydroxy group of tris are dehydrated and condensed to form an ester bond, and the carboxylic acid group of compound (B) and the amino group of tris are further dehydrated and condensed to form an amide bond.
  • a pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) is synthesized.
  • the dehydration condensation reaction between the carboxylic acid group of compound (A) and the hydroxy group of tris can be generally carried out under the same reaction conditions as the dehydration condensation reaction when forming an esterified product of carboxylic acid and alcohol.
  • the dehydration condensation reaction between the carboxylic acid group of compound (B) and the amino group of tris can be generally carried out under the same reaction conditions as the dehydration condensation reaction when forming an amidated product of a carboxylic acid and an amine. That is, the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I) can be synthesized relatively easily by a general dehydration condensation reaction by using Tris as a linker.
  • Compound (A) is reacted with Tris to perform a dehydration condensation reaction with the hydroxyl group of Tris, and then compound (B) is reacted with the obtained esterified product to form a reaction with the amino group derived from Tris.
  • a pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) can be synthesized.
  • the compound (B) is reacted with Tris to perform a dehydration condensation reaction with the amino group of Tris, and then the resulting amidated product is reacted with the compound (A) to form a hydroxyl group derived from Tris.
  • the pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) can also be synthesized by performing a dehydration condensation reaction with.
  • the compounds in which Z 1 is an ethylene group and X is -N(R 2 )(R 3 ) are For example, it can be synthesized by a simpler synthesis method using N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide.
  • -Z 1 -X in general formula (I) is represented by formula (H-1), (H-4), (H-5 ), (H-16), (H-17), (H-21), (H-22), (H-23), (H-24), (H-25), (H-26)
  • One example is a compound.
  • a secondary amine compound represented by the following general formula (C) (hereinafter sometimes referred to as “compound (C)”) was added to N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide. After that, it can be produced by condensing the obtained compound represented by general formula (D) (hereinafter referred to as “compound (D)”) and compound (A).
  • R 2 and R 3 in general formula (I'), general formula (C) and general formula (D) are the same as R 2 and R 3 in X of general formula (I), respectively.
  • the addition reaction of compound (C) to the unsaturated bond in N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide is generally carried out under the same reaction conditions as the addition reaction when adding a secondary amine to an alkene. be able to.
  • the dehydration condensation reaction between the carboxylic acid group of compound (A) and the hydroxyl group of compound (D) is generally carried out under the same reaction conditions as the dehydration condensation reaction when forming an esterified product of carboxylic acid and alcohol. Can be done. That is, by using N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I') can be produced relatively easily by a general addition reaction and dehydration condensation reaction. Can be synthesized.
  • the pH-sensitive cationic lipid represented by general formula (I) can be easily produced, for example, by the method specifically shown in the Examples of this specification. By referring to this production method and appropriately selecting raw material compounds, reagents, reaction conditions, etc., those skilled in the art can easily produce any lipid falling within the scope of general formula (I).
  • the lipid nanoparticles according to the present invention have the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention as a constituent lipid.
  • the number of pH-sensitive cationic lipids according to the present invention constituting the lipid nanoparticles according to the present invention may be one type or two or more types.
  • the amount of the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention is determined from among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles. , means the total amount of lipid molecules corresponding to the pH-sensitive cationic lipid according to the invention.
  • the proportion of the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention in the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles is not particularly limited.
  • the ratio of the amount of the pH-sensitive cationic lipids of the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles ([the amount of pH-sensitive cationic lipids of the present invention (mol) )]/([Amount (mol) of total lipids constituting lipid nanoparticles]) x 100%) is preferably 5 mol% or more, more preferably 10 mol% or more, and even more preferably 20 mol% or more.
  • the ratio of the amount of the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles in the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably 90 mol% or less, and 80 mol% or less. is more preferable, and even more preferably 70 mol% or less.
  • lipids other than the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention can be lipids that are generally used when forming liposomes.
  • examples of such lipids include phospholipids, sterols, glycolipids, and saturated or unsaturated fatty acids. These can be used alone or in combination of two or more.
  • phospholipids examples include glycerophospholipids such as phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, cardiolipin, plasmalogen, ceramide phosphorylglycerol phosphate, and phosphatidic acid; sphingomyelin, ceramide phosphorylglycerol, and ceramide phosphorylethanolamine. and sphingophospholipids; Furthermore, phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin can also be used.
  • glycerophospholipids such as phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, cardiolipin, plasmalogen, ceramide phosphorylglycerol phosphate, and phosphati
  • the fatty acid residues in glycerophospholipids and sphingophospholipids are not particularly limited, but examples include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 24 carbon atoms, and saturated or unsaturated fatty acid residues having 14 to 20 carbon atoms. Fatty acid residues are preferred. Specifically, mention may be made of acyl groups derived from fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, and lignoceric acid. Can be done. When these glycerolipids or sphingolipids have two or more fatty acid residues, all the fatty acid residues may be the same group or may be mutually different groups.
  • sterols examples include animal-derived sterols such as cholesterol, cholesterol succinate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, and dihydrocholesterol; plant-derived sterols (phytosterols) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol; Examples include sterols derived from microorganisms such as thymosterol and ergosterol.
  • glycolipids examples include glyceroglycolipids such as sulfoxyribosylglyceride, diglycosyldiglyceride, digalactosyldiglyceride, galactosyldiglyceride, and glycosyldiglyceride; glycosphingolipids such as galactosylcerebroside, lactosylcerebroside, and ganglioside; and the like. It will be done.
  • saturated or unsaturated fatty acids include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms, such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • the constituent lipids of the lipid nanoparticles according to the present invention preferably include neutral lipids, more preferably phospholipids or sterols, and preferably include sterols. is more preferable, and even more preferably contains cholesterol.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention preferably contain a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid component.
  • Polyalkylene glycol is a hydrophilic polymer, and by constructing lipid nanoparticles using polyalkylene glycol-modified lipids as lipid membrane-constituting lipids, the surface of the lipid nanoparticles can be modified with polyalkylene glycol. Surface modification with polyalkylene glycol may improve the stability of lipid nanoparticles, such as their retention in blood.
  • polyethylene glycol for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol, etc.
  • the molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.
  • stearylated polyethylene glycol eg, stearic acid PEG45 (STR-PEG45), etc.
  • stearylated polyethylene glycol can be used to modify lipids with polyethylene glycol.
  • the ratio of the polyalkylene glycol-modified lipid to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles according to the present invention is determined by the selectivity of the pH-sensitive cationic lipid according to the present invention to the target tissue, specifically, according to the present invention.
  • the amount is not particularly limited as long as it does not impair target tissue-specific gene expression activity when lipid nanoparticles are used as gene expression carriers.
  • the ratio of polyalkylene glycol-modified lipids to the total amount of lipids constituting lipid nanoparticles is preferably 0.5 to 3 mol%.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be subjected to appropriate surface modification, etc., if necessary.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can have improved blood retention by modifying the surface with a hydrophilic polymer or the like.
  • surface modification can be performed by using lipids modified with these modifying groups as constituent lipids of lipid nanoparticles.
  • examples of lipid derivatives for improving blood retention include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerol phospholipid derivatives, etc.
  • You can also use In addition to polyalkylene glycol, we also use dextran, pullulan, Ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, and divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer as hydrophilic polymers to increase blood retention.
  • amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan, etc. can also be used for surface modification.
  • the lipid nanoparticles can be surface-modified with an oligosaccharide compound having three or more saccharides.
  • the type of oligosaccharide compound having three or more saccharides is not particularly limited, but for example, an oligosaccharide compound having about 3 to 10 sugar units bonded to it can be used, preferably about 3 to 6 sugar units bonded to it. Oligosaccharide compounds can be used. Among these, oligosaccharide compounds that are glucose trimers or hexamers can be preferably used, and oligosaccharide compounds that are glucose trimers or tetramers can be used more preferably.
  • isomaltotriose, isopanose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc. can be suitably used. More preferred are triose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose. Particularly preferred is maltotriose or maltotetraose, most preferred is maltotriose.
  • the amount of surface modification of lipid nanoparticles with oligosaccharide compounds is not particularly limited, but for example, it is about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably about 5 to 10 mol%, based on the total lipid amount. It is.
  • the method of surface-modifying lipid nanoparticles with oligosaccharide compounds is not particularly limited, but for example, liposomes (International Publication No. 2007/102481) in which lipid nanoparticles are surface-modified with monosaccharides such as galactose or mannose are known. Therefore, the surface modification method described in this publication can be adopted.
  • liposomes International Publication No. 2007/102481
  • monosaccharides such as galactose or mannose
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be provided with any one or more functions such as, for example, a temperature change sensitive function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitive function.
  • a temperature change sensitive function e.g., a thermosensitive function
  • a membrane permeation function e.g., a membrane permeation function
  • a gene expression function e.g., a gene expression function
  • a pH sensitive function e.g., a pH sensitive function
  • the lipid nanoparticles according to the present invention include one or more kinds selected from the group consisting of an antioxidant such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene, a charged substance, and a membrane polypeptide. It may contain substances such as Examples of charged substances that impart a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine, and examples of charged substances that impart a negative charge include dicetyl phosphate and cholesteryl hemis. Cusinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and the like can be mentioned. Examples of membrane polypeptides include membrane superficial polypeptides and integral membrane polypeptides. The blending amount of these substances is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the size of the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably 400 nm or less in average particle size, and preferably 300 nm or less in order to easily achieve high delivery efficiency to target cells in vivo. It is more preferable that the average particle diameter is 200 nm or less, even more preferably 150 nm or less.
  • the average particle diameter of lipid nanoparticles means the number average particle diameter measured by dynamic light scattering (DLS). Measurement by dynamic light scattering can be carried out in a conventional manner using a commercially available DLS device or the like.
  • the polydispersity index (PDI) of the lipid nanoparticles according to the present invention is about 0.01 to 0.7, preferably about 0.01 to 0.6, and more preferably about 0.01 to 0.3.
  • the zeta potential may range from -50 mV to 5 mV, preferably from -10 mV to 5 mV.
  • the form of the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, but examples of forms dispersed in an aqueous solvent include unilamellar liposomes, multilamellar liposomes, spherical micelles, and amorphous layered structures.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are preferably unilamellar liposomes or multilamellar liposomes.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention preferably contain components to be delivered into target cells inside the particles covered with a lipid membrane.
  • the components that the lipid nanoparticles according to the present invention encapsulate inside the particles are not particularly limited as long as they have a size that can be encapsulated.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can encapsulate arbitrary substances such as nucleic acids, saccharides, peptides, low molecular compounds, and metal compounds.
  • Nucleic acids are preferred as the components to be included in the lipid nanoparticles according to the present invention.
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or an analog or derivative thereof (eg, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.).
  • the nucleic acid to be encapsulated in the lipid nanoparticle according to the present invention may be a single-stranded nucleic acid, a double-stranded nucleic acid, a linear shape, or a circular shape.
  • the nucleic acid to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention preferably contains a foreign gene for expression within the target cell, and is a nucleic acid that functions to express the foreign gene within the cell by being taken into the cell. It is more preferable that there be.
  • the foreign gene may be a gene originally contained in the genomic DNA of the target cell, or may be a gene not contained in the genomic DNA.
  • Examples of such nucleic acids include gene expression vectors containing a nucleic acid consisting of a base sequence encoding a gene of interest to be expressed.
  • the gene expression vector may exist as an extrachromosomal gene in the introduced cell, or may be incorporated into genomic DNA by homologous recombination.
  • the gene expression vector to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and vectors commonly used in gene therapy and the like can be used.
  • the gene expression vector to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably a nucleic acid vector such as a plasmid vector.
  • the plasmid vector may remain circular, or may be previously cut into linear forms and encapsulated in the lipid nanoparticles of the present invention.
  • Gene expression vectors can be designed by conventional methods using commonly used molecular biological tools based on the base sequence information of the gene to be expressed, and can be manufactured by various known methods. .
  • the nucleic acid encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is a functional nucleic acid that controls the expression of a target gene present in a target cell.
  • the functional nucleic acids include antisense oligonucleotides, antisense DNA, antisense RNA, siRNA, microRNA, mRNA, and the like.
  • it may be plasmid DNA (pDNA) that serves as an siRNA expression vector for expressing siRNA in cells.
  • the siRNA expression vector can be prepared from a commercially available siRNA expression vector, and may be modified as appropriate.
  • the nucleic acid to be encapsulated in the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably mRNA or pDNA, since it has particularly good selectivity to in-vivo tissues.
  • the method for producing lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be adopted.
  • all lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and a lipid film is formed by drying under reduced pressure using an evaporator or spray drying using a spray dryer, and then the components are encapsulated in the lipid nanoparticles.
  • it can be produced by adding an aqueous solvent containing a nucleic acid or the like to the dried above-mentioned mixture, and further emulsifying it using an emulsifying machine such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifying machine, a high-pressure injection emulsifying machine, etc.
  • liposomes can also be produced by well-known methods such as reverse phase evaporation. If it is desired to control the size of lipid nanoparticles, extrusion (extrusion filtration) may be performed under high pressure using a membrane filter with uniform pore sizes.
  • composition of the aqueous solvent is not particularly limited, but examples include buffer solutions such as phosphate buffer, citrate buffer, and phosphate buffered saline, physiological saline, and medium for cell culture. Can be done.
  • aqueous solvents can stably disperse lipid nanoparticles, but they also contain monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and melesinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars (aqueous solutions) such as sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol, as well as glycerin, diglycerin, and polyglycerin.
  • monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose, lactose, sucrose, cellobios
  • polyhydric alcohol such as propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, 1,3-butylene glycol, etc. may be added.
  • polyhydric alcohol aqueous solution
  • the pH of the aqueous solvent should be set from weakly acidic to around neutral (about pH 3.0 to 8.0), and/or dissolved oxygen should be removed by nitrogen bubbling, etc. is desirable.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can also be produced by an alcohol dilution method using a channel.
  • a solution in which a lipid component is dissolved in an alcohol solvent and a solution in which a water-soluble component to be included in lipid nanoparticles is dissolved in an aqueous solvent are introduced through separate flow channels, and the two are combined.
  • This is a method for producing lipid nanoparticles.
  • baffles baffles having a constant width relative to the channel width are alternately arranged from both sides.
  • aqueous solvent used in the alcohol dilution method those mentioned above can be used.
  • aqueous dispersion of lipid nanoparticles When the obtained aqueous dispersion of lipid nanoparticles is freeze-dried or spray-dried, for example, monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, Stability can be improved by using sugars (aqueous solutions) such as disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and melesinose, polysaccharides such as cyclodextrin, and sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol.
  • sugars aqueous solutions
  • sugars such as disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and melesinose, poly
  • the above-mentioned saccharides, glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether Stability may be improved by using polyhydric alcohols (aqueous solutions) such as , diethylene glycol monoalkyl ether, and 1,3-butylene glycol.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention function as gene expression carriers to target tissues. By encapsulating a foreign gene to be expressed in a target cell in the lipid nanoparticles of the present invention and administering it to a test animal, the foreign gene is expressed in the target tissue of the test animal.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can also encapsulate medicinal ingredients other than nucleic acids and introduce the medicinal ingredients into target tissues, and are also useful as drug delivery carriers. Therefore, the lipid nanoparticles according to the present invention are useful as active ingredients of pharmaceutical compositions used for various treatments including gene therapy.
  • pH-sensitive cationic lipids According to the present invention, compounds with high tissue specificity for the liver are used as constituent lipids, and other constituent lipids are also selected from lipids that are easily taken up into the liver, thereby achieving liver selectivity. It is possible to produce lipid nanoparticles with high Similarly, by using a compound with high tissue specificity to the spleen among the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention as the constituent lipid, and selecting and using other constituent lipids that are easily taken up into the spleen, Lipid nanoparticles with high spleen selectivity can be produced.
  • lipid nanoparticles with high liver selectivity or lipid nanoparticles with high spleen selectivity When a gene expression vector encapsulated in such lipid nanoparticles with high liver selectivity or lipid nanoparticles with high spleen selectivity is administered to an individual animal, the gene expression vector encapsulated in the lipid nanoparticles is transferred to other lipid nanoparticles. It is selectively expressed in the liver and spleen compared to other organs.
  • lipid nanoparticles of the present invention when siRNA expression vectors are encapsulated in lipid nanoparticles with high liver selectivity or lipid nanoparticles with high spleen selectivity, when administered to an individual animal, the lipid nanoparticles
  • the encapsulated siRNA expression vector is selectively expressed in the liver and spleen compared to other organs, and the expression of the gene targeted by the expression vector is suppressed.
  • Lipid nanoparticles with high liver selectivity have a content ratio of phosphatidylcholine in the total constituent lipids of 7 mol% or less, preferably 2 to 7 mol%, more preferably 3 to 5 mol%, and an apparent pKa of 7.5 or less. , preferably 7.2 or less.
  • a lipid having a pKa of 7.5 or less, preferably 6.0 to 7.4 may be used as a constituent lipid. It can be prepared by
  • Lipid nanoparticles with high spleen selectivity have a content ratio of phosphatidylcholine in the total constituent lipids of 8 mol% or more, preferably 10 mol% or more, more preferably 10 to 25 mol%, and still more preferably 10 to 20 mol%, and Among the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention, those whose constituent lipids are lipids with a pKa of about 6.2 to 6.6 can be mentioned.
  • -Z 1 -X corresponds to the general formula (H-5), (H-16 ), or (H-4) as a constituent lipid.
  • Lipid nanoparticles in which phosphatidylcholine accounts for a relatively large proportion of the total constituent lipids and whose constituent lipids are lipids with a pKa of about 6.2 to 6.6 among the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention Among the cells that make up the cell, it has particularly high selectivity for B cells and dendritic cells.
  • the content ratio of phosphatidylcholine to the total constituent lipids is 5 mol% or more, preferably 10 mol% or more, more preferably 10 to 25 mol%, even more preferably 10 to 20 mol%.
  • lipids having a pKa of about 6.2 to 6.6, preferably -Z 1 -X have the general formulas (H-5) and (H-16 ), or (H-4) as a constituent lipid.
  • the content ratio of phosphatidylcholine to the total constituent lipids is 3 mol% or more, preferably 5 mol% or more, more preferably 5 to 25 mol%, and even more preferably 5 to 20 mol%.
  • the lipids having a pKa of about 6.2 to 6.6, preferably -Z 1 -X correspond to the general formulas (H-5) and (H-16). , or (H-4) as a constituent lipid.
  • Lipid nanoparticles for use as carriers with lung as the target tissue include those having an apparent pKa of 7.5 or more, preferably 7.5 to 8.5.
  • -Z 1 -X is represented by the general formula (H-19), (H-18), or (H-2). , (H-3), or (H-4) as a constituent lipid.
  • lipid nanoparticles for use as a carrier with the brain as the target tissue for example, among the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention, -Z 1 -X is the above-mentioned general formula (H-4). Preferably, it is a constituent lipid.
  • lipid nanoparticles to be used as a carrier with the heart as the target tissue for example, among the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention, -Z 1 -X has the above general formula (H-19), (H- 4), (H-16), or (H-7) as a constituent lipid.
  • lipid nanoparticles to be used as a carrier whose target tissue is muscle for example, among the pH-sensitive cationic lipids according to the present invention, -Z 1 -X has the above general formula (H-18), (H- 19), (H-4), or (H-16) as a constituent lipid.
  • the animal to which the lipid nanoparticles according to the present invention are administered is not particularly limited, and may be a human or a non-human animal.
  • non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and birds such as chickens, quail, and ducks.
  • the administration route for administering the lipid nanoparticles according to the present invention to animals is not particularly limited, but includes intravenous administration, enteral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, and nasal administration. Parenteral administration such as intrapulmonary administration is preferred.
  • YSK05 was synthesized by the method described in Non-Patent Document 2.
  • 7-(4-(dimethylamino)butyl)-7-hydroxytridecane-1,13-diyl dioleate (CL1H6), 7-(4-(diisopropylamino)butyl)-7-hydroxytridecane-1,13- Diyl dioleate (CL4H6) and 7-hydroxy 7-(4-((1-methylpiperidine-4-carbonyl)oxy)butyl)tridecane-1,13-diyl dioleate (CL15H6) are produced by the method described in Patent Document 1. The synthesized one was used.
  • CL4F6 (7-(4-(diisopropylamino)butyl)-13-((2-hexylnonanoyl)oxy)-7-hydroxytridecyl 2-hexyldecanoate) was synthesized in Comparative Synthesis Example 1 below. was used. 7-Hydroxy-7-(4-morpholinobutyl)tridecane-1,13-diyldioleate (CL7H6) was synthesized in Comparative Synthesis Example 2 described later.
  • SM-102 was manufactured by Cayman Chemical
  • ALC-0315 was manufactured by Ambeed
  • DLin-MC3-DMA (MC3) was manufactured by Selleck Biotech
  • cholesterol (Chol) was manufactured by SIGMA Aldrich.
  • 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DSPC
  • 1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPPC
  • 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- Phosphocholine POPC
  • 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DOPC
  • 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine POPE
  • 1,2-dioleoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine DOPE
  • methoxyethylene glycol 2000 modified 2-dimyristoyl-rac-glycerol PEG-DMG
  • methoxyethylene glycol 2000 modified 2-distearyl-rac-glycerol PEG -DSG
  • TLC Thin layer chromatography
  • mRNA encoding firefly luciferase (Fluc) (CleanCap FLuc mRNA, 5 moU)
  • mRNA encoding ovalbumin (OVA) Ova mRNA
  • lipid nanoparticles were prepared by an alcohol dilution method using a channel.
  • a microfluidic device "iLiNP” manufactured by Lilac Pharma
  • the flow rate of the device was controlled using a syringe pump (Harvard Apparatus). Specifically, first, 80 ⁇ L of an ethanol solution containing each lipid component at a predetermined molar ratio and adjusted to a total lipid concentration of 8 mM, and an acetate buffer (25 mM, pH 4.0) adjusted to a nucleic acid concentration of 55 ⁇ g/mL. 240 ⁇ L was sent into the microchannel, and the lipid nanoparticle solution discharged from the channel was collected.
  • the lipid nanoparticle solution was placed in a dialysis membrane (MWCO 12,000-14,000, manufactured by Spectrum Laboratories), and the outer aqueous phase was PBS (-) (pH 7.4) and dialyzed at 4°C for more than 2 hours. A lipid nanoparticle solution was collected from.
  • a microchannel iLiNP manufactured by Lilac Pharma
  • a built-in baffle mixer was used. Specifically, first, 13.75 ⁇ L of a 1 mg/mL mRNA solution was diluted to 250 ⁇ L with 25 mM acetate buffer (pH 4.0), and the solution was prepared as an RNA solution and dispensed into a 1 mL syringe (manufactured by HAMILTON). .
  • pH-sensitive cationic lipid/chol/DSPC/PEG-DSG 50/40/10/1.0 (mol%)
  • 200 ⁇ L of 10 mM pH-sensitive cationic lipid/ethanol solution and 200 ⁇ L of 10 mM cholesterol/ethanol solution 100 ⁇ L of 10 mM pH-sensitive cationic lipid/ethanol solution and 200 ⁇ L of 10 mM cholesterol/ethanol solution.
  • the lipid nanoparticle solution was pumped into the microchannel as described above, and the lipid nanoparticle solution discharged from the channel was collected.
  • the lipid nanoparticle solution was placed in a dialysis membrane (MWCO 12,000-14,000, manufactured by Spectrum Laboratories), and the outer aqueous phase was PBS (-) (pH 7.4), and dialyzed at 4°C for over 2 hours to remove ethanol. After removal and buffer exchange, the lipid nanoparticle solution was collected from the dialysis membrane.
  • encapsulation rate of lipid nanoparticles (encapsulation efficiency)> The encapsulation rate of lipid nanoparticles was determined by measuring the amount of encapsulated nucleic acid (mRNA) using Ribogreen (manufactured by Life Technologies), which is an RNA intercalator. The amount of mRNA was quantified based on a calibration curve created from serially diluted solutions of mRNA with known concentrations.
  • Ribogreen manufactured by Life Technologies
  • 10mM HEPES buffer (pH 7.4), 10w/v% Triton Triton(-) buffer was prepared by replacing TritonX-100 with 10mM HEPES buffer (pH 7.4).
  • the sample was added to a black 96-well plate for fluorescence measurement at 100 ⁇ L/well, and 100 ⁇ L/well of Triton (+) buffer or Triton ( ⁇ ) buffer was added.
  • TNS p-Toluenesulfonic acid
  • Lipid nanoparticles were administered to mice by intravenous administration using a 27G injection needle.
  • BALB/c 4-5 weeks old, female was used as the mouse unless otherwise specified.
  • lipid nanoparticles encapsulating Fluc mRNA were intravenously injected into BALB/c mice (female, 4 weeks old) at a dose of 0.01 mg mRNA/kg.
  • mice were euthanized and each tissue was collected, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C.
  • Tissues were homogenized with passive lysis buffer (Promega) using a bead-type cell disruptor (Micro Smash MS-100R, TOMY Seiko). Tissue debris was removed by centrifugation and the supernatant was collected.
  • Fluc activity in the supernatant was measured using a luciferase assay system (E1500, Promega) according to the manufacturer's protocol. Luminescence was measured using a luminometer (Luminescencer-PSN, manufactured by ATTO). The protein concentration was determined using a commercially available measurement kit (BCA Protein Assay Kit, manufactured by Pierce). Fluc activity was expressed as relative light units (RLU) per mg of protein.
  • Example 1 After condensing an oleic acid residue to the hydroxyl group of Tris, 3-(dimethylamino)propionic acid is condensed to the tris-derived amino group of the resulting ester to form 2-(3-(dimethylamino) Propanamide)-2-((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldioleate (TOT-1) was synthesized.
  • Example 2 4-(dimethylamino)butyric acid is condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(4-(dimethylamino)butanamide)-2-((oleoyloxy)methyl)propane. -1,3-diyl dioleate (TOT-2) was synthesized.
  • Example 3 4-(dimethylamino)butyric acid is condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(1-methylpiperidine-4-carboxamide)-2-((oleoyloxy)methyl).
  • TOT-3 Propane-1,3-diyl dioleate
  • Example 1 except that 1-methyl-piperazine-4-carboxylic hydrochloride (89.8 mg, 0.50 mmol) was reacted with TOT-0 instead of 3-(dimethylamino)propionate hydrochloride. Similarly, TOT-3 (345 mg, yield 83%) was obtained as a white wax.
  • Example 4 3-(dimethylamino)propionic acid is condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(3-(diethylamino)propanamide)-2-((oleoyloxy)methyl).
  • TOT-4 Propane-1,3-diyl dioleate
  • Example 5 3-(dimethylamino)propionic acid was condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to form 2-((oleoyloxy)methyl)-2-(3-(piperidin-1-yl). ) Propanamide) Propane-1,3-diyl dioleate (TOT-5) was synthesized.
  • TOT-5 was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1-piperidine propionic acid (78.6 mg, 0.50 mmol) was reacted with TOT-0 instead of 3-(dimethylamino)propionate hydrochloride. (146 mg, 35% yield) was obtained as a colorless oil.
  • Example 6 3-(dimethylamino)propionic acid was condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(2-aminoacetamido)-2-((oleoyloxy)methyl)propane-1. ,3-diyl dioleate (TOT-6) was synthesized.
  • Example 7 The amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 is condensed with N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-methyl-glycine to produce 2-(2-(methylamino)acetamide)- 2-((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldioleate (TOT-7) was synthesized.
  • Example 8 O-tert-butyl-N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-serine was condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to form 2-((S) -2-Amino-3-hydroxypropanamide)-2-((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldioleate (TOT-8) was synthesized.
  • N-ethyl-N-methyl-beta-alanine was condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(3-(ethyl(methyl)amino)propanamide)-2-( (Oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldioleate (TOT-16) was synthesized.
  • Example 10 3-(pyrrolidin-1-yl)propanoic acid was condensed with the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-((oleoyloxy)methyl)-2-(3-(pyrrolidine-).
  • TLC was performed on TOT-1 to TOT-5 synthesized in Examples 1 to 5, YSK05, CL1H6, CL4H6, CL7H6, CL15H6, CL4F6, SM-102, ALC-0315, and MC3 to determine their affinity for polar surfaces. I looked into it. Specifically, each ionized lipid (5 to 10 nmol each) was spotted on an aluminum TLC plate (silica gel), and electrophoresed using dichloromethane:methanol (19:1 or 9:1) (volume ratio) as a mobile phase. - Stained with anisaldehyde and measured mobility (Rf value).
  • FIG. Figure 1 (A) shows the TLC results using dichloromethane:methanol (9:1) as the mobile phase
  • Figure 1 (B) shows the TLC results using dichloromethane: methanol (19:1) as the mobile phase.
  • TOT-1 to TOT-5 the black circles are plots of TOT (TOT-1 to TOT-5)
  • the white circles are lipids other than TOT (YSK05, CL1H6, CL4H6, CL7H6, CL15H6, CL4F6, SM-102, ALC-0315, and MC3). This is the plot of As shown in FIG.
  • Lipid nanoparticles were prepared using TOT-5 synthesized in Example 5 as a constituent lipid.
  • Phosphatidylethanolamine (PE), cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT-5.
  • DOPE was used as PE.
  • Lipid nanoparticles loaded with Fluc mRNA were produced using the alcohol dilution method.
  • Lipid nanoparticles were prepared using TOT-5 synthesized in Example 5 as a constituent lipid.
  • PE, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT-5.
  • DOPE or POPE was used as PE.
  • each of the prepared Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles was administered to Balb/c mice through the tail vein, and Fluc activity (RLU/mg protein) was measured.
  • Fluc activity was confirmed in the liver and spleen of mice administered with any of the lipid nanoparticles, but the FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing DOPE showed higher Fluc activity than the FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing POPE. It was shown to be an excellent gene expression carrier.
  • Lipid nanoparticles were prepared using TOT-4 to TOT-8 synthesized in Examples 4 to 8 as constituent lipids. DOPE, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT.
  • the Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles containing TOT-6 to TOT-8 had higher Fluc activity in the spleen than in the liver, indicating that the lipid nanoparticles containing TOT-6 to TOT-8 had high spleen selectivity. , was shown to be useful as a gene expression carrier targeting the spleen.
  • Lipid nanoparticles were prepared using TOT-5 synthesized in Example 5 as a constituent lipid.
  • Phosphatidylcholine (PC), cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT-5.
  • a DSPC was used as the PC.
  • FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were produced using the alcohol dilution method.
  • Lipid nanoparticles were prepared using TOT-4 synthesized in Example 4 as a constituent lipid.
  • PC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT-4.
  • Flucm RNA-loaded lipid nanoparticles were prepared by the method.
  • each of the prepared Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles was administered to Balb/c mice through the tail vein, and Fluc activity (RLU/mg protein) was measured. The results are shown in FIG. Fluc activity was confirmed in the liver and spleen of mice administered with any of the lipid nanoparticles. From this result, it was confirmed that the lipid nanoparticles containing TOT-4 as a constituent lipid are useful as gene expression carriers targeting the liver and spleen in all the compositions used this time.
  • FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing DSPC and FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing DPPC show higher Fluc activity in the spleen than in the liver, indicating that they are excellent as spleen-selective gene expression carriers. It was done. In particular, Fluc activity in the liver was relatively suppressed in Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles containing DSPC. It was suggested that DSPC is optimal as a sex lipid.
  • Lipid nanoparticles were prepared using TOT-1 to TOT-8, TOT-16, and TOT-17 synthesized in Examples 1 to 10 as constituent lipids.
  • DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT.
  • TOT tetra-phosphate
  • DSPC semiconductor
  • cholesterol semiconductor
  • PEG-DMG phosphatidylcholine
  • equal amounts of each were adjusted so that the total amount was 65 mol%.
  • Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles containing TOT-4 showed extremely high Fluc activity in the spleen, and were shown to be excellent as spleen-selective gene expression carriers. Furthermore, Fluc activity was confirmed in the liver for all lipid nanoparticles other than FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing TOT-2 as a constituent lipid. It was also confirmed that lipid nanoparticles containing a mixture of TOT-1 and TOT-5 as constituent lipids are useful as gene expression carriers targeting the liver.
  • Example 17 FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing TOT-4, which had the best spleen selectivity in Example 16, and FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing RNA-LPX (manufactured by BioNTech), a commercially available lipid with high spleen selectivity. The gene expression ability in the spleen was compared with
  • Example 18 The gene expression activity of lipid nanoparticles using TOT-4 and lipid nanoparticles using CL4F6 as pH-sensitive cationic lipids for each tissue was compared and investigated. DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than pH-sensitive cationic lipids.
  • Fluc activity RLU/mg protein
  • 0.2 mg/kg of Fluc mRNA was administered to mice through the tail vein, and 6 hours after administration of the lipid nanoparticles, about 50 mg of Fluc mRNA was administered to mice. After collecting each sample, they were stored frozen. 500 ⁇ L of passive lysis buffer (manufactured by Promega) was added to each tube to the collected organs.
  • liver and spleen Homogenize the liver at 4000 rpm for 2 times for 20 seconds, the spleen, kidney, lung, and heart at 5000 rpm for 2 times for 20 seconds, and the muscle for 4 times at 5000 rpm for 20 seconds, then centrifuge at 13000 rpm for 10 minutes at 4°C. After separation treatment, the supernatant was collected and used as a sample for measurement. For liver and spleen, a 100-fold dilution was made using passive lysis buffer.
  • luciferase assay buffer of a luciferase assay system (E1500, manufactured by Promega) was added in advance, and the amount of luminescence was measured using a luminometer.
  • the protein concentration was determined using a commercially available measurement kit (BCA Protein Assay Kit, manufactured by Pierce). Fluc activity was expressed as relative light units (RLU) per mg of protein.
  • FIG. 10 shows the measurement results of the luciferase expression level (Fluc activity) in each tissue of mice to which each Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticle was administered.
  • Mice administered with TOT-4-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles showed higher luciferase activity in the spleen, lung, brain, heart, and muscle than mice administered with CL4F6-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles.
  • lipid nanoparticles containing TOT-4 as a constituent lipid serve as gene expression carriers that can be transported to various tissues.
  • Example 20 Delivery of lipid nanoparticles to various tissues using TOT-4 as a pH-sensitive cationic lipid was investigated. DOPE or DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT-4.
  • each of the prepared Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles was intravenously administered to Balb/c mice at a dose of 0.01 mg of Fluc mRNA per 1 kg of body weight.
  • luciferase expression was determined. was evaluated by bioluminescence imaging in live animals. Specifically, after mice were anesthetized under isoflurane, 100 ⁇ L of a substrate solution (d-luciferin dissolved in PBS at a concentration of 30 mg/mL) was intraperitoneally injected. Anesthetized mice were placed on a black sheet, and the intensity of luciferase-derived luminescence throughout the mice was measured.
  • the intensity of luciferase-derived luminescence in each organ was imaged and measured using an imaging system (IVIS Lumina system, Perkin Elmer). Images were processed with “Living Image software v.4.3” (64 bit, manufactured by Caliper Life Sciences).
  • FIG. 11 shows an imaging image in which the luciferase-derived luminescence intensity of the entire mouse was measured.
  • luciferase expression was observed mainly in the liver, and in mice to which DSPC-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were administered, expression was particularly observed in the spleen.
  • DSPC-containing Flucm RNA-loaded lipid nanoparticles were administered, expression was also observed in the heels, hands, nose tip, neck, etc.
  • Example 21 The usefulness of lipid nanoparticles using TOT-5 as a pH-sensitive cationic lipid as a gene expression carrier for mRNA with antitumor effects was investigated.
  • DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT-5.
  • Ova mRNA was used as mRNA with antitumor effect, and mouse lymphoma cell line EL4 cells (EG7-OVA cells) stably expressing Ova antigen were used as tumor cells.
  • C57BL/6N mice female, 6 weeks old were inoculated in the flank region with 5 ⁇ 10 5 E.G.7-OVA cells per mouse by subcutaneous injection. Thereafter, the tumor volume of each mouse was measured over time.
  • Ova mRNA-loaded lipid nanoparticles suspended in PBS were injected with 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, or 0.5 mg RNA/ It was administered intravenously to the tail vein to give a weight of 1 kg.
  • the results of monitoring tumor volume are shown in FIG. 12.
  • antitumor effects were observed at doses of 0.1 mg RNA/kg or more.
  • TOT-5 was synthesized using N-(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-3-(piperidin-1-yl)propanamide (Compound 3).
  • TOT-4 was synthesized using 3-(diethylamino)-N-(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)propanamide (compound 4).
  • Example 24 1-ethylpiperidine-4-carboxylic acid was condensed with the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(1-ethylpiperidine-4-carboxamide)-2-((oleoyloxy) methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-18) was synthesized.
  • Example 25 1-(prophen-2-yl)piperilide-4-carboxylic acid is condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(1-isopropylpiperidine-4-carboxamide)-2- ((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-19) was synthesized.
  • Example 26 3-(pyrrolidin-1-yl)propano hydrochloride was condensed to the amino group in TOT-0 synthesized in Example 1 to produce 2-(1-methylpyrrolidine-3-carboxamide)-2-(( Oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-20) was synthesized.
  • Example 27 By condensing N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, N ⁇ -methyltryptamine, and oleic acid, 2-(3-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)(methyl)amino)propane Amido)-2-((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-21) was synthesized.
  • N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide (93%, 188.4 mg, 1.0 mmol) and N ⁇ -methyltryptamine were dissolved in EtOH (1 mL) and water (0.4 mL). The resulting reaction mixture was allowed to stir overnight at ambient temperature in the dark and then evaporated. The resulting crude product was dissolved in anhydrous DCM (5 mL) and oleic acid (890 mg, 3.15 mmol), DMAP (12.2 mg, 0.1 mmol) and EDCI-HCl (633 mg, 3.30 mmol) were added. . The reaction mixture was allowed to stir overnight at ambient temperature in the dark.
  • Example 28 N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, isonipectamide, and oleic acid are condensed to form 2-(3-(4-carbamoylpiperidin-1-yl)propanamide)-2-((oleoyloxy ) Methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-22) was synthesized.
  • Example 29 By condensing N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, N-methyl-2-pyridinemethanamine, and oleic acid, 2-(3-(methyl(pyridin-2-ylmethyl)amino)propanamide)-2 -((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-23) was synthesized.
  • TOT-23 (215 mg, yield 65.5 mg) was prepared in the same manner as TOT-22, except that N-methyl-2-pyridinemethanamine (36.7 mg, 0.3 mmol) was used in place of isonipectamide. 7%) was obtained as a pale yellow oil.
  • N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, 1'H-spiro[piperidine-4,4'-quinazolin]-2'(3'H)-one, and oleic acid are condensed to form 2-((oleic acid).
  • (oiloxy)methyl)-2-(3-(2'-oxo-2',3'-dihydro-1'H-spiro[piperidine-4,4'-quinazolin]-1-yl)propanamido)propane- 1,3-diyldiolate (TOT-24) was synthesized.
  • N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, 3-(4-piperidinyl)-1,3-benzoxazol-2(3H)-one, and oleic acid are condensed to form 2-((oleoyloxy)methyl )-2-(3-(4-(2-oxobenzo[d]oxazol-3(2H)-yl)piperidin-1-yl)propanamido)propane-1,3-diyldiolate (TOT-25) Synthesized.
  • Example 32 By condensing N-[tris(hydroxymethyl)methyl]acrylamide, N-methyl-4-pyridylmethylamine, and oleic acid, 2-(3-(methyl(pyridin-4-ylmethyl)amino)propanamide)-2 -((oleoyloxy)methyl)propane-1,3-diyldiolate (TOT-26) was synthesized.
  • TOT-26 (54 mg, yield 16.5 mg) was prepared in the same manner as TOT-22, except that N-methyl-4-pyridylmethylamine (36.7 mg, 0.3 mmol) was used in place of isonipectamide. 5%) was obtained as a colorless oil.
  • Example 33 Using TOT-1 to 8 and 16 to 20 pH-sensitive cationic lipids (hereinafter sometimes collectively referred to as "TOT") synthesized in Examples 1 to 10 and 24 to 26 as constituent lipids, lipid nanoparticles were prepared. was prepared. DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT.
  • TOT pH-sensitive cationic lipids
  • RNA-loaded lipid nanoparticles were prepared by. Table 2 shows the ⁇ average particle diameter (nm), polydispersity index (PdI), pKa, and encapsulation rate (%) of each FlucmRNA-loaded lipid nanoparticle.
  • lipid nanoparticles had a ⁇ average particle diameter of about 100 to 200 nm and an encapsulation rate of about 90%, and both had physical properties sufficiently suitable as gene expression carriers.
  • the pKa of lipid nanoparticles is influenced by TOT as the constituent lipid, and by appropriately selecting TOT, lipid nanoparticles with a desired pKa can be obtained within a very wide range from 6.2 to 7.7 or more. It was confirmed that particles could be prepared.
  • each of the prepared Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles was administered to Balb/c mice through the tail vein, and Fluc activity (RLU/mg protein) in each tissue was measured.
  • Fluc activity in each tissue was measured.
  • the Fluc activity of each tissue was measured in the same manner as in Example 19.
  • mice administered with each FlucmRNA-loaded lipid nanoparticle were administered with different luciferase activity than in control mice (mice administered with CL4F6-containing lipid nanoparticles) (FIG. 13).
  • mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-5, TOT-16, and TOT-4 had higher luciferase activity than control mice, and constituted TOT with a pKa of about 6.2 to 6.6. It was found that spleen selectivity could be enhanced by using lipids (FIG. 14).
  • mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-19 had the highest luciferase activity
  • mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-18, TOT-2, TOT-3, and TOT-4 had the highest luciferase activity.
  • luciferase activity was higher than in control mice ( Figure 15). Since TOT-18, TOT-19, TOT-2, and TOT-3 have a pKa of 7.5 or higher, it is possible to increase the lung selectivity of lipid nanoparticles by selecting TOT with a high pKa. It was suggested.
  • luciferase activity was significantly higher in mice administered lipid nanoparticles containing TOT-4, indicating that by using TOT-4 as a constituent lipid, a carrier that can be efficiently transported to the brain can be produced.
  • Figure 16 In the heart, luciferase activity in mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-4 and TOT-19 was very high, and even in mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-16 and TOT-7, luciferase activity was significantly higher than in mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-16 and TOT-7. The luciferase activity was higher than in mice ( Figure 17).
  • luciferase activity in mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-18, TOT-19, and TOT-4 was extremely high, and even in mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-16, luciferase activity was significantly higher than that in mice administered with lipid nanoparticles containing TOT-16. The luciferase activity was higher than that in mice ( Figure 18).
  • Example 34 As a result of statistical analysis, it was predicted that the selectivity of the liver and spleen in the uptake of lipid nanoparticles into tissues is influenced by the content ratio of DSPC in the total lipid component of the lipid nanoparticles. Therefore, we prepared lipid nanoparticles with varying DSPC content and examined their uptake into the liver and spleen.
  • the Fluc activity of each tissue was measured in the same manner as in Example 19.
  • Figure 19 shows the measurement results of Fluc activity in the liver and spleen of each mouse.
  • Figure 19(A) shows the results of mice administered with TOT-5-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles
  • Figure 19(B) shows the results of mice administered with MC3-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles
  • SM-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles The results of the mice administered with the particles are shown in FIG. 19(C), and the results of the mice administered with the ALC-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles are shown in FIG. 19(D), respectively.
  • any of the cationic lipids As the DSPC content increased, the activity in the spleen tended to improve and the activity in the liver tended to decrease. In particular, in mice to which TOT-5-containing FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were administered, the activity was predominant in the liver when DSPC was less than 10 mol%, and the activity was predominant in the spleen when DSPC was 10 mol% or more.
  • Example 35 In the uptake of lipid nanoparticles into organs, we investigated the relationship between DSPC content-dependent organ selectivity and the pKa of lipid nanoparticles.
  • TOT-1 to 5 and 16 were used as pH-sensitive cationic lipids.
  • DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as lipids other than TOT.
  • Each of the prepared Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles was intravenously administered to Balb/c mice at a concentration of 0.01 mg/kg as Fluc mRNA, and the liver and spleen were collected 6 hours after the lipid nanoparticle administration to determine Fluc activity. (RLU/mg protein) was measured. The Fluc activity of each tissue was measured in the same manner as in Example 19.
  • FIG. 20(A) shows a plot of each FlucmRNA-loaded lipid nanoparticle with specificity on the vertical axis and pKa on the horizontal axis.
  • lipid nanoparticles with lower pKa have higher Fluc activity in the liver when the DSPC content is 3 mol% and in the spleen when the DSPC content is 15 mol%. showed that.
  • the influence of pKa on the spleen/liver ratio (specificity) of Fluc activity was large under the condition that the content of DSPC was 3 mol %, and for lipid nanoparticles with pKa exceeding 7, Fluc activity was predominant in the spleen. It was shown that when the pKa of lipid nanoparticles is low, the targeting to the liver and spleen can be significantly changed by changing the DSPC content.
  • Example 36 It has been reported that endogenous apolipoprotein E (ApoE) is involved in the uptake of lipid nanoparticles into hepatocytes. Therefore, FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles with a DSPC content of 3 mol% or 15 mol% were administered to wild-type mice and ApoE-deficient mice, and their uptake into the liver and spleen was examined.
  • ApoE endogenous apolipoprotein E
  • Each of the prepared Fluc mRNA-loaded lipid nanoparticles was intravenously administered to wild-type mice (Balb/c mice) or ApoE-deficient mice (both 4 weeks old, female) at a concentration of 0.01 mg/kg as Fluc mRNA.
  • the Fluc activity of each tissue was measured in the same manner as in Example 19.
  • the spleen is composed of multiple types of cells, and their functions vary depending on the cell type. Therefore, we investigated which cell types in the spleen take up TOT-containing lipid nanoparticles into the spleen. TOT-5, DSPC, cholesterol, and PEG-DMG were used as constituent lipids of the lipid nanoparticles.
  • spleens were also collected from Balb/c mice to which lipid nanoparticles were not administered.
  • HBSS (-) buffer was added to the sterile Petri dish to loosen the tissue, and the resulting suspension was passed through a 40 ⁇ m cell strainer and incubated at 4°C. The cells were centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes. After removing the supernatant, red blood cells were removed by adding 1 mL of RBC lysis buffer, diluted with 9 mL of cold HBSS(-) buffer, and centrifuged at 4° C., 400 ⁇ g, for 5 minutes.
  • B cells are CD19 + CD3 ⁇ cells
  • T cells are CD19 ⁇ CD3 + cells
  • NK cells are CD3 ⁇ CD49b + cells
  • dendritic cells are CD11c + I-A/I-E + cells
  • neutrophils are Ly6G + CD11b. + cells were stained with antibody, gently tapped every 15 minutes, and reacted on ice for 30 minutes. After the reaction, the volume was adjusted to 1 mL/tube using FACS buffer, centrifuged at 4° C., 400 ⁇ g, for 5 minutes, and then washed twice with 1 mL of FACS buffer to prepare a sample. 6 ⁇ L of propidium iodide solution was added to the sample, and after each cell group was extracted with each surface antigen, the DiD fluorescence intensity was measured.
  • FACS buffer (1x PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN 3 ) is prepared by dissolving 10 PBS tablets in 1 L of deuterium-depleted water (DDW), sterilizing it in an autoclave, and adding 5.0 g of albumin. (derived from bovine serum, fraction V, pH 7.0) and 1.0 g of sodium azide were added and dissolved. It was stored at 4°C until use.
  • DDW deuterium-depleted water
  • DiD-positive cells are cells into which DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles have been taken up. Therefore, the DiD fluorescence intensity of each spleen cell type was determined as the amount of uptake of DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles.
  • the measurement results are shown in FIG. 22.
  • “DC” indicates the results for dendritic cells
  • "neu” indicates the results for neutrophils.
  • the DSPC content of the lipid nanoparticles increased, the number of splenic B cells into which the DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were taken up increased.
  • TOT-5-containing lipid nanoparticles are highly taken up by B cells and dendritic cells; This resulted in an improvement of about 10 times.
  • Example 38 The splenic B cells that had the highest amount of uptake in Example 37 were allowed to take in lipid nanoparticles with varying DSPC content, and the influence of Fluc activity and DSPC content was investigated. As the DiD-modified Flucm RNA-loaded lipid nanoparticles, those prepared in Example 37 were used.
  • the collected spleen was placed on a sterile Petri dish and shredded with scissors, then an appropriate amount of cold HBSS (-) buffer was added to the sterile Petri dish to loosen the tissue, and the resulting suspension was passed through a 40 ⁇ m cell strainer and incubated at 4°C. The cells were centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes.
  • red blood cells were removed by adding 1 mL of RBC lysis buffer, diluted with 9 mL of cold HBSS(-) buffer, and centrifuged at 4° C., 400 ⁇ g, for 5 minutes. After removing the supernatant, the cells were resuspended in 5 mL of cold HBSS(-) buffer, the number of cells was counted, and the cells were centrifuged at 4° C. and 400 ⁇ g for 5 minutes.
  • the cells were suspended in MACS buffer (a solution containing 2mM EDTA in FACS buffer) to give a final volume of 5 x 10 7 cells/mL/tube, and centrifuged at 4°C, 400 x g, for 5 minutes. The supernatant was removed. The precipitated cells were suspended in 450 ⁇ L of MACS buffer, and 50 ⁇ L of CD19 MicroBeads were added to make a total cell suspension of 500 ⁇ L. The entire amount of the cell suspension was added to the MS column, and after the suspension had flowed out of the column, 500 ⁇ L of MACS buffer was added to the column, which was repeated three times. Thereafter, the column was removed from the MACS separator, placed on a collection tube, 1 mL of MACS buffer was added, and the plunger was pushed in to collect B cells.
  • MACS buffer a solution containing 2mM EDTA in FACS buffer
  • Example 39 It is known that the complement system is involved in the uptake of nanoparticles into immune cells, and in particular, the complement receptor CD21/35 is known to be involved in the uptake of nanoparticles into B cells (Limei et al. Shen, et al, Journal of Allergy, 2018, vol.142, p.1558-1570; Monika Bednarczyk, et al, Molecular Sciences, 2021, vol.22, p.2869). Therefore, we investigated whether the complement system is also involved in the uptake of TOT-containing lipid nanoparticles into B cells. Among the DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles prepared in Example 37, those with a DSPC content of 3 mol% and those with a DSPC content of 15 mol% were used.
  • Spleens were collected from the euthanized mice in the same manner as in Example 38, and splenic B cells (primary B cells) were isolated and collected from the collected spleens. The number of cells was counted, and 1 ⁇ 10 7 cells/tube were collected and centrifuged at 4° C. and 400 ⁇ g for 5 minutes. After removing the supernatant, 1 ⁇ passive lysis buffer was added at 100 ⁇ L/tube. Since white aggregates were observed, the mixture was centrifuged at 4° C. and 13,000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was collected and used as a sample for measurement.
  • luciferase assay buffer of a luciferase assay system (E1500, manufactured by Promega) was added in advance, and the amount of luminescence was measured using a luminometer.
  • Inactivated serum was prepared as follows. Blood was collected from the heart of the mouse under anesthesia and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The blood clot was removed by tapping and centrifuged at 1500 ⁇ g for 15 minutes at room temperature, and then the supernatant was collected and used as serum. Mouse serum was heated at 56°C for 30 minutes and was used as inactivated serum.
  • FIG. 24(A) The measurement results of DiD fluorescence intensity of each primary B cell into which DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles were incorporated are shown in FIG. 24(A).
  • the FACS results are shown in FIG. 24(B).
  • FIG. 24(A) the amount of DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles taken up by primary B cells in the presence of inactivated serum or EDTA was lower than that of untreated serum without EDTA. clearly decreased.
  • Example 40 Regarding the splenic B cells that had the highest amount of uptake in Example 37, it was investigated which cell type among the splenic B cells was taken up. Among the DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles prepared in Example 37, those with a DSPC content of 3 mol% and those with a DSPC content of 15 mol% were used.
  • spleens were also collected from Balb/c mice to which lipid nanoparticles were not administered.
  • Spleen cells were collected in the same manner as in Example 37 and blocked with purified anti-mouse CD16/32 antibody (10 ⁇ g/mL, prepared in FACS buffer). Thereafter, B cells were stained with antibodies as CD19 + cells, MZB cells as CD21/35 high CD23 mid cells, and FOB cells as CD21/35 mid CD23 high cells, and the cells were gently tapped every 15 minutes and allowed to react on ice for 30 minutes. Ta. After the reaction, the volume was adjusted to 1 mL/tube using FACS buffer, centrifuged at 4° C., 400 ⁇ g, for 5 minutes, and then washed twice with 1 mL of FACS buffer to prepare a sample. 6 ⁇ L of propidium iodide solution was added to the sample, and after each cell group was extracted with each surface antigen, the DiD fluorescence intensity was measured.
  • FIG. 25 shows the results of measuring DiD fluorescence intensity for B cells, MZB cells, and FOB cells of mice administered with nanoparticles (15% DSPC).
  • the DiD-modified FlucmRNA-loaded lipid nanoparticles containing TOT were clearly taken up in a higher amount by MZB cells, which highly express CD21/35, than by FOB cells.
  • lipid nanoparticles with a DSPC content of 15 mol% were better taken up into MZB cells than lipid nanoparticles with a DSPC content of 3 mol%.
  • MBP and C1q are proteins located upstream of the lectin pathway and classical complement pathway, respectively, and have similar structures to each other, and have been reported to be recognized by the C1q receptor (Ehrnthaller, et al. al, Mol Med, 2010, vol.17(3-4), p.317-329). IgM is recognized by the globular heads of C1q. It has been reported that fibrinogen, a blood coagulation-related factor, and vitronectin, a cell adhesion factor, become ligands for gC1q receptors when denatured (Ghebrehiwet, et al, Immunol Rev, 2002, vol.180, p .65-77).
  • lipid nanoparticles with a relatively high content of DSPC are taken up into spleen cells by the complement pathway, particularly the pathway mediated by the C1q receptor, and it is believed that lipid nanoparticles with a relatively high content of DSPC are taken up into spleen cells by the complement pathway, particularly by the pathway mediated by the C1q receptor, and are effective for animals in which this pathway is activated.
  • Potentially useful as a drug delivery carrier is possible.

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Abstract

本発明は、比較的高価な原料を使用せず、より簡便に合成可能なｐＨ感受性カチオン性脂質、及び当該ｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子を提供することを課題とする。本発明は、一般式(I)［Ｒ１は、炭素数１～２２の炭化水素基であり；一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基でも異種の基でもよく；Ｚ１は、炭素数１～６のアルキレン基又は単結合であり；Ｘは、－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、又は、５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、当該基は炭素原子によりＺ１に結合する）であり；Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成してもよい］で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質である。

Description

ｐＨ感受性カチオン性脂質及び脂質ナノ粒子
　本発明は、３本の疎水性鎖を備えるｐＨ感受性カチオン性脂質、及び当該ｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子に関する。
　本発明は、２０２２年７月１９日付で日本に出願された特願２０２２－１１５０１５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　脂溶性薬物や、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｍＲＮＡ等の核酸を封入し、標的細胞へ送達するためのキャリアとして、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が利用されている。例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸を効率的に標的細胞内へ送達するためのキャリアとなる脂質ナノ粒子として、生理的ｐＨでは電気的に中性であり、エンドソームなどの弱酸性ｐＨ環境下ではカチオン性に変化するｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子が報告されている（特許文献１）。血中で正電荷を帯びる脂質ナノ粒子は、血漿タンパク質と非特異的な相互作用を起こして、細網内皮系により速やかに血中から消失する。これに対して、ｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子は、血中の中性条件下では電荷を帯びず、エンドソーム内の弱酸性条件下では正電荷を帯びて効率的にエンドソーム脱出を行うことができる。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質としては、例えば、Jayaramanらは、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを開発し、マウス肝臓における第７因子（Ｆ７）ノックダウンにおいてＥＤ５０で０．００５ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇを達成した（非特許文献１）。本発明者らもこれまでに独自のｐＨ感受性カチオン性脂質ＹＳＫ０５及びＹＳＫ１３－Ｃ３を開発しており、Ｆ７ノックダウンにおけるＥＤ５０としてそれぞれ０．０６、０．０１５ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇを達成している（非特許文献２～４）。本発明者らはさらに、ｐＨ感受性カチオン性脂質として、７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイル ジオレアート（ＣＬ４Ｈ６）等の２本の炭化水素鎖と１本の親水性基とを有する化合物も開発した（特許文献１）。
　一方で、核酸等を内包する脂質ナノ粒子の製造方法としては、流路を用いたアルコール希釈法を原理とするものがある。例えば、２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることで直径３０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を再現良く製造可能であることが報告されている（非特許文献５）。また、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることにより、従来の三次元ミキサーを用いる流路構造体よりも、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることも報告されている（特許文献２）。これらのナノ粒子製剤の製造方法は、近年では主に、脂溶性薬物や、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）又はｍＲＮＡ等の核酸を搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製造に採用されている。
国際公開第２０１８／２３０７１０号 国際公開第２０１８／１９０４２３号
Jayaraman et al., Angewandte Chemie International Edition, 2012, vol.51, p.8529-8533. Watanabe et al., Scientific Reports, 2014, 4:4750, DOI: 10.1038/srep04750. Yamamoto et al., Journal of Hepatology, 2016, vol.64, p.547-555. Sato et al., Molecular Therapy, 2016, vol.24, p.788-795. Leung et al.，Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces，2012，vol.116(34)，p.18440-18450.
　化合物を工場で量産する際には、製造コストや品質の安定性等の点から、安価な原料を用い、少ない反応工程で合成できることが好ましい。しかしながら、ＣＬ４Ｈ６等の特許文献１に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質の合成反応は、６～７段階もの多段階反応であり、さらに、有機金属を使用するＧｒｉｇｎａｒｄ反応も要する。下記にＣＬ４Ｈ６の合成反応の概略を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本発明は、有機金属反応や比較的高価な原料を使用せず、少ない工程でより簡便に合成可能なｐＨ感受性カチオン性脂質、及び当該ｐＨ感受性カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＣＡＳ番号：７７－８６－１）（以下、「トリス（Ｔｒｉｓ）」と略する）をリンカーとして用い、トリスの３個のヒドロキシ基にそれぞれ炭化水素鎖を結合させ、トリスのアミノ基に１本の親水性基を結合させることにより、比較的高価な原料を使用せず、少ない工程数で、ｐＨ感受性カチオン性脂質を合成可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下のｐＨ感受性カチオン性脂質等を提供するものである。
［１］　下記の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、炭素数１～２２の炭化水素基であり；一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよく；Ｚ１は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい、炭素数１～６のアルキレン基、又は単結合であり；Ｘは、－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、又は、５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、当該基は炭素原子によりＺ１に結合し、当該環上には、１若しくは２個の炭素数１～４の炭化水素基又はアミド基が置換されていてもよい）であり；Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよい炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、炭素数１～４の炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよく；該環の１個の炭素原子は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい）を形成してもよい］
で表される化合物からなる、ｐＨ感受性カチオン性脂質。
［２］　前記一般式（Ｉ）中、－Ｚ１－Ｘが、下記式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）～（Ｈ－２６）のいずれかである、前記［１］のｐＨ感受性カチオン性脂質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［３］　一分子中３個あるＲ１が、全て同じ基である、前記［１］又は［２］のｐＨ感受性カチオン性脂質。
［４］　前記Ｒ１が、炭素数１５～２２のアルキル基又は炭素数１５～２２のアルケニル基である、前記［１］～［３］のいずれかのｐＨ感受性カチオン性脂質。
［５］　下記一般式（Ｉ－１）～（Ｉ－８）、（Ｉ－１６）～（Ｉ－２６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、Ｒ１は前記と同じである。］
のいずれかで表される化合物である、前記［１］～［４］のいずれかのｐＨ感受性カチオン性脂質。
［６］　トリス骨格を有しており、
　前記トリス骨格の３個の酸素原子にそれぞれ脂肪酸残基が結合しており、前記脂肪酸残基は、炭化水素鎖部分の炭素数が１～２２であり、１個以上の不飽和結合を有していてもよく、一分子中の３個の前記脂肪酸残基は、同種の基であってもよく、２種以上の異なる基であってもよく、
　前記トリス骨格の１個の窒素原子に、１級～３級アミンが、カルボニル基又はカルボニル基とこれに続く炭素数１～６のアルキレン基を介して連結されており、前記アルキレン基は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよく、
　ｐＫａが４．０～９．０である化合物からなる、ｐＨ感受性カチオン性脂質。
［７］　下記一般式（Ａ）で表される化合物と、下記一般式（Ｂ）で表される化合物と、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとを、縮合させることにより、下記一般式（Ｉ）で表される化合物からなるｐＨ感受性カチオン性脂質を製造する、ｐＨ感受性カチオン性脂質の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式（Ａ）中、Ｒ１は、炭素数１～２２のアルキル基又は炭素数２～２２のアルケニル基である］
［式（Ｂ）中、Ｚ１は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい、炭素数１～６のアルキレン基、又は単結合であり；Ｘは、－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、又は、５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、当該基は炭素原子によりＺ１に結合し、当該環上には、１若しくは２個の炭素数１～４の炭化水素基又はアミド基が置換されていてもよい）であり；Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよい炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、炭素数１～４の炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよく；該環の１個の炭素原子は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい）を形成してもよい］
［式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｚ１、及びＸは、前記と同じであるが、一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよい］
［８］　下記一般式（Ｃ）で表される化合物に、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドを付加させた後、さらに下記一般式（Ａ）で表される化合物を縮合させることにより、下記一般式（Ｉ’）で表される化合物からなるｐＨ感受性カチオン性脂質を製造する、ｐＨ感受性カチオン性脂質の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式（Ｃ）及び（Ｉ’）中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよい炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、炭素数１～４の炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよく；該環の１個の炭素原子は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい）を形成してもよい；式（Ａ）中、Ｒ１は、炭素数１～２２のアルキル基又は炭素数２～２２のアルケニル基であり；式（Ｉ’）中、Ｒ１は、前記と同様であり、一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよい］
［９］　前記［１］～［６］のいずれかのｐＨ感受性カチオン性脂質を含有している、脂質ナノ粒子。
［１０］　さらに、ステロール及びポリアルキレングリコール修飾脂質を含有している、前記［９］の脂質ナノ粒子。
［１１］　さらに、ホスファチジルコリンを含有している、前記［９］又は［１０］の脂質ナノ粒子。
［１２］　核酸を含有する、前記［９］～［１１］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［１３］　前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡである、前記［１２］の脂質ナノ粒子。
［１４］　前記［１］～［６］のいずれかのｐＨ感受性カチオン性脂質を含有している脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
［１５］　前記［１］～［６］のいずれかのｐＨ感受性カチオン性脂質と核酸を含有している脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
［１６］　遺伝子治療に用いられる、前記［１４］又は［１５］の医薬用組成物。
［１７］　前記［１２］の脂質ナノ粒子であって、標的細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した脂質ナノ粒子を、被験動物（但し、ヒトを除く）へ投与し、前記被験動物の標的細胞内で前記外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子の発現方法。
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、比較的合成が容易であり、大量合成に適している。このため、当該ｐＨ感受性カチオン性脂質は、医薬品の有効成分として用いられる脂質ナノ粒子の構成脂質として有用である。
試験例１において、各脂質のＲｆ値を見かけのｐＫａ値に対してプロットしたプロット図である。図１（Ａ）は、ジクロロメタン：メタノール（９：１）を移動相としたＴＬＣの結果を、図１（Ｂ）は、ジクロロメタン：メタノール（１９：１）を移動相としたＴＬＣの結果を、それぞれ示す。 実施例１１において、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１２において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１４において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１５において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１６において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１７において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１８において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例１９において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの各組織のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示した図である。 実施例２０において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの個体全体のルシフェラーゼ由来発光強度を測定したイメージング画像である。 実施例２１において、腫瘍細胞接種から７日後及び１０日後にＯｖａｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を静脈投与したマウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例３３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肺のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの脳のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの心臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３３において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの筋肉のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３４において、各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの肝臓及び脾臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３５において、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（図中、「ＤＳＰＣ－３」）とＤＳＰＣの含有量が１５ｍｏｌ％のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（図中、「ＤＳＰＣ－１５」）について、縦軸を特異性、横軸をｐＫａとしてプロットした図（図２０（Ａ））と、特異性変化とｐＫａの関係をプロットした図（図２０（Ｂ））である。 実施例３６において、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％又は１５ｍｏｌ％のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与した野生型マウス及びＡｐｏＥ欠損マウスの肝臓及び脾臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３７において、ＤＳＰＣ含有量が異なるＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を取り込ませた脾臓のＤｉＤの蛍光強度を、細胞種ごとに分けて測定した結果を示した図である。 実施例３８において、ＤＳＰＣの含有量が様々であるＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓Ｂ細胞のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の測定結果を示した図である。 実施例３９において、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％又は１５ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、未処理血清かつＥＤＴＡ無添加の条件下、未処理血清かつＥＤＴＡ添加条件下、又は非働化血清かつＥＤＴＡ無添加条件下で取り込ませたプライマリーＢ細胞のＤｉＤの蛍光強度の測定結果を示した図である。 実施例４０において、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％又は１５ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの、Ｂ細胞、ＭＺＢ細胞、及びＦＯＢ細胞のＤｉＤの蛍光強度を測定した結果を示した図である。
　以下、本発明の実施態様について具体的に説明する。本願明細書において、「Ｘ１～Ｘ２（Ｘ１とＸ２は、Ｘ１＜Ｘ２を満たす実数）」は、「Ｘ１以上Ｘ２以下」を意味する。また、「ＣＸ３－Ｘ４（Ｘ３とＸ４は、Ｘ３＜Ｘ４を満たす整数）」は、「炭素数がＸ３以上Ｘ４以下」を意味する。
［ｐＨ感受性カチオン性脂質］
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、トリスの３個のヒドロキシ基にそれぞれ炭化水素鎖を結合させ、トリスのアミノ基に１本の親水性基を結合させた化合物である。３本の炭化水素鎖と親水性部分を備える化合物であり、その構造の類似性から、リン脂質等の脂質との親和性が高く、脂質ナノ粒子の構成脂質として好適である。
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の一例として、トリス骨格の３個の酸素原子にそれぞれ脂肪酸残基が結合されており、かつ当該トリス骨格の１個の窒素原子に１級～３級アミンが、カルボニル基又はカルボニル基とこれに続く炭素数１～６のアルキレン基を介して連結されている化合物が挙げられる。トリス骨格の１個の窒素原子は、これに連結するカルボニル基と共にアミド結合を形成する。ここで、「トリス骨格」とは、トリスヒドロキシメチルアミノメタンの３個のヒドロキシ基とアミノ基から、それぞれ水素原子を１個ずつ除いた構造を意味する。トリス骨格に結合される３個の脂肪酸残基は、炭化水素鎖部分の炭素数が１～２２であり、１個以上の不飽和結合を有していてもよい。また、一分子中の複数在る脂肪酸残基は同種の基であってもよく、２種以上の異なる基であってもよい。本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一分子中の複数在る脂肪酸残基が全て同種の基であることが好ましい。トリス骨格の１個の窒素原子とアミンは、カルボニル基を介して、又はカルボニル基とこれに続く炭素数１～６のアルキレン基を介して連結されており、カルボニル基と連結するアルキレン基は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい。当該アミンとしては、具体的には、後記のＸで挙げられた基を用いることができる。当該化合物のｐＫａは、末端のアミンの構造に依存し、好ましくは、４．０～９．０程度、好ましくは４．５～８．５程度、より好ましくは５．０～８．５程度である。
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の一例として、下記一般式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　一般式（Ｉ）中、Ｒ１は、炭素数１～２２の炭化水素基（Ｃ１－２２炭化水素基）である。当該Ｃ１－２２炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。当該炭化水素基としては、アルキル基であってもよく、アルケニル基であってもよい。当該アルケニル基としては、不飽和結合を１個有する基であってもよく、２個有する基であってもよく、３個有する基であってもよい。
　Ｒ１がＣ１－２２アルキル基の場合、当該アルキル基としては、
メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基；
ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基；
ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、１－エチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１－メチル－２，２－ジメチルブチル基；
ｎ－ヘプチル基、１－メチルヘキシル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、４－メチルヘキシル基、５－メチルヘキシル基、１－エチルペンチル基、１，１－ジメチルペンチル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、４，４－ジメチルペンチル基、１－メチル－３，３－ジメチルブチル基、２－メチル－３，３－ジメチルブチル基；
ｎ－オクチル基、１－メチルヘプチル基、２－メチルヘプチル基、３－メチルヘプチル基、４－メチルヘプチル基、５－メチルヘプチル基、６－メチルヘプチル基、１－エチルヘキシル基、１，１－ジメチルヘキシル基、２，２－ジメチルヘキシル基、３，３－ジメチルヘキシル基、４，４－ジメチルヘキシル基、５，５－ジメチルヘキシル基、１－メチル－４，４－ジメチルペンチル基、２－メチル－４，４－ジメチルペンチル基、３－メチル－４，４－ジメチルペンチル基；
ｎ－ノニル基、１－メチルオクチル基、２－メチルオクチル基、３－メチルオクチル基、４－メチルオクチル基、５－メチルオクチル基、６－メチルオクチル基、７－メチルオクチル基、１－エチルヘプチル基、１，１－ジメチルヘプチル基、２，２－ジメチルヘプチル基、３，３－ジメチルヘプチル基、４，４－ジメチルヘプチル基、５，５－ジメチルヘプチル基、６，６－ジメチルヘプチル基、１－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基、２－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基、３－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基、４－メチル－５，５－ジメチルヘキシル基；
ｎ－デシル基、１－メチルノニル基、２－メチルノニル基、３－メチルノニル基、４－メチルノニル基、５－メチルノニル基、６－メチルノニル基、７－メチルノニル基、８－メチルノニル基、１－エチルオクチル基、１，１－ジメチルオクチル基、２，２－ジメチルオクチル基、３，３－ジメチルオクチル基、４，４－ジメチルオクチル基、５，５－ジメチルオクチル基、６，６－ジメチルオクチル基、７，７－ジメチルオクチル基、１－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、２－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、３－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、４－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基、５－メチル－６，６－ジメチルヘプチル基；
ｎ－ウンデシル基、１－メチルデシル基、２－メチルデシル基、３－メチルデシル基、４－メチルデシル基、５－メチルデシル基、６－メチルデシル基、７－メチルデシル基、８－メチルデシル基、９－メチルデシル基、１－エチルノニル基、１，１－ジメチルノニル基、２，２－ジメチルノニル基、３，３－ジメチルノニル基、４，４－ジメチルノニル基、５，５－ジメチルノニル基、６，６－ジメチルノニル基、７，７－ジメチルノニル基、８，８－ジメチルノニル基、１－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、２－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、３－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、４－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、５－メチル－７，７－ジメチルオクチル基、６－メチル－７，７－ジメチルオクチル基；
ｎ－ドデシル基、１－メチルウンデシル基、２－メチルウンデシル基、３－メチルウンデシル基、４－メチルウンデシル基、５－メチルウンデシル基、６－メチルウンデシル基、７－メチルウンデシル基、８－メチルウンデシル基、９－メチルウンデシル基、１０－メチルウンデシル基、１－エチルデシル基、１，１－ジメチルデシル基、２，２－ジメチルデシル基、３，３－ジメチルデシル基、４，４－ジメチルデシル基、５，５－ジメチルデシル基、６，６－ジメチルデシル基、７，７－ジメチルデシル基、８，８－ジメチルデシル基、９，９－ジメチルデシル基、１－メチル－８，８－ジメチルノニル基、２－メチル－８，８－ジメチルノニル基、３－メチル－８，８－ジメチルノニル基、４－メチル－８，８－ジメチルノニル基、５－メチル－８，８－ジメチルノニル基、６－メチル－８，８－ジメチルノニル基、７－メチル－８，８－ジメチルノニル基；
ｎ－トリデシル基、１－メチルドデシル基、２－メチルドデシル基、３－メチルドデシル基、４－メチルドデシル基、５－メチルドデシル基、６－メチルドデシル基、７－メチルドデシル基、８－メチルドデシル基、９－メチルドデシル基、１０－メチルドデシル基、１１－メチルドデシル基、１－エチルウンデシル基、１，１－ジメチルウンデシル基、２，２－ジメチルウンデシル基、３，３－ジメチルウンデシル基、４，４－ジメチルウンデシル基、５，５－ジメチルウンデシル基、６，６－ジメチルウンデシル基、７，７－ジメチルウンデシル基、８，８－ジメチルウンデシル基、９，９－ジメチルウンデシル基、１０，１０－ジメチルウンデシル基、１－メチル－９，９－ジメチルデシル基、２－メチル－９，９－ジメチルデシル基、３－メチル－９，９－ジメチルデシル基、４－メチル－９，９－ジメチルデシル基、５－メチル－９，９－ジメチルデシル基、６－メチル－９，９－ジメチルデシル基、７－メチル－９，９－ジメチルデシル基、８－メチル－９，９－ジメチルデシル基；
ｎ－テトラデシル基、１－メチルトリデシル基、２－メチルトリデシル基、３－メチルトリデシル基、４－メチルトリデシル基、５－メチルトリデシル基、６－メチルトリデシル基、７－メチルトリデシル基、８－メチルトリデシル基、９－メチルトリデシル基、１０－メチルトリデシル基、１１－メチルトリデシル基、１２－メチルトリデシル基、１－エチルドデシル基、１，１－ジメチルドデシル基、２，２－ジメチルドデシル基、３，３－ジメチルドデシル基、４，４－ジメチルドデシル基、５，５－ジメチルドデシル基、６，６－ジメチルドデシル基、７，７－ジメチルドデシル基、８，８－ジメチルドデシル基、９，９－ジメチルドデシル基、１０，１０－ジメチルドデシル基、１１，１１－ジメチルドデシル基、１－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、２－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、３－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、４－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、５－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、６－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、７－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、８－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基、９－メチル－１０，１０－ジメチルウンデシル基；
ｎ－ペンタデシル基、１－メチルテトラデシル基、２－メチルテトラデシル基、３－メチルテトラデシル基、４－メチルテトラデシル基、５－メチルテトラデシル基、６－メチルテトラデシル基、７－メチルテトラデシル基、８－メチルテトラデシル基、９－メチルテトラデシル基、１０－メチルテトラデシル基、１１－メチルテトラデシル基、１２－メチルテトラデシル基、１３－メチルテトラデシル基、１－エチルトリデシル基、１，１－ジメチルトリデシル基、２，２－ジメチルトリデシル基、３，３－ジメチルトリデシル基、４，４－ジメチルトリデシル基、５，５－ジメチルトリデシル基、６，６－ジメチルトリデシル基、７，７－ジメチルトリデシル基、８，８－ジメチルトリデシル基、９，９－ジメチルトリデシル基、１０，１０－ジメチルトリデシル基、１１，１１－ジメチルトリデシル基、１２，１２－ジメチルトリデシル基、１－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、２－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、３－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、４－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、５－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、６－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、７－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、８－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、９－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基、１０－メチル－１１，１１－ジメチルドデシル基；
ｎ－ヘキサデシル基、１－メチルペンタデシル基、２－メチルペンタデシル基、３－メチルペンタデシル基、４－メチルペンタデシル基、５－メチルペンタデシル基、６－メチルペンタデシル基、７－メチルペンタデシル基、８－メチルペンタデシル基、９－メチルペンタデシル基、１０－メチルペンタデシル基、１１－メチルペンタデシル基、１２－メチルペンタデシル基、１３－メチルペンタデシル基、１４－メチルペンタデシル基；
ｎ－ヘプタデシル基、１－メチルヘキサデシル基、２－メチルヘキサデシル基、３－メチルヘキサデシル基、４－メチルヘキサデシル基、５－メチルヘキサデシル基、６－メチルヘキサデシル基、７－メチルヘキサデシル基、８－メチルヘキサデシル基、９－メチルヘキサデシル基、１０－メチルヘキサデシル基、１１－メチルヘキサデシル基、１２－メチルヘキサデシル基、１３－メチルヘキサデシル基、１４－メチルヘキサデシル基、１５－メチルヘキサデシル基；
ｎ－オクタデシル基、１－メチルヘプタデシル基、２－メチルヘプタデシル基、３－メチルヘプタデシル基、４－メチルヘプタデシル基、５－メチルヘプタデシル基、６－メチルヘプタデシル基、７－メチルヘプタデシル基、８－メチルヘプタデシル基、９－メチルヘプタデシル基、１０－メチルヘプタデシル基、１１－メチルヘプタデシル基、１２－メチルヘプタデシル基、１３－メチルヘプタデシル基、１４－メチルヘプタデシル基、１５－メチルヘプタデシル基、１６－メチルヘプタデシル基；
ｎ－ノナデシル基、１－メチルオクタデシル基、２－メチルオクタデシル基、３－メチルオクタデシル基、４－メチルオクタデシル基、５－メチルオクタデシル基、６－メチルオクタデシル基、７－メチルオクタデシル基、８－メチルオクタデシル基、９－メチルオクタデシル基、１０－メチルオクタデシル基、１１－メチルオクタデシル基、１２－メチルオクタデシル基、１３－メチルオクタデシル基、１４－メチルオクタデシル基、１５－メチルオクタデシル基、１６－メチルオクタデシル基、１７－メチルオクタデシル基；
ｎ－イコシル基、１－メチルノナデシル基、２－メチルノナデシル基、３－メチルノナデシル基、４－メチルノナデシル基、５－メチルノナデシル基、６－メチルノナデシル基、７－メチルノナデシル基、８－メチルノナデシル基、９－メチルノナデシル基、１０－メチルノナデシル基、１１－メチルノナデシル基、１２－メチルノナデシル基、１３－メチルノナデシル基、１４－メチルノナデシル基、１５－メチルノナデシル基、１６－メチルノナデシル基、１７－メチルノナデシル基、１８－メチルノナデシル基；
ｎ－ヘンイコシル基、１－メチルイコシル基、２－メチルイコシル基、３－メチルイコシル基、４－メチルイコシル基、５－メチルイコシル基、６－メチルイコシル基、７－メチルイコシル基、８－メチルイコシル基、９－メチルイコシル基、１０－メチルイコシル基、１１－メチルイコシル基、１２－メチルイコシル基、１３－メチルイコシル基、１４－メチルイコシル基、１５－メチルイコシル基、１６－メチルイコシル基、１７－メチルイコシル基、１８－メチルイコシル基、１９－メチルイコシル基；
ｎ－ドコシル基、１－メチルヘンイコシル基、２－メチルヘンイコシル基、３－メチルヘンイコシル基、４－メチルヘンイコシル基、５－メチルヘンイコシル基、６－メチルヘンイコシル基、７－メチルヘンイコシル基、８－メチルヘンイコシル基、９－メチルヘンイコシル基、１０－メチルヘンイコシル基、１１－メチルヘンイコシル基、１２－メチルヘンイコシル基、１３－メチルヘンイコシル基、１４－メチルヘンイコシル基、１５－メチルヘンイコシル基、１６－メチルヘンイコシル基、１７－メチルヘンイコシル基、１８－メチルヘンイコシル基、１９－メチルヘンイコシル基、２０－メチルヘンイコシル基；等が挙げられる。
　Ｒ１がＣ２－２２アルケニル基の場合、当該アルケニル基としては、Ｃ２－２２アルキル基として挙げられた基中の炭素分子同士の飽和結合のうちの１～３個を、不飽和結合とした基が挙げられる。
　一般式（Ｉ）において、一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよい。本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、合成の容易性と品質安定性の点から、一分子中に３個在るＲ１は、全て同種の基であることが好ましい。
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｒ１は、直鎖状のＣ１－２２アルキル基又は直鎖状のＣ２－２２アルケニル基であることが好ましく、直鎖状のＣ１５－２２アルキル基又は直鎖状のＣ１５－２２アルケニル基であることがより好ましい。本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一分子中に在る３個のＲ１が、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－イコシル基、ｎ－ヘンイコシル基、ｎ－ドコシル基、ｎ－ペンタデセニル基、ｎ－ヘキサデセニル基、ｎ－ヘプタデセニル基、ｎ－オクタデセニル基、ｎ－ノナデセニル基、ｎ－イコセニル基、ｎ－ヘンイコセニル基、及び、ｎ－ドコセニル基からなる群より選択される、同種の基又は互いに異種の基であることがより好ましく、一分子中に在る３個のＲ１が全て、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－イコシル基、ｎ－ヘンイコシル基、ｎ－ドコシル基、ｎ－ペンタデセニル基、ｎ－ヘキサデセニル基、ｎ－ヘプタデセニル基、ｎ－オクタデセニル基、ｎ－ノナデセニル基、ｎ－イコセニル基、ｎ－ヘンイコセニル基、及び、ｎ－ドコセニル基からなる群より選択される同種の基であることがさらに好ましい。
　一般式（Ｉ）中、Ｚ１は、１個のヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基、又は単結合である。当該Ｃ１－６アルキレン基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。当該Ｃ１－６アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、１－メチルメチレン基、１－ヒドロキシメチルメチレン基、ｎ－プロピレン基、１－メチルエチレン基、１－ヒドロキシメチルエチレン基、２－メチルエチレン基、ｎ－ブチレン基、１－メチルプロピレン基、１－ヒドロキシメチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、３－メチルプロピレン基、１－エチルエチレン基、２－エチルエチレン基、ｎ－ペンチレン基、１－メチルブチレン基、２－メチルブチレン基、３－メチルブチレン基、４－メチルブチレン基、１－エチルプロピレン基、２－エチルプロピレン基、３－エチルプロピレン基、ｎ－ヘキシレン基、１－メチルペンチレン基、２－メチルペンチレン基、３－メチルペンチレン基、４－メチルペンチレン基、１－エチルブチレン基、２－エチルブチレン基、３－エチルブチレン基等が挙げられる。本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｚ１が、メチレン基、エチレン基、ｎ－プロピレン基、１－ヒドロキシメチルメチレン基、１－メチルメチレン基、１－メチルエチレン基、１－ヒドロキシメチルエチレン基、又は２－メチルエチレン基である化合物が好ましく、Ｚ１が、メチレン基、エチレン基、ｎ－プロピレン基、又は１－ヒドロキシメチルメチレン基である化合物がより好ましい。
　一般式（Ｉ）中、Ｘは、－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、又は、５～７員非芳香族ヘテロ環基である。Ｘが示す５～７員非芳香族ヘテロ環基は、炭素原子によりＺ１に結合する。
　一般式（Ｉ）中、Ｘが－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）である場合、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよいＣ１－４炭化水素基である。当該Ｃ１－４炭化水素基としては、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－４アルキル基であってもよく、直鎖状又は分岐鎖状のＣ２－４アルケニル基であってもよい。
　Ｒ２及びＲ３がＣ１－４アルキル基である場合、当該のＣ１－４アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。Ｒ２及びＲ３がＣ２－４アルケニル基である場合、当該Ｃ２－４アルケニル基としては、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチルビニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基等が挙げられる。本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）中、Ｘが－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）である場合、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して、水素原子又は直鎖状若しくは分岐鎖状のＣ１－４アルキル基である化合物が好ましく、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して、水素原子又は直鎖状のＣ１－４アルキル基である化合物がより好ましく、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、又はｎ－プロピル基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（Ｉ）中、Ｘが－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）である場合、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成していてもよい。Ｒ２及びＲ３が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環としては、例えば、１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、及び１－ピペラジニル基が挙げられる。
　Ｘが－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）であり、かつＲ２及びＲ３が互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成している場合、形成される５～７員非芳香族ヘテロ環は、環中の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよい。当該Ｃ１－４炭化水素基としては、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基が好ましい。該環中の２個の水素原子がＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていている場合、互いに同じ基により置換されていてもよく、互いに異なる基により置換されていてもよい。含窒素環式基としては、窒素原子にカルボニル基が隣接している環から誘導される基が好ましく、例えば、ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２（３Ｈ）－オン、１,３－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－オン、インドリン－２－オン、１,３－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－オン、１,３－ジヒドロ－２Ｈ－イミダゾール－２－オン、オキサゾール－２（３Ｈ）－オン、オキサゾリジン－２－オン、イミダゾリジン－２－オン、ピロリジン－２－オン、１，４－ジヒドロイソキノリン－３（２Ｈ）－オン、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－２－オン、３，４－ジヒドロキナゾリン－２（１Ｈ）－オン、３，４－ジヒドロキノリン－２（１Ｈ）－オン、１，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン－２－オン、３，４－ジヒドロピリジン－２（１Ｈ）－オン、３，６－ジヒドロ－ピリジン－２（１Ｈ）－オン、３，６－ジヒドロ－２Ｈ－１,３－オキサジン－２－オン、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１,３－オキサジン－２－オン、３，４－ジヒドロピリミジン－２（１Ｈ）－オン、ピペリジン－２－オン、１,３－オキサジナン－２－オン、テトラヒドロピリミジン－２（１Ｈ）－オン等の含窒素環から誘導される基が挙げられる。
　Ｘが－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）であり、かつＲ２及びＲ３が互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成している場合、当該５～７員非芳香族ヘテロ環を構成する炭素原子のうちの１個は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい。当該他の含窒素環式基としては、窒素原子にカルボニル基が隣接している環から誘導される基が好ましく、具体的には、前記と同様の基が挙げられる。
　一般式（Ｉ）中、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基である場合、当該ヘテロ環基に含まれるヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子などを挙げることができる。当該ヘテロ環基中のヘテロ環を構成するヘテロ原子は、１個でもよく、同一又は異なるヘテロ原子が２個以上でもよい。当該ヘテロ環基中のヘテロ環は、飽和のヘテロ環であってもよく、１個又は２個以上の二重結合が含まれていてもよいが、ヘテロ環が芳香環となることはない。
　Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基である場合、当該ヘテロ環基は、炭素原子によりＺ１に結合し、当該環上には１若しくは２個のＣ１－４炭化水素基又はアミド基が置換されていてもよい。当該Ｃ１－４炭化水素基としては、直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－４アルキル基であってもよく、直鎖状又は分岐鎖状のＣ２－４アルケニル基であってもよい。直鎖状又は分岐鎖状のＣ１－４アルキル基、及び、直鎖状又は分岐鎖状のＣ２－４アルケニル基は、前記で挙げられたものを用いることができる。
　一般式（Ｉ）中、－Ｚ１－Ｘとしては、下記式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）、及び（Ｈ－１７）のいずれかの基が好ましい。一般式（Ｉ）中、－Ｚ１－Ｘとしては、下記式（Ｈ－１８）～（Ｈ－２６）のいずれかの基であることも好ましい。下記式中、黒丸は結合手を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）中、－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）、及び（Ｈ－１７）のいずれかの基である化合物が好ましく、一般式（Ｉ）中、Ｒ１が直鎖状のＣ１－２２アルキル基又は直鎖状のＣ２－２２アルケニル基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）、及び（Ｈ－１７）のいずれかの基である化合物がより好ましく、一般式（Ｉ）中、Ｒ１が直鎖状のＣ１５－２２アルキル基又は直鎖状のＣ１５－２２アルケニル基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）、及び（Ｈ－１７）のいずれかの基である化合物がさらに好ましく、一般式（Ｉ）中、Ｒ１が直鎖状のＣ１５－２２アルキル基又は直鎖状のＣ１５－２２アルケニル基であり、一分子中に在る３個のＲ１が全て同じ基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）、及び（Ｈ－１７）のいずれかの基である化合物がよりさらに好ましい。なかでも、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）中、一分子中に在る３個のＲ１が全て、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－イコシル基、ｎ－ヘンイコシル基、ｎ－ドコシル基、ｎ－ペンタデセニル基、ｎ－ヘキサデセニル基、ｎ－ヘプタデセニル基、ｎ－オクタデセニル基、ｎ－ノナデセニル基、ｎ－イコセニル基、ｎ－ヘンイコセニル基、及び、ｎ－ドコセニル基のいずれかの基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）、及び（Ｈ－１７）のいずれかの基である化合物が特に好ましい。
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）中、－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１８）～（Ｈ－２６）のいずれかの基である化合物が好ましく、一般式（Ｉ）中、Ｒ１が直鎖状のＣ１－２２アルキル基又は直鎖状のＣ２－２２アルケニル基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１８）～（Ｈ－２６）のいずれかの基である化合物がより好ましく、一般式（Ｉ）中、Ｒ１が直鎖状のＣ１５－２２アルキル基又は直鎖状のＣ１５－２２アルケニル基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１８）～（Ｈ－２６）のいずれかの基である化合物がさらに好ましく、一般式（Ｉ）中、Ｒ１が直鎖状のＣ１５－２２アルキル基又は直鎖状のＣ１５－２２アルケニル基であり、一分子中に在る３個のＲ１が全て同じ基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１８）～（Ｈ－２６）のいずれかの基である化合物がよりさらに好ましい。なかでも、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）中、一分子中に在る３個のＲ１が全て、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－イコシル基、ｎ－ヘンイコシル基、ｎ－ドコシル基、ｎ－ペンタデセニル基、ｎ－ヘキサデセニル基、ｎ－ヘプタデセニル基、ｎ－オクタデセニル基、ｎ－ノナデセニル基、ｎ－イコセニル基、ｎ－ヘンイコセニル基、及び、ｎ－ドコセニル基のいずれかの基であり、かつ－Ｚ１－Ｘが式（Ｈ－１８）～（Ｈ－２６）のいずれかの基である化合物が特に好ましい。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、下記一般式（Ｉ－１）～（Ｉ－８）、（Ｉ－１６）、及び（Ｉ－１７）で表される化合物が挙げられる。式中、Ｒ１は一般式（Ｉ）と同じである。各化合物のみかけのｐＫａも併せて示す。一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質中、Ｘは親水性部であり、この部分の構造により、当該ｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａが影響を受ける。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、下記一般式（Ｉ－１８）～（Ｉ－２６）で表される化合物が挙げられる。式中、Ｒ１は一般式（Ｉ）と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、１つのｓｐ３炭素から３本のＲ１からなる炭化水素鎖が延びており、当該ｓｐ３炭素にはさらに、Ｚ１を介してＸからなる親水性基が連結されている。このため、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、Ｘからなる親水性基が、Ｒ１からなる３本の炭化水素鎖によって立体的に遮蔽される配向をとり得る。一方で、ＣＬ４Ｈ６等の特許文献１に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質は、２本の疎水性鎖と親水性基とを有しており、当該親水性基と疎水性鎖が互いに分離するような位置関係にある。これらの立体構造の相違により、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子の構成脂質として使用した場合に、従来のＣＬ４Ｈ６等のｐＨ感受性カチオン性脂質とは異なる特性が期待できる。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは特に限定されないが、例えば４．０～９．０程度、好ましくは４．５～８．５程度、より好ましくは５．０～８．５程度で選択することができ、この範囲のｐＫａを与えるように各置換基の種類を選択することが好ましい。当該ｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは、特に、一般式（Ｉ）中の－Ｚ１－Ｘの影響を受ける。例えば一般式（Ｉ）中の－Ｚ１－Ｘを、式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）～（Ｈ－２６）の中から所望のｐＫａに近い基とすることにより、所望のｐＫａのｐＨ感受性カチオン性脂質が得られる。
　本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、例えば、下記一般式（Ａ）で表される化合物（以下、「化合物（Ａ）」ということがある）、下記一般式（Ｂ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｂ）」ということがある）と、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとを、縮合させることにより製造することができる。一般式（Ａ）中のＲ１は、一般式（Ｉ）中のＲ１と同じである。一般式（Ｂ）中のＺ１及びＸは、それぞれ、一般式（Ｉ）中のＺ１及びＸと同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　化合物（Ａ）のカルボン酸基とトリスのヒドロキシ基とを脱水縮合させてエステル結合を形成し、さらに、化合物（Ｂ）のカルボン酸基とトリスのアミノ基とを脱水縮合させてアミド結合を形成させることによって、一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質が合成される。化合物（Ａ）のカルボン酸基とトリスのヒドロキシ基との脱水縮合反応は、一般的にカルボン酸とアルコールとのエステル化物を形成する際の脱水縮合反応と同様の反応条件で行うことができる。化合物（Ｂ）のカルボン酸基とトリスのアミノ基との脱水縮合反応は、一般的にカルボン酸とアミンとのアミド化物を形成する際の脱水縮合反応と同様の反応条件で行うことができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質は、トリスをリンカーとすることにより、一般的な脱水縮合反応で、比較的簡便に合成することができる。
　トリスに、化合物（Ａ）を反応させて、トリスのヒドロキシ基との脱水縮合反応を行った後、得られたエステル化物に対して化合物（Ｂ）を反応させて、トリス由来のアミノ基との脱水縮合反応を行うことによって、一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質が合成できる。また、トリスに、化合物（Ｂ）を反応させて、トリスのアミノ基との脱水縮合反応を行った後、得られたアミド化物に対して化合物（Ａ）を反応させて、トリス由来のヒドロキシ基との脱水縮合反応を行ことによっても、一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質が合成できる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｚ１がエチレン基であり、Ｘが－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）である化合物（一般式（Ｉ’）で表される化合物）は、例えば、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドを用いて、より簡便な合成方法で合成することができる。一般式（Ｉ’）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、前記一般式（Ｉ）中の－Ｚ１－Ｘが、式（Ｈ－１）、（Ｈ－４）、（Ｈ－５）、（Ｈ－１６）、（Ｈ－１７）、（Ｈ－２１）、（Ｈ－２２）、（Ｈ－２３）、（Ｈ－２４）、（Ｈ－２５）、（Ｈ－２６）である化合物が挙げられる。具体的には、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドに下記一般式（Ｃ）で表される第２級アミン化合物（以下、「化合物（Ｃ）」ということがある）を付加させた後、得られた一般式（Ｄ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｄ）」）と化合物（Ａ）とを縮合させることにより製造することができる。一般式（Ｉ’）、一般式（Ｃ）及び一般式（Ｄ）中のＲ２及びＲ３は、それぞれ、一般式（Ｉ）のＸ中のＲ２及びＲ３と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド中の不飽和結合への化合物（Ｃ）の付加反応は、一般的にアルケンに第２級アミンを付加する際の付加反応と同様の反応条件で行うことができる。化合物（Ａ）のカルボン酸基と化合物（Ｄ）のヒドロキシ基との脱水縮合反応は、一般的にカルボン酸とアルコールとのエステル化物を形成する際の脱水縮合反応と同様の反応条件で行うことができる。すなわち、一般式（Ｉ’）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質は、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドを用いることにより、一般的な付加反応と脱水縮合反応で、比較的簡便に合成することができる。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質は、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は一般式（Ｉ）の範囲に包含される任意の脂質を容易に製造することができる。
［脂質ナノ粒子］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質とする。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質が２種類以上である場合、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。
　脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占める本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の割合は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係る脂質ナノ粒子においては、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の量の割合（［本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、５モル％以上が好ましく、１０モル％以上がより好ましく、２０モル％以上がさらに好ましい。一方で、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に占めるｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が多すぎると、脂質ナノ粒子の所望の特性を付与するためのその他の脂質の含有量が少なすぎてしまう場合がある。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子における脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質の量の割合は、９０モル％以下であることが好ましく、８０モル％以下がより好ましく、７０モル％以下がさらに好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質以外の脂質としては、一般的にリポソームを形成する際に使用される脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えば、リン脂質、ステロール、糖脂質、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、カルジオリピン、プラスマロゲン、セラミドホスフォリルグリセロールホスファート、ホスファチジン酸等のグリセロリン脂質；スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルエタノールアミン等のスフィンゴリン脂質；などを挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いることもできる。グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質における脂肪酸残基は、特に限定されないが、例えば、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、炭素数１４～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。これらのグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が２以上の脂肪酸残基を有する場合、全ての脂肪酸残基が同一の基であってもよく、互いに異なる基であってもよい。
　ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールなどが挙げられる。糖脂質としては、例えば、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；などが挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数１２～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質としては、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質に加えて、中性脂質を含むことが好ましく、リン脂質又はステロールを含むことがより好ましく、ステロールを含むことがさらに好ましく、コレステロールを含むことがよりさらに好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質成分としてポリアルキレングリコール修飾脂質を含有することが好ましい。ポリアルキレングリコールは親水性ポリマーであり、ポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質ナノ粒子を構築することにより、脂質ナノ粒子の表面をポリアルキレングリコールで修飾することができる。ポリアルキレングリコールで表面修飾することにより、脂質ナノ粒子の血中滞留性などの安定性を高めることができる場合がある。
　ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば３００～１０，０００程度、好ましくは５００～１０，０００程度、さらに好ましくは１，０００～５，０００程度である。
　例えば、脂質のポリエチレングリコールによる修飾には、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸ＰＥＧ４５（ＳＴＲ－ＰＥＧ４５）など）を用いることができる。その他、Ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００]－１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００］－１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル-メトキシポリエチレングリコール－７５０］－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル-メトキシポリエチレングリコール－２０００］－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００]－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－ＤＭＧ）などのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。
　本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合は、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質による標的組織への選択性、具体的には、本発明に係る脂質ナノ粒子を遺伝子発現キャリアとして用いる場合の標的組織特異的遺伝子発現活性を損なわない量であれば特に限定されるものではない。例えば、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合は、０．５～３モル％とすることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面を親水性ポリマー等で修飾することにより、血中滞留性を高めることができる。これらの修飾基で修飾された脂質を脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子の核内移行を促進するために、例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３～１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３～６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。中でも、好ましくはグルコースの３量体ないし６量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの３量体又は４量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して１～３０モル％程度、好ましくは２～２０モル％程度、より好ましくは５～１０モル％程度である。
　オリゴ糖化合物で脂質ナノ粒子を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質ナノ粒子をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（国際公開第２００７／１０２４８１号）が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本願明細書の開示として含める。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、脂質ナノ粒子の血液中での滞留性を向上させ、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質ナノ粒子を脱出させて、封入された核酸を標的細胞内でより効率よく発現させることができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチドなどからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和若しくは不飽和脂肪族アミンなどを挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の大きさは、生体内の標的細胞に高い送達効率が得られやすいことから、平均粒子径が４００ｎｍ以下であることが好ましく、平均粒子径が３００ｎｍ以下であることがより好ましく、平均粒子径が２００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１５０ｎｍ以下であることがよりさらに好ましい。なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は０．０１～０．７程度、好ましくは０．０１～０．６程度、さらに好ましくは０．０１～０．３程度である。ゼータ電位は－５０ｍＶ～５ｍＶの範囲、好ましくは－１０ｍＶ～５ｍＶの範囲とすることができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、球状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソームであることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜で覆われた粒子内部に、標的の細胞内に送達する目的の成分を内包していることが好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子が粒子内部に内包する成分としては、内包可能な大きさであれば特に限定されるものではない。本発明に係る脂質ナノ粒子には、核酸、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる成分としては、核酸が好ましい。核酸としては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やホスホロチオエートＤＮＡなど）であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよく、線状であってもよく、環状であってもよい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内で発現させるための外来遺伝子を含むことが好ましく、細胞内に取り込まれることによって外来遺伝子を細胞内で発現させるために機能する核酸であることがより好ましい。当該外来遺伝子は、標的細胞のゲノムＤＮＡ中に本来含まれている遺伝子であってもよく、ゲノムＤＮＡ中に含まれていない遺伝子であってもよい。このような核酸としては、発現させる目的の遺伝子をコードする塩基配列からなる核酸を含む遺伝子発現ベクターが挙げられる。当該遺伝子発現ベクターは、導入された細胞内において、染色体外遺伝子として存在するものであってもよく、相同組換えによりゲノムＤＮＡ中に取り込まれるものであってもよい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されるものではなく、一般的に遺伝子治療等で使用されるベクターを用いることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる遺伝子発現ベクターとしては、プラスミドベクター等の核酸ベクターであることが好ましい。プラスミドベクターは、環状のままであってもよく、予め線状に切断した状態で本発明に係る脂質ナノ粒子に封入させてもよい。遺伝子発現ベクターは、発現させる対象の遺伝子の塩基配列情報に基づいて、一般的に使用される分子生物学的ツールを利用して常法により設計でき、公知の各種の方法で製造することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内に存在する標的遺伝子の発現を制御する機能性核酸であることも好ましい。当該機能性核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるｓｉＲＮＡ発現ベクターとなるプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であってもよい。ｓｉＲＮＡ発現ベクターとしては、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターから調製することができ、また、これを適宜改変してもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸としては、特に生体内の組織への選択性が良好であることから、ｍＲＮＡ又はｐＤＮＡであることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、当該脂質ナノ粒子に封入させる成分、例えば核酸等を含む水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
　水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質ナノ粒子を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１,３－ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質ナノ粒子を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０～８．０程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、流路を用いたアルコール希釈法により製造することもできる。当該方法は、アルコール溶媒に脂質成分を溶解させた溶液と、水系溶媒に脂質ナノ粒子に包含させる水溶性成分を溶解させた溶液とを、別々の流路から導入し、これを合流させることによって脂質ナノ粒子を製造する方法である。２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることにより、直径３０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を再現良く製造可能である（非特許文献５）。製造に使用する流路としては、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることから、特許文献２に記載されているような、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることが好ましい。アルコール希釈法において用いられる水系溶媒としては、前記のものを用いることができる。
　得られた脂質ナノ粒子の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３－ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、標的組織への遺伝子発現キャリアとして機能する。本発明に係る脂質ナノ粒子に、標的細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した上で、被験動物へ投与することにより、当該被験動物の標的組織内で当該外来遺伝子が発現する。本発明に係る脂質ナノ粒子は、核酸以外の薬効成分を封入して当該薬効成分を標的組織へ導入することもでき、薬剤輸送キャリアとしても有用である。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、遺伝子治療をはじめとする各種の治療に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用である。
　構成脂質として、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、肝臓への組織特異性が高い化合物を用い、その他の構成脂質も肝臓へ取り込まれやすい脂質を選択して用いることにより、肝臓選択性の高い脂質ナノ粒子を製造できる。同様に、構成脂質として、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、脾臓への組織特異性が高い化合物を用い、その他の構成脂質も脾臓へ取り込まれやすい脂質を選択して用いることにより、脾臓選択性の高い脂質ナノ粒子を製造できる。このような肝臓選択性の高い脂質ナノ粒子や脾臓選択性の高い脂質ナノ粒子に遺伝子発現ベクターを封入したものを動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入された遺伝子発現ベクターは、他の臓器よりも肝臓や脾臓において選択的に発現する。同様に、本発明に係る脂質ナノ粒子のうち、肝臓選択性の高い脂質ナノ粒子や脾臓選択性の高い脂質ナノ粒子にｓｉＲＮＡ発現ベクターを封入したものを動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入されたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、他の臓器よりも肝臓や脾臓において選択的に発現し、当該発現ベクターが標的とする遺伝子の発現が抑制される。
　肝臓選択性の高い脂質ナノ粒子としては、ホスファチジルコリンが構成脂質全体に占める含有割合が７ｍｏｌ％以下、好ましくは２～７ｍｏｌ％、より好ましくは３～５ｍｏｌ％であり、かつ見かけｐＫａが７．５以下、好ましくは７．２以下であるものが挙げられる。見かけｐＫａが当該範囲内の脂質ナノ粒子は、例えば、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ｐＫａが７．５以下、好ましくは６．０～７．４の脂質を構成脂質として用いることにより調製できる。
　脾臓選択性の高い脂質ナノ粒子としては、ホスファチジルコリンが構成脂質全体に占める含有割合が８ｍｏｌ％以上、好ましくは１０ｍｏｌ％以上、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％、さらに好ましくは１０～２０ｍｏｌ％であり、かつ本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ｐＫａが６．２～６．６程度の脂質を構成脂質としたものが挙げられる。中でも、ホスファチジルコリンが構成脂質全体に占める含有割合を８ｍｏｌ％以上とし、かつ本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－５）、（Ｈ－１６）、又は（Ｈ－４）である脂質を構成脂質としたものが好ましい。
　ホスファチジルコリンが構成脂質全体に占める含有割合が比較的多く、かつ本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ｐＫａが６．２～６．６程度の脂質を構成脂質とした脂質ナノ粒子は、脾臓を構成する細胞のうち、特にＢ細胞や樹状細胞への選択性が高い。例えば、Ｂ細胞選択性の高い脂質ナノ粒子としては、ホスファチジルコリンが構成脂質全体に占める含有割合が５ｍｏｌ％以上、好ましくは１０ｍｏｌ％以上、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％、さらに好ましくは１０～２０ｍｏｌ％であり、かつ本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ｐＫａが６．２～６．６程度の脂質、好ましくは－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－５）、（Ｈ－１６）、又は（Ｈ－４）である脂質を構成脂質としたものが挙げられる。樹状細胞選択性の高い脂質ナノ粒子としては、ホスファチジルコリンが構成脂質全体に占める含有割合が３ｍｏｌ％以上、好ましくは５ｍｏｌ％以上、より好ましくは５～２５ｍｏｌ％、さらに好ましくは５～２０ｍｏｌ％であり、かつ本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、ｐＫａが６．２～６．６程度の脂質、好ましくは－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－５）、（Ｈ－１６）、又は（Ｈ－４）である脂質を構成脂質としたものが挙げられる。
　標的組織を肺とするキャリアとして用いるための脂質ナノ粒子としては、見かけｐＫａが７．５以上、好ましくは７．５～８．５であるものが挙げられる。肺選択性の高い脂質ナノ粒子としては、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－１９）、（Ｈ－１８）、（Ｈ－２）、（Ｈ－３）、又は（Ｈ－４）である脂質を構成脂質としたものが好ましい。
　標的組織を脳とするキャリアとして用いるための脂質ナノ粒子としては、例えば、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－４）である脂質を構成脂質としたものが好ましい。
　標的組織を心臓とするキャリアとして用いるための脂質ナノ粒子としては、例えば、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－１９）、（Ｈ－４）、（Ｈ－１６）、又は（Ｈ－７）である脂質を構成脂質としたものが好ましい。
　標的組織を筋肉とするキャリアとして用いるための脂質ナノ粒子としては、例えば、本発明に係るｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、－Ｚ１－Ｘが、前記一般式（Ｈ－１８）、（Ｈ－１９）、（Ｈ－４）、又は（Ｈ－１６）である脂質を構成脂質としたものが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。また、本発明に係る脂質ナノ粒子を動物に投与する際の投与経路は、特に限定されるものではないが、経静脈投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等の非経口投与であることが好ましい。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜ＮＭＲ＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ社のＮＭＲ装置（ＥＣＡ５００装置、ＥＣＺ４００装置、又はＥＣＸ４００Ｐ装置）を用いて、テトラメチルシランを内部標準（０ｐｐｍ）として取得した。ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｍはマルチプレットの略語である。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの化学シフトは、σスケールで、テトラメチルシランからダウンフィールドで、ｐｐｍで報告された。
＜脂質ナノ粒子の構成脂質＞
　ＹＳＫ０５は、非特許文献２に記載の方法で合成したものを用いた。７－（４－（ジメチルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイル ジオレエート（ＣＬ１Ｈ６）、７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）－７－ヒドロキシトリデカン－１,１３－ジイル ジオレアート（ＣＬ４Ｈ６）、及び７－ヒドロキシ７－（４－（（１－メチルピペリジン－４－カルボニル）オキシ）ブチル）トリデカン－１,１３－ジイル ジオレアート（ＣＬ１５Ｈ６）は、特許文献１に記載の方法で合成したものを用いた。ＣＬ４Ｆ６（７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）－１３－（（２－ヘキシルノナノイル）オキシ）－７－ヒドロキシトリデシル　２－ヘキシルデカノエート）は、後記比較合成例１で合成したものを用いた。７－ヒドロキシ－７－（４－モルホリノブチル）トリデカン－１,１３－ジイルジオレエート（ＣＬ７Ｈ６）は、後記比較合成例２で合成したものを用いた。ＳＭ－１０２はCayman Chemical社製を、ＡＬＣ－０３１５はAmbeed社製を、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）はSelleck Biotech社製を、コレステロール（Ｃｈｏｌ）はSIGMA Aldrich社製を、それぞれ用いた。１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、メトキシエチレングリコール２０００修飾２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、及びメトキシエチレングリコール２０００修飾２－ジステアリル－ｒａｃ－グリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）は、日油社製を用いた。
＜薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、全ての反応の反応物は、プレコートされたＴＬＣプレート（Millipore社製）を用いたＴＬＣによってモニターされた。ＴＬＣの可視化は、ＵＶ光（２５４ｎｍ）、リンモリブデン酸染色、又はｐ－アニスアルデヒド染色によって行った。反応産物は、自動化されたcombiflash（登録商標） Rf クロマトグラフィーシステム（Teledyne ISCO社製）又はSelektシステム（Biotage社製）によって精製された。
＜ｍＲＮＡ＞
　脂質ナノ粒子に内包させる核酸のうち、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡ（CleanCap FLuc mRNA、5moU）及びオボアルブミン（ＯＶＡ）をコードするｍＲＮＡ（Ova mRNA）は、TriLink Biotechnologies社製を用いた。
＜脂質ナノ粒子の調製＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、脂質ナノ粒子は、流路を用いたアルコール希釈法により調製した。
　実施例１１～１８における脂質ナノ粒子の調製には、流路としては、ミキサー内蔵マイクロ流体デバイス「ｉＬｉＮＰ」（ライラックファーマ社製）を用いた。当該デバイスの流量は、シリンジポンプ（ハーバード装置）を使用して制御した。
　具体的には、まず、各脂質成分を所定のモル比で含有する総脂質濃度８ｍＭに調整したエタノール溶液を８０μＬと、核酸濃度５５μｇ／ｍＬに調整した酢酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０）を２４０μＬとをマイクロ流路内に送液し、流路から排出された脂質ナノ粒子溶液を回収した。当該脂質ナノ粒子溶液を、透析膜（MWCO 12,000-14,000、Spectrum Laboratories社製）に入れ、外水相をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）として、４℃、２時間以上透析した後、透析膜から脂質ナノ粒子溶液を回収した。
　実施例３３以降の実施例における脂質ナノ粒子の調製は、バッフルミキサー内蔵マイクロ流路ｉＬｉＮＰ（ライラックファーマ製）を用いた。
　具体的には、まず、１ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ溶液 １３．７５μＬを２５０μＬになるように２５ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０）で希釈した溶液をＲＮＡ溶液として、１ｍＬ容シリンジ（HAMILTON社製）に分取した。また、ｐＨ感受性カチオン性脂質／ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＳＧ＝５０／４０／１０／１．０（ｍｏｌ％）の場合、１０ｍＭ ｐＨ感受性カチオン性脂質／エタノール溶液を２００μＬ、１０ｍＭ コレステロール／エタノール溶液を１６０μＬ、１０ｍＭ ＤＳＰＣ／エタノール溶液を４０μＬ、１ｍＭ ＰＥＧ－ＤＳＧ／エタノール溶液を４０μＬ、及びエタノール６０μＬを混合して全量を５００μＬとした溶液（脂質終濃度８ｍＭ、１００％エタノール）を脂質溶液として、１ｍＬ容シリンジ（HAMILTON社製）に分取した。それぞれのシリンジをシリンジポンプに装着し、バッフルミキサー内蔵マイクロ流路とポンプを接続し、ＲＮＡ溶液と脂質溶液を流速比３：１（Ｎ／Ｐ＝７．４）、総流速５００μＬ／分となるようにマイクロ流路内に送液し、流路から排出された脂質ナノ粒子溶液を回収した。当該脂質ナノ粒子溶液を、透析膜（MWCO 12,000-14,000、Spectrum Laboratories社製）に入れ、外水相をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）として、４℃、２時間以上透析することによってエタノールの除去及びバッファー交換を行った後、透析膜から脂質ナノ粒子溶液を回収した。
＜脂質ナノ粒子の平均粒子径とゼータ電位の測定＞
　脂質ナノ粒子のＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）中における平均粒子径（個数平均値）、ζ平均粒子径、及び多分散度指数（ＰｄＩ）、並びに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中におけるゼータ電位を、動的光散乱法を利用した分析装置「Zetasizer Nano ZS ZEN3600」（Malvern社製）を用いて測定した。
＜脂質ナノ粒子の封入率（カプセル化効率）＞
　脂質ナノ粒子の封入率は、ＲＮＡインターカレーターであるRibogreen（life technologies社製）を用いて封入されている核酸（ｍＲＮＡ）の量を測定して求めた。濃度既知のｍＲＮＡの希釈系列溶液から作成された検量線に基づき、ｍＲＮＡ量を定量した。
　具体的には、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）、１０ｗ／ｖ％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを、１０ウェルあたりそれぞれ９７８．８μＬ、２０μＬ、１．２５μＬずつ混合したものをＴｒｉｔｏｎ（＋）バッファーとし、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に置き換えたものをＴｒｉｔｏｎ（－）バッファーとした。サンプルを蛍光測定用黒色９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、さらにＴｒｉｔｏｎ（＋）バッファー又はＴｒｉｔｏｎ（－）バッファーを１００μＬ／ウェル添加した。当該プレートをシェーキングインキュベーター（SI-300、AS ONE社製）で軽く振とうさせた後（７００ｒｐｍ、３０秒間）、各ウェルの蛍光強度をマイクロプレートリーダー（VARIOSKAN LUX、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて測定し（波長 Ｅｘ／Ｅｍ＝５００ｎｍ／５２５ｎｍ）、核酸の封入率（％）を算出した。
＜脂質ナノ粒子の見かけのｐＫａの測定＞
　脂質ナノ粒子の見かけのｐＫａは、p-Toluenesulfonic acid（ＴＮＳ）を用いて測定した。まず、ＴＮＳ（終濃度：０．７５μＭ）と脂質ナノ粒子（終濃度：３０μＭ）を各ｐＨ（ｐＨ３．５～９．５）に調整した緩衝液（２００ｍＬ）中で混合した。緩衝液としては、２０ｍＭ クエン酸緩衝液、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、又は１３０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いた。調製された混合液の蛍光強度を、分光蛍光光度計（VarioskanLux、Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、λex＝３２１ｎｍ、λem＝４４７ｎｍの設定で測定した。測定値のうち、最も高い値及び低い値をそれぞれ１００％及び０％荷電率とし、５０％荷電率を示すｐＨを見かけのｐＫａとして算出した。カチオン性に帯電したｐＨ感受性カチオン性脂質の含有比率（％）は、ヘンダーソン・ハッセルバルチの式を使用して算出した。
＜マウスへの脂質ナノ粒子の投与＞
　マウスへの脂質ナノ粒子の投与は、２７Ｇの注射針を用いて尾静脈内投与することにより行った。マウスは、特に記載のない限り、ＢＡＬＢ／ｃ（４～５週齢、雌）を用いた。
＜Ｆｌｕｃ活性の測定＞
　まず、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢）に、０．０１ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇの用量でＦｌｕｃ ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を静脈注射した。静脈注射から６時間後に、マウスを安楽死させ、各組織を回収し、液体窒素で凍結させて、－８０℃で保存した。ビーズ式細胞破砕装置（Micro Smash MS-100R、TOMY Seiko社製）を使用して、パッシブ溶解バッファー（Promega社製）で組織をホモジナイズした。組織破片は、遠心分離によって除去し、上清を回収した。当該上清中のＦｌｕｃ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（E1500、Promega社製）を製造元のプロトコルに従って使用して測定した。発光は、ルミノメーター（Luminescencer-PSN、ATTO社製）を使用して測定した。タンパク質濃度は、市販の測定キット（BCA Protein Assay Kit、Pierce社製）を使用して決定した。Ｆｌｕｃ活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの相対光単位（ＲＬＵ）として表した。
［比較合成例１］ＣＬ４Ｆ６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　特許文献１に記載の方法で合成された７－（４－（ジイソプロピルアミノ）ブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（１．０ｍｍｏｌ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、続いて、２－ヘキシルデカノイン酸（２．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン）（０．２０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（３．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。濾液を０．５Ｎ 酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー［溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）］に供することにより精製して、ＣＬ４Ｆ６を得た。
［比較合成例２］ＣＬ７Ｈ６の合成
（１）２，２，３，３，１９，１９，２０，２０－オクタメチル－１１－（４－モルホリノブチル）－４,１８－ジオキサ－３,１９－ジシラヘニコサン－１１－オール（化合物１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　モルホリン（１０．５ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）及びＤＣＭ（ジクロロメタン、２９ｍＬ）を１１－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－５－（６－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）ヘキシル）－５－ヒドロキシウンデシル－４－メチルベンゼンスルホネート（１３．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）に加えた後、得られた反応混合物を室温で５日間撹拌した。当該反応混合物から溶媒を蒸発させた後、残留物をＥｔＯＡｃに懸濁させた後に濾過した。得られた濾液を、水（５０ｍＬ×２）、次いでブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後、濾液を蒸発させることによって、粗製物が淡黄色の油性残留物として得られた。当該残留物を、シリカゲルカラム（ＳｉＯ２）にロードし、ＤＣＭとメタノールのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、化合物１（１０．３ｇ、収率８６％）が淡黄色の油として得られた。
（２）７－（４－モルホリノブチル）トリデカン－１,７,１３－トリオール（化合物２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　化合物１（１０．３ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、得られた溶液を氷上で冷却した。当該溶液に１２Ｎ ＨＣｌ溶液（５ｍＬ）を加えた反応混合物を、室温で一晩撹拌した。当該反応混合物から溶媒を蒸発させた後、残留物をＮａＯＨ水溶液（０．５Ｍ、１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。得られた有機相を混ぜ合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を蒸発させることによって、粗製物が淡黄色の油性残留物として得られた。当該残留物を、シリカゲルカラム（ＳｉＯ２）にロードし、ＤＣＭとメタノールのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、化合物２（３．９３ｇ、収率５３％）が無色の油として得られた。
（３）ＣＬ７Ｈ６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　化合物２（３．９３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）及びオレイン酸（６．５４ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）に溶解させ、得られた混合物に、ＤＭＡＰ（２８３ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（５．０５ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を、周囲温度で８時間撹拌した。当該反応混合物から溶媒を蒸発させた後、残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で懸濁し、得られた懸濁液を、ＮａＯＨ水溶液（０．５Ｍ、１００ｍＬ）、次いでブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を蒸発させることによって、粗製物が淡黄色の油性残留物として得られた。当該残留物を、シリカゲルカラム（ＳｉＯ２）にロードし、ＤＣＭとメタノールと水酸化アンモニウムとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＣＬ７Ｈ６（９．１７ｇ、収率９７％）が淡黄色の油として得られた。
［実施例１］
　トリスのヒドロキシ基に、オレイン酸残基を縮合させた後、得られたエステル化物のトリス由来アミノ基に、３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸を縮合させて、２－（３－（ジメチルアミノ）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－１）を合成した。
（１）　ｔｅｒｔ－ブチル（１,３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル）カルバメート（化合物１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　ｔｅｒｔ－ブタノール（７５ｍＬ）に溶解させた二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（２３．５ｇ、１０７．７ｍｍｏｌ）を、トリス（１０．０ｇ、８２．６ｍｍｏｌ）をメタノール（７５ｍＬ）とｔｅｒｔ－ブタノール（７５ｍＬ）の混合溶媒に分散させた溶液に滴下させた。 得られた反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、当該反応混合物を蒸発させた。得られた残留物を、冷ＥｔＯＡｃで沈殿させることにより精製した。真空濾過により、化合物１（１６．７ｇ、収率９１％）が白色粉末として得られた。
（２）　２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（化合物２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　化合物１（２．２１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物にさらに、オレイン酸（９．３２ｇ、３３．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン）（１２２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）（７．６７ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）を溶解させた。得られた反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌した後、蒸発させた。得られた残留物をＥｔＯＡｃで懸濁し、飽和クエン酸溶液、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。当該溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、化合物２（８．５０ｇ、収率８４％）が無色の油として得られた。
（３）　２２－アミノ－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　化合物２（８．５０ｇ、８．３８ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（４４ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（５ｍＬ）及びＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）（１ｍＬ）を加えた。得られた反応混合物を、周囲温度で３時間撹拌した。当該反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、有機相を１Ｎ ＮａＯＨ水溶液、水及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＥｔＯＡｃのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－０（５．００ｇ、収率６５％）が無色の油として得られた。
（４）　２－（３－（ジメチルアミノ）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－１）の合成。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　ＴＯＴ－０（３６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩（７６．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４．９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（８３．６μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（１１５ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、３５℃で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１ｍＬ：１．４ｍＬ）で懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ＤＣＭとメタノールのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－１（２４５ｍｇ、収率６０％）が無色の油として得られた。
［実施例２］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、４－（ジメチルアミノ）酪酸を縮合させて、２－（４－（ジメチルアミノ）ブタナミド）-2-（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩に代えて、４－（ジメチルアミノ）酪酸塩酸塩（８３．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をＴＯＴ－０に反応させた以外は、実施例１と同様にして、ＴＯＴ－２（３４１ｍｇ、収率８３％）が無色の油として得られた。
［実施例３］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、４－（ジメチルアミノ）酪酸を縮合させて、２－（１－メチルピペリジン－４－カルボキサミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩に代えて、１－メチル－ピペラジン－４－カルボン酸塩酸塩（８９．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をＴＯＴ－０に反応させた以外は、実施例１と同様にして、ＴＯＴ－３（３４５ｍｇ、収率８３％）が白いワックスとして得られた。
［実施例４］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸を縮合させて、２－（３－（ジエチルアミノ）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩に代えて、３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩（９０．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をＴＯＴ－０に反応させた以外は、実施例１と同様にして、ＴＯＴ－４（６７．６ｍｇ、収率１６％）が無色の油として得られた。
［実施例５］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸を縮合させて、２－（（オレオイルオキシ）メチル）－２－（３－（ピペリジン－１－イル）プロパナミド）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩に代えて、１－ピペリジンプロピオン酸（７８．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をＴＯＴ－０に反応させた以外は、実施例１と同様にして、ＴＯＴ－５（１４６ｍｇ、収率３５％）が無色の油として得られた。
［実施例６］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、３－（ジメチルアミノ）プロピオン酸を縮合させて、２－（２－アミノアセトアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　ＴＯＴ－０（３６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（４ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グリシン（１３１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ－ＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド）（１２２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で懸濁させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた後、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）（１．８ｍＬ）とピペリジン（２００μＬ）を混合物に加えた。得られた反応混合物は、周囲温度で一晩撹拌した後、蒸発させた。残留物を順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＡｃＯＥｔのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－６（２５２ｍｇ、収率６５％）が無色の油として得られた。
［実施例７］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－メチル－グリシンを縮合させて、２－（２－（メチルアミノ）アセトアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　ＴＯＴ－０（３６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をエタノール（４ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－メチル－グリシン（１３７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）とＤＭＴ－ＭＭ（１２２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物に、ＤＭＦ（１．８ｍＬ）とピペリジン（２００μＬ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌させた。得られた反応混合物を蒸発させた後、残留物を順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＡｃＯＥｔのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－７（２８８ｍｇ、収率７３％）が無色の油として得られた。
［実施例８］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル]－Ｌ－セリンを縮合させて、２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－ヒドロキシプロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　ＴＯＴ－０（３６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をエタノール（４ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル]－Ｌ－セリン（１６９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）とＤＭＴ－ＭＭ（１２２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を無水ＤＣＭ（２．８ｍＬ）に溶解させ、ＴＦＡ（０．８ｍＬ）及びＴＩＰＳ（０．４ｍＬ）を加えた。得られた反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌した後、ＥｔＯＡｃで希釈した。得られた有機相を、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液、水、及びブラインで洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物に、ＤＭＦ（１．８ｍＬ）とピペリジン（２００μＬ）を加えた後、周囲温度で一晩撹拌させた。得られた反応混合物を蒸発させた後、残留物を順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＡｃＯＥｔのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－８（１５７ｍｇ、収率３９％）が無色の油として得られた。
［実施例９］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、Ｎ－エチル－Ｎ－メチル－ベータ－アラニンを縮合させて、２－（３－（エチル（メチル）アミノ）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－１６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　ＴＯＴ－０（３６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、Ｎ－エチル－Ｎ－メチル－ベータ－アラニン（８３．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４．９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（８３．６μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（１１５ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＡｃＯＥｔのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで生成した。これにより、ＴＯＴ－１６（２７．１ｍｇ、収率６．６％）が無色の油として得られた。
［実施例１０］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸を縮合させて、２－（（オレオイルオキシ）メチル）－２－（３－（ピロリジン－１－イル）プロパナミド）プロパン－１,３－ジイルジオレエート（ＴＯＴ－１７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　ＴＯＴ－０（３６６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物に、３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸塩酸塩（８９．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４．９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（８３．６μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）、及びＥＤＣＩ（１１５ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で懸濁し、０．５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＡｃＯＥｔのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－１７（３６．３ｍｇ、収率８．７％）が無色の油として得られた。
［試験例１］
　実施例１～５で合成したＴＯＴ－１～ＴＯＴ－５と、ＹＳＫ０５、ＣＬ１Ｈ６、ＣＬ４Ｈ６、ＣＬ７Ｈ６、ＣＬ１５Ｈ６、ＣＬ４Ｆ６、ＳＭ－１０２、ＡＬＣ－０３１５、及びＭＣ３について、ＴＬＣを行い、極性表面に対する親和性を調べた。
　具体的には、各イオン化脂質（それぞれ、５～１０ｎｍｏｌ）をアルミニウムＴＬＣプレート（シリカゲル）にスポットし、ジクロロメタン：メタノール（１９：１又は９：１）（容量比）を移動相として泳動させ、ｐ－アニスアルデヒドで染色し、移動度（Ｒｆ値）を測定した。
　各脂質のＲｆ値を見かけのｐＫａ値に対してプロットしたプロット図を図１に示す。図１（Ａ）は、ジクロロメタン：メタノール（９：１）を移動相としたＴＬＣの結果を、図１（Ｂ）は、ジクロロメタン：メタノール（１９：１）を移動相としたＴＬＣの結果を、それぞれ示す。図中、黒丸がＴＯＴ（ＴＯＴ－１～ＴＯＴ－５）のプロットであり、白丸がＴＯＴ以外の脂質（ＹＳＫ０５、ＣＬ１Ｈ６、ＣＬ４Ｈ６、ＣＬ７Ｈ６、ＣＬ１５Ｈ６、ＣＬ４Ｆ６、ＳＭ－１０２、ＡＬＣ－０３１５、及びＭＣ３）のプロットである。図１に示すように、各イオン化脂質の移動度（Ｒｆ値）は、見かけのｐＫａ値と相関した。特に、ＴＯＴは、他の脂質と比較して、高いＲｆ値を示した。これらの結果から、ＴＯＴは、Ｘからなる親水性基が、Ｒ１からなる３本の炭化水素鎖によって立体的に遮蔽されており、極性の高いシリカゲルとの相互作用が弱いことが示唆された。
［実施例１１］
　実施例５で合成したＴＯＴ－５を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ－５以外の脂質として、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。ＰＥとして、ＤＯＰＥを使用した。
　具体的には、ＴＯＴ－５、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－５／ＤＯＰＥ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０～６５／１０～３５／０～４０／１（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡを搭載させた脂質ナノ粒子（ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図２に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認された。この結果から、ＴＯＴ－５を構成脂質とした脂質ナノ粒子は、今回使用した全ての組成において、肝臓や脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることが確認された。なかでも、構成脂質の組成比がＴＯＴ－５／ＤＯＰＥ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６０／１５／２５／１のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子が肝臓で高いＦｌｕｃ活性を示し、脾臓でのＦｌｕｃ活性はさほど高くなかったことから、肝臓選択性の遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。
［実施例１２］
　実施例５で合成したＴＯＴ－５を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ－５以外の脂質として、ＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。ＰＥとして、ＤＯＰＥ又はＰＯＰＥを使用した。
　具体的には、実施例１１と同様にして、ＴＯＴ－５、ＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－５／ＰＥ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６０／１５／２５／１（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図３に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認されたが、ＤＯＰＥを含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のほうが、ＰＯＰＥを含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子よりも高いＦｌｕｃ活性を示し、遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。
［実施例１３］
　実施例４～８で合成したＴＯＴ－４～ＴＯＴ－８を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ以外の脂質として、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、実施例１１と同様にして、ＴＯＴ－４～ＴＯＴ－８のいずれか１種、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ／ＤＯＰＥ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６０／１５／２５／１．０（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図４に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認されたことから、ＴＯＴ－４、ＴＯＴ－６～ＴＯＴ－８を構成脂質とする脂質ナノ粒子も、ＴＯＴ－５を構成脂質とする脂質ナノ粒子と同様に、肝臓や脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることが確認された。なかでも、ＴＯＴ－４又はＴＯＴ－５を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、非常に高いＦｌｕｃ活性を示し、遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。一方で、ＴＯＴ－６～ＴＯＴ－８を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、肝臓よりも脾臓におけるＦｌｕｃ活性が高かったことから、ＴＯＴ－６～ＴＯＴ－８を含む脂質ナノ粒子は脾臓選択性が高く、脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることが示された。
［実施例１４］
　実施例５で合成したＴＯＴ－５を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ－５以外の脂質として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。ＰＣとして、ＤＳＰＣを使用した。
　具体的には、ＴＯＴ－５、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５５～７０／５～３０／１０～３５／１（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図５に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認された。この結果から、ＴＯＴ－５を構成脂質とした脂質ナノ粒子は、今回使用した全ての組成において、肝臓や脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることが確認された。なかでも、構成脂質の組成比がＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、脾臓で高いＦｌｕｃ活性を示し、肝臓でのＦｌｕｃ活性はさほど高くなかったことから、脾臓選択性の遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。また、構成脂質の組成比がＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／５／３０／１のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、肝臓において非常に高いＦｌｕｃ活性を示したことから、肝臓選択性の遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。
［実施例１５］
　実施例４で合成したＴＯＴ－４を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ－４以外の脂質として、ＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。ＰＣとして、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、又はＤＯＰＣを使用した。
　具体的には、ＴＯＴ－４、ＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－４／ＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図６に示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、肝臓と脾臓でＦｌｕｃ活性が確認された。この結果から、ＴＯＴ－４を構成脂質とした脂質ナノ粒子は、今回使用した全ての組成において、肝臓や脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることが確認された。なかでも、ＤＳＰＣを含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子とＤＰＰＣを含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、いずれも、肝臓よりも脾臓において高いＦｌｕｃ活性を示し、脾臓選択性の遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。特に、ＤＳＰＣを含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、肝臓でのＦｌｕｃ活性が比較的抑えられていたことから、ＴＯＴ－４を含有する脂質ナノ粒子のうち、脾臓選択性の遺伝子発現キャリアとしては、中性脂質としてＤＳＰＣが最適であることが示唆された。
［実施例１６］
　実施例１～１０で合成したＴＯＴ－１～ＴＯＴ－８、ＴＯＴ－１６、及びＴＯＴ－１７を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ以外の脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、ＴＯＴ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。ＴＯＴを２種類用いた場合には、それぞれ等量ずつ、合計量が６５モル％となるように調整した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図７に示す。図中、「ＴＯＴ－１，５」は、ＴＯＴとしてＴＯＴ－１とＴＯＴ－５を等量ずつ使用して製造されたＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の結果を示す。いずれの脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、脾臓でＦｌｕｃ活性が確認されたことから、ＴＯＴ－１～ＴＯＴ－４、ＴＯＴ－６～ＴＯＴ－８、ＴＯＴ－１６、及びＴＯＴ－１７、並びにＴＯＴ－１とＴＯＴ－５の混合物を構成脂質とする脂質ナノ粒子も、ＴＯＴ－５を構成脂質とする脂質ナノ粒子と同様に、脾臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることが確認された。なかでも、ＴＯＴ－４を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、脾臓で非常に高いＦｌｕｃ活性を示し、脾臓選択性の遺伝子発現キャリアとして優れていることが示された。また、ＴＯＴ－２を構成脂質とするＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子以外はいずれも、肝臓でＦｌｕｃ活性が確認されたことから、ＴＯＴ－１、ＴＯＴ－３～ＴＯＴ－８、ＴＯＴ－１６、及びＴＯＴ－１７、並びにＴＯＴ－１とＴＯＴ－５の混合物を構成脂質とする脂質ナノ粒子は、肝臓を標的とする遺伝子発現キャリアとして有用であることも確認された。
［実施例１７］
　実施例１６で最も脾臓選択性が良好であったＴＯＴ－４を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子と、市販の脾臓選択性の高い脂質であるＲＮＡ－ＬＰＸ（BioNTech社製）を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子との脾臓における遺伝子発現能を比較した。
　ＲＮＡ－ＬＰＸの脂質組成（モル比）は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ＝５０／５０（ｍｏｌ％）である。ＲＮＡ－ＬＰＸを使用したＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、構成脂質としてＲＮＡ－ＬＰＸを使用した以外は、実施例１６のＴＯＴ－４を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子と同様にして調製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図８に示す。この結果、ＴＯＴ－４を含むＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、脾臓において、ＲＮＡ－ＬＰＸを使用したＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の２４倍も高い遺伝子発現を示した。
［実施例１８］
　ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＴＯＴ－４を用いた脂質ナノ粒子と、ＣＬ４Ｆ６を用いた脂質ナノ粒子との、各組織に対する遺伝子発現活性を比較して調べた。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質以外の脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、ＴＯＴ－４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－４／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＴＯＴ－４含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。また、ＣＬ４Ｆ６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＣＬ４Ｆ６／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＣＬ４Ｆ６含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。結果を図９に示す。図中、「ＮＴ」は脂質ナノ粒子を投与していないマウスの結果であり、「Ｆ」はＣＬ４Ｆ６含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果であり、「ＰＣ」はＴＯＴ－４含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果である。この結果、ＴＯＴ－４含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、ＣＬ４Ｆ６含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子と同様に、脾臓及び肝臓で高い遺伝子発現を示した。
［実施例１９］
　ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＴＯＴ－４を用いた脂質ナノ粒子と、ＣＬ４Ｆ６を用いた脂質ナノ粒子との、各組織に対する遺伝子発現活性を比較して調べた。
　具体的には、実施例１８と同様にして、ＴＯＴ－４／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成のＴＯＴ－４含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子と、ＣＬ４Ｆ６／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／１．５（ｍｏｌ％）の組成のＣＬ４Ｆ６含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、多分散度指数（ＰｄＩ）、及び封入率（％）を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに投与し、各組織のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（Ｎ＝３）。
　具体的には、まず、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．２ｍｇ／ｋｇとなるようにマウスに尾静脈内投与し、脂質ナノ粒子投与から６時間後に、肝臓、脾臓、肺、心臓、脳、筋肉を約５０ｍｇずつ回収したのち、凍結保管した。回収した臓器に、パッシブ溶解バッファー（Promega社製）を各チューブに５００μＬずつ添加した。肝臓は４０００ｒｐｍ、２０秒間で２回、脾臓、腎臓、肺、及び心臓は５０００ｒｐｍ、２０秒間で２回、筋肉は５０００ｒｐｍ、２０秒間で４回、それぞれホモジナイズし、１３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離処理し、上清を回収して測定用サンプルとした。肝臓と脾臓に対しては、パッシブ溶解バッファーを用いて１００倍希釈した。ルシフェラーゼアッセイシステム（E1500、Promega社製）のルシフェラーゼアッセイバッファー５０μＬを予め添加した試験管に、測定用サンプル（組織上清）５０μＬをピペッティングにより混合し、ルミノメーターにより発光量を測定した。タンパク質濃度は、市販の測定キット（BCA Protein Assay Kit、Pierce社製）を使用して決定した。Ｆｌｕｃ活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの相対光単位（ＲＬＵ）として表した。
　各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの各組織のルシフェラーゼ発現量（Ｆｌｕｃ活性）の測定結果を図１０に示す。ＴＯＴ－４含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、脾臓、肺、脳、心臓、及び筋肉で、ＣＬ４Ｆ６含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスよりも、高いルシフェラーゼ活性を示した。これらの結果から、ＴＯＴ－４を構成脂質とする脂質ナノ粒子は、様々な組織に輸送可能な遺伝子発現キャリアとなることが示唆された。
［実施例２０］
　ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＴＯＴ－４を用いた脂質ナノ粒子の各組織への送達を調べた。
　ＴＯＴ－４以外の脂質として、ＤＯＰＥ又はＤＳＰＣと、コレステロールと、ＰＥＧ－ＤＭＧとを使用した。
　具体的には、実施例１９と同様にして、ＴＯＴ－４、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－４／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、ＤＳＰＣ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。また、ＴＯＴ－４、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－４／ＤＯＰＥ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６０／１５／２５／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、ＤＯＰＥ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、体重１ｋｇ当たりのＦｌｕｃ ｍＲＮＡの投与量が０．０１ｍｇとなるように尾静脈内投与した、投与から６時間後に、ルシフェラーゼの発現を生きた動物の生物発光イメージングによって評価した。具体的には、マウスをイソフルラン下で麻酔した後、１００μＬの基質溶液（ｄ－ルシフェリンを３０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解させた溶液）を腹腔内注射した。麻酔下のマウスを黒いシートの上に置き、個体全体のルシフェラーゼ由来発光の強度を測定した。各臓器のルシフェラーゼ由来発光の強度は、イメージングシステム（IVIS Luminaシステム、Perkin Elmer社製）を用いて画像化して測定した。画像は、「Living Imageソフトウェアv.4.3」（６４ビット、Caliper Life Sciences社製）で処理した。
　マウス個体全体のルシフェラーゼ由来発光強度を測定したイメージング画像を図１１に示す。ＤＯＰＥ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、主に肝臓でルシフェラーゼ発現が観察され、ＤＳＰＣ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、脾臓で特に発現が観察された。ＤＳＰＣ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、踵や手、鼻先、首元などでも発現がみられた。これらの結果から、血管への送達、あるいは免疫細胞への送達により、血管が集まる部位で発現がみられた可能性が示唆された。
［実施例２１］
　ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＴＯＴ－５を用いた脂質ナノ粒子の、抗腫瘍効果のあるｍＲＮＡの遺伝子発現キャリアとしての有用性を調べた。
　ＴＯＴ－５以外の脂質として、ＤＳＰＣと、コレステロールと、ＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　抗腫瘍効果のあるｍＲＮＡとして、Ｏｖａ ｍＲＮＡを用い、腫瘍細胞として、Ｏｖａ抗原を安定発現するマウスリンパ腫細胞株ＥＬ４細胞（Ｅ.Ｇ.７－ＯＶＡ細胞）を用いた。
　具体的には、まず、実施例１９と同様にして、ＴＯＴ－５、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、Ｏｖａ ｍＲＮＡを封入したＯｖａｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雌、６週齢）の脇腹領域に、マウス１匹当たり５×１０５個のＥ.Ｇ.７－ＯＶＡ細胞を皮下注射して接種させた。その後、各マウスの腫瘍体積を、経時的に測定した。
［腫瘍体積（ｍｍ３）］＝［腫瘍の長軸（ｍｍ）］×［腫瘍の短軸（ｍｍ）］２）×０．５２
　腫瘍細胞接種から７日目と１０日目に、ＰＢＳに懸濁させたＯｖａｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、０、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、又は０．５ｍｇ ＲＮＡ／ｋｇ体重となるように尾静脈内投与した。
　腫瘍体積をモニタリングした結果を図１２に示す。ＯｖａｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の投与から１８日目において、０．１ｍｇ ＲＮＡ／ｋｇ以上の投与量で、抗腫瘍効果がみられた。
［実施例２２］
　Ｎ－（１,３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル）－３－（ピペリジン－１－イル）プロパンアミド（化合物３）を用いて、ＴＯＴ－５を合成した。
（１）Ｎ－（１,３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル）－３－（ピペリジン－１－イル）プロパンアミド（化合物３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　ピペリジン（１．９８ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）を、メタノール（１０ｍＬ）に溶解させたＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド（９３％、１．８８４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）に加えた。当該反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。これにより、化合物３（２．７２ｇ、収率９７％）が白色粉末として得られた。得られた粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
（２）ＴＯＴ－５の合成
　化合物３（２６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた溶液に、オレイン酸（８９０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（６３３ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を４０℃で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃで懸濁し、シリカゲルに通した後、濾液を０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）及びブラインで洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ヘキサンと０．５％ ＴＥＡ含有ＡｃＯＥｔとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－５（７９９ｍｇ、収率７６％）が無色の油として得られた。
［実施例２３］
　３－（ジエチルアミノ）－Ｎ－（１,３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル）プロパンアミド（化合物４）を用いて、ＴＯＴ－４を合成した。
（１）３－（ジエチルアミノ）－Ｎ－（１,３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル）プロパンアミド（化合物４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　ジエチルアミン（６．２７ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド（９３％、１．８８４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）に加えた。当該反応混合物を、４０℃で一晩撹拌させた。得られた残留物を、順相カラム（Sfaer Silica HCD、Biotage社製）にロードし、ＤＣＭとメタノールとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、化合物４（２．０１ｇ、収率８１％）が淡黄色固体として得られた。
（２）ＴＯＴ－４の合成
　化合物４（１２４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解させた溶液に、オレイン酸（４７８ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３０７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を４０℃で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃで懸濁し、シリカゲルに通した後、濾液を０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）及びブラインで洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた残留物を、アミノカラム（Sfaer Amino D、Biotage社製）にロードし、ヘキサンとＡｃＯＥｔとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－４（２３５ｍｇ、収率４５％）が無色の油として得られた。
［実施例２４］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、１－エチルピペリジン－４－カルボン酸を縮合させて、２－（１－エチルピペリジン－４－カルボキサミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－１８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸に代えて１－エチルピペリジン－４－カルボン酸（７８．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－１７と同様にして、ＴＯＴ－１８（３７．４ｍｇ、収率８．９％）が無色の油として得られた。
［実施例２５］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、１－（プロフェン－２－イル）ピペリリド－４－カルボン酸を縮合させて、２－（１－イソプロピルピペリジン－４－カルボキサミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－１９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸に代えて１－（プロフェン－２－イル）ピペリリド－４－カルボン酸（１０３．９ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－１７と同様にして、ＴＯＴ－１９（１０８．４ｍｇ、収率２５．４％）が無色の油として得られた。
［実施例２６］
　実施例１で合成したＴＯＴ－０中のアミノ基に、３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸塩酸塩を縮合させて、２－（１－メチルピロリジン－３－カルボキサミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２０）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸に代えて３－（ピロリジン－１－イル）プロパン酸塩酸塩（８９．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－１７と同様にして、ＴＯＴ－２０（１１６．６ｍｇ、収率２８．４％）が無色の油として得られた。
［実施例２７］
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドとＮω－メチルトリプタミンとオレイン酸を縮合させて、２－（３－（（２－（１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）（メチル）アミノ）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２１）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド（９３％、１８８．４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮω－メチルトリプタミンを、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）及び水（０．４ｍＬ）に溶解させた。得られた反応混合物を、暗所で周囲温度で一晩撹拌させた後、蒸発させた。得られた粗生成物を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解させ、オレイン酸（８９０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（６３３ｍｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、暗所で周囲温度で一晩撹拌させた。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で懸濁し、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。得られた溶液を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を、順相カラム（Rening、Biotage社製）にロードし、０．５％ ＴＥＡ含有ヘキサンと０．５％ ＴＥＡ含有ＡｃＯＥｔとのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－２１（９９３．３ｍｇ、収率８７％）が無色の油として得られた。
［実施例２８］
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドとイソニペクトアミドとオレイン酸を縮合させて、２－（３－（４－カルバモイルピペリジン－１－イル）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　水に溶解させたＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド（９３％、５２．６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）に、２－プロパノール（６００μＬ）に溶解させたイソニペクトアミド（３８．５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を、周囲温度で一晩撹拌させた後、溶媒を減圧下で除去した。得られた粗生成物を無水ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解させ、オレイン酸（２８２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ－ＨＣｌ（２１１ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応混合物を、４０℃で一晩撹拌させた。得られた反応混合物をヘキサンで希釈し、セライトパッドに通した後、濾液を蒸発させた。残留物を、順相カラム（Rening、Biotage社製）にロードし、０．５％ ＴＥＡ含有ヘキサンと０．５％ ＴＥＡ含有ＡｃＯＥｔのグラジエント移動相を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、ＴＯＴ－２２（１７１．５ｍｇ、収率５２％）が無色の油として得られた。
［実施例２９］
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドとＮ－メチル－２－ピリジンメタンアミンとオレイン酸を縮合させて、２－（３－（メチル（ピリジン－２－イルメチル）アミノ）プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　イソニペクトアミドに代えて、Ｎ－メチル－２－ピリジンメタンアミン（３６．７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－２２と同様にして、ＴＯＴ－２３（２１５ｍｇ、収率６５．７％）が淡黄色の油として得られた。
［実施例３０］
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドと１'Ｈ－スピロ［ピペリジン－４,４'－キナゾリン］－２'（３'Ｈ）－オンとオレイン酸を縮合させて、２－（（オレオイルオキシ）メチル）－２－（３－（２'－オキソ－２',３'－ジヒドロ－１'Ｈ－スピロ［ピペリジン－４,４'－キナゾリン］－１－イル）プロパンアミド）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　イソニペクトアミドに代えて、１'Ｈ－スピロ［ピペリジン－４,４'－キナゾリン］－２'（３'Ｈ）－オン（６５．２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－２２と同様にして、ＴＯＴ－２４（１５５．８ｍｇ、収率４３．８％）が無色の油として得られた。
［実施例３１］
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドと３－（４－ピペリジニル）－１,３－ベンゾオキサゾール－２（３Ｈ）－オンとオレイン酸を縮合させて、２－（（オレオイルオキシ）メチル）－２－（３－（４－（２－オキソベンゾ［ｄ］オキサゾール－３（２Ｈ）－イル）ピペリジン－１－イル）プロパンアミド）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　イソニペクトアミドに代えて、３－（４－ピペリジニル）－１,３－ベンゾオキサゾール－２（３Ｈ）－オン（６５．５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－２２と同様にして、ＴＯＴ－２５（１１６．２ｍｇ、収率３２．６％）が黄色の油として得られた。
［実施例３２］
　Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドとＮ－メチル－４－ピリジルメチルアミンとオレイン酸を縮合させて、２－（３－（メチル（ピリジン－４－イルメチル）アミノ)プロパンアミド）－２－（（オレオイルオキシ）メチル）プロパン－１,３－ジイルジオレート（ＴＯＴ－２６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　イソニペクトアミドに代えて、Ｎ－メチル－４－ピリジルメチルアミン（３６．７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を用いた以外は、ＴＯＴ－２２と同様にして、ＴＯＴ－２６（５４ｍｇ、収率１６．５％）が無色の油として得られた。
［実施例３３］
　実施例１～１０、２４～２６で合成したＴＯＴ－１～８、１６～２０のｐＨ感受性カチオン性脂質（以下、まとめて「ＴＯＴ」ということがある）を構成脂質として用いて、脂質ナノ粒子を調製した。
　ＴＯＴ以外の脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、各種ＴＯＴ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、アルコール希釈法によって、ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のζ平均粒子径（ｎｍ）、多分散度指数（ＰｄＩ）、ｐＫａ、及び封入率（％）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
　表２に示すように、全ての脂質ナノ粒子において、ζ平均粒子径は１００～２００ｎｍ程度、封入率は９０％程度であり、いずれも遺伝子発現キャリアとして十分に好適な物性であった。また、構成脂質としたＴＯＴによって脂質ナノ粒子のｐＫａは影響を受けており、ＴＯＴを適切に選択することによって、６．２から７．７以上と非常に幅広い範囲内で所望のｐＫａの脂質ナノ粒子を調製できることが確認された。
　次いで、調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子をＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、各組織のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。対照として、ＴＯＴに代えてＣＬ４Ｆ６を用いて、ＣＬ４Ｆ６／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／１０／４０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で調製したＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子も同様にマウスに投与して、各組織のＦｌｕｃ活性を測定した。各組織のＦｌｕｃ活性は、実施例１９と同様にして測定した。
　各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの各組織のルシフェラーゼ発現量の測定結果を図１３～１８に示す。肝臓では、ＴＯＴを含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスではいずれも、コントロールマウス（ＣＬ４Ｆ６含有脂質ナノ粒子を投与したマウス）よりもルシフェラーゼ活性は低かった（図１３）。脾臓では、ＴＯＴ－５、ＴＯＴ－１６、ＴＯＴ－４を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスで、コントロールマウスよりもルシフェラーゼ活性が高く、ｐＫａが６．２～６．６程度のＴＯＴを構成脂質とすることにより、脾臓選択性を高められることがわかった（図１４）。肺では、ＴＯＴ－１９を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスが最もルシフェラーゼ活性が高く、ＴＯＴ－１８、ＴＯＴ－２、ＴＯＴ－３、ＴＯＴ－４を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、コントロールマウスよりもルシフェラーゼ活性が高かった（図１５）。ＴＯＴ－１８、ＴＯＴ－１９、ＴＯＴ－２、ＴＯＴ－３は、ｐＫａが７．５以上であることから、ｐＫａが高いＴＯＴを選択することで、脂質ナノ粒子の肺選択性を高められることが示唆された。脳では、ＴＯＴ－４を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスで非常に顕著にルシフェラーゼ活性が高く、ＴＯＴ－４を構成脂質とすることにより、脳へ効率よく輸送可能なキャリアを製造できることが示唆された（図１６）。心臓では、ＴＯＴ－４とＴＯＴ－１９を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスのルシフェラーゼ活性が非常に高く、ＴＯＴ－１６とＴＯＴ－７を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、コントロールマウスよりもルシフェラーゼ活性が高かった（図１７）。筋肉では、ＴＯＴ－１８とＴＯＴ－１９とＴＯＴ－４を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスのルシフェラーゼ活性が非常に高く、ＴＯＴ－１６を含有させた脂質ナノ粒子を投与したマウスでも、コントロールマウスよりもルシフェラーゼ活性が高かった（図１８）。
［実施例３４］
　統計解析の結果、脂質ナノ粒子の組織への取り込みにおいて、肝臓と脾臓の選択性は、当該脂質ナノ粒子の構成脂質全体に占めるＤＳＰＣの含有割合の影響を受けることが予測された。そこで、ＤＳＰＣの含有割合をふった脂質ナノ粒子を調製し、肝臓と脾臓への取り込みを調べた。
　具体的には、実施例１９と同様にして、ＴＯＴ－５、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／Ｘ／３５－Ｘ／１．５（ｍｏｌ％）（Ｘ＝３、５、１０、１５、又は２０）の組成で用いて、ＴＯＴ－５含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．０１ｍｇ／ｋｇとなるようにＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、脂質ナノ粒子投与から６時間後に肝臓と脾臓を回収し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（Ｎ＝３）。各組織のＦｌｕｃ活性は、実施例１９と同様にして測定した。
　また、カチオン性脂質として、ＴＯＴ－５に代えて、ＳＭ－１０２、ＡＬＣ－０３１５、又はＭＣ３を用いたＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子も同様にして、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝５０／Ｘ／５０－Ｘ／１．５（ｍｏｌ％）（Ｘ＝５、１０、１５、又は２０）の組成で作製してマウスに尾静脈内投与し、肝臓及び脾臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。
　各マウスの肝臓及び脾臓のＦｌｕｃ活性の測定結果を図１９に示す。ＴＯＴ－５含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果を図１９（Ａ）に、ＭＣ３含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果を図１９（Ｂ）に、ＳＭ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果を図１９（Ｃ）に、ＡＬＣ含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスの結果を図１９（Ｄ）に、それぞれ示す。いずれのカチオン性脂質においても、ＤＳＰＣ含有量の増加に伴い、脾臓での活性が向上し、肝臓での活性が低下する傾向にあった。特に、ＴＯＴ－５含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、ＤＳＰＣが１０ｍｏｌ％未満で肝臓優位な活性を示し、１０ｍｏｌ％以上で脾臓優位となった。
［実施例３５］
　脂質ナノ粒子の臓器への取り込みにおいて、ＤＳＰＣの含有量依存的な臓器選択性と脂質ナノ粒子のｐＫａとの関連性について調べた。
　ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＴＯＴ－１～５、及び１６を用いた。ＴＯＴ以外の脂質として、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを使用した。
　具体的には、実施例１９と同様にして、ＴＯＴ／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／３／３２／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％であるＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ＤＳＰＣ－３含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を作製した。また、ＴＯＴ／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、ＤＳＰＣの含有量が１５ｍｏｌ％であるＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ＤＳＰＣ－１５含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を作製した。
　調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．０１ｍｇ／ｋｇとなるようにＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、脂質ナノ粒子投与から６時間後に肝臓と脾臓を回収し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。各組織のＦｌｕｃ活性は、実施例１９と同様にして測定した。
　各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子について、肝臓のＦｌｕｃ活性に対する脾臓のＦｌｕｃ活性の比（［脾臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）］／［肝臓のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）］）を「特異性」として算出した。各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子について、縦軸を特異性、横軸をｐＫａとしてプロットした図を図２０（Ａ）に示す。また、同じＴＯＴを用いて調製されたＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子同士において、ＤＳＰＣ－１５含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の特異性とＤＳＰＣ－３含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の特異性との差（特異性変化）と脂質ナノ粒子のｐＫａとの関係をプロットした図を図２０（Ｂ）に示す。
　図２０（Ａ）に示すように、低いｐＫａの脂質ナノ粒子ほど、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％の場合には肝臓で、ＤＳＰＣの含有量が１５ｍｏｌ％の場合には脾臓で、それぞれ高いＦｌｕｃ活性を示した。特に、Ｆｌｕｃ活性の脾臓／肝臓比（特異性）に対するｐＫａの影響は、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％の条件で大きく、ｐＫａが７を超える脂質ナノ粒子では、Ｆｌｕｃ活性は脾臓優位であった。脂質ナノ粒子のｐＫａが低い場合には、ＤＳＰＣ含有量を変化させることによって、肝臓と脾臓に対する標的性が大きく変わることが示された。
［実施例３６］
　脂質ナノ粒子の肝実質細胞への取り込みには、内因性のアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）が関与していることが報告されている。そこで、野生型マウスとＡｐｏＥ欠損マウスに対して、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％又は１５ｍｏｌ％であるＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与し、肝臓と脾臓への取り込みを調べた。
　まず、実施例３５と同様にして、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／３／３２／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％であるＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。また、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）の組成で用いて、ＤＳＰＣの含有量が１５ｍｏｌ％であるＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。
　調製した各ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、野生型マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス）又はＡｐｏＥ欠損マウス（いずれも４週齢、雌）に、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．０１ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈内投与し、脂質ナノ粒子投与から６時間後に肝臓と脾臓を回収し、Ｆｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した（Ｎ＝３）。各組織のＦｌｕｃ活性は、実施例１９と同様にして測定した。
　測定結果を図２１に示す。ＤＳＰＣの含有量が３ｍｏｌ％のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与した場合、ＡｐｏＥ欠損マウスのＦｌｕｃ活性（図中、「３－ＡｐｏＥ（－）」）は、野生型マウスのＦｌｕｃ活性（図中、「３－ＷＴ」）と比べて、肝臓における活性が低下した一方で、脾臓における活性は上昇しなかった。ＤＳＰＣの含有量が１５ｍｏｌ％のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与した場合、ＡｐｏＥ欠損マウスのＦｌｕｃ活性（図中、「１５－ＡｐｏＥ（－）」）は、野生型マウスのＦｌｕｃ活性（図中、「１５－ＷＴ」）と同様であり、肝臓及び脾臓におけるＦｌｕｃ活性は、ＡｐｏＥに依存していなかった。
［実施例３７］
　脾臓は複数種類の細胞から構成されており、細胞種によりその機能も様々である。そこで、ＴＯＴを含有する脂質ナノ粒子の脾臓への取り込みにおいて、脾臓中のどの細胞種に取り込まれているのかを調べた。脂質ナノ粒子の構成脂質としては、ＴＯＴ－５、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを用いた。
　まず、赤色蛍光物質ＤｉＤを０．５ｍｏｌ％となるように取り込ませてＤｉＤ修飾する以外は、実施例３４と同様にして、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／Ｘ／３５－Ｘ／１．５（ｍｏｌ％）（Ｘ＝３、５、１０、１５、又は２０）の組成のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を作製した。得られたＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．２ｍｇ／ｋｇとなるようにＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、投与から１時間後に安楽死させ、脾臓を回収した（Ｎ＝３）。対照として、脂質ナノ粒子を投与していないＢａｌｂ／ｃマウスからも脾臓を回収した。
　脾臓の細胞を、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及び好中球に識別するため、細胞染色を行った。回収した脾臓を滅菌シャーレに乗せ、ハサミで細断した後、当該滅菌シャーレに冷ＨＢＳＳ（－）バッファーを適量添加して組織をほぐし、得られた懸濁物を４０μｍセルストレイナーに通し、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、１ｍＬのＲＢＣライシスバッファーを添加することによって赤血球を除去し、９ｍＬの冷ＨＢＳＳ（－）バッファーで希釈してから、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、５ｍＬの冷ＨＢＳＳ（－）バッファーで再懸濁させた後、細胞数を数え、１．５ｍＬ容チューブに３×１０６細胞になるように添加し、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、ブロッキングのために、精製抗マウスＣＤ１６/３２抗体（１０μｇ／ｍＬ、ＦＡＣＳバッファーで調製）を１００μＬ/１×１０６細胞となるように添加し、５分おきに軽くたたきつつ、１０分間氷上で反応させた。Ｂ細胞をＣＤ１９＋ＣＤ３－細胞、Ｔ細胞をＣＤ１９－ＣＤ３＋細胞、ＮＫ細胞をＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋細胞、樹状細胞をＣＤ１１ｃ＋Ｉ－Ａ/Ｉ－Ｅ＋細胞、好中球をＬｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞として抗体染色し、１５分おきに軽くタッピングし、３０分間、氷上で反応させた。反応後、ＦＡＣＳバッファーにより１ｍＬ/ｔｕｂｅとし、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理し、続けて２回、１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄してサンプルとした。サンプルに、６μＬのヨウ化プロピジウム溶液を添加し、各細胞群を各表面抗原により抽出後、ＤｉＤ蛍光強度を測定した。
　なお、ＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ３）は、ＰＢＳ錠１０個を１Ｌの重水素減少水（ＤＤＷ）に溶かし、オートクレーブ滅菌後に、５．０ｇのアルブミン（ウシ血清由来、フラクションＶ、ｐＨ７．０）と１．０ｇのアジ化ナトリウムを加えて溶解させて調製した。使用時まで４℃で保存した。
　ＤｉＤ陽性細胞（ＤｉＤ蛍光を発している細胞）が、ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子が取り込まれた細胞である。そこで、各脾臓細胞種のＤｉＤ蛍光強度を、ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子の取り込み量として求めた。測定結果を図２２に示す。図中、「ＤＣ」は樹状細胞の結果を、「ｎｅｕ」は好中球の結果を示す。脂質ナノ粒子のＤＳＰＣ含有量の増加に伴い、脾臓Ｂ細胞において、ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子が取り込まれた細胞が増大していた。また、図２２に示すように、ＴＯＴ－５を含有する脂質ナノ粒子では、Ｂ細胞と樹状細胞への取り込みが多く、特に、Ｂ細胞への取り込みは、脂質ナノ粒子のＤＳＰＣ含有量の増加により、約１０倍も向上した。
［実施例３８］
　実施例３７において最も取り込み量が多かった脾臓Ｂ細胞について、ＤＳＰＣの含有割合をふった脂質ナノ粒子を取り込ませて、Ｆｌｕｃ活性とＤＳＰＣの含有割合の影響を調べた。ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子としては、実施例３７で調製したものを用いた。
　ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．１ｍｇ／ｋｇとなるようにＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、投与から６時間後に安楽死させ、脾臓を回収した（Ｎ＝３）。回収した脾臓を滅菌シャーレに乗せ、ハサミで細断した後、当該滅菌シャーレに冷ＨＢＳＳ（－）バッファーを適量添加して組織をほぐし、得られた懸濁物を４０μｍセルストレイナーに通し、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、１ｍＬのＲＢＣライシスバッファーを添加することによって赤血球を除去し、９ｍＬの冷ＨＢＳＳ（－）バッファーで希釈してから、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、５ｍＬの冷ＨＢＳＳ（－）バッファーで再懸濁させた後、細胞数を数え、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、ＭＡＣＳバッファー（ＦＡＣＳバッファーに、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有させた溶液）で懸濁し、５×１０７細胞／ｍＬ/チューブとし、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理して上清を除去した。沈殿の細胞を４５０μＬのＭＡＣＳバッファーで懸濁し、５０μＬのＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを加えて全量５００μＬの細胞懸濁液とした。ＭＳカラムに当該細胞懸濁液を全量加え、懸濁液がカラムを流れ出た後、当該カラムに５００μＬのＭＡＣＳバッファーを加えることを３回繰り返した。その後、ＭＡＣＳセパレーターからカラムを取り外し、回収チューブ上にカラムを置き、１ｍＬのＭＡＣＳバッファーを加えてプランジャーを押し込み、Ｂ細胞を回収した。
　回収したＢ細胞のＦｌｕｃ活性（ＲＬＵ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を、実施例１９と同様にして測定した（Ｎ＝３）。測定結果を図２３に示す。脂質ナノ粒子におけるＤＳＰＣ含有量の増加に伴い、脾臓Ｂ細胞のＦｌｕｃ活性が約２０倍も向上した。
［実施例３９］
　免疫細胞へのナノ粒子の取り込みには、補体系が関与することが知られており、特にＢ細胞へのナノ粒子取り込みには、補体受容体ＣＤ２１/３５が関与すると知られている（Limei Shen, et al, Journal of Allergy, 2018, vol.142, p.1558-1570；Monika Bednarczyk, et al, Molecular Sciences, 2021, vol.22, p.2869）。そこで、ＴＯＴ含有脂質ナノ粒子のＢ細胞への取り込みについても、補体系が関与しているかどうか、調べた。
　ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子としては、実施例３７で調製したもののうち、ＤＳＰＣ含有量が３ｍｏｌ％のものと１５ｍｏｌ％のものを用いた。
　安楽死させたマウスから、実施例３８と同様にして、脾臓を回収し、回収した脾臓から脾臓Ｂ細胞（プライマリーＢ細胞）を単離して回収した。細胞数を数え、１×１０７細胞／チューブを分取し、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理した。上清を除去した後、１×パッシブ溶解バッファーを１００μＬ/ｔｕｂｅで添加した。白い凝集物がみられたため、４℃、１３０００ｒｐｍ、１０分間遠心処理した後、上清を回収して測定用サンプルとした。ルシフェラーゼアッセイシステム（E1500、Promega社製）のルシフェラーゼアッセイバッファー５０μＬを予め添加した試験管に、測定用サンプル（組織上清）５０μＬをピペッティングにより混合し、ルミノメーターにより発光量を測定した。
　非働化血清は、以下の様にして調製した。麻酔下で、マウスの心臓から採血し、室温で３０分間静置した。タッピングにより血餅をはがし、室温、１５００×ｇ、１５分間遠心処理した後、上清を回収し血清とした。マウス血清を５６℃で３０分間加熱したものを、非働化血清とした。
　プライマリーＢ細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬとなるように基本培地で再懸濁し、氷上で保存した。９６ウェルプレート内で、ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（８ｎｇ ＲＮＡ/μＬ）を５μＬ、ＰＢＳを５μＬ、マウス血清を１０μＬ混合した溶液を調製した。ＥＤＴＡ添加群として、Ｄ－ＰＢＳ（－）の一部を２μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液に置き換えた。また、非働化群として、マウス血清を加熱処理したものに置き換えた。溶液を３７℃、５％ＣＯ２で１時間静置した後、２．５×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液８０μＬをウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間静置した（終細胞数：２×１０５細胞／ウェル、終ＲＮＡ量：４０ｎｇ／ウェル、血清終濃度:１０％、ＥＤＴＡ終濃度:１０ｍＭ）。ウェル内の溶液を全量回収し、ＦＡＣＳバッファーを４００μＬ加え、セルソーター（CytoFLEX、ベックマン・コールター社製）により、ＤｉＤ蛍光強度を測定した。
　ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を取り込ませた各プライマリーＢ細胞のＤｉＤ蛍光強度の測定結果を図２４（Ａ）に示す。また、ＤＳＰＣ含有量が１５ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、非働化していない血清存在下、ＥＤＴＡなしの条件で培養して取り込ませたプライマリーＢ細胞について、ＤｉＤの取り込み量でソーティングしたＦＡＣＳの結果を図２４（Ｂ）に示す。図２４（Ａ）に示すように、プライマリーＢ細胞に取り込まれるＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子量は、非働化血清の存在下やＥＤＴＡ存在下では、未処理血清でＥＤＴＡ無しの条件下よりも、明らかに低下した。また、未処理血清でＥＤＴＡ無しの条件下では、ＤＳＰＣ含有量が１５ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のほうが、３ｍｏｌ％のものよりも取り込み量が多かったが、非働化血清の存在下やＥＤＴＡ存在下では、ＤＳＰＣ含有量が３ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子のほうが、取り込み量が多かった。これらの結果から、ＴＯＴ含有脂質ナノ粒子の脾臓Ｂ細胞への取り込みは、いずれかの補体系が関与している可能性が示唆された。
［実施例４０］
　実施例３７において最も取り込み量が多かった脾臓Ｂ細胞について、脾臓Ｂ細胞中のどの細胞種に取り込まれているのかを調べた。
　ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子としては、実施例３７で調製したもののうち、ＤＳＰＣ含有量が３ｍｏｌ％のものと１５ｍｏｌ％のものを用いた。
　ＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡとして０．１ｍｇ／ｋｇとなるようにＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈内投与し、投与から１時間後に安楽死させ、脾臓を回収した（Ｎ＝３）。対照として、脂質ナノ粒子を投与していないＢａｌｂ／ｃマウスからも脾臓を回収した。
　実施例３７と同様にして、脾臓の細胞を回収し、精製抗マウスＣＤ１６/３２抗体（１０μｇ／ｍＬ、ＦＡＣＳバッファーで調製）でブロッキングした。その後、Ｂ細胞をＣＤ１９＋細胞、ＭＺＢ細胞をＣＤ２１／３５ｈｉｇｈＣＤ２３ｍｉｄ細胞、ＦＯＢ細胞をＣＤ２１／３５ｍｉｄＣＤ２３ｈｉｇｈ細胞として抗体染色し、１５分おきに軽くタッピングし、３０分間、氷上で反応させた。反応後、ＦＡＣＳバッファーにより１ｍＬ/ｔｕｂｅとし、４℃、４００×ｇ、５分間で遠心処理し、続けて２回、１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄してサンプルとした。サンプルに、６μＬのヨウ化プロピジウム溶液を添加し、各細胞群を各表面抗原により抽出後、ＤｉＤ蛍光強度を測定した。
　脂質ナノ粒子を投与していないマウス（ＮＴ）、ＤＳＰＣ含有量が３ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウス（３％ＤＳＰＣ）、及びＤＳＰＣ含有量が１５ｍｏｌ％のＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を投与したマウス（１５％ＤＳＰＣ）のＢ細胞、ＭＺＢ細胞、及びＦＯＢ細胞について、ＤｉＤ蛍光強度を測定した結果を図２５に示す。図２５に示すように、ＴＯＴを含有するＤｉＤ修飾ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子は、ＦＯＢ細胞と比べて、ＣＤ２１/３５が高発現しているＭＺＢ細胞で明らかに取り込み量が高かった。また、ＭＺＢ細胞への取り込みは、ＤＳＰＣ含有量が３ｍｏｌ％の脂質ナノ粒子よりも、ＤＳＰＣ含有量が１５ｍｏｌ％の脂質ナノ粒子のほうが向上していた。
　実施例３５で調製したＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／３／３２／１．５（ｍｏｌ％）の組成のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ＤＳＰＣ－３含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）と、ＴＯＴ－５／ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝６５／１５／２０／１．５（ｍｏｌ％）のＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ＤＳＰＣ－１５含有ＦｌｕｃｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子）を、それぞれ、実施例３９で調製したマウス未処理血清とインキュベートした後、各脂質ナノ粒子に結合したタンパク質を同定した。この結果、ＤＳＰＣ含有量が３ｍｏｌ％の脂質ナノ粒子と比較して、ＤＳＰＣ含有量が１５ｍｏｌ%の脂質ナノ粒子に多く結合しているタンパク質として、フィブリノーゲン、ヴィトロネクチン、ＩｇＭ、マンノース結合タンパク質Ｃ（ＭＢＰ）、Ｃ１ｑ等が検出された。
　ＭＢＰ、Ｃ１ｑはそれぞれ、補体のレクチン経路、古典経路の上流に位置するタンパク質であり、互いに類似の構造を有しており、Ｃ１ｑ受容体に認識されることが報告されている（Ehrnthaller, et al, Mol Med, 2010, vol.17(3-4), p.317-329）。ＩｇＭは、Ｃ１ｑのglobular headsにより認識される。血液凝固関連因子であるフィブリノーゲンや、細胞接着因子であるヴィトロネクチンは、変性するとｇＣ１ｑ受容体のリガンドとなることが報告されている（Ghebrehiwet, et al, Immunol Rev, 2002, vol.180, p.65-77）。これらの知見から、ＤＳＰＣの含有量が比較的多い脂質ナノ粒子は、補体経路、特に、Ｃ１ｑ受容体を介した経路によって脾臓細胞へ取り込まれると推定され、当該経路が活性化している動物に対する薬物輸送キャリアとして有用である可能性がある。

Claims (17)

  1. 　下記の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）中、Ｒ１は、炭素数１～２２の炭化水素基であり；一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよく；Ｚ１は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい、炭素数１～６のアルキレン基、又は単結合であり；Ｘは、－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、又は、５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、当該基は炭素原子によりＺ１に結合し、当該環上には、１若しくは２個の炭素数１～４の炭化水素基又はアミド基が置換されていてもよい）であり；Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよい炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、炭素数１～４の炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよく；該環の１個の炭素原子は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい）を形成してもよい］
    で表される化合物からなる、ｐＨ感受性カチオン性脂質。
  2. 　前記一般式（Ｉ）中、－Ｚ１－Ｘが、下記式（Ｈ－１）～（Ｈ－８）、（Ｈ－１６）～（Ｈ－２６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、黒丸は結合手を表す。］
    のいずれかである、請求項１に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質。
  3. 　一分子中３個あるＲ１が、全て同じ基である、請求項１に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質。
  4. 　前記Ｒ１が、炭素数１５～２２のアルキル基又は炭素数１５～２２のアルケニル基である、請求項１に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質。
  5. 　下記一般式（Ｉ－１）～（Ｉ－８）、（Ｉ－１６）～（Ｉ－２６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｒ１は前記と同じである。］
    のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質。
  6. 　トリス骨格を有しており、
    　前記トリス骨格の３個の酸素原子にそれぞれ脂肪酸残基が結合しており、前記脂肪酸残基は、炭化水素鎖部分の炭素数が１～２２であり、１個以上の不飽和結合を有していてもよく、一分子中の３個の前記脂肪酸残基は、同種の基であってもよく、２種以上の異なる基であってもよく、
    　前記トリス骨格の１個の窒素原子に、１級～３級アミンが、カルボニル基又はカルボニル基とこれに続く炭素数１～６のアルキレン基を介して連結されており、前記アルキレン基は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよく、
    　ｐＫａが４．０～９．０である化合物からなる、ｐＨ感受性カチオン性脂質。
  7. 　下記一般式（Ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、Ｒ１は、炭素数１～２２のアルキル基又は炭素数２～２２のアルケニル基である］
    で表される化合物と、下記一般式（Ｂ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、Ｚ１は、１個の炭素数１～３のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよい、炭素数１～６のアルキレン基、又は単結合であり；Ｘは、－Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）、又は、５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、当該基は炭素原子によりＺ１に結合し、当該環上には、１若しくは２個の炭素数１～４の炭化水素基又はアミド基が置換されていてもよい）であり；Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよい炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、炭素数１～４の炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよく；該環の１個の炭素原子は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい）を形成してもよい］
    で表される化合物と、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとを、縮合させることにより、下記一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式中、Ｒ１、Ｚ１、及びＸは、前記と同じであるが、一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよい］
    で表される化合物からなるｐＨ感受性カチオン性脂質を製造する、ｐＨ感受性カチオン性脂質の製造方法。
  8. 　下記一般式（Ｃ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、又は、１個若しくは２個の水素原子がフェニル基、ピロリル基、ピリミジル基、又はインドリル基に置換されていてもよい炭素数１～４の炭化水素基であるが、Ｒ２及びＲ３は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、炭素数１～４の炭化水素基、アミド基、又は含窒素環式基に置換されていてもよく；該環の１個の炭素原子は、他の含窒素環式基を構成する炭素原子であってもよい）を形成してもよい］
    で表される化合物に、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドを付加させた後、さらに、下記一般式（Ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     ［式中、Ｒ１は、炭素数１～２２のアルキル基又は炭素数２～２２のアルケニル基である］
    で表される化合物を縮合させることにより、下記一般式（Ｉ’）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、前記と同じであり；一分子中３個あるＲ１は、互いに同種の基であってもよく、異種の基であってもよい］
    で表される化合物からなるｐＨ感受性カチオン性脂質を製造する、ｐＨ感受性カチオン性脂質の製造方法。
  9. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質を含有している、脂質ナノ粒子。
  10. 　さらに、ステロール及びポリアルキレングリコール修飾脂質を含有している、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。
  11. 　さらに、ホスファチジルコリンを含有している、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。
  12. 　核酸を含有する、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。
  13. 　前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡである、請求項１２に記載の脂質ナノ粒子。
  14. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質を含有している脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
  15. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のｐＨ感受性カチオン性脂質と核酸を含有している脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
  16. 　遺伝子治療に用いられる、請求項１５に記載の医薬用組成物。
  17. 　請求項１２に記載の脂質ナノ粒子であって、標的細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した脂質ナノ粒子を、被験動物（但し、ヒトを除く）へ投与し、前記被験動物の標的細胞内で前記外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子の発現方法。
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