KR102248744B1 - Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용 - Google Patents

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Abstract

포유류 폐를 비롯하여, CFTR 발현을 유도하기 위한 CFTR mRNA의 재료, 제형, 생성 방법 및 전달 방법이 제공된다. 본 발명은 특히 낭포성 섬유증를 치료하는 데 유용할 수 있다.

Description

CFTR MRNA 조성물 및 관련 방법 및 사용{CFTR MRNA COMPOSITIONS AND RELATED METHODS AND USES}
관련 출원
본원은 2013년 3월 14일에 출원된 미국 임시 출원 제 61/783,663호에 대한 우선권을 주장하고, 상기의 개시내용은 본원에 참조로 편입되었다.
본 발명은 낭포성 섬유증 막전위 조절자(CFTR) mRNA 조성물, 상기의 사용 및 상기의 제조 및 사용 방법들에 관한 것이다.
낭포성 섬유증은 상피 세포 내 다수의 다른 이온 통로 및 전송체계의 조절에 관여하는 것으로 여겨지는 염화 이온 통로를 인코딩하는 CFTR 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 유전 질환이다. CFTR의 기능의 상실은 만성 폐질환, 비정상적인 점액 생산 및 기대 수명의 급격한 감소를 초래한다. 일반적으로 Rowe 등, New Engl. J. Med. 352, 1992-2001 (2005) 참조.
1989년 CFTR 유전자를 복제하는 데 성공했으나, 낭포성 섬유증 치료를 위해 CFTR를 대체할 효과적인 치료법은 아직 발견되지 않았다. 폐에서 CFTR의 발현을 유도하려고 시도할 때 겪게 되는 여러 어려움들이 문헌에 기록된 바 있다. 예를 들어, CFTR DNA를 포함하는 바이러스 벡터는 면역 반응을 야기하였고, 투여 후 CF 증상이 지속되었다. Conese 등, J. Cyst. Fibros. 10 Suppl 2, S114-28 (2011); Rosenecker 등, Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 439-45 (2006). CFTR DNA를 비롯한 DNA의 비-바이러스 전달 또한 면역 반응을 야기하는 것으로 보고된 바 있다. Alton 등, Lancet 353, 947-54 (1999); Rosenecker 등, J Gene Med. 5, 49-60 (2003). 더욱이, 비-바이러스 DNA 벡터는 핵공 복합체의 기전이 일반적으로 전사가 일어날 핵에 DNA를 수입(import)하지 않는다는 추가적인 문제와 마주친다. Pearson, Nature 460, 164-69 (2009).
폐에서의 CFTR 발현 유도를 어렵게 하는 또 다른 원인은 폐 환경 그 자체이다. 폐 표면활성 물질(Pulmonary surfactant)이 Lipofectamine (Lipofectamine)(DOSPA:DOPE)과 같은, 양이온성 지질 운반 비히클의 형질전환 효율을 감소시키는 것으로 보고된 바 있다.
Ernst 등, J. Gene Med. 1, 331-40 (1999). 또한, Rosenecker 등, 2003, supra는 중합체-매개 또는 지질-매개 형질전환 중 하나를 방해할 수 있는, 기도 표면 액체에 존재하는 다수의 억제 성분을 확인하였다. 메신저 RNA 치료법이 치료용 또는 대체용 단백질의 발현을 유도하기 위한 일반적인 방식으로서 제안된 바 있다. 숙주에서 단백질 생산의 수단으로서 메신저 RNA(mRNA)를 도입한다는 개념은 이전에 보고된 바 있다(Yamamoto, A. 등 Eur. J. Pharm. 2009, 71, 484-489; Debus, H. 등 J. Control Rel. 2010, 148, 334-343). 그러나, 어떤 리포플렉스 제형들을 사용하는 mRNA 전달에 대해, 분명 폐에 특이적인 어려움들이 보고된 바 있다. 예를 들어, mRNA 또는 DNA를 운반하는 리포플렉스의 체외 및 체내 성능을 비교한 결과, mRNA 조성물이 배양된 세포에서 더 높은 발현을 나타냈으나, 측정 가능한 발현은 마우스의 폐로 비강투여했을 때 DNA 조성물에서만 발견되었다. Andries 등, Mol. Pharmaceut. 9, 2136-45 (2012).
또한 CFTR가 반딧불이 발광효소(luciferase)(FFL)와 같은 모형 또는 보고자 유전자와 비교하여 상대적으로 큰 유전자임을 주목해야 한다. 야생형 CFTR 코딩 서열(서열 식별 번호: 2) 및 FFL 코딩 서열(서열 식별 번호: 7)의 길이를 비교해보자. 길이의 차이는 일부 상황에서 안정성에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 소정 용량의 mRNA가 단백질 발현을 생성할 것인가 그리고 얼마나 생성할 것인가에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, mRNA의 체외 합성이 일반적으로 정상적인 세포 mRNA 및, 바람직하지 않은 오염물질을 구성하는 기타 세포 구성성분들의 부재 때문에 세포에 의한 합성에 바람직할 수는 있지만, CFTR mRNA와 같이 긴 코딩 서열을 사용한 mRNA의 체외 합성이, FFL과 같이 비교적 짧은 코딩 서열을 사용한 mRNA의 체외 합성보다 달성하기 더 어렵다.
PCT 특허공보 WO2007/024708 및 미국 특허 공보 US2010/0203627 및 US2011/0035819에서 CFTR mRNA의 치료용 투여가 논의되었으나, CFTR mRNA의 투여 후 폐에서의 기능적 CFTR의 생산 실현의 감소에 대한 입증, 또는 체외-전사된 CFTR mRNA를 사용하여 폐에서의 CFTR 발현을 유도하는 것과 관련된 어려움들을 극복하기 위한 충분한 지침은 제공하고 않는다. 여기에는 mRNA의 체외 합성을 달성하는 것의 어려움 및 Andries 등, supra와 같은 연구자들이 상응하는 DNA-기반 조성물들이 어느 정도의 수준의 발현을 제공하였으나, 그럼에도 mRNA를 발현 유도에 비효과적이게 만드는 것을 확인한 바 있는 폐-특이적 물질들과 mRNA 조성물과의 상호작용에 특이적인 어려움들이 포함된다.
따라서, 낭포성 섬유증의 치료를 위해, 포유류의 폐를 비롯하여, CFTR 발현의 유도를 위해 물질, 제형, 생산 방법 및 CFTR mRNA의 전달 방법의 개선이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 부분적으로 체내에서 기능적 CFTR 발현을 유도할 수 있는, CFTR mRNA의 제형과 비천연 유래 CFTR mRNA의 개발, 및 이들의 투여 방법을 기초로 한다. 본 발명에 따른 상기 조성물들, 방법들, 및 사용들은 낭포성 섬유증의 효과적인 치료에 적합한 바람직한 안전성 프로파일을 갖는 큰 포유류의 폐에서의 CFTR 발현을 제공할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 CFTR 단백질을 인코딩하는 mRNA의 전달에 의한, 특히 이와 같은 전달이 필요한 개체(예컨대, 포유류)의 폐에서의 CFTR의 체내 생산 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, CFTR 단백질을 인코딩하는 mRNA가 상기 개체의 폐에 직접 전달된다. 본원에 사용되는 용어 "CFTR 단백질"은 천연 유래 CFTR 단백질 활성을 대신하고 및/또는 낭포성 섬유증과 관련된 하나 이상의 증상의 강도, 중증도 및/또는 빈도를 감소시키기 위해 사용되는 전장 CFTR 단백질, 이것의 절편 또는 일부분 모두를 아우른다. 예를 들어, 본 발명에 따른 적합한 CFTR 단백질은 상기 야생형 인간 CFTR 단백질(서열 식별 번호:1)과 동일한 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 적합한 CFTR 단백질은 상기 야생형 인간 CFTR 단백질(서열 식별 번호:1)과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 포유류의 폐 중 상피 세포에서 CFTR 발현을 유도하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유류의 폐 중 상피 세포를 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 조성물 체외 전사된 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물이고; 상기 체외 전사된 mRNA는 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 체외 전사된 mRNA은 서열 식별 번호: 1과 최소한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 포유류 표적 세포에서 CFTR 발현을 유도하는 방법을 제공하는데, 상기방법은 상기 포유류 표적 세포를 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 조성물은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 체외 전사된 mRNA를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 체외 전사된 mRNA은 서열 식별 번호: 1과 최소한 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 코딩 서열, 5'-UTR 및 3'-UTR를 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자를 제공하고, 여기서 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하고, 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 3과 최소한 80% 동일하다. 또 다른 구현예에서, 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 1과 최소한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하고/거나, 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 3과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 코딩 서열, 5'-UTR 및 3'-UTR를 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자를 제공하고, 여기서 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하고, 상기 코딩 서열은 최소한 서열 식별 번호: 2의 야생형 코딩 서열과 비교하여, 표 1에 나열된 상기 코딩 서열의 위치에서 표 1에 나열된 비-야생형 염기를 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 최소한 95% 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 코딩 서열, 5'-UTR 및 3'-UTR를 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자를 제공하고, 여기서 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하고, 상기 코딩 서열은 서열 식별 번호: 2의 야생형 코딩 서열과 비교하여, 표 2에 나열된 코딩 서열의 상응하는 위치에 있는 표 2에 나열된 비- 야생형 염기를 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 최소한 95% 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단일 펩티드용 코딩 서열을 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자를 제공한다.. 특정 구현예에서, 본 발명은 성장 호르몬 선도 서열용 코딩 서열을 포함하는 비천연 유래 mRNA를 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:18 또는 서열 식별 번호:19의 코딩 서열을 포함하는 비천연 유래 mRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 코딩 서열 서열 식별 번호:18 또는 서열 식별 번호:19의 최소한 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 비천연 유래 mRNA를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:9, 서열 식별 번호:10, 서열 식별 번호:11, 서열 식별 번호:12, 서열 식별 번호:13, 서열 식별 번호:14, 서열 식별 번호:15, 서열 식별 번호:16 또는 서열 식별 번호:17의 서열을 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:9, 서열 식별 번호:10, 서열 식별 번호:11, 서열 식별 번호:12, 서열 식별 번호:13, 서열 식별 번호:14, 서열 식별 번호:15, 서열 식별 번호:16 또는 서열 식별 번호:17 중 어는 것의 최소한 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 하나의 서열을 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, RNA 중합효소 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적 조성물으로 충전된 분무화(nebulization) 또는 에어로졸화 장치를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 mRNA 및, 상기 mRNA에서 발현된 기능적 CFTR를 포함하는 배양된 세포를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 기능적 CFTR의 발현을 유도하기 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 사용을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 포유류의 폐 중 상피 세포에서 CFTR 발현을 유도하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 상피 세포를 하나의 조성물과 접촉하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 본 발명에 따른 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 포유류 표적 세포에서 CFTR 발현을 유도하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 포유류 표적 세포를 상기 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 본 발명에 따른 mRNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 CFTR 단백질을 인코딩하는 mRNA를 치료를 필요로 하는 개체에 투여함으로써, 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 mRNA가 상기 개체의 폐에 투여된다. 한 구현예에서, 상기 mRNA가 흡입, 분무화, 비강 투여 또는 에어로졸화에 의해 투여된다. 다양한 구현예에서, mRNA의 투여는 상기 개체의 폐에서 CFTR의 발현을 초래한다..
특정 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료를 필요로 하는 개체의 폐에 투여함으로써 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상기 야생형 인간 CFTR 단백질(서열 식별 번호:1)과 최소한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료가 필요한 개체의 폐에 투여함으로써, 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 특별한 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:3의 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료가 필요한 개체의 폐에 투여함으로써 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 서열 식별 번호:3과 최소한 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료가 필요한 개체의 폐에 투여함으로써 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다.
그 밖의 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 CFTR 단백질을 인코딩하는 mRNA를 제조하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 CFTR mRNA를 체외에서 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 RNA 중합효소와 단리된 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 및 RNA 중합효소는 하나의 세포 내에 포함되지 않고; 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 RNA 중합효소에 대한 템플레이트이고; 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 템플레이트 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하고; 상기 템플레이트 서열은 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 서열에 상보적인 코딩 서열 상보체를 포함하고; 및 (a) 상기 템플레이트 서열은 서열 식별 번호: 2의 상보체보다 더 적은 잠재 프로모터를 포함하거나, (b) 상기 템플레이트 서열은 서열 식별 번호: 2보다 더 적은 직접 및/또는 역 반복을 포함하거나, (c) 상기 템플레이트 서열은 서열 식별 번호: 2보다 더 적은 불리한 코돈의 상보체를 포함하거나, 또는 (d) 코딩 서열 상보체의 GC 서열 식별 번호: 2의 GC 함량보다 낮다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CFTR mRNA를 체외에서 제조하는 방법을 제공하는데, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 RNA 중합효소와 단리된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 및 RNA 중합효소는 하나의 세포 내에 포함되지 않고; 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 RNA 중합효소에 대한 템플레이트이고; 및 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 템플레이트 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하고, 상기 RNA 중합효소는 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를 합성한다.
이와 같은 사용 및 치료 방법의 일부 구현예에서, 상기 체외 전사된 mRNA는 비천연 유래 UTRs를 포함하도록 변형된 인간 CFTR (서열 식별 번호: 2)를 인코딩하는 천연 유래 또는 야생형 mRNA이다. 다른 구현예에서, 상기 체외 전사된 mRNA는 상기 기술된 바와 같이 비천연 유래 mRNA이다.
본 발명의 추가적 목표 및 이점이 부분적으로는 하기의 상세 설명에 제시될 것이고, 부분적으로는 하기 상세 설명에서 분명해지거나 또는 본 발명의 실현에 의해 학습될 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 이점들은 특히 청구항에 제시된 요소들 및 이들의 조합들을 수단으로 실현 및달성될 것이다.
상기의 일반적 상세설명 및 하기의 상세설명 모두 단지 예시 및설명을 위한 것으로 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
본 명세서에 병합되고, 그 일부를 구성하는, 이후 수반되는 도들은 본 발명의 여러 구현예들을 묘사하고, 상기 설명과 함께 본 발명의 원칙을 설명하는 역할을 한다.
도면의 간략한 설명
본 발명의 상기 양태 및 이점들이 하기 수반되는 도를 참조하여 하기의 상세설명에서 분명해질 것이다.
도 1a. 인간 CFTR mRNA로 형질전환하고 24시간 후 인간 CFTR 단백질에 대한 성숙한 "C" 밴드 검출. 미변성된 및 변성된 (SNIM) mRNA (2-티오우리딘 및 5-메틸사이티딘의 25% 포함) 둘 다에 대해 성공적인 단백질 생산을 관찰하였다. R&D Systems MAB25031 항체를 사용하여 면역침강법을 수행하고, Ab570을 사용하여 검출을 수행하였다.
도 1b. PEI/미변성된 인간 CFTR mRNA 나노입자의 노출 24시간 후, CFTR KO 마우스 폐들의 웨스턴 블랏 분석. 대략 1시간을 경과하면서 분무화(Pari Boy jet 네블라이저)를 통해 마우스를 처리하였다. 제공된 방법에 따라 유도된 인간 CFTR 단백질의 면역침강법을 수행하였다. 대조군 마우스에서는 관찰되지 않았지만, 처리된 모든 마우스에서 성숙한 "C" 밴드를 검출하였다.
도 2. 8-Br-cAMP의 전류-전압 플롯이 처리된(4 ug hCFTR mRNA) 및 미처리된 HEK293T 세포의 전류를 유발하였다. 미처리된 세포와 비교하여, 상기의 hCFTR mRNA 형질전환된 세포 내에서 큰 전류가 유도된다. 특이적 CFTR 단백질 억제제, CFTRinh-172에 노출되었던 처리된 세포가 Cl- 이온 전류 흐름의 급격한 감소(~89%)를 나타낸다.
도 3. +80mV 막 전위를 인가했을 때 8-Br-cAMP의 히스토그램 플랏이 처리된(4 ug hCFTR mRNA) 및 미처리된 HEK293T 세포의 전류를 유발시켰다. 미처리된 세포와 비교하여, 상기의 hCFTR mRNA 형질전환된 세포 내에서 큰 전류가 유도된다. 특이적 CFTR 단백질 억제제, CFTRinh-172에 노출되었던 처리된 세포가 Cl- 이온 전류 흐름의 급격한 감소(~89%)를 나타낸다.
도 4. 천연, 포스콜린 및 GlyH-101 노출의 HEK 293 세포의 프로파일들을 비교하는 전류-전압 플랏. 어떤 시나리오에서도 전류의 유의미한 변화가 관찰되지 않았다.
도 5. 처리된(4 ug hCFTR mRNA) 및 미처리된 HEK293 세포의 포스콜린-유발된 전류의 전류-전압 플랏. 미처리된 세포와 비교하여, 상기의 hCFTR mRNA 형질전환된 세포 내에서 큰 전류가 유도된다. 특이적 CFTR 단백질 억제제, GlyH-101에 노출된 처리된 세포가 그래프의 오른쪽 상의 스텝 플로트 (+100 mV)에서 나타나는 바와 같이 Cl- 이온 전류 흐름의 급격한 감소(~95%)를 보여준다.
도 6. 미처리된 (PBS) (왼쪽) 및 처리된(오른쪽) CFTR KO 마우스 폐에서 인간 CFTR mRNA의 현장 혼성화. 마우스를 기도삽관 투여를 통해 PEI 나노입자 중 캡슐화된 미변성된 hCFTR mRNA 30 ug에 노출시켰다. 투여 24시간 후, 양쪽 폐를 통틀어 실질적인 양성 염색이 관찰된다.
도 7. 서로 다른 확대창(최대 20배 확대)에서 인간 CFTR mRNA-처리된 CFTR KO 마우스 폐의 현장혼성화. 마우스를 기도삽관 투여를 통해 PEI 나노입자 중 캡슐화된 미변성된 hCFTR mRNA 30 ug에 노출시켰다.
도 8. 인간 CFTR mRNA-처리된(오른쪽) CFTR KO 마우스 폐의 현장 혼성화를 보여주는 고배율 (40x) 대표 폐 횡단면. 투여 24시간 후, 표적 기관지 상피 세포의 정점 세포질에서 인간 CFTR mRNA가 검출되었다. 마우스를 기도삽관 투여를 통해 PEI 나노입자 중 캡슐화된 미변성된 hCFTR mRNA 30 ug에 노출시켰다.
도 9. 투여 6시간 후(왼쪽) 및 24시간 후(오른쪽), 인간 CFTR mRNA-처리된 CFTR KO 마우스 폐들의 현장 혼성화 염색의 비교. 마우스를 기도삽관 투여를 통해 PEI 나노입자 중 캡슐화된 미변성된 hCFTR mRNA 30 ug에 노출시켰다. 실질적인 양성 염색이 투여 24시간 후 여전히 관찰되지만, 강렬한 양성 세포내 염색은 기관지 및 폐포 영역 내에서 양쪽 폐를 통틀어 6시간 안에 관찰된다.
도 10. 미처리된 (PBS)(위) 및 처리된(아래) CFTR KO 마우스 폐들에서의 인간 CFTR mRNA의 현장 혼성화. 마우스를 기도삽관 투여를 통해 C12-200 지질 나노입자 중 캡슐화된 미변성된 hCFTR mRNA 15 ug에 노출시켰다. 투여 6시간 후, 양쪽 폐를 통들어 실질적인 양성 염색이 관찰된다.
도 11. 인간 CFTR mRNA 처리된 CFTR KO 마우스 폐의 현장 혼성화를 보여주는 고배율(40x) 대표 폐 횡단면. 인간 CFTR mRNA가 투여 6시간 후 세포내 폐포 영역(오른쪽)에서 뿐만 아니라 표적 기관지 상피 (왼쪽)의 정점 세포질에서 검출되었다. 마우스를 기도삽관 투여를 통해 C12-200 지질 나노입자 중 캡슐화된 미변성된 hCFTR mRNA 15 ug에 노출시켰다.
도 12. hCFTR 발현을 위한 서로 다른 세포주의 검사. CHO 및 COS-7 (A) 및, hCFTR 코딩 구조물로 형질전환된 BHK 및 PKC (B) 세포의 면역 블롯. 형질전환 24시간 후, 단백질 용해물을 제조하였고, 주요 항체로 MA1-935를 사용하여 검사하였다. 화살표는 추정상의 CFTR를 가리킨다. 실시예 6에서 MA1-935 특이성에 대한 논의 참조.
도 13. 서로 다른 항-인간 CFTR 항체들의 교차 재활성화. (A) 마우스 항-인간 CFTR MA1-935(Chemicon): (B) 마우스 항-인간 CFTR AB570 (낭포성 섬유증 재단): (C) 마우스 항-인간 CFTR AB596 (낭포성 섬유증 재단): (D) 토끼 항-인간 CFTR G449 (Rockefeller University). 화살표는 CFTR를 가리킨다.
도 14. 세 가지 서로 다른 항체들(R29, R66/17 및 R66/16)을 사용한 인간 CFTR의 면역침강법, 이어서 AB596를 사용한 면역검출법. 1번 줄: T84 세포 (양성 대조군), 2번 줄: 미처리된 돼지 폐 조직 (300 mg), 3번 줄: 처리된 돼지 폐 조직 (697 mg), 4번 줄: 처리된 돼지 폐 조직(163 mg).
도 15. 실시예 6의 HGT5001 제형 중 hCFTR SNIM RNA/10 μg FFL SNIM RNA 20 μg의 IT 스프레이 도포 24시간 후, 마우스의 각각에 면역침강법 및 웨스턴 블랏팅 법. hCFTR의 성숙한 글리코실화된 C-밴드 및 만노실화된 B-밴드를 나타내는 T84 세포가 제공된 양성 대조군. 면역침강된 분획 없는 "상청액" 잔여 세포 추출물 분획. "IP" 면역침강된 분획.
도 16. MAB25031을 사용한 T84 세포로부터의 hCFTR의 면역침강법, 이어서 AB570 (A) 및 MAB1660 (B)를 사용한 면역검출법.
도 17. 서로 다른 구조물로 형질전환하고 72시간 후, NIH3T3 세포로부터 CFTR의 면역침강법.
도 18. 500 ug 단백질 및 MAB1660(왼쪽 및 가운데 패널)을 사용하여, 그리고 증가된 양의 총 단백질 (8 mg) 및 MAB25031(오른쪽 패널)을 사용하여, 서로 다른 구조물로 형질전환하고 72시간 후, NIH3T3 세포로부터의 CFTR의 면역 침강.
도 19. 실시예 6의 PEI 제형 중 hCFTR SNIM RNA 전달 후 돼지 폐 샘플에서, MAB25031을 사용한 hCFTR의 면역 침강 및 AB570을 사용한 추후 면역검출법. 1번 줄: 돼지 #2의 발광효소-음성 왼쪽 꼬리엽(caudal lobe)에서 획득한 샘플, 2번 줄: 돼지 #1의 발광효소-양성 폐 영역에서 획득한 샘플.
도 20. 마취되어 환기장치가 연결된(ventilated) 돼지(왼쪽)에 분무가 수행되었다. 분무장치가 상기 환기 시설에 선으로 연결되었다(오른쪽, 흰색 화살표 참조).
도 21. EFlow 메쉬 네블라이저로, 실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA를 에어로졸 투여한 후 서로 다른 폐 부위로부터 획득한 돼지 조직 샘플들의 균질 현탁액에서 측정된 발광효소 발현. 발광효소 측정 전 밤새 폐 샘플들을 탈체 배양하였다(pg 발광효소/mg 폐 조직).
도 22. 실시예 6의 PEI 제형 중 제형 FFL SNIM RNA 1 mg을 에어로졸 투여한 후 서로 다른 폐 영역에서 획득한 대표적 돼지 조직 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI. 측정 전에 폐 샘플들이 밤새 탈체로 배양되었다.
도 23. PARI BOY 제트 분무장치를 사용한, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 1 mg의 에어로졸 투여 후, 서로 다른 폐 영역들에서 획득된 대표적인 돼지 조직 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI 영상. 측정 전에 폐 샘플들이 밤새 탈체로 배양되었다.
도 24. Aeroneb 메쉬 분무 장치를 사용한, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 및 hCFTR mRNA 각각 1 mg을 에어로졸 투여한 후, 서로 다른 폐 영역들에서 획득한 대표적인 돼지 조직 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI. 측정 전에 폐 샘플들이 밤새 탈체로 배양되었다.
도 25. Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용한, "SHIRE 제형 #3" (HGT5001:DOPE:Chol:DMGPEG2K (50:25:20:5) (몰 비율) 중 FFL SNIM RNA 1 mg을 에어로졸 투여한 후, 서로 다른 폐 영역들에서 획득한 대표적인 돼지 조직 샘플들에서 발광효소 발현의 BLI 측정 전에 폐 샘플들이 밤새 탈체로 배양되었다.
도 26. 하나의 미처리된 대조군 돼지의 서로 다른 폐 영역들에서 획득한 돼지 조직 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI. 기타 미처리된 대조군 돼지가 동일한 결과를 나타내었다(데이터 표시하지 않음).
도 27. 1회-처리된 돼지 #3 및 #6의 폐 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI. 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 및 hCFTR SNIM RNA 각각 1 mg의 에어로졸 투여가 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 수행되었다. 전체 돼지 폐의 슬라이스 조각들이 보인다. 상위 3줄: 돼지 #3, 하위 세줄: 돼지 #6.
도 28. 2회-처리된 돼지 #4 및 #8의 폐 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI. 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 및 hCFTR SNIM RNA 각각 1 mg의 에어로졸 투여가 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 수행되었다. 전체 돼지 폐의 슬라이스 조각들이 보인다. 상위 세 줄: 돼지 #4, 하위 세 줄: 돼지 #8.
도 29. 3회-처리된 돼지 #1 및 #2의 폐 샘플들에서의 발광효소 발현의 BLI. 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 및 hCFTR-mRNA SNIM RNA 각각 1 mg의 에어로졸 투여가 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 수행되었다. 전체 돼지 폐의 슬라이스 조각들이 보인다. 상위 세 줄: 돼지 #1, 하위 세 줄: 돼지 #2.
도 30. 3회 처리된 돼지 #1의 폐 조직 상에서의 발광효소 IHC. 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 및 hCFTR SNIM RNA 각각 1 mg의 에어로졸 투여가 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 수행되었다. 발광효소 발현은 진분홍색(reddish-pink colour)(항-발광효소 pAb 1:300, G7451, Promega, Refine AP-Kit, chromogen: New fuchsine)으로 나타났다.
도 31. 3회 처리된 돼지 #1의 높은 수준의 BLI-양성 폐 조직에 hCFTR IP/WB를 실시하였다. 1번 줄: T84 세포(양성 대조군), 2번 줄: 미처리된 돼지 폐 조직(300 mg), 3번 줄: 처리된 돼지 폐 조직(697 mg), 4번 줄: 처리된 돼지 폐 조직(163 mg). 성숙한 복합체-글리코실화된 hCFTR가 일명 분산된 C-밴드로 나타났다. 만노오스가 풍부한 hCFTR가 좀 더 밀집된 일명 B-밴드로 나타났다. hCFTR 발현이 T84 세포 및, hCFTR SNIM RNA 처리된 돼지 #1의 돼지 폐 조직에서 관찰된 반면, 미처리된 돼지에서는 hCFTR 발현이 관찰되지 않았다.
도 32. 실시예 6의 PEI 제형 중 hCFTR SNIM RNA 전달 후, 돼지 폐 샘플로부터 MAB25031을 사용한 hCFTR의 면역침강 및 AB570을 사용한 추후 면역검출. 1번 줄: 돼지 #2의 발광효소-음성 왼쪽 꼬리엽(caudal lobe)에서 획득한 샘플, 2번 줄: 돼지 #1의 발광효소-양성 폐 영역에서 획득한 샘플.
도 33 a 및 b. C-말단 His10 태깅된(CO-CFTR-C-His10) 및 태깅되지 않은 (CO-CFTR) 코돈 최적화된 인간 CFTR SNIM RNA로 HEK 293T 세포의 체외 형질전환. 형질전환 이후, 전체 세포 용해물이 수집되어 (A) 항-CFTR 항체 #217 및 (B) 항-His 항체 1187를 사용하는 웨스턴 블랏에 의해 인간 CFTR 발현에 대해 분석되었다. 형질전환된 샘플이 비-형질전환된 HEK 293T 대조군 용해물과 비교되었다(3번 줄).
도 33c. 성장 호르몬 선도 서열 및 (GH-CO-CFTR) 또는 C-말단 His10 태깅된 코돈 최적화 인간 CFTR (CO-CFTR-C-His10)을 인코딩하는 SNIM RNA로 HEK 293T 세포의 체외 형질전환. 형질전환 이후, 전체 세포 용해물을 수집하고, 항-CFTR 항체 #217를 사용하는 웨스턴 블랏에 의해 인간 CFTR 발현에 대하여 분석되었다. 형질전환된 샘플이 비-형질전환된 HEK 293T 대조군 용해물과 비교되었다(3번 줄).
도 34. 지질 (cKK-E12) 또는 중합체(PEI) 나노입자 제형 중 하나로 캡슐화된 말단 His10 태깅된 코돈 최적화 인간 CFTR SNIM RNA로 CFTR 녹아웃(knockout) 마우스의 체내 형질전환. 각각의 mRNA 제형의 분무형태의 전달 이후, 오른쪽 및 왼쪽 폐 조직 용해물이 수집되고, 항-His 항체 1187를 사용하여 웨스턴 블랏에 의해 CFTR 발현에 대해 분석되었다. 대조군 CFTR 녹아웃 폐 조직 및 CFTR-His10 HEK293 용해물이 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다.
도 35. 주입수의 분무화 후 수집된 돼지 폐 샘플들에서의 FFL 발현의 생물발광 검출.
도 36. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 1 mg CO-CFTR SNIM RNA으로 분무화한 후 수집된 돼지 폐 샘플들에서 FFL 발현의 생물발광 검출.
도 37. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 5 mg CO-CFTR SNIM RNA으로 분무화한 후 수집된 돼지 폐 샘플들에서 FFL 발현의 생물발광 검출.
도 38. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 10 mg CO-CFTR SNIM RNA으로 분무화한 후 수집된 돼지 폐 샘플들에서의 FFL 발현의 생물발광 검출.
도 39. 서로 다른 코호트에서 CFTR 발현의 상대적 정량화. 밴드 강도가 단백질 사다리에서 150kDa 밴드로 정상화되었다.
도 40. 상피 세포층에서 검출되고 항-CFTR 항체를 사용한 CFTR 면역조직화학 염색을 통해 명확한 막 막으로 국한된 CFTR 신호를 나타내는 최소한 하나의 상피 세포를 갖는 "CFTR-양성" 기관지의 대표적 예.
도 41. 대조군 (WFI) 또는 5 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 돼지 폐에서의 CFTR의 면역조직화학 염색.
도 42. 5 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 항-CFTR로의 면역조직화학 염색에 의한 돼지 폐에서의 검사 결과인 "낮은" CFTR 발현을 나타낸다.
도 43. 5 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 항-CFTR로의 면역조직화학 염색에 의한 돼지 폐에서의 검사 결과인 "중간" CFTR 발현을 나타낸다.
도 44. 5 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 항-CFTR로의 면역조직화학 염색에 의한 돼지 폐에서의 검사 결과인 "높은" CFTR 발현을 나타낸다.
도 45. 대조군 (WFI) 또는 10 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후 돼지 폐에서의 CFTR의 면역조직화학 염색.
도 46. 동물별 CFTR-양성 기관지/세기관지의 상대적 수의 정량화. 에어로졸 투여 24시간 후 각 코호트(WFI; 및 1mg, 5mg, 10mg 인간 CFTR SNIM RNA)의 분석. 150 kDa 단백질 표준에 대한 신호 강도로 정상화된 CFTR 발현. (WFI=9.4±5.6%, 1MG=15.2±6.6%, 5MG=25.4±14.1%, 10MG=20.9±3.7%; WFI vs 5MG p=0.0281, WFI vs 10MG p=0.0174)
도 47. 네블라이저에 의한 주입수의 에어로졸 전달 후, 돼지 폐에서 (A) 유비퀴틴 C 및 (B) dap B의 다중 핵산 현장 검출을 묘사한다.
도 48. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 10 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 돼지 폐에서 (A) 유비퀴틴 C 및 (B) dap B의 다중 핵산 현장 검출을 묘사한다.
도 49. 네블라이저에 의한 주입수의 에어로졸 전달 후, 돼지에서 (A) 오른쪽 두개 및 (B) 왼쪽 두개의 다중 핵산 제자리 검출을 묘사한다.
도 50. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 1 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 돼지에서 (A) 오른쪽 두개 및 (B) 왼쪽 두개의 다중 핵산 제자리 검출을 묘사한다.
도 51. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 5 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 돼지에서 (A) 오른쪽 두개 및 (B) 왼쪽 두개의 다중 핵산 제자리 검출을 묘사한다.
도 52. 분지형 25 kDa PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA + 10 mg CO-CFTR SNIM RNA의 에어로졸 전달 후, 돼지에서 (A) 오른쪽 두측 및 (B) 왼쪽 두측의 다중 핵산 현장 검출을 묘사한다.
도 53. FFL/CO-CFTR-C-His10 mRNA 캡슐화된 cKK-E12 지질 나노입자에 노출 시, 발광을 통한 처리된 돼지 폐에서의 활성 반딧불이 발광효소 (FFL) 단백질의 양성 검출을 묘사한다. 돼지가 Pari 제트 네블라이저를 사용한 분무화를 통해 1 mg FFL + 9 mg CO-CFTR-C-His10 mRNA 캡슐화된 지질 나노입자로 처리되고, 24시간 후 희생되었다. FFL 발광이 IVIS 생체발광측정기(bioluminometer)를 사용하여 가시화되었다.
도 54. 돼지 10, 11 및 12에 투여된 분무화된 복합체(용량 1 mg)를 사용하여 형질전환된 HEK 세포에서 hCFTR 발현의 예시적 결과를 묘사한다.
도 55. 돼지 13, 14 및 15에 투여된 분무화된 복합체(용량 5 mg)로 형질전환된 HEK 세포 및 돼지 19, 20 및 21에 투여된 분무화된 복합체(용량 10 mg)를 사용하여 형질전환된 HEK 세포에서의 hCFTR 발현의 예시적 결과를 묘사한다.
도 56. 돼지 16 (용량 5 mg), 돼지 22(용량 10 mg) 및 돼지 67(용량 1 mg)에 투여된 분무화된 복합체를 사용하여 형질전환된 HEK 세포에서의 hCFTR 발현의 예시적 결과를 묘사한다.
도 57. 돼지 17, 18 (용량 5 mg), 돼지 23, 24 (용량 10 mg) 및 돼지 68, 69 (용량 1 mg)에 투여된 분무화된 복합체를 사용하여 형질전환된 HEK 세포에서의 hCFTR 발현의 예시적 결과를 묘사한다.
발명의 상세 설명
정의
본원에 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA)를 가리키기 위해 사용된다. 용어 폴리뉴클레오티드, 핵산, DNA, RNA 및 mRNA에는 표준 또는 미변성된 잔기; 비표준 또는 변성된 잔기; 및 표준 및 비표준 잔기의 혼합물로 이루어진 분자들이 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "mRNA"는 코딩 영역 및 미코딩 영역을 모두 포함하는 변성된 및 미변성된 RNA를 가리키기 위해 사용된다.
본원에 사용되는 구문 mRNA의 "코딩 영역"은 일반적으로 번역되었을 때 폴리펩티드, 단백질 또는 효소와 같은, 발현 생성물의 생산을 초래하는 일부분을 가리킨다.
"비표준 핵염기"는 천연 염기 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 또는 우라실(U)이 아닌 염기 모이어티이다. 상기 비표준 핵염기는 핵산 이중 나선 에서 이것의 염기쌍 특성들 및 핵산 이중나선에서의 DNA 또는 RNA 중합효소들에 의한 병합 부위(RNA 중합효소에 의한 DNA 템플레이트의 전사 중에 형성되는 것과 같은 국소 RNA-DNA 나선 포함)가 앞서 나열된 5개 핵염기들 중 하나와 가장 비슷할 때 구체적 핵염기(A, C, G, T 또는 U)의 유사체인데, 단, T의 유사체는 일반적으로 U의 유사체이고, 그 반대도 마찬가지다. 두 번째 서열에 대한 첫 번째 서열의 백분율 동일성을 결정하기 위해, 하나의 염기의 하나의 유사체는 천연 염기에 불일치하지 않는다; 예를 들어, 슈도우리딘은 우리딘과 일치하고, 5-메틸사이티딘은 사이티딘과 일치한다.
"뉴클레오시드", "염기", "뉴클레오티드" 또는 "잔기"를, 비제한적으로 비롯한 용어들과 결합하여 사용하는 용어 "비표준"은 "핵염기"와 결합하여 사용될 때와 같은 방식으로 해석되어야 한다.
"GC 함량"은 핵산 서열 중, 구아닌 잔기, 사이토신 잔기, 또는 이들의 유사체인 총 핵염기 잔기의 분획 또는 백분율이다. 예를 들어, 정확히 사이토신 30개, 정확히 구아닌 30개, 정확히 사이토신 유사체 1개 및 정확히 구아닌 유사체를 함유하는 100 nt 서열은 62%의 GC 풍성함(richness)을 갖는다.
본원에 사용되는 "불리한(disfavored) 코돈"은 동일한 아미노산 잔기에 대한 다른 코돈보다 포유류 세포에 의해 덜 효율적으로 또는 덜 빠르게 번역되는 코돈을 가리킨다. 불리한 코돈은 일반적으로 코돈의 3번째 즉 "워블(wobble)" 위치에 A 또는 U가 있는 코돈을 포함한다. 불리한 코돈에 대한 논의는, 예컨대, 미국 특허공보 2009/0069256 A1 참조.
"비천연 유래 mRNA 분자"는 야생형 세포의 정상적인 전사 및 스플라이싱 과정을 거쳐 생성되지 않은 mRNA이다. mRNA는 그것의 서열(예컨대, 어떤 천연 유래 CFTR mRNA에서도 나타나지 않는 일련의 코돈 및/또는 하나 이상의 UTRs)로 인해, 및/또는 이것이 비표준 뉴클레오티드 잔기이기 때문에, 비천연 유래로 분류될 수 있다. 비천연 유래 mRNA 분자는 체외에서 합성될 수 있다.
아래 표 1과 표 2 각각에서, 비야생형 컬럼은 CFTR 코딩 서열에서의 위치(위치)에서의 비-야생형 염기를 가리키고(예컨대, 서열 식별 번호: 3 참조), 야생형 컬럼은 동일한 위치에서 야생형 염기(예컨대, 서열 식별 번호: 2) 또는 인간 CFTR에 대한 RefSeq 입력항목(승인 번호. NM_000492.3, 2013년 2월 10일, 버전, GenBank에서 구입 가능; NM_000492.3의 서열이 비코딩 서열을 함유하여서 상기 코딩 서열이 133 내지 4575번 위치에서 발생하고, 예를 들어, 아래 표들의 7번 위치는 NM_000492.3 서열의 139번 위치에 해당함을 주목해야 한다)을 표시한다.
비천연 유래 CFTR mRNA
본 발명은 천연 유래 또는 야생형 CFTR mRNA(및 상기 mRNA를 포함하는 조성물들)을 사용하여 체내에서 기능적 CFTR를 생성하는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 또한 CFTR 단백질(예컨대, 서열 식별 번호:1)을 인코딩하는 비천연 유래 CFTR mRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 비천연 유래 CFTR mRNA는 정제된 또는 단리된 것이다.
기타 구현예에서, 상기 비천연 유래 CFTR mRNA는 세포에 존재한다. 일부 구현예에서, 비천연 유래CFTR mRNA를 포함하는 세포는 비천연 유래CFTR mRNA를 합성하지 않았고/거나, 상기 비천연 유래 CFTR mRNA에 상보적인 DNA 및/또는 기능적 CFTR 유전자를 포함하지 않고; 상기 세포는 임의로 불활성 CFTR 유전자, 예컨대 상기 유전자의 발현 생성물을 비기능적으로 만드는 무의미, 과오, 틀이동, 삽입 또는 결실 돌연변이를 갖는 CFTR 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 비천연 유래 CFTR mRNA를 포함하는 세포는 상기 비천연 유래 CFTR mRNA에서 번역된 기능적 CFTR 단백질을 추가로 포함한다. 상기 세포는 예컨대, 폐 상피 세포, 간 세포, 또는 신장 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 세포 배양액에 존재한다.
CFTR 코딩 서열
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CFTR mRNA는 서열 식별 번호: 2(즉, 야생형 인간 CFTR의 코딩 서열)보다 잠재 프로모터의 상보체가 적고, 서열 식별 번호: 2보다 직접 및/또는 역반복이 적고, 서열 식별 번호: 2보다 불리한 코돈이 적은 코딩 서열을 포함하고/거나, 상기 코딩 서열의 GC 함량은 서열 식별 번호: 2의 GC 함량보다 낮다.
하나의 서열의 잠재 프로모터, 직접 및/또는 역반복, 및/또는 불리한 코돈은 일반적인 방식을 사용하여 당해기술의 숙련가에 의해 인식될 수 있다. 예를 들어, 하나의 서열의 직접 및/또는 역반복 함량은 서열 분석에 의해 결정될 수 있다(Liu 등, Journal of Theoretical Biology (2014) 344: 19-30). 하나의 서열의 잠재 프로모터 함량은 또한, 서열 분석, 예컨대 구조물 등 내부의 Shine-Dalgarno 서열의 존재에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CFTR mRNA는 체외-전사되는데, 즉, 상기 mRNA는 생체 세포 내부가 아닌 인공적 환경(예컨대, 무세포 체외 전사 체계)에서 합성되었다. 일반적으로, 체외 전사는 적합한 반응 조건(염, 완충용액 및 온도)에서 프로모터 및, 원하는 mRNA(환형 또는 선형일 수 있음)에 상보적인 서열을 포함하는 DNA 템플레이트, RNA 중합효소 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제공하는 단계를 수반한다. RNase 억제제, 환원제 및/또는 피로인산가수분해효소가 반응 혼합물에 존재할 수도 있다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CFTR mRNA는 서열 식별 번호: 2의 야생형 코딩 서열 대비 표 1에 나열된 코딩 서열의 위치들에 있는, 표 1에 나열된 비-야생형 염기의 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 최소한 95%를 포함하는 코딩 서열을 포함한다.
표 1. CFTR를 인코딩하는 mRNA의 코딩 서열에서 사용될 수 있는 비-야생형 염기.
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Figure 112016001735018-pct00111
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CFTR mRNA는 서열 식별 번호: 2의 야생형 코딩 서열 대비, 표 2에 나열된 코딩 서열의 상응하는 위치에 있는 표 2에 나열된 비-야생형 염기의 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 최소한 95%를 포함하는 코딩 서열을 포함한다.
표 2. CFTR를 인코딩하는 mRNA의 코딩 서열에 사용될 수 있는 비-야생형 염기의 하위집단.
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Figure 112016001735018-pct00113
Figure 112016001735018-pct00114
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일부 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 3의 코딩 서열을 포함하는 비천연 유래 CFTR mRNA를 포함한다. 추가적인 예시적 비천연 유래 CFTR mRNA 코딩 서열이 서열의 간략한 설명 부분에, 예를 들어, 서열 식별 번호:9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 중 어느 하나와 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 CFTR mRNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 비천연 유래 CFTR mRNA는 5'UTR, 3'UTR, 신호 펩티드 코딩 서열 또는 아래 기술되는 바와 같은 캡(캡) 또는 꼬리 구조물을 포함한다.
야생형 CFTR 코딩 서열과 다른 코딩 서열을 포함하는 상기의 CFTR mRNA는 효능 및 제조의 용이성과 관련하여 이점들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 CFTR 코딩 서열에 상보적인 템플레이트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용한 체외 전사 반응은 더 큰 RNA 수율을 수득할 수 있고; 상기 템플레이트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 성장하는 동안 좀 더 안정적일 수 있고(즉, 돌연변이가 일어날 가능성이 적고), 이로써 반응에서 사용가능한 템플레이트를 생성하기 위해 필요한 정제의 양을 감소시키고; 및 코딩 서열을 포함하는 mRNA의 체내 번역이 더 높을 수 있다.
신호 펩티드 서열
일부 구현예에서, CFTR 단백질을 인코딩하는 mRNA는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 병합한다. 본원에 사용되는 용어 "신호 펩티드"는 분비 경로를 향한 단백질을 표적으로 삼을 수 있는 신규 합성단백질에 존재하는 펩티드를 가리킨다. 일부 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 mRNA의 번역에 이어 소포체로의 전좌(translocation) 후, 쪼개진다. 신호 펩티드는 또한 신호 서열, 선도 서열 또는 선도 펩티드라고 불린다. 전형적으로, 신호 펩티드는 짧은(예컨대, 5~30, 5~25, 5~20, 5~15 또는 5~10개 아미노산 길이) 펩티드이다. 신호 펩티드는 신규 합성 단백질의 N-말단에 존재할 수 있다. 어떤 특정 이론에 제한되기를 기대하지 않으면서, mRNA를 인코딩하는 CFTR 상에 서열을 인코딩하는 신호 펩티드의 병합은 상기 CFTR 단백질의 체내 분비 및/또는 생산을 촉진할 수 있다.
본 발명의 적합한 신호 펩티드는 다양한 진핵 및 원핵 단백질, 특히 분비된 단백질에서 도출된 이종 서열일 수있다. 일부 구현예에서, 적합한 신호 펩티드는 류신이 풍부한 서열이다. Yamamoto Y 외 (1989), Biochemistry, 28:2728-2732 참조(본원에 참조로 편입되었음). 적합한 신호 펩티드는 인간 성장 호르몬(hGH), 혈청 알부민 프레프로프로테인, Ig 카파 경쇄 전구체, 아주로시딘 프레프로프로테인, 시스타틴-S, 트립시노겐 2 전구체, 칼륨 통로 차단제, 알파 코노톡신 lp1.3, 알파 코노톡신, 알파-갈락토시다아제, 셀룰로오스, 아스파르트산 단백질가수분해효소 네펜데신-1, 산 키티나아제, K28 프레프로-독성물질, 킬러 독성물질 자이고신 전구체 및 콜레라 유독성분에서 유도될 수 있다. 예시적 신호 펩티드 서열이 Kober, 등, Biotechnol. Bioeng., 110: 1164-73, 2012에 기술되어 있고, 상기 내용이 본원에 참조로 편입되었다.
일부 구현예에서, mRNA를 인코딩하는 CFTR는 인간 성장 호르몬(hGH), 또는 그것의 절편에서 유도된 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 편입시킬 수 있다. 비제한적인, hGH 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하기에 나타나 있다.
5' 인간 성장 호르몬(hGH) 서열 (서열 식별 번호:18):
AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCCCUGGUUGCAAGAAGGAUCGGCUUUCCCGACCAUCCCACUCUCC
선택적 5' 인간 성장 호르몬(hGH) 서열 (서열 식별 번호:19):
AUGGCAACUGGAUCAAGAACCUCCCUCCUGCUCGCAUUCGGCCUGCUCUGUCUCCCAUGGCUCCAAGAAGGAAGCGCGUUCCCCACUAUCCCCCUCUCG
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 mRNA는 서열 식별 번호:18 또는 서열 식별 번호:19와 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 인코딩하는 신호 펩티드를 편입시킬 수 있다.
5'- UTR , 3'- UTR , 폴리 -A 꼬리, 캡 및 비표준 뉴클레오티드 잔기
일부 구현예에서, 상기 mRNA는 서열 식별 번호: 4와 동일하거나 또는 서열 식별 번호: 4와 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일한 그것의 5'-UTR 중 한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 mRNA는 서열 식별 번호: 5와 동일하거나 또는 서열 식별 번호: 5와 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99% 동일한 그것의 3'-UTR 중 하나의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리-A 꼬리는 최소한 70, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개 잔기의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 폴리-A 꼬리는 70~100, 100~120, 120~150, 150~200, 또는 200~300, 300~400, 또는 400~500개 잔기의 범위의 길이를 갖는다. 폴리 A 꼬리는 당해기술에서 인정된 다양한 기법을 사용하여 첨가될 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 꼬리가 폴리 A 중합효소를 사용하여 합성 또는 체외 전사된 RNA에 첨가될 수 있다(Yokoe, 등 Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터 또한 긴 폴리 A 꼬리를 인코딩할 수 있다. 뿐만 아니라, 폴리 A 꼬리는 PCR 생성물로부터 직접 전사에의해 첨가될 수 있다. 폴리 A는 또한 RNA 리가아제로 감각 RNA의 3' 말단에 연결될 수도 있다(예컨대, Molecular Cloning A Laboratory Manua1, 2nd Ed., ed. Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edition)참조). 일부 구현예에서, 폴리-U 또는 폴리-C 꼬리는 폴리-A 꼬리를 대사하여 또는 이에 덧붙여 사용될 수도 있다. 예를 들어, mRNA를 인코딩하는 CFTR는 3' 폴리(C) 꼬리 구조를 가질 수 있다. mRNA의 3' 말단 상의 적합한 폴리-C 꼬리는 전형적으로 약 10 내지 200개 사이토신 뉴클레오티드(예컨대, 약 10 내지 150개 사이토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개 사이토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개 사이토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 60개 사이토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 40개 사이토신 뉴클레오티드)를 포함한다. 상기 폴리-C 꼬리는 폴리-A 꼬리에 첨가될 수도 있고, 또는 폴리-A 꼬리를 치환할 수도 있다.
일부 구현예에서, 상기 mRNA는 5'-캡, 예를 들어, 캡 1 구조물을 포함한다. 효소 캡 mRNA 및 절차에 대해, 예컨대, Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249; European patent publication 2 010 659 A2; U.S. Patent No. 6,312,926 참조. 5' 캡는 전형적으로 다음과 같이 첨가된다: 우선, RNA 말단 인산분해효소가 5' 뉴클레오티드의 말단 인산기들 중 하나를 제거하고, 말단 인산염 2개를 남긴다; 그러고나서 구아노신 삼인산(GTP)이 구아닐산 전달효소를 통해 상기 말단에 첨가되어, 5'5'5 삼인산 연결을 생성하고; 마지막으로 구아닌의 7-질소가 메틸전달효소에 의해 메틸화된다. 캡 구조물의 예에는, 비제한적으로 m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G이 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 mRNA는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 상기 비표준 뉴클레오티드 잔기는 예컨대, 5-메틸-사이티딘 ("5mC"), 슈도우리딘 ("ψU"), 및/또는 2-티오-우리딘 ("2sU")을 포함할 수 있다. 예컨대, 이와 같은 잔기 및 이들의 mRNA 병합에 대한 논의는 미국 특허 제8,278,036호 또는 WO2011012316 참조. 일부 구현예에서, mRNA는 SNIM RNA일 수 있다. 본원에 사용되는 SNIM RNA는 PCT 공보 WO 2011/012316에 기술된 바와 같이, IVT 반응에서의 변성된 뉴클레오티드의 특정 백분율을 포함하는 체외 전사(IVT)에 의해 생성된 메신저 RNA를 지명하는, 안정화된 비-면역성 메신저 RNA의 두문자어이다. 본원에 개시된 예들에서 사용되는 SNIM RNA는 U 잔기의 25%가 2-티오-우리딘이고, C 잔기의 25%가 5-메틸사이티딘인 IVT에 의해서 생성되었다. 비표준 뉴클레오티드 잔기의 존재가 동일한 서열을 가지고 있으나 단지 표준 잔기만 함유한 대조군 mRNA보다 상기 mRNA를 좀 더 안정화시킬 수 있고 및/또는 면역성을 줄일 수도 있다. 추가적인 구현에에서, 상기 mRNA는 아이소사이토신, 슈도아이소사이토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린 사이토신, 이들 변성체 및 기타 핵염기 변성체의 조합들 중에서 선택된 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다. 어떤 구현에들은 추가로 푸라노오스 고리 또는 핵염기의 추가적 변성체를 포함할 수 있다. 추가적 변성체는 예를 들어, 설탕 변성체 또는 치환체(예컨대, 2'-O-알킬 변성체, 잠금 핵산 (LNA) 중 하나 이상)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 RNA는 추가적 폴리뉴클레오티드 및/또는 펩티드 폴리뉴클레오티드(PNA)와 복합체를 형성하거나 또는 혼성화될 수 있다. 설탕 변성체가 2'-O-알킬 변성체인 구현예에서, 이와 같은 변성체에는 비제한적으로 2'-데옥시-2'-플루오로변성체, 2'-O-메틸 변성체, 2'-O-메톡시에틸 변성체 및 2'-데옥시 변성체가 포함될 수 있다. 어떤 구현예에서, 이들 변성체 중 어떤 것은 개별적으로 또는 조합하여, 뉴클레오티드의 0~100%, 예를 들어, 구성 뉴클레오티드의 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상으로 포함할 수 있다.
CFTR mRNA를 포함하는 조성물
어떤 구현예에서, 본 발명의 mRNA 분자는 벌거숭이, 즉 패키지에 넣지 않은 mRNA로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 mRNA의 투여는 적합한 운반체의 포함에 의해 촉진될 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 운반체는 하나 이상의 mRNA로 표적 세포의 형질전환을 촉진할 수 있는 능력을 기반으로 선택된다.
본원에 사용되는 용어 "운반체"는 일반적으로 mRNA를 비롯한 생물학적 활성 제제의 투여와 결합하여 사용하기 위한 표준 약제학적 운반체, 비히클, 희석제, 부형제 등 어떤 것을 포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물에서 활용되는 운반체는 리포좀 소포, 또는 표적 세포 및/또는 조직으로의 mRNA의 운반을 용이하게 하는 기타 수단들을 포함할 수 있다. 적합한 운반체에는, 비제한적으로, 중합체 기반 운반체, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI) 및 다중-도메인-블록 중합체, 지질 나노입자 및 리포좀, 나노리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오 리포좀, 천연 및 합성유도 엑소좀, 천연, 합성 및 반-합성 박막층체, 나노미립자, 칼슘 포스포-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자, 건조 분말, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 전분-기반 전달 체계, 미셀, 에멀션, 졸-겔, 니오좀, 플라즈미드, 바이러스, 인산칼슘 뉴클레오티드, 앱타머(aptamers), 펩티드, 펩티드 접합체, 소규모-분자 표적된 접합체, 및 기타 벡터 태그가 포함된다. 또한 적합한 운반체로 바이오나노캡슐 및 기타 바이러스 캡시드 단백질 집합체의 사용이 고려되고 있다 (Hum. Gene Ther. 2008 Sep;19(9):887-95).
일부 구현예에서, 상기 운반체는 유기 양이온, 예컨대 양이온성 지질 또는 양이온성 유기 중합체를 포함한다. 상기 양이온성 지질은, 존재할 경우, mRNA를 캡슐화하는 리포좀 소포의 성분일 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 운반체는 단독으로 또는 다른 운반체와 조합하여, 중합체를 하나의 운반체로 사용하여 제형화된다. 적합한 중합체에는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알키시아노아크릴레이트, 폴리락티드, 폴리락티드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리캐프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알긴산염, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민, PEG화된 프로타민, PLL, PEG화된 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI)이 포함될 수 있다. PEI가 존재할 경우, 분자량이 10 내지 40 kDa인 분지형 PEI, 예컨대, 25 kDa 분지형 PEI (Sigma #408727)일 수 있다. 본 발명에 적합한 추가적 예시적 중합체에는 PCT 공보 WO2013182683에 기술된 것들이 포함되는데, 상기의 내용은 본원에 참조로 편입되었다.
표적 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하는 리포좀 운반체의 사용이 본 발명에서 고려되었다. 리포좀(예컨대, 리포좀 지질 나노입자)은 체내에서 일반적으로 연구, 산업 및 의학계에서, 특히 진단용 또는 치료용 화합물의 운반체로서 이들의 사용을 위해, 다양한 응용 분야에서 활용가능하고(Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond 등, Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999), 보통 하나 이상의 이중층의 막에 의해 외부 매체로부터 외딴 내부 수성 공간을 갖는 소수포액(microscopic vesicles)이란 특징을 갖는다 리포좀의 이중막이 전형적으로 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 기원의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 형성된다(Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). 상기 리포좀의 이중막은 또한 양친매성 중합체 및 계면활성제(예컨대, 폴리머로솜, 니오좀, 등)에 의해 형성될 수 있다.
어떤 구현예에서, 상기 mRNA는 지질 나노입자와 복합체가 형성되어 상기 표적 세포로의 전달을 용이하게 한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 mRNA 캡슐화를 위해 하나 이상의 양이온성 지질, 추가적 지질, 예컨대 비-양이온성 지질(또한 헬퍼 지질), 콜레스테롤-기반 지질, 및/또는 PEG화된 지질을 활용하는 다중-구성 지질 혼합물과 조합될 수 있다.
양이온성 지질
일부 구현예에서, 적합한 지질 나노입자는 양이온성 지질을 함유한다. 본원에 사용되는 구절 "양이온성 지질"은 선택된 pH, 예컨대 생리학적 pH에서의 순 양성 전하량를 갖는 수많은 지질 종들 중 어느 하나를 가리킨다. 일부 양이온성 지질, 특히 적정가능한 또는 pH-적정 가능한 양이온성 지질라고 알려진 것들은 mRNA를 전달하는 데 효과적이다. 여러 양이온성(예컨대, 적정 가능한) 지질이 문헌에 기술된 바 있고, 이들 중 다수는 상업적으로 구입 가능하다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 특히 적합한 양이온성 지질에는 국제특허공보 WO 2010/053572(및 특히, [00225]절에 기술된 C12-200) 및 WO 2012/170930에 기술된 것들이 포함되는데, 이들 둘은 본원에 참조로 편입되었다. 일부 구현예에서, 상기 양이온성 지질 cKK-E12가 사용되고(WO 2013/063468에 개시됨), 상기의 내용은 전체가 본원에 참조로 편입되었다. 일부 구현예에서, 상기 양이온성 지질 N-[l-(2,3-디올레이록시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 즉 "DOTMA"이 사용된다. (Feigner 등 (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); U.S. Pat. No. 4,897,355). DOTMA는 단독으로 또는 중성 지질, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민, 즉 "DOPE" 또는 기타 양이온성 또는 비-양이온성 지질과 함께 조합하여 리포좀 운반 비히클 또는 지질 나노입자로 제형화될 수 있고, 이와 같은 리포좀은 표적 세포로의 핵산의 전달을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 양이온성 지질에는 예를 들어, 5-카르복시스페르밀글리시네디옥타데실아미드, 즉 "DOGS," 2,3-디올레이록시-N-[2(스페르민-카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄, 즉 "DOSPA" (Behr 등 Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); U.S. Pat. No. 5,171,678; U.S. Pat. No. 5,334,761), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판, 즉 "DODAP", 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판, 즉 "DOTAP"이 포함된다. 고려되는 양이온성 지질에는 또한 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DSDMA", 1,2-디올레이록시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DLinDMA", 1,2-디리노레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 즉 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 즉 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 즉 "DDAB", N-(1,2-디미리스타일옥시프로-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 즉 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스, 시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판 즉 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-l-(시스,시스-9', 1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 즉 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레이록시벤질아민 즉 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레오일옥시-Ν,Ν-디메틸프로필아민 즉 "DLinDAP", 1,2-N,N'-디리놀레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DLincarbDAP", 1,2-디리놀레오일카바밀-3-디메틸아미노프로판 즉 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 즉 "DLin- -DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 즉 "DLin-K-XTC2-DMA", 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민 (DLin-KC2-DMA)) (WO 2010/042877; Semple 등, Nature Biotech. 28: 172-176 (2010) 참조), 또는 이들의 혼합물들이 포함된다. (Heyes, J., 외, J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., 등, Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT 공보 WO2005/121348A1).
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 미국 임시 특허출원 제61/617,468호(2013년 3월 29일 출원, 본원에 참조로 편입됨)에 기술된 이온화가능 양이온성 지질, 예컨대 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-l-일)테트라코사-15,18-디엔-1-아민 (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민 (HGT5001), 및 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민 (HGT5002)을 포함하는 지질 나노입자를 활용한다.
일부 구현예에서, 이와 같은 조성물에 존재하는 양이온성 지질들 중 하나 이상은 이미다졸, 디알킬아미노 또는 구아니디늄 모이어티 중 최소한 하나를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 양이온성 지질들 중 하나 이상은 4급 아민을 포함하지 않는다.
비- 양이온성 / 헬퍼 지질
일부 구현예에서, 적합한 지질 나노입자는 하나 이상의 비-양이온성("헬퍼") 지질을 함유한다. 본원에 사용되는 용어 "비-양이온성 지질"은 모든 중성, 쌍성이온성 또는 음이온성 지질을 가리킨다. 본원에 사용되는 용어 "음이온성 지질"은 선택된 pH, 예컨대 생리학적 pH에서 순 음성 전하량을 갖는 수많은 지질 종들 중 어느 하나를 가리킨다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 중성 지질, 즉 조성물이 제형화되고 및/또는 투여되는조건에서 순 전하량을 갖지 않는 지질이다. 비-양이온성 지질에는, 비제한적으로 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트라스 PE, l-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 또는 이들의 혼합물이 포함된다.
콜레스테롤-기반 지질
일부 구현예에서, 적합한 지질 나노입자는 하나 이상의 콜레스테롤-기반 지질을 포함한다. 예를 들어, 적합한 콜레스테롤-기반 양이온성 지질에는 예를 들어, 콜레스테롤, PEG화된 콜레스테롤, DC-초이(N,N-디메틸-N-에틸카복사미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진 (Gao, 외 Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf 외 BioTechniques 23, 139 (1997); U.S. Pat. No. 5,744,335), 또는 ICE가 포함된다.
PEG화된 지질
일부 구현예에서, 적합한 지질 나노입자는 하나 이상의 PEG화된 지질을 포함한다. 예를 들어, 예컨대 N-옥타노일-스핀고사인-l-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000] (C8 PEG-2000 세라마이드-)를 비롯한 유도된 세라마이드(PEG-CER)와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변성된 인지질 및 유도된 지질이 본 발명에 의해 하나 이상의 양이온성 물질과 조합하여, 그리고 일부 구현예에서, 다른 지질과 조합하는 것이 고려되었다. 일부 구현예에서, 적합한 PEG화된 지질은 아실 사슬이 더 짧은 (예컨대, C14 또는 C18) PEG-세라마이드를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질 DSPE-PEG-말레이미드-렉틴이 사용될 수도 있다. 기타 고려되는 PEG-변성된 지질에, 비제한적으로, C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유결합으로 부착되는 길이 최대 5 kDa의 폴리에틸렌 글리콜 사슬이 포함된다. 특정한 이론에 제한될 것이라는 기대 없이, PEG화된 지질의 첨가가 복합체 응집을 방지하고 순환 수명을 증가시켜 표적 세포로의 리포좀 캡슐화된 mRNA의 전달을 용이하게 할 수 있을 것으로 고려된다.
어떤 구현예에서, 상기 조성물은 아래와 같은 지질들의 조합 중 하나를 포함한다:
C12-200, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
HGT5000, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
HGT5001, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
XTC, DSPC, 콜레스테롤, PEG-DMG;
MC3, DSPC, 콜레스테롤, PEG-DMG;
ALNY-100, DSPC, 콜레스테롤, PEG-DSG;
cKK-E12, DOPE, Cho1, PEGDMG2K.
일부 구현예에서, 지질:mRNA 비율은 5:1(mg:mg), 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 이상, 최대 30:1(mg:mg) 그 이상일 수 있다. N/P 비율은 1.1:1 내지 10:1 그 이상일 수 있다. 예시적 지질 비율은 40:30:20:10, 55:20:20:5, 50:25:20:5 (양이온성 지질:헬퍼 지질:chol:PEG 지질)이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 점액용해제(예컨대, N-아세틸시스테인, 에르도스테인, 브롬헥신, 카보시스테인, 기아페네신 또는 요오드화 글리세롤)를 포함하지 않는다.
약제학적 조성물로 충전된 장치
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 예컨대 비천연 유래 CFTR mRNA를 포함하는 양이온성 지질-기반 또는 PEI-기반 조성물이 한 개체의 호흡기에 투여되기 위해 장치에 충전되어 제공된다. 상기 장치는 예컨대, 점적, 에어로졸화 또는 분무화 장치일 수 있다. 적합한 장치에는 예를 들어, PARI Boy 제트 네블라이저, Aeroneb® Lab 네블라이저, MicroSprayer® 또는 EFlow 메쉬 네블라이저가 포함된다. 선택적으로, 건조 분말 흡입기 또는 에어로졸화 장치, 예컨대 휴대용 흡입기가 사용될 수 있다.
용법 및 방법
본 발명에 따른 용법 및 방법을 위한 mRNA
무엇보다, 본 발명은 특히 포유류의 폐에서, CFTR 단백질의 체내 생성을 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 포유류의 폐에서 상피 세포 중 CFTR 발현을 유도하는 방법을 제공하는데, 상기 방법에는 체외 전사된 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물과 상기 상피 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 체외 전사된 mRNA는 서열 식별 번호: 1 (야생형 인간 CFTR의 아미노산 서열)을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 체외 전사된 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 사용을 제공하고, 여기서 체외 전사된 mRNA는 포유류의 폐에서 상피 세포 중 CFTR 발현의 유도를 위해, 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 포유류 표적 세포에서의 CFTR 발현을 유도하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조성물과 상기 포유류 표적 세포를 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 조성물은 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 체외 전사된 mRNA를 포함한다. 본 발명은 추가로 조성물의 사용을 제공하고, 상기 조성물은 포유류 표적 세포에서의 CFTR 발현의 유도를 위해, 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 체외 전사된 mRNA를 포함한다.
이와 같은 용법 및 치료 방법의 일부 구현예에서, 상기 체외 전사된 mRNA는 인간 CFTR (서열 식별 번호: 2)를 인코딩하는 천연 유래 또는 야생형 mRNA다. 다른 구현예에서, 체외 전사된 mRNA는 앞서 기술된 비천연 유래 mRNA이다.
어떤 구현예에서, 상기 체외 전사된 mRNA는 서열 식별 번호: 2(야생형 인간 CFTR mRNA 코딩 서열)와 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92% 95% 또는 100% 동일한 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다.
서열 식별 번호: 2와 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA는 앞서 논의된 mRNA보다 더 많은 잠재 프로모터, 직접 및 역반복, 및/또는 GC 함량을 가질 수 있다. 서열 식별 번호: 2를 포함하는 벡터들이 종종 전형적인 성장 조건 하의 숙주 세포에서, 삽입/결실/재배열 돌연변이를 겪어서, 체외 전사에 직접적으로 쓰일 수 없는 이종 계층의 벡터들이 생성되는 것이 관찰되었다. 저온, 부드러운 빛 및/또는 저단위 반복(low copy) 세포 예컨대 CopyCutter®와 같은 조건 하의 숙주 세포의 성장이 돌연변이의 발현을 감소시키나, 없애지는 못한다는 것이 관찰되었다. 따라서, 서열 식별 번호: 2와 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 코딩 서열을 포함하는 mRNA의 체외 전사 반응이, 앞서 기술된 바와 같이 벡터를 생육하고, 상기 벡터를 수확 및 선형화하고, 상기 전사 반응에 사용하기 위한 원하는 종을 정제함으로써 획득한 템플레이트를 사용하는 것이 권장될 수 있다. 정제 단계는, 예컨대, 크기배제 크로마토그래피 또는 약한 음이온 교환일 수 있다.
본 발명에 따른 용법 및 방법을 위한 체외 전사된 mRNA는 이와 같은 특징들과 관련하여 상기의 섹션에서 논의된 바와 같이, 5'-UTR, 3'UTR, 폴리-A, 폴리-U 및/또는 폴리-C 꼬리, 캡, 및/또는 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다.
용법 및 방법을 위한 약제학적 조성물
본 발명에 따른 용법을 위한 약제학적 조성물은 앞선 섹션에서 논의된 바와 같이 본 발명에 따른용법 및 방법을 위한 mRNA 및 CFTR mRNA를 포함하는 조성물과 관련하여 앞선 섹션에서 논의된 바와 같은 추가적 성분들을 포함할 수 있다. 따라서, 앞서 논의된 운반체들 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물의 사용 및/또는 투여가 고려된다.
일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 PEI, 예컨대 분자량이 10~40 kDa, 예를 들어, 25 kDa인 분지형 PEI이다.
다른 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 양이온성 지질, PEG화된 지질 및 추가적 지질(예컨대 중성 지질)을 포함한다. 상기 양이온성 지질, PEG화된 지질, 및/또는 추가적 지질이 CFTR mRNA를 포함하는 조성물과 관련된 상기의 섹션에 나열된 것들 중에서 선택될 수 있다.
폐에서의 발현을 유도하기 위한 투여 경로
포유류의 폐에서의 CFTR 발현을 위한 방법 및 사용의 일부 구현예에서, 앞서 기술된 약제학적 조성물은 기도삽관 점적, 분무화 및 에어로졸화에서 선택된 경로로 투여된다. 상기 조성물을 투여하기 위한 장치는 약제학적 조성물로 충전된 장치와 관련하여 앞선 섹션에서 나열된 장치들에서 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 분무화 또는 에어로졸화를 통해 투여된다. 일부 지질 제형은 분무화가 시도될 경우, 응집되는 경향일 있을 수 있는데, 일반적으로 상기 제형을 조절함으로써, 예컨대, 양이온성 지질을 치환함으로써, 응집 문제를 해결할 수 있다.
낭포성 섬유증의 치료
다른 무엇보다, 본 발명은 낭포성 섬유증 치료를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에 본원에 기술된 CFTR 단백질을 인코딩하는 mRNA 또는 상기 mRNA를 함유하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 mRNA 또는 상기 mRNA를 함유하는 약제학적 조성물이 개체의 폐에 직접 투여될 수도 있다. 폐 전달을 위한 다양한 투여 경로가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 mRNA 또는 mRNA를 함유하는 조성물이 흡입, 분무화 또는 에어로졸화에 의해 투여된다. 다양한 구현예에서, 상기 mRNA의 투여는 상기 개체의 폐(예컨대, 폐의 상피 세포)에서의 CFTR의 발현을 야기한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료를 필요로 하는 개체의 폐에 투여함으로써 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호:1과 최소한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료를 필요로 하는 개체의 폐에 투여함으로써, 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 3의 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료를 필요로 하는 개체의 폐에 투여함으로써, 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 3과 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하는 mRNA를, 치료를 필요로 하는 개체의 폐에 투여함으로써, 낭포성 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 낭포성 섬유증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 예시적 비천연 유래 CFTR mRNA는 "서열의 간략한 설명" 섹션에 기술된 것으로, 예컨대 서열 식별 번호:9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이다. 일부 구현예에서, 낭포성 섬유증를 치료하기 위해 사용될 수 있는 비천연 유래 CFTR mRNA는 서열 식별 번호: 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 중 어느 하나와 최소한 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함한다.
실시예
하기의 구체적인 실시예들은 어떤 방식으로든 본 개시의 나머지 부분에 대해 묘사하기 위해 구성된 것일 뿐, 제한하지는 않는다. 추가 상세 설명 없이, 당해기술의 숙련가는 본원의 설명을 기반으로, 본 발명을 십분 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 개시된 실시예들에서 사용되는 CFTR mRNA 및 SNIM RNA는 서열 식별 번호: 4의 서열을 갖는 5' UTR, 서열 식별 번호: 3의 서열을 갖는 코딩 서열 (CDS) 및 서열 식별 번호: 5의 서열을 갖는 3' UTR를 포함하였다. 본원에 개시된 실시예에 사용된 FFL mRNA 및 SNIM RNA는 각각 서열 식별 번호: 6, 7 및 8의 서열들을 갖는 5' UTR, CDS 및 3' UTR을 포함하였다.
실시예 1: 체외 에서 합성된, CFTR를 인코딩하는 mRNA
메신저 RNA 합성. 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR) mRNA 및 반딧불이 발광효소(FFL) mRNA를, 상기 유전자를 인코딩하는 플라즈미드 DNA 템플레이트로부터의 체외 전사에 의해 합성하고, 이어서 5' 캡 구조물(캡 1)(Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) 및 겔 전기영동법에 의해 결정된 대략 200개 뉴클레오티드 길이의 3' 폴리(A) 꼬리를 첨가하였다. 5' 및 3' 미번역 영역이 각 mRNA 생성물에 존재하였다.
예시적 비천연 유래CFTR mRNA에 "서열의 간략한 설명" 섹션에 기술된 서열 식별 번호:9, 서열 식별 번호:10, 서열 식별 번호:11, 서열 식별 번호:12, 서열 식별 번호:13, 서열 식별 번호:14, 서열 식별 번호:15, 서열 식별 번호:16 또는 서열 식별 번호:17이 포함된다.
실시예 2: HEK 세포에서 CFTR 발현 및 활성
본 실시예는 완전히 기능적 CFTR 단백질이 세포에 전달되는 합성 인간 CFTR mRNA에서 발현됨을 입증한다.
세포 및 CFTR 형질전환. 인간 배아 신장 HEK293T 세포를 10% 태아소혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Invitrogen Cat # 11965-092)에서 배양하였다. 형질전환 1일 전, 세포를 50~60%의 밀집도로 6-웰 플레이에 플레이팅하여 정상적인 조직 배양 조건(36℃, 5% CO2, 95% 공기의 습한 대기) 하에서 배양하였다. 60 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat # 11668019)을 900 μl OptiMem 감소 혈청 배지 (Invitrogen Cat # 31985-062)에 희석시키고, 부드럽게 교반하였다. 24 μg CFTR mRNA (플레이트당 4 μg)를 900 μl OptiMem 배지에 희석시켰다. mRNA를 즉시 희석된 리포펙타민에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 플레이팅 배지를 HEK293T 세포로부터 흡입하여 1 ml OptiMem 감소 혈청 배지로 대체하였다. mRNA/Lipofectamine 복합체 300 μl를 각 웰에 첨가하고, 상기 세포가 폴리-L-라이신 코팅된 유리 커버 슬립(BD Biosciences, BD Biocoat) 상에서 기계적 분리에 의해 다시 플레이팅되기 전 24시간 동안 정상적인 조직 배양 조건 하에 방치하여 상기 세포는 쉽게 전기생리학적 기록를 위해 기록실로 전달될 수 있었다. 추가로 최호 24시간 동안 표준 조직 배양 조건 하에서 세포를 배양하고 최종 플레이팅 48시간 안에 사용하였다.
전기생리학적 기록. 실온에서 5~8 MΩ 전극을 가진 Axopatch 200B 증폭기를 사용하여 전체-세포 패치-클램프 기록을 수행하였다. 데이터를 디지털화(50 kHz)하고 적절히 필터링(5 kHz)하였다. 전압 오류를 최소화하기 위해 직렬 저항을 보충하였다(70-80%). 하기 조성물로 이루어진 피펫 용액으로 전압-클램프 기록을 수행하였다: 140 mM NMDG-Cl; 5 mM EGTA; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES; pH 7.2; 310 mOsm/l. 수조 용액(bathing solution)은 140 mM NaC1, 3 mM KC1, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 및 10 mM HEPES를 함유하고; pH 7.3, D-글로코오스로 315 mOsm/l로 조정. 전체-세포 구성을 설정하고 3~5분 후, 전압 클램프 기록을 시작하였다.
-60 mV 또는 0 mV의 홀드 전위(holding potential)에서 세포를 전압-클램프하였고, 일련의 양성 및 음성 전압 단계(-80 mV 내지 +80 mV 또는 -100 내지 +100 mV, 20 mV씩 증가하여)를 기록된 HEK293T 세포에 주입하여 CFTR-유도 전체-세포 클로라이드 (Cl-) 전류를 유도하였다. cAMP의 막투과 유사체, 8-Br-cAMP(500 μM, Sigma Aldrich)를 기록된 세포에 4분 동안 적용하여 CFTR 전류를 용이하게 하였다. '황금-표준' CFTR 차단제인 CFTRinh-172(10 μM, Sigma)를 각 기록의 말단에 적용하여 CFTR 유도 Cl- 전류를 차단하였다. 비-형질전환된 HEK293T 세포에서 대조군 기록을 수행하였다.
검사 화합물. 기록된 세포에서 대략 200 μm 놓인 이젝션 피펫으로 DAD-16VC 빠른 관류 시스템 (ALA Scientific Instruments, USA)을 사용하여 검사 화합물을 도포하였다. ddH20에서 500 mM 보관 농도로 8-Br-cAMP를 만들었다. DMSO 중 10 mM 보관 농도로 CFTRinh-172를 만들었다. 모든 화합물을 -20℃에 보관하여 신속하게 해동하고 사용 직전에 원하는 최종 농도로 희석하였다.
분석. 모든 분석은 클램프피트(MDS Analytical Technologies) 및 엑셀(Microsoft) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 모든 값은 최대 유도된-피크 전류 진폭이다. 상기 데이터의 통계학적 차이를 스튜던트 t-검정으로 평가하고, 적절하게 짝을 이루거나 이루지 못하고, P < 0.05에서 유의미하다고 고려되었다.
체외 인간 CFTR 단백질 생산. hCFTR mRNA를 통한 인간 CFTR 단백질 생산을, 본원에 기술된 HEK293T 세포에서 인간 CFTR mRNA의 형질전환을 통해 수행하였다. 처리된 및 미처리된 세포를 형질전환 24시간 후, 수확하여 면역침강법을 시행하였다. 웨스턴 블랏 분석을 통한 인간 CFTR 단백질의 검출은 완전한 복합체 글리코실화된 CFTR 단백질("C" 밴드로 지정)이 합성 메신저 RNA에서 생산됨(도 1a)을 입증한다.
체외 인간 CFTR 단백질 활성. 형질전환 후 생성된 합성 인간 CFTR mRNA-유도 CFTR 단백질의 활성을 계산하기 위해, HEK 293 및 HEK 293T 세포에서 전체 세포 패치 클램프 분석법을 수행하였다. 대조군 세포(미처리된 및 거짓 형질전환된)뿐만 아니라 처리된 세포에 활성체(8-Br-cAMP, 포스콜린) 및 억제제(CFTRinh-172, GlyH-101) 기질을 처리하여 전류 흐름(염화 이온 전송)의 변화를 계산하였다.
HEK293T 세포를 hCFTR mRNA 4 ug으로 형질전환하고, 형질전환 24시간 후 분석하였다. 전체 세포 클램프 분석법을 수행하여, 설정 전압의 적용 시 염화 이온 전송으로 표현되는 전류 흐름을 측정하였다. 전압 램프 -80 mV 내지 +80 mV의 결과로서 전류 대 전압의 플롯(도 2에 묘사)은 미처리된 대 hCFTR mRNA-처리된 세포를 비교할 때, 전류의 실질적인 차이를 보여준다. CFTR 단백질의 활성체로 알려진 8-Br-cAMP에 노출된 후 상기와 같은 전류의 증가는 인간 CFTR 단백질이 이들 세포에 존재한다는 점을 시사한다. 이와 같이 사전에 형질전환된 세포를 알려진 특이적 CFTR 억제제, CFTRinh-172로 처리할 때, 각각의 전류는 거의 대조군 수준으로 급락한다(~89% 감소). 이와 같은 억제제에 노출된 후 상기의 감소는 인간 CFTR 단백질의 존재를 강하게 뒷받침한다. 요약하면, 이와 같은 결과들은 합성 hCFTR mRNA가 활성 인간 CFTR 단백질을 생산할 수 있음을 입증한다.
별도로, HEK293 세포 내 자동화 시스템(IonWorks)을 사용하여 CFTR 전체 세포 활성 분석법을 수행하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 대조군 세포 (미처리된 및 거짓 형질전환된)뿐 아니라 처리된 세포에 활성체 및 억제제 기질을 적용하여 전류 흐름의 변화(염화 이온 전송)를 계산하였다. 이와 같은 연구들에서 CFTR 단백질 활성체로서 포스콜린를 활용하였고, hCFTR mRNA-형질전환된 세포의 일부분은 추가로 다른 특이적 CFTR 억제제, GlyH-101에 노출시켰다. GlyH-101은 상기 단백질의 세포외 막면에 작용하는 CFTR 기공 차단제 작용을 하는 것으로 보인다. 주목할 만한 점은 이와 같은 작용기전이 CFTR 단백질의 세포내 면에서 작용하는 것으로 보고된 CFTRinh-172의 작용기전과 다르다는 것이다.
도 4는 GlyH-101뿐만 아니라 포스콜린으로 처리된 모(parental) HEK293 세포주의 전류-전압 플롯을 나타낸다. 전류의 유의미한 변화는 관찰되지 않았고, 이것은 이와 같은 특이적 CFTR 활성체/억제제가 상기 세포주에 존재하는 내생적 단백질에 어떤 영향도 미치지 않음을 시사한다.
전압 램프 -100 mV 내지 +100 mV의 결과인 전류-전압 플롯(도 5)은 미처리된 HEK293 세포와 hCFTR mRNA-처리된 세포를 비교할 때 전류의 실질적인 차이를 보여준다. CFTR 단백질의 알려진 활성체인 포스콜린에 노출된 후, 이와 같은 전류의 증가는 상기 세포에 인간 CFTR 단백질이 존재함을 시사한다. 이와 같이 사전에 형질전환된 세포를 다른 특이적 CFTR 억제제인 GlyH-101로 처리할 때, 각각의 전류는 거의 대조군 수준으로 급락한다(~95% 감소). 이와 같은 억제제에 노출된 후 상기의 감소는 인간 CFTR 단백질의 존재를 강하게 뒷받침한다.
종합하면, 두 개의 서로 다른 메커니즘의 결과인 이들 억제 데이터는 합성 인간 CFTR 메신저 RNA에서 유도된 완전한 기능적 CFTR 단백질의 존재를 강하게 뒷받침한다.
실시예 3: CFTR의 체내 발현
본 실시예는 폐 투여를 통해 전달된, CFTR를 인코딩하는 mRNA에서 CFTR 단백질이 체내에서 효과적으로 발현됨을 입증한다.
제형 프로토콜 1. C12-200의 에탄올 용액의 50 mg/mL의 분취액, DOPE, Chol 및 DMG-PEG2K를 혼합하고 에탄올로 희석하여 최종 부피 3 mL로 만들었다. 별도로, CFTR mRNA의 수성 완충 용액(10 mM 구연산염/150 mM NaC1, pH 4.5)을 1 mg/mL 저장품으로 제조하였다. 상기 지질 용액을 수성 mRNA 용액에 빠르게 주입하고 흔들어 20% 에탄올의 최종 현탁액을 수득하였다. 수득된 나노입자 현탁액을 여과하고, 1x PBS(pH 7.4)로, 이어서 물로 완전여과하고, 농축하여 2~8oC에서 보관하였다. 최종 농도 = 1.09 mg/mL CFTR mRNA (캡슐화됨). Z평균 = 80.2 nm (Dv(50) = 55.5 nm; Dv(90) = 99.6 nm).
제형 프로토콜 2. 수성 용액 PEI(분지형, 25 kDa) 2.0 mg/mL의 분취액을 CFTR mRNA의 수성용액(1.0 mg/mL)과 혼합하였다. 수득된 복합체 혼합물을 여러 차례 위아래로 피펫팅하고 주입 전 20분 동안 놓아 두었다. 최종 농도 = 0.60 mg/mL CFTR mRNA (캡슐화됨). Z평균 = 75.9 nm (Dv(50) = 57.3 nm; Dv(90) = 92.1 nm).
기도삽관으로 투여된 mRNA-충전 나노입자를 통해 생성된 FFL 및 CFTR 단백질의 분석. 모든 연구는 암컷 BALB/C 마우스 또는 CFTR KO 마우스를 사용하여 실시하였다. 캡슐화된 FFL mRNA의 각각의 용량의 직접 점적법(MicroSprayer®) 또는 분무법(PARI Boy 또는 Aeroneb) 중 한 가지 방법을 통해 FFL 샘플들을 주입하였다. PARI Boy 제트 네블라이저를 사용하여 CFTR mRNA를 주입하였다. 발현할 시간을 준 후, 마우스를 희생시켜 식염수를 관류시켰다.
FFL mRNA의 기도삽관 투여. MicrosprayerTM(50 μL/동물)를 통한 단일 기도삽관 에어로졸 투여로 FFL 실험 재료를 투여하는 동안 동물들을 케타민 50~100 mg/kg과 자일라진 5~15 mg/kg의 혼합물의 복강내 주입으로 마취시켰다.
FFL mRNA의 분무화(에어로졸) 투여. Aeroneb® Lab 네블라이저(공칭 투여 부피, 최대 8 mL/그룹)를 통한 단일 에어로졸 흡입으로 FFL 실험 재료를 투여하였다. 상기 시험 재료를 동물들 전체 그룹(n=4)이 담긴 상자에 전달하고, 산소 흐름 및 스캐빈저 장치에 연결하였다.
CFTR mRNA의 투여. 아래 실시예 6에 기술된 방식으로 CFTR mRNA를 제조하였다. 4마리 CFTR 녹아웃 마우스를 에어로졸실에 넣고, 대략 1시간 경과하는 동안 분무화(Pari Boy 제트 네블라이저)를 통해 2 mg 총 코돈 최적화 미변성된 인간 CFTR mRNA(서열 식별 번호: 3의 코딩 서열 포함)에 노출시켰다. 노출 24시간 후, 마우스를 희생시켰다.
안락사. 동물들을 용량 투여 후 전형적인 시간에 CO2 질식(± 5%)으로 안락사시키고, 이어서 개흉술 및 방혈을 실시하였다. 전체 혈액(최대 획득가능한 부피)를 심장천자를 통해 수집한 후, 폐기처분하였다.
관류. 방혈 후, 모든 동물에 식염수로 심장 관류를 실시하였다. 요약하면, 식염수 함유한 10 mL 주사기에 부착된 23/21 게이지 바늘을 관류를 위해 좌심실의 내강에 꽂아, 전신 심장내 관류를 수행하였다.. 우심방을 절개하여 관류액의 배출구를 제공하였다. 바늘을 심장에 꽂은 후, 플런저에 부드럽고 지속적인 압력을 가하여 동물의 관류를 실시하였다. 기존 관류액이 깨끗이 흐를 때(가시적인 혈액 없음)(플러싱 용액이 전신을 포화시켰으며 절차가 완료되었음을 나타냄), 플러싱 용액의 충분한 흐름을 확보하였다.
조직 포집. 관류 후, 모든 동물에게서 간과 폐(오른쪽 및 왼쪽)를 수확하였다. 선택 그룹은 대략 간의 절반과 폐 양쪽(오른쪽 및 왼쪽)을 액체 질소에서 냉동시켜 별도로 공칭온도 -70oC에서 보관하였다. 선택 그룹은 대략 간의 절반을 동물 한 개체 당 하나의 조직학 카세트(histology cassette)에 배치하였다. 추가적으로, 상기 폐를 기도로 삽입된 캐뉼라를 통해 10% NBF로 부풀렸다. 상기 기도를 끈으로 묶어, 양쪽 폐(오른쪽 및 왼쪽) 및 기도를 동물 한 개체 당 하나의 조직학 카세트에 온전히 놓았다. 모든 조직학 카세트를 주변 온도에서 24시간 동안 10% NBF에서 보관한 후, 70% 에탄올로 옮겼다.
FFL-처리된 마우스에서의 FFL 발현. 조직 샘플들의 분석 시, FFL-처리된 마우스에서 FFL 발현을 검출하였다(데이터 표시하지 않음).
CFTR 녹아웃 마우스에서의 CFTR 발현. CFTR 발현을 CFTR mRNA-처리된 마우스 폐의 면역침강법-웨스턴 블랏 분석법에 의해 검출하였다. 모든 처리된 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 폐에서 성숙한 "C" 밴드를 검출한 반면, 대조군 마우스에서는 관찰되지 않았다(도 1b). 사용한 항체들은 면역침강법의 경우 MAB25031(R&D Systems)였고, 웨스턴 블랏 분석법을 통한 검출의 경우 SAB4501942(Sigma)였다.
본원에 표시된 결과들은 CFTR 단백질이 mRNA의 폐 전달을 기반으로, 체내에서 성공적으로 발현될 수 있음을 시사한다. 더욱이, CFTR mRNA가 성공적으로 CFTR 녹아웃 마우스의 폐에 전달되어 결과적으로 폐에서 효과적인 단백질 생산을 야기한다는 사실은 CFTR mRNA 기반 체내 단백질 생성이 CFTR 단백질 결핍을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 중합체 나노입자를 사용한 CFTR mRNA의 폐 전달
마우스의 폐로 인간 CFTR 메신저 RNA의 전달은 분무화뿐만 아니라 직접 점적(instillation)을 통해 완성될 수 있다. 현장 혼성화 법을 사용하여, 인간 CFTR mRNA-충전 나노입자의 마우스로의 기도삽관 투여 후, 인간 CFTR mRNA를 성공적으로 검출할 수 있다. 중합체 나노입자(예컨대, 폴리에틸렌이민, PEI)뿐만 아니라 지질-기반 나노입자(예컨대 C12-200)를 활용하여, 투여가 달성될 수도 있다.
중합체 나노 운반체를 사용한 CFTR mRNA의 투여. CFTR KO 마우스를 기도삽관 투여(30 ug 캡슐화된 mRNA)를 통해, 폴리에틸렌이민(PEI)-기반 CFTR mRNA 충전 나노입자로 처리하였다. 상기 처리된 마우스를 투여 6시간 후 그리고 24시간 후 희생시키고, 양쪽 폐를 수확하여 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 고정시켰다. 외생 인간 CFTR mRNA의 검출을 위해 현장 혼성화를 활용하였다(도 6). 처리된 CFTR KO 마우스의 양쪽 폐에서, 투여 24시간 후, 광범위한 분배로 마우스의 실질적인 염색을 관찰한 반면, PBS-처리된 대조군 마우스의 경우 염색을 관찰하지 못했다.
고배율(최대 20배율)에서의 처리된 폐의 분석은 양쪽 폐의 기관지 및 폐포 전체의 광범위한 양성 세포내 염색을 드러냈다(도 7). 추가 배율을 설정했을 때(40x), 표적 정단 기관지 상피 세포의 세포질 내 양성 염색을 관찰하였다(도 8). 따라서, 메신저 RNA API를 표적 정단 기관지 상피 세포로 성공적으로 전달할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 추가로, 투여 6시간 후, 실질적인 염색을 관찰할 수 있었던 반면, hCFTR mRNA의 유의미한 양성 검출은 24시간 후 여전히 관찰할 수 있었다(도 9).
실질적인 양성 세포내 염색은 투여 24시간 후, 양쪽 폐 전체에서, 기관지와 폐포 영역 내에서 관찰되었다.
실시예 5: 지질-기반 나노입자를 사용한 CFTR mRNA의 폐 전달
지질-기반 나노운반체를 사용한 CFTR mRNA의 투여. 앞서 언급된 바와 같이, 인간 CFTR mRNA의 성공적인 폐 전달은 지질 나노입자 기반 전달 비히클을 통해 달성될 수 있다. 본원에 양이온성 지질 성분으로 C12-200을 활용하는 hCFTR mRNA-충전 양이온성 지질 나노입자의 예들이 개시된다.
CFTR KO 마우스의 양쪽 폐 내에서의 인간 CFTR mRNA의 성공적인 검출은 현장 혼성화를 통해 달성하였다. 녹아웃 마우스를 C12-200-기반 지질 나노입자에 캡슐화된 hCFTR mRNA 15 ug 으로 처리하고, 투여 6시간 후에 희생시켰다. PBS-처리된 대조군 마우스와 비교하여, 양쪽 폐의 기관지 및 폐포 전역에서 hCFTR mRNA의 양성 검출을 관찰하였다(도 10).
추가 배율로 설정할 시(40x), 세포내 말단 폐포 영역뿐만 아니라 기관지 상피 세포의 정점 세포질 내에서 인간 CFTR mRNA의 양성 검출을 관찰하였다(도 11).
종합하면, 합성 인간 CFTR 메신저 RNA의 성공적인 전달은 중합체(PEI) 및 지질 나노입자-기반(C12-200) 전달 체계들을 활용하여 달성될 수 있다. 이와 같은 체계들은 마우스의 표적 세포들 내에 약물 성분들의 세포내 축적을 제공하였다. 추가로, 투여 24시가 후 이들 표적 세포들에 hCFTR mRNA의 실질적인 양이 존재하였다.
실시예 6: 특이적 항체를 사용한 인간 CFTR 발현의 입증
마우스, 돼지 및 배양된 세포에서의 인간 CFTR 단백질 검출의 항체 입증. hCFTR 단백질에 특이적이고, 마우스 및 돼지 유사체와 교차반응하지 않으며, 향후 실험을 위해 충분한 공급량으로 활용가능한 가능한 항체를 확인하기 위해 실험을 수행하였다. 요약하면, 학문적 및 상업적 공급원으로부터의 다양한 항-hCFTR 항체들의 실험은 결과적으로 마우스 또는 돼지 CFTR에 대한 교차-반응 없이 면역침강법 및 웨스턴 블랏팅 (IP/WB) 후, 인간 CFTR 단백질을 검출할 수 있는 항-hCFTR 항체들의 조합을 확인하였다. 따라서, 마우스 또는 돼지 CFTR 중 하나를 위한 교차-반응 없는 hCFTR 단백질의 검출을 위한 적합한 항-hCFTR 항체들을 IP/WB 결과들을 기반으로 확인하였다.
세포를 hCFTR mRNA로 형질전환하였고, 형질전환 24시간 후, ProteoExtract 막관통 Kit(Merck)를 활용하여 단백질 용해물을 제조하고, 마우스 항-인간 CFTR 항체(MA1-935)를 사용하여 hCFTR를 위해 웨스턴 블랏팅으로 막관통 분획을 검사하였다. 16HBE 세포에서 유래된 용해물을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 12a가 CHO 및 COS-7 세포에서 유래된 데이터를 제공한다.
새끼 햄스터 신장 세포(BHK)(문헌에서 CFTR-음성으로 기술됨)를 CHO 및 COS-7 세포와 유사하게 형질전환시켰고, 단백질 용해물을 웨스턴 블랏으로 검사하였다. 이전에 공개된 보고서와 대조되게, CFTR에 대한 분명한 양성 신호가 마우스 단일클론 항-CFTR 항체(도 12b)를 사용하여 관찰될 수 있다. 웨스턴 블랏 분석에 사용되는 항체의 특이성을 실험하기 위해, Eckhardt Wolf 교수(Ludwig Maximilians University, Munich)에 의해 제공된, CFTR-녹아웃 돼지(PKC)에서 유래된 돼지 신장 세포를 형질전환 실험에 사용하였고, CFTR 발현에 대해 단백질 용해물을 검사하였다. 도 12b에 분명하게 나타나듯이, CFTR에 대한 신호가 PKC 세포에서 검출될 수 없었다. 그러나, 형질전환은 검출가능한 어떤 hCFTR 발현도 야기하지 않았다. 형질전환에 대한 대조군으로 발광효소를 사용하자, PKC 세포가 CHO 또는 COS-7 세포와 비교하여, 몇 배 덜 효율적으로 발광효소를 발현함이 발견되었다. 형질전환 이후 검사된 어떤 세포주에서도 hCFTR 밴드의 강도에 어떤 유의미한 차이도 검출되지 않았기 때문에, hCFTR에 대해 더 높은 민감도와 특이성을 갖는 다른 hCFTR 항체들에 대한 광범위한 검사를 수행하였다.
웨스턴 블랏s을 통한 항체 검사. 서로 다른 주요 항체들(MA1-935(Thermo Scientific Pierce Antibodies, Rockford, IL, USA), AB596(Cystic Fibrosis Consortium, University of Pennsylvania, PA, USA) 및 AB570(Cystic Fibrosis Consortium, University of Pennsylvania, PA, USA))을 사용하는 면역 블랏팅을 위해 사용되는 ProteoExtract 막관통 키트(Merck) 및 막관통 분획을 사용하여 인간 기관지 상피 세포주(BEAS-2B), 인간 배아 신장 세포주 (HEK), 마우스 폐 및 돼지 폐에서 단백질 용해물을 제조하였다.. 상기 데이터를 도 13으로 요약하였다.
MA1-935가 세 종 모두에서 CFTR을 검출한 반면, AB596은 인간 및 마우스 CFTR는 검출하나, 돼지는 검출하지 않았고, 항체 G449는 오직 인간 CFTR만을 특이적으로 검출하였다. AB570으로는, 마우스 및 돼지 샘플들에서 관찰되는 약간의 저분자량 밴드들이 실제로 CFTR인지 또는 비특이성 생성물인지 분명하지 않았다. 추후 실험(데이터 표시 하지 않음)에서, MA1-935가 CFTR이 아닌 밴드를 인식함이 발견되었다. 따라서, 일반적으로, MA1-935의 결과가 다른 항체들을 사용하여 생성된 결과들을 확인시켜주는 것으로 고려되었으나, 사용된 항-CFTR 항체가 MA1-935였던 실험들은 결론을 제공하는 실험으로 고려되지 않았다.
조직 샘플들에서의 hCFTR (IP- hCFTR )의 면역침강법 . 검사된 모든 항체들이 여러 개의 비특이성 밴드를 생성하였고, 그들 중 어떤 것도 hCFTR의 특징적인 밴딩(온전한 글리코실화된 단백질을 나타내는 C-밴드 및 핵심 만노실화된 형태를 나타내는 B-밴드) 을 생성하지 않았다는 점을 고려할 때, 검출의 민감도 및 특이성을 높이기 위해 hCFTR의 면역침강법 (IP) 및 웨스턴 블랏에 의한 차후 검출을 설정하였고, 그 결과 신호 대 노이즈 비율이 증가되었다.
초기 IP 실험은 2012년에 van Barneveld 등이 Immunochemical analysis of Mutant CFTR in Lung explants, Cell Physiol . Biochem . 30, 587-595 (2012))에 의해 공개된 프로토콜 및 항체들을 사용하여 Prof. Brkhard
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(Medizinsche Hochschule Hannover)와의 공동작업으로 수행하였다. IP 실험을 위한 양성 대조군으로 hCFTR를 과발현하는 인간 결장암 세포(T84)를 사용하였다.
아래 실시예 8에 기술된 바와 같이, 서로 다른 세 가지 항체들(R29, R66/17 및 R66/16)을 사용한 hCFTR의 면역침강법과 이어서 AB596을 사용한 면역검출법이 hCFTR SNIM RNA의 에어로졸로 처리된 돼지의 폐에서 획득된 단백질 용해물에서 hCFTR의 특이적 검출을 야기하였다(도 14).
HGT5001 제형. HGT5001:DOPE;Chol;PEGDMG2K (상대적 양 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg))의 제형("HGT5001 제형") 중 hCFTR SNIM RNA를 사용하는 에어로졸 실험을 마우스에 수행하였고, mRNA 전달 24시간 후 단리된 폐에서 획득한 단백질 용해물을 돼지 용해물과 동일한 항체들 및 조건들을 사용하여 IP에 의해 분석하였다. 그러나, 마우스 샘플들에 대한 특징적인 성숙한 CFTR 밴딩 패턴이 검출될 수 없었다(도 15).
체외-형질전환된 세포에서 유래된 hCFTR (IP-hCFTR)의 면역침강법. 돼지에서 유래된 조직 재료를 사용한 최초 IP 결과는 전사 전달 후 체내에서 hCFTR 검출의 기술적 가능성에 대한 증거를 제공하였다. 그런, CFTR를 면역침강하는 데 사용된 항체들(R29, R66/17 및 R66/16) 중 어떤 것도 상업적으로 구입할 수 없기 때문에, IP 반응에서 효능에 대해 다른 상업적으로 구입 가능한 항체들을 검사하였다. R&D systems의 두 가지 항체(MAB25031 및 MAB1660)를 검사하였다.
T84 세포에서 단백질 용해물을 제조하고, 서로 다른 농도의 MAB25031 항체를 사용하는 IP 반응에 총 단백질 500 μg을 사용하였다. 면역침강된 hCFTR 단백질의 양을, 그러고 나서 AB570(Cystic Fibrosis Foundation)을 사용하는 면역 블롯팅에 의해 검출하였다. 이와 같은 조건 하의 AB596은 훨씬 더 높은 배경을 초래하였고, 그래서 추가로 검사하지 않았다. 도 16a에서 나타나 듯이, IP 항체의 농도를 2 μg/ml에서 4 μg/ml로 증가시켰을 때, CFTR 단백질의 추가적인 증가는 없었다. 온전히 글리코실화된 및 오직 핵심 글리코실화된 형태(각각 C-밴드 및 B-밴드) 둘 다 검출되었다. 또한, 웨스턴 블랏에서 MAB1660을 주요 항체로 사용하여 동일한 면역침강물을 검사하였다. 상기 항체의 경우, 밴드-C만이 보였다(도 16b).
MAB25031 항체를 사용하여 T84 면역침강물에서 내생적 hCFTR을 성공적으로 검출한 후, 형질전환 후 hCFTR 단백질의 검출을 목적으로, NIH3T3 세포에서 실험을 수행하였다. NIH3T3 세포을 hCFTR SNIM RNA로 형질전환하였다. 형질전환 72시간 후 단백질 용해물을 제조하였고, BCA 법을 사용하여 상기 단백질의 양을 정량화하였다. MAB25031 항체 2 μg/ml을 사용하여 총 단백질 용해물 500 μg에서 인간 CFTR 단백질을 면역침강하였고, 이어서 AB570을 사용하여 면역 블롯팅하였다(도 17). 그러나, CFTR는 검출할 수 없었다. 형질전환 그 자체가 CFTR 단백질의 양에 미치는 영향에 대한 대조군 샘플들로 mRNA를 인코딩하는 LacZ로 형질전환된 세포를 분석하였다.
면역침강법에 사용된 총 단백질의 양을 500 μg에서 8 mg으로 증가시켰으나, AB570로 면역검출법 후, 어떤 검출가능한 hCFTR 단백질이 생성되지 않았다. 또 다른 hCFTR 특이적 항체, MAB1660(R&D Systems) 또한 면역침강법에 대한 검사를 실시하였다(도 18). 그러나, 이 항체는 MAB25031만큼 효과적으로 CFTR를 침강시키지 않았다. 따라서, 향후 모든 면역침강법은 MAB25031로 수행하였다.
표지 유전자로 발광효소를 사용한 운동학적 실험들이 mRNA의 최대 발현이 형질전환 24시간 후에 관찰됨을 보여주었기 때문에, mRNA 형질전환된 샘플들에서의 hCFTR 검출의 부재가 반드시 검사된 mRNA의 기능성의 부재를 의미하는 것은 아닐 것이다. hCFTR 검출의 부재는 오히려 검사된 샘플들의 불충분한 hCFTR 농도 또는 적용된 항체들의 특이성의 부재 때문이다.
PEI 제형. 다음과 같이 제조된 25 kDa 분지형 PEI ("PEI 제형")로 나노입자 제형의 hCFTR SNIM RNA의 돼지로의 전달(실시예 7 참조)에서 hCFTR를 검출할 가능성에 대해, 설정된 조건들을 검사하였다. SNIM RNA 필요량을 주입수(Braun, Melsungen)에 적용하기 직전에 희석시켜, 총 부피 4 ml로 만들고, N/P 비율 10인 피펫을 사용하여 분지형 PEI 25 kDa의 수성 용액 4 ml에 재빨리 첨가하였다. 상기 용액을 위아래로 피펫팅 10회하여 혼합하고, 지시된 네블라이저를 사용하여, 개별 4.0 ml의 2개 분획을 돼지 폐에 차례로 분무하였다. 발광효소 활성이 검출되지 않아서, mRNA 전달 및/또는 발현의 부재를 시사하는, 돼지 #1의 발광효소 발현 폐 영역에서 획득한 하나의 샘플과 돼지 #2의 꼬리엽에서 획득한 또 다른 샘플을 양성 및 음성 대조군으로 선택하였다. 이와 같은 샘플들에서 제조된 단백질 용해물을 MAB25031(R&D Systems)을 사용하여 면역침강시키고, AB570을 사용하여 hCFTR 단백질을 검출하였다. 도 19에 나타난 바와 같이, 발광효소 발현은 hCFTR mRNA의 발현과 상관관계가 있다. 발광효소 활성이 검출될 수 없었던 돼지 #2의 왼쪽 꼬리 엽에서 획득한 샘플은 또한 음성 hCFTR에 대해 음성(1번 줄)이었던 반면, 발광효소에 대해 양성(2번 줄)이었던 돼지 #1의 샘플들에서 hCFTR가 검출되었다.
실시예 7: mRNA의 에어로졸 전달
캡슐화된 mRNA 에어로졸의 돼지 폐로의 전달의 성립. 반딧불이 발광효소(FFL) SNIM RNA의 돼지 폐로의 에어로졸 투여가 단계별 실험 절차에 의해 성립되었다. 1단계에서, 환기를 제어하면서, FFL SNIM RNA 제형을 마취된 돼지에 분무하였다. 2단계, 에어로졸 투여가 완료된 직후, 폐를 잘라 내, BLI에 의해 폐 샘플들에서 탈체 발광효소 측정을 수행하기 전, 밤새 폐 샘플들을 세포 배지에서 배양하였다.
German Landrace의 돼지를 Technical University Munich, Weihenstephan, Germany에서 획득하였다. 상기 돼지의 체중은 35~90 kg였다. 한 마리 돼지에 각 처리를 수행하였다. 총 5마리 돼지를 처리하였다. 첫 번째 돼지(90 kg)는 EFLOW 메쉬 네블라이저 및 폐 균질 현탁액 중의 발광효소 활성의 측정을 사용하여, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA로 처리하였다. 두 번째 돼지(60 kg)는 EFLOW 메쉬 네블라이저 및 BLI에 의한 폐 샘플들 중 발광효소 활성의 측정을 사용하여, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA로 처리하였다. 세 번째 돼지(80 kg)는 PARI BOY 제트 네블라이저 및 BLI에 의한 폐 샘플들 중 발광효소 활성의 측정을 사용하여, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA로 처리하였다. 네 번째 돼지(60 kg)는 Aeroneb 메쉬 네블라이저 및 BLI에 의한 폐 샘플들 중 발광효소 활성의 측정을 사용하여, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA/hCFTR mRNA로 처리하였다. 다섯 번째 돼지(35 kg)는 Aeroneb 메쉬 네블라이저 및 BLI에 의한 폐 샘플들 중 발광효소 활성의 측정을 사용하여, 실시예 6의 HGT5001 제형 중 FFL SNIM RNA로 처리하였다.
체중 1kg 당 아자페론 2 mg, 케타민 15 mg, 아트로핀 0.1 mg의 약물로 돼지를 안정시키고, 이어서 측면 귀 정맥에 정맥주입 라인을 삽입하였다. 체중 1kg 당 필요한 만큼 프로포폴 3~5 mg을 정맥 주입하여 돼지를 마취시켰다. 체중 1kg 당 4~8 mg의 1% 프로포폴 볼루스 주입과 함께 이소플루란(2~3%)으로 마취를 유지시킴으로써, 필요한 만큼 마취를 늘렸다. 마취 시간은 대략 1-3시간이었다 측면 귀 정맥을 통해 펜토바르비탈(체중 1kg 당 100 mg) 및 염화칼륨의 볼루스 주입으로 돼지를 희생시켰다. 폐를 잘라 내고, 다양한 폐 부위에서 조직 샘플들을 포집하여, 세포 배양배지에 밤새 배양시켰다. 발광효소 활성 조직 샘플들의 측정을 위해, 튜브 루미노미터에서 균질화하여 분석하거나 또는 D-루시페린 기질을 포함하는 배지 수조에서 배양하고, 탈체 발광효소 BLI를 시행하였다.
돼지 # 1에 대한 상세 설명 및 결과. 실험 세팅이 도 20에 묘사되었다. 에어로졸 투여를 위해, EFLOW 메쉬 네블라이저를 호흡장치의 환기관에 선으로 연결시켰다. 에어로졸 투여는 대략 60분 걸렸고, 개방된 환경에서의 대조군 실험에서 기대된 것보다 더 오랜 시간이 걸렸다. 이것은 분명 메쉬 네블라이저의 저장고에서 에어로졸의 배출에 의해 보여졌듯이, 분무화 중 역압의 증가에 의해 초래되었다. 주입수 중 1 mg FFL SNIM RNA를 포함하는 실시예 6의 PEI 제형 8ml를 WP5에 기술된 바와 같이 제조하고, 2개의 별도의 4 ml 분획을 차례로 분무하였다. 세포 배지에서의 밤새 배양 후, 다양한 폐 부위의 잘라낸 폐 샘플들로 이루어진 조직 균질 현탁액에서, 발광효소 측정을 수행하였다. 폐 샘플들의 기원에 따라 발현값을 맵핑하였다(도 21).
결과는 돼지 폐 조직에서의 성공적인 발광효소 발현을 나타내었다. 폐의 중앙 부위에서 발광효소 발현이 제일 높았고, 폐의 말단 부위로 갈수록 감소하였다. 발현 패턴은 선택된 환기 매개변수에 따른 흡입된 FFL SNIM RNA-PEI 나노입자의 예상 배치 패턴과 상관관계가 있었다. 발광효소 발현의 수치가 실시예 6의 동일한 PEI 제형를 사용한 WP5의 마우스 실험에서 관찰된 것과 동일한 범위에 속했다.
돼지 # 2에 대한 상세 설명 및 결과. 돼지 #1에서와 마찬가지로, 돼지 #2에서 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA의 에어로졸 투여를 수행하였으나, 생물발광 영상(BLI)으로 폐 샘플들에 대한 발광효소 활성을 측정하였다. 본 실험은 BLI로 기관 배양된 폐 샘플들의 탈체 발광효소 측정을 성립시키기 위해 수행하였다. 처리된 돼지의 서로 다른 폐 부위의 개별적 조직 샘플들에서 발광효소 측정 분명히 관찰되었다(도 22). 본 실험은 돼지 #1에서 획득한 결과를 입증하였다.
돼지 # 3에 대한 상세 설명 및 결과. EFLOW 메쉬 네블라이저를 사용한 돼지 #1 및 #2에서의 에어로졸 투여는 일부 기술적 어려움 및 불충분한 분무시간을 드러냈다. 따라서, 돼지 #3은 T-연결기를 통해 환기관에 연결된 PARI BOY 제트 네블라이저를 사용하여 처리하였다. 에어로졸 투여는 EFLOW 메쉬 네블라이저보다 오래 걸렸고(대략 80분), 에어로졸 투여는 만족스럽지 못했다. 처리된 돼지의 서로 다른 폐 부위의 슬라이스된 폐 샘플들에서 아주 낮은 발광효소 활성을 검출하였다(도 23).
돼지 # 4에 대한 상세 설명 및 결과. 이전 실험들의 결과들이 선택된 실험환경에서 돼지의 폐에 에어로졸 투여를 하기 위해 제트 네블라이저보다 메쉬 네블라이저가 더 적합함을 입증하였다. 이와 같은 이유로, 개방형 환경에서 검사할 때, 실시예 6의 PEI 제형을 만족스럽게 분모하기 위한 목적에서 또 다른 메쉬 네블라이저를 검사하였다. 돼지 #4는 호흡장치의 환기관에 선으로 연결된 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 처리하였다. 본 실험에서, 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 1 mg과 함께 hCFTR mRNA 1 mg을 전달하였다. 이것은 실시예 8에서 수행될 반복 투여와 관련하여 공동제형화된 FFL SNIM RNA/hCFTR mRNA-PEI 나노입자의 제형 안정성 및 분무가능성을 검사하기 위해 수행하였다. 상기 제형은 안정적이었고, 분무화에 부적합함을 보이지 않았다. 발광효소 활성이 처리된 돼지의 서로 다른 폐 부위의 개별적인 조직 샘플들에서 분명히 관찰되었다(도 24).
본 실험은 더 높은 발현 수치를 획득하였으나, 돼지 #1 및 돼지 #2에서 획득한 결과를 입증하였다. 본 실험은 Aeroneb 메쉬 네블라이저가 돼지의 폐에 실시예 6의 PEI 제형을 전달하는 데 가장 적합함을 보여주었다. 또한, 본 발명은 FFL SNIM RNA가 hCFTR mRNA와 함께 공동으로 전달될 경우, 여전히 활성임을 입증하였다.
돼지 # 5에 대한 상세 설명 및 결과. 돼지 #5를 Aeroneb 메쉬 네블라이저로 에어로졸화된 실시예 6의 HGT5001 제형 중 FFL SNIM RNA 1 mg으로 처리하였다. 상기 제형은 기술적 어려움 없이 에어로졸화 될 수 있다. 처리된 돼지의 서로 다른 폐 부위의 개별적 조직 샘플들에서 발광효소 활성이 분명히 관찰되었다(도 25).
본 발명은 실시예 6의 HGT5001 제형 중 에어로졸화된 FFL SNIM RNA가, 비록 실시예 6의 PEI 제형으로 처리된 돼지에서보다 발현 수치가 대략 15~20배 더 낮지만, 돼지 폐 조직에서 활성임을 나타내었다.
결론. 실시예 6의 PEI 제형와 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 성공적인 결과를 획득하였다. 4마리 돼지를 실시예 6의 PEI 제형으로 처리하여 에어로졸 전달을 위한 최적의 실험 환경을 확인하였다. 상기 결과들은 발광효소 발현이 돼지 폐 균질 현탁액에서 그리고 BLI에 의해 검출될 수 있음을 입증하였다. 발광효소 발현은 폐의 중앙 부위에서 가장 높았고, 폐의 말단 영역에서는 보이지 않았다. Aeroneb 메쉬 네블라이저가 전달 시간이 가장 짧고, 최상의 결과를 제공함이 밝혀졌다. 본 실험들에 따라, 또 다른 돼지를 실시예 6의 HGT5001 제형에 캡슐화된 FFL SNIM RNA로 처리하였다. 돼지 폐의 일부 부위에서 발광효소 발현이 분명히 관찰되었으나, 발현 수치는 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA보다 낮았다. 본 연구 패키지의 결과는 대규모 임상전 동물 모형으로서 SNIM RNA의 돼지 폐로의 전달이 중합체(예컨대, PEI) 기반 제형 및 지질(예컨대, HGT5001) 기반 제형과 같은 다양한 제형들을 사용하여 가능할 수 있음을 분명하게 입증하였다. 본 실시예의 결과들은 임상에서 네블라이저에 의해 인간 환자에게 일어나는 상황을 면밀히 모방하는 대형 동물의 폐에 성공적인 SNIM RNA 전달에 대한 개념의 증거를 제공하였다.
실시예 8: 체내 mRNA 전달(주간 복용)
돼지에게 1주 1회 에어로졸 도포의 실용성을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 실용성이란 폐질환의 유도 없이(2 급보다 높은 부작용 부재), 1주 간격으로 변성된 mRNA의 에어로졸 도포를 3회 수행하는 것으로 규정되었다. 추가적인 목적은 i) 동물의 고통 정도, ii) 돼지의 실험실 또는 임상 평가 중 발생하는 부작용들, 및 iii) 유도된 단백질(발광효소 및 hCFTR)의 측정을 평가하는 것이었다.
돼지의 폐에 PEI 제형 중 SNIM RNA의 반복적인 에어로졸 투여가 성립되었다. 두 마리 돼지로 이루어진 그룹들을 실시예 6의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA/hCFTR SNIM RNA로 주 단위로 1회, 2회, 또는 3회 처리하였다. 미처리된 두 마리 돼지를 대조군으로 삼았다. 처리 24시간 후, 폐를 잘라내고, BLI로 단리된 폐 샘플들에서 탈체 발광효소 활성을 측정하였다. IP/WB를 사용하여 hCFTR 단백질의 발현을 분석하였다. 세포 수준에서의 발광효소 발현의 검출을 위해 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 혈청 및 혈액 화학에서 염증성 사이토카인의 측정으로, 독성을 연구하였다. 조직병리학을 폐 샘플들에 수행하였다. 연구 프로토콜 "파일럿 프로젝트: 돼지에서 낭포성 섬유증의 에어로졸 치료를 위해 동물 모형을 성립하기 위한 변성된 mRNA의 반복적 적용"은 본 실험의 시작 전 관리당국에 의해 승인받았다(동물실험 라이선스 Nr.: 0-045-12).
실험 설계. 분무할 때 대략 6주령(평균 체질량 ~25 kg)되는 암컷 돼지(German Landrace)를 Technical University Munich, Weihenstephan, Germany에서 구입하였다. 돼지를 임의로 선택화도 아래 계획대로 처리하였다(표 3). 각각 2마리 돼지로 이루어진 처리군은 아래와 같았다:
그룹 0 - 처리하지 않은 대조군
그룹 I - 1일째, 실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여.
그룹 II - 1일째, 실시예 6의 PEI 제형 중 2 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여 및 8일째 실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여.
그룹 III - 1일 및 8일째, 실시예 6의 PEI 제형 중 2 mg hCFTR SNIM RNA (6379-186)의 에어로졸 투여 및, 15일째 실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여.
각 그룹의 처리 및 평가에 대한 계획은 표 3에 나타나 있다. 묘사된 개입 이외에도, 매일매일 상기 돼지들의 신체검사도 수행하였다.
표 3. 서로 다른 처리 그룹들의 시간경과에 따른 다이어그램.
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실험 절차. 체중 1kg 당 아자페론 2 mg, 케타민 15 mg, 아트로핀 0.1 mg의 약물로 돼지를 안정시키고, 이어서 측면 귀 정맥에 정맥주입 라인을 삽입하였다. 체중 1kg 당 필요한 만큼 프로포폴 3~5 mg을 정맥 주입하여 돼지를 마취시켰다. 필요한 만큼, 지속적으로 1% 프로포폴을 주입하여 마취를 유지시켰다. 환기 파라미터를 종말호기 이산화탄소와 맵팽하고, 필요한 경우 조절하였다. 맥박 산소 측정법, 카프노그래피, 직장 온도 탐침 및 반사 상태를 사용하여, 마취, 호흡 및 심혈관 관련 파라미터를 지속적으로 모니터링하였다. 10 ml/kg/h의 안정된 전해물 용액을 실험 동물들에게 주입하였다. 마취 시간은 대략 80~120분이었다. 충분한 자발 호흡의 개시 후, 돼지에게서 관상기관을 없앴다(extubated). 안정시킨 후, 체중 1kg당 펜토바르비탈 100 mg를 측면 귀 정맥에 볼루스 주입하여 돼지를 희생시켰다. 폐를 잘라내고 대략 1 cm 두깨의 조직 샘플들로 잘라서 여러 폐 부위에서 수집하여, 세포 배양을수행하였다. 발광효소 활성의 측정을 위해, D-루시페린 기질을 포함하는 배지 수조에서 조직 샘플들을 배양하고, 탈체 발광효소 BLI를 실시하였다.
BLI에 의한 처리 그룹에서의 발광효소 발현.
그룹 0(처리 없는 대조군 그룹)의 경우, 폐 슬라이스 조각에서 발광효소 활성이 관찰되지 않았다(도 26).
그룹 I (실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여)의 경우, 1회 처리된 돼지 #3 및 #6의 폐 샘플들에서 발광효소 활성이 분명히 검출되었다(도 27). 발광효소 발현이 폐의 중심부에서 가장 높았다.
그룹 II (1일째 실시예 6의 PEI 제형 중 2 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여 및 8일째 실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여)의 경우, 2회-처리된 돼지 #4 및 #8의 폐 샘플들에서 발광효소 활성이 분명히 검출되었다(도 28). 발광효소 발현이 폐의 중심부에서 가장 높았다. 측정 당일의 전원 중단 및 BLI 시스템으로의 결과적인 기술적 문제들 때문에, 샘플들이 측정 전에 배지에서 추가로 10시간 동안 보관되어 있었음이 고려되어야 한다.
그룹 III(1일 및 8일째 실시예 6의 PEI 제형 중 2 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여, 및 15일째 실시예 6의 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg hCFTR SNIM RNA의 에어로졸 투여)의 경우, 발광효소 활성이 3회-처리된 돼지 #1 및 #2의 폐 샘플들에서 분명히 검출되었다(도 29). 발광효소 발현이 폐의 중심부에서 가장 높았다.
SNIM RNA- PEI 나노입자의 특성들. 분무 전에, SNIM RNA-PEI 제형의 입자 크기 및 제타 전위를 측정하였다(표 X1). SNIM RNA-PEI 나노입자는 25~37 nm의 입자 크기 및 30~49 mV의 제타 전위를 갖도록 재현가능하게 형성될 수 있다.
표 X1. 입자 크기 및 제타 전위 측정
Figure 112015085471780-pct00019
IHC에 의한 처리 그룹에서의 발광효소 발현. BLI에 의해 양성인 폐 슬라이스 조각들(Sophistolab AG, Eglisau, Switzerland)의 조직 샘플들에 대해 FFL에 대한 IHC를 수행하고, 미처리된 돼지와 발광효소-양성 마우스 종양 조직을 양성 대조군으로 비교하였다. 예상과 같이, 강한 신호가 발광효소-양성 마우스 종양 조직에 보인 반면, 미처리된 돼지의 폐 조직은 특정한 염색을 보이지 않았다.. 분명히 검출가능한 염색 패턴을 3회 처리를 받은 돼지 #1의 폐 조직에서 관찰할 수 있었다. 큰 기도 및 작은 기도의 기관지 상피에서 FFL 발현이 가장 두드러졌다(도 30).
IP/WB에 의한 처리된 돼지의 폐 조직에서의 hCFTR 단백질의 검출. 3회 처리된 돼지 #1의 상당한 BLI-양성 폐 조직에 van Barneveld A 등, Cell Physiol Biochem. 30, 587-95 (2012)에 기술된 프로토콜에 따라 hCFTR IP/WB를 실시하였다(도 31). 성숙한 복합체-글리코실화된 hCFTR이 분산된 소위 C-밴드로 나타난다. 만노오스가 풍부한 hCFTR가 좀 더 밀집된 소위 B-밴드로 나타난다. 분명히 hCFTR 발현이 T84 양성 대조군 세포 및, 실시예 6의 PEI 제형 중 hCFTR SNIM RNA로 처리된 돼지 #1의 폐 조직에서 관찰된다. 미처리된 돼지에서 hCFTR 단백질의 발현이 관찰되지 않았다. 동일한 프로토콜(van Barneveld A 등, supra)을 사용한 공개된 연구로부터, 인간 폐 조직에서 hCFTR 단백질 발현의 비교는 hCFTR SNIM 에어로졸 처리 후 돼지 폐 조직에서의 hCFTR의 처리가 건강한 인간 폐에서의 hCFTR 발현과 유사함을 시사하였다.
이와 같은 발견은 처리된 돼지 폐에서 IP/WB에 의한 hCFTR 단백질의 검출을 위해 서로 다른 세트의 항체들을 사용함으로써 추후에 입증되었다(실시예 6 참조). 발광효소 활성이 검출되지 않음으로써, mRNA 전달 및/또는 발현의 부재를 시사하는, 돼지 #1의 발광효소 발현 폐 영역에서 획득한 하나의 샘플 및 돼지 #2의 꼬리 엽에서 획득한 또 다른 샘플을 양성 및 음성 대조군으로 선택하였다. 이와 같은 샘플들에서 제조된 단백질 용해물을 MAB25031(R&D Systems)을 사용하여 면역침강시키고, AB570을 사용하여 hCFTR 단백질을 검출하였다. 도 32에 나타났듯이, 발광효소 발현은 hCFTR mRNA의 발현과 상관관계가 있다. 발광효소 활성이 검출가능하지 않은, 돼지 #2의 왼쪽 꼬리 엽에서 획득한 샘플은 또한 hCFTR에 대해 음성(1번줄)이었던 반면, 발광효소에 대해 양성인 돼지 #1의 샘플들에서 hCFTR가 검출가능하였다(2번 줄).
유독성: 폐 샘플들의 예비 조직학적 평가. 세 마리를 안락사시킨 후 채취한 폐의 샘플들의 조직학적 평가를 수행하였다. 파라핀 섹션에 폐 샘플들을 함침시킨 후, 형태학적 평가를 위해 헤마톡실린-에오신(Hematoxiline-Eosine)으로 염색하였다. 상기 발견은 세 마리 돼지에서 획득한 샘플들 전체에 대해 일관되었고, 이중 두 마리(돼지 #1 및 돼지 #2)는 3회 에어로졸 도포를 받았고, 세 번째 돼지(돼지 #7)는 에어로졸 도포가 없었던 미처리된 대조군이었다.
유독성: 통증. 돼지 #2와 돼지 #1만이 1차 처리 후 2~4일째에 경미한 통증의 징후를 보였다. 따라서, 3주 내 3회 에어로졸 도포는 경미한 통증만을 유발시켰다
유독성: 부작용. 실험실 파라미터(혈액, MBS 및 BAL) 및 상기 돼지의 신체 검사에 의해, 부작용(AE)의 종류 및 빈도(본 실험의 2차 목표로 규정됨)를 분석하였다.
상기 연구 프로토콜에 의해 규정된 시점에 혈청 및 전신 혈액 샘플들을 채취하였다. 기관 특이성 병리학(혈액, 골수, 간, 근육 및 신장)을 나타내는 것으로 시사되는 12개 대표적 파라미터(헤모글로빈, 적혈구 용적, AP, ALT, AST, CK, 빌리루빈, 크레아티닌, 글로코오스, 칼륨, 혈소판 및 백혈구)를 선택하여, VCOG, 버전 2011에 따라 분류된 VetMedLab, Ludwigsburg, Germany에서 실험 결과를 획득하였다.
상기 결과는 상기 돼지에서 중증 부작용(AE) 이 관찰되지 않았음을 보여주었다(3, 4 또는 5 급의 AE가 중증으로 규정됨). 실시예 6의 PEI 제형 중 SNIM RNA의 에어로졸 도포 후, 실험실 파라미터의 변화가 없었다. 일부 파라미터(예컨대 CK 또는 간 효소)에서의 약간의 변화의 이와 같은 변화는 실험 절차 자체적으로(예컨대 근육내 주사 및 마취)에 의해 유발되었을 가능성이 크다. 또한 반복되는 적용에서, 3회 적용 후에도, 음성 효과가 검출되지 않았고, 그룹 3의 돼지는 2급 AE보다 높은 급의 AE를 나타내지 않는다. 심지어 1급 또는 2급 AE도 드물었고, 실시예 6의 PEI 제형 중 SNIM RNA의 에어로졸 도포과 상관관계를 보이지 않았다.
반복적인 혈액 샘플들 이외에, 다른 2개의 파라미터를 평가하여 폐에서의 병리학적 과정을 평가하였다: i) 기관지-폐포-세척액(BALF) 안락사 후 채취, 및 ii) 미생물 샘플들(MBS) (기도에서 획득한 도말 마취 시 채취). 해부 시 각각의 돼지로부터 BALF를 채취하고, 추가 검사를 위해 -80℃에 보관하였다. 각각의 에어로졸 도포 전에 기도 도말을 채취하여, 미생물 차원에서 검사하였다. 이와 같은 검사의 결과, Bordetella bronchiospectica (돼지의 호흡기의 일반적인병원균) 및 대장균을 비롯한 광범위한 범위의 병원균들이 드러났다.근육내주사를 통해 툴라스로마이신(1 ml Draxxin® 10%)으로 돼지를 1회 처리하였다.
신체 검사. 실험실 파라미터 이외에, 에어로졸 도포 사이의 관찰 기간 동안 돼지의 신체 검사를 수행하였다 (상세 설명은 본 연구 프로토콜의 부록 1 및 부록 4의 1.1.2 참조). 돼지에 대한 AE의 원인을 기록하고, 급을 매기고 개입 또는 그 밖의 다른 것에 배정하기 위한 시스템이 없기 때문에, 개와 고양이를 위해 규정된 일반적인 독성 표준(CTC)-시스템을 사용하였다(2011년 VOCG). 실험실 파라미터의 급을 매기기 위해, 종에 특이성을 갖는 ULN(정상적인 최고한계치) 및 LLN (정상적인 최저한계치)를 사용하였다. 다음의 6개 AE 분류 내에서 임상 평가를 수행하였다:
(1) 알레르기/면역 작용; (2) 폐 /호흡기; (3) 체질적 임상적 징후; (4) 피부관련/피부; (5) 위장; 및 (6) 폐/호흡기.
상기 결과는 상기 돼지에서 중증 AE(3, 4 또는 5급)가 관찰되지 않았음을 보여주었다. PEI 제형 중 SNIM RNA의 에어로졸 도포 후 신체검사에 의해 평가된 파라미터의 장애가 없었다. 그룹 3의 두 마리 돼지가 3가지 호흡기 파라미터(기관지 경련/천명, 후두부종 및 호흡곤란)에서 1급 및 2급 AE를 보였으나, 이와 같은 경미한 발견은 1~2일에 그쳤다. 이와 같은 관찰들은 이들 두 마리 돼지에서 1회 마취/기관내 삽관/에어로졸 도포 후에만 발생하였고, 두 마리 돼지 또는 그 밖의 다른 돼지들에게서 2회 또는 3회 에어로졸 도포 후에는 발생하지 않았는데, 이와 같은 발견은 연구 대상 물질에 의해 유발된 것으로 보이지 않는다.
결론. 본 실시예의 결과는 FFL 및 hCFTR SNIM RNA를 인코딩하는 PEI 제형을, 각 처리 사이클 후, 부작용 없이, 돼지의 폐에, 반복적으로 에어로졸 투여할 수 있음을 입증하였다. 발광효소 발현을 폐 조직의 중앙 부위에서 발견하였으나, 폐의 말단 부위에서는 검출되지 않았다. 발광효소 발현의 부위 패턴은, 환기를 제어화면서 사용된 세팅에 따라, 실시예 6의 PEI 제형의 예상 배치 패턴과 상관관계가 있다. 처리된 돼지에서 획득한 선택된 폐 샘플들에 대한 면역조직화학은 큰 기도 및 작은 기도의 기관지 상피에서 대부분 발광효소 발현을 나타내었다. IP/WB는 분명히 미처리된 돼지 폐와 발광효소-음성 폐 샘플들에 부재한, 처리된 돼지 폐 중의 성숙한 인간 CFTR의 복합체-글리코실화된 C-밴드의 발현을 입증하였다. hCFTR SNIM RNA 에어로졸 처리 후 돼지 폐 조직에서의 hCFTR 발현은 hCFTR 단백질 검출을 위한 동일한 프로토콜를 사용한 공개된 보고서와 비교할 때, 건강한 인간 폐에서의 hCFTR 발현과 견줄만하였다. 1급 또는 2급 부작용은 매우 드물었고, PEI 제형 중의 SNIM RNA의 에어로졸 도포과 상관관계가 보이지 않았다. 따라서, hCFTR 단백질의 발현은 SNIM hCFTR mRNA로 처리된 돼지의 폐에서 성공적으로 입증되었다.
실시예 9: 신호 펩티드를 함유하는, mRNA를 인코딩하는 CFTR
본 실시예는 서열을 인코딩하는 신호 펩티드로 CFTR 단백질이 CFTR를 인코딩하는 mRNA에서 효과적으로 발현될 수 있음을 입증한다.
메신저 RNA 합성. 본 실험을 위해, C-말단 His10 태깅된 코돈 최적화 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CO-CFTR-C-His10)(서열 식별 번호:15), 성장 호르몬신호 서열 선도(GH-CO-CFTR)(서열 식별 번호:16) 및 코돈 최적화 인간 CFTR(CO-CFTR)(서열 식별 번호:17) SNIM RNA를 가진 코돈 최적화 인간 CFTR를 표준 방법을 사용하여 플라즈미드 DNA 템플레이트로부터 체외 전사로 합성하였다. 세포 및 CFTR 형질전환. 인간 배아 신장 HEK293T 세포를 10% 태아소혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Invitrogen Cat # 11965-092)에서 배양하였다. 형질전환 1일 전, 세포를 50~60%의 밀집도로 6-웰 플레이에 플레이팅하여 정상적인 조직 배양 조건(36℃, 5% CO2, 95% 공기의 습한 대기) 하에서 배양하였다. 형질전환을 위해 준비할 때, 60 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat # 11668019)을 OptiMem 감소된 혈청 배지(Invitrogen Cat # 31985-062)에서 희석한 후, 부드럽게 교반하였다. 상기 실험을 위해, CO-CFTR, GH-CO-CFTR 또는 CO-CFTR-C-His10 SNIM RNA 4 μg를 900 μl OptiMem 배지에서 희석시켰다. 상기 mRNA를 희석된 Lipofectamine®에 즉시 첨가하여, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 플레이팅 배지를 부드럽게 분취하고, 1 ml OptiMem 감소된 혈청 배지 및 각각의 mRNA/Lipofectamine® 복합체 300 μl로 대체하였다. 표준 조직 배양 조건 하에서 세포를 배양하였다.
웨스턴 분석. 대략 형질전환 48시간 후, 각각의 플레이트에서 세포를 옮겨 용해시켰다. 전체 세포 용해물에 SDS-PAGE로 분리를 실시하고, 웨스턴 블랏으로 검출하였다. 도 33에 나타난 바와 같이, 인간 CFTR 단백질의 강력한 발현이 CO-CFTR, GH-CO-CFTR 및 인간 CO-CFTR-C-His10 mRNA 형질전환 이후에, 항-CFTR (a 및 b) 또는 항-His (C) 항체들에 의해 검출되었다. (도 33).
실시예 10: CFTR 녹아웃 마우스으로의 체내 CO- CFTR -C- His10 mRNA 전달
기도삽관 투여된 mRNA -충전 나노입자를 통해 생성된 인간 CFTR 단백질의 분석. 모든 연구를 CFTR KO 마우스를 사용하여 수행하였다. CFTR mRNA 제형 또는 비히클 대조군을 PARI Boy 제트 네블라이저를 사용하여 유입시켰다. mRNA에서 단백질 발현을 허용하기 위한 설정 시간이 지난 후, 마우스를 희생시키고, 식염수로 관류시켰다.
메신저 RNA 합성. 상기 실시예에서, 플라즈미드 DNA 템플레이트에서 체외 전사로, C-말단 His10 태깅된 코돈 최적화 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CO-CFTR-C-His10) SNIM RNA 및 코돈-최적화 FFL SNIM RNA을 합성하였다
PEI 제형. 상기 접근방식을 위해, 중합체성 및 지질-기반 나노입자 제형 모두를 사용하여, CFTR 녹아웃 마우스의 폐에서의 CO-CFTR-C-His10 mRNA의 전달 및 발현을 평가하였다. 25 kDa 분지형 PEI를 갖는 중합체성 나노입자 제형를 아래와 같이 제조하였다. SNIM RNA 필요량을 주입수(Braun, Melsungen)에 적용하기 직전에 희석시켜, 총 부피 4 ml로 만들고, N/P 비율 10인 피펫을 사용하여 분지형 PEI 25 kDa의 수성 용액 4 ml에 재빨리 첨가하였다. 상기 용액을 위아래로 10회 피펫팅하여 혼합하고, 지시된 네블라이저를 사용하여 별도의 2개 4.0 ml 분획을 마우스 폐에 차례로 분무하였다.
cKK-E12 제형. 지질-기반 나노입자 실험의 경우, cKK-E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K(상대적 양 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)의 제형 중 CO-CFTR-C-His10 SNIM RNA를 사용하여 지질 제형을 제조하였다. 상기 용액을 지시된 네블라이저를 사용하여 마우스 폐에 분무하였다.
인간 CO- CFTR -C- His10 mRNA의 분무화 (에어로졸) 투여. PARI Boy 제트 네블라이저(공칭 투여 부피, 최대 8 mL/그룹)를 통해 단일 에어로졸 흡입으로 CFTR 시험 재료를 투여하였다. 상기 시험 재료를 동물들 전체 그룹(n=4)이 담긴 상자에 전달하고, 산소 흐름 및 스캐빈저 장치에 연결하였다.
인간 CO- CFTR -C- His 10 mRNA의 투여. 앞서 기술된 방식으로 CFTR mRNA를 제조하였다. 4마리 CFTR 녹아웃 마우스를 에어로졸실에 넣고, 대략 1시간 경과하는 동안 분무화(Pari Boy 제트 네블라이저)를 통해 2 mg 총 total 코돈 최적화 미변성된 인간 CFTR mRNA(서열 식별 번호: 3의 코딩 서열 포함)에 노출시켰다. 노출 24시간 후, 마우스를 희생시켰다.
안락사. 복용량 투여(± 5%) 후, 대표적인시기에 CO2 질식으로 동물을 안락사시키고, 이어서 개흉술 및 방혈을 실시하였다. 전체 혈액(최대 획득가능한 부피)를 심장천자를 통해 수집한 후, 폐기처분하였다.
관류. 방혈 후, 모든 동물에 식염수로 심장 관류를 실시하였다. 요약하면, 식염수 함유한 10 mL 주사기에 부착된 23/21 게이지 바늘을 관류를 위해 좌심실의 내강에 꽂아, 전신 심장내 관류를 수행하였다.. 우심방을 절개하여 관류액의 배출구를 제공하였다. 바늘을 심장에 꽂은 후, 플런저에 부드럽고 지속적인 압력을 가하여 동물의 관류를 실시하였다. 기존 관류액이 깨끗이 흐를 때(가시적인 혈액 없음)(플러싱 용액이 전신을 포화시켰으며 절차가 완료되었음을 나타냄), 플러싱 용액의 충분한 흐름을 확보하였다.
조직 포집. 관류 후, 모든 동물의 양쪽 폐(오른쪽 및 왼쪽)를 수확하였다. 양쪽 폐(오른쪽 및 왼쪽)를 액체 질소에서 급속냉동시키고, 공칭 -70ºC에서 따로 보관하였다.
CFTR 녹아웃 마우스에서 CO-CFTR-C-His 10 mRNA로부터의 인간 CFTR의 발현. CFTR mRNA-처리된 마우스 폐에서 포집된 조직 용해물의 웨스턴 블랏 분석에 의해 CFTR 발현을 검출하였다. 지질-기반 및 중합체-기반 제형 모두의 경우에, 성숙한 "C" 밴드를 모든 처리된 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 폐에서 검출하였다 (도 34). 실시예 9에 기술된 바와 같이, HEK 293T 인간 CO-CFTR-C-His10 양성 세포에서 포집된 용해물과의 비교를 통해, 성숙한 "C" 밴드의 발현을 검증하였다. 반면, 야생형 미처리된 대조군 마우스에서 포집된 용해물에서는 어떤 검출 신호도 관찰되지 않았다(도 34). 모두 종합해 보면, 이와 같은 데이터는 중합체-기반 및 지질 기반 제형(상기 나열된 cKK-E12 제형 등) 모두 예컨대, 흡입을 통한 CFTR mRNA의 폐 전달에 효과적이며, 일단 전달되면, 상기 코돈 최적화 CFTR mRNA는 효과적으로 인간 CFTR 단백질을 발현할 수 있음을 시사한다.
실시예 11: 체내 용량 증가 연구
돼지 폐로의 PEI 캡슐화된 mRNA 에어로졸 전달의 용량 상승. 다양한 농도의 반딧불이 발광효소 (FFL) SNIM RNA 및 코돈 최적화 인간 CFTR (CO-CFTR) SNIM RNA의 조합을 돼지 폐에 에어로졸 투여하는 것이 단계별 실험 절차에 의해 성립되었다. 1단계에서, 환기를 제어하면서, 마취된 돼지에게 FFL/CO-CFTR SNIM RNA 제형을 분무하였다. 2단계에서, 에어로졸 투여가 완료되고 24시간 후, 진정되면, 측면 귀 정맥을 통해 펜토바르비탈(체중 1kg 당 100 mg) 및 염화칼륨의 볼루스 주사로 동물들을 희생시켰다. 폐를 잘라내어 대략 1 cm 두께의 조직 샘플들로 슬라이스하였다. 발광효소 활성의 측정을 위해, D-루시페린 기질을 포함하는 배지 수조에서 조직 샘플들을 배양하고, 탈체 발광효소 BLI를 실시하였다. BLI 후, 발광효소-양성 및 발광효소-음성 부위에서의 샘플들을 조직병리학, 면역조직화학 및 현장 혼성화를 위해 채취하였다. 잔류 샘플들을 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 이어서 IP/WB 및 Elisa에 의한 분석이 끝날 때까지 차후 -80℃로 보관된다.
메신저 RNA 합성. 본 실시예에서, 표준 방법을 사용하여, 플라즈미드 DNA 템플레이트에서 체외 전사로, 코돈 최적화 인간 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CO-CFTR) SNIM RNA, 코돈-최적화 FFL mRNA SNIM RNA를 합성하였다.
실험 설계. German Landrace의 돼지를 Technical University Munich, Weihenstephan, Germany에서 획득하였다. 상기 돼지의 체중은 35~90 kg 범위였다. 상기 연구는 가변성을 위해 대조군에 연령 및 체중-매칭된 돼지를 사용하여 설계하였다. 4-arm 연구의 각각의 실험군을 위해, 6 마리 돼지(3 수컷 및 3 암컷)의 단일 코호트를 성립시켰다 제1 코호트를 주입수(WFI)로만 처리하고, 이것을 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여 투여하였다. 제2 코호트를 Aeroneb 메쉬 네블라이저를 사용하여, 아래 기술된 PEI 제형 중 1 mg FFL SNIM RNA 및 1 mg 코돈 최적화 인간 CFTR (CO-CFTR) SNIM RNA의 용액으로 처리하였다. 제3 코호트는 하기의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 1 mg 및 코돈 최적화 인간 CFTR (CO-CFTR) SNIM RNA 5 mg로 처리하였다. 제4 코호트는 하기의 PEI 제형 중 FFL SNIM RNA 1 mg 및 코돈 최적화 인간 CFTR (CO-CFTR) SNIM RNA 10 mg으로 처리하였다. 각 실험군의 처리 및 평가를 위한 계획이 아래 표 4에 나타나있다.
표 4. 용량 증가 연구를 위한 실험 설계
Figure 112015085471780-pct00020
mRNA - PEI 제형. 아래서 기술된 예시적인 표준화된 제형 절차를 동물 처리 직전에 수행하였다.
재료:
주사기 펌프 (혼합 장치):
제조업체: KD Scientific
유형: KDS-210-CE
주사기:
제조업체: B.Braun
유형: Omnifix, 20mL 또는 30 mL / Luer Lock Solo
Ref.: 4617207V
튜브:
제조업체: B.Braun
유형: SafEFlow Extension Set
Ref.: 4097154
바늘:
제조업체: B.Braun
유형: Sterican, 20G x 1 ½"
Ref.: 4657519
혼합 밸프:
제조업체: B.Braun
유형: Discofix C 3SC
Ref.: 16494C
주입수:
제조업체: B.Braun
유형: 수성
Ref.: 82423E
8mL: 3mL 주입수의 부피에 1mg hCFTR SNIM RNA 및 1 mg FFL SNIM RNA N/P 10을 함유하는 폴리플렉스를 제조하기 위한 예시적 방법으로서, RNA 보관 용액(c: 물 1mg/mL; FFL mRNA 1.5mL + CFTR mRNA 1.5mL) 3mL로 15mL 팔콘튜브를 채워다. 두 번째 팔콘튜브에서, 5.61mL 주입수를 0.39mL brPEI 보관 용액과 혼합하였다(c: 물 중10mg/mL). 20mL 주사기 2개를 혼합 장치에 고정시켰다. 각각은 관을 통해 바늘에 연결되어 있었다. 주사기 펌프의 권취 기능을 사용하여 하나의 주사기는 RNA-로 채우고, 다른 주사기는 PEI-용액으로 채웠다. (설정: 직경: 20.1mm, 흐름: 5mL/min, 부피: 5.9mL). 상기 바늘을 제거하고, 튜브를 혼합 밸브에 연결하였다. RNA-용액을 함유한 주사기를 밸브의 기울어진 위치에 연결시키는 것이 중요하다. 배출구 직경을 제어하기위해, 바늘을 연결하였다. 주사기 펌프(설정: 직경: 20.1mm, 흐름: 40mL/min, 부피: 5.8mL)의 주입 기능을 사용하여, 상기 혼합을 수행하였다. 재현가능한 폴리분산지수를 달성하기 위해, 상기 샘플들을 혼합하는 동안 수동으로 분취하였다. 흐름이 안정화(100-250 μL)될 때까지의 첫 μL 및 때때로 공기 방울을 함유하는 마지막 μL를 별도의 시험관에 포집하였다. 폴리플렉스 형성을 위해 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하고, 이후 얼음에서 보관하였다. 서로 다른 용량의 경우, 상기 파라미터를 수정하여, 표5에 나타난 바와 같이 상황에 맞추었다.
표 5: 서로 다른 혼합 부피를 위한 예시적 부피 및 세팅
Figure 112015085471780-pct00021
V(권취) 및 V(주입)는 각각 mRNA 및 PEI 성분의 분취 및 분산을 위해 주사기 펌프 상의 세틸을 지정한다.
분무된 복합체의 기능성을 확인하기 위한 HEK 세포의 형질전환. 분무 후, 복합체의 분취액(80 μl)을 사용하여 HEK 세포를 형질전환하였다. 형질전환 1일 전, 1x106 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 형질전환 당일, 배지를 상기 세포에서 제거하고, PBS로 세포를 1회 세척하고, 이어서 복합체 80μl와 함께 무혈청 MEM 배지 920μl을 각 웰에 첨가하였다. 각각의 복합체의 경우, 세 개 동형 웰을 준비하였다. 표준 세포 배양조건 하에서 4시간 동안 상기 복합체와 함께 상기 세포를 배양하였다.. 배양 마지막에, 복합체 함유 배지를 제거하고, 혈청 함유 MEM 배지(1ml)를 각 웰에 첨가하였다. 표준 세포 배양 조건 하에서 플레이트를 배양하였다. 형질전환 24시간 후, 균질화 단계를 배제하고, 동물조직에 사용되는 동일한 프로토콜 및 완충용액을 사용하여 단백질 용해물을 제조하였다. 분석을 위해 3개 웰로부터의 세포를 풀링(pool)하였다. R24.1 항체(R&D Systems)를 이용한 면역침강법 및 217, 432 및 596 항체들 (모두 Cystic Fibrosis Consortium, University of Pennsylvania, PA, USA에서 획득)의 조합을 이용한 웨스턴 블랏을 사용하여, 인간 CFTR의 발현을 검출하였다. 돼지에 분무된 모든 복합체의 경우에 hCFTR가검출될 수 있다(도 54~57 참조).
에어로졸 도포. Aeroneb® 메쉬 네블라이저를 사용하여, 에어로졸 (WFI 단독 44 ml; WFI 중 변성된 mRNA PEI 제형: 44, 8 및 24)을 분무하고 마취된 돼지에게 흡입시켰다. 체중 1kg 당 아자페론 2 mg, 케타민 15 mg, 아트로핀 0.1 mg의 약물로 돼지를 안정시키고, 이어서 측면 귀 정맥에 정맥주입 라인을 삽입하였다. 체중 1kg 당 필요한 만큼 프로포폴 3~5 mg을 정맥 주입하여 돼지를 마취시켰다. 체중 1kg 당 4~8 mg의 1% 프로포폴 볼루스 주입과 함께 이소플루란(2~3%)으로 마취를 유지시킴으로써, 필요한 만큼 마취를 늘렸다. 마취 시간은 대략 1-3시간이었다 에어로졸화를 완료하고 24시간 후, 측면 귀 정맥을 통해 펜토바르비탈(체중 1kg 당 100 mg) 및 염화칼륨의 볼루스 주입으로 돼지를 희생시켰다. 폐를 잘라내고, 다양한 폐 부위에서 조직 샘플들을 포집하였다. 보관된 샘플들에 생물 발광, 조직면역학, IP/웨스턴 블랏 및 Elisa와 같이 서로 다른 평가 방법을 실시하였다.
생물 발광 분석. 발광효소 활성의 측정을 위해, 조직 샘플들을 튜브 루미노미터에서 균질화 및 분석하거나 또는 D-루시페린 기질을 포함하는 배지 수조에서 배양한 후, 탈체 발광효소 BLI를 실시하였다. 상기 데이터는 코호트 1(WFI 비히클 대조군)의 대조군 폐 조직 샘플들과 비교하여, 코호트 2~4(1 mg, 5, mg 및 10 mgs 각각) 각각에서 강한 생물 발광 신호가 관찰되었음을 보여준다. (도 35~38).
웨스턴 블랏 및 면역조직화학에 의한 CFTR 발현 분석. FFL 양성 조직 샘플들(한 코호트 내의 각 돼지에서 최소 10개 샘플)을 잘라내 인간 CFTR에 대한 면역침강법/웨스턴 블랏 (IP-WB) 및 면역조직화학에 의해 분석하였다. 요약하면, 단백질 용해물을 다음과 같이 돼지 폐에서 제조하였다: 분석을 위해 300~400mg의 폐 조직을 사용하였다. LysingMatrixA(MPBiomedicals, Ref:6910-500) 및 균질기 "FastPrep24" (MP Biomedicals)를 사용하여, 단백질 분해효소 억제제를 함유하는 기본 완충용액(20mM Tris, 150 mM NaC1, pH 8.0) 상기 조직을 균질화하였다. 전체 조직 혼합물을 새로운 2ml 안전잠금 사전냉각된 Eppendorf 튜브에 옮겨 담고, 25μl 이오도아세트아미드(Sigma: I6125) 및 1μl Omni 절단(Omni 절단 완충용액에서 1:5로 희석됨)(Epicenter: OC7810K)를 첨가하였다. 그러고 나서, 상기 샘플들을 5분 동안 얼음 위에서 배양시키고, 이어서 10%SDS 용액 26μl를 첨가하였다. 샘플들을 추가로 쉐이커에서 60분 동안 4℃에서 배양하였다. 배양 후, 용해 완충용액(850μl 염기 완충용액 + 10% TritonX-100 + 5% 소듐 데옥콜레이트) 260μl를 샘플들에 첨가하고, 90분 동안 쉐이커에서 4℃로 배양시켯다. 마지막으로, 단백질 용해물을 4℃에서 10~20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 새로운 Eppendorf 튜브에 옮겨 담았다. BCA 단백질 분석(Pierce)을 사용하여 단백질 농도를 정량화하였다. 샘플들에서 총 단백질 10mg을 함유하는 분취액을 분취하고, 말단 부피는 샘플 당 1ml로 염기 완충용액으로 조절하였다. 실시예 6에 제시된 데이터를 기반으로, 항체 R24.1을 사용하여 CFTR의 면역침강법을 수행하였고, 이어서 Cystic Fibrosis Consortium, University of Pennsylvania, PA, USA에서 획득한 서로 다른 3가지 항체들(항체들 217, 432, 596)의 3중 조합을 사용하여 CFTR의 웨스턴 블랏 면역검출법을 실시하였다. 여러 동물 중 내부-그룹 가변성을 위해 제어하기 위해 CFTR 발현의 가변성을 위해, 150 kDa에 상응하는 단백질 크기 표준의 표지자 밴드를 기초자료로 설명하였고, 서로 다른 그룹의 밴드 강도의 차이는 상기 값으로 정상화되었다. 도 39에 나타난 바와 같이, 코호트 1의 대조군 돼지에서 분석된 조직 샘플의 단 16% 만이 기준선보다 높은 수준을 야기하였다. 반면, 코호트 3 과 4는, 각각 5 mg 및 10 mg 처리 실험군을 나타내는데, 각각은 기준선보다 더 높은 CFTR 발현 수준에 대해 폐 조직 샘플들 시험 양성의 30 % 이상을 야기하였다(도 39). 더욱이, 코호트 3과 4에서 관찰된 CFTR 발현의 증가는 대조군에 비해 거의 2배 크다.
CFTR-양성 기관지 및 세기관지의 정량화에 의해, CFTR 면역조직화학의 분석을 수행하였다.. 최소한 하나의 상피 세포가 분명한 막-국소화 CFTR 신호를 보여주는 상피 세포층에서 검출된 경우, 기관지/세기관지는 양성으로 간주되었다. "양성" 샘플의 대표적인 이미지가 도 40에 나타나 있다. 단일 항체 또는 최대 3가지 항체들의 조합들을 활용하여 CFTR에 대한 사용가능한 항체들의 특이성을 평가함으로써, CFTR 면역조직화학을 위한 조건을 최적화하였다. 분명한 CFTR-특이성 신호가 항체 596의 배양 후에 관찰되었다. 상기 데이터는 CFTR-양성 상피 세포가 4개의 모든 코호트의 폐 조직 섹션에서 검출되었음을 입증하고, 면역조직화학 절차에 의한 인간 및 돼지 CFTR의 검출을 입증하였다(도 41 및 45). CFTR의 저발현도(도 42), 중발현도(도 43) 및 고발현도(도 44)가 코호트 3에서 관찰되었고, 전체 발견내용은 비히클 대조군과 비교하여 코돈 최적화 인간 CFTR SNIM RNA의 5 mg 처리가 더 많은 수의 CFTR 양성 세포 및 전체 CFTR 신호 강도를 야기함을 입증한다. 상기 데이터는 또한 10 mg 치료 후 CFTR 발현의 추가 증진을 묘사함으로써, 분명한 용량 반응 효과(도 45)를 입증하였다. CFTR-양성 기관지 / 세기관지의 절대 수와 상대 수의 정량화가 추가로 상기의 발견들을 뒷받침하고, 비히클 대조군과 비교하여, 5 또는 10 mg의 인간 CFTR SNIM RNA로 처리된 동물에서 유의미하게 더 높은 수치를 드러냈다(도 46). 인간 CFTR SNIM RNA로의 처리 후, CFTR 발현 정도의 전반적 상승을 시사함.
현장 혼성화(ISH)에 의한 CFTR 발현 분석. FFL 양성 조직 샘플들을 잘라내(하나의 코호트 내 각 돼지의 경우 최소 10개 샘플 채취), RNAcope®(AAdvanced Cell Diagnostic) "ZZ" 탐침 기술을 사용하여, 수동 현장 혼성화 분석을 실시하였다. 탐침은 코돈 최적화 인간 CFTR SNIM RNA (서열 식별 번호:17)의 코돈-최적화 서열을 기반으로 생성되었다. 요약하면, RNAcope® 분석은 슬라이드에 올린 포르말린-고정, 파라핀 함침(FFPE) 조직에서의 세포 당 단일 RNA 분자의 가시화를 위해 설계된 현장 혼성화 분석이다. 함침된 조직 샘플들은 제조업체 프로토콜에 따라 전처리하고, 표적 특이성 인간 CFTR 특이성 RNA 탐침으로 배양하였다. hCFTR 탐침은 인간, 마우스, 래트, 돼지 및 원숭이와의 교차 재활성화로, CFTR를 결합시키는 것으로 나타났다. 일단 결합되면, 상기 탐침은 6회에 걸친 연속적인 증폭 주기를 통해, 폭포효과의 신호 증폭 분자로 혼성화된다. 이어서, 상기 샘플을 신호 증폭 카세트에 특이적인 HRP-표지된 탐침으로 검사하고 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 크로마틱 가시화에 의해 분석하였다. 유비퀴틴 C에 특이적인 탐침을 양성 대조군(도 47a 및 48a)으로 사용한 반면, dapB를 음성 대조군으로 사용하였다(도 47B 및 48B). 양성 CFTR 신호를 미처리된 및 비히클 대조군 처리된 돼지 폐 조직의 신호와 비교하였다(도 49 a 및 b). 염색된 샘플들이 표준 명시야 현미경 하에서 가시화되었다. 상기 데이터는 비히클 대조군(도 49 및 50 a 및 b)과 비교하여, 코돈 최적화 인간 CFTR SNIM RNA 1 mg으로의 처리가 코호트 2의 오른쪽 (a) 및 왼쪽 (b) 폐 조직 모두에서 CFTR 발현의 급격한 증가를 야기함을 입증하고, 더욱이, 추가의 CFTR 발현 증가가, 코호트 3 및 4 (도 51 및 52 a 및 b)에 대해 분석된 오른쪽(a) 및 왼쪽(b) 폐 샘플들 내에서 금격한 증가 염색이 관찰됨으로써 입증된 바와 같이, 5 mg 및 10 mg 처리 그룹에서 나타났다. 종합해 보면, 이와 같은 데이터는 흡입을 통한 mRNA의 효과적인 전달 및 폐의 양쪽 엽 및 기타 다른 조직들 내의 인간 CFTR의 발현을 강력히 뒷받침한다.
결론. 상기 결과는 발광효소 및 CFTR mRNA 모두 체내에서 폐 조직에 효과적으로 전달될 수 있음을 입증하였다. 폐의 오른쪽 및 왼쪽 옆 내의 서로 다른 부위에서 포집된 다양한 조직 샘플들 전반에서 발광효소 발현을 관찰하였다. 따라서 분무가 mRNA의 투여에 효과적인 접근방법이고, 상당히 균일한 분배를 야기한다는 점을 시사한다. 더욱이, 발광효소 이외에도, CFTR mRNA 또한 폐에 효과적으로 전달되어, 결국 단백질 발현이 증진된다. 발현 및 단백질 활성을 IP-WB, 면역조직화학 및 현장 혼성화에 의해 검증하였다. 각각의 접근 방식은 분명하게 폐의 조직 내에서, mRNA 전달 및 CFTR 발현 및/또는 활성의 용량의존 증가를 입증한다. 종합하면, 본 실험들은, 인간 개체의 폐에 CFTR mRNA를 전달하기 위한 전반적인 실용성 및 가능성을 부각시키고, 치료용 체내 CFTR 단백질 생성의 효과성을 보여준다.
실시예 12: 폐에서의 체내 발현
본 실시예는 mRNA-충전 나노입자의 에어로졸 전달 후 폐에서의 성공적인 체내 발현을 입증하였다. 모든 연구를 수행할 때, German Landrace의 돼지(Technical University Munich, Weihenstephan, Germany에서 획득)를 사용하였다. 상기 돼지는 체중이 35~90 kg이었다. FFL/CO-CFTR-C-His10 mRNA 제형 또는 비히클 대조군을 Pari 제트 네블라이저를 사용하여 도입하였다. mRNA에서 단백질 발현이 일어나도록 설정된 시간이 지난 후, 돼지를 희생시키고, 식염수로 관류시켰다.
메신저 RNA 합성. 본 실시예에서, 코돈 최적화 반딧불이 발광효소(CO-FFL) mRNA를 플라즈미드 DNA 템플레이트에서 체외 전사에서 합성하였다.
cKK-E12 제형. 지질-기반 나노입자 실험의 경우, cKK-E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K(상대량 40:30:25:5 (몰비)의 제형 중에 캡슐화된 1 mg FFL + 9 mg의 CO-CFTR-C-His10 mRNA로 지질 제형을 제조하였다. 지시된 네블라이저를 사용하여 상기 용액을 돼지 폐에 분무하였다.
에어로졸 도포. 에어로졸(식염수 또는 CO-FFL cKK-E12 제형)을 분무하여 마취된 돼지에게 흡입시켰다. 체중 1kg 당 아자페론 2 mg, 케타민 15 mg, 아트로핀 0.1 mg의 약물로 돼지를 안정시키고, 이어서 측면 귀 정맥에 정맥주입 라인을 삽입하였다. 체중 1kg 당 필요한 만큼 프로포폴 3~5 mg을 정맥 주입하여 돼지를 마취시켰다. 체중 1kg 당 4~8 mg의 1% 프로포폴 볼루스 주입과 함께 이소플루란(2~3%)으로 마취를 유지시킴으로써, 필요한 만큼 마취를 늘렸다. 마취 시간은 대략 1-3시간이었다 측면 귀 정맥을 통해 펜토바르비탈(체중 1kg 당 100 mg) 및 염화칼륨의 볼루스 주입으로 돼지를 희생시켰다. 폐를 잘라 내고, 다양한 폐 부위에서 조직 샘플들을 포집하여, 세포 배양배지에 밤새 배양시켰다. 이와 같은 보관된 샘플들에 생물 발광 검출을 실시하였다.
생물 발광 분석. 발광효소 활성의 측정을 위해, 조직 샘플들을 튜브 루미노미터에서 균질화 및 분석하거나 또는 D-루시페린 기질을 포함하는 배지 수조에서 배양한 후, 탈체 발광효소 BLI를 실시하였다. 대조군 돼지(식염수 비히클 대조군)의 (b) 대조군 폐 조직 샘플들과 비교하여, (a) FFL/CO-CFTR-C-His10 mRNA 처리된 돼지 각각에서 강한 생물 발광 신호가 관찰되었다(도 53 a 및 b).
이와 같은 데이터는 FFL/CFTR mRNA가 에어로졸 투여에 의해 폐로 성공적으로 전달되고, 폐에서 발현됨을 입증한다.
서열의 간단한 설명
서열 식별 번호 1. 야생형 CFTR 아미노산 서열.
서열 식별 번호 2. 야생형 CFTR mRNA 코딩 서열.
서열 식별 번호 3. 비천연 유래CFTR mRNA 코딩 서열 #1.
서열 식별 번호 4. CFTR mRNA 5'-UTR.
서열 식별 번호 5. CFTR mRNA 3'-UTR #1.
서열 식별 번호 6. FFL 5' UTR.
서열 식별 번호 7. FFL 코딩 서열.
서열 식별 번호 8. FFL 3' UTR.
서열 식별 번호 9. 비천연 유래CFTR mRNA 코딩 서열 #2.
서열 식별 번호 10. 비천연 유래CFTR mRNA 코딩 서열 #3.
서열 식별 번호 11. 비천연 유래CFTR mRNA 코딩 서열 #4.
서열 식별 번호 12. 비천연 유래CFTR mRNA 코딩 서열 #5.
서열 식별 번호 13. 비천연 유래CFTR mRNA 코딩 서열 #6.
서열 식별 번호 14. 비천연 유래 CFTR mRNA 코딩 서열 #7.
서열 식별 번호 15. 코돈 최적화 인간 CFTR C-말단 His10 융합 mRNA 코딩 서열.
서열 식별 번호 16. 성장 호르몬 선도 서열을 갖는 코돈 최적화 인간 CFTR mRNA 코딩 서열.
서열 식별 번호 17. 코돈 최적화 인간 CFTR mRNA
서열 식별 번호 18. mRNA 선도 서열 #1
서열 식별 번호 19. mRNA 선도 서열 #2
서열 식별 번호 20. CFTR mRNA 3'-UTR #2.
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등가물들
본 명세서는 본 명세서에 언급된 참조문헌들의 개시내용의 관점에서 철저히 이해된다. 본 명세서 내의 구현예들은 본 발명의 구현예의 예시를 제공하는 것으로, 본 발명의 범위를 제한하기 위해 구성된 것이 아니다. 당해기술의 숙련가는 그 밖의 많은 구현예들이 본 발명에 포함된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본원에서 언급된 모든 공보 및 특허는 전체가 참조로 편입되었다. 참조에 의해 편입된 내용들이 본 명세서와 불일치하거나 반할 경우, 본 명세서가 그와 같은 내용의 우위에 선다. 본원에서 모든 참조문헌의 언급이, 그와 같은 참조문헌들이 본 발명의 이전 기술임을 인정하는 것은 아니다.
달리 지시되지 않는 한, 청구항을 비롯하여 본 명세서에서 사용되는 구성성분, 반응 조건 등의 수량을 나타내는 모든 숫자는 근사값으로 이해되어야 하며, 본 발명에 의해 획득하고자 하는 바람직한 특성들에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 등가물의 원칙의 적용을 본 청구항의 범위에 국한시키려는 노력에서가 아니라, 각각의 숫자 매개변수는 유의미한 십진수의 수와 일반적인 반올림 법칙의 관점에서 이해되어야 한다. 본원에서 유의미한 십진수의 서로 다른 양을 갖는 일련의 숫자들의 언급이, 주어진 덜 유의미한 십진수를 갖는 숫자들이 좀 더 유의미한 십진수를 갖는 숫자들과 동일한 정확성을 갖는 것으로 시사한다고 이해되어서는 안 된다.
청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는"과 함께 결합하여 사용되는 단수명사는 "하나"를 의미할 수있으나, 또한 "하나 이상", "최소한 하나" 및 "하나 또는 하나를 초과"의 의미와 일치한다. 청구항에서 "또는"은, 개시 내용이 유일한 선택안 및 "및/또는" 을 가리키는 정의를 뒷받침하더라도, 선택안만을 언급하기 위해 또는 선택안들이 상호 배타적이라는 점이 달리 명시되지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되는 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 일련의 원소 앞에 사용되는 용어 "최소한"은 일련의 모든 원소를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 당해기술의 숙련가는 본원에 기술된 발명의 구체적 구현에들의 여러 등가물들을, 일반적인 실험을 사용하여, 알 수 있거나, 또는 확인할 수 있다. 이와 같은 등가물들은 하기의 청구항에 포함되는 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적/과학적 용어들은 본 발명이 속한 당해기술의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다 본원에 기술된 것과 유사 또는 동등한 모든 방법 및 재료들이 본 발명의 실현 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료가 본원에 기술되어 있다.
본원에서 논의되는 공보들은 본 출원의 출원일자 이전에 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 이전 발명 때문에 이와 같은 공보를 앞설 권리가 없다고 인정하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 추가로 제공된 공보의 일자는 실제 공보 일자와 다를 수 있기 때문에 독립적으로 확인할 필요가있을 수 있다.
본 발명의 기타 구현예들은 본원에 개시된 발명의 명세서 및 실현을 고려할 때, 당해기술의 숙련가들에게 명백한 것이다. 명세서와 예시는 예시적으로만 간주되고, 본 발명의 진정한 범위와 사상은 이하의 청구항에 의해 나타나도록 의도된다.
<110> Shire Human Genetic Therapies <120> CFTR MRNA COMPOSITIONS AND RELATED METHODS AND USES <130> 2006685-0455 <150> US 61/783,663 <151> 2013-03-14 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1480 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Arg Ser Pro Leu Glu Lys Ala Ser Val Val Ser Lys Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ser Trp Thr Arg Pro Ile Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Gln Arg Leu 20 25 30 Glu Leu Ser Asp Ile Tyr Gln Ile Pro Ser Val Asp Ser Ala Asp Asn 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Leu Glu Arg Glu Trp Asp Arg Glu Leu Ala Ser Lys 50 55 60 Lys Asn Pro Lys Leu Ile Asn Ala Leu Arg Arg Cys Phe Phe Trp Arg 65 70 75 80 Phe Met Phe Tyr Gly Ile Phe Leu Tyr Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala 85 90 95 Val Gln Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ile Ala Ser Tyr Asp Pro Asp 100 105 110 Asn Lys Glu Glu Arg Ser Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Leu Cys 115 120 125 Leu Leu Phe Ile Val Arg Thr Leu Leu Leu His Pro Ala Ile Phe Gly 130 135 140 Leu His His Ile Gly Met Gln Met Arg Ile Ala Met Phe Ser Leu Ile 145 150 155 160 Tyr Lys Lys Thr Leu Lys Leu Ser Ser Arg Val Leu Asp Lys Ile Ser 165 170 175 Ile Gly Gln Leu Val Ser Leu Leu Ser Asn Asn Leu Asn Lys Phe Asp 180 185 190 Glu Gly Leu Ala Leu Ala His Phe Val Trp Ile Ala Pro Leu Gln Val 195 200 205 Ala Leu Leu Met Gly Leu Ile Trp Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Phe 210 215 220 Cys Gly Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Ala Leu Phe Gln Ala Gly Leu 225 230 235 240 Gly Arg Met Met Met Lys Tyr Arg Asp Gln Arg Ala Gly Lys Ile Ser 245 250 255 Glu Arg Leu Val Ile Thr Ser Glu Met Ile Glu Asn Ile Gln Ser Val 260 265 270 Lys Ala Tyr Cys Trp Glu Glu Ala Met Glu Lys Met Ile Glu Asn Leu 275 280 285 Arg Gln Thr Glu Leu Lys Leu Thr Arg Lys Ala Ala Tyr Val Arg Tyr 290 295 300 Phe Asn Ser Ser Ala Phe Phe Phe Ser Gly Phe Phe Val Val Phe Leu 305 310 315 320 Ser Val Leu Pro Tyr Ala Leu Ile Lys Gly Ile Ile Leu Arg Lys Ile 325 330 335 Phe Thr Thr Ile Ser Phe Cys Ile Val Leu Arg Met Ala Val Thr Arg 340 345 350 Gln Phe Pro Trp Ala Val Gln Thr Trp Tyr Asp Ser Leu Gly Ala Ile 355 360 365 Asn Lys Ile Gln Asp Phe Leu Gln Lys Gln Glu Tyr Lys Thr Leu Glu 370 375 380 Tyr Asn Leu Thr Thr Thr Glu Val Val Met Glu Asn Val Thr Ala Phe 385 390 395 400 Trp Glu Glu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Glu Lys Ala Lys Gln Asn Asn 405 410 415 Asn Asn Arg Lys Thr Ser Asn Gly Asp Asp Ser Leu Phe Phe Ser Asn 420 425 430 Phe Ser Leu Leu Gly Thr Pro Val Leu Lys Asp Ile Asn Phe Lys Ile 435 440 445 Glu Arg Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys 450 455 460 Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Met Gly Glu Leu Glu Pro Ser Glu Gly 465 470 475 480 Lys Ile Lys His Ser Gly Arg Ile Ser Phe Cys Ser Gln Phe Ser Trp 485 490 495 Ile Met Pro Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr 500 505 510 Asp Glu Tyr Arg Tyr Arg Ser Val Ile Lys Ala Cys Gln Leu Glu Glu 515 520 525 Asp Ile Ser Lys Phe Ala Glu Lys Asp Asn Ile Val Leu Gly Glu Gly 530 535 540 Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Ala Arg Ile Ser Leu Ala Arg 545 550 555 560 Ala Val Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Pro Phe Gly 565 570 575 Tyr Leu Asp Val 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cugggcgagg gcggcaucac ccugucuggc ggccagagag ccagaaucag ccuggccaga 1680 gccguguaca aggacgccga ccuguaccug cuggacagcc ccuucggcua ccuggacgug 1740 cugaccgaga aagagaucuu cgagagcugc gugugcaagc ugauggccaa caagaccaga 1800 auccugguca ccagcaagau ggaacaccug aagaaggccg acaagauccu gauccugcac 1860 gagggcagca gcuacuucua cggcacauuc agcgagcugc agaaccugca gcccgacuuc 1920 agcagcaaac ugaugggcug cgacagcuuc gaccaguuca gcgccgagag aagaaacagc 1980 auccugaccg agacacugca cagauucagc cuggaaggcg acgcccccgu gucuuggacc 2040 gagacaaaga agcagagcuu caagcagacc ggcgaguucg gcgagaagag aaagaacucc 2100 auccugaacc ccaucaacag cauccggaag uucagcaucg ugcagaaaac cccccugcag 2160 augaacggca ucgaagagga cagcgacgag ccccuggaaa gacggcugag ccuggugccu 2220 gacagcgagc agggcgaggc cauccugccu agaaucagcg ugaucagcac cggccccacc 2280 cugcaggcua gaaggcggca gagcgugcug aaccugauga cccacagcgu gaaccagggc 2340 cagaacaucc accgcaagac caccgccagc accagaaagg ugucccuggc uccucaggcc 2400 aaccugaccg agcuggacau cuacagcaga aggcugagcc aggaaaccgg ccuggaaauc 2460 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cacugcucgg caccccggug 1320 cuuaaggaca ucaacuucaa gauugaacgc ggacagcucu uggcgguggc cggauccacc 1380 ggagcaggaa agacuagccu gcugauggug aucaugggug agcuggaacc guccgaaggc 1440 aaaaucaagc acuccggcag aaucagcuuc ugcucgcagu uuucguggau caugccagga 1500 accaucaaag agaacaucau cuuuggaguc ucauacgaug aguaccgcua cagaagcgug 1560 auuaaggccu gccagcuuga agaggacauc uccaaguucg cggaaaagga caacaucgug 1620 cugggugagg gagggaucac guugucgggc ggucagagag cccgcauuuc gcuggcacgg 1680 gcuguguaca aggaugcgga ucuuuaccuu cuggacucgc cauucgguua ccucgacgug 1740 cugaccgaaa aagaaaucuu cgagagcugc guguguaagc ugauggcuaa uaagacuaga 1800 auccucguga cguccaaaau ggaacaucuu aagaaggcgg auaagauucu cauucuucac 1860 gaggggucga gcuacuucua cgggacuuuu agcgagcugc agaauuugca gccggacuuc 1920 agcucaaagc ucaugggcug cgacucguuc gaucaguuca gcgccgaacg gcgcaauucg 1980 aucuugacgg aaacccugca cagauucucg cuggagggag augcaccugu cucguggacc 2040 gaaaccaaga agcaguccuu caagcagacg ggagaguucg gagaaaagcg gaagaacuca 2100 auccucaacc caaucaacuc cauucgcaaa uucucaaucg 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cuuaugccuu gauuaagggg auuauccucc gcaagauuuu caccacgauu 1020 ucguucugca uuguauugcg cauggcagug acacggcaau uuccgugggc cgugcagaca 1080 ugguaugacu cgcuuggagc gaucaacaaa auccaagacu ucuugcaaaa gcaagaguac 1140 aagacccugg aguacaaucu uacuacuacg gagguaguaa uggagaaugu gacggcuuuu 1200 ugggaggaag gauucggcga auuguucgaa aaggcuaagc agaacaacaa caaucggaaa 1260 accuccaaug gggacgauuc gcuguucuuc ucgaauuucu cccugcuggg aacgcccgug 1320 cuuaaagaca ucaacuucaa gaucgaacgg ggccagcugc ucgcggucgc gggcagcacu 1380 ggagcgggaa agacuucccu gcucaugguc aucaugggag agcuggagcc cucggagggc 1440 aaaaucaagc acucggggag gaucucauuu ugcagccagu ucucguggau caugcccggu 1500 acuaucaaag aaaacaucau cuuuggaguc agcuaugacg aguaccgcua ccggucggug 1560 aucaaggccu gccagcugga agaagauauc uccaaguucg ccgaaaagga caacauugug 1620 cugggagaag guggaaucac ucucucggga ggccagcgcg cacggaucuc acucgcaagg 1680 gccguguaca aggaugccga uuuguaccug uuggauucgc cguucgguua ucuugauguc 1740 cucacugaga aagagauuuu ugagucgugc gucuguaagc ugauggccaa caaaacccgc 1800 auccugguga 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gaaccagggu 2340 cagaacaucc accgcaaaac caccgccucc accaggaagg ugucacuggc cccucaagcc 2400 aaucugacug aguuggauau cuacuccaga aggcucagcc aggaaaccgg acuggaaauc 2460 ucggaagaga ucaacgaaga ggaucucaaa gaguguuucu ucgacgacau ggaaucaauc 2520 ccugcuguca cuacuuggaa caccuaucuc cgcuacauua ccgugcacaa gucacucauc 2580 uucguccuga ucuggugccu cgugaucuuc cuggccgagg ucgcagcauc gcuggucgug 2640 cuguggcugc ucggcaacac cccacuccaa gacaaaggca acagcaccca uucccgcaac 2700 aacuccuacg cggugaucau cacuucaacu ucguccuacu acgucuuuua caucuacgug 2760 ggcguggcgg acacgcuccu ggcuaugggg uucuuucgcg ggcugccucu uguccacacg 2820 cucaucacug ugucaaagau ucuccaccac aaaaugcugc acuccgugcu ccaggccccu 2880 augucgacuu ugaacacgcu uaaggccgga ggcauccuua acagauucuc gaaagauauc 2940 gcgaucuugg acgaucuucu gccgcugacu aucuuugacu ucauccaacu ccugcugauc 3000 gucaucggug ccaucgcagu ggucgcggug cuccaaccgu acauuuucgu ggcgacugug 3060 ccggugaucg uggcguucau caugcugcgg gcuuacuuuc uucagaccuc acagcagcug 3120 aagcaacucg aaucggaggg uagaucacca aucuuuaccc accucgucac 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gaccacuacg gaagucguga uggaaaacgu gacugcuuuu 1200 ugggaggaag gcuucggcga acuuuuugaa aaggcaaagc aaaacaauaa caacagaaag 1260 acgucaaacg gcgaugacuc gcuguucuuc uccaauuucu cccugcucgg caccccugug 1320 cugaaggaca ucaacuucaa aauugaacgc ggacagcugc uggccguggc gggaucgacc 1380 ggggcuggga aaaccucguu guugauggug aucaugggag aacucgaacc cucggaggga 1440 aagauuaagc auagcggacg gaucagcuuc uguucccagu ucucguggau caugccggga 1500 accauuaagg aaaacaucau cuucggcgug uccuacgacg aguaccggua uaggucggug 1560 aucaaggccu gccaguugga agaggacauc uccaaguucg cugagaagga caacaucgug 1620 cucggugaag ggggcauuac ucuguccggu ggccagcgcg cgagaauuuc gcuggcucgc 1680 gcgguguaca aagaugcgga ucucuaucug cuggauucgc ccuucggaua ccucgauguc 1740 cucacggaga aggagaucuu cgaaucgugc gugugcaagu ugauggcgaa caagacuagg 1800 auccugguca cuuccaagau ggagcacuug aagaaggccg auaagaucuu gauccuccau 1860 gaaggaucga gcuacuuuua cggaacuuuc ucagagcugc agaacuugca gccggacuuc 1920 ucaagcaaac ugauggguug cgacucguuc gaccaguuuu cggcagaacg gcggaacucg 1980 auccugacug agacucugca 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ugaaaacauc ucguucagca uuagccccgg ucagcgugug 3720 ggguugcucg ggaggaccgg gucaggaaaa ucgacguugc ugucggccuu cuugagacuu 3780 cugaauacag agggugagau ccagaucgac ggcguuucgu gggauagcau caccuugcag 3840 caguggcgca aggcguucgg agucauuccc caaaaggugu ucaucuuuuc gggaaccuuc 3900 cgcaagaauc uggauccgua cgaacagugg agcgaccaag agauuuggaa aguggcagau 3960 gaagugggau ugcggagcgu caucgaacag uuuccgggaa agcucgauuu cguccuugug 4020 gacgguggau gugugcuguc gcacggccau aagcagcuga ugugucucgc ccgcucggug 4080 cugucaaagg cgaagauccu cuugcuggau gagccaucag cccaucugga cccggugacg 4140 uaccagauca uuagacggac gcugaaacag gcauucgcgg acugcacugu gauccucugu 4200 gaacaucgga ucgaggccau gcuggagugu caacaauucu uggucaucga agagaacaaa 4260 gugcggcagu acgacagcau ccaaaagcug cugaacgaga ggucccucuu ccgccaggcc 4320 aucuccccau ccgaccgggu caagcuguuc ccucaccgca acagcucaaa gugcaaaucc 4380 aaaccccaga ucgcagcgcu gaaagaagaa acugaagaag aagugcaaga cacuagacug 4440 uga 4443 <210> 14 <211> 4443 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized 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ccggcaguga ccacuuggaa caccuacuug cgcuauauca cugugcacaa aagccuuauc 2580 uucguccuca ucuggugccu cgucaucuuc cuggcugagg ucgcagccuc gcuggucgug 2640 cucugguugc ucggaaacac uccgcugcag gauaagggga auucgacuca cucgcggaac 2700 aauucguacg cugucauuau caccucgacg ucgucauacu acguguuuua caucuacgug 2760 ggaguggcug acacucuguu ggcuaugggg uucuuucgcg gccugccacu gguccauacu 2820 cucauuacug uguccaaaau ccuucaucac aagauguugc auucagugcu gcaagcaccg 2880 auguccaccc ucaauacccu uaaggcuggc gggauucuca accgcuucuc gaaagacauc 2940 gccauccucg augaucuucu gccucucacc aucuuugauu ucauccagcu gcuccugauc 3000 gugaucggag cgauugccgu gguggcagug uugcagccgu acaucuuugu cgcaacugug 3060 ccggucaucg ucgccuucau caugcugcgc gccuacuucu ugcaaacguc acagcaacug 3120 aagcagcuug aauccgaggg aagaucaccu aucuucaccc accucgugac uucgcugaag 3180 gggcugugga cgcugcgcgc auuuggaagg caaccguacu ucgagacuuu guuccacaag 3240 gcgcucaauc uucacacugc caauugguuc uuguaccugu caacgcugag augguuucag 3300 augcggaucg aaaugaucuu cgugaucuuc uuuaucgcgg ugacuuucau cucgauccug 3360 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uuaucuuuag cggaaccuuc 3900 cgaaagaauc ucgauccuua ugaacagugg ucagaucaag agauuuggaa agucgcggac 3960 gagguuggcc uucggagugu aaucgagcag uuuccgggaa aacucgacuu uguccuugua 4020 gaugggggau gcguccuguc gcaugggcac aagcagcuca ugugccuggc gcgauccguc 4080 cucucuaaag cgaaaauucu ucucuuggau gaaccuucgg cccaucugga cccgguaacg 4140 uaucagauca ucagaaggac acuuaagcag gcguuugccg acugcacggu gauucucugu 4200 gagcaucgua ucgaggccau gcucgaaugc cagcaauuuc uugucaucga agagaauaag 4260 guccgccagu acgacuccau ccagaagcug cuuaaugaga gaucauuguu ccggcaggcg 4320 auuucaccau ccgauagggu gaaacuuuuu ccacacagaa auucgucgaa gugcaagucc 4380 aaaccgcaga ucgcggccuu gaaagaagag acugaagaag aaguucaaga cacgcgucuu 4440 caccaucacc aucaccauca ccaucaccau uaa 4473 <210> 16 <211> 4542 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized olignucleotide <400> 16 auggccacug gaucaagaac cucacugcug cucgcuuuug gacugcuuug ccugcccugg 60 uugcaagaag gaucggcuuu cccgaccauc ccacucucca ugcagcgguc cccgcucgaa 120 aaggccagug ucguguccaa acucuucuuc 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ucguccucau cuggugucuc 2700 gugaucuuuc ucgcugaggu cgcagcguca cuuguggucc ucuggcugcu ugguaauacg 2760 cccuugcaag acaaaggcaa uucuacacac ucaagaaaca auuccuaugc cgugauuauc 2820 acuucuacaa gcucguauua cguguuuuac aucuacguag gaguggccga cacucugcuc 2880 gcgauggguu ucuuccgagg acucccacuc guucacacgc uuaucacugu cuccaagauu 2940 cuccaccaua agaugcuuca uagcguacug caggcuccca uguccaccuu gaauacgcuc 3000 aaggcgggag guauuuugaa ucgcuucuca aaagauauug caauuuugga ugaccuucug 3060 ccccugacga ucuucgacuu cauccaguug uugcugaucg ugauuggggc uauugcagua 3120 gucgcugucc uccagccuua cauuuuuguc gcgaccguuc cggugaucgu ggcguuuauc 3180 augcugcggg ccuauuucuu gcagacguca cagcagcuua agcaacugga gucugaaggg 3240 aggucgccua ucuuuacgca ucuugugacc aguuugaagg gauuguggac guugcgcgcc 3300 uuuggcaggc agcccuacuu ugaaacacug uuccacaaag cgcugaaucu ccauacggca 3360 aauugguuuu uguauuugag uacccuccga ugguuucaga ugcgcauuga gaugauuuuu 3420 gugaucuucu uuaucgcggu gacuuuuauc uccaucuuga ccacgggaga gggcgaggga 3480 cgggucggua uuauccugac acucgccaug aacauuauga gcacuuugca gugggcagug 3540 aacagcucga uugaugugga uagccugaug agguccguuu cgagggucuu uaaguucauc 3600 gacaugccga cggagggaaa gcccacaaaa aguacgaaac ccuauaagaa ugggcaauug 3660 aguaagguaa ugaucaucga gaacagucac gugaagaagg augacaucug gccuagcggg 3720 ggucagauga ccgugaagga ccugacggca aaauacaccg agggagggaa cgcaauccuu 3780 gaaaacaucu cguucagcau uagccccggu cagcgugugg gguugcucgg gaggaccggg 3840 ucaggaaaau cgacguugcu gucggccuuc uugagacuuc ugaauacaga gggugagauc 3900 cagaucgacg gcguuucgug ggauagcauc accuugcagc aguggcggaa agcguuugga 3960 guaauccccc aaaaggucuu uaucuuuagc ggaaccuucc gaaagaaucu cgauccuuau 4020 gaacaguggu cagaucaaga gauuuggaaa gucgcggacg agguuggccu ucggagugua 4080 aucgagcagu uuccgggaaa acucgacuuu guccuuguag augggggaug cguccugucg 4140 caugggcaca agcagcucau gugccuggcg cgauccgucc ucucuaaagc gaaaauucuu 4200 cucuuggaug aaccuucggc ccaucuggac ccgguaacgu aucagaucau cagaaggaca 4260 cuuaagcagg cguuugccga cugcacggug auucucugug agcaucguau cgaggccaug 4320 cucgaaugcc agcaauuucu ugucaucgaa gagaauaagg uccgccagua cgacuccauc 4380 cagaagcugc uuaaugagag aucauuguuc cggcaggcga uuucaccauc cgauagggug 4440 aaacuuuuuc cacacagaaa uucgucgaag ugcaagucca aaccgcagau cgcggccuug 4500 aaagaagaga cugaagaaga aguucaagac acgcgucuuu aa 4542 <210> 17 <211> 4443 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized olignucleotide <400> 17 augcagcggu ccccgcucga aaaggccagu gucgugucca aacucuucuu cucauggacu 60 cggccuaucc uuagaaaggg guaucggcag aggcuugagu ugucugacau cuaccagauc 120 cccucgguag auucggcgga uaaccucucg gagaagcucg aacgggaaug ggaccgcgaa 180 cucgcgucua agaaaaaccc gaagcucauc aacgcacuga gaaggugcuu cuucuggcgg 240 uucauguucu acgguaucuu cuuguaucuc ggggagguca caaaagcagu ccaaccccug 300 uuguuggguc gcauuaucgc cucguacgac cccgauaaca aagaagaacg gagcaucgcg 360 aucuaccucg ggaucggacu guguuugcuu uucaucguca gaacacuuuu guugcaucca 420 gcaaucuucg gccuccauca caucgguaug cagaugcgaa ucgcuauguu uagcuugauc 480 uacaaaaaga cacugaaacu cucgucgcgg guguuggaua agauuuccau cggucaguug 540 gugucccugc uuaguaauaa ccucaacaaa uucgaugagg gacuggcgcu ggcacauuuc 600 guguggauug ccccguugca agucgcccuu uugaugggcc uuauuuggga gcuguugcag 660 gcaucugccu uuuguggccu gggauuucug auuguguugg cauuguuuca ggcugggcuu 720 gggcggauga ugaugaagua ucgcgaccag agagcgggua aaaucucgga aagacucguc 780 aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucggucaaag ccuauugcug ggaagaagcu 840 auggagaaga ugauugaaaa ccuccgccaa acugagcuga aacugacccg caaggcggcg 900 uauguccggu auuucaauuc gucagcguuc uucuuuuccg gguucuucgu ugucuuucuc 960 ucgguuuugc cuuaugccuu gauuaagggg auuauccucc gcaagauuuu caccacgauu 1020 ucguucugca uuguauugcg cauggcagug acacggcaau uuccgugggc cgugcagaca 1080 ugguaugacu cgcuuggagc gaucaacaaa auccaagacu ucuugcaaaa gcaagaguac 1140 aagacccugg aguacaaucu uacuacuacg gagguaguaa uggagaaugu gacggcuuuu 1200 ugggaagagg guuuuggaga acuguuugag aaagcaaagc agaauaacaa caaccgcaag 1260 accucaaaug gggacgauuc ccuguuuuuc ucgaacuucu cccugcucgg aacacccgug 1320 uugaaggaca ucaauuucaa gauugagagg ggacagcuuc ucgcgguagc gggaagcacu 1380 ggugcgggaa aaacuagccu cuugauggug auuauggggg agcuugagcc cagcgagggg 1440 aagauuaaac acuccgggcg uaucucauuc uguagccagu uuucauggau caugcccgga 1500 accauuaaag agaacaucau uuucggagua uccuaugaug aguaccgaua cagaucgguc 1560 auuaaggcgu gccaguugga agaggacauu ucuaaguucg ccgagaagga uaacaucguc 1620 uugggagaag gggguauuac auugucggga gggcagcgag cgcggaucag ccucgcgaga 1680 gcgguauaca aagaugcaga uuuguaucug cuugauucac cguuuggaua ccucgacgua 1740 uugacagaaa aagaaaucuu cgagucgugc guguguaaac uuauggcuaa uaagacgaga 1800 auccugguga caucaaaaau ggaacaccuu aagaaggcgg acaagauccu gauccuccac 1860 gaaggaucgu ccuacuuuua cggcacuuuc ucagaguugc aaaacuugca gccggacuuc 1920 ucaagcaaac ucauggggug ugacucauuc gaccaguuca gcgcggaacg gcggaacucg 1980 aucuugacgg aaacgcugca ccgauucucg cuugagggug augccccggu aucguggacc 2040 gagacaaaga agcagucguu uaagcagaca ggagaauuug gugagaaaag aaagaacagu 2100 aucuugaauc cuauuaacuc aauucgcaag uucucaaucg uccagaaaac uccacugcag 2160 augaauggaa uugaagagga uucggacgaa ccccuggagc gcaggcuuag ccucgugccg 2220 gauucagagc aaggggaggc cauucuuccc cggauuucgg ugauuucaac cggaccuaca 2280 cuucaggcga ggcgaaggca auccgugcuc aaccucauga cgcauucggu aaaccagggg 2340 caaaacauuc accgcaaaac gacggccuca acgagaaaag ugucacuugc accccaggcg 2400 aauuugacug aacucgacau cuacagccgu aggcuuucgc aagaaaccgg acuugagauc 2460 agcgaagaaa ucaaugaaga agauuugaaa gaguguuucu uugaugacau ggaaucaauc 2520 ccagcgguga caacguggaa cacauacuug cguuacauca cggugcacaa guccuugauu 2580 uucguccuca ucuggugucu cgugaucuuu cucgcugagg ucgcagcguc acuugugguc 2640 cucuggcugc uugguaauac gcccuugcaa gacaaaggca auucuacaca cucaagaaac 2700 aauuccuaug ccgugauuau cacuucuaca agcucguauu acguguuuua caucuacgua 2760 ggaguggccg acacucugcu cgcgaugggu uucuuccgag gacucccacu cguucacacg 2820 cuuaucacug ucuccaagau ucuccaccau aagaugcuuc auagcguacu gcaggcuccc 2880 auguccaccu ugaauacgcu caaggcggga gguauuuuga aucgcuucuc aaaagauauu 2940 gcaauuuugg augaccuucu gccccugacg aucuucgacu ucauccaguu guugcugauc 3000 gugauugggg cuauugcagu agucgcuguc cuccagccuu acauuuuugu cgcgaccguu 3060 ccggugaucg uggcguuuau caugcugcgg gccuauuucu ugcagacguc acagcagcuu 3120 aagcaacugg agucugaagg gaggucgccu aucuuuacgc aucuugugac caguuugaag 3180 ggauugugga cguugcgcgc cuuuggcagg cagcccuacu uugaaacacu guuccacaaa 3240 gcgcugaauc uccauacggc aaauugguuu uuguauuuga guacccuccg augguuucag 3300 augcgcauug agaugauuuu ugugaucuuc uuuaucgcgg ugacuuuuau cuccaucuug 3360 accacgggag agggcgaggg acgggucggu auuauccuga cacucgccau gaacauuaug 3420 agcacuuugc agugggcagu gaacagcucg auugaugugg auagccugau gagguccguu 3480 ucgagggucu uuaaguucau cgacaugccg acggagggaa agcccacaaa aaguacgaaa 3540 cccuauaaga augggcaauu gaguaaggua augaucaucg agaacaguca cgugaagaag 3600 gaugacaucu ggccuagcgg gggucagaug accgugaagg accugacggc aaaauacacc 3660 gagggaggga acgcaauccu ugaaaacauc ucguucagca uuagccccgg ucagcgugug 3720 ggguugcucg ggaggaccgg gucaggaaaa ucgacguugc ugucggccuu cuugagacuu 3780 cugaauacag agggugagau ccagaucgac ggcguuucgu gggauagcau caccuugcag 3840 caguggcgga aagcguuugg aguaaucccc caaaaggucu uuaucuuuag cggaaccuuc 3900 cgaaagaauc ucgauccuua ugaacagugg ucagaucaag agauuuggaa agucgcggac 3960 gagguuggcc uucggagugu aaucgagcag uuuccgggaa aacucgacuu uguccuugua 4020 gaugggggau gcguccuguc gcaugggcac aagcagcuca ugugccuggc gcgauccguc 4080 cucucuaaag cgaaaauucu ucucuuggau gaaccuucgg cccaucugga cccgguaacg 4140 uaucagauca ucagaaggac acuuaagcag gcguuugccg acugcacggu gauucucugu 4200 gagcaucgua ucgaggccau gcucgaaugc cagcaauuuc uugucaucga agagaauaag 4260 guccgccagu acgacuccau ccagaagcug cuuaaugaga gaucauuguu ccggcaggcg 4320 auuucaccau ccgauagggu gaaacuuuuu ccacacagaa auucgucgaa gugcaagucc 4380 aaaccgcaga ucgcggccuu gaaagaagag acugaagaag aaguucaaga cacgcgucuu 4440 uaa 4443 <210> 18 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized olignucleotide <400> 18 auggccacug gaucaagaac cucacugcug cucgcuuuug gacugcuuug ccugcccugg 60 uugcaagaag gaucggcuuu cccgaccauc ccacucucc 99 <210> 19 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized olignucleotide <400> 19 auggcaacug gaucaagaac cucccuccug cucgcauucg gccugcucug ucucccaugg 60 cuccaagaag gaagcgcguu ccccacuauc ccccucucg 99 <210> 20 <211> 105 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized olignucleotide <400> 20 cggguggcau cccugugacc ccuccccagu gccucuccug gcccuggaag uugccacucc 60 agugcccacc agccuugucc uaauaaaauu aaguugcauc aagcu 105

Claims (47)

  1. 코딩 서열, 5'-UTR 및 3'-UTR을 포함하는 비천연 유래 mRNA 분자로서, 상기 코딩 서열이 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 인코딩하고, 상기 코딩 서열이 서열 식별 번호: 3와 최소한 80% 동일한 것인 비천연 유래 mRNA 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 코딩 서열이 서열 식별 번호: 3과 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일한 것인 mRNA 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 코딩 서열이 서열 식별 번호: 3과 동일한 것인 mRNA 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 5'-UTR이 서열 식별 번호: 4를 포함 또는 상기 3'-UTR이 서열 식별 번호: 5를 포함하거나, 또는
    상기 5'-UTR이 서열 식별 번호: 4를 포함하고 상기 3'-UTR이 서열 식별 번호: 5를 포함하는 것인, mRNA 분자.
  5. 청구항 1에 있어서, 최소한 70, 100, 120, 150, 200 또는 250개 잔기 길이의 폴리-A 꼬리(poly-A-tail)를 3' 말단에 추가로 포함하는 mRNA 분자.
  6. 청구항 1에 있어서, 5' 캡(5' cap)을 추가로 포함하는 mRNA 분자.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 mRNA가 비표준 핵염기를 포함하고, 상기 비표준 핵염기가 5-메틸-사이티딘, 슈도우리딘, 및 2-티오-우리딘에서 선택된 하나인 mRNA 분자.
  8. 청구항 1에 있어서, 포유류 또는 포유류 세포에서의 기능적 낭포성 섬유증 막전위 조절자(CFTR) 발현을 유도할 때 사용하기 위한 mRNA 분자.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 선형 또는 환형 폴리뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 mRNA를 포함하는, 기능적 CFTR의 발현을 유도하여 낭포성 섬유증을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 폴리에틸렌이민 (PEI), 프로타민, PEG화된 프로타민, 폴리-L-라이신(PLL), PEG화된 PLL 또는 양이온성 지질에서 선택되는 유기 양이온을 추가로 포함하고, 상기 유기 양이온이 상기 mRNA와 공유결합으로 복합체를 형성하는 것이고,
    상기 양이온성 지질이 DODAP(1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판), DLinDMA, DLin-KC2-DMA, C12-200, HGT4003, HGT5000, HGT5001, MC3, ICE, 디알킬아미노 모이어티를 포함하는 양이온성 지질, 이미다졸 모이어티를 포함하는 양이온성 지질, 및 구아니디늄 모이어티를 포함하는 양이온성 지질에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 추가로 중성 지질, PEG화된 지질, 또는 콜레스테롤을 포함하고,
    상기 중성 지질이 상기 조성물에 존재하고, DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE(1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DPPE(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPE(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민) 및 DOPG(,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤))에서 선택되고,
    상기 PEG화된 지질이 상기 조성물에 존재하고 최대 길이가 5 kDa인 폴리(에틸렌) 글리콜 사슬에 공유결합으로 부착되는 하나 이상의 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 유기 양이온이 10 내지 40 kDa의 분자량을 가진 분지형 PEI인 것인 약제학적 조성물.
  15. (i) 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 하나의 mRNA 및 (ii) 상기 mRNA에서 발현되는 기능적 CFTR을 포함하는 배양된 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, 야생형 인간 CFTR을 인코딩하는 게놈 DNA 또는 야생형 인간 CFTR을 인코딩하는 cDNA를 포함하지 않는 배양된 세포.
  17. 체외에서 CFTR mRNA를 제조하는 방법으로서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 단리된 폴리뉴클레오티드를 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서
    상기 단리된 폴리뉴클레오티드 및 RNA 중합효소가 한 세포 내에 함유되지 있지 않으며;
    상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 상기 RNA 중합효소를 위한 템플레이트이며;
    상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 템플레이트 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하며;
    상기 템플레이트 서열이 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 서열에 상보적인 코딩 서열 상보체를 포함하며; 그리고
    (a) 상기 템플레이트 서열이 서열 식별 번호: 2의 상보체보다 더 적은 잠재 프로모터를 포함하거나, (b) 상기 템플레이트 서열이 서열 식별 번호: 2보다 더 적은 직접 및 역반복을 포함하거나, (c) 상기 템플레이트 서열이 서열 식별 번호: 2보다 더 적은 불리한 코돈의 상보체를 포함하거나, 또는 (d) 코딩 서열 상보체의 GC 함량이 서열 식별 번호: 2의 GC 함량보다 낮은 것인 방법.
  18. 체외에서 CFTR mRNA를 제조하는 방법으로서, 뉴클레오시드 트리포스페이트 존재 하에 청구항 9의 단리된 폴리뉴클레오티드를 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서
    상기 단리된 폴리뉴클레오티드 및 RNA 중합효소가 한 세포 내에 함유되지 있지 않으며;
    상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 상기 RNA 중합효소를 위한 템플레이트이며; 그리고
    상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 템플레이트 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하며,
    및 상기 RNA 중합효소가 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를 합성하는 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 RNA 중합효소가 T7 RNA 중합효소인 것인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트가 슈도우리딘 트리포스페이트, 5-메틸-사이티딘 트리포스페이트 및 2-티오-우리딘 트리포스페이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 서열 식별 번호: 1을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 mRNA를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 단리된 mRNA에 5' 캡을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 캡으로 닫힌 단리된 mRNA를 유기 양이온을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 운반체와 접촉시킴으로써 약제학적 조성물을 제형화하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 유기 양이온이 폴리에틸렌이민 (PEI), 프로타민, PEG화된 프로타민, 폴리-L-라이신(PLL), PEG화된 PLL, 또는 양이온성 지질을 포함하는 것인 방법.

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PL3338765T3 (pl) 2009-12-01 2019-06-28 Translate Bio, Inc. Pochodna steroidowa dla dostarczania mrna w ludzkich chorobach genetycznych
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
US8853377B2 (en) * 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
EP3336082B1 (en) 2011-06-08 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
CN111671918A (zh) 2011-06-08 2020-09-18 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
ES2708561T3 (es) 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのｍＲＮＡ療法
NZ718817A (en) 2013-10-22 2020-07-31 Massachusetts Inst Technology Lipid formulations for delivery of messenger rna
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
CN105658800A (zh) * 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 Mrna的cns递送及其用途
ES2750661T3 (es) 2014-04-25 2020-03-26 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
US10172924B2 (en) 2015-03-19 2019-01-08 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for pompe disease
WO2017001570A2 (en) 2015-06-30 2017-01-05 Ethris Gmbh Atp-binding cassette family coding polyribonucleotides and formulations thereof
US20210206818A1 (en) 2016-01-22 2021-07-08 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
PT3377637T (pt) * 2016-04-08 2020-06-17 Krystal Biotech Inc Composições para uso em métodos para o tratamento de ferimentos, transtornos e doenças da pele
EP3825400A1 (en) 2016-04-08 2021-05-26 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
EP3458108A4 (en) * 2016-05-18 2020-04-22 ModernaTX, Inc. POLYNUCLEOTIDES FOR CODING THE TRANSMEMBRANE CONDUCTIVE REGULATOR OF CYSTIC FIBROSE FOR TREATING CYSTIC FIBROSE
HRP20230050T1 (hr) 2016-05-18 2023-03-03 Modernatx, Inc. Polinukleotidi koji kodiraju interleukin-12 (il12) i njihova upotreba
MA46756A (fr) * 2016-11-10 2019-09-18 Translate Bio Inc Formulation de nanoparticules lipidiques à base de glace améliorée pour l'administration de l'arnm
CN110225980B (zh) 2016-11-21 2023-01-06 纳米线科技公司 化学组合物及其使用方法
JP7181880B2 (ja) * 2017-01-27 2022-12-01 ザ・メソジスト・ホスピタル 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム
DK3585892T3 (da) 2017-02-27 2022-08-22 Translate Bio Inc Fremgangsmåder til oprensning af messenger-rna
WO2018157154A2 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
IL268857B2 (en) 2017-02-27 2024-09-01 Translate Bio Inc Methods for the purification of messenger RNA
KR102700956B1 (ko) 2017-02-28 2024-09-03 사노피 치료적 rna
EP3600379B1 (en) 2017-03-31 2022-12-21 Accanis Biotech F&E GmbH & Co KG Prevention and treatment of non-melanoma skin cancer (nmsc)
EP3398963B1 (en) * 2017-05-04 2021-09-29 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Chemically modified mrna for use in the treatment of a disease associated with the cftr gene
EP3624824B1 (en) * 2017-05-16 2024-07-10 Translate Bio, Inc. Codon-optimized mrna encoding cftr for use in treating cystic fibrosis
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
EP3437650A1 (en) 2017-07-31 2019-02-06 Accanis Biotech F&E GmbH & Co KG Treatment of local skin hypotrophy conditions
NZ761412A (en) * 2017-09-08 2024-07-05 Generation Bio Co Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free dna vectors
AU2019252658B2 (en) 2018-04-12 2023-09-14 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
CN112703255A (zh) 2018-05-14 2021-04-23 纳米线科技公司 化学组合物及其使用方法
JP7422977B2 (ja) * 2018-07-23 2024-01-29 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａ用乾燥粉末製剤
CN118421617A (zh) 2018-08-24 2024-08-02 川斯勒佰尔公司 用于纯化信使rna的方法
EP3849617A1 (en) * 2018-09-14 2021-07-21 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of methylmalonic acidemia
EP3856761A1 (en) 2018-09-24 2021-08-04 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of netherton syndrome
EP3861108A1 (en) 2018-10-04 2021-08-11 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed rna
US11072808B2 (en) 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
EP3877538A1 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger rna purification
WO2020097379A2 (en) * 2018-11-09 2020-05-14 Translate Bio, Inc. Peg lipidoid compounds
SG11202107969SA (en) * 2019-02-08 2021-08-30 Krystal Biotech Inc Compositions and methods for delivering cftr polypeptides
CN113396219A (zh) 2019-02-11 2021-09-14 埃泽瑞斯公司 通过切向流过滤纯化mRNA
US20220195461A1 (en) * 2019-04-15 2022-06-23 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for transgene expression
CN114641318A (zh) * 2019-04-15 2022-06-17 衣阿华大学研究基金会 用于治疗囊性纤维化的组合物和方法
EP4031662A1 (en) * 2019-09-20 2022-07-27 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
AU2021264465A1 (en) * 2020-04-27 2022-12-15 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods for the treatment of cystic fibrosis
WO2021222801A2 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Arcturus Therapeutics, Inc. Nucleic acids and methods of treatment for cystic fibrosis
JP7391460B2 (ja) 2020-09-16 2023-12-05 エルジー・ケム・リミテッド 化合物、これを含む抗菌消臭組成物、およびその製造方法
JP2024511437A (ja) * 2021-03-23 2024-03-13 リコード セラピューティクス，インク． ポリヌクレオチド組成物、関連製剤、およびその使用方法
EP4314028A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 Krystal Biotech, Inc. Viral vectors for cancer therapy
JP2024520834A (ja) * 2021-06-09 2024-05-24 レコード・セラピューティクス・インコーポレイテッド ポリヌクレオチド組成物、関連する製剤及びその使用方法
EP4434534A1 (en) 2023-03-22 2024-09-25 ADvantage Therapeutics, Inc. Klotho mrna

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999014346A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
WO2007024708A2 (en) 2005-08-23 2007-03-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
WO2011012316A2 (de) 2009-07-31 2011-02-03 Ludwig-Maximilians-Universität Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression

Family Cites Families (440)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2647121A (en) 1951-02-02 1953-07-28 Ruth P Jacoby Diamine-bis-acetamides
US2819718A (en) 1953-07-16 1958-01-14 Isidore H Goldman Drainage tube
US2717909A (en) 1953-09-24 1955-09-13 Monsanto Chemicals Hydroxyethyl-keryl-alkylene-ammonium compounds
US2844629A (en) 1956-04-25 1958-07-22 American Home Prod Fatty acid amides and derivatives thereof
US3096560A (en) 1958-11-21 1963-07-09 William J Liebig Process for synthetic vascular implants
GB1072118A (en) 1962-12-01 1967-06-14 Sandoz Ag Amides of aminopropionic acid
JPS5141663B1 (ko) 1966-03-12 1976-11-11
JPS4822365B1 (ko) 1968-10-25 1973-07-05
NL143127B (nl) 1969-02-04 1974-09-16 Rhone Poulenc Sa Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep.
US3614955A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Standby defibrillator and method of operation
US3614954A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Electronic standby defibrillator
JPS5024216B1 (ko) 1970-12-29 1975-08-14
JPS5024216Y1 (ko) 1970-12-29 1975-07-21
JPS5012146Y2 (ko) 1971-07-27 1975-04-15
US3945052A (en) 1972-05-01 1976-03-23 Meadox Medicals, Inc. Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same
US3805301A (en) 1972-07-28 1974-04-23 Meadox Medicals Inc Tubular grafts having indicia thereon
JPS49127908A (ko) 1973-04-20 1974-12-07
JPS5624664B2 (ko) 1973-06-28 1981-06-08
US4013507A (en) 1973-09-18 1977-03-22 California Institute Of Technology Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells
JPS5123537A (ja) 1974-04-26 1976-02-25 Adeka Argus Chemical Co Ltd Kasozaisoseibutsu
GB1527592A (en) 1974-08-05 1978-10-04 Ici Ltd Wound dressing
US3995623A (en) 1974-12-23 1976-12-07 American Hospital Supply Corporation Multipurpose flow-directed catheter
JPS5813576B2 (ja) 1974-12-27 1983-03-14 アデカ ア−ガスカガク カブシキガイシヤ 安定化された合成高分子組成物
JPS5524302Y2 (ko) 1975-03-31 1980-06-10
DE2520814A1 (de) 1975-05-09 1976-11-18 Bayer Ag Lichtstabilisierung von polyurethanen
US4281669A (en) 1975-05-09 1981-08-04 Macgregor David C Pacemaker electrode with porous system
JPS5210847A (en) 1975-07-16 1977-01-27 Nippon Steel Corp Pinch roll
US4096860A (en) 1975-10-08 1978-06-27 Mclaughlin William F Dual flow encatheter
CA1069652A (en) 1976-01-09 1980-01-15 Alain F. Carpentier Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring
US4134402A (en) 1976-02-11 1979-01-16 Mahurkar Sakharam D Double lumen hemodialysis catheter
US4072146A (en) 1976-09-08 1978-02-07 Howes Randolph M Venous catheter device
US4335723A (en) 1976-11-26 1982-06-22 The Kendall Company Catheter having inflatable retention means
US4099528A (en) 1977-02-17 1978-07-11 Sorenson Research Co., Inc. Double lumen cannula
US4140126A (en) 1977-02-18 1979-02-20 Choudhury M Hasan Method for performing aneurysm repair
US4265745A (en) 1977-05-25 1981-05-05 Teijin Limited Permselective membrane
US4182833A (en) 1977-12-07 1980-01-08 Celanese Polymer Specialties Company Cationic epoxide-amine reaction products
US4180068A (en) 1978-04-13 1979-12-25 Motion Control, Incorporated Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure
EP0005035B1 (en) 1978-04-19 1981-09-23 Imperial Chemical Industries Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
US4284459A (en) 1978-07-03 1981-08-18 The Kendall Company Method for making a molded catheter
US4227533A (en) 1978-11-03 1980-10-14 Bristol-Myers Company Flushable urinary catheter
US4375817A (en) 1979-07-19 1983-03-08 Medtronic, Inc. Implantable cardioverter
DE3010841A1 (de) 1980-03-21 1981-10-08 Ulrich Dr.med. 6936 Haag Uthmann Katheder
US4308085A (en) 1980-07-28 1981-12-29 Jenoptik Jena Gmbh Process for the preparation of high molecular thermoplastic epoxide-amine-polyadducts
US4339369A (en) 1981-04-23 1982-07-13 Celanese Corporation Cationic epoxide-amine reaction products
US4406656A (en) 1981-06-01 1983-09-27 Brack Gillium Hattler Venous catheter having collapsible multi-lumens
US4475972A (en) 1981-10-01 1984-10-09 Ontario Research Foundation Implantable material
US4401472A (en) 1982-02-26 1983-08-30 Martin Marietta Corporation Hydraulic cement mixes and processes for improving hydraulic cement mixes
US4568329A (en) 1982-03-08 1986-02-04 Mahurkar Sakharam D Double lumen catheter
US4546499A (en) 1982-12-13 1985-10-15 Possis Medical, Inc. Method of supplying blood to blood receiving vessels
US4530113A (en) 1983-05-20 1985-07-23 Intervascular, Inc. Vascular grafts with cross-weave patterns
US4550447A (en) 1983-08-03 1985-11-05 Shiley Incorporated Vascular graft prosthesis
US4647416A (en) 1983-08-03 1987-03-03 Shiley Incorporated Method of preparing a vascular graft prosthesis
US5104399A (en) 1986-12-10 1992-04-14 Endovascular Technologies, Inc. Artificial graft and implantation method
US4571241A (en) 1983-12-16 1986-02-18 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4710169A (en) 1983-12-16 1987-12-01 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4737518A (en) 1984-04-03 1988-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lipid derivatives, their production and use
US4562596A (en) 1984-04-25 1986-01-07 Elliot Kornberg Aortic graft, device and method for performing an intraluminal abdominal aortic aneurysm repair
US4782836A (en) 1984-05-24 1988-11-08 Intermedics, Inc. Rate adaptive cardiac pacemaker responsive to patient activity and temperature
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4662382A (en) 1985-01-16 1987-05-05 Intermedics, Inc. Pacemaker lead with enhanced sensitivity
US4762915A (en) 1985-01-18 1988-08-09 Liposome Technology, Inc. Protein-liposome conjugates
US4860751A (en) 1985-02-04 1989-08-29 Cordis Corporation Activity sensor for pacemaker control
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
CA1320724C (en) 1985-07-19 1993-07-27 Koichi Kanehira Terpene amino alcohols and medicinal uses thereof
US4701162A (en) 1985-09-24 1987-10-20 The Kendall Company Foley catheter assembly
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
DE3616824A1 (de) 1986-05-17 1987-11-19 Schering Ag Verwendung von haertbaren kunstharzmischungen fuer oberflaechenbeschichtungen und druckfarben und verfahren zu ihrer herstellung
DE3780374D1 (de) 1986-07-31 1992-08-20 Irnich Werner Frequenzadaptierender herzschrittmacher.
US4960409A (en) 1986-09-11 1990-10-02 Catalano Marc L Method of using bilumen peripheral venous catheter with adapter
JPH0829776B2 (ja) 1986-10-29 1996-03-27 東燃化学株式会社 合成樹脂製容器及びその製造用金型
US4720517A (en) 1986-11-24 1988-01-19 Ciba-Geigy Corporation Compositions stabilized with N-hydroxyiminodiacetic and dipropionic acids and esters thereof
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPS63154788U (ko) 1987-03-31 1988-10-11
DE3728917A1 (de) 1987-08-29 1989-03-09 Roth Hermann J Neue lipide mit unsymmetrisch substituierter disulfidbruecke
US4946683A (en) 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
US5047540A (en) 1987-12-17 1991-09-10 Shionogi & Co., Ltd. Lipid derivatives
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
US4892540A (en) 1988-04-21 1990-01-09 Sorin Biomedica S.P.A. Two-leaflet prosthetic heart valve
US5176661A (en) 1988-09-06 1993-01-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Composite vascular catheter
US5024671A (en) 1988-09-19 1991-06-18 Baxter International Inc. Microporous vascular graft
US5200395A (en) 1988-10-18 1993-04-06 Ajinomoto Company, Inc. Pharmaceutical composition of BUF-5 for treating anemia
CA2001401A1 (en) 1988-10-25 1990-04-25 Claude Piantadosi Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
ATE165516T1 (de) 1989-03-21 1998-05-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5101824A (en) 1990-04-16 1992-04-07 Siemens-Pacesetter, Inc. Rate-responsive pacemaker with circuitry for processing multiple sensor inputs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1992001425A1 (en) 1990-07-26 1992-02-06 Rodney James Lane Self expanding vascular endoprosthesis for aneurysms
US5693338A (en) 1994-09-29 1997-12-02 Emisphere Technologies, Inc. Diketopiperazine-based delivery systems
JPH0765267B2 (ja) 1990-08-22 1995-07-12 花王株式会社 柔軟仕上剤
DE9117152U1 (de) 1990-10-09 1996-07-11 Cook Inc., Bloomington, Ind. Stent
DE59008908D1 (de) 1990-12-19 1995-05-18 Osypka Peter Herzschrittmacherleitung mit einem inneren Kanal und mit einem Elektrodenkopf.
US5116360A (en) 1990-12-27 1992-05-26 Corvita Corporation Mesh composite graft
JP2547524Y2 (ja) 1991-01-22 1997-09-10 東洋ラジエーター株式会社 オイルクーラ
US5405363A (en) 1991-03-15 1995-04-11 Angelon Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5330768A (en) 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US5545449A (en) 1991-10-02 1996-08-13 Weyerhaeuser Company Polyether-reinforced fiber-based materials
US6013638A (en) * 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US5151105A (en) 1991-10-07 1992-09-29 Kwan Gett Clifford Collapsible vessel sleeve implant
US5284491A (en) 1992-02-27 1994-02-08 Medtronic, Inc. Cardiac pacemaker with hysteresis behavior
US5352461A (en) 1992-03-11 1994-10-04 Pharmaceutical Discovery Corporation Self assembling diketopiperazine drug delivery system
SE9200951D0 (sv) 1992-03-27 1992-03-27 Kabi Pharmacia Ab Pharmaceutical composition containing a defined lipid system
EP0635019B1 (en) 1992-04-06 1999-05-26 Biosite Diagnostics Inc. Opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
WO1994003598A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 The Green Cross Corporation Antiallergic agent
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5461223A (en) 1992-10-09 1995-10-24 Eastman Kodak Company Bar code detecting circuitry
US5300022A (en) 1992-11-12 1994-04-05 Martin Klapper Urinary catheter and bladder irrigation system
US5496362A (en) 1992-11-24 1996-03-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable conformal coil patch electrode with multiple conductive elements for cardioversion and defibrillation
US5552155A (en) 1992-12-04 1996-09-03 The Liposome Company, Inc. Fusogenic lipsomes and methods for making and using same
US5716395A (en) 1992-12-11 1998-02-10 W.L. Gore & Associates, Inc. Prosthetic vascular graft
DE69424406T2 (de) 1993-02-19 2000-10-26 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Arzneistoffzusammensetzung, die ein nukleinsäurecopolymer enthält
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5697953A (en) 1993-03-13 1997-12-16 Angeion Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
JPH0753535Y2 (ja) 1993-03-16 1995-12-13 株式会社ハンズ リュックサック
US5624976A (en) 1994-03-25 1997-04-29 Dentsply Gmbh Dental filling composition and method
US5314430A (en) 1993-06-24 1994-05-24 Medtronic, Inc. Atrial defibrillator employing transvenous and subcutaneous electrodes and method of use
DE4325848A1 (de) 1993-07-31 1995-02-02 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin
EP0875280B1 (en) 1993-10-06 2001-08-22 The Kansai Electric Power Co., Inc. Method for removing carbon dioxide from combustion exhaust gas
US5609624A (en) 1993-10-08 1997-03-11 Impra, Inc. Reinforced vascular graft and method of making same
SE9303481L (sv) 1993-10-22 1995-04-23 Berol Nobel Ab Hygienkomposition
AU1091095A (en) 1993-11-08 1995-05-29 Harrison M. Lazarus Intraluminal vascular graft and method
NZ277614A (en) 1993-11-24 1998-05-27 Megabios Corp Piperazine-containing amphiphiles and their use in liposomes for delivering genetic material intracellularly
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5464924A (en) 1994-01-07 1995-11-07 The Dow Chemical Company Flexible poly(amino ethers) for barrier packaging
US5844107A (en) 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
EP0758883B1 (en) 1994-04-12 2003-03-19 The Liposome Company, Inc. Fusogenic liposomes and methods of making and using same
US5840576A (en) 1994-07-20 1998-11-24 Cytotherapeutics, Inc. Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
JP2001523215A (ja) 1995-04-17 2001-11-20 イマークス ファーマシューティカル コーポレーション ハイブリッド磁気共鳴造影剤
US5772694A (en) 1995-05-16 1998-06-30 Medical Carbon Research Institute L.L.C. Prosthetic heart valve with improved blood flow
US5783383A (en) 1995-05-23 1998-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of detecting cytomegalovirus (CMV)
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
CA2222328C (en) 1995-06-07 2012-01-10 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5609629A (en) 1995-06-07 1997-03-11 Med Institute, Inc. Coated implantable medical device
US5607385A (en) 1995-08-17 1997-03-04 Medtronic, Inc. Device and algorithm for a combined cardiomyostimulator and a cardiac pacer-carioverter-defibrillator
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
FR2740978B1 (fr) 1995-11-10 1998-01-02 Ela Medical Sa Dispositif medical actif du type defibrillateur/cardioverteur implantable
US5874105A (en) 1996-01-31 1999-02-23 Collaborative Laboratories, Inc. Lipid vesicles formed with alkylammonium fatty acid salts
DE69730218D1 (de) 1996-04-11 2004-09-16 Univ British Columbia Fusogene liposomen
US5935936A (en) 1996-06-03 1999-08-10 Genzyme Corporation Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5913848A (en) 1996-06-06 1999-06-22 Luther Medical Products, Inc. Hard tip over-the-needle catheter and method of manufacturing the same
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5736573A (en) 1996-07-31 1998-04-07 Galat; Alexander Lipid and water soluble derivatives of drugs
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
EP0941066B1 (en) 1996-08-26 2003-10-29 Transgene S.A. Cationic lipid-nucleic acid complexes
CA2271388C (en) 1996-09-13 2007-11-06 The School Of Pharmacy, University Of London Liposomes encapsulating polynucleotides operatively coding for immunogenic polypeptides
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
JP4175667B2 (ja) 1996-11-04 2008-11-05 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング トランスフェクションのためのカチオン試薬
US6887665B2 (en) 1996-11-14 2005-05-03 Affymetrix, Inc. Methods of array synthesis
US5985930A (en) 1996-11-21 1999-11-16 Pasinetti; Giulio M. Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide
US6204297B1 (en) 1996-11-26 2001-03-20 Rhodia Inc. Nonionic gemini surfactants
JPH10197978A (ja) 1997-01-09 1998-07-31 Mitsubishi Paper Mills Ltd ハロゲン化銀写真感光材料
EP0853123A1 (de) 1997-01-10 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
FR2760193B1 (fr) 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5945326A (en) 1997-03-20 1999-08-31 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease
EP1027033B1 (en) 1997-05-14 2009-07-22 The University Of British Columbia High efficiency encapsulation of nucleic acids in lipid vesicles
US20030104044A1 (en) 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
JPH115786A (ja) 1997-06-13 1999-01-12 Pola Chem Ind Inc 新規アミノヒドロキシプロピルピペラジン誘導体
US6067471A (en) 1998-08-07 2000-05-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Atrial and ventricular implantable cardioverter-defibrillator and lead system
JPH1180142A (ja) 1997-09-05 1999-03-26 Pola Chem Ind Inc ジフェニルアルキル化合物の製造法
US6165763A (en) 1997-10-30 2000-12-26 Smithkline Beecham Corporation Ornithine carbamoyltransferase
US6096075A (en) 1998-01-22 2000-08-01 Medical Carbon Research Institute, Llc Prosthetic heart valve
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6271209B1 (en) 1998-04-03 2001-08-07 Valentis, Inc. Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors
US6176877B1 (en) 1998-04-20 2001-01-23 St. Jude Medical, Inc. Two piece prosthetic heart valve
DE19822602A1 (de) 1998-05-20 1999-11-25 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Polyaminosäureestern durch Veresterung von sauren Polyaminosäuren oder Umesterung von Polyaminosäureestern
NO313244B1 (no) 1998-07-08 2002-09-02 Crew Dev Corp Fremgangsmåte for isolering og produksjon av magnesitt eller magnesiumklorid
US6055454A (en) 1998-07-27 2000-04-25 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac pacemaker with automatic response optimization of a physiologic sensor based on a second sensor
US6312926B1 (en) 1998-08-14 2001-11-06 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey mRNA capping enzymes and uses thereof
AU771367B2 (en) 1998-08-20 2004-03-18 Cook Medical Technologies Llc Coated implantable medical device
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6468793B1 (en) * 1998-10-23 2002-10-22 Florida State University Research Foundation CFTR genes and proteins for cystic fibrosis gene therapy
WO2000030444A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
US6248725B1 (en) 1999-02-23 2001-06-19 Amgen, Inc. Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
CA2370690A1 (en) 1999-04-20 2000-10-26 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US6169923B1 (en) 1999-04-23 2001-01-02 Pacesetter, Inc. Implantable cardioverter-defibrillator with automatic arrhythmia detection criteria adjustment
CA2369595C (en) 1999-04-23 2010-10-05 Alza Corporation Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
ATE232173T1 (de) * 1999-05-17 2003-02-15 Edscha Ag Fronthaubenanordnung
JP2003530070A (ja) 1999-05-19 2003-10-14 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としてのインターフェロン−αタンパク質の発現および搬出
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
WO2001005375A1 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Purdue Research Foundation Vinyl ether lipids with cleavable hydrophilic headgroups
CN1378592A (zh) 1999-07-23 2002-11-06 杰南技术公司 在无rna酶和有机溶剂的条件下应用切向流过滤来纯化质粒dna的方法
US6358278B1 (en) 1999-09-24 2002-03-19 St. Jude Medical, Inc. Heart valve prosthesis with rotatable cuff
US6371983B1 (en) 1999-10-04 2002-04-16 Ernest Lane Bioprosthetic heart valve
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
EP1242609A2 (en) 1999-12-30 2002-09-25 Novartis AG Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
EP1261379A2 (en) 2000-02-17 2002-12-04 Genzyme Corporation Genetic modification of the lung as a portal for gene delivery
US6370434B1 (en) 2000-02-28 2002-04-09 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac lead and method for lead implantation
US6565960B2 (en) 2000-06-01 2003-05-20 Shriners Hospital Of Children Polymer composite compositions
WO2002000870A2 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Christian Plank Method for transfecting cells using a magnetic field
IL138474A0 (en) 2000-09-14 2001-10-31 Epox Ltd Highly branched water-soluble polyamine oligomers, process for their preparation and applications thereof
USRE43612E1 (en) 2000-10-10 2012-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
CA2426244A1 (en) 2000-10-25 2002-05-02 The University Of British Columbia Lipid formulations for target delivery
GB0028361D0 (en) 2000-11-21 2001-01-03 Glaxo Group Ltd Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components
US20020094528A1 (en) 2000-11-29 2002-07-18 Salafsky Joshua S. Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interations
JP2002167368A (ja) 2000-12-01 2002-06-11 Nitto Denko Corp アルキル置換デンドリマーおよびその製造法
US20050004058A1 (en) 2000-12-07 2005-01-06 Patrick Benoit Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US20020192721A1 (en) 2001-03-28 2002-12-19 Engeneos, Inc. Modular molecular clasps and uses thereof
US7084303B2 (en) 2001-04-23 2006-08-01 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Tertiary amine compounds having an ester structure and processes for preparing same
US6585410B1 (en) 2001-05-03 2003-07-01 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Radiant temperature nulling radiometer
EP2305699B1 (de) 2001-06-05 2014-08-13 CureVac GmbH Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt und optimierter Codon Usage für die Impfung gegen Schlafkrankheit, Leishmaniose und Toxoplasmose
EP2428571B1 (en) 2001-09-28 2018-07-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. MicroRNA molecules
AU2002340490A1 (en) 2001-11-09 2003-05-19 Bayer Healthcare Ag Isotopically coded affinity markers 3
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
DE10214983A1 (de) 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
US20030215395A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US7601367B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
CA2488012A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Children's Hospital Medical Center Cftr modifier genes and expressed polypeptides useful in treating cystic fibrosis
DK1519714T3 (da) 2002-06-28 2011-01-31 Protiva Biotherapeutics Inc Fremgangsmåde og apparat til fremstilling af liposomer
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US20040028804A1 (en) 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
CA2495535A1 (en) 2002-08-22 2004-03-04 Celltran Limited Cell culture surface
CA2504910A1 (en) 2002-11-04 2004-05-21 Ge Bayer Silicones Gmbh & Co. Kg Linear polyamino and/or polyammonium polysiloxane copolymers i
AU2003281978A1 (en) 2002-11-22 2004-06-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh 2,5-diketopiperazines for the treatment of obesity
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
EP1586983B1 (en) 2003-01-20 2013-06-05 Asahi Kasei EMD Corporation Pointing device
NZ542665A (en) 2003-03-05 2008-05-30 Senesco Technologies Inc Use of antisense oligonucleotides or siRNA to suppress expression of eIF-5A1
US20040224912A1 (en) 2003-05-07 2004-11-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression
US7619017B2 (en) 2003-05-19 2009-11-17 Wacker Chemical Corporation Polymer emulsions resistant to biodeterioration
US7507859B2 (en) 2003-06-16 2009-03-24 Fifth Base Llc Functional synthetic molecules and macromolecules for gene delivery
US7803397B2 (en) 2003-09-15 2010-09-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
EP1675943A4 (en) 2003-09-15 2007-12-05 Massachusetts Inst Technology NANOLITRE SYNTHESIS OF BIOMATERIALS IN NETWORKS AND SCREENING THEREOF
US20050069590A1 (en) 2003-09-30 2005-03-31 Buehler Gail K. Stable suspensions for medicinal dosages
MXPA06003978A (es) 2003-10-10 2006-06-27 Powderject Vaccines Inc Constructos de acidos nucleicos.
WO2005037226A2 (en) 2003-10-17 2005-04-28 Georgia Tech Research Corporation Genetically engineered enteroendocrine cells for treating glucose-related metabolic disorders
AU2004287652A1 (en) 2003-11-10 2005-05-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Diimonium salt compound and use thereof
US7022214B2 (en) 2004-01-21 2006-04-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Carrier ampholytes of high pH range
US7556684B2 (en) 2004-02-26 2009-07-07 Construction Research & Technology Gmbh Amine containing strength improvement admixture
US20060228404A1 (en) 2004-03-04 2006-10-12 Anderson Daniel G Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues
WO2005118874A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Wyeth Enhancing protein expression
ATE537263T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Kationische lipide und verwendungsverfahren
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB0418172D0 (en) 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102004043342A1 (de) 2004-09-08 2006-03-09 Bayer Materialscience Ag Blockierte Polyurethan-Prepolymere als Klebstoffe
AU2005300638A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
GB0502482D0 (en) 2005-02-07 2005-03-16 Glaxo Group Ltd Novel compounds
JP5042863B2 (ja) 2005-02-14 2012-10-03 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 生物学的に活性な分子をデリバリーするための脂質ナノ粒子系組成物および方法
US7977452B2 (en) 2005-03-28 2011-07-12 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Janus dendrimers and dendrons
US9006487B2 (en) 2005-06-15 2015-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US7238791B1 (en) 2005-12-16 2007-07-03 Roche Diagnostics Operations, Inc. 6-monoacetylmorphine derivatives useful in immunoassay
WO2007073489A2 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Trustees Of Boston University Molecules for gene delivery and gene therapy, and methods of use thereof
CN100569877C (zh) 2005-12-30 2009-12-16 财团法人工业技术研究院 含多uv交联反应基的分枝状结构化合物及其应用
AU2007238624B2 (en) 2006-04-14 2012-05-31 Cellscript, Llc Kits and methods for generating 5' capped RNA
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
MX2008014437A (es) * 2006-05-19 2008-11-27 Scripps Research Inst Tratamiento de desplegamiento de proteinas.
US20070275923A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Nastech Pharmaceutical Company Inc. CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY
EP2032652A4 (en) 2006-06-05 2011-08-17 Massachusetts Inst Technology NETWORKED DEVELOPABLE POLYMERS AND ITS USE
US20090186805A1 (en) 2006-07-06 2009-07-23 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
ES2293834B1 (es) 2006-07-20 2009-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas.
WO2008011561A2 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Massachusetts Institute Of Technology End-modified poly(beta-amino esters) and uses thereof
KR101129509B1 (ko) 2006-10-03 2012-04-13 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 함유 조성물
JP2010506838A (ja) * 2006-10-12 2010-03-04 コペルニクス セラピューティクス インコーポレイテッド コドン最適化ｃｆｔｒ
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
WO2008140615A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Novozymes, Inc. Modified messenger rna stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
WO2008113364A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Recepticon Aps Amino derivatives to prevent nephrotoxicity and cancer
WO2008121199A2 (en) * 2007-03-28 2008-10-09 University Of Iowa Research Foundation Transgenic animal models of disease
JP5186126B2 (ja) 2007-03-29 2013-04-17 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 新規トリアジン誘導体ならびにその製法およびそのガス分離膜としての用途
PT2144609E (pt) 2007-04-18 2015-02-06 Cornerstone Pharmaceuticals Inc Formulações farmacêuticas contendo derivados de ácido lipóico
WO2008137470A1 (en) 2007-05-01 2008-11-13 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
US20090163705A1 (en) 2007-05-21 2009-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
WO2009036280A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Copernicus Therapeutics, Inc. Long-term in vivo transgene expression
NZ584048A (en) 2007-10-02 2012-08-31 Marina Biotech Inc Lipopeptides for delivery of nucleic acids
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
EP2500427B1 (en) 2007-11-22 2014-07-30 Japan Science and Technology Agency Translation regulation system in cell or artifical cell model by using low-molecular-weight RNA
CA3043911A1 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
ES2535419T3 (es) 2007-12-27 2015-05-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente
CA2710983A1 (en) 2007-12-27 2009-10-01 The Ohio State University Research Foundation Lipid nanoparticle compositions and methods of making and using the same
AU2008347250A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Screening method for selected amino lipid-containing compositions
JP5788312B2 (ja) 2008-04-11 2015-09-30 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達
HUE034483T2 (en) 2008-04-15 2018-02-28 Protiva Biotherapeutics Inc New lipid preparations for introducing a nucleic acid
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
US20090263407A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic Lipids and Uses Thereof
CA2726052A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Modulation of gene expression through endogenous small rna targeting of gene promoters
JP5024216B2 (ja) 2008-07-23 2012-09-12 トヨタ自動車株式会社 内燃機関の点火時期制御装置及び点火時期制御方法
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
DK2331954T3 (da) 2008-08-27 2020-04-06 Life Technologies Corp Apparat og fremgangsmåde til processering af biologiske prøver
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
US20100112042A1 (en) 2008-10-16 2010-05-06 Mdrna, Inc. Processes and Compositions for Liposomal and Efficient Delivery of Gene Silencing Therapeutics
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20120009222A1 (en) 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
CA2742954C (en) 2008-11-07 2018-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
SG10201901089TA (en) 2008-11-10 2019-03-28 Arbutus Biopharma Corp Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
TW201019969A (en) 2008-11-17 2010-06-01 Enzon Pharmaceuticals Inc Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system
US9023820B2 (en) 2009-01-26 2015-05-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
US20100222489A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Jiang Dayue D Copolymer composition, membrane article, and methods thereof
AU2010223967B2 (en) 2009-03-12 2015-07-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes
CN102334237B (zh) 2009-04-02 2015-05-13 西蒙公司 电信接线板
CN102497887A (zh) 2009-04-17 2012-06-13 Isis创新公司 递送遗传物质的组合物
WO2010124004A2 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Emory University Nanocarrier therapy for treating invasive tumors
SG10201402054UA (en) 2009-05-05 2014-09-26 Muthiah Manoharan Lipid compositions
HUE056773T2 (hu) 2009-06-10 2022-03-28 Arbutus Biopharma Corp Továbbfejlesztett lipid készítmény
US8273869B2 (en) 2009-06-15 2012-09-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8236943B2 (en) 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
ES2727711T3 (es) 2009-07-30 2019-10-18 Spiral Therapeutics Inc Compuestos inhibidores de Apaf-1
DE102009043342A1 (de) 2009-09-29 2011-03-31 Bayer Technology Services Gmbh Stoffe für selbstorganisierte Träger zur kontrollierten Freisetzung eines Wirkstoffs
PL3338765T3 (pl) 2009-12-01 2019-06-28 Translate Bio, Inc. Pochodna steroidowa dla dostarczania mrna w ludzkich chorobach genetycznych
SI3112467T1 (en) 2009-12-07 2018-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
BR112012015755B1 (pt) 2009-12-23 2021-06-22 Novartis Ag Lipídeo furtivo, e composição
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
IL300109A (en) 2010-06-03 2023-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the transfer of active substances
CN101863544B (zh) 2010-06-29 2011-09-28 湖南科技大学 一种氰尿酸基重金属螯合絮凝剂及其制备方法
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
PL2691443T3 (pl) 2011-03-28 2021-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Sprzężone lipomery i ich zastosowania
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
WO2012133737A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 架橋性アミン化合物、該化合物を用いた高分子膜及びその製造方法
WO2012151503A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 The Broad Institute, Inc. Multiplexed genetic reporter assays and compositions
AU2012255913A1 (en) 2011-05-17 2013-11-21 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
EP2532649B1 (en) 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
CN111671918A (zh) 2011-06-08 2020-09-18 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
EP3336082B1 (en) 2011-06-08 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
WO2013003475A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2764007A4 (en) 2011-10-05 2015-05-06 Protiva Biotherapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DISABLING ALDEHYDE DEHYDROGENASE
CA3119789A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid derivatives functionalized on the n-terminal capable of forming drug encapsulating microspheres
US20140378538A1 (en) 2011-12-14 2014-12-25 Moderma Therapeutics, Inc. Methods of responding to a biothreat
WO2013090186A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
AU2012358384A1 (en) 2011-12-21 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
US20140371302A1 (en) 2011-12-29 2014-12-18 Modema Therapeutics, Inc. Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
CA2862377A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
JP6275655B2 (ja) 2012-02-24 2018-02-07 プロティバ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド トリアルキルカチオン性脂質およびその使用方法
AU2013237873B2 (en) 2012-03-29 2017-12-14 Translate Bio, Inc. Ionizable cationic lipids
CA2868030C (en) 2012-03-29 2021-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
AU2013243949A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
AU2013271392B2 (en) 2012-06-08 2018-02-15 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of mRNA to non-lung target cells
US20150126589A1 (en) * 2012-06-08 2015-05-07 Ethris Gmbh Pulmonary Delivery of Messenger RNA
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
US20150307542A1 (en) 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
WO2014089486A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
WO2014113089A2 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
EP2968397A4 (en) 2013-03-12 2016-12-28 Moderna Therapeutics Inc DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP2971098B1 (en) 2013-03-14 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
ES2708561T3 (es) 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
EA201591293A1 (ru) 2013-03-14 2016-02-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки антител, кодируемых мрнк
ES2797974T3 (es) 2013-03-14 2020-12-04 Translate Bio Inc Acidos ribonucleicos con nucleótidos modificados con 4-tio y procedimientos relacionados
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
JP2016514970A (ja) 2013-03-14 2016-05-26 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのキャップ効率の定量的評価
EP4279610A3 (en) 2013-03-15 2024-01-03 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144711A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3757570B1 (en) 2013-03-15 2023-10-11 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
WO2014210356A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
JP7019233B2 (ja) 2013-07-11 2022-02-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法
CN110974981A (zh) 2013-07-23 2020-04-10 野草莓树生物制药公司 用于递送信使rna的组合物和方法
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20160264614A1 (en) 2013-10-02 2016-09-15 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
US20160243221A1 (en) 2013-10-18 2016-08-25 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのｍＲＮＡ療法
CN105658800A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 Mrna的cns递送及其用途
US20170173128A1 (en) 2013-12-06 2017-06-22 Moderna TX, Inc. Targeted adaptive vaccines
US20150167017A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
CN111304231A (zh) 2013-12-30 2020-06-19 库瑞瓦格股份公司 人工核酸分子
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
US10307472B2 (en) 2014-03-12 2019-06-04 Curevac Ag Combination of vaccination and OX40 agonists
SG10201912038TA (en) 2014-04-23 2020-02-27 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
EP3201338B1 (en) 2014-10-02 2021-11-03 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
WO2016071857A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus expression
US20170362627A1 (en) 2014-11-10 2017-12-21 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
WO2016077125A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
EP3247363A4 (en) 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3247398A4 (en) 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
US20180245077A1 (en) 2015-03-20 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
WO2016183366A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
EP3307305A4 (en) 2015-06-10 2019-05-22 Modernatx, Inc. TARGETED ADAPTIVE VACCINES
EP3329003A2 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
AU2016324463B2 (en) 2015-09-17 2022-10-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
US20190054112A1 (en) 2015-09-18 2019-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
MX2020011167A (es) 2018-04-25 2021-02-09 Ethris Gmbh Formulaciones a base de lipidos para el suministro de arn.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999014346A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
WO2007024708A2 (en) 2005-08-23 2007-03-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
WO2011012316A2 (de) 2009-07-31 2011-02-03 Ludwig-Maximilians-Universität Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression

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Publication number Publication date
JP6316930B2 (ja) 2018-04-25
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