ES2905591T3 - Plataforma de estructura de núcleo/cáscara para inmunoterapia - Google Patents

Plataforma de estructura de núcleo/cáscara para inmunoterapia Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende una vacuna terapéutica contra el cáncer que comprende una población de moléculas de ARNm que codifican al menos un antígeno tumoral, en la que la población está comprendida dentro de una pluralidad de partículas de núcleo de polímero o proteína que comprenden al menos un polímero o proteína con carga positiva, y además en la que la pluralidad de partículas de núcleo de polímero o proteína están a su vez encapsuladas en una bicapa lipídica biocompatible.

Description

DESCRIPCIÓN
Plataforma de estructura de núcleo/cáscara para inmunoterapia
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a los campos de la biología molecular, la oncología y, en particular, a las composiciones multicomponentes optimizadas para las vacunas de ARNm. También se desvelan formulaciones y medicamentos que incluyen estas composiciones, así como procedimientos para la entrega eficiente de vacunas basadas en ARNm a células de mamíferos, y para tratar y/o mejorar los síntomas de uno o más cánceres o tumores en un mamífero afectado.
Descripción de la técnica relacionada
Vacunas terapéuticas
Una vacuna suele estar compuesta por antígenos que pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario del cuerpo y uno o más adyuvantes que pueden potenciar la reacción inmunitaria del cuerpo. Sin embargo, una vacuna terapéutica contra el cáncer es totalmente diferente de las vacunas profilácticas utilizadas para prevenir enfermedades infecciosas, dado que la vacuna debe ser lo suficientemente potente como para generar células inmunitarias que eliminen las células cancerosas en lugar de producir anticuerpos que combatan los patógenos. Las vacunas terapéuticas tienen un enorme potencial en el tratamiento de múltiples tipos de enfermedades potencialmente mortales, como el cáncer y las enfermedades infecciosas. Una cuestión clave para determinar el éxito de la vacunación contra el cáncer es la inducción potente de respuestas antitumorales contra el antígeno seleccionado. Tanto los péptidos proteicos como los plásmidos de ADN han servido tradicionalmente como antígenos para el desarrollo de vacunas (Melero et al., 2014; Schwartzentruber et al., 2011; Kantoff et al., 2010). Las proteínas y los péptidos son relativamente fáciles de preparar y se pueden producir a gran escala; sin embargo, la elección del péptido antigénico depende del tipo único de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) del paciente, por lo que se debe personalizar para que coincida con los pacientes individuales. Por otro lado, las vacunas de ADN tienen una baja potencia y corren el riesgo de una integración genómica incontrolada (McNamara et al., 2015).
Vacunas contra el cáncer basadas en ARNm
El ARNm ha surgido recientemente como una fuente ideal de antígenos para las vacunas terapéuticas contra el cáncer (Sullenger y Nair, 2016). Las moléculas de ARNm se pueden adaptar para codificar múltiples antígenos y servir como adyuvante al activar la señalización del receptor tipo Toll (TLR) en las células presentadoras de antígenos (Heil et al., 2004; Diebold et al., 2004). Además, la transferencia de genes mediada por ARNm se puede producir en células que no se dividen, dado que no se requiere la translocación nuclear ni la transcripción, mientras que la transferencia de genes mediada por ADN plasmídico es mayormente efectiva en células que se dividen (McNamara et al., 2015; Kallen y Thess, 2014).
Dado que las moléculas de ARNm cargadas negativamente no pueden entrar directamente en las células presentadoras de antígenos, la vacuna basada en ARNm se suele preparar por medio de la transfección de moléculas de ARNm en células dendríticas (DC) derivadas del paciente por medio de electroporación (Van Tendeloo et al., 2001). A continuación, la vacuna de DC se reintroduce en el paciente para la síntesis, el procesamiento y la presentación del antígeno tumoral. Un número de vacunas de DC han llegado a diferentes etapas de los ensayos clínicos (Wilgenhof et al., 2013). Sin embargo, este procedimiento no permite la producción en masa de vacunas terapéuticas listas para usar.
Un enfoque alternativo para preparar la vacuna de ARNm es empaquetar las moléculas de ARNm en nanopartículas e inocularlas directamente en el cuerpo donde la vacuna es tomada por las células presentadoras de antígeno. Este enfoque aprovecha la gran capacidad fagocítica de las células presentadoras de antígenos. Las vacunas de ARNm condensado en protamina constituyen una parte importante en este grupo, y varias de ellas se encuentran en diferentes fases de estudios preclínicos y ensayos clínicos (Weide et al., 2009). El empaquetamiento del ARNm con protamina no sólo permite la captación celular de las partículas de la vacuna, sino que también facilita la estimulación de la señalización TLR-7/8 dependiente de MyD88 en las células del huésped (Scheel et al., 2005). Sin embargo, la degradación del ARNm es una preocupación potencial, dado que parte del ARNm desnudo está expuesto al fluido corporal y es vulnerable al ataque de las ARNasas plasmáticas y tisulares. Además, la exposición de las moléculas de ARNm a las células no presentadoras de antígenos corre el riesgo de desencadenar reacciones adversas dentro del organismo.
Otro enfoque alternativo es encapsular el ARNm en partículas lipídicas (el documento WO 2015/011633 A1). Las vacunas basadas en ARN plasmídico se han administrado como complejos de ARN:protamina encapsulados en una bicapa lipídica (Heyes et al., 2007). Más allá de las vacunas, el ARNsi se ha administrado en forma de complejos de protamina o partículas lipídicas encapsuladas en una bicapa lipídica (Meissner et al., 2015).
Deficiencias en el estado de la técnica
La industria y el mundo académico han trabajado durante mucho tiempo para desarrollar vacunas terapéuticas eficaces contra el cáncer, pero hasta ahora se ha logrado poco éxito. Un tipo de vacuna terapéutica contra el cáncer que se está probando en estudios preclínicos y clínicos es una vacuna de ARNm, que se compone de una molécula de ARNm que se condensa en una estructura central (que va de ~20 nanómetros a unos cientos de nanómetros). Una vez que la vacuna de ARNm es captada por las células presentadoras de antígenos, el ARNm se libera en el interior de esas células y se utiliza como plantilla para producir el antígeno o los antígenos codificados. Un ejemplo de este tipo de vacuna es la vacuna de ARNm CuraVac.
Los principales problemas de estas vacunas son: 1) las moléculas de ARNm están expuestas a los fluidos corporales y, por lo tanto, son vulnerables a la degradación por parte de las enzimas tisulares, celulares y/o plasmáticas; 2) las moléculas de ARNm “desnudas” pueden interactuar con todo tipo de células inmunitarias, lo que puede provocar efectos secundarios no deseados (tales como la secreción de altos niveles de citoquinas); y 3) dichos ARNm no son internalizados de forma muy eficaz por las células presentadoras de antígenos.
Los neoantígenos asociados a los tumores se identifican constantemente como resultado del esfuerzo masivo de secuenciación del genoma del cáncer y del avance tecnológico en la predicción de mutaciones tumorales inmunogénicas (véase, por ejemplo, Schumacher y Schreiber, 2015; Shukla et al., 2015; Yadav et al., 2014). Este recurso ha proporcionado una oportunidad sin precedentes para desarrollar nuevas y mejores vacunas contra el cáncer. Desgraciadamente, el desarrollo de la tecnología necesaria para las vacunas contra el cáncer se ha retrasado.
Sin embargo, las inmunoterapias, tales como las desveladas en la presente memoria, representan una nueva vía para la terapéutica del cáncer. Estas terapias pueden estar basadas en las características genéticas únicas de determinadas células cancerosas, para de ese modo evitar que el organismo sea atacado innecesariamente por los fármacos convencionales de quimioterapia. Las vacunas basadas en el ARNm desvelada en la presente memoria tienen la flexibilidad de incluir múltiples neoantígenos dentro de la misma construcción, y la(s) elección(es) del(los) péptido(s) antigénico(s) puede(n) ser adaptada(s) en base al espectro mutacional único del paciente individual, lo que hace posible la medicina de precisión o “personalizada”.
Breve sumario de la invención
La plataforma de administración de vacunas biocompatibles de múltiples componentes descrita en la presente memoria representa un avance importante en la superación de estas y otras limitaciones inherentes a la técnica, al proporcionar, en un sentido general, composiciones para la administración eficaz de ARNm a las células presentadoras de antígenos (tales como las células dendríticas) y su captación eficiente por parte de las mismas en procedimientos para estimular la inmunidad anticancerosa.
En un sentido global y general, las composiciones de núcleo/cáscara desveladas pueden entregar eficientemente moléculas de ácido nucleico (que incluyen, por ejemplo, ARNm que codifican uno o más antígenos específicos del cáncer o del tumor) empaquetadas dentro de una estructura de “núcleo”, y encapsuladas con una “cáscara” externa de bicapa lipídica hidrofílica, a una o más células de mamífero seleccionadas (que incluyen, por ejemplo, una o más células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, macrófagos y células B, sin limitación. La presencia de la cáscara lipofílica que encapsula el núcleo hidrofóbico interior protege a los ácidos nucleicos de la degradación por las enzimas tisulares o de la interacción con otras células inmunitarias. Además, la cubierta lipofílica también permite una mayor internalización de las composiciones por parte de las células presentadoras de antígenos, y estimula una inmunidad antitumoral más potente en comparación con las vacunas terapéuticas convencionales basadas en ARNm.
En un importante avance sobre la tecnología existente, los sistemas de administración de vacunas multicomponentes núcleo/cáscara desvelados permiten una alternativa al actual “cuello de botella” en el desarrollo de vacunas contra el cáncer basadas en ARNm, al estimular una inmunidad antitumoral robusta, que es superior a las estructuras convencionales de un solo componente “núcleo+ácidos nucleicos” que constituyen las vacunas existentes basadas en ARNm. Estos núcleos/cáscaras hidrofílicos/hidrófobos multicomponentes facilitan la preparación de vacunas de ARNm que son significativamente más potentes que las vacunas de ARNm convencionales a la hora de estimular la maduración de las células dendríticas y, por lo tanto, el procesamiento y la presentación del antígeno.
En realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona vacunas de ARNm estructuradas en el núcleo que son significativamente más potentes que las vacunas convencionales de ARNm en la estimulación de interferón-p, interferón-a e interleucina-12. Dichas vacunas terapéuticas basadas en ARNm multicomponentes que codifican antígenos tumorales se utilizan especialmente en la preparación de medicamentos para el tratamiento de una o más enfermedades en un mamífero, y en particular para el tratamiento y/o la mejora de uno o más síntomas de un cáncer de mamífero.
Una composición que comprende una vacuna terapéutica contra el cáncer que comprende una población de moléculas de ARNm que codifican al menos un primer antígeno tumoral, en la que la población está comprendida dentro de una pluralidad de partículas de núcleo de polímero que comprenden al menos un polímero cargado positivamente, y además en la que la pluralidad de partículas de núcleo de polímero están a su vez encapsuladas en una bicapa lipídica biocompatible.
Preferentemente, la cubierta de bicapa lipídica biocompatible facilita la macropinocitosis de la pluralidad de partículas del núcleo del poliplex por una o más células presentadoras de antígeno de mamíferos, que incluyen células dendríticas humanas, macrófagos humanos y células B humanas, sin limitación.
Dichas composiciones también pueden incluir opcionalmente uno o más adyuvantes, tales como CpG, poli(I:C), alumbre, g Mp-AMP cíclico (cGAMP), lipopolisacárido (LPS), lípido A monofosforil (MPLA), o cualquier combinación de los mismos, encapsulados dentro de la bicapa lipídica biocompatible, contenidos dentro del núcleo de ARNm, o contenidos dentro del espacio entre las partículas del núcleo y las bicapas fosfolípidas envolventes que las rodean/comprenden.
En ciertas realizaciones, el agente cargado positivamente utilizado para preparar las partículas del núcleo incluirá uno o más de protamina, polietilenimina, poli-(p-aminoéster), poli-arginina, poli-lisina, y combinaciones de los mismos.
Del mismo modo, los fosfolípidos biocompatibles utilizados para preparar el componente de la cáscara hidrofílica incluirán preferentemente uno o más de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE) 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol amina-N-[amino(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), O-etilfosfatidilcolina (EDPPC), colesterol y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, la bicapa fosfolipídica biocompatible incluirá preferentemente:
(a) del 30% al 70% de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (“EDOPC”);
(b) del 70% al 30% de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (“dOp E”); o
(c) del 0,5 al 5% de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfotanol amina-N-[amino(polietilenglicol)-2000] (“DSPE-PEG”). Alternativamente, la bicapa lipídica biocompatible puede incluir preferentemente:
(a) del 45% al 55% del EDOPC;
(b) del 55% al 45% de DOPE; y
(c) del 1% al 2% de DSPE-PEG.
En la práctica de la invención, las composiciones desveladas en la presente memoria incluirán preferentemente una población de moléculas de ácido nucleico, tal como ARNm, que codifican al menos un antígeno, que es específico para una o más células cancerosas o tumorales de mamíferos. Los antígenos específicos de las células cancerosas incluyen, pero no se limitan a los antígenos asociados a los tumores, tales como los antígenos E75 y p66 de1HER2 específicos del cáncer de mama, el antígeno TRP2 específico del melanoma y los antígenos mutados por el tumor [neoantígenos], tal como el HER2 con inserción de YVMA en el exón 20 [HER2YVMA] en los cánceres de mama y de pulmón, y los generados como resultado de mutaciones en el genoma del cáncer. Algunos ejemplos de antígenos específicos del cáncer y de los tumores incluyen, pero no se limitan a: HER2E75, HER2p66, HER2YVMA y TRP2. Las composiciones desveladas en la presente memoria son preferentemente adecuadas para aumentar el nivel de expresión de interferón tipo I (IFN-I), cuando se introducen en células de mamífero adecuadas; y preferentemente adecuadas para aumentar la expresión de uno o más de los IFN-a4, IFN-p, y sus citoquinas descendentes tales como CCL-5, por ejemplo.
En ciertas realizaciones, las composiciones desveladas serán adecuadas para su introducción en una población de uno o más tipos de células de mamífero. Dichas células incluyen, pero no se limitan a, células dendríticas, macrófagos, células B, células cancerosas o una combinación de las mismas.
Las composiciones desveladas en la presente memoria pueden incluir además opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, que incluyen, por ejemplo, y sin limitación, un agente tal como un agente inmunomodulador, un agente antineoplásico, un agente neuroactivo, un agente citotóxico, un agente citostático, un agente antiinflamatorio, un agente antilipidémico, una hormona, un agonista del receptor, un antagonista del receptor, un agente antiinfeccioso, una proteína, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno, una enzima, un ARN, un ADN, un ARNsi, un ARNm, una ribozima, una hormona, un cofactor, un esteroide, una molécula antisentido o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones preferentes, el agente inmunomodulador es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en una IL-12p70, una proteína, un ligando de FLT3 [FLT3L], y una pequeña molécula inhibidora de la indoleamina 2,3-dioxigenasa [IDO-1] tal como GDC-0919 o INCB24360.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico puede incluir (pero no se limita a) uno o más compuestos tales como ciclofosfamida, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, docetaxel, paclitaxel, trastuzumab metotrexato, epirubicina, carboplatino, vinorelbina, capecitabina, gemcitabina, mitoxantrona, isabepilona, eribulina, lapatinib, carmustina, una mostaza de nitrógeno, una mostaza de azufre, un tetranitrato de platino (por ejemplo, cis-platino), vinblastina, etopósido, camptotecina, o cualquier combinación de los mismos.
En otras realizaciones, la composición puede incluir opcionalmente uno o más antígenos, polipéptidos antigénicos o fragmentos de péptidos antigénicos de los mismos, que incluyen, por ejemplo, múltiples péptidos antigénicos que son producidos por las células por separadores decir, a partir de diferentes moléculas de ARNm] o juntos/es decir, a partir de una molécula de ARNm]. Dichos antígenos pueden ser solubles, por lo que se pueden incorporar al lumen o volumen definido por el exterior del núcleo, y la superficie interna de la bicapa lipídica exterior, o en el caso de antígenos insolubles, se pueden incorporar dentro de la estructura del núcleo, y/o dentro de la propia bicapa lipídica. Los ejemplos de antígenos solubles incluyen, pero no se limitan a, el péptido p66 del antígeno HER2 (HER2p66), y homólogos o fragmentos antigénicos del mismo.
Los ejemplos de antígenos ligeramente solubles incluyen, pero no se limitan a, el péptido del antígeno E75 HER2 (HER2E75), y los homólogos o fragmentos antigénicos del mismo.
En ciertas realizaciones, las composiciones de administración de vacunas contra el cáncer desveladas en la presente memoria se pueden mezclar con uno o más portadores, tampones, diluyentes, vehículos o excipientes aceptables para uso farmacéutico, o mezclarse con uno o más tensioactivos, liposomas, niosomas, etosomas, transferosomas, fosfolípidos, esfingosomas, exosomas u otros tipos de vesículas que son producidas por las propias células.
Dichas composiciones se formulan preferentemente para la administración sistémica a un mamífero, y preferentemente, para la administración intradérmica o intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranodal o intraocular, o, alternativamente, en forma de parche cutáneo a un humano, y particularmente formuladas para el contacto con, y la captación por, una o más células presentadoras de antígeno, que incluyen, sin limitación, células dendríticas humanas, macrófagos y células B.
En ciertas realizaciones, las composiciones de vacunas basadas en ARNm desveladas se pueden adaptar y configurar como parte de un kit terapéutico que incluye la composición, y al menos un primer conjunto de instrucciones para la administración de la composición a un mamífero, tal como un paciente humano con cáncer, que necesite las mismas. Dichos kits se pueden utilizar como parte de un régimen para la prevención, el diagnóstico, el tratamiento o la mejora de uno o más síntomas de un cáncer o un trastorno hiperproliferativo.
Otro aspecto de la presente divulgación es un procedimiento para tratar o mejorar uno o más síntomas de cáncer en un animal que lo necesite. En un sentido global y general, dicho procedimiento incluye generalmente al menos la etapa de administrar al animal una cantidad eficaz de una o más de las composiciones de vacuna terapéutica contra el cáncer basadas en ARNm desveladas en la presente memoria, durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar uno o más síntomas del cáncer en el animal. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser diagnosticado o identificado como un cáncer refractario, metastásico, recidivante o resistente al tratamiento.
Los ejemplos de tales cánceres incluyen, pero no se limitan a, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer colorrectal, el cáncer gástrico, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer de cabeza y cuello, la leucemia, el linfoma, el mieloma múltiple, el cáncer de hígado, el cáncer de riñón, el cáncer de vejiga, el melanoma y las afecciones relacionadas en un mamífero afectado.
En ciertas realizaciones, el cáncer puede ser un cáncer metastásico, tal como el cáncer de mama metastásico, el cáncer de pulmón metastásico, el melanoma metastásico, o el cáncer colorrectal metastásico, el cáncer gástrico, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer de cabeza y cuello, el cáncer de hígado, el cáncer de riñón, el cáncer de vejiga, o una o más afecciones relacionadas en el mamífero afectado.
Dichos procedimientos pueden incluir, además, una etapa de administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de radiación o de un quimioterapéutico adicional al animal, ya sea en una sola administración, o en una serie de administraciones múltiples durante un período de uno o más días, durante un período de una o más semanas, o durante un período de uno o más meses o más.
Dicho procedimiento también puede incluir opcionalmente una etapa de administración de un segundo agente quimioterapéutico distinto, o una segunda vacuna terapéutica contra el cáncer distinta al mamífero afectado bajo tratamiento.
En otra realización, la presente divulgación también proporciona un procedimiento para administrar un agente activo, y particularmente uno o más antígenos anticancerígenos, o uno o más ARNm que codifican dichos antígenos anticancerígenos, a una o más células, tejidos, órganos o sistemas de un individuo mamífero que lo necesita. El procedimiento generalmente implica proporcionar a un individuo mamífero que lo necesite, una o más de las composiciones desveladas en la presente memoria en una cantidad y durante un tiempo eficaces para administrar las vacunas de ARNm a una población de células (por ejemplo, células presentadoras de antígenos tales como las células dendríticas) presentes en uno o más tejidos, órganos, sistemas o células seleccionados dentro o alrededor del cuerpo del individuo. En realizaciones particularmente preferentes, el individuo es un humano, y la composición comprende un componente codificador de antígeno de ARNm contenido dentro de una población de partículas de núcleo de polímero, que a su vez están contenidas dentro de una bicapa lipídica externa.
Las composiciones desveladas encuentran utilidad particular en una variedad de regímenes de tratamiento in vitro, ex vivo e in vivo , y se pueden formular solas o, alternativamente, en combinación con uno o más agentes adicionales, que incluyen, sin limitación, uno o más antígenos anticancerosos, uno o más péptidos antigénicos, uno o más reactivos de diagnóstico, uno o más reactivos terapéuticos uno o más reactivos citotóxicos, uno o más agentes quimioterapéuticos, uno o más adyuvantes, uno o más agentes inmunoestimulantes, uno o más agentes inmunomoduladores, o cualquier combinación de los mismos, para su uso en una variedad de indicaciones terapéuticas, que incluyen, sin limitación, para el tratamiento o la mejora de los síntomas de uno o más cánceres humanos, trastornos hiperproliferativos, enfermedades infecciosas, enfermedades del corazón, y similares.
Como se describe en la presente memoria, los sistemas de vacunas desvelados pueden incluir además uno o más agentes activos, tales como, por ejemplo, uno o más agentes profilácticos, uno o más agentes terapéuticos, uno o más agentes de diagnóstico, una o más vacunas, uno o más agentes de formación de imágenes, uno o más radiomarcadores, uno o más agentes adyuvantes, uno o más agentes quimioterapéuticos, uno o más agentes citotóxicos, uno o más fármacos inhibidores de puntos de control [por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-L1, anticuerpo anti-CTLA-4, etc.], o cualquier combinación de los mismos.
En realizaciones relacionadas, la invención también proporciona kits terapéuticos y/o terapéuticos que incluyen uno o más de los sistemas de administración de vacunas de ARNm basados en núcleo/cáscara desvelados en la presente memoria, típicamente en combinación con uno o más portadores aceptables para uso farmacéutico, uno o más dispositivos para la administración de las composiciones a un individuo de interés, así como uno o más conjuntos de instrucciones para usar la composición en el diagnóstico, o el tratamiento de una enfermedad de mamíferos tales como cánceres y similares.
La invención también proporciona, en un sentido global y general, composiciones y procedimientos para entregar eficazmente una población de moléculas de ARNm a una población de células de mamíferos (que incluyen, por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, células B o células tumorales) dentro del cuerpo de un mamífero. Dichas composiciones se administran preferentemente al individuo mamífero en una cantidad y durante un tiempo eficaces para tratar o mejorar una o más enfermedades o afecciones anormales en el individuo. En ciertas realizaciones, el individuo está en riesgo de padecer, se le ha diagnosticado o se sospecha que tiene una o más afecciones proliferativas celulares anormales, que incluyen, por ejemplo, uno o más cánceres u otros trastornos hiperproliferativos.
Como se indica en la presente memoria, las composiciones de la presente divulgación se pueden administrar al individuo a través de uno o más procedimientos convencionales de administración, que incluyen, sin limitación, por vía intravenosa, cutánea, subcutánea o por inyección directa a una o más células o uno o más tejidos, órganos o tumores dentro o alrededor del cuerpo del individuo.
Como se describe además en la presente memoria, en ciertas aplicaciones, puede ser deseable poner en contacto una población de células obtenidas de un individuo ex vivo con las composiciones de vacunas desveladas en la presente memoria, y luego, posteriormente, reintroducir las células contactadas resultantes en el cuerpo del individuo. Tal terapia ex vivo se contempla particularmente para ser útil en la introducción de las vacunas de ARNm desveladas a poblaciones de células dendríticas humanas, para permitir que los ingredientes activos se pongan en contacto con las células, y luego para reintroducir las células transformadas resultantes de nuevo en el cuerpo del animal. Preferentemente, las células dendríticas extraídas para su uso en dicha manipulación ex vivo serán las del propio paciente sometido a tratamiento.
En realizaciones particulares, las composiciones de vacuna de ARNm de la presente invención se pueden formular para la administración farmacéutica, y preferentemente para la administración a un ser humano. Dichas composiciones pueden incluir además uno o más agentes terapéuticos adicionales, quimioterapéuticos, adyuvantes o una segunda vacuna de ARNm distinta.
Las vacunas de ARNm desveladas en la presente memoria también se pueden utilizar in vitro para ampliar la población de células T específicas del antígeno del tumor. Un ejemplo de la aplicación es el cocultivo con células T humanas derivadas del paciente a fin de ampliar la población de células T específicas del antígeno del tumor antes de que se infundan de nuevo al paciente.
Además, las vacunas de ARNm desveladas también se pueden utilizar para aislar el receptor de células T específico del antígeno del tumor para la ingeniería de células T. Un ejemplo es el cocultivo de células dendríticas que contienen vacunas de ARNm con células T humanas, y el aislamiento de las células T con una alta capacidad de unión de las mismas. Una vez aisladas las células T, se pueden determinar sus receptores de células T por medio de la secuenciación y utilizarlos para generar células TCR-T (otra rama de la inmunoterapia contra el cáncer).
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar ciertos aspectos de la presente invención. Para promover la comprensión de los principios de la invención, se hará referencia ahora a las realizaciones, o ejemplos, ilustrados en los dibujos y se utilizará un lenguaje específico para describirlos. No obstante, se entenderá que no se pretende limitar el alcance de la invención. Cualquier alteración y modificación adicional en las formas de realización descritas, y cualquier aplicación adicional de los principios de la invención como se describen en la presente memoria se contemplan como normalmente ocurriría a alguien con conocimientos ordinarios en la técnica al que se refiere la invención. La invención se puede entender mejor por referencia a la siguiente descripción tomada en conjunción con los dibujos adjuntos, en los que números de referencia similares identifican elementos similares, y en los que:
La FIG. 1A, la FIG. 1B, la FIG. 1C, la FIG. 1D, la FIG. 1E, la FIG. 1F, la FIG. 1G, la FIG. 1H, la FIG. 1I, la FIG.
1J, la FIG. 1K, y la FIG. 1L muestran la estructura y caracterización de la vacuna de ARNm de lipopoliplex. La FIG. 1A es una vista esquemática de una vacuna basada en lipopoliplex-ARNm preparada de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación. La vacuna ejemplar está compuesta por un “núcleo” lipofóbico poliplex, ensamblado a través de la interacción electrostática entre el polímero PbAE cargado positivamente y las moléculas de ARNm cargadas negativamente. El núcleo de ARN poliplex resultante se encapsula en una “cáscara” de bicapa lipídica hidrofílica La FIG. 1B muestra un ensayo de retardo de gel en la unión de un poliplex-ARN ejemplar. Las muestras se cargaron en el siguiente orden: ARNm libre, poliplex/ARNm con 10, 20, 30 y 40 (peso/peso). La FIG. 1C, la FIG. 1D, y la FIG. 1E muestran imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de cáscaras liposomales vacías (FIG. 1C), el núcleo del poliplex/ARNm (p/p =20) (FIG. ID), y la estructura núcleo-cáscara de lipopoliplex/ARNm (FiG. IE). La FIG. 1F, la FIG. 1G, la FIG. 1h , la FIG. 1I, la FIG.
1J y la FIG. 1K ilustran la expresión de eGFP en células DC2.4 tratadas con partículas empaquetadas con ARNm. Las células DC2.4 se trataron con el control PBS (FIG. IF), núcleo de ARNm de PbAE/eGFP (FIG. 1G), ARNm de PbAE/eGFP empaquetado con EDOPC/DOPE (FIG. 1H), ARNm de PbAE/eGFP empaquetado con DOTAP/Chol (FIG. 1I), ARNm de PbAE/eGFP empaquetado en CHEMS/DOPE/R8 (FIG. 1J), o núcleo de ARNm de protamina/eGFP (FIG. 1K), y la expresión de eGFP se detectó por medio de microscopía de fluorescencia 24 horas después. La FIG. 1L ilustra la viabilidad de DC2.4 tras el tratamiento con los diversos tipos de partículas;
La FIG. 2A y la FIG. 2B ilustran la captación preferente de un ejemplo de vacuna con núcleo de lipopolímero/ARN por una población de células dendríticas de mamífero. En la FIG. 2A, se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de las células GFP-positivas después de las células DC2.4, MDA-MB-231 y mDMEC que habían sido incubadas con ARNm lipopolímero/eGFP durante 24 hs antes de la clasificación celular; en la FIG. 2B, se utilizó una imagen bioluminiscente para detectar la expresión de luciferasa en ratones 48 hs después de la inyección s.c. de LPP/Luc. A la izquierda, un ratón de control; a la derecha, un ratón tratado con LPP/Luc.
La FIG. 3A, la FIG. 3B, la FIG. 3C, la FIG. 3D, la FIG.3E, la FIG. 3F, la FIG. 3G, la FIG.3H, la FIG. 3I, y la FIG.
3J muestran el mecanismo de entrada de las células. La FIG. 3A a la FIG. 3H representan imágenes de células DC2.4 tratadas con LPP/0,5 |jg de ARNm de eGFP marcado con FAM en presencia de un control simulado (FIG.
3A), amilorida (FIG. 3B), clorpromazina (FIG. 3C), cloroquina (FIG. 3D), genisteína (FIG. 3E), pimozida (FIG. 3F), nocodazol (FIG. 3G) o citocalasina D (FIG. 3H). La FIG. 3I muestra el análisis de Image J de las células FAM-positivas, mientras que la FIG. 3J ilustra la captación dependiente del tiempo del ARNm etiquetado con LPP/FAM por las células DC2.4. Las barras de error representan la media ± desviación estándar de experimentos por triplicado;
La FIG. 4A, la FIG. 4B, la FIG. 1D, y la FIG. 4D muestran la estimulación de las DC por la vacuna LPP/ARNm. La FIG. 4A muestra la secreción de citoquinas en BMDC tratados con LPP/OVA (EdOPC/DOPE/DSPE-PEG empaquetados con ARNm de OVA y controles; la FIG. 4B muestra la inhibición de la expresión de IL-12 e IFN-p por el inhibidor de TLR7/8, ODN2087; la FIG. 4C es una comparación entre el ARNm de LPP/OVA y la proteína de LPP/OVA en la estimulación de DC; la FIG. 4D es el análisis de citometría de flujo de los marcadores de maduración de DC. Las barras de error representan la media ± desviación estándar de experimentos por triplicado;
La FIG. 5A, la FIG. 5B, la FIG. 5C, y la FIG. 5D muestran la estimulación de la presentación cruzada del antígeno de las DC por la vacuna LPP/ARNm. La FIG. 5A es el análisis de citometría de flujo de la presentación de H-2kb-OVA257-264. La FIG. 5B muestra la secreción de IL-2 dependiente del tiempo por parte de las células T CD4+ y CD8+ específicas de OVA tras la coincubación con BMDC postratadas. B3Z: Célula T CD8+ específica de OVA; DOBW: Célula T CD4+ específica de OVA. La FIG. 5C muestra la secreción de IL-2 en función del tiempo por parte de las células T CD4+ y CD8+ específicas de OVA tras la coincubación con células DC2.4 postratadas; la FIG. 5D muestra una comparación de la secreción de IL-2 por parte de las células T CD8 específicas de OVA tras la coincubación con células DC2.4 pretratadas con ARNm de LPP/OVA o con proteína de LPP/OVA;
La FIG. 6A, la FIG. 6B, la FIG. 6C, la FIG. 6D, la FIG. 6E y la FIG. 6F muestran la actividad antitumoral de LPP/OVA in vitro e in vivo. La FIG. 6A muestra los niveles de IFN-p en suero 3, 6 y 24 horas después de s.c. Vacunación con ARNm LPP/OVA; la FIG. 6B muestra el análisis de citometría de flujo sobre la activación de células T en ratones vacunados con ARNm LPP/OVA; la FIG. 6C ilustra la producción de IFN-y por los esplenocitos y las células de los ganglios linfáticos de ratones vacunados con ARNm LPP/OVA tras la estimulación con OT-I y OT-II; la FIG. 6D ilustra la muerte dependiente del tiempo de las células de melanoma B16-OVA en cultivo tras la coincubación con células T específicas de antígeno; la FIG. 6E ilustra la inhibición de la metástasis pulmonar del melanoma B16-OVA por el ARNm de LPP/OVA. Se muestran el programa de tratamiento (panel superior) e imágenes representativas de los pulmones de los ratones tras el tratamiento (panel central), y se resume el número medio de nódulos tumorales en el pulmón (panel inferior). Los datos se presentan como media ± SEM. Había 5 ratones en cada grupo; la FIG. 6F muestra la producción de IFN-y por las PBMC de ratones vacunados con ARNm de LPP/TRP2; la FIG. 6G muestra el porcentaje de células T CD8+ específicas de TRP2 en PBMC de ratones vacunados;
La FIG. 7 muestra que las moléculas de ARNm se mezclaron con una cantidad creciente de polímero (PbAE), y las muestras se separaron por electroforesis en un gel de agarosa. Las moléculas de ARNm no unidas se desplazaron hacia el fondo, y las moléculas de ARNm unidas permanecieron con el polímero en la parte superior. Carril Núm. 1: ARNm libre, Carriles 2 a 5: moléculas de ARNm con cantidad creciente de polímero; La FIG. 8A y la FIG. 8B muestran el análisis del tamaño de las nanopartículas de vacunas de ARNm no dirigidas y dirigidas, respectivamente;
La FIG. 9A, la FIG. 9B y la FIG. 9C muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de una cáscara lipídica vacía ejemplar (izquierda), un núcleo de ARNm (centro) y una nanopartícula de vacuna de ARNm completa, respectivamente, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación;
La FIG. 10A, la FIG. 10B, la FIG. 10C, la FIG. 10D, la FIG. 10E, y la FIG. 10F muestran que las células dendríticas DC2.4 se coincubaron con la misma cantidad de ARNm de EGFP (proteína verde fluorescente), ya sea en forma de núcleo de ARNm (PbAE/núcleo de ARNm o Protamina/núcleo de ARNm) o empaquetado en cáscaras de lípidos (nuestra vacuna de ARNm, ARNm encapsulado en DOTAP/colesterol o ARNm encapsulado en CHEMS/DOPE/R8). La expresión de la EGFP se monitorizó con un microscopio de fluorescencia 24 hs después;
La FIG. 11 muestra que las células DC2.4 se incubaron con el núcleo de ARNm desnudo o con ARNm empaquetado, y se determinó la viabilidad celular 24 hs después;
La FIG. 12A y la FIG. 12B muestran que el ARNm marcado con Cy5 se empaquetó en vacunas no dirigidas o dirigidas. A continuación, las partículas fluorescentes de la vacuna se incubaron con células DC2.4 durante 4 horas. Se midió el porcentaje de células internalizadas con las partículas fluorescentes de la vacuna de ARNm (FIG. 12A) y células con fluorescencia total (FIG. 12B);
La FIG. 13 ilustra la estimulación de la maduración de las células dendríticas por medio de una vacuna de ARNm. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) se trataron con la vacuna de ARNm o con componentes individuales de la vacuna, y se midió la secreción de la citoquina interferón-p (IFN-p) de tipo I y del marcador de maduración de células dendríticas IL-12p70 por medio de un ensayo inmunoenzimático (ELISA); La FIG. 14 demuestra la inhibición de la estimulación de las células dendríticas mediada por la vacuna de ARNm por medio del inhibidor de TLR7/8 ODN2095. Las BMDC se trataron con la proteína ovoalbúmina (OVA), con el inhibidor de TLR7/8 ODN2095, con una vacuna de ARNm que expresaba OVA, o con una combinación de vacuna de ARNm y ODN2095, y se midió por ELISA la secreción de la citoquina interferón-p (IFN-p) de tipo I y del marcador de maduración de células dendríticas IL-12p70;
La FIG. 15 muestra las BMDC que se trataron con control negativo de PBS, núcleo de protamina/ARNm o vacuna de ARNm específica para OVA (vacuna de ARNm que expresa la proteína OVA); a continuación se aplicó la citometría de flujo para detectar las células dendríticas positivas para CD11c que también mostraban el epítopo MHCI-OVA;
La f Ig . 16A muestra las células BMDC y la FIG. 16B muestra células DC2.4 tratadas con la vacuna de ARNm de OVA que se coincubaron con células T CD4 específicas de OVA (DOBW) y células T CD8 (B3Z) durante 24 o 48 hs. La expresión de IL-2 por parte de las células T fue detectada y cuantificada por ELISA;
La FIG. 17 muestra que la vacuna de ARNm de OVA se coempaquetó con el inhibidor de IDO1 INCB024360, y se aplicó para tratar los BMDC. A continuación, los BMDC se coincubaron con células T específicas de OVA y se midió la secreción de IL-2 por medio de ELISA;
La FIG. 18A y la FIG. 18B muestran que los ratones C57BL6 se trataron 3 veces con PBS, proteína de OVA o vacuna de ARNm de OVA, y se aislaron las células (incluidas las células T activadas) del bazo y los ganglios linfáticos y se aplicaron para comprobar el estado de estimulación de las células T y la actividad de eliminación de las células tumorales. En la FIG. 18A, la secreción de interferón-y después de que las células aisladas fueran desafiadas (es decir, coincubadas) con péptidos de antígenos específicos de OVA OTI y OTII. En la FIG. 18B, la coincubación de células T aisladas con células tumorales B16-OVA, y se midió la viabilidad celular;
La FIG. 19 muestra ratones C57BL6 con metástasis pulmonares del tumor B16-OVA que se trataron 3 veces con la vacuna de ARNm de OVA (en los días 3, 7 y 10). Los ratones se sacrificaron el día 18 y se contaron los nódulos tumorales en el pulmón. La línea de tiempo superior muestra el programa de tratamiento. En el centro de la imagen se muestran pulmones representativos del grupo de control con PBS y del grupo de tratamiento con la vacuna de ARNm de OVA; para comparar se muestra la cuantificación, basada en el número de nódulos tumorales en el pulmón;
La FIG. 20 muestra un esquema ejemplar de una estructura de vacuna de acuerdo con un aspecto particular de la presente divulgación. En ella, se puede visualizar una visión general de la nanopartícula vacunal de ARNm compuesta por (1) el núcleo de ARNm en el centro, (2) la cubierta lipídica en el exterior (con o sin la fracción de orientación), y (3) moléculas pequeñas y/o proteínas en el medio; y
La FIG. 21 muestra que el empaquetamiento conjunto del ARNm que codifica la IL12p70 promueve aún más la actividad de la vacuna de ARNm en comparación con la vacuna de un solo antígeno.
Breve descripción de las secuencias:
La SEC. ID Núm.:1 es un epítopo de células T citotóxicas ejemplar derivado del péptido TP53 de tipo salvaje, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.: 2 es un epítopo ejemplar de células T citotóxicas derivado del péptido TP53 mutado, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.:3 es un epítopo de células T citotóxicas ejemplar derivado del péptido TP53 de tipo salvaje, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.: 4 es un epítopo ejemplar de células T citotóxicas derivado del péptido TP53 mutado, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.:5 es un epítopo de células T citotóxicas ejemplar derivado del péptido PIK3CA de tipo salvaje, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.: 6 es un epítopo ejemplar de células T citotóxicas derivado del péptido PIK3CA mutado, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.:7 es un epítopo de células T citotóxicas ejemplar derivado del péptido PIK3CA de tipo salvaje, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.: 8 es un epítopo ejemplar de células T citotóxicas derivado del péptido PIK3CA mutado, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación;
La SEC. ID Núm.: 9 es un epítopo ejemplar de células T citotóxicas derivado del péptido PTEN de tipo salvaje, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación; y
La SEC. ID Núm.: 10 es un epítopo ejemplar de células T citotóxicas derivado del péptido PTEN mutado, y que es útil de acuerdo con uno o más aspectos de la presente divulgación.
Descripción de las realizaciones ilustrativas
A continuación se describen realizaciones ilustrativas de la invención. En aras de la claridad, no se describen en esta memoria descriptiva todas las características de una implementación real. Por supuesto, se apreciará que en el desarrollo de cualquier realización real de este tipo, se deben tomar numerosas decisiones específicas de implementación para lograr los objetivos específicos de los desarrolladores, tal como el cumplimiento de las restricciones relacionadas con el sistema y con el negocio, que variarán de una implementación a otra. Además, se apreciará que tal esfuerzo de desarrollo podría ser complejo y requerir mucho tiempo, pero sería una tarea rutinaria para aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica que tengan el beneficio de esta divulgación.
Cáncer
El cáncer es posiblemente una de las mayores amenazas mundiales para la salud pública. La metástasis del cáncer es una característica clave de la malignidad y contribuye a más del 90% de las muertes relacionadas con los tumores sólidos. Debido a los mecanismos poco conocidos de la metástasis del cáncer, no se dispone de una firma de diagnóstico/pronóstico ni de un tratamiento específico para controlar eficazmente la metástasis tumoral. De hecho, la metástasis es un proceso complejo que implica una secuencia bien coordinada de acontecimientos en los que algunas células tumorales abandonan la lesión primaria y se instalan en lugares distales. Dado que no todas las células de los tumores primarios tienen la capacidad de metastatizar, se razona que las células cancerosas metastásicas pueden poseer características especiales que pueden proporcionar valiosos objetivos terapéuticos. Vacunas terapéuticas contra el cáncer basadas en ARNm
Las vacunas terapéuticas contra el cáncer basadas en ARNm tienen la ventaja de desencadenar una inmunidad anticancerosa robusta sin el peligro potencial de integración del genoma de las vacunas de ADN o la limitación de la selección de antígenos de las vacunas peptídicas. Sin embargo, una vacuna convencional de ARNm compuesta por moléculas de ARNm condensadas en una estructura central de proteína cargada positivamente no es internalizada eficazmente por las células presentadoras de antígenos y, por lo tanto, no puede ofrecer suficiente protección a las moléculas de ARNm contra la degradación por las enzimas plasmáticas y tisulares.
Composiciones de lipopolímeros para el empaquetado de ARNm
En un aspecto, la presente divulgación proporciona sistemas de suministro de lipopoliplex (LPP) y de cáscara/núcleo basados en proteínas que están diseñados para empaquetar moléculas de ácido nucleico (que incluyen, por ejemplo, ARNm), en un “núcleo” poliplex de polímero que luego se carga en una estructura de “cáscara” que está compuesta por una bicapa de fosfolípidos. Un sistema ilustrativo se muestra en la FIG. 1A, y un esquema generalizado de dichos sistemas de administración de vacunas se muestra en la FIG. 20. Estas composiciones no sólo pueden proteger las moléculas de ARNm dentro de la estructura del núcleo del poliplex hidrofóbico contra el ataque de los ARN y su posterior degradación, sino que la presencia de una estructura envolvente de bicapa de fosfolípidos que rodea el núcleo también sirve para internalizar de forma más eficiente el vector por parte de las células presentadoras de antígenos (que incluyen, sin limitación, macrófagos, células B, células dendríticas y similares), y facilitar el transporte de la partícula a través del sistema vesicular, y la liberación final de las moléculas de ARNm de la estructura del núcleo al citosol para facilitar la producción del antígeno o antígenos codificados. En el Ejemplo 1, se ha caracterizado sistemáticamente la composición y la morfología de los LPP particulares, y también se ha estudiado la captación celular de los LPP/ARNm por parte de las DC y la síntesis proteica resultante en las DC del antígeno peptídico codificado. Por medio de la aplicación de la ovoalbúmina (OVA) como un modelo de antígeno, se examinaron las respuestas inmunitarias a la vacuna de ARNm LPP/OVA en cultivo celular, y también se evaluó la inmunidad antitumoral en un modelo murino de metástasis pulmonar de melanoma que se estableció con células de melanoma B16 que expresaban OVA.
Formulaciones farmacéuticas
En ciertas realizaciones, la presente divulgación se refiere a composiciones de administración de vacunas preparadas en formulaciones aceptables para uso farmacéutico para su administración a una o más células o tejidos de un animal, ya sea sola o en combinación con una o más modalidades de diagnóstico, profilaxis y/o terapia. La formulación de excipientes y soluciones portadoras aceptables para uso farmacéutico es muy conocida por los expertos en la técnica, al igual que el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones de vacunas basadas en ARNm -LPP descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de diagnóstico y diagnóstico del cáncer.
En determinadas circunstancias, será deseable administrar los sistemas de administración de vacunas basados en el núcleo de polímero/capas bicapa de fosfolípidos desvelados en vehículos farmacéuticos convenientemente formulados por medio de uno o más dispositivos de administración estándar, que incluyen, sin limitación, por vía subcutánea, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, transdérmica, tópica, por inhalación oral o nasal, o por inyección directa a una o más células, tejidos u órganos dentro o alrededor del cuerpo de un animal, y preferentemente de un humano.
Los procedimientos de administración también pueden incluir las modalidades descritas en Patente de los Estados Unidos Núm. 5.543.1585.641.515y 5.399.363. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua estéril, y se pueden mezclar adecuadamente con uno o más tensioactivos, tal como la hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, aceites o mezclas de los mismos. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Para la administración de una solución acuosa inyectable, sin limitación, la solución puede ser adecuadamente tamponada, si es necesario, y el diluyente líquido primero se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, subdérmica y/o intraperitoneal. A este respecto, las composiciones de la presente invención se pueden formular en uno o más vehículos aceptables para uso farmacéutico, que incluyen por ejemplo medios acuosos estériles, tampones, diluyentes, etc. Por ejemplo, una dosis dada de ingrediente(s) activo(s) se puede disolver en un volumen particular de una solución isotónica (por ejemplo, una solución isotónica basada en NaCl), y luego inyectarse en el sitio de administración propuesto, o diluirse aún más en un vehículo adecuado para infusión intravenosa (véase, por ejemplo, “REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES” 15ta edición, págs. 1035 a 1038 y 1570 a 1580). Aunque necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del individuo tratado, la extensión del tratamiento y el lugar de administración, la persona responsable de la administración podrá, no obstante, determinar los regímenes de dosificación correctos y apropiados para el individuo individual mediante el uso de los conocimientos ordinarios en las artes médicas y farmacéuticas.
Las composiciones inyectables estériles se pueden preparar por medio de la incorporación de las composiciones de vacunas desveladas en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, de acuerdo con lo necesario, seguido por una esterilización filtrada. Por lo general, las dispersiones se pueden preparar por medio de la incorporación del o los principios activos esterilizados seleccionados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. Las composiciones de vacunas desveladas en la presente memoria también se pueden formular en forma neutra o de sal.
Las sales aceptables para uso farmacéutico incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos aminos libres de la proteína), y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, sin limitación, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos tales como, sin limitación, acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilos libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, sin limitación, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de forma compatible con la formulación de la dosis, y en la cantidad que sea eficaz para la aplicación prevista. Las formulaciones de los compuestos de la presente invención se pueden administrar fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, preparaciones tópicas, formulaciones orales, que incluyen cápsulas de liberación sostenida, hidrogeles, coloides, geles viscosos, reactivos transdérmicos, formulaciones intranasales y de inhalación, y similares.
La cantidad, el régimen de dosificación, la formulación y la administración de las composiciones de vacunas desveladas en la presente memoria estarán dentro del ámbito de los expertos en la técnica que se benefician de la presente enseñanza. Sin embargo, es probable que la administración de una cantidad diagnósticamente eficaz (es decir, eficaz para uso farmacéutico) de una o más de las composiciones de vacunas basadas en ARNm desveladas se pueda lograr por medio de una única administración, tal como, sin limitación, una única inyección de una cantidad suficiente del agente administrado para proporcionar el beneficio deseado al paciente que lo necesita. Alternativamente, en algunas circunstancias, puede ser deseable proporcionar múltiples, o sucesivas administraciones de las composiciones desveladas, ya sea durante un período relativamente corto, o incluso un período relativamente prolongado, como puede ser determinado por el médico que supervisa la administración de dichas composiciones al individuo seleccionado que se somete a dicho(s) procedimiento(s).
Típicamente, las formulaciones de uno o más de los sistemas de administración de vacunas basados en núcleo de polímero/cáscara de bicapa de fosfolípido descritos en la presente memoria contendrán al menos una cantidad efectiva de un primer agente activo. Preferentemente, la formulación puede contener al menos un 0,001% de cada ingrediente activo, preferentemente al menos un 0,01% del ingrediente activo, aunque se puede variar el porcentaje del ingrediente(s) activo(s), por supuesto, , y puede convenientemente estar presente en cantidades de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 90% en peso o volumen, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 80 % en peso o volumen, o más preferentemente, de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 60% en peso o volumen, basado en la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composición se puede preparar de forma que se obtenga una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria del compuesto. Factores tales como la solubilidad, la biodisponibilidad, la t1/2 biológica, la vía de administración, la vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán contempladas por los expertos en la técnica de preparar tales formulaciones farmacéuticas, y como tal, una variedad de dosis y regímenes de tratamiento pueden ser deseables. En las realizaciones preferentes, el agente activo es un componente de la vacuna de ARNm incluido en el polímero interior.
Aunque se contempla que la administración sistémica es eficaz en muchas realizaciones de la invención, también se contempla que las formulaciones desveladas en la presente memoria sean adecuadas para la inyección directa en uno o más órganos, tejidos o tipos de células del cuerpo. La administración directa de las composiciones desveladas a lugares discretos particulares dentro del cuerpo, o directamente a los tejidos tumorales o cancerosos, por ejemplo, se puede llevar a cabo mediante el uso de medios adecuados conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en las artes médicas oncológicas pertinentes.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender además uno o más excipientes, tampones o diluyentes que están particularmente formulados para el contacto con células de mamíferos, y en particular con células humanas, y/o para la administración a un individuo mamífero, tal como un paciente humano. Las composiciones pueden comprender además opcionalmente uno o más agentes de diagnóstico o pronóstico, y/o pueden estar formuladas dentro de una población de microesferas, micropartículas, nanoesferas o nanopartículas, y pueden estar formuladas para su administración a una o más células, tejidos, órganos o cuerpo de un ser humano en particular.
La formulación de excipientes y soluciones portadoras aceptables para uso farmacéutico es muy conocida por los expertos en la técnica, al igual que el desarrollo de regímenes adecuados de dosificación, diagnóstico y/o tratamiento para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de modalidades, que incluyen, por ejemplo, sin limitación, las rutas de administración oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intratumoral e intramuscular.
La cantidad particular de las composiciones empleadas, y el tiempo particular de administración, o el régimen de dosificación para las composiciones que emplean las formulaciones de vacunas desveladas estarán dentro del ámbito de una persona de habilidad ordinaria en la técnica que tenga el beneficio de la presente enseñanza. Sin embargo, es probable que la administración de las formulaciones desveladas se pueda lograr por medio de la administración de una o más dosis de la formulación, durante un tiempo eficaz para proporcionar el beneficio deseado al paciente que se somete a dicho tratamiento. Dichos regímenes de dosificación pueden ser determinados por el médico que supervisa la administración de los compuestos, dependiendo de la afección particular o del paciente, el alcance o la duración de la terapia que se está administrando, etc.
Las formulaciones farmacéuticas que comprenden uno o más ingredientes activos, como se desvela en la presente memoria, no se limitan en modo alguno a su uso sólo en seres humanos, o incluso en primates, o mamíferos. En ciertas realizaciones, los procedimientos y composiciones en la presente memoria desvelados se pueden emplear mediante el uso de especies de aves, anfibios, reptiles u otros animales. En realizaciones preferentes, sin embargo, las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para su administración a un mamífero, y en particular, a los seres humanos, en una variedad de regímenes para modular el potencial metastásico de las células cancerosas. Como se ha indicado anteriormente, dichas composiciones no se limitan únicamente a su uso en seres humanos, sino que también se pueden formular para su administración veterinaria, que incluyen, sin limitación, a ganado seleccionado, animales exóticos o domesticados, animales de compañía (que incluyen mascotas y similares), primates no humanos, así como especímenes zoológicos o en cautiverio, y similares.
Composiciones para la preparación de medicamentos
Otro aspecto importante de la presente invención se refiere a los procedimientos para utilizar las composiciones desveladas (así como las formulaciones que las incluyen) en la preparación de medicamentos para prevenir, diagnosticar, tratar y/o mejorar uno o más síntomas de una o más enfermedades, disfunciones, afecciones anormales o trastornos en un animal, que incluyen, por ejemplo, mamíferos vertebrados. El uso de las composiciones desveladas se contempla particularmente en el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer, en la detección o predicción de la metástasis del cáncer o en la supervisión de su extensión, y/o para la supresión del potencial metastásico de uno o más tipos de células cancerosas.
Dicho uso generalmente implica la administración al mamífero que lo necesita de una o más de las composiciones de vacunas desveladas, en una cantidad y durante un tiempo suficientes para diagnosticar, tratar, disminuir o mejorar uno o más síntomas de cáncer en un mamífero afectado.
Las formulaciones farmacéuticas que incluyen una o más de las composiciones de vacunas basadas en ARNm desveladas también forman parte de la presente invención, y particularmente aquellas composiciones que incluyen además al menos un primer excipiente aceptable para uso farmacéutico para su uso en la terapia y/o mejora de uno o más síntomas de cáncer en un mamífero afectado.
Definiciones ejemplares
De acuerdo con la presente invención, los polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico y similares incluyen, pero no se limitan a, ADN (que incluyen y no limitándose a ADN genómico o extragenómico), genes, ácidos nucleicos peptídicos (ARP), ARN (que incluyen, pero sin limitarse a los ARNr, ARNm y ARNt), nucleósidos y segmentos de ácidos nucleicos adecuados, ya sean obtenidos de fuentes naturales, sintetizados químicamente, modificados o preparados o sintetizados de otro modo, total o parcialmente, por la mano del hombre.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a los expertos una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, (2da Ed.) J. Stenesh (Ed.), Wiley-Interscience (1989) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (3ra Ed.), P. Singleton y D. Sainsbury (Eds.), Wiley-Interscience (2007) Chambers Dictionary of Science and Technology (2da Ed.), P. Walker (Ed.), Chambers (2007) Glossary of Genetics (5ta Ed.), R. Rieger et al. (Eds.), Springer-Verlag (1991); y The Harper-Collins Dictionary of Biology, W.G. Hale y J.P. Margham, (Eds.), Harper-Collins (1991).
Aunque cualquier procedimiento y composición similar o equivalente a los descritos en la presente memoria se puede utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los procedimientos preferentes, y las composiciones se describen en la presente memoria. A efectos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación en aras de la claridad y la facilidad de referencia:
De acuerdo con la convención del derecho de patentes de larga data, las palabras “un” y “una”, cuando se utilizan en esta solicitud, incluidas las reivindicaciones, denotan “uno o más”
Los términos “aproximadamente” y “aproximadamente”, como se utilizan en la presente memoria, son intercambiables y, en general, se debe entender que se refieren a un intervalo de números en torno a un número determinado, así como a todos los números de un intervalo de números recitado (por ejemplo, “aproximadamente de 5 a 15” significa “aproximadamente de 5 a aproximadamente 15”, a menos que se indique lo contrario). Además, se debe entender que todos los intervalos numéricos de la presente memoria incluyen cada número entero dentro del intervalo.
Como se utiliza en la presente memoria, un “polipéptido antigénico” o un “polipéptido inmunogénico” es un polipéptido que, cuando se introduce en un vertebrado, reacciona con las moléculas del sistema inmunitario del vertebrado, es decir, es antigénico, y/o induce una respuesta inmunitaria en el vertebrado, es decir, es inmunogénico.
“Biocompatible” se refiere a un material que, cuando se expone a células vivas, soportará una actividad celular apropiada de las células sin causar un efecto indeseable en las mismas, tal como un cambio en un ciclo de vida de las células, un cambio en una tasa de proliferación de las mismas o un efecto citotóxico.
El término “equivalente biológico-funcional” es muy conocido en la técnica, y se define con más detalle en la presente memoria. En consecuencia, las secuencias que tienen entre un 85% y un 90% aproximadamente; o más preferentemente, entre un 91% y un 95% aproximadamente; o incluso más preferentemente, entre un 96% y un 99% aproximadamente; de nucleótidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a una o más de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria se contemplan particularmente para ser útiles en la práctica de los procedimientos y composiciones establecidos en la presente solicitud.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “tampón” incluye una o más composiciones, o soluciones acuosas de las mismas, que resisten la fluctuación del pH cuando se añade un ácido o un álcali a la solución o composición que incluye el tampón. Esta resistencia al cambio de pH se debe a las propiedades amortiguadoras de dichas soluciones, y puede ser una función de uno o más compuestos específicos incluidos en la composición. De este modo, las soluciones u otras composiciones que presentan una actividad amortiguadora se denominan tampones o soluciones amortiguadoras. Los tampones generalmente no tienen una capacidad ilimitada para mantener el pH de una solución o composición; más bien, suelen ser capaces de mantener el pH dentro de ciertos intervalos, por ejemplo de un pH de aproximadamente 5 a 7.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “portador” pretende incluir cualquier disolvente, medio de dispersión, revestimiento, diluyente, tampón, agente isotónico, solución, suspensión, coloide, inerte, o similares, o una combinación de los mismos que sea aceptable para uso farmacéutico para la administración al animal correspondiente o aceptable para un propósito terapéutico o de diagnóstico, de acuerdo con el caso.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “segmento de ADN” se refiere a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN obtenido a partir de una muestra biológica mediante el uso de una de las composiciones desveladas en la presente memoria se refiere a uno o más segmentos de ADN que han sido aislados de, o purificados libres de, el a Dn genómico total de la especie particular de la que se obtienen. El término “segmento de ADN” incluye segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, así como vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus y similares.
El término “cantidad efectiva”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cantidad que es capaz de tratar o mejorar una enfermedad o afección o que de otro modo es capaz de producir un efecto terapéutico previsto. Como se utiliza en la presente memoria, el término “epítopo” se refiere a la porción de una sustancia inmunógena dada que es el objetivo de, es decir, está unida por un anticuerpo o receptor de superficie celular de un sistema inmunitario del huésped que ha montado una respuesta inmunitaria a la sustancia inmunógena dada, como se determina por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Además, un epítopo se puede definir como una porción de una sustancia inmunógena que provoca una respuesta de anticuerpos o induce una respuesta de células T en un animal, de acuerdo con se determine por cualquier procedimiento disponible en la técnica (véase, por ejemplo, Geysen et al., 1984). Un epítopo puede ser una porción de cualquier sustancia inmunógena, tal como una proteína, un polinucleótido, un polisacárido, una sustancia química orgánica o inorgánica, o cualquier combinación de las mismas. El término “epítopo” también se puede utilizar indistintamente como “determinante antigénico” o “sitio determinante antigénico”
El término “por ejemplo” o “por ejemplo”, como se utiliza en la presente memoria, se emplea simplemente a modo de ejemplo, sin intención de limitación, y no se debe interpretar como referido únicamente a los elementos explícitamente enumerados en la memoria descriptiva.
Como se utiliza en la presente memoria, un “heterólogo” se define en relación con una secuencia de ácido nucleico de referencia predeterminada. Por ejemplo, con respecto a la secuencia de un gen estructural, un promotor heterólogo se define como un promotor que no se encuentra naturalmente adyacente al gen estructural referenciado, sino que se posiciona por manipulación de laboratorio. Asimismo, un gen o segmento de ácido nucleico heterólogo se define como un gen o segmento que no se encuentra naturalmente adyacente a los elementos promotores y/o potenciadores referenciados.
Como se utiliza en la presente memoria, “homólogo” significa, cuando se refiere a polinucleótidos, secuencias que tienen la misma secuencia esencial de nucleótidos, a pesar de surgir de diferentes orígenes. Normalmente, las secuencias de ácido nucleico homólogas se derivan de genes u organismos estrechamente relacionados que poseen una o más secuencias genómicas sustancialmente similares. Por el contrario, un polinucleótido “análogo” es aquel que comparte la misma función con un polinucleótido de una especie u organismo diferente, pero que puede tener una secuencia primaria de nucleótidos significativamente diferente que codifica una o más proteínas o polipéptidos que cumplen funciones similares o poseen una actividad biológica similar. Los polinucleótidos análogos se pueden derivar a menudo de dos o más organismos que no están estrechamente relacionados (por ejemplo, genética o filogenéticamente).
Como se utiliza en la presente memoria, el término “homología” se refiere a un grado de complementariedad entre dos o más secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas. La palabra “identidad” puede sustituir a la palabra “homología” cuando una primera secuencia de ácido nucleico o aminoácido tiene exactamente la misma secuencia primaria que una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácido. La homología y la identidad de secuencias se pueden determinar por medio del análisis de dos o más secuencias por medio de algoritmos y programas informáticos conocidos en la técnica. Estos procedimientos se pueden utilizar para evaluar si una secuencia determinada es idéntica u homóloga a otra secuencia seleccionada.
Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para obtener la máxima correspondencia, de acuerdo con lo medido mediante el uso de uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (u otros algoritmos disponibles para personas con conocimientos ordinarios) o por medio de inspección visual.
Como se utiliza en la presente memoria, la frase “en necesidad de tratamiento” se refiere a un juicio realizado por un cuidador, tal como un médico o veterinario, de que un paciente requiere (o se beneficiará de una o más maneras) de un tratamiento. Dicho juicio puede estar basado en una variedad de factores que están en el ámbito de la experiencia del cuidador, y puede incluir el conocimiento de que el paciente está enfermo como resultado de un estado de enfermedad que es tratable por uno o más compuestos o composiciones farmacéuticas tales como las que se exponen en la presente memoria.
Las frases “aislado” o “biológicamente puro” se refieren al material que está sustancialmente, o esencialmente, libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. Así, los polinucleótidos o polipéptidos aislados de acuerdo con la presente divulgación preferentemente no contienen materiales normalmente asociados con esos polinucleótidos o polipéptidos en su entorno natural, o in situ .
Como se utiliza en la presente memoria, el término “kit” se puede utilizar para describir variaciones del recinto portátil y autónomo que incluye al menos un conjunto de reactivos, componentes o composiciones formuladas para uso farmacéutico de la presente invención. Opcionalmente, dicho kit puede incluir uno o más conjuntos de instrucciones para el uso de las composiciones adjuntas, tal como, por ejemplo, en una aplicación de laboratorio o clínica.
Los términos “enlace” o “unión” se refieren a cualquier procedimiento conocido en la técnica para conectar funcionalmente una o más proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o polinucleótidos, que incluyen, sin limitación, la fusión recombinante, la unión covalente, la unión disulfuro, la unión iónica, la unión de hidrógeno, la unión electrostática y similares.
El término “de origen natural”, como se utiliza en la presente memoria aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o una secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por la mano del hombre en un laboratorio es de origen natural. Como se utiliza en la presente memoria, las cepas de roedores de laboratorio que pueden haber sido criadas selectivamente de acuerdo con la genética clásica se consideran animales de origen natural.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ácido nucleico” incluye uno o más tipos de: polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-deoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glicósido de una base de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas (que incluyen sitios abásicos). El término “ácido nucleico”, como se utiliza en la presente memoria, también incluye polímeros de ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos que están unidos covalentemente, normalmente por enlaces fosfodiéster entre subunidades, pero en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. Los “ácidos nucleicos” incluyen el ADN de cadena simple y doble, así como el ARN de cadena simple y doble. Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen, sin limitación, ADNg; ARNhn; ARNm; ARNr, ARNt, ARN micro (ARNmi), ARN de interferencia pequeño (ARNsi), ARN nucleolar pequeño (ARNsnO), ARN nuclear pequeño (ARNsn), y ARN temporal pequeño (ARNst), y similares, y cualquier combinación de los mismos.
El término “operablemente enlazado”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son típicamente contiguas, o sustancialmente contiguas, y, cuando es necesario para unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, dado que los potenciadores suelen funcionar cuando están separados del promotor por diversos kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar unidos de forma operativa pero no contigua.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “paciente” (también denominado indistintamente “receptor” “huésped” o “individuo”) se refiere a cualquier huésped que pueda servir como receptor de uno o más de los dispositivos de acceso vascular como se discute en la presente memoria. En ciertos aspectos, el receptor será un animal vertebrado, lo que denota cualquier especie animal (y preferentemente, una especie de mamífero tal como el ser humano). En ciertas realizaciones, un “paciente” se refiere a cualquier huésped animal, que incluye, pero sin limitarse a, primates humanos y no humanos, aves, reptiles, anfibios, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, córvidos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, murinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos y similares, incluidos, sin limitación, el ganado doméstico, los animales de rebaño o migratorios o las aves, los exóticos o los especímenes zoológicos, así como los animales de compañía, las mascotas y cualquier animal bajo el cuidado de un veterinario.
La frase “aceptable para uso farmacéutico” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción alérgica o similar cuando se administran a un ser humano, y en particular, cuando se administran al ojo humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es muy conocida en la técnica. Normalmente, estas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o como suspensiones. Alternativamente, se pueden preparar en forma sólida adecuada para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección.
Como se utiliza en la presente memoria, “sal aceptable para uso farmacéutico” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de tales sales incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, y similares; y sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico (embónico), ácido algínico, ácido naftóico, ácido poliglutámico, ácidos naftalenosulfónicos, ácidos naftalenodisulfónicos, ácido poligalacturónico; sales con cationes metálicos polivalentes tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares; sales formadas con un catión orgánico formado por N,N'-dibencilendiamina o etilendiamina; y combinaciones de los mismos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “plásmido” o “vector” se refiere a una construcción genética que está compuesta por material genético (es decir, ácidos nucleicos). Típicamente, un plásmido o un vector contiene un origen de replicación que es funcional en las células huésped bacterianas, por ejemplo, Escherichia coli, y marcadores seleccionables para detectar las células huésped bacterianas que incluyen el plásmido. Los plásmidos y vectores de la presente invención pueden incluir uno o más elementos genéticos como los descritos en la presente memoria, dispuestos de forma que una secuencia codificadora insertada se pueda transcribir y traducir en una célula de expresión adecuada. Además, el plásmido o vector puede incluir uno o más segmentos de ácido nucleico, genes, promotores, potenciadores, activadores, regiones de clonación múltiple, o cualquier combinación de los mismos, que incluyen segmentos obtenidos o derivados de una o más fuentes naturales y/o artificiales.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “polipéptido” pretende abarcar un “polipéptido” singular así como “polipéptidos” plurales, e incluye cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos. Por lo tanto, como se utiliza en la presente memoria, los términos que incluyen, pero no se limitan a “péptido”, “dipéptido”, “tripéptido”, “proteína”, “enzima”, “cadena de aminoácidos” y “secuencia de aminoácidos contigua” se engloban dentro de la definición de “polipéptido”, y el término “polipéptido” se puede utilizar en lugar de, o de forma intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término incluye, además, polipéptidos que han sufrido una o más modificaciones postraduccionales, que incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación, escisión proteolítica, procesamiento postraduccional o modificación por inclusión de uno o más aminoácidos no naturales. Existe una nomenclatura convencional en la técnica para las estructuras polinucleotídicas y polipeptídicas.
Por ejemplo, las abreviaturas de una y tres letras se emplean ampliamente para describir los aminoácidos: Alanina (A; Ala), Arginina (R; Arg), Asparagina (N; Asn), Ácido aspártico (D; Asp), Cisteína (C; Cys), Glutamina (Q; Gln), Ácido glutámico (E; Glu), Glicina (G; Gly), Histidina (H; His), Isoleucina (I; Ile), Leucina (L; Leu), Metionina (M; Met), Fenilalanina (F; Phe), Prolina (P; Pro), Serina (S; Ser), Treonina (T; Thr), Triptófano (W; Trp), Tirosina (Y; Tyr), Valina (V; Val) y Lisina (K; Lys). Se prefiere que los residuos de aminoácidos en la presente memoria descritos estén en la forma isomérica “1”. Sin embargo, los residuos de la forma isomérica “d” pueden ser sustituidos por residuos de 1-aminoácidos a condición de que se mantengan las propiedades deseadas del polipéptido.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “prevenir”, “prevención”, “suprimir” y “supresión”, como se utilizan en la presente memoria, se refieren a la administración de un compuesto, ya sea solo o contenido en una composición farmacéutica, antes de la aparición de los síntomas clínicos de un estado de enfermedad, con el fin de prevenir cualquier síntoma, aspecto o característica del estado de enfermedad. No es necesario que esta prevención y supresión sean absolutas para que se consideren médicamente útiles.
El término “proteína” se utiliza en la presente memoria indistintamente con “péptido” y “polipéptido”, e incluye tanto los péptidos y polipéptidos producidos sintéticamente, recombinantemente o in vitro, como los péptidos y polipéptidos expresados in vivo tras la administración de secuencias de ácido nucleico a un animal o individuo humano. El término “polipéptido” se refiere preferentemente a cualquier longitud de cadena de aminoácidos, incluidos los péptidos cortos de entre dos y 20 residuos de aminoácidos, los oligopéptidos de entre 10 y 100 residuos de aminoácidos y los polipéptidos más largos de entre 100 residuos de aminoácidos o más. Además, el término también pretende incluir las enzimas, es decir, las biomoléculas funcionales que incluyen al menos un polímero de aminoácidos. Los polipéptidos y proteínas de la presente invención también incluyen polipéptidos y proteínas que son o han sido modificados post-translacionalmente, e incluyen cualquier azúcar u otro(s) derivado(s) o conjugado(s) añadido(s) a la cadena de aminoácidos de la columna vertebral.
El término “Purificado”, como se utiliza en la presente memoria, significa separado de muchos otros compuestos o entidades. Un compuesto o entidad puede estar parcialmente purificado, sustancialmente purificado o puro. Un compuesto o entidad se considera puro cuando se le han quitado prácticamente todos los demás compuestos o entidades, es decir, es preferente que tenga una pureza de al menos un 90%, más preferentemente de al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior al 99%. Un compuesto o entidad parcial o sustancialmente purificado puede ser eliminado de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70% o al menos el 80% del material con el que se encuentra naturalmente, por ejemplo, material celular tales como proteínas celulares y/o ácidos nucleicos.
El término “recombinante” indica que el material (por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido) ha sido alterado artificial o sintéticamente (no naturalmente) por la intervención humana. La alteración se puede llevar a cabo en el material dentro o fuera de su entorno natural, o estado nativo. En concreto, por ejemplo, una secuencia promotora es “recombinante” cuando se produce por la expresión de un segmento de ácido nucleico diseñado por la mano del hombre. Por ejemplo, un “ácido nucleico recombinante” es aquel que se fabrica por medio de la recombinación de ácidos nucleicos, por ejemplo durante la clonación, la mezcla de ADN u otros procedimientos, o por medio de mutagénesis química o de otro tipo; un “polipéptido recombinante” o “proteína recombinante” es un polipéptido o proteína que se produce por expresión de un ácido nucleico recombinante; y un “virus recombinante”, por ejemplo, un virus AAV recombinante, se produce por expresión de un ácido nucleico recombinante.
El término “elemento regulador”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una región o regiones de una secuencia de ácido nucleico que regula la transcripción. Los elementos reguladores ejemplares incluyen, entre otros, potenciadores, elementos postranscripcionales, secuencias de control transcripcional y similares.
El término “segmento de ARN” se refiere a una molécula de ARN que se ha aislado libre de ARN celular total de una especie particular. Por lo tanto, los segmentos de ARN se pueden referir a uno o más segmentos de ARN (ya sea de origen nativo o sintético) que se han aislado o purificado libres de otros ARN. El término “segmento de ARN” incluye segmentos de ARN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos.
El término “secuencia”, cuando se refiere a los aminoácidos, se refiere a todo o a una parte del orden lineal N-terminal a C-terminal de los aminoácidos dentro de una cadena de aminoácidos dada, por ejemplo, un polipéptido o una proteína; “subsecuencia” significa cualquier tramo consecutivo de aminoácidos dentro de una secuencia, por ejemplo, al menos 3 aminoácidos consecutivos dentro de una secuencia proteica o polipeptídica dada. Con referencia a las cadenas de nucleótidos, “secuencia” y “subsecuencia” tienen significados similares relacionados con el orden 5' a 3' de los nucleótidos.
El término “una secuencia esencialmente como se establece en la SEC. ID Núm.: X” significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de la SEC. ID Núm.: X y tiene relativamente pocos nucleótidos (o aminoácidos en el caso de secuencias polipeptídicas) que no son idénticos a, o un equivalente biológicamente funcional de, los nucleótidos (o aminoácidos) de la s Ec . ID Núm.: X. El término “equivalente biológicamente funcional” es muy conocido en la técnica, y se define con más detalle en la presente memoria. En consecuencia, las secuencias que tienen entre aproximadamente 85% y aproximadamente 90%; o más preferentemente, entre aproximadamente 91% y aproximadamente 95%; o incluso más preferentemente, entre aproximadamente 96% y aproximadamente 99%; de nucleótidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a una o más de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria se contemplan particularmente para ser útiles en la práctica de la invención.
Las condiciones de hibridación estándar adecuadas para los ácidos nucleicos para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, hibridación en formamida al 50%, solución de Denhardt al 5*, SSC al 5*, fosfato de sodio al 25 mM, SDS al 0,1% y 100 pg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42 °C durante 16 hs, seguido por lavados secuenciales de 1 hora con solución de SSC al 0,1*, SDS al 0,1% a 60 °C para eliminar la cantidad deseada de señal de fondo. Las condiciones de hibridación de menor rigor para la presente invención incluyen, por ejemplo, la hibridación en formamida al 35%, solución de Denhardt al 5*, SSC al 5*, fosfato sódico al 25 mM, SDS al 0,1% y 100 pg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado o ADN de E. coli a 42 °C durante 16 hs, seguido por lavados secuenciales con SSC al 0,8*, SDS al 0,1% a 55 °C. Los expertos en la técnica reconocerán que dichas condiciones de hibridación se pueden ajustar fácilmente para obtener el nivel de rigor deseado para una aplicación particular.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “gen estructural” pretende describir en general un polinucleótido, tal como un gen, que se expresa para producir un péptido, polipéptido, proteína, ribozima, molécula de ARN catalítico o molécula antisentido codificada.
El término “individuo”, como se utiliza en la presente memoria, describe un organismo, que incluye mamíferos tales como los primates, al que se le puede proporcionar un tratamiento con las composiciones de acuerdo con la presente invención. Las especies de mamíferos que se pueden beneficiar de los procedimientos de tratamiento desvelados incluyen, pero no se limitan a, simios; chimpancés; orangutanes; seres humanos; monos; animales domésticos tales como perros y gatos; ganado tales como caballos, ganado vacuno, cerdos, ovejas, cabras y pollos; y otros animales tales como ratones, ratas, cobayas y hámsteres.
El término “sustancialmente complementario”, cuando se utiliza para definir secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, significa que una secuencia particular del individuo, por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos, es sustancialmente complementaria a toda o a una parte de la secuencia seleccionada, y por lo tanto se unirá específicamente a una porción de un ARNm que codifica la secuencia seleccionada. Como tal, típicamente las secuencias serán altamente complementarias a la secuencia “objetivo” del ARNm, y no tendrán más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 bases erróneas en la parte complementaria de la secuencia. En muchos casos, puede ser deseable que las secuencias sean coincidencias exactas, es decir, que sean completamente complementarias a la secuencia a la que se une específicamente el oligonucleótido y, por lo tanto, que no haya desajustes a lo largo del tramo complementario. Como tal, las secuencias altamente complementarias se unirán típicamente de forma bastante específica a la región de la secuencia objetivo del ARNm y, por lo tanto, serán altamente eficientes en la reducción, y/o incluso en la inhibición de la traducción de la secuencia del ARNm objetivo en el producto polipeptídico.
Las secuencias de ácido nucleico sustancialmente complementarias serán superiores a aproximadamente el 80 por ciento de complementariedad (o “% de coincidencia exacta”) con una secuencia objetivo de ácido nucleico correspondiente a la que el ácido nucleico se une específicamente, y serán, más preferentemente, superiores a aproximadamente el 85 por ciento de complementariedad con la secuencia objetivo correspondiente a la que el ácido nucleico se une específicamente. En ciertos aspectos, como se ha descrito anteriormente, será deseable tener incluso más secuencias de ácido nucleico sustancialmente complementarias para su uso en la práctica de la invención, y en tales casos, las secuencias de ácido nucleico serán mayores de aproximadamente el 90 por ciento complementarias a la secuencia objetivo correspondiente a la que el ácido nucleico se une específicamente, y en ciertas realizaciones pueden ser superiores a aproximadamente el 95 por ciento complementarias a la secuencia objetivo correspondiente a la que se une específicamente el ácido nucleico, e incluso hasta e incluyendo aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, e incluso aproximadamente el 100% de coincidencia exacta complementaria a toda o una parte de la secuencia objetivo a la que se une específicamente el ácido nucleico diseñado.
El porcentaje de similitud o el porcentaje de complementariedad de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico desveladas se puede determinar, por ejemplo, por medio de la comparación de la información de la secuencia mediante el uso del programa informático GAP, versión 6.0, disponible en el Grupo Informático de Genética de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (1970). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros preferentes por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess (1986), (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para los huecos finales.
Naturalmente, la presente invención también abarca segmentos de ácido nucleico que son complementarios, esencialmente complementarios, y/o sustancialmente complementarios a por lo menos una o más de las secuencias de nucleótidos específicas en la presente memoria expuestas. Las secuencias de ácido nucleico que son “complementarias” son aquellas que son capaces de emparejarse de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad Watson-Crick. Como se utiliza en la presente memoria, el término “secuencias complementarias” significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como se puede evaluar por medio de la misma comparación de nucleótidos expuesta anteriormente, o como se define como capaz de hibridar con uno o más de los segmentos específicos de ácido nucleico desvelados en la presente memoria en condiciones relativamente estrictas tales como las descritas inmediatamente antes.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “sustancialmente libre” o “esencialmente libre” en relación con la cantidad de un componente se refiere preferentemente a una composición que contiene menos de aproximadamente el 10 por ciento en peso, preferentemente menos de aproximadamente el 5 por ciento en peso, y más preferentemente menos de aproximadamente el 1 por ciento en peso de un compuesto. En las realizaciones preferentes, estos términos se refieren a menos de aproximadamente 0,5 por ciento en peso, menos de aproximadamente 0,1 por ciento en peso o menos de aproximadamente 0,01 por ciento en peso.
Las sondas y los cebadores para su uso en la presente invención pueden ser de cualquier longitud adecuada. Por medio de la asignación de valores numéricos a una secuencia, por ejemplo, el primer residuo es 1, el segundo residuo es 2, etc., se puede proponer un algoritmo que defina todas las sondas o cebadores contenidos en una secuencia determinada:
n a n y, donde n es un número entero desde 1 hasta el último número de la secuencia e y es la longitud de la sonda o del cebador menos uno, donde n y no supera el último número de la secuencia. De este modo, para una sonda o cebador de 25 pares de bases (es decir, un “25-mer”), la colección de sondas o cebadores corresponde a las bases 1 a 25, a las bases 2 a 26, a las bases 3 a 27, a las bases 4 a 28, y así sucesivamente en toda la longitud de la secuencia. Del mismo modo, para una sonda o cebador de 35 pares de bases (es decir, un “35-mer), las secuencias ejemplares de cebadores o sondas incluyen, sin limitación, secuencias correspondientes a las bases 1 a 35, a las bases 2 a 36, a las bases 3 a 37, a las bases 4 a 38, y así sucesivamente en toda la longitud de la secuencia. Del mismo modo, para los 40-mers, dichas sondas o cebadores pueden corresponder a los nucleótidos del primer par de bases al pb 40, del segundo pb de la secuencia al pb 41, del tercer pb al pb 42, y así sucesivamente, mientras que para los 50-mers, dichas sondas o cebadores pueden corresponder a una secuencia de nucleótidos que se extienda del pb 1 al pb 50, del pb 2 al pb 51, del pb 3 al pb 52, del pb 4 al pb 53, y así sucesivamente.
Los términos “corresponde sustancialmente a”, “sustancialmente homólogo” o “identidad sustancial”, como se utilizan en la presente memoria, denotan una característica de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, en la que una secuencia de ácido nucleico o aminoácido seleccionada tiene al menos un 70 o un 75 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de ácido nucleico o aminoácido de referencia seleccionada. Más típicamente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia tendrán al menos aproximadamente el 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o incluso 85 por ciento de identidad de secuencia, y más preferentemente, al menos aproximadamente el 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, o 95 por ciento de identidad de secuencia. Más preferentemente aún, las secuencias altamente homólogas suelen compartir una identidad de secuencia mayor que al menos aproximadamente el 96, 97, 98 o 99 por ciento entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia con la que se comparó.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “sintético” significa que el material no es de origen humano o animal.
El término “período terapéutico-práctico” significa el período de tiempo necesario para que uno o más agentes activos sean terapéuticamente eficaces. El término “terapéuticamente eficaz” se refiere a la reducción de la gravedad y/o la frecuencia de uno o más síntomas, la eliminación de uno o más síntomas y/o la causa subyacente, la prevención de la aparición de los síntomas y/o su causa subyacente, y la mejora o la reparación del daño.
Un “agente terapéutico” puede ser cualquier sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que pueda producir un efecto biológico deseado en un sitio objetivo de un individuo. El agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, una citoquina, un agente citotóxico, un compuesto nucleolítico, un isótopo radiactivo, un receptor y una enzima activadora de pro-fármacos, que puede ser de origen natural, o producida por procedimientos sintéticos o recombinantes, o cualquier combinación de los mismos. Los fármacos afectados por la multirresistencia clásica, tales como los alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina y vincristina), las antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina y daunorrubicina), los inhibidores de la transcripción del ARN (por ejemplo, la actinomicina-D) y los fármacos estabilizadores de los microtúbulos (por ejemplo, el paclitaxel) pueden tener una utilidad particular como agente terapéutico. Las citoquinas también se pueden utilizar como agente terapéutico. Los ejemplos de estas citocinas son las linfocinas, las monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Un agente de quimioterapia contra el cáncer puede ser un agente terapéutico preferente. Para una descripción más detallada de los agentes anticancerígenos y otros agentes terapéuticos, se remite a los expertos en la técnica a cualquier número de manuales instructivos, que incluyen, pero sin limitarse a, el Physician's Desk Reference y a “Pharmacological Basis of Therapeutics" de Goodman y Gilman, décima edición, Hardman et al. (Eds.) (2001).
Como se utiliza en la presente memoria, un “sitio de reconocimiento del factor de transcripción” y un “sitio de unión del factor de transcripción” se refieren a una(s) secuencia(s) polinucleotídica(s) o motivo(s) de secuencia, que se identifican como sitios para la interacción específica de la secuencia de uno o más factores de transcripción, que adoptan frecuentemente la forma de unión directa proteína-ADN. Típicamente, los sitios de unión del factor de transcripción se pueden identificar por medio de huellas de ADN, ensayos de desplazamiento de movilidad en gel, y similares, y/o se pueden predecir en base a motivos de secuencias consenso conocidos, o por otros procedimientos conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica.
El término “elemento regulador transcripcional” se refiere a una secuencia polinucleotídica que activa la transcripción sola o en combinación con una o más secuencias de ácido nucleico. Un elemento regulador transcripcional puede, por ejemplo, comprender uno o más promotores, uno o más elementos de respuesta, uno o más elementos reguladores negativos, y/o uno o más potenciadores.
La “unidad transcripcional” se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende al menos un primer gen estructural unido de forma operable a al menos una primera secuencia promotora de acción cis y opcionalmente unido de forma operable a una o más secuencias de ácido nucleico de acción cis necesarias para la transcripción eficiente de las secuencias genéticas estructurales, y al menos un primer elemento regulador distal que pueda ser necesario para la transcripción apropiada, específica de tejido y de desarrollo, de la secuencia genética estructural, posicionado de forma operable bajo el control del promotor y/o de los elementos potenciadores, así como cualquier secuencia cis adicional que sea necesaria para la transcripción y traducción eficientes (por ejemplo, sitio(s) de poliadenilación, secuencia(s) de control de la estabilidad del ARNm, etc.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “transformación” pretende describir en general un proceso de introducción de una secuencia de polinucleótidos exógena (por ejemplo, un vector viral, un plásmido o una molécula de ADN o ARN recombinante) en una célula huésped o protoplasto en el que el polinucleótido exógeno se incorpora al menos a un primer cromosoma o es capaz de replicarse de forma autónoma dentro de la célula huésped transformada. La transfección, la electroporación y la captación “desnuda” de ácidos nucleicos son ejemplos de técnicas utilizadas para transformar una célula huésped con uno o más polinucleótidos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “célula transformada” se refiere a una célula huésped cuyo complemento de ácido nucleico ha sido alterado por la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en esa célula.
Los término “tratar” o “tratamiento de”, como se utilizan en la presente memoria, se refieren a proporcionar cualquier tipo de gestión médica o quirúrgica a un individuo. El tratamiento puede incluir, pero no se limita a, la administración de una composición que comprende un agente terapéutico a un individuo. El término “tratar” incluye cualquier administración o aplicación de un compuesto o composición de la invención a un individuo con fines tales como curar, revertir, aliviar, reducir la gravedad de, inhibir la progresión de, o reducir la probabilidad de una enfermedad, trastorno o afección o uno o más síntomas o manifestaciones de una enfermedad, trastorno o afección. En ciertos aspectos, las composiciones de la presente invención también se pueden administrar de forma profiláctica, es decir, antes del desarrollo de cualquier síntoma o manifestación de la enfermedad, cuando dicha profilaxis esté justificada.
Por lo general, en estos casos, el individuo será uno que ha sido diagnosticado por estar “en riesgo” de desarrollar dicha enfermedad o trastorno, ya sea como resultado de la historia familiar, el historial médico, o la realización de una o más pruebas de diagnóstico o pronóstico indicativas de una propensión a desarrollar posteriormente dicha enfermedad o trastorno.
El término “vector”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico (típicamente compuesta de ADN) capaz de replicarse en una célula huésped y/o a la que otro segmento de ácido nucleico puede unirse operativamente para provocar la replicación del segmento adjunto. Un plásmido, un cósmido o un virus es un vector ejemplar.
Las expresiones “de orden cero” o “casi de orden cero” aplicadas a la cinética de liberación de agentes activos de las composiciones de administración de vacunas desveladas pretenden incluir una tasa de liberación del agente activo de forma controlada durante un periodo de tiempo terapéuticamente práctico tras la administración de la composición, de forma que se alcance una concentración plasmática terapéuticamente eficaz del agente activo. En ciertas realizaciones, será ventajoso emplear uno o más segmentos de ácido nucleico de la presente invención en combinación con un marcador detectable apropiado (es decir, una “etiqueta”), tal como en el caso de emplear sondas de polinucleótidos marcadas para determinar la presencia de una secuencia objetivo dada en un ensayo de hibridación. Se conoce en la técnica una amplia variedad de compuestos y composiciones indicadoras apropiadas para el etiquetado de sondas de oligonucleótidos, que incluyen, sin limitación, ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos o de otro tipo, tales como la avidina/biotina, etc., que son capaces de ser detectados en un ensayo adecuado. En algunas realizaciones particulares, también se puede emplear una o más etiquetas fluorescentes o una etiqueta enzimática tal como la ureasa, la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos menos deseables desde el punto de vista medioambiental. En el caso de las etiquetas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos, cromogénicos o fluorogénicos que se pueden emplear para proporcionar un procedimiento de detección de la muestra que sea visible al ojo humano, o por medio de procedimientos analíticos tales como escintigrafía, fluorimetría, espectrofotometría y similares, para identificar la hibridación específica con muestras que contengan una o más secuencias de ácidos nucleicos complementarias o sustancialmente complementarias. En el caso de los denominados ensayos de “multiplexación”, en los que se detectan dos o más sondas etiquetadas simultánea o secuencialmente, puede ser deseable etiquetar una primera sonda de oligonucleótidos con una primera etiqueta que tenga una primera propiedad o parámetro de detección (por ejemplo, un máximo espectral de emisión y/o excitación), que también etiquete una segunda sonda de oligonucleótidos con una segunda etiqueta que tenga una segunda propiedad o parámetro de detección que sea diferente (es decir, discreta o discernible de la primera etiqueta). El uso de ensayos de multiplexación, en particular en el contexto de los protocolos de amplificación/detección genética, es muy conocido por los expertos en genética molecular.
Equivalentes funcionales biológicos
Se pueden llevar a cabo modificaciones y cambios en la estructura de los ácidos nucleicos, o en los vectores que los comprenden, así como en los ARNm, polipéptidos o agentes terapéuticos codificados por ellos y aun así obtener sistemas de administración de vacunas funcionales que contengan uno o más agentes terapéuticos con características deseables. Como se ha mencionado anteriormente, a menudo es deseable introducir una o más mutaciones en una secuencia polinucleotídica específica. En ciertas circunstancias, la secuencia del polipéptido codificado resultante está alterada por esta mutación, o en otros casos, la secuencia del polipéptido no se modifica por una o más mutaciones en el polinucleótido codificador.
Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una molécula equivalente, o incluso mejorada, de segunda generación, los cambios de aminoácidos se pueden lograr por medio del cambio de uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante, de acuerdo con la Tabla 1.
Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, las regiones de unión a antígenos de los anticuerpos o los sitios de unión en las moléculas de sustrato. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden llevar a cabo determinadas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica y, por supuesto, en su secuencia codificadora de ADN subyacente, y obtener, no obstante, una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, los inventores contemplan la posibilidad de llevar a cabo diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones desveladas o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos péptidos sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.
TABLA 1
AMINOÁCIDOS CODONES
Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU
Cisteína Cys C UGC UGU
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Al llevar a cabo estos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado en la presente memoria por referencia). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basado en sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (­ 0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Es conocido en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y aun así dar lugar a una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtener una proteína funcionalmente equivalente. Al hacer tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de ±2, se prefieren particularmente los que estén dentro de ±1, y se prefieren aún más particularmente los que estén dentro de ±0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer de forma efectiva basándose en la hidrofilia. La Patente de los Estados Unidos Núm. 4.554.101 establece que la mayor hidrofilia promedio local de una proteína, regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.
Como se detalla en Patente de los Estados Unidos Núm. 4.554.101se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y seguir obteniendo una proteína biológicamente equivalente, y en particular, inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia estén dentro de ± 2, los que estén dentro de ± 1 son particularmente preferentes, y los que estén dentro de ± 0,5 son aún más particularmente preferentes.
Como se ha señalado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta una o más de las características anteriores son muy conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen la arginina y la lisina; el glutamato y el aspartato; la serina y la treonina; la glutamina y la asparagina; y la valina, la leucina y la isoleucina.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones ilustrativas de la invención. Aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica deberían apreciar que las técnicas desveladas en estos ejemplos representan técnicas descubiertas que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferentes para su práctica. Sin embargo, aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan.
EJEMPLO 1 - EL LIPOPOLIPLEX POTENCIA LA INMUNIDAD ANTITUMORAL DE VACUNAS BASADAS EN ARNm
En este ejemplo, se describe una vacuna de ARNm de lipopolímero, que consiste en un núcleo de ARNm de polímero de poli-(p-aminoéster) encapsulado en un 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina/1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina/1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)-2000 (EDOPC/DOPE/ DSPE-PEG). Esta vacuna de ARNm con estructura de núcleo entra en las células dendríticas a través de la macropinocitosis. Mostró una actividad adyuvante intrínseca al estimular de forma potente la expresión de interferóna e interleucina-12 en las células dendríticas a través de la señalización del receptor 7/8 similar a Toll. Las células dendríticas tratadas con la vacuna de ARNm mostraron una mayor capacidad de presentación de antígenos. Los ratones portadores de tumores B16-OVA metastásicos de pulmón que expresan el antígeno de la ovoalbúmina se trataron con el ARNm del lipopolímero, y se observó una reducción de más del 90% de los nódulos tumorales. En conjunto, esta estructura en forma de núcleo proporciona un sistema excelente para el suministro de vacunas de ARNm a las células de mamíferos.
La FIG. 1A ilustra esquemáticamente la síntesis de una composición ejemplar de vacuna de lipopolímero de cáscara/núcleo-ARN de acuerdo con un aspecto de la invención. En la vacuna de ARNm con cáscara/núcleo, el ARNm cargado negativamente se condensaba dentro de un polímero cargado positivamente, que juntos formaban una estructura de “núcleo” de polímero apretado de unos pocos nanómetros a unos cientos de nanómetros de diámetro. Este núcleo de polímero fue encapsulado por una “cáscara” de bicapa de fosfolípidos hidrofílica que mejoró la captación por parte de las células dendríticas y protegió las moléculas de ARNm dentro del núcleo interno de la degradación por nucleasas celulares. La composición resultante de tres componentes cáscara/núcleo/ARNm también se podría modificar aún más por medio de la carga de uno o más adyuvantes solubles en el espacio entre el núcleo interno del polímero-ARNm y la cáscara lipídica externa, para mejorar aún más la inmunidad antitumoral.
Los resultados descritos en la presente memoria revelan múltiples ventajas del sistema de vacunas estructuradas de polipex ARNm con cáscara/núcleo desvelado, en comparación con las vacunas convencionales de ARNm comprimido. La encapsulación de las partículas de ARNm del polímero en una cubierta exterior de fosfolípidos no sólo protegió las moléculas de ARNm del núcleo de la degradación, sino que también mejoró significativamente la captación de las partículas de la vacuna por parte de las células dendríticas presentadoras de antígenos (FIG. 1A). Además, la presencia de una estructura de cáscara de lípidos que encapsula el núcleo impidió que las moléculas de ARNm del núcleo interactuaran con las células inmunitarias no DC, lo que limitó los posibles efectos secundarios no deseados. Además, las composiciones de vacunas de ARNm LPP desveladas en la presente memoria fueron más potentes que las vacunas convencionales de ARNm “desnudo” en la estimulación de la expresión de IFN-a e IL-12 (citoquinas que desempeñan un papel importante en la mediación de la inmunidad antitumoral a través de la promoción de la maduración de los DC) (FIG. 4A). Además, las vacunas de ARNm LPP fueron muy potentes a la hora de mediar la muerte de las células tumorales. Por último, las composiciones de vacunas multicomponentes cáscara/núcleo/ARN descritas en la presente memoria también proporcionaron una opción eficaz para encapsular adyuvantes solubles u otras moléculas estimulantes en la cáscara lipídica cuando existe la necesidad de mejorar aún más la actividad de las células presentadoras de antígenos. Todas estas propiedades ponen de manifiesto la utilidad de esta plataforma de vacunas terapéuticas en la creación de nuevos agentes inmunoterapéuticos en la era de la medicina de precisión, que evoluciona rápidamente.
Materiales y procedimientos
Síntesis del polímero de poli-(P-aminoéster) (PbAE). El PbAE (MW ~4 kDa) se sintetizó en un procedimiento de reacción de dos etapas como se describió previamente (Kamat et al., 2013). En la primera etapa, el polímero base se sintetizó por medio de la mezcla de diacrilato de 1,4-butanediol (Sigma-Aldrich) con 5-amino-1-pentanol (Sigma-Aldrich) en una proporción molar de 1,2:1. La reacción se mantuvo a 90 °C durante 24 horas en un vial de centelleo de vidrio con una barra de agitación de teflón. El polímero base se secó y luego se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro a una concentración final de 167 mg/mL. En la segunda etapa, se mezclaron 480 pl de la solución de polímero base con 320 pl de 0,5 mol/L de (PEO)4-bis-amina (Molecular Biosciences, Boulder, CO, EE.UU.) en un tubo Eppendorf de 1,5 mL, y se dejó reaccionar durante 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de polímeros se dializó primero contra agua mili-Q en un tubo de diálisis (MWCO 3.500 Da) para eliminar la mayor parte de los reactivos libres, y luego se mezcló con 4* el volumen de éter etílico (Sigma-Aldrich) y se agitó vigorosamente, seguido por una centrifugación a 4.000 rpm durante 5 minutos para eliminar aún más los monómeros sin reaccionar en el sobrenadante. Los polímeros purificados se secaron al vacío y se disolvieron en acetato de sodio 25 mM, pH 5,2.
Preparación delpoliplex PbAE/ARNm. El poliplex PbAE/ARNm se preparó por medio de la mezcla de un volumen del polímero PbAE con dos volúmenes de moléculas de ARNm (Trilink Biotechnologies, San Diego, CA, USA). Tras la incubación durante 20 minutos a 20 °C, se analizó la distribución del tamaño y el potencial zeta del poliplex mediante el uso de un instrumento de dispersión de luz dinámica Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Inc., Worcestershire, REINO UNIDO). El poliplex PbAE/ARNm también se analizó en un ensayo de retardo de gel. Brevemente, se cargó en cada pocillo una muestra de poliplex que contenía 250 ng de ARNm y se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% con tampón TBE 1* (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.). Las bandas de ARN se tiñeron con la tinción de gel de ácido nucleico Gelred (Biotium, Hayward, CA, USA) y se visualizaron con un sistema GelDoc (BioRad, Hercules, CA, USA).
Preparación y caracterización de las vacunas de LPP/ARNm. Los lípidos 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)-2000 (DSPE-PEG-2000) el hemisuccinato de colesterol (CHEMS) y el 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) se compraron a Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, EE.u U.). El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Los reactivos se disolvieron en cloroformo a una concentración final de 20 mg/mL y se aplicaron para preparar películas lipídicas delgadas por medio de evaporación rotatoria en un Rotavapor Buchi (Oldham, REINO UNIDO) bajo vacío parcial. La fina película lipídica estaba compuesta por un 49% de EDOPC, un 49% de DOPE y un 2% de DSPE-PEG. La película lipídica se rehidrató con una solución que contenía PbAE/ARNm polipéptido para preparar la vacuna de ARNm lipopolímero. La distribución de tamaños y el potencial zeta de la vacuna LPP/ARN se midieron con DLS y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Se aplicó el mismo procedimiento para preparar lipopolímeros CHEMS/DOPE/octaarginina (CHEMS/DOPE/R8) y DOTAP/Colesterol/DSPE-PEG-2000 (d OtAp/CoI/Ds PE-PEG-2000). Para preparar el poliplex de protamina/ARNm, se mezcló sulfato de protamina (grado X, Sigma Aldrich) con ARNm en una proporción de peso de 2:1 en tampón Tris-HCL 10 mM, seguido por una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.
Captación celular de la vacuna LPP/ARNm in vitro. Se aplicaron células DC2.4 inmortalizadas (una línea de células dendríticas murinas derivadas de la médula ósea) para probar la expresión de proteínas de la vacuna LPP/ARNm. Brevemente, las células se sembraron en una placa de 24 pocilios a una densidad de siembra de 1,5 * 105 células/pocillo, y se mantuvieron en 1 mL de medio completo RPMI-1640 (complementado con un 10% de suero fetal bovino [FBS, Atlas Biological, Fort Collins, CO, USA], 1% de penicilina/estreptomicina [10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina, Sigma-Aldrich] y 0,1% de p-mercaptoetanol [Sigma-Aldrich]). Las células se incubaron con LPP empaquetado con 0,5 |jg de ARNm de eGFP (LPP/ARNm de eGFP) durante 24 horas, y la expresión de eGFP se visualizó mediante el uso de un microscopio de fluorescencia Eclipse TE2000-S (Nikon Corporation, Tokio, JAPÓN). Se llevó a cabo una citometría de flujo para medir el porcentaje de células positivas a la GFP mediante el uso de un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). También se aplicó el mismo procedimiento para determinar la expresión de la eGFP en las células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231 (American Type Culture Collection; Manassas, VA, EE.UU.) y en las células endoteliales cutáneas murinas mDMEC tras incubarlas con ARNm de LPP/eGFP, respectivamente.
Para determinar la ruta de internalización celular de la vacuna LPP/ARNm, se sembraron células DC2.4 a una densidad de 1,5 * 105 células/pocillo en una placa de 24 pocilios y se incubaron durante 24 horas a 37 °C. A continuación, se trataron con ARNm marcado con FAM y empaquetado en LPP (ARNm LPP/FAM) y uno de los siguientes inhibidores de moléculas pequeñas: amilorida (0,2 mM), cloroquina (100 mM), genisteína (50 jM), clorpromazina (15 jM ) o pimozida (10 jM). Se dejó que las células crecieran durante 4 hs antes de lavarlas con PBS frío y aplicarlas para determinar la captación de partículas por medio de microscopía de fluorescencia.
Citotoxicidad del LPP/ARNm in vitro. Para probar la citotoxicidad potencial de la vacuna LPP/ARNm, se sembraron células DC2.4, MDA-MB-231 y endoteliales en una placa de 96 pocilios a una densidad de siembra de 3 * 104 células/pocillo, y se trataron con LPP/0,1 jg de ARNm. La viabilidad de las células se midió 24 horas después con un ensayo de proliferación celular en solución acuosa CellTiter 96® (MTS) (Promega, Inc., Madison, WI, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Preparación de células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC). Las BMDC se prepararon a partir de ratones C57BL/6 como se describió previamente (Xia et al., 2015). Brevemente, las células de la médula ósea del fémur y la tibia se lavaron con una jeringa con una solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) que contenía un 2% de FBS. Las células se centrifugaron a 500 * g durante 4 minutos, se trataron con tampón de lisis ACK (Lonza, Inc.) para eliminar los glóbulos rojos y se resuspendieron en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 0,5% de p-mercaptoetanol, 1% de penicilina/estreptomicina, 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y 20 ng/mL de interleucina-4 (IL-4). Se sembraron en placas de 6 pocilios a una densidad de siembra de 1 * 106 células/mL, y el medio de crecimiento se cambió cada dos días. Las células dendríticas no adherentes se cosecharon el día 5.
Medición de citoquinas proinflamatorias. Las BMDC se sembraron a una densidad de 3 * 105 células/pocillo en una placa de 24 pocilios, y se trataron con LPP/0,5 jg de ARNm de OVA. Los componentes desensamblados de la vacuna LPP/ARNm (la cubierta del liposoma y el núcleo del poliplex) sirvieron como controles negativos. Tras 24 horas de incubación, se recolectaron los sobrenadantes y se midieron las concentraciones de IL-6, TNF-a, IFN-p e IL-12 con un kit de ELISA para la medición de citoquinas (eBioscience, San Diego, CA, USA).
Inhibición deTLR7/8. Las células DC2.4 se sembraron en una placa de 24 pocilios a una densidad de 1,5 * 105células/1 mL de medio completo RPMI-1640, y se incubaron durante 24 horas a 37 °C. A continuación, las células se trataron con el inhibidor de TLR7/8 Od N 2087 (Militenly Biotec, San Diego, CA, EE.UU.) a una concentración final de 2,5 jM durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente, se añadió al cultivo LPP/0,5 |jg de ARNm de OVA y se mantuvo el crecimiento celular durante otras 24 horas antes de recolectar el medio de cultivo celular para el análisis de citoquinas. Las células dendríticas sin tratamiento con inhibidores del TLR sirvieron de control positivo, y las células sin tratamiento con ARNm de LPP/OVA se utilizaron como control negativo.
Evaluación de la maduración de las células dendríticas. Las células DC2.4 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1,5 * 105 células/pocillo suministradas con 1 mL de medio completo RPMI. Se trataron con LPP/0,5 jg de ARNm y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. A continuación, las células se lavaron con PBS, se tiñeron con anticuerpos específicos para CD11c, CD40, CD86 y MHC II (BD Bioscience), y se aplicaron para el análisis de citometría de flujo con un citómetro de flujo BD Accuri C6 (Becton Dickinson, Inc., Franklin Lakes, NJ, USA).
Ensayos de presentación de antígenos restringidos por el MHC I y II. Para medir la presentación del antígeno, los BMDC tratados con ARNm de LPP/OVA se tiñeron durante 10 minutos a temperatura ambiente con un pentámero que reconoce el complejo OVA257-264-H-2Kb (H-2Kb/SIINFEKL, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). A continuación, las células se tiñeron durante 30 minutos con un anticuerpo anti-CDllc (BD Bioscience) y se analizaron con un citómetro de flujo Accuri C6.
Para determinar la activación de las células T, las células BMDC y DC2.4 se trataron con LPP/0,5 jg de ARNm de OVA durante 24 horas. Las células se lavaron con PBS y se cocultivaron con células T CD8 específicas de OVA de B3Z o con células T CD4 específicas de OVA de DOBW en una proporción de células DC/T de 1:1. Se llevó a cabo un ELISA para medir la secreción de IL-2 por las células T activadas. Todas las muestras se midieron por triplicado.
Eliminación in vitro de células de melanoma B16-OVA por parte de células T citotóxicas. Las DC2.4 se sembraron a una densidad de 1,5 * 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. Tras la incubación de una noche, las células se trataron con LPP/0,5 jg de ARNm de OVA durante 24 horas a 37 °C. Estas células DC2.4 fueron posteriormente co-cultivadas con células T B3Z en una proporción de células DC2.4/T de 1:2. Tras 24 horas de incubación, las células T activadas se aplicaron a un cocultivo con células de melanoma B16 en una proporción de células T/tumorales de 5:1 durante 4, 8 o 24 horas a 37 °C. A continuación, se determinó la viabilidad de las células tumorales por medio de un ensayo de viabilidad con formazán MTS (Promega, Inc., Madison, WI, EE.UU.), como se ha descrito anteriormente. Las células tumorales tratadas con células T no activadas o con células T activadas con un péptido de antígeno de cáncer de mama HER2 sirvieron como controles negativos. Todas las muestras se midieron por triplicado.
Prueba de eficacia en un modelo murino de melanoma pulmonar metastásico. Se inocularon ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad con 2,5 * 105 células tumorales de melanoma B16-OVA por inyección en la vena de la cola para establecer tumores metastásicos de pulmón siguiendo un protocolo descrito previamente (Overwijk y Restifo, 2001). Tres días después de la inoculación del tumor, los ratones se vacunaron por vía subcutánea con ARNm de LPP/OVA (1 jg). La vacunación se reforzó en los días 7 y 10 con dos inoculaciones más. Los ratones se sacrificaron el día 18, y los pulmones se cosecharon y fijaron con paraformaldehído al 4%. El número de nódulos tumorales metastásicos de pulmón se contó bajo un microscopio de disección.
Imágenes de bioluminiscencia en ratones vivos. A los ratones BALB/c se les administró por vía subcutánea 10 jg de ARNm de luciferasa cargado en LPP (ARNm de LPP/Luc). Los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con 30 jg de RediJect D-luciferin Ultra (Perkin-Elmer) 24 o 48 horas después, y se midió la bioluminiscencia en un sistema de imágenes Xenogen IVIS-200.
Prueba de eficacia en un modelo murino de melanoma pulmonar metastásico. Se inocularon ratones C57BL/6 macho y hembra de ocho semanas de edad con 2,5 * 105 células tumorales de melanoma B16-OVA por medio de inyección en la vena de la cola para establecer tumores metastásicos de pulmón. Tres días después de la inoculación del tumor, los ratones fueron vacunados por vía subcutánea con ARNm de LPP/OVA (1 mg). La vacunación se reforzó en los días 7 y 10 con dos inoculaciones más. Los ratones se sacrificaron el día 18, y los pulmones se cosecharon y fijaron con paraformaldehído al 4%. El número de nódulos tumorales metastásicos de pulmón se contó bajo un microscopio de disección.
Análisis de activación de células T in vivo. Para determinar el estado de activación de las células T, los ratones C57BL/6 se inmunizaron s.c. con 2,5 mg de ARNm de LPP/OVA. Para determinar la activación de las células T por el marcador de superficie, los ratones se sacrificaron 24 horas después, y se recolectaron el bazo y los ganglios linfáticos, se procesaron y se tiñeron con un anticuerpo antimurino c D3, CD4, CD8 o CD69 (Ebioscience) durante 30 minutos a 4 °C, y luego se analizaron por citometría de flujo mediante el uso del citómetro de flujo BD Accuri C6 (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Para medir la activación de las células T por medio de la secreción de IFN-y, los ratones C57BL/6 se inmunizaron s.c. con ARNm de LPP/OVA o ARNm de LPP/TRP2 los días 1, 4 y 7. Una semana después de la última inmunización, se recolectaron el bazo, los ganglios linfáticos y las PBMC y se procesaron para el análisis de células individuales. Las células se volvieron a estimular con OT-I (OVA257-264), OT-II (OVA323-339) o PMA-Ionomicina durante 48 horas a 37 °C. La secreción de IFN-y se analizó por medio de ELISA (eBioscience).
Análisis estadístico. Se aplicó la prueba t de Student de dos colas para comparar los grupos experimentales. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
La vacuna de ARNm basada en lipopolímeros es óptima para la captación por parte de las células dendríticas y la expresión de proteínas. Se describe una plataforma para vacunas basadas en ARNm que incluyen una estructura de núcleo de PbAE/ARNm empaquetada en una envoltura de bicapa lipídica (FIG. 1A). Se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa para examinar la capacidad de unión del ARNm al polímero catiónico PbAE, y se determinó que el ARNm quedaba totalmente encapsulado en el PbAE cuando la proporción PbAE/ARNm (peso/peso) era de 20 o más (FIG. 1B). En consecuencia, se eligió una proporción PbAE/ARNm de 20 para preparar las vacunas de ARNm de LPP en el resto del estudio. El análisis TEM detectó un núcleo de polímero PbAE/ARN de 50 nm (FIG. 1C) rodeado de una cubierta lipídica de EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 (FIG. 1D, FIG.
1E, y FIG. IF).
La cubierta lipídica para la vacuna LPP/ARNm se comparó entre EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000, DOTAP/Col/DSPE-PEG-2000 y CHEMS/DOPE/R8. DOTAP/Col/DSPE-PEG-2000 forma una envoltura lipídica catiónica, y CHEMS/DOPE/R8 es una envoltura lipídica con una fracción de focalización activa; ambas se han aplicado previamente para la entrega de ARN (Wang et al., 2013; Hayashi et al., 2015). Las DC2.4 sirvieron como células presentadoras de antígeno y se aplicaron moléculas de ARNm que codifican la proteína eGFP para preparar el núcleo del poliplex. Las células incubadas con el núcleo PbAE/ARNm no expresaron un nivel detectable de eGFP (FIG. 1G). Mientras que las células tratadas con las partículas empaquetadas con EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 y DOTAP/Col/DSPE-PEG-2000 expresaron proteínas eGFP brillantes, las incubadas con el poliplex empaquetado con CHEMS/DOPE/R8 no tuvieron un nivel detectable de eGFP (FIG. 1H, FIG. 1I, y FIG. J). Curiosamente, las células tratadas con protamina/eGFP tampoco tenían un alto nivel de expresión de eGFP (FIG. 1K), aunque las vacunas de ARNm basadas en protaminas se encuentran en diferentes fases de ensayos clínicos (Kallen y Thess, 2014). Además, se detectó un alto nivel de citotoxicidad de la formulación DOTAP/Col/DSPE-PEG-2000 (FIG.
1L). En consecuencia, se seleccionó EDOPC/DOPE/ DSPE-PEG-2000 para la preparación de la vacuna LPP/ARNm en todos los estudios de seguimiento.
La vacuna LPP/ARN entra en las células dendríticas a través de la macropinocitosis. Se investigó la captación de las partículas de la vacuna LPP/ARN por diferentes tipos de células. Se añadió una cantidad igual de partículas EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 empaquetadas con ARNm de PbAE/eGFP en cultivos de células DC 2.4, células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 o células endoteliales murinas mDMEC, y se detectaron las células que expresaban eGFP 24 horas después. En consonancia con la idea de que las DC son las células de presentación de antígenos más eficaces y con un alto potencial fagocítico (Banchereau y Steinman, 1998), todas las células DC2.4 habían internalizado las partículas de la vacuna y expresaban la proteína verde fluorescente; en comparación, aproximadamente la mitad de las células MDA-MB-231 eran positivas a la GFP, y sólo una pequeña fracción de las células endoteliales sintetizaba la GFP (FIG. 2A y FIG.2B).
El mecanismo de captación celular se examinó por medio del tratamiento de las células DC2.4 con inhibidores de la endocitosis, macropinocitosis y fagocitosis. El tratamiento con amilorida, un inhibidor de la macropinocitosis (Koivusalo et al., 2010), redujo en un 70% la captación celular del ARNm etiquetado con FAM en EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 (LPP/FAM-ARNm). En comparación, la captación celular de las partículas no se vio afectada significativamente por el inhibidor de la endocitosis mediada por caveolina, genisteína; el inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, clorpromazina; o el inhibidor de la fagocitosis, pimozida (véase la FIG. 3A, la FIG.
3B, la FIG. 3C, la FIG. 3D, la FIG. 3E, la FIG.3F, y la FIG.3G).
Estos resultados sugieren que la macropinocitosis fue la principal vía de entrada de las células para las vacunas basadas en ARNm de LPP desveladas. Significativamente, la cloroquina, un reactivo que impide la acidificación y maduración de los endosomas, no afectó a la acumulación de ARNm (FIG. 3A, FIG. 3B, FIG.3C, FIG. 3D, FIG. 3E, FIG. 3F, y FIG. 3G). La monitorización en función del tiempo de las células tratadas con cloroquina mostró un aumento retardado de la intensidad de la fluorescencia, con un pico de intensidad alcanzado 120 min después de la incubación (FIG. 3H). Este resultado indica que las moléculas de ARNm salieron con éxito de los endosomas y entraron en el citosol.
La vacuna de ARNm de LPP promueve la maduración de las DC. Los modelos tumorales murinos con una ovoalbúmina (OVA) sobreexpresada se han aplicado ampliamente para probar la eficacia de las vacunas contra el cáncer (Kim et al., 2015; Avci et al., 2011; Uhlig et al., 2015). Se aplicó el ARNm de OVA para ensamblar la vacuna terapéutica de ARNm (LPP/OVA), y se examinó la inmunidad antitumoral in vitro e in vivo. En un entorno in vitro , las DC derivadas de la médula ósea (BMDC) se coincubaron con LPP/OVA o con controles, y se midieron los niveles de citoquinas en el medio de crecimiento celular. Resulta interesante que tanto el núcleo del poliplex/OVA como el LPP/OVA, junto con la protamina/OVA, puedan desencadenar una expresión significativa de TNF-a (FIG. 4A). Se ha informado previamente de que la maduración de las DC dependientes del TNF-a es fundamental para activar las respuestas inmunitarias adaptativas a la infección viral (Trevejo et al., 2001) y para la inmunidad antitumoral (Brunner et al., 2000). Sin embargo, ni el poliplex/OVA ni la protamina/OVA fueron tan potentes como el LPP/OVA para estimular la expresión de IFN-p e IL-12 (FIG. 4A). Se ha demostrado previamente que el interferón de tipo I IFN-p promueve la maduración de las DC, el procesamiento y la presentación de antígenos y la estimulación de la expansión clonal de las células T (Xia et al., 2015). Asimismo, la IL-12 es una de las citocinas Th1 (Mills y Ley, 2014), y las DC que producen IL-12 promueven la inmunidad de las células T CD8+ de tipo I (Carreno et al., 2013; Carreno et al., 2015). Los resultados indican que tanto el núcleo del poliplex/ARN como la cubierta lipídica son necesarios a fin de maximizar el efecto adyuvante de la vacuna. El efecto adyuvante mediado por LPP/ARNm fue mediado a través de la activación de la señalización TLR-7/8, en línea con las partículas de ARNm condensadas por protamina (Scheel et al., 2005; Fotin-Mleczek et al., 1997), dado que el tratamiento con el inhibidor de TLR7/8 de oligodeoxinucleótido corto, ODN2087, suprimió completamente la expresión de IL-12 e IFN-p estimulada por LPP/OVA (FIG. 4B).
También se examinaron los marcadores de maduración de DC en las células DC2.4 tratadas con LPP/OVA. Las células post-tratamiento mostraron un nivel de expresión de MHC II dramáticamente aumentado (FIG. 4C). Se ha informado que las DC expresan un mayor nivel de MHC II cargado con péptidos derivados de antígenos en la membrana plasmática tras la activación (Trombetta y Mellman, 2005). Además, los niveles de los otros marcadores de maduración de las DC, CD40 y CD86, también fueron mayores en las células tratadas (FIG. 4D).
La vacuna de ARNm LPP estimula la presentación del antígeno. Se analizó el procesamiento y la presentación del antígeno en los BMDCS tratados con LPP/OVA. La citometría de flujo detectó DC CD11c+ que también mostraban el epítopo MHCI-OVA en la superficie celular (FIG. 5A). Cuando las células post-tratamiento se coincubaron con células T CD4+ o CD8+ específicas de OVA, se detectaron incrementos significativos en la secreción de IL-2 por parte de las células T específicas de antígeno (FIG. 5B), lo que indica que las DC habían procesado y presentado con éxito epítopos de OVA que podían ser reconocidos por las células T. Estos resultados demostraron que los BMDC podían traducir correctamente el antígeno del ARNm, así como procesar y presentar los epítopos del antígeno. En otro estudio, se observaron efectos similares con las células DC2.4 después del tratamiento (FIG. 5C y FIG.5D).
La vacuna de ARNm de LPP tiene una potente actividad antitumoral. Para comprobar la eliminación de células tumorales in vitro, se cocultivaron células T específicas de OVA activadas con células de melanoma B16-OVA en una proporción de células T efectoras/ células tumorales de 5:1, y se examinó la eliminación de células tumorales en función del tiempo. Se observó una disminución significativa de la viabilidad de las células tumorales B16-OVA ya a las 4 horas de la coincubación, y la mayoría de las células tumorales estaban muertas a las 24 hs (FIG. 6A).
En comparación, las células tumorales tratadas con células T ingenuas no mostraron una muerte celular significativa. Para confirmar la eliminación de células tumorales específicas de antígeno, se coincubaron células B16-OVA con células T específicas para el antígeno del cáncer de mama HER2, pero no para el OVA, y no se observó ninguna muerte celular.
La actividad antitumoral se evaluó además en un modelo de metástasis pulmonar de melanoma B16-OVA. Los ratones se trataron con la inyección subcutánea de LPP/OVA tres veces, y se sacrificaron 8 días después del último tratamiento para examinar el crecimiento del tumor en el pulmón. Los ratones del grupo de control con PBS desarrollaron extensas metástasis pulmonares; en comparación, los tratados con el ARNm LPP/OVA mostraron una disminución del 96% en el número de nódulos tumorales en el pulmón (FIG. 6B), lo que demuestra el poder de la vacuna de ARNm de LPP en el tratamiento de tumores metastásicos.
En un estudio separado, ratones C57BL6 portadores de un melanoma B16 se trataron con otra vacuna de ARNm dirigida a TRP2 (ARNm LPP/TRP2). Se detectó un nivel significativo de expresión de IFN-y por parte de las PBMC en los ratones vacunados. Aproximadamente el 4% de las PBMC totales eran células T CD8¿ específicas de TRP2. Estos resultados demostraron que la plataforma LPP/ARNm no está restringida a un solo ARNm específico, lo que indica su potencial para amplias aplicaciones en la lucha contra los cánceres (véase la FIG. 6C, la FIG. 6D, la FIG.
6E, y la FIG. 6F).
EJEMPLO 2 - EL LIPOPOLÍMERO POTENCIA LA INMUNIDAD ANTITUMORAL DE LAS VACUNAS BASADAS EN ARNm
La FIG. 8A y la FIG. 8B muestran la distribución del tamaño de las partículas de la vacuna de ARNm sin objetivo y con objetivo. La vacuna de ARNm dirigido tiene manosa en la superficie de la cubierta lipídica. Dado que las células dendríticas expresan un receptor de manosa y tienden a unirse a partículas con una fracción de manosa en la superficie con una alta afinidad de unión. Se preparó siguiendo el mismo procedimiento que la vacuna de ARNm no dirigida. La composición lipídica de la cáscara es 49% EDOPC, 49% Do PE, 1% DSPE-PEG y 1% DSPE-PEG-manosa. Las partículas de la vacuna de ARNm, tanto las no dirigidas como las dirigidas, están dentro del intervalo de 40 a 200 nm, y el tamaño medio de las partículas dirigidas es mayor que el de las no dirigidas.
La FIG. 12A y la FIG. 12B muestran que las células dendríticas captan la vacuna de ARNm dirigido con mayor eficacia que la vacuna de ARNm no dirigido. La vacuna de ARNm dirigido tiene manosa en la superficie de la cubierta lipídica. Se preparó siguiendo el mismo procedimiento que la vacuna de ARNm no dirigida. La composición lipídica de la cáscara es 49% EDOPC, 49% DOPE, 1% DSPE-PEG y 1% DSPE-PEG-manosa. Las moléculas de ARNm marcadas con colorante fluorescente Cy5 se empaquetaron en vacunas no dirigidas o dirigidas. Las vacunas se incubaron con células DC2.4 (una línea de células dendríticas inmortalizadas) durante 4 horas, y se llevó a cabo una citometría de flujo para detectar las células que habían captado las partículas de vacunas fluorescentes. El porcentaje de células DC2.4 internalizadas con la vacuna de ARNm fluorescente se muestra en la FIG.
12A, mientras que la FIG. 12B muestra la intensidad fluorescente total en las células DC2.4. Estos resultados indicaron que la conjugación en la superficie de una fracción de afinidad (es decir, manosa) es un enfoque eficaz para mejorar la captación de las partículas de la vacuna por parte de las células dendríticas.
La FIG. 17 muestra que el inhibidor de IDO1 mejoró la presentación del antígeno por parte de las células dendríticas. Se prepararon vacunas de ARNm por medio de la encapsulación tanto del núcleo de ARNm de OVA como del inhibidor de IDOl INCB024360 dentro de la cubierta lipídica. Las vacunas de ARNm con o sin INCB024360 se utilizaron para tratar los BMDC, y los BMDC se aplicaron para coincubar con células T específicas de OVA B3Z. Las células T estimuladas secretaron IL-2 en el medio de crecimiento, y se aplicó un ELISA para medir el nivel de IL-2. De acuerdo con el resultado, la inclusión del inhibidor de IDOl podría estimular aún más la activación de las células T.
La FIG. 18A y la FIG. 18B muestran las respuestas inmunitarias antitumorales de la vacuna de ARNm de OVA. Los ratones C57BL6 se trataron con la proteína OVA o con la vacuna de ARNm OVA los días 1, 4 y 7. Una semana después del último tratamiento, se sacrificó a los ratones y se recolectaron muestras de bazo, ganglios linfáticos y sangre periférica. (FIG. 18A ) Se reestimularon células individuales preparadas a partir de bazos y ganglios linfáticos con péptidos OTI (OVA257-2640 o OTII (OVA323-339) durante 48 horas, y se aplicó un ELISA para medir el nivel de interferón-y secretado en el medio. (FIG. 18B) Las células T de la sangre periférica se coincubaron con las células tumorales B16-OVA y se midió la viabilidad celular 24 hs después. Este resultado indica que el tratamiento con la vacuna de ARNm de OVA, pero no con la proteína de OVA, promueve la generación de células T específicas de antígeno de OVA que son eficaces para eliminar las células tumorales que expresan el antígeno.
EJEMPLO 3 - DESCRIPCIÓN GENERALIZADA DE LA PLATAFORMA DE LA VACUNA ARNm
La FIG.20 ilustra una descripción general de la plataforma de vacunas de ARNm desvelada en la presente memoria. La vacuna está compuesta preferentemente por una pluralidad de estructuras de “núcleo” hidrofóbicas (cada una de las cuales comprende al menos un ARNm que codifica un antígeno de interés), que están comprendidas dentro de estructuras de “cáscara” hidrofílicas (compuestas por una capa liposomal y formuladas para encapsular eficazmente las estructuras de núcleo en ellas). El “núcleo” hidrofóbico incluye preferentemente una población de moléculas de ARNm cargadas negativamente y moléculas de poliplex (por ejemplo, PbAE) o proteínas (por ejemplo, protamina) cargadas positivamente, mientras que la “envoltura” hidrofílica está compuesta preferentemente por una combinación de lípidos y/o fosfolípidos en una proporción preseleccionada y optimizada. En ciertas realizaciones, puede ser deseable “funcionalizar” la superficie de la cubierta lipídica por medio de la conjugación de uno o más elementos de afinidad a la misma (por ejemplo, elementos de azúcar tales como manosa, proteínas de unión o anticuerpos específicos para uno o más epítopos que expresan DC) para mejorar la interacción y/o aumentar la unión entre la partícula de la vacuna y las células presentadoras de antígenos a las que se dirige (tales como células dendríticas, macrófagos y células B) el complejo núcleo/capa de la vacuna. El espacio “citosólico” que se forma entre el núcleo interno que contiene el ARNm y la bicapa liposomal externa también se puede optimizar para contener una o más citoquinas (por ejemplo, CpG), proteínas (por ejemplo, FLT3L) o moléculas pequeñas (por ejemplo, un agente inmunomodulador tal como un inhibidor de IDO-1), con lo que se potencia o amplía aún más la actividad de la vacuna en células y pacientes seleccionados.
En las realizaciones preferentes, se determinó que una proporción de >20:1 de moléculas de polímero a ARNm (o alternativamente, >1:1 de moléculas de protamina a ARNm) proporcionaba los resultados más deseables al preparar las construcciones de entrega de cáscara/núcleo para las composiciones terapéuticas desveladas en la presente memoria. Asimismo, se demostró que una proporción de aproximadamente 1 |jg de ARNm por 2 |jg de protamina y 20 jg de lípido era especialmente ventajosa para formular vacunas para la administración en humanos.
EJEMPLO 4 - DOS ARNm- PUEDEN SER COEMPAQUETADOS EN UNA SOLA CÁSCARA PARA UNA INMUNOTERAPIA DUAL
En el estudio mostrado en la FIG. 21, se mezclaron 500 ng de ARNm de OVA con cantidades crecientes de ARNm que codifican la IL12p70 para preparar el núcleo de protamina/ARNm, y a continuación se empaquetó el núcleo en una cubierta de lípidos. Así, la vacuna de ARNm resultante contenía dos moléculas de ARNm diferentes: ARNm para codificar el antígeno OVA y ARNm para codificar la citocina estimulante de las células dendríticas IL12p70. Las células DC2.4 se trataron primero con las vacunas de ARNm y luego se coincubaron con células T específicas de OVA B3Z. El nivel de IL-2 en el medio de crecimiento celular se midió 24 horas después. Los resultados mostraron que el coempaquetado de 500 ng de ARNm de IL12p70 potenció la actividad de la vacuna. Esto demostró que 1) era posible empaquetar dos tipos diferentes de moléculas de ARNm en una sola partícula de vacuna; y 2) los dos tipos de moléculas de ARNm podían servir para diferentes propósitos: uno para la producción de antígenos, el otro para la estimulación de células dendríticas.
Este resultado demostró un aspecto importante de la presente invención, particularmente con respecto al diseño de inmunoterapias contra el cáncer “personalizadas”, que se crean para pacientes específicos. Esta aplicación se amplía en los estudios descritos en el siguiente ejemplo:
EJEMPLO 5 - VACUNAS BASADAS EN ARNm PARA LA INMUNOTERAPIA PERSONALIZADA DEL CÁNCER Los avances en la identificación de mutaciones somáticas del genoma del cáncer y la predicción de mutaciones tumorales inmunogénicas han proporcionado oportunidades sin precedentes para desarrollar vacunas terapéuticas para la inmunoterapia personalizada del cáncer. Sin embargo, la preparación de las vacunas tradicionales basadas en proteínas o péptidos a fin de dirigirse a las células cancerosas con un espectro de mutaciones heterogéneo en un determinado tumor es una tarea de enormes proporciones. La plataforma de vacunas de ARNm desvelada se ha diseñado específicamente para este fin. En este caso, esta plataforma de gran eficacia se utilizó para probar la hipótesis de que el tratamiento personalizado del cáncer de mama se podría lograr por medio de la vacunación personalizada basada en las características genómicas únicas del cáncer de las pacientes.
Este ejemplo aborda tres grandes retos en la investigación del cáncer de mama:
a) revolucionar los regímenes de tratamiento sustituyéndolos por otros más eficaces, menos tóxicos y que repercutan en la supervivencia;
b) eliminar la mortalidad asociada al cáncer de mama metastásico; y
c) determinar por qué y cómo las células del cáncer de mama permanecen latentes durante años y luego reaparecen, y utilizar esta información para prevenir dicha reaparición.
La inmunoterapia contra el cáncer ha logrado una eficacia clínica sin precedentes en múltiples tipos de cánceres en los últimos años. Sin embargo, sólo un pequeño número de pacientes con cáncer se benefician de la inmunoterapia, y muchos pacientes no responden o no montan respuestas inmunes antitumorales eficaces. Múltiples líneas de evidencia han demostrado que la presencia de linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL) sirve como marcador de pronóstico y predice la respuesta a diferentes terapias, que incluyen la inmunoterapia y la quimioterapia. Los tumores que carecen de TlL se han caracterizado como “no inflamados”, y generalmente se correlacionan con el fracaso del tratamiento y el mal pronóstico. Por ejemplo, la eficacia del anticuerpo de bloqueo de puntos de control en pacientes con cáncer de mama, que tiene relativamente menos TIL, es mucho menos eficaz en comparación con la de los pacientes con melanoma o carcinoma de pulmón de células no pequeñas, tipos de tumores con abundantes TIL que se caracterizan por estar “inflamados” Por lo tanto, un medio para promover la infiltración de células T y mantener la función de las células T en el microambiente del tumor es un enfoque para desarrollar una inmunoterapia eficaz, especialmente para los tipos de tumores “no inflamados”, que incluyen el cáncer de mama. Las vacunas terapéuticas contra el cáncer tienen el potencial de estimular una potente inmunidad antitumoral. En un estudio reciente, se utilizó una vacuna de células dendríticas basada en la nanotecnología (vacuna nano-DC) que contenía un péptido de antígeno HER2 p66 para atacar el cáncer de mama HER2-positivo, y detectar la infiltración masiva en el tumor de células T CD8+ específicas del antígeno y la estimulación de citoquinas con sesgo Th1, lo que dio lugar a una potente inhibición del crecimiento del tumor HER2-positivo en un modelo murino de cáncer de mama.
Un estudio de seguimiento también demostró la sinergia entre el tratamiento con la vacuna contra el cáncer y el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1 para promover aún más la infiltración de células T en el tumor, como lo demuestra el aumento de células T CD3+ dentro de la población de células CD45+ asociadas al tumor.
Vacuna terapéutica de ARNm en la nueva era de la inmunoterapia personalizada. Aunque la carga global de mutaciones en el cáncer de mama no es tan pesada como en el melanoma o el cáncer de pulmón de células no pequeñas, un estudio reciente de 560 secuencias del genoma completo del cáncer de mama identificó 1.628 mutaciones probables en 93 genes cancerígenos, y el TP53 fue el gen cancerígeno conductor más comúnmente mutado en el cáncer de mama con receptor de estrógeno (RE) negativo. Este resultado coincide con un informe anterior de acuerdo con el cual las mutaciones de TP53 son más frecuentes en los cánceres de mama HER2-positivos (72%) y de tipo basal (80%), mientras que las mutaciones de PIK3CA son poco frecuentes en los cánceres de mama de tipo basal (9%) en comparación con otros subtipos (29 a 45%). Mediante el uso de herramientas en línea que se basan en motivos de corte del proteasoma, se han identificado múltiples epítopos de células T citotóxicas que están conservados al 100% entre las proteínas humanas y murinas, que incluyen los de TP53, PIK3CA y PTEN (Tabla 2). Estos epítopos sirven como los mejores reactivos para el desarrollo de inmunoterapias de “próxima generación”, y los resultados obtenidos de los estudios de eficacia mediante el uso de modelos tumorales murinos se pueden aplicar directamente para predecir las respuestas de los pacientes.
TABLA 2
EPÍTOPOS DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS EN BC
Nombre del Péptido Secuencia del Péptido* SEC. ID Núm.: X
TP53-170 TEVVRRCPH SEC. ID Núm.: 1
EPÍTOPOS DE CÉLULAS T CITOTÓXICAS EN BC
Nombre del Péptido Secuencia del Péptido* SEC. ID Núm.: X
TP53-170* TEVVHRCPH SEC. ID Núm.: 2
TP53-258 TLEDSSGN SEC. ID Núm.: 3
TP53-258* TDEDSSGN SEC. ID Núm.: 4
PIK3CA-106 GNREEKNRE SEC. ID Núm.: 5
PIK3CA-106* GNRENKNRE SEC. ID Núm.: 6
PIK3CA-721 QEKLKDETQK SEC. ID Núm.: 7
PIK3CA-721* QEKLKDKTQK SEC. ID Núm.: 8
PTEN-63 NHYKIYNLC SEC. ID Núm.: 9
PTEN-63 * NHYNIYNLC SEC. ID Núm.: 10
*Las secuencias de aminoácidos en las proteínas de tipo salvaje se proporcionan como referencia, y los aminoácidos mutantes están subrayados.
La plataforma de la vacuna basada en ARNm desvelada en la presente memoria se ha desarrollado idealmente para este propósito. Mediante el uso de una vacuna de ARNm LPP, que estaba compuesta por un núcleo de ARNm en una estructura de cáscara liposomal donde el núcleo de poliplex/ARNm está compuesto por polímero/ARNm (PpAE/ARNm) o protamina/ARNm, y la cáscara liposomal está hecha de una mezcla de fosfolípidos neutros y cargados positivamente, la plataforma permite una expresión robusta de proteínas a partir de las moléculas de ARNm. A diferencia de las vacunas convencionales basadas en péptidos, las vacunas basadas en ARNm tienen la ventaja de incorporar múltiples epítopos de antígenos en una construcción de minigénesis y, por lo tanto, se pueden personalizar rápidamente para adaptarse a las necesidades de cada paciente en función de su espectro de mutaciones en el genoma del cáncer individual. También se diferencian de las vacunas tradicionales derivadas de plásmidos en que (entre otras ventajas) funcionan tanto en células en división como en las que no lo están, y tampoco hay riesgo de integración genómica. Curiosamente, aunque los productos de vacunas de ARNm basados en protaminas se han probado durante muchos años, la expresión de antígenos proteicos a partir de protaminas/ARNm desnudos era sólo una fracción de la de LPP/ARNm. Una posible razón es que las moléculas de ARNm en la construcción desnuda son vulnerables al ataque de las ARNasas plasmáticas.
Alternativamente, el LPP/ARN desencadena que las DC expresen un nivel mucho más alto de IL-12, una citoquina que es esencial para el máximo procesamiento de antígenos y la actividad de presentación de las células de presentación de antígenos. El núcleo de ARNm también sirve como un fuerte adyuvante para la vacuna por medio de la activación de la señalización de los receptores tipo Toll 7 y 8 (TLR7/8), como lo demuestra la inhibición de la expresión de citoquinas por el inhibidor de TLR7/8 ODN2095. Para comprobar la actividad de la vacuna de ARNm, se aplicó ovoalbúmina (OVA) como antígeno modelo, y se incubaron células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) con LPP/OVA para determinar la presentación del antígeno y la activación de las células T. Los BMDC incubados con LPP/OVA, pero no con protamina/OVA, mostraron un alto nivel de epítopo del complejo mayor de histocompatibilidad tipo I (MHCI)-OVA en la superficie. El tratamiento con la vacuna de ARNm LPP/OvA provocó la estimulación de las células T CD4+ y CD8+ en el bazo y los ganglios linfáticos. Esta vacuna también fue eficaz para inhibir el crecimiento de los tumores que expresan OVA. En otro estudio, se demostró que las vacunas LPP/ARNm desveladas eran mucho más eficaces que las vacunas liposomales de ARNm simples (es decir, las que carecen de la estructura central protectora del ARNm) para promover la expresión del antígeno y estimular la activación de las DC, a pesar de las prominentes publicaciones recientes sobre vacunas liposomales de ARNm con una estructura y composición similares para el cáncer y las enfermedades infecciosas. En conjunto, estos datos mostraron que la plataforma de la vacuna LPP/ARNm proporciona una inmunidad antitumoral robusta a través de un potente procesamiento y presentación de antígenos. La estructura del núcleo del poliplex/ARNm y la cubierta del liposoma es muy superior a otras plataformas basadas en el ARNm (protamina/ARNm desnudo y ARNm encapsulado en liposomas) para estimular la inmunidad antitumoral.
Es bien sabido que los cánceres humanos son heterogéneos tanto en sus características moleculares como estructurales, y que las mutaciones/amplificaciones/supresiones de genes se producen con frecuencia durante el crecimiento del tumor, la expansión clonal y el tratamiento farmacológico. Esta complejidad se ve agravada por el hecho de que cada tipo de cáncer tiene sus propias características. Por ejemplo, el cáncer de mama triple negativo (TNBC, que carece de expresión del receptor de estrógeno, del receptor de progesterona o de1HER2/neu) tiene una alta tasa de mutación del TP53 que se combina con mutaciones de baja frecuencia en una amplia variedad de genes. Lo más probable es que estos eventos de mutación causen la formación de diferentes clones (algunos dominantes y otros no bien representados) con características específicas de amplificación/mutación de genes en un solo tumor. En consecuencia, no es infrecuente identificar espectros de mutación diferentes en diferentes nódulos tumorales de un mismo paciente o entre los tumores primarios y los metastásicos. El objetivo de la inmunoterapia contra el cáncer es eliminar todos los clones del tumor con gran eficacia, y la vacuna contra el cáncer de ARNm se adapta muy bien a este propósito, dado que una sola construcción de la vacuna se puede diseñar para dirigirse a múltiples antígenos para adaptarse a la complejidad del genoma del cáncer en cada paciente.
Generación de tumores primarios y metastásicos en ratones inmunocompetentes: Las células tumorales de glándula mamaria murina 4T1 (nulas en p53) se modificarán para generar una mutación puntual en el gen PIK3CA o PTEN con la tecnología CRISPR/Cas9, una práctica que se lleva a cabo de forma rutinaria en el laboratorio. Las células 4T1 con mutaciones de tipo salvaje o PIK3CA y PTEN se infectarán entonces con un retrovirus que lleva un gen TP53 mutante y un gen de luciferasa. Las células 4T1 isogénicas resultantes serán portadoras de una única mutación en el gen TP53 (4T1/TP53*), de mutaciones dobles en el gen TP53 y en PIK3CA o PTEN (4T1/TP53*PIK3CA* o 4T1/TP53*Pt EN*), o de mutaciones en los tres genes (4T1/TP53*PIK3CA*PTEN*). Las cuatro líneas isogénicas se agrupan en una proporción de 1:1:1:1, y se inoculan en la almohadilla de grasa de la glándula mamaria de ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de edad para generar el tumor primario. Como se demostró en el ejemplo anterior, los tumores primarios 4T1 desarrollan metástasis en el hígado y el pulmón con una alta eficiencia. Se lleva a cabo un análisis histológico para caracterizar los tumores primarios y los nódulos tumorales metastásicos y se comparan con los tumores 4T1 parentales. Se pueden aislar y cuantificar células individuales de los tumores por medio de reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para medir el porcentaje de células tumorales portadoras de una única mutación TP53* o de mutaciones dobles o triples en un determinado tumor.
Prueba de las respuestas inmunitarias in vitro : Se pueden llevar a cabo estudios celulares para garantizar que las vacunas de ARNm puedan ejercer las funciones previstas antes de aplicarlas al tratamiento de un modelo murino con tumor. Las vacunas individuales de ARNm se pueden incubar con células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) durante 6 horas, y luego las BMDC se coincuban con células T murinas. La maduración de las DC se puede determinar por medio del análisis de citometría de flujo sobre la expresión de CD40 y CD86 y por medio de ELISA sobre la expresión de interleucina-12 (IL-12). La activación de las células T se mide por la expresión de interferón (IFN-I) e interleucina-2 (IL-2).
Examen de las respuestas inmunitarias de las vacunas de ARNm in vivo : Los ratones BALB/c serán inoculados con células 4T1 que comprenden una mezcla de 4 clones isogénicos en las almohadillas de grasa de la glándula mamaria. Cuando los tumores primarios alcancen los 200 a -300 mm3, los ratones se dividirán en 4 grupos (n = 10 ratones/grupo) y se tratarán por vía intradérmica con las 4 vacunas de ARNm, y la vacunación se reforzará una vez más una semana después. Las muestras de sangre se recolectarán una vez antes de la segunda vacunación y otra vez al finalizar el experimento. Los ratones serán sacrificados 3 días después de la segunda vacunación y se recolectarán muestras de bazo, ganglios linfáticos y tumores. Todas las muestras se aplicarán para aislar las células T CD3+ mediante el uso de un kit de aislamiento de células T de ratón EasySepTM (StemCell Technologies), y las células activadas se detectarán en función del nivel de expresión de IL-2 e IFN-I o de los marcadores de maduración de superficie o mediante el uso del ensayo ELISPOT, siguiendo los mismos protocolos que hemos descrito. También se examinarán los niveles de expresión de las proteínas inhibidoras del punto de control.
Evaluación de la actividad antitumoral de las vacunas de ARNm: Los ratones BALB/c serán inoculados con los tumores parentales 4T1 o con tumores derivados de una mezcla de 4 clones isogénicos (n = 10 ratones/grupo) se dividirán en 4 grupos y tratados intradérmicamente (i.d.) con las 4 vacunas de ARNm semanalmente durante 4 semanas. Se mantendrán los ratones para controlar el crecimiento del tumor (de acuerdo con el tamaño del mismo) y la metástasis tumoral a órganos distantes (mediante el uso de un sistema de imágenes Xenogen IVIS-200). Los ratones serán sacrificados cuando el peso del tumor primario (calculado sobre la base del volumen del tumor asumiendo que la densidad es de 1 g/cm3) supere el 10% del peso corporal, la ulceración del tumor o los signos de enfermedad, que incluyen el letargo, la espalda encorvada y el pelo erizado.
Respuestas inmunitarias a las vacunas de ARNm en ratones transgénicos HLA-A2 : Los ratones transgénicos HLA-A2 de los Laboratorios Jackson (C57BL/6-Tg[HAL-A2.1]lEnge/J) expresan los antígenos leucocitarios humanos HLA-A2.1 MHCI en las células del bazo, la médula ósea y el timo. Para predecir las respuestas inmunitarias de los pacientes a la vacuna de ARNm, los ratones HLA-A2 (n=10 ratones/grupo) son tratados con las cuatro vacunas de ARNm enumeradas, y se recolectan muestras de sangre y de tejido para examinar las actividades de las células T específicas del antígeno.
Modelo tumoral murino : Los ratones inoculados con clones isogénicos mixtos desarrollarán tumores con características moleculares mixtas. En caso de que las células tumorales de un clon isogénico crezcan mucho más rápido que el resto de clones, lo que se detectará en base al análisis de PCR de las muestras tumorales, la proporción de estos clones se puede ajustar antes de la inoculación de las células tumorales. Si las señales de los tumores primarios interfieren con la detección de los nódulos metastásicos, los tumores primarios pueden ser extirpados quirúrgicamente cuando alcanzan los 500 cm3, y la metástasis tumoral se monitoriza por medio de un ensayo de luminiscencia.
Inmunidad antitumoral : El análisis de las respuestas inmunitarias revela que las vacunas de ARNm pueden ejercer una potente inmunidad antitumoral. Se espera que las vacunas que codifican múltiples epítopos de neoantígenos (por ejemplo, LPP/p53-PI3K-PTEN) tengan la ventaja de promover una mayor inmunidad antitumoral en comparación con las vacunas que tienen un solo epítopo (es decir, LPP/p53), y el efecto se reflejará en la medición de la actividad de las células T y en la inhibición del crecimiento del tumor y la metástasis. Si el tratamiento con determinadas vacunas, tal como la LPP/p53 o la LPP/p53-PI3K, sólo provoca una inhibición parcial del crecimiento del tumor, se pueden recolectar tejidos tumorales de los ratones post-vacunados y analizar la composición del tumor, centrándose en el porcentaje de células tumorales de los 4 clones isogénicos individuales. Los cambios en la composición de los tumores indicarían la eficacia (o la falta de eficacia) de determinada(s) vacuna(s). Un riesgo potencial de las vacunas de ARNm es que los epítopos del neoantígeno MHCI se seleccionaron en base a un conjunto de algoritmos, pero no se han confirmado con estudios biológicos. En caso de que no se observara ninguna respuesta o una respuesta muy débil de los epítopos seleccionados de acuerdo con los resultados de un estudio in vitro concreto, se podrán utilizar epítopos alternativos en una repetición del estudio hasta que se obtenga un número de candidatos exitosos. Alternativamente, los epítopos del antígeno se pueden modificar con sustituciones de un solo aminoácido para mejorar la unión al MHC, una estrategia que se ha aplicado con éxito para desarrollar antígenos MHCI de WT1.
Estudio con ratones HLA-A2: Dado que las secuencias peptídicas que revisten la región epitópica del neoantígeno MHCI se conservan entre la proteína humana y el homólogo de ratón, se espera que se observen respuestas inmunitarias similares en los ratones BALB/c y en los ratones transgénicos HLA-A2.
Las vacunas terapéuticas contra el cáncer deben activar las células presentadoras de antígenos, principalmente las DC, a fin de ejercer sus actividades antitumorales. Para comprender plenamente el mecanismo de acción de las vacunas terapéuticas contra el cáncer basadas en ARNm y para identificar el enfoque para mejorar aún más las actividades de esta nueva terapia, es necesario primero identificar la(s) subpoblación(es) de DC esenciales para impulsar la inmunidad antitumoral. En este estudio, se seleccionaron experimentos para determinar el papel de 3 subconjuntos principales de DC en la actividad de la vacuna de ARNm: las DC convencionales CD8+ y c D8- (cDC) y las DC plasmocitoides (pDC). Para este estudio se han obtenido tres líneas de ratones modificados genéticamente de The Jackson Laboratories: Batf3_/_knockout, zDC-DTR (receptor de toxina diftérica [DTR] en la región no traducida 3' del gen Zbt646 ), y Cd11c- DTR (DTR bajo el control del promotor CD11c). Los ratones knockout Batf3-/-no generan DC CD8+. El tratamiento de los ratones zDC-DTR con toxina diftérica (DT) agota ambos tipos de cDC de la médula ósea, pero no afecta a las pDC, mientras que el tratamiento con DT de los ratones Cd11c-DTR agota todas las DC del organismo.
Inmunidad antitumoral en ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados : Para evaluar el papel de las DC CD8+ en la inmunidad antitumoral, se inoculan células tumorales 4T1 en ratones Batf3-/-knockout en fondo BALB/c o en ratones de tipo salvaje de control (n=10 ratones/grupo), y los animales son tratados con la vacuna LPP/p53-PI3K-PTEN ARNm semanalmente durante 4 semanas. Para evaluar el impacto de los cDC y pDC en la actividad de la vacuna de ARNm, los ratones portadores de tumores zDC-DTR y Cd11c-DTR se dividen en 2 grupos de tratamiento por línea (n = 10 ratones/grupo). Los ratones de los grupos de control no reciben tratamiento con DT, mientras que los de los grupos de tratamiento reciben una dosis de DT (20 pg/kg, i.p.) 24 horas antes de la vacunación. El agotamiento de los subconjuntos de DC se confirma por medio de análisis de citometría de flujo antes de los estudios de eficacia a gran escala. Se vigila el crecimiento del tumor y la metástasis, y los ratones son sacrificados cuando muestran signos de enfermedad.
Basado en el mecanismo de acción de las vacunas de ARNm, el agotamiento de todas las DC en los ratones Cd11c-DTR debería eliminar completamente la inmunidad antitumoral de la vacuna de ARNm. Los resultados de los ratones Batf3-/- knockout y zDC-DTR deberían ilustrar qué subconjunto de DC desempeña un papel esencial para promover la actividad de la vacuna de ARNm. En el ejemplo anterior, se observaron fuertes respuestas al tratamiento con la vacuna de ARNm por parte de los BMDc , lo que indica la implicación de los DC CD8+. Si el subconjunto objetivo de DC no se elimina por completo en los ratones zDC-DTR o Cd11c-DTR después del tratamiento con 20 pg/kg de DT (un protocolo utilizado por múltiples laboratorios), la dosis de DT y/o el programa de dosificación se pueden ajustar de acuerdo con lo necesario.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una vacuna terapéutica contra el cáncer que comprende una población de moléculas de ARNm que codifican al menos un antígeno tumoral, en la que la población está comprendida dentro de una pluralidad de partículas de núcleo de polímero o proteína que comprenden al menos un polímero o proteína con carga positiva, y además en la que la pluralidad de partículas de núcleo de polímero o proteína están a su vez encapsuladas en una bicapa lipídica biocompatible.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en CpG, poli(I:C), alumbre y cualquier combinación de los mismos, encapsulado dentro de la bicapa lipídica biocompatible.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende un compuesto inmunomodulador, tales como una proteína IL-12p70, un ligando FLT3 o un inhibidor de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO-1) tal como GDC-0919 o INCB24360, encapsulado dentro del espacio entre la bicapa lipídica biocompatible.
4. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que el polímero o la proteína con carga positiva comprende protamina, polietilenimina, poli-(p-aminoéster), o cualquier combinación de los mismos.
5. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la bicapa lipídica biocompatible comprende una o más de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfotanol amina-A/-[am¡no(pol¡et¡lenglicol)-2000] (DSPE-PEG); y combinaciones de las mismas.
6. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la bicapa lipídica biocompatible comprende:
(a) del 30% al 70%, o más preferentemente del 45% al 55%, de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC);
(b) del 70% al 30%, o más preferentemente del 55% al 45% de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE); o
(c) del 0,5 al 5%, o más preferentemente del 1% al 2%, de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol amina-N-[amino(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG).
7. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la población de moléculas de ARNm codifica al menos un antígeno que es específico de una célula cancerosa de mamífero, o una proteína, polipéptido o péptido específico del cáncer o del tumor, tal como HER2p66, YVMA HER2E75, HER2, TRP2, p66, o cualquier combinación o fragmento antigénico de los mismos.
8. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la población de moléculas de ARNm codifica HER2p66.
9. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que además comprende un agente terapéutico, tal como un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente inmunomodulador, un agente antineoplásico, un agente citotóxico, un agente citostático, un agente neuroactivo, un agente antiinflamatorio, un agente antilipidémico, una hormona, un agonista del receptor, un antagonista del receptor, un agente antiinfeccioso, una proteína, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno, una enzima, un ARN, un ADN, un ARNsi, un ARNm, una ribozima, una hormona, un cofactor, un esteroide, una molécula antisentido, ciclofosfamida, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, docetaxel, paclitaxel, trastuzumab, metotrexato, epirubicina, cisplatino, carboplatino, vinorelbina, capecitabina, gemcitabina, mitoxantrona, isabepilona, eribulina, lapatinib, carmustina, una mostaza de nitrógeno, una mostaza de azufre, un tetranitrato de platino, vinblastina, etopósido, camptotecina y cualquier combinación de los mismos.
10. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, (a) que además comprende un polipéptido antigénico, un polipéptido de fusión antigénica, un péptido antigénico, o un fragmento del mismo; (b) comprendida dentro de una población de partículas de silicio mesoporoso, nanopartículas, micropartículas, o cualquier combinación de las mismas; (c) mezclado con uno o más tensioactivos, liposomas, niosomas, etosomas, transferosomas, fosfolípidos, esfingosomas o cualquier combinación de los mismos; o (d) que además comprende uno o más portadores, tampones, diluyentes, vehículos o excipientes aceptables para uso farmacéutico.
11. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, comprendida en una población aislada de células presentadoras de antígenos de mamíferos, tales como células cancerosas, células tumorales, células de macrófagos, células B, células dendríticas o cualquier combinación de las mismas.
12. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para su uso en
a) la profilaxis, terapia o mejora de uno o más síntomas de un cáncer de mamífero; o
b) la terapia o la mejora de uno o más síntomas del cáncer humano, tales como el cáncer metastásico humano.
13. Una población aislada de células de mamíferos, tales como células presentadoras de antígenos, células dendríticas, macrófagos, células B, o cualquier combinación de las mismas, que comprende la composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.
14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en terapia.
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