KR101862502B1

KR101862502B1 - 재구성 인공 암세포, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR101862502B1
Application number: KR1020170000357A
Authority: KR
Inventors: 임용택; 김선영
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-02
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2018-05-29
Also published as: WO2018124378A1

Abstract

암의 예방 및 치료 과정에서 중요한 역할을 담당하는 항암 면역 활성을 위한 재구성 인공 암세포, 상기 재구성 인공 암세포의 제조 방법, 및 상기 재구성 인공 암세포를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

Description

재구성 인공 암세포, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 항암 조성물{RECONSTITUTED ARTIFICIAL TUMOR CELLS, PREPARING METHOD OF THE SAME, AND ANTI-CANCER COMPOSITION INCLUDING THE SAME}

본원은, 암의 예방 및 치료 과정에서 중요한 역할을 담당하는 항암 면역 활성을 위한 재구성 인공 암세포, 상기 재구성 인공 암세포의 제조 방법, 및 상기 재구성 인공 암세포를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

현재 암세포에 대한 항원(antigen)을 수지상세포와 같은 항원제시세포로 활성화 하고, 이를 이용하여 암세포를 직접 사멸할 수 있는 T 세포를 효과적으로 활성화하는 기술인 항암 면역치료 기법이 항암 치료 분야에서 큰 관심의 대상이 되고 있다.

이러한 생체 내의 항암 기능을 담당하는 다양한 면역세포를 활성화하는 기술은, 기존의 화학 요법이나 방사선 요법 기반 항암 치료 방법에 비하여, 환자 자신의 면역 시스템을 활용하기 때문에 부작용을 최소화 할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 면역세포는 현대 기술로는 진단하기 어려운 미세한 크기의 암세포나 다른 조직으로 전이되어 있는 암세포를 선택적으로 제거할 수 있다는 측면에서도 차세대 항암치료 방법으로 각광받고 있다.

하지만, 현재 비임상 단계나 임상 단계에서 시도되고 있는 대부분의 기술에서는, 암세포에 존재하는 주항원(dominant antigen)을 이용하고 있어, 암세포가 갖는 항원의 다양성(heterogeneity)을 반영하지 못하기 때문에, 치료 효과가 매우 낮다. 또한, 특정 항원에 대한 활성만을 갖고 있는 면역세포로부터 살아남은 암세포가 다른 조직으로 전이(metastasis)함으로써, 암이 재발(recurrence)될 수 있다. 최근에, 암세포에 대한 다양한 항원들에 정보를 오믹스(Omics)를 이용하여 분석하려는 시도가 활발하게 진행되고 있으나, 많은 시간과 비용이 소모된다는 단점이 있다.

이러한 이유로, 최근에는 실제 암세포의 다양한 항원 정보를 갖고 있는 암세포의 라이세이트(lysate)를 항암 치료를 위한 항원으로서 직접 사용하려는 시도가 활발하게 진행 중이다. 하지만, 이러한 암세포 라이세이트를 그 형태 그대로 항원으로서 사용할 경우, 면역세포로의 전달 효율이 매우 낮고, 막 또는 세포질 단백질 기반 항원의 낮은 항원성(antigenicity)로 인하여 효과적인 면역활성화 반응을 유도할 수 없어, 그 치료 효과가 여전히 매우 낮은 실정이다.

따라서, 암세포 라이세이트를 이용한 항암치료 효과를 높이기 위해서는 암세포 라이세이트의 종양 항원(tumor antigen)을 인식하는 항원제시세포 내로의 항원의 전달 효율을 높이는 기술과 함께, 항원성을 증가시키는 기술의 개발이 매우 중요하다.

대한민국 공개특허 2012-0002943호는, 세균유래 마이크로베시클을 이용한 암치료 및 암진단 방법에 대해 개시하고 있다.

본원은, 재구성 인공 암세포, 상기 재구성 인공 암세포의 제조 방법, 및 상기 재구성 인공 암세포를 포함하는 항암 조성물을 제공하고자 한다.

본원은, 항원의 다양성(heterogeneity of antigens) 정보를 모두 포함하면서도, 높은 항원성(antigenicity)을 갖는 재구성 인공 암세포 기반의 항암 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 재구성 인공 암세포로서, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 면역활성물질; 및 암세포의 라이세이트(lysate)를 포함하며, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 원형 또는 타원형의 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하고, 상기 면역활성물질 및 상기 암세포의 라이세이트는 각각 독립적으로, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 상기 재구성 인공 암세포의 내부에 존재하는 것인, 재구성 인공 암세포를 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1측면에 따른 재구성 인공 암세포를 포함하는, 항암 조성물을 제공한다.

본원의 제 3 측면은, 재구성 인공 암세포의 제조 방법으로서, 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질 및 면역활성물질을 제 1 용매에 용해하는 것; 상기 제 1 용매를 증발시켜 면역활성물질을 포함하는 지질 막을 형성하는 것; 제 2 용매에 상기 지질 막을 용해하여 제 1 용액을 형성하는 것; 및 상기 제 1 용액에 암세포의 라이세이트를 혼합 및 초음파 처리하여 재구성 인공 암세포를 제조하는 것을 포함하는, 재구성 인공 암세포의 제조 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 암세포의 라이세이트로부터 수득된 암세포의 특성을 갖는 암세포 유래 단백질들과, 면역활성물질(예를 들어, 병원균 유래 양이온성 지질 및 톨-유사 수용체 리간드)을 혼성화 구조로 재구성(reconstitution)함으로써, 나노크기의 재구성 인공 암세포인 튜모좀(tumosome)을 제조할 수 있으며, 상기 재구성 인공 암세포인 튜모좀을 이용하여 항암 면역세포 활성화 기술을 개발할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따른 재구성 인공 암세포는, 실제 암세포 라이세이트를 항암 조성물로 사용했을 때의 장점인 항원의 다양성(heterogeneity of antigens) 정보를 모두 포함하면서도, 실제 암세포 라이세이트를 사용했을 때의 단점인 낮은 항원성(antigenicity)을 극복한, 새로운 개념의 항암 조성물로서 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 재구성 인공 암세포를 이용하여 암 항원 및 면역활성물질을 면역세포로 전달하는 효율을 향상시킬 수 있으며, 동시에 항원의 항원성을 동시에 증강시킬 수 있다. 또한, 항암 면역세포의 활성화와 관련된 사이토카인의 발현을 현저하게 증가시킴으로써, 암의 치료 효과에 탁월한 효능을 나타낼 수 있다.

본원의 일 구현예에 따른 재구성 인공 암세포는, 항암 면역 치료에서 중요한 역할을 담당하는 T 세포의 활성화를 효과적으로 유도하며, 암의 예방과 치료 모델에 적용될 경우 치료 효능이 현저하게 향상될 수 있다.

도 1은, 본원의 일 실시예에 있어서, 재구성 인공 암세포인 튜모좀(tumosome)의 합성 방법 및 모형도를 나타낸 것이다. 도 1에서, 상기 재구성 인공 암세포는 암세포의 특성을 갖는 암세포 유래 단백질들과 면역활성물질(예를 들어, 병원균 유래 양이온성 지질 및 TLR4 리간드)의 혼성화 구조로 재구성 된다.
도 2의 (a) 내지 (g)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 재구성 인공 암세포인 튜모좀의 DLS 분석 결과(a), TEM 이미지(b), FT-IR 분석 결과(d), 유세포 분석기 분석 결과(d), 형광 이미지(e), ELISA 분석 결과[(f) 및 (g)]를 나타낸 것이다.
도 3의 (a) 내지 (f)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 재구성 인공 암세포인 튜모좀의 근적외선형광을 이용한 영상 가이드 수술 이미지[(a) 내지 (c)], 조직형광기법을 통한 세포 내 유입 확인 결과[(d) 및 (e)], 사이토카인(cytokine) IL-6 확인 결과(f)를 나타낸 것이다.
도 4의 (a) 내지 (f)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 재구성 인공 암세포인 튜모좀의 생체 내 T 세포 활성 측정 결과[(a) 및 (b)], 흑색종 모델에서의 종양 치유 능력 측정 결과[(c) 내지 (f)]를 나타낸 것이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 있어서, 다양한 조합으로 합성된 튜모좀의 T 세포 활성화 효능 비교를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 있어서, 절제한 암 조직으로부터 얻은 암세포의 막 또는 세포질 단백질들을 이용한 튜모좀의 제조 방법 및 모형도를 나타낸 것이다.
도 7의 (a) 및 (b)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀을 이용한 암의 재발(tumor recurrence) 방지를 위한 실험 과정의 모식도 이다. 도 7의 (a)는 C57BL/6 마우스 흑색종 모델에 종양을 투여하여 키운 뒤, 수술 과정을 통하여 종양을 약 1% 미만 정도로 남겨놓고 나머지 부분을 절제한 후에, 핀(clip)을 이용하여 봉합하는 과정을 나타내며, 도 7의 (b)는 봉합 후 일주일 뒤에 확인한 결과로서, 남겨진 종양이 다시 성장한 모습을 나타낸다.
도 8의 (a) 내지 (c)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 튜모좀을 수지상세포 (BMDCs)에 처리한 후의 면역활성효과를 나타낸 그래프로서, 각각 유세포 분석기를 통하여 확인한 세포 내 유입 효과(a), 전구염증 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 분비량을 ELISA 실험 방법을 이용하여 분석한 결과(b), BMDCs의 성숙도(maturation) 정도에 따라 발현되는 CD80, CD86 및 CD40의 농도(c)를 나타낸 것이다.
도 9는, 본원의 일 실시예에 있어서, C57BL/6 마우스 흑색종 모델을 이용하여 튜모좀의 암 재발 방지 항암 치료 효능 평가를 나타낸 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 "튜모좀(tumosome)"으로 명명되는 것일 수 있다. 상기 재구성 인공 암세포는 암세포 정보를 갖고 있는 암세포 유래 단백질들인 암세포의 라이세이트; 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 및 면역세포 활성화 기능을 갖는 면역활성물질(예를 들어, 병원균 유래 세포막 성분 등)을 혼성화(hybridization)함으로써 형성된 재구성 리포좀 형태로서, 약 1,200 Å의 직경, 예를 들어 약 300 Å 내지 약 5,000 Å 범위의 직경을 가지며, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질에 의해 형성된 뼈대 모양의 외벽과, 및 암세포의 외벽에 존재하는 인지질-결합 막 단백질 및 암세포의 세포질 내부에 포함되어 있던 세포질 단백질을 포함하는, 새로운 형태의 혼성화된 구조를 갖는 리포좀을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 인지질-결합 암세포 막 단백질 및 상기 암세포 세포질 내에 존재하는 단백질은 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질들을 의미하는 것일 수 있으며, 즉 상기 암세포의 라이세이트에 기반한 항원인 막 또는 세포질 단백질과, 상기 면역활성물질이 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질과 함께 재구성(reconstitution)된 것일 수 있다 (도 1).

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 약 300 Å 내지 약 5,000 Å 범위의 직경을 갖는 것일 수 있다. 이러한 크기는 체내의 면역세포가 제조된 재구성 인공 암세포를 실제 암세포처럼 인식하고, 세포 내 업테이크(uptake)를 통해 암 항원을 효과적으로 인지하기에 최적화된 조건이며, 예를 들어, 약 300 Å 내지 약 4,000 Å, 약 300 Å 내지 약 3,000 Å, 약 300 Å 내지 약 2,000 Å, 약 300 Å 내지 약 1,000 Å, 약 300 Å 내지 약 500 Å, 약 500 Å 내지 약 5,000 Å, 약 500 Å 내지 약 4,000 Å, 약 500 Å 내지 약 3,000 Å, 약 500 Å 내지 약 2,000 Å, 약 500 Å 내지 약 1,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 5,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 4,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 3,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 2,000 Å, 약 2,000 Å 내지 약 5,000 Å, 약 2,000 Å 내지 약 4,000 Å, 약 2,000 Å 내지 약 3,000 Å, 약 3,000 Å 내지 약 5,000 Å, 약 3,000 Å 내지 약 4,000 Å, 약 4,000 Å 내지 약 5,000 Å, 또는 약 1,000 Å 내지 약 1,500 Å 범위의 직경을 갖는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포가 상기 직경 크기를 가지는 경우, 파고시토시스(phagocytosis) 또는 엔도시토시스(endocytosis)에 의한 상기 암 항원 및/또는 다른 면역활성물질의 세포 내 전달능이 향상될 수 있다.

도 1은, 본원의 일 구현예에 따른 상기 재구성 인공 암세포의 구조를 나타낸 것으로서, 도 1의 상부 도면에 나타낸 바와 같이, 상기 암세포는 암세포의 막과 세포질에 존재하는 다양한 암세포 관련 정보를 갖고 있는 물질을 암 항원으로 사용하기 위하여 용해(lysis)되었다. 예를 들어, 상기 암세포는, 암세포 주(cell line)를 이용하여 수득되거나, 체내에 존재하는 암 조직(tumor tissue)으로부터 분리되는 것일 수 있다. 또한, 실제 암 조직에서 항암제나 방사선을 가함으로써 세포 내 스트레스와 관련된 단백질의 생성을 유도한 후에, 암세포를 용해함으로써 제조되는 것일 수 있다.

종래 연구결과를 통해 밝혀진 바와 같이, 면역세포가 암 항원을 인식하는 과정에서 용액 상태보다는 입자 형태(particulate type)의 항원을 효과적으로 인지하기 때문에, 본원에서는 상기 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질들을 그대로 사용하기 보다는 나노입자 형태로 제조하고자 하였다.

상기 암세포의 라이세이트에서 분리된 단백질 항원들은 원래, 인지질 결합 특성을 갖는 막 단백질 및 세포질 내에 존재하던 다양한 단백질 성분을 포함하고 있기 때문에, 이들 성분만을 이용하여서는 안정한 구조를 갖는 나노입자 형태를 구현하기 어렵다.

따라서, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질들을 면역활성물질 및 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질과 함께 재구성함으로써, 나노 크기의 형태를 갖는 재구성 인공 암세포인 튜모좀을 형성하여, 결과적으로는 암세포 막 및/또는 세포질 내에 존재하는 다양한 암 항원 성분들이 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 내부에 봉입될 수 있도록 할 수 있다(도 1의 하부 도면). 예를 들어, 상기 암세포의 라이세이트에서 분리된 단백질 항원들 및 면역활성물질이 상기 면역활성물질 중 양이온성 지질에 의해, 재구성 인공 암세포로 재구성됨으로써, 상기 암세포의 라이세이트에 존재하는 다양한 암 단백질 항원들과 관련된 물질의 면역세포 내 전달 효율이 상승하여, 상기 암 항원과 관련된 물질을 면역세포가 효과적으로 인지할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 원형 또는 타원형의 외벽을 형성하는 지질을 포함하고, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 내부에 독립적으로 암세포의 라이세이트 및 면역활성물질을 포함하는, 리포좀 구조일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 복합 리포좀이 갖는 리포좀 구조에 의해 다양한 친수성 및/또는 친유성 면역활성물질이 로딩되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성물질은 스트레스를 받은 암세포에서 발현되는 면역활성물질, 예를 들어 열-충격 단백질(heat-shock protein)일 수 있으며, 또는 T 세포의 활성화를 유도하는 물질일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist, TLR), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 양이온성 지질(cationic lipids), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 천연 톨-유사 수용체 아고니스트 또는 합성 톨-유사 수용체 아고니스트일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역활성물질은 하나 또는 둘 이상의 톨-유사 수용체 아고니스트의 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어, CL401(듀얼 TLR2 및 TLR7 아고니스트)또는 CL429(듀얼 TLR2 및 NOD2 아고니스트)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 TLR-1을 통해 신호전달 반응을 야기시킬 수 있는 것일 수 있으며, 예를 들어, 트리-아실화된 지질펩티드(LP); 페놀-가용성 모듈린(modulin); 코박테리움튜베르쿨로시스(Mycobacteriumtuberculosis) 지질펩티드; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH; 보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei)로부터의 박테리아 지질펩티드; OspA 지질펩티드의 아세틸화된 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드(Pam3Cys) 지질펩티드; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 TLR-2 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, Pam3Cys-Lip을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-3 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 폴리아이시 계열로서 Poly(I:C), Poly(ICLC), Poly(IC12U), Ampligen 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-4 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 시겔라 플렉시네리(Shigella flexineri) 외막 단백질 제조물, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-5 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 플라젤린(flagellin) 또는 이의 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-7 아고니스트 또는 TLR-8 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 이미퀴모드, R837, 레스퀴모드, 또는 R848와 같은 이미다조퀴놀린 분자; VTX-2337; CRX642; 인지질 기 또는 포스포노지질 기에 공유적으로 결합된 이미다조퀴놀린; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨 유사 아고니스트는 TLR-9 아고니스트를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 CpG 모티프를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, β-에스킨, 디지토닌 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항바이러스성 펩티드는 케이엘케이(KLK) 를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 인플러머좀 인듀서는 TDB(trehalose-6,6-dibehenate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 NOD 리간드는 M-TriLYS(NOD2 아고니스트-합성 무라밀 트리펩티드) 또는 NOD2 아고니스트(N-glycolylated muramyldipeptid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 CDS 리간드는 Poly(dA:dT)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 STING 리간드는 cGAMP, di-AMP, 또는 di-GMP 일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 면역활성물질은 Pam3Cys-Lip, 폴리아이시(Poly(I:C), CRX-527, MPLA(monophosphoryl lipid A), 플라젤린(flagellin), 이미퀴모드, 레스퀴모드, CpG, QS21, M-TriLys(MurNAc-Ala-D-isoGln-Lys), TDB(trehalose-6,6-dibehenate), 8837, Poly(dA:dT), cGAMP, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 MPLA는 그람음성균, LPS(lipopolysaccharide)에서 파생된 것으로, 세포 신호 전달 체계인 톨-유사 수용체 4(TLR4)를 통하여 신호전달을 한다. 자극된 TLR4의 신호전달은 면역반응을 활성화시키는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cyrokine)의 분비를 유도하게 되며, 상기 사이토카인은 T 세포 및 B 세포의 증식과 분화, 활성을 자극하는 역할을 한다. 이에 따라 활성화된 T 세포는 세포독성 T 세포로 분화를 촉진시키고, 인터페론-감마와 같은 사이토카인의 분비로 인해 세포성 면역반응에 관여한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 카복실기, 아민기, 티올기, 알데히드기, 비오틴기 등의 기능성기를 포함하는 상기 면역활성물질에 의하여, 다양한 기능을 담당하는 물질들이 컨쥬게이션(conjugation)되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역활성물질 중 양이온성 지질에 의하여, 음전하를 띄는 상기 면역활성물질 또는 DNA, RNA와 같은 바이오소재가 상기 재구성 인공 암세포에 효과적으로 로딩되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질에 의하여 항원 교차제시(antigen cross-presentation)가 유도됨으로써, 암 항원이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 양이온성 지질이 상기 암세포의 라이세이트 및 다른 면역활성물질과 조합됨으로써, 항원 교차제시가 유도되어 상기 암 항원이 세포 내로 전달될 수 있으며, 이에 따라 항암 효과가 나타날 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 나노 크기 또는 옹스트롱의 직경 크기를 가지므로, 파고시토시스(phagocytosis) 또는 엔도시토시스(endocytosis)에 의한 상기 암 항원 및/또는 다른 면역활성물질의 세포 내 전달능이 향상될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포가 양이온성 지질의 면역활성물질을 포함하는 경우, 상기 양이온성 지질에 의하여 상기 재구성 인공 암세포와 음이온성인 세포막 사이의 정전기적 인력이 유도되어, 상기 암 항원 및/또는 다른 면역활성물질의 세포 내 전달능이 더 향상될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DC-콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride), DDA(dimethyldioctadecylammonium), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DOTMA(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane), EPC(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), MVL5(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide), DODAP(lipids1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 포스파티딜글리세롤류, 포스파티딜콜린류, 포스파티딜에탄올아민류, 포스파티딜세린류, 포스파티딜이노시톨류, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 디올레오일 포스파티딜 포스포콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민, 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트, N,N,N,N-테트라메틸-N,N,N,N-테트라팔미틸스퍼민, 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸암모늄 브로마이드, 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤, 디옥타데실아미도글리실스퍼민, N,N-[비스(2-히드록시에틸)]-N-메틸-N-[2,3-디(테트라데카노일옥시)프로필]암모늄 요오드, [N,N,N´,N´-테트라메틸-N,N´-비스(2-히드록시에틸)-2,3-디(올레오일옥시)-1,4-부탄디암모늄 요오드], N-t-부틸-N′-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘, 디에틸아미노에틸 덱스트란, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 암세포 주위에 직접 주입되거나, 암 조직을 제거한 후에 암의 재발 방지를 위하여 주입되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포는 폐, 결장, 중추신경계, 피부, 난소, 신장, 유방, 위, 또는 대장의 암세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포는 피부의 암세포일 수 있으며, 예를 들어, 흑색종 유래 암세포, 또는 melanoma_B16-F10를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포의 라이세이트는 막 또는 세포질 단백질을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 막 또는 세포질 단백질은, 예를 들어 재조합 단백질 막 또는 세포질 단백질, 서브유닛, 스플릿 막 또는 세포질 단백질 항원들을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1측면에 따른 재구성 인공 암세포를 포함하는, 항암 조성물을 제공한다. 본원의 제 2측면에 따른 항암 조성물에 대하여, 본원의 제 1측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 면역활성물질; 및 암세포의 라이세이트를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 재구성 인공 암세포는 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 면역활성물질; 및 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질을 포함하며, 상기 외벽을 형성하는 지질은 원형 또는 타원형의 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하며, 상기 면역활성물질 및 암세포의 라이세이트는 각각 독립적으로, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 상기 재구성 인공 암세포 내부에 존재하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 원형 또는 타원형의 외벽을 형성하는 지질을 포함하고, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 내부에 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질 및 면역활성물질을 포함하는, 리포좀 구조일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 "튜모좀(tumosome)"으로 명명되는 것일 수 있다. 상기 재구성 인공 암세포는 암세포 정보를 갖고 있는 암세포 유래 단백질들인 암세포의 라이세이트와, 면역세포 활성화 기능을 갖는 면역활성물질(예를 들어, 병원균 유래 세포막 성분 등)을 혼성화(hybridization)함으로써 형성된 재구성 리포좀 형태로서, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질에 의해 형성된 뼈대 모양의 외벽과, 및 암세포의 외벽에 존재하는 인지질-결합 막 단백질 및 암세포의 세포질 내부에 포함되어 있던 세포질 단백질을 포함하는, 새로운 형태의 혼성화된 구조를 갖는 리포좀을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 인지질-결합 암세포 막 단백질 및 상기 암세포 세포질 내에 존재하는 단백질은 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질들을 의미하는 것일 수 있으며, 즉 상기 암세포의 라이세이트에 기반한 항원인 막 또는 세포질 단백질과, 상기 면역활성물질이 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질과 함께 재구성(reconstitution)된 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포는 암세포의 막과 세포질에 존재하는 다양한 암세포 관련 정보를 갖고 있는 물질을 암 항원으로 사용하기 위하여 용해(lysis)된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 암세포는, 암세포 주(cell line)를 이용하여 수득되거나, 체내에 존재하는 암 조직(tumor tissue)으로부터 분리되는 것일 수 있다. 또한, 실제 암 조직에서 항암제나 방사선을 가함으로써 세포 내 스트레스와 관련된 단백질의 생성을 유도한 후에, 암세포를 용해함으로써 제조되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질들을 면역활성물질 및 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질과 함께 재구성함으로써, 나노 크기의 형태를 갖는 재구성 인공 암세포인 튜모좀을 형성하여, 결과적으로는 암세포 막 및/또는 세포질 내에 존재하는 다양한 암 항원 성분들이 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 내부에 봉입될 수 있도록 한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 암세포의 라이세이트에서 분리된 단백질 항원들 및 면역활성물질이 상기 면역활성물질 중 양이온성 지질에 의해, 재구성 인공 암세포로 재구성됨으로써, 상기 암세포의 라이세이트에 존재하는 다양한 암 단백질 항원들과 관련된 물질의 면역세포 내 전달 효율이 상승하여, 상기 암 항원과 관련된 물질을 면역세포가 효과적으로 인지할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포의 직경은 약 300Å 내지 약 4,000Å인 것일 수 있다. 이러한 크기는 체내의 면역세포가 제조된 재구성 인공 암세포를 실제 암세포처럼 인식하고, 세포 내 업테이크(uptake)를 통해 암 항원을 효과적으로 인지하기에 최적화된 조건이며, 예를 들어, 상기 재구성 인공 암세포는 약 300 Å 내지 약 4,000 Å, 약 300 Å 내지 약 3,000 Å, 약 300 Å 내지 약 2,000 Å, 약 300 Å 내지 약 1,000 Å, 약 300 Å 내지 약 500 Å, 약 500 Å 내지 약 5,000 Å, 약 500 Å 내지 약 4,000 Å, 약 500 Å 내지 약 3,000 Å, 약 500 Å 내지 약 2,000 Å, 약 500 Å 내지 약 1,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 5,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 4,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 3,000 Å, 약 1,000 Å 내지 약 2,000 Å, 약 2,000 Å 내지 약 5,000 Å, 약 2,000 Å 내지 약 4,000 Å, 약 2,000 Å 내지 약 3,000 Å, 약 3,000 Å 내지 약 5,000 Å, 약 3,000 Å 내지 약 4,000 Å, 약 4,000 Å 내지 약 5,000 Å, 또는 약 1,000 Å 내지 약 1,500 Å 범위의 직경을 갖는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포를 포함하는 항암 조성물은, 암세포 주위에 직접 주입되거나, 암 조직을 제거한 후에 암의 재발 방지를 위하여 주입되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 카복실기, 아민기, 티올기, 알데히드기, 비오틴기 등의 기능성기를 포함하는 상기 면역활성물질에 의하여, 다양한 기능을 담당하는 물질들이 컨쥬게이션(conjugation)되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역활성물질 중 양이온성 지질에 의하여, 음전하를 띄는 상기 다른 면역활성물질 또는 DNA, RNA와 같은 바이오소재가 상기 재구성 인공 암세포에 효과적으로 로딩되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 지질에 의하여 항원 교차제시(antigen cross-presentation)가 유도됨으로써, 암 항원이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 양이온성 지질이 상기 암세포의 라이세이트 및 면역활성물질과 조합됨으로써, 항원 교차제시가 유도되어 상기 암 항원이 세포 내로 전달될 수 있으며, 이에 따라 항암 효과가 나타날 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포가 양이온성 지질의 면역활성물질을 포함하는 경우, 상기 양이온성 지질에 의하여 상기 재구성 인공 암세포와 음이온성인 세포막 사이의 정전기적 인력이 유도되어, 상기 암 항원 및/또는 다른 면역활성물질의 세포 내 전달능이 더욱 향상될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포의 라이세이트는 막 또는 세포질 단백질을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 막 또는 세포질 단백질은, 예를 들어 재조합 단백질, 막 또는 세포질 단백질, 서브유닛, 스플릿 단백질 항원들을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 재구성 인공 암세포의 제조 방법으로서, 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질 및 면역활성물질을 제 1 용매에 용해하는 것; 상기 제 1 용매를 증발시켜 면역활성물질을 포함하는 지질 막을 형성하는 것; 제 2 용매에 상기 지질 막을 용해하여 제 1 용액을 형성하는 것; 및 상기 제 1 용액에 암세포의 라이세이트를 혼합 및 초음파 처리하여 재구성 인공 암세포를 제조하는 것을 포함하는, 재구성 인공 암세포의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 초음파 처리는 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 및 세포질 단백질들이 양친성 특성을 갖는 지질 층 외벽에 균일하게 분포하도록 하는데 중요한 역할을 하며, 내부에 봉입되는 효율을 또한 높일 수 있다.

본원의 제 3측면에 따른 제조 방법에 대하여, 본원의 제 1측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 면역활성물질; 및 암세포의 라이세이트(lysate)를 포함하며, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 원형 또는 타원형의 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하고, 상기 면역활성물질 및 상기 암세포의 라이세이트는 각각 독립적으로, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 상기 재구성 인공 암세포의 내부에 존재하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 원형 또는 타원형의 외벽을 형성하는 지질을 포함하고, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 내부에 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질 및 면역활성물질을 포함하는, "튜모좀(tumosome)"으로 명명되는 리포좀 구조일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 용매는 유기용매 및 C1 내지 C₆의 알코올을 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 유기용매는 약 40℃ 내지 약 110℃의 끓는점을 가지는 비극성 용매일 수 있고, 탄화수소, 할로겐 탄화수소, 또는 방향족 탄화수소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 알코올은 에탄올일 수 있으며, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질이 상기 에탄올에 용해됨으로써, 지질 막을 형성하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 용매는 인산염완충용액(PBS), 인산 버퍼(phosphate buffer), 증류수, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 암세포의 라이세이트; 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 및 상기 면역활성물질은, 약 0.01 내지 10 : 0.01 내지 10 : 0.1 내지 100의 중량비(또는 부피비)로 혼합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 암세포의 라이세이트; 상기 외벽을 형성하는 지질; 및 상기 면역활성물질은, 약 0.01:0.01:0.1, 약 0.01:0.01:100, 약 0.01:10:0.1, 약 0.01:10:100, 약 0.01:0.01:0.1, 약 10:0.01:0.1, 약 10:0.01:100, 약 10:10:0.1, 약 10:10:100, 또는 약 10:0.01:0.1의 중량비(또는 부피비)로 혼합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포는 원형 또는 타원형의 외벽을 형성하는 지질을 포함하고, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽 및/또는 내부에 각각 독립적으로 암세포의 라이세이트에서 분리된 막 또는 세포질 단백질 및 면역활성물질을 포함하는, 리포좀 구조일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 글리코지질 트레할로오스 포스파티딜글리세롤류, 포스파티딜콜린류, 포스파티딜에탄올아민류, 포스파티딜세린류, 포스파티딜이노시톨류, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 디올레오일 포스파티딜 포스포콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민, 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트, N,N,N,N-테트라메틸-N,N,N,N-테트라팔미틸스퍼민, 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸암모늄 브로마이드, 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤, 디옥타데실아미도글리실스퍼민, N,N-[비스(2-히드록시에틸)]-N-메틸-N-[2,3-디(테트라데카노일옥시)프로필]암모늄 요오드, [N,N,N´,N´-테트라메틸-N,N´-비스(2-히드록시에틸)-2,3-디(올레오일옥시)-1,4-부탄디암모늄 요오드], N-t-부틸-N′-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘, 디에틸아미노에틸 덱스트란, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

본원 발명의 실시예를 통해, 재구성 인공 암세포를 이용한 종양 항원의 효과적인 세포 내 전달과 면역세포의 활성화, 항암 치료 효능 및 예방, 세포 독성 T 세포의 활성화 효과를 소동물 모델을 통하여 검증하였다.

실시예 1. 암세포 라이세이트로부터 막 또는 세포질 단백질 분리

생쥐 유래 흑색종 멜라로마(melanoma_B16-F10) 세포는 소 태아 혈청(10% FBS)과 항생제(50 U/ml 페니실린과 50 ug/ml 스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified eagle’s medium) 안에서 배양되었으며, 5% 이산화탄소(CO₂)가 존재하는 37℃ 배양기에서 유지되었다. 세포막 유도를 위해, 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 사용하여 배양 용기로부터 분리하여 1.5 x 10⁸세포를 수확하였다. 수확된 세포는 500 x g로 원심 분리시켜, 인산완충식염수(PBS)로 세 번의 세척을 진행하였다. 세포들은 10 ml당 한 개의 프로테아제 억제제(protease inhibitor tablet)가 녹아있는 세포 용해 완충액[lysis buffer, 트리스 완충액(20 mM Tris-HCl pH=7.5, 염화칼륨(10 mM KCl), 염화마그네슘(2 mM MgCl₂)]에 부유시켰다. 세포 용해 완충액에 부유된 세포는, 5 분 동안 900 x g로 원심 분리하기 전에 균질기(homogenizer)와 막자(pestle)를 이용하여 20 번 반복을 통해 용해되었다. 상층액은 모으고, 펠렛(pellet)은 세포 용해 완충액에 다시 부유시켜 위의 방법을 반복하였다. 두 번 반복을 통해 모은 상층액은 20 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리한 후, 펠렛은 버리고, 상층액만 다시 30 분 동안 100,000 × g에서 원심 분리하였다. 암세포의 원형질막을 포함한 펠렛은 세척액[트리스 완충액(10 mM Tris-HCl pH=7.5), 이디티에이(1 mM EDTA)]으로 부유시킨 후, 다시 원심분리를 진행하였다. 상기와 같은 방법을 3 번 반복하여 모은 마지막 펠렛은, 세척액 200 μl 에 분산시켜 바이신코닉산(bicinchoninic acid; BCA) 단백질 정량법을 이용하여 암 항원 단백질을 정량한 후, 약 5 mg/ml은 추후 실험을 위하여 사용되었다.

실시예 2. 튜모좀(tumosome)의 제조 및 특성 분석

2-1. MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1) 제조

도 1 은, 본원의 튜모좀 제조 방법 및 모형도를 나타낸 것이다. 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC, 2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide, DDA, 2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(cholesterol 0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 모노포스포릴 지질 A[monophosphoryl lipid a, MPLA, 0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 지질(Avanti Polar Lipids), 미국], 에탄올(ethanol) 1 mL에 용해시켰다. 용액을 둥근 플라스크에 옮긴 뒤에 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 그런 다음, 실시예 1에서 분리한 암 항원 단백질(melanoma_B16-F10 tumor-associated antigen protein, 0.4 mg/mL)을 포함하는 인산 완충 용액(PBS, 0.0067M PO₄) 2 mL을 넣은 뒤에 교반기(stirrer)를 이용하여서 60℃에서 30 분 동안 600 rpm 속도로 지질막을 용액에 분산시켰다. 상기 분산된 용액을 4 mL 유리병(vial)에 옮긴 뒤에 초음파 분산기(tip sonicator)를 이용하여서 1 분 동안 인산 완충 용액(PBS)에 지질막이 완전하게 분산되도록 풀어주었다. 그런 다음, 회전기(tube revolve)를 사용하여 2 시간 정도 교반 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

도 2의 (a) 및 (b)는 제조된 튜모좀의 구조를 나타낸 이미지로서, 튜모좀의 구조는 DLS(dynamic Light Scattering, 오츠가, 일본) 및 TEM(투과전자현미경, high-resolution transmission electron microscopy)를 통해 분석되었다. 투과전자현미경으로 관찰된 튜모좀의 이미지를 통해, 구형의 나노 리포좀임을 확인하였다. 도 2의 (b)에서 DLS(dynamic Light Scattering, 오츠가, 일본) 측정 결과, 지름이 115.38±7.09 m 임을 확인하였고, 또한 동적산란법을 이용하여 측정한 결과 표면 전하는 약 28.06±2.2 mV 임을 확인할 수 있었다. 도 2의 (c)는 제조된 튜모좀을 적외선 분광기(FT-IR, dourier transform infrared spectroscopy)를 이용하여서 분석한 것으로서, 아미드 I, II 부분(amide I: 1600-1690 cm^-1, Amide II: 1480-1575 cm^-1)의 C=O 스트레치와 N-H 벤딩(bedding)을 통해 암세포 라이세이트에서 채취한 암 항원 단백질이 튜모좀에 성공적으로 로딩된 것을 확인하였다.

2-2. MPLA/TDB를 포함하는 튜모좀(tumosome-2) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA[0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 지질(Avanti Polar Lipids), 미국], TDB(10 mg, 아반띠 폴라 지질(Avanti Polar Lipids), 미국)를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-2)을 제조하였다.

2-3. MPLA/QS21를 포함하는 튜모좀(tumosome-3) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA[0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 지질(Avanti Polar Lipids), 미국], QS21(2 mg, Desert King International, 샌디에고, 미국)를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-3)을 제조하였다.

2-4. DDA/CpG를 포함하는 튜모좀(tumosome-4) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), CpG(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-4)을 제조하였다.

2-5. DDA/Poly(I:C)를 포함하는 튜모좀(tumosome-5) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), Poly(I:C)(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-5)을 제조하였다.

2-6. DDA/Resiquimod를 포함하는 튜모좀(tumosome-6) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 레시퀴모드(resiquimod, 2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-6)을 제조하였다.

2-7. DDA/STING(cyclic DNA)를 포함하는 튜모좀(tumosome-7) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), c-di-AMP(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-7)을 제조하였다.

2-8. DDA/Pam3CSK4 를 포함하는 튜모좀(tumosome-8) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), Pam3CSK4(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-8)을 제조하였다.

2-9. DDA/CL401를 포함하는 튜모좀(tumosome-9) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), CL401(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-9)을 제조하였다.

2-10. DDA/CL429를 포함하는 튜모좀(tumosome-10) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), CL429(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-10)을 제조하였다.

2-11. DDA/N-Glycolyl-MDP를 포함하는 튜모좀(tumosome-11) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), N-Glycolyl-MDP(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-11)을 제조하였다.

2-12. MPLA/DDA/poly(IC)를 포함하는 튜모좀(tumosome-12) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA[0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 지질(Avanti Polar Lipids), 미국], DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), poly(I:C)(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국) 를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-12)을 제조하였다.

2-13. MPLA/DDA/CpG를 포함하는 튜모좀(tumosome-13) 제조

DOPC(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), MPLA[0.2 mg/mL, 아반띠 폴라 지질(Avanti Polar Lipids), 미국], DDA(2 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), 콜레스테롤(0.5 mg/mL, 시그마알드리치, 미국), CpG(2 mg, Invivo Gen, 샌디에고, 미국)를 에탄올 1 mL에 용해시킨 후에, 회전 농축기(rotary Evaporator)을 이용하여서 에탄올(ethanol)을 완전히 증발시키면, 얇은 지질 막(thin-film) 형태가 만들어진다. 이후, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여 튜모좀(tumosome-13)을 제조하였다.

실시예 3. 튜모좀의 형광 이미지를 통한 구조 확인 및 세포 내 유입 효과 평가

도 2의 (d) 및 도 2의 (e)에 나타낸 바와 같이, 수지상세포(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)에 3 시간 동안 실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)을 처리한 후 형광 현미경과 유세포 분석기를 이용하여 튜모좀의 구조 및 세포 내 유입 효과를 평가하였다. 형광 이미지에서 나타낸 바와 같이, 종양 막(tumor membrane, 녹색)과 지질(빨간색)는 세포 내 같은 위치에 존재하며, 겹쳐지는 것(co-localization)을 확인하였다. 유세포 분석기를 통하여 세포 내 유입 효과를 평가하였을 때 또한, 튜모좀이 단독으로 암 항원만 처리하였을 때보다 BMDCs에서 세포 내 유입효과가 9.4 배 높은 것을 확인하였다.

실시예 4. 튜모좀에 의한 세포 활성 평가

도 2의 (f) 및 도 2의 (g)에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)에 의한 BMDCs의 활성은 전구염증 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 분비량을 이엘아이에스에이(ELISA) 실험방법을 이용하여 분석하였다. 면역활성물질인 MPLA(monophosphoryl lipid A)가 포함된 튜모좀을 처리하였을 경우, Th1 반응을 유도하는 IL-6의 분비가 튜모좀의 농도에 따라 증가되는 것으로 확인되었다. 또한, 세포 사멸과 종양 생성 억제를 유도하는 TNF-α의 분비량은 MPLA가 포함된 튜모좀의 처리 후에 큰 폭으로 증가되었다. MPLA는 톨-유사-수용체 4의 자극으로 수지상세포의 성숙을 유도하는 것으로 알려져 있다. 전체적으로 종합해보면, 이러한 결과는 수지상세포의 활성과 성숙 정도는 MPLA가 단독으로 처리되었을 때보다, MPLA가 포함된 튜모좀으로 처리되었을 경우 더 높아지는 것으로 확인되었다. 이러한 이유는 세포 내 전달 효율과 톨-유사-수용체 4의 자극 두 가지의 시너지로 유도되는 면역 활성이 증대하기 때문이다.

실시예 5. 림프노드 조직형광기법을 통한 세포 내 유입 확인

실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)은 여러 가지 방법으로 체내에 주입될 수 있다. 도 3의 (a) 내지 (c)는, 근적외선형광을 이용한 영상 가이드 수술 그림을 나타낸 것이다. 인도시아닌그린(indocyanine green, ICG)는 종양이 림프절을 통해 직접 전이되는 경우, 가장 처음 도달하는 림프절인 감시 림프절(Sentinel lymph node, SLN)을 근적외선시각화(mapping) 시킬 수 있어 암 수술에 많이 이용되고 있다. 도 3의 (a)에 나타낸 바와 같이, 먼저 ICG를 생쥐에 주입시킨 뒤에 림프노드를 시각화시키고, 제조된 튜모좀을 근적외선형광을 이용하여 영상 가이드 수술을 진행하였다. 주입 후 동일한 위치(co-localization)에 합쳐졌으며, 또한 림프절을 떼어내서 확인하였다. 도 3의 (d) 및 (e)에 나타낸 바와 같이, 제조된 튜모좀을 주입한 후 림프노드를 떼어내어서 조직 형광 기법을 통하여 세포 내 유입을 확인하였다. 그 결과 튜모좀(FITC, antigen)은 수지상세포(DCs, TRITC CD205)에 합쳐지는 것을 확인하였다. 또한, 유세포 분석기를 통해서 확인하였을 때, 제조된 튜모좀에서 가장 세포 내 유입율이 높은 것을 확인하였다.

실시예 6. 튜모좀에 의한 혈액 내 활성화 확인

도 3의 (f)에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)을 주입한 후 혈액 내에서 혈청을 분리하여 Th1 반응을 유도하는 사이토카인(cytokine) IL-6를 확인한 결과, 대조군에 비해서 튜모좀으로 처리한 마우스 군에서 가장 높은 분비율을 보이는 것을 확인하였다.

실시예 7. 튜모좀에 의한 T 세포 증식 검사

도 4의 (a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)의 생체 내 T 세포 활성 특성을 동물 실험(in-vivo)을 통해 확인하였다. 동물 실험에는 특정 병원균이 없는 6 주령의 암컷 C57BL/6 생쥐(코아텍, 대한민국)를 사용하였다. 먼저, 체중(g) 당 0.01 ml의 2.5% 아버틴(avertin; 2,2,2-tribromoethanol-tert-amylalcohol, 시그마알드리치, 미국) 용액을 생쥐의 복강에 주입하여 마취시키고, 튜모좀을 양쪽 샅고랑림프절(Inguinal lymph node)에 10 μl씩 주입하였으며, 대조군에는 PBS를 주입하였다. 주입 1 주일 후, 경추 탈골 방법으로 생쥐를 희생시킨 후 복강을 절개하여 비장(spleen)을 적출하였다. 와이어-메시(Wire-mesh)를 이용하여 조직으로부터 단일세포를 얻은 뒤, 이를 PBS를 사용하여 세척하고 원심분리(1500 rpm, 5 분)를 시행하였다. 상기 단일세포 서스펜션을 10% 우태아혈청(FBS, fetal Bovine Serum, 시그마알드리치), 100U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신(라이프테크놀로지, 미국)를 함유하고 있는 RPMI 배지(Roswell Park Memorial Institute medium, 라이프테크놀로지)에 1 x 10⁵ cells/well로 분주하였다. 배양액에 암세포 라이세이트의 자극을 가한 후 37℃, 5% CO₂/air 에서 배양하였다. 배양한 T 세포에서 상층액을 제거하고 WST-1(시그마알드리치)을 첨가한 배양액을 넣고 2 시간 더 배양한 뒤, ELISA 판독기(ELISA Reader, Molecular Devices, 미국)를 이용하여 440 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. T 세포 증식 정도를 확인한 결과, 튜모좀 투여군에서, 대조군에 비하여 유의하게 T 세포 증식이 증가함을 확인하였다. 또한, IFN-γ의 분비량을 확인하였을 때도, 튜모좀 실험군에서 가장 많이 분비되는 것을 확인하였다.

실시예 8. 튜모좀에 의한 항암 치료 효능 평가

도 4의 (c) 및 (d)에 나타낸 바와 같이, C57BL/6 마우스 흑색종 모델을 이용하여 실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)을 림프절(intranodal injection)로 투여한 후 종양 치유 능력을 확인하였다. 6 주령 생쥐 암컷 5 마리의 오른쪽 대퇴부에 1 x 10⁵ 흑색종 세포(B16F10)를 피하주사로 주입하고, 다음날부터 튜모좀을 샅고랑림프절(inguinal lymph node)에 3 일 간격으로 3 번 10 μl씩 주입하였으며, 대조군에는 PBS를 주입하였다. 그 다음 암세포 투여 후 21 일 동안, 1 주일에 2-3 회씩 종양 크기(tumor volume)를 측정하였다. 그 결과 암세포 주입 후 튜모좀을 투여한 경우에, 대조군에 비해 종양세포의 증식이 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 또한, 생존율에서도 효과가 있는 것을 확인하였다.

실시예 9. 튜모좀에 의한 암 예방 효과

도 4의 (e) 및 (f)에 나타낸 바와 같이, 생쥐 모델에 제조된 실시예 2-1 의 MPLA/DDA를 포함하는 튜모좀(tumosome-1)을 먼저 투여하고 흑색종을 유발하여, 흑색종에 대한 항암 효과를 분석하였다. 먼저, 튜모좀을 C57BL/6 6 주령 생쥐 암컷 5 마리 양쪽 샅고랑 림프절에 10 μl씩 주입하였으며, 대조군에는 PBS를 주입하였다. 1 주일 후 같은 방법으로 1 회 반복 주입하고, 그 다음 1 주일 경과 후, 1 x 10⁵ 흑색종 세포(B16F10)를 피하 주사를 실시한 후, 종양 세포 투여일(0 일)로부터 21 일 동안 1 주일에 2 내지 3 회씩 종양 크기(tumor volume)를 측정하였다. 그 결과, 튜모좀을 투여한 경우에, 대조군에 비해 종양세포의 생성 및 증식이 현저히 억제되는 암 예방 효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, 이 경우 대조군에 비해 종양세포의 증식이 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 생존율에서도 또한 효과가 있는 것을 확인하였다.

실시예 10. 다양한 조합의 튜모좀에 의한 T 세포 증식 검사

상기 실시예 2에서 제조된 다양한 면역활성화 물질과 지질 구성으로 재조합된 튜모좀의 생체 내 T 세포 활성 특성을 동물실험을 통해 확인하였다. 실험은 상기 실시예 7에서와 동일한 방법으로 진행되었으며 다양한 튜모좀에 의한 IFN-γ의 분비량을 확인하였다(도 5). 2 가지 면역활성화 물질로 이루어진 튜모좀보다는 MPLA/DDA/CpG 또는 MPLA/DDA/poly(I:C)와 같은 3 성분계 구성 물질로 이루어진 튜모좀 그룹에서, 암세포를 사멸할 수 있는 T 세포 활성화 효능이 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 11. 수술 과정을 통해 절제한 암 조직으로부터 막 또는 세포질 단백질 분리

6주령의 암컷 C57BL/6 생쥐(코아텍, 대한민국)에 오른쪽 대퇴부에 5 x 10⁵ 흑색종 세포(B16F10)를 피하 주사로 주입하고, 2주 후에 종양의 크기가 12 내지13mm 정도가 되었을 때, 수술을 통하여 암 조직을 절제하여 암세포를 적출한 후에 상기 실시예 1과 같은 방법으로 막 또는 세포질 단백질을 분리한 후, 추후 실험을 위하여 사용되었다.

실시예 12. 수술 과정을 통해 절제한 암 조직을 이용한 튜모좀의 제조

도 6은, 절제한 암 조직으로부터 얻은 암세포의 막 또는 세포질 단백질을 이용한 튜모좀의 제조 방법 및 모형도를 나타낸 것이다. 상기 실시예 11 에서 분리한 암세포 막 및 세포질 단백질을 이용하여 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 튜모좀을 제조하였다.

실시예 13. 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀의 암 재발(tumor recurrence) 방지 효과 검증 실험 준비

도 7의 (a)는 C57BL/6 마우스 흑색종 모델을 투여한 후, 종양을 키운 뒤에 암의 재발 방지 효과를 보기 위해서 종양을 1% 미만 정도로 남겨놓은 뒤에 7 mm 크기의 핀(clip)을 이용하여 봉합해 준 이미지이다. 도 7의 (b)는, 봉합 후 일주일 뒤에 확인한 결과를 나타낸 이미지로서, 남겨진 종양이 다시 급 성장하여, 원래 크기의 종양이 다시 생성됨을 확인하였다.

실시예 14. 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀의 세포 내 유입 효과 평가

도8의 (a)는 상기 실시예 3과 같은 방법으로 상기 실시예 12에서 제조된 튜모좀을, 수지상세포(BMDCs)에 처리한 후 유세포 분석기를 통하여 평가한 세포 내 유입 효과를 나타낸 그래프이다. 도 8의 (a)에 나타낸 바와 같이, 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀이 단독으로 암 항원만 처리 하였을 때보다, BMDCs 에서 세포 내 유입 효과가 5.45배 높은 것을 확인하였다.

실시예 15. 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀의 세포 활성 평가

도 8의 (b)는 상기 실시예 4와 같은 방법으로 상기 실시예 12의 튜모좀을 수지상세포(BMDCs)에 처리한 후, 전구염증 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 분비량을 이엘아이에스에이(ELISA) 실험 방법을 이용하여 분석한 결과이다. 면역활성물질인 MPLA(monophosphoryl lipid A)가 포함된 튜모좀을 처리하였을 경우, Th1 반응을 유도하는 IL-6의 분비가 튜모좀의 농도에 따라 증가되는 것으로 확인되었다. 또한, 세포 사멸과 종양 생성 억제를 유도하는 TNF-α의 분비량은 MPLA가 포함된 튜모좀의 처리 후에 큰 폭으로 증가되었다. MPLA는 톨-유사-수용체 4의 자극으로 수지상세포의 성숙을 유도하는 것으로 알려져있다. 전체적으로 종합해보면, 이러한 결과는 수지상세포의 활성과 성숙 정도는 MPLA가 단독으로 처리되었을 때보다, MPLA가 포함된 튜모좀으로 처리되었을 경우 더 높아지는 것으로 확인되었다. 이러한 이유는 튜모좀 혼성화 구조에 의한 세포 내 전달 효율과 톨-유사-수용체 4의 자극 두 가지의 시너지로 유도되는 면역 활성이 증가 하였기 때문이다.

실시예 16. 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀에 의한 세포 성숙도 평가

도 8의 (c)는 상기 실시예 12의 튜모좀을 수지상세포에 처리한 후, BMDCs의 성숙도(maturation) 정도에 따라 발현되는 CD80, CD86 및 CD40의 농도를 표지한 결과를 나타낸 것이다. 도 8의 (c)에 나타낸 바와 같이, MPLA가 포함된 튜모좀을 처리 후에, 그 농도가 큰 폭으로 증가됨을 보여주고 있다. 이러한 이유는 세포 내 전달 효율과 톨-유사-수용체 4의 자극 두 가지의 시너지로 유도되는 면역 활성이 증대되기 때문이다.

실시예 17. 절제한 암 조직을 이용하여 제조된 튜모좀에 의한 암 재발(tumor recurrence) 방지 효능 평가

도 9에서는 C57BL/6 마우스 흑색종 모델을 이용하여 암 재발 방지 항암 치료 효능 평가를 확인하였다. 먼저, 6 주령 생쥐 암컷 5 마리의 오른쪽 대퇴부에 5 x 10⁵ 흑색종 세포(B16F10)를 피하주사로 주입하고, 14 일 이 지난 후 종양의 크기가 평균 400 mm³가 되었을 때, 상기 실시예 13과 같은 과정으로 수술을 진행 한 뒤에 수술한 날로부터, 상기 실시예 12의 튜모좀을 3 일 간격으로 3 번 주입하였으며 대조군에는 PBS를 주입하였다. 도 9에서, 빨간색 화살표는 수술한 날을 나타낸 것이며, 파란색 화살표는 튜모좀을 주입한 날을 나타낸 것이다. 암세포 투여 후 25 일 동안, 1 주일에 2 내지 3회씩 종양 크기(tumor volume)을 측정하였다. 그 결과, 수술 후에 튜모좀을 투여한 실험군의 경우에, 대조군에 비해 종양세포의 증식이 현저히 억제됨을 관찰할 수 있었다.

본원은, 암세포의 막 및/또는 세포질 단백질과, 면역활성물질을 포함하는 지질로 혼성화 구조를 갖도록 제조된 재구성 인공 암세포에 관한 것으로서, 상기 재구성 인공 암세포인 튜모좀은 항원의 다양성(heterogeneity of antigens) 정보를 모두 포함하면서도, 항암 면역세포의 활성화와 관련된 사이토카인의 발현을 현저하게 증가시켰으며, 암의 치료 효과에 탁월한 효능을 보였다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

재구성 인공 암세포로서,
상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질; 면역활성물질; 및 암세포의 라이세이트(lysate)를 포함하며,
상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 원형 또는 타원형의 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하고,
상기 외벽을 형성하는 지질, 상기 암세포의 라이세이트 및 상기 면역활성물질은 혼성화되어 재구성된 구조를 포함하는 것이고,
상기 면역활성물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 사포닌, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 양이온성 지질(cationic lipids), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하고,
상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린이고,
상기 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실암모늄, DC-콜레스테롤, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질이고,
상기 암세포는 흑색종 유래 암세포인,
재구성 인공 암세포.
제 1 항에 있어서,
상기 암세포는 암조직(tumor tissue)에서 분리된 암세포 및 세포주(cell line)로부터 수득된 암세포 중 하나 이상의 암세포를 포함하는 것인, 재구성 인공 암세포.
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제 1 항 또는 제 2 항에 따른 재구성 인공 암세포를 포함하는, 항암 조성물.
재구성 인공 암세포의 제조 방법으로서,
재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질 및 면역활성물질을 제 1 용매에 용해하는 것;
상기 제 1 용매를 증발시켜 면역활성물질을 포함하는 지질 막을 형성하는 것;
제 2 용매에 암세포의 라이세이트 및 상기 지질 막을 첨가하여 제 1 용액을 형성하는 것; 및
상기 제 1 용액을 초음파 처리하여 재구성 인공 암세포를 제조하는 것
을 포함하고,
상기 면역활성물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 사포닌, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 양이온성 지질(cationic lipids), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하고,
상기 재구성 인공 암세포의 외벽을 형성하는 지질은 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린이고,
상기 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실암모늄, DC-콜레스테롤, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질이고,
상기 암세포는 흑색종 유래 암세포인,
재구성 인공 암세포의 제조 방법.
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