JP2020169218A - ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ組成物ならびに関連する方法及び使用 - Google Patents

ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ組成物ならびに関連する方法及び使用 Download PDF

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Abstract

【課題】哺乳動物の肺における誘導を含む、ＣＦＴＲ発現の誘導のためのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの材料、製剤、産生方法、及び送達方法を提供すること。【解決手段】本発明は、嚢胞性線維症を治療するために特に有用である。本発明は、部分的には、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ及び非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの製剤の開発、ならびにインビボの機能的ＣＦＴＲ発現を誘導し得るそれらの投与方法に基づく。本発明に従う組成物、方法、及び使用は、嚢胞性線維症の有効な治療に好適な好ましい安全性プロファイルとともに、大型哺乳動物の肺におけるＣＦＴＲ発現を提供し得る。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国仮出願第６１／７８３，６６３号の優先権を主張するものであり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）のｍＲＮＡ組成物、その用途、ならびにその作製及び使用方法に関する。
嚢胞性線維症は、上皮細胞中の複数の他のイオンチャネル及び輸送系の制御に関与すると考えられる塩素イオンチャネルをコードする、ＣＦＴＲ遺伝子の変異に起因する常染色体性遺伝性障害である。ＣＦＴＲの機能の損失は、慢性肺疾患、異常な粘液産生、及び劇的に低減された平均余命をもたらす。一般的にはＲｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２，１９９２−２００１（２００５）を参照されたい。
１９８９年におけるＣＦＴＲ遺伝子のクローニングにも関わらず、嚢胞性線維症の治療のためのＣＦＴＲを置換する有効な療法は未だ開発されていない。文献は、肺におけるＣＦＴＲの発現を誘導する試みにおいて遭遇する多数の難点を記述してきた。例えば、ＣＦＴＲ ＤＮＡを含むウイルスベクターは免疫応答を誘発し、ＣＦ症状が投与後に持続した。Ｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｙｓｔ．Ｆｉｂｒｏｓ．１０ Ｓｕｐｐｌ ２，Ｓ１１４−２８（２０１１）、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，４３９−４５（２００６）。ＣＦＴＲのＤＮＡを含むＤＮＡの非ウイルス性送達も、免疫応答を誘発すると報告されてきた。Ａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５３，９４７−５４（１９９９）、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．５，４９−６０（２００３）。さらに、非ウイルス性ＤＮＡベクターは、核膜孔複合体の機構が、転写が起こるであろう核内にＤＮＡを通常は移入しないという追加の問題に遭遇する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１６４−６９（２００９）。
肺におけるＣＦＴＲ発現を誘導するに当たっての難点の別の源は、肺環境自体である。肺胞界面活性物質は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）などのカチオン性脂質移動ビヒクルのトランスフェクション効率を低減させることが報告されてきた。
Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１，３３１−４０（１９９９）。また、上記のＲｏｓｅｎｅｃｋｅｒらは、２００３年に、ポリマー媒介性または脂質媒介性のトランスフェクションのいずれかを妨害し得る、気道表面の液体中に存在する複数の阻害性構成要素を特定した。伝令ＲＮＡ療法は、治療的または補充タンパク質の発現を誘導するための一般的な手法として提案されてきた。タンパク質産生の手段としての、宿主への伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の導入という概念は、以前に報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００９，７１，４８４−４８９、Ｄｅｂｕｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．２０１０，１４８，３３４−３４３）。しかしながら、ある特定のリポプレックス製剤を使用するｍＲＮＡ送達について、明らかな肺特異的な難点が報告されてきた。例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを担持するリポプレックスのインビトロ及びインビボ性能の比較は、ｍＲＮＡ組成物が培養細胞中でより高い発現をもたらしたにも関わらず、マウス肺に鼻腔内投与されたとき、ＤＮＡ組成物でのみ測定可能な発現が検出されたことを明らかにした。Ａｎｄｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．９，２１３６−４５（２０１２）。
ＣＦＴＲは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）などのモデルまたはレポーター遺伝子に対して比較的大きい遺伝子であることにも注目すべきである。野生型ＣＦＴＲコード配列（配列番号２）及びＦＦＬコード配列（配列番号７）の長さを比較されたい。長さの差は、ある状況下では安定性に、ひいては、任意の所定の用量のｍＲＮＡがタンパク質発現を生み出すかどうか、そしてそれが生み出すタンパク質発現の量に、影響し得る。さらに、ｍＲＮＡのインビトロ合成は、正常な細胞のｍＲＮＡ、及び望ましくない汚染物質を構成する他の細胞の構成要素の非存在のため細胞による合成より一般的に好ましいが、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡなどの長いコード配列を有するｍＲＮＡのインビトロ合成は、ＦＦＬなどの比較的短いコード配列を有するｍＲＮＡのインビトロ合成よりも、達成が実質的に困難である。
ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７／０２４７０８号ならびに米国特許公開第２０１０／０２０３６２７号及び同第２０１１／００３５８１９号は、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの治療的投与を記述するが、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの投与後の肺における機能的ＣＦＴＲの産生の実践に対する実証された低減、または、インビトロ転写ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを使用する肺におけるＣＦＴＲ発現の誘導に関連する難点を克服するための十分な助言のいずれも提供しない。これらは、ｍＲＮＡのインビトロ合成の達成に伴う難点、及びｍＲＮＡ組成物と肺特異性物質との相互作用に特異的な難点を含み、上記のＡｎｄｒｉｅｓらなどの研究者は、対応するＤＮＡベースの組成物がいくらかのレベルの発現を提供したにも関わらず、これらの難点によりｍＲＮＡ組成物が発現の誘導に無効なものとなっていることを見出している。
したがって、嚢胞性線維症の治療のための、哺乳動物の肺における誘導を含む、ＣＦＴＲ発現の誘導のためのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの改善された材料、製剤、産生方法、及び送達方法が必要とされている。
国際公開第２００７／０２４７０８号 米国特許出願公開第２０１０／０２０３６２７号明細書 米国特許出願公開第２０１１／００３５８１９号明細書
Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２，１９９２−２００１（２００５） Ｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｙｓｔ．Ｆｉｂｒｏｓ．１０ Ｓｕｐｐｌ ２，Ｓ１１４−２８（２０１１） Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，４３９−４５（２００６） Ａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５３，９４７−５４（１９９９） Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．５，４９−６０（２００３） Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１６４−６９（２００９） Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１，３３１−４０（１９９９） Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００９，７１，４８４−４８９ Ｄｅｂｕｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．２０１０，１４８，３３４−３４３ Ａｎｄｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．９，２１３６−４５（２０１２）
本発明は、部分的には、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ及び非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの製剤の開発、ならびにインビボの機能的ＣＦＴＲ発現を誘導し得るそれらの投与方法に基づく。本発明に従う組成物、方法、及び使用は、嚢胞性線維症の有効な治療に好適な好ましい安全性プロファイルとともに、大型哺乳動物の肺におけるＣＦＴＲ発現を提供し得る。
したがって、一態様では、本発明は、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達することによって、送達を必要とする対象（例えば、哺乳動物）の、特に肺におけるＣＦＴＲのインビボの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡは、対象の肺に直接送達される。本明細書において使用される場合、「ＣＦＴＲタンパク質」は、自然発生的ＣＦＴＲタンパク質活性の代わりとするため、ならびに／または嚢胞性線維症に関連する１つ以上の症状の強度、重症度、及び／もしくは頻度を低減させるために使用され得る、ＣＦＴＲタンパク質のいかなる完全長、断片、または部分をも包含する。例えば、本発明に従う好適なＣＦＴＲタンパク質は、野生型ヒトＣＦＴＲタンパク質（配列番号１）と同一のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従う好適なＣＦＴＲタンパク質は、野生型ヒトＣＦＴＲタンパク質（配列番号１）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有し得る。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺における上皮細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法を提供し、本方法は、哺乳動物の肺における上皮細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、インビトロ転写ｍＲＮＡを含む薬学的組成物であり、インビトロ転写ｍＲＮＡは、配列番号１をコードするコード配列を含む。別の実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、配列番号１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含む。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物の標的細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法を提供し、本方法は、哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡを含む。別の実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、配列番号１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含む。
別の実施形態では、本発明は、コード配列、５’−ＵＴＲ、及び３’−ＵＴＲを含む非自然発生的ｍＲＮＡ分子を提供し、該コード配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、該コード配列は、配列番号３と少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、該コード配列は、配列番号１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列をコードする、かつ／または該コード配列は、配列番号３と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。
別の実施形態では、本発明は、コード配列、５’−ＵＴＲ、及び３’−ＵＴＲを含む非自然発生的ｍＲＮＡ分子を提供し、該コード配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、該コード配列は、配列番号２の野生型コード配列と比べて、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の表１に列記される非野生型塩基を、表１に列記されるコード配列の位置において含む。
別の実施形態では、本発明は、コード配列、５’−ＵＴＲ、及び３’−ＵＴＲを含む非自然発生的ｍＲＮＡ分子を提供し、該コード配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、該コード配列は、配列番号２の野生型コード配列と比べて、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の表２に列記される非野生型塩基を、表２に列記されるコード配列の対応する位置において含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、シグナルペプチドのためのコード配列を含む非自然発生的ｍＲＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、本発明は、成長ホルモンリーダー配列のためのコード配列を含む非自然発生的ｍＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１８または配列番号１９のコード配列を含む、非自然発生的ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１８または配列番号１９に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のコード配列を含む、非自然発生的ｍＲＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７の配列を含む、非自然発生的ｍＲＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である配列を含む、非自然発生的ｍＲＮＡ分子を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオシド三リン酸塩を含む、組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うｍＲＮＡを含む、薬学的組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従う薬学的組成物が装填された、噴霧またはエアロゾル化装置を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うｍＲＮＡと、本ｍＲＮＡから発現される機能的ＣＦＴＲと、を含む、培養細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、機能的ＣＦＴＲの発現の誘導のための、本発明に従う薬学的組成物の使用を提供する。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺における上皮細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法を提供し、本方法は、上皮細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、本発明に従うｍＲＮＡを含む薬学的組成物である。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物の標的細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法を提供し、本方法は、哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、本発明に従うｍＲＮＡを含む。
別の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載のＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。一実施形態では、本ｍＲＮＡは、対象の肺に投与される。一実施形態では、本ｍＲＮＡは、吸入、噴霧、鼻腔内投与、またはエアロゾル化によって投与される。様々な実施形態では、本ｍＲＮＡの投与は、対象の肺におけるＣＦＴＲの発現をもたらす。
特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号１をコードするコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、野生型ヒトＣＦＴＲタンパク質（配列番号１）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号３のコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載される、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡの作製方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、単離ポリヌクレオチドをＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの作製方法を提供し、該単離ポリヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼは、細胞中に含有されず、該単離ポリヌクレオチドは、該ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型であり、該単離ポリヌクレオチドは、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、該鋳型配列は、配列番号１をコードする配列に相補的であるコード配列補体を含み、（ａ）該鋳型配列は、配列番号２の補体よりも少ないクリプティックプロモーター（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含むか、（ｂ）該鋳型配列は、配列番号２よりも少ない直列反復及び／もしくは逆方向反復を含むか、（ｃ）該鋳型配列は、配列番号２よりも少ない不利なコドン（ｄｉｓｆａｖｏｒｅｄ ｃｏｄｏｎ）の補体を含むか、または（ｄ）該コード配列補体のＧＣ含量は、配列番号２のＧＣ含量よりも低い。
別の実施形態では、本発明は、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、本発明に従う単離ポリヌクレオチドをＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの作製方法を提供し、該単離ポリヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼは、細胞中に含有されず、該単離ポリヌクレオチドは、該ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型であり、該単離ポリヌクレオチドは、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、該ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１をコードするコード配列を含むｍＲＮＡを合成する。
かかる使用及び治療方法のいくつかの実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、非自然発生的ＵＴＲを含むように修飾されたヒトＣＦＴＲ（配列番号２）をコードする自然発生的または野生型ｍＲＮＡである。他の実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、上述の非自然発生的ｍＲＮＡである。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
哺乳動物の肺における上皮細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記哺乳動物の前記肺における前記上皮細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、インビトロ転写ｍＲＮＡを含む薬学的組成物であり、
前記インビトロ転写ｍＲＮＡが、配列番号１をコードするコード配列を含む、前記方法。
（項目２）
哺乳動物の標的細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、配列番号１のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、前記方法。
（項目３）
（ａ）前記インビトロ転写ｍＲＮＡ配列が、配列番号２よりも少ないクリプティックプロモーター（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の補体を含む、
（ｂ）前記インビトロ転写ｍＲＮＡ配列が、配列番号２よりも少ない直列反復及び／もしくは逆方向反復を含む、
（ｃ）前記コード配列が、配列番号２よりも少ない不利なコドンを含む、かつ／または、
（ｄ）前記コード配列のＧＣ含量が、配列番号２のＧＣ含量よりも低い、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
コード配列、５’−ＵＴＲ、及び３’−ＵＴＲを含み、前記コード配列が、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号３と少なくとも８０％同一である、非自然発生的ｍＲＮＡ分子。
（項目５）
コード配列、５’−ＵＴＲ、及び３’−ＵＴＲを含み、前記コード配列が、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号２の野生型コード配列と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の表１に列記される非野生型塩基を、表１に列記されるコード配列の位置において含む、非自然発生的ｍＲＮＡ分子。
（項目６）
コード配列、５’−ＵＴＲ、及び３’−ＵＴＲを含み、前記コード配列が、配列番号１のアミノ酸配列をコードし、前記コード配列が、配列番号２の前記野生型コード配列と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の表２に列記される非野生型塩基を、表２に列記されるコード配列の対応する位置において含む、非自然発生的ｍＲＮＡ分子。
（項目７）
前記コード配列が、配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、項目４〜６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目８）
前記コード配列が配列番号３と同一である、項目４に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目９）
前記５’−ＵＴＲが、配列番号４を含む、かつ／または前記３’−ＵＴＲが、配列番号５を含む、項目４〜８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１０）
少なくとも７０、１００、１２０、１５０、２００、または２５０残基長のポリＡテールをさらに含む、項目４〜９のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１１）
５’キャップをさらに含む、項目４〜１０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１２）
少なくとも１つの構成ヌクレオチドが、ロックド核酸残基である、項目４〜１１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１３）
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの非標準核酸塩基を含む、項目４〜１２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１４）
前記非標準核酸塩基が、５−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び２−チオ−ウリジンのうちの１つ以上から選択される、項目１３に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１５）
哺乳動物または哺乳動物の細胞における機能的ＣＦＴＲ発現を誘導するのに使用するための、項目４〜１４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ分子。
（項目１６）
項目４〜１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡの前記配列に相補的な配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目１７）
前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド残基を含む線状または環状のポリヌクレオチドである、項目１６に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８）
項目１６または項目１７に記載のポリヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオシド三リン酸塩を含む、組成物。
（項目１９）
項目４〜１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡを含む、薬学的組成物。
（項目２０）
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、またはカチオン性脂質から選択される有機カチオンをさらに含み、前記有機カチオンが、前記ｍＲＮＡと非共有結合的に複合される、項目１９に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
前記有機カチオンがカチオン性脂質であり、前記組成物が、中性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び／またはコレステロールをさらに含む、項目２０に記載の薬学的組成物。
（項目２２）
前記カチオン性脂質が、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＭＣ３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノ部分を含むカチオン性脂質、イミダゾール部分を含むカチオン性脂質、及びグアニジウム部分を含むカチオン性脂質から選択される、項目２１に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
前記中性脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目２１または２２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
前記ＰＥＧ化脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖に共有結合された、Ｃ６〜Ｃ２０長の１つ以上のアルキル鎖（複数可）を含む、項目２１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
（項目２５）
前記有機カチオンが、１０ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有する分岐状ＰＥＩである、項目２０に記載の薬学的組成物。
（項目２６）
項目１９〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物が装填された、噴霧またはエアロゾル化装置。
（項目２７）
項目４〜１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡから発現される機能的ＣＦＴＲと、を含む、培養細胞。
（項目２８）
野生型ヒトＣＦＴＲをコードするゲノムＤＮＡまたは野生型ヒトＣＦＴＲをコードするｃＤＮＡを含まない、項目２７に記載の培養細胞。
（項目２９）
機能的ＣＦＴＲの発現の誘導のための、項目１９〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物の使用。
（項目３０）
哺乳動物の肺における上皮細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記上皮細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、項目４〜１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡを含む薬学的組成物である、前記方法。
（項目３１）
哺乳動物の標的細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法であって、
前記方法が、前記哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、
前記組成物が、項目４〜１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡを含む、前記方法。
（項目３２）
前記組成物が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはカチオン性脂質から選択される有機カチオンをさらに含み、前記有機カチオンが、前記インビトロ転写ｍＲＮＡと非共有結合的に複合される、項目１〜３または２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物が粘液溶解剤を含まない、項目１〜３または２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記有機カチオンがカチオン性脂質であり、前記組成物が、中性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び／またはコレステロールをさらに含む、項目１〜３または２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＭＣ３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノ部分を含むカチオン性脂質、イミダゾール部分を含むカチオン性脂質、及びグアニジウム部分を含むカチオン性脂質から選択される、項目１〜３または２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記中性脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目１〜３または２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記ＰＥＧ化脂質が、前記組成物中に存在し、かつ、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖に共有結合された、Ｃ６〜Ｃ２０長の１つ以上のアルキル鎖（複数可）を含む、項目１〜３または２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記有機カチオンが、１０ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有する分岐状ＰＥＩである、項目１〜３または２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記組成物が、噴霧またはエアロゾル化を介して投与される、項目１〜３または２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
インビトロのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの作製方法であって、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、単離ポリヌクレオチドをＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含み、
前記単離ポリヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼが、細胞中に含有されず、
前記単離ポリヌクレオチドが、前記ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型であり、
前記単離ポリヌクレオチドが、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、
前記鋳型配列が、配列番号１をコードする配列に相補的であるコード配列補体を含み、
（ａ）前記鋳型配列が、配列番号２の補体よりも少ないクリプティックプロモーターを含むか、（ｂ）前記鋳型配列が、配列番号２よりも少ない直列反復及び／もしくは逆方向反復を含むか、（ｃ）前記鋳型配列が、配列番号２よりも少ない不利なコドンの補体を含むか、または（ｄ）前記コード配列補体のＧＣ含量が、配列番号２のＧＣ含量よりも低い、前記方法。
（項目４１）
インビトロのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの作製方法であって、ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、項目１６または１７のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドをＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含み、
前記単離ポリヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼが、細胞中に含有されず、
前記単離ポリヌクレオチドが、前記ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型であり、
前記単離ポリヌクレオチドが、鋳型配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、
前記ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１をコードするコード配列を含むｍＲＮＡを合成する、前記方法。
（項目４２）
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、項目４０または４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記ヌクレオシド三リン酸塩が、プソイドウリジン三リン酸塩、５−メチル−シチジン三リン酸塩、及び２−チオ−ウリジン三リン酸塩のうちの１つ以上を含む、項目４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
配列番号１をコードするコード配列を含む前記ｍＲＮＡを単離することをさらに含む、項目４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
５’キャップを前記単離ｍＲＮＡに付加することをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記キャップ形成された単離ｍＲＮＡを、１つ以上の有機カチオンを含む１つ以上の薬学的に許容される担体と接触させることによって、薬学的組成物を製剤化することをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記１つ以上の有機カチオンが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、またはカチオン性脂質を含む、項目４６に記載の方法。
本発明の追加の目的及び利点は、部分的には、以下の説明において述べられ、部分的には、その説明から明らかになるか、または本発明の実践によって学習され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に指摘される要素ならびに組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は例示かつ説明に過ぎず、特許請求される、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
本発明の前述の態様及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後のヒトＣＦＴＲタンパク質の成熟型「Ｃ」バンドの検出。成功裏のタンパク質産生が、無修飾及び修飾（ＳＮＩＭ）ｍＲＮＡの両方（２５％の２−チオウリジン及び５−メチルシチジンを含む）について観察された。免疫沈降は、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＭＡＢ２５０３１抗体及びＡｂ５７０を使用する検出を使用して実施された。 ＰＥＩ／無修飾ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡナノ粒子の曝露の２４時間後のＣＦＴＲ ＫＯマウス肺のウェスタンブロット分析。マウスは、およそ１時間にわたって、噴霧（Ｐａｒｉ Ｂｏｙジェット噴霧器）を介して処置された。提供された方法に従って抽出されたヒトＣＦＴＲタンパク質の免疫沈降が実施された。成熟型「Ｃ」バンドは、対照マウスでは観察されないが、すべての処置マウスにおいて検出される。 処置済（４ｕｇのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）及び無処置ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ誘起電流の電流−電圧プロット。無処置細胞と比較して、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクト細胞中で大電流が誘導される。特異的ＣＦＴＲタンパク質阻害剤、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２に曝露された処置細胞は、Ｃｌ−イオン電流の流れにおける顕著な低減（約８９％）を示す。 ＋８０ｍＶの膜電位の適用時の処置済（４ｕｇのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）及び無処置ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ誘起電流のヒストグラムプロット。無処置細胞と比較して、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクト細胞中で大電流が誘導される。特異的ＣＦＴＲタンパク質阻害剤、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２に曝露された処置細胞は、Ｃｌ−イオン電流の流れにおける顕著な低減（約８９％）を示す。 未変性、ホルスコリン、及びＧｌｙＨ−１０１曝露のＨＥＫ ２９３細胞のプロファイルを比較する電流−電圧プロット。電流の有意な変化は、いずれの状況でも観察されなかった。 処置済（４ｕｇのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）及び無処置ＨＥＫ２９３細胞のホルスコリン誘起電流の電流−電圧プロット。無処置細胞と比較して、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクト細胞中で大電流が誘導される。特異的ＣＦＴＲタンパク質阻害剤、ＧｌｙＨ−１０１に曝露された処置細胞は、グラフ右側のステッププロット（＋１００ｍＶ）で実証される通り、Ｃｌ−イオン電流の流れにおける顕著な低減（約９５％）を示す。 無処置（ＰＢＳ）（左）及び処置済（右）のＣＦＴＲ ＫＯマウス肺におけるヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡのインサイツのハイブリダイゼーション。マウスは、気管内投与を介して、ＰＥＩナノ粒子中の３０ｕｇの被包された無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡに曝露された。実質的な陽性染色が、投与の２４時間後における両方の肺全体で観察される。 異なる拡大率の図（最大２０倍の拡大率）での、ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置されたＣＦＴＲ ＫＯマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーション。マウスは、気管内投与を介して、ＰＥＩナノ粒子中の３０ｕｇの被包された無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡに曝露された。 ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置された（右）ＣＦＴＲ ＫＯマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーションを示す高拡大率（４０倍）の代表的な肺切片。ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、投与の２４時間後の標的の気管支上皮細胞の頂端細胞質中で検出された。マウスは、気管内投与を介して、ＰＥＩナノ粒子中の３０ｕｇの被包された無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡに曝露された。 投与の６時間後（左）及び２４時間後（右）におけるヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置されたＣＦＴＲ ＫＯマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーション染色の比較。マウスは、気管内投与を介して、ＰＥＩナノ粒子中の３０ｕｇの被包された無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡに曝露された。強い陽性細胞内染色が、６時間以内に両方の肺全体で気管支及び肺胞の領域内に観察され、一方で、実質的な陽性染色は、投与の２４時間後において依然として観察される。 無処置（ＰＢＳ）（上部）及び処置済（下部）のＣＦＴＲ ＫＯマウス肺におけるヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡのインサイツのハイブリダイゼーション。マウスは、気管内投与を介して、Ｃ１２−２００脂質ナノ粒子中の１５ｕｇの被包された無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡに曝露された。実質的な陽性染色が、投与の６時間後における両方の肺全体で観察される。 ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置されたＣＦＴＲ ＫＯマウス肺のインサイツのハイブリダイゼーションを示す高拡大率（４０倍）の代表的な肺切片。ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、投与の６時間後において標的の気管支上皮領域（左）ならびに細胞内肺胞領域（右）の頂端細胞質中で検出された。マウスは、気管内投与を介して、Ｃ１２−２００脂質ナノ粒子中の１５ｕｇの被包された無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡに曝露された。 ｈＣＦＴＲ発現のための異なる細胞株のスクリーニング。ｈＣＦＴＲをコードするコンストラクトをトランスフェクトされたＣＨＯ及びＣＯＳ−７（Ａ）ならびにＢＨＫ及びＰＫＣ（Ｂ）細胞の免疫ブロット。タンパク質ライセートをトランスフェクションの２４時間後に調製し、一次抗体としてＭＡ１−９３５を使用してスクリーニングした。矢印は推定のＣＦＴＲを示す。実施例６にてＭＡ１−９３５特異性の記述を参照されたい。 異なる抗ヒトＣＦＴＲ抗体の交差反応性。（Ａ）‐マウス抗ヒトＣＦＴＲ ＭＡ１−９３５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、（Ｂ）‐マウス抗ヒトＣＦＴＲ ＡＢ５７０（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、（Ｃ）‐マウス抗ヒトＣＦＴＲ ＡＢ５９６（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、（Ｄ）ウサギ抗ヒトＣＦＴＲ Ｇ４４９（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。矢印はＣＦＴＲを示す。 ３つの異なる抗体（Ｒ２９、Ｒ６６／１７、及びＲ６６／１６）を使用するヒトＣＦＴＲの免疫沈降、続いてＡＢ５９６を使用する免疫検出。レーン１：Ｔ８４細胞（陽性対照）、レーン２：無処置のブタ肺組織（３００ｍｇ）、レーン３：処置されたブタ肺組織（６９７ｍｇ）、レーン４：処置されたブタ肺組織（１６３ｍｇ）。 それぞれ実施例６のＨＧＴ５００１製剤中の２０μｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ／１０μｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡの髄腔内スプレー適用の２４時間後におけるマウスの免疫沈降及びウェスタンブロッティング。Ｔ８４細胞は、ｈＣＦＴＲの成熟型グリコシル化Ｃバンド及びマンノシル化Ｂバンドを示す陽性対照とした。「上清」は、免疫沈降した画分を有しない残りの細胞抽出画分。「ＩＰ」は、免疫沈降した画分。 ＭＡＢ２５０３１を使用するＴ８４細胞からのｈＣＦＴＲの免疫沈降、続いてＡＢ５７０（Ａ）及びＭＡＢ１６６０（Ｂ）を使用する免疫検出。 ＭＡＢ２５０３１を使用するＴ８４細胞からのｈＣＦＴＲの免疫沈降、続いてＡＢ５７０（Ａ）及びＭＡＢ１６６０（Ｂ）を使用する免疫検出。 異なるコンストラクトのトランスフェクションの７２時間後におけるＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＣＦＴＲの免疫沈降。 ５００ｕｇのタンパク質及びＭＡＢ１６６０（左及び中央のパネル）ならびにＭＡＢ２５０３１を使用する（右のパネル）増加した量の総タンパク質（８ｍｇ）を使用する、異なるコンストラクトのトランスフェクションの７２時間後におけるＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＣＦＴＲの免疫沈降。 ＭＡＢ２５０３１を使用するｈＣＦＴＲの免疫沈降、及び、実施例６のＰＥＩ製剤中のｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ送達後のブタ肺試料からのＡＢ５７０を使用するその後の免疫検出。レーン１：ブタ２番のルシフェラーゼ陰性左尾状葉からの試料、レーン２：ブタ１番のルシフェラーゼ陽性肺領域からの試料。 麻酔及び換気されたブタ（左）に噴霧が実施された。噴霧器は換気系にインラインで接続された（右、白の矢印参照）。 ＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器を用いた、実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与後、異なる肺領域からのブタ組織検体のホモジネートにおいて測定されたルシフェラーゼ発現。肺検体は、ルシフェラーゼ測定（肺組織１ｍｇ当たりのｐｇルシフェラーゼ）の前に、エクスビボで一晩培養された。 実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 ＰＡＲＩ ＢＯＹジェット噴霧器を使用する、実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ造影。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用する、実施例６のＰＥＩ製剤中の各１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及びｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用する、「ＳＨＩＲＥ製剤３番」（ＨＧＴ５００１：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＰＥＧ２Ｋ（５０：２５：２０：５）（モル比）中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与後の、異なる肺領域からの代表的なブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。肺検体は、測定前にエクスビボで一晩培養された。 １頭の無処置対照ブタからの異なる肺領域からのブタ組織検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。他方の無処置対照ブタは、同じ結果を示した（データは示さず）。 １回処置されたブタ３番及び６番の肺検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。実施例６のＰＥＩ製剤中の各１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及びｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与が、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して実施された。ブタ肺全体のスライスが示されている。上３行：ブタ３番、下３行：ブタ６番。 ２回処置されたブタ４番及び８番の肺検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。実施例６のＰＥＩ製剤中の各１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及びｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与が、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して実施された。ブタ肺全体のスライスが示されている。上３行：ブタ４番、下３行：ブタ８番。 ３回処置されたブタ１番及び２番の肺検体におけるルシフェラーゼ発現のＢＬＩ。実施例６のＰＥＩ製剤中の各１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及びｈＣＦＴＲ−ｍＲＮＡ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与が、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して実施された。ブタ肺全体のスライスが示されている。上３行：ブタ１番、下３行：ブタ２番。 ３回処置されたブタ１番の肺組織に対するルシフェラーゼＩＨＣ。実施例６のＰＥＩ製剤中の各１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及びｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与が、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して実施された。ルシフェラーゼ発現は、赤みがかったピンク色に見えた（抗ルシフェラーゼｐＡｂ １：３００、Ｇ７４５１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｅｆｉｎｅ ＡＰ−Ｋｉｔ、色素原：ニューフクシン）。 ３重処置されたブタ１番の高度にＢＬＩ陽性の肺組織は、ｈＣＦＴＲのＩＰ／ＷＢを受けた。レーン１：Ｔ８４細胞（陽性対照）、レーン２：無処置のブタ肺組織（３００ｍｇ）、レーン３：処置されたブタ肺組織（６９７ｍｇ）、レーン４：処置されたブタ肺組織（１６３ｍｇ）。成熟型複合グリコシル化ｈＣＦＴＲが、分散したいわゆるＣバンドとして現れた。マンノースが豊富なｈＣＦＴＲが、より高密度ないわゆるＢバンドとして現れた。ｈＣＦＴＲ発現が、Ｔ８４細胞、及びｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置されたブタ１番のブタ肺組織中で観察され、一方で、無処置のブタにおいてｈＣＦＴＲ発現は観察されなかった。 ＭＡＢ２５０３１を使用するｈＣＦＴＲの免疫沈降、及び、実施例６のＰＥＩ製剤中のｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ送達後のブタ肺試料からのＡＢ５７０を使用するその後の免疫検出。レーン１：ブタ２番のルシフェラーゼ陰性左尾状葉からの試料、レーン２：ブタ１番のルシフェラーゼ陽性肺領域からの試料。 ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞への、Ｃ末端Ｈｉｓ１０タグ付き（ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０）及びタグなし（ＣＯ−ＣＦＴＲ）のコドン最適化ヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの、インビトロのトランスフェクション。トランスフェクション後、細胞全体のライセートが採取され、（Ａ）抗ＣＦＴＲ抗体２１７番及び（Ｂ）抗Ｈｉｓ抗体１１８７を使用するウェスタンブロットによって、ヒトＣＦＴＲ発現について分析された。トランスフェクトされた試料は、非トランスフェクションＨＥＫ ２９３Ｔ対照ライセート（レーン３）と比較された。 ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞への、成長ホルモンリーダー配列及び（ＧＨ−ＣＯ−ＣＦＴＲ）を有するコドン最適化ヒトＣＦＴＲをコードするＳＮＩＭ ＲＮＡ、または、Ｃ末端Ｈｉｓ１０タグ付きコドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０）をコードするＳＮＩＭ ＲＮＡの、インビトロのトランスフェクション。トランスフェクション後、細胞全体のライセートが採取され、抗ＣＦＴＲ抗体２１７番を使用するウェスタンブロットによって、ヒトＣＦＴＲ発現について分析された。トランスフェクトされた試料は、非トランスフェクションＨＥＫ ２９３Ｔ対照ライセート（レーン３）と比較された。 ＣＦＴＲノックアウトマウスへの、脂質（ｃＫＫ−Ｅ１２）またはポリマー（ＰＥＩ）ナノ粒子製剤のいずれかの中に被包されたＣ末端Ｈｉｓ１０タグ付きコドン最適化ヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの、インビボのトランスフェクション。各ｍＲＮＡ製剤それぞれの噴霧送達後、右及び左の肺組織のライセートが採取され、抗Ｈｉｓ抗体１１８７を使用するウェスタンブロットによって、ＣＦＴＲ発現について分析された。対照ＣＦＴＲノックアウト肺組織及びＣＦＴＲ−Ｈｉｓ１０ ＨＥＫ２９３のライセートが、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用された。 注射用水の噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるＦＦＬ発現の生物発光検出。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるＦＦＬ発現の生物発光検出。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるＦＦＬ発現の生物発光検出。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１０ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの噴霧後に採取されたブタの肺試料におけるＦＦＬ発現の生物発光検出。 異なるコホートにおけるＣＦＴＲ発現の相対定量。バンド強度は、タンパク質ラダー内の１５０ｋＤａのバンドに正規化された。 上皮細胞層内で少なくとも１つの上皮細胞が検出され、抗ＣＦＴＲ抗体を使用するＣＦＴＲ免疫組織化学的染色を介して明らかな膜局在型ＣＦＴＲシグナルを示す、「ＣＦＴＲ陽性」の気管支の代表的な例。 対照（ＷＦＩ）または５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後のブタの肺におけるＣＦＴＲの免疫組織化学的染色。 ５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の抗ＣＦＴＲを用いた免疫組織化学的染色によってブタの肺においてアッセイされた「低い」ＣＦＴＲ発現レベルを表す。 ５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の抗ＣＦＴＲを用いた免疫組織化学的染色によってブタの肺においてアッセイされた「中間の」ＣＦＴＲ発現レベルを表す。 ５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の抗ＣＦＴＲを用いた免疫組織化学的染色によってブタの肺においてアッセイされた「高い」ＣＦＴＲ発現レベルを表す。 対照（ＷＦＩ）または１０ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後のブタの肺におけるＣＦＴＲの免疫組織化学的染色。 動物当たりのＣＦＴＲ陽性の気管支／細気管支の相対数の定量。エアロゾル投与の２４時間後の各コホート（ＷＦＩ、及び１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇのヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ）の分析。１５０ｋＤａのタンパク質標準のシグナル強度に正規化されたＣＦＴＲ発現。（ＷＦＩ＝９．４±５．６％、１ＭＧ＝１５．２±６．６％、５ＭＧ＝２５．４±１４．１％、１０ＭＧ＝２０．９±３．７％、ＷＦＩ対５ＭＧ ｐ＝０．０２８１、ＷＦＩ対１０ＭＧ ｐ＝０．０１７４） 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタの肺における（Ａ）ユビキチンＣ及び（Ｂ）ｄａｐ Ｂの、多重核酸のインサイツの検出を示す。 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタの肺における（Ａ）ユビキチンＣ及び（Ｂ）ｄａｐ Ｂの、多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１０ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタの肺における（Ａ）ユビキチンＣ及び（Ｂ）ｄａｐ Ｂの多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１０ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタの肺における（Ａ）ユビキチンＣ及び（Ｂ）ｄａｐ Ｂの多重核酸のインサイツの検出を示す。 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 噴霧器による注射用水のエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋５ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１０ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 分岐状の２５ｋＤａのＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ＋１０ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル送達後の、ブタにおける（Ａ）右頭蓋及び（Ｂ）左頭蓋の多重核酸のインサイツの検出を示す。 ＦＦＬ／ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡを被包したｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子への曝露時の、処置されたブタ肺の活性ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）タンパク質の発光を介する陽性検出を示す。ブタは、Ｐａｒｉジェット噴霧器を使用する噴霧を介して、１ｍｇのＦＦＬ＋９ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡを被包した脂質ナノ粒子で処置され、処置の２４時間後に屠殺された。ＦＦＬ発光は、ＩＶＩＳ生物発光計を使用して可視化された。 ＦＦＬ／ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡを被包したｃＫＫ−Ｅ１２脂質ナノ粒子への曝露時の、処置されたブタ肺の活性ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）タンパク質の発光を介する陽性検出を示す。ブタは、Ｐａｒｉジェット噴霧器を使用する噴霧を介して、１ｍｇのＦＦＬ＋９ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡを被包した脂質ナノ粒子で処置され、処置の２４時間後に屠殺された。ＦＦＬ発光は、ＩＶＩＳ生物発光計を使用して可視化された。 ブタ１０、１１、及び１２（１ｍｇ用量）に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のｈＣＦＴＲ発現の例示的な結果を示す。 ブタ１３、１４、及び１５（５ｍｇ用量）に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞、ならびにブタ１９、２０、及び２１（１０ｍｇ用量）に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のｈＣＦＴＲ発現の例示的な結果を示す。 ブタ１６（５ｍｇ用量）、２２（１０ｍｇ用量）、及び６７（１ｍｇ用量）に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のｈＣＦＴＲ発現の例示的な結果を示す。 ブタ１７、１８（５ｍｇ用量）、２３、２４（１０ｍｇ用量）、及び６８、６９（１ｍｇ用量）に与えられた噴霧される複合体を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のｈＣＦＴＲ発現の例示的な結果を示す。
定義
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すために使用される。ポリヌクレオチド、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡという用語は、標準的または無修飾の残基、非標準的または修飾された残基、ならびに標準的残基及び非標準的残基の混合物からなる分子を含む。
本明細書において使用される場合、用語「ｍＲＮＡ」は、コード領域及び非コード領域の両方を含む修飾ＲＮＡ及び無修飾ＲＮＡを指すために使用される。
本明細書において使用される場合、ｍＲＮＡの「コード領域」という語句は、一般的に、翻訳されると、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などの発現産物の産生をもたらす部分を指す。
「非標準核酸塩基」は、天然の塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）以外の塩基部分である。非標準核酸塩基は、Ｔの類似体が一般的にＵの類似体でもある（逆もまた同じ）ことを除いて、核酸の二重らせんにおけるその塩基対形成特性、及び、核酸の二重らせん（ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鋳型の転写の間に形成されるものなどの局在性ＲＮＡ−ＤＮＡらせんを含む）におけるＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによる組み込みの座位が、以前に列記した５つの核酸塩基のうちの１つに最も類似している場合、特異的な核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）の類似体である。第２の配列に対する第１の配列の同一性の割合を決定する目的のため、塩基の類似体は、天然の塩基に対してミスマッチではない（例えば、プソイドウリジンはウリジンにマッチし、５−メチルシチジンはシチジンにマッチするなど）。
「ヌクレオシド」、「塩基」、「ヌクレオチド」または「残基」を含むがこれらに限定されない用語と併せて使用される用語「非標準的」は、「核酸塩基」と併せて使用されているかのような場合と同様に解釈されるものとする。
「ＧＣ含量」は、グアニン残基、シトシン残基、またはこれらの類似体である、核酸配列における合計の核酸塩基残基の分率または割合である。例えば、正確に３０のシトシン、正確に３０のグアニン、正確に１つのシトシン類似体、及び正確に１つのグアニン類似体を含有する１００ｎｔの配列は、６２％のＧＣ豊富度を有する。
本明細書において使用される場合、「不利なコドン」は、哺乳動物細胞によって、同じアミノ酸残基の別のコドンほど効率的または急速に翻訳されないコドンを指す。不利なコドンは、一般的に、コドンの第３あるいは「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」位置にＡまたはＵを有するコドンを含む。不利なコドンの記述については、例えば、米国特許公開第２００９／００６９２５６ Ａ１号を参照されたい。
「非自然発生的ｍＲＮＡ分子」は、野生型細胞の通常の転写及びスプライシング過程を介して産生されないｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、その配列の長所（例えば、いずれの自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡにおいても現れない一連のコドン及び／または１つ以上のＵＴＲ）によって、かつ／または、それが非標準的ヌクレオチド残基を含むため、非自然発生的と見なされ得る。非自然発生的ｍＲＮＡ分子は、インビトロ合成され得る。
以下の表１及び２それぞれにおいて、非野生型の列は、ＣＦＴＲコード配列中の位置（（Ｐｏｓ．）における非野生型塩基を示し（例えば、配列番号３を参照されたい）、野生型の列は、同じ位置における野生型塩基を示す（例えば、配列番号２またはヒトＣＦＴＲのＲｅｆＳｅｑエントリー（ＧｅｎＢａｎｋから入手可能な受入番号ＮＭ＿０００４９２．３、２０１３年２月１０日バージョン）を参照されたい。ＮＭ＿０００４９２．３の配列は、例えば、以下の表中の位置７がＮＭ＿０００４９２．３配列の位置１３９に対応するように、そのコード配列が位置１３３〜４５７５において生じるように非コード配列を含有することに留意されたい）。
非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ
自然発生的または野生型のＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（及びそのｍＲＮＡを含む組成物）を使用するインビボの機能的ＣＦＴＲの産生方法を提供することに加えて、本発明は、ＣＦＴＲタンパク質（例えば、配列番号１）をコードする非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡも提供する。いくつかの実施形態では、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、精製または単離される。
他の実施形態では、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含む細胞は、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを合成しなかった、かつ／または、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ及び／もしくは機能的ＣＦＴＲ遺伝子に相補的なＤＮＡを含まず、この細胞は、不活性ＣＦＴＲ遺伝子、例えば、遺伝子の発現産物を非機能性にする、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異、または欠失変異を有するＣＦＴＲ遺伝子などを任意に含み得る。いくつかの実施形態では、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含む細胞は、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡから翻訳された機能的ＣＦＴＲタンパク質をさらに含む。該細胞は、例えば、肺上皮細胞、肝細胞、または腎細胞であり得る。いくつかの実施形態では、該細胞は細胞培養物中にある。
ＣＦＴＲコード配列
いくつかの実施形態では、本発明に従うＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、配列番号２（すなわち、野生型ヒトＣＦＴＲのコード配列）よりも少ないクリプティックプロモーターの補体、配列番号２よりも少ない直列反復及び／もしくは逆方向反復、配列番号２よりも少ない不利なコドンを有するコード配列を含む、かつ／または、該コード配列のＧＣ含量が、配列番号２のＧＣ含量よりも低い。
配列のクリプティックプロモーター、直列反復及び／もしくは逆方向反復、ならびに／または不利なコドンは、日常的な方法を使用して当業者によって認識され得る。例えば、配列の直列反復及び／もしくは逆方向反復含量は、配列分析によって決定され得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）３４４：１９−３０）。配列のクリプティックプロモーター含量も、配列分析、例えば、コンストラクトなどの中のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の存在によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、本発明に従うＣＦＴＲ ｍＲＮＡはインビトロ転写され、すなわち、本ｍＲＮＡは、生物学的細胞中ではない人工的な設定（例えば、細胞を有しないインビトロ転写系）で合成された。一般的に、インビトロ転写は、好適な反応条件（塩、緩衝液、及び温度）で、プロモーター及び所望のｍＲＮＡ（これは環状または線状であり得る）に相補的な配列を含むＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにヌクレオシド三リン酸塩を提供することを含む。リボヌクレアーゼ阻害剤、還元剤、及び／またはピロホスファターゼが、反応混合物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、本発明に従うＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、配列番号２の野生型コード配列と比べて、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の表１に列記される非野生型塩基を、表１に列記されるコード配列の位置において含む、コード配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明に従うＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、配列番号２の野生型コード配列と比べて、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の表２に列記される非野生型塩基を、表２に列記されるコード配列の対応する位置において含む、コード配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３のコード配列を含む、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含む。追加の例示的な非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列、例えば、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７などは、配列の簡単な説明の項に記載される。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７のうちのいずれかと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のコード配列を含む、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、以下に記載の、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、シグナルペプチドコード配列、またはキャップもしくはテール構造を含む。
野生型ＣＦＴＲコード配列と異なるコード配列を含む上述のＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、有効性及び調製の容易さに関する利点を提供し得る。例えば、ＣＦＴＲコード配列に相補的な鋳型配列を含むポリヌクレオチドを使用するインビトロ転写反応は、より高いＲＮＡ収率をもたらし得、該鋳型配列を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞内での成長の間により安定しており（すなわち、より変異しにくくなり）、反応において使用可能な鋳型を生成するために必要な精製の量を低減し得、該コード配列を含むｍＲＮＡのインビボ翻訳は、より高くなり得る。
シグナルペプチド配列
いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を組み込む。本明細書において使用される場合、用語「シグナルペプチド」は、タンパク質の標的を分泌経路に定め得る、新たに合成されたタンパク質において存在するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ｍＲＮＡの翻訳に続く小胞体内への移行後に切断される。シグナルペプチドは、シグナル配列、リーダー配列、またはリーダーペプチドとも称される。典型的に、シグナルペプチドは短い（例えば、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、または５〜１０アミノ酸長の）ペプチドである。シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在し得る。いかなる特定の理論にも制限されることを望むものではないが、ＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡへのシグナルペプチドをコードする配列の組み込みは、インビボのＣＦＴＲタンパク質の分泌及び／または産生を促進し得る。
本発明に好適なシグナルペプチドは、様々な真核生物タンパク質及び原核生物タンパク質に由来する、特に分泌タンパク質における、異種性の配列であり得る。いくつかの実施形態では、好適なシグナルペプチドは、ロイシンが豊富な配列である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：２７２８−２７３２を参照されたい。好適なシグナルペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、血清アルブミンプレプロタンパク質、Ｉｇカッパ軽鎖前駆体、アズロシジンプレプロタンパク質、シスタチン−Ｓ前駆体、トリプシノーゲン２前駆体、カリウムチャネルブロッカー、αコノトキシンｌｐ１．３、αコノトキシン、αガラクトシダーゼ、セルロース、アスパラギン酸プロテイナーゼネペンテシン−１、酸キチナーゼ、Ｋ２８プレプロ−トキシン、キラートキシンジゴシン（ｚｙｇｏｃｉｎ）前駆体、及びコレラトキシンに由来し得る。例示的なシグナルペプチド配列は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１０：１１６４−７３，２０１２に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に由来するシグナルペプチドをコードする配列、またはその断片を組み込み得る。ｈＧＨシグナルペプチドをコードする非限定的なヌクレオチド配列は、以下に示される。
５’ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）配列（配列番号１８）：
ＡＵＧＧＣＣＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＧＡＡＣＣＵＣＡＣＵＧＣＵＧＣＵＣＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＵＧＣＵＵＵＧＣＣＵＧＣＣＣＵＧＧＵＵＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＵＣＧＧＣＵＵＵＣＣＣＧＡＣＣＡＵＣＣＣＡＣＵＣＵＣＣ
代替的な５’ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）配列（配列番号１９）：
ＡＵＧＧＣＡＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＧＡＡＣＣＵＣＣＣＵＣＣＵＧＣＵＣＧＣＡＵＵＣＧＧＣＣＵＧＣＵＣＵＧＵＣＵＣＣＣＡＵＧＧＣＵＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＧＣＧＵＵＣＣＣＣＡＣＵＡＵＣＣＣＣＣＵＣＵＣＧ
いくつかの実施形態では、本発明に従うｍＲＮＡは、配列番号１８または配列番号１９と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するシグナルペプチドをコードする配列を組み込み得る。
５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ポリＡテール、キャップ、及び非標準的ヌクレオチド残基
いくつかの実施形態では、本ｍＲＮＡは、その５’−ＵＴＲにおいて、配列番号４と同一であるか、または配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、本ｍＲＮＡは、その３’−ＵＴＲにおいて、配列番号５と同一であるか、または配列番号５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、本ｍＲＮＡはポリＡテールを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも７０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００の残基長を有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、７０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１５０、１５０〜２００、または２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００の範囲の残基長を有する。ポリＡテールは、当該技術分野において承認されている様々な技術を使用して付加され得る。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成またはインビトロ転写ＲＮＡに付加され得る（Ｙｏｋｏｅ，ｅｌ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターも、長いポリＡテールをコードすることができる。さらに、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物からの直接的な転写によって付加され得る。ポリＡはまた、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端に連結され得る（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９９１ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ポリＡテールの代わりに、またはそれに加えて、ポリＵもしくはポリＣテールが使用され得る。例えば、ＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含み得る。ｍＲＮＡの３’末端上の好適なポリＣテールは、約１０〜２００のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０のシトシンヌクレオチド）を典型的に含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加されるか、またはポリＡテールを置換し得る。
いくつかの実施形態では、本ｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、キャップ１構造を含む。ｍＲＮＡキャッピング酵素及び手順については、例えば、Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５，８６，１２３９−１２４９、欧州特許公開２ ０１０ ６５９ Ａ２、米国特許第６，３１２，９２６号を参照されたい。５’キャップは、典型的に、以下の通りに付加される；まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、末端リン酸基のうちの１つを５’ヌクレオチドから除去して、２つの末端リン酸を残し、次にグアノシン三リン酸塩（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸塩連鎖を産生し、次にグアニンの７−窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本ｍＲＮＡは、１つ以上の非標準的ヌクレオチド残基を含む。非標準的ヌクレオチド残基は、例えば、５−メチル−シチジン（「５ｍＣ」）、プソイドウリジン（「ψＵ」）、及び／または２−チオ−ウリジン（「２ｓＵ」）を含み得る。かかる残基及びｍＲＮＡへのそれらの組み込みの記述については、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号または国際公開第ＷＯ２０１１０１２３１６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはＳＮＩＭ ＲＮＡであり得る。本明細書において使用される場合、ＳＮＩＭ ＲＮＡは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０１２３１６号に記載の、ＩＶＴ反応においてある特定の割合の修飾ヌクレオチドを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって産生される伝令ＲＮＡを示す、安定化非免疫原性伝令ＲＮＡの頭字語である。本明細書に開示される実施例において使用されるＳＮＩＭ ＲＮＡは、Ｕ残基の２５％が２−チオ−ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５−メチルシチジンであったＩＶＴによって産生された。非標準的ヌクレオチド残基の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが標準的残基しか含有しない対照ｍＲＮＡよりも安定的にする、かつ／またはそれよりも免疫原性でなくし得る。さらなる実施形態では、本ｍＲＮＡは、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾及び他の核酸塩基の修飾の組み合わせから選択される、１つ以上の非標準的ヌクレオチド残基を含み得る。ある特定の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含み得る。追加の修飾としては、例えば、糖修飾または置換（例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）のうちの１つ以上）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本ＲＮＡは、追加のポリヌクレオチド及び／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）で複合もしくはハイブリッド形成され得る。糖修飾が２’−Ｏ−アルキル修飾である実施形態では、かかる修飾としては、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾、及び２’−デオキシ修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、これらの修飾のいずれも、ヌクレオチドの０〜１００％、例えば、個別または組み合わせで、構成ヌクレオチドの０％超、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または１００％において存在し得る。
ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含む組成物
ある特定の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、裸または未包装のｍＲＮＡとして投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物中のｍＲＮＡの投与は、好適な担体の包含によって促進され得る。ある特定の実施形態では、該担体は、標的細胞への１つ以上のｍＲＮＡのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。
本明細書において使用される場合、用語「担体」は、一般的に、ｍＲＮＡを含む、生物活性剤の投与に関連する使用のために意図される、標準的な薬学的担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤などのうちのいずれかを含む。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物中に用いられる該担体は、リポソーム小胞、または標的細胞及び／もしくは組織へのｍＲＮＡの移動を促進するための他の手段を含み得る。好適な担体としては、ポリマー系担体、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びマルチドメインブロックポリマー、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然エキソソーム及び合成的に誘導されたエキソソームの両方、天然、合成、及び半合成の層状体、ナノ微粒子、ケイ酸カルシウム蛍光体ナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、乾燥粉末、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達系、ミセル、乳濁液、ゾルゲル、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ペプチド抱合体、小分子標的抱合体、ならびに他のベクタータグが挙げられるが、これらに限定されない。好適な担体としてのバイオナノカプセル及び他のウイルス性カプシドタンパク質アセンブリの使用も企図される。（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｓｅｐ；１９（９）：８８７−９５）。
いくつかの実施形態では、該担体は、カチオン性脂質またはカチオン性有機ポリマーなどの有機カチオンを含む。存在する場合、カチオン性脂質は、ｍＲＮＡを被包するリポソーム小胞の構成要素であり得る。
本発明のある特定の実施形態では、該担体は、担体としてのポリマーを、単独で、または他の担体と組み合わせて使用して製剤化される。好適なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を挙げることができる。ＰＥＩが存在するとき、それは、１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量の分岐状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分岐状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ ４０８７２７番）であり得る。本発明のために好適な追加の例示的なポリマーとしては、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３１８２６８３号に記載のものが挙げられ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を促進するためのリポソーム担体の使用は、本発明によって企図される。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は、一般的に、様々な研究、産業、及び医学における応用において、特に診断用または治療的化合物の担体としてのインビボのそれらの使用のために有用であり（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３，１９９９）、通常は、１つ以上の二重層の膜によって外部培地から隔絶された内部水性空間を有する微視的な小胞として特徴付けられる。リポソームの二重膜は、典型的に、両親媒性分子、例えば、空間的に分離した親水性及び疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などによって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの二重膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性物質（例えば、ポリメロソーム、ニオソームなど）によっても形成され得る。
ある特定の実施形態では、本ｍＲＮＡは、標的細胞への送達を促進するために脂質ナノ粒子と複合される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質（ヘルパー脂質とも称される）などの追加の脂質、コレステロール系脂質、及び／またはｍＲＮＡ被包のためのＰＥＧ化脂質を用いる多構成要素の脂質混合物と組み合わされる場合がある。
カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含有する。本明細書において使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨにおいて正味の正電荷を有する、ある数の脂質種のうちのいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質、特に、滴定可能またはｐＨ滴定可能なカチオン性脂質として知られるものが、ｍＲＮＡを送達するに当たって特に有効である。いくつかのカチオン性（例えば、滴定可能）脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するために特に好適なカチオン性脂質としては、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号（そして特に、段落［００２２５］に記載されるＣ１２−２００）ならびに国際公開第ＷＯ２０１２／１７０９３０号に記載のものを含み、この両方が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２が使用され（国際公開第ＷＯ２０１３／０６３４６８号に開示される）、その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアンモニウム、すなわち「ＤＯＴＭＡ」が使用される。（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で、または中性脂質、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム移動ビヒクルまたは脂質ナノ粒子へと製剤化され得、かかるリポソームは、標的細胞への核酸の送達を向上させるために使用され得る。他の好適なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、すなわち「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム、すなわち「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、すなわち「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、すなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。企図されるカチオン性脂質としては、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン、すなわち「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン、すなわち「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン、すなわち「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン、すなわち「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物、すなわち「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物、すなわち「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、すなわち「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン、すなわち「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル１−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン、すなわち「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン、すなわち「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン、すなわち「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン、すなわち「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン、すなわち「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン、すなわち「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン、すなわち「ＤＬｉｎ−−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、すなわち「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照されたい）、またはこれらの混合物も挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６−２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、２０１３年３月２９日提出の米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）を含む、脂質ナノ粒子を用いる。
いくつかの実施形態では、かかる組成物中に存在するカチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、四級アミンを含まない。
非カチオン性／ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書において使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、中性脂質、双性イオン性、またはアニオン性脂質のいずれかを指す。本明細書において使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨにおいて正味の負電荷を帯びる、ある数の脂質種のうちのいずれかを指す。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、本組成物が製剤化及び／または投与される条件下で正味電荷を帯びない脂質である。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
コレステロールベースの脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、１つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、好適なコレステロールベースのカチオン性脂質としては、例えば、コレステロール、ＰＥＧ化コレステロール、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボアミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。
ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、及びＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［サクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用は、カチオン性脂質のうちの１つ以上、そしていくつかの実施形態では他の脂質との組み合わせで、本発明によって企図される。いくつかの実施形態では、好適なＰＥＧ化脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド−レクチンが使用され得る。他の企図されるＰＥＧ修飾脂質としては、Ｃ６〜Ｃ２０長のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、これに限定されない。特定の理論に制限されることを望むものではないが、ＰＥＧ化脂質の付加は、複合体の凝集を防止し、循環の寿命を増加させ、リポソームで被包されたｍＲＮＡの標的細胞への送達を促進し得ることが企図される。
ある特定の実施形態では、本組成物は、以下の脂質の組み合わせのうちの１つを含む：
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、
ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、
ＸＴＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、
ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、
ＡＬＮＹ−１００、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＧ、
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ、ＰＥＧＤＭＧ２Ｋ。
いくつかの実施形態では、脂質：ｍＲＮＡ比は、５：１（ｍｇ：ｍｇ）、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、及びそれ以上から最大３０：１（ｍｇ：ｍｇ）、またはそれ以上であり得る。Ｎ／Ｐ比は、１．１：１から最大１０：１の範囲内、またはそれ以上であり得る。脂質比の例は、４０：３０：２０：１０、５５：２０：２０：５、５０：２５：２０：５（カチオン性脂質：ヘルパー脂質：ｃｈｏｌ：ＰＥＧ脂質）である。
いくつかの実施形態では、本発明に従う薬学的組成物は、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、エルドステイン、ブロムヘクシン（ｂｒｏｍｈｅｋｓｉｎ）、カルボシステイン、グイアフェネシン（ｇｕｉａｆｅｎｅｓｉｎ）、またはヨウ素化グリセロール）を含まない。
薬学的組成物が装填された装置
いくつかの実施形態では、非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含むカチオン性脂質ベースまたはＰＥＩベースの組成物などの、本発明に従う薬学的組成物は、対象の呼吸器系への投与のための装置において提供される。本装置は、例えば、滴下、エアロゾル化、または噴霧装置であり得る。好適な装置としては、例えば、ＰＡＲＩ Ｂｏｙジェット噴霧器、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）実験室噴霧器、ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（登録商標）、またはＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器が挙げられる。あるいは、携帯型吸入器などの乾燥粉末吸入器またはエアロゾル化装置が使用され得る。
使用及び方法
本発明に従う使用及び方法のためのｍＲＮＡ
とりわけ、本発明は、特に哺乳動物の肺における、ＣＦＴＲタンパク質のインビボの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳動物の肺における上皮細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法であって、該上皮細胞をインビトロ転写ｍＲＮＡを含む薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供し、該インビトロ転写ｍＲＮＡは、配列番号１（野生型ヒトＣＦＴＲのアミノ酸配列）をコードするコード配列を含む。本発明はまた、哺乳動物の肺における上皮細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導のための、インビトロ転写ｍＲＮＡを含む薬学的組成物の使用を提供し、該インビトロ転写ｍＲＮＡは、配列番号１をコードするコード配列を含む。
本発明は、哺乳動物の標的細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導方法をさらに提供し、本方法は、哺乳動物の標的細胞を組成物と接触させることを含み、本組成物は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡを含む。本発明は、哺乳動物の標的細胞中のＣＦＴＲ発現の誘導のための組成物の使用をさらに提供し、本組成物は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡを含む。
かかる使用及び治療方法のいくつかの実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、ヒトＣＦＴＲ（配列番号２）をコードする自然発生的または野生型ｍＲＮＡである。他の実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、上述の非自然発生的ｍＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、インビトロ転写ｍＲＮＡは、配列番号２（野生型ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％９５％、または１００％同一である配列番号１をコードするコード配列を含む。
配列番号２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列番号１をコードするコード配列を含むｍＲＮＡは、上述の本ｍＲＮＡよりも多いクリプティックプロモーター、直列反復及び逆方向反復、ならびに／またはＧＣ含量を有し得る。配列番号２を含むベクターは、典型的な成長条件下で、宿主細胞中の挿入／欠失／再配列変異を頻繁に経験し、インビトロ転写のために直接的に使用され得なかったベクターの異種性の集団をもたらしたことが観察された。より低い温度、落ち着いた光、及び／または低コピー細胞、例えばＣｏｐｙＣｕｔｔｅｒ（登録商標）などの条件下で成長する宿主細胞は、変異の発生を低減させたが排除しなかったことが分かった。したがって、配列番号２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のコード配列を含むｍＲＮＡのインビトロ転写反応には、上述のベクターを成長させることによって得られる鋳型を使用し、このベクターを収集及び直線化し、転写反応において使用するための所望の種を精製することが賢明な場合がある。精製ステップは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィまたは弱アニオン交換であり得る。
本発明に従う使用及び方法のためのインビトロ転写ｍＲＮＡは、かかる特徴に関する上記の項で記述される通り、５’−ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ、ポリＵ、及び／もしくはポリＣテール、キャップ、ならびに／または非標準的ヌクレオチド残基を含み得る。
使用及び方法のための薬学的組成物
本発明に従う使用のための薬学的組成物は、前項で記述された本発明に従う使用及び方法のためのｍＲＮＡ、ならびにＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含む組成物に関する上記の項で記述された追加の成分を含み得る。したがって、上述の担体のいずれかを含む薬学的組成物の使用及び／または投与が企図される。
いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、１０〜４０ｋＤａの範囲、例えば、２５ｋＤａの分子量を有する分岐状ＰＥＩなどのＰＥＩを含む。
他の好ましい実施形態では、薬学的組成物は、カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び追加の脂質（中性脂質など）を含む。カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び／または追加の脂質は、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含む組成物に関する上記の項に列記されるものから選択され得る。
肺における発現の誘導のための投与経路
哺乳動物の肺におけるＣＦＴＲ発現の誘導のための方法及び使用のいくつかの実施形態では、上述の薬学的組成物は、気管内滴下、噴霧、及びエアロゾル化から選択される経路によって投与される。本組成物を投与するための装置は、薬学的組成物が装填された装置に関する上記の項に列記される装置から選択され得る。
好ましい実施形態では、本組成物は、噴霧またはエアロゾル化を介して投与される。いくつかの脂質製剤は、噴霧が試みられる際に凝集する傾向を有し得るが、配合を調整すること、例えば、カチオン性脂質を置換することによって、凝集の問題を解決することが一般的に可能である。
嚢胞性線維症の治療
とりわけ、本発明は、嚢胞性線維症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載のＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ、または本ｍＲＮＡを含有する薬学的組成物を投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。本ｍＲＮＡまたは本ｍＲＮＡを含有する薬学的組成物は、対象の肺に直接投与され得る。肺送達のための様々な投与経路が使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する組成物は、吸入、噴霧、またはエアロゾル化によって投与される。様々な実施形態では、本ｍＲＮＡの投与は、対象の肺（例えば、肺の上皮細胞）におけるＣＦＴＲの発現をもたらす。
特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号１をコードするコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列をコードするコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号３のコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象の肺に、配列番号３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のコード配列を含むｍＲＮＡを投与することによる、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。嚢胞性線維症を治療するために使用され得る追加の例示的な非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ、例えば、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７などは、配列の簡単な説明の項に記載される。いくつかの実施形態では、嚢胞性線維症を治療するために使用され得る非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、配列番号３、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７のうちのいずれかと、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のコード配列を含む。
実施例
以下の具体的な実施例は単なる例示であり、本開示の残部をいかようにも制限するものではないと解釈されるべきである。さらなる詳細を伴わずに、当業者であれば、本明細書の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。
別途指示されない限り、本明細書に開示される実施例において使用されるＣＦＴＲ ｍＲＮＡ及びＳＮＩＭ ＲＮＡは、配列番号４の配列を有する５’ＵＴＲ、配列番号３の配列を有するコード配列（ＣＤＳ）、及び配列番号５の配列を有する３’ＵＴＲを含んだ。本明細書に開示される実施例において使用されるＦＦＬ ｍＲＮＡ及びＳＮＩＭ ＲＮＡは、それぞれ配列番号６、７、及び８の配列を有する５’ＵＴＲ、ＣＤＳ、及び３’ＵＴＲを含んだ。
実施例１：インビトロ合成されたＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡ
伝令ＲＮＡ合成。ヒト嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ、及びホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡを、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって合成し、続いて、５’キャップ構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５，８６，１２３９−１２４９）、及び、ゲル電気泳動によって決定されたときに長さがおよそ２００のヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを付加した。５’及び３’の非翻訳領域が各ｍＲＮＡ産物中に存在した。
例示的な非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡとしては、配列の簡単な説明の項に記載の配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７が挙げられる。
実施例２：ＨＥＫ細胞中のＣＦＴＲ発現及び活性
この実施例は、細胞に送達される合成ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡから完全に機能的なＣＦＴＲタンパク質が発現されることを実証する。
細胞及びＣＦＴＲトランスフェクション。ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５−０９２）内で成長させた。トランスフェクションの前日に、５０〜６０％コンフルエンスの６ウェルプレートに細胞をプレーティングし、正常組織培養条件下（５％のＣＯ２、９５％の空気の加湿雰囲気中で３６℃）でインキュベートした。６０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８０１９）を、９００μｌのＯｐｔｉＭｅｍ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号３１９８５−０６２）中で希釈し、穏やかにボルテックスした。２４μｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（プレート当たり４μｇ）を、９００μｌのＯｐｔｉＭｅｍ培地中で希釈した。このｍＲＮＡを、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅに直ちに添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレーティング培地を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から穏やかに吸引し、１ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ低血清培地と交換した。３００μｌのｍＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を各ウェルに加え、細胞を正常組織培養条件下に２４時間置き、その後、細胞を電気生理学的記録のための記録チャンバに容易に移動できるように、機械的解離によってポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたガラスカバースリップ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ）に再度プレーティングした。細胞を、最低でさらに２４時間にわたって標準的な組織培養条件下でインキュベートし、最終のプレーティングの４８時間以内に使用した。
電気生理学的記録。５〜８ＭΩの電極を有するＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器を使用して、全細胞パッチ固定記録を室温で行った。データを適切にデジタル化し（５０ｋＨｚ）、フィルタリングした（５ｋＨｚ）。直列抵抗を補正し（７０〜８０％）、電圧誤差を最小化した。以下の組成のピペット溶液を用いて、電圧固定記録を実施した：１４０ｍＭのＮＭＤＧ−Ｃｌ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、３１０ｍＯｓｍ／ｌ。浴液は、Ｄ−グルコースで３１５ｍＯｓｍ／ｌに調整された１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３を含有した。電圧固定記録を、全細胞構成の確立の３〜５分後に開始した。
細胞を、−６０ｍＶまたは０ｍＶのいずれかの保持電位で電圧固定し、記録されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一連の正電圧及び負電圧ステップ（２０ｍＶの増分において−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶまたは−１００〜＋１００ｍＶのいずれか）を注入し、ＣＦＴＲに誘導された全細胞塩素イオン（Ｃｌ−）電流を誘起した。ｃＡＭＰの膜透過性類似体、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（５００μＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、記録される細胞に４分間適用し、ＣＦＴＲ電流を促進した。「ゴールドスタンダード」のＣＦＴＲブロッカー、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を、各記録の終わりに適用し、ＣＦＴＲに誘導されたＣｌ−電流を遮断した。対照記録を、非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で実施した。
試験化合物。記録される細胞からおよそ２００μｍに配置された排出ピペットを用いる、ＤＡＤ−１６ＶＣ急速灌流システム（ＡＬＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）を使用して、試験化合物を適用した。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰをｄｄＨ２０中５００ｍＭのストック濃度として作製した。ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２をＤＭＳＯ中１０ｍＭのストックとして作製した。全化合物を−２０℃で保管し、使用直前に急速に解凍して所望の最終濃度に希釈した。
分析。Ｃｌａｍｐｆｉｔ（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）ソフトウェアを使用して全分析を行った。すべての値は、最大の誘起されたピーク電流振幅である。データの統計的差異を、必要に応じて対応または独立のスチューデントｔ検定によって評価し、Ｐ＜０．０５で有意と見なした。
インビトロのヒトＣＦＴＲタンパク質産生。ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡを介するヒトＣＦＴＲタンパク質の産生を、本明細書に記載のＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションを介して達成した。処置済及び無処置の細胞を収集し、トランスフェクションの２４時間後に免疫沈降法を行った。ウェスタンブロット分析を介するヒトＣＦＴＲタンパク質の検出は、完全複合のグリコシル化ＣＦＴＲタンパク質（「Ｃ」バンドとして示される）が、合成伝令ＲＮＡから産生されたことを実証する（図１Ａ）。
インビトロのヒトＣＦＴＲタンパク質活性。トランスフェクション後に産生された合成ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡ由来のＣＦＴＲタンパク質の活性を決定するため、ＨＥＫ ２９３及びＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の両方で全細胞パッチ固定アッセイを実施した。電流の流れ（塩素イオン輸送）の変化の決定を助けるために、処置細胞ならびに対照細胞（無処置及び偽トランスフェクトされた）を、活性化剤（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、ホルスコリン）及び阻害剤（ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２、ＧｌｙＨ−１０１）基質に晒した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、４ｕｇのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に分析した。全細胞固定アッセイを行い、既定の電圧の適用時の塩素イオン輸送によって表される電流の流れを測定した。−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶの電圧ランプの結果としての電流対電圧のプロット（図２に示される）は、無処置細胞とｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置された細胞とを比較したときの電流の実質的差異を示す。ＣＦＴＲタンパク質の既知の活性化剤である８−Ｂｒ−ｃＡＭＰへの曝露後の電流のこの増加は、ヒトＣＦＴＲタンパク質がこれらの細胞中に存在することを示唆する。これらの以前にトランスフェクトされた細胞を、既知のＣＦＴＲ阻害剤、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２を用いて処置すると、それぞれの電流は、対照レベル近くまで低下する（約８９％の減少）。この阻害剤の曝露後のかかる減少は、ヒトＣＦＴＲタンパク質の存在を強く支持する。これらの結果は、総じて、合成ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡが活性ヒトＣＦＴＲタンパク質を産生し得ることを実証する。
別々に、ＨＥＫ２９３細胞中で自動化システム（ＩｏｎＷｏｒｋｓ）を使用して、ＣＦＴＲ全細胞活性アッセイを実施した。上述の通り、電流の流れ（塩素イオン輸送）の変化の決定を助けるために、処置細胞ならびに対照細胞（無処置及び偽トランスフェクトされた）を、活性化剤及び阻害剤基質に晒した。これらの研究では、ＣＦＴＲタンパク質活性化剤としてホルスコリンを用い、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクト細胞の一部を、異なる特異的ＣＦＴＲ阻害剤、ＧｌｙＨ−１０１にさらに曝露した。ＧｌｙＨ−１０１は、タンパク質の細胞外膜側に作用する、ＣＦＴＲ細孔ブロッカーとして作用すると考えられる。特に、この機構の作用は、ＣＦＴＲタンパク質の細胞内側から機能すると報告されているＣＦＴＲｉｎｈ−１７２のものとは異なる。
図４は、ホルスコリンならびにＧｌｙＨ−１０１で処置された親のＨＥＫ２９３細胞株の電流−電圧プロットを表す。電流の著しい変化は測定されず、これらの特異的ＣＦＴＲ活性化剤／阻害剤が、細胞株中に存在する内在性タンパク質に影響を有しないことを示唆する。
−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの電圧ランプの結果としての電流対電圧のプロット（図５に示される）は、無処置ＨＥＫ２９３細胞とｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置された細胞とを比較したときの電流の実質的差異を示す。ＣＦＴＲタンパク質の既知の活性化剤であるホルスコリンへの曝露後の電流のこの増加は、ヒトＣＦＴＲタンパク質がこれらの細胞中に存在することを示唆する。これらの以前にトランスフェクトされた細胞を、異なる既知の特異的ＣＦＴＲ阻害剤、ＧｌｙＨ−１０１を用いて処置すると、それぞれの電流は、対照レベル近くまで低下する（約９５％の減少）。この阻害剤の曝露後のかかる減少は、ヒトＣＦＴＲタンパク質の存在を強く支持する。
総じて、２つの明確に異なる機構の結果であるこれらの阻害データは、合成ヒトＣＦＴＲ伝令ＲＮＡに由来する完全に機能的なＣＦＴＲタンパク質の同一性を強く支持する。
実施例３：ＣＦＴＲのインビボの発現
この実施例は、ＣＦＴＲタンパク質が、肺内投与によって送達されるＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡから、インビボで有効に発現されることを実証する。
製剤化プロトコル１。Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、３ｍＬの最終容積までエタノールで希釈した。別々に、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液に急速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中の最終懸濁液を得た。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、続いて水で透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．０９ｍｇ／ｍＬのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（被包されている）。Ｚ平均＝８０．２ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝５５．５ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝９９．６ｎｍ）。
製剤化プロトコル２。２．０ｍｇ／ｍＬの水溶液ＰＥＩ（分岐状、２５ｋＤａ）のアリコートを、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（１．０ｍｇ／ｍＬ）の水溶液と混合した。結果として生じる複合混合物を、上下に数回ピペッティングし、注射前に２０分間置いた。最終濃度＝０．６０ｍｇ／ｍＬのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（被包されている）。Ｚ平均＝７５．９ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝５７．３ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝９２．１ｎｍ）。
ｍＲＮＡが充填されたナノ粒子の気管内投与を介して産生されたＦＦＬ及びＣＦＴＲタンパク質の分析。雌のＢＡＬＢ／ＣマウスまたはＣＦＴＲ ＫＯマウスのいずれかを使用して、すべての研究を実施した。ＦＦＬ試料を、各用量の被包されたＦＦＬ ｍＲＮＡの直接滴下（ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（登録商標））または噴霧（ＰＡＲＩ ＢｏｙもしくはＡｅｒｏｎｅｂ）のいずれかを介して導入した。ＰＡＲＩ Ｂｏｙジェット噴霧器を使用して、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを導入した。マウスを屠殺し、発現のための時間を持った後、生理食塩水で灌流した。
ＦＦＬ ｍＲＮＡの気管内投与。ケタミン５０〜１００ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン５〜１５ｍｇ／ｋｇの混合物を用い、腹腔内注射で動物を麻酔しながら、Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（商標）を介する単一の気管内エアロゾル投与（５０μＬ／動物）によって、ＦＦＬ試験材料を投与した。
ＦＦＬ ｍＲＮＡの噴霧（エアロゾル）投与。Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）実験室噴霧器を介する単一のエアロゾル吸入（最大８ｍＬ／群の通常用量容積）によって、ＦＦＬ試験材料を投与した。試験材料を、動物の全群を収容するボックス（ｎ＝４）に送達し、酸素流及び捕捉システムに接続した。
ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの投与。以下の実施例６に記載の方法でＣＦＴＲ ｍＲＮＡを調製した。４匹のＣＦＴＲノックアウトマウスをエアロゾルチャンバボックスに配置し、およそ１時間にわたる噴霧（Ｐａｒｉ Ｂｏｙジェット噴霧器）を介して、２ｍｇの全コドンを最適化した無修飾ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（配列番号３のコード配列を含む）に曝露した。曝露の２４時間後にマウスを屠殺した。
安楽死。動物を、用量投与（±５％）後の代表的な時間にＣＯ２窒息によって安楽死させ、続いて開胸及び全採血を行った。心穿刺を介して全血（最大の入手可能な容積）を採取し、廃棄した。
灌流。全採血後、全動物は、生理食塩水を用いた心臓灌流を受けた。手短に言えば、灌流のために左心室の管腔内に置かれた生理食塩水を含む１０ｍＬのシリンジに取付けられた２３／２１ゲージの針を挿入することによって、全身の心臓内灌流を実施した。右心房を切開し、灌流液の排液口を提供した。穏やかで安定した圧力をプランジャーに適用し、針を心臓内に配置した後、動物を灌流した。フラッシング溶液が身体を飽和し、手順が完了したことを示すように、出てくる灌流液が澄んで（目に見える血液がなく）流れるとき、十分な流量のフラッシング溶液を確保した。
組織採取。灌流後、全動物の肝臓ならびに肺（右及び左）を収集した。選択群の肝臓のおよそ半分ならびに両方（右及び左）の肺を液体窒素中で即座に凍結し、名目上−７０℃で別々に保管した。選択群の肝臓のおよそ半分を、動物１匹当たり１つの組織学カセットに配置した。さらに、気管に挿入したカニューレを通して、１０％のＮＢＦで肺を膨張させた。気管を結紮で縛り、肺（右及び左）ならびに気管を、動物１匹当たり１つの組織学カセットにインタクトに配置した。すべての組織学カセットを、１０％のＮＢＦ中で２４時間、環境条件で保管し、７０％のエタノールに移動させた。
ＦＦＬ処置マウスにおけるＦＦＬの発現。組織試料の分析時に、ＦＦＬ処置マウスにおいてＦＦＬ発現を検出した（データは示さず）。
ＣＦＴＲノックアウトマウスにおけるＣＦＴＲの発現。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ処置マウス肺の免疫沈降ウェスタンブロット分析によって、ＣＦＴＲ発現を検出した。成熟型「Ｃ」バンドは、対照マウスでは観察されなかった一方で、すべての処置マウスの左及び右の肺において検出された（図１Ｂ）。使用した抗体は、免疫沈降についてはＭＡＢ２５０３１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、そしてウェスタンブロット分析を介する検出についてはＳＡＢ４５０１９４２（Ｓｉｇｍａ）であった。
ここに示される結果は、ＣＦＴＲタンパク質が、ｍＲＮＡの肺送達に基づいて、インビボで成功裏に発現され得ることを示す。さらに、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡがＣＦＴＲノックアウトマウスの肺に成功裏に送達され、肺における有効なタンパク質産生をもたらしたという事実は、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡベースのインビボのタンパク質産生が、ＣＦＴＲタンパク質欠乏症を治療するために使用され得ることを示す。
実施例４：ポリマーナノ粒子を使用するＣＦＴＲ ｍＲＮＡの肺送達
マウスの肺へのヒトＣＦＴＲ伝令ＲＮＡの送達は、直接吸入ならびに噴霧のいずれかを介して達成され得る。インサイツのハイブリダイゼーション方法を使用すると、ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡが充填されたナノ粒子をマウスに気管内投与した後、ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡを成功裏に検出することができる。投与は、脂質ベースのナノ粒子（例えば、Ｃ１２−２００）ならびにポリマーナノ粒子（例えば、ポリエチレンイミン、ＰＥＩ）を用いて達成され得る。
ポリマーナノ担体を使用するＣＦＴＲ ｍＲＮＡの投与。ＣＦＴＲ ＫＯマウスを、気管内投与（３０ｕｇの被包されたｍＲＮＡ）を介して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのＣＦＴＲ ｍＲＮＡが充填されたナノ粒子で処置した。投与の６時間後及び２４時間後に処置マウスを屠殺し、肺を収集して１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定した。外来性ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡの検出のために、インサイツのハイブリダイゼーションを用いた（図６）。ＰＢＳで処置された対照マウスでは染色が観察されなかった一方で、処置されたＣＦＴＲ ＫＯマウスの両方のマウスの肺では、広範な分布を伴って投与の２４時間後に実質的な染色が観察された。
より高拡大率（最大２０倍の拡大率）での処置された肺の分析は、両方の肺の気管支及び肺胞の領域全体にわたる広範な陽性細胞内染色を明らかにした（図７）。さらなる拡大率（４０倍）では、標的の頂端気管支上皮細胞の細胞質中で陽性染色が観察された（図８）。したがって、伝令ＲＮＡ ＡＰＩが、標的の頂端気管支上皮細胞に成功裏に送達されたと結論付けることができる。さらに、実質的な染色が投与の６時間後において観察され得る一方で、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡの有意な陽性検出は２４時間後に依然として観察された（図９）。
実質的な陽性細胞内染色は、投与の２４時間後において、両方の肺全体で気管支及び肺胞の領域内に観察された。
実施例５：脂質ベースのナノ粒子を使用するＣＦＴＲ ｍＲＮＡの肺送達
脂質ベースのナノ担体を使用するＣＦＴＲ ｍＲＮＡの投与。上述の通り、ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡの成功裏の肺送達は、脂質ナノ粒子ベースの送達ビヒクルを介して達成され得る。カチオン性脂質構成要素としてＣ１２−２００を利用する、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡが充填されたカチオン性脂質ナノ粒子の実施例がここに開示される。
ＣＦＴＲ ＫＯマウスの肺内のヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡの成功裏の検出は、インサイツのハイブリダイゼーションを介して達成された。ノックアウトマウスを、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子中に被包された１５ｕｇのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置し、投与の６時間後に屠殺した。ＰＢＳで処置された対照マウスと比較した場合、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡの陽性検出が、両方の肺の気管支及び肺胞の領域全体で観察された（図１０）。
さらなる拡大率（４０倍）では、気管支上皮細胞の頂端細胞質中、ならびに細胞内末端肺胞領域内で、ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡの陽性検出が観察された（図１１）。
総じて、合成ヒトＣＦＴＲ伝令ＲＮＡの成功裏の送達は、ポリマー（ＰＥＩ）及び脂質ナノ粒子ベース（Ｃ１２−２００）の送達系の両方を利用して達成され得る。これらの送達系は、マウスの標的細胞中の原体の細胞内蓄積をもたらした。さらに、実質的な量のｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、投与の２４時間後にこれらの標的細胞中に存在した。
実施例６：特異的抗体を使用するヒトＣＦＴＲ発現の検証
マウス、ブタ、及び培養細胞におけるヒトＣＦＴＲタンパク質検出のための抗体検証。ｈＣＦＴＲタンパク質に特異的であり、マウス及びブタ類似体と交差反応せず、かつ将来の実験のために十分な供給が利用可能である抗体を同定するために、実験を実施した。手短に言えば、学術的及び商業的供給源からの様々な抗ｈＣＦＴＲ抗体の試験は、マウスまたはブタＣＦＴＲのいずれかに対する交差反応性を伴わずに、免疫沈降及びウェスタンブロッティング（ＩＰ／ＷＢ）後のヒトＣＦＴＲタンパク質を検出することができた抗ｈＣＦＴＲ抗体の組み合わせの同定につながった。したがって、マウスまたはブタＣＦＴＲのいずれかに対する交差反応性を伴わないｈＣＦＴＲタンパク質の検出のための好適な抗ｈＣＦＴＲ抗体が、ＩＰ／ＷＢ結果に基づいて同定された。
細胞にｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後において、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ膜貫通キット（Ｍｅｒｃｋ）を使用してタンパク質ライセートを調製し、マウス抗ヒトＣＦＴＲ抗体（ＭＡ１−９３５）を使用して、ウェスタンブロッティングによって、ｈＣＦＴＲについて膜貫通画分をスクリーニングした。１６ＨＢＥ細胞からのライセートを陽性対照として使用した。図１２Ａは、ＣＨＯ及びＣＯＳ−７細胞からのデータを提示する。
文献中にＣＦＴＲ陰性として記載されるベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を、ＣＨＯ及びＣＯＳ−７細胞と同様にトランスフェクトし、タンパク質ライセートをウェスタンブロットによってスクリーニングした。以前に公開された報告とは対照的に、マウスモノクローナル抗ＣＦＴＲ抗体を使用して、ＣＦＴＲの明らかな陽性シグナルを観察することができた（図１２Ｂ）。ウェスタンブロット分析において使用される抗体の特異性を試験するために、Ｅｃｋｈａｒｄｔ Ｗｏｌｆ教授（Ｌｕｄｗｉｇ Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｕｎｉｃｈ）により快く提供されたＣＦＴＲノックアウトブタ（ＰＫＣ）からのブタ腎細胞を、トランスフェクション実験において使用し、タンパク質ライセートをＣＦＴＲ発現についてスクリーニングした。図１２Ｂにおいて明らかであった通り、ＣＦＴＲのシグナルは、ＰＫＣ細胞中で検出され得なかった。しかしながら、トランスフェクションは、いくらの検出可能なｈＣＦＴＲ発現ももたらさなかった。トランスフェクションのための対照としてルシフェラーゼを使用して、ＰＫＣ細胞は、ＣＨＯまたはＣＯＳ−７細胞と比較した場合、数倍効率が低いルシフェラーゼを発現することが分かった。トランスフェクション後、スクリーニングした細胞株のいずれにおいてもｈＣＦＴＲバンドの強度における有意差が検出され得なかったため、ｈＣＦＴＲに対するより高い感受性及び特異性を有する他のｈＣＦＴＲ 抗体に関する広範なスクリーニングを実施した。
ウェスタンブロットを介する抗体スクリーニング。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ膜貫通キット（Ｍｅｒｃｋ）、ならびに、異なる一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡからのＭＡ１−９３５、Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＰＡ，ＵＳＡからのＡＢ５９６、及びＣｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＰＡ，ＵＳＡからのＡＢ５７０）を使用する免疫ブロッティングのために使用される膜貫通画分を使用して、ヒト気管支上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）、ヒト胚性腎細胞株（ＨＥＫ）、マウス肺、及びブタ肺から、タンパク質ライセートを調製した。データを図１３の通りに要約する。
ＭＡ１−９３５は３つの種すべてにおいてＣＦＴＲを検出した一方で、ＡＢ５９６はヒト及びマウスＣＦＴＲを検出するがブタは検出せず、抗体Ｇ４４９はヒトＣＦＴＲのみを特異的に検出する。ＡＢ５７０では、マウス及びブタ試料で観察されたわずかに低い分子量のバンドが、実際にＣＦＴＲまたは非特異的産物であるかは明らかではなかった。その後の実験（データは示さず）では、ＭＡ１−９３５が、ＣＦＴＲではないバンドを認識することが分かった。したがって、一般的に、ＭＡ１−９３５の結果は、他の抗体を使用して生成された確証となる結果として見なされたが、使用された唯一の抗ＣＦＴＲ抗体がＭＡ１−９３５であった実験は、決定的とは見なされなかった。
組織試料からのｈＣＦＴＲの免疫沈降（ＩＰ−ｈＣＦＴＲ）。スクリーニングした抗体すべてがいくつかの非特異的なバンドを生み出し、ｈＣＦＴＲの特徴的なバンド形成パターン（Ｃバンドは完全グリコシル化タンパク質を表し、Ｂバンドはコアマンノシル化形態を表す）を生み出したものはなかったことを所与として、検出の感受性及び特異性を上昇させ、それによってシグナル対ノイズ比を増加させるように、ｈＣＦＴＲの免疫沈降（ＩＰ）及びウェスタンブロットによるその後の検出を確立した。
ｖａｎ Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔ ＣＦＴＲ ｉｎ Ｌｕｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０，５８７−５９５（２０１２））によって公開されたプロトコル及び抗体を使用して、Ｂｕｒｋｈａｒｄ Ｔuｍｍｌｅｒ教授（Ｍｅｄｉｚｉｎｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ）と共同で、初期ＩＰ実験を実施した。ｈＣＦＴＲを過剰発現させるヒト結腸癌細胞（Ｔ８４）を、ＩＰ実験のための陽性対照として使用した。
３つの異なる抗体（Ｒ２９、Ｒ６６／１７、及びＲ６６／１６）を使用するｈＣＦＴＲの免疫沈降と、その後のＡＢ５９６を用いた免疫検出は、以下の実施例８に記載の、ｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾルで処置されたブタの肺からのタンパク質ライセート中のｈＣＦＴＲの特異的検出をもたらした（図１４）。
ＨＧＴ５００１製剤。ＨＧＴ５００１：ＤＯＰＥ；Ｃｈｏｌ；ＰＥＧＤＭＧ２Ｋ（相対量５０：２５：２０：５（ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ））の製剤（「ＨＧＴ５００１製剤」）中のｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡを使用するエアロゾル実験をマウスにおいて実施し、ｍＲＮＡ送達の２４時間後における単離された肺からのタンパク質ライセートも、ブタライセートと同じ抗体及び条件を使用するＩＰによって分析した。しかしながら、マウス試料では、特徴的な成熟型ＣＦＴＲバンド形成パターンは検出され得なかった（図１５）。
インビトロでトランスフェクトされた細胞からのｈＣＦＴＲの免疫沈降（ＩＰ−ｈＣＦＴＲ）。ブタからの組織材料を使用する初期ＩＰ結果は、インビボの転写物送達後のｈＣＦＴＲ検出の技術的な実行可能性についての証拠を提供した。しかしながら、ＣＦＴＲを免疫沈降するに当たって使用された抗体のすべて（Ｒ２９、Ｒ６６／１７、及びＲ６６／１６）が市販されていないため、他の市販の抗体を、ＩＰ反応におけるそれらの有効性についてスクリーニングした。Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからの２つの抗体（ＭＡＢ２５０３１及びＭＡＢ１６６０）を試験した。
タンパク質ライセートをＴ８４細胞から調製し、異なる濃度のＭＡＢ２５０３１抗体を使用するＩＰ反応において５００μｇの総タンパク質を使用した。次に、免疫沈降されたｈＣＦＴＲタンパク質の量を、ＡＢ５７０（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）を使用する免疫ブロッティングによって検出した。これらの条件下のＡＢ５９６は、はるかに高いバックグラウンドをもたらしたため、さらに試験しなかった。図１６Ａで明らかになる通り、ＩＰ抗体の濃度が２μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌに増加したとき、沈降されるＣＦＴＲタンパク質の量にさらなる増加はなかった。完全にグリコシル化した形態及びコアのみグリコシル化した形態の両方（それぞれＣバンド及びＢバンド）が検出された。ウェスタンブロットにおける一次抗体としてＭＡＢ１６６０を使用して、同じ免疫沈降物をスクリーニングした。しかしながら、この抗体では、バンドＣのみが目に見えた（図１６Ｂ）。
ＭＡＢ２５０３１抗体を使用するＴ８４免疫沈降物からの内在性ｈＣＦＴＲの成功裏の検出後、トランスフェクション後のｈＣＦＴＲタンパク質を検出する目的で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞における実験を実施した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後においてタンパク質ライセートを調製し、ＢＣＡ法を使用してタンパク質量を定量した。２μｇ／ｍｌのＭＡＢ２５０３１抗体を使用して、５００μｇの総タンパク質ライセートからヒトＣＦＴＲタンパク質を免疫沈降し、続いてＡＢ５７０を使用する免疫ブロッティングを行った（図１７）。しかしながら、ＣＦＴＲは検出され得なかった。ｍＲＮＡをコードするＬａｃＺをトランスフェクトされた細胞を、ＣＦＴＲタンパク質の量に対するトランスフェクション自体の影響について、対照試料として分析した。
免疫沈降において使用される総タンパク質の量の５００μｇから８ｍｇへの増加は、ＡＢ５７０を用いた免疫検出後に検出可能な一切のｈＣＦＴＲタンパク質をもたらさなかった。別のｈＣＦＴＲ特異的抗体、ＭＡＢ１６６０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）も、免疫沈降についてスクリーニングした（図１８）。しかしながら、この抗体は、ＭＡＢ２５０３１ほど有効にＣＦＴＲを沈降しない。したがって、今後すべての免疫沈降を、ＭＡＢ２５０３１を用いて実施した。
ルシフェラーゼをマーカー遺伝子として使用する動力学実験が、ｍＲＮＡの最大発現はトランスフェクションの２４時間後において観察されることを示したため、ｍＲＮＡトランスフェクト試料中のｈＣＦＴＲ検出の欠如は、試験したｍＲＮＡの機能性の欠如を必ずしも意味しない場合がある。ｈＣＦＴＲ検出の欠如はむしろ、試験した試料中の不十分なｈＣＦＴＲ濃度、または適用された抗体の特異性の欠如に起因するものである。
ＰＥＩ製剤。以下の通り調製された２５ｋＤａの分岐状ＰＥＩを有するナノ粒子製剤（「ＰＥＩ製剤」）の、ブタへのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの送達（実施例７を参照されたい）後にｈＣＦＴＲを検出するそれらの実行可能性について、確立された条件を試験した。注射用水（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）中の適用のすぐ前に、必要量のＳＮＩＭ ＲＮＡを４ｍｌの総容積まで希釈し、１０のＮ／Ｐ比でピペットを使用して、分岐状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）の４ｍｌの水溶液に素早く添加した。この溶液を、上下に１０回ピペッティングすることによって混合し、２つの別々の４．０ｍｌの画分として、指示された噴霧器を使用して相次いでブタ肺に噴霧した。ブタ１番のルシフェラーゼを発現する肺領域からの１つの試料、及び、ルシフェラーゼ活性が検出され得ず、したがってｍＲＮＡ送達及び／または発現の欠如を示す、ブタ２番の尾状葉からの別の試料を、陽性対照及び陰性対照として選択した。これらの試料から調製されたタンパク質ライセートを、ＭＡＢ２５０３１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して免疫沈降し、ＡＢ５７０を使用してｈＣＦＴＲタンパク質を検出した。図１９に示す通り、ルシフェラーゼ発現は、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡの発現と相関性があった。ルシフェラーゼ活性が検出不可能であったブタ２番の左尾状葉からの試料は、ｈＣＦＴＲについても陰性であった（レーン１）が、ルシフェラーゼに対して陽性であったブタ１番からの試料では、ｈＣＦＴＲは検出され得た（レーン２）。
実施例７：ｍＲＮＡのエアロゾル送達
ブタの肺への被包されたｍＲＮＡエアロゾルの送達の確立。ブタ肺へのホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与を、段階的な実験手順によって確立した。第１のステップでは、制御呼吸の間に麻酔されたブタにＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ製剤を噴霧した。第２のステップでは、エアロゾル投与が完了した直後に肺を切除し、肺検体を細胞培養培地中で一晩インキュベートし、その後ＢＬＩによって肺検体にエクスビボのルシフェラーゼ測定を実施した。
Ｇｅｒｍａｎ Ｌａｎｄｒａｃｅのブタを、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから取得した。ブタは３５〜９０ｋｇの範囲の体重を有した。１頭のブタに各処置を実施した。合計５頭のブタを処置した。第１のブタ（体重９０ｋｇ）を、ＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器及び肺ホモジネート中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。第２のブタ（体重６０ｋｇ）を、ＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器及びＢＬＩによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。第３のブタ（体重８０ｋｇ）を、ＰＡＲＩ ＢＯＹジェット噴霧器及びＢＬＩによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。第４のブタ（体重６０ｋｇ）を、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器及びＢＬＩによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ／ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置した。第５のブタ（体重３５ｋｇ）を、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器及びＢＬＩによる肺検体中のルシフェラーゼ活性の測定を使用して、実施例６のＨＧＴ５００１製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。
アザペロン２ｍｇ／体重ｋｇ、ケタミン１５ｍｇ／体重ｋｇ、アトロピン０．１ｍｇ／体重ｋｇの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール３〜５ｍｇ／体重ｋｇの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて麻酔を強化するために、４〜８ｍｇ／体重ｋｇのイソフルラン（２〜３％）と１％のプロポフォールのボーラス注入によって麻酔を維持した。麻酔の持続時間はおよそ１〜３時間であった。外側耳静脈を介するペントバルビタール（１００ｍｇ／体重ｋｇ）及び塩化カリウムのボーラス注入でブタを殺処理した。肺を切除し、組織検体を様々な肺領域から採取し、続いて細胞培養培地中で一晩インキュベートした。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、管用ルミノメーター内でホモジナイズして分析するか、またはＤ−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボルシフェラーゼＢＬＩを行うかのいずれかを行った。
ブタ１番の詳細及び結果。実験の設定を図２０に示す。エアロゾル投与のために、ＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器を人工呼吸器の換気管にインライン接続した。エアロゾル投与はおよそ６０分かかり、開放系を用いた対照実験から予想されるよりも長かった。これは明らかに、メッシュ噴霧器のリザーバにおけるエアロゾルの流出によって証明される通り、噴霧の間の増加した背圧によって引き起こされた。注射用水中に１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ
ＲＮＡを含む８ミリリットルの実施例６のＰＥＩ製剤を、ＷＰ５に記載の通り調製し、２回に分けて４ｍｌずつの分量で相次いで噴霧した。細胞培養培地における一晩のインキュベーション後、様々な肺領域の切除された肺検体の組織ホモジネート中で、ルシフェラーゼ測定を実施した。肺検体の起点に従って、発現値をマッピングした（図２１）。
結果は、ブタ肺組織中の成功裏のルシフェラーゼ発現を示した。ルシフェラーゼ発現は肺の中央部分で最も高く、肺のより遠位の領域に向かって減少した。この発現パターンは、選択された換気パラメータに従って、吸入されたＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ−ＰＥＩナノ粒子の予想される堆積パターンと相関性があった。ルシフェラーゼ発現のレベルは、同じ実施例６のＰＥＩ製剤を使用するＷＰ５におけるマウス実験で観察されたものと同じ範囲内であった。
ブタ２番の詳細及び結果。ブタ２番における実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与を、ブタ１番と同様に実施したが、ルシフェラーゼ活性は、生物発光造影（ＢＬＩ）によって、肺検体で測定した。この実験を実施して、ＢＬＩによる器官培養肺検体のエクスビボのルシフェラーゼ測定を確立した。ルシフェラーゼ測定は、処置されたブタの異なる肺領域の個別の組織検体中で明らかに観察された（図２２）。この実験は、ブタ１番から得られた結果を確証した。
ブタ３番の詳細及び結果。ＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器を使用するブタ１番及び２番におけるエアロゾル投与は、いくつかの技術的難点及び不十分な噴霧時間を明らかにした。したがって、Ｔコネクタを介して換気管に接続されたＰＡＲＩ ＢＯＹジェット噴霧器を使用して、ブタ３番を処置した。エアロゾル投与は、ＥＦｌｏｗメッシュ噴霧器を用いるよりも長く（およそ８０分間）持続し、エアロゾル投与は満足のいくものではなかった。非常に低いルシフェラーゼ活性が、処置されたブタの異なる肺領域からスライスした肺試料中で検出された（図２３）。
ブタ４番の詳細及び結果。以前の実験の結果は、メッシュ噴霧器が、ジェット噴霧器よりも、選択された設定におけるブタの肺へのエアロゾル投与に好適であることを実証した。この理由のため、別のメッシュ噴霧器をこの目的のために試験し、これは、開放系で試験した際に実施例６のＰＥＩ製剤を満足に噴霧した。人工呼吸器の管にインライン接続されたＡｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して、ブタ４番を処置した。この実験では、１ｍｇのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡを、実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡとともに共送達した。これは、実施例８で実施する繰り返しの投薬に関して、共製剤化された（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ／ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ−ＰＥＩナノ粒子の製剤安定性及び噴霧可能性（ｎｅｂｕｌｉｓａｂｉｌｉｔｙ）を試験するために行った。この製剤は安定しており、噴霧との不適合性を露呈しなかった。ルシフェラーゼ活性は、処置されたブタの異なる肺領域の個別の組織検体中で明らかに観察された（図２４）。
この実験は、ブタ１番及びブタ２番から得られた結果を確証したが、より高い発現レベルが得られた。この実験は、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器が、ブタの肺への実施例６のＰＥＩ製剤の送達に最適であったことを示した。さらに、この実験は、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡとともに共送達されたときにＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡが依然として活性であったことを実証した。
ブタ５番の詳細及び結果。ブタ５番を、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を用いてエアロゾル化された実施例６のＨＧＴ５００１製剤中１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。製剤は、技術的難点なしにエアロゾル化され得た。ルシフェラーゼ活性は、処置されたブタの異なる肺領域の個別の組織検体中で明らかに観察された（図２５）。
この実験は、発現レベルは実施例６のＰＥＩ製剤で処置されたブタにおけるものよりもおよそ１５〜２０分の１まで低かったが、実施例６のＨＧＴ５００１製剤中のエアロゾル化されたＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡが、ブタ肺組織中で活性であることを示した。
結論。成功裏の結果が、実施例６のＰＥＩ製剤を用いたＡｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して得られた。４頭のブタを実施例６のＰＥＩ製剤で処置し、エアロゾル送達のための最適な実験設定を特定した。結果は、ルシフェラーゼ発現が、ブタ肺ホモジネートにおいて、そしてＢＬＩによって検出され得たことを実証した。ルシフェラーゼ発現は肺の中央部分で最も高く、肺の遠位領域ではほとんど見られなかった。Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器は、最短の送達時間とともに最良の結果をもたらすことが分かった。これらの実験に従って、別のブタを、実施例６のＨＧＴ５００１製剤中に被包されたＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。ルシフェラーゼ発現はブタ肺のいくつかの部分で明らかに観察されたが、発現レベルは実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡについてのものよりも低かった。このワークパッケージの結果は、大型の前臨床動物モデルとしてのブタの肺へのＳＮＩＭ ＲＮＡ送達が、ポリマー（例えば、ＰＥＩ）ベースの製剤及び脂質（例えば、ＨＧＴ５００１）ベースの製剤などの様々な製剤を使用して実行可能であったことを明らかに実証した。この実施例の結果は、ヒト患者における状況を綿密に模倣する大型動物の肺への、臨床実践で使用される噴霧器による成功裏のＳＮＩＭ ＲＮＡ送達についての概念の証拠を提供した。
実施例８：インビボのｍＲＮＡ送達（週用量）
治験を実施し、ブタにおける週１回のエアロゾル適用の実用性を評価した。肺疾患の誘導を伴わず（等級２より高い有害事象の存在なし）に１週間の間隔で修飾ｍＲＮＡの３回のエアロゾル適用を実施することとして、実用性を定義した。追加の目的は、ｉ）動物の苦痛の等級、ｉｉ）ブタの実験的または臨床的査定の間に生じる有害事象、ならびにｉｉｉ）誘導されるタンパク質（ルシフェラーゼ及びｈＣＦＴＲ）の測定を評価するためであった。
ブタの肺へのＰＥＩ製剤中のＳＮＩＭ ＲＮＡの繰り返しのエアロゾル投与を確立した。２頭のブタの群を、実施例６のＰＥＩ製剤中のＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ／ｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡを用いて、弱く間隔で１回、２回、または３回処置した。２頭の無処置ブタを対照とした。処置の２４時間後に肺を切除し、ＢＬＩによって単離された肺検体中のエクスビボのルシフェラーゼ活性を測定した。ＩＰ／ＷＢを使用してｈＣＦＴＲタンパク質の発現を分析した。細胞レベルでのルシフェラーゼ発現の検出のため、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を実施した。血清中の炎症性サイトカイン及び血液化学の測定によって、毒性を調査した。肺試料に病理組織診断を実施した。研究プロトコル「パイロットプロジェクト：ブタにおける嚢胞性線維症のエアロゾル療法のための動物モデルを確立するための修飾ｍＲＮＡの繰り返しの適用（Ｐｉｌｏｔ ｐｒｏｊｅｃｔ： Ｒｅｐｅａｔｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｅｒｏｓｏｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐｉｇｓ）」は、実験の開始前に地方当局によって承認された（動物実験許諾番号０−０４５−１２）。
実験設計。雌で噴霧時におよそ６週齢（平均体重約２５ｋｇ）のブタ、Ｇｅｒｍａｎ Ｌａｎｄｒａｃｅを、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ブタをランダム化し、以下のスキーム（表３）に従って処置した。各２頭のブタの処置群は以下の通りであった。
０群−処置なしの対照群
Ｉ群−１日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与。
ＩＩ群−１日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の２ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与、かつ８日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与。
ＩＩＩ群−１日目及び８日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の２ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ（６３７９−１８６）のエアロゾル投与、１５日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与。
処置のためのスキーム及び各群の評価を表３に示す。例示される治療介入に加えて、ブタの身体検査を日常的に行った。
実験手順。アザペロン２ｍｇ／体重ｋｇ、ケタミン１５ｍｇ／体重ｋｇ、アトロピン０．１ｍｇ／体重ｋｇの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール３〜５ｍｇ／体重ｋｇの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて１％のプロポフォールの連続的な静脈内注入で麻酔を維持した。換気パラメータを呼気終末二酸化炭素と一致させ、必要に応じて調整した。パルスオキシメトリ、カプノグラフィ、直腸温プローブ、及び反射状態を使用して、麻酔、呼吸、及び心血管のパラメータを連続的に監視した。動物は、１０ｍｌ／ｋｇ／時で平衡電解液の注入を受けた。麻酔の持続時間はおよそ８０〜１２０分間であった。十分な自発呼吸の開始後に、ブタを抜管した。鎮静後、外側耳静脈を介する１００ｍｇ／体重ｋｇのペントバルビタールのボーラス注入でブタを殺処理した。肺を切除し、スライスされたおよそ１ｃｍ厚の組織検体を様々な肺領域から採取し、続いて細胞培養液中でのインキュベーションを行った。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、Ｄ−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボのルシフェラーゼＢＬＩを行った。ＢＬＩによる処置群におけるルシフェラーゼ発現。
０群（処置なしの対照群）については、ルシフェラーゼ活性は、肺スライスにおいて観察されなかった（図２６）。
Ｉ群（実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与）については、ルシフェラーゼ活性は、１回処置されたブタ３番及び６番の肺検体中で明らかに検出された（図２７）。ルシフェラーゼ発現は、肺の中央部分で最も高かった。
ＩＩ群（１日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の２ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与、かつ８日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与）については、ルシフェラーゼ活性は、２回処置されたブタ４番及び８番の肺検体中で明らかに検出された（図２８）。ルシフェラーゼ発現は、肺の中央部分で最も高かった。測定日の停電及びＢＬＩシステムに結果として生じた技術的問題のため、試料を測定前に細胞培養培地中でさらに１０時間保管したことを考慮すべきである。
ＩＩＩ群（１日目及び８日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の２ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与、１５日目に実施例６のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル投与）については、ルシフェラーゼ活性は、３回処置されたブタ１番及び２番の肺検体中で明らかに検出された（図２９）。ルシフェラーゼ発現は、肺の中央部分で最も高かった。
ＳＮＩＭ ＲＮＡ−ＰＥＩナノ粒子の特性。噴霧前に、ＳＮＩＭ ＲＮＡ−ＰＥＩ製剤の粒径及びゼータ電位を測定した（表Ｘ１）。ＳＮＩＭ ＲＮＡ−ＰＥＩナノ粒子は、２５〜３７ｎｍの範囲の粒径及び３０〜４９ｍＶの範囲のゼータ電位をもって再現性よく形成され得る。
ＩＨＣによる処置群におけるルシフェラーゼ発現。ＢＬＩにより陽性であった肺スライス（Ｓｏｐｈｉｓｔｏｌａｂ ＡＧ，Ｅｇｌｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の組織検体にＦＦＬのためのＩＨＣを実施し、無処置ブタの肺組織及び陽性対照としてのルシフェラーゼ陽性マウス腫瘍組織と比較した。予想された通り、強いシグナルがルシフェラーゼ陽性マウス腫瘍組織中に見られたが、無処置ブタの肺組織は特異的染色を示さなかった。明らかに検出可能な染色パターンが、３回の処置を受けたブタ１番の肺組織中で観察され得た。ＦＦＬ発現は、大小の気道の気管支上皮中で最も顕著であった（図３０）。
ＩＰ／ＷＢによる処置されたブタの肺組織中のｈＣＦＴＲタンパク質の検出。３回処置されたブタ１番の高度にＢＬＩ陽性の肺組織に、ｖａｎ Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０，５８７−９５（２０１２）によって説明されるプロトコルに従って、ｈＣＦＴＲのＩＰ／ＷＢを行った（図３１）。成熟型複合グリコシル化ｈＣＦＴＲが、分散したいわゆるＣバンドとして現れる。マンノースが豊富なｈＣＦＴＲが、より高密度ないわゆるＢバンドとして現れる。明らかに、ｈＣＦＴＲ発現が、Ｔ８４陽性対照細胞、及び実施例６のＰＥＩ製剤中のｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置されたブタ１番の肺組織中で観察される。ｈＣＦＴＲタンパク質の発現は、無処置ブタでは観察されなかった。同一のプロトコル（ｖａｎ Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ Ａら、上記参照）を使用する公開された研究によるヒト肺組織中のｈＣＦＴＲタンパク質発現の比較は、ｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭエアロゾル処置後のブタ肺組織中のｈＣＦＴＲの発現が、健常なヒトの肺におけるｈＣＦＴＲ発現と同様であったことを示唆した。
この所見は、処置されたブタの肺におけるＩＰ／ＷＢによるｈＣＦＴＲタンパク質の検出のために異なる組の抗体を使用することによって、さらに確証された（実施例６を参照されたい）。ブタ１番のルシフェラーゼを発現する肺領域からの１つの試料、及び、ルシフェラーゼ活性が検出され得ず、したがってｍＲＮＡ送達及び／または発現の欠如を示す、ブタ２番の尾状葉からの別の試料を、陽性対照及び陰性対照として選択した。これらの試料から調製されたタンパク質ライセートを、ＭＡＢ２５０３１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して免疫沈降し、ＡＢ５７０を使用してｈＣＦＴＲタンパク質を検出した。図３２に示す通り、ルシフェラーゼ発現は、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡの発現と相関性があった。ルシフェラーゼ活性が検出不可能であったブタ２番の左尾状葉からの試料は、ｈＣＦＴＲについても陰性であった（レーン１）が、ルシフェラーゼに対して陽性であったブタ１番からの試料では、ｈＣＦＴＲは検出され得た（レーン２）。
毒性：肺試料の予備的組織学的査定。３頭の動物の安楽死後に取った肺の試料の組織学的査定を実施した。パラフィン切片に包埋した後、形態学的評価のために肺試料をＨｅｍａｔｏｘｉｌｉｎｅ−Ｅｏｓｉｎｅで染色した。所見は３頭のブタの試料全体で一貫しており、これらのうち２つ（ブタ１番及びブタ２番）は、３回のエアロゾル適用を受け、第３（ブタ７番）はエアロゾル適用なしの無処置対照であった。
毒性：苦痛。ブタ２番及びブタ１番のみ、第１の処置後２〜４日目に苦痛の軽度の兆候を示した。したがって、３週間以内の３回のエアロゾル適用は、軽度の苦痛しか引き起こさなかった。
毒性：有害事象。有害事象（ＡＥ）の種類及び頻度を、ブタの検査パラメータ（血液、ＭＢＳ、及びＢＡＬ）ならびに身体検査（この治験では二次的目的として定義される）によって分析した。
研究プロトコルによって定義される時間点において、血清及び全血試料を取った。器官特異性病理（血液、骨髄、肝臓、筋肉、及び腎臓）を示すことを示唆する１２の代表的なパラメータ（ヘモグロビン、ヘマトクリット、ＡＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＫ、ビリルビン、クレアチニン、グルコース、カリウム、血小板、及び白血球細胞）を選択し、ＶｅｔＭｅｄＬａｂ，Ｌｕｄｗｉｇｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た試験結果をＶＣＯＧ、バージョン２０１１に従って分類した。
結果は、重度の有害事象（ＡＥ）がブタにおいて観察されなかったことを示した（等級３、４、または５のＡＥが重度と見なされたであろう）。実施例６のＰＥＩ製剤中のＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル適用後に検査パラメータの障害はなかった。いくつかのパラメータ（例えば、ＣＫまたは肝臓酵素）のわずかな変化については、これらの変化は、むしろ実験手順自体（例えば、筋肉内注射及び麻酔）によって引き起こされた可能性が高い。また、繰り返しの適用からの陰性の効果は検出され得なかった（第３の適用後であっても、３群のブタはＡＥ等級２よりも高いＡＥを示さない）。ＡＥ等級１または２でさえ稀であり、実施例６のＰＥＩ製剤中のＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル適用との相関性を示さなかった。
繰り返しの血液試料の他に、２つの他のパラメータを査定し、肺における病理学的過程：ｉ）安楽死後に取られる気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、及びｉｉ）微生物試料（ＭＢＳ）（麻酔の間に取られるスメア形態気管）を評価した。剖検の間に各ブタからＢＡＬＦを取り、さらなる検査のために−８０℃で保管した。各エアロゾル適用前に気管のスメアを取り、微生物学的に検査した。これらの検査は、ボルデテラ‐ブロンキオスペクチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｏｓｐｅｃｔｉｃａ）（ブタの呼吸器の一般的な病原体）及び大腸菌を含む、病原体の広範なスペクトルを明らかにした。ブタを、ツラスロマイシンの筋肉内注射（１ｍｌのＤｒａｘｘｉｎ（登録商標）１０％）で１回処置した。
身体検査。検査パラメータに加えて、エアロゾル適用の間の観察期間中にブタの身体検査を実施した（詳細は研究プロトコルの附属書類１の１．１．２及び附属書類４を参照されたい）。ＡＥの記述、等級分け、及び属性の割り当てのためのシステムは、ブタに関しては治療介入またはその他のいずれについても定義されていないため、イヌ及びネコのために確立された一般的な毒性基準（ＣＴＣ）システム（ＶＯＣＧによって２０１１年に公開された）を使用した。検査パラメータを等級分けするために、種特異性ＵＬＮ（正常上限）及びＬＬＮ（正常下限）を使用した。以下の６つのＡＥ分類内で臨床的査定を行った：
（１）アレルギー性／免疫性事象、（２）肺性／呼吸性、（３）体質的臨床兆候、（４）皮膚科学的／皮膚、（５）胃腸管系、及び（６）肺性／呼吸性。
結果は、ブタにおいて重度のＡＥが観察されなかった（等級３、４、または５がない）ことを示した。ＰＥＩ製剤中のＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル適用後に身体検査によって査定されたパラメータの障害はなかった。３群の２頭のブタは、呼吸パラメータのうちの３つにおいて等級１及び２のＡＥ（気管支痙攣／喘鳴、喉頭水腫、及び呼吸困難）を示したが、これらの軽度または中等度の所見は、１日もしくは２日に制限された。これらの観察は、これら２頭のブタにおいて第１の麻酔／挿管／エアロゾル適用の後のみに生じたが、これら２頭のブタもしくはいずれの他のブタにおいても、第２または第３のエアロゾル適用後には生じなかったため、これらの所見が調査中の物質によって引き起こされることはありそうにない。
結論。この実施例の結果は、ＦＦＬ及びｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡをコードするＰＥＩ製剤が、各処置サイクル後の活性の損失なしに、かつ有害事象なしに、ブタの肺に繰り返し成功裏にエアロゾル化され得ることを実証した。ルシフェラーゼ発現は肺組織の中央部分に見られたが、遠位の肺領域ではほとんど検出されなかった。ルシフェラーゼ発現の領域パターンは、制御呼吸のために使用される設定に従って、実施例６のＰＥＩ製剤の予想される堆積パターンと相関性があった。選択された肺試料形態処置されたブタへの免疫組織化学的検査は、主に大小の気道の気管支上皮中のルシフェラーゼ発現を示した。ＩＰ／ＷＢは、無処置ブタの肺及びルシフェラーゼ陰性肺検体では不在であった、処置されたブタの肺における成熟型ヒトＣＦＴＲの複合グリコシル化Ｃバンドの発現を明らかに実証した。ｈＣＦＴＲタンパク質検出のための同一のプロトコルを使用する公開された報告と比較した場合、ｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡエアロゾル処置後のブタ肺組織中のｈＣＦＴＲの発現は、健常なヒトの肺におけるｈＣＦＴＲ発現に匹敵した。有害事象の等級１または２は非常に稀であり、ＰＥＩ製剤中のＳＮＩＭ ＲＮＡのエアロゾル適用との相関性を示さなかった。したがって、ｈＣＦＴＲタンパク質の発現は、ＳＮＩＭ ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡで処置されたブタの肺において成功裏に実証された。
実施例９：シグナルペプチドを含有するＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡ
この実施例は、ＣＦＴＲタンパク質が、シグナルペプチドをコードする配列を有するＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡから有効に発現され得ることを実証する。
伝令ＲＮＡ合成。実験のため、Ｃ末端Ｈｉｓ１０タグ付きコドン最適化ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０）（配列番号１５）、成長ホルモンシグナル配列リーダーを有するコドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＧＨ−ＣＯ−ＣＦＴＲ）（配列番号１６）、及びコドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＣＯ−ＣＦＴＲ）（配列番号１７）ＳＮＩＭ ＲＮＡを、標準的な方法を使用してプラスミドＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって合成した。細胞及びＣＦＴＲトランスフェクション。ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５−０９２）内で成長させた。トランスフェクションの前日に、５０〜６０％コンフルエンスの６ウェルプレートに細胞をプレーティングし、正常組織培養条件下（５％のＣＯ２、９５％の空気の加湿雰囲気中で３６℃）でインキュベートした。トランスフェクションのための調製において、６０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８０１９）を、ＯｐｔｉＭｅｍ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号３１９８５−０６２）中で希釈し、穏やかにボルテックスした。実験のため、４μｇのＣＯ−ＣＦＴＲ、ＧＨ−ＣＯ−ＣＦＴＲ、またはＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ＳＮＩＭ ＲＮＡのいずれかを、９００μｌのＯｐｔｉＭｅｍ培地中で希釈した。このｍＲＮＡを、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）に直ちに添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレーティング培地を、穏やかに吸引し、１ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ低血清培地及び３００μｌの各ｍＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）複合体のそれぞれと交換した。細胞を標準的な組織培養条件下でインキュベートした。
ウェスタン分析。およそ４８のトランスフェクション後、細胞をそれぞれのプレートから除去し、溶解させた。全細胞ライセートに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を行い、ウェスタンブロットによってプローブした。図３３に示す通り、ＣＯ−ＣＦＴＲ、ＧＨ−ＣＯ−ＣＦＴＲ、及びヒトＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ｍＲＮＡのトランスフェクション後、抗ＣＦＴＲ（Ａ＆Ｂ）または抗Ｈｉｓ（Ｃ）抗体によって、ヒトＣＦＴＲタンパク質の強い発現が検出された（図３３）。
実施例１０：ＣＦＴＲノックアウトマウスへのインビボのＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡの送達
気管内投与されたｍＲＮＡが充填されたナノ粒子を介して産生されたヒトＣＦＴＲタンパク質の分析。ＣＦＴＲ ＫＯマウスを使用して、すべての研究を実施した。ＰＡＲＩ Ｂｏｙジェット噴霧器を使用して、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ製剤またはビヒクル対照を導入した。マウスを屠殺し、所定期間後、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を可能にするため、生理食塩水で灌流した。
伝令ＲＮＡ合成。この実施例では、Ｃ末端Ｈｉｓ１０タグ付きコドン最適化ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０）ＳＮＩＭ ＲＮＡ、及びコドン最適化ＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡを、プラスミドＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって合成した。
ＰＥＩ製剤。この手法では、ＣＦＴＲ ノックアウトマウスの肺におけるＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡの送達及び発現を、ポリマー及び脂質ベースのナノ粒子製剤の両方を使用して評価した。以下の通り調製した２５ｋＤａの分岐状ＰＥＩを有するポリマーナノ粒子製剤。注射用水（Ｂｒａｕｎ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）中の適用のすぐ前に、必要量のＳＮＩＭ ＲＮＡを４ｍｌの総容積まで希釈し、１０のＮ／Ｐ比でピペットを使用して、分岐状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）の４ｍｌの水溶液に素早く添加した。この溶液を、上下に１０回ピペッティングすることによって混合し、２つの別々の４．０ｍｌの画分として、指示された噴霧器を使用して相次いでマウス肺に噴霧した。
ｃＫＫ−Ｅ１２製剤。脂質ベースのナノ粒子の実験のために、ｃＫＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧＤＭＧ２Ｋ（相対量５０：２５：２０：５（ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ：ｍｇ）の製剤中のＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ＳＮＩＭ ＲＮＡを使用して、脂質製剤を生成した。この溶液を、指示された噴霧器を使用してマウス肺に噴霧した。
ヒトＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡの噴霧（エアロゾル）投与。ＣＦＴＲ試験材料を、ＰＡＲＩ Ｂｏｙジェット噴霧器を介する単一のエアロゾル吸入によって投与した（最大８ｍＬ／群の名目用量容積）。試験材料を、動物の全群を収容するボックス（ｎ＝４）に送達し、酸素流及び捕捉システムに接続した。
ヒトＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡの投与。上記の方法でＣＦＴＲ ｍＲＮＡを調製した。４匹のＣＦＴＲ ノックアウトマウスをエアロゾルチャンバボックスに配置し、およそ１時間にわたる噴霧（Ｐａｒｉ Ｂｏｙジェット噴霧器）を介して、２ｍｇの全コドンを最適化した無修飾ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（配列番号３のコード配列を含む）に曝露した。曝露の２４時間後にマウスを屠殺した。
安楽死。動物を、用量投与（±５％）後の代表的な時間にＣＯ２窒息によって安楽死させ、続いて開胸及び全採血を行った。心穿刺を介して全血（最大の入手可能な容積）を採取し、廃棄した。
灌流。全採血後、全動物は、生理食塩水を用いた心臓灌流を受けた。手短に言えば、灌流のために左心室の管腔内に置かれた生理食塩水を含む１０ｍＬのシリンジに取付けられた２３／２１ゲージの針を挿入することによって、全身の心臓内灌流を実施した。右心房を切開し、灌流液の排液口を提供した。穏やかで安定した圧力をプランジャーに適用し、針を心臓内に配置した後、動物を灌流した。フラッシング溶液が身体を飽和し、手順が完了したことを示すように、出てくる灌流液が澄んで（目に見える血液がなく）流れるとき、十分な流量のフラッシング溶液を確保した。
組織採取。灌流後、全動物の肺（右及び左）を収集した。両方（右及び左）の肺を液体窒素中で即座に凍結し、名目上−７０℃で別々に保管した。
ＣＦＴＲノックアウトマウスにおけるＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡからのヒトＣＦＴＲの発現。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ処置マウス肺から採取した組織ライセートのウェスタンブロット分析によって、ＣＦＴＲ発現を検出した。脂質ベース及びポリマーベースの製剤の両方について、成熟型「Ｃ」バンドは、すべての処置マウスの左及び右の肺において検出された（図３４）。実施例９に記載の、ＨＥＫ ２９３ＴヒトＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０陽性細胞から採取したライセートとの比較によって、成熟型「Ｃ」バンドの発現を確認した。対照的に、検出可能なシグナルは、野生型の無処置対照マウスから採取したライセート中で観察されなかった（図３４）。まとめると、これらのデータは、ポリマー及び脂質ベースの製剤（例えば上記のｃＫＫ−Ｅ１２製剤など）の両方が、例えば、吸入を介するＣＦＴＲ ｍＲＮＡの肺送達に有効であり、かつ、一度送達されると、コドン最適化ＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、ヒトＣＦＴＲタンパク質を有効に発現し得ることを示唆する。
実施例１１：インビボの用量増大研究
ブタの肺へのＰＥＩで被包されたｍＲＮＡのエアロゾル送達の用量増大。ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ＳＮＩＭ ＲＮＡと、コドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＣＯ−ＣＦＴＲ）ＳＮＩＭ ＲＮＡとの組み合わせの、様々な濃度でのブタ肺へのエアロゾル投与を、段階的な実験手順によって確立した。第１のステップでは、制御呼吸の間に麻酔されたブタにＦＦＬ／ＣＯ−ＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ製剤を噴霧した。第２のステップでは、エアロゾル投与が完了した２４時間後の鎮静後に、外側耳静脈を介するペントバルビタール（１００ｍｇ／体重ｋｇ）及び塩化カリウムのボーラス注入によって、動物を屠殺した。肺を切除し、およそ１ｃｍ厚の組織検体にスライスした。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、Ｄ−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボのルシフェラーゼＢＬＩを行った。ＢＬＩの後、病理組織診断、免疫組織化学的検査、ならびにインサイツのハイブリダイゼーションのために、ルシフェラーゼ陽性領域及びルシフェラーゼ陰性領域からの試料を取った。残留する検体を液体窒素中でショック凍結し、その後、ＩＰ／ＷＢ及び酵素結合免疫吸着検定法による分析まで−８０℃で保管した。
伝令ＲＮＡ合成。この実施例では、コドン最適化ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＯ−ＣＦＴＲ）ＳＮＩＭ ＲＮＡ、コドン最適化ＦＦＬ ｍＲＮＡ ＳＮＩＭ ＲＮＡを、標準的な方法を使用してプラスミドＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって合成した。
実験設計。Ｇｅｒｍａｎ Ｌａｎｄｒａｃｅのブタを、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから取得した。ブタは３５〜９０ｋｇの範囲の体重を有した。可変性を制御するために、年齢及び体重をマッチさせたブタの両方を使用して、この研究を設計した。４アーム研究の各実験群について、６頭のブタ（雄３頭及び雌３頭）の単一のコホートを確立した。第１のコホートを、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して投与された注射用水（ＷＦＩ）単独で処置した。第２のコホートを、Ａｅｒｏｎｅｂメッシュ噴霧器を使用して、以下に記載のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのコドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＣＯ−ＣＦＴＲ）ＳＮＩＭ ＲＮＡの溶液で処置した。第３のコホートは、以下に記載のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び５ｍｇのコドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＣＯ−ＣＦＴＲ）ＳＮＩＭ ＲＮＡを受けた。第４のコホートを、以下に記載のＰＥＩ製剤中の１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１０ｍｇのコドン最適化ヒトＣＦＴＲ（ＣＯ−ＣＦＴＲ）ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置した。処置のためのスキーム及び各群の評価を以下の表４に示す。
ｍＲＮＡ−ＰＥＩ製剤。以下に記載の例示的な標準化された製剤化手順を、動物の処置のすぐ前に実施した。
８ｍＬ：３ｍＬの容積の注射用水及び３ｍＬのＲＮＡ原液（ｃ：水中１ｍｇ／ｍＬ；１．５ｍＬのＦＦＬ ｍＲＮＡ＋１．５ｍＬのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）中、１ｍｇのｈＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ及び１ｍｇのＦＦＬ ＳＮＩＭ ＲＮＡ Ｎ／Ｐ １０を含有するポリプレックスの調製のための例示的な方法を、１５ｍＬのファルコン管に充填した。第２のファルコン管において、５．６１ｍＬの注射用水を０．３９ｍＬのｂｒＰＥＩ原液（ｃ：水中１０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。２つの２０ｍＬのシリンジを、混合装置内に固定した。それらの各々を、管を介して針に接続した。シリンジポンプの取水機能を使用して、一方のシリンジをＲＮＡ溶液で、そして他方をＰＥＩ溶液で充填した。（設定：直径：２０．１ｍｍ、流速：５ｍＬ／分、容積：５．９ｍＬ）。針を除去し、管を混合弁に接続した。ＲＮＡ溶液を含有するシリンジを、弁の傾斜した位置に接続することが重要であった。出口の直径を制御するため、針を接続した。シリンジポンプの注入機能を使用して混合を実施した（設定：直径：２０．１ｍｍ、流速：４０ｍＬ／分、容積：５．８ｍＬ）。再現可能な多分散指数を達成するため、混合の間に試料を手動で分画した。流速が安定するまで（１００〜２００μＬ）の初めの数μＬ、及び気泡をしばしば含有する最後の数μＬを、別々の管に採取した。この混合物を、ポリプレックス形成のために室温で３０分間インキュベートし、その後、氷上で保管した。異なる用量のために、表５に示す通りパラメータを修正して適合させた。
噴霧される複合体の機能性を調べるためのＨＥＫ細胞のトランスフェクション。噴霧後、複合体（８０μｌ）のアリコートを使用して、ＨＥＫ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、１×１０６細胞を６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクション当日、細胞から培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、８０μｌの複合体を、９２０μｌの血清を含まないＭＥＭ培地とともにウェル毎に添加した。各複合体について、３つの複製ウェルを調製した。この細胞を、標準的な細胞培養条件下で、複合体とともに４時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、培地を含有する複合体を除去し、ＭＥＭ培地を含有する血清（１ｍｌ）をウェル毎に添加した。プレートを、標準的な細胞培養条件下でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に、ホモジネーションステップを除いて、動物組織のために使用したものと同じプロトコル及び緩衝液を使用して、タンパク質ライセートを調製した。３つのウェルからの細胞を、分析のために貯蔵した。Ｒ２４．１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた免疫沈降、ならびに２１７、４３２、及び５９６抗体（すべてＣｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＰＡ，ＵＳＡから）の組み合わせを用いたウェスタンブロットを使用して、ヒトＣＦＴＲの発現を検出した。ブタにおいて噴霧された複合体のすべてについて、ｈＣＦＴＲが検出され得た（図５４〜５７を参照されたい）。
エアロゾル適用。エアロゾル（ＷＦＩ単独４４ｍｌ；ＷＦＩにおける修飾ｍＲＮＡ ＰＥＩ製剤：８、２４、及び４４ｍｌ）を、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）メッシュ噴霧器を介して、麻酔されたブタに噴霧し吸入させた。アザペロン２ｍｇ／体重ｋｇ、ケタミン１５ｍｇ／体重ｋｇ、アトロピン０．１ｍｇ／体重ｋｇの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール３〜５ｍｇ／体重ｋｇの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて麻酔を強化するために、４〜８ｍｇ／体重ｋｇのイソフルラン（２〜３％）と１％のプロポフォールのボーラス注入によって麻酔を維持した。麻酔の持続時間はおよそ１〜３時間であった。エアロゾル化完了の２４時間後、外側耳静脈を介するペントバルビタール（１００ｍｇ／体重ｋｇ）及び塩化カリウムのボーラス注入でブタを屠殺した。肺を切除し、組織検体を様々な肺領域から採取した。保管した試料に、生物発光、病理組織診断、ＩＰ／ウェスタンブロット、及び酵素結合免疫吸着検定法などの異なる査定法を行った。
生物発光分析。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、管用ルミノメーター内でホモジナイズして分析するか、またはＤ−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボルシフェラーゼＢＬＩを行うかのいずれかを行った。データは、コホート１（ＷＦＩビヒクル対照）からの対照肺組織試料と比較した場合、コホート２〜４（それぞれ１ｍｇ、５ｍｇ、及び１０ｍｇ）のそれぞれについて、強い生物発光シグナルが観察されたことを示す（図３５〜３８）。
ウェスタンブロット及び免疫組織化学的検査によるＣＦＴＲ発現分析。ＦＦＬ陽性組織試料を切除し（コホート内の各ブタにつき最低１０の試料）、ヒトＣＦＴＲについて、免疫沈降／ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）、及び免疫組織化学的検査によって分析した。手短に言えば、タンパク質ライセートを、ブタ肺から以下の通りに調製した：３００〜４００ｍｇの肺組織を分析に使用した。ＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＡ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、参照：６９１０−５００）及びホモジナイザー「ＦａｓｔＰｒｅｐ２４」（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して、プロテアーゼ阻害剤を含有する基礎緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中で、組織をホモジナイズした。この全組織ミックスを、新たな２ｍｌの安全錠の予冷したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移動させ、２５μｌのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ：Ｉ６１２５）及び１μｌのＯｍｎｉクリーブ（Ｏｍｎｉクリーブ緩衝液中で１：５に希釈）（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ：ＯＣ７８１０Ｋ）を添加した。次にこの試料を、氷上で５分間インキュベートし、その後、２６μｌの１０％のＳＤＳ溶液を添加した。４℃で６０分間、シェーカーで試料をさらにインキュベートした。インキュベーション後、２６０μｌの溶解緩衝液（８５０μｌの基礎緩衝液＋１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５％のデオキシコール酸ナトリウム）を試料に添加し、４℃で９０分間、シェーカーでそれらをインキュベートした。最後に、タンパク質ライセートを、１０〜２０分間４℃で、１３，０００ｒｐｍにおいて遠心分離し、上清を新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移動させた。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を定量した。１０ｍｇの総タンパク質を含有するように試料を等分し、基礎緩衝液を用いて最終容量を試料当たり１ｍｌに調整した。実施例６に提示されるデータに基づいて、抗体Ｒ２４．１を使用するＣＦＴＲの免疫沈降を行い、その後、Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＰＡ，ＵＳＡから得た３つの異なる抗体（抗体２１７、４３２、５９６）の３重の組み合わせを使用するＣＦＴＲのウェスタンブロット免疫検出を行った。異なる動物間の群内の可変性、及びＣＦＴＲ発現の可変性を制御するため、１５０ｋＤａに対応するタンパク質の大きさの標準におけるマーカーバンドを基準として設定し、異なる群のバンド強度をこの値に正規化した。図３９に示す通り、コホート１の対照ブタから分析された組織試料の１６％のみが、基線を超えるＣＦＴＲ発現レベルをもたらした。対照的に、それぞれ５ｍｇ及び１０ｍｇの処置群を表すコホート３及び４は、それぞれ、それらの肺組織試料の３０％超が、基線よりも高いＣＦＴＲ発現レベルに陽性の試験結果をもたらした（図３９）。さらに、コホート３及び４において観察されたＣＦＴＲ発現の増加は、対照のものよりもほぼ２倍高かった。
ＣＦＴＲ陽性の気管支及び細気管支の定量によって、ＣＦＴＲ免疫組織化学的検査の分析を実施した。少なくとも１つの上皮細胞が明らかな膜局在型ＣＦＴＲシグナルを示す上皮細胞層において検出された場合、気管支／細気管支を陽性と見なした。「陽性」試料の代表的な画像を図４０に示す。ＣＦＴＲを利用する単一の抗体、またはそれぞれ最大３つの抗体の組み合わせに対する、利用可能な抗体の特異性を査定することによって、ＣＦＴＲ免疫組織化学的検査の条件を最適化した。明らかなＣＦＴＲ特異的シグナルが、抗体５９６のインキュベーション後に観察された。データは、ＣＦＴＲ陽性上皮細胞が４つのコホートすべての肺組織切片において検出され、免疫組織化学的検査手順によるヒト及びブタのＣＦＴＲの検出を示したことを実証する（図４１及び４５）。低（図４２）、中（図４３）、及び高（図４４）のＣＦＴＲ発現レベルがコホート３について観察されたが、総合的な所見は、コドン最適化ヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡの５ｍｇの処置が、ビヒクル対照と比較してより大きな数のＣＦＴＲ陽性細胞及び総合的なＣＦＴＲシグナル強度をもたらしたことを実証する。データは、１０ｍｇの処置後のＣＦＴＲ発現のさらなる強化も示し、したがって、明らかな用量応答効果を実証する（図４５）。ＣＦＴＲ陽性の気管支／細気管支の絶対数及び相対数の定量は、これらの所見をさらに支持し、ビヒクル対照と比較して、５または１０ｍｇのヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡで処置された動物における有意に高い数を明らかにする（図４６）。ヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡでの処置後のＣＦＴＲ発現レベルにおける総合的な上昇を示す。
インサイツのハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によるＣＦＴＲ発現分析。ＦＦＬ陽性組織試料を切除し（コホート内の各ブタにつき最低１０の試料）、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（高度細胞診断）「ＺＺ」プローブ技術を使用する手動のインサイツのハイブリダイゼーション分析を行った。コドン最適化ヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡ（配列番号１７）のコドン最適化配列に基づいて、プローブを生成した。手短に言えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッセイは、スライド上に乗せたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中の細胞当たりの単一のＲＮＡ分子を可視化するように設計された、インサイツのハイブリダイゼーションアッセイである。各包埋組織試料を、製造者のプロトコルに従って前処置し、標的特異的なヒトＣＦＴＲ特異的ＲＮＡプローブとともにインキュベートした。ｈＣＦＴＲプローブは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、及びサルとの交差反応性をもって、ＣＦＴＲに結合することが示された。結合すると、一連の６回の連続増幅を通して、ブローブをシグナル増幅分子のカスケードとハイブリッド形成させる。次にこの試料を、シグナル増幅カセットに特異的なＨＲＰ標識化プローブで処置し、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して、染色体可視化によってアッセイした。ユビキチンＣに特異的なプローブを陽性対照として使用し（図４７Ａ及び４８Ａ）、一方でｄａｐＢを陰性対照として使用した（図４７Ｂ及び４８Ｂ）。陽性ＣＦＴＲシグナルを、無処置、及びビヒクル対照で処置したブタの肺組織のものと比較した（図４９Ａ及びＢ）。染色した試料を、標準的な明視野顕微鏡下で可視化した。データは、１ｍｇのコドン最適化ヒトＣＦＴＲ ＳＮＩＭ ＲＮＡを用いた処置が、ビヒクル対照と比較した場合、コホート２の右（Ａ）及び左（Ｂ）の肺組織の両方におけるＣＦＴＲ発現の劇的な増加をもたらしたことを実証する（図４９及び５０Ａ＆Ｂ）。さらに、コホート３及び４について分析された右（Ａ）及び左（Ｂ）の肺試料において観測された劇的な増加染色によって実証される通り、５ｍｇ及び１０ｍｇの処置群について、ＣＦＴＲ発現のさらなる増加が観察された（図５１及び５２Ａ＆Ｂ）。まとめると、これらのデータは、吸入を介するｍＲＮＡの有効な送達、ならびに肺の両方の葉及びそれらの様々な組織におけるヒトＣＦＴＲの発現を強く支持する。
結論。結果は、ルシフェラーゼ及びＣＦＴＲ ｍＲＮＡの両方が、肺組織にインビボで有効に送達され得ることを実証した。ルシフェラーゼ発現は、肺の右及び左の葉の両方における異なる領域から採取された様々な組織試料全体で観察された。したがって、噴霧はｍＲＮＡの投与に有効な手法であり、かなり均一な分布をもたらすという示唆。さらに、ルシフェラーゼに加えて、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡも肺に効率的に送達され、強化されたタンパク質発現をもたらした。ＩＰ−ＷＢ、免疫組織化学的検査、及びインサイツのハイブリダイゼーションによって、発現及びタンパク質活性を確認した。各手法は、肺の組織における、ｍＲＮＡ送達ならびにＣＦＴＲ発現及び／または活性の用量依存的な増加を明らかに実証した。まとめると、実験は、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡをヒト対象の肺に送達するための総合的な実用性及び実行可能性を強調し、治療用途のためのインビボのＣＦＴＲタンパク質産生の有効性を実証する。
実施例１２：肺におけるインビボの発現
この実施例は、ｍＲＮＡが充填されたナノ粒子のエアロゾル送達後の肺における成功裏のインビボの発現を実証する。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから取得したＧｅｒｍａｎ Ｌａｎｄｒａｃｅのブタを使用して、すべての研究を実施した。ブタは３５〜９０ｋｇの範囲の体重を有した。Ｐａｒｉジェット噴霧器を使用して、ＦＦＬ／ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡ製剤またはビヒクル対照を導入した。ブタを屠殺し、所定期間後、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を可能にするため、生理食塩水で灌流した。
伝令ＲＮＡ合成。この実施例では、コドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＣＯ−ＦＦＬ）ｍＲＮＡを、プラスミドＤＮＡ鋳型からインビトロ転写によって合成した。
ｃＫＫ−Ｅ１２製剤。脂質ベースのナノ粒子実験のために、ｃＫＫ−Ｅ１２：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧＤＭＧ２Ｋ（相対量４０：３０：２５：５（モル比）の製剤中に被包された１ｍｇのＦＦＬ＋９ｍｇのＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡを使用して、脂質製剤を生成した。この溶液を、指示された噴霧器を使用してブタ肺に噴霧した。
エアロゾル適用。エアロゾル（生理食塩水またはＣＯ−ＦＦＬ ｃＫＫ−Ｅ１２製剤）を、麻酔されたブタに噴霧し吸入させた。アザペロン２ｍｇ／体重ｋｇ、ケタミン１５ｍｇ／体重ｋｇ、アトロピン０．１ｍｇ／体重ｋｇの前投薬、続いて外側耳介静脈への静脈ラインの挿入によって、ブタの鎮静を開始した。必要に応じてプロポフォール３〜５ｍｇ／体重ｋｇの静脈内注射によって、ブタを麻酔した。必要に応じて麻酔を強化するために、４〜８ｍｇ／体重ｋｇのイソフルラン（２〜３％）と１％のプロポフォールのボーラス注入によって麻酔を維持した。麻酔の持続時間はおよそ１〜３時間であった。外側耳静脈を介するペントバルビタール（１００ｍｇ／体重ｋｇ）及び塩化カリウムのボーラス注入でブタを殺処理した。肺を切除し、組織検体を様々な肺領域から採取し、続いて細胞培養培地中で一晩インキュベートした。保管した試料に、生物発光検出を行った。
生物発光分析。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織検体を、管用ルミノメーター内でホモジナイズして分析するか、またはＤ−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、エクスビボルシフェラーゼＢＬＩを行うかのいずれかを行った。（Ａ）ＦＦＬ／ＣＯ−ＣＦＴＲ−Ｃ−Ｈｉｓ１０ ｍＲＮＡで処置されたブタのそれぞれについて、（Ｂ）対照ブタからの対照肺組織試料（生理食塩水ビヒクル対照）と比較した場合、強い生物発光シグナルが観察された（図５３Ａ＆Ｂ）。
これらのデータは、ＦＦＬ／ＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、エアロゾル投与によって肺に成功裏に送達され、肺において発現されたことを示す。
配列の簡単な説明
配列番号１。野生型ＣＦＴＲアミノ酸配列。
配列番号２。野生型ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列。
配列番号３。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号１。
配列番号４。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ ５’−ＵＴＲ。
配列番号５。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ ３’−ＵＴＲ番号１。
配列番号６。ＦＦＬ ５’ＵＴＲ。
配列番号７。ＦＦＬコード配列。
配列番号８。ＦＦＬ ３’ＵＴＲ。
配列番号９。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号２。
配列番号１０。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号３。
配列番号１１。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号４。
配列番号１２。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号５。
配列番号１３。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号６。
配列番号１４。非自然発生的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列番号７。
配列番号１５。コドン最適化ヒトＣＦＴＲ Ｃ末端Ｈｉｓ１０融合ｍＲＮＡコード配列。配列番号１６。成長ホルモンリーダー配列を有するコドン最適化ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列。
配列番号１７。コドン最適化ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡ
配列番号１８。ｍＲＮＡリーダー配列番号１
配列番号１９。ｍＲＮＡリーダー配列番号２
配列番号２０。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ ３’−ＵＴＲ番号２。

配列番号１
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配列番号２
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配列番号３
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配列番号４
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配列番号５
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配列番号６
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配列番号７
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配列番号８
ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号８）

配列番号９
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配列番号１０
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配列番号１７
ＡＵＧＣＡＧＣＧＧＵＣＣＣＣＧＣＵＣＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＵＧＵＣＧＵＧＵＣＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＵＵＣＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＣＵＵＡＧＡＡＡＧＧＧＧＵＡＵＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＵＵＧＡＧＵＵＧＵＣＵＧＡＣＡＵＣＵＡＣＣＡＧＡＵＣＣＣＣＵＣＧＧＵＡＧＡＵＵＣＧＧＣＧＧＡＵＡＡＣＣＵＣＵＣＧＧＡＧＡＡＧＣＵＣＧＡＡＣＧＧＧＡＡＵＧＧＧＡＣＣＧＣＧＡＡＣＵＣＧＣＧＵＣＵＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＣＡＵＣＡＡＣＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＵＵＣＵＵＣＵＧＧＣＧＧＵＵＣＡＵＧＵＵＣＵＡＣＧＧＵＡＵＣＵＵＣＵＵＧＵＡＵＣＵＣＧＧＧＧＡＧＧＵＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＵＣＣＡＡＣＣＣＣＵＧＵＵＧＵＵＧＧＧＵＣＧＣＡＵＵＡＵＣＧＣＣＵＣＧＵＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＵＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＡＵＣＧＣＧＡＵＣＵＡＣＣＵＣＧＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＵＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＣＡＵＣＧＵＣＡＧＡＡＣＡＣＵＵＵＵＧＵＵＧＣＡＵＣＣＡＧＣＡＡＵＣＵＵＣＧＧＣＣＵＣＣＡＵＣＡＣＡＵＣＧＧＵＡＵＧＣＡＧＡＵＧＣＧＡＡＵＣＧＣＵＡＵＧＵＵＵＡＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＣＡＡＡＡＡＧＡＣＡＣＵＧＡＡＡＣＵＣＵＣＧＵＣＧＣＧＧＧＵＧＵＵＧＧＡＵＡＡＧＡＵＵＵＣＣＡＵＣＧＧＵＣＡＧＵＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＵＡＧＵＡＡＵＡＡＣＣＵＣＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＵＧＡＧＧＧＡＣＵＧＧＣＧＣＵＧＧＣＡＣＡＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＡＵＵＧＣＣＣＣＧＵＵＧＣＡＡＧＵＣＧＣＣＣＵＵＵＵＧＡＵＧＧＧＣＣＵＵＡＵＵＵＧＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＣＡＧＧＣＡＵＣＵＧＣＣＵＵＵＵＧＵＧＧＣＣＵＧＧＧＡＵＵＵＣＵＧＡＵＵＧＵＧＵＵＧＧＣＡＵＵＧＵＵＵＣＡＧＧＣＵＧＧＧＣＵＵＧＧＧＣＧＧＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＵＡＵＣＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＣＧＧＧＵＡＡＡＡＵＣＵＣＧＧＡＡＡＧＡＣＵＣＧＵＣＡＵＣＡＣＵＵＣＧＧＡＡＡＵＧＡＵＣＧＡＡＡＡＣＡＵＣＣＡＧＵＣＧＧＵＣＡＡＡＧＣＣＵＡＵＵＧＣＵＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＧＡＧＡＡＧＡＵＧＡＵＵＧＡＡＡＡＣＣＵＣＣＧＣＣＡＡＡＣＵＧＡＧＣＵＧＡＡＡＣＵＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＵＡＵＧＵＣＣＧＧＵＡＵＵＵＣＡＡＵＵＣＧＵＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＵＵＣＣＧＧＧＵＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＣＵＵＵＣＵＣＵＣＧＧＵＵＵＵＧＣＣＵＵＡＵＧＣＣＵＵＧＡＵＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＡＵＣＣＵＣＣＧＣＡＡＧＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＡＵＵＵＣＧＵＵＣＵＧＣＡＵＵＧＵＡＵＵＧＣＧＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＵＵＵＣＣＧＵＧＧＧＣＣＧＵＧＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＡＵＧＡＣＵＣＧＣＵＵＧＧＡＧＣＧＡＵＣＡＡＣＡＡＡＡＵＣＣＡＡＧＡＣＵＵＣＵＵＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＵＡＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＡＧＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＣＵＡＣＵＡＣＧＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＧＡＣＧＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＵＵＵＵＧＧＡＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＵＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＵＣＡＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＡＵＵＣＣＣＵＧＵＵＵＵＵＣＵＣＧＡＡＣＵＵＣＵＣＣＣＵＧＣＵＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＵＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＵＵＣＵＣＧＣＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＡＧＣＡＣＵＧＧＵＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＣＵＡＧＣＣＵＣＵＵＧＡＵＧＧＵＧＡＵＵＡＵＧＧＧＧＧＡＧＣＵＵＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＵＵＡＡＡＣＡＣＵＣＣＧＧＧＣＧＵＡＵＣＵＣＡＵＵＣＵＧＵＡＧＣＣＡＧＵＵＵＵＣＡＵＧＧＡＵＣＡＵＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＵＣＡＵＵＵＵＣＧＧＡＧＵＡＵＣＣＵＡＵＧＡＵＧＡＧＵＡＣＣＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＧＧＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＧＵＧＣＣＡＧＵＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＵＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＵＡＡＣＡＵＣＧＵＣＵＵＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＵＡＵＵＡＣＡＵＵＧＵＣＧＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＵＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＵＡＵＡＣＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＵＵＵＧＵＡＵＣＵＧＣＵＵＧＡＵＵＣＡＣＣＧＵＵＵＧＧＡＵＡＣＣＵＣＧＡＣＧＵＡＵＵＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＣＵＵＣＧＡＧＵＣＧＵＧＣＧＵＧＵＧＵＡＡＡＣＵＵＡＵＧＧＣＵＡＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＵＧＡＣＡＵＣＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＣＡＣＣＵＵＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＣＵＣＣＡＣＧＡＡＧＧＡＵＣＧＵＣＣＵＡＣＵＵＵＵＡＣＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＡＧＡＧＵＵＧＣＡＡＡＡＣＵＵＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＵＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＡＣＵＣＡＵＧＧＧＧＵＧＵＧＡＣＵＣＡＵＵＣＧＡＣＣＡＧＵＵＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＵＣＧＡＵＣＵＵＧＡＣＧＧＡＡＡＣＧＣＵＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＡＧＧＧＵＧＡＵＧＣＣＣＣＧＧＵＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＵＵＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＵＵＵＧＧＵＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＵＣＵＵＧＡＡＵＣＣＵＡＵＵＡＡＣＵＣＡＡＵＵＣＧＣＡＡＧＵＵＣＵＣＡＡＵＣＧＵＣＣＡＧＡＡＡＡＣＵＣＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＵＧＧＡＡＵＵＧＡＡＧＡＧＧＡＵＵＣＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＧＣＣＧＧＡＵＵＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＣＣＣＧＧＡＵＵＵＣＧＧＵＧＡＵＵＵＣＡＡＣＣＧＧＡＣＣＵＡＣＡＣＵＵＣＡＧＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＵＣＣＧＵＧＣＵＣＡＡＣＣＵＣＡＵＧＡＣＧＣＡＵＵＣＧＧＵＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＵＵＣＡＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＵＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＡＧＵＧＵＣＡＣＵＵＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＧＡＡＵＵＵＧＡＣＵＧＡＡＣＵＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＣＣＧＵＡＧＧＣＵＵＵＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＵＣＡＡＵＧＡＡＧＡＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＵＵＵＧＡＵＧＡＣＡＵＧＧＡＡＵＣＡＡＵＣＣＣＡＧＣＧＧＵＧＡＣＡＡＣＧＵＧＧＡＡＣＡＣＡＵＡＣＵＵＧＣＧＵＵＡＣＡＵＣＡＣＧＧＵＧＣＡＣＡＡＧＵＣＣＵＵＧＡＵＵＵＵＣＧＵＣＣＵＣＡＵＣＵＧＧＵＧＵＣＵＣＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＵＣＧＣＵＧＡＧＧＵＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＣＵＵＧＵＧＧＵＣＣＵＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＧＧＵＡＡＵＡＣＧＣＣＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＵＵＣＵＡＣＡＣＡＣＵＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＡＵＧＣＣＧＵＧＡＵＵＡＵＣＡＣＵＵＣＵＡＣＡＡＧＣＵＣＧＵＡＵＵＡＣＧＵＧＵＵＵＵＡＣＡＵＣＵＡＣＧＵＡＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＡＣＡＣＵＣＵＧＣＵＣＧＣＧＡＵＧＧＧＵＵＵＣＵＵＣＣＧＡＧＧＡＣＵＣＣＣＡＣＵＣＧＵＵＣＡＣＡＣＧＣＵＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＵＣＣＡＡＧＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡＵＡＡＧＡＵＧＣＵＵＣＡＵＡＧＣＧＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＵＣＣＣＡＵＧＵＣＣＡＣＣＵＵＧＡＡＵＡＣＧＣＵＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＵＡＵＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＧＡＵＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＧＡＣＣＵＵＣＵＧＣＣＣＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＵＣＧＡＣＵＵＣＡＵＣＣＡＧＵＵＧＵＵＧＣＵＧＡＵＣＧＵＧＡＵＵＧＧＧＧＣＵＡＵＵＧＣＡＧＵＡＧＵＣＧＣＵＧＵＣＣＵＣＣＡＧＣＣＵＵＡＣＡＵＵＵＵＵＧＵＣＧＣＧＡＣＣＧＵＵＣＣＧＧＵＧＡＵＣＧＵＧＧＣＧＵＵＵＡＵＣＡＵＧＣＵＧＣＧＧＧＣＣＵＡＵＵＵＣＵＵＧＣＡＧＡＣＧＵＣＡＣＡＧＣＡＧＣＵＵＡＡＧＣＡＡＣＵＧＧＡＧＵＣＵＧＡＡＧＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＵＡＵＣＵＵＵＡＣＧＣＡＵＣＵＵＧＵＧＡＣＣＡＧＵＵＵＧＡＡＧＧＧＡＵＵＧＵＧＧＡＣＧＵＵＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＵＡＣＵＵＵＧＡＡＡＣＡＣＵＧＵＵＣＣＡＣＡＡＡＧＣＧＣＵＧＡＡＵＣＵＣＣＡＵＡＣＧＧＣＡＡＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＵＡＵＵＵＧＡＧＵＡＣＣＣＵＣＣＧＡＵＧＧＵＵＵＣＡＧＡＵＧＣＧＣＡＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＵＵＵＵＧＵＧＡＵＣＵＵＣＵＵＵＡＵＣＧＣＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵＣＵＵＧＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＵＣＧＧＵＡＵＵＡＵＣＣＵＧＡＣＡＣＵＣＧＣＣＡＵＧＡＡＣＡＵＵＡＵＧＡＧＣＡＣＵＵＵＧＣＡＧＵＧＧＧＣＡＧＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＧＡＵＵＧＡＵＧＵＧＧＡＵＡＧＣＣＵＧＡＵＧＡＧＧＵＣＣＧＵＵＵＣＧＡＧＧＧＵＣＵＵＵＡＡＧＵＵＣＡＵＣＧＡＣＡＵＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＡＧＵＡＣＧＡＡＡＣＣＣＵＡＵＡＡＧＡＡＵＧＧＧＣＡＡＵＵＧＡＧＵＡＡＧＧＵＡＡＵＧＡＵＣＡＵＣＧＡＧＡＡＣＡＧＵＣＡＣＧＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＵＧＡＣＡＵＣＵＧＧＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＣＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＣＧＣＡＡＵＣＣＵＵＧＡＡＡＡＣＡＵＣＵＣＧＵＵＣＡＧＣＡＵＵＡＧＣＣＣＣＧＧＵＣＡＧＣＧＵＧＵＧＧＧＧＵＵＧＣＵＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＧＧＧＵＣＡＧＧＡＡＡＡＵＣＧＡＣＧＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＣＣＵＵＣＵＵＧＡＧＡＣＵＵＣＵＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＧＧＵＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＣＧＧＣＧＵＵＵＣＧＵＧＧＧＡＵＡＧＣＡＵＣＡＣＣＵＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＧＵＵＵＧＧＡＧＵＡＡＵＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＵＣＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＣＧＧＡＡＣＣＵＵＣＣＧＡＡＡＧＡＡＵＣＵＣＧＡＵＣＣＵＵＡＵＧＡＡＣＡＧＵＧＧＵＣＡＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＵＵＵＧＧＡＡＡＧＵＣＧＣＧＧＡＣＧＡＧＧＵＵＧＧＣＣＵＵＣＧＧＡＧＵＧＵＡＡＵＣＧＡＧＣＡＧＵＵＵＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＵＣＣＵＵＧＵＡＧＡＵＧＧＧＧＧＡＵＧＣＧＵＣＣＵＧＵＣＧＣＡＵＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＡＵＧＵＧＣＣＵＧＧＣＧＣＧＡＵＣＣＧＵＣＣＵＣＵＣＵＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＵＧＧＡＵＧＡＡＣＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＧＵＡＡＣＧＵＡＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＵＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＵＵＵＧＣＣＧＡＣＵＧＣＡＣＧＧＵＧＡＵＵＣＵＣＵＧＵＧＡＧＣＡＵＣＧＵＡＵＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＣＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＧＣＡＡＵＵＵＣＵＵＧＵＣＡＵＣＧＡＡＧＡＧＡＡＵＡＡＧＧＵＣＣＧＣＣＡＧＵＡＣＧＡＣＵＣＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡＵＧＡＧＡＧＡＵＣＡＵＵＧＵＵＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＡＵＵＵＣＡＣＣＡＵＣＣＧＡＵＡＧＧＧＵＧＡＡＡＣＵＵＵＵＵＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＣＧＵＣＧＡＡＧＵＧＣＡＡＧＵＣＣＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＵＣＧＣＧＧＣＣＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＵＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣＧＵＣＵＵＵＡＡ（配列番号１７）

配列番号１８
ＡＵＧＧＣＣＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＧＡＡＣＣＵＣＡＣＵＧＣＵＧＣＵＣＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＵＧＣＵＵＵＧＣＣＵＧＣＣＣＵＧＧＵＵＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＵＣＧＧＣＵＵＵＣＣＣＧＡＣＣＡＵＣＣＣＡＣＵＣＵＣＣ（配列番号１８）

配列番号１９
ＡＵＧＧＣＡＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＧＡＡＣＣＵＣＣＣＵＣＣＵＧＣＵＣＧＣＡＵＵＣＧＧＣＣＵＧＣＵＣＵＧＵＣＵＣＣＣＡＵＧＧＣＵＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＧＣＧＵＵＣＣＣＣＡＣＵＡＵＣＣＣＣＣＵＣＵＣＧ（配列番号１９）

配列番号２０
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号２０）
均等物
本明細書は、本明細書中に引用される参考文献の教示を踏まえて最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを認識する。本開示において引用されるすべての刊行物及び特許は、参照によりその全体が組み込まれる。参照により組み込まれる材料が本明細書と矛盾するか、または一貫しない場合、本明細書はいかなるかかる材料にも優先する。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、かかる参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
別途指示されない限り、特許請求の範囲を含む、本明細書において使用される成分の量、反応条件などを表すすべての数字は、近似値として理解されるべきであり、本発明によって得ることが求められる所望の特性に依存して変化してよい。最低限、また均等物の原理の適用を特許請求の範囲に制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効桁数及び通常の四捨五入手法を踏まえて解釈されるべきである。本明細書における異なる量の有効数字の一連の数の列挙は、より少ない有効数字が与えられた数が、より多くの有効数字が与えられた数と同じ精度を有することを意味するものとして解釈されるべきではない。
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／または明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される場合、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは１つよりも多くの」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替のみに言及することが明確に示されるか、または代替が互いに排他的である場合を除き、「及び／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替及び「及び／または」のみに言及する定義を支持する。
別途指示されない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素に言及すると理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または、ほんの日常的な実験を使用して、それらを確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等な任意の方法及び材料が、本発明の実践または試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで説明される。
本明細書において記述される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のみのために提供される。本明細書におけるいかなる内容も、先行する発明によって本発明がかかる刊行物に先立つ資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立して確認する必要があり得る。
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察、及び本明細書に開示される本発明の実践から、当業者に明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は、ほんの例示として見なされることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (1)

  1. 本願図面に記載の発明。
JP2020122566A 2013-03-14 2020-07-17 ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ組成物ならびに関連する方法及び使用 Withdrawn JP2020169218A (ja)

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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2506857T (pt) 2009-12-01 2018-05-14 Translate Bio Inc Entrega de arnm para o acréscimo de proteínas e enzimas em doenças genéticas humanas
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
WO2012075040A2 (en) * 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
TR201910686T4 (tr) 2011-06-08 2019-08-21 Translate Bio Inc Mrna iletimine yönelik lipit nanopartikül bileşimleri ve yöntemler.
CA2838063C (en) 2011-06-08 2023-07-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
EA201591229A1 (ru) 2013-03-14 2016-01-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы очистки матричной рнк
PL2968586T3 (pl) 2013-03-14 2019-01-31 Translate Bio, Inc. Kompozycje mrna cftr i związne z nimi sposoby i zastosowania
EP3060258A1 (en) 2013-10-22 2016-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
NZ718817A (en) * 2013-10-22 2020-07-31 Massachusetts Inst Technology Lipid formulations for delivery of messenger rna
EP4276176A3 (en) 2013-10-22 2024-01-10 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
EP3060671B1 (en) * 2013-10-22 2021-12-29 Translate Bio, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
EA201691696A1 (ru) 2014-04-25 2017-03-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы очистки матричной рнк
WO2016149508A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for pompe disease
DE112016002962T5 (de) 2015-06-30 2018-05-24 Ethris Gmbh Familie der ATP-bindenden Kassetten-codierende Polyribonucleotide und Formulierungen derselben
US20210206818A1 (en) 2016-01-22 2021-07-08 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
US10266843B2 (en) 2016-04-08 2019-04-23 Translate Bio, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
PL3377637T3 (pl) * 2016-04-08 2020-09-07 Krystal Biotech, Inc. Kompozycje do stosowania w sposobach leczenia ran, zaburzeń i chorób skóry
WO2017180917A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
RU2769316C2 (ru) 2016-05-18 2022-03-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Полинуклеотиды, кодирующие интерлейкин-12 (il12), и их применения
WO2017201347A1 (en) * 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2018089790A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Translate Bio, Inc. Improved ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mrna
US10415080B2 (en) 2016-11-21 2019-09-17 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
WO2018140826A1 (en) * 2017-01-27 2018-08-02 The Methodist Hospital Core/shell structure platform for immunotherapy
EP3971291A1 (en) 2017-02-27 2022-03-23 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
AU2018224318A1 (en) 2017-02-27 2019-09-19 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
MA47603A (fr) 2017-02-27 2020-01-01 Translate Bio Inc Nouvel arnm cftr à codons optimisés
AU2018229278A1 (en) 2017-02-28 2019-10-17 Sanofi Therapeutic RNA
US20200038487A1 (en) 2017-03-31 2020-02-06 Accanis Biotech F&E Gmbh & Co Kg Prevention and treatment of non-melanoma skin cancer (nmsc)
EP3398963B1 (en) * 2017-05-04 2021-09-29 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Chemically modified mrna for use in the treatment of a disease associated with the cftr gene
WO2018213476A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
US20200131498A1 (en) 2017-06-14 2020-04-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
EP3437650A1 (en) 2017-07-31 2019-02-06 Accanis Biotech F&E GmbH & Co KG Treatment of local skin hypotrophy conditions
JP2020537493A (ja) * 2017-09-08 2020-12-24 ジェネレーション バイオ カンパニー 非ウイルス性カプシド不含ｄｎａベクターの脂質ナノ粒子製剤
WO2019200163A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
AU2019271028A1 (en) 2018-05-14 2020-12-03 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
JP7422977B2 (ja) * 2018-07-23 2024-01-29 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａ用乾燥粉末製剤
CA3108544A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
WO2020068862A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of netherton syndrome
CA3114892A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed rna
US11072808B2 (en) 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
CA3115119A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger rna purification
AU2019374871A1 (en) * 2018-11-09 2021-05-27 Translate Bio, Inc. PEG lipidoid compounds
AU2020219343A1 (en) * 2019-02-08 2021-08-19 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for delivering CFTR polypeptides
EP3924487B1 (en) 2019-02-11 2024-04-10 ethris GmbH Mrna purification by tangential flow filtration
AU2020257182A1 (en) * 2019-04-15 2021-12-09 Spirovant Sciences, Inc. Methods and compositions for transgene expression
BR112021020708A2 (pt) * 2019-04-15 2022-03-15 Spirovant Sciences Inc Composições e métodos para tratamento de fibrose cística
WO2021055609A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
EP4143326A1 (en) * 2020-04-27 2023-03-08 University of Iowa Research Foundation Compositions and methods for the treatment of cystic fibrosis
US20230056935A1 (en) 2020-09-16 2023-02-23 Lg Chem, Ltd. Compound, Antimicrobial Deodorant Composition Comprising Same, and Method for Producing Same
CA3213107A1 (en) * 2021-03-23 2022-09-29 Mirko HENNIG Polynucleotide compositions, related formulations, and methods of use thereof
BR112023020209A2 (pt) 2021-04-02 2023-12-19 Krystal Biotech Inc Genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, composição farmacêutica, uso do vírus do herpes ou da composição farmacêutica, método para expressar, realçar, aumentar, ampliar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo imunomodulatório, método para prover alívio profilático, paliativo ou terapêutico, e, método para tratar câncer
CN117881789A (zh) * 2021-06-09 2024-04-12 瑞科德治疗公司 多核苷酸组合物、相关制剂、及其使用方法

Family Cites Families (443)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2647121A (en) 1951-02-02 1953-07-28 Ruth P Jacoby Diamine-bis-acetamides
US2819718A (en) 1953-07-16 1958-01-14 Isidore H Goldman Drainage tube
US2717909A (en) 1953-09-24 1955-09-13 Monsanto Chemicals Hydroxyethyl-keryl-alkylene-ammonium compounds
US2844629A (en) 1956-04-25 1958-07-22 American Home Prod Fatty acid amides and derivatives thereof
US3096560A (en) 1958-11-21 1963-07-09 William J Liebig Process for synthetic vascular implants
GB1072118A (en) 1962-12-01 1967-06-14 Sandoz Ag Amides of aminopropionic acid
JPS5141663B1 (ja) 1966-03-12 1976-11-11
JPS4822365B1 (ja) 1968-10-25 1973-07-05
NL143127B (nl) 1969-02-04 1974-09-16 Rhone Poulenc Sa Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep.
US3614954A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Electronic standby defibrillator
US3614955A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Standby defibrillator and method of operation
JPS5024216Y1 (ja) 1970-12-29 1975-07-21
JPS5024216B1 (ja) 1970-12-29 1975-08-14
JPS5012146Y2 (ja) 1971-07-27 1975-04-15
US3945052A (en) 1972-05-01 1976-03-23 Meadox Medicals, Inc. Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same
US3805301A (en) 1972-07-28 1974-04-23 Meadox Medicals Inc Tubular grafts having indicia thereon
JPS49127908A (ja) 1973-04-20 1974-12-07
JPS5624664B2 (ja) 1973-06-28 1981-06-08
US4013507A (en) 1973-09-18 1977-03-22 California Institute Of Technology Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells
JPS5123537A (ja) 1974-04-26 1976-02-25 Adeka Argus Chemical Co Ltd Kasozaisoseibutsu
GB1527592A (en) 1974-08-05 1978-10-04 Ici Ltd Wound dressing
US3995623A (en) 1974-12-23 1976-12-07 American Hospital Supply Corporation Multipurpose flow-directed catheter
JPS5813576B2 (ja) 1974-12-27 1983-03-14 アデカ ア−ガスカガク カブシキガイシヤ 安定化された合成高分子組成物
JPS5524302Y2 (ja) 1975-03-31 1980-06-10
US4281669A (en) 1975-05-09 1981-08-04 Macgregor David C Pacemaker electrode with porous system
DE2520814A1 (de) 1975-05-09 1976-11-18 Bayer Ag Lichtstabilisierung von polyurethanen
JPS5210847A (en) 1975-07-16 1977-01-27 Nippon Steel Corp Pinch roll
US4096860A (en) 1975-10-08 1978-06-27 Mclaughlin William F Dual flow encatheter
CA1069652A (en) 1976-01-09 1980-01-15 Alain F. Carpentier Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring
US4134402A (en) 1976-02-11 1979-01-16 Mahurkar Sakharam D Double lumen hemodialysis catheter
US4072146A (en) 1976-09-08 1978-02-07 Howes Randolph M Venous catheter device
US4335723A (en) 1976-11-26 1982-06-22 The Kendall Company Catheter having inflatable retention means
US4099528A (en) 1977-02-17 1978-07-11 Sorenson Research Co., Inc. Double lumen cannula
US4140126A (en) 1977-02-18 1979-02-20 Choudhury M Hasan Method for performing aneurysm repair
US4265745A (en) 1977-05-25 1981-05-05 Teijin Limited Permselective membrane
US4182833A (en) 1977-12-07 1980-01-08 Celanese Polymer Specialties Company Cationic epoxide-amine reaction products
US4180068A (en) 1978-04-13 1979-12-25 Motion Control, Incorporated Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure
EP0005035B1 (en) 1978-04-19 1981-09-23 Imperial Chemical Industries Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
US4284459A (en) 1978-07-03 1981-08-18 The Kendall Company Method for making a molded catheter
US4227533A (en) 1978-11-03 1980-10-14 Bristol-Myers Company Flushable urinary catheter
US4375817A (en) 1979-07-19 1983-03-08 Medtronic, Inc. Implantable cardioverter
DE3010841A1 (de) 1980-03-21 1981-10-08 Ulrich Dr.med. 6936 Haag Uthmann Katheder
US4308085A (en) 1980-07-28 1981-12-29 Jenoptik Jena Gmbh Process for the preparation of high molecular thermoplastic epoxide-amine-polyadducts
US4339369A (en) 1981-04-23 1982-07-13 Celanese Corporation Cationic epoxide-amine reaction products
US4406656A (en) 1981-06-01 1983-09-27 Brack Gillium Hattler Venous catheter having collapsible multi-lumens
US4475972A (en) 1981-10-01 1984-10-09 Ontario Research Foundation Implantable material
US4401472A (en) 1982-02-26 1983-08-30 Martin Marietta Corporation Hydraulic cement mixes and processes for improving hydraulic cement mixes
US4568329A (en) 1982-03-08 1986-02-04 Mahurkar Sakharam D Double lumen catheter
US4546499A (en) 1982-12-13 1985-10-15 Possis Medical, Inc. Method of supplying blood to blood receiving vessels
US4530113A (en) 1983-05-20 1985-07-23 Intervascular, Inc. Vascular grafts with cross-weave patterns
US4550447A (en) 1983-08-03 1985-11-05 Shiley Incorporated Vascular graft prosthesis
US4647416A (en) 1983-08-03 1987-03-03 Shiley Incorporated Method of preparing a vascular graft prosthesis
US5104399A (en) 1986-12-10 1992-04-14 Endovascular Technologies, Inc. Artificial graft and implantation method
US4571241A (en) 1983-12-16 1986-02-18 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4710169A (en) 1983-12-16 1987-12-01 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4737518A (en) 1984-04-03 1988-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lipid derivatives, their production and use
US4562596A (en) 1984-04-25 1986-01-07 Elliot Kornberg Aortic graft, device and method for performing an intraluminal abdominal aortic aneurysm repair
US4782836A (en) 1984-05-24 1988-11-08 Intermedics, Inc. Rate adaptive cardiac pacemaker responsive to patient activity and temperature
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4662382A (en) 1985-01-16 1987-05-05 Intermedics, Inc. Pacemaker lead with enhanced sensitivity
US4762915A (en) 1985-01-18 1988-08-09 Liposome Technology, Inc. Protein-liposome conjugates
US4860751A (en) 1985-02-04 1989-08-29 Cordis Corporation Activity sensor for pacemaker control
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
CA1320724C (en) 1985-07-19 1993-07-27 Koichi Kanehira Terpene amino alcohols and medicinal uses thereof
US4701162A (en) 1985-09-24 1987-10-20 The Kendall Company Foley catheter assembly
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
DE3616824A1 (de) 1986-05-17 1987-11-19 Schering Ag Verwendung von haertbaren kunstharzmischungen fuer oberflaechenbeschichtungen und druckfarben und verfahren zu ihrer herstellung
DE3780374D1 (de) 1986-07-31 1992-08-20 Irnich Werner Frequenzadaptierender herzschrittmacher.
US4960409A (en) 1986-09-11 1990-10-02 Catalano Marc L Method of using bilumen peripheral venous catheter with adapter
JPH0829776B2 (ja) 1986-10-29 1996-03-27 東燃化学株式会社 合成樹脂製容器及びその製造用金型
US4720517A (en) 1986-11-24 1988-01-19 Ciba-Geigy Corporation Compositions stabilized with N-hydroxyiminodiacetic and dipropionic acids and esters thereof
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPS63154788U (ja) 1987-03-31 1988-10-11
DE3728917A1 (de) 1987-08-29 1989-03-09 Roth Hermann J Neue lipide mit unsymmetrisch substituierter disulfidbruecke
US4946683A (en) 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
US5047540A (en) 1987-12-17 1991-09-10 Shionogi & Co., Ltd. Lipid derivatives
US4892540A (en) 1988-04-21 1990-01-09 Sorin Biomedica S.P.A. Two-leaflet prosthetic heart valve
US5176661A (en) 1988-09-06 1993-01-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Composite vascular catheter
US5024671A (en) 1988-09-19 1991-06-18 Baxter International Inc. Microporous vascular graft
US5200395A (en) 1988-10-18 1993-04-06 Ajinomoto Company, Inc. Pharmaceutical composition of BUF-5 for treating anemia
CA2001401A1 (en) 1988-10-25 1990-04-25 Claude Piantadosi Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1990011092A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Vical, Inc. Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5101824A (en) 1990-04-16 1992-04-07 Siemens-Pacesetter, Inc. Rate-responsive pacemaker with circuitry for processing multiple sensor inputs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0549590A1 (en) 1990-07-26 1993-07-07 LANE, Rodney James Self expanding vascular endoprosthesis for aneurysms
US5693338A (en) 1994-09-29 1997-12-02 Emisphere Technologies, Inc. Diketopiperazine-based delivery systems
JPH0765267B2 (ja) 1990-08-22 1995-07-12 花王株式会社 柔軟仕上剤
ATE135555T1 (de) 1990-10-09 1996-04-15 Cook Inc Perkutane stentanordnung
EP0491082B1 (de) 1990-12-19 1995-04-12 Peter Dr. Ing. Osypka Herzschrittmacherleitung mit einem inneren Kanal und mit einem Elektrodenkopf
US5116360A (en) 1990-12-27 1992-05-26 Corvita Corporation Mesh composite graft
JP2547524Y2 (ja) 1991-01-22 1997-09-10 東洋ラジエーター株式会社 オイルクーラ
US5405363A (en) 1991-03-15 1995-04-11 Angelon Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5330768A (en) 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US6013638A (en) * 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US5545449A (en) 1991-10-02 1996-08-13 Weyerhaeuser Company Polyether-reinforced fiber-based materials
US5151105A (en) 1991-10-07 1992-09-29 Kwan Gett Clifford Collapsible vessel sleeve implant
US5284491A (en) 1992-02-27 1994-02-08 Medtronic, Inc. Cardiac pacemaker with hysteresis behavior
US5352461A (en) 1992-03-11 1994-10-04 Pharmaceutical Discovery Corporation Self assembling diketopiperazine drug delivery system
SE9200951D0 (sv) 1992-03-27 1992-03-27 Kabi Pharmacia Ab Pharmaceutical composition containing a defined lipid system
EP0635019B1 (en) 1992-04-06 1999-05-26 Biosite Diagnostics Inc. Opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
WO1994003598A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 The Green Cross Corporation Antiallergic agent
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5461223A (en) 1992-10-09 1995-10-24 Eastman Kodak Company Bar code detecting circuitry
US5300022A (en) 1992-11-12 1994-04-05 Martin Klapper Urinary catheter and bladder irrigation system
US5496362A (en) 1992-11-24 1996-03-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable conformal coil patch electrode with multiple conductive elements for cardioversion and defibrillation
US5552155A (en) 1992-12-04 1996-09-03 The Liposome Company, Inc. Fusogenic lipsomes and methods for making and using same
US5716395A (en) 1992-12-11 1998-02-10 W.L. Gore & Associates, Inc. Prosthetic vascular graft
WO1994018987A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Drug composition containing nucleic acid copolymer
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5697953A (en) 1993-03-13 1997-12-16 Angeion Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
JPH0753535Y2 (ja) 1993-03-16 1995-12-13 株式会社ハンズ リュックサック
US5624976A (en) 1994-03-25 1997-04-29 Dentsply Gmbh Dental filling composition and method
US5314430A (en) 1993-06-24 1994-05-24 Medtronic, Inc. Atrial defibrillator employing transvenous and subcutaneous electrodes and method of use
DE4325848A1 (de) 1993-07-31 1995-02-02 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin
EP1062998B1 (en) 1993-10-06 2003-03-26 The Kansai Electric Power Co., Inc. Method for removing carbon dioxide from combustion exhaust gas
US5609624A (en) 1993-10-08 1997-03-11 Impra, Inc. Reinforced vascular graft and method of making same
SE9303481L (sv) 1993-10-22 1995-04-23 Berol Nobel Ab Hygienkomposition
WO1995013033A1 (en) 1993-11-08 1995-05-18 Lazarus Harrison M Intraluminal vascular graft and method
NZ277614A (en) 1993-11-24 1998-05-27 Megabios Corp Piperazine-containing amphiphiles and their use in liposomes for delivering genetic material intracellularly
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5464924A (en) 1994-01-07 1995-11-07 The Dow Chemical Company Flexible poly(amino ethers) for barrier packaging
US5844107A (en) 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
NZ268146A (en) 1994-04-12 1997-10-24 Liposome Co Inc Liposome compositions and medicinal uses
US5858747A (en) 1994-07-20 1999-01-12 Cytotherapeutics, Inc. Control of cell growth in a bioartificial organ with extracellular matrix coated microcarriers
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
JP2001523215A (ja) 1995-04-17 2001-11-20 イマークス ファーマシューティカル コーポレーション ハイブリッド磁気共鳴造影剤
US5772694A (en) 1995-05-16 1998-06-30 Medical Carbon Research Institute L.L.C. Prosthetic heart valve with improved blood flow
US5783383A (en) 1995-05-23 1998-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of detecting cytomegalovirus (CMV)
US5609629A (en) 1995-06-07 1997-03-11 Med Institute, Inc. Coated implantable medical device
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US5607385A (en) 1995-08-17 1997-03-04 Medtronic, Inc. Device and algorithm for a combined cardiomyostimulator and a cardiac pacer-carioverter-defibrillator
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
FR2740978B1 (fr) 1995-11-10 1998-01-02 Ela Medical Sa Dispositif medical actif du type defibrillateur/cardioverteur implantable
US5874105A (en) 1996-01-31 1999-02-23 Collaborative Laboratories, Inc. Lipid vesicles formed with alkylammonium fatty acid salts
WO1997038010A2 (en) 1996-04-11 1997-10-16 The University Of British Columbia Fusogenic liposomes
US5935936A (en) 1996-06-03 1999-08-10 Genzyme Corporation Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5913848A (en) 1996-06-06 1999-06-22 Luther Medical Products, Inc. Hard tip over-the-needle catheter and method of manufacturing the same
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5736573A (en) 1996-07-31 1998-04-07 Galat; Alexander Lipid and water soluble derivatives of drugs
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
PT941066E (pt) 1996-08-26 2004-03-31 Transgene Sa Complexos de lipido cationico - acido nucleico
WO1998010748A1 (en) 1996-09-13 1998-03-19 The School Of Pharmacy Liposomes
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
WO1998019709A2 (en) 1996-11-04 1998-05-14 Qiagen Gmbh Cationic reagents for transfection
US6887665B2 (en) 1996-11-14 2005-05-03 Affymetrix, Inc. Methods of array synthesis
US5985930A (en) 1996-11-21 1999-11-16 Pasinetti; Giulio M. Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide
US6204297B1 (en) 1996-11-26 2001-03-20 Rhodia Inc. Nonionic gemini surfactants
JPH10197978A (ja) 1997-01-09 1998-07-31 Mitsubishi Paper Mills Ltd ハロゲン化銀写真感光材料
EP0853123A1 (de) 1997-01-10 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
FR2760193B1 (fr) 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5945326A (en) 1997-03-20 1999-08-31 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
US20030104044A1 (en) 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
JPH115786A (ja) 1997-06-13 1999-01-12 Pola Chem Ind Inc 新規アミノヒドロキシプロピルピペラジン誘導体
US6067471A (en) 1998-08-07 2000-05-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Atrial and ventricular implantable cardioverter-defibrillator and lead system
JPH1180142A (ja) 1997-09-05 1999-03-26 Pola Chem Ind Inc ジフェニルアルキル化合物の製造法
EP2292771A3 (en) * 1997-09-19 2011-07-27 Life Technologies Corporation Sense mRNA therapy
US6165763A (en) 1997-10-30 2000-12-26 Smithkline Beecham Corporation Ornithine carbamoyltransferase
US6096075A (en) 1998-01-22 2000-08-01 Medical Carbon Research Institute, Llc Prosthetic heart valve
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6271209B1 (en) 1998-04-03 2001-08-07 Valentis, Inc. Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors
US6176877B1 (en) 1998-04-20 2001-01-23 St. Jude Medical, Inc. Two piece prosthetic heart valve
DE19822602A1 (de) 1998-05-20 1999-11-25 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Polyaminosäureestern durch Veresterung von sauren Polyaminosäuren oder Umesterung von Polyaminosäureestern
NO313244B1 (no) 1998-07-08 2002-09-02 Crew Dev Corp Fremgangsmåte for isolering og produksjon av magnesitt eller magnesiumklorid
US6055454A (en) 1998-07-27 2000-04-25 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac pacemaker with automatic response optimization of a physiologic sensor based on a second sensor
US6312926B1 (en) 1998-08-14 2001-11-06 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey mRNA capping enzymes and uses thereof
AU771367B2 (en) 1998-08-20 2004-03-18 Cook Medical Technologies Llc Coated implantable medical device
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6468793B1 (en) * 1998-10-23 2002-10-22 Florida State University Research Foundation CFTR genes and proteins for cystic fibrosis gene therapy
US6656498B1 (en) 1998-11-25 2003-12-02 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
US6248725B1 (en) 1999-02-23 2001-06-19 Amgen, Inc. Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
WO2000062813A2 (en) 1999-04-20 2000-10-26 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
MXPA01010750A (es) 1999-04-23 2003-08-20 Alza Corp Conjugado que tiene un enlace dividible para utilizarse en un liposoma.
US6169923B1 (en) 1999-04-23 2001-01-02 Pacesetter, Inc. Implantable cardioverter-defibrillator with automatic arrhythmia detection criteria adjustment
EP1178913B1 (de) * 1999-05-17 2003-02-05 Edscha AG Fronthaubenanordnung
DK1187852T3 (da) 1999-05-19 2007-11-26 Merck Patent Gmbh Ekspression og eksport af interferon-alpha-proteiner som Fc-fusionsproteiner
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
WO2001005375A1 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Purdue Research Foundation Vinyl ether lipids with cleavable hydrophilic headgroups
EP1200578B1 (en) 1999-07-23 2004-04-14 Genentech, Inc. Method for rnase- and organic solvent-free plasmid dna purification using tangential flow filtration
US6358278B1 (en) 1999-09-24 2002-03-19 St. Jude Medical, Inc. Heart valve prosthesis with rotatable cuff
US6371983B1 (en) 1999-10-04 2002-04-16 Ernest Lane Bioprosthetic heart valve
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
JP2003519199A (ja) 1999-12-30 2003-06-17 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 遺伝子治療のための新規なコロイド合成ベクター
CA2400634A1 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Chester Li Genetic modification of the lung as a portal for gene delivery
US6370434B1 (en) 2000-02-28 2002-04-09 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac lead and method for lead implantation
US6565960B2 (en) 2000-06-01 2003-05-20 Shriners Hospital Of Children Polymer composite compositions
WO2002000870A2 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
IL138474A0 (en) 2000-09-14 2001-10-31 Epox Ltd Highly branched water-soluble polyamine oligomers, process for their preparation and applications thereof
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
USRE43612E1 (en) 2000-10-10 2012-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
JP2004511572A (ja) 2000-10-25 2004-04-15 ザ　ユニバーシティ　オブ　ブリティッシュ　コロンビア 標的化送達のための脂質製剤
GB0028361D0 (en) 2000-11-21 2001-01-03 Glaxo Group Ltd Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components
US20020094528A1 (en) 2000-11-29 2002-07-18 Salafsky Joshua S. Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interations
JP2002167368A (ja) 2000-12-01 2002-06-11 Nitto Denko Corp アルキル置換デンドリマーおよびその製造法
US20050004058A1 (en) 2000-12-07 2005-01-06 Patrick Benoit Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US20020192721A1 (en) 2001-03-28 2002-12-19 Engeneos, Inc. Modular molecular clasps and uses thereof
TW588032B (en) 2001-04-23 2004-05-21 Shinetsu Chemical Co New tertiary amine compound having ester structure and method for producing the same
US6585410B1 (en) 2001-05-03 2003-07-01 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Radiant temperature nulling radiometer
EP2305699B1 (de) 2001-06-05 2014-08-13 CureVac GmbH Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt und optimierter Codon Usage für die Impfung gegen Schlafkrankheit, Leishmaniose und Toxoplasmose
EP2386637B1 (en) 2001-09-28 2018-05-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
WO2003040288A2 (de) 2001-11-09 2003-05-15 Bayer Healthcare Ag Isotopencodierte affinitätsmarker 3
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
DE10214983A1 (de) 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
US20030215395A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US7601367B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
EP1513870A4 (en) * 2002-05-31 2006-06-07 Childrens Hosp Medical Center CFTR MODIFIER GENES AND EXPRESSED POLYPEPTIDES SUITABLE FOR THE TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS AND METHOD AND PRODUCTS FOR DETECTING AND / OR IDENTIFYING THEM
ATE485031T1 (de) 2002-06-28 2010-11-15 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US20040028804A1 (en) 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
JP2005536214A (ja) 2002-08-22 2005-12-02 セルトラン リミテッド 細胞培養表面
AU2003301852A1 (en) 2002-11-04 2004-06-07 Ge Bayer Silicones Gmbh And Co. Kg Linear polyamino and/or polyammonium polysiloxane copolymers i
AU2003281978A1 (en) 2002-11-22 2004-06-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh 2,5-diketopiperazines for the treatment of obesity
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
EP1586983B1 (en) 2003-01-20 2013-06-05 Asahi Kasei EMD Corporation Pointing device
WO2004078940A2 (en) 2003-03-05 2004-09-16 Senesco Technologies, Inc. USE OF ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES OR siRNA TO SUPPRESS EXPRESSION OF eIF-5A1
US20040224912A1 (en) 2003-05-07 2004-11-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression
US7619017B2 (en) 2003-05-19 2009-11-17 Wacker Chemical Corporation Polymer emulsions resistant to biodeterioration
WO2005007810A2 (en) 2003-06-16 2005-01-27 Grinstaff Mark W Functional synthetic molecules and macromolecules for gene delivery
CA2539670A1 (en) 2003-09-15 2005-03-31 Massachusetts Institute Of Technology Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and screening thereof
NZ592917A (en) 2003-09-15 2012-12-21 Protiva Biotherapeutics Inc Stable polyethyleneglycol (PEG) dialkyloxypropyl (DAA) lipid conjugates
US20050069590A1 (en) 2003-09-30 2005-03-31 Buehler Gail K. Stable suspensions for medicinal dosages
BRPI0415204A (pt) 2003-10-10 2006-12-05 Powderject Vaccines Inc construção de ácido nucleico, métodos de obtenção da expressão em células de mamìferos de um polipeptìdeo de interesse, e de imunização com ácido nucleico, partìculas revestidas, receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação mediada por partìculas, dispositivo de liberação mediada por partìculas, e, sequência de promotor quimérico isolada purificada
WO2005037226A2 (en) 2003-10-17 2005-04-28 Georgia Tech Research Corporation Genetically engineered enteroendocrine cells for treating glucose-related metabolic disorders
KR20060111471A (ko) 2003-11-10 2006-10-27 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 디이모늄염 화합물 및 그의 용도
US7022214B2 (en) 2004-01-21 2006-04-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Carrier ampholytes of high pH range
US7556684B2 (en) 2004-02-26 2009-07-07 Construction Research & Technology Gmbh Amine containing strength improvement admixture
US20060228404A1 (en) 2004-03-04 2006-10-12 Anderson Daniel G Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues
WO2005118874A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Wyeth Enhancing protein expression
US7799565B2 (en) 2004-06-07 2010-09-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
US7745651B2 (en) 2004-06-07 2010-06-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB0418172D0 (en) 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102004043342A1 (de) 2004-09-08 2006-03-09 Bayer Materialscience Ag Blockierte Polyurethan-Prepolymere als Klebstoffe
AU2005300638A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
GB0502482D0 (en) 2005-02-07 2005-03-16 Glaxo Group Ltd Novel compounds
CA2597724A1 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
EP1869106B1 (en) 2005-03-28 2014-06-25 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Janus dendrimers and dendrons
EP2476756A1 (en) 2005-06-15 2012-07-18 Massachusetts Institute of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
DK2578685T3 (da) * 2005-08-23 2019-06-03 Univ Pennsylvania Rna indeholende modificerede nukleosider og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US7238791B1 (en) 2005-12-16 2007-07-03 Roche Diagnostics Operations, Inc. 6-monoacetylmorphine derivatives useful in immunoassay
US20090221684A1 (en) 2005-12-22 2009-09-03 Trustees Of Boston University Molecules for Gene Delivery and Gene Therapy, and Methods of Use Thereof
CN100569877C (zh) 2005-12-30 2009-12-16 财团法人工业技术研究院 含多uv交联反应基的分枝状结构化合物及其应用
CA2649325C (en) 2006-04-14 2019-01-08 Epicentre Technologies Corporation Kits and methods for generating 5' capped rna
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
CA2653052A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 The Scripps Research Institute Treatment of protein misfolding
US20070275923A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Nastech Pharmaceutical Company Inc. CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY
US8808681B2 (en) 2006-06-05 2014-08-19 Massachusetts Institute Of Technology Crosslinked, degradable polymers and uses thereof
US20090186805A1 (en) 2006-07-06 2009-07-23 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
ES2293834B1 (es) 2006-07-20 2009-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas.
US8071082B2 (en) 2006-07-21 2011-12-06 Massachusetts Institute Of Technology End-modified poly(beta-amino esters) and uses thereof
MX2009003548A (es) 2006-10-03 2009-04-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulaciones que contienen lipidos.
CA2665620A1 (en) 2006-10-12 2008-04-17 Copernicus Therapeutics Inc. Codon optimized cftr
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
CN101611145B (zh) 2006-12-21 2013-08-14 诺维信股份有限公司 用于在细菌细胞中表达基因的修饰型信使rna稳定化序列
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008097926A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Yale University Transient transfection with rna
WO2008113364A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Recepticon Aps Amino derivatives to prevent nephrotoxicity and cancer
CA2682100C (en) * 2007-03-28 2017-11-21 University Of Iowa Research Foundation Transgenic animal models of disease
JP5186126B2 (ja) 2007-03-29 2013-04-17 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 新規トリアジン誘導体ならびにその製法およびそのガス分離膜としての用途
NZ580973A (en) 2007-04-18 2011-10-28 Cornerstone Pharmaceuticals Inc Pharmaceutical formulations containing lipoic acid derivatives
US8678686B2 (en) 2007-05-01 2014-03-25 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
US20090163705A1 (en) 2007-05-21 2009-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
US8389238B2 (en) 2007-09-12 2013-03-05 Copernicus Therapeutics, Inc. Long-term in vivo transgene expression
AU2008308679B2 (en) 2007-10-02 2015-01-29 Marina Biotech, Inc. Lipopeptides for delivery of nucleic acids
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
EP2500427B1 (en) 2007-11-22 2014-07-30 Japan Science and Technology Agency Translation regulation system in cell or artifical cell model by using low-molecular-weight RNA
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
US9006191B2 (en) 2007-12-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
CA2710983A1 (en) 2007-12-27 2009-10-01 The Ohio State University Research Foundation Lipid nanoparticle compositions and methods of making and using the same
US20110097720A1 (en) 2008-01-02 2011-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
US20090263407A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic Lipids and Uses Thereof
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
US8222221B2 (en) 2008-06-04 2012-07-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Modulation of gene expression through endogenous small RNA targeting of gene promoters
JP5024216B2 (ja) 2008-07-23 2012-09-12 トヨタ自動車株式会社 内燃機関の点火時期制御装置及び点火時期制御方法
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
WO2010025302A2 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Life Technologies Corporation Apparatus for and method of processing biological samples
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
US9139554B2 (en) 2008-10-09 2015-09-22 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
CA2739046A1 (en) 2008-10-16 2010-04-22 Marina Biotech, Inc. Process and compositions for liposomal and effective delivery of nucleic acids
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20120009222A1 (en) 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
MX2011004859A (es) 2008-11-07 2011-08-03 Massachusetts Inst Technology Lipidoides de aminoalcohol y usos de los mismos.
EP3238738B1 (en) 2008-11-10 2020-09-23 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
US20110305769A1 (en) 2008-11-17 2011-12-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system
CA2750561C (en) 2009-01-26 2017-10-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression
US20100222489A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Jiang Dayue D Copolymer composition, membrane article, and methods thereof
CN104922699B (zh) 2009-03-12 2020-07-24 阿尔尼拉姆医药品有限公司 脂质配制的组合物以及用于抑制Eg5和VEGF基因表达的方法
WO2010114789A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 The Siemon Company Telecommunications patch panel
PT2419144T (pt) 2009-04-17 2019-09-16 Univ Oxford Innovation Ltd Composição para a administração de material genético
US9220682B2 (en) 2009-04-22 2015-12-29 Emory University Nanocarrier therapy for treating invasive tumors
KR20220150411A (ko) 2009-05-05 2022-11-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
SI3431076T1 (sl) 2009-06-10 2022-04-29 Arbutus Biopharma Corporation Izboljšana lipidna formulacija
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
CN104651408A (zh) 2009-06-15 2015-05-27 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
CA2767129C (en) 2009-07-01 2015-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
ES2727711T3 (es) 2009-07-30 2019-10-18 Spiral Therapeutics Inc Compuestos inhibidores de Apaf-1
CN102695525B (zh) 2009-07-31 2016-01-20 埃泽瑞斯公司 用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的rna
DE102009043342A1 (de) 2009-09-29 2011-03-31 Bayer Technology Services Gmbh Stoffe für selbstorganisierte Träger zur kontrollierten Freisetzung eines Wirkstoffs
PT2506857T (pt) 2009-12-01 2018-05-14 Translate Bio Inc Entrega de arnm para o acréscimo de proteínas e enzimas em doenças genéticas humanas
SI3112467T1 (en) 2009-12-07 2018-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
SG181904A1 (en) 2009-12-23 2012-07-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
CA2799091A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
SG186085A1 (en) 2010-06-03 2013-01-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the delivery of active agents
CN101863544B (zh) 2010-06-29 2011-09-28 湖南科技大学 一种氰尿酸基重金属螯合絮凝剂及其制备方法
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
EP2691443B1 (en) 2011-03-28 2021-02-17 Massachusetts Institute of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012133737A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 架橋性アミン化合物、該化合物を用いた高分子膜及びその製造方法
EP2705152B1 (en) 2011-05-04 2017-10-25 The Broad Institute, Inc. Multiplexed genetic reporter assays and compositions
WO2012158736A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
EP2532649B1 (en) 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
CA2838063C (en) 2011-06-08 2023-07-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
TR201910686T4 (tr) 2011-06-08 2019-08-21 Translate Bio Inc Mrna iletimine yönelik lipit nanopartikül bileşimleri ve yöntemler.
US9862926B2 (en) 2011-06-27 2018-01-09 Cellscript, Llc. Inhibition of innate immune response
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2755986A4 (en) 2011-09-12 2015-05-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
RU2014117690A (ru) 2011-10-05 2015-11-10 Протива Байотерапьютикс Инк. Композиции и способы для сайленсинга альдегид-дегидрогеназы
EP4074694A1 (en) 2011-10-27 2022-10-19 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid-, peptide- an polypeptide-lipids, isomers, compositions, an uses thereof
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
WO2013090186A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
RU2014129863A (ru) 2011-12-21 2016-02-10 Модерна Терапьютикс, Инк. Способы повышения жизнеспособности или увеличения продолжительности жизни органа или экспланта органа
WO2013101690A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 modeRNA Therapeutics Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
PL3144389T3 (pl) 2011-12-30 2018-10-31 Cellscript, Llc WYTWARZANIE I STOSOWANIE ZSYNTETYZOWANEGO IN VITRO ssRNA DO WPROWADZANIA DO SSACZYCH KOMÓREK W CELU INDUKCJI EFEKTU BIOLOGICZNEGO LUB BIOCHEMICZNEGO
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
DK2817287T3 (da) 2012-02-24 2019-01-02 Arbutus Biopharma Corp Trialkyl kationisk lipid og metoder til anvendelse deraf
DK2830595T3 (da) 2012-03-29 2019-12-02 Translate Bio Inc Ioniserbare kationiske lipider
US9877919B2 (en) 2012-03-29 2018-01-30 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
AU2013243949A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
MX2014015041A (es) 2012-06-08 2015-06-17 Shire Human Genetic Therapies Administración pulmonar de arnm a células objetivo no pulmonares.
ES2826203T3 (es) * 2012-06-08 2021-05-17 Ethris Gmbh Suministro pulmonar de ARN mensajero
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
EP2929035A1 (en) 2012-12-07 2015-10-14 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
EP2931319B1 (en) 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
EP2946014A2 (en) 2013-01-17 2015-11-25 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
EP2968397A4 (en) 2013-03-12 2016-12-28 Moderna Therapeutics Inc DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
JP2016515216A (ja) 2013-03-14 2016-05-26 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのキャップ効率の定量的評価
LT2970456T (lt) 2013-03-14 2021-08-10 Translate Bio, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EA201591229A1 (ru) 2013-03-14 2016-01-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы очистки матричной рнк
CN105051213A (zh) 2013-03-14 2015-11-11 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
EA201591281A1 (ru) 2013-03-14 2016-02-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Рибонуклеиновые кислоты с 4'-тиомодифицированными нуклеотидами и связанные с ними способы
PL2968586T3 (pl) 2013-03-14 2019-01-31 Translate Bio, Inc. Kompozycje mrna cftr i związne z nimi sposoby i zastosowania
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
ES2967701T3 (es) 2013-03-15 2024-05-03 Translate Bio Inc Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas
WO2014144711A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
US9315472B2 (en) 2013-05-01 2016-04-19 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
WO2014210356A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
HRP20211563T1 (hr) 2013-07-11 2022-01-07 Modernatx, Inc. Pripravci koji sadrže sintetske polinukleotide koji kodiraju proteine srodne crispr-u i sintetske sgrna, te postupci njihove uporabe
WO2015011633A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US20160194625A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20160264614A1 (en) 2013-10-02 2016-09-15 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
AU2014337156A1 (en) 2013-10-18 2016-05-12 Modernatx, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
EP4276176A3 (en) 2013-10-22 2024-01-10 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
EP3060671B1 (en) 2013-10-22 2021-12-29 Translate Bio, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
EP3060258A1 (en) 2013-10-22 2016-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
US20170173128A1 (en) 2013-12-06 2017-06-22 Moderna TX, Inc. Targeted adaptive vaccines
US20150167017A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
BR112016014462A2 (pt) 2013-12-30 2017-10-24 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico artificiais
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
US10307472B2 (en) 2014-03-12 2019-06-04 Curevac Ag Combination of vaccination and OX40 agonists
BR112016024644A2 (pt) 2014-04-23 2017-10-10 Modernatx Inc vacinas de ácido nucleico
KR20170075742A (ko) 2014-10-02 2017-07-03 프로티바 바이오쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 제거하는 조성물 및 방법
WO2016071857A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus expression
EP3461904A1 (en) 2014-11-10 2019-04-03 ModernaTX, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
US20170362627A1 (en) 2014-11-10 2017-12-21 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
WO2016118724A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3247398A4 (en) 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016154127A2 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
WO2016183366A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
WO2016197132A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2016201377A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Moderna Therapeutics, Inc. Targeted adaptive vaccines
CN108350455A (zh) 2015-07-29 2018-07-31 阿布特斯生物制药公司 用于使b型肝炎病毒基因表达沉默的组合物和方法
PL3350333T3 (pl) 2015-09-17 2022-03-07 Modernatx, Inc. Polinukleotydy zawierające region stabilizujący ogon
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
WO2017049074A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
JP2021522228A (ja) 2018-04-25 2021-08-30 エスリス ゲーエムベーハーｅｔｈｒｉｓ ＧｍｂＨ Ｒｎａの送達用の脂質に基づく製剤

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