WO2020054851A1 - 光機能性化合物及び脂質ナノ粒子 - Google Patents

光機能性化合物及び脂質ナノ粒子 Download PDF

Info

Publication number
WO2020054851A1
WO2020054851A1 PCT/JP2019/036124 JP2019036124W WO2020054851A1 WO 2020054851 A1 WO2020054851 A1 WO 2020054851A1 JP 2019036124 W JP2019036124 W JP 2019036124W WO 2020054851 A1 WO2020054851 A1 WO 2020054851A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
lipid
rtpa
compound
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/036124
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
原島　秀吉
勇磨 山田
勇太 高野
サトリアルジ
Original Assignee
国立大学法人北海道大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人北海道大学 filed Critical 国立大学法人北海道大学
Publication of WO2020054851A1 publication Critical patent/WO2020054851A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers

Definitions

  • the present invention relates to a photofunctional compound suitable for photodynamic therapy and lipid nanoparticles containing the photofunctional compound.
  • Priority is claimed on Japanese Patent Application No. 2018-172698, filed Sep. 14, 2018, the content of which is incorporated herein by reference.
  • Photodynamic therapy is a treatment method that damages target cells and tissues using a photofunctional compound.
  • Light of a specific wavelength is irradiated by incorporating the photofunctional compound into target cells and tissues.
  • target cells and the like are damaged. Since photodynamic therapy can control the cells to be impaired by adjusting the light irradiation area, it has high spatiotemporal resolution (milliseconds and submillimeters) and non-invasive external stimulation is possible Therapeutic methods are being actively developed.
  • Examples of photofunctional compounds used for photodynamic therapy include porphyrin derivative compounds such as photofrin and resaphyrin. Since the porphyrin derivative compound selectively accumulates in cancer cells, it is administered to a patient, and cancer cells are induced by active oxygen generated by light irradiation. “Cancer photoimmunotherapy” using porphyrin analog compounds (see Non-Patent Document 1) has been approved by the US Food and Drug Administration (FDA) in April 2016, Is being tested in clinical trials.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • Mitochondria are organelles that control cell death, and by targeting them, it is possible to aim at killing malignant cells resistant to conventional drugs.
  • the modulation of mitochondrial function is associated with various diseases such as mitochondrial encephalomyopathy, neurodegenerative disease, cancer, and diabetes, and development of a novel therapeutic method targeting the organelle is expected.
  • photodynamic therapy targeting mitochondria is in a basic research stage (for example, see Patent Document 1) and has not yet been established in Japan and overseas.
  • Patent Document 3 discloses a method for retaining an aggregate of a target substance inside a lipid membrane structure containing a fusogenic lipid and having a lipid membrane having a mitochondrial targeting signal peptide on the surface. .
  • the target substance can be released into mitochondria by incorporating the lipid membrane structure holding the target substance into cells.
  • JP 2007-271503 A Japanese Patent Publication No. 2009-511626 International Publication No. WO 2006/095837 International Publication No. 2017/090763
  • An object of the present invention is to provide a photofunctional compound suitable for photodynamic therapy, which produces a phototherapeutic effect by irradiation with near-infrared light, and a lipid nanoparticle for transporting the compound into cells.
  • the present inventors by expanding the ⁇ -electron conjugate structure of the porphyrin skeleton, a high optical capture efficiency, and a photo-functional compound that can obtain a photo-induced electron transfer effect, and the photo-functional compound By encapsulating in a lipid nanoparticle having excellent delivery properties into mitochondria, it is possible to obtain a lipid nanoparticle having excellent light collecting properties and cytotoxicity and suitable for photodynamic therapy. Completed.
  • R 1 to R 4 each independently represent a hydroxyl group, a methoxy group, or an ethoxy group
  • n1 to n4 each independently represent 0 or 1
  • R 5 and R 6 represent Each independently represents an alkoxy group having 1 to 16 carbon atoms
  • n5 and n6 each independently represents 0, 1 or 2
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, a carbon atom
  • R 9 is an alkyl group of 1 to 3 carbon atoms
  • n5 or n6 is 2, a plurality of R 5 and R 6 May be the same group or different groups.
  • the photofunctional compound is represented by the following general formula (1) [Wherein, R 1 to R 4 each independently represent a hydroxyl group, a methoxy group, or an ethoxy group; n1 to n4 each independently represent 0 or 1, and R 5 and R 6 represent Each independently represents an alkoxy group having 1 to 16 carbon atoms; n5 and n6 each independently represents 0, 1 or 2; R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, a carbon atom Represents an alkyl group of 1 to 3 groups, a hydroxyl group, a carboxy group, or —COOR 9 (R 9 is an alkyl group of 1 to 3 carbon atoms); when n5 or n6 is 2, a plurality of R 5 and R 6 May be the same group or different groups.] And at least one member selected from the group consisting of a cyanine compound having a
  • [3] The lipid nanoparticle according to [2], wherein a ratio of a positively charged amino acid residue to a total amino acid residue constituting the membrane permeable domain is 50% or more.
  • [4] The lipid nanoparticle according to [2] or [3], wherein the membrane-permeable domain is composed of polyarginine.
  • [5] The lipid nanoparticle according to any of [2] to [4], wherein a ratio of the corn-type lipid to the total amount of lipid constituting the lipid nanoparticle is 70 mol% or more.
  • [6] The lipid nanoparticle according to any one of [2] to [5], which is used for photodynamic therapy.
  • a pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticle of any of the above [2] to [6] as an active ingredient.
  • the compound according to the present invention is a photofunctional compound having high near fat solubility. Therefore, the compound can be easily included in the lipid nanoparticles.
  • the lipid nanoparticles containing the compound according to the present invention contain a photofunctional compound that generates active oxygen by irradiating near-infrared light, and have excellent uptake efficiency into cells. For this reason, the lipid nanoparticles and the pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient are particularly suitable for photodynamic therapy.
  • FIG. 3 is a view showing an absorption spectrum of a 6 ⁇ M DMSO solution of rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter in Example 1.
  • FIG. 3 is a view showing the particle size distribution of rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter in Example 1.
  • FIG. 4 is a view showing the measurement results of the zeta potential of rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter in Example 1.
  • Example 1 the average particle size of rTPA-MITO-Porter in the state of being dispersed in the solution at 4 ° C. (nm: plotted with a black triangle in the figure) and the result of measuring PDI over time (open in the figure)
  • FIG. 1 is a view showing an absorption spectrum of a 6 ⁇ M DMSO solution of rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter in Example 1.
  • FIG. 3 is a view showing the particle size distribution of rTPA-LP
  • FIG. 7 is a view showing the results of the cell viability (%) of HeLa cells which were not subjected to near-infrared light irradiation after incorporating rTPA-LP in Example 2.
  • FIG. 7 is a view showing the results of the cell viability (%) of HeLa cells which were not subjected to near-infrared light irradiation after incorporating rTPA-LP in Example 2.
  • FIG. 9 is a view showing the results of the cell viability (%) of HeLa cells which were subjected to near-infrared light irradiation treatment after incorporating rTPA-LP in Example 2.
  • FIG. 9 is a view showing the results of the cell viability (%) of HeLa cells which were subjected to near-infrared light irradiation treatment after incorporating rTPA-MITO-Porter in Example 2.
  • FIG. 7 is a view showing the results of the cell viability (%) of SAS cells which were subjected to near-infrared light irradiation treatment after incorporating rTPA-MITO-Porter in Example 2.
  • FIG. 9 is a view showing the results of the cell viability (%) of HeLa cells which were subjected to near-infrared light irradiation treatment after incorporating rTPA-MITO-Porter in Example 2.
  • FIG. 9 is a view showing the results of flow cytometry analysis of HeLa cells into which NBD-labeled rTPA-LP or NBD-labeled rTPA-MITO-Porter has been incorporated in Example 3.
  • FIG. 9 is a view showing the measurement results of the uptake efficiency (%) of HeLa cells into which NBD-labeled rTPA-LP or NBD-labeled rTPA-MITO-Porter was taken up in Example 3.
  • FIG. 9 is a view showing the measurement results of the uptake efficiency (%) of SAS cells into which NBD-labeled rTPA-LP or NBD-labeled rTPA-MITO-Porter was taken up in Example 3.
  • FIG. 10 is a microscope image of HeLa cells into which rTPA-MITO-Porter has been taken in Example 4.
  • 10 is a microscope image of HeLa cells into which rTPA-LP has been incorporated in Example 4.
  • 7 is a microscope image before and after light irradiation treatment of HeLa cells into which rTPA-MITO-Porter was taken in Example 4.
  • FIG. 11 is a view showing the results of measuring the tumor volume (mm 3 ) of the rTPA-MITO-Porter administration group and the control group over time in Example 5.
  • FIG. 11 is a view showing the results of measuring the body weight (g) of the rTPA-MITO-Porter administration group and the control group over time in Example 5.
  • the photofunctional compound according to the present invention is a compound represented by the following general formula (1). Since the compound has a molecular structure obtained by expanding the ⁇ -electron conjugate structure of the porphyrin skeleton, the compound has excellent light-collecting properties and cytotoxicity. Further, the compound is a photosensitive compound that absorbs light having a wavelength of 650 to 1000 nm to cause a photochemical reaction. Hereinafter, unless otherwise specified, “near-infrared light” means light having a wavelength in the range of 650 to 1000 nm. As a result of the photochemical reaction occurring in the cell, a phototherapy effect in which the cell is damaged is obtained. The phototherapy effect means an effect that causes cell damage, and may be any of a photoinduced electron transfer effect, a photodynamic effect, and a light heating effect.
  • R 1 to R 4 each independently represent a hydroxyl group, a methoxy group, or an ethoxy group.
  • R 1 to R 4 may be different groups, but all are preferably the same group.
  • R 1 to R 4 are preferably a methoxy group or an ethoxy group, and more preferably a compound having a methoxy group.
  • n1 to n4 each independently represent 0 or 1.
  • the compound represented by the general formula (1) may be a compound in which a part of n1 to n4 is 0 and the rest is 1, a compound in which all of n1 to n4 are 0, Alternatively, a compound in which all of n1 to n4 are 1 is more preferable.
  • n1 ⁇ n4 is 1, among the R 1 ⁇ R 4, some is in the para position, partly in ortho-position, the rest may be a compound is meta, R 1 ⁇ R compound all is in the para position of the 4, compounds all are ortho position R 1 ⁇ R 4, or preferably all of the compound is meta-position of R 1 ⁇ R 4, all of R 1 ⁇ R 4 is para Are more preferred.
  • R 5 and R 6 each independently represent an alkoxy group having 1 to 16 carbon atoms.
  • the alkoxy group having 1 to 16 carbon atoms may be a linear group or a branched group. Specific examples of the alkoxy group include methoxy, ethoxy, n-propoxy, n-butoxy, n-pentyloxy, n-hexyloxy, n-heptyloxy, and n-octyloxy groups.
  • N-nonyloxy group N-nonyloxy group, n-decyloxy group, n-undecyloxy group, n-dodecyloxy group, n-tridecyloxy group, n-tetradecyloxy group, n-pentadecyloxy group, n-hexadecyloxy Group, isopropoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, isopentyloxy group, sec-pentyloxy group, tert-pentyloxy group, neopentyloxy group, isohexyloxy group, sec-hexyloxy Group, tert-hexyloxy group, neohexyloxy group, isoheptyloxy group, ec-heptyloxy group, tert-heptyloxy group, neoheptyloxy group, isooctyloxy group
  • R 5 and R 6 each independently represent a linear alkoxy group having 1 to 16 carbon atoms because the retention efficiency to lipid nanoparticles can be further improved.
  • a compound in which R 5 and R 6 are each independently a linear alkoxy group having 6 to 16 carbon atoms is more preferable.
  • the compound represented by the general formula (1) is more preferably a compound in which R 5 and R 6 are the same linear alkoxy group having 7 to 11 carbon atoms.
  • n5 and n6 each independently represent 0, 1 or 2.
  • a plurality of R 5 and R 6 may be the same group or different groups.
  • R 7 and R 8 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxy group, or —COOR 9 (R 9 is a group having 1 to 3 carbon atoms). Represents an alkyl group).
  • R 7 and R 8 are an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an iso-propyl group.
  • R 9 includes a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, or an iso-propyl group.
  • R 7 and R 8 are a carboxy group
  • the carboxy group may form a salt with any cation and may be in a carboxylate state.
  • the cation constituting the carboxylate is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and alkali metal salts such as potassium salts and sodium salts are preferable.
  • Examples of the compound represented by the general formula (1), R 7 and R 8, compounds both in the para position, the compound both are ortho or compounds both is meta are preferred, R 7 and A compound in which both R 8 is in the para position is more preferable, and a compound in which R 7 and R 8 are both in the para position and are the same group is further preferable.
  • R 7 and R 8 are both in the para position and are the same group
  • R 7 and R 8 are carboxylate
  • a compound is also good carboxy group or -COOR 9 and preferably at, R 7 and R 8, compounds are also good carboxy group to a carboxylic acid salt is more preferred
  • R 7 and R 8 are carboxylate Is more preferable
  • a compound in which R 7 and R 8 are —COOK or —COONa is particularly preferable.
  • R 11 to R 18 are groups shown in Table 1.
  • H represents a hydrogen atom
  • Me represents a methyl group
  • Et represents an ethyl group
  • OH represents a hydroxyl group
  • OMe represents a methoxy group
  • Et represents an ethoxy group
  • OR ′ represents a linear alkoxy group having 1 to 16 carbon atoms.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention contain a corn-type lipid, a peptide having a membrane transduction domain (PTD), and a photofunctional compound, and the photofunctional compound is represented by the general formula (1). And at least one selected from the group consisting of a cyanine compound having a maximum absorption wavelength of 680 nm or more.
  • the lipid nanoparticle according to the present invention is a nanoparticle whose surface is covered with a lipid membrane, and holds therein a photofunctional compound such as the compound represented by the general formula (1).
  • the photofunctional compound contained in the lipid nanoparticles according to the present invention may be a compound represented by the general formula (1) or a cyanine compound having a maximum absorption wavelength of 680 nm or more, even if only one type. Alternatively, two or more types may be combined.
  • the photofunctional compound contained in the lipid nanoparticles according to the present invention the compound represented by the general formula (1) is preferable, and the compound represented by the general formula (1) is more preferable.
  • the cyanine compound having a maximum absorption wavelength of 680 nm or more includes a compound represented by the following general formula (2-1), a compound represented by the following general formula (2-2), and a compound represented by the following general formula (2-3) And a compound represented by the following general formula (2-4).
  • a ⁇ is a monovalent anion.
  • a ⁇ is not particularly limited, and examples thereof include halide ions such as chloride ion, bromide ion, fluoride ion, iodide ion, and astatine ion.
  • R 21 represents —Z 21 —CH 3 or —Z 21 —COOH.
  • Z 21 is a single bond, an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms or an alkenylene group having 2 to 8 carbon atoms. Both the alkylene group and the alkenylene group may be linear or branched. Examples of the alkylene group having 1 to 8 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, an n-propylene group, an n-butylene group, an n-pentylene group, an n-hexylene group, an n-heptylene group, and an n-octylene group. No.
  • alkenylene group having 2 to 8 carbon atoms examples include a vinylene group, an n-propenylene group, an n-butenylene group, an n-pentenylene group, an n-hexenylene group, an n-heptenylene group, and an n-octenylene group.
  • R 21 is Z 21 —COOH; And Z 21 is a linear alkylene group having 3 to 8 carbon atoms or a linear alkenylene group having 3 to 8 carbon atoms; or R 21 is Z 21 —CH 3 and Z 21 is a carbon atom.
  • Compounds that are a linear alkylene group having 3 to 8 or a linear alkenylene group having 3 to 8 carbon atoms are preferable.
  • R 21 is Z 21 -COOH, and Z 21 is more preferably a compound which is a straight-chain alkylene group or a linear alkenylene group having a carbon number of 4-6 having 4 to 6 carbon atoms, R 21 is Z Compounds which are 21- COOH and wherein Z 21 is a linear alkylene group having 4 to 6 carbon atoms are more preferred.
  • the cyanine compound may be contained as a derivative.
  • the derivative include a derivative in which a cyanine compound and a hydrophobic group or a substance containing the same are directly or indirectly linked.
  • the hydrophobic group include a saturated or unsaturated fatty acid group and a cholesterol group. Among them, a saturated or unsaturated fatty acid residue having 10 to 24 carbon atoms is particularly preferable, and a C14 to C20 fatty acid group is particularly preferable. Are more preferred.
  • acyl groups derived from fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, and lignoceric acid.
  • the fatty acid residue has an ester bond (—COO—), an amide bond (—CONH—), an ether bond (—O—), a carbonyl bond (—CO—) between one or more carbon-carbon single bonds. ), And one or more bonds selected from the group consisting of a carbonate bond (—OCOO—).
  • the linking group for linking the cyanine compound with the hydrophobic group is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired.
  • a peptide chain, a sugar chain, a polyoxyethylene (POE) chain, A hydrocarbon chain, a nucleic acid chain, or the like can be used, and two or more of these can be used directly or via a group such as an ether bond, a thioether bond, an ester bond, a silyl ether bond, an amide bond, a carbonyl group, or a siloxane bond. It may be a linked group.
  • Cone type lipid Lipids are roughly classified into three types, cone type, cylindrical type, and inverted cone type, according to the ratio of polar groups to non-polar groups. It is a lipid in which the group occupies a larger volume than the hydrophilic group, and is also called a nonbilayer lipid.
  • the reverse hexagonal structure of the corn-type lipid in the lipid bilayer forms an inverted micelle structure in the lipid bilayer, and the formed reverse micelle structure is considered to be involved in membrane fusion, membrane permeability, etc. ing.
  • the lipid nanoparticle according to the present invention contains corn lipid as a lipid constituting the lipid membrane.
  • Lipid membranes containing corn-type lipids tend to fuse with cell membranes and mitochondrial membranes.
  • the amount of the corn-type lipid contained in the lipid nanoparticle is not particularly limited, but the ratio of the corn-type lipid to the total lipid amount constituting the lipid nanoparticle ([the amount of the corn-type lipid (mol)] / ([ The amount (mol) of total lipids constituting the lipid nanoparticles]) x 100%) is preferably 50 mol% or more and 100 mol% or less, more preferably 70 mol% or more and 100 mol% or less, and 75 It is still more preferably from 100 mol% to 100 mol%, and still more preferably from 80 mol% to 100 mol%.
  • Examples of the corn-type lipid include phosphatidylethanolamine (PE) and a derivative in which a linear hydrophobic group is linked to PE.
  • Examples of the derivative in which a linear hydrophobic group is linked to PE include a PE derivative in which one or two saturated or unsaturated fatty acid residues are linked.
  • Examples of the PE derivative include diacylphosphatidylethanolamine such as dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE).
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the lipid nanoparticles according to the present invention include a peptide having a membrane permeable domain. Lipid nanoparticles having a peptide membrane-permeable domain on the surface are easily fused to cell membranes and mitochondrial membranes.
  • the membrane-permeable domain is not particularly limited as long as it is a domain composed of a peptide that can penetrate a lipid membrane, and a known membrane-permeable domain or a modified peptide thereof can be used.
  • the ratio of positively charged amino acid residues (arginine, lysine, and histidine residues) to the total amino acid residues constituting the domain is 50.
  • lipid nanoparticle according to the present invention can be made into a lipid nanoparticle having more excellent delivery efficiency into mitochondria. it can.
  • Examples of the membrane permeable domain having a large content of positively charged amino acid residues include polyarginine, HIV-1 derived Tat (48-60) (GRKKRRQRRRPPPQ: SEQ ID NO: 1), and HIV-1 derived Rev (34- 50) (TRQARRRNRRRWRREQRQR: SEQ ID NO: 2), KALA peptide (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA: SEQ ID NO: 3) (Patent Document 4), S2 peptide [X 1 X 2 KFX 1 X 2 KF (X 1 is D-arginine, X 2 is D-arginine, X 2 is X-dimethyl). ): SEQ ID NO: 4] and the like.
  • the total number of amino acid residues constituting the membrane permeable domain is not particularly limited, it is usually 4 to 50, preferably 6 to 45, more preferably 7 to 40, and still more preferably 7 to 20.
  • Polyarginine as a membrane permeable domain usually consists of 4 to 20, preferably 6 to 12, and more preferably 7 to 10 consecutive arginine residues.
  • the peptide having a membrane-permeable domain may be composed of only the membrane-permeable domain, or may have an arbitrary amino acid sequence at the C-terminal and / or N-terminal of the membrane-permeable domain.
  • the amino acid sequence added to the C-terminal and / or N-terminal of the membrane-permeable domain is preferably an amino acid sequence having rigidity (for example, polyproline).
  • Polyproline unlike polyethylene glycol (PEG), which is soft and irregularly shaped, is linear and retains some rigidity.
  • the amino acid residues included in the amino acid sequence added to the C-terminal and / or N-terminal of the membrane-permeable domain are preferably amino acid residues other than acidic amino acids. This is because a negatively charged acidic amino acid residue may electrostatically interact with a positively charged arginine residue to reduce the effect of the arginine residue contained in the membrane-permeable domain.
  • the content of the peptide having a membrane-permeable domain contained in the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited. Usually, the ratio of the peptide having a membrane-permeable domain to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles is 4 to 20 mol%, preferably 6 to 16 mol%, more preferably 8 to 12 mol%. is there.
  • the amount of the membrane-permeable peptide domain present in the lipid nanoparticles according to the present invention to the above range, the binding ability of the lipid nanoparticles to the mitochondrial membrane can be improved, and the binding between the lipid nanoparticles and the mitochondrial membrane can be improved. As an opportunity, membrane fusion between lipid nanoparticles and mitochondrial membrane can be efficiently induced.
  • the membrane-permeable domain contained in the lipid nanoparticle according to the present invention exists on the particle surface of the lipid nanoparticle.
  • the membrane-permeable domain is preferably contained as a derivative directly or indirectly linked to a hydrophobic group or a substance containing the same.
  • the hydrophobic group of the derivative is embedded in the lipid membrane on the particle surface of the lipid nanoparticle, and the membrane-permeable domain is stabilized on the particle surface of the lipid nanoparticle.
  • the hydrophobic group include a saturated or unsaturated fatty acid group and a cholesterol group.
  • a saturated or unsaturated fatty acid residue having 10 to 24 carbon atoms is particularly preferable, and a C14 to C20 fatty acid group is particularly preferable.
  • acyl groups derived from fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, and lignoceric acid.
  • fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, and lignoceric acid.
  • the fatty acid residue has an ester bond (—COO—), an amide bond (—CONH—), an ether bond (—O—), a carbonyl bond (—CO—) between one or more carbon-carbon single bonds. ), And one or more bonds selected from the group consisting of a carbonate bond (—OCOO—).
  • glycerolipids or sphingolipids are preferable. This is because glycerolipids and the like are widely used as constituent components of lipid membranes.
  • the linking group for linking the membrane-permeable domain with a hydrophobic group or the like is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired.
  • a peptide chain, a sugar chain, a POE chain, a PEG chain , A hydrocarbon chain, a nucleic acid chain, or the like, and two or more of these can be used directly or via a group such as an ether bond, a thioether bond, an ester bond, a silyl ether bond, an amide bond, a carbonyl group, or a siloxane bond. And the groups may be linked together.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention also preferably include a mitochondrial translocating RNA aptamer on the particle surface.
  • a mitochondrial translocating RNA aptamer By having a molecule that promotes transfer to mitochondria on the particle surface, the lipid nanoparticle according to the present invention can be made into a lipid nanoparticle that is more excellent in delivery efficiency into mitochondria.
  • mitochondrial translocating RNA aptamers include, for example, RP RNA aptamer (SEQ ID NO: 5), MRP RNA aptamer (SEQ ID NO: 6), and D-arm RNA aptamer (SEQ ID NO: 7) (see Non-patent Document 4). Is mentioned.
  • Lipids are an essential component of lipid nanoparticles.
  • the amount of lipid contained in the lipid nanoparticle is usually at least 70 mol%, preferably at least 75 mol%, more preferably at least 80 mol%, based on the total amount of the substances constituting the lipid nanoparticle.
  • Examples of the lipid constituting the lipid nanoparticle include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like exemplified below.
  • phospholipid examples include phosphatidylcholines (for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, etc.), phosphatidylglycerol (for example, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol).
  • phosphatidylcholines for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, etc.
  • phosphatidylglycerol for example, dioleoyl
  • Phosphatidyl glycerol dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol, etc.
  • phosphatidyl ethanolamine for example, dilauroyl phosphatidyl ethanolamine, dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine, dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine, distearoyl phos) Fatidiethanolamine
  • phosphatidylserine phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, ceramide phosphorylethanolamine, ceramide phosphorylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, 1,2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholine, plasmalogen, Egg yolk lecithin, soy lecithin, hydrogenated products thereof and the like.
  • glycolipids examples include glyceroglycolipids (eg, sulfoxyribosylglyceride, diglycosyldiglyceride, digalactosyldiglyceride, galactosyldiglyceride, glycosyldiglyceride), and glycosphingolipids (eg, galactosylcerebroside, lactosylcerebroside, ganglioside) and the like. .
  • glyceroglycolipids eg, sulfoxyribosylglyceride, diglycosyldiglyceride, digalactosyldiglyceride, galactosyldiglyceride, glycosyldiglyceride
  • glycosphingolipids eg, galactosylcerebroside, lactosylcerebroside, ganglioside
  • animal-derived sterols eg, cholesterol, cholesterol succinic acid, cholestanol, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol
  • plant-derived sterols eg, stigmasterol, sitosterol, campesterol
  • Sterols derived from microorganisms for example, timosterol and ergosterol
  • saturated or unsaturated fatty acids examples include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms, such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • lipid constituting the lipid nanoparticle according to the present invention one or more lipid derivatives having various functions can be used.
  • the lipid derivative include a lipid derivative having a blood retention function, a temperature change sensitive function, a pH sensitive function, and the like.
  • Examples of the blood-retaining lipid derivative capable of imparting a blood-retaining function include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivative, glutamic acid derivative, polyglycerin phospholipid derivative, and polyalkylene glycol. Derivatives and the like.
  • polyalkylene glycol derivatives examples include N- ⁇ carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbonyl-methoxypolyethylene glycol-750 ⁇ -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N - ⁇ Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000 ⁇ -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000 ⁇ -1,2-distearoyl-sn- Risero -3 phosphodiesterase polyethylene glycol derivatives such as ethanolamine and the like.
  • Examples of the temperature-change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature-change sensitive function include, for example, dipalmitoyl phosphatidylcholine, and examples of the pH-sensitive lipid derivative capable of imparting a pH-sensitive function include dioleoyl phosphatidyl Ethanolamine and the like can be mentioned.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can also contain various additives as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the additive include a film stabilizer, an antioxidant, and a charged substance.
  • a membrane stabilizer is any component that can be included to physically or chemically stabilize a lipid membrane or to adjust the fluidity of a lipid membrane.
  • the film stabilizer include sterol, glycerin, and fatty acid esters thereof.
  • the sterol include the same specific examples as described above, and examples of the fatty acid ester of glycerin include triolein and trioctanoin.
  • the amount of the membrane stabilizer contained in the lipid nanoparticle is usually 30 mol% or less, preferably not more than the total lipid amount constituting the lipid nanoparticle. It is at most 25 mol%, more preferably at most 20 mol%. Note that the lower limit of the content of the film stabilizer is 0 mol%.
  • Antioxidants are optional components that can be included to prevent oxidation of lipid membranes.
  • the antioxidant include tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene, and the like.
  • the amount of the membrane stabilizer contained in the lipid nanoparticles is usually 30 mol% or less, preferably 25 mol% or less of the total amount of the substances constituting the lipid nanoparticles. Mol% or less, more preferably 20 mol% or less. The lower limit of the content of the antioxidant is 0 mol%.
  • a charged substance is an optional component contained to impart a positive charge or a negative charge to a lipid membrane.
  • the charged substance imparting a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; and saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane.
  • the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, and the like.
  • the amount of the charged substance contained in the lipid nanoparticle is usually 30 mol% or less, preferably 25 mol% or less, of the total substance constituting the lipid nanoparticle. , More preferably 20 mol% or less. Note that the lower limit of the content of the charged substance is 0 mol%.
  • a protein is any component that can be included to maintain the structure of a lipid membrane or to impart functionality to a lipid membrane.
  • the membrane protein include a membrane surface protein, an integral membrane protein, an antibody, and a signal peptide.
  • the amount of the protein contained in the lipid nanoparticle is usually 10 mol% or less, preferably 5 mol% or less, of the total amount of the substance constituting the lipid nanoparticle, and further, It is preferably at most 2 mol%.
  • the lower limit of the protein content is 0 mol%.
  • the lipid nanoparticle By retaining an antibody against the cell surface antigen of the target cell on the surface of the lipid nanoparticle, the lipid nanoparticle can be specifically incorporated into the target cell.
  • a monoclonal antibody is preferably used, and one type of monoclonal antibody having specificity for a single epitope may be used, and two or more types of monoclonal antibodies having specificity for various epitopes may be used.
  • Antibodies may be used in combination.
  • the antibody either a monovalent antibody or a multivalent antibody may be used.
  • any of the native (intact) molecules or fragments or derivatives thereof may be used, for example, F (ab ') 2, Fab', Fab, chimeric antibodies having at least two antigens or epitope binding sites, or Use a hybrid antibody, or a bispecific recombinant antibody such as quadrome or triome, an interspecies hybrid antibody, an anti-idiotype antibody, or a derivative that has been chemically modified or processed. be able to.
  • the lipid nanoparticle can be preferentially transported to a specific cell or organelle.
  • the signal peptide is preferably contained as a derivative directly or indirectly linked to a hydrophobic group or a substance containing the same, as in the case of the membrane-permeable domain peptide.
  • a hydrophobic group a substance containing the same, and a linking group for linking the signal peptide to the hydrophobic group, the same as those described above can be used.
  • the amount of the signal peptide contained in the lipid nanoparticle is usually 10 mol% or less, preferably 5 mol% or less of the total amount of the substances constituting the lipid nanoparticle. , More preferably 2 mol% or less.
  • the lower limit of the content of the signal peptide is 0 mol%.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention preferably have one or more mitochondrial targeting signals (MTS).
  • MTS mitochondrial targeting signals
  • the binding ability of the lipid nanoparticles to the mitochondrial membrane can be improved, and the membrane fusion between the lipid nanoparticles and the mitochondrial membrane can be efficiently induced by the binding between the lipid nanoparticles and the mitochondrial membrane.
  • MTS mitochondrial targeting signals
  • any peptide can be used as long as the function of the MTS is retained, a known MTS may be used as it is, or a mutation (deletion of one or more amino acids, Substitution, insertion or addition) may be used.
  • MTS is usually composed of 20 to 70 amino acid residues.
  • MTS has an ability to translocate to various regions in mitochondria such as outer mitochondrial membrane, inner mitochondrial membrane, intermitochondrial space, and mitochondrial matrix.
  • any MTS may be used in the present invention.
  • the known MTS for example, the one disclosed in Patent Document 3 can be used.
  • lipid nanoparticles according to the present invention can be subjected to appropriate surface modification and the like as needed.
  • lipid nanoparticles can be surface-modified with oligosaccharide compounds of three or more sugars.
  • the type of the oligosaccharide compound having three or more saccharides is not particularly limited.
  • an oligosaccharide compound having about 3 to 10 saccharide units bound thereto can be used, and preferably about 3 to 6 saccharide units are bound. Oligosaccharide compounds can be used.
  • the amount of surface modification of the lipid nanoparticles by the oligosaccharide compound is not particularly limited, but is, for example, about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably about 5 to 10 mol% based on the total lipid amount. It is.
  • the surface modification of lipid nanoparticles with an oligosaccharide compound can be performed by a known method described in WO 2007/102481 or the like.
  • the form of the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, examples of the form dispersed in an aqueous solvent include unilamellar liposomes, multilamellar liposomes, and spherical micelles.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are preferably unilamellar liposomes and multilamellar liposomes.
  • the size of the lipid nanoparticles according to the present invention is preferably high, even when the target cell is present in a relatively deep part of the living body, so that the average particle diameter is preferably 300 nm or less.
  • the particle diameter is more preferably 200 nm or less, and further preferably the average particle diameter is 100 nm or less.
  • the average particle diameter of the lipid nanoparticles means the number average particle diameter measured by dynamic light scattering (DLS).
  • the measurement by the dynamic light scattering method can be performed by a conventional method using a commercially available DLS device or the like.
  • the method for producing the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be adopted.
  • it can be produced by a simple hydration method.
  • the simple hydration method first, all lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and a lipid film is formed by performing drying under reduced pressure using an evaporator or spray drying using a spray dryer, and then drying the aqueous solvent. It can be produced by adding the mixture to the above mixture and further emulsifying the mixture with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsifier.
  • an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsifier.
  • the obtained aqueous dispersion of lipid nanoparticles can also be freeze-dried or spray-dried.
  • the liposome can be produced by a well-known method, for example, a reverse phase evaporation method.
  • extrusion extrusion filtration
  • composition of the aqueous solvent is not particularly limited, and examples thereof include buffers such as phosphate buffer, citrate buffer, and phosphate buffered saline, physiological saline, and a medium for cell culture. Can be.
  • aqueous solvents can stably disperse lipid nanoparticles, and furthermore, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharide, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and meresinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars (aqueous solutions) such as sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol; glycerin, diglycerin, and polyglycerin , Propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol -Al
  • the pH of the aqueous solvent should be set from weakly acidic to about neutral (about pH 3.0 to 8.0), and / or dissolved oxygen should be removed by nitrogen bubbling or the like. Is desirable.
  • the photofunctional compound contained in the lipid nanoparticles according to the present invention is soluble in an organic solvent. For this reason, after dissolving and drying in an organic solvent at the same time as other lipid components, an aqueous solvent is added and emulsified, whereby lipid nanoparticles containing a photofunctional compound can be produced.
  • the lipid nanoparticle according to the present invention contains a corn-type lipid as a lipid constituting a lipid membrane, and has a membrane permeable domain on the particle surface. Therefore, the efficiency of incorporation into cells is high, and the efficiency of incorporation into mitochondria is also high.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention contain a membrane-permeable domain having a high content ratio of positively charged amino acid residues, the delivery efficiency into mitochondria is extremely excellent, and the encapsulating photofunctionality Compounds can be efficiently transferred into mitochondria.
  • the lipid nanoparticle according to the present invention can be used as a photocontrollable cytotoxic agent.
  • All the photofunctional compounds contained in the lipid nanoparticles according to the present invention have an absorption maximum wavelength of 650 to 1000 nm. Because many substances in the body do not absorb wavelengths between 650 and 1200 nm, near-infrared light can reach deeper into the body than light of other wavelengths. For this reason, the lipid nanoparticles according to the present invention are particularly preferably used when cells or tissues for causing cell damage are present inside the body. In addition, light having a wavelength shorter than 650 nm has a low phototherapeutic effect, and thus has the advantage that cells not irradiated with near-infrared light have a low risk of cell damage caused by natural light or the like.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention may be used for damaging cells in vitro, such as cultured cells, or may be used for damaging cells in vivo.
  • the target cell is a cell cultured in vitro
  • the lipid nanoparticle can be incorporated into the target cell by culturing the target cell in a medium containing the lipid nanoparticle according to the present invention.
  • the target cells are cells in a living body
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be administered by intravenous administration or the like to reach the target cells and be taken up. Next, the target cells are irradiated with near-infrared light.
  • a tissue containing the target cell may be irradiated with near-infrared light from outside the living body.
  • the irradiated near-infrared light causes a photochemical reaction of the photofunctional compound delivered into the target cells by the lipid nanoparticles, damaging the cell membrane of the target cells and necrosis of the target cells.
  • the irradiation amount of the near-infrared light is not particularly limited as long as the light amount is sufficient to damage the target cells in which the photofunctional compound has been incorporated by the irradiated near-infrared light. It is preferably at least 1 J / cm 2 .
  • the lipid nanoparticles according to the present invention control cytotoxicity by near-infrared light having excellent biological permeability.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are preferable as an active ingredient of a pharmaceutical composition, more preferably as an active ingredient of a pharmaceutical composition used for photodynamic therapy, and are used for diseases or abnormal cells caused by cell overgrowth. Is more preferable as an active ingredient of a pharmaceutical composition used in photodynamic therapy for the purpose of treating a disease caused by, and particularly preferable as an active ingredient of a pharmaceutical composition used in photodynamic therapy for the purpose of treating cancer. .
  • the lipid nanoparticles according to the present invention have higher incorporation efficiency into mitochondria than the conventional method of transferring a photofunctional compound into mitochondria performed in Patent Document 2 and the like. For this reason, the lipid nanoparticle according to the present invention is also preferable as an active ingredient of a pharmaceutical composition used for photodynamic therapy for treating a disease caused by mitochondrial abnormality.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and may vary depending on the target cell and the tissue containing the same. It is determined as appropriate.
  • the administration route of the pharmaceutical composition according to the present invention includes oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, enema administration and the like.
  • the animal to which the pharmaceutical composition according to the present invention is administered is not particularly limited, and may be a human or an animal other than a human.
  • Non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters, guinea pigs, and birds such as chickens, quails, ducks, and the like.
  • compositions according to the present invention may be prepared by the usual methods, such as powders, granules, capsules, tablets, chewables, oral solids such as sustained-release preparations, solutions, oral liquids such as syrups, and injections.
  • Formulation may be carried out, if necessary, by excipients, binders, lubricants, disintegrants, fluidizers, solvents, dissolution aids, buffers, suspending agents, emulsifiers, isotonic agents ,
  • a stabilizer, a preservative, an antioxidant, a flavoring agent, a coloring agent, and the like can be compounded by a conventional method.
  • dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE) and sphingomyelin (SM) were obtained from Avanti Polar Lipids (AL, USA).
  • DOPE dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine
  • SM sphingomyelin
  • STR-R8 Stearylated octaarginine (STR-R8) from Toray Research Center (Japan), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) from Wako (Japan), fetal bovine serum (FBS) from Sigma @ Aldrich (MO, USA)
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • MO fetal bovine serum
  • annexin V-FITC apoptosis detection kit was purchased from Nakarai Tesque (Kyoto, Japan).
  • SAS cells human oral squamous cell carcinoma cells, were obtained from the National Institute of Biomedical Innovation (Health, and JETB), and HeLa cells were obtained from Riken BRC (Japan).
  • Singlet oxygen sensor green reagent, MitoTracker® Green FM and MitoSOX® Red Mitochondrial Superoxide Indicator were purchased from Thermo Fischer Scientific Inc. (MA, USA). All other chemicals and solvents used were commercial reagent grade products.
  • ⁇ NMR> 1 H and 13 C NMR spectra were measured using an NMR spectrometer (JNM-EX400, manufactured by JEOL).
  • the FT-IR spectrum was recorded using a spectrometer (FT / IR 660Plus, manufactured by JEOL).
  • High-resolution mass spectra (HRMS) were obtained using MALDI (Ultraflex II, manufactured by Bruker) or ESI (Scientific Exactive, manufactured by ThermoFisher).
  • the UV-visible-near infrared (NIR) absorption spectrum was measured using a spectrophotometer (Scientific Evolution 220, manufactured by ThermoFisher).
  • the steady state fluorescence spectrum was recorded using a spectrofluorometer (F4500, manufactured by Hitachi).
  • ⁇ Culture of cultured cells HeLa cells and SAS cells were cultured in low glucose DMEM supplemented with 10% FBS and penicillin-streptomycin at 37 ° C. in a 5% CO 2 / air atmosphere. The cells were passaged at 90% confluency.
  • IR film: 3066, 2918, 2850, 2187, 2160, 2137, 1687, 1595, 1501, 1434, 1327, 1236, 1176, 1095, 1032, 999, 938, 824, 790, 712, 628, 590, 563 , 518, 494, 470, 445, 433, 409 cm -1 .
  • HRMS MALDI: m / z calcd for C98H94N6O10Zn (M +), 1578.6317; found 1578.6311.
  • Example 1 Lipid nanoparticles for delivering the photofunctional compound rTPA produced in Production Example 1 to mitochondria were produced. Specifically, lipid nanoparticles (rTPA-MITO-Porter) in which rTPA is retained in a lipid structure targeting mitochondria (MITO-Porter) were produced using a simple hydration method (Non-Patent Document 6). reference.).
  • lipid ethanol solution obtained by dissolving a lipid mixture containing DOPE and SM at a 9: 2 (molar ratio) in ethanol, and a chloroform solution obtained by dissolving rTPA in chloroform were mixed with a total lipid amount.
  • a chloroform solution obtained by dissolving rTPA in chloroform was mixed with a total lipid amount.
  • the lipid solution in the test tube was dried under reduced pressure, and a HEPES buffer solution containing glucose (10 mM HEPES, 290 mM glucose) was added to the obtained lipid membrane film and hydrated at room temperature for 15 minutes (total lipid concentration: 0.55 mM).
  • the hydrated lipid solution was subjected to ultrasonic treatment with a bath-type sonicator (AU-25C, manufactured by Aiwa Medical Industry Co., Ltd.) for 30 seconds, and then with a probe-type sonicator for 10 minutes to give liposomes (rTPA-LP).
  • a bath-type sonicator (AU-25C, manufactured by Aiwa Medical Industry Co., Ltd.) for 30 seconds, and then with a probe-type sonicator for 10 minutes to give liposomes (rTPA-LP).
  • AU-25C bath-type sonicator
  • a STR-R8 solution is added to the collected supernatant (rTPA-LP suspension) so that the content ratio of STR-R8 to total lipids is 10 mol%, and liposomes targeting mitochondria and encapsulating rTPA RTPA-MITO-Porter was produced.
  • ⁇ Measurement of particle distribution and zeta potential The particle size and distribution of the produced liposomes were examined using dynamic light scattering (DLS). Zeta potential was measured by phase analytical light scattering (PALS) on a 5 ⁇ M solution using the M3-PALS technique (Zetasizer Nano ZS, manufactured by Malvern Instruments, Worcestershire, UK).
  • PALS phase analytical light scattering
  • FIG. 1 shows an absorption spectrum of a 6 ⁇ M DMSO solution
  • FIG. 2 shows a particle size distribution measured by DLS
  • FIG. 3 shows a result of zeta potential measured by PALS. Show.
  • FIGS. 1 and 2 it was confirmed that both rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter were nanoparticles of approximately the same size.
  • FIG. 3 it was confirmed that rTPA-LP was negatively charged, whereas rTPA-MITO-Porter was a positively charged nanoparticle.
  • the liposome solution of rTPA-MITO-Porter was stored at 4 ° C. for several days, and the average particle size (nm) and the polydispersity index (PDI), which is an index of uniformity, were determined with time. It was measured.
  • FIG. 4 shows the measurement results. In the figure, solid triangles represent the results of particle size, and open squares represent the results of PDI. As a result, it was confirmed that the rTPA-MITO-Porter can stably exist at 4 ° C. for 2 weeks or more.
  • SOSG Singlet Oxygen Sensor Green
  • meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine dihydrate was used as a positive control, except that the wavelength of irradiation light was 430 nm. Note that meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine dihydrate has a maximum absorption wavelength near 420 nm.
  • rTPA-LP (“rTPA-LPs” in the figure) generates singlet oxygen by light irradiation similarly to the positive control. From these results, it was confirmed that even when rTPA was loaded on the liposome, generation of singlet oxygen was induced by irradiation with near-infrared light, that is, it had a phototherapeutic effect.
  • Example 2 The phototherapy effect of rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter prepared in Example 1 on cancer-derived cultured cells was examined.
  • the cultured cells used were HeLa cells, which are cervical cancer cell cultures, and SAS cells, which were oral cancer cell cultures.
  • DMEM rTPA-LP concentration: 0, 0.05, 0.1, 0.25, or 0.5 ⁇ M
  • WST1 assay Cell viability after light irradiation treatment was evaluated using the WST1 assay.
  • the WST-1 reagent was first added to the culture solution in each well immediately after irradiation, and the mixture was incubated for 2 hours. Next, the change in the absorbance of the culture solution in each well was measured using a microplate photometer (EnSpire (registered trademark) multimode plate reader, manufactured by Perkin Elmer, USA). Measurements were taken at 450 nm absorbance using the 630 nm standard. At least three independent trials were performed.
  • FIG. 6A shows the results of cells without light irradiation
  • FIG. 6B shows the results of cells after light irradiation treatment.
  • the cells into which rTPA-MITO-Porter had been taken up had no cell killing effect observed when the near-infrared light irradiation treatment was not performed (illustration shown). Is omitted.)
  • the cell viability was comparable to that of untreated cells, and no cell killing effect was observed.
  • rTPA-MITO-Porter showed a phototherapeutic effect. It was confirmed to have.
  • the EC 50 of rTPA-MITO-Porter was 0.16 ⁇ M (0.26 ⁇ g / mL).
  • the phototherapeutic effect of rTPA-MITO-Porter was observed at a lower concentration than rTPA-LP, suggesting that rTPA-MITO-Porter has higher mitochondrial uptake efficiency than rTPA-LP. .
  • SAS cells were used in place of HeLa cells, the number of cells seeded in a 48-well plate was 5 ⁇ 10 4 cells / mL, and the amount of rTPA-MITO-Porter added to the medium was 0, 0.1, RTPA-MITO-Porter was incorporated into SAS cells in the same manner except that the irradiation time of the light irradiation treatment was 5 minutes and the light intensity was 20.6 J / cm 2 ). The cell viability (%) after irradiation with near-infrared light was examined by the WST1 assay.
  • the SAS cells into which rTPA-MITO-Porter had been incorporated did not show a cell killing effect when the near-infrared light irradiation treatment was not performed (not shown).
  • the EC 50 of rTPA-MITO-Porter was 0.41 ⁇ M (0.64 ⁇ g / mL).
  • Example 3 The uptake of rTPA-MITO-Porter in the cultured cancer cells was evaluated.
  • rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter were prepared using DOPE (NBD-DOPE) labeled with a fluorescent dye (NBD) instead of DOPE.
  • cells were seeded in a 6-well plate and cultured for 24 hours. Next, the medium in each well was replaced with DMEM containing no FBS and containing NBD-labeled rTPA-LP or NBD-labeled rTPA-MITO-Porter, followed by culturing. The cells after culturing for 1 hour from the medium exchange were washed once with PBS containing 20 units / mL of heparin, and then treated with trypsin. The separated cells were centrifuged at 700 ⁇ g at 4 ° C. for 3 minutes, and the supernatant was removed.
  • the obtained cell pellet was washed with PBS containing 0.5% (w / v) bovine serum albumin and 0.1% (w / v) sodium azide (FACS buffer), and then centrifuged again. And the supernatant was drained. After resuspending the obtained cell pellet in a FACS buffer, NBD-labeled rTPA-LP or NBD-labeled rTPA-MITO-Porter was analyzed using a flow cytometer (Gallious, manufactured by Beckman Coulter, Inc., USA). The incorporated cells were sorted.
  • FIG. 9A shows the results of flow cytometry analysis
  • “Non treatment” indicates the results of cells not incorporating liposomes
  • “LPs” indicates the results of cells incorporating NBD-labeled rTPA-LP
  • “MITO-Porter” indicates results of cells without NBD-labeled rTPA-MITO-Porter. The results of the cells into which is incorporated are shown. As shown in FIG. 9B, the NBD-labeled rTPA-MITO-Porter always showed high cell transduction ability.
  • the cell uptake efficiency of NBD-labeled rTPA-MITO-Porter was about 8-fold higher than that of NBD-labeled rTPA-LP.
  • the polyarginine modification (MITO-Porter) increased the uptake efficiency into cells about eight-fold. This suggested that the amount of delivery to mitochondria was also improved.
  • Example 4 The intracellular localization of rTPA-LP and rTPA-MITO-Porter incorporated into the cells was examined.
  • HeLa cells were seeded on a 35 mm glass base dish (Iwaki, Japan) and cultured for 24 hours. Next, the culture medium of each dish was replaced with DMEM containing no FBS and phenol red and containing rTPA-LP or rTPA-MITO-Porter, followed by culturing. DMEM containing FBS but not phenol red was added to the medium of the cells after culturing for 1 hour after the medium was exchanged to adjust the FBS concentration in the medium to 10% (w / v), and then cultured for 2 hours. did. After washing the cultured cells, the cells were replaced with fresh phenol red-free DMEM containing FBS and a fluorescent reagent, and incubated for 30 minutes.
  • MitoTracker (trademark) Green @ FM that stains mitochondria was used as a fluorescent reagent.
  • the cells after the incubation were observed using a confocal laser scanning microscope (Nikon Eclipse Ti, Nikon Instrument) having excitation wavelengths of 487.4 nm and 636.1 nm.
  • rTPA fluorescence was observed at 663-738 nm (red) and MitoTracker ⁇ Green ⁇ FM fluorescence was observed at 500-550 nm (green).
  • FIG. 11 is a microscopic image of cells into which rTPA-MITO-Porter has been taken
  • FIG. 12 is a microscopic image of cells into which rTPA-LP has been taken.
  • yellow signals were observed in the rTPA image and the merge image of the MitoTracker ⁇ Green ⁇ FM image, confirming that rTPA was localized in mitochondria (FIG. 11).
  • the amount of rTPA-LP incorporated into cells was smaller than that of rTPA-MITO-Porter, and transfer to mitochondria was hardly observed. From these results, it was confirmed that the photofunctional compound was transported to mitochondria with very high efficiency by retaining the lipid nanoparticles having positively charged surfaces.
  • the cells into which rTPA-MITO-Porter had been taken up and the cells into which rTPA-LP had been taken up were subjected to light irradiation under the same conditions as in Example 2.
  • cell death was induced by irradiation time of about 8 minutes
  • cell death was induced by irradiation time of about 12 minutes.
  • the time required for inducing cell death by irradiation with 700 nm light was shorter in the cells incorporating rTPA-MITO-Porter than in the cells incorporating rTPA-LP.
  • FIG. 13 shows transmitted light images and mitochondrial stained images of cells into which rTPA-MITO-Porter was taken in before and after the light irradiation treatment.
  • the morphology of mitochondria changed.
  • RTPA-MITO-Porter was injected into tumor-bearing mice, and the anticancer effect obtained by light irradiation treatment was examined.
  • Tumor-bearing mice were prepared by injecting SAS cells subcutaneously into Balb / c mice (male, 4 weeks old).
  • the tumor volume and body weight of each mouse were measured over time.
  • the tumor volume was calculated using the following formula by measuring the lengths of the long side and the short side of the subcutaneous tumor tissue using calipers.
  • rTPA-MP (+) shows the results of the rTPA-MITO-Porter administration group
  • HBG (+) shows the results of the control group.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、光線力学療法に好適な光機能性化合物及びこれを含む脂質ナノ粒子を提供することを課題とする。本発明は、下記一般式（１）［式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立して、水酸基、メトキシ基、又はエトキシ基を表し；ｎ１～ｎ４は、それぞれ独立して、０又は１を表し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水酸基又は炭素数１～１５のアルコキシ基を表し；ｎ５及びｎ６は、それぞれ独立して、０、１又は２を表し；Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、又は－ＣＯＯＲ９（Ｒ９は、炭素数１～３のアルキル基）を表す］で表されることを特徴とする、化合物を提供する。

Description

光機能性化合物及び脂質ナノ粒子
　本発明は、光線力学療法に好適な光機能性化合物、及び当該光機能性化合物を含む脂質ナノ粒子に関する。
　本願は、２０１８年９月１４日に、日本に出願された特願２０１８－１７２６９８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　光線力学療法は、光機能性化合物を用いて標的の細胞や組織を障害する治療方法である。標的とする細胞や組織に光機能性化合物を取り込ませて、特定の波長の光を照射する。当該光機能性化合物に引き起こされた光化学反応の結果、標的の細胞等は障害される。光線力学療法は、障害させる細胞を光の照射領域の調節によって制御できるため、時空間的に高い解像度（ミリ秒以下、ミリメートル以下）を有すること、非侵襲的な外部刺激が可能であることから、治療法開発が盛んに行われている。
　光線力学療法に使用される光機能性化合物としては、例えば、フォトフリンやレザフィリンのようなポルフィリン誘導体化合物がある。ポルフィリン誘導体化合物は、癌細胞選択的に集積するため、これを患者に投与し、光照射により産生された活性酸素によって癌細胞死を誘導する。また、ポルフィリン類縁体化合物を用いた「癌光免疫療法」（非特許文献１参照。）は、２０１６年４月の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）からの認可を皮切りに、日本をはじめとする各地で臨床試験が行われている。
　光線力学療法においては、ミトコンドリアを標的とすることも考えられている。ミトコンドリアは細胞死を司るオルガネラであり、これを標的とすることで、従来の薬剤に耐性を有する悪性細胞に対する死滅効果を狙うことができる。また、ミトコンドリア機能の変調は、ミトコンドリア脳筋症、神経変性疾患、癌、糖尿病などの種々の疾患との関連が報告されており、当該オルガネラを標的とした新規治療法開発が期待されている。しかしミトコンドリアを標的とした光線力学療法は基礎研究段階であり（例えば、特許文献１参照。）、国内外において未だ確立されていない。
　ミトコンドリアを標的とした光線力学療法の実現のためには、光機能性化合物を効率的にミトコンドリア内に移送することが重要である。ミトコンドリア内への光機能性化合物の移送は、従来、光機能性化合物の細胞膜透過性と陽電荷を調整することにより実現してきた（例えば、特許文献２、非特許文献２、及び非特許文献３参照。）。
　一方で、脂質ナノ粒子を、ミトコンドリア内に目的物質を送達するためのキャリアとして利用する方法が報告されている。例えば、特許文献３には、膜融合性脂質を含有し、ミトコンドリアターゲティングシグナルペプチドを表面に有する脂質膜を備える脂質膜構造体の内部に、目的物質の凝集体を保持させる方法が開示されている。目的物質を保持させた脂質膜構造体を細胞に取り込ませることにより、当該目的物質をミトコンドリア内に放出させることができる。
特開２００７－２７１５０３号公報 特表２００９－５１１６２６号公報 国際公開第２００６／０９５８３７号 国際公開第２０１７／０９０７６３号
Mitsunaga，et al.，Nature Medicine，2011，vol.17，p.1685-1691. Luo，et al.，Advanced Functional Materials，2016，vol.26，p.2826-2835. Guo，et al.，Small，2016，vol.12(33)，p.4541-4552. Yamada, et al.，Journal of Pharmaceutical Sciences，2016，vol.105，p.1705-1713. Lee，et al.，Chemical Communications，2011，vol.47(14)，p.4246-4248. Yamada，et al.，Biochim. Biophys. Acta，2008，vol.1778，p.423-432.
　細胞環境内で効果的に作用する光機能性化合物は、ポルフィリン誘導体化合物をはじめとして多数報告されているが、いずれも利用できる光の波長が限られていたり、適切な溶媒溶解性を有する必要があるなどの問題があった。特に、従来の光機能性化合物の細胞膜透過性と陽電荷を調整する方法では、分子設計の自由度に大きな制約を受けるため、利用可能な化合物が限定されるという問題もあった。
　本発明は、近赤外光の照射によって光治療効果を生じる、光線力学療法に好適な光機能性化合物、及びこれを細胞内へ輸送するための脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ポルフィリン骨格のπ電子共役構造を拡張することにより、光補足の効率が高く、かつ光誘起電子移動効果が得られる光機能性化合物となること、及び、当該光機能性化合物をミトコンドリア内への送達性に優れた脂質ナノ粒子に内包させることにより、光捕集性と細胞傷害性に優れた、光線力学療法に好適な脂質ナノ粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の化合物、脂質ナノ粒子、及び医薬用組成物を提供するものである。
［１］　下記一般式（１）
［式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立して、水酸基、メトキシ基、又はエトキシ基を表し；ｎ１～ｎ４は、それぞれ独立して、０又は１を表し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、炭素数１～１６のアルコキシ基を表し；ｎ５及びｎ６は、それぞれ独立して、０、１又は２を表し；Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、又は－ＣＯＯＲ９（Ｒ９は、炭素数１～３のアルキル基）を表す；ｎ５又はｎ６が２の場合、複数存在するＲ５及びＲ６は、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい］
で表されることを特徴とする、化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［２］　コーン型脂質、膜透過性ドメインを有するペプチド、及び光機能性化合物を含有し、
　前記光機能性化合物が、下記一般式（１）
［式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立して、水酸基、メトキシ基、又はエトキシ基を表し；ｎ１～ｎ４は、それぞれ独立して、０又は１を表し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、炭素数１～１６のアルコキシ基を表し；ｎ５及びｎ６は、それぞれ独立して、０、１又は２を表し；Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、又は－ＣＯＯＲ９（Ｒ９は、炭素数１～３のアルキル基）を表す；ｎ５又はｎ６が２の場合、複数存在するＲ５及びＲ６は、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい］
で表される化合物、及び、極大吸収波長が６８０ｎｍ以上であるシアニン化合物からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、脂質ナノ粒子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［３］　前記膜透過性ドメインを構成する総アミノ酸残基に対する正電荷アミノ酸残基の割合が、５０％以上である、前記［２］の脂質ナノ粒子。
［４］　前記膜透過性ドメインが、ポリアルギニンからなる、前記［２］又は［３］の脂質ナノ粒子。
［５］　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記コーン型脂質の割合が７０モル％以上である、前記［２］～［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［６］　光線力学療法に用いられる、前記［２］～［５］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［７］　前記［２］～［６］のいずれかの脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
　本発明に係る化合物は、近脂溶性の高い光機能性化合物である。このため、当該化合物は、脂質ナノ粒子に容易に内包することができる。
　また、本発明に係る化合物を内包する脂質ナノ粒子は、近赤外光を照射して活性酸素を生じる光機能性化合物を内包しており、かつ細胞への取り込み効率に優れている。このため、当該脂質ナノ粒子及びこれを有効成分とする医薬用組成物は、光線力学療法に特に適している。
実施例１において、ｒＴＰＡ－ＬＰとｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの６μＭのＤＭＳＯ溶液の吸収スペクトルを示した図である。 実施例１において、ｒＴＰＡ－ＬＰとｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの粒度分布を示した図である。 実施例１において、ｒＴＰＡ－ＬＰとｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒのゼータ電位の測定結果を示した図である。 実施例１において、４℃の溶液に分散した状態におけるｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの平均粒子径（ｎｍ：図中、黒塗り三角形のプロット）及びＰＤＩを経時的に計測した結果（図中、白抜き四角形のプロット）を示した図である。 実施例１において、エタノール／Ｈ２Ｏ（１/１９９、ｖ/ｖ）中における、ｒＴＰＡ－ＬＰとポジティブコントロールの、６０秒間及び１２０秒間の光照射（光強度＝２０ｍＷ／ｃｍ２：７００±２０ｎｍ（水及びｒＴＰＡ－ＬＰ）及び４３０±１０ｎｍ（ポジティブコントロール））した後の光誘起一重項酸素生成能力の測定結果を示した図である。 実施例２において、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた後に近赤外光照射処理を行わなかったＨｅＬａ細胞の細胞生存率（％）の結果を示した図である。 実施例２において、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた後に近赤外光照射処理を行なったＨｅＬａ細胞の細胞生存率（％）の結果を示した図である。 実施例２において、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた後に近赤外光照射処理を行なったＨｅＬａ細胞の細胞生存率（％）の結果を示した図である。 実施例２において、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた後に近赤外光照射処理を行なったＳＡＳ細胞の細胞生存率（％）の結果を示した図である。 実施例３において、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰ又はＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませたＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示した図である。 実施例３において、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰ又はＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませたＨｅＬａ細胞の取り込み効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例３において、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰ又はＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませたＳＡＳ細胞の取り込み効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例４において、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませたＨｅＬａ細胞の顕微鏡画像である。 実施例４において、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませたＨｅＬａ細胞の顕微鏡画像である。 実施例４において、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませたＨｅＬａ細胞の光照射処理の前後の顕微鏡画像である。 実施例５において、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ投与群と対照群の腫瘍体積（ｍｍ３）を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例５において、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ投与群と対照群の体重（ｇ）を経時的に測定した結果を示した図である。
＜光機能性化合物＞
　本発明に係る光機能性化合物は、下記一般式（１）で表される化合物である。当該化合物は、ポルフィリン骨格のπ電子共役構造を拡張した分子構造を備えるため、光捕集性と細胞傷害性に優れている。さらに、当該化合物は、６５０～１０００ｎｍの波長の光を吸収して光化学反応を引き起こす、光感受性化合物である。以下、特に記載がない限り、「近赤外光」とは波長が６５０～１０００ｎｍの範囲内の光を意味する。細胞内でこの光化学反応が引き起こされる結果、当該細胞が傷害される光治療効果が得られる。なお、光治療効果は、細胞傷害を引き起こす効果を意味し、光誘起電子移動効果、光線力学効果、及び光線温熱効果のいずれであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立して、水酸基、メトキシ基、又はエトキシ基を表す。Ｒ１～Ｒ４は、互いに異なる基であってもよいが、いずれも同じ基であることが好ましい。Ｒ１～Ｒ４としては、メトキシ基又はエトキシ基が好ましく、いずれもメトキシ基である化合物がより好ましい。
　一般式（１）中、ｎ１～ｎ４は、それぞれ独立して、０又は１を表す。一般式（１）で表される化合物としては、ｎ１～ｎ４のうち、一部が０であり、残りが１である化合物であってもよいが、ｎ１～ｎ４の全てが０である化合物、又はｎ１～ｎ４の全てが１である化合物がより好ましい。ｎ１～ｎ４が１の場合、Ｒ１～Ｒ４のうち、一部がパラ位であり、一部がオルト位であり、残りがメタ位である化合物であってもよいが、Ｒ１～Ｒ４の全てがパラ位である化合物、Ｒ１～Ｒ４の全てがオルト位である化合物、又はＲ１～Ｒ４の全てがメタ位である化合物が好ましく、Ｒ１～Ｒ４の全てがパラ位である化合物がより好ましい。
　一般式（１）中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、炭素数１～１６のアルコキシ基を表す。炭素数１～１６のアルコキシ基としては、直鎖状の基であってもよく、分岐鎖状の基であってもよい。当該アルコキシ基としては、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、ｎ－ヘプチルオキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、ｎ－ノニルオキシ基、ｎ－デシルオキシ基、ｎ－ウンデシルオキシ基、ｎ－ドデシルオキシ基、ｎ－トリデシルオキシ基、ｎ－テトラデシルオキシ基、ｎ－ペンタデシルオキシ基、ｎ－ヘキサデシルオキシ基、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、イソペンチルオキシ基、ｓｅｃ－ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、ｓｅｃ－ヘキシルオキシ基、ｔｅｒｔ－ヘキシルオキシ基、ネオヘキシルオキシ基、イソヘプチルオキシ基、ｓｅｃ－ヘプチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ヘプチルオキシ基、ネオヘプチルオキシ基、イソオクチルオキシ基、ｓｅｃ－オクチルオキシ基、ｔｅｒｔ－オクチルオキシ基、ネオオクチルオキシ基、イソノニルオキシ基、ｓｅｃ－ノニルオキシ基、ｔｅｒｔ－ノニルオキシ基、ネオノニルオキシ基、イソデシルオキシ基、ｓｅｃ－デシルオキシ基、ｔｅｒｔ－デシルオキシ基、ネオデシルオキシ基等が挙げられる。特に、脂質ナノ粒子への保持効率をより高められることから、一般式（１）で表される化合物としては、Ｒ５及びＲ６がそれぞれ独立して炭素数１～１６の直鎖状のアルコキシ基である化合物が好ましく、Ｒ５及びＲ６がそれぞれ独立して炭素数６～１６の直鎖状のアルコキシ基である化合物がより好ましい。なかでも、一般式（１）で表される化合物としては、Ｒ５及びＲ６が互いに同種の炭素数７～１１の直鎖状のアルコキシ基である化合物がさらに好ましい。
　一般式（１）中、ｎ５及びｎ６は、それぞれ独立して、０、１又は２を表す。ｎ５又はｎ６が２の場合、複数存在するＲ５及びＲ６は、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい。
　一般式（１）中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、又は－ＣＯＯＲ９（Ｒ９は、炭素数１～３のアルキル基）を表す。
　Ｒ７及びＲ８が炭素数１～３のアルキル基の場合、当該アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、又はイソ－プロピル基が挙げられる。また、Ｒ７及びＲ８が－ＣＯＯＲ９の場合、Ｒ９としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、又はイソ－プロピル基が挙げられる。Ｒ７及びＲ８がカルボキシ基の場合、当該カルボキシ基は、任意のカチオンと塩を形成し、カルボン酸塩の状態であってもよい。カルボン酸塩を構成するカチオンとしては、本件発明の効果を損なわない限り特に限定されるものではなく、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩が好ましい。
　一般式（１）で表される化合物としては、Ｒ７及びＲ８が、どちらもパラ位である化合物、どちらもオルト位である化合物、又はどちらもメタ位である化合物が好ましく、Ｒ７及びＲ８がどちらもパラ位である化合物がより好ましく、Ｒ７及びＲ８がどちらもパラ位であり、かつ互いに同じ基である化合物がさらに好ましい。一般式（１）で表される化合物であって、Ｒ７及びＲ８がどちらもパラ位であり、かつ互いに同じ基である化合物のなかでも、特に、Ｒ７及びＲ８が、カルボン酸塩であってもよいカルボキシ基又は－ＣＯＯＲ９である化合物が好ましく、Ｒ７及びＲ８が、カルボン酸塩であってもよいカルボキシ基である化合物がより好ましく、Ｒ７及びＲ８がカルボン酸塩である化合物がさらに好ましく、Ｒ７及びＲ８が、－ＣＯＯＫ又は－ＣＯＯＮａである化合物が特に好ましい。
　一般式（１）で表される化合物としては、下記一般式（１－１）で表される化合物が好ましい。一般式（１－１）中、Ｒ１1～Ｒ1８は、表１に示す基である。表中、「Ｈ」は水素原子、「Ｍｅ」はメチル基、「Ｅｔ」はエチル基、「ＯＨ」は水酸基、「ＯＭｅ」はメトキシ基、「Ｅｔ」はエトキシ基を表す。また、「ＯＲ’」は、炭素数が１以上１６以下の直鎖状アルコキシ基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜脂質ナノ粒子＞
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、コーン型脂質、膜透過性ドメイン（Protein Transduction Domain：ＰＴＤ）を有するペプチド、及び光機能性化合物を含有し、当該光機能性化合物が、前記一般式（１）で表される化合物、及び、極大吸収波長が６８０ｎｍ以上であるシアニン化合物からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする。本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面が脂質膜によって被覆されているナノ粒子であり、その内部に前記一般式（１）で表される化合物等の光機能性化合物を保持している。光機能性化合物を脂質ナノ粒子に包含させた状態で移送させることにより、細胞内、特にミトコンドリア内に効率よく送達することができる。
［光機能性化合物］
　本発明に係る脂質ナノ粒子が含有する光機能性化合物は、前記一般式（１）で表される化合物、又は、極大吸収波長が６８０ｎｍ以上であるシアニン化合物のうち、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせていてもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子が含有する光機能性化合物としては、前記一般式（１）で表される化合物が好ましく、前記一般式（１）で表される化合物がより好ましい。
　極大吸収波長が６８０ｎｍ以上であるシアニン化合物としては、下記一般式（２－１）で表される化合物、下記一般式（２－２）で表される化合物、下記一般式（２－３）で表される化合物、又は下記一般式（２－４）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　一般式（２－１）、一般式（２－２）、一般式（２－３）、及び一般式（２－４）中、Ａ－は、１価のアニオンである。Ａ－は、特に限定されるものではなく、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン、アスタチン化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。
　一般式（２－１）、一般式（２－２）、一般式（２－３）、及び一般式（２－４）中、Ｒ２１は、－Ｚ２１－ＣＨ３又は－Ｚ２１－ＣＯＯＨを表す。Ｚ２１は、単結合、又は、炭素数１～８のアルキレン基若しくは炭素数２～８のアルケニレン基である。アルキレン基及びアルケニレン基は、いずれも、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。炭素数１～８のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ－プロピレン基、ｎ－ブチレン基、ｎ－ペンチレン基、ｎ－ヘキシレン基、ｎ－ヘプチレン基、ｎ－オクチレン基等が挙げられる。炭素数２～８のアルケニレン基としては、例えば、ビニレン基、ｎ－プロペニレン基、ｎ－ブテニレン基、ｎ－ペンテニレン基、ｎ－ヘキセニレン基、ｎ－ヘプテニレン基、ｎ－オクテニレン基等が挙げられる。
　一般式（２－１）、一般式（２－２）、一般式（２－３）、又は一般式（２－４）で表される化合物としては、Ｒ２１がＺ２１－ＣＯＯＨであり、かつＺ２１が炭素数３～８の直鎖状アルキレン基又は炭素数３～８の直鎖状アルケニレン基である化合物；又は、Ｒ２１がＺ２１－ＣＨ３であり、かつＺ２１が炭素数３～８の直鎖状アルキレン基又は炭素数３～８の直鎖状アルケニレン基である化合物が好ましい。中でも、Ｒ２１がＺ２１－ＣＯＯＨであり、かつＺ２１が炭素数４～６の直鎖状アルキレン基又は炭素数４～６の直鎖状アルケニレン基である化合物がより好ましく、Ｒ２１がＺ２１－ＣＯＯＨであり、かつＺ２１が炭素数４～６の直鎖状アルキレン基である化合物がさらに好ましい。特に、一般式（２－１）で表される化合物としては、－Ｒ２１が－（ＣＨ２）５－ＣＯＯＨであるＣｙ５（ＣＡＳ番号：１４６３６８－１５－２）が好ましく、一般式（２－２）で表される化合物としては、－Ｒ２１が－（ＣＨ２）５－ＣＯＯＨであるＣｙ５．５（ＣＡＳ番号：２１０８９２－２３－２）が好ましい。一般式（２－３）で表される化合物としては、－Ｒ２１が－（ＣＨ２）５－ＣＯＯＨであるＣｙ７（ＣＡＳ番号：９４３２９８－０８－６）が好ましく、一般式（２－４）で表される化合物としては、－Ｒ２１が－（ＣＨ２）５－ＣＯＯＨであるＣｙ７．５が好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子が含有する光機能性化合物がシアニン化合物である場合は、シアニン化合物は誘導体として含有されていてもよい。当該誘導体としては、例えば、シアニン化合物と疎水性基又はこれを含む物質とを直接又は間接的に連結させた誘導体が挙げられる。当該疎水性基としては、例えば、飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール基等が挙げられ、これらのうち特に炭素数１０～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましく、炭素数１４～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基がより好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。なお、当該脂肪酸残基は、１個以上の炭素－炭素単結合間に、エステル結合（-COO-）、アミド結合（-CONH-）、エーテル結合（-O-）、カルボニル結合（-CO-）、及びカーボネート結合（-OCOO-）からなる群より選択される１以上の結合が挿入されていてもよい。また、これらの脂肪酸残基を含む物質としては、脂質膜の構成成分として汎用されていることから、グリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が好ましい。シアニン化合物と疎水性基等を連結させる連結基としては、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ペプチド鎖、糖鎖、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）鎖、炭化水素鎖、核酸鎖等を用いることができ、これらの２種以上を、直接、又はエーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、シリルエーテル結合、アミド結合、カルボニル基、シロキサン結合等の基を介して連結させた基であってもよい。
［コーン型脂質］
　脂質は、極性基と非極性基の占める割合に従って、コーン（ｃｏｎｅ）型、シリンダー（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ）型、逆コーン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｃｏｎｅ）型の３種類に大別され、そのうち、コーン型脂質は、疎水性基が親水性基に比べて大きな容積を占める脂質であり、非二重層脂質（ｎｏｎｂｉｌａｙｅｒ　ｌｉｐｉｄ）とも称される。脂質二重層中でコーン型脂質が逆ヘキサゴナル構造をとることにより、脂質二重層中に逆ミセル構造が形成され、形成された逆ミセル構造は、膜融合、膜の透過性等に関与すると考えられている。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜を構成する脂質として、コーン型脂質を含む。コーン型脂質を含む脂質膜は、細胞膜やミトコンドリア膜に融合しやすい。脂質ナノ粒子に含まれるコーン型脂質の量は特に限定されるものではないが、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するコーン型脂質の割合（［コーン型脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）が５０モル％以上１００モル％以下であることが好ましく、７０モル％以上１００モル％以下であることがより好ましく、７５モル％以上１００モル％以下であることがさらに好ましく、８０モル％以上１００モル％以下であることがよりさらに好ましい。なお、コーン型脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）やＰＥに直鎖状の疎水性基を連結させた誘導体等が挙げられる。ＰＥに直鎖状の疎水性基を連結させた誘導体としては、例えば、１本又は２本の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を連結させたＰＥ誘導体が挙げられる。当該ＰＥ誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のジアシルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。
［膜透過性ドメインを有するペプチド］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、膜透過性ドメインを有するペプチドを含む。ペプチドからなる膜透過性ドメインを表面に備える脂質ナノ粒子は、細胞膜やミトコンドリア膜に融合しやすい。当該膜透過性ドメインとしては、脂質膜を透過可能なペプチドからなるドメインであれば特に限定されるものではなく、既知の膜透過性ドメインやその改変ペプチドを用いることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子が含有する膜透過性ドメインとしては、ドメインを構成する総アミノ酸残基に対する、正電荷アミノ酸残基（アルギニン残基、リジン残基、及びヒスチジン残基）の割合が５０％以上１００モル％以下であるドメインが好ましい。正電荷アミノ酸残基の含有割合が多い膜透過性ドメインは、負電荷を有するミトコンドリア膜と静電的に相互作用することができる。このため、正電荷アミノ酸残基の含有割合が多い膜透過性ドメインを粒子表面に有することにより、本発明に係る脂質ナノ粒子を、ミトコンドリア内への送達効率により優れた脂質ナノ粒子とすることができる。正電荷アミノ酸残基の含有割合が多い膜透過性ドメインとしては、例えば、ポリアルギニン、ＨＩＶ－１由来のＴａｔ（４８－６０）（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ：配列番号１）、ＨＩＶ－１由来のＲｅｖ（３４－５０）（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ：配列番号２）、ＫＡＬＡペプチド（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡ：配列番号３）（特許文献４）、Ｓ２ペプチド［Ｘ１Ｘ２ＫＦＸ１Ｘ２ＫＦ（Ｘ１はＤ－アルギニン、Ｘ２はジメチルチロシン）：配列番号４］等が挙げられる。
　膜透過性ドメインを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常４～５０個、好ましくは６～４５個、さらに好ましくは７～４０個、よりさらに好ましくは７～２０個である。膜透過性ドメインとしてのポリアルギニンは、通常４～２０個、好ましくは６～１２個、さらに好ましくは７～１０個の連続したアルギニン残基からなる。
　膜透過性ドメインを有するペプチドは、膜透過性ドメインのみからなっていてもよく、膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に任意のアミノ酸配列を有していてもよい。膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン）であることが好ましい。ポリプロリンは、柔らかくて不規則な形をとっているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と異なり、直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、膜透過性ドメインのＣ末端及び／又はＮ末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、膜透過性ドメインに含まれるアルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に含有されている膜透過性ドメインを有するペプチドの含有量は、特に限定されるものではない。通常、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する膜透過性ドメインを有するペプチドの割合は、４～２０モル％であり、好ましくは６～１６モル％であり、さらに好ましくは８～１２モル％である。本発明に係る脂質ナノ粒子に存在する膜透過性ペプチドドメイン量を前記範囲とすることにより、脂質ナノ粒子のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質ナノ粒子とミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質ナノ粒子とミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子に含有されている膜透過性ドメインのうち少なくとも一部は、当該脂質ナノ粒子の粒子表面に存在する。本発明に係る脂質ナノ粒子においては、膜透過性ドメインは、疎水性基又はこれを含む物質と、直接又は間接的に連結させた誘導体として含有させることが好ましい。膜透過性ドメインをこのような誘導体として含有させることにより、脂質ナノ粒子の粒子表面の脂質膜に当該誘導体の疎水性基部分が嵌まり込み、膜透過性ドメインを脂質ナノ粒子の粒子表面に安定して露出させることができる。当該疎水性基としては、例えば、飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール基等が挙げられ、これらのうち特に炭素数１０～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましく、炭素数１４～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基がより好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。なお、当該脂肪酸残基は、１個以上の炭素－炭素単結合間に、エステル結合（-COO-）、アミド結合（-CONH-）、エーテル結合（-O-）、カルボニル結合（-CO-）、及びカーボネート結合（-OCOO-）からなる群より選択される１以上の結合が挿入されていてもよい。また、これらの脂肪酸残基を含む物質としては、グリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が好ましい。グリセロ脂質等は、脂質膜の構成成分として汎用されているためである。膜透過性ドメインと疎水性基等とを連結する連結基としては、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ペプチド鎖、糖鎖、ＰＯＥ鎖、ＰＥＧ鎖、炭化水素鎖、核酸鎖等を用いることができ、これらの２種以上を、直接、又はエーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、シリルエーテル結合、アミド結合、カルボニル基、シロキサン結合等の基を介して連結させた基であってもよい。
［ミトコンドリア移行性ＲＮＡアプタマー］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、粒子表面に、ミトコンドリア移行性ＲＮＡアプタマーを含むことも好ましい。粒子表面にミトコンドリアへの移行を促進する分子を有することにより、本発明に係る脂質ナノ粒子を、ミトコンドリア内への送達効率により優れた脂質ナノ粒子とすることができる。ミトコンドリア移行性ＲＮＡアプタマーとしては、例えば、ＲＰ　ＲＮＡアプタマー（配列番号５）、ＭＲＰ　ＲＮＡアプタマー（配列番号６）、Ｄ－ａｒｍ　ＲＮＡアプタマー（配列番号７）（いずれも、非特許文献４参照。）等が挙げられる。
［脂質］
　脂質は、脂質ナノ粒子の必須の構成成分である。脂質ナノ粒子に含有される脂質量は、脂質ナノ粒子を構成する総物質量の通常７０モル％以上、好ましくは７５モル％以上、さらに好ましくは８０モル％以上である。
　脂質ナノ粒子を構成する脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
　リン脂質としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２－ジミリストイル－１，２－デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。
　糖脂質としては、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等が挙げられる。
　ステロールとしては、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。
　飽和又は不飽和の脂肪酸としては、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する脂質としては、１種又は２種以上の、様々な機能を備える脂質誘導体を用いることもできる。当該脂質誘導体としては、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、ｐＨ感受性機能等を有する脂質誘導体が挙げられる。
　血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、ポリアルキレングリコール誘導体等が挙げられる。ポリアルキレングリコール誘導体としては、例えば、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００｝－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００｝－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－７５０｝－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００｝－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００｝－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙げられる。
　温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
［その他の添加剤］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、本発明の効果を損なわない限り、各種添加剤を含有することもできる。当該添加剤としては、例えば、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質等が挙げられる。
　膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、任意の構成成分である。膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。本発明に係る脂質ナノ粒子が膜安定化剤を含有する場合、脂質ナノ粒子に含有される膜安定化剤量は、通常、脂質ナノ粒子を構成する総脂質量の３０モル％以下、好ましくは２５モル％以下、さらに好ましくは２０モル％以下である。なお、膜安定化剤の含有量の下限値は０モル％である。
　抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、任意の構成成分である。抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。本発明に係る脂質ナノ粒子が抗酸化剤を含有する場合、脂質ナノ粒子に含有される膜安定化剤量は、通常、脂質ナノ粒子を構成する総物質量の３０モル％以下、好ましくは２５モル％以下、さらに好ましくは２０モル％以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は０モル％である。
　荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させる、任意の構成成分である。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられる。負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。本発明に係る脂質ナノ粒子が荷電物質を含有する場合、脂質ナノ粒子に含有される荷電物質量は、通常、脂質ナノ粒子を構成する総物質量の３０モル％以下、好ましくは２５モル％以下、さらに好ましくは２０モル％以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０モル％である。
［タンパク質］
　タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、任意の構成成分である。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、抗体、シグナルペプチド等が挙げられる。本発明に係る脂質ナノ粒子がタンパク質を含有する場合、脂質ナノ粒子に含有されるタンパク質量は、通常、脂質ナノ粒子を構成する総物質量の１０モル％以下、好ましくは５モル％以下、さらに好ましくは２モル％以下である。なお、タンパク質の含有量の下限値は０モル％である。
　脂質ナノ粒子表面に、標的細胞の細胞表面抗原に対する抗体を保持させておくことにより、脂質ナノ粒子を標的細胞に特異的に取り込ませることができる。抗体としては、モノクローナル抗体を使用することが好ましく、単一のエピトープに対して特異性を有する１種のモノクローナル抗体を使用してもよく、各種エピトープに対して特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて使用してもよい。また、抗体としては、１価抗体又は多価抗体のいずれを使用してもよい。天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子又はそのフラグメント若しくは誘導体のいずれを使用してもよく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又はクワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ）、トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）等の二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾、加工等が施された誘導体を使用することができる。また、公知の細胞融合、ハイブリドーマ技術、抗体工学等を適用し、合成又は半合成技術によって得られる抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、ＤＮＡ組換え技術によって得られる抗体、又は標的エピトープに対して中和特性を有する抗体又は結合特性を有する抗体等を使用することができる。
　脂質ナノ粒子表面に、シグナルペプチドを保持させておくことにより、脂質ナノ粒子を特定の細胞やオルガネラに優先的に移送させることができる。シグナルペプチドは、前記の膜透過性ドメインペプチドと同様に、疎水性基又はこれを含む物質と、直接又は間接的に連結させた誘導体として含有させることが好ましい。疎水性基やこれを含む物質、シグナルペプチドと疎水性基等を連結する連結基は、前記と同様のものを用いることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子がシグナルペプチドを含有する場合、脂質ナノ粒子に含有されるシグナルペプチド量は、通常、脂質ナノ粒子を構成する総物質量の１０モル％以下、好ましくは５モル％以下、さらに好ましくは２モル％以下である。なお、シグナルペプチドの含有量の下限値は０モル％である。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、１種又は２種以上のミトコンドリアターゲディングシグナル（ＭＴＳ）を有することが好ましい。これにより、脂質ナノ粒子のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質ナノ粒子とミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質ナノ粒子とミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。ＭＴＳとしては、ＭＴＳの機能が保持されている限り、いかなるペプチドも使用することができ、公知のＭＴＳをそのまま使用してもよく、公知のＭＴＳに変異（１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）を加えたものを使用してもよい。ＭＴＳは、通常、２０～７０個のアミノ酸残基からなり、ＭＴＳには、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア膜間腔、ミトコンドリアマトリックス等のミトコンドリア内の様々な領域への移行能を有するものが含まれるが、本発明においてはいずれのＭＴＳを使用してもよい。公知のＭＴＳとしては、例えば、特許文献３に開示されているものを用いることができる。
［表面修飾］
　本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
　例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３～１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３～６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して１～３０モル％程度、好ましくは２～２０モル％程度、より好ましくは５～１０モル％程度である。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾は、国際公開第２００７／１０２４８１号等に記載されている公知の方法で行うことができる。
［形態］
　本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、又は球状ミセルなどを挙げることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソームであることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の大きさは、標的細胞が生体内の比較的深奥部に存在する場合でも高い送達効率が得られやすいことから、平均粒子径が３００ｎｍ以下であることが好ましく、平均粒子径が２００ｎｍ以下であることがより好ましく、平均粒子径が１００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。
［製造方法］
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、単純水和法により製造できる。単純水和法は、まず、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。得られた脂質ナノ粒子の水性分散物は、凍結乾燥又は噴霧乾燥することもできる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
　水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質ナノ粒子を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質ナノ粒子を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０～８．０程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子が含有する光機能性化合物は、有機溶媒に可溶である。このため、他の脂質成分と同時に有機溶媒に溶解して乾燥させた後、水系溶媒を添加して乳化することにより、光機能性化合物を内包する脂質ナノ粒子を製造することができる。
［光線力学療法への使用及び医薬用組成物］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜を構成する脂質としてコーン型脂質を含有しており、かつ粒子表面に膜透過性ドメインを備える。このため、細胞への取り込み効率が高く、ひいてはミトコンドリア内への取り込み効率も高い。特に、本発明に係る脂質ナノ粒子が、正電荷アミノ酸残基の含有割合が多い膜透過性ドメインを含有する場合には、ミトコンドリア内への送達効率に非常に優れており、内包する光機能性化合物を効率よくミトコンドリア内へ移送することができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子を取り込ませた細胞に対して、当該脂質ナノ粒子が内包する光機能性化合物が吸収可能な波長の光が照射されると、光化学反応が生じる。この反応により活性酸素が産生され、これにより当該細胞が傷害される。すなわち、本発明に係る脂質ナノ粒子は、光制御可能な細胞傷害剤として使用できる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子が含有する光機能性化合物は、いずれも吸収極大波長が６５０～１０００ｎｍにある。生体内の多くの物質は６５０～１２００ｎｍの波長を吸収しないため、近赤外光は他の波長の光よりも生体内のより深部にまで到達し得る。このため、本願発明に係る脂質ナノ粒子は、細胞傷害を引き起こす目的の細胞や組織が身体内部にある場合に特に好適に用いられる。また、６５０ｎｍより短波長の光では光治療効果が低いため、近赤外光を照射していない細胞において自然光等によって細胞障害が引き起こされるリスクが低いという利点もある。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、培養細胞等の生体外の細胞の傷害のために使用されてもよく、生体内の細胞の傷害のために使用されてもよい。標的細胞が生体外で培養されている細胞の場合、本発明に係る脂質ナノ粒子を含有する培地で標的細胞を培養することで、当該脂質ナノ粒子を標的細胞に取り込ませることができる。標的細胞が生体内の細胞の場合、本発明に係る脂質ナノ粒子を経静脈投与等により投与して、標的細胞にまで到達させて取り込ませることができる。次いで、この標的細胞に近赤外光を照射する。標的細胞が生体内の細胞の場合、標的細胞を含む組織に対して生体外から近赤外光を照射してもよい。照射された近赤外光によって、脂質ナノ粒子によって標的細胞内に送達された光機能性化合物に光化学反応が生じ、標的細胞の細胞膜が傷害され、標的細胞が壊死する。近赤外光の照射量は、照射された近赤外光によって光機能性化合物が取り込まれている標的細胞が傷害されるのに十分な光量であれば特に限定されるものではなく、例えば、１Ｊ/ｃｍ２以上であることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、生体透過性に優れた近赤外光によって細胞傷害性を制御する。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、医薬用組成物の有効成分として好ましく、光線力学療法に用いられる医薬用組成物の有効成分としてより好ましく、細胞の過増殖に起因する疾患や異常細胞に起因する疾患の治療を目的とした光線力学療法に用いられる医薬用組成物の有効成分としてさらに好ましく、がん治療を目的とした光線力学療法に用いられる医薬用組成物の有効成分として特に好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、特許文献２等で行われている従来のミトコンドリア内への光機能性化合物の移送方法に比べて、ミトコンドリアへの取り込み効率が高い。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、ミトコンドリアの異常に起因する疾患に対する治療を目的とした光線力学療法に用いられる医薬用組成物の有効成分としても好ましい。
　本発明に係る医薬用組成物（本発明に係る脂質ナノ粒子を有効成分とする医薬用組成物）の投与経路は特に限定されるものではなく、標的とする細胞及びそれを含む組織に応じて適宜決定される。例えば、本発明に係る医薬用組成物の投与経路としては、経口投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。
　本発明に係る医薬用組成物が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
　本発明に係る医薬用組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの経口用固形剤、溶液剤、シロップ剤などの経口用液剤、注射剤、注腸剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。製剤化は、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して常法により行うことができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜試薬＞
　以降の実験において、使用された全ての溶媒及び化学物質は、試薬グレードの品質であり、別段の記載がない限り、商業的に購入されたものをさらに精製することなく使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及びカラムクロマトグラフィーは、それぞれ、シリカゲル60F254（Merck社製）及びSiliaFlash F60（230-400メッシュ; SiliCycle社製）を用いて行った。また、化合物の同定は、高解像度質量分析、赤外分光スペクトル、及び核磁気共鳴スペクトルにより行った。
　また、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）は、Avanti Polar Lipids社（AL、USA）から入手したものを使用した。ステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ－Ｒ８）は東レリサーチセンター社（日本）から、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は和光社（日本）から、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はSigma Aldrich社（MO、USA）から、プレミックスＷＳＴ－１細胞増殖アッセイシステムキットは、Takara Bio社（日本）から、アネキシンＶ－ＦＩＴＣアポトーシス検出キットはナカライテスク社（Kyoto、Japan）から、それぞれ購入したものを使用した。ヒト口腔扁平上皮癌細胞であるＳＡＳ細胞は、国立生物医学研究所（National Institutes of Biomedical Innovation、Health、and JETB）から入手したものを用い、ＨｅＬａ細胞はRiken BRC（日本）から入手したものを用いた。シングレット酸素センサーグリーン試薬、MitoTracker（登録商標） Green FM、及びMitoSOX（登録商標） Red Mitochondrial Superoxide Indicatorは、Thermo Fischer Scientific Inc.（MA、USA）から購入した。使用した他の全ての化学物質及び溶媒は、市販の試薬級製品を用いた。
＜ＮＭＲ＞
　１Ｈ及び１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルは、それぞれ、ＮＭＲ分光計（JNM-EX400、JEOL社製）を用いて測定した。ＦＴ－ＩＲスペクトルは、分光計（FT/IR 660Plus、JEOL社製）を用いて記録した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、ＭＡＬＤＩ（Ultraflex II、Bruker社製）又はＥＳＩ（Scientific Exactive、ThermoFisher社製）を用いて得た。ＵＶ－可視－近赤外（ＮＩＲ）吸収スペクトルは、分光光度計（Scientific Evolution 220、ThermoFisher社製）を用いて測定した。定常状態の蛍光スペクトルは、分光蛍光光度計（F4500、Hitachi社製）を用いて記録した。
＜培養細胞の培養＞
　ＨｅＬａ細胞及びＳＡＳ細胞は、低グルコースのＤＭＥＭに１０％ＦＢＳ及びペニシリン－ストレプトマイシンを添加した培地中で、３７℃、５％ＣＯ２／空気雰囲気下で培養した。細胞の継代は、９０％コンフルエンシーで行った。
［製造例１］
　以下の反応により、光機能性化合物ｒＴＰＡを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（１）化合物１
　アセトン（78mL）中に、ｍ－ニトロフェノール（2.99g、21.5mmol）、１－ブロモデカン（9.37g、42.3mmol）及びＫ２ＣＯ３（1.33g、9.61mmol）を添加して得られた混合物を、３２時間還流した。次いで、この反応混合物を冷却した後、溶媒を減圧下で除去した。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン（２/１、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、残留物から化合物１を黄色油状物として得た。収量は4.46gであった（16.0mmol、74％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.78 (dd, J = 8.3 and 5.8 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.21, (dd, J = 8.3 and 2.4 Hz, 1H), 4.02 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.9-1.7 (m, 2H), 1.5-1.4 (m, 2H), 1.4-1.2 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100.4 MHz): 159.56, 149.02, 129.63, 121.26, 115.13, 108.58, 68.56, 31.77, 29.45, 29.43, 29.23, 29.10, 28.90, 25.83, 22.55, 13.93.
IR (film): 2923, 2853, 1620, 1580, 1527, 1468, 1348, 1285, 1245, 1095, 1023, 861, 813, 794, 737, 672, 620, 530, 470, 433 cm-1.
HRMS (EI): m/z Calcd for C16H25NO3 (M+), 279.1834; Found, 279.1830.
（２）化合物２
　前記（１）で得た化合物１（1.93g、6.91mmol）を乾燥ＴＨＦ（テトラヒドロフラン、30mL）に溶解させた溶液を、室温及び大気圧下で２時間、５％Ｐｄ触媒担持炭素粉末（0.50g）上で水素化した。その後、触媒を濾過により除去し、濾液を減圧下で濃縮して、化合物２を白色固体として得た。 収量は1.67g（6.71mmol、97％）であった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.03 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.31 (dd, J = 8.3 and 2.4 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 8.3 and 2.4 Hz, 1H), 6.24 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 3.90 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.63 (s, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.30 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 160.31, 147.66, 130.00, 107.70, 104.65, 101.68, 67.78, 31.88, 29.57, 29.55, 29.39, 29.30, 26.05, 22.66, 14.09.
IR (film): 3398, 3299, 3217, 2956, 2917, 2850, 1613, 1584, 1494, 1487, 1392, 1333, 1296, 1188, 1160, 1082, 1034, 991, 929, 840, 751, 718, 682, 614, 561, 528, 470, 454, 438, 405 cm-1.
HRMS (ESI): m/z Calcd for C16H27NO ([M+H+]), 250.2165; Found, 250.2163.
（３）化合物３
　前記（２）で得た化合物２（512mg、1.11mmol）、ＮａＯ－ｔ－Ｂｕ（506mg、5.27mmol）、２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルホスフィノ－２'，４'，６'－トリイソプロピルビフェニル（182mg、0.429mmol）、Ｐｄ（ｄｂａ）２（54.4mg、0.0946mmol）、及びｐ－ブロモアニソール（1.48g、7.89mmol）を乾燥トルエン（10mL）に添加した混合物を、アルゴン雰囲気下、１００℃で２８時間撹拌した。次いで、この反応混合物を冷却した後、ジエチルエーテルで希釈し、塩水で洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ（40：60：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、残留物から化合物３（0.705g 、1.53mmol、74％）を得た。
1H NMR (CDCl3 , 400 MHz): δ 7.06-7.02 (m, 5H), 6.83-6.79 (m, 4H), 6.47 (dd, J = 11 and 2.0 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 7.8 and 2.4 Hz, 1H), 3.82 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.79 (s, 6H), 1.69 (m, 2H), 1.43-1.25 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 159.90, 155.76, 150.05, 141.03, 129.44, 126.89, 114.60, 113.27, 107.32, 106.33, 67.83, 55.45, 31.89, 29.56, 29.42, 29.32, 26.06, 22.67, 14.11.
IR (film): 2923, 2852, 1593, 1503, 1464, 1265, 1237, 1216, 1179, 1147, 1106, 1035, 825, 781, 762, 722, 691, 592, 568, 524, 421 cm-1.
HR-mass (ESI): m/z calcd for C30H39NO3 (M+), 461.2924; Found, 461.2922.
（４）化合物４
　ＮＩＳ（0.327g、1.45mmol）をＤＭＦ（4mL）に溶解した溶液を、前記（３）で得た化合物３（0.657g、1.42mmol）をＤＭＦ（6mL）に溶解した溶液に滴下した後、室温で１時間攪拌した。この反応混合物を、４０ｍＬの飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液の上に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。得られた有機層を、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。次に、この有機層から溶媒を除去した。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ（40：60：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、残留物を精製し、化合物４（0.765g、1.30mmol、91％）を得た。
1H NMR (CDCl3 , 400 MHz): δ 7.45 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.05-7.01 (m, 4H), 6.83-6.79 (m, 4H), 6.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 8.8 and 2.9 Hz, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.75 (t, J = 6.3Hz, 2H), 1.71 (m, 2H), 1.45-1.25 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 157.85, 155.94, 150.30, 140.42, 138.73, 126.56, 114.73, 104.95, 74.83, 68.83, 55.32, 31.85, 31.51, 29.49, 29.46, 29.25, 28.93, 25.97, 22.61,22.57, 14.06.
IR (film): 2923, 2850, 1580, 1504, 1463, 1328, 1295, 1239, 1179, 1161, 1037, 827, 637, 596, 409 cm-1.
HRMS (ESI): m/z calcd for C30H38INO3 (M+), 587.1891; Found, 587.1888.
（５）化合物５
　前記（４）で得た化合物４（0.549g、0.934mmol）、トリイソプロピルシリルアセチレン（188.6mg、1.03mmol）、Ｐｄ（ｔＢｕ３Ｐ）２（17.1mg、0.033mmol）、ＣｕＩ（29.4mg、0.15mmol）、及びトリエチルアミン（0.74 mL）をトルエン（3.9 mL）に混合した混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で１４時間撹拌した。この反応混合物を、塩水（30mL）の上に注ぎ、Ｅｔ２Ｏで抽出した。得られた有機層を、塩水で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ（25：75：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、残留物を精製し、化合物５（0.482g、0.751mmol、81％）を得た。
1H NMR (CDCl3 , 400 MHz): δ 7.19 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.05-7.01 (m, 4H), 6.83-6.80 (m, 4H), 6.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.35 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.74 (t, J = 6.3Hz, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.26 (m, 12H), 1.12 (m, 21H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 161.00, 156.08, 150.11, 140.36, 134.04, 126.83, 114.62, 112.00, 104.66, 103.94, 103.86, 92.35, 68.30, 55.39, 53.36, 31.86, 29.59, 29.52, 29.35, 29.33, 26.19, 22.66, 18.71, 14.08, 11.43.
IR (ATR): 2925, 2861, 2148, 1598, 1504, 1465, 1331, 1296, 1241, 1180, 1122, 1038, 829, 679, 606, 547, 420 cm-1.
HRMS (ESI): m/z calcd for C41H59NO3Si (M+, [M+H]+), 641.4259; Found, 641.4253.
（６）化合物６
　前記（５）で得た化合物５（0.456 g, 0.711 mmol）をＣＨ２Ｃｌ２（60 mL）に溶解させた溶液を、－７８℃に冷却し、テトラブチルアンモニウムフルオライドの１Ｍ　ＴＨＦ溶液（70mL）を滴下した。この反応混合物を室温まで温めた後、６時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物を、溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ（40：60：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６（0.300g、0.618mmol、87％）を得た。
1H NMR (CDCl3 , 400 MHz): δ 7.18 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.07-7.04 (m, 4H), 6.84-6.81 (m, 4H), 6.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.35 (dd, J = 8.8 and 1.9 Hz, 1H), 3.78 (m, 8H), 3.16 (s, 1H), 1.71 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 1.26 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.3 Hz, 3H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 160.87, 156.27, 150.53, 140.06, 134.22, 127.13, 114.67, 111.48, 103.34, 102.69, 80.81, 79.19, 68.49, 55.37, 31.85, 29.51, 29.48, 29.32, 29.28, 28.92, 25.83, 22.63.
IR (film): 3286, 2925, 2853, 1600, 1504, 1465, 1438, 1332, 1297, 1241, 1180, 1117, 1036, 829, 648, 570, 541, 506, 409 cm-1.
HRMS (ESI): m/z calcd for C32H39NO3 (M+), 485.2924; Found, 485.2930.
（７）化合物１０
　非特許文献５に記載の方法に準じて、化合物１０（5,15-dibromo-10, 20-di-(4-carboxymethylphenyl)porphyrin）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（８）化合物１１
　前記（７）で得た化合物１０（163.9mg、0.20mmol）を無水ＴＨＦ（20mL）に溶解させた溶液に、トリエチルアミン（6.75mL）、Ｐｄ（ｄｂａ）２（108.4 mg, 0.11 mmol）、トリフェニルホスファン（71.0mg、0.27mmol）、ＣｕＩ（28.4mg、0.15mmol）、及び前記（６）で得た化合物６（300.1mg、0.62mmol）を加えた。この混合物を、６５℃で１６時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。残留物から、溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ（75：25：1、v/v）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー、続いて、溶離剤としてＣＨＣｌ３を用いた分取用ＧＰＣ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーを利用して、化合物１１（97.7mg、0.0607mmol、33％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.53 (d, J = 4.4 Hz, 4H), 8.65 (d, J = 4.4 Hz , 4H), 8.38 (d, J = 7.8 Hz, 4H), 8.25 (d, J = 7.8 Hz, 4H), 7.48 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 8.3 Hz, 8H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 8H), 6.52 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.46 (s, 1H), 4.06 (s, 6H), 3.88 (t, J = 5.8 Hz, 4H) 3.61 (s, 12H), 1.93-1.06 (m, 32H), 0.71 (t, J = 6.4 Hz, 12H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 167.43, 160.83, 156.30, 152.03, 150.46, 149.02, 147.50, 140.26, 134.46, 133.24, 131.60, 131.35, 129.25, 127.83, 127.24, 120.99, 114.80, 112.00, 104.57, 103.44, 103.18, 95.41, 95.04, 68.61, 55.42, 52.27, 31.65, 29.58, 29.49, 29.46, 29.40, 29.14, 26.28, 22.46, 13.88.
IR (film): 2922, 2850, 2175, 1716, 1595, 1500, 1462, 1432, 1335, 1273, 1234, 1176, 1099, 1034, 999, 822, 795, 717, 648, 629, 606, 586, 571, 544, 521, 482, 459, 425 cm-1.
HRMS (ESI): m/z calcd for C100H98N6O10Zn (M+), 1606.6630; Found, 1606.6621.
（９）ｒＴＰＡ化合物
　前記（８）で得た化合物１１(51.0 mg, 0.0317 mmol)をＴＨＦ／ｅｔｈａｎｏｌ(1:1、v/v) (22.8 mL)に溶解させた溶液に、水酸化カリウム（245.1mg）を水（2.6mL）に溶解した溶液を加えて、この混合物を１時間還流した。この反応混合物を、冷却した後、溶媒を蒸発させた。残留物を水で希釈し、目的のポルフィリン二カリウム塩を濾過した。析出物をＴＨＦに溶解した溶液を、塩水に注ぎ、ＴＨＦで抽出した。得られた有機層を、塩水で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。 次いで、溶媒を減圧下で除去した後、ｒＴＰＡ（48.1mg、0.0290mmol、収率92％）を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 9.69 (d, J = 3.9 Hz, 4H), 8.65 (d, J = 3.9 Hz, 4H), 8.34 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 8.20 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.3 Hz, 8H), 6.97 (d, J = 7.8 Hz, 8H), 6.49 (s, 1H), 6.41 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.98 (m, 4H), 3.75 (s, 12H), 1.96-0.96 (m, 32H), 0.61(t, J = 5.8 Hz, 6H).
IR (film): 3066, 2918, 2850, 2187, 2160, 2137, 1687, 1595, 1501, 1434, 1327, 1236, 1176, 1095, 1032, 999, 938, 824, 790, 712, 628, 590, 563, 518, 494, 470, 445, 433, 409 cm-1.
HRMS (MALDI): m/z calcd for C98H94N6O10Zn (M+), 1578.6317; found 1578.6311.
［実施例１］
　製造例１で製造した光機能性化合物ｒＴＰＡを、ミトコンドリアへ送達するための脂質ナノ粒子を製造した。具体的には、ミトコンドリアを標的とした脂質構造体（MITO-Porter）にｒＴＰＡを保持させた脂質ナノ粒子（ｒＴＰＡ-MITO-Porter）を、単純水和法を用いて製造した（非特許文献６参照。）。
＜リポソームの調製＞
　具体的には、試験管に、ＤＯＰＥとＳＭを９：２（モル比）で含む脂質混合物をエタノールに溶解させた脂質エタノール溶液と、ｒＴＰＡをクロロホルムに溶解させたクロロホルム溶液とを、総脂質量に対するｒＴＰＡの割合が５モル％となるように添加して混和した。当該試験管内の脂質溶液を減圧乾燥処理し、得られた脂質膜フィルムに、グルコース含有ＨＥＰＥＳ緩衝液（10 mM HEPES、290mM グルコース）を加えて、室温で１５分間水和させた（総脂質濃度：0.55 mM）。次に、水和した脂質溶液を、バスタイプソニケーター（AU-25C、アイワ医科工業社製）で３０秒間、続いてプローブタイプソニケーターで１０分間超音波処理を行い、リポソーム（ｒＴＰＡ－ＬＰ）を調製した。カプセル化されていないｒＴＰＡを除去するために、リポソームを含む懸濁液を、２０，６００×ｇで５分間、遠心分離処理し、上清を回収した。回収した上清（ｒＴＰＡ－ＬＰ懸濁液）に、ＳＴＲ－Ｒ８溶液を、全脂質に対するＳＴＲ－Ｒ８の含有割合が１０モル％となるように添加して、ミトコンドリアを標的としｒＴＰＡを内包するリポソームであるｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを生成した。
＜粒子分布及びゼータ電位の測定＞
　生成されたリポソームの粒子サイズ及びその分布は、動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いて調べた。ゼータ電位は、Ｍ３－ＰＡＬＳ技術（Zetasizer Nano ZS、Malvern Instruments社製、Worcestershire、UK）を用いて、５μＭ溶液に対して相分析光散乱法（ＰＡＬＳ）により測定した。
　ｒＴＰＡ－ＬＰとｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒについて、６μＭのＤＭＳＯ溶液の吸収スペクトルを図１に、ＤＬＳにより測定された粒度分布を図２に、ＰＡＬＳにより測定されたゼータ電位の結果を図３に、それぞれ示す。図１及び２に示すように、ｒＴＰＡ－ＬＰとｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒはいずれも同程度のサイズのナノ粒子であることが確認された。また、図３に示すように、ｒＴＰＡ－ＬＰは負に帯電していたのに対して、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒは正に帯電するナノ粒子であることが確認された。
＜リポソームの安定性評価＞
　粒子安定性を評価するために、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒのリポソーム溶液を４℃で数日間保存し、経時的に平均粒子径（ｎｍ）及び均一性の指標である多分散性指数（ＰＤＩ）を測定した。
　測定結果を図４に示す。図中、黒塗り三角形は粒子サイズの結果を表し、白抜き四角形はＰＤＩの結果を表す。この結果、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒは、４℃で２週間以上にわたり粒子が安定に存在できることを確認した。
＜光照射時の一重項酸素の発生率の測定＞
　リポソームに搭載したｒＴＰＡが、光治療効果を有することを確認するため、光照射時の一重項酸素の発生率を測定した。
　具体的には、まず、ｒＴＰＡ－ＬＰ溶液又は水に対して、７００ｎｍの波長の光を照射し（light intensity＝２０ｍＷ/ｃｍ２）、発生した一重項酸素をSinglet Oxygen Sensor Greenで検出した。
　Singlet Oxygen Sensor Green（ＳＯＳＧ）試薬を用いた一重項酸素発生の検出は、製造者のプロトコールに従って行った。すなわち、ｒＴＰＡとして２μＭとなる量のｒＴＰＡ－ＬＰと、５μＭ　ＳＯＳＧとの混合物に対して、キセノンランプを用いて、６０秒間及び１２０秒間、波長７００±２０ｎｍの光（光強度＝２０ｍＷ/ｃｍ２）を照射した。光照射後の溶液の５３０ｎｍにおける蛍光強度の変化を、分光蛍光光度法により、４９０ｎｍの励起波長で測定した。
　また、メソ－テトラ（４－スルホナトフェニル）ポルフィン二水和物を、ポジティブコントロールとして用い、照射する光の波長を４３０ｎｍとした以外は同様にして発生した一重項酸素を検出した。なお、メソ－テトラ（４－スルホナトフェニル）ポルフィン二水和物は、４２０ｎｍ付近に極大吸収波長がある。
　図５に、７００±２０ｎｍ（水及びｒＴＰＡ－ＬＰ）及び４３０±１０ｎｍ（ポジティブコントロール）における６０秒間（図中、黒カラム）及び１２０秒間（図中、白カラム）の光照射（光強度＝２０ｍＷ/ｃｍ２）後の光誘起一重項酸素生成能力（エタノール／Ｈ２Ｏ（１/１９９、ｖ/ｖ）中における能力）の測定結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。有意差は、不対ｔ検定（**：ｐ＜０．０１）を用いて計算した。図５に示すように、ｒＴＰＡ－ＬＰ（図中、「ｒＴＰＡ－ＬＰｓ」）は、ポジティブコントロールと同様に、光照射により一重項酸素が発生することが確認された。この結果から、ｒＴＰＡはリポソームに搭載されている状態でも近赤外光照射によって一重項酸素の生成が誘導されること、すなわち、光治療効果を有することが確認された。
［実施例２］
　実施例１で調製したｒＴＰＡ－ＬＰ及びｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒについて、癌由来の培養細胞におけるによる光治療効果を調べた。培養細胞は、子宮頸癌細胞の培養株であるＨｅＬａ細胞と、口腔癌細胞の培養株であるＳＡＳ細胞を用いた。
　まず、４８ウェルプレートに、３×１０４個／ｍＬのＨｅＬａ細胞をまき、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で２４時間培養した。その後、ＦＢＳ非含有であってｒＴＰＡ－ＬＰを含有するＤＭＥＭ（ｒＴＰＡ－ＬＰ濃度：０、０．０５、０．１、０．２５、又は０．５μＭ）に培地を交換して培養した。培地交換から１時間培養後、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し、各ウェルの培地のＦＢＳ濃度を１０％に調製した後、３時間培養した時点で、光照射処理（照射時間：３分間、波長λ＝７００±１０ｎｍ、光強度：１２．３Ｊ/ｃｍ２）を行った。光照射処理後の細胞生存率を、ＷＳＴ１アッセイを用いて評価した。ＷＳＴ１アッセイは、まず、照射の直後に各ウェルの培養液に対してＷＳＴ－１試薬を添加して、２時間インキュベートした。次いで、各ウェルの培養液の吸光度の変化を、マイクロプレート光度計（EnSpire（登録商標）マルチモードプレートリーダー、Perkin Elmer社製、USA）を用いて測定した。測定は、６３０ｎｍでの基準を用いて４５０ｎｍの吸光度で測定した。 少なくとも３つの独立した試行が行われた。
　測定結果を図６に示す。図６Ａは光照射をしていない細胞の結果を示し、図６Ｂは光照射処理後の細胞の結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３～４）を示す。非処置群（ｒＴＰＡ－ＬＰを含まない培地で培養した細胞群。図中、「ＮＴ」）と各濃度の処置群との間の有意差は、非反復ＡＮＯＶＡ及びそれに続くダネット検定（ｎ.ｓ.＝有意ではない；＊　ｐ＜０．０５；＊＊　ｐ＜０．０１）を用いて計算した。
　図６Ａに示すように、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞でも、近赤外光の光照射処理を行わなかった場合には、殺細胞効果は観察されなかった。また、図６Ｂに示すように、ｒＴＰＡ－ＬＰを培地に添加した場合でも、添加量が０．２５μＭ以下では、未処理細胞と同程度の細胞生存率であり、殺細胞効果は観察されなかった。ｒＴＰＡ－ＬＰ濃度が０．５μＭである培地で培養した細胞では、光照射によって細胞生存率が有意に低下し、細胞毒性が観察された。
　次いで、ｒＴＰＡ－ＬＰに代えてｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを用いた以外は同様にして、ＨｅＬａ細胞にｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませて近赤外光の光照射処理を行った後の細胞生存率（％）をＷＳＴ１アッセイにより調べた。
　測定結果を図７に示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３～４）を示す。非処置群（ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを含まない培地で培養した細胞群。図中、「ＮＴ」）と各濃度の処置群との間の有意差は、非反復ＡＮＯＶＡ及びそれに続くダネット検定（ｎ.ｓ.＝有意ではない；＊　ｐ＜０．０５；＊＊　ｐ＜０．０１）を用いて計算した。
　ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞と同様に、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞でも、近赤外光の光照射処理を行わなかった場合には、殺細胞効果は観察されなかった（図示は省略。）。また、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた場合でも、投与量が０．０５μＭ以下では、未処理細胞と同程度の細胞生存率であり、殺細胞効果は観察されなかった。一方で、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを０．１μＭ以上添加した培地で培養した細胞では、光照射によって細胞生存率が有意に低下し、細胞毒性が観察され、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒが光治療効果を有することが確認された。なお、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－ＰｏｒｔｅｒのＥＣ５０は、０．１６μＭ（０．２６μｇ／ｍＬ）であった。ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒでは、ｒＴＰＡ－ＬＰよりも低濃度で光治療効果が観察されたことから、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒは、ｒＴＰＡ－ＬＰよりも、ミトコンドリアへの取り込み効率が高いことが示唆された。
　次いで、ＨｅＬａ細胞に代えてＳＡＳ細胞を用いたこと、４８ウェルプレートに播く細胞が５×１０４個／ｍＬとしたこと、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの培地への添加量を０、０．１、０．２５、又は０．５μＭとしたこと、光照射処理の照射時間を５分間、光強度を２０．６Ｊ/ｃｍ２）とした以外は同様にして、ＳＡＳ細胞にｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませて近赤外光の光照射処理を行った後の細胞生存率（％）をＷＳＴ１アッセイにより調べた。
　測定結果を図８に示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３～４）を示す。非処置群（図中、「ＮＴ」）と各濃度の処置群との間の有意差は、非反復ＡＮＯＶＡ及びそれに続くダネット検定（ｎ.ｓ.＝有意ではない；＊　ｐ＜０．０５；＊＊　ｐ＜０．０１）を用いて計算した。
　ＨｅＬａ細胞と同様に、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませたＳＡＳ細胞でも、近赤外光の光照射処理を行わなかった場合には、殺細胞効果は観察されなかった（図示は省略。）。一方で、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを０．１μＭ以上添加した培地で培養した細胞では、光照射によって細胞生存率が有意に低下し、細胞毒性が観察され、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒが光治療効果を有することが確認された。ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－ＰｏｒｔｅｒのＥＣ５０は、０．４１μＭ（０．６４μｇ／ｍＬ）であった。
［実施例３］
　培養癌細胞におけるｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの取り込み評価を行った。
＜蛍光標識リポソームの調製＞
　取り込み効率を計算するために、まず、ＤＯＰＥに代えて蛍光色素（ＮＢＤ）で標識したＤＯＰＥ（ＮＢＤ－ＤＯＰＥ）を用いて、ｒＴＰＡ－ＬＰ及びｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを調製した。
＜取り込み効率の算出＞
　ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰ又はＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを実施例２と同様にしてＨｅＬａ細胞へ取り込ませた後、細胞に取り込まれた各リポソームの量を、ＮＢＤの蛍光を指標としてフローサイトメトリーを用いて測定し、細胞取り込み能を評価した。対照として、リポソームを取り込ませていない細胞についても、フローサイトメトリーを行って同様にして測定した。
　具体的には、細胞を６ウェルプレートに播いて２４時間培養した。次いで、各ウェルの培地を、ＦＢＳ非含有であって、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰ又はＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを含有するＤＭＥＭに交換して培養した。培地交換から１時間培養後の細胞を、２０ユニット／ｍＬのヘパリンを含有するＰＢＳで１回洗浄した後、トリプシン処理した。分離した細胞を７００×ｇ、４℃で３分間遠心分離処理し、上清を除去した。得られた細胞ペレットを、０．５％（w/v）ウシ血清アルブミン及び０．１％（w/v）アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を含むＰＢＳで洗浄した後、再び遠心分離処理して上清を排出した。得られた細胞ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、フローサイトメーター（Gallious、Beckman Coulter社製、IN、USA）を用いて、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰ又はＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒが取り込まれた細胞を分取した。
　図９Ａに、フローサイトメトリー分析の結果を示し、図９Ｂに、取り込み効率（％）の測定結果を示す。データは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。有意差は、非反復ＡＮＯＶＡ及びそれに続くボンフェローニ（＊＊：ｐ＜０．０１）を用いて計算した。図中、「Ｎｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」がリポソームを取り込ませなかった細胞の結果を、「ＬＰｓ」がＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞の結果を、「ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ」がＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞の結果を、それぞれ示す。図９Ｂに示すように、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒは、常に高い細胞導入能を示した。ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの細胞取り込み効率は、ＮＢＤ標識ｒＴＰＡ－ＬＰよりも約８倍大きかった。つまり、ポリアルギニン修飾（ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）によって、細胞への取り込み効率が約８倍に増加していた。これにより、ミトコンドリアへの送達量も向上していることが示唆された。
　ＨｅＬａ細胞に代えてＳＡＳ細胞を用いて同様の評価を行った。結果を図１０に示す。その結果、ＨｅＬａ細胞と比べて効率は低かったが、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒは細胞に高い取り込み効率で取り込まれることが確認された。
［実施例４］
　細胞内に取り込ませたｒＴＰＡ－ＬＰ及びｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの細胞内における局在を調べた。
　ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍガラスベースディッシュ（Iwaki社製、Japan）に播いて２４時間培養した。次いで、各ディッシュの培地を、ＦＢＳとフェノールレッドが非含有であって、かつｒＴＰＡ－ＬＰ又はｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを含有するＤＭＥＭに交換して培養した。培地交換から１時間培養後の細胞の培地に、ＦＢＳは含有するがフェノールレッドは含有しないＤＭＥＭを添加して、培地中のＦＢＳ濃度を１０％（w/v）に調製した後、２時間培養した。培養後の細胞を洗浄した後、ＦＢＳ及び蛍光試薬を含む新鮮なフェノールレッド不含ＤＭＥＭに交換し、３０分間インキュベートした。蛍光試薬は、ミトコンドリアを染色するMitoTracker（商標）Green FMを用いた。インキュベート後の細胞を、４８７．４ｎｍ及び６３６．１ｎｍの励起波長を有する共焦点レーザー走査顕微鏡（Nikon Eclipse Ti、Nikon Instrument社製）を用いて観察した。ｒＴＰＡの蛍光は６６３～７３８ｎｍ（赤色）で観察され、MitoTracker Green FMの蛍光は５００～５５０ｎｍ（緑色）で観察された。
　図１１は、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞の顕微鏡画像であり、図１２は、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞の顕微鏡画像である。ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞では、ｒＴＰＡ画像とMitoTracker Green FM画像のｍｅｒｇｅ画像では黄色のシグナルが観察され、ｒＴＰＡがミトコンドリアに局在していることが確認された（図１１）。一方で、ｒＴＰＡ－ＬＰは、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒよりも細胞へ取り込まれている量が少なく、ミトコンドリアへの移行もほとんど観察されなかった。これらの結果から、光機能性化合物を、表面が正に帯電している脂質ナノ粒子に保持させることにより、ミトコンドリアへ非常に高い効率で移送させられることが確認された。
　さらに、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞とｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞に対して、実施例２と同じ条件で光照射処理を行った。ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞では、照射時間が８分間程度で細胞死が誘導され、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞では、照射時間が１２分間程度で細胞死が誘導された。７００ｎｍの光照射による細胞死誘導に要する時間は、ｒＴＰＡ－ＬＰを取り込ませた細胞よりもｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞の方が短かった。
　光照射処理の前後のｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを取り込ませた細胞について、透過光画像とミトコンドリア染色像を図１３に示す。光照射処理後の細胞では、ミトコンドリアの形態が変化していた。この結果から、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒがミトコンドリアに集積した後に光照射すると、ミトコンドリア形態異常を伴う細胞死が誘導されることが示唆された。
［実施例５］
　担癌マウスに、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを注入し、光照射処理により得られる抗癌効果を調べた。
　担癌マウスは、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄、４週齢）の皮下にＳＡＳ細胞を注入して作製した。ＳＡＳ細胞接種から６日目に、癌組織に、８．２μｇのｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－ＰｏｒｔｅｒをＨＥＰＥＳ－グルコースバッファーに懸濁させた懸濁液を局所投与し、その後、光照射処理（波長λ＝７００±１０ｎｍ、光強度：２０．６Ｊ/ｃｍ２、照射時間：２０分間）を行った（ｎ＝２）。光照射処理から６時間後には、光照射部分に広い痣が観察された。
　対照群の担癌マウス（ｎ＝３）に対しては、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを含まないＨＥＰＥＳ－グルコースバッファーのみを局所投与し、その後、同じ条件で光照射処理を行った。対照群では、光照射部分に痣は観察されなかった。
　各マウスの腫瘍体積と体重を経時的に測定した。腫瘍体積は、ノギスを用いて皮下に存在している腫瘍組織の長辺と短辺の長さを測定し、下記式を用いて算出した。
［腫瘍体積（ｍｍ３）］=［長辺（ｍｍ）］×［短辺（ｍｍ）］２×０．５２ 
　腫瘍体積の経時的測定結果を図１４に、体重の経時的測定結果を図１５に、それぞれ示す。図中、「ｒＴＰＡ－ＭＰ（＋）」はｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ投与群の結果を、「Ｈ－Ｂ－Ｇ（＋）」は対照群の結果を、それぞれ示す。
　この結果、光照射処理後の癌組織の体積は、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ投与群では、６日目から１０日目までほとんど増せず、１０日目以降の増大も緩やかであり、対照群とは異なり、癌の増殖が抑制されていた。また、体重変化は両群に差はなかった。この結果から、ｒＴＰＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒは抗癌剤として使用できることが確認された。

Claims (7)

  1. 　下記一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立して、水酸基、メトキシ基、又はエトキシ基を表し；ｎ１～ｎ４は、それぞれ独立して、０又は１を表し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水酸基又は炭素数１～１５のアルコキシ基を表し；ｎ５及びｎ６は、それぞれ独立して、０、１又は２を表し；Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、又は－ＣＯＯＲ９（Ｒ９は、炭素数１～３のアルキル基）を表す；ｎ５又はｎ６が２の場合、複数存在するＲ５及びＲ６は、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい］
    で表されることを特徴とする、化合物。
  2. 　コーン型脂質、膜透過性ドメインを有するペプチド、及び光機能性化合物を含有し、
    　前記光機能性化合物が、下記一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立して、水酸基、メトキシ基、又はエトキシ基を表し；ｎ１～ｎ４は、それぞれ独立して、０又は１を表し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水酸基又は炭素数１～１５のアルコキシ基を表し；ｎ５及びｎ６は、それぞれ独立して、０、１又は２を表し；Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、又は－ＣＯＯＲ９（Ｒ９は、炭素数１～３のアルキル基）を表す；ｎ５又はｎ６が２の場合、複数存在するＲ５及びＲ６は、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい］
    で表される化合物、及び、極大吸収波長が６８０ｎｍ以上であるシアニン化合物からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、脂質ナノ粒子。
  3. 　前記膜透過性ドメインを構成する総アミノ酸残基に対する正電荷アミノ酸残基の割合が、５０％以上である、請求項２に記載の脂質ナノ粒子。
  4. 　前記膜透過性ドメインが、ポリアルギニンからなる、請求項２又は３に記載の脂質ナノ粒子。
  5. 　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記コーン型脂質の割合が７０モル％以上である、請求項２～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  6. 　光線力学療法に用いられる、請求項２～５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  7. 　請求項２～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
PCT/JP2019/036124 2018-09-14 2019-09-13 光機能性化合物及び脂質ナノ粒子 WO2020054851A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-172698 2018-09-14
JP2018172698 2018-09-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020054851A1 true WO2020054851A1 (ja) 2020-03-19

Family

ID=69776536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/036124 WO2020054851A1 (ja) 2018-09-14 2019-09-13 光機能性化合物及び脂質ナノ粒子

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2020054851A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007037444A1 (ja) * 2005-09-30 2007-04-05 National University Corporation Hokkaido University 目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクター

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007037444A1 (ja) * 2005-09-30 2007-04-05 National University Corporation Hokkaido University 目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクター

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE CAS 26-09-2019, retrieved from STN Database accession no. RN 1239855-49-2 *
HAMMERER,F. ET AL.: "Mitochondria-targeted cationic porphyrin-triphenylamine hybrids for enhanced two-photon photodynamic therapy", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 26, no. 1, 2018, pages 107 - 118, XP085307323, ISSN: 0968-0896, DOI: 10.1016/j.bmc.2017.11.024 *
LEE, M. W. ET AL.: "Synthesis, Optical and Photovoltaic Properties of Porphyrin Dyes", JOURNAL OF MACROMOLECULAR SCIENCE , PART A: PURE AND APPLIED CHEMISTRY, vol. 46, no. 7, 2009, pages 730 - 737, XP055692482, ISSN: 1060-1325 *
PAN, D. ET AL.: "Meso-substituted porphyrin photosensitizers with enhanced near-infrared absorption: Synthesis, characterization and biological evaluation for photodynamic therapy", TETRAHEDRON, vol. 74, no. 21, 2018, pages 2677 - 2683, XP055692472, ISSN: 0040-4020 *
RAJORA,M.A. ET AL.: "Advancing porphyrin' s biomedical utility via supramolecular chemistry", CHEMICAL SOCIETY REVIEWS, vol. 46, no. 21, 2017, pages 6433 - 6469, XP055692477, ISSN: 0306-0012 *
SENGE, M. 0. ET AL.: "5, 15-A2B2- and 5, 15-A2BC-Type Porphyrins with Donor and Acceptor Groups for Use in Nonlinear Optics and Photodynamic Therapy", EUROPEAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 2011, no. 29, 2011, pages 5797 - 5816, XP055692470, ISSN: 1099-0690 *
STARKEY,J.R. ET AL.: "New Two-Photon Activated Photodynamic Therapy Sensitizers Induce Xenograft Tumor Regressions after Near-IR Laser Treatment through the Body of the Host Mouse", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 14, no. 20, 2008, pages 6564 - 6573, XP055093850, ISSN: 1078-0432, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-07-4162 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9872833B2 (en) Liposome composite body
Elnaggar et al. Phytochylomicron as a dual nanocarrier for liver cancer targeting of luteolin: in vitro appraisal and pharmacodynamics
US20100166840A1 (en) Liposome having lipid membrane containing bacterial cell component
JPWO2007102481A1 (ja) 目的物質の核内送達用ベクター
CN110974971A (zh) 一种在活细胞表面锚定修饰纳米药物的方法
US9463248B2 (en) Material, method for preparing same, and uses thereof
CN108969771A (zh) 甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用
JP6570188B2 (ja) ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体
JP5069920B2 (ja) マンノース６−リン酸−ポリエチレングリコール結合体
US20230149560A1 (en) Lipid compositions for delivery of sting agonist compounds and uses thereof
JP6238366B2 (ja) 非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法
WO2020054851A1 (ja) 光機能性化合物及び脂質ナノ粒子
US20210275489A1 (en) Platinum-based amphiphile prodrugs
CA3236290A1 (en) Formulated and/or co-formulated nanocarriers compositions containing immunogenic cell death (icd) inducing prodrugs useful in the treatment of cancer and methods thereof
CN113616811B (zh) 一种载脂蛋白修饰的融合型多功能纳米囊泡及其制备方法和应用
EP2896401B1 (en) Targeted drug delivery system for poorly soluble drug
JP2023514324A (ja) がんの処置において有用なＴＦＧβアンタゴニストプロドラッグを含有する製剤化および／または共製剤化リポソーム組成物ならびにその方法
JP2023507322A (ja) がんの処置において有用なＴｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）アゴニストプロドラッグを含有する製剤化および／または共製剤化リポソーム組成物ならびにその方法
JP5817053B2 (ja) 腫瘍特異性を有するリポソーム
KR101862502B1 (ko) 재구성 인공 암세포, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 항암 조성물
US20240108685A1 (en) Oral liposomal compositions
JP4904573B2 (ja) 目的物質の脳毛細血管内皮細胞への取り込みを亢進させるための組成物
CN110575549B (zh) 一种tbFGF配体修饰的具有肿瘤主动靶向功能的脂质体及其制备方法与用途
JP2023541389A (ja) がんの処置において有用なｐｄ－１アンタゴニストプロドラッグを含有する製剤化および／または共製剤化リポソーム組成物ならびにその方法
KR20230158044A (ko) 암의 치료에 유용한 A2aR 길항제 전구약물을 함유하는 제제화된 및/또는 공동-제제화된 리포솜 조성물 및 그의 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19860574

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19860574

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP