BR112015022868B1 - Composições de mrna de cftr e usos e métodos relacionados - Google Patents

Composições de mrna de cftr e usos e métodos relacionados Download PDF

Info

Publication number
BR112015022868B1
BR112015022868B1 BR112015022868-2A BR112015022868A BR112015022868B1 BR 112015022868 B1 BR112015022868 B1 BR 112015022868B1 BR 112015022868 A BR112015022868 A BR 112015022868A BR 112015022868 B1 BR112015022868 B1 BR 112015022868B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cftr
mrna
seq
hcftr
lung
Prior art date
Application number
BR112015022868-2A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112015022868A2 (pt
Inventor
Michael Heartlein
Braydon Charles Guild
Frank DeRosa
Carsten Rudolph
Christian Plank
Lianne Smith
Original Assignee
Ethris Gmbh
Shire Human Genetic Therapies, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50513499&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112015022868(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ethris Gmbh, Shire Human Genetic Therapies, Inc filed Critical Ethris Gmbh
Publication of BR112015022868A2 publication Critical patent/BR112015022868A2/pt
Publication of BR112015022868B1 publication Critical patent/BR112015022868B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03049—Channel-conductance-controlling ATPase (3.6.3.49)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

COMPOSIÇÕES DE MRNA DE CFTR E USOS E MÉTODOS RELACIONADOS RESUMO São apresentados materiais, formulações, métodos de produção e métodos para a distribuição de mRNA de CFTR para a indução da expressão de CFTR, inclusive no pulmão de mamíferos. A presente invenção é particularmente útil para o tratamento de fibrose cística.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US N° de Série 61/783.663, depositado em 14 de março de 2013, cuja divulgação é deste modo incorporada por referência.
FUNDAMENTOS
[0002] A presente invenção refere-se a composições de mRNA (CFTR) do regulador transmembranar da fibrose cística, usos destas e métodos de produção e seus usos.
[0003] A fibrose cística é um distúrbio autossômico hereditário resultante da mutação do gene de CFTR, que codifica um canal de íon de cloreto, o qual acredita-se estar envolvido na regulação de outros múltiplos canais de íon e sistemas de transporte em células epiteliais. A perda da função de CFTR resulta em uma doença pulmonar crônica, produção anormal de muco e uma expectativa de vida dramaticamente reduzida. Ver, genericamente, Rowe et al., New Engl. J. Med. 352, 1992-2001 (2005).
[0004] Apesar da clonagem do gene de CFTR em 1989, não foi desenvolvida ainda uma terapia eficaz para substituir o CFTR no tratamento de fibrose cística. Estão documentadas na literatura numerosas dificuldades encontradas na tentativa de induzir a expressão de CFTR nos pulmões. Por exemplo, vetores virais que compreendem respostas imunes desencadeadas pelo DNA de CFTR e sintomas de FC continuaram após a administração. Conese et al., J. Cyst. Fibros. 10 Supl 2, S114-28 (2011); Rosenecker et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 439-45 (2006). Relataram-se que a distribuição não-viral de DNA, incluindo DNA de CFTR, desencadeia respostas imunes. Alton et al., Lancet 353, 947-54 (1999); Rosenecker et al., J Gene Med. 5, 49-60 (2003). Além disso, os vetores de DNA não-viral encontram o problema adicional de que o maquinário do complexo de poros nucleares não costuma importar DNA para o núcleo, onde a transcrição ocorreria. Pearson, Nature 460, 164-69 (2009).
[0005] Outra fonte de dificuldades na indução da expressão de CFTR nos pulmões é o próprio ambiente dos pulmões. Relatou-se que o surfactante pulmonar reduz a eficácia da transfecção para veículos de transferência de lipídios catiônicos, como Lipofectamina (DOSPA: DOPE).
[0006] Ernst et al., J. Gene Med. 1, 331-40 (1999). Além disso, Rosenecker et al., 2003, supra, identificou vários componentes inibitórios presentes no líquido da superfície das vias respiratórias, que podem interferir na transfecção mediara por polímero ou mediada por lipídio. Foi sugerida a terapia com RNA mensageiro como uma abordagem geral para indução de expressão de uma proteína terapêutica ou de substituição. O conceito de introdução de RNA mensageiro (mRNA) como meio de produção de proteína com um hospedeiro foi relatado anteriormente (Yamamoto, A. et al. Eur. J. Pharm. 2009, 71, 484-489; Debus, H. et al. J. Control Rel. 2010, 148, 334-343). No entanto, as dificuldades aparentes específicas dos pulmões foram relatadas quanto à distribuição de mRNA utilizando certas formulações de lipoplexos. Por exemplo, uma comparação de desempenho in vitro e in vivo de lipoplexos que transportam mRNA ou DNA revelou que embora a composição de mRNA tenha conferido uma expressão maios em células cultivadas, a expressão mensurável foi detectada apenas com a composição de DNA quando administrada de maneira intranasal aos pulmões de camundongos. Andries et al., Mol. Pharmaceut. 9, 2136-45 (2012).
[0007] Deve também ser observado que o CFTR é um gene relativamente grande em relação aos genes modelos ou repórteres, como luciferase vagalume (FFL). Compare os comprimentos da sequência de codificação de CFTR de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2) e a sequência de codificação de FFL (SEQ ID NO: 7). A diferença de comprimento pode ter impacto na estabilidade sob certas circunstâncias e, por conseguinte, se e quanto de expressão de proteína qualquer dose de mRNA produzirá. Além disso, embora a síntese in vitro de mRNA seja geralmente preferível à síntese por células devido à ausência de mRNA celular normal e outros componentes celulares que constituem contaminantes indesejáveis, a síntese in vitro de mRNA com uma longa sequência de codificação, como mRNA de CFTR, é substancialmente mais difícil de obter do que a síntese in vitro de mRNA com uma sequência de codificação relativamente breve, como FFL.
[0008] A publicação de patente PCT WO 2007/024708 e as publicações de patente US2010/0203627 e US2011/0035819 discutem a administração terapêutica do mRNA de CFTR, mas não fornecem uma redução demonstrada para a prática da produção de CFTR nos pulmões após a administração do mRNA de CFTR ou orientação suficiente para superar as dificuldades associadas à indução da expressão de CFTR nos pulmões usando mRNA de CFTR transcrito in vitro. Estes incluem dificuldades na obtenção da síntese in vitro síntese do mRNA e dificuldades específicas para as interações das composições de mRNA com substâncias específicas dos pulmões que pesquisadores, como Andries et al., supramencionado, descobriram que processam composições de mRNA ineficazes para a indução de expressão mesmo quando as composições com base em DNA correspondentes forneceram algum nível de expressão.
[0009] Assim, existe uma necessidade de materiais melhorados, formulações, métodos de produção e métodos para a distribuição de mRNA de CFTR para a indução da expressão de CFTR, incluindo nos pulmões de mamíferos, para o tratamento da fibrose cística.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0010] A presente invenção é baseada, em partes, no desenvolvimento de formulações de mRNA de CFTR e mRNA de CFTR de ocorrência não-natural e métodos de administração deste que podem incluir expressão de CFTR funcional in vivo. As composições, métodos e utilizações de acordo com a invenção podem proporcionar expressão de CFTR nos pulmões de um mamífero com um perfil de segurança favorável adequado para o tratamento eficaz de fibrose cística.
[0011] Assim, em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção in vivo de CFTR, em particular, nos pulmões de um indivíduo (pro exemplo, um mamífero) que necessita da distribuição através da distribuição de mRNA codificando uma proteína de CFTR. Em algumas modalidades, o mRNA que codifica uma proteína de CFTR é distribuído diretamente aos pulmões do indivíduo. Tal como aqui utilizado, uma "proteína de CFTR" engloba qualquer comprimento completo, fragmento ou porção de uma proteína de CFTR que possam ser usados para substituir a atividade da proteína de CFTR de ocorrência natural e / ou reduzir a intensidade, gravidade e / ou frequência de um ou mais sintomas associados à fibrose cística. Por exemplo, uma proteína de CFTR adequada de acordo com a presente invenção pode ter uma sequência de aminoácidos idêntica à de tipo selvagem da proteína de CFTR humana (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, uma proteína de CFTR adequada de acordo com a presente invenção pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à de tipo selvagem da proteína de CFTR humana (SEQ ID NO: 1).
[0012] Em uma modalidade, a invenção fornece um método de indução da expressão de CFTR em células epiteliais em pulmões de mamíferos, o método compreendendo o contato das células epiteliais nos pulmões do mamífero com uma composição, onde: a composição é uma composição farmacêutica que compreende um mRNA transcrito in vitro; o mRNA transcrito in vitro compreende uma sequência de codificação que codifica SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o mRNA transcrito in vitro compreende uma sequência de codificação que codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à SEQ ID NO:1.
[0013] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de indução de expressão de CFTR em uma célula alvo de mamífero, o método compreendendo o contato da célula alvo de mamífero com uma composição, compreendendo a composição um mRNA transcrito in vitro que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o mRNA transcrito in vitro compreende uma sequência de codificação que codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à SEQ ID NO:1.
[0014] Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação, um 5'-UTR e um 3'-UTR, em que a sequência de codificação codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e a sequência de codificação é de pelo menos 80% idênticas à SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência de codificação codifica a sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1 e / ou a sequência de codificação é cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 3.
[0015] Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação, um 5'-UTR e um 3'-UTR, em que a sequência de codificação codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e a sequência de codificação compreende pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das bases de tipo não-selvagem listadas na Tabela 1 nas posições da sequência de codificação listada na Tabela 1 em relação à sequência de codificação de tipo selvagem da SEQ ID NO: 2.
[0016] Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação, um 5'-UTR e um 3'-UTR, em que a sequência de codificação codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e a sequência de codificação compreende pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das bases de tipo não-selvagem listadas na Tabela 2 nas posições da sequência de codificação listada na Tabela 2 em relação à sequência de codificação de tipo selvagem da SEQ ID NO: 2.
[0017] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma molécula de mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação para um peptídeo de sinal. Em uma modalidade particular, a invenção fornece um mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação para uma sequência principal de hormônio de crescimento. Em certas modalidades, a invenção fornece um mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, a invenção fornece um mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de codificação de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para a SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
[0018] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma molécula de mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma molécula de mRNA de ocorrência não-natural que compreende uma sequência de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para qualquer um dentre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ID SEQ NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17.
[0019] Em uma modalidade, a invenção fornece um polinucleotídeo compreende uma sequência complementar para a sequência de um mRNA de acordo com a invenção.
[0020] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende o polinucleotídeo de acordo com a invenção, uma RNA- polimerase e trifosfatos de nucleosídeo.
[0021] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um mRNA de acordo com a invenção.
[0022] Em outra modalidade, a invenção fornece um aparelho de nebulização ou em aerossol carregado com uma composição farmacêutica de acordo com a invenção.
[0023] Em outra modalidade, a invenção fornece uma célula cultivada que compreende um mRNA de acordo com a invenção e o CFTR funcional expresso a partir do mRNA.
[0024] Em outra modalidade, a invenção fornece um uso de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para a indução de expressão de CFTR funcional.
[0025] Em outra modalidade, a invenção fornece um método de indução de expressão de CFTR nas células epiteliais dos pulmões de um mamífero, o método compreendendo o contato das células epiteliais com uma composição, em que a composição é uma composição farmacêutica compreendendo um mRNA de acordo com a invenção.
[0026] Em outra modalidade, a invenção fornece um método de indução da expressão de CFTR em uma célula alvo de mamífero, o método compreendendo o contato da célula alvo de mamífero com uma composição, a composição compreendendo um mRNA de acordo com a invenção.
[0027] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de fibrose cística através da administração a um sujeito carente de tratamento um mRNA que codifica uma proteína de CFTR, conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o mRNA é administrado aos pulmões do indivíduo. Em uma modalidade, o mRNA é administrado por inalação, nebulização, administração intranasal ou em aerossol. Em várias modalidades, a administração do mRNA resulta na expressão de CFTR nos pulmões do indivíduo.
[0028] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um método de tratamento de fibrose cística através da administração aos pulmões de um indivíduo carente de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento da fibrose cística através da administração ao pulmão de um indivíduo em necessidade de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação que codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à proteína de CFTR humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1). Em outra modalidade particular, a presente invenção fornece um método de tratamento de fibrose cística através da administração aos pulmões de um indivíduo carente de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação da SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento da fibrose cística através da administração ao pulmão de um indivíduo em necessidade de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3.
[0029] Em outro aspecto, ainda, a presente invenção fornece métodos para produção de um mRNA que codifica uma proteína CFTR, conforme aqui descrito. Em uma modalidade, a invenção fornece um método de produção de mRNA de CFTR in vitro, compreendendo o contato de um polinucleotídeo isolado com uma polimerase de RNA na presenta de trifosfatos de nucleosídeos, em que: o polinucleotídeo isolado e a polimerase de RNA não estão contidos em uma célula; o polinucleotídeo isolado é um modelo para a polimerase de RNA; o polinucleotídeo isolado compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência modelo; a sequência modelo compreende um complemento de sequência de codificação, que é complementar a uma sequência que codifica a SEQ ID NO: 1; e (a) a sequência modelo compreende menos promotores crípticos que o complemento de SEQ ID NO: 2, (b) a sequência modelo compreende menos repetições diretas e / ou invertidos do que a SEQ ID NO: 2, (c) a sequência modelo compreende complementos de menos códons desfavorecidos do que a SEQ ID NO: 2, ou (d) o conteúdo de GC do complemento de sequência de codificação é menor do que o conteúdo de GC da SEQ ID NO: 2.
[0030] Em outra modalidade, a invenção fornece um método de produção de mRNA de CFTR in vitro, compreendendo o contato de um polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção com uma polimerase de RNA na presença de trifosfatos de nucleosídeos, em que: o polinucleotídeo isolado e a polimerase de RNA polimerase não estão contidos em uma célula; o polinucleotídeo isolado é um modelo para a polimerase de RNA; e o polinucleotídeo isolado compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência modelo e a polimerase de RNA sintetiza o mRNA que compreende uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1.
[0031] Em algumas modalidades de tais utilizações e métodos de tratamento, o mRNA transcrito in vitro é um mRNA de ocorrência natural ou de tipo selvagem que codifica CFTR humano (SEQ ID NO: 2) modificado para incluir UTRs de ocorrência não-natural. Em outras modalidades, o mRNA transcrito in vitro é um mRNA de ocorrência não-natural, conforme descrito acima.
[0032] Vantagens adicionais da invenção serão definidas em partes na descrição a seguir, e em parte serão evidentes a partir da descrição ou podem ser aprendidas pela prática da invenção. Os objetos e vantagens da invenção serão apreendidos e obtidos por meio dos elementos e combinações particularmente destacados nas reivindicações anexas.
[0033] Deve ser entendido que tanto a descrição geral anterior quanto a seguinte descrição detalhada são apenas exemplificativas e explicativas e não são restritivas da invenção, conforme reivindicado.
[0034] As figuras em anexo, que são incorporadas ao e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram diversas modalidades da invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0035] Os aspectos e vantagens anteriores da presente invenção podem tornar-se evidentes a partir da seguinte descrição detalhada com referência aos desenhos anexos.
[0036] Figura 1A. A detecção da banda madura "C" para a proteína de CFTR humana 24 horas após a transfecção com mRNA de CFTR humano. A produção bem-sucedida de proteínas bem sucedida foi observada tanto para o mRNA não-modificado quanto para o modificado (SNIM) (compreendendo 25% de 2-tiouridina e 5-metilcitidina). A imunoprecipitação foi executada utilizando-se anticorpos MAB25031 de sistemas R&D e detecção utilizando-se Ab570.
[0037] Figura 1B Análise Western Blot da pós-exposição de 24 horas dos pulmões de camundongos CFTR KO de nanopartículas de mRNA de CFTR humano PEI/não-modificado. Os camundongos foram tratados por meio de nebulização (nebulizador de jato Pari Boy) ao longo de aproximadamente uma hora. A imunoprecipitação do derivado de proteína de CFTR humana, de acordo com os métodos fornecidos, foi realizada. A banda "C" madura é detectada em todos os camundongos tratados, mas não foi observada nos camundongos de controle.
[0038] Figura 2. Representação gráfica de corrente-voltagem de correntes evocadas por 8-Br-cAMP de células HEK293T não-tratadas e tratadas (mRNA de hCFTR de 4 ug). Uma grande corrente é induzida dentro das células transfectadas do mRNA de hCFTR em comparação às células não-tratadas. As células tratadas que foram expostas a um inibidor da proteína de CFTR específica, CFTRinh-172, mostram uma significativa redução (~ 89%) no fluxo de corrente de íons de Cl.
[0039] Figura 3. Representação gráfica de histograma de correntes evocadas por 8-Br-cAMP de células tratadas (mRNA de hCFTR de 4 ug) e células HEK293T não-tratadas a partir da aplicação de um potencial de membrana de +80 mV. Uma grande corrente é induzida dentro das células transfectadas do mRNA de hCFTR em comparação às células não- tratadas. As células tratadas que foram expostas a um inibidor da proteína de CFTR específica, CFTRinh-172, mostram uma significativa redução (~89%) no fluxo de corrente de íons de Cl.
[0040] Figura 4. Representação gráfica corrente-voltagem comparando perfis de células HEK 293 de forskolina nativa e exposição a GlyH-101. Nenhuma alteração significativa na corrente foi observada em nenhum cenário.
[0041] Figura 5. Representação gráfica de corrente-voltagem de correntes evocadas por forskolina de células HEK293 não-tratadas e tratadas (mRNA de hCFTR de 4 ug). Uma grande corrente é induzida dentro das células transfectadas do mRNA de hCFTR em comparação às células não-tratadas. As células tratadas que foram expostas a um inibidor da proteína de CFTR específica, GlyH-101, mostram uma significativa redução (~ 95%) no fluxo de corrente de íons de Cl, como demonstrado na representação gráfica da etapa (+100 mV) do lado direito do gráfico.
[0042] Figura 6. Hibridização in situ do mRNA de CFTR humano em pulmões de camundongos de CFTR KO não-tratados (PBS) (à esquerda) e tratados (à direita). Os camundongos foram expostos a 30 ug de mRNA de hCFTR encapsulado não-modificado em nanopartículas de PEI através de administração intratraqueal. Coloração positiva substancial é observada ao longo de ambos os pulmões em 24 horas após a administração.
[0043] Figura 7. Hibridização in situ dos pulmões de camundongos de CFTR KO tratados com mRNA de CFTR humano em diferentes vistas de ampliação (ampliação de até 20x). Os camundongos foram expostos a 30 ug de mRNA de hCFTR encapsulado não-modificado em nanopartículas de PEI através de administração intratraqueal.
[0044] Figura 8. Seção dos pulmões representativas com elevada ampliação (40x) demonstrando hibridização in situ dos pulmões de camundongos de CFTR KO tratados com mRNA de CFTR humano (à direita). O mRNA de CFTR humano foi detectado no citoplasma apical de células epiteliais brônquicas alvo 24 horas após a administração. Os camundongos foram expostos a 30 ug de mRNA de hCFTR encapsulado não-modificado em nanopartículas de PEI através de administração intratraqueal.
[0045] Figura 9. Comparação da coloração da hibridização in situ dos pulmões de camundongos CFTR KO tratados com mRNA de CFTR humano seis horas (à esquerda) e 24 horas (à direita) após a administração. Os camundongos foram expostos a 30 ug de mRNA de hCFTR encapsulado não-modificado em nanopartículas de PEI através de administração intratraqueal. Coloração positiva intracelular intensa é observada dentro de seis horas ao longo de ambos os pulmões nas regiões alveolares e bronquiais e uma coloração positiva substancial continua a ser observada 24 horas após a administração.
[0046] Figura 10. Hibridização in situ do mRNA de CFTR humano em pulmões de camundongos CFTR KO não-tratados (PBS) (topo) e tratados (ao fundo). Os camundongos foram expostos a 15 μg de mRNA de hCFTR encapsulado não-modificado em nanopartículas de lipídio C12-200 por administração intratraqueal. Coloração positiva substancial é observada ao longo de ambos os pulmões 6 horas após a administração.
[0047] Figura 11. Seções dos pulmões representativas com elevada ampliação (40x) demonstrando hibridização in situ dos pulmões de camundongos de CFTR KO tratados com mRNA de CFTR humano. O mRNA de CFTR humano foi detectado no citoplasma apical do da região epitelial bronquial alvo (à esquerda) e da região alveolar intracelular (à direita) seis horas após a administração. Os camundongos foram expostos a 15 ug de mRNA de hCFTR encapsulado não-modificado em nanopartículas de lipídio C12-200 por administração intratraqueal.
[0048] Figura 12. Rastreio de diferentes linhas celulares quanto à expressão de hCFTR. Imunotransferência de células CHO e COS-7 (a) e BHK e PKC (b) transfectadas com hCFTR que codificam construtos. Os lisados de proteína foram preparados 24 horas após a transfecção e rastreados utilizando MA1-935 como anticorpo primário. A seta indica CFTR putativo. Veja a discussão sobre a especificidade de MA1-935 no Exemplo 6.
[0049] Figura 13. Reatividade cruzada de diferentes anticorpos CFTR anti-humano. (A) - MA1-935 de CFTR anti-humano de camundongos (Chemicon): (C) - AB570 de CFTR anti-humano de camundongos (Fundação de Fibrose Cística): (B) - AB596 de CFTR anti-humano de camundongos (Fundação de Fibrose Cística): (D) G449 de CFTR anti- humano de coelho (Universidade de Rockefeller). A seta indica CFTR.
[0050] Figura 14. Imunoprecipitação de CFTR humano utilizando três anticorpos diferentes (R29, R66 /17 e R66 /16) seguida de imunodetecção utilizando AB596. Rota 1: Células T84 (controle positivo), Rota 2: o tecido pulmonar de porco não-tratado (300 mg), Rota 3: tecido pulmonar de porco (697 mg), Rota 4: tecido pulmonar de porco tratado (163 mg).
[0051] Figura 15. Imunoprecipitação e Western blotting de um camundongo 24 horas após aplicação de spray IT de RNA SNIM de hCFTR de 20 μg/RNA SNIM de FFL de 10 μg, cada um deles na formulação de HGT5001 do Exemplo 6. As células T84 serviram um controle positivo exibindo a banda C glicosilada madura e a banda B manosilada de hCFTR. Fração do extrato celular remanescente "sobrenadante" sem a fração imunoprecipitada. Fração imunoprecipitada "IP"
[0052] Figura 16. A imunoprecipitação de hCFTR a partir de células T84 utilizando MAB25031 seguida de imunodetecção utilizando AB570 (A) e MAB1660 (B).
[0053] Figura 17. A imunoprecipitação de CFTR a partir de células de NIH3T3 72 horas após a transfecção com diferentes construtos.
[0054] Figura 18. A imunoprecipitação de CFTR a partir de células NIH3T3 72 horas após a transfecção com diferentes construções utilizando 500 ug de proteína e MAB1660 (à esquerda e nos painéis centrais) e quantidade aumentada da proteína total (8mg) utilizando MAB25031 (painel à direita).
[0055] Figura 19. Imunoprecipitação de hCFTR usando MAB25031 e imunodetecção subsequente utilizando AB570 de amostras de pulmões de porco após a distribuição do RNA de SNIM de hCFTR na formulação de PEI do Exemplo 6. Rota 1: amostra de lobo caudal esquerdo negativo para luciferase do porco #2, Rota 2: amostra de regiões pulmonares positiva para luciferase do porco #1.
[0056] Figura 20. Foi realizada nebulização nos porcos anestesiados e ventilados (à esquerda). O nebulizador foi ligado em linha com o sistema de ventilação (à direita, ver a seta branca).
[0057] Figura 21. Expressão de luciferase medida em homogeneizados de espécimes de tecido suíno de diferentes regiões dos pulmões após a administração por aerossol de 1 mg de RNA de SNIM de FFL na formulação de PEI do Exemplo 6 com o nebulizador com malha EFlow. Os espécimes pulmonares eram ex vivo cultivados durante a noite antes das medições de luciferase (pg de luciferase / mg de tecido pulmonar).
[0058] Figura 22. Expressão de luciferase de BLI é representativa de espécimes de tecido suíno de diferentes regiões dos pulmões após a administração por aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL na formulação de PEI do Exemplo 6. Os espécimes pulmonares foram cultivados ex vivo durante a noite anterior às medições.
[0059] Figura 23. Expressão de luciferase de BLI é representativa de espécimes de tecido suíno de diferentes regiões dos pulmões após a administração por aerossol de 1 mg de RNA de SNIM de FFL na formulação de PEI do Exemplo 6 usando um nebulizador de jato PARI BOY. Os espécimes pulmonares foram cultivados ex vivo durante a noite anterior às medições.
[0060] Figura 24. Expressão de luciferase de BLI é representativa de espécimes de tecido suíno de diferentes regiões dos pulmões após a administração por aerossol de cada 1 mg de RNA SNIM de FFL e RNA SNIM de hCFTR na formulação de PEI do Exemplo 6 usando um nebulizador de malha Aeroneb. Os espécimes pulmonares foram cultivados ex vivo durante a noite anterior às medições.
[0061] Figura 25. BLI da expressão de luciferase em espécimes representativos de tecido suíno de diferentes regiões pulmonares após a administração em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL na "Formulação #3 de SHIRE(HGT5001: DOPE: Chol: DMGPEG2K (50:25:20:5) (razão molar) usando um nebulizador de malha Aeroneb. Os espécimes pulmonares foram cultivados ex vivo durante a noite anterior às medições.
[0062] Figura 26. BLI da expressão luciferase em espécimes de tecido suíno de diferentes regiões pulmonares de um porco de controle não-tratado. O outro porco de controle não-tratado apresentou o mesmo resultado (dados não exibidos).
[0063] Figura 27. BLI da expressão de luciferase em espécimes pulmonares de porcos tratados uma vez #3 e #6. A administração em aerossol de 1 mg cada de RNA SNIM de FFL e RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 foi executada usando um nebulizador em malha Aeroneb. Fatias do pulmão do porco inteiro são exibidas. Três fileiras superiores: porco #3, três fileiras inferiores: porco #6.
[0064] Figura 28. BLI da expressão de luciferase em espécimes pulmonares de dois porcos tratados #4 e #8. A administração em aerossol de 1 mg cada de RNA SNIM de FFL e RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 foi executada usando um nebulizador em malha Aeroneb. Fatias do pulmão do porco inteiro são exibidas. Três fileiras superiores: porco #4, três fileiras inferiores: porco #8.
[0065] Figura 29. BLI da expressão de luciferase em espécimes pulmonares de porcos três vezes tratados #1 e #2. A administração em aerossol de cada 1 mg de RNA de SNIM de FFL e RNA de SNIM de hCFTR-mRNA na Formulação de PEI do Exemplo 6 foi executada utilizando um nebulizador em malha Aeroneb. Fatias do pulmão do porco inteiro são exibidas. Três fileiras superiores: porco #1, três fileiras inferiores: porco #2.
[0066] Figura 30. IHC de luciferase no tecido pulmonar do porco #1 três vezes tratado. A administração em aerossol de 1 mg cada de RNA SNIM de FFL e RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 foi executada usando um nebulizador em malha Aeroneb. A expressão de luciferase apareceu na cor rosa-avermelhado (pAb anti-luciferase de 1: 300, G7451, Promega, Refine AP-Kit, cromogéneo: nova fucsina).
[0067] Figura 31. O tecido pulmonar altamente positivo para BLI de porcos tratados triplamente #1 foi submetido a IP de hCFTR/WB. Rota 1: Células T84 (controle positivo), Rota 2: o tecido pulmonar de porco não- tratado (300 mg), Rota 3: tecido pulmonar de porco (697 mg), Rota 4: tecido pulmonar de porco tratado (163 mg). O hCFTR complexo glicosilado maduro apareceu como o disperso chamado de banda C. o hCFTR rico em manose apareceu como a chamada banda B mais densa. A expressão de hCFTR foi observada em células T84 e no tecido pulmonar suíno do porco #1 tratado com RNA SNIM de hCFTR, onde nenhuma expressão de hCFTR foi observada em porcos não-tratados.
[0068] Figura 32. Imunoprecipitação de hCFTR usando MAB25031 e imunodetecção subsequente utilizando AB570 de amostras de pulmões de porco após a distribuição do RNA SNIM de hCFTR na formulação de PEI do Exemplo 6. Rota 1: amostra de lobo caudal esquerdo negativo para luciferase do porco #2, Rota 2: amostra de regiões pulmonares positiva para luciferase do porco #1.
[0069] Figura 33 A&B. Transfecção in vitro de células HEK 293T com o His terminado em C marcado como 10 (CO-CFTR-C-His10) e RNA SNIM de CFTR humano otimizado de códon não-marcado (CO-CFTR). A seguir à transfecção, todo o lisado celular foi coletado e analisado para expressão de CFTR humano por Western blot utilizando (A) um anticorpo #217 anti-CFTR e (B) um anticorpo 1187 anti-His. Amostras transfectadas foram comparadas a lisados de controle de HEK 293T de não-transfecção (Rota 3).
[0070] Figura 33 C. Transfecção in vitro de células HEK 293T com RNA SNIM que codifica CFTR humano otimizado de códon com uma sequência principal de hormônio de crescimento e um (GH-CO-CFTR) ou um RNA SNIM que codifica o CFTR (CO-CFTR-C-His10) humano otimizado de códon marcado com 10 de His terminado em C. A seguir à transfecção, todo o lisado celular foi coletado e analisado para expressão de CFTR humano por Western blot utilizando um anticorpo #217 anti-CFTR. Amostras transfectadas foram comparadas a lisados de controle de HEK 293T de não-transfecção (Rota 3).
[0071] Figura 34. A transfecção in vivo de camundongos nocaute de CFTR com RNA SNIM de CFTR humano otimizado de códon marcado como10de His terminado em C encapsulado em um lipídio (CKK-E12) ou em uma formulação de nanopartícula polimérica (PEI). Após a distribuição nebulizada de cada formulação do respectivo mRNA, o lisado de tecido pulmonar esquerdo e direito foi coletado e analisado para expressão de CFTR por Western blot utilizando anticorpo 1187 anti-His. Tecido pulmonar nocaute de CFTR de controle e lisado HEK293 de CFTR-His10 foi usado como controles positivo e negativo, respectivamente.
[0072] Figura 35. Detecção bioluminescente da expressão de FFL em amostras de pulmão de porco coletadas após a nebulização com água para injeção.
[0073] Figura 36. Detecção bioluminescente de expressão da FFL em amostras de pulmão de porco recolhidos seguintes nebulização com 1 mg de RNA SNIM de FFL + 1 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDa ramificada.
[0074] Figura 37. Detecção bioluminescente de expressão de FFL em amostras de pulmão de porco coletadas após a nebulização com 1 mg de RNA SNIM de FFL + 5 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDA ramificada.
[0075] Figura 38. Detecção bioluminescente de expressão da FFL em amostras de pulmão de porco recolhidos seguintes nebulização com 1 mg de RNA SNIM de FFL + 10 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDa ramificada.
[0076] Figura 39. A quantificação relativa da expressão de CFTR em diferentes coortes. As intensidades de banda foram normalizadas para banda de 150kDa na escada de proteína.
[0077] Figura 40. Exemplo representativo de brônquios "positivos para CFTR" com pelo menos uma célula epitelial detectada dentro da camada de células epiteliais e exibindo um sinal de CFTR localizado em uma membrana clara através de coloração imunohistoquímica de CFTR utilizando um anticorpo anti-CFTR.
[0078] Figura 41. A coloração imunohistoquímica de CFTR no pulmão de porco após a distribuição em aerossol de controle (WFI) ou de 5 mg de RNA SNIM de CO-CFTR.
[0079] Figura 42. Representa um nível de expressão de CFTR "baixo", analisado no pulmão de porco por coloração imunohistoquímica com anti-CFTR após a distribuição em aerossol do RNA SNIM de CO- CFTR de 5 mg.
[0080] Figura 43. Representa um nível de expressão de CFTR "médio", analisado em um pulmão de porco por coloração imunohistoquímica com anti-CFTR após a distribuição em aerossol de 5 mg de RNA SNIM de CO-CFTR.
[0081] Figura 44. Representa um nível de expressão de CFTR "elevado", analisado no pulmão de porco por coloração imunohistoquímica com anti-CFTR após a distribuição em aerossol do RNA SNIM de CO- CFTR de 5mg.
[0082] Figura 45. A coloração imunohistoquímica de CFTR no pulmão de porco após a distribuição em aerossol do controle (WFI) ou de 10 mg de RNA SNIM de CO-CFTR.
[0083] Figura 46. A quantificação de números relativos de brônquios positivos para CFTR/bronquíolos por animal. A análise de cada coorte (WFI; e 1mg, 5mg, 10mg de RNA SNIM de CFTR humano) 24 horas após a administração em aerossol. Expressão de CFTR normalizada para sinalizar a intensidade para o padrão de proteína de 150 kDa. (WFI = 9,4 ± 5,6%, 1 MG = 15,2 ± 6,6%, 5MG = 25,4 ± 14,1%, 10MG = 20,9 ± 3,7%; WFI contra 5MG p = 0,0281, WFI contra 10MG p = 0,0174)
[0084] Figura 47. Ilustra a detecção in situ de ácido nucleico multiplexo de (A) ubiquitina C e (B) dap B no pulmão de porco após a distribuição em aerossol de água para injeção por nebulizador.
[0085] Figura 48. Ilustra a detecção in situ de ácido nucleico multiplexo de (A) ubiquitina C e (B) dap B no pulmão de porco após a distribuição em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL + 10 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDa ramificada.
[0086] Figura 49. Ilustra a detecção in situ de ácido nucleico multiplexo de (A) ubiquitina C e (B) cranialis esquerdo suíno, após a distribuição em aerossol de água para injeção por nebulizador.
[0087] Figura 50. Ilustra a detecção in situ de ácido nucleico multiplexo de (A) ubiquitina C e (B) cranialis esquerdo suíno após a distribuição em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL + 1 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDa ramificada.
[0088] Figura 51. Ilustra a detecção in situ de ácido nucleico multiplexo de (A) ubiquitina C e (B) cranialis esquerdo suíno após a distribuição em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL + 5 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDa ramificada.
[0089] Figura 52. Ilustra a detecção in situ de ácido nucleico multiplexo de (A) ubiquitina C e (B) cranialis esquerdo suíno após a distribuição em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL + 10 mg de RNA SNIM de CO-CFTR em uma formulação de PEI de 25 kDa ramificada.
[0090] Figura 53. Ilustra a detecção positiva da proteína de luciferase de vagalume (FFL) no pulmão do porco tratado através de luminescência após a exposição a FFL/a nanopartículas de lipídio cKK-E12 encapsuladas de mRNA de CO-CFTR-C-His10. Os porcos foram tratados com 1 mg de FFL + 9 mg de nanopartículas de lipídio encapsuladas de mRNA de CO- CFTR-C-His10 através de nebulização usando um nebulizador de jato Pari e sacrificados após 24 horas de tratamento. Luminescência de FFL foi visualizada utilizando um bioluminômetro IVIS.
[0091] Figura 54. Ilustra resultados exemplares de expressão de hCFTR em células HEK transfectadas utilizando complexos nebulizados dados aos porcos 10, 11 e 12 (dose de 1 mg).
[0092] Figura 55. Ilustra resultados exemplificativos de expressão de hCFTR em células HEK transfectadas utilizando complexos nebulizados dados aos porcos 13, 14 e 15 (dose de 5 mg) e em células HEK transfectadas utilizando complexos nebulizados dados aos porcos 19, 20 e 21 (dose de 10 mg).
[0093] Figura 56. Ilustra resultados exemplares de expressão de hCFTR em células HEK transfectadas utilizando complexos nebulizados dados aos porcos 16 (dose de 5 mg), 22 (dose de 10 mg) e 67 (dose de 1 mg).
[0094] Figura 57. Ilustra resultados exemplares de expressão de hCFTR em células HEK transfectadas utilizando complexos nebulizados dados aos porcos 17, 18 (dose de 5 mg), 23, 24 (dose de 10 mg) e 68, 69 (dose de 1 mg).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0095] Como usado aqui, o termo "polinucleotídeo" é geralmente utilizado para se referir a um ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA). Os termos polinucleotídeo, ácido nucleico, DNA, RNA e mRNA incluem moléculas tais que são constituídas por: resíduos padrão ou não- modificados; resíduos modificados ou não-padronizados; e misturas de resíduos não-padronizados e padronizados.
[0096] Conforme usado aqui, o termo "mRNA" é usado para se referir ao RNA modificado e não-modificado, incluindo uma região de codificação e uma região sem ser de codificação.
[0097] Conforme usado aqui, o termo "região de codificação" de um mRNA geralmente se refere àquela posição que quando transladada resulta na produção de um produto de expressão, como um polipeptídeo, uma proteína ou uma enzima.
[0098] Uma "nucleobase não-padronizados" é uma porção de base que não as bases naturais adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) ou uracila (U). A nucleobase não-padronizados é um análogo de uma nucleobase específica (A, C, G, T ou U) quando as suas propriedades de pareamento em uma dupla hélice de ácido nucleico e o local de incorporação pelas polimerases de DNA ou RNA em uma dupla hélice de ácido nucleico (incluindo uma hélice RNA-DNA local, como aquela formada durante a transcrição de um modelo de DNA pela polimerase de RNA) são mais semelhantes a uma das cinco nucleobases listadas anteriormente, exceto pelo fato de que os análogos de T geralmente serão também análogos de U e vice-versa. Para fins de determinação da identidade da porcentagem de uma primeira sequência relativa a uma segunda sequência, um análogo de uma base não é incompatível com a base natural; por exemplo, a pseudouridina combina com a uridina, 5-metilcitidina combina com citidina, etc.
[0099] O termo "não-padronizados" utilizado em conjunto com termos que incluem, mas não se limitam a, "nucleosídeo, "base", "nucleotídeo" ou "resíduo" deve ser interpretado como se fosse usado em conjunto com "nucleobase".
[0100] "Conteúdo de GC" é a fração ou porcentagem dos resíduos totais de nucleobase em uma sequência de ácido nucleico que corresponde a resíduos de guanina, resíduos de citosina e análogos destes. Por exemplo, uma sequência de 100 nt que contém exatamente 30 citosinas, exatamente 30 guaninas, exatamente um análogo da citosina e exatamente um análogo da guanina possui uma riqueza de GC de 62%.
[0101] Conforme usado aqui, um "códon desfavorecido" refere-se a um códon que é transladado de maneira menos eficiente ou rápida por células de mamíferos do que outro códon para o mesmo resíduo de aminoácido. Códons desfavorecidos geralmente incluem códons com um A ou U na 3a posição ou na posição de "oscilação" do códon. Para uma discussão quanto aos códons desfavorecidos, ver, por exemplo, a publicação de patente U.S. 2009/0069256 A1.
[0102] Uma "molécula de mRNA de ocorrência não-natural" é um mRNA que não é produzido por meio de transcrição normal e processos de ligação de células de tipo selvagem. Um mRNA pode ser qualificado como de ocorrência não-natural em virtude de sua sequência (por exemplo, uma série de códons e/ou um ou mais UTRs que não se apresentam em nenhum mRNA de CFTR de ocorrência natural) e/ou por incluir resíduos de nucleotídeo não-padronizados. Uma molécula de mRNA de ocorrência não- natural pode ser sintetizada in vitro.
[0103] Em cada uma das Tabelas 1 e 2 abaixo, a coluna NWT indica a base de tipo não-selvagem na posição (Pos.) no CFTR que codifica a sequência (ver, por exemplo, a SEQ ID NO: 3) e a coluna WT indica a base de tipo selvagem na mesma posição (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou a entrada RefSeq para CFTR humano (número de acesso NM_000492,3, de 10 de fevereiro de 2013, versão disponível no GenBank; note que a sequência de NM_000492,3 contém uma sequência sem ser de codificação, de modo que a sequência de codificação ocorre na posição entre 133 e 4575, de modo que, por exemplo, a posição 7 na tabela abaixo corresponde à posição 139 da sequência NM_000492,3).
mRNA de CFTR de ocorrência não-natural.
[0104] Além de fornecer métodos de produção de CFTR funcional in vivo utilizando mRNA de CFTR de ocorrência natural ou tipo selvagem (e composições que compreender aquele mRNA), a invenção também fornece um mRNA de CFTR de ocorrência não-natural que codifica a proteína de CFTR (por exemplo, SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, o mRNA de CFTR de ocorrência não-natural é purificado ou isolado.
[0105] Em outras modalidades, o mRNA de CFTR de ocorrência não- natural está presente em uma célula. Em algumas modalidades, a célula que compreende o mRNA de CFTR de ocorrência não-natural não sintetiza o mRNA de CFTR de ocorrência não-natural e/ou não compreende DNA complementar ao mRNA de CFTR de ocorrência não-natural e/ou um gene de CFTR funcional; a célula pode compreender, opcionalmente, um gene de CFTR inativo, como um gene de CFTR com uma mutação sem sentido, de troca de sentido, de troca de quadro, de inserção ou de deleção que leva ao produto de expressão do gene não-funcional. Em algumas modalidades, a célula que compreende um mRNA de CFTR de ocorrência não-natural compreende a proteína de CFTR funcional transladada de um mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. A célula pode ser, por exemplo, uma célula epitelial pulmonar, uma célula do fígado ou uma célula de rim. Em algumas modalidades, a célula encontra-se em um cultivo celular.
Sequência de codificação de CFTR
[0106] Em algumas modalidades, o mRNA de CFTR, de acordo com a invenção, compreende uma sequência de codificação com menos complementos de promotores crípticos do que a SEQ ID NO: 2 (isto é, a sequência de codificação de CFTR humano de tipo selvagem), menos repetições diretas e/ou invertidas do que a SEQ ID NO: 2, menos códons desfavorecidos do que a SEQ ID NO: 2 e/ou o conteúdo de GC da sequência de codificação é mais baixo do que o conteúdo de GC da SEQ ID NO: 2.
[0107] Os promotores crípticos, as repetições diretas e/ou indiretas e/ou os códons desfavorecidos de uma sequência podem ser reconhecidos por alguém versado na técnica utilizando métodos de rotina. Por exemplo, o conteúdo de repetição direto e/ou invertido de uma sequência pode ser determinado por análise de sequência (Liu et al., Journal of Theoretical Biology (2014) 344: 19-30). O conteúdo do promotor críptico de uma sequência também pode ser determinado por análise de sequência, por exemplo, pela presença de sequências Shine-Dalgarno no construto ou semelhantes.
[0108] Em algumas modalidades, o mRNA de CFTR, de acordo com a invenção, é transcrito in vitro, isto é, o mRNA foi sintetizado em uma configuração artificial, não dentro de uma célula biológica (por exemplo, um sistema de transcrição in vitro sem a célula). Geralmente, a transcrição in vitro envolve o fornecimento de um modelo de DNA que compreende um promotor e uma sequência complementar ao mRNA desejado (o qual pode ser circular ou linear), uma polimerase de RNA e trifosfatos de nucleosídeo em condições de reação apropriadas (sais, tampões e temperatura). Inibidores de RNase, agentes redutores e/ou pirofosfatase podem estar presentes na mistura da reação. Em algumas modalidades, a polimerase de RNA é uma polimerase de RNA T7.
[0109] Em algumas modalidades, o mRNA de CFTR, de acordo com a invenção, compreende uma sequência de codificação que compreende pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das bases de tipo não-selvagem listadas na Tabela 1 nas posições da sequência de codificação listadas na Tabela 1 em relação à sequência de codificação de tipo selvagem da SEQ ID NO: 2. Tabela 1. Bases do tipo não-selvagem que podem ser utilizadas na sequência de codificação de mRNA que codifica CFTR
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
Figure img0005
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
Figure img0009
Figure img0010
[0110] Em algumas formas de realização, o mRNA CFTR de acordo com a invenção compreende uma sequência codificante que compreende pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou, pelo menos, 95% das bases não de tipo selvagem listadas na Tabela 2 nas posições correspondentes da sequência de codificação listados na Tabela 2 em relação à do tipo selvagem sequência de codificação de SEQ ID NO: 2. Tabela 2. Subconjunto de bases do tipo selvagem que não pode ser utilizada na sequência de codificação de mRNA que codifica CFTR.
Figure img0011
Figure img0012
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
Figure img0016
[0111] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um mRNA de CFTR de ocorrência não natural que compreende uma sequência de codificação da SEQ ID NO: 3. Sequências de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural exemplificativos adicionais são descritos na seção de Breve Descrição das Sequências, como, por exemplo, as SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um mRNA de CFTR que compreende uma sequência de codificação pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17. Em algumas modalidades, um mRNA de CFTR de ocorrência não-natural compreende uma 5'UTR, 3'UTR, uma sequência de codificação de peptídeo de sinal ou uma cápsula ou estrutura de cauda, conforme descrito abaixo.
[0112] Os mRNAs de CFTR descritos acima que compreendem uma sequência de codificação que diferente da sequência de codificação de CFTR de tipo selvagem pode proporcionar vantagens quanto à eficácia e facilidade de preparação. Por exemplo, as reações de transcrição in vitro utilizando um polinucleotídeo que compreende uma sequência modelo complementar à sequência de codificação de CFTR pode fornecer um maior rendimento de RNA; um polinucleotídeo que compreende tal sequência modelo pode ser mais estável (isto é, menos propenso a mutação) durante o crescimento em uma célula hospedeira, reduzindo a quantidade de purificação necessária para gerar o modelo utilizável em uma reação; e a tradução in vivo de um mRNA compreendendo a sequência de codificação pode ser maior.
Sequência de Peptídeo de Sinal
[0113] Em algumas modalidades, um mRNA que codifica uma proteína de CFTR incorpora uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal. Conforme utilizado aqui, o termo "peptídeo de sinal" se refere a um peptídeo presente em uma proteína sintetizada recentemente que pode direcionar a proteína na direção da via secretora. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é clivado após a translocação para o retículo endoplasmático que se segue à tradução do mRNA. Peptídeo de sinal também é referido como uma sequência de sinal, sequência principal ou peptídeo principal. Tipicamente, um peptídeo de sinal é um peptídeo curto (por exemplo, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15 ou 5-10 aminoácidos de comprimento). Um peptídeo de sinal pode estar presente na terminação N de uma proteína sintetizada recentemente. Sem que se pretenda se limitar a teoria alguma, a incorporação de um peptídeo de sinal que codifica a sequência em um CFTR que codifica mRNA pode facilitar a secreção e/ou a produção da proteína de CFTR in vivo.
[0114] Um peptídeo de sinal apropriado para a presente invenção pode ser uma sequência heterogênea derivada de várias proteínas eucarióticas e procarióticas, em proteínas secretadas particulares. Em algumas modalidades, um peptídeo de sinal adequado é uma sequência rica em leucina. Ver Yamamoto Y et al. (1989), Biochemistry, 28:2728-2732, que é incorporado aqui por referência. Um peptídeo de sinal adequado pode ser derivado de um hormônio de crescimento humano (hGH), pré- proteína de albumina de soro, precursor de cadeia leve de kappa lg, pré- proteína Azurocidina, precursor de precistatina-S, precursor de tripsinógeno 2, bloqueador de canal de potássio, lp1.3 conotoxina alfa, conotoxina alfa, galactosidase alfa, celulose, nepentesina-1 de proteinase aspártica, quitinase ácida, pré-protoxina K28, precursor de zigocina de toxina matadora e toxina de Cólera. Exemplos de sequências de peptídeo de sinal são descritos em Kober, et al., Biotechnol. Bioeng., 110: 1164-73, 2012, que é aqui incorporado por referência.
[0115] Em algumas modalidades, um CFTR que codifica mRNA pode incorporar uma sequência que codifica um peptídeo de sinal derivado do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de um fragmento seu. Uma sequência não-limitativa de nucleotídeos que codifica um peptídeo de sinal do hGH é exibida abaixo. Sequência do hormônio de crescimento humano 5' (hGH) (SEQ ID NO: 18): AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGA CUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCA UCCCACUCUCC Sequência alternativa do hormônio de crescimento humano 5' (hGH) (SEQ ID NO:19): AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCC UGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAU CCCCCUCUCG
[0116] Em algumas modalidades, um mRNA, de acordo com a presente invenção, pode incorporar um peptídeo de sinal que codifica uma sequência que tenha 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade em relação à SEQ ID NO:18 ou à SEQ ID NO:19.
5'-UTR, 3'-UTR, cauda poli-A, cápsula e resíduos de nucleotideo não-padronizados.
[0117] Em algumas modalidades, o mRNA compreende uma sequência em sua 5'-UTR que é idêntica à SEQ ID NO: 4 ou é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 4.
[0118] Em algumas modalidades, o mRNA compreende uma sequência em sua 3'-UTR que é idêntica à SEQ ID NO: 5 ou é pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 5.
[0119] Em algumas modalidades, o mRNA compreende uma cauda poli-A. Em algumas modalidades, a cauda poli-A tem um comprimento de pelo menos 70, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 400 ou 500 resíduos. Em algumas modalidades, a cauda poli-A tem um comprimento que varia de 70 a 100, 100 a 120, 120 a 150, 150 a 200, ou 200 a 300, 300 a 400 ou 400 a 500 resíduos. Caudas poli A podem ser adicionadas utilizando-se uma variedade de técnicas reconhecidas na técnica. Por exemplo, caudas poli-A longas podem ser adicionadas ao RNA transcrito in vitro ou sintético utilizando uma polimerase de poli-A (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Um vetor de transcrição também pode codificar caudas poli-A longas. Ademais, causas poli-A podem ser adicionadas por transcrição diretamente dos produtos de PCR. Poli A também pode ser ligada à extremidade 3' de um RNA de sentido com ligase de RNA (ver, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edição)). Em algumas modalidades, uma cauda poli-U ou poli-C pode ser usada no lugar ou somada a uma cauda poli-A. Por exemplo, o CFTR que codifica os mRNAS pode incluir uma estrutura de causa poli(C) em 3'. Uma cauda poli-C adequada na terminação 3' do mRNA inclui, tipicamente, cerca de 10 a 200 nucleotídeos de citosina (por exemplo, cerca de 10 a 150 nucleotídeos de citosina, cerca de 10 a 100 nucleotídeos de citosina, cerca de 20 a 70 nucleotídeos de citosina, cerca de 20 a 60 citosina nucleotídeos ou cerca de 10 a 40 nucleotídeos de citosina). A cauda poli-C pode ser adicionada à cauda poli-A ou pode substituir a cauda poli-A.
[0120] Em algumas modalidades, o mRNA compreende uma cápsula em 5', por exemplo, uma estrutura cap1. Para mRNA como cápsula de enzima e procedimentos, ver, por exemplo, Fechter, P.; Brownlee, G.G. “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins” J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249; publicação de patente europeia 2 010 659 A2; Patente U.S. N° 6.312.926. Uma cápsula 5' é, tipicamente, adicionada da seguinte maneira: primeiro, uma fosfatase terminal de RNA remove um dos grupos de fosfatase terminal do nucleotídeo 5', deixando duas fosfatases terminais; trifosfato de guanosina (GTP) é então adicionado aos fosfatos terminais por meio de transferase de guanilil, produzindo uma ligação de 5'5'5 trifosfato; e o 7-nitrogênio da guanina é então metilado por uma metiltransferase. Exemplos de estruturas de cápsula incluem, mas não estão limitados a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A e G(5')ppp(5')G.
[0121] Em algumas modalidades, o mRNA compreende um ou mais resíduos de nucleotídeo não-padronizados. Os resíduos de nucleotídeo não-padronizados podem incluir, por exemplo, 5-metil-citidina ("5mC"), pseudouridina ("ΦU") e/ou 2-tio-uridina ("2SU"). Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 8.278.036 ou WO2011012316 para uma discussão acerca de tais resíduos e de sua incorporação em mRNA. Em algumas modalidades, o mRNA pode ser RNA SNIM. Conforme utilizado aqui, RNA SNIM é um acrônimo de RNA Mensageiro Não-imunogênico Estabilizado, designando RNAs mensageiros produzidos por transcrição in vitro (IVT), incluindo certas porcentagens de nucleotídeos modificados na reação por IVT, conforme descrito na Publicação PCT WO 2011/012316. O RNA SNIM utilizado nos exemplos aqui divulgados foi produzido por IVT, em que 25% dos resíduos U foram de 2-tio-uridina e 25% dos resíduos C foram 5- metilcitidina. A presença de resíduos de nucleotídeo não-padronizados pode tornar o mRNA mais estável e/ou menos imunogênico do que o mRNA de controle com a mesma sequência, porém contendo apenas resíduos padrão. Em outras modalidades, o mRNA pode compreender um ou mais resíduos de nucleotídeo não-padronizados escolhidos dentre: isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracil, 5-propiniluracil, 6- aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina e citosina 2-cloro-6- aminopurina, assim como combinações dessas modificações e outras modificações de nucleobase. Certas modalidades podem incluir, ainda, modificações adicionais ao anel de furanose ou à nucleobase. As modificações adicionais podem incluir, por exemplo, modificações ou substituições de açúcar (por exemplo, uma ou mais de uma modificação de 2'-O-alquil ou um ácido nucleico bloqueado (LNA)). Em algumas modalidades, os RNAs podem ser complexado ou hibridizados com polinucleotídeos adicionais e/ou polinucleotídeos de peptídeo (PNA). Em modalidades onde a modificação de açúcar for uma modificação de 2'-O- alquil, tal modificação pode incluir, mas não está limitada a uma modificação de 2'-desóxi-2'-fluor, uma modificação de 2'-O-metil, uma modificação de 2'-O-metóxietil e uma modificação de 2'-deóxi. Em certas modalidades, qualquer uma dentre essas modificações podem estar presentes em 0-100% de nucleotídeos, por exemplo, mais de 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95 % ou 100% dos nucleotídeos constituintes, individualmente ou em combinação.
Composições que compreendem mRNA de CFTR
[0122] Em certas modalidades, as moléculas de mRNA da invenção podem ser administradas como mRNA puro ou não-embalado. Em algumas modalidades, a administração do mRNA nas composições da invenção pode ser facilitada pela inclusão de um transportador adequado. Em certas modalidades, o transportador é selecionado com base na sua capacidade de facilitar a transfecção de uma célula alvo com um ou mais mRNAs.
[0123] Conforme utilizado aqui, o termo "transportador" inclui qualquer um dos transportadores farmacêuticos padrão, veículos, diluentes, excipientes e semelhantes, que são geralmente destinados à utilização em conexão com a administração de agentes biologicamente ativos, incluindo mRNA.
[0124] Em certas modalidades, os transportadores utilizados nas composições da invenção podem compreender uma vesícula lipossômica ou outros meios para facilitar a transferência de um mRNA aos tecidos e/ou às células alvo. Os transportadores apropriados incluem, mas não estão limitados a, transportadores à base de polímero, como polímeros de polietileneimina (PEI) e de bloqueio multidomínio, nanopartículas de lipídio e lipossomos, nanolipossomos, nanolipossomos contendo ceramida, proteolipossomos, exossomos de derivação sintética e natural, corpos lamelares sintéticos e semissintéticos, nanoparticulados, nanoparticulados de fosfato de cálcio, nanopartículas de dióxido de silício, pós secos, poli(D- arginina), nanodendrímeros, sistemas de distrição à base de amido, micelas, emulsões, sol-gel, niossomos, plasmídeos, vírus, nucleotídeos de fosfato de cálcio, aptâmeros, peptídeos, conjugados de peptídeo, conjugados direcionados a moléculas pequenas e outras marcações vetoriais. Também é contemplado o uso de bionanocápsulas e outros conjuntos de proteínas de capsídeo viral como transportadores adequados. (Hum. Gene Ther. 2008 Sep;19(9):887-95).
[0125] Em algumas modalidades, o transportador compreende um cátion orgânico, como um lipídio catiônico ou um polímero orgânico catiônico. Se estiver presente, o lipídio catiônico pode ser um componente de vesículas lipossômicas que encapsulam o mRNA.
[0126] Em certas modalidades da invenção, o transportador é formulado utilizando um polímero como transportador, sozinho ou em combinação com outros transportadores. Os polímeros adequados podem incluir, por exemplo, poliacrilatos, polialquicianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactido-poliglicólido, policaprolactonas, dextrano, albumina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas, protamina, protamina PEGuilada, PLL, PLL PEGuilada e polietilenimina (PEI). Quando PEI estiver presente, ele pode ser PEI ramificada com um peso molecular que varia de 10 a 40 kDa, por exemplo, PEI ramificada de 25 kDa (Sigma # 408727). Exemplos de polímeros adicionais adequados para a presente invenção incluem os descritos na Publicação PCT WO2013182683, o conteúdo da qual é aqui incorporado por referência.
[0127] A utilização de transportadores de lipossomos para facilitar a distribuição de polinucleotídeos às células alvo é contemplada pela presente invenção. Os lipossomos (por exemplo, nanopartículas de lipídios lipossomais) são geralmente úteis em uma variedade de aplicações em pesquisa, na indústria e na medicina, particularmente para seu uso como transportadores de compostos terapêuticos ou de diagnóstico in vivo (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999) e são normalmente caracterizados como vesículas microscópicas com um espaço interior aquoso sequestrado de um meio externo por uma membrana de uma ou mais camadas duplas. Membranas de camada dupla de lipossomos são tipicamente formadas por moléculas anfifílicas, como lipídios de origem sintética ou natural que compreendem domínios hidrofóbicos e hidrofílicos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). As membranas de camada dupla dos lipossomos também podem ser formadas por polímeros anfifílicos e surfactantes (por exemplo, polimerossomos, niossomos, etc.). Em certas modalidades, o mRNA é complexado com nanopartículas de lipídio para facilitar a distribuição à célula alvo. Em certas modalidades, as composições da invenção podem ser combinadas com uma mistura de lipídios multicomponente utilizando um ou mais lipídios catiônicos, lipídios adicionais, como lipídios não-catiônicos (também referidos como lipídios auxiliares), lipídios à base de colesterol e/ou lipídios PEGuilados para encapsulamento de mRNA.
Lipídios Catiônicos
[0128] Em algumas modalidades, uma nanopartícula de lipídio apropriada contém um lipídio catiônico. Conforme utilizado aqui, o termo "lipídio catiônico" se refere a qualquer um dentre uma série de espécies de lipídio que têm uma carga positiva de rede a um pH selecionado, como pH fisiológico. Alguns lipídios catiônicos, em particular os que são conhecidos como lipídios catiônicos tituláveis ou tituláveis por pH, são particularmente efetivos na distribuição do mRNA. Vários lipídios catiônicos (por exemplo, os tituláveis) foram descritos na literatura, muitos deles encontram-se disponíveis no mercado. Lipídios catiônicos particularmente adequados para utilização nas composições e métodos da invenção incluem os descritos nas publicações internacionais de patente WO 2010/053572 (e, particularmente, C12-200, descrito no parágrafo [00225]) e WO 2012/170930, ambos incorporados aqui por referência. Em algumas modalidades, o lipídio catiônico CKK-E12 é usado (divulgado em WO 2013/063468), cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o lipídio catiônico N- [l- (2,3- dioleilóxi) propil] -N, N, N-trimetilamônio, ou "DOTMA", é usado. (Feigner et al. (Proc. Natl Acad. Sei. 84, 7413 (1987); Pat. U.S. No. 4.897.355). DOTMA pode ser formulado isoladamente ou pode ser combinado com o lipídio neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina, ou "DOPE", ou com outros lipídios catiônicos ou não-catiônicos em um veículo de transferência lipossômica ou uma nanopartícula de lipídio, e tais lipossomos podem ser usados para melhorar a distribuição de ácidos nucleicos nas células alvo. Outros lipídios catiônicos adequados incluem, por exemplo, 5- carboxiespermilglicinedioctadecilamido, ou "DOGS", 2,3-dioleilóxi-N- [2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-l-propanamínio ou "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Pat. U.S. N° 5.171.678; Pat. U.S. N° 5.334.761), l,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano, ou "DODAP", l,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano, ou "DOTAP". Os lipídios catiônicos contemplados também incluem l,2-distearilóxi-N,N-dimetil-3-aminopropano, ou "DSDMA", 1,2-dioleilóxi-N,N-dimetil-3-aminopropano, ou "DODMA", 1, 2- dilinoleilóxi-N,N-dimetil-3-aminopropano, ou "DLinDMA", l,2-dilinolenilóxi- N,N-dimetil-3-aminopropano, ou "DLenDMA", cloreto de N-dioleil-N, N- dimetilamônio, ou "DODAC", N, brometo de N-distearil--N,N- dimetilarnrnônio, ou "DDAB", brometo de amônio de N-(l,2-dimiristilóxiprop- 3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil,ou "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3- beta-óxibutano-4-óxi)-l-(cis,cis-9,12-octadecadienóxi)propano, ou "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-óxi)-3'-oxapentóxi)-3-dimetil-l-(cis,cis- 9', l-2'-octadecadienóxi)propano, ou "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4- dioleilóxibenzilamina, ou "DMOBA", 1, 2-N, N'-dioleilcarbamil-3- dimetilaminopropano, ou "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoilóxi-N,N- dimetilpropilamina, ou "DLinDAP", l,2-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano, ou "DLincarbDAP", l,2-Dilinoleoilcarbamil-3- dimetilaminopropano, ou "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil- [l,3]-dioxolano, ou "DLin - - DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[l,3]- dioxolano, ou "DLin-K-XTC2-DMA", e 2-(2,2-di ((9Z,12Z)-octadeca-9, l 2- dien-1-il)-l,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (ver, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)), ou misturas destes. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicação PCT WO2005/121348A1).
[0129] Em certas modalidades, as composições e métodos da invenção utilizam nanopartículas de lipídio que compreendem um lipídio catiônico ionizável descrito no pedido de patente provisório U.S. 61/617.468, depositado em 29 de março de 2013 (aqui incorporado por referência), como, por exemplo, (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z) octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1 -il)tetracosa-4,15,18- trieno-1-amina (HGT5001) e (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca- 9, 12-dien-1-il)tetracosa-5, 15, 18-trien-1-amina (HGT5002).
[0130] Em algumas modalidades, um ou mais dos lipídios catiônicos presentes em uma composição dessas compreendem pelo menos um dentre um imidazol, dialquilamino ou porção de guanidínio. Em uma modalidade preferível, um ou mais lipídios catiônicos não compreendem uma amina quaternária.
Lipídios não-catiônicos/auxiliares
[0131] Em algumas modalidades, uma nanopartícula de lipídio apropriada contém um ou mais lipídios não-catiônicos ("auxiliares"). Conforme utilizado aqui, o termo "lipídio não-catiônico" se refere a qualquer lipídio aniônico, zwitteriônico ou neutro. Conforme utilizado aqui, o termo "lipídio catiônico" se refere a qualquer um dentre uma série de espécies de lipídio que têm uma carga positiva de rede a um pH selecionado, como pH fisiológico. Em algumas modalidades, um lipídio não-catiônico é um lipídio neutro, isto é, um lipídio que não transporta uma carga de rede nas condições sob as quais a composição é formulada e/ou administrada. Os lipídios não-catiônicos incluem, mas não estão limitados a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina- fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina-4-(N- maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato (DOPE-Mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimuristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil- fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1- trans PE, l-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE) ou uma mistura destes.
Lipídios à base de colesterol
[0132] Em algumas modalidades, uma nanopartícula de lipídio apropriada compreende um ou mais lipídios à base de colesterol. Por exemplo, os lipídios catiônicos à base de colesterol apropriados incluem, por exemplo, colesterol, colesterol PEGuilado, DC-Choi (N, N-dimetil-N- etilcarboxamidocolesterol), l,4-bis(3-N-oleilamino-propil) piperazina ( Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Pat. U.S. N° 5.744.335) ou ICE.
Lipídios PEGuilados
[0133] Em algumas modalidades, uma nanopartícula de lípidio adequada compreende um ou mais lipídios PEGuilados. Por exemplo, o uso de fosfolipídios (PEG)-modificados de glicol de polietileno e lipídios derivados, como ceramidas derivadas (PEG-CER), incluindo N-Octanoil- esfingosina-l-[Sucinil(Glicol de Metoxipolietileno) -2000] (ceramida de C8 PEG-2000) é contemplado pela presente invenção em combinação com um ou mais dos lipídios catiônicos e, em algumas modalidades, outros lipídios. Em algumas modalidades, os lípidos PEGuilados adequados compreendem PEG-ceramidas possuindo cadeias de acil mais curtas (por exemplo, C14 ou C18). Em algumas modalidades, o lipídio PEGuilado DSPE-PEG-maleimida- Lactina pode ser usado. Outros lipídios PEG-modificados contemplados incluem, sem se limitar a, uma cadeia de glicol de polietileno de até 5 kDa de comprimento acoplada de forma covalente a um lipídio com cadeia(s) de alquil de C6-C20 de comprimento. Sem que se pretenda se limitar a uma teoria particular, contempla-se que a adição dos lipídios PEGuilados pode evitar a agregação complexa e aumentar a vida útil da circulação a fim de facilitar a distribuição do mRNA encapsulado por lipossomo à célula alvo.
[0134] Em certas modalidades, a composição compreende uma das seguintes combinações de lípidos: C12-200, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT5001, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; XTC, DSPC, colesterol, PEG-DMG; MC3, DSPC, colesterol, PEG-DMG; ALNY-100, DSPC, colesterol, PEG-DSG; CKK-E12, DOPE, Col, PEGDMG2K.
[0135] Em algumas modalidades, as razões lípido:mRNA pode ser de 5: 1 (mg: mg), 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 e superior, até 30:1 (mg:mg) ou mais. Razões N/P podem estar na faixa de 1.1:1 a 10:1 ou superior. Razões de lipídio exemplificativas são: de 40:30:20:10, 55:20:20:5, 50:25:20: 5 (lípido catiônico:lípido auxiliar:col:lipídio PEG).
[0136] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas, de acordo com a invenção, não compreendem um agente mucolítico (por exemplo, N-acetilcisteína, erdosteína, bromheksina, carbocisteína, guiafenesina ou glicerol iodado).
Aparelhos carregados com uma composição farmacêutica
[0137] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção, como uma composição à base de lipídio catiônico ou à base de PEI compreendendo um mRNA de CFTR de ocorrência não- natural, é fornecido em um aparelho para administração ao sistema respiratório de um indivíduo. O aparelho pode ser, por exemplo, um aparelho de instilação, aerossolização ou nebulização. Aparelhos adequados incluem, por exemplo, um jato nebulizador PARI Boy, nebulizador Aeroneb® Lab, MicroSprayer® ou nebulizador com malha eFLOW. Alternativamente, podem ser utilizados inaladores de pó seco ou aparelhos de tratamento por aerossol, como inaladores portáteis.
Usos e Métodos mRNA para usos e métodos de acordo com a invenção
[0138] Entre outras coisas, a presente invenção fornece métodos para produção in vivode uma proteína de CFTR, em particular em um pulmão de um mamífero. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para induzir a expressão de CFTR nas células epiteliais do pulmão de um mamífero, compreendendo o contato das células epiteliais com uma composição farmacêutica compreendendo um mRNA transcrito in vitro, onde o mRNA transcrito in vitro compreende uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1 (a sequência de aminoácidos de CFTR humano de tipo selvagem). A invenção também proporciona a utilização de composições farmacêuticas que compreendem um mRNA transcrito in vitro, em que o mRNA transcrito in vitro compreende uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1, para a indução da expressão de CFTR nas células epiteliais do pulmão de um mamífero.
[0139] A invenção fornece ainda métodos de indução de expressão de CFTR em uma célula alvo de mamífero, o método compreendendo o contato da célula alvo de mamífero com uma composição, compreendendo a composição um mRNA transcrito in vitro que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1. A invenção proporciona ainda uma utilização de uma composição, compreendendo a composição um mRNA transcrito in vitro codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, para a indução da expressão de CFTR em uma célula alvo de um mamífero.
[0140] Em algumas modalidades de tais usos e métodos de tratamento, o mRNA transcrito in vitro é um mRNA de ocorrência natural ou de tipo selvagem que codifica o CFTR humano (SEQ ID NO: 2). Em outras modalidades, o mRNA transcrito in vitro é um mRNA de ocorrência não- natural, conforme descrito acima.
[0141] Em certas modalidades, o mRNA transcrito in vitro compreende uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1, que é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 2 (sequência de codificação do mRNA de CFTR humano de tipo selvagem).
[0142] O mRNA compreendendo uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1, que é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, pode ter um promotor críptico, uma repetição direta e invertida e/ou um conteúdo de GC maiores do que o mRNA discutido acima. Observou-se que os vetores compreendendo a SEQ ID NO: 2 foi frequentemente submetida a mutações de inserção/deleção/rearranjo em células hospedeiras sob condições típicas de crescimento, resultando em uma população heterogênea de vetores que não poderia ser usada diretamente para a transcrição in vitro. Descobriu-se que as células hospedeiras de crescimento sob condições como baixa temperatura, luz moderada e/ou células de cópia baixas, como CopyCutter®, reduzem, mas não eliminam a ocorrência de mutação. Por conseguinte, pode ser aconselhável para a transcrição in vitro reações de mRNA que compreendam uma sequência de codificação pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 2, para usar um modelo obtido pelo crescimento do vetor conforme descrito acima, coletando e linearizando o vetor e purificando as espécies desejadas para uso na reação de transcrição. A etapa de purificação pode ser, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho ou troca de ânion fraco.
[0143] O mRNA transcrito in vitro para os usos e métodos de acordo com a invenção pode compreender uma 5'-UTR, 3'UTR, causa poli-A, poliU e/ou poli-C, cápsula e/ou resíduos de nucleotídeo não-padronizados, conforme discutido na seção acima no que diz respeito a essas características.
Composições farmacêuticas para os usos e métodos
[0144] As composições farmacêuticas para utilização de acordo com a invenção podem compreender mRNA para usos e métodos de acordo com a invenção conforme descrito na seção anterior e os ingredientes adicionais conforme discutido na seção acima no que diz respeito às composições que compreendem o mRNA de CFTR. Assim, são contemplados a utilização e/ou administração de composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos transportadores discutidos acima.
[0145] Em algumas modalidades preferíveis, as composições farmacêuticas compreendem PEI, como PEI ramificada com um peso molecular na faixa de 10-40 kDa, por exemplo: 25 kDa.
[0146] Em outras modalidades preferíveis, as composições farmacêuticas compreendem um lípido catiônico, um lípido peguilado e um lípido adicional (como um lípido neutro). Os lipídios catiônicos, lipídio peguilado e/ou lípido adicional podem ser escolhidos dentre os listados na seção acima quanto às composições compreendendo o mRNA de CFTR.
Vias de administração para a indução da expressão no pulmão
[0147] Em algumas modalidades dos métodos e usos para indução da expressão de CFTR no pulmão de um mamífero, uma composição farmacêutica, conforme descrita acima, é administrada por uma via escolhida dentre: instilação intratraqueal, nebulização e aerossolização. O aparelho para administrar a composição pode ser escolhido dentre os aparelhos listados na secção acima quanto aos aparelhos carregados com uma composição farmacêutica.
[0148] Nas modalidades preferíveis, a composição é administrada por meio de nebulização ou de aerossolização. Algumas formulações lipídicas podem apresentar uma tendência para se agregar quando a nebulização é experimentada, mas, em geral, é possível resolver questões de agregação através do ajuste da formulação, por exemplo: substituindo- se o lipídio catiônico.
Tratamento de fibrose cística
[0149] Entre outras coisas, a presente invenção pode ser utilizada para o tratamento de fibrose cística. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método de tratamento da fibrose cística por administração a um sujeito com necessidade de tratamento de um mRNA que codifica uma proteína de CFTR, tal como aqui descrito ou de uma composição farmacêutica contendo o mRNA. O mRNA ou uma composição farmacêutica contendo o mRNA podem ser administrados diretamente ao pulmão do indivíduo. Podem ser utilizadas várias vias de administração para a administração pulmonar. Em algumas modalidades, um mRNA ou uma composição contendo um mRNA aqui descrito é administrado por inalação, nebulização ou aerossolização. Em várias modalidades, a administração dos resultados de mRNA na expressão de CFTR no pulmão do indivíduo (por exemplo, células epiteliais do pulmão).
[0150] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um método de tratamento de fibrose cística através da administração aos pulmões de um indivíduo carente de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação que codifica a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento da fibrose cística através da administração ao pulmão de um indivíduo em necessidade de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1. Em outra modalidade particular, a presente invenção fornece um método de tratamento de fibrose cística através da administração aos pulmões de um indivíduo carente de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento da fibrose cística através da administração ao pulmão de um indivíduo em necessidade de tratamento um mRNA que compreende uma sequência de codificação pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3. Os mRNAs de CFTR de ocorrência não-natural exemplificativos que podem ser usados para o tratamento de fibrose cística são descritos na seção de Breve Descrição das Sequências, como, por exemplo, as SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17. Em algumas modalidades, os mRNAs de CFTR de ocorrência não-natural que podem ser usados para o tratamento de fibrose cística compreende uma sequência de codificação pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16ou 17.
EXEMPLOS
[0151] Os exemplos específicos a seguir devem ser interpretados como meramente ilustrativos e não limitantes no que diz respeito ao restante desta divulgação de maneira nenhuma. Sem um aprofundamento, acredita-se que um indivíduo versado na técnica possa, com base na descrição neste documento, utilizar a presente invenção em toda sua extensão.
[0152] A menos que indicado de outro modo, o mRNA de CFTR e o RNA SNIM usados nos exemplos aqui divulgados compreenderam uma 5' UTR com a sequência da SEQ ID NO: 4, uma sequência de codificação (CDS) com a sequência da SEQ ID NO: 3 e uma 3' UTR com a sequência da SEQ ID NO: 5. O mRNA de FFL e o RNA SNIM usados nos exemplos aqui divulgados compreenderam uma 5' UTR e uma 3' UTR com as sequências da SEQ ID NOS: 6, 7 e 8, respectivamente.
Exemplo 1: mRNA sintetizado in vitro que codifica o CFTR
[0153] Síntese do RNA mensageiro. O mRNA regulador da condutância da transmembranar da fibrose cística humano (CFTR) e o mRNA de luciferase de vagalume (FFL) foram sintetizados por transcrição in vitro de um modelo de DNA de plasmídeo que codifica o gene, que foi seguido pela adição de uma estrutura de cápsula 5' (cápsula 1) (Fechter, P.; Brownlee, GG. “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins” J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) e uma cauda 3' poli(A) de aproximadamente 200 nucleotídeos de comprimento, conforme determinado por eletroforese de gel. As regiões 5' e 3' não-traduzidas estavam presentes em cada produto do mRNA.
[0154] Exemplos de mRNAs de CFTR incluem a SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:17, descritos na seção de Breve Descrição das Sequências.
Exemplo 2: Expressão de CFTR e Atividade em células HEK
[0155] Este exemplo demonstra que a proteína de CFTR totalmente funcional é expressa a partir do mRNA de CFTR sintético humano distribuído às células.
[0156] Transfecção de CFTR e células. Células HEK293T embrionárias de rim humano foram cultivadas em DMEM (Invitrogen Cat # 11965-092) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L- Glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. No dia anterior à transfecção, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços a 50-60% de confluência e foram incubadas sob condições de cultivo de tecidos normais (36°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar). 60 μl de Lipofetamina 2000 (Invitrogen Cat # 11668019) foram diluídos em 900 μl de OptiMem reduzidos em meios de soro (Invitrogen Cat # 31985-062) e agitados suavemente. 24 μl do mRNA de CFTR (4 μl por placa) foram diluídos em 900 μl de meios de Optimem. O mRNA foi imediatamente adicionado à Lipofetamina diluída e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. Os meios de plaqueamento foram suavemente aspirados das células HEK293T e substituído com 1 ml de meio de soro OptiMem reduzido. 300 μl do complexo de mRNA/lipofetamina foi adicionado a cada poço e as células deixadas em repouso em condições de cultivo de tecidos normais durante 24 horas antes de serem replaqueadas por desprendimento mecânico de lamínulas de revestimento de vidro revestido (BD Biosciences, BD Biocoat), de modo que as células poderiam ser facilmente transferidas a uma câmara de registro para registro eletrofisiológico. As células foram incubadas sob condições padrão de cultivo de tecido por um período mínimo de 24 horas adicionais e foram usadas em 48 horas de plaqueamento final.
[0157] Gravação Eletrofisiológica. Registros de fixação de remendo de célula inteira foram conduzidos à temperatura ambiente usando um amplificador Axopatch 200B com eletrodos de 5-8 MQ. Os dados foram digitalizados (50 kHz) e filtrados (5 kHz) apropriadamente. A resistência em série foi compensada (70-80%) para minimizar os erros de voltagem. Registros de fixação de voltagem foram realizados com soluções em pipeta a partir da seguinte composição: 140 mM NMDG-Cl; 5 mM EGTA; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES; pH 7.2; 310 mOsm/l. A solução de banho continha: 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 e 10 mM de HEPES; pH 7,3, ajustado para 315 mOsm/l com D-glicose. Registros de fixação de voltagem foram iniciados 3-5 minutos após o estabelecimento da configuração da célula inteira.
[0158] As células foram fixadas por voltagem a um potencial de retenção de -60 mV ou 0 mV e uma série de etapas de voltagens positivas e negativas (de -80 mV a +80 mV ou -100 a +100 mV em incrementos de 20 mV) injetados nas células HEK293T registradas para evocar as correntes de cloreto (Cl-) de célula inteira induzidas por CFTR. A membrana permeável análoga de cAMP, 8-Br-cAMP (500 μM, Sigma Aldrich) foi aplicada por 4 minutos a células gravadas para facilitar as correntes de CFTR. O bloqueador de CFTR "padrão ouro", CFTRinh-172 (10 μM, Sigma) foi aplicado na extremidade de cada registro para bloquear a corrente de Cl- induzida por CFTR. Registros de controles foram realizados em células HEK293T não-transfectadas.
[0159] Compostos de Teste. Os compostos de teste foram aplicados utilizando um sistema de perfusão rápida DAD-16VC (ALA Scientific Instruments, EUA) com a pipeta de ejeção colocada a aproximadamente 200 μm da célula registrada. 8-Br-cAMP foi produzido como uma concentração de estoque de 500 mM em ddH20. CFTRinh-172 foi produzido como um estoque de 10 mM em DMSO. Todos os compostos foram armazenados a -20°C e foram rapidamente descongeladas e diluídos à concentração final desejada imediatamente antes da utilização.
[0160] Análise. Toda a análise foi conduzida usando Clampfit (MDS Analytical Technologies) e o software Excel (Microsoft). Todos os valores são de amplitude de corrente máxima evocada ao pico. As diferenças estatísticas nos dados foram avaliadas pelo teste t de Student, pareadas ou não-pareadas conforme apropriado e consideradas significativas em P < 0,05.
[0161] Produção da proteína de CFTR humana in vitro A produção da proteína CFTR humana através do mRNA de hCFTR foi realizada por meio da transfecção do mRNA de CFTR humano nas células HEK293T aqui descritas. Células tratadas e não-tratadas foram coletadas e submetidas a métodos de imunoprecipitação 24 horas após a transfecção. A detecção da proteína CFTR humana através da análise Western blot demonstra que a proteína de CFTR glicosilada inteiramente complexa (designada como banda "C") foi produzida a partir do RNA mensageiro sintético (Figura 1A).
[0162] Atividade da proteína de CFTR humana in vitro. Para determinar a atividade da proteína de CFTR derivada do mRNA do CFTR humano sintético produzida após a transfecção, análises de fixação de remendo celular foram realizadas nas células HEK 293 e HEK 293T. Células tratadas, bem como células de controle (não-tratados e transfectadas por simulação), foram submetidas aos substratos ativadores (8-Br-cAMP, forskolin) e inibidores (CFTRinh-172, GlyH-101) para ajudar a determinar alterações no fluxo da corrente (transporte por íon de cloreto).
[0163] Células HEK293T foram transfectadas com 4 ug de mRNA de hCFTR e analisadas 24 horas após a transfecção. Análises de fixação de células foram conduzidas para medir o fluxo corrente, conforme representado pelo transporte de íon de cloreto a partir da aplicação de uma voltagem estabelecida. Um gráfico de corrente x voltagem como resultado de uma rampa de voltagem de -80 mV por +80 mV (representado na Figura 2) demonstra diferenças substanciais na corrente em comparação entre células tratadas com mRNA de hCFTR contra células não-tratadas. Tal aumento na corrente após a exposição a 8-Br-cAMP, um conhecido ativador da proteína de CFTR, sugere que a proteína de CFTR humana está presente nessas células. A partir do tratamento dessas células previamente transfectadas com um inibidor de CFTR específico conhecido, CFTRinh-172, a respectiva corrente é reduzida novamente próximo aos níveis de controle (diminuição de ~89%). Essa diminuição após a exposição a esse inibidor corrobora fortemente a presença da proteína de CFTR humana. Esses resultados demonstram que o mRNA de hCFTR sintético pode produzir proteínas de CFTR humanas ativas.
[0164] Separadamente, análises da atividade de célula inteira de CFTR foram realizadas usando um sistema automatizado (IonWorks) em células HEK293. Como descrito acima, células tratadas, bem como células de controle (não-tratadas e transfectadas por simulação), foram submetidas aos substratos ativadores e inibidores para ajudar a determinar alterações no fluxo da corrente (transporte por íon de cloreto). Nesses estudos, forskolina foi empregada como ativadora da proteína de CFTR e uma porção das células transfectadas por mRNA de hCFTR foram expostas adicionalmente a um inibidor de CFTR específico diferente, GlyH-101. Acredita-se que GlyH-101 funcione como um bloqueador de poros de CFTR que age a partir do lado extracelular da membrana celular da proteína. Notavelmente, este mecanismo de ação é diferente de CFTRinh-172, o qual é relacionado com a função do lado intracelular da proteína de CFTR.
[0165] A Figura 4 representa um gráfico de corrente-tensão da linha de células parentais HEK293 tratadas com forskolina, bem como GlyH-101. Nenhuma alteração significativa na corrente foi observada, sugerindo que esses ativadores/inibidores específicos de CFTR não têm efeito sobre as proteínas endógenas presentes na linha celular.
[0166] Um gráfico de corrente x voltagem como resultado de uma rampa de voltagem de -100 mV por +100 mV (representado na Figura 5) demonstra diferenças substanciais na corrente em comparação entre células HEK293 não-tratadas contra células tratadas com mRNA de hCFTR. Esse aumento na corrente após a exposição à forskolina, um ativador conhecido da proteína de CFTR, é indicativo de que a proteína de CFTR humana está presente nessas células. A partir do tratamento dessas células previamente transfectadas com um inibidor de CFTR específico conhecido, GlyH-101, a respectiva corrente é reduzida novamente próximo aos níveis de controle (diminuição de ~95%). Essa diminuição após a exposição a esse inibidor corrobora fortemente a presença da proteína de CFTR humana.
[0167] No total, esses dados de inibição que são um resultado de dois mecanismos distintos corrobora fortemente a identidade de uma proteína de CFTR completamente funcional derivada do RNA mensageiro de CFTR humano sintético.
Exemplo 3: Expressão in vivo de CFTR
[0168] Esse exemplo demonstra que a proteína de CFTR é expressa efetivamente in vivo a partir de um CFTR que codifica um mRNA distribuído através de administração pulmonar.
[0169] Protocolo da Formulação 1. Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de C12-200, DOPE, Chol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa de tampão (10 mM de citrato/150 mM de NaCl, pH 4,5) de mRNA de CFTR foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lípido foi injetada rapidamente em uma solução aquosa de mRNA e agitada para render uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultante foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), seguido por água, concentrada e armazenada a 2-8oC. Concentração final = 1,09 mg/mL de mRNA de CFTR (encapsulado). Zave = 80,2 nm (DV(50) = 55,5 nm; DV(90) = 99,6 nm).
[0170] Protocolo de Formulação 2. Alíquotas de uma solução aquosa de PEI de 2,0 mg/mL (ramificada, 25 kDa) foram misturadas com solução aquosa de mRNA de CFTR (1,0 mg/mL). A mistura complexada resultante foi pipetada para cima e para baixo várias vezes e posta de lado por 20 minutos antes da injeção. Concentração final = 0,60 mg/mL de mRNA de CFTR (encapsulado). Zave = 75,9 nm (Dv(50) = 57,3 nm; Dv(90) = 92,1 nm).
[0171] Análise da proteína de CFTR e FFL produzida através de nanopartículas carregadas com mRNA administradas por via intratraqueal. Todos os estudos foram realizados usando camundongos fêmea BALB/C ou KO de CFTR. Amostras de FFL foram introduzias através da respectiva dose por instilação direta (MicroSprayer®) ou nebulização (PARI Boy ou Aeroneb) de mRNA de FFL encapsulado. O mRNA de CFTR foi introduzido utilizando-se um nebulizador de jato PARI Boy. Os camundongos foram sacrificados e perfundidos com salina após dando-se tempo o bastante para a expressão.
[0172] Administração intratraqueal de mRNA de FFL. Os materiais de teste de FFL foram administrados por uma única administração de aerossol intratraqueal através de Microsprayer™ (50 μL/animal) enquanto os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina de 50-100 mg/kg e xilazina de 5-15 mg/kg.
[0173] Administração de nebulização (aerossol) de mRNA de FFL. Os materiais de teste de FFL foram administrados por uma única inalação de aerossol através de um nebulizador Aeroneb® Lab (volume de dose nominal de até 8 mL/grupo). O material de teste foi distribuído a uma caixa contendo o grupo completo de animais (n = 4) e conectado ao sistema sequestrante e ao fluxo de oxigênio.
[0174] Administração de mRNA de CFTR. O mRNA de CFTR foi preparado da maneira descrita no Exemplo 6 abaixo. Quatro camundongos nocaute de CFTR foram colocados em uma caixa com câmara de aerossol e expostos ao mRNA de CFTR humano não-modificado otimizado por códon total de 2 mg (compreendendo a sequência de codificação da SEQ ID NO: 3) através de nebulização (nebulizador de jato Pari Boy) durante o período de aproximadamente uma hora. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a exposição.
[0175] Eutanásia. Os animais foram submetidos a eutanásia por asfixia em CO2 a administrações pós-dose em uma quantidade representativa (± 5%), seguido de toracotomia e exsanguinação. Todo o sangue (volume máximo alcançável) foi coletado através de puntura cardíaca e descartado.
[0176] Perfusão. Na sequência da exsanguinação, todos os animais foram submetidos a perfusão cardíaca com solução salina. Em breve, toda a perfusão intracardíaca corporal foi realizada inserindo-se uma agulha de calibragem 23/21 acoplada a uma seringa de 10 mL contendo soro fisiológico no lúmen do ventrículo esquerdo para a perfusão. O átrio direito foi incisado para fornecer uma saída de drenagem para o perfundido. Uma pressão suave e constante foi aplicada ao êmbolo para perfundir o animal depois de a agulha ter sido posicionado no coração. O fluxo adequado da solução de lavagem foi assegurado quando o perfundido de saída flui de maneira clara (livre de sangue visível), indicando que a solução de lavagem saturou o corpo e que o procedimento está completo.
[0177] Coleta de tecido. Após a perfusão, todos os animais apresentavam o fígado e os pulmões (direito e esquerdo) coletados. Grupos selecionados tiveram aproximadamente metade do fígado e ambos os pulmões (direito e esquerdo) submetidos a congelação rápida em nitrogênio líquido e armazenados separadamente a simbólicos -70oC. Grupos selecionados tiveram aproximadamente metade do fígado, por animal, colocada em um cassete de histologia. Ademais, os pulmões foram inflados com 10% de NBF através de uma cânula inserida na traqueia. A traqueia foi amarrada com uma ligadura e os pulmões (direito e esquerdo) e a traqueia foram colocados, intactos, em um cassete de histologia por animal. Todos os cassetes de histologia foram armazenados em ambiente em NBF a 10% durante 24 horas e transferidos para etanol a 70%.
[0178] Expressão de FFL em camundongos tratados com FFL. A partir da análise das amostras de tecido, a expressão de FFL foi detectada em camundongos tratados com FFL (dados não mostrados).
[0179] Expressão de CFTR em camundongos nocaute de CFTR. A expressão de CFTR foi detectada por análise Western blot de imunoprecipitação dos pulmões do camundongo tratado com mRNA de CFTR. A banda "C" madura foi detectada nos pulmões direitos e esquerdos de todos os camundongos tratados, mas não foi identificada nos camundongos de controle (Figura 1B). Os anticorpos utilizados foram MAB25031 (R&D Systems) para imunoprecipitação e SAB4501942 (Sigma) para detecção através de análise Western blot.
[0180] Os resultados apresentados aqui indicam que uma proteína de CFTR pode ser expressa com sucesso in vivo com base na distribuição de mRNA ao pulmão. Além disso, o facto de o mRNA de CFTR ter sido distribuído com êxito ao pulmão do camundongo nocaute e ter resultado na produção efetiva de proteína no pulmão indica que a produção de proteína in vivo à base de mRNA de CFTR pode ser usada no tratamento da deficiência da proteína de CFTR.
Exemplo 4: Distribuição ao pulmão de mRNA de CFTR utilizando nanopartículas poliméricas
[0181] A distribuição do RNA mensageiro de CFTR humano aos pulmões de um camundongo pode ser obtida através de inalação direta bem como através de nebulização. Com o uso de métodos de hibridização in situ, é possível obter êxito na detecção de mRNA de CFTR humano após a administração intratraqueal de nanopartículas carregadas de mRNA de CFTR humano aos camundongos. A administração pode ser obtida empregando-se nanopartículas à base de lípidos (por exemplo, C12-200), bem como nanopartículas poliméricas (por exemplo, polietilenimina, PEI).
[0182]! administração de mRNA de CFTR usando nanotransportadores poliméricos. Camundongos de KO de CFTR foram tratados com nanopartículas carregadas com mRNA de CFTR à base de polietileneimina (PEI) através de administração intratraqueal (30 μg de mRNA encapsulado). Os camundongos tratados foram sacrificados seis horas e vinte e quatro horas após a administração e os pulmões foram coletados e fixados em formalina neutra de tampão (NBF) a 10%. A hibridização in situ foi empregada para detectar mRNA de CFTR exógeno humano (Figura 6). Uma coloração substancial foi observada 24 horas após a administração com ampla distribuição em ambos os pulmões dos camundongos de KO de CFTR tratados, mas nenhuma coloração foi observada nos camundongos de controle tratados com PBS.
[0183] Análise dos pulmões tratados com ampliações mais elevadas (até 20x de ampliação) revelou extensa coloração intracelular positiva ao longo das regiões brônquicas e alveolares de ambos os pulmões (Figura 7). Após nova ampliação (40x), coloração positiva dentro do citoplasma das células epiteliais brônquicas alvo apicais foi observada (Figura 8). Assim, pode-se concluir que a API do RNA mensageiro foi distribuída com êxito para as células epiteliais brônquicas apicais. Além disso, enquanto uma coloração substancial pôde ser observada 6 horas após a administração, uma detecção positiva significativa de mRNA de hCFTR foi observada após 24 horas (Figura 9).
[0184] Coloração intracelular positiva substancial foi observada por todos os pulmões nas regiões bronquiais e alveolares 24 horas após a administração.
Exemplo 5: Distribuição ao pulmão de mRNA de CFTR utilizando nanopartículas à base de lipídio
[0185] Administração de nanotransportadores à base de lipídio. Como mencionado acima, a distribuição bem-sucedida ao pulmão de mRNA de CFTR pode ser obtido através de veículos de distribuição à base de nanopartículas de lipídio. São divulgados aqui exemplos de nanopartículas de lipídio catiônicas carregadas com mRNA de hCFTR utilizando C12-200 como o componente de lipídio catiônico.
[0186] A detecção bem-sucedida de mRNA de CFTR humano nos pulmões dos camundongos de KO de CFTR foi obtida através de hibridização in situ. Os camundongos nocaute foram tratados com 15 μg de mRNA de hCFTR encapsulado em nanopartículas de lipídio à base de C12200 e sacrificados 6 horas após a administração. Detecção positiva de mRNA de hCFTR foi observada em todas as regiões alveolares e bronquiais de ambos os pulmões em comparação aos camundongos de controle tratados com PBS (Figura 10).
[0187] Após nova ampliação (40x), detecção positiva de mRNA de CFTR foi observada no citoplasma apical das células epiteliais bronquiais, assim como nas regiões alveolares terminais (Figura 11).
[0188] No total, a distribuição bem-sucedida do RNA mensageiro de CFTR pode ser obtida utilizando os sistemas de distribuição à base de nanopartículas de lipídio (C12-200) e poliméricas (PEI). Esses sistemas proporcionaram acumulação intracelular da substância da droga nas células alvo dos camundongos. Ademais, quantidades substanciais de mRNA de hCFTR estavam presentes nessas células alvo 24 horas após a administração.
Exemplo 6: Validação da expressão de CFTR humano utilizando anticorpo específico
[0189] Validação do anticorpo para a detecção de proteína de CFTR humana em camundongos, porcos e células cultivadas. Experiências foram realizadas para identificar um anticorpo que é específico para a proteína de hCFTR, que não reage de forma cruzada com o camundongo e o análogo de suíno e que se encontra disponível em quantidade suficiente para experiências futuras. Resumidamente, o teste de vários anticorpos anti- hCFTR de fontes acadêmicas e comerciais levou à identificação de uma combinação de anticorpos anti-hCFTR que foram capazes de detectar a proteína de CFTR humana após a imunoprecipitação e a análise Western blot (IP/WB) sem reatividade cruzada para CFTR murino ou porcina. Desse modo, os anticorpos anti-hCFTR para detectar a proteína de hCFTR sem reatividade cruzada para CFTR murina ou porcina foram identificados com base nos resultados de IP/WB.
[0190] As células foram transfectadas com mRNA de hCFTR e lisados de proteína foram preparados utilizando o ProteoExtract Transmembrane Kit (Merck) 24 horas após a transfecção e a fração da transmembrana foi rastreada por Western blotting para hCFTR utilizando o anticorpo de CFTR anti-humano de camundongo (MA1-935). Lisados de células 16HBE foram utilizados como controle positivo. A Figura 12A apresenta dados de células CHO e COS-7.
[0191] Células de rim de hamster filhote (BHK), descritos na literatura como negativos para CFTR, foram transfectadas de modo semelhante às células CHO e COS-7 e os lisados de proteína rastreados por Western blot. Em contraste com os relatórios previamente publicados, um sinal claro positivo para CFTR podia ser observado utilizando o anticorpo anti-CFTR do camundongo (Figura 12B). Para testar a especificidade do anticorpo utilizado na análise Western blot, células de rim suíno de porcos nocaute de CFTR (PKC), gentilmente fornecidos pelo Prof. Eckhardt (Universidade Ludwig Maximilians, Munique), foram utilizados em experimentos de transfecção e os lisados de proteína rastreados para expressão de CFTR. Como ficou evidente na Figura 12B, nenhum sinal de CFTR pode ser detectado em células de PKC. No entanto, a transfecção não resultou em nenhuma expressão detectável de hCFTR. Usando a luciferase como um controle para a transfecção, descobriu-se que as células de PKC expressam luciferase de maneira bem menos eficiente em comparação às células CHO ou COS-7. Visto que nenhuma diferença significativa na intensidade da banda de hCFTR pôde ser detectada em nenhuma das linhas celulares rastreadas após a transfecção, executou-se extenso rastreamento de outros anticorpos de hCFTR com sensibilidades superiores e especificidade para hCFTR.
[0192] Rastreamento de anticorpos através de Western Blot. Os lisados da proteína foram preparados a partir da linha celular humana epitelial bronquial (BEAS-2B), da linha celular de rim embrionário humano (HEK), de pulmões de camundongo e pulmões de porco utilizando o ProteoExtract Transmembrane Kit (Merck) e de fracção transmembranar usados para imunotransferência utilizando diferentes anticorpos primários (MA1- 935, da Thermo Scientific Pierce Antibodies, Rockford, IL, EUA; AB596, da Cystic Fibrosis Consortium, Universidade da Pensilvânia, PA, EUA; e AB570, da Cystic Fibrosis Consortium, Universidade da Pensilvânia, PA, EUA). Os dados estão resumidos como a Figura 13.
[0193] Enquanto MA1-935 detectou CFTR em todas as três espécies, AB596 detectou CFTR murina ou humana, mas não porcina, e o anticorpo G449 detectou apenas CFTR humana, especificamente. Com AB570, não estava claro se as bandas de peso molecular ligeiramente baixos observados com amostras murina e suína são, de fato, produtos de CFTR ou não-específicos. Em experiências subsequentes (dados não mostrados), verificou-se que MA1-935 reconhece uma banda que não é de CFTR. Portanto, em geral, os resultados de MA1-935 foram considerados como confirmação dos resultados obtidos utilizando outros anticorpos, mas experiências nas quais o único anticorpo anti-CFTR utilizado foi MA1-935 não foram considerados conclusivos.
[0194]! imunoprecipitaçao de hCFTR (IP-hCFTR) a partir de amostras de tecido. Considerando-se que todos os anticorpos rastreados produziram várias bandas não-específicas e nenhum deles produziu o padrão de bandas característico de hCFTR (banda C que representa a proteína totalmente glicosilada e a banda B que representa a forma manosilada de núcleo), a imunoprecipitação (IP) de hCFTR e a subsequente detecção por Western blot foi estabelecida para aumentar a sensibilidade e a especificidade de detecção, aumentando, desse modo, a razão sinal-ruído.
[0195] Experimentos iniciais de IP foram realizadas em colaboração com o Prof. Burkhard Tümmler (Medizinsche Hochschule Hannover) utilizando protocolos e anticorpos publicados por van Barneveld et al. 2012, Immunochemical analysis of Mutant CFTR in Lung explants, Cell Physiol. Biochem. 30, 587-595 (2012)). Células de carcinoma do cólon humano (T84) que sobreexpressam hCFTR foram utilizadas como controles positivos para as experiências de IP.
[0196] A imunoprecipitação de hCFTR utilizando três anticorpos diferentes (R29, R66/17 e R66/16) seguido por imunodetecção com AB596 resultou na detecção específica de hCFTR em lisados de proteína dos pulmões de porcos tratados com um aerossol de RNA de hCFTR SNIM, conforme descrito no Exemplo 8 abaixo (Figura 14).
[0197] Formulação de HGT5001. Experimentos com aerossol utilizando RNA de hCFTR SNIM em uma formulação de HGT5001:DOPE; Chol; PEGDMG2K (quantidades relativas de 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) ("Formulação de HGT5001") foram realizados em camundongos e lisados proteicos de pulmões isolados 24 horas após a distribuição de mRNA também foram analisados por IP utilizando os mesmos anticorpos e condições usadas para os lisados dos porcos. No entanto, nenhum padrão de banda de CFTR maduro característico pôde ser detectado para as amostras de camundongo (Figura 15).
[0198] A imunoprecipitação de hCFTR (IP-hCFTR) a partir de células transfectadas in vitro. Resultados IP iniciais utilizando material de tecido de suínos forneceram a evidência quanto à viabilidade técnica da detecção de hCFTR após a distribuição transcrita in vivo. No entanto, visto que nenhum dos anticorpos utilizados no CFTR de imunoprecipitação (R29, R66/17 e R66/16) encontram-se disponíveis no mercado, outros anticorpos disponíveis foram rastreados quanto à sua eficácia em reações de IP. Dois anticorpos de sistemas R&D (MAB25031 e MAB1660) foram testados.
[0199] Os lisados proteicos foram preparados a partir de células T84 e 500 μg do total de proteína foi utilizado na reação de IP usando diferentes concentrações do anticorpo MAB25031. A quantidade de proteína hCFTR imunoprecipitada foi então detectada por imunotransferência usando AB570 (Cystic Fibrosis Foundation). AB596, sob essas condições, resultou em uma base muito mais elevada e, assim, não foi mais testado. Como revelado na Figura 16A, não houve mais aumento na quantidade de proteína de CFTR precipitada quando a concentração do anticorpo de IP foi aumentada de 2 μg/ml para 4 μg/ml. Tanto a forma completamente glicosilada quanto a forma glicosilada de núcleo (bandas C e B, respectivamente) foram detectadas. Os mesmos imunoprecipitados também foram rastreados usando MAB1660 como anticorpo primário em western blot. Com esse anticorpo, todavia, apenas a banda C estava visível (Figura 16B).
[0200] Após a detecção bem-sucedida da hCFTR endógena a partir de imunoprecipitados T84 usando o anticorpo MAB25031, os experimentos foram realizados em células NIH3T3 com o objetivo de detectar a proteína de hCFTR após a transfecção. As células NIH3T3 foram transfectadas com o RNA de hCFTR SNIM. Os lisados proteicos foram preparados 72 horas após a transfecção e os montantes de proteína foram quantificados usando o método BCA. A Proteína CFTR humana foi imunoprecipitada a partir de 500 μg dos lisados do total de proteína usando o anticorpo MAB25031 em 2 μg/mL seguido de imunotransferência usando AB570 (Figura 17). No entanto, nenhuma CFTR pôde ser detectada. As células transfectadas com LacZ codificando mRNA foram analisadas como amostras de controle quanto ao efeito de transfecção em si no montante de proteína de CFTR.
[0201] O aumento da quantidade do total de proteína usado na imunoprecipitação de 500 μg a 8 mg não resultou em nenhuma proteína de hCFTR após a imunodetecção com AB570. Outro anticorpo específico de hCFTR, MAB1660 (R&D Systems), também foi examinado quanto à imunoprecipitação (Figura 18). No entanto, esse anticorpo não precipita CFTR de forma tão eficaz como MAB25031. Assim, todas as imunoprecipitações futuras foram realizadas com MAB25031.
[0202] A ausência de detecção de hCFTR nas amostras transfectadas de mRNA não precisa, necessariamente, significar a ausência de funcionalidade dos mRNAs testados como experimentos cinéticos utilizando luciferase como gene marcador mostrou que a expressão máxima com mRNA é observada 24 horas após a transfecção. A ausência de detecção de hCFTR deve-se sobretudo à concentração insuficiente de hCFTR nas amostras testadas ou à ausência de especificidade dos anticorpos aplicados.
[0203] Formulação de PEI. As condições estabelecidas foram testadas quanto à sua viabilidade para detectar hCFTR a partir do RNA de hCFTR SNIM em distribuição aos porcos (ver Exemplo 7) de uma formulação de nanopartículas com PEI ramificada de 25 kDa ("Formulação PEI") preparada como se segue: O montante necessário de RNA SNIM foi diluído imediatamente antes da aplicação em água para injeção (Braun, Melsungen) para um volume total de 4 ml e adicionado rapidamente a 4 ml de uma solução aquosa de PEI ramificada de 25 kDa utilizando uma pipeta a uma razão de N/P de 10. A solução foi agitada dez vezes, para cima e para baixo, por pipetagem e nebulizada como duas frações de 4,0 ml separadas, uma após a outra, aos pulmões do porco utilizando o nebulizador indicado. Uma amostra da luciferase expressa a partir de áreas do pulmão do porco #1 e outra do lobo caudal do porco #2, onde nenhuma atividade da luciferase pôde ser detectada, indicando, assim, a ausência de distribuição e/ou expressão de mRNA, foram selecionadas como controles positivo e negativo. Os lisados de proteína preparados a partir dessas amostras foram imunoprecipitados utilizando MAB25031 (R&D Systems) e a proteína de hCFTR detectada utilizando AB570. Como mostrado na Figura 19, a expressão de luciferase teve correlação com a expressão do mRNA de hCFTR. A amostra do lobo caudal esquerdo do porco# 2, onde nenhuma atividade da luciferase foi detectada, também foi negativa para hCFTR (rota 1), enquanto que hCFTR positiva para luciferase (rota 2) pôde ser detectada em amostras do porco #1.
Exemplo 7: Distribuição de mRNA em aerossol
[0204] Estabelecimento da distribuição de mRNA encapsulado em aerossol aos pulmões dos porcos. A administração em aerossol de RNA SNIM de luciferase de vagalume (FFL) aos pulmões dos porcos foi estabelecida através de um procedimento experimental passo a passo. Em uma primeira etapa, formulações de RNA SNIM de FFL foram nebulizadas aos porcos anestesiados durante a ventilação controlada. Em uma segunda etapa, os pulmões foram removidos imediatamente após a administração em aerossol ter sido completada e amostras de pulmão foram incubadas em meio do cultivo celular durante uma noite antes de a medição da luciferase ex vivo ter sido realizada nos espécimes pulmonares por BLI.
[0205] Porcos Landrace alemão foram obtidos junto à Universidade Técnica de Munique, Weihenstephan, Alemanha. Os porcos tinham um peso corporal variando entre 35-90 kg. Cada tratamento foi realizado em um porco. No total, cinco porcos foram tratados. O primeiro porco (90 kg de peso) foi tratado com RNA SNIM de FFL na formulação de PEI do Exemplo 6 utilizando um nebulizador de malha EFlow e medição da atividade da luciferase em homogeneizados pulmonares. O segundo porco (60 kg de peso) foi tratado com RNA SNIM de FFL na Formulação PEI do Exemplo 6 utilizando um nebulizador de malha eFLOW e medição da atividade de luciferase em espécimes pulmonares por BLI. O terceiro porco (80 kg de peso) foi tratado com RNA SNIM de FFL na Formulação de PEI do Exemplo 6 usando um nebulizador de jato PARI BOY e medição da atividade da luciferase em espécimes pulmonares por BLI. O quarto porco (60 kg de peso) foi tratado com RNA SNIM de FFL/mRNA de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 utilizando um nebulizador de malha Aeroneb e medição da atividade de luciferase em amostras de pulmão por BLI. O quinto porco (35 kg de peso) foi tratado com RNA SNIM de FFL na Formulação de HGT5001 do Exemplo 6 utilizando um nebulizador de malha e medição da atividade de luciferase em espécimes pulmonares por BLI.
[0206] A sedação nos porcos foi iniciada pela pré-medicação com azaperona de 2 mg/kg do peso corporal, cetamina de 15 mg/kg do peso corporal, atropina de 0,1 mg/kg do peso corporal e seguido por inserção de uma linha intravenosa na veia auricular lateral. Os porcos foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol de 3-5 mg/kg do peso corporal, conforme necessário. A anestesia foi mantida por isoflurano (23%) com 1% de injeção de bolo de propofol de 4 a 8 mg/kg do peso corporal para intensificar a anestesia, conforme necessário. A duração da anestesia foi de aproximadamente 1-3 horas. Os porcos foram mortos com injeção de bolo de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) e de cloreto de potássio através da veia lateral da orelha. Os pulmões foram removidos e os espécimes de tecido foram coletados de várias regiões pulmonares por incubação em meio de cultivo celular durante uma noite. Para a medição da atividade da luciferase, espécimes de tecido foram homogeneizados ou analisados em um luminômetro tubular ou incubados em um banho como meio compreendendo substrato de D-Luciferina e submetidos a BLI de luciferase ex vivo.
[0207] Detalhes e resultados do porco #1. A configuração experimental é ilustrada na Figura 20. Para administração em aerossol, um nebulizador de malha eFLOW foi ligado em linha à tubulação de ventilação do respirador. A administração em aerossol levou aproximadamente 60 minutos e foi mais demorada do que o esperado com experimentos de controle com um sistema aberto. Isso foi causado, aparentemente, pelo aumento da pressão de retorno durante a nebulização, como evidenciado por meio de aerossol de saída no reservatório do nebulizador de malha. Oito ml da Formulação de PEI do Exemplo 6 compreendendo 1 mg de RNA SNIM de FFL em água para injeção foram preparados, como descrito em WP5, foram nebulizados e separados em duas porções de 4 ml, uma após a outra. A medição da luciferase foi realizada em homogeneizados de tecido de espécimes pulmonares removidos de várias regiões do pulmão após uma incubação de uma noite em meio de cultivo celular. Os valores de expressão foram mapeados de acordo com a origem das amostras de pulmão (Figura 21).
[0208] Os resultados mostraram expressão de luciferase bem- sucedida no tecido pulmonar suíno. A expressão de luciferase era mais elevada em partes centrais do pulmão e diminuiu para regiões mais distais do pulmão. O padrão de expressão foi correlacionado com o padrão de deposição esperado das nanopartículas inaladas de RNA-PEI SNIM de FFL, de acordo com os parâmetros de ventilação escolhidos. Os níveis de expressão de luciferase foram na mesma faixa dos observados nos experimentos com camundongos em WP5 usando a mesma Formulação de PEI do Exemplo 6.
[0209] Detalhes e resultados do porco #2. A administração em aerossol de RNA SNIM de FFL na Formulação de PEI do Exemplo 6 no porco # 2 foi realizada como no porco #1, mas a atividade da luciferase foi medida em espécimes pulmonares por imageamento bioluminescente (BLI). Esse experimento foi realizado para estabelecer a medição de luciferase ex vivo dos espécimes pulmonares cultivados por BLI. A medição da luciferase foi claramente observada nos espécimes de tecido individuais de diferentes regiões do pulmão do porco tratado (Figura 22). O experimento confirmou os resultados obtidos a partir de porco #1.
[0210] Detalhes e resultados do porco #3. Administração em aerossol nos porcos #1 e #2 utilizando o nebulizador de malha eFlow apresentou algumas dificuldades técnicas e tempo de nebulização inadequado. Assim, o porco #3 foi tratado utilizando-se o nebulizador de jato PARI BOY que estava ligado à tubulação de ventilação através de um conector em T. A administração em aerossol durou mais tempo (cerca de 80 min) do que com o nebulizador de malha EFlow e a administração em aerossol foi insatisfatória. Uma atividade muito baixa de luciferase foi detectada em amostras pulmonares fatiadas a partir de diferentes regiões pulmonares do porco tratado (Figura 23).
[0211] Detalhes e resultados do porco #4. Os resultados dos experimentos anteriores demonstraram que um nebulizador de malha é mais apropriado para administração em aerossol para os pulmões de porcos na configuração escolhida do que um nebulizador de jato. Por essa razão, outro nebulizador de malha foi testado para essa finalidade, o qual nebulizou, de maneira satisfatória, a Formulação de PEI do Exemplo 6 quando testado em um sistema aberto. O porco #4 foi tratado utilizando o nebulizador de malha Aeroneb, que foi ligado em-linha à tubulação do respirador. Nesse experimento, 1 mg de mRNA de hCFTR foi codistribuído em conjunto com 1 mg de RNA SNIM de FFL na Formulação de PEI do Exemplo 6. Isso foi feito para testar a estabilidade da formulação e o potencial de nebulização das nanopartículas de mRNA-PEI de hCFTR/RNA SNIM de FFL em relação à dosagem repetida a ser realizada no Exemplo 8. A formulação permaneceu estável e não apresentou incompatibilidade com a nebulização. A atividade da luciferase foi claramente observada nos espécimes individuais de tecido de diferentes regiões do pulmão do porco tratado (Figura 24).
[0212] A experiência confirmou os resultados obtidos a partir dos porcos #1 e #2, embora níveis de expressão mais elevados tenham sido obtidos. O experimento mostrou que o nebulizador de malha Aeroneb era melhor adaptado para a distribuição da Formulação de PEI do Exemplo 6 aos pulmões dos porcos. Ademais, o experimento demonstrou que o RNA SNIM de FFL ainda estava ativo quando foi codistribuído em conjunto com o mRNA de hCFTR.
[0213] Detalhes e resultados do porco #5. O porco #5 foi tratado com 1 mg de RNA SNIM de FFL na Formulação de HGT5001 do Exemplo 6 aerossolizada com o nebulizador de malha Aeroneb. A formulação pôde ser aerossolizada sem dificuldades técnicas. A atividade da luciferase foi claramente observada nos espécimes individuais de tecido de diferentes regiões do pulmão do porco tratado (Figura 25).
[0214] O experimento mostrou que o RNA SNIM de FFL em aerossol na Formulação de HGT5001 do Exemplo 6 estava ativo no tecido pulmonar do porco, ainda que os níveis de expressão estivessem aproximadamente 15-20 vezes mais baixo do que nos porcos tratados com a Formulação de PEI do Exemplo 6.
[0215] Conclusão. Bons resultados foram obtidos utilizando o nebulizador de malha Aeroneb com a Formulação de PEI do Exemplo 6. Quatro porcos foram tratados com a Formulação de PEI do Exemplo 6 para identificar a configuração experimental ideal para a distribuição em aerossol. Os resultados demonstraram que a expressão da luciferase pôde ser detectada em homogeneizados de pulmão de porco e por BLI. A expressão de luciferase foi mais elevada nas partes centrais dos pulmões e dificilmente identificada nas áreas distais dos pulmões. Descobriu-se que o nebulizador de malha Aeroneb apresentou melhores resultados em conjunto com o tempo de distribuição mais breve. De acordo com esses experimentos, outro porco foi tratado com o RNA SNIM de FFL encapsulado na Formulação de HGT5001 do Exemplo 6. Embora a expressão da luciferase tenha sido claramente observada em algumas partes dos pulmões de porcos, os níveis de expressão foram menores do que para o RNA SNIM de FFL na Formulação de PEI do Exemplo 6. Os resultados a partir deste pacote de trabalho demonstraram claramente que a distribuição do RNA SNIM aos pulmões dos porcos como um modelo pré- clínico de animal de grande porte foi possível utilizando várias formulações, como a Formulação de base polimérica (por exemplo, PEI) e formulações de base lipídica (por exemplo, HGT5001). Os resultados desse exemplo proporcionaram a prova do conceito para a distribuição bem-sucedida de RNA SNIM aos pulmões de um animal de grande porte, que imita de maneira semelhante a situação em pacientes humanos com os nebulizadores utilizados na prática clínica.
Exemplo 8: Distribuição do mRNA in vivo (dose semanal)
[0216] Uma experiência foi executada a fim de avaliar a viabilidade de uma aplicação em aerossol uma vez por semana aos porcos. A viabilidade foi definida como a realização de três aplicações de aerossol de mRNA modificado em intervalos de uma semana sem indução de doença pulmonar (ausência de eventos adversos superior à classificação 2). O objetivos adicionais foram para avaliar i) o nível de sofrimento dos animais, ii) os eventos adversos que ocorridos durante a avaliação clínica ou laboratorial dos porcos e iii) a medição das proteínas induzidas (luciferase e hCFTR).
[0217] A administração repetida em aerossol de RNA SNIM na Formulação de PEI aos pulmões dos porcos foi estabelecida. Grupos de dois porcos foram tratados duas uma, duas ou três vezes em intervalos semanais com RNA SNIM de FFL/RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6. Dois porcos não-tratados serviram como controle. Os pulmões foram removidos 24 horas após o tratamento e a atividade da luciferase ex vivo foi medida em espécimes pulmonares isolados por BLI. A expressão da proteína de hCFTR foi analisada utilizando IP/WB. A imunohistoquímica (IHQ) foi realizada para detecção da expressão de luciferase no nível celular. A toxicologia foi investigada por medição de citocinas inflamatórias no soro e da química do sangue. O exame histopatológico foi realizado em amostras pulmonares. O protocolo do estudo "Pilot project: Repeated application of modified mRNA to establish an animal model for aerosol therapy of cystic fibrosis in pigs” foi aprovado pelas autoridades locais antes do início dos experimentos (Experimentos em animais com o número de licença: 0-045-12).
[0218] Projeto experimental. Suínos, Landrace alemão, fêmea com aproximadamente 6 semanas de idade (~ 25 kg de massa corporal, em média) em nebulização foram comprados da Universidade Técnica de Munique, Weihenstephan, Alemanha. Os porcos foram distribuídos aleatoriamente e tratados de acordo com o esquema abaixo (Tabela 3). Os grupos de tratamento de cada um dos dois porcos foram como se segue: Grupo 0 - Grupo de controle sem tratamento Grupo I - Administração em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 1. Grupo II - Administração em aerossol de 2 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 1 e 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 em 8 dias. Grupo III - Administração em aerossol de 2 mg de RNA SNIM de hCFTR (6379-186) na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 1 e no dia 8, administração em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 15.
[0219] O regime de tratamento e avaliação de cada grupo é mostrado na Tabela 3. Além das intervenções ilustradas, o exame físico dos porcos foi realizado em uma base diária.
[0220] Tabela 3. Diagrama de linha do tempo de diferentes grupos de tratamento.
Figure img0017
Figure img0018
[0221] Procedimento experimental A sedação nos porcos foi iniciada pela pré-medicação com azaperona de 2 mg/kg do peso corporal, cetamina de 15 mg/kg do peso corporal, atropina de 0,1 mg/kg do peso corporal e seguido por inserção de uma linha intravenosa na veia auricular lateral. Os porcos foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol de 3-5 mg/kg do peso corporal, conforme necessário. A anestesia foi mantida com infusão intravenosa continua de propofol a 1%, conforme necessário. Os parâmetros de ventilação foram pareados com dióxido de carbono endexpiratório e ajustado, se necessário. Parâmetros de anestesia, respiratórios e cardiovasculares foram monitorados continuamente por meio de oximetria de pulso, capnografia, sonda de temperatura retal e status de reflexo. Os animais receberam a infusão de uma solução de eletrólito equilibrada a 10 ml/kg/h. A duração da anestesia foi de aproximadamente 80-120 min. Os porcos foram extubados após o início da respiração espontânea suficiente. Os porcos foram mortos com injeção de bolo de pentobarbital de 100 mg/kg do peso corporal através da veia lateral da orelha após a sedação. Os pulmões foram removidos e os espécimes de tecido com espessura de aproximadamente 1 cm foram coletados de várias regiões pulmonares seguidos de incubação em cultivo celular. Para a medição de luciferase, espécimes de tecido foram incubados em um banho com meio compreendendo substrato de D-Luciferina e submetidos a BLI de luciferase ex vivo.
Expressão de luciferase em grupos de tratamento por BLI.
[0222] Para o Grupo 0 (grupo de controle sem tratamento), não foi observada nenhuma atividade de luciferase em fatias de pulmão (Figura 26).
[0223] Para o Grupo I (administração em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6), a atividade de luciferase foi claramente detectada em espécimes pulmonares dos porcos #3 e #6 tratados uma vez (Figura 27). A expressão de luciferase foi mais elevada em partes centrais dos pulmões.
[0224] Para o Grupo II (administração em aerossol de 2 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 1 e 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 8), a atividade de luciferase foi claramente detectada em espécimes pulmonares dos porcos #4 e #8 tratados duas vezes (Figura 28). A expressão de luciferase foi mais elevada nas partes centrais dos pulmões. Há de se considerar que as amostras foram armazenadas durante 10 horas adicionais em meio de cultivo celular antes da medição por conta de uma falta de energia no dia das medições, resultando em problemas técnicos com o sistema BLI.
[0225] Para o Grupo III (administração em aerossol de 2 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6 no dia 1 e no dia 8, a administração em aerossol de 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg de RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do exemplo 6 no dia 15), a atividade de luciferase foi claramente detectada em espécimes pulmonares dos porcos #1 e #2 tratados três vezes (Figura 29). A expressão de luciferase foi mais elevada em partes centrais dos pulmões.
[0226] Propriedades das nanopartículas RNA-Pei SNIM. O tamanho das partículas e do potencial zeta foram medidos para as formulações de RNA-PEI SNIM antes da nebulização (Tabela X1). As nanopartículas RNA- PEI SNIM pôde ser formada de forma reprodutível com um tamanho que varia entre 25-37 nm e potenciais zeta variando entre 30-49 mV. Tabela X1. Tamanho de partícula e medições do potencial zeta
Figure img0019
Figure img0020
[0227] Expressão de luciferase em grupos de tratamento por IHC. IHC para FFL foi realizada em amostras de tecido de fatias pulmonares (Sophistolab AG, Eglisau, Suíça), que foram positivas por BLI e comparadas com tecido pulmonar de um suíno não-tratado e tecido do tumor de um camundongo positivo para luciferase como controle positivo. Conforme esperado, um forte sinal foi observado no tecido de tumor do camundongo positivo para luciferase, enquanto que o tecido do pulmão do suíno não-tratado não apresentou coloração específica. Um padrão de coloração claramente detectável pôde ser observado no tecido pulmonar de porco # 1, que recebeu três tratamentos. A expressão de FFL foi mais proeminente no epitélio bronquial de grandes e pequenas vias aéreas (Figura 30).
[0228] Detecção da proteína hCFTR no tecido pulmonar do porco tratado por IP/WB. O tecido pulmonar altamente BLI-positivo do porco #1 três vezes tratado foi submetido a IP/WB de hCFTR, de acordo com o protocolo descrito por van Barneveld A et al., Cell Physiol Biochem. 30, 587-95 (2012) (Figura 31). O hCFTR complexo glicosilado maduro apareceu como o disperso chamado de banda C. A hCFTR rica em manose aparece como a mais densa chamada banda B. A expressão clara de hCFTR é observada em células de controle positivo de T84 e no tecido pulmonar do porco # 1, tratado com RNA SNIM de hCFTR na Formulação de PEI do Exemplo 6. A expressão da proteína de hCFTR não foi observada nos porcos não-tratados. Uma comparação da expressão da proteína de hCFTR em tecido de pulmão humano a partir de um estudo publicado utilizando protocolo idêntico (van Barneveld A et al., acima) sugeriu que a expressão de hCFTR no tecido pulmonar de porco após o tratamento de aerossol SNIM de hCFTR foi semelhante à expressão no hCFTR humano em um pulmão humano saudável.
[0229] Essa descoberta foi corroborada pela utilização de um conjunto diferente de anticorpos para a detecção da proteína de hCFTR por IP/WB no pulmão de porco tratado (ver Exemplo 6). Uma amostra da luciferase expressa a partir de áreas do pulmão do porco #1 e outra do lobo caudal do porco #2, onde nenhuma atividade da luciferase pôde ser detectada, indicando, assim, a ausência de distribuição e/ou expressão de mRNA, foram selecionadas como controles positivo e negativo. Os lisados proteicos preparados a partir dessas amostras foram imunoprecipitados utilizando MAB25031 (R&D Systems) e a proteína de hCFTR detectada utilizando AB570. Como mostrado na Figura 32, a expressão de luciferase teve correlação com a expressão do mRNA de hCFTR. A amostra do lobo caudal esquerdo do porco# 2, onde nenhuma atividade da luciferase foi detectada, também foi negativa para hCFTR (rota 1), enquanto que hCFTR positiva para luciferase (rota 2) pôde ser detectada em amostras do porco #1.
[0230] Toxicologia: Avaliação histológica preliminar de amostras pulmonares. A avaliação histológica de amostras dos pulmões tomadas após a eutanásia dos três animais foi realizada. Depois de fixá-las em parafina, as amostras de pulmão foram tingidas com hematoxilina-eosina para avaliação morfológica. Os resultados foram consistentes nas amostras dos três porcos, dois dos quais (porco #1 e porco #2) receberam três aplicações de aerossol e o terceiro (porco #7) foi um controle não-tratado com ausência de aplicação de aerossol.
[0231] Toxicologia: Sofrimento. Apenas o porco #2 e o porco #1 mostraram leves sinais de desconforto no dia 2-4 depois do primeiro tratamento. Assim, três aplicações de aerossol em três semanas causaram apenas sofrimento leve.
[0232] Toxicologia: Eventos adversos. O tipo e a frequência dos eventos adversos (AE) foram analisados por parâmetros laboratoriais (sangue, MBS e BAL) e pelo exame físico dos porcos (definido como um objetivo secundário nesta testagem).
[0233] Amostras de soro e de sangue completas foram tomadas nos pontos temporais definidos pelo protocolo do estudo. Doze parâmetros representativos (hemoglobina, hematócrito, AP, ALT, AST, CK, bilirrubina, creatinina, glicose, potássio, trombócitos e células brancas do sangue) como indicativos para mostrar a patologia específica do órgão (sangue, medula óssea, fígado, músculo e rim) foram selecionados e os resultados obtidos a partir do VetMedLab, Ludwigsburg, Alemanha, classificados de acordo com VCOG, versão 2011.
[0234] Os resultados mostraram que nenhum evento adverso grave (AE) foi observado nos suínos (um AE de classificação 3, 4 ou 5 seria considerado grave). Não houve comprometimento dos parâmetros laboratoriais após a aplicação de aerossol de RNA SNIM na Formulação de PEI do Exemplo 6. Para as pequenas alterações em alguns parâmetros (por exemplo, enzimas hepáticas ou CK) é mais provável que essas mudanças tenham sido motivadas pelo próprio procedimento experimental (por exemplo, injeções i.m. e anestesia). Ademais, nenhum efeito negativo da aplicação repetida pôde ser detectado - mesmo após a terceira aplicação, os porcos do grupo 3 não apresentaram AE superior à AE de classificação 2. Mesmo a classificação 1 ou 2 de AE foi raro e não apresentou correlação alguma com a aplicação de aerossol de RNA SNIM na Formulação PEI do Exemplo 6.
[0235] Além das amostras de sangue repetidas, dois outros parâmetros foram analisados para avaliar os processos patológicos no pulmão: i) Fluido da lavagem broncoalveolar (BALF) - extraído após a eutanásia e ii) amostras de microbiologia (MBS) (mancha na traqueia - tirada durante a anestesia). O BALF foi extraído de cada porco durante a autópsia e foi armazenado a -80 ° C para posterior examinação. As manchas na traqueia foram tomadas antes de cada aplicação de aerossol e microbiologicamente examinadas. Esses exames revelaram um amplo espectro de patógenos, incluindo Bordetella bronchiospectica (um agente patogênico comum do trato respiratório do porco) e Escherichia coli. Os porcos foram tratados uma vez com injeção i.m. de tulatromicina (1 ml de Draxxin® 10%).
[0236] Exame físico. Além dos parâmetros laboratoriais, exames físicos dos porcos foram realizadas nos períodos de observação entre as aplicações de aerossol (para mais detalhes, ver 1.1.2 do anexo 1 e do anexo 4 do protocolo de estudo). Como nenhum sistema de documentação, classificação e estabelecimento de atribuição da AE, quer para a intervenção ou para qualquer outra coisa, é definido para porcos, o sistema de critérios toxicológicos comuns (CTC) estabelecido para cães e gatos foi utilizado (publicado por VOCG, em 2011). Para classificar os parâmetros laboratoriais, os ULN (limites superiores do normal) e LLN (limites inferiores do normal) específicos de espécie foram usados. As avaliações clínicas foram feitas dentro das seis categorias de AE a seguir: (1) eventos alérgicos/imunológicos; (2) pulmonar/respiratória; (3) sinais clínicos constitucionais; (4) dermatológica/pele; (5) gastrointestinais; e (6) pulmonar/respiratória.
[0237] Os resultados mostraram que nenhum AE grave (nenhum de classificação 3, 4, ou 5) foram observados nos suínos. Não houve comprometimento dos parâmetros avaliados por exame físico, após a aplicação de aerossol de RNA SNIM na Formulação de PEI. Os dois porcos do grupo 3 apresentaram AE de classificação 1 e 2 em três dos parâmetros respiratórios (broncoespasmo/chiado, edema de laringe e dispneia), mas esses achados leves ou moderados foram restritos a um ou dois dias. Como essas observações só ocorreram depois da primeira aplicação de aerossol/intubação/anestesia nesses dois porcos, mas não após a segunda ou a terceira aplicação de aerossol nesses dois porcos ou em qualquer outro porco, é improvável que esses achados tenham sido motivados pela substância sob investigação.
[0238] Conclusão. Os resultados deste exemplo demonstram que a Formulação de PEI que codifica FFL e o RNA SNIM de hCFTR puderam ser aerossolizados com êxito repetidamente aos pulmões dos porcos sem perda na atividade após cada ciclo de tratamento e sem eventos adversos. A expressão de luciferase foi encontrada em partes centrais do tecido pulmonar, mas dificilmente detectada em áreas distais do pulmão. O padrão regional de expressão de luciferase se correlacionou com o padrão de deposição esperado da Formulação de PEI do Exemplo 6 de acordo com as configurações utilizadas para ventilação controlada. A imunohistoquímica em amostras pulmonares selecionadas de porcos tratados apresentou expressão de luciferase predominantemente no epitélio bronquial de vias respiratórias amplas e pequenas. IP/WB demonstrou claramente que a expressão de banda C glicosilada por complexo da CFTR humana madura no pulmão suíno tratado estava ausente no pulmão suíno não-tratado e nos espécimes de pulmão negativos para luciferase. A expressão de hCFTR no tecido pulmonar de porco após o tratamento com aerossol de RNA SNIM de hCFTR foi comparável à expressão de hCFTR em um pulmão humano saudável se comparada aos relatórios publicados usando o protocolo idêntico para a detecção da proteína de hCFTR. Eventos adversos de classificação 1 ou 2 foram raros e não apresentaram correlação alguma com a aplicação de aerossol de RNA SNIM na Formulação PEI. Assim, a expressão da proteína de hCFTR foi demonstrada com sucesso em pulmões de porcos tratados com RNA SNIM de hCFTR.
Exemplo 9: CFTR que codifica peptídeo de sinal contendo mRNA
[0239] Esse exemplo demonstra que uma proteína de CFTR pode ser efetivamente expressada a partir de uma CFTR que codifica um mRNA com uma sequência de codificação de peptídeo de sinal.
[0240] Síntese do RNA mensageiro. Para o experimento, o regulador da condutância transmembranar da fibrose cística humana otimizado com códon marcado com His10 com terminação em C (CO-CFTR-C-His10)(SEQ ID NO:15), uma CFTR humana otimizada com códon com um líder de sequência de sinal de hormônio de crescimento (GH-CO-CFTR)(SEQ ID NO:16) e um RNA SNIM de CFTR humana otimizada com códon (CO- CFTR)(SEQ ID NO:17) foram sintetizados por transcrição in vitro a partir de um modelo de DNA de plasmídeo utilizando métodos padrão. Transfecção de CFTR e de células. Células HEK293T embrionárias de rim humano foram cultivadas em DMEM (Invitrogen Cat # 11965-092) suplementadas com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-Glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. No dia anterior à transfecção, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços a 50-60% de confluência e foram incubadas sob condições de cultivo de tecidos normais (36°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar). Na preparação para a transfecção, 60 μl de Lipofetamina 2000 (Invitrogen Cat # 11668019) foram diluídos em meios de soro reduzidos OptiMem (Invitrogen Cat # 31985-062) e agitados suavemente. Para o experimento, 4 μg de CO-CFTR, GH-CO- CFTR ou RA SNIM de CO-CFTR-C-His10 foram diluídos em 900 μl de meios OptiMem. O mRNA foi imediatamente adicionado à Lipofetamina® diluída e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. Os meios de plaqueamento foram suavemente aspirados e substituídos com 1 ml de meio de soro OptiMem reduzido e 300 μl de cada complexo de mRNA/Lipofectamina®. As células foram incubadas sob condições de cultivo de tecido padrão.
[0241] Análise Western. Aproximadamente 48 após a transfecção, as células foram removidas das suas respectivas placas e lisados. O lisado da célula inteira foi submetido à separação por SDS-PAGE e sondado por Western blot. Como mostrado na Figura 33, a expressão robusta da proteína de CFTR humana foi detectada após a transfecção de CO-CFTR, GH-CO-CFTR e mRNA de CO-CFTR-C-His10humano, pelos anticorpos CFTR (A&B) ou anti-His (C) (Figura 33).
Exemplo 10: Na Vivo CO-CFTR-C-His10 mRNA Entrega de CFTR Camundongos Nocaute
[0242] Análise da proteína CFTR humana produzida através intratraqueal administrado nanopartículas carregadas com mRNA. Todos os estudos foram realizados utilizando camundongos KO CFTR. CFTR mRNA formulação ou veículo de controle foi introduzido usando um jato nebulizador PARI Boy. Os camundongos foram sacrificados e perfundidos com solução salina, depois de um período de tempo predeterminado, para permitir a expressão de proteína a partir do mRNA.
[0243] Síntese do RNA mensageiro. No exemplo, o C-terminal His10 com etiquetas regulador da condutância transmembranar da fibrose cística humana códons otimizados (CO-CFTR-C-His10) SNIM RNA e com códons otimizados FFL SNIM RNA foram sintetizados por in vitro a transcrição a partir de modelos de DNA de plasmídeo.
[0244] Formulação de PEI. Para a abordagem, a entrega e expressão de mRNA de CFTR-CO-C-His10 nos pulmões de camundongos nocaute CFTR foi avaliada usando ambas as formulações de nanopartículas poliméricas e à base de lípidos. As formulações de nanopartículas poliméricas com 25 kDa PEI ramificada preparada como se segue. O montante necessário de RNA SNIM foi diluído imediatamente antes da aplicação em água para injeção (Braun, Melsungen) para um volume total de 4 ml e adicionado rapidamente a 4 ml de uma solução aquosa de PEI ramificada de 25 kDa utilizando uma pipeta a uma razão de N/P de 10. A solução foi misturada por pipetagem cima e para baixo dez vezes e nebulização como dois separados 4,0 ml fracções um após o outro para os pulmões do mouse usando o nebulizador indicado.
[0245] Formulação de CKK-E12. Para o experimento de nanopartículas à base de lípidos, uma formulação lipídica foi criada usando CO-CFTR-C-His10 SNIM RNA numa formulação de CKK-E12: DOPE: Chol: PEGDMG2K (quantidades relativas de 50: 25: 20: 5 (mg: mg : mg: mg). A solução foi nebulizada nos pulmões do camundongo utilizando o nebulizador indicado.
[0246] A nebulização (aerossol) Administração de CFTR humano CO-C-His10-mRNA. Materiais de ensaio foram administrados por CFTR uma única inalação de aerossol por meio de nebulizador de jacto PARI Menino (volume de dose nominal de até 8 mL / grupo). O material de teste foi distribuído a uma caixa contendo o grupo completo de animais (n = 4) e conectado ao sistema sequestrante e ao fluxo de oxigênio.
[0247] A administração de CFTR humano CO-C-His-10 mRNA. CFTR mRNA foi preparado da maneira descrita acima. Quatro camundongos nocaute de CFTR foram colocados em uma caixa com câmara de aerossol e expostos ao mRNA de CFTR humano não-modificado otimizado por códon total de 2 mg (compreendendo a sequência de codificação da SEQ ID NO: 3) através de nebulização (nebulizador de jato Pari Boy) durante o período de aproximadamente uma hora. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a exposição.
[0248] Eutanásia. Os animais foram sacrificados por asfixia com CO2, a administração pós-dose de tempos representativos (± 5%) seguido por toracotomia e exanguinações. Todo o sangue (volume máximo alcançável) foi coletado através de puntura cardíaca e descartado.
[0249] Perfusão. Seguindo exsanguinação, todos os animais foram submetidos a perfusão cardíaca com solução salina. Em breve, toda a perfusão intracardíaca corporal foi realizada inserindo-se uma agulha de calibragem 23/21 acoplada a uma seringa de 10 mL contendo soro fisiológico no lúmen do ventrículo esquerdo para a perfusão. O átrio direito foi incisado para fornecer uma saída de drenagem para o perfundido. Uma pressão suave e constante foi aplicada ao êmbolo para perfundir o animal depois de a agulha ter sido posicionado no coração. O fluxo adequado da solução de lavagem foi assegurado quando o perfundido de saída flui de maneira clara (livre de sangue visível), indicando que a solução de lavagem saturou o corpo e que o procedimento está completo.
[0250] Coleta de Tecidos. Após a perfusão, todos os animais tiveram seus pulmões (direito e esquerdo) coletados. Ambos ps (direita e esquerda) pulmões foram rapidamente congelados em azoto líquido e armazenados separadamente a simbólicos -70oC.
[0251] Expressão de CFTR humana do CO-CFTR-C-His10 mRNA CFTR em camundongos nocaute. Expressão de CFTR foi detectado por análise de Western blot de lisado de tecidos recolhidos a partir de pulmões tratados com mRNA CFTR de camundongo. Banda "C" madura foi detectada em pulmões esquerdo e direito de todos os camundongos tratados, tanto para o e formulações à base de polímeros à base de lípidos (Figura 34). Expressão da banda "C" madura foi verificada por comparação com lisado recolhidos a partir de células HEK 293T humano CO-CFTR-C- His10 células positivas como descrito no Exemplo 9. Em contraste, nenhum sinal detectável foi observado em lisado recolhidos a partir de camundongos de tipo selvagem de controle não tratadas (Figura 34). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que ambas as formulações poliméricas e lipídicas base (como a formulação CKK-E12 listados acima) são eficazes para a entrega pulmonar de mRNA de CFTR, por exemplo, por meio de inalação, e que uma vez entregues, os códons optimizados de mRNA de CFTR pode eficazmente expressar a proteína CFTR humana.
Exemplo 11: Estudo de aumento de dose in vivo
[0252] Aumento de dose de distribuição em aerossol de mRNA encapsulado de PEI para os pulmões suínos. A administração em aerossol de uma combinação de RNA SNIM de luciferase de vagalume (FFL) e de RNA SNIM de CFTR (CO-CFTR) humano otimizado com códon a concentrações variáveis aos pulmões dos porcos foi estabelecida por meio de um procedimento experimental passo a passo. Em uma primeira etapa, a formulação de FFL/RNA SNIM de CO-CFTR foi nebulizada aos porcos anestesiados durante a ventilação controlada. Em uma segunda etapa, os animais foram sacrificados por injeção de bolo de pentobarbital (100 mg/kg do peso corporal) e cloreto de potássio através da veia lateral da orelha após a sedação de 24 horas após a conclusão da administração de aerossol. Os pulmões foram removidos e fatiados em espécies de tecido de espessura de cerca de 1 cm. Para a medição da atividade de luciferase, os espécimes de tecido foram incubados em um banho com meio compreendendo substrato de D-Luciferina e submetidos a BLI de luciferase ex vivo. Após BLI, amostras de regiões de luciferase positiva e de luciferase negativa foram tomadas para histopatologia, imunohistoquímica e hibridação in situ. Os espécimes residuais foram congelados em choque em nitrogênio líquido e subsequentemente armazenados a - 80°C até a análise por IP/WB e Elisa.
[0253] Síntese do RNA mensageiro. No exemplo, códons otimizados do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística humana (CO-CFTR) SNIM RNA, com códons otimizados FFL mRNA SNIM RNA foram sintetizados por in vitro a transcrição a partir de modelos de DNA de plasmídeo utilizando métodos padrão.
[0254] Projeto experimental. Porcos Landrace alemão foram obtidos junto à Universidade Técnica de Munique, Weihenstephan, Alemanha. Os porcos tinham um peso corporal variando entre 35-90 kg. O estudo foi projetado usando porcos com idades e pesos correspondentes a fim de controlar a variabilidade. Foi estabelecido um único coorte de seis suínos (3 do sexo masculino e três do sexo feminino) para cada grupo experimental do estudo de 4 braços. O primeiro coorte foi tratado apenas com água para injeção (WFI), que foi administrada utilizando um nebulizador de malha Aeroneb. O segundo coorte foi tratado com uma solução de 1 mg de RNA SNIM de FFL e 1 mg do RNA SNIM de CFTR humano otimizado com códon (CO-CFTR) na Formulação PEI descrita abaixo, utilizando um nebulizador de malha Aeroneb. O terceiro coorte recebeu 1 mg de RNA SNIM de FFL e 5 mg de RNA SNIM de CFTR humano otimizado com códon (CO-CFTR) na Formulação de PEI descrita abaixo. O quarto coorte foi tratado com 1 mg de RNA SNIM de FFL e 10 mg de RNA SNIM de CFTR humano otimizado com códon (CO-CFTR) na Formulação de PEI descrita abaixo. O regime de tratamento e avaliação de cada grupo é mostrado na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Projeto experimental para estudo de escalonamento de dose
Figure img0021
[0255] mRNA - formulação de PEI. Um procedimento de formulação padronizada exemplificativo descrito abaixo foi realizado pouco antes do tratamento dos animais. Materiais: Bomba de seringa (dispositivo de mistura): Fabricante: KD Scientific Tipo: KDS-210-CE Seringa: Fabricante: B.Braun Tipo: Omnifix de 20 mL ou 30 mL / Luer Lock Solo Ref: 4617207V Tubulação: Fabricante: B.Braun Tipo: Safeflow Extension Set Ref: 4097154 Agulha: Fabricante: B.Braun Tipo: Sterican, 20G x 1 %‘’ Ref: 4657519 Válvula de mistura: Fabricante: B.Braun Tipo: Discofix C 3SC Ref: 16494C Água para injeção: Fabricante: B.Braun Tipo: Aqua Ref: 82423E
[0256] Método exemplificativo para a preparação de poliplexos contendo 1 mg de RNA de hCFTR SNIM e 1 mg de FFL de mRNA SNIM N / P 10 em um volume de 8 mL: 3 mL de água para injeção e solução de estoque de RNA de 3 mL (c: 1 mg/mL em água; 1,5 mL de mRNA de FFL + 1,5 mL de mRNA de CFTR) foram depositados em um tubo falcon de 15 mL. Em um segundo tubo falcon de 5,61 mL, a água para injeção foi misturada com uma solução de estoque de brPEI de 0,39 mL brPEI (c: 10 mg/mL em água). Duas seringas de 20 mL foram fixadas no dispositivo de mistura. Cada uma delas foi ligada a uma agulha através de um tubo. Uma seringa foi preenchida com a solução de RNA e a outra com a solução de PEI utilizando a função de retirada da bomba da seringa. (Configurações: Diâmetro: 20,1 mm, Fluxo: 5 mL/min, Volume: 5,9 mL). As agulhas foram removidas e os tubos ligados à válvula de mistura. Foi importante conectar a seringa contendo a solução de RNA à posição angular da válvula. Para controlar o diâmetro de saída, uma agulha foi conectada. A mistura foi realizada usando a função de bomba da seringa (Configurações: Diâmetro: 20,1 mm, Fluxo: 40 mL/min, Volume: 5,8 mL). Para obter um índice de polidispersibilidade reprodutível, as amostras foram fracionadas manualmente durante a mistura. Os primeiros μLs até a estabilização do fluxo (100-200μL) e os últimos μL, por vezes contendo bolhas de ar, foram coletados em um tubo separado. A mistura foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente para a formação de poliplex e depois armazenada em gelo. Para doses diferentes, os parâmetros foram modificados e adaptados como mostrado na Tabela 5. Tabela 5: Volumes exemplificativos e configurações para diferentes volumes de mistura
Figure img0022
V (retirada) e V (infusão) designam a configuração da bomba da seringa para aspiração e dispensão, respectivamente, dos componentes de mRNA e PEI.
[0257] A transfecção de células HEK para verificar a funcionalidade dos complexos nebulizados. Após a nebulização, uma alíquota de complexos (80μl) foi usada para transfectar células HEK. Um dia antes da transfecção, células 1x106 foram plaqueadas em placas de 6 poços. No dia da transfecção, o meio foi removido das células, as células foram lavadas com PBS uma vez, depois disso, 80μl de complexos em conjunto com 920μl de meio MEM sem soro foi adicionado a cada poço. Para cada complexo, foram preparados três poços replicados. As células foram incubadas com os complexos durante 4 horas sob condições de cultivo celular padronizado. No final da incubação, um complexo contendo o meio foi removido e o meio de MEM contendo soro (1 ml) foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas em condições de cultivo celular padrão. Passadas 24 horas da transfecção, os lisados proteicos foram preparados utilizando o mesmo protocolo e os tampões foram usados para os tecidos animais com a exclusão da etapa de homogenização. As células de três poços foram agrupadas para análise. A expressão de CFTR humana foi detectada utilizando imunoprecipitação com o anticorpo R24.1 (R&D Systems) e Western blot com uma combinação de 217, 432 e 596 anticorpos (todos do Cystic Fibrosis Consortium, Universidade da Pensilvânia, PA, USA). hCFTR pôde ser detectado para todos os complexos nebulizados nos porcos (ver Figuras 54-57).
[0258] Aplicação em aerossol. O aerossol (apenas WFI de 44 ml; formulação de PEI de mRNA em WFI: de 8,24 e 44 ml) foi nebulizado e inalado no porco anestesiado através do nebulizador de malha Aeroneb® . A sedação nos porcos foi iniciada pela pré-medicação com azaperona de 2 mg/kg do peso corporal, cetamina de 15 mg/kg do peso corporal, atropina de 0,1 mg/kg do peso corporal e seguido por inserção de uma linha intravenosa na veia auricular lateral. Os porcos foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol de 3-5 mg/kg do peso corporal, conforme necessário. A anestesia foi mantida por isoflurano (2-3%) com 1% de injeção de bolo de propofol de 4 a 8 mg/kg do peso corporal para intensificar a anestesia, conforme necessário. A duração da anestesia foi de aproximadamente 1-3 horas. Os porcos foram sacrificados com injeção de bolo de pentobarbital (100 mg/kg do peso corporal) e de cloreto de potássio através da veia lateral da orelha 24 horas após a conclusão do tratamento com aerossol. Os pulmões foram removidos e os espécimes pulmonares foram coletados de várias regiões pulmonares. As amostras armazenadas foram submetidas a diferentes métodos de avaliação, como bioluminescência, histopatologia, IP/Western Blot e Elisa.
[0259] Análise de bioluminescência. Para a medição da atividade da luciferase, espécimes de tecido foram homogeneizados ou analisados em um luminômetro tubular ou incubados em um banho como meio compreendendo substrato de D-Luciferina e submetidos a BLI de luciferase ex vivo Os dados ilustram que um sinal de bioluminescência forte foi observado para cada um dos coortes 2-4 (1 mg, 5, mg e 10 mg, respectivamente) em comparação às amostras de tecido pulmonar de controle do coorte 1 (controle de veículo WFI) (Figuras 35-38 ).
[0260] Análise de expressão de CFTR por Western Blot e imunohistoquímica. Amostras de tecidos positivos para FFL foram removidas (mínimo de 10 amostrar por porco em um coorte) e analisadas por imunoprecipitação/Western Blot (WB-IP) e imunohistoquímica para CFTR humana. Em resumo, os lisados proteicos foram preparados a partir de pulmões de porcos da seguinte forma: Entre 300-400 mg de tecido pulmonar foram utilizados para análise. O tecido foi homogeneizado em um tampão de base (20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 8,0) contendo inibidores de protease utilizando LysingMatrixA (MPBiomedicals, Ref: 6910500) e o homogeneizador "FastPrep24" (MP Biomedicals). A mistura do tecido inteiro foi transferida para um novo tubo Eppendorf pré-refrigerado com trava de segurança de 2ml e iodoacetamida de 25 μl (Sigma: I6125) e clivagem Omni de 1μl (1:5 diluído em tampão de clivagem Omni) (Epicentro: OC7810K) foram adicionados. As amostras foram então incubadas no gelo durante 5 minutos, seguida pela adição de 26μl da solução com 10% de SDS. As amostras foram incubadas, posteriormente, a 4°C durante 60 minutos em um misturador. Pós-incubação, 260μl de tampão de lise (tampão de base de 850μl + 10% de Triton X-100 + 5% desoxicolato de sódio) foram adicionados às amostras e foram incubados a 4°C em um misturador durante 90 minutos. Por fim, os lisados proteicos foram centrifugados a 13.000 rpm a 4°C durante 10-20 min e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf. A concentração de proteína foi quantificada usando a análise de proteína BCA (Pierce). Foram porcionadas amostras contendo 10 mg do total de proteína e os volumes finais foram ajustados com o tampão de base a 1 ml por amostra. Com base nos dados apresentados no Exemplo 6, a imunoprecipitação de CFTR foi realizada utilizando o anticorpo R24.1 e foi seguida pela imunodetecção por Western Blot de CFTR usando uma combinação de três anticorpos diferentes obtidos junto ao Cystic Fibrosis Consortium, Universidade da Pensilvânia, PA, EUA (anticorpos 217, 432, 596). Para controlar a variabilidade intragrupo entre diferentes animais e a variabilidade da expressão de CFTR, a banda de marcadores em tamanhos padronizados de tamanho de proteína correspondentes a 150 kDa foram definidos como referência e as intensidades de banda de diferentes grupos foram normalizadas para esse valor. Como demonstrado na Figura 39, apenas 16% das amostras de tecidos analisadas dos porcos de controle do coorte 1 resultaram em um nível de expressão de CFTR superior à linha de base. Em contraste, os coortes 3 e 4, que representam os grupos de tratamento de 5 mg e 10 mg, respectivamente, resultaram, cada, em mais de 30% de suas amostras de tecido pulmonar com resultado positivo para um nível de expressão de CFTR superior à linha de base (Figura 39). Além disso, o aumento da expressão de CFTR observado em coortes de 3 e 4 foi quase duas vezes maior do que a do controle.
[0261] A análise de imunohistoquímica de CFTR foi realizada pela quantificação dos bronquíolos e brônquios positivos para CFTR. Um brônquio/bronquíolo foi considerado positivo se pelo menos uma célula epitelial tiver sido detectada dentro da camada de células epiteliais que indicam um sinal claro de CFTR situada na membrana. Uma imagem representativa de uma amostra "positiva" é representada na Figura 40. As condições para a imunohistoquímica de CFTR foram otimizadas pela análise da especificidade dos anticorpos disponíveis contra CFTR utilizando um único anticorpo ou combinações de até três anticorpos, respectivamente. Sinais claros específicos de CFTR foram observados após a incubação do anticorpo 596. Os dados demonstram que as células epiteliais positivas para CFTR foram detectadas em seções de tecido pulmonar de todos os quatro grupos, demonstrando a detecção de CFTR humana e porcina por meio do procedimento de imunohistoquímica (Figura 41 e 45). Embora níveis de expressão de CFTR baixos (Figura 42), médios (Figura 43) e elevados (Figura 44) tenham sido observados no coorte 3, a descoberta como um todo demonstra que o tratamento de 5 mg do RNA SNIM de CFTR humano otimizado com códon resultou em um número superior de células positivas para CFTR e da intensidade do sinal de CFTR como um todo para o controle do veículo. Os dados também ilustram outra intensificação da expressão de CFTR a seguir ao tratamento de 10 mg, demonstrando, assim, um efeito claro de resposta à dose (Figura 45). A quantificação de números absolutos e relativos de brônquios/bronquíolos positivos para CFTR corroboram ainda mais essas descobertas, apresentando um número significativamente maior em animais tratados com 5 ou 10 mg do RNA SNIM de CFTR humano em comparação ao controle de veículo (Figura 46). Indicação de uma elevação geral nos níveis de expressão de CFTR após o tratamento com RNA SNIM de CFTR humano.
[0262] Análise de expressão de CFTR por hibridaçâo in situ (ISH). As amostras de tecidos positivas de FFL foram removidas (mínimo de 10 amostras para cada porco em um coorte) e submetidas à análise de hibridização manual in situ usando a tecnologia de sonda "ZZ" RNAscope® (Advanced Cell Diagnostic). As sondas foram geradas com base na sequência otimizadas com códons do RNA SNIM de CFTR humano otimizado com códon (SEQ ID NO:17). Em resumo, a análise ensaio RNAscope® é uma análise de hibridização in situ projetada para visualizar moléculas de RNA único por célula de tecido fixado em parafina (FFPE), fixado em formalina posicionado em lâminas. Cada amostra de tecido fixada foi pré-tratada de acordo com o protocolo de fábrica e incubada com uma sonda de RNA específico de CFTR humano específico alvo. A sonda de hCFTR foi exibida como vinculada a CFTR, com reatividade cruzada a humanos, camundongos, ratos, porcos e macacos. Uma vez vinculada, a sonda é hibridizada com uma cascata de moléculas de amplificação de sinal, por meio de uma série de 6, a sonda é hibridado com uma cascata de moléculas de amplificação de sinal, através de uma série de seis rodadas consecutivas de amplificação. A amostra foi então tratada com uma sonda marcada com HRP específico para o cassete de amplificação de sinal e analisadas por visualização cromática utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB). A sonda específica para Ubiquitina C foi utilizada como o controle positivo (Figuras 47A e 48A), enquanto dapB foi usada como o controle negativo (Figuras 47B e 48B). O sinal de CFTR positivo foi comparado ao do tecido pulmonar porcino tratado de controle de veículo (Figura 49 A e B). Amostras com coloração foram visualizadas em um microscópio de campo claro padrão. Os dados demonstram que o tratamento com 1 mg de RNA SNIM de CFTR humano otimizado com códon resultou em um aumento drástico na expressão de CFTR no tecido do pulmão direito (A) e também do esquerdo (B) do coorte 2 em comparação ao controle de veículo (Figura 49 e 50 A e B). Além disso, foi observado um aumento na expressão de CFTR para os grupos de tratamento de 5 mg e 10 mg, como demonstrado por um aumento drástico de coloração nas amostras do pulmão direito (A) e esquerdo (B) analisadas nos coortes 3 e 4 (Figuras 51 e 52 A e B). Tomados em conjunto, esses dados corroboram fortemente a distribuição efetiva de mRNA por meio de inalação e a expressão de CFTR humana em ambos os lobos do pulmão e seus diversos tecidos.
[0263] Conclusão. Os resultados demonstraram que tanto a luciferase quanto o mRNA de CFTR podem ser distribuídos efetivamente in vivo para os tecidos pulmonares. A expressão de luciferase foi observada ao longo de várias amostras de tecido coletadas a partir de diferentes regiões nos lobos pulmonares direito e esquerdo dos pulmões. Isso sugere que a nebulização é uma abordagem efetiva para a administração de mRNA e resulta em uma distribuição bastante uniforme. Ademais, em adição à luciferase, o mRNA de CFTR também foi distribuído de maneira eficiente aos pulmões, resultando em uma expressão intensificada de proteína. A expressão e a atividade proteica foram verificadas por IP-WB, imunohistoquímica e hibridização in situ. Cada abordagem demonstrou claramente um aumento dependente de dose na distribuição de mRNA e na expressão e/ou atividade de CFTR nos tecidos do pulmão. Tomadas em conjunto, os experimentos destacam a viabilidade geral e possibilidade de distribuição do mRNA de CFTR ao pulmão de um indivíduo humano e demonstram a efetividade da produção de proteína de CFTR in vivo para uso terapêutico.
Exemplo 12: Expressão/n vivo no pulmão
[0264] Esse exemplo demonstra a expressão in vivo bem-sucedida no pulmão após a distribuição em aerossol das nanopartículas carregadas com mRNA. Todos os estudos foram realizados utilizando porcos da raça Landrace alemão, obtido junto à Universidade Técnica de Munique, Weihenstephan, Alemanha. Os porcos tinham um peso corporal variando entre 35-90 kg. A formulação de mRNA de FFL/CO-CFTR-C-His10 ou controle de veículo foi induzida usando um nebulizador de jato Pari. Os porcos foram sacrificados e perfundidos com solução salina, depois de um período de tempo predeterminado, para permitir a expressão de proteína do mRNA.
[0265] Síntese do RNA mensageiro. No exemplo, o mRNA de luciferase de vagalume otimizada com códon (CO-FFL) foi sintetizado por transcrição in vitro de modelos de DNA de plasmídeo.
[0266] Formulação de CKK-E12. Para o experimento de nanopartículas à base de lípidos, uma formulação lipídica foi criada usando 1 mg de FFL + 9 mg de mRNA de CO-CFTR-C-His10 encapsulados em uma formulação de CKK-E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K (quantidades relativas de 40:30:25:5 (razão molar). A solução foi nebulizada para os pulmões dos porcos que usam o nebulizador indicado.
[0267] Aplicação em aerossol. O aerossol (salina ou formulação de CO-FFL CKK-E12) foi nebulizado e inalado ao porco anestesiado. A sedação nos porcos foi iniciada pela pré-medicação com azaperona de 2 mg/kg do peso corporal, cetamina de 15 mg/kg do peso corporal, atropina de 0,1 mg/kg do peso corporal e seguido por inserção de uma linha intravenosa na veia auricular lateral. Os porcos foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol de 3-5 mg/kg do peso corporal, conforme necessário. A anestesia foi mantida por isoflurano (2-3%) com 1% de injeção de bolo de propofol de 4 a 8 mg/kg do peso corporal para intensificar a anestesia, conforme necessário. A duração da anestesia foi de aproximadamente 1-3 horas. Os porcos foram mortos com injeção de bolo de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) e de cloreto de potássio através da veia lateral da orelha. Os pulmões foram removidos e os espécimes de tecido foram coletados de várias regiões pulmonares por incubação em meio de cultivo celular durante uma noite. As amostras armazenadas foram submetidas à detecção de bioluminescência.
[0268] Análise de bioluminescência. Para a medição da atividade da luciferase, espécimes de tecido foram homogeneizados ou analisados em um luminômetro tubular ou incubados em um banho como meio compreendendo substrato de D-Luciferina e submetidos a BLI de luciferase ex vivo Um sinal de bioluminescência forte foi observado para cada um dentre: (A) porcos tratados com mRNA de FFL/CO-CFTR-C-His10, em comparação a (B) amostras de tecido de pulmão de controle de porcos de controle (controle de veículo de salina) (Figura 53 A e B).
[0269] Esses dados ilustram que o mRNA de FFL/CFTR foram distribuídos com êxito e expressados no pulmão por administração em aerossol. BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO 1. Sequência de aminoácido de CFTR de tipo selvagem. SEQ ID NO:2 Sequência de codificação de mRNA de CFTR de tipo selvagem. SEQ ID NO 3. Sequência #1 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 4. 5'-UTR de mRNA de CFTR. SEQ ID NO 5. 3’-UTR de mRNA de CFTR #1. SEQ ID NO 6. 5'UTR de FFL. SEQ ID NO 7. Sequência de codificação de FFL. SEQ ID NO 8. 3'UTR de FFL. SEQ ID NO 9. Sequência #2 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 10. Sequência #3 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 11. Sequência #4 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 12. Sequência #5 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 13. Sequência #6 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 14. Sequência #7 de codificação de mRNA de CFTR de ocorrência não-natural. SEQ ID NO 15. Sequência de codificação de mRNA de fusão de His10 com terminação em C de CFTR humano otimizado com códon. SEQ ID NO 16. Sequência de codificação de mRNA de CFTR humano otimizado com códon com uma sequência principal de hormônio de crescimento. SEQ ID NO 17. mRNA de CFTR humano otimizado com códon SEQ ID NO 18. Sequência principal #1 de mRNA SEQ ID NO 19. Sequência principal #2 de mRNA SEQ ID NO 20. 3’-UTR de mRNA de CFTR #2. SEQ ID NO:1 MQRSPLEKASVVSKLFFSWTRPILRKGYRQRLELSDIYQIPSVDSADNLSE KLEREWDRELASKKNPKLINALRRCFFWRFMFYGIFLYLGEVTKAVQPLLL GRIIASYDPDNKEERSIAIYLGIGLCLLFIVRTLLLHPAIFGLHHIGMQMRIAM FSLIYKKTLKLSSRVLDKISIGQLVSLLSNNLNKFDEGLALAHFVWIAPLQVA LLMGLIWELLQASAFCGLGFLIVLALFQAGLGRMMMKYRDQRAGKISERLV ITSEMIENIQSVKAYCWEEAMEKMIENLRQTELKLTRKAAYVRYFNSSAFFF SGFFVVFLSVLPYALIKGIILRKIFTTISFCIVLRMAVTRQFPWAVQTWYDSL GAINKIQDFLQKQEYKTLEYNLTTTEVVMENVTAFWEEGFGELFEKAKQN NNNRKTSNGDDSLFFSNFSLLGTPVLKDINFKIERGQLLAVAGSTGAGKTS LLMVIMGELEPSEGKIKHSGRISFCSQFSWIMPGTIKENIIFGVSYDEYRYR SVIKACQLEEDISKFAEKDNIVLGEGGITLSGGQRARISLARAVYKDADLYLL DSPFGYLDVLTEKEIFESCVCKLMANKTRILVTSKMEHLKKADKILILHEGSS YFYGTFSELQNLQPDFSSKLMGCDSFDQFSAERRNSILTETLHRFSLEGD APVSWTETKKQSFKQTGEFGEKRKNSILNPINSIRKFSIVQKTPLQMNGIEE DSDEPLERRLSLVPDSEQGEAILPRISVISTGPTLQARRRQSVLNLMTHSV NQGQNIHRKTTASTRKVSLAPQANLTELDIYSRRLSQETGLEISEEINEEDL KECFFDDMESIPAVTTWNTYLRYITVHKSLIFVLIWCLVIFLAEVAASLVVLW LLGNTPLQDKGNSTHSRNNSYAVIITSTSSYYVFYIYVGVADTLLAMGFFR GLPLVHTLITVSKILHHKMLHSVLQAPMSTLNTLKAGGILNRFSKDIAILDDLL PLTIFDFIQLLLIVIGAIAVVAVLQPYIFVATVPVIVAFIMLRAYFLQTSQQLKQ LESEGRSPIFTHLVTSLKGLWTLRAFGRQPYFETLFHKALNLHTANWFLYL STLRWFQMRIEMIFVIFFIAVTFISILTTGEGEGRVGIILTLAMNIMSTLQWAV NSSIDVDSLMRSVSRVFKFIDMPTEGKPTKSTKPYKNGQLSKVMIIENSHV KKDDIWPSGGQMTVKDLTAKYTEGGNAILENISFSISPGQRVGLLGRTGSG KSTLLSAFLRLLNTEGEIQIDGVSWDSITLQQWRKAFGVIPQKVFIFSGTFR KNLDPYEQWSDQEIWKVADEVGLRSVIEQFPGKLDFVLVDGGCVLSHGH KQLMCLARSVLSKAKILLLDEPSAHLDPVTYQIIRRTLKQAFADCTVILCEHR IEAMLECQQFLVIEENKVRQYDSIQKLLNERSLFRQAISPSDRVKLFPHRNS SKCKSKPQIAALKEETEEEVQDTRL (SEQ ID NO:1) SEQ ID NOG 2 AUGCAGAGGUCGCCUCUGGAAAAGGCCAGCGUUGUCUCCAAA CUUUUUUUCAGCUGGACCAGACCAAUUUUGAGGAAAGGAUACAGACA GCGCCUGGAAUUGUCAGACAUAUACCAAAUCCCUUCUGUUGAUUCU GCUGACAAUCUAUCUGAAAAAUUGGAAAGAGAAUGGGAUAGAGAGCU GGCUUCAAAGAAAAAUCCUAAACUCAUUAAUGCCCUUCGGCGAUGUU UUUUCUGGAGAUUUAUGUUCUAUGGAAUCUUUUUAUAUUUAGGGGA AGUCACCAAAGCAGUACAGCCUCUCUUACUGGGAAGAAUCAUAGCUU CCUAUGACCCGGAUAACAAGGAGGAACGCUCUAUCGCGAUUUAUCUA GGCAUAGGCUUAUGCCUUCUCUUUAUUGUGAGGACACUGCUCCUAC ACCCAGCCAUUUUUGGCCUUCAUCACAUUGGAAUGCAGAUGAGAAUA GCUAUGUUUAGUUUGAUUUAUAAGAAGACUUUAAAGCUGUCAAGCCG UGUUCUAGAUAAAAUAAGUAUUGGACAACUUGUUAGUCUCCUUUCCA ACAACCUGAACAAAUUUGAUGAAGGACUUGCAUUGGCACAUUUCGUG UGGAUCGCUCCUUUGCAAGUGGCACUCCUCAUGGGGCUAAUCUGGG AGUUGUUACAGGCGUCUGCCUUCUGUGGACUUGGUUUCCUGAUAGU CCUUGCCCUUUUUCAGGCUGGGCUAGGGAGAAUGAUGAUGAAGUAC AGAGAUCAGAGAGCUGGGAAGAUCAGUGAAAGACUUGUGAUUACCU CAGAAAUGAUUGAAAAUAUCCAAUCUGUUAAGGCAUACUGCUGGGAA GAAGCAAUGGAAAAAAUGAUUGAAAACUUAAGACAAACAGAACUGAAA CUGACUCGGAAGGCAGCCUAUGUGAGAUACUUCAAUAGCUCAGCCU UCUUCUUCUCAGGGUUCUUUGUGGUGUUUUUAUCUGUGCUUCCCUA UGCACUAAUCAAAGGAAUCAUCCUCCGGAAAAUAUUCACCACCAUCU CAUUCUGCAUUGUUCUGCGCAUGGCGGUCACUCGGCAAUUUCCCUG GGCUGUACAAACAUGGUAUGACUCUCUUGGAGCAAUAAACAAAAUAC AGGAUUUCUUACAAAAGCAAGAAUAUAAGACAUUGGAAUAUAACUUAA CGACUACAGAAGUAGUGAUGGAGAAUGUAACAGCCUUCUGGGAGGA GGGAUUUGGGGAAUUAUUUGAGAAAGCAAAACAAAACAAUAACAAUA GAAAAACUUCUAAUGGUGAUGACAGCCUCUUCUUCAGUAAUUUCUCA CUUCUUGGUACUCCUGUCCUGAAAGAUAUUAAUUUCAAGAUAGAAAG AGGACAGUUGUUGGCGGUUGCUGGAUCCACUGGAGCAGGCAAGACU UCACUUCUAAUGAUGAUUAUGGGAGAACUGGAGCCUUCAGAGGGUA AAAUUAAGCACAGUGGAAGAAUUUCAUUCUGUUCUCAGUUUUCCUGG AUUAUGCCUGGCACCAUUAAAGAAAAUAUCAUCUUUGGUGUUUCCUA UGAUGAAUAUAGAUACAGAAGCGUCAUCAAAGCAUGCCAACUAGAAG AGGACAUCUCCAAGUUUGCAGAGAAAGACAAUAUAGUUCUUGGAGAA GGUGGAAUCACACUGAGUGGAGGUCAACGAGCAAGAAUUUCUUUAG CAAGAGCAGUAUACAAAGAUGCUGAUUUGUAUUUAUUAGACUCUCCU UUUGGAUACCUAGAUGUUUUAACAGAAAAAGAAAUAUUUGAAAGCUG UGUCUGUAAACUGAUGGCUAACAAAACUAGGAUUUUGGUCACUUCUA AAAUGGAACAUUUAAAGAAAGCUGACAAAAUAUUAAUUUUGAAUGAAG GUAGCAGCUAUUUUUAUGGGACAUUUUCAGAACUCCAAAAUCUACAG CCAGACUUUAGCUCAAAACUCAUGGGAUGUGAUUCUUUCGACCAAUU UAGUGCAGAAAGAAGAAAUUCAAUCCUAACUGAGACCUUACACCGUU UCUCAUUAGAAGGAGAUGCUCCUGUCUCCUGGACAGAAACAAAAAAA CAAUCUUUUAAACAGACUGGAGAGUUUGGGGAAAAAAGGAAGAAUUC UAUUCUCAAUCCAAUCAACUCUAUACGAAAAUUUUCCAUUGUGCAAA AGACUCCCUUACAAAUGAAUGGCAUCGAAGAGGAUUCUGAUGAGCCU UUAGAGAGAAGGCUGUCCUUAGUACCAGAUUCUGAGCAGGGAGAGG CGAUACUGCCUCGCAUCAGCGUGAUCAGCACUGGCCCCACGCUUCA GGCACGAAGGAGGCAGUCUGUCCUGAACCUGAUGACACACUCAGUU AACCAAGGUCAGAACAUUCACCGAAAGACAACAGCAUCCACACGAAAA GUGUCACUGGCCCCUCAGGCAAACUUGACUGAACUGGAUAUAUAUU CAAGAAGGUUAUCUCAAGAAACUGGCUUGGAAAUAAGUGAAGAAAUU AACGAAGAAGACUUAAAGGAGUGCCUUUUUGAUGAUAUGGAGAGCAU ACCAGCAGUGACUACAUGGAACACAUACCUUCGAUAUAUUACUGUCC ACAAGAGCUUAAUUUUUGUGCUAAUUUGGUGCUUAGUAAUUUUUCU GGCAGAGGUGGCUGCUUCUUUGGUUGUGCUGUGGCUCCUUGGAAA CACUCCUCUUCAAGACAAAGGGAAUAGUACUCAUAGUAGAAAUAACA GCUAUGCAGUGAUUAUCACCAGCACCAGUUCGUAUUAUGUGUUUUA CAUUUACGUGGGAGUAGCCGACACUUUGCUUGCUAUGGGAUUCUUC AGAGGUCUACCACUGGUGCAUACUCUAAUCACAGUGUCGAAAAUUUU ACACCACAAAAUGUUACAUUCUGUUCUUCAAGCACCUAUGUCAACCC UCAACACGUUGAAAGCAGGUGGGAUUCUUAAUAGAUUCUCCAAAGAU AUAGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCUCUUACCAUAUUUGACUUCAU CCAGUUGUUAUUAAUUGUGAUUGGAGCUAUAGCAGUUGUCGCAGUU UUACAACCCUACAUCUUUGUUGCAACAGUGCCAGUGAUAGUGGCUU UUAUUAUGUUGAGAGCAUAUUUCCUCCAAACCUCACAGCAACUCAAA CAACUGGAAUCUGAAGGCAGGAGUCCAAUUUUCACUCAUCUUGUUAC AAGCUUAAAAGGACUAUGGACACUUCGUGCCUUCGGACGGCAGCCU UACUUUGAAACUCUGUUCCACAAAGCUCUGAAUUUACAUACUGCCAA CUGGUUCUUGUACCUGUCAACACUGCGCUGGUUCCAAAUGAGAAUA GAAAUGAUUUUUGUCAUCUUCUUCAUUGCUGUUACCUUCAUUUCCAU UUUAACAACAGGAGAAGGAGAAGGAAGAGUUGGUAUUAUCCUGACUU UAGCCAUGAAUAUCAUGAGUACAUUGCAGUGGGCUGUAAACUCCAGC AUAGAUGUGGAUAGCUUGAUGCGAUCUGUGAGCCGAGUCUUUAAGU UCAUUGACAUGCCAACAGAAGGUAAACCUACCAAGUCAACCAAACCA UACAAGAAUGGCCAACUCUCGAAAGUUAUGAUUAUUGAGAAUUCACA CGUGAAGAAAGAUGACAUCUGGCCCUCAGGGGGCCAAAUGACUGUC AAAGAUCUCACAGCAAAAUACACAGAAGGUGGAAAUGCCAUAUUAGA GAACAUUUCCUUCUCAAUAAGUCCUGGCCAGAGGGUGGGCCUCUUG GGAAGAACUGGAUCAGGGAAGAGUACUUUGUUAUCAGCUUUUUUGA GACUACUGAACACUGAAGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGUGUGUCUUG GGAUUCAAUAACUUUGCAACAGUGGAGGAAAGCCUUUGGAGUGAUA CCACAGAAAGUAUUUAUUUUUUCUGGAACAUUUAGAAAAAACUUGGA UCCCUAUGAACAGUGGAGUGAUCAAGAAAUAUGGAAAGUUGCAGAUG AGGUUGGGCUCAGAUCUGUGAUAGAACAGUUUCCUGGGAAGCUUGA CUUUGUCCUUGUGGAUGGGGGCUGUGUCCUAAGCCAUGGCCACAAG CAGUUGAUGUGCUUGGCUAGAUCUGUUCUCAGUAAGGCGAAGAUCU UGCUGCUUGAUGAACCCAGUGCUCAUUUGGAUCCAGUAACAUACCAA AUAAUUAGAAGAACUCUAAAACAAGCAUUUGCUGAUUGCACAGUAAU UCUCUGUGAACACAGGAUAGAAGCAAUGCUGGAAUGCCAACAAUUUU UGGUCAUAGAAGAGAACAAAGUGCGGCAGUACGAUUCCAUCCAGAAA CUGCUGAACGAGAGGAGCCUCUUCCGGCAAGCCAUCAGCCCCUCCG ACAGGGUGAAGCUCUUUCCCCACCGGAACUCAAGCAAGUGCAAGUC UAAGCCCCAGAUUGCUGCUCUGAAAGAGGAGACAGAAGAAGAGGUG CAAGAUACAAGGCUUUAG (SEQ ID NO:2) SEQ ID N0G3 AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAA CUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGC AGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUC GGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAA CUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUG CUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGG GAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCG CCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUAC CUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGU UGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCG AAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGU CGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCU UAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUU UCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAU UUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCU GAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAU GAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUC AUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUG CUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUG AGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUC GUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUU UUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCA CCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCA AUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUC AACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGA GUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCU UUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGA AUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUC UCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUU UCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGG UGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAG CCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUA GCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUU UUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGG CGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAA CAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGA GCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGU AUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAA GAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGA GAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAG AUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCU CAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGG GUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUC UUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGG UAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAA UUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAU UCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAA UUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGU GCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUG AUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGC UCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGC AAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAA UUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCG GACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGU UUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACAC AUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUC AUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUG UGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAA UUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUA CAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACAC UCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACG CUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGU ACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGU AUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCU GCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUU GGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCG CGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUU CUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGG UCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGA CGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCA CAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUA CCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUU CUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGC GAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGA GCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCU GAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACG GAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUU GAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACA UCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAA AUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCA UUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAG GAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGA GGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUG CAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUA UCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGG UCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGA GUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGA UGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUG GCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAAC CUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGAC ACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAU CGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAG AGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAG AGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAAC UUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUC GCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCU UUAA (SEQ ID NO:3) SEQ ID NOG 4 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUC CAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGU GCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUU GACACG (SEQ ID NO:4) SEQIDNOG CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGC CCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAU UAAGUUGCAUC (SEQ ID NO:5) SEQIDNOG GGGAUCCUACC (SEQ ID NO:6) SEQIDNOG AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCU ACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAU GAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCA CAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCG UUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCA UCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCC GUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAAC GACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCC AGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCU CAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGG AUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUG ACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCG AGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGU GGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCG CUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCA GAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCAC GGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUC GGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAG CUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAU UUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGC AACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGG UAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCA GGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCC GAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCU UCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGU GAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGC GGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGA CGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAG CACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGG GCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACA CCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAU GCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAA CCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUAC AACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGU GCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAG AUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUA (SEQ ID NO:7) SEQ ID NOG 8 UUUGAAUU (SEQ ID NO:8) SEQIDNOG AUGCAGAGAAGCCCCCUGGAAAAGGCCAGCGUGGUGUCCAAG CUGUUCUUCAGCUGGACCAGACCCAUCCUGAGAAAGGGCUACAGAC AGAGACUGGAACUGAGCGACAUCUACCAGAUCCCCAGCGUGGACAG CGCCGACAACCUGAGCGAGAAGCUGGAAAGAGAGUGGGACAGAGAG CUGGCUAGCAAGAAGAACCCCAAGCUGAUCAACGCCCUGAGGCGGU GCUUCUUCUGGCGGUUUAUGUUCUACGGCAUCUUCCUGUACCUGGG CGAAGUGACAAAGGCCGUGCAGCCCCUGCUCCUGGGCAGAAUCAUU GCCAGCUACGACCCCGACAACAAAGAGGAAAGAUCUAUCGCCAUCUA CCUGGGCAUCGGCCUGUGCCUGCUGUUCAUCGUGCGGACACUGCU GCUGCACCCCGCCAUCUUCGGCCUGCACCACAUCGGCAUGCAGAUG AGAAUCGCCAUGUUCAGCCUGAUCUACAAGAAAACCCUGAAGCUGAG CAGCAGGGUGCUGGACAAGAUCAGCAUCGGACAGCUGGUGUCCCUG CUGAGCAACAACCUGAACAAGUUCGACGAGGGACUGGCCCUGGCUC ACUUCGUGUGGAUCGCUCCACUGCAGGUCGCCCUGCUGAUGGGCCU GAUCUGGGAGCUGCUGCAGGCCAGCGCUUUCUGCGGCCUGGGCUU UCUGAUUGUGCUGGCCCUGUUUCAGGCUGGCCUGGGCAGGAUGAU GAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGCAAGAUCAGCGAGAGACUG GUCAUCACCAGCGAGAUGAUCGAGAACAUCCAGAGCGUGAAGGCCU ACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUCGAAAACCUGAGACAG ACCGAGCUGAAGCUGACCAGAAAGGCCGCCUACGUGCGGUACUUCA ACAGCAGCGCCUUCUUCUUCUCCGGCUUCUUCGUGGUGUUCCUGUC CGUGCUGCCCUACGCCCUGAUCAAGGGCAUCAUCCUG AGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCUUUCUGCAUCGUGCUGAGAAUGG CCGUGACCAGACAGUUCCCCUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACAG CCUGGGCGCCAUCAACAAGAUCCAGGACUUCCUGCAGAAGCAGGAG UACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACCACCACCGAGGUGGUCAUGGA AAACGUGACCGCCUUCUGGGAGGAAGGCUUCGGCGAGCUGUUCGAG AAGGCCAAGCAGAACAACAACAACAGAAAGACCAGCAACGGCGACGA CUCCCUGUUCUUCUCCAACUUCUCCCUGCUGGGCACCCCCGUGCUG AAGGACAUCAACUUCAAGAUCGAGAGAGGCCAGCUGCUCGCCGUGG CCGGCUCUACAGGCGCUGGCAAGACCUCUCUGCUGAUGGUCAUCAU GGGCGAGCUGGAACCCAGCGAGGGCAAGAUCAAGCACAGCGGCAGA AUCAGCUUCUGCAGCCAGUUCAGCUGGAUCAUGCCCGGC SEQ ID NOGIO AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAA CUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGC AGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUC GGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAA CUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUG CUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGG GAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCG CCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUAC CUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGU UGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCG AAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGU CGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCU UAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUU UCGUGUGGAUUGCCCCGCUGCAAGUCGCACUGCUUAUGGGACUGAU UUGGGAACUGUUGCAGGCCAGCGCCUUUUGCGGCCUGGGAUUUCUC AUUGUGCUUGCACUUUUCCAAGCAGGGCUCGGCAGAAUGAUGAUGA AGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUCUCAGAACGGCUCGUGAU UACUUCAGAAAUGAUCGAGAACAUUCAAUCGGUGAAAGCGUACUGCU GGGAAGAGGCGAUGGAAAAGAUGAUCGAAAACCUCAGACAGACCGAG UUGAAGCUGACCCGGAAGGCCGCGUACGUCAGAUACUUCAACAGCA GCGCUUUCUUCUUCUCGGGCUUCUUCGUCGUGUUCCUGUCGGUGC UGCCGUAUGCCCUCAUUAAGGGAAUUAUCUUG CGGAAGAUCUUUACUACUAUCUCAUUUUGCAUCGUCCUUCGGAUGG CGGUCACUCGGCAGUUCCCGUGGGCCGUGCAGACCUGGUACGACAG CCUCGGGGCCAUCAACAAGAUCCAAGACUUUCUCCAAAAGCAAGAGU ACAAAACCCUCGAAUACAACCUCACCACUACUGAAGUGGUCAUGGAA AACGUGACCGCCUUUUGGGAAGAAGGCUUCGGAGAACUGUUCGAGA AGGCGAAGCAAAACAACAAUAAUCGCAAGACUAGCAACGGGGAUGAC UCACUGUUCUUCAGCAAUUUCUCACUGCUCGGCACCCCGGUGCUUA AGGACAUCAACUUCAAGAUUGAACGCGGACAGCUCUUGGCGGUGGC CGGAUCCACCGGAGCAGGAAAGACUAGCCUGCUGAUGGUGAUCAUG GGUGAGCUGGAACCGUCCGAAGGCAAAAUCAAGCACUCCGGCAGAA UCAGCUUCUGCUCGCAGUUUUCGUGGAUCAUGCCAGGA SEQ ID N0G11 AUGCAGAGAAGCCCACUGGAAAAGGCGUCGGUGGUGUCAAAG CUGUUCUUUAGCUGGACCAGACCUAUCUUGCGGAAGGGAUACCGCC AACGCCUGGAGCUGUCGGACAUCUACCAGAUUCCGUCAGUGGAUUC AGCAGACAAUCUCUCCGAAAAGCUGGAACGCGAAUGGGACAGAGAGU UGGCGUCAAAGAAGAACCCAAAGUUGAUCAAUGCCCUGCGCCGCUG CUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGAAUCUUUCUGUACCUCGGC GAAGUCACCAAGGCUGUGCAACCGCUUCUGCUGGGACGCAUCAUCG CCUCAUACGACCCGGACAACAAGGAAGAACGCUCCAUCGCAAUCUAC CUCGGGAUCGGCCUCUGCCUGCUGUUUAUCGUGCGGACGCUGCUG CUCCAUCCAGCCAUUUUCGGACUGCACCACAUUGGCAUGCAAAUGC GGAUCGCCAUGUUCAGCCUGAUCUACAAAAAGACCCUGAAGUUGAGC UCACGGGUGUUGGAUAAGAUUUCGAUCGGACAGCUGGUGUCGCUGC UCUCCAACAACCUCAACAAGUUUGACGAAGGCCUGGCACUGGCCCAC UUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUA UUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUC UGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGA UGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGU CAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUU GCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACU GAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUU CGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGU UUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUC CGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGG CAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUC GCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGU ACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAG AAUGUGACGGCUUUUUGGGAGGAAGGAUUCGGCGAAUUGUUCGAAA AGGCUAAGCAGAACAACAACAAUCGGAAAACCUCCAAUGGGGACGAU UCGCUGUUCUUCUCGAAUUUCUCCCUGCUGGGAACGCCCGUGCUUA AAGACAUCAACUUCAAGAUCGAACGGGGCCAGCUGCUCGCGGUCGC GGGCAGCACUGGAGCGGGAAAGACUUCCCUGCUCAUGGUCAUCAUG GGAGAGCUGGAGCCCUCGGAGGGCAAAAUCAAGCACUCGGGGAGGA UCUCAUUUUGCAGCCAGUUCUCGUGGAUCAUGCCCGGU SEQ ID N0G12 AUGCAGCGGUCCCCUCUGGAGAAGGCUUCCGUGGUCAGCAAG CUGUUCUUCUCGUGGACCAGACCUAUCCUCCGCAAGGGAUACCGCC AGCGCCUGGAGCUGUCAGAUAUCUACCAGAUCCCAAGCGUGGACUC AGCCGACAAUCUGAGCGAAAAGCUGGAACGGGAGUGGGACCGGGAG CUCGCCUCCAAGAAGAAUCCGAAGUUGAUCAAUGCGCUGCGCAGAU GCUUCUUCUGGCGGUUUAUGUUUUACGGCAUCUUUCUGUAUCUCGG AGAAGUGACCAAAGCCGUGCAGCCGCUGCUCUUGGGUAGGAUCAUU GCUUCGUACGACCCGGACAACAAAGAAGAACGCUCCAUCGCCAUCUA CCUCGGAAUCGGUCUGUGCCUGCUCUUUAUCGUGCGCACUCUCCUG CUGCAUCCGGCGAUCUUCGGACUGCACCACAUCGGCAUGCAAAUGC GGAUCGCAAUGUUCUCACUGAUCUACAAAAAGACUCUGAAGCUCAGC UCCAGAGUGCUGGAUAAGAUCUCGAUCGGGCAACUCGUCAGCCUGC UGUCGAACAAUCUGAAUAAGUUCGACGAAGGGUUGGCCCUCGCACA UUUCGUGUGGAUCGCACCGCUGCAAGUGGCGCUCCUGAUGGGACUC AUUUGGGAACUGCUCCAAGCCAGCGCGUUUUGCGGACUCGGAUUCC UGAUCGUGCUCGCCCUGUUCCAAGCCGGACUGGGGCGCAUGAUGAU GAAGUACCGCGAUCAGCGGGCAGGAAAGAUCUCCGAGCGGUUGGUG AUCACUUCCGAAAUGAUCGAGAAUAUUCAGUCCGUGAAGGCCUACUG CUGGGAAGAAGCUAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACUUGCGGCAAACUG AGCUGAAAUUGACUCGCAAAGCGGCAUACGUCCGCUACUUCAAUAGC AGCGCCUUCUUCUUUUCGGGCUUUUUCGUGGUGUUUCUGAGCGUG CUGCCCUACGCUCUGAUCAAGGGAAUCAUCCUC CGGAAAAUCUUCACCACCAUUUCGUUCUGUAUCGUGUUGCGCAUGG CCGUGACUCGCCAGUUCCCCUGGGCGGUGCAGACCUGGUACGACAG CUUGGGGGCAAUCAAUAAGAUUCAAGACUUCUUGCAAAAGCAGGAGU ACAAGACUCUGGAGUACAACCUGACCACCACUGAAGUCGUGAUGGAG AACGUGACCGCCUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGA AAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAU UCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGA AGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGC GGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUG GGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUA UCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGA SEQ ID NOG 13 AUGCAGCGCUCGCCUCUGGAGAAAGCCUCAGUCGUGUCAAAAC UGUUCUUUAGCUGGACUCGCCCGAUUCUCCGGAAGGGUUAUAGACA GCGCUUGGAGCUCUCCGACAUCUACCAAAUCCCUUCCGUGGACUCC GCCGACAACCUGUCGGAGAAGCUCGAACGCGAGUGGGACCGGGAAC UCGCGUCCAAAAAGAAUCCAAAACUCAUUAAUGCACUGCGCCGCUGC UUCUUCUGGCGCUUUAUGUUUUACGGUAUCUUUCUCUACCUGGGCG AGGUGACGAAAGCAGUGCAGCCGCUCCUGCUUGGCAGAAUUAUCGC CUCGUACGAUCCGGAUAACAAAGAAGAACGCUCAAUCGCUAUCUACC UCGGUAUCGGAUUGUGCCUGCUUUUCAUCGUGCGCACCCUGUUGCU GCACCCGGCGAUUUUCGGACUCCACCACAUCGGAAUGCAAAUGAGAA UUGCAAUGUUCUCAUUGAUCUACAAAAAGACCCUUAAACUGUCGUCC CGCGUCCUCGACAAGAUUUCAAUCGGCCAGCUGGUGUCGCUUCUUU CGAAUAAUCUUAACAAGUUCGAUGAAGGACUCGCGCUCGCCCAUUUC GUGUGGAUCGCACCACUUCAAGUCGCACUGCUCAUGGGACUGAUUU GGGAGUUGCUGCAGGCUUCCGCCUUUUGCGGCCUGGGAUUCCUGA UCGUCCUGGCUUUGUUCCAGGCUGGACUGGGCAGAAUGAUGAUGAA GUACCGGGACCAGCGGGCAGGAAAGAUCAGCGAAAGGCUCGUGAUC ACUAGCGAAAUGAUCGAGAACAUCCAAUCCGUCAAGGCGUACUGCUG GGAAGAAGCGAUGGAGAAGAUGAUCGAAAAUCUUCGCCAGACCGAAC UCAAACUCACUAGAAAGGCUGCCUACGUGCGCUACUUUAACAGCUCA GCAUUUUUCUUCUCCGGAUUUUUCGUGGUGUUCCUGUCGGUGCUGC CAUACGCCCUGAUCAAGGGGAUCAUUCUU CGCAAAAUCUUCACCACGAUCUCAUUCUGCAUUGUCCUCCGGAUGG CCGUGACGCGGCAGUUCCCUUGGGCAGUGCAAACUUGGUACGAUUC GCUGGGGGCCAUUAACAAGAUUCAAGAUUUUCUUCAAAAGCAGGAGU ACAAAACCCUGGAGUACAAUCUGACCACUACGGAAGUCGUGAUGGAA AACGUGACUGCUUUUUGGGAGGAAGGCUUCGGCGAACUUUUUGAAA AGGCAAAGCAAAACAAUAACAACAGAAAGACGUCAAACGGCGAUGAC UCGCUGUUCUUCUCCAAUUUCUCCCUGCUCGGCACCCCUGUGCUGA AGGACAUCAACUUCAAAAUUGAACGCGGACAGCUGCUGGCCGUGGC GGGAUCGACCGGGGCUGGGAAAACCUCGUUGUUGAUGGUGAUCAUG GGAGAACUCGAACCCUCGGAGGGAAAGAUUAAGCAUAGCGGACGGA UCAGCUUCUGUUCCCAGUUCUCGUGGAUCAUGCCGGGA SEQ ID NOG 14 AUGCAAAGGUCCCCAUUGGAGAAGGCCUCAGUGGUGUCGAAG CUGUUCUUCUCGUGGACCAGGCCUAUCCUCCGGAAGGGAUACAGAC AGCGGCUGGAACUGUCCGAUAUCUACCAGAUCCCCAGCGUGGACAG CGCCGAUAAUCUCAGCGAAAAGCUGGAACGGGAAUGGGACCGCGAA CUCGCUUCGAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCUCUGCGGAGAU GUUUCUUUUGGCGGUUCAUGUUUUACGGAAUCUUUCUGUACUUGGG AGAGGUCACGAAGGCUGUGCAGCCUCUGCUGCUGGGACGGAUUAUC GCGUCGUAUGACCCCGACAAUAAGGAAGAACGCAGCAUCGCAAUCUA CCUGGGCAUCGGAUUGUGCCUGCUGUUCAUCGUGAGAACUCUCCUG CUGCAUCCAGCCAUCUUCGGACUCCACCACAUUGGAAUGCAGAUGA GAAUCGCAAUGUUCUCCCUGAUCUACAAGAAAACGCUCAAGCUCAGC AGCCGCGUGCUCGAUAAGAUCAGCAUCGGUCAAUUGGUGUCCCUGC UGUCGAAUAACCUCAACAAGUUCGACGAAGGGUUGGCCCUCGCUCA CUUCGUGUGGAUCGCACCUCUGCAAGUGGCCCUGCUGAUGGGACUG AUUUGGGAGCUGCUGCAGGCUUCCGCUUUCUGCGGCCUGGGAUUU CUUAUCGUGCUUGCUCUGUUCCAGGCGGGACUGGGACGCAUGAUGA UGAAGUACCGGGACCAACGGGCUGGAAAGAUCAGCGAACGGCUGGU GAUCACUUCCGAAAUGAUUGAGAAUAUCCAGUCAGUCAAGGCGUACU GCUGGGAAGAGGCUAUGGAAAAGAUGAUUGAAAAUCUGAGACAAACC GAGCUGAAGCUGACUCGGAAAGCGGCCUACGUCAGAUACUUCAAUA GCUCAGCUUUCUUUUUCUCGGGGUUUUUCGUCGUGUUCCUGUCGG UGCUUCCCUAUGCCCUGAUUAAGGGCAUCAUUCUG CGCAAGAUCUUCACUACGAUCUCAUUCUGCAUCGUGCUGCGCAUGG CUGUGACCAGACAAUUCCCGUGGGCCGUGCAAACCUGGUACGAUUC ACUGGGAGCCAUCAACAAGAUCCAAGACUUUCUCCAAAAACAGGAGU AUAAGACCCUGGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUGGUGAUGGA GAACGUGACUGCGUUUUGGGAAGAAGGGUUCGGCGAACUGUUUGAA AAGGCCAAGCAGAACAAUAACAACAGAAAGACUUCAAACGGAGAUGA CUCGCUGUUCUUUUCGAACUUCAGCCUGCUGGGUACCCCAGUGUUG AAAGAUAUCAACUUCAAGAUUGAGAGAGGACAGCUGCUGGCUGUGG CGGGAUCCACCGGAGCAGGAAAAACUUCACUCCUGAUGGUGAUCAU GGGAGAACUCGAACCGUCAGAGGGGAAGAUUAAACACUCGGGAAGA AUCUCAUUUUGCUCCCAAUUUUCAUGGAUUAUGCCGGGA SEQ ID NOG 15 AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAA CUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGC AGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUC GGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAA CUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUG CUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGG GAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCG CCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUAC CUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGU UGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCG AAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGU CGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCU UAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUU UCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAU UUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCU GAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAU GAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUC AUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUG CUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUG AGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUC GUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUU UUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUC CGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGG CAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUC GCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGU ACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAG AAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGA AAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAU UCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGA AGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGC GGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUG GGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUA UCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGA SEQ ID N0G16 AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGA CUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCA UCCCACUCUCCAUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGU GUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGG UAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGG UAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGA CCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGA GAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUA UCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGC AUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGC GAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACA CUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGC AGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAA CUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGU CCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCU GGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUG GGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUG GGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGG AUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAA GACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAA GCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCC GCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUA UUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUU CUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCA AGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGU GACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUU GGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAA GACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAU GUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAG CAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCC CUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGG ACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGG AAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGG GAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCU CAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAG AACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGU CAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAG AAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAG GGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGC AGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUG ACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAA UAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGG CGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGG CACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAAC UCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAA CUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAU GCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGA CAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUU AACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAU GAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUU AGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGA UUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCA AUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACA UUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCC CAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGC AAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUG AAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAAC GUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUU UUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAG CGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGA CAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUA UCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGU GGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUC GUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCU UCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAG GCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGG AUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCU GAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUAC AUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGC GGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUC UGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAG GGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAA CACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUG UAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUU UUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCAC GGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUG AACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUG UGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGA CAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGA AUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAG AAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACC UGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUC UCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGG ACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUC UGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAG CAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAA AAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUA UGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUU GGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUG UCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCU CAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUC UUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCA UCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCU CUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUU GUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCU GCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAU AGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAA ACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAG ACACGCGUCUUUAA (SEQ ID NO:16). SEQ ID NOG 17 AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAA CUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGC AGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUC GGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAA CUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUG CUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGG GAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCG CCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUAC CUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGU UGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCG AAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGU CGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCU UAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUU UCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAU UUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCU GAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAU GAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUC AUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUG CUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUG AGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUC GUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUU UUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCA CCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCA AUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUC AACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGA GUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCU UUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGA AUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUC UCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUU UCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGG UGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAG CCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUA GCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUU UUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGG CGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAA CAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGA GCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGU AUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAA GAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGA GAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAG AUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCU CAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGG GUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUC UUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGG UAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAA UUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAU UCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAA UUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGU GCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUG AUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGC UCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGC AAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAA UUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCG GACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGU UUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACAC AUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUC AUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUG UGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAA UUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUA CAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACAC UCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACG CUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGU ACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGU AUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCU GCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUU GGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCG CGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUU CUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGG UCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGA CGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCA CAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUA CCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUU CUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGC GAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGA GCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCU GAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACG GAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUU GAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACA UCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAA AUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCA UUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAG GAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGA GGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUG CAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUA UCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGG UCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGA GUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGA UGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUG GCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAAC CUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGAC ACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAU CGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAG AGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAG AGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAAC UUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUC GCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCU UUAA (SEQ ID NO:17) SEQ ID NOG 18 AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGA CUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCA UCCCACUCUCC (SEQ ID NO:18) SEQ ID NOG 1 AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCC UGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAU CCCCCUCUCG (SEQ ID NO:19) SEQ ID NOG CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGC CCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAU UAAGUUGCAUCAAGCU
Equivalentes
[0270] A especificação é melhor compreendida à luz dos ensinamentos das referências citadas na especificação. As modalidades na especificação fornecem uma ilustração das modalidades da invenção e não devem ser interpretadas como limitadoras do escopo da invenção. O versado na técnica reconhecerá prontamente que muitas outras modalidades são englobadas pela invenção. Todas as publicações e patentes citadas nesta divulgação são incorporadas por referência na sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com esta especificação, a especificação substituirá qualquer material desse tipo. A citação de qualquer referência aqui não constitui uma admissão de que tais referências são de técnica anterior à presente invenção.
[0271] Salvo indicação contrária, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação e assim por diante utilizados na especificação, incluindo as reivindicações, devem ser entendidos como aproximados e podem variar dependendo das propriedades desejadas cuja obtenção se procura por meio da presente invenção. Pelo menos, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado levando em consideração o número de algarismos significativos relatados e aplicando as técnicas de arredondamento comuns. A recitação de uma série de números com quantidades distintas de algarismos significativos na especificação não deve ser interpretada como implicando que os números com menos algarismos significativos apresentados têm a mesma precisão do que os números apresentados com mais algarismos significativos.
[0272] O uso da palavra "um" ou "uma", quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especificação, pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais do que um". O uso do termo "ou" nas reivindicações deve significar "e/ou", a não ser que exista uma indicação explícita para se referir apenas a alternativas ou às alternativas que são exclusivas entre si, embora a divulgação corrobore uma definição que se refere apenas às alternativas e a "e/ou".
[0273] A menos que indicado de outra forma, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento da série. Todos aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descrita neste documento. Pretende-se abranger tais equivalentes pelas seguintes reivindicações.
[0274] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos.
[0275] As publicações discutidas neste documento são providas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Adicionalmente, as datas de publicação providas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar serem confirmadas de forma independente. Outras modalidades da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica considerando a especificação e prática da invenção divulgada neste documento. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados como exemplos apenas, com um verdadeiro escopo do espírito da invenção sendo indicado pelas seguintes reivindicações.

Claims (11)

1. Molécula de mRNA transcrita in vivo caracterizada por compreender uma sequência de codificação de SEQ ID NO:3, e em que o mRNA codifica uma proteína de condutância transmembrana de fibrose cística humana (CFTR) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para uso no tratamento de fibrose cística.
2. Molécula de mRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a molécula de mRNA compreender uma região não traduzida 5'-UTR, a 3'-UTR, uma sequência codificadora de peptídeo sinal, uma estrutura cap e/ou estrutura de cauda.
3. Molécula de mRNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a 5'-UTR compreender SEQ ID NO:4 e/ou a 3'-UTR compreender SEQ ID NO:5.
4. Molécula de mRNA de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada por a estrutura de cauda ser uma cauda de poli-A de pelo menos 70, 100, 120, 150, 200 ou 250 nucleotídeos em comprimento.
5. Molécula de mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-4, caracterizada por a estrutura cap ser uma estrutura cap1.
6. Molécula de mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a molécula de mRNA compreender um ou mais nucleotídeos não padronizados, em que opcionalmente o um ou mais nucleotídeos não padronizados são selecionados a partir de 5-metil-citidina, pseudouridina e 2-tio-uridina.
7. Uso da molécula de mRNA conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser na preparação de uma composição formulada para inalação, administração intranasal, aerossolização ou nebulização.
8. Composição caracterizada por compreender um carreador e uma molécula de mRNA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o carreador compreende um cátion orgânico, tal como um lipídeo catiônico ou um polímero orgânico catiônico.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o polímero orgânico catiônico ser selecionado do grupo consistindo de polietilenoimina (PEI), protamina, protamina PEGuilada, poli-L-lisina PLL, PLL PEGuilada.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por PEI ser PEI ramificada com um peso molecular variando de 10 kDa a 40 kDa.
11. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o carreador ser um lipossoma.
BR112015022868-2A 2013-03-14 2014-03-14 Composições de mrna de cftr e usos e métodos relacionados BR112015022868B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361783663P 2013-03-14 2013-03-14
US61/783,663 2013-03-14
PCT/US2014/028849 WO2014153052A2 (en) 2013-03-14 2014-03-14 Cftr mrna compositions and related methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112015022868A2 BR112015022868A2 (pt) 2017-11-07
BR112015022868B1 true BR112015022868B1 (pt) 2023-05-16

Family

ID=50513499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112015022868-2A BR112015022868B1 (pt) 2013-03-14 2014-03-14 Composições de mrna de cftr e usos e métodos relacionados

Country Status (28)

Country Link
US (5) US9181321B2 (pt)
EP (2) EP2968586B1 (pt)
JP (5) JP6316930B2 (pt)
KR (3) KR102248744B1 (pt)
CN (2) CN105142676B (pt)
AU (3) AU2014236305B2 (pt)
BR (1) BR112015022868B1 (pt)
CA (1) CA2904151C (pt)
CL (1) CL2015002675A1 (pt)
CY (1) CY1120790T1 (pt)
DK (1) DK2968586T3 (pt)
EA (2) EA037922B1 (pt)
ES (1) ES2689523T3 (pt)
HK (2) HK1218068A1 (pt)
HR (1) HRP20181580T1 (pt)
HU (1) HUE042640T2 (pt)
IL (5) IL305374A (pt)
LT (1) LT2968586T (pt)
MX (1) MX365409B (pt)
NZ (1) NZ751462A (pt)
PE (1) PE20151773A1 (pt)
PL (1) PL2968586T3 (pt)
PT (1) PT2968586T (pt)
RS (1) RS57739B1 (pt)
SG (2) SG10201710253QA (pt)
SI (1) SI2968586T1 (pt)
UA (1) UA117008C2 (pt)
WO (1) WO2014153052A2 (pt)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ700688A (en) 2009-12-01 2016-02-26 Shire Human Genetic Therapies Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
US8853377B2 (en) * 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
JP6184945B2 (ja) 2011-06-08 2017-08-23 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子組成物および方法
AU2012267578B2 (en) 2011-06-08 2017-04-20 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
EP3536787A1 (en) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
EP2970955B1 (en) 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
EA037922B1 (ru) 2013-03-14 2021-06-07 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. мРНК CFTR И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОВИСЦИДОЗА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО
ES2954366T3 (es) 2013-10-22 2023-11-21 Translate Bio Inc Terapia de ácido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa
CA2928186A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
EP3060257B1 (en) 2013-10-22 2021-02-24 Translate Bio, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
EP4036241A1 (en) 2013-10-22 2022-08-03 Translate Bio, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
ES2750661T3 (es) 2014-04-25 2020-03-26 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
WO2016149508A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for pompe disease
AU2016286364B2 (en) 2015-06-30 2022-07-28 Ethris Gmbh ATP-binding cassette family coding polyribonucleotides and formulations thereof
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
HUE049237T2 (hu) 2016-04-08 2020-09-28 Krystal Biotech Inc Készítmények a bõr sérülései, rendellenességei és betegségei kezelési eljárásaiban történõ alkalmazásra
ES2844180T3 (es) 2016-04-08 2021-07-21 Translate Bio Inc Acido nucleico codificante multimérico y usos del mismo
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
MA45053A (fr) * 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour un régulateur de conductance transmembranaire de fibrose kystique pour le traitement de la fibrose kystique
MX2018013509A (es) 2016-05-18 2019-03-28 Modernatx Inc Polinucleotidos que codifican interleucina-12 (il12) y sus usos de los mismos.
CN110114058B (zh) * 2016-11-10 2023-05-26 川斯勒佰尔公司 用于递送mrna的改进的基于ice的脂质纳米颗粒制剂
SG10202100951SA (en) 2016-11-21 2021-03-30 Nanostring Technologies Inc Chemical compositions and methods of using same
EP4008344B1 (en) * 2017-01-27 2023-12-06 The Methodist Hospital Core/shell structure platform for immunotherapy
MA47605A (fr) 2017-02-27 2020-01-01 Translate Bio Inc Procédés de purification d'arn messager
EP4008783A1 (en) 2017-02-27 2022-06-08 Translate Bio MA, Inc. Methods for purification of messenger rna
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
KR20190124750A (ko) 2017-02-28 2019-11-05 사노피 치료적 rna
US20200038487A1 (en) 2017-03-31 2020-02-06 Accanis Biotech F&E Gmbh & Co Kg Prevention and treatment of non-melanoma skin cancer (nmsc)
EP3398963B1 (en) * 2017-05-04 2021-09-29 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Chemically modified mrna for use in the treatment of a disease associated with the cftr gene
IL270631B2 (en) * 2017-05-16 2024-03-01 Translate Bio Inc Treatment of cystic fibrosis through the administration of mRNA with an optimal codon encoding ctfr
US20200131498A1 (en) 2017-06-14 2020-04-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
EP3437650A1 (en) 2017-07-31 2019-02-06 Accanis Biotech F&E GmbH & Co KG Treatment of local skin hypotrophy conditions
KR20200051708A (ko) * 2017-09-08 2020-05-13 제너레이션 바이오 컴퍼니 비-바이러스성 캡시드-비함유 dna 벡터의 지질 나노입자 제형
EP3775236A1 (en) 2018-04-12 2021-02-17 Krystal Biotech, LLC Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
CA3099909A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
KR20210056331A (ko) * 2018-07-23 2021-05-18 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 건조 분말 제형
CN112930396B (zh) 2018-08-24 2024-05-24 川斯勒佰尔公司 用于纯化信使rna的方法
AU2019346549A1 (en) 2018-09-24 2021-04-15 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of netherton syndrome
WO2020072914A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed rna
US11072808B2 (en) 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
US20210388338A1 (en) 2018-11-08 2021-12-16 Translate Bio, Inc. Methods and Compositions for Messenger RNA Purification
EP3876994A2 (en) * 2018-11-09 2021-09-15 Translate Bio, Inc. Peg lipidoid compounds
SG11202107969SA (en) * 2019-02-08 2021-08-30 Krystal Biotech Inc Compositions and methods for delivering cftr polypeptides
CN113396219A (zh) 2019-02-11 2021-09-14 埃泽瑞斯公司 通过切向流过滤纯化mRNA
BR112021020708A2 (pt) * 2019-04-15 2022-03-15 Spirovant Sciences Inc Composições e métodos para tratamento de fibrose cística
US20220195461A1 (en) * 2019-04-15 2022-06-23 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for transgene expression
CA3155003A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
EP4143326A1 (en) * 2020-04-27 2023-03-08 University of Iowa Research Foundation Compositions and methods for the treatment of cystic fibrosis
US20230056935A1 (en) 2020-09-16 2023-02-23 Lg Chem, Ltd. Compound, Antimicrobial Deodorant Composition Comprising Same, and Method for Producing Same
KR20230175196A (ko) * 2021-03-23 2023-12-29 리코드 테라퓨틱스, 인크. 폴리뉴클레오티드 조성물, 관련된 제제, 및 이의 사용 방법
AU2022246917A1 (en) 2021-04-02 2023-10-12 Krystal Biotech, Inc. Viral vectors for cancer therapy
JP2024520834A (ja) * 2021-06-09 2024-05-24 レコード・セラピューティクス・インコーポレイテッド ポリヌクレオチド組成物、関連する製剤及びその使用方法

Family Cites Families (443)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2647121A (en) 1951-02-02 1953-07-28 Ruth P Jacoby Diamine-bis-acetamides
US2819718A (en) 1953-07-16 1958-01-14 Isidore H Goldman Drainage tube
US2717909A (en) 1953-09-24 1955-09-13 Monsanto Chemicals Hydroxyethyl-keryl-alkylene-ammonium compounds
US2844629A (en) 1956-04-25 1958-07-22 American Home Prod Fatty acid amides and derivatives thereof
US3096560A (en) 1958-11-21 1963-07-09 William J Liebig Process for synthetic vascular implants
GB1072118A (en) 1962-12-01 1967-06-14 Sandoz Ag Amides of aminopropionic acid
JPS5141663B1 (pt) 1966-03-12 1976-11-11
JPS4822365B1 (pt) 1968-10-25 1973-07-05
NL143127B (nl) 1969-02-04 1974-09-16 Rhone Poulenc Sa Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep.
US3614954A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Electronic standby defibrillator
US3614955A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Standby defibrillator and method of operation
JPS5024216B1 (pt) 1970-12-29 1975-08-14
JPS5024216Y1 (pt) 1970-12-29 1975-07-21
JPS5012146Y2 (pt) 1971-07-27 1975-04-15
US3945052A (en) 1972-05-01 1976-03-23 Meadox Medicals, Inc. Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same
US3805301A (en) 1972-07-28 1974-04-23 Meadox Medicals Inc Tubular grafts having indicia thereon
JPS49127908A (pt) 1973-04-20 1974-12-07
JPS5624664B2 (pt) 1973-06-28 1981-06-08
US4013507A (en) 1973-09-18 1977-03-22 California Institute Of Technology Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells
JPS5123537A (ja) 1974-04-26 1976-02-25 Adeka Argus Chemical Co Ltd Kasozaisoseibutsu
GB1527592A (en) 1974-08-05 1978-10-04 Ici Ltd Wound dressing
US3995623A (en) 1974-12-23 1976-12-07 American Hospital Supply Corporation Multipurpose flow-directed catheter
JPS5813576B2 (ja) 1974-12-27 1983-03-14 アデカ ア−ガスカガク カブシキガイシヤ 安定化された合成高分子組成物
JPS5524302Y2 (pt) 1975-03-31 1980-06-10
US4281669A (en) 1975-05-09 1981-08-04 Macgregor David C Pacemaker electrode with porous system
DE2520814A1 (de) 1975-05-09 1976-11-18 Bayer Ag Lichtstabilisierung von polyurethanen
JPS5210847A (en) 1975-07-16 1977-01-27 Nippon Steel Corp Pinch roll
US4096860A (en) 1975-10-08 1978-06-27 Mclaughlin William F Dual flow encatheter
CA1069652A (en) 1976-01-09 1980-01-15 Alain F. Carpentier Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring
US4134402A (en) 1976-02-11 1979-01-16 Mahurkar Sakharam D Double lumen hemodialysis catheter
US4072146A (en) 1976-09-08 1978-02-07 Howes Randolph M Venous catheter device
US4335723A (en) 1976-11-26 1982-06-22 The Kendall Company Catheter having inflatable retention means
US4099528A (en) 1977-02-17 1978-07-11 Sorenson Research Co., Inc. Double lumen cannula
US4140126A (en) 1977-02-18 1979-02-20 Choudhury M Hasan Method for performing aneurysm repair
US4265745A (en) 1977-05-25 1981-05-05 Teijin Limited Permselective membrane
US4182833A (en) 1977-12-07 1980-01-08 Celanese Polymer Specialties Company Cationic epoxide-amine reaction products
US4180068A (en) 1978-04-13 1979-12-25 Motion Control, Incorporated Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure
EP0005035B1 (en) 1978-04-19 1981-09-23 Imperial Chemical Industries Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
US4284459A (en) 1978-07-03 1981-08-18 The Kendall Company Method for making a molded catheter
US4227533A (en) 1978-11-03 1980-10-14 Bristol-Myers Company Flushable urinary catheter
US4375817A (en) 1979-07-19 1983-03-08 Medtronic, Inc. Implantable cardioverter
DE3010841A1 (de) 1980-03-21 1981-10-08 Ulrich Dr.med. 6936 Haag Uthmann Katheder
US4308085A (en) 1980-07-28 1981-12-29 Jenoptik Jena Gmbh Process for the preparation of high molecular thermoplastic epoxide-amine-polyadducts
US4339369A (en) 1981-04-23 1982-07-13 Celanese Corporation Cationic epoxide-amine reaction products
US4406656A (en) 1981-06-01 1983-09-27 Brack Gillium Hattler Venous catheter having collapsible multi-lumens
US4475972A (en) 1981-10-01 1984-10-09 Ontario Research Foundation Implantable material
US4401472A (en) 1982-02-26 1983-08-30 Martin Marietta Corporation Hydraulic cement mixes and processes for improving hydraulic cement mixes
US4568329A (en) 1982-03-08 1986-02-04 Mahurkar Sakharam D Double lumen catheter
US4546499A (en) 1982-12-13 1985-10-15 Possis Medical, Inc. Method of supplying blood to blood receiving vessels
US4530113A (en) 1983-05-20 1985-07-23 Intervascular, Inc. Vascular grafts with cross-weave patterns
US4647416A (en) 1983-08-03 1987-03-03 Shiley Incorporated Method of preparing a vascular graft prosthesis
US4550447A (en) 1983-08-03 1985-11-05 Shiley Incorporated Vascular graft prosthesis
US5104399A (en) 1986-12-10 1992-04-14 Endovascular Technologies, Inc. Artificial graft and implantation method
US4571241A (en) 1983-12-16 1986-02-18 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4710169A (en) 1983-12-16 1987-12-01 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4737518A (en) 1984-04-03 1988-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lipid derivatives, their production and use
US4562596A (en) 1984-04-25 1986-01-07 Elliot Kornberg Aortic graft, device and method for performing an intraluminal abdominal aortic aneurysm repair
US4782836A (en) 1984-05-24 1988-11-08 Intermedics, Inc. Rate adaptive cardiac pacemaker responsive to patient activity and temperature
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4662382A (en) 1985-01-16 1987-05-05 Intermedics, Inc. Pacemaker lead with enhanced sensitivity
US4762915A (en) 1985-01-18 1988-08-09 Liposome Technology, Inc. Protein-liposome conjugates
US4860751A (en) 1985-02-04 1989-08-29 Cordis Corporation Activity sensor for pacemaker control
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
CA1320724C (en) 1985-07-19 1993-07-27 Koichi Kanehira Terpene amino alcohols and medicinal uses thereof
US4701162A (en) 1985-09-24 1987-10-20 The Kendall Company Foley catheter assembly
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
DE3616824A1 (de) 1986-05-17 1987-11-19 Schering Ag Verwendung von haertbaren kunstharzmischungen fuer oberflaechenbeschichtungen und druckfarben und verfahren zu ihrer herstellung
EP0255899B1 (de) 1986-07-31 1992-07-15 Werner Prof. Dr.-Ing. Irnich Frequenzadaptierender Herzschrittmacher
US4960409A (en) 1986-09-11 1990-10-02 Catalano Marc L Method of using bilumen peripheral venous catheter with adapter
JPH0829776B2 (ja) 1986-10-29 1996-03-27 東燃化学株式会社 合成樹脂製容器及びその製造用金型
US4720517A (en) 1986-11-24 1988-01-19 Ciba-Geigy Corporation Compositions stabilized with N-hydroxyiminodiacetic and dipropionic acids and esters thereof
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPS63154788U (pt) 1987-03-31 1988-10-11
DE3728917A1 (de) 1987-08-29 1989-03-09 Roth Hermann J Neue lipide mit unsymmetrisch substituierter disulfidbruecke
US4946683A (en) 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
US5047540A (en) 1987-12-17 1991-09-10 Shionogi & Co., Ltd. Lipid derivatives
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
US4892540A (en) 1988-04-21 1990-01-09 Sorin Biomedica S.P.A. Two-leaflet prosthetic heart valve
US5176661A (en) 1988-09-06 1993-01-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Composite vascular catheter
US5024671A (en) 1988-09-19 1991-06-18 Baxter International Inc. Microporous vascular graft
US5200395A (en) 1988-10-18 1993-04-06 Ajinomoto Company, Inc. Pharmaceutical composition of BUF-5 for treating anemia
CA2001401A1 (en) 1988-10-25 1990-04-25 Claude Piantadosi Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions
DE69032284T2 (de) 1989-03-21 1998-10-08 Vical, Inc., San Diego, Calif. Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5101824A (en) 1990-04-16 1992-04-07 Siemens-Pacesetter, Inc. Rate-responsive pacemaker with circuitry for processing multiple sensor inputs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1992001425A1 (en) 1990-07-26 1992-02-06 Rodney James Lane Self expanding vascular endoprosthesis for aneurysms
US5693338A (en) 1994-09-29 1997-12-02 Emisphere Technologies, Inc. Diketopiperazine-based delivery systems
JPH0765267B2 (ja) 1990-08-22 1995-07-12 花王株式会社 柔軟仕上剤
ES2085435T3 (es) 1990-10-09 1996-06-01 Cook Inc Dispositivo dilatador percutaneo.
EP0491082B1 (de) 1990-12-19 1995-04-12 Peter Dr. Ing. Osypka Herzschrittmacherleitung mit einem inneren Kanal und mit einem Elektrodenkopf
US5116360A (en) 1990-12-27 1992-05-26 Corvita Corporation Mesh composite graft
JP2547524Y2 (ja) 1991-01-22 1997-09-10 東洋ラジエーター株式会社 オイルクーラ
US5405363A (en) 1991-03-15 1995-04-11 Angelon Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5330768A (en) 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US5545449A (en) 1991-10-02 1996-08-13 Weyerhaeuser Company Polyether-reinforced fiber-based materials
US6013638A (en) * 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US5151105A (en) 1991-10-07 1992-09-29 Kwan Gett Clifford Collapsible vessel sleeve implant
US5284491A (en) 1992-02-27 1994-02-08 Medtronic, Inc. Cardiac pacemaker with hysteresis behavior
US5352461A (en) 1992-03-11 1994-10-04 Pharmaceutical Discovery Corporation Self assembling diketopiperazine drug delivery system
SE9200951D0 (sv) 1992-03-27 1992-03-27 Kabi Pharmacia Ab Pharmaceutical composition containing a defined lipid system
CA2132342A1 (en) 1992-04-06 1993-10-14 Kenneth F. Buechler Novel opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
CA2141685A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Koji Naito Antiallergic composition
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5461223A (en) 1992-10-09 1995-10-24 Eastman Kodak Company Bar code detecting circuitry
US5300022A (en) 1992-11-12 1994-04-05 Martin Klapper Urinary catheter and bladder irrigation system
US5496362A (en) 1992-11-24 1996-03-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable conformal coil patch electrode with multiple conductive elements for cardioversion and defibrillation
US5552155A (en) 1992-12-04 1996-09-03 The Liposome Company, Inc. Fusogenic lipsomes and methods for making and using same
US5716395A (en) 1992-12-11 1998-02-10 W.L. Gore & Associates, Inc. Prosthetic vascular graft
CA2156288C (en) 1993-02-19 2005-10-18 Junichi Yano Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5697953A (en) 1993-03-13 1997-12-16 Angeion Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
JPH0753535Y2 (ja) 1993-03-16 1995-12-13 株式会社ハンズ リュックサック
US5624976A (en) 1994-03-25 1997-04-29 Dentsply Gmbh Dental filling composition and method
US5314430A (en) 1993-06-24 1994-05-24 Medtronic, Inc. Atrial defibrillator employing transvenous and subcutaneous electrodes and method of use
DE4325848A1 (de) 1993-07-31 1995-02-02 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin
EP0875280B1 (en) 1993-10-06 2001-08-22 The Kansai Electric Power Co., Inc. Method for removing carbon dioxide from combustion exhaust gas
US5609624A (en) 1993-10-08 1997-03-11 Impra, Inc. Reinforced vascular graft and method of making same
SE9303481L (sv) 1993-10-22 1995-04-23 Berol Nobel Ab Hygienkomposition
WO1995013033A1 (en) 1993-11-08 1995-05-18 Lazarus Harrison M Intraluminal vascular graft and method
CA2176714A1 (en) 1993-11-24 1995-06-01 Timothy D. Heath Amphiphilic derivatives of piperazine
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5464924A (en) 1994-01-07 1995-11-07 The Dow Chemical Company Flexible poly(amino ethers) for barrier packaging
US5844107A (en) 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
DK0758883T3 (da) 1994-04-12 2003-06-02 Liposome Co Inc Fusogene liposomer og fremgangsmåder til fremstilling af og anvendelse af disse
US5833979A (en) 1994-07-20 1998-11-10 Cytotherapeutics, Inc. Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
JP2001523215A (ja) 1995-04-17 2001-11-20 イマークス ファーマシューティカル コーポレーション ハイブリッド磁気共鳴造影剤
US5772694A (en) 1995-05-16 1998-06-30 Medical Carbon Research Institute L.L.C. Prosthetic heart valve with improved blood flow
US5783383A (en) 1995-05-23 1998-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of detecting cytomegalovirus (CMV)
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5609629A (en) 1995-06-07 1997-03-11 Med Institute, Inc. Coated implantable medical device
US5607385A (en) 1995-08-17 1997-03-04 Medtronic, Inc. Device and algorithm for a combined cardiomyostimulator and a cardiac pacer-carioverter-defibrillator
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
FR2740978B1 (fr) 1995-11-10 1998-01-02 Ela Medical Sa Dispositif medical actif du type defibrillateur/cardioverteur implantable
US5874105A (en) 1996-01-31 1999-02-23 Collaborative Laboratories, Inc. Lipid vesicles formed with alkylammonium fatty acid salts
ATE273320T1 (de) 1996-04-11 2004-08-15 Univ British Columbia Fusogene liposomen
US5935936A (en) 1996-06-03 1999-08-10 Genzyme Corporation Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5913848A (en) 1996-06-06 1999-06-22 Luther Medical Products, Inc. Hard tip over-the-needle catheter and method of manufacturing the same
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5736573A (en) 1996-07-31 1998-04-07 Galat; Alexander Lipid and water soluble derivatives of drugs
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
AU729077B2 (en) 1996-08-26 2001-01-25 Transgene S.A. Cationic lipid-nucleic acid complexes
EP0938298B1 (en) 1996-09-13 2002-12-04 Lipoxen Technologies Limited Liposome-based composition
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
WO1998019709A2 (en) 1996-11-04 1998-05-14 Qiagen Gmbh Cationic reagents for transfection
US6887665B2 (en) 1996-11-14 2005-05-03 Affymetrix, Inc. Methods of array synthesis
US5985930A (en) 1996-11-21 1999-11-16 Pasinetti; Giulio M. Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide
US6204297B1 (en) 1996-11-26 2001-03-20 Rhodia Inc. Nonionic gemini surfactants
JPH10197978A (ja) 1997-01-09 1998-07-31 Mitsubishi Paper Mills Ltd ハロゲン化銀写真感光材料
EP0853123A1 (de) 1997-01-10 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
FR2760193B1 (fr) 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5945326A (en) 1997-03-20 1999-08-31 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease
US20030104044A1 (en) 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
EP1027033B1 (en) 1997-05-14 2009-07-22 The University Of British Columbia High efficiency encapsulation of nucleic acids in lipid vesicles
JPH115786A (ja) 1997-06-13 1999-01-12 Pola Chem Ind Inc 新規アミノヒドロキシプロピルピペラジン誘導体
US6067471A (en) 1998-08-07 2000-05-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Atrial and ventricular implantable cardioverter-defibrillator and lead system
JPH1180142A (ja) 1997-09-05 1999-03-26 Pola Chem Ind Inc ジフェニルアルキル化合物の製造法
EP1021549A2 (en) * 1997-09-19 2000-07-26 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
US6165763A (en) 1997-10-30 2000-12-26 Smithkline Beecham Corporation Ornithine carbamoyltransferase
US6096075A (en) 1998-01-22 2000-08-01 Medical Carbon Research Institute, Llc Prosthetic heart valve
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6271209B1 (en) 1998-04-03 2001-08-07 Valentis, Inc. Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors
US6176877B1 (en) 1998-04-20 2001-01-23 St. Jude Medical, Inc. Two piece prosthetic heart valve
DE19822602A1 (de) 1998-05-20 1999-11-25 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Polyaminosäureestern durch Veresterung von sauren Polyaminosäuren oder Umesterung von Polyaminosäureestern
NO313244B1 (no) 1998-07-08 2002-09-02 Crew Dev Corp Fremgangsmåte for isolering og produksjon av magnesitt eller magnesiumklorid
US6055454A (en) 1998-07-27 2000-04-25 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac pacemaker with automatic response optimization of a physiologic sensor based on a second sensor
US6312926B1 (en) 1998-08-14 2001-11-06 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey mRNA capping enzymes and uses thereof
KR20010072816A (ko) 1998-08-20 2001-07-31 쿡 인코포레이티드 피복된 삽입용 의료 장치
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6468793B1 (en) * 1998-10-23 2002-10-22 Florida State University Research Foundation CFTR genes and proteins for cystic fibrosis gene therapy
AU1830200A (en) 1998-11-25 2000-06-13 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
US6248725B1 (en) 1999-02-23 2001-06-19 Amgen, Inc. Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
AU783647B2 (en) 1999-04-20 2005-11-17 University Of British Columbia, The Cationic peg-lipids and methods of use
US6169923B1 (en) 1999-04-23 2001-01-02 Pacesetter, Inc. Implantable cardioverter-defibrillator with automatic arrhythmia detection criteria adjustment
IL146055A0 (en) 1999-04-23 2002-07-25 Alza Corp Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US7591333B1 (en) * 1999-05-17 2009-09-22 Edscha Ag Front hood assembly
DE60035871T2 (de) 1999-05-19 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
WO2001005375A1 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Purdue Research Foundation Vinyl ether lipids with cleavable hydrophilic headgroups
CA2378944A1 (en) 1999-07-23 2001-02-01 Genentech, Inc. Method for rnase- and organic solvent-free plasmid dna purification using tangential flow filtration
US6358278B1 (en) 1999-09-24 2002-03-19 St. Jude Medical, Inc. Heart valve prosthesis with rotatable cuff
US6371983B1 (en) 1999-10-04 2002-04-16 Ernest Lane Bioprosthetic heart valve
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
EP1242609A2 (en) 1999-12-30 2002-09-25 Novartis AG Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
CA2400634A1 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Chester Li Genetic modification of the lung as a portal for gene delivery
US6370434B1 (en) 2000-02-28 2002-04-09 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac lead and method for lead implantation
US6565960B2 (en) 2000-06-01 2003-05-20 Shriners Hospital Of Children Polymer composite compositions
EP1297169B1 (en) 2000-06-26 2012-08-08 Ethris Gmbh Method for transfecting cells using a magnetic field
IL138474A0 (en) 2000-09-14 2001-10-31 Epox Ltd Highly branched water-soluble polyamine oligomers, process for their preparation and applications thereof
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
USRE43612E1 (en) 2000-10-10 2012-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
JP2004511572A (ja) 2000-10-25 2004-04-15 ザ　ユニバーシティ　オブ　ブリティッシュ　コロンビア 標的化送達のための脂質製剤
GB0028361D0 (en) 2000-11-21 2001-01-03 Glaxo Group Ltd Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components
US20020094528A1 (en) 2000-11-29 2002-07-18 Salafsky Joshua S. Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interations
JP2002167368A (ja) 2000-12-01 2002-06-11 Nitto Denko Corp アルキル置換デンドリマーおよびその製造法
US20050004058A1 (en) 2000-12-07 2005-01-06 Patrick Benoit Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US20020192721A1 (en) 2001-03-28 2002-12-19 Engeneos, Inc. Modular molecular clasps and uses thereof
TW588032B (en) 2001-04-23 2004-05-21 Shinetsu Chemical Co New tertiary amine compound having ester structure and method for producing the same
US6585410B1 (en) 2001-05-03 2003-07-01 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Radiant temperature nulling radiometer
DE50214200D1 (de) 2001-06-05 2010-03-25 Curevac Gmbh Stabilisierte Tumorantigen-mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt
EP2428568B1 (en) 2001-09-28 2018-04-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
EP1446665A2 (de) 2001-11-09 2004-08-18 Bayer HealthCare AG Isotopencodierte affinitätsmarker 3
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
DE10214983A1 (de) 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
US20030215395A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US7601367B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
JP2005528449A (ja) * 2002-05-31 2005-09-22 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 嚢胞性線維症の治療に有用なｃｆｔｒ修飾遺伝子および発現ポリペプチド、ならびにそれを検出および／または同定する方法および製品
US7901708B2 (en) 2002-06-28 2011-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Liposomal apparatus and manufacturing methods
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US20040028804A1 (en) 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
EP1539936A2 (en) 2002-08-22 2005-06-15 Celltran Limited Cell culture surface
US7563857B2 (en) 2002-11-04 2009-07-21 Momentive Performance Materials Gmbh Linear polyamino and/or polyammonium polysiloxane copolymers I
EP1572669A2 (en) 2002-11-22 2005-09-14 Novo Nordisk A/S 2,5-diketopiperazines for the treatment of obesity
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
WO2004066138A1 (ja) 2003-01-20 2004-08-05 Asahi Kasei Emd Corporation ポインティングデバイス
NZ542665A (en) 2003-03-05 2008-05-30 Senesco Technologies Inc Use of antisense oligonucleotides or siRNA to suppress expression of eIF-5A1
US20040224912A1 (en) 2003-05-07 2004-11-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression
US7619017B2 (en) 2003-05-19 2009-11-17 Wacker Chemical Corporation Polymer emulsions resistant to biodeterioration
WO2005007810A2 (en) 2003-06-16 2005-01-27 Grinstaff Mark W Functional synthetic molecules and macromolecules for gene delivery
US7803397B2 (en) 2003-09-15 2010-09-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
CA2539670A1 (en) 2003-09-15 2005-03-31 Massachusetts Institute Of Technology Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and screening thereof
US20050069590A1 (en) 2003-09-30 2005-03-31 Buehler Gail K. Stable suspensions for medicinal dosages
AU2004279991B2 (en) 2003-10-10 2010-11-25 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid constructs
WO2005037226A2 (en) 2003-10-17 2005-04-28 Georgia Tech Research Corporation Genetically engineered enteroendocrine cells for treating glucose-related metabolic disorders
EP1683784A4 (en) 2003-11-10 2007-08-22 Nippon Kayaku Kk DIIMONIUM SALT CONNECTION AND ITS USE
US7022214B2 (en) 2004-01-21 2006-04-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Carrier ampholytes of high pH range
US7556684B2 (en) 2004-02-26 2009-07-07 Construction Research & Technology Gmbh Amine containing strength improvement admixture
US20060228404A1 (en) 2004-03-04 2006-10-12 Anderson Daniel G Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues
US20090069256A1 (en) 2004-06-04 2009-03-12 Smith Larry R Enhancing protein expression
AU2005251403B2 (en) 2004-06-07 2011-09-01 Arbutus Biopharma Corporation Cationic lipids and methods of use
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB0418172D0 (en) 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102004043342A1 (de) 2004-09-08 2006-03-09 Bayer Materialscience Ag Blockierte Polyurethan-Prepolymere als Klebstoffe
CA2586708A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
GB0502482D0 (en) 2005-02-07 2005-03-16 Glaxo Group Ltd Novel compounds
CA2597724A1 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
EP1869106B1 (en) 2005-03-28 2014-06-25 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Janus dendrimers and dendrons
EP1912679A4 (en) 2005-06-15 2009-07-29 Massachusetts Inst Technology AMINOUS LIPIDS AND ITS USES
ES2735531T3 (es) 2005-08-23 2019-12-19 Univ Pennsylvania ARN que contiene nucleósidos modificados y métodos de uso del mismo
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
WO2007051303A1 (en) 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
US7238791B1 (en) 2005-12-16 2007-07-03 Roche Diagnostics Operations, Inc. 6-monoacetylmorphine derivatives useful in immunoassay
WO2007073489A2 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Trustees Of Boston University Molecules for gene delivery and gene therapy, and methods of use thereof
CN100569877C (zh) 2005-12-30 2009-12-16 财团法人工业技术研究院 含多uv交联反应基的分枝状结构化合物及其应用
CA2649325C (en) 2006-04-14 2019-01-08 Epicentre Technologies Corporation Kits and methods for generating 5' capped rna
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
WO2007137237A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 The Scripps Research Institute Treatment of protein misfolding
US20070275923A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Nastech Pharmaceutical Company Inc. CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY
EP2032652A4 (en) 2006-06-05 2011-08-17 Massachusetts Inst Technology NETWORKED DEVELOPABLE POLYMERS AND ITS USE
US20090186805A1 (en) 2006-07-06 2009-07-23 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
ES2293834B1 (es) 2006-07-20 2009-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas.
CA2658768C (en) 2006-07-21 2016-05-17 Massachusetts Institute Of Technology End-modified poly(beta-amino esters) and uses thereof
MX2009003548A (es) 2006-10-03 2009-04-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulaciones que contienen lipidos.
CA2665620A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-17 Copernicus Therapeutics Inc. Codon optimized cftr
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
US8268586B2 (en) 2006-12-21 2012-09-18 Novozymes, Inc. Modified messenger RNA stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
EP2139461A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Recepticon Aps Amino derivatives to prevent nephrotoxicity and cancer
WO2008121199A2 (en) * 2007-03-28 2008-10-09 University Of Iowa Research Foundation Transgenic animal models of disease
JP5186126B2 (ja) 2007-03-29 2013-04-17 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 新規トリアジン誘導体ならびにその製法およびそのガス分離膜としての用途
EP2144609B1 (en) 2007-04-18 2014-10-29 Cornerstone Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulations containing lipoic acid derivatives
US8678686B2 (en) 2007-05-01 2014-03-25 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
US20090163705A1 (en) 2007-05-21 2009-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
WO2009036280A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Copernicus Therapeutics, Inc. Long-term in vivo transgene expression
NZ584048A (en) 2007-10-02 2012-08-31 Marina Biotech Inc Lipopeptides for delivery of nucleic acids
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
EP2221371B1 (en) 2007-11-22 2013-11-13 Japan Science and Technology Agency Translation regulation system in cell or artificial cell model by using low-molecular-weight rna
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
WO2009120247A2 (en) 2007-12-27 2009-10-01 The Ohio State University Research Foundation Lipid nanoparticle compositions and methods of making and using the same
AU2008342535B2 (en) 2007-12-27 2015-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
WO2009088891A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
CN102119217B (zh) 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
US20090263407A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic Lipids and Uses Thereof
US8222221B2 (en) 2008-06-04 2012-07-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Modulation of gene expression through endogenous small RNA targeting of gene promoters
JP5024216B2 (ja) 2008-07-23 2012-09-12 トヨタ自動車株式会社 内燃機関の点火時期制御装置及び点火時期制御方法
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
US8404198B2 (en) 2008-08-27 2013-03-26 Life Technologies Corporation Apparatus for and method of processing biological samples
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
WO2010045512A2 (en) 2008-10-16 2010-04-22 Mdrna , Inc. Processes and compositions for liposomal and efficient delivery of gene silencing therapeutics
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20120009222A1 (en) 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
JP6087504B2 (ja) 2008-11-07 2017-03-01 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミノアルコールリピドイドおよびその使用
KR102344392B1 (ko) 2008-11-10 2021-12-28 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
CN102216462A (zh) 2008-11-17 2011-10-12 安龙制药公司 用于核酸递送系统的支化阳离子脂质
US9023820B2 (en) 2009-01-26 2015-05-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
US20100222489A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Jiang Dayue D Copolymer composition, membrane article, and methods thereof
NZ594995A (en) 2009-03-12 2013-06-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF HUMAN KINESIN FAMILY MEMBER 11 (Eg5) AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) GENES
CN102334237B (zh) 2009-04-02 2015-05-13 西蒙公司 电信接线板
PT2419144T (pt) 2009-04-17 2019-09-16 Univ Oxford Innovation Ltd Composição para a administração de material genético
US9220682B2 (en) 2009-04-22 2015-12-29 Emory University Nanocarrier therapy for treating invasive tumors
NZ621981A (en) 2009-05-05 2015-09-25 Tekmira Pharmaceuticals Corp Lipid compositions
EA201791744A3 (ru) 2009-06-10 2018-07-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
US8273869B2 (en) 2009-06-15 2012-09-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
CA2767129C (en) 2009-07-01 2015-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8716464B2 (en) 2009-07-20 2014-05-06 Thomas W. Geisbert Compositions and methods for silencing Ebola virus gene expression
CN102574818B (zh) 2009-07-30 2015-02-25 萨尔瓦特实验室股份有限公司 Apaf-1抑制剂化合物
DK2459231T3 (en) * 2009-07-31 2016-09-05 Ethris Gmbh RNA with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
DE102009043342A1 (de) 2009-09-29 2011-03-31 Bayer Technology Services Gmbh Stoffe für selbstorganisierte Träger zur kontrollierten Freisetzung eines Wirkstoffs
NZ700688A (en) 2009-12-01 2016-02-26 Shire Human Genetic Therapies Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP3623474A1 (en) 2009-12-07 2020-03-18 The Trustees of The University of Pennsylvania Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
ES2749426T3 (es) 2009-12-18 2020-03-20 Univ British Columbia Métodos y composiciones para administración de ácidos nucleicos
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
AU2010334911A1 (en) 2009-12-23 2012-07-12 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
DK2575764T3 (en) 2010-06-03 2017-08-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc BIODEGRADABLE LIPIDS FOR THE ACTIVATION OF ACTIVE AGENTS
CN101863544B (zh) 2010-06-29 2011-09-28 湖南科技大学 一种氰尿酸基重金属螯合絮凝剂及其制备方法
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
WO2012027675A2 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
HUE058896T2 (hu) 2010-10-01 2022-09-28 Modernatx Inc N1-metil-pszeudo-uracilt tartalmazó ribonukleinsavak és azok felhasználásai
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
EP2691443B1 (en) 2011-03-28 2021-02-17 Massachusetts Institute of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
WO2012133737A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 架橋性アミン化合物、該化合物を用いた高分子膜及びその製造方法
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
EP2705152B1 (en) 2011-05-04 2017-10-25 The Broad Institute, Inc. Multiplexed genetic reporter assays and compositions
CN103687957A (zh) 2011-05-17 2014-03-26 现代治疗公司 工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法
EP2532649B1 (en) 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
AU2012267578B2 (en) 2011-06-08 2017-04-20 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
JP6184945B2 (ja) * 2011-06-08 2017-08-23 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子組成物および方法
WO2013003475A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RS62993B1 (sr) 2011-10-03 2022-03-31 Modernatx Inc Modifikovani nukleozidi, nukleotidi, i nukleinske kiseline, i njihove upotrebe
CA2850792A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing aldehyde dehydrogenase
AU2012328570B2 (en) 2011-10-27 2017-08-31 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid derivatives functionalized on the n-terminus capable of forming drug encapsulating microspheres and uses thereof
WO2013090186A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
EP2791364A4 (en) 2011-12-14 2015-11-11 Moderna Therapeutics Inc METHODS OF RESPONSE TO A BIOLOGICAL THREAT
CN104114572A (zh) 2011-12-16 2014-10-22 现代治疗公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
CA2859691A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Moderna Therapeutics, Inc. Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
US20140371302A1 (en) 2011-12-29 2014-12-18 Modema Therapeutics, Inc. Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
EP4372081A2 (en) 2011-12-30 2024-05-22 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
HUE041494T2 (hu) 2012-02-24 2019-05-28 Arbutus Biopharma Corp Trialkil-kationos lipidek és alkalmazási módszereik
BR112014024131A2 (pt) 2012-03-29 2017-07-25 Shire Human Genetic Therapies lipídios catiônicos ionizáveis
US9877919B2 (en) 2012-03-29 2018-01-30 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
JP2015518705A (ja) 2012-04-02 2015-07-06 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
BR112014029807A2 (pt) * 2012-06-08 2017-06-27 Ethris Gmbh administração pulmonar de rna mensageiro
EA201492055A1 (ru) * 2012-06-08 2015-11-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ИНГАЛЯЦИОННАЯ ДОСТАВКА мРНК В НЕЛЕГОЧНЫЕ КЛЕТКИ-МИШЕНИ
EP3536787A1 (en) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
CA2884870C (en) 2012-08-13 2022-03-29 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
EP2929035A1 (en) 2012-12-07 2015-10-14 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
EP2931319B1 (en) 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20150315541A1 (en) 2012-12-13 2015-11-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
JP2016504050A (ja) 2013-01-17 2016-02-12 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 細胞表現型の改変のためのシグナルセンサーポリヌクレオチド
WO2014158795A1 (en) 2013-03-12 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Diagnosis and treatment of fibrosis
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EA037922B1 (ru) 2013-03-14 2021-06-07 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. мРНК CFTR И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОВИСЦИДОЗА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО
CN105209633A (zh) 2013-03-14 2015-12-30 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
ES2680595T3 (es) 2013-03-14 2018-09-10 Translate Bio, Inc. Evaluación cuantitativa para eficacia de ARN mensajero para tapar
ES2647832T3 (es) 2013-03-14 2017-12-26 Translate Bio, Inc. Ácidos ribonucleicos con nucleótidos modificados con 4-tio y procedimientos relacionados
HUE055044T2 (hu) 2013-03-14 2021-10-28 Translate Bio Inc MRNS-kódolt ellenanyagok bejuttatására szolgáló eljárások és készítmények
EP2970955B1 (en) 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
EP3431592A1 (en) 2013-03-14 2019-01-23 Translate Bio, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
ES2795249T3 (es) 2013-03-15 2020-11-23 Translate Bio Inc Mejora sinérgica de la administración de ácidos nucleicos a través de formulaciones mezcladas
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
WO2014144711A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
US9315472B2 (en) 2013-05-01 2016-04-19 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
US9895443B2 (en) 2013-06-26 2018-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
EP3971287A1 (en) 2013-07-11 2022-03-23 ModernaTX, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
JP6620093B2 (ja) 2013-07-23 2019-12-11 アービュートゥス バイオファーマ コーポレイションＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法
AU2014315287A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051173A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015058069A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
CA2928186A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
EP4036241A1 (en) 2013-10-22 2022-08-03 Translate Bio, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
ES2954366T3 (es) 2013-10-22 2023-11-21 Translate Bio Inc Terapia de ácido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa
WO2015085318A2 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Moderna Therapeutics, Inc. Targeted adaptive vaccines
EP3053585A1 (en) 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
KR102399799B1 (ko) 2013-12-30 2022-05-18 큐어백 아게 인공 핵산 분자
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
CA2935878C (en) 2014-03-12 2023-05-02 Curevac Ag Combination of vaccination and ox40 agonists
PT3134131T (pt) 2014-04-23 2022-03-24 Modernatx Inc Vacinas de ácidos nucleicos
US10415037B2 (en) 2014-10-02 2019-09-17 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis B virus gene expression
WO2016071857A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus expression
EP3218508A4 (en) 2014-11-10 2018-04-18 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
WO2016077125A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
EP3247363A4 (en) 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016118725A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016154127A2 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
WO2016183366A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
EP3307305A4 (en) 2015-06-10 2019-05-22 Modernatx, Inc. TARGETED ADAPTIVE VACCINES
US20180208932A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
PL3350333T3 (pl) 2015-09-17 2022-03-07 Modernatx, Inc. Polinukleotydy zawierające region stabilizujący ogon
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
US20190054112A1 (en) 2015-09-18 2019-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
AU2019258679A1 (en) 2018-04-25 2020-10-15 Ethris Gmbh Cryoprotective agents for particulate formulations

Also Published As

Publication number Publication date
NZ751462A (en) 2021-07-30
SG10201710253QA (en) 2018-01-30
CN105142676B (zh) 2022-06-28
HUE042640T2 (hu) 2019-07-29
CL2015002675A1 (es) 2016-06-10
EP3446712A8 (en) 2019-04-10
WO2014153052A2 (en) 2014-09-25
KR102311614B1 (ko) 2021-10-08
EP3446712A1 (en) 2019-02-27
JP2022022419A (ja) 2022-02-03
AU2019202582B2 (en) 2021-05-27
AU2014236305B2 (en) 2019-01-17
PT2968586T (pt) 2018-11-13
US20150038556A1 (en) 2015-02-05
JP2020169218A (ja) 2020-10-15
HRP20181580T1 (hr) 2019-02-22
US20230302039A1 (en) 2023-09-28
MX2015012333A (es) 2016-05-31
US9713626B2 (en) 2017-07-25
IL262984A (en) 2018-12-31
HK1218068A1 (zh) 2017-02-03
CN105142676A (zh) 2015-12-09
PL2968586T3 (pl) 2019-01-31
JP6738366B2 (ja) 2020-08-12
JP6316930B2 (ja) 2018-04-25
SI2968586T1 (sl) 2018-12-31
US20200046752A1 (en) 2020-02-13
BR112015022868A2 (pt) 2017-11-07
US10420791B2 (en) 2019-09-24
HK1220137A1 (zh) 2017-04-28
KR20210049986A (ko) 2021-05-06
EA201591477A1 (ru) 2016-03-31
IL282453A (en) 2021-06-30
JP2016517437A (ja) 2016-06-16
CA2904151A1 (en) 2014-09-25
EA202190410A1 (ru) 2022-03-31
AU2019202582A1 (en) 2019-07-25
MX365409B (es) 2019-05-31
IL240982A0 (en) 2015-11-30
CA2904151C (en) 2023-09-12
NZ711657A (en) 2021-01-29
LT2968586T (lt) 2018-11-26
IL240982B (en) 2018-11-29
US20160106772A1 (en) 2016-04-21
RS57739B1 (sr) 2018-12-31
US9181321B2 (en) 2015-11-10
ES2689523T3 (es) 2018-11-14
EP2968586A2 (en) 2016-01-20
EA037922B1 (ru) 2021-06-07
JP2018100307A (ja) 2018-06-28
DK2968586T3 (en) 2018-10-08
AU2021215095A1 (en) 2021-08-26
JP2023054353A (ja) 2023-04-13
WO2014153052A3 (en) 2015-09-24
KR102248744B1 (ko) 2021-05-06
JP7236525B2 (ja) 2023-03-09
IL290953B2 (en) 2024-01-01
IL262984B (en) 2021-05-31
EP2968586B1 (en) 2018-07-25
UA117008C2 (uk) 2018-06-11
US11510937B2 (en) 2022-11-29
CY1120790T1 (el) 2019-12-11
IL290953B1 (en) 2023-09-01
CN115154620A (zh) 2022-10-11
IL305374A (en) 2023-10-01
IL282453B (en) 2022-03-01
WO2014153052A9 (en) 2015-08-06
US20180015116A1 (en) 2018-01-18
KR20160010398A (ko) 2016-01-27
PE20151773A1 (es) 2015-12-20
IL290953A (en) 2022-04-01
AU2014236305A1 (en) 2015-09-24
SG11201507391VA (en) 2015-10-29
KR20210122917A (ko) 2021-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230302039A1 (en) Cftr mrna compositions and related methods and uses
US20220023442A1 (en) Nucleic acids and methods of treatment for cystic fibrosis
US20230159449A1 (en) Lipid formulations containing nucleic acids and methods of treatment for cystic fibrosis
NZ711657B2 (en) Cftr mrna compositions and related methods and uses

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B15K Others concerning applications: alteration of classification

Ipc: A61K 47/00 (2006.01), A61K 31/7105 (2006.01)

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 14/03/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS