JP2003530070A

JP2003530070A - Ｆｃ融合タンパク質としてのインターフェロン−αタンパク質の発現および搬出

Info

Publication number: JP2003530070A
Application number: JP2000618329A
Authority: JP
Inventors: キン−ミンロウ，; ヤーピンスン，; ステファンディー．ガイルズ，
Original assignee: レキシジェンファーマシューティカルズコーポレイション
Priority date: 1999-05-19
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2003-10-14
Also published as: PL352332A1; NO20015587L; DE60035871T2; CA2372400A1; PT1187852E; CZ20014123A3; BR0010725A; EP1187852B1; ES2291205T3; EP1187852A1; HUP0201474A3; CA2372400C; HUP0201474A2; AU777963B2; DE60035871D1; MXPA01011845A; ZA200109227B; DK1187852T3; HK1046694A1; AU5031800A

Abstract

(57)【要約】免疫グロブリンＦｃ−インターフェロン−α融合タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）が開示される。この核酸配列は、適切な発現ベクターに挿入され得、哺乳動物細胞において発現され得る。このような核酸配列の発現によって産生され得る免疫グロブリンＦｃ−インターフェロン−α融合タンパク質のファミリーもまた開示される。例えば、肝炎のような状態を処置するための、このような核酸配列および／または融合タンパク質を使用する方法もまた開示され、この状態は、インターフェロン−αの投与によって軽減される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本出願は、１９９９年５月１９日に出願された、米国仮特許出願番号６０／１
３４，８９５号（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に対して優
先権を主張する。

【０００２】（発明の分野）本明細書中に開示される発明は、インターフェロン−αのタンパク質のクラス
のメンバーの産生を高める融合タンパク質発現系に関する。より詳細には、本発
明は、免疫グロブリンＦｃ−インターフェロン−αのようなＦｃ融合タンパク質
の哺乳動物細胞における抗レベル発現および分泌、ならびにこのＦｃ融合タンパ
ク質の種々の構造的形態および使用に関する。

【０００３】（発明の背景）タンパク質のインターフェロン−α（ＩＮＦ−α）ファミリーは、種々の疾患
の処置において有用であることが示されている。例えば、インターフェロン−α
２ａおよび２ｂ（それぞれ商品名ＲｏｆｅｒｏｎおよびＩｎｔｒｏｎＡ）は、
Ｂ型、Ｃ型およびＤ型の慢性肝炎（生命を脅かす肝臓のウイルス性疾患）、尖圭
コンジローム（性器いぼ）、ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫、ヘアリーセル白血病、
悪性黒色腫、基底細胞癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、Ｉ型およびＩＩ型ヘルペス
、水痘／帯状疱疹、および菌状息肉腫の処置において使用されている。インター
フェロン−α前立腺癌および慢性骨髄性白血病を含む処置レジメンの効力もまた
、研究されている。

【０００４】ヒトインターフェロン−αファミリーは、インターフェロンのうち最も大きく
、最も複雑なファミリーである。このインターフェロン−αファミリーのメンバ
ーは、他のインターフェロンとは異なるグループとしてそれらを規定する類似し
たアミノ酸配列を有する；すなわち、これらのタンパク質は、典型的に、典型的
なタンパク質の整列において少なくとも３５％のアミノ酸同一性を有する。Ｓｗ
ｉｓｓＰｒｏｔデータベースは、多くのヒトインターフェロン−αタンパク質を
含み、これは、代替的に名づけられたインターフェロン−δタンパク質およびイ
ンターフェロン−ωタンパク質を含む。これらのタンパク質は、典型的には、約
２３個のアミノ酸のリーダー配列を用いて合成され、そして成熟タンパク質は、
典型的に、約１９ｋＤの分子量を有する。これらのタンパク質が非常に類似して
いるので、インターフェロン−αがヒトまたは他の哺乳動物供給源から得られ、
広範囲に精製されると、種々の生物学的活性を有する同一種（ｉｓｏｓｐｅｃｉ
ｅｓ）の混合物がしばしば得られる［Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓら、米国特許第４，
７３２，６８３号］。同様に、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡは、十
分に類似したサイズおよび性質を有するので、単一のセットの手順を使用してプ
ラスミド構築物の目的のためにこれらのｃＤＮＡを操作し得る。従って、哺乳動
物供給源からインターフェロン−αの単一種を効率的に産生しそして精製するた
めの方法を有することは有用である。

【０００５】約１９ｋＤというその比較的小さいサイズ（Ｌａｗｎら（１９８１）ＰＲＯＣ
．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：５４３５）が原因で、イン
ターフェロン−αは、腎臓によって濾過され得る。しかし、濾過される場合、イ
ンターフェロン−αは、典型的に、腎臓尿細管細胞によって吸着され、そして代
謝され、そして従って、通常排出されない。現在の臨床的実施に従って、処方さ
れたインターフェロン−αは、筋肉内注射によって投与され、その後、その血清
中のレベルは、インターフェロン−α２ａについて約５時間の半減期、そしてイ
ンターフェロン−α２ｂについて２〜３時間の半減期で減少する（ＰＨＹＳＩＣ
ＩＡＮＳＤＥＳＫＲＥＦＥＲＥＮＣＥ、第５０版、１９９６：２１４５−２
１４７および２３６４−２３７３）。

【０００６】さらに、それらの比較的小さなサイズが原因で、インターフェロン−αの複数
回の頻繁な注射が必要であり（通常、毎日または週に３回）、患者のインターフ
ェロン−αのレベルにおいて有意な変化が存在し得る。さらに、注射された用量
が大きく、ヘアリーセル白血病について用量当たり約５０マイクログラムからＡ
ＩＤＳ関連カポージ肉腫についての用量当たり３００マイクログラムの範囲にわ
たる。高レベルの循環インターフェロン−αは、皮膚毒性、神経学的毒性、免疫
毒性および内分泌毒性を含む、有意な副作用を生じ得る。インターフェロン−α
の小さなサイズによって、このインターフェロン−αは、血液脳関門を通過し、
そして中枢神経系に入り得、いくつかの神経学的な副作用の原因となることが考
えられる。従って、同時に副作用を最小化しながら、インターフェロン−αを用
いて処置される患者における効力および有効な血清半減期を増加することが有用
である。

【０００７】インターフェロン−αの高い投薬量、低い効力、短い血清半減期、精製の困難
さ、および副作用を考えると、産生を高め、そしてこの治療剤の薬学的性質を改
良する方法が当該分野で必要とされている。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、インターフェロン−αを含む融合タンパク質を作製し、そして使用
するのに有用な方法および組成物を特徴とする。特に、本発明は、免疫グロブリ
ンＦｃ−インターフェロン−α融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）配列、およびこのような融合タンパク質を産生するために核酸
を発現するための方法を特徴とする。融合タンパク質は、生物学的に活性なイン
ターフェロン−αの高レベル発現を容易にし得る。融合タンパク質は、哺乳動物
（例えば、ヒト）に投与する前に薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ
得る。特定の条件下において、インターフェロン−αは、処方および／または投
与の前に融合タンパク質から切断され得る。あるいは、融合タンパク質を含むイ
ンターフェロン−αをコードする核酸配列は、薬学的に受容可能なキャリアと組
み合わせられ得、そして哺乳動物に投与され得る。

【０００９】インターフェロン−αの産生および分泌を容易にする新規な核酸配列（例えば
ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供することが本発明の目的である。特に、本発明は、
（ｉ）インターフェロン−αの効率的な産生および分泌を容易にする核酸配列；
（ｉｉ）種々の哺乳動物宿主細胞においてインターフェロン−αの迅速かつ効率
的な産生および分泌のための核酸構築物；ならびに（ｉｉｉ）非ネイティブな、
生合成の、またはその他の人工インターフェロン−αタンパク質（例えば、合理
的な設計によって作製されたタンパク質）を含む、組換えインターフェロン−α
またはその遺伝的に操作された改変体の産生、分泌および回収のための方法を提
供する。

【００１０】本発明の他の目的は、インターフェロン−αをコードするポリヌクレオチドに
融合される場合、通常の試薬および技術を使用して精製され得る融合ポリペプチ
ドを含むインターフェロン−αをコードするポリヌクレオチド配列を提供するこ
とである。なお別の目的は、分泌カセットとコードされるインターフェロン−α
タンパク質との間にタンパク質分解性切断部位を差し挟むことであり、その結果
、分泌カセットは、インターフェロン−αが独立して精製され得るように、イン
ターフェロン−αドメインから切断され得る。

【００１１】従って、１つの局面において、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域−インター
フェロン−α融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子）を提供する。この核酸分子は、５’→３’の方向で連続的に、単一の配
列で、免疫グロブリンＦｃ領域および少なくとも１つの標的タンパク質をコード
し、ここで、この標的タンパク質は、インターフェロン−αを含む。

【００１２】好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒン
ジ領域を含み、そして好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリン定常重鎖領
域ドメイン（例えば、免疫グロブリン重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、免疫グロブリ
ン定常重鎖３（ＣＨ３）ドメイン、およびＦｃ領域を生成するために使用される
免疫グロブリンのタイプに依存して、必要に応じて、免疫グロブリン重鎖４（Ｃ
Ｈ４）ドメイン）を含む。より好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ
領域は、少なくとも免疫グロブリン定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインを欠いている
。免疫グロブリンＦｃ領域が、任意の免疫グロブリンのクラス（例えば、ＩｇＡ
、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に基づき得るが、ＩｇＧに基づく免
疫グロブリンＦｃ領域が好ましい。

【００１３】本発明の核酸は、複製可能な発現ベクターへの操作的な結合で組み込まれ得、
次いで、このベクターは、コンピテントな哺乳動物宿主細胞に導入され、インタ
ーフェロン−αに基づく融合タンパク質を産生し得る。得られたインターフェロ
ン−αに基づく融合タンパク質は、哺乳動物宿主細胞から効率的に産生かつ分泌
される。分泌されたインターフェロン−αに基づく融合タンパク質は、哺乳動物
細胞を溶解することなく、培養培地から収集され得る。このタンパク質産物は、
すべて従来的な技術を使用して、活性についてアッセイされ得、そして／または
所望されるような共通の試薬を用いて精製され得、そして／または融合パートナ
ーから切断され得る。

【００１４】別の局面において、本発明は、インターフェロン−αを含む融合タンパク質を
提供する。本発明の融合タンパク質は、ネイティブなインターフェロン−αより
、改善された生物学的特性（例えば、可溶性の増大、血清半減期の延長、および
そのレセプターへの結合の増加）を実証する。これらの特性は、インターフェロ
ン−αの臨床的な効力を有意に改善し得る。好ましい実施形態において、この融
合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、免疫グロブリンＦｃ領域およびイ
ンターフェロン−αを、必要に応じて、免疫グロブリンＦｃ領域およびインター
フェロン−αの間に他の部分（例えば、タンパク質分解部位）を介在させて含む
。得られる融合タンパク質は、好ましくは、通常のグリコシル化部位（すなわち
、鋳型抗体において通常存在する）でＦｃ領域をグリコシル化する細胞において
合成される。

【００１５】別の実施形態において、その融合タンパク質は、第２の標的タンパク質（例え
ば、成熟の、全長インターフェロン−αまたはその生物活性フラグメント）を含
み得る。この型の構築物において、第１および第２の標的タンパク質は、同じタ
ンパク質かまたは異なるタンパク質であり得る。第１および第２の標的タンパク
質は、直接的にまたはポリペプチドリンカーによってのいずれかで、互いに連結
され得る。あるいは、両方の標的タンパク質は、直接的にまたはポリペプチドリ
ンカーを介してのいずれかで、免疫グロブリンＦｃ領域に連結され得る。後者の
場合、第１の標的タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結され得
、そして第２の標的タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ末端に連結さ
れ得る。

【００１６】別の実施形態において、２つの融合タンパク質が、共有結合的（例えば、ジス
ルフィド結合、ポリペプチド結合、または架橋剤によって）または非共有結合的
のいずれかで結合して、ダイマータンパク質を産生し得る。好ましい実施形態に
おいて、２つの融合タンパク質は、好ましくは、各鎖の免疫グロブリンＦｃ領域
中に配置された免疫グロブリンのヒンジ領域中に配置された、少なくとも１つ以
上、好ましくは２つの鎖間のシステイン残基を介するジスルフィド結合によって
共有結合的に結合される。

【００１７】本発明の他の目的は、インターフェロン−α融合タンパク質の多価および多量
体形態ならびにその組み合わせを提供することである。

【００１８】別の局面において、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域および標的タンパク質
を含む融合タンパク質を産生する方法を提供する。本方法は、（ａ）そのような
融合タンパク質（シグナル配列を有するかまたは有さないかのいずれか）をコー
ドするＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する工程、および（ｂ）その融合タ
ンパク質を産生するために哺乳動物細胞を培養する工程、を包含する。次いで、
得られる融合タンパク質は、収集され得、必要な場合、再フォールディングされ
得、そして当該分野において周知でありかつ使用される従来の精製技術を使用し
て精製され得る。その融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ領域と標的タンパ
ク質との間に配置されたタンパク質分解的切断部位を含むと仮定する場合、その
標的は、従来のタンパク質分解酵素を使用して融合タンパク質から切断され得、
そして必要な場合、使用に先立って精製される。

【００１９】なおさらなる局面において、本発明は、本発明の方法および／または本発明の
融合構築物によって産生されるインターフェロン−αの有効量を哺乳動物に投与
することによる、インターフェロン−αまたはその活性な改変体によって緩和さ
れる、状態を処置するための方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸（例
えば、「裸のＤＮＡ」または本発明のＤＮＡもしくはＲＮＡを含むベクター）を
、その状態を有する哺乳動物に投与することによって、インターフェロン−αま
たはその活性な改変体によって緩和される、状態を処置するための方法を提供す
る。

【００２０】好ましい実施形態において、本発明の構築物は、肝臓障害の処置において使用
され得、ここで、インターフェロン−αは、免疫グロブリンＦｃ領域によって、
肝臓内に局在化される。本発明の構築物は、肝障害の処置において特に有用であ
り得る。肝障害には、ウイルス疾患（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、もしくはＤ
型肝炎）、肝癌ならびに肝臓に位置する転移を含む他の癌の型が含まれるがこれ
らに限定されない。

【００２１】本発明の前述のおよび他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明、図
面、および上記の特許請求の範囲から明らかである。

【００２２】（発明の詳細な説明）多くの状態が、インターフェロン−αの投与によって軽減され得る。例えば、
以前に議論したように、インターフェロン−α２ａおよび２ｂ（それぞれ、商品
名ＲｏｆｅｒｏｎおよびＩｎｔｒｏｎＡ）は、慢性のＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、お
よびＤ型肝炎、尖圭コンジローム（性器いぼ）、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、ヘア
リーセル白血病、悪性黒色腫、基底細胞癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞癌、Ｉ型お
よびＩＩ型ヘルペス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ならびに菌状息肉腫の処置にお
いて有用である。さらに、研究が、前立腺癌および慢性骨髄性白血病の処置にお
けるインターフェロン−αの効力を評価するために実行されている。

【００２３】肝炎の処置のために、例えば、肝臓に濃縮されているインターフェロン−αの
形態を有することが特に有用であり得る。このようにして、他の組織中のインタ
ーフェロン−αの濃度が最小化され得、それによって副作用を減少する。肝臓組
織は、可溶性免疫複合体の除去のための主要な部位であり、そしてＦｃレセプタ
ーは、肝臓マクロファージ（クップファー細胞）上で豊富である（Ｂｅｎａｃｅ
ｒｒａｆ，Ｂ．ら（１９５９）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．８２：１３１；Ｐａｕｌ，
Ｗ．Ｅ．（１９９３）ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３
版、第５章、１１３−１１６）。従って、インターフェロン−αを免疫グロブリ
ンＦｃ領域に融合させることによって、インターフェロン−α分子は、免疫グロ
ブリンＦｃ領域を欠く同じインターフェロン−α分子と比較して、肝臓組織に好
ましく標的化され得る。Ｆｃレセプターについての最も高い親和性を有するＩｇ
Ｇ型の抗体は、ＩｇＧ１である。しかし、対照的に、ＩｇＧ４は、例えば、Ｆｃ
γレセプターＩに対しておよそ１０分の１の低い親和性を有する（Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎおよびＡｂｒａｈａｍ（１９８０）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１２５：２７３５
；Ｗｏｏｆら（１９８６）ＭＯＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．２３：３１９）。ＩｇＧ１
由来のＦｃγ１は、リガンドのＣ末端に配置された場合に、そのリガンドについ
てのレセプターを発現する細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣ
Ｃ）を媒介し得る。さらに、Ｆｃγ１は、リガンドのＣ末端に存在する場合に、
そのリガンドについてのレセプターを発現する細胞に対するＣ１ｑ結合および補
体結合を媒介し得る。

【００２４】ＩｇＧ１とは対照的に、ＩｇＧ４は、補体結合を有効には行わない。このこと
は、Ｎ末端インターフェロン−αが、ＩｇＧ４由来のＣ末端Ｆｃ領域に融合され
得るという提案をもたらした（Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｗ．ら、米国特許第５，７２３
，１２５号）。しかし、ＩｇＧ４のＦｃ領域がＦａｂ領域から分離される場合に
、ＩｇＧ４のＦｃは、補体ならびにＩｇＧ１のＦｃ領域を結合する（Ｉｓｅｎｍ
ａｎ，Ｄ．Ｅ．ら（１９７５）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１１４：１７２６）。この
結果ならびにＩｇＧ１のＦｃ配列およびＩｇＧ４のＦｃ配列が全く同一であると
いう事実に基づくと、理論に束縛されることは望まないが、ＩｇＧ４のＦａｂ領
域が、Ｃ１ｑ結合および補体結合を立体的にブロックすることが考えられる。な
ぜなら、ＩｇＧ４Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を接続するヒンジ領域は、ＩｇＧ
１のヒンジよりも短いからである。大きな、立体的にかさ高いＩｇＧ４のＦａｂ
領域が低分子（例えば、インターフェロン−α）で置換された場合、ならびに、
インターフェロン−αおよびＦｃ領域が可撓性リンカーによって接続される場合
、このようなインターフェロン−α−Ｆｃ−γ４融合物は、インターフェロン−
αレセプターを有する細胞に結合されるときに補体結合することが考えられる。

【００２５】Ｎ末端サイトカインおよびＣ末端Ｆｃ領域の融合に起因する細胞毒性効果は周
知である。例えば、Ｆｃ領域に対するサイトカインインターロイキン−２（ＩＬ
−２）の融合物は、補体結合を行い得、そしてＩＬ−２レセプターを有する細胞
の溶解を引き起こし得る分子を作製する（Ｌａｎｄｏｌｆｉ，Ｎ．Ｆ．米国特許
第５，３４９，０５３号）。

【００２６】Ｆｃ領域がリガンドのＮ末端に配置されている融合物（「イムノフューシン（
ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）」または「Ｆｃ−Ｘ」融合物と名付けられ、ここでＸ
は、インターフェロン−αのようなリガンドである）は、多数の独特の、有利な
生物学的特性を有する（Ｌｏら、米国特許第５，７２６，０４４号および同第５
，５４１，０８７号；Ｌｏら（１９９８）ＰＲＯＴＥＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩ
ＮＧ１１：４９５）。特に、このような融合タンパク質は、細胞表面上の関連
するＦｃレセプターになお結合し得る。しかし、そのリガンドが細胞表面上のそ
のレセプターに結合する場合、Ｆｃ領域の配向が変化し、そしてＡＤＣＣおよび
補体結合を媒介する配列が閉ざされるようである。結果として、Ｆｃ−Ｘ分子中
のＦｃ領域は、ＡＤＣＣまたは補体結合を有効には媒介しない。従って、Ｆｃ−
Ｘ融合物は、増大した血清半減期ならびに、ＡＤＣＣおよび補体結合からの有害
な効果がほとんど有さない、肝臓における相対的な濃度を有することが予想され
る。

【００２７】本発明のＦｃ−Ｘ構築物の１つの特徴は、肝臓において標的タンパク質（この
場合においては、インターフェロン−α）を濃縮することである。γ１鎖および
γ３鎖由来のＦｃ領域は、Ｆｃ領域についての最大の親和性を示し、γ４鎖は、
減少した親和性を示し、そしてγ２鎖は、Ｆｃレセプターに対して極度に低い親
和性を示す。従って、γ１鎖またはγ３鎖由来のＦｃ領域は、好ましくは本発明
のＦｃ−Ｘ構築物中で使用される。なぜなら、それらは、Ｆｃレセプターについ
て最大の親和性を有し、従って、インターフェロン−αを優先的に肝臓組織に標
的化し得るからである。このことは、Ｘ−Ｆｃタンパク質（例えば、インターフ
ェロン−α−Ｆｃ融合タンパク質）とは対照的である。ここでは、肝臓における
濃度の潜在的な利点は、この融合タンパク質が、インターフェロン−αのレセプ
ターを有する細胞に対するエフェクター機能（すなわち、補体結合およびＡＤＣ
Ｃ）を媒介し得るという事実によってバランスが保たれなくてはならない。

【００２８】従って、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域および少なくとも１つの標的タン
パク質（本明細書中ではインターフェロン−αと呼ばれる）を含む融合タンパク
質を規定するアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。本発明の具体的な
タンパク質構築物の３つの例示的な実施形態は、図１Ａ〜１Ｃとして図面で例証
される。ダイマー性の構築物が好ましいので、すべては、隣接するサブユニット
中のシステイン残基間の一対のジスルフィド結合によって架橋されたダイマーと
して図示される。図面において、ジスルフィド結合は、各重鎖中の免疫グロブリ
ンヒンジ領域を介して２つの免疫グロブリン重鎖Ｆｃ領域を互いに連結させるよ
うに描かれ、従って、これらの分子のネイティブな形態に特徴的である。Ｆｃの
ヒンジ領域を含む構築物は好ましく、そして治療薬剤として有望であることが示
されてきたが、本発明は、他の位置での架橋が所望されるように選択され得るこ
とを意図する。さらに、いくつかの状況において、本発明の実施において有用な
ダイマーまたはマルチマーは、非共有結合（例えば、疎水性相互作用）によって
産生され得る。ホモダイマー性構築物が、本発明の重要な実施形態であるので、
図面はそのような構築物を例証する。しかし、ヘテロダイマー性構築物もまた、
本発明の実施において有用であることが理解されるべきである。

【００２９】図１Ａは、本明細書中に示される原理に従って産生されるダイマー性構築物を
例証する（例えば、実施例１を参照のこと）。ホモダイマーの各モノマーは、ヒ
ンジ領域を含む免疫グロブリンＦｃ領域１、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメ
インを含む。インターフェロン−α２は、直接的に（すなわち、ポリペプチド結
合を介して）、Ｆｃ領域のＣ末端に結合する。Ｆｃ領域が、ポリペプチドリンカ
ーを介して標的タンパク質に結合され得ることが理解されるべきである（示さず
）。

【００３０】図１Ｂおよび１Ｃは、タンデムに配列されかつリンカーによって接続された複
数のインターフェロン−αタンパク質を標的タンパク質として含む、本発明のタ
ンパク質構築物を示す。図１Ｂにおいて、標的タンパク質は、全長インターフェ
ロン−α２、グリシン残基およびセリン残基からできているポリペプチドリンカ
ー４、およびインターフェロン−αの活性改変体３を含む。図１Ｃは、大部分の
Ｃ末端タンパク質ドメインが第２のインターフェロン−αの全長コピー２を含む
という点で図１Ｂの構築物とは異なる。図１Ａ〜１Ｃは、Ｆｃ−Ｘ構築物を表す
が（ここで、Ｘは標的タンパク質である）、本発明の有用なタンパク質はまた、
式Ｘ−Ｆｃ−Ｘによって示され得、ここでＸは、同じかまたは異なる標的タンパ
ク質を示し得ることが考えられる。

【００３１】本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチドリンカー」は、天然では互
いに自然に連結していない２つのタンパク質を互いに連結し得るポリペプチド配
列を意味すると理解される。ポリペプチドリンカーは、好ましくは、複数のアミ
ノ酸（例えば、アラニン、グリシン、およびセリン、またはこのようなアミノ酸
の組み合わせ）を含む。好ましくは、そのポリペプチドリンカーは、約１０〜１
５残基長の一連のセリンおよびグリシンのペプチドを含む。例えば、米国特許第
５，２５８，６９８号を参照のこと。しかし、最適なリンカー長およびアミノ酸
組成が、慣用的な実験によって決定され得ることが意図される。

【００３２】本明細書中で使用される場合、「多価」とは、２つ以上の生物学的に活性なセ
グメントを取り込む組換え分子をいう。多価分子を形成するタンパク質フラグメ
ントは、必要に応じて、構成成分の一部と結合しかつ各々が独立して機能するこ
とを可能にするポリペプチドリンカーを通して連結され得る。

【００３３】本明細書中で使用される場合、用語「二価」とは、配置Ｆｃ−ＸまたはＸ−Ｆ
ｃ（ここで、Ｘは標的分子である）を有する多価組換え分子をいう。免疫グロブ
リンＦｃ領域は、例えば、鎖間のジスルフィド結合を介して結合して、図１Ａに
示される構築物の型を産生し得る。本発明の融合構築物が配置Ｆｃ−Ｘ−Ｘを有
する場合、得られるＦｃ分子は、図１Ｃに示される。２つの標的タンパク質は、
ペプチドリンカーを通して連結され得る。図１Ａに示される型の構築物は、標的
分子とそのレセプターの間の見かけの結合親和性を増加させ得る。

【００３４】本明細書中で使用される場合、用語「マルチマー」とは、共有結合的に（例え
ば、共有結合的相互作用（例えば、ジスルフィド結合））または非共有結合的に
（例えば、疎水性相互作用）よってのいずれかの、２以上のポリペプチド鎖の安
定な結合をいう。用語マルチマーは、ホモマルチマー（ここではサブユニットは
同じものである）ならびにヘテロマルチマー（ここではサブユニットは異なる）
の両方を含むことが意図される。

【００３５】本明細書中で使用される場合、用語「ダイマー」のは、２つのポリペプチド鎖
が、共有結合相互作用または非共結合相互作用を介して安定に結合された特定の
マルチマー分子をいう。このような構築物は、図１Ａに概略的に示される。免疫
グロブリンＦｃ領域（少なくともヒンジ領域の部分を含む）、ＣＨ２ドメインお
よびＣＨ３ドメインが、ダイマーを代表的に形成することが理解されるべきであ
る。多くのタンパク質リガンドは、ダイマーとしてそれらのレセプターに結合す
ることが既知である。タンパク質リガンドＸが、天然に二量体化する場合、Ｆｃ
−Ｘ分子におけるＸ部分は、より高度に二量体化する。なぜなら、二量体化プロ
セスは、濃度に依存するからである。Ｆｃによって結合される２つのＸ部分は物
理的に近接している。この分子内プロセスの二量体化により、ダイマーの方へ平
衡が大きくシフトし、そしてレセプターへの結合を増強する。

【００３６】本明細書中で使用される場合、用語「インターフェロン−α」は、全長成熟イ
ンターフェロン−α（例えば、ヒトインターフェロン−α１（配列番号８）、ヒ
トインターフェロン−α２（配列番号９）、ヒトインターフェロン−α４（配列
番号１０）、ヒトインターフェロン−α５（配列番号１１）、ヒトインターフェ
ロン−α６（配列番号１２）、ヒトインターフェロン−α７（配列番号１３）、
ヒトインターフェロン−α８（配列番号１４）、ヒトインターフェロン−α１０
（配列番号１５）、ヒトインターフェロン−α１４（配列番号１６）、ヒトイン
ターフェロン−α１６（配列番号１７）、ヒトインターフェロン−α１７（配列
番号１８）、ヒトインターフェロン−α２１（配列番号１９）、ヒトインターフ
ェロンΔ１（配列番号２０）、ＩＩ−１（インターフェロンω−１）（配列番号
２１））；およびマウスインターフェロン−α１（配列番号２２）、マウスイン
ターフェロン−α２（配列番号２３）、マウスインターフェロン−α４（配列番
号２４）、マウスインターフェロン−α５（配列番号２５）、マウスインターフ
ェロン−α６（配列番号２６）、マウスインターフェロン−α７（配列番号２７
）、マウスインターフェロン−α８（配列番号２８）、およびマウスインターフ
ェロン−α９（配列番号２９）ならびにそれらの改変体および生理活性フラグメ
ントを意味すると理解される。インターフェロン−αの既知の配列は、ＧｅｎＢ
ａｎｋで見出され得る。

【００３７】用語、生理活性フラグメントは、任意のインターフェロン−αタンパク質フラ
グメントいう。このフラグメントは、配列番号２の鋳型ヒトインターフェロン−
αタンパク質の、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして
最も好ましくは少なくとも９０％の生物学的活性を有する。配列番号２の鋳型ヒ
トインターフェロン−αタンパク質は、実施例４の細胞増殖阻害アッセイを使用
して決定される。用語、改変体は、種改変体および対立形質改変体、ならびに他
の天然に生じるか、または非天然に生じる改変体（例えば、遺伝的操作プロトコ
ールによって作製される）を含む。これらの改変体は、配列番号２に開示された
成熟ヒトインターフェロン−αタンパク質に少なくとも７０％類似であるか、ま
たは６０％同一であり、より好ましくは少なくとも７５％類似であるか、または
６５％同一であり、そして最も好ましくは少なくとも８０％類似であるか、また
は７０％同一である。

【００３８】候補ポリペプチドが、参照ポリペプチドに類似または同一の要求性パーセント
を有するかどうかを決定するために、候補アミノ酸配列および参照アミノ酸配列
は、動的プログラミングアルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１
９８１）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１４７：１９５−１９７）を、ＢＬＯＳＵＭ６
２置換マトリックス（ＨｅｉｎｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）「
Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｍａｔｒｉｃｅｓｆｒｏ
ｍｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｃｋｓ」ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．
ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載される）と組み合わせて、
使用して最初に整列される。本発明について、ギャップ挿入ペナルティーについ
ての適切な値は、−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティーについての適
切な値は、−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムおよびＢ
ＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用するアルゴリズムを実施するコンピューター
プログラム（例えば、ＧＣＧｐｒｏｇｒａｍｓｕｉｔ（ＯｘｆｏｒｄＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ））は市販され、
そして当業者によって広く使用される。

【００３９】一旦、候補配列と参照配列との間のアライメントが作製されると、類似性パー
セントのスコアが計算され得る。各配列の個々のアミノ酸は、互いの類似性につ
いて連続して比較される。２つの整列されたアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６
２マトリックスにおける値が、ゼロまたは負の数である場合、ペアの類似性スコ
アはゼロである；別のペアの類似性スコアは１．０である。生の類似性スコアは
、整列されたアミノ酸のペアの類似性スコアの合計である。次いで生のスコアは
、候補配列または参照配列の小さなほうのアミノ酸の数での除算によって規格化
される。規格化された生のスコアは、類似性パーセントである。あるいは、同一
性パーセントを計算するために、各配列の整列されたアミノ酸は、連続して再び
比較される。アミノ酸が、非同一である場合、ペアの同一スコアはゼロである；
他のペア同一性スコアは、１．０である。生の同一性スコアは、同一の整列され
たアミノ酸の合計である。次いで、生のスコアは、候補配列または参照配列の小
さいほうのアミノ酸の数での除算によって規格化される。規格化された生スコア
は、同一性パーセントである。挿入および欠失は、類似性および同一性パーセン
トを計算する目的のために無視される。従って、ギャップペナルティーは、この
計算に使用されないが、最初のアライメントにおいては使用される。

【００４０】改変体は、インターフェロン−α様活性を有する他のインターフェロン−α変
異体タンパク質も含み得る。種改変体および対立形質改変体としては、ヒトおよ
びマウスインターフェロン−α配列が挙げられるが、これらに限定されない。ヒ
トインターフェロン−α改変体は、配列番号８〜２１に示され、そしてマウスイ
ンターフェロン−α改変体は、配列番号２２〜２９に示される。

【００４１】さらに、インターフェロン−α配列は、配列番号７に示されるコンセンサス配
列の一部またはすべてを含み得、ここでインターフェロン−αは、配列番号２の
成熟ヒトインターフェロン−α（実施例４の細胞増殖阻害アッセイを使用して決
定される）の、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最
も好ましくは少なくとも９０％の生物学的活性を有する。

【００４２】これらのタンパク質は、非常に類似の精製特性および他の生物学的特性を有す
る。特に、Ｆｃインターフェロン−αタンパク質のＤＮＡ操作、融合タンパク質
発現、および融合タンパク質精製特性は、非常に類似している。例えば、ヒトイ
ンターフェロン−α２ａおよびヒトインターフェロン−α２ｂは、１アミノ酸の
み異なり、従って、インターフェロン−α２ａは、インターフェロン−α２ｂが
アルギニン残基を有するのと同じ位置にリジン残基を有する。ヒトインターフェ
ロン−α２ａおよびヒトインターフェロン−α２ｂは、非常に類似した特性を有
し、そしてすべての公知の目的に交換可能である。

【００４３】インターフェロン−αの三次元構造は、Ｘ線結晶学によって解かれた（Ｒａｍ
ａｓｗａｍｙら、（１９８６）ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ４：１４５３）。インターフ
ェロン−αタンパク質の配列は、非常に類似しているので、決定された構造は、
全体のタンパク質のファミリーについての構造とみなされる。インターフェロン
−αの三次元構造は、インターフェロンβの構造と同様に、ダイマーインターフ
ェースで亜鉛イオンを有するダイマーである。しかし、溶液中において、インタ
ーフェロン−αは、モノマーとして振舞う。サイトカインＩＬ−６および他のタ
ンパク質リガンドから類推して、インターフェロン−αが、レセプター結合の際
に二量体化し得ることが提案されている（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｒら、
（１９９６）ＳＴＲＵＣＴＲＵＲＥ４：１４５３；Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍら（
１９９７）ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９４：１１８１３）
。

【００４４】リガンドの二量体化は、リガンドとそのレセプターとの間の見かけ上の結合親
和性を増加し得る。例えば、Ｆｃインターフェロン−α融合タンパク質の１つの
インターフェロン−α部分が細胞上のレセプターに、特定の親和性で、結合し得
る場合、同じＦｃインターフェロン−α融合タンパク質の第２のインターフェロ
ン−α部分は、同じ細胞上の第２のレセプターに、より高い結合力（見かけ上の
親和性）で結合し得る。これは、以下のための生じる。第１のインターフェロン
−α部分が既に結合した後に第２のインターフェロン−α部分の、レセプターへ
の物理的な近接に起因して生じる。抗体が抗原に結合する場合、見かけ上の親和
性は、少なくとも１００００（すなわち１０⁴）倍に増加し得る。各タンパク質
サブユニット（すなわち「Ｘ」）は、それ自身の独立した機能を有し、その結果
、多価分子において、タンパク質サブユニットの機能は相加的または相乗的であ
り得る。従って、正常なダイマーＦｃ分子の、インターフェロン−αへの融合に
より、インターフェロン−αの活性を増加し得る。従って、図１Ａに示されるこ
の型の構築物は、インターフェロンとそのレセプターとの間の見かけ上の結合親
和性を増加し得る。

【００４５】本明細書中に開示される標的タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を有す
る融合タンパク質として発現される。既知のように、各免疫グロブリン重鎖定常
領域は、４または５のドメインを含む。これらのドメインは、以下のように連続
して名付けされる：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。重鎖ドメイ
ンのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンカセット間の交差相同性を有する（例えば、
ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインに対して相同
性であり、そしてＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインに対して相同性である）
。

【００４６】本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロ
ブリン鎖定常領域のカルボニル末端部分、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領
域、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域
は、以下を含み得る：１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメ
イン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣ
Ｈ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２以上の
ドメインの組み合わせおよび免疫グロブリンヒンジ領域。好ましい実施形態にお
いて、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域ＣＨ２
ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、そして好ましくはＣＨ１ドメインを欠く
。重鎖定常領域がＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）に
由来する免疫グロブリンのクラスが現在好ましい。ヒトＦｃ γ−１のヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列は、配列番号３および４に示される。他のクラスの
免疫グロブリン、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およ
びＩｇＭ（Ｉｇμ）が使用され得る。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択
は、米国特許第５，５４１，０８７号および同５，７２６，０４４号に記載され
る。特定の結果を達成するために特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラス
から特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を選択することは、当業者の範囲内
であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部
は、好ましくは、少なくともヒンジドメインの一部、そして好ましくは少なくと
もＦｃγのＣＨ₃ドメインの一部または任意のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩ
ｇＭの相同性ドメインの一部を含む。

【００４７】適用に依存して、ヒト以外の種（例えば、マウスまたはラット）からの定常領
域遺伝子が使用され得る。ＤＮＡ構築物における融合パートナーとして使用され
る免疫グロブリンＦｃ領域は、一般的に任意の哺乳動物種に由来し得る。ここで
、宿主細胞または動物におけるＦｃ領域に対する免疫応答を誘発することは望ま
しくなく、Ｆｃ領域は宿主細胞または動物と同じ種に由来し得る。例えば、宿主
動物または細胞がヒトである場合、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、使用され得
る；同様に、宿主動物または細胞がマウスである場合に、マウス免疫グロブリン
Ｆｃ領域は、使用され得る。

【００４８】本発明の実行において有用であるヒト免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核
酸配列、およびヒト免疫グロブリンＦｃ領域を規定するアミノ酸配列は、配列番
号３および配列番号４に示される。しかし、本発明の実行において有用である他
の免疫グロブリンＦｃ領域配列が、例えばヌクレオチド配列によってコードされ
る配列によって見出され得ることが、意図される。このヌクレオチド配列は、Ｇ
ｅｎｂａｎｋおよび／またはＥＭＢＬデータベース（例えばＡＦ０４５５３６．
１（Ｍａｃａｃａｆｕｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ＡＦ０４５５３７．１（Ｍａｃ
ａｃａｍｕｌａｔｔａ）、ＡＢ０１６７１０（Ｆｅｌｉｘｃａｔｕｓ）、Ｋ
００７５２（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、Ｕ０３７８０（
Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ）、Ｚ４８９４７（Ｃａｍｅｌｕｓｄｒｏｍｅｄａｒｉ
ｕｓ）、Ｘ６２９１６（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ）、Ｌ０７７８９（Ｍｕｓｔｅｌ
ａｖｉｓｉｏｎ）、Ｘ６９７９７（Ｏｖｉｓａｒｉｅｓ）、Ｕ１７０６６（
Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓ）、Ｘ０７１８９（Ｒａｔｔｕ
ｓｒａｔｔｕｓ）、ＡＦ５７６１９．１（Ｔｒｉｃｈｏｓｕｒｕｓｖｕｌｐ
ｅｃｕｌａ）またはＡＦ０３５１９５（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓｄｏｍｅｓｔ
ｉｃａ））に開示される（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される
）。

【００４９】さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が、本発
明の実行に有用であり得ることが意図される。１例は、上部ＣＨ２領域にアミノ
酸置換基を導入し、Ｆｃレセプターに対して減少された親和性を有するＦｃ改変
体を作製する工程を包含し得る（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．
１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学的技術を使用してこのような
構築物を調製し得る。

【００５０】ＦＣ領域配列としてのヒトＦｃγ１の使用は、いくつかの利点を有する。例え
ば、Ｆｃ融合タンパク質がバイオ製薬（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）
として使用される場合、Ｆｃγ１ドメインは、融合タンパク質にエフェクター機
能活性を与え得る。エフェクター機能活性は、生物学的活性（例えば、胎盤転移
および増加した血清の半減期）を含む。免疫グロブリンＦｃ領域はまた、抗Ｆｃ
ＥＬＩＳＡによる検出およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓタン
パク質Ａ（「タンパク質Ａ」）への結合を介した精製のために提供する。しかし
、特定の適用において、免疫グロブリンＦｃ領域から特定のエフェクター機能（
例えば、Ｆｃレセプター結合および／または相補結合）を欠失することが所望さ
れ得る。

【００５１】本発明が、従来の組換えＤＮＡ方法論を開発し、本発明の実行におけるＦｃ融
合タンパク質を産生することが理解される。Ｆｃ融合構築物は、好ましくはＤＮ
Ａレベルで産生され、そして得られたＤＮＡ発現ベクターは組み込まれ、そして
本発明の融合タンパク質を産生するために発現される。本明細書中で使用される
場合、用語「ベクター」は、ヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味すると理
解される。このベクターは、宿主細胞に組み込まれ得、そして宿主細胞ゲノムに
再結合し、かつ宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、またはエピソームとして自立
的に複製する。このようなベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファー
ジミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイ
ルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよび
アデノ随伴ウイルスが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語標的タン
パク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物
の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物の分泌を意味すると理解される。

【００５２】有用な発現ベクターは、ｐｄＣｓであり（Ｌｏら、（１９８８）ＰＲＯＴＥＩ
ＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ１１：４９５）、ここでＦｃ−Ｘ遺伝子の転写は
、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリ
アデニル化シグナルを利用する。使用されたヒトサイトメガロウイルスのエンハ
ンサーおよびプロモーターは、Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）ＣＥＬＬ４１：５
２１に提供される配列のヌクレオチド−６０４〜＋７に由来した。ベクターはま
た、選択マーカーとして変異ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む（Ｓｉｍｏ
ｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９８３）ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．Ｓ
ＣＩ．ＵＳＡ８０：２４９５）。

【００５３】適切な宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列で形質転換され得るか、またはトラン
スフェクトされ得、そして標的タンパク質の発現および／または分泌に使用され
得る。現在、本発明の使用に好ましい宿主細胞としては、不死ハイブリドーマ細
胞、ＮＳ／Ｏミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、
ＨＥＬＡ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。

【００５４】哺乳動物細胞において融合タンパク質の高レベルの発現を産生するために使用
された１つの発現系は、５’→３’の方向で、分泌カセットをコードするＤＮＡ
構築物であり、シグナル配列および免疫グロブリンＦｃ領域、および標的タンパ
ク質を含む。いくつかの標的タンパク質は、このような系で首尾よくに発現され
、そして例えば、ＩＬ２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２、βＩＧ−Ｈ
３、ＩｇＥレセプター、ＰＳＭＡ、およびｇｐ１２０を含む。これらの発現構築
物は、Ｌｏらの米国特許第５，５４１，０８７号および第５，７２６，０４４号
に記載される。

【００５５】本明細書において使用されるように、用語「シグナル配列」は、インターフェ
ロン−α融合タンパク質の分泌を指向し、そしてその後、宿主細胞中で翻訳され
た後に切断されるセグメントを意味することが理解される。本発明のシグナル配
列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を惹起する、アミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチドである。本発明において有用なシグナル配列としては、
抗体軽鎖シグナル配列（例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９
）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨ．１２５：１９１））、抗体重鎖シグナル配列
（例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら（１９８０）
ＮＡＴＵＲＥ２８６：５７７４））、および当該分野で公知である任意の他のシ
グナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ（１９８４）ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳ
ＲＥＳＥＡＲＣＨ１２：５１４５を参照のこと）が挙げられる。

【００５６】シグナル配列は、当該分野で十分特徴付けられており、代表的に１６〜３０個
のアミノ酸残基を有することが公知であり、そしてそれより大きいか、または小
さいアミノ酸残基を含み得る。代表的なシグナルペプチドは、３つの領域からな
る：塩基性Ｎ末端領域、中心疎水性領域、および極性のより高いＣ末端領域。中
心疎水性領域は、４〜１２個の疎水性残基を有し、この残基は、新生ポリペプチ
ドの輸送の際に、膜脂質二重層中にシグナルペプチドを固定させる。惹起後に、
このシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素によっ
て、小胞体のルーメンで一般に切断される。シグナルペプチドの潜在的な切断部
位は、「（−３，−１）ルール」に一般に従う。従って、代表的なシグナルペプ
チドは、−１および−３の位置に小さな中性アミノ酸残基を有し、かつこの領域
にプロリン残基を有さない。このシグナルペプチダーゼは、例えば、−１アミノ
酸と＋１アミノ酸との間のシグナルペプチドを切断する。従って、このシグナル
配列は、分泌の間に、融合タンパク質のアミノ末端から切断され得る。結果とし
て、これは、免疫グロブリンＦｃ領域および標的タンパク質からなるＦｃ融合タ
ンパク質の分泌を生じる。シグナルペプチド配列の詳細な議論は、ｖｏｎＨｅ
ｉｊｎｅ（１９８９）ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．１４：４６８３か
ら提供される。

【００５７】当業者に明らかであるように、分泌カセットに使用する特定のシグナル配列の
適合性は、いくつかの慣用実験方法を必要とし得る。このような実験方法は、Ｆ
ｃ融合タンパク質の分泌を指向するシグナル配列の能力を決定する工程、および
Ｆｃ融合タンパク質の効果的な分泌を達成するために使用される、配列の最適な
コンフィギュレーション、ゲノムまたはｃＤＮＡの決定を包含する。さらに、当
業者は、上記のｖｏｎＨｅｉｊｎｅによって示される規則に従って合成シグナ
ルペプチドを生成し、そして慣用実験方法によって、このような合成シグナル配
列の効果について試験し得る。シグナル配列はまた、「シグナルペプチド」、「
リーダー配列」または「リーダーペプチド」として言及され得る。

【００５８】シグナル配列と免疫グロブリンＦｃ領域との融合は、時折、分泌カセットとし
て本明細書中で言及される。本発明の実施において有用である例示的な分泌カセ
ットは、５’→３’方向に免疫グロブリン軽鎖遺伝子およびヒト免疫グロブリン
γ１遺伝子のＦｃγ１領域のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドである
。免疫グロブリンＦｃγ１遺伝子のＦｃγ１領域は、好ましくは、免疫グロブリ
ンヒンジドメインおよび少なくともＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含み、
またはより好ましくは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン
の少なくとも一部分を含む。本明細書で使用されるように、免疫グロブリンヒン
ジ領域の「一部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成し得る少なくとも１個、好
ましくは２個のシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジの一部分を意味す
ると理解される。この分泌カセットをコードするＤＮＡは、ゲノムコンフィギュ
レーションまたはそのｃＤＮＡコンフィギュレーションに存在し得る。特定の環
境の下、ヒト免疫グロブリンＦｃγ２重鎖配列由来のＦｃ領域を産生することは
、利点があり得る。ヒト免疫グロブリンγ１およびγ２配列に基づくＦｃ融合は
、マウスにおいて同様に振舞うが、γ２配列に基づくＦｃ融合は、ヒトにおいて
優れた薬物速度を示し得る。

【００５９】別の実施形態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと標的タンパク質との間
に挿入されるタンパク分解性切断部位をコードする。切断部位は、コード化融合
タンパク質のタンパク分解、続く標的タンパク質からのＦｃドメインの分離を提
供する。本明細書において使用されるように、「タンパク分解性切断部位」は、
タンパク分解性酵素または他のタンパク分解性切断試薬により、好ましくは切断
されるアミノ酸配列を意味すると理解される。有用なタンパク分解性切断部位は
、トリプシン、プラスミンまたはエンテロキナーゼＫのようなタンパク分解酵素
によって認識されるアミノ酸配列を含む。多くの切断部位／切断試薬対は、公知
である（例えば、米国特許第５，７２６，０４４号を参照のこと）。

【００６０】さらに、これらの定常領域の構造の置換または欠失が有用であり、ここで、定
常領域ドメインの１以上のアミノ酸残基が置換されるかまたは欠失される。１例
として、上流ＣＨ２領域でのアミノ酸置換により、Ｆｃレセプターに対して減少
したアフィニティーを有するＦｃ改変体が産生される（Ｃｏｌｅら（１９９７）
Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学的技術
を使用してこのような構築物を調製し得る。

【００６１】本明細書において開示される実施例において、高いレベルのＦｃ−インターフ
ェロン−αが産生された。初期クローンによって約５０μｇ／ｍＬのＦｃ−イン
ターフェロン−αが産生され、これは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグ
ラフィーによって容易に均一となるまで精製され得る。発現レベルは、しばしば
、サブクローニングによって数倍増加され得る。上記のように、インターフェロ
ン−αがＦｃ融合分子として発現される場合、高レベルの発現が得られることが
見出される。おそらくＦｃタンパク質がキャリアとして作用し、ポリペプチドが
Ｃ末端で正しく折り畳まれ、効果的に分泌されるのを助けるからである。さらに
、Ｆｃ領域はグルコシル化され、そして生理学的ｐＨが大きく変化し、従って、
Ｆｃ領域が疎水性タンパク質を可溶化するのを助け得る。

【００６２】高レベルの発現に加えて、インターフェロン−α融合タンパク質は、インター
フェロンのみと比較して、部分的にそれらの長い分子サイズに起因した血清のよ
り長い半減期を示した。例えば、半減期が２〜５時間であるインターフェロン−
α（ＰＨＹＳＩＣＩＡＮＳＤＥＳＫＲＥＦＥＲＥＮＣＥ，第５０版、１９９
６：２１５６−２１４７および２３６４−２３７３）と比較して、Ｆｃ−インタ
ーフェロン−αは、マウスにおいて１９．３時間の循環半減期を有する（実施例
６を参照のこと）。約１９ｋＤの分子量を有するインターフェロン−αは、腎臓
濾過によって効果的に洗浄するのに十分小さい。これに対して、Ｆｃ−インター
フェロン−αは、約１００ｋＤの分子量を有する。なぜならば、各Ｆｃ分子に結
合する２個のインターフェロン−α部分（すなわち、Ｆｃはダイマー形態である
ので、２個のインターフェロン−α）が存在するからである。このようなダイマ
ー構造が、インターフェロン−αレセプターに対してより高い結合親和性を示し
得る。インターフェロン−α活性は、レセプターにより媒介されるので、この二
価のインターフェロン−α融合タンパク質は、可能性としてインタフェロン−α
自体よりもより有効である。

【００６３】さらに、多くのタンパク質リガンドは、ダイマーとしてそれらのリガンドに結
合することが公知である。インターフェロン−αは、弱い二量体化定数を有する
タンパク質リガンドのクラスに属するので、インターフェロン−α上のＦｃによ
って与えられる物理学的束縛により、二量体化を分子内プロセスとさせ、ダイマ
ーの方に平衡をシフトさせ、そしてレセプターへの結合を増強する。システイン
残基がまた、標準的な組換えＤＮＡ技術によってモノマーに適切な位置で導入さ
れ得、ジスルフィド共有結合の形成によりダイマーを安定化させる。

【００６４】本発明の融合タンパク質は、いくつかの重要な臨床的な利点を提供する。Ｄａ
ｕｄｉ細胞における生物学的活性の試験および細胞変性効果アッセイについての
試験で立証されるように（実施例４）、Ｆｃ−インターフェロン−αの生物学的
な活性は、インターフェロン−αの活性よりも有意に高い。

【００６５】本発明の別の実施形態において、種々の構造的コンホメーション（例えば、二
価または多価の構築物、二量体または多量体の構築物、およびそれらの組み合わ
せ）を有する構築物が提供される。このような本発明の分子の機能性コンホメー
ションにより、インターフェロン−αならびに他の抗ウイルス性タンパク質およ
び抗癌性タンパク質を、動物モデルにおいて調査し得る。

【００６６】本発明の重要な局面は、種々のインターフェロン−αタンパク質およびコード
ＤＮＡの配列および特性が極めて類似しているということである。Ｆｃ−Ｘ融合
の状況において、インターフェロン−αタンパク質およびコードＤＮＡの特性は
、本質的に同一であり、その結果、治療の目的のために、一連の共通の技術を使
用して任意のＦｃインターフェロン−αＤＮＡ融合タンパク質を産生し、融合タ
ンパク質を発現し、融合タンパク質を精製し、そして融合タンパク質を投与し得
る。

【００６７】本発明はまた、Ｆｃ融合タンパク質として非ヒト種のインターフェロン−αを
産生するための方法を提供する。非ヒトインターフェロン−αタンパク質は、イ
ンターフェロン−αの臨床前研究に有用である。なぜならば、タンパク質薬物の
効果および毒性の研究は、ヒトで試験する前に動物モデル系で実施しなければな
らないからである。ヒトタンパク質は、マウスモデルで作用し得ない。なぜなら
ば、タンパク質は、免疫応答を誘発し、そして／または試験結果をゆがめる異な
った薬物速度を示し得るからである。従って、等価なマウスタンパク質は、マウ
スモデルで試験するためのヒトタンパク質の最良の代替物である。

【００６８】本発明は、本発明のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を、種々の癌、ウイル
ス性疾患、他の疾患、関連する状態およびその原因を有する哺乳動物に投与する
ことによって、このような状態を処置する方法を提供する。関連する状態として
は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、性器いぼ、ヘアリーセル白血病、ＡＩＤＳ
関連カポージ肉腫、黒色腫、前立腺癌およびウイルス性疾患および癌の他の形態
が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答を調節する際に、インターフ
ェロン−αによって成される幅広い役割の観点において、本発明はまた、インタ
ーフェロン−αの投与によって緩和される状態を処理する方法を提供する。これ
らの方法は、ウイルス感染または癌に直接関係し得るかまたはし得ない状態を有
する哺乳動物に、本発明の組成物の有効量を投与する工程を包含する。

【００６９】本発明のタンパク質は、治療薬剤として有用であるだけではなく、このタンパ
ク質が診断用途のための抗体の産生に有用であることが当業者に認識される。同
様に、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ベクターまたはこのような使用のための他
の送達系）の適切な投与は、本発明の使用方法に含まれる。

【００７０】免疫グロブリンＦｃを含む融合タンパク質としての、Ｆｃインターフェロン−
αは、非常に好都合な組織分布およびわずかに異なる作用モードを有し、そして
特に血清の長い半減期および投与され得る多量の用量の可溶性タンパク質の観点
で、臨床的効果を達成する。特に、肝臓に高レベルのＦｃγレセプターが存在し
、これはＢ型肝炎およびＤ型肝炎を引き起こすウイルスによる感染部位である。
インターフェロン−αの神経学的な副作用は、血液脳関門を通過し得る小さなサ
イズのインターフェロン−αのために生じると考えられる。より大きなサイズの
Ｆｃインターフェロン−αは、このタンパク質が血液脳関門を通過する範囲を有
意に減少させる。

【００７１】本発明の組成物は、特定の分子と適合性である任意の経路によって投与され得
る。本発明の組成物が、直接的に（例えば、注射、移植または組織部位への局所
的投与によるように局所的に）または全身的に（例えば、非経口的または経口的
に）任意の適切な手段によって動物に提供され得る。この組成物は、非経口的（
例えば、静脈内、皮下、眼、腹腔内、筋肉内、頬、直腸、膣、眼窩内、大脳内、
頭蓋内、脊髄内、脳室内、硬膜下腔内、槽内、嚢内、鼻腔内、またはエアロゾル
投与）に投与される場合、この組成物は、好ましくは、水性または生理学的に適
合性の流体懸濁物または液体の一部を含む。従って、このキャリアまたはビヒク
ルは、生理学的に受容可能であり、その結果、患者へ所望の組成物を送達するこ
とに加えて、患者の電解質および／または容積バランスに他に不利な影響を与え
ない。従って、この試薬に対する流体媒体は、正常な生理学的な生理食塩水を含
み得る。

【００７２】本発明のＤＮＡ構築物（または遺伝子構築物）はまた、遺伝子治療のプロトコ
ールの一部として使用され得、インターフェロン−αまたはその融合タンパク質
構築物をコードする核酸を送達する。本発明は、特定の細胞型において、インビ
ボトランスフェクションのための発現ベクターおよびインタフェロンαまたはそ
の融合タンパク質構築物の発現を特徴とし、インターフェロン−αの機能を再構
築または補充する。インターフェロン−αの発現構築物、またはその融合タンパ
ク質構築物は、任意の生物学的に有効なキャリア（例えば、インターフェロン−
α遺伝子またはその融合タンパク質構築物をインビボで細胞に有効に送達し得る
、任意の処方物または組成物）で投与され得る。アプローチとしては、組換えレ
トロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイ
ルス−１、または組換えバクテリアプラスミドもしくは真核生物プラスドを含む
ウイルス性ベクターへの被験体遺伝子の挿入を含む。本発明の融合タンパク質を
コードする核酸の１回の投薬当たりの好ましい用量は、１μｇ／ｍ²〜１００ｍ
ｇ／ｍ²、より好ましくは、２０μｇ／ｍ²〜１０ｍｇ／ｍ²、そして最も好まし
くは、４００μｇ／ｍ²〜４ｍｇ／ｍ²の範囲内である。最適の用量および投与モ
ードが、当該分野の技術レベル内で、慣用的な実験により十分決定され得ること
が考慮される。

【００７３】１回の投薬当たり好ましい融合タンパク質の用量は、０．１ｍｇ／ｍ²〜１０
０ｍｇ／ｍ²、より好ましくは、１ｍｇ／ｍ²〜２０ｍｇ／ｍ²、そして最も好ま
しくは、２ｍｇ／ｍ²〜６ｍｇ／ｍ²の範囲内である。しかし、最適な用量はまた
、処置される疾患および副作用の存在で左右されることが考慮される。しかし、
最適な用量は、慣用的な実験を使用して決定され得る。融合たんぱく質の投与は
、周期的なボーラス注射によるか、または外部レザバ（例えば、静脈内バックか
ら）からもしくは内部レザバ（例えば、生分解性移植片）から連続的な静脈内投
与または腹腔内投与によってである。さらに、本発明の融合タンパク質はまた、
意図されるレシピエントに複数の異なる生物学的に活性な分子と一緒に投与し得
ることが考慮される。しかし、融合タンパク質と他の分子、投薬モード、用量の
最適な組み合わせが、当該分野の技術レベル内で、慣用的な実験によって十分決
定され得ることが考慮される。

【００７４】本発明は、以下の非制限的な例によってさらに例示される。

【００７５】（実施例）（実施例１．ｈｕＦｃ−ｈｕインターフェロン−α（ｈｕＦｃ−ＩＦＮ−α）
の発現）ｍＲＮＡをヒト末梢血単核細胞から調製し、そして逆転写酵素を用いて逆転写
した。得られたｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのテンプレー
トとして使用して、ｈｕＦｃ−インターフェロン−α（ｈｕＦｃ−ＩＦＮ−α）
融合タンパク質として、発現のためのヒトインターフェロン−αｃＤＮＡをクロ
ーン化および適合した。順方向プライマーは、

【００７６】

【化１】であり、ここで、配列ＣＣＣＧＧＧ（ＸｍａＩ制限酵素認識部位）ＴＡＡＡは、
免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端をコードし、続いて、インターフェロン−
αのＮ末端をコードする配列（太字）が続く。逆方向プライマーは、

【００７７】

【化２】であり、これは、その翻訳終止コドン（アンチコドン、ＴＣＡ）を有するインタ
ーフェロン−αのカルボキシ末端配列（アンチセンス）をコードし、そしてこれ
は次いで、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が続く。Ａ５１７塩基対ＰＣＲ産物を
クローン化しそして配列決定した。配列分析により、ＰＣＲ産物が、発現に適合
した成熟ヒトインターフェロン−α（すなわち、５’末端にＸｍａＩ、３’末端
にＸｈｏＩ部位を有する）をコードすることを確認した。

【００７８】発現ベクターｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ＩＦＮ−αを以下のようにして構築した。
Ｌｏら（１９９８）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１１：４９５に
従って、ヒトインターフェロン−αｃＤＮＡを含むＸｍａＩ−ＸｈｏＩ制限フラ
グメントをｐｄＣｓ−ｈｕＦｃベクターのＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントに結
合した。ｈｕＦＣは、ヒト免疫グロブリンγ１のＦｃフラグメントである。得ら
れたベクター、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ＩＦＮ−αを使用して、ｈｕＦｃ−ＩＦＮ
−αの発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトした。

【００７９】（実施例２．タンパク質のトランスフェクションおよび発現）一過性トランスフェクションのために、リン酸カルシウムを用いてプラスミド
ＤＮＡを共沈することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）「ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲＣＯＬＯＮＩＮＧ−−ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ」
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰＲＥＳＳ、ＮＹ）、または製造業
者の指示に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（ＬｉｆｅＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用してリポフェク
ションすることによって、プラスミドｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ＩＦＮ−αをヒト腎
臓２９３細胞に導入した。

【００８０】安定にトランスフェクトされたクローンを得るために、プラスミドＤＮＡを、
エレクトロポレーションによって、マウス骨髄腫ＮＳ／０細胞に導入した。簡潔
には、ＮＳ／０細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよびペニシリ
ン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた
。約５×１０⁶個の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄し、そ
して０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。次いで、その細胞と共に１０μｇの直線
化プラスミドＤＮＡを、氷上で１０分間、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＣｕｖｅｔ
ｔｅ（電極間隔０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ）中でインキュベートした。０．２５
Ｖおよび５００μＦに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒ
ｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、エレクトロポレーションを行った。細胞を氷上
で１０分間回復させ、その後、それらの細胞を増殖培地に再懸濁し、次いで２つ
の９６ウェルプレートにプレートした。１００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）
の存在下で増殖させることにより、安定にトランスフェクトされたクローンを選
択し、これをトランスフェクションの２日後に導入した。２〜３回以上について
は、細胞を３日毎に供給し、そしてＭＴＸ耐性クローンが、２〜３週間で現れた
。クロンの上清を、抗ＦｃＥＬＩＳＡ（実施例３を参照のこと）によってアッセ
イして、高い産生物を同定した。高度に産生するクローンを単離し、そして１０
０ｎＭＭＴＸを含む増殖培地中で増殖させた。

【００８１】ゲル電気泳動により特徴付けられるルーチンについて、馴化培地中のＦｃ融合
タンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に結合し、次いで、２−メルカプトエタノールと共
にか、または２−メルカプトエタノールなしで、標準タンパク質サンプル緩衝液
中で沸騰することにより、このＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅから溶
離した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）で電気泳動した後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色することによっ
て、タンパク質のバンドを可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、ｈｕＦｃ−
ｈｕインターフェロン−αは、約５２ｋＤの見かけのＭＷを有していた。

【００８２】精製のために、ＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅの融合タンパク質の
バンドを、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ３、およ
び１５０ｍＭＮａＣｌ）中で溶離した。ついで、この溶離液を、すぐに、０．
１容量の２Ｍトリス−塩酸塩で、ｐＨ８に中和した。

【００８３】（実施例３．ＥＬＩＳＡ手順）ＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの懸濁液中のヒトＦｃ含有タンパ
ク質産物の濃度を、抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡによって決定した。この手順を以下に
詳細に記載する。

【００８４】（Ａ．プレートのコーティング）ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）で、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ、および９０ウェ
ルプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅＭａｘｉｓｏｒｐ）中１０
０μＬ／ウェルで、コーティングした。コーティングしたプレートをカバーし、
そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ中０．０５
％のＴｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、そしてＰＢＳ中１％ＢＳ
Ａ／１％ヤギ血清、２００μＬ／ウェルでブロックした。ブロック緩衝液と共に
３７℃で２時間インキュベートした後、このプレートを、ＰＢＳ中０．０５％の
Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、そしてペーパータオル上でたたいて乾燥させた。

【００８５】（Ｂ．試験サンプルおよび二次抗体を用いるインキュベーション）試験サンプルを、サンプル緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．
０５％Ｔｗｅｅｎ）中で適切なように希釈した。既知の濃度のキメラ抗体（ヒト
Ｆｃを有する）を使用して、標準曲線を作成した。標準曲線を作成するために、
サンプル緩衝液で段階希釈を行って、１２５ｎｇ／ｍＬ〜３．９ｎｇ／ｍＬの範
囲の標準曲線を得た。この希釈サンプルおよび標準物を、１００μＬ／ウェルで
プレートに添加し、そしてこのプレートを３７℃で２時間インキュベートした。
インキュベーション後、このプレートを、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで８
回洗浄した。次いで、各ウェルに、サンプル緩衝液中で約１：１２０，０００に
希釈した１００μＬの二次抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒ
トＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。二
次抗体の正確な希釈は、多くのＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧの各々について決定され
なければならない。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを、ＰＢＳ
中０．０５％のＴｗｅｅｎで８回洗浄した。

【００８６】（Ｃ．発色）基質溶液を、１００μＬ／ウェルでプレートに添加した。この基質溶液は、３
０ｍｇのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ））（１錠
剤）を１５ｍＬの０．０２５Ｍクエン酸／０．０５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄緩衝液（ｐ
Ｈ５）（これは、０．０３％の新たに添加した過酸化水素を含む）に溶解するこ
とによって調製した。色を、暗闇で３０分間室温で発色させた。発色時間は、ロ
ットによって、様々な被覆プレート、二次抗体などに基づいて変化させた。４Ｎ
硫酸を、１００μＬ／ウェルで添加することにより反応を停止した。このプレー
トをプレートリーダー（これは、４９０および６５０ｎｍに設定され、そして４
９０ｎｍにおけるＯＤから６５０ｎｍにおけるバックグラウンドＯＤを引くよう
にプログラミングされる）で読みとった。

【００８７】（実施例４．バイオアッセイ）２つの異なるアッセイを使用して、ｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αの生物活性を、
ヒトインターフェロン−α（ｈｕ−ＩＦＮ−α）ヒト白血球インターフェロン（
Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の生物活性と比較した。第１のアッセイ
は、Ｄａｕｄｉヒトリンパ芽球腫Ｂ細胞株（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）の増殖
の阻害を決定する。第２のアッセイは、ヒト肺癌Ａ５４９細胞株（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ１８５）に対する脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性効果の阻害を
測定する。

【００８８】インターフェロン−αは、Ｄａｕｄｉ（ヒトＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫）細胞の
増殖を阻害する。Ｄａｕｄｉ細胞を、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０で２回
洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０および２０％熱不活化（５６℃）ウシ胎児血清から
なる増殖培地に再懸濁した。ついで、この細胞を、異なる濃度のαＩＦＨ（２．
１×１０⁶ＩＵ／ｍｇ）およびｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αの存在下、２４ウェル
プレートに、１×１０⁵細胞／ｍＬ／ウェルでプレートした。３〜４日後、ｈｕ
Ｆｃ−ｈｕＩＦＮ−αの形態の５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−αが、Ｄａｕｄｉ細胞
増加の５０〜１００％阻害を達成する７５０ｐｇ／ｍＬのｈｕＩＦＮ−αと同じ
程度に有効であることが見出された。コントロールとして、インターフェロン−
γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）は、このアッセイにお
いて、１００ｎｇ／ｍＬで、活性を示さなかった。これは、阻害がインターフェ
ロン−α特異性であることを示す。

【００８９】（実施例５．抗ウイルス活性の測定）細胞培養におけるウイルスの複製は、しばしば、細胞毒性（細胞変性効果（Ｃ
ＰＥ）として公知の効果）を生じる。インターフェロンは、細胞培養における抗
ウイルス状態を誘導し、そしてこのようなＣＥＰから細胞を保護し得る。抗ウイ
ルス活性ＩＦＮ−αは、「ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．Ｃｌｅｍｅｎ
ｓ，Ａ．Ｇ．ＭｏｒｒｉｓおよびＡ．Ｊ．Ｈ．Ｇｅａｒｉｎｇ編、Ｉ．Ｒ．Ｌ．
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７に記載されるように、細胞変性効果減少（
ＣＰＥＲ）アッセイによって定量され得る。ｈｕＦＣ−ｈｕＩＦＮ−αおよびｈ
ｕＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ１８５）および脳心筋炎ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ１２９Ｂ）を使用して、
上記の参考文献に記載されるＣＰＥＲプロトコルに従って比較した。５０％ＣＰ
ＥＲ（すなわち、５０％保護）を与える有効用量は、ｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α
について５７０ｐｇ／ｍＬ（ＩＦＮ−αの量に基づいて）であり、ｈｕＩＦＮ−
αについて５００ｐｇ／ｍＬであることが見出された。従って、ｈｕＦｃ−ｈｕ
ＩＮＦ−αにおけるＩＮＦ−αおよびｈｕＩＦＮ−αは、実質的に等価な抗ウイ
ルス活性を有する。

【００９０】（実施例６．薬物速度論）ｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αの薬物速度を、４Ｂａｌｂ／ｃのマウスの群におい
て決定した。２５ｍｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを、各マウスの尾静脈に注射
した。血液を、注射の直後（すなわち、ｔ＝０分）、および注射の０．５、１、
２、４、８および２４時間後に眼窩後出血によって得た。血液サンプルを、凝固
を防ぐために、ヘパリンの入った管に収集した。細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ高
速微小遠心分離で４分間、遠心分離することによって除去した。血漿中のｈｕＦ
ｃ−ｈｕＩＦＮ−αの濃度を、抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡおよび抗ｈｕＦｃ抗体を用
いるウエスタンブロット分析によって測定し、これはまた、ｈｕＦｃ−ｈｕＩＦ
Ｎ−αが循環においてインタクトなままであることを示した（ｈｕＦｃ−ｈｕＩ
ＦＮ−αについて５２ｋＤ）。分解産物（ｈｕＦｃについて３２ｋＤのバンド）
は、検出し得なかった。ｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αの循環半減期は、１９．３時
間と決定され、これは、約２〜５時間のヒトＩＦＮ−αの報告された循環半減期
（ＰＨＹＳＩＣＩＡＮＳＤＥＳＫＲＥＦＥＲＥＮＣＥ，第５０版、１９９６
：２１４５〜２１４７および２３６４〜２３７３）より有意に長い。

【００９１】（実施例７．ＳＣＩＤマウスにおけるヒトバーキットリンパ腫の播種性増殖の
処置）Ｄａｕｄｉ（ヒトバーキットリンパ腫）細胞を、播種性腫瘍としてＣ．Ｂ−１
７ＳＣＩＤ（重篤複合免疫不全）マウスにおいて増殖した（Ｇｈｅｔｉｅら、（
１９９０）ＩＮＴＬ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ：４５：４８１）。０．２ｍＬＰＢＳ
Ｂ中約５×１０⁶個のＤａｕｄｉ細胞の単細胞懸濁液を、６〜８週齢のＳＣＩＤ
マウスに静脈内注射した。３日後、マウスを、８匹の３グループに無作為化し、
そして０．２ｍＬのＰＢＳ、ＰＢＳ中３０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α（約
１２μｇのＩＦＮ−αを含む）、またはＰＢＳ中６０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦ
Ｎ−αを毎日腹腔内注射した。その結果を図２に示す。

【００９２】Ｄａｕｄｉ細胞の注射の２８日後まで、コントロールＰＢＳ（菱形）グループ
の全てのマウスは、後ろ脚の麻痺を発症した。このＰＢＳコントロールグループ
のマウスは、３８日目に死亡し始め、そして６１日までに、このコーントロール
グループの全てのマウスが死亡した。逆に、処置グループのマウスは、より長く
、かつ用量依存性様式で、生存した。３０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを受
けたグループ（×印）について、第１の死亡は７０日目に起こり、そして全ての
マウスが１３４日までに死亡した。６０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを受け
たグループ（三角）について、第１の死亡は１２６日目まで起こらず、そして４
匹が１５３日目に死亡した。残りのマウスは病気であり、安楽死させた。

【００９３】（実施例８．ＳＣＩＤマウスにおけるヒトバーカットリンパ腫の限局性増殖の
処置）このモデルにおいて、Ｄａｕｄｉ細胞を、皮下腫瘍としてＣ．Ｂ−１７ＳＣＩ
Ｄマウスにおいて増殖した（Ｇｈｅｔｉｅら、（１９９０）ＩＮＴ．Ｊ．ＣＡＮ
ＣＥＲ：４５〜４８１）。０．１ｍＬＰＢＳ中約６×１０⁶個のＤａｕｄｉ細
胞の単細胞懸濁液を、６〜８週齢のＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍サイズ
が２００〜４００ｍｍ³に達すると（これは、約４週間かかった）、処置を始め
た。マウスを８匹の３グループに無作為化し、そして各グループに、０．２ｍＬ
のＰＢＳ、ＰＢＳ中３０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α、またはＰＢＳ中６０
μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを一日６回腹腔内注射した。その結果を図３に
示す。腫瘍のサイズは、１週間に２回測定した。

【００９４】コントロールグループのマウスの腫瘍（菱形）は、３５日目までに、５６０２
ｍｍ³の平均容積（範囲：４３４３〜６５６６ｍｍ³）まで迅速に増殖し、その後
、このグループの全てのマウスを安楽死させた。対照的に、処置グループのマウ
スの腫瘍の増殖は、用量依存性様式で抑制された。３０μｇおよび６０μｇのｈ
ｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを受けたグループは、３５日目で、それぞれ、２１４お
よび１７０ｍｍ³の平均腫瘍容積を有し、これは、処置前の２６８および２６７
ｍｍ³より小さかった。実際に、３０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを受けた
グループの８匹のうち５匹、および６０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−αを受け
たグループの８匹のうち４匹において、皮下腫瘍が完全に収縮した。しかし、さ
らに処置を行わない場合、いくつかの腫瘍は回復し、そして増殖した。それにも
かかわらず、このグループの２匹のマウスは、実験が終了した２０５日まで、腫
瘍を有さないままであった。

【００９５】（実施例９．Ｆｃ−インターフェロン−αによる肝疾患の処置）肝疾患（例えば、肝炎または肝転移）は、インターフェロン−αまたはインタ
ーフェロン−α−Ｆｃより、Ｆｃ−インターフェロン−αでより有効に処置され
得ると考えられる。

【００９６】例えば、Ｆｃ−インターフェロン−αは、腫瘍細胞が肝臓に転移しているマウ
スモデルを処置する際に有効であり得ると考えられる。手術の約５分前に、０．
２ｍｌのＰＢＳ中、８０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジン
を腹腔内注射することによって、マウスを麻酔する。次いで、無菌性を保証する
ために、層流フード中で以下の工程を行う。各マウスの皮膚を、ベタジン（ｂｅ
ｔａｄｉｎｅ）およびエタノールで清潔にし、そして補充されていない１００μ
ｌのＲＰＭＩ１６４０培地中の腫瘍細胞（例えば、Ｄａｕｄｉ細胞）を、２７
ゲージ針を使用して、１分間掛けて、脾膜のしたに注射した。２分後、脾茎を、
４．０シルク縫合糸で結紮し、そして脾臓を取り出した。

【００９７】いくつかの細胞は、注射部位から肝臓に運ばれ、ここでこれらの細胞は転移生
腫瘍を形成し得る。次いで、転移性肝腫瘍を有するマウスをＦｃ−インターフェ
ロン−αで処置する。Ｆｃ−インターフェロン−αで処置したマウスは、等モル
量のインターフェロン−αまたはインターフェロン−α−Ｆｃ融合タンパク質で
処置したマウスに比べて、腫瘍増殖の有意な減少を示すと考えられる。

【００９８】さらに、Ｆｃ−インターフェロン−αの特定の効果は、Ｆｃ−インターフェロ
ン−αが濃縮されていない他の組織に局在化する障害の処置における効果より、
肝疾患の処置においてより明白であると考えられる。

【００９９】（等価物）本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形
態で具現化され得る。従って、上記の実施例は、本明細書中に記載される本発明
の限定ではなく、全ての例示の観点において考慮される。従って、本発明の範囲
は、上記の説明よりむしろ添付の特許請求の範囲により示され、従って、特許請
求の範囲と等しい意味および範囲内となる全ての変更がここに包含されることが
意図される。

【０１００】（参考文献の援用）本明細書中上記で参考とされる科学の論文および特許文献の各々の開示は、本
明細書中で参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明に従って構築された融合タンパク質の非限定的な例の
概略図である。

【図２】図２は、Ｄａｕｄｉ細胞の懸濁物を注射し、次いでｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮαで
処置したＳＣＩＤマウスの群についての生存曲線を示すグラフである。０日目に
、マウスに、Ｄａｕｄｉ細胞を注射した。３〜８日目に、８匹のマウスの群にＰ
ＢＳ（ひし形）、３０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α（十字形）、または６０
μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α（三角形）を注射した。

【図３】図３は、ｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮαで処置したＳＣＩＤマウスにおけるＤａｕｄ
ｉ細胞の皮下腫瘍の増殖速度を示すグラフである。処置の約４週間前に、マウス
にＤａｕｒｉ細胞を皮下注射した。注射したＤａｕｒｉ細胞が、増殖して２００
〜４００ｍｍ³の腫瘍を形成した時点で、マウスを８匹の群に分類し、そして６
日間、ＰＢＳ（ひし形）、ＰＢＳ中の３０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α（四
角形）、またはＰＢＳ中の６０μｇのｈｕＦｃ−ｈｕＩＦＮ−α（三角形）の注
射で処置した。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/16 Ｃ０７Ｋ 14/56 ４Ｈ０４５ 31/20 16/18 43/00 １１７ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/56 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 16/18 Ｃ１２Ｒ 1:91 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 37/66 ＺＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者スン，ヤーピンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02474，アーリントン，ブラットルドライブ８ (72)発明者ガイルズ，ステファンディー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 01741，カーライル，サンセットロード 159 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA23 BA44 CA04 CA07 DA02 EA02 GA11 4B064 AG09 AG26 CA10 CA19 CA21 CC24 DA01 4B065 AA90X AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA02 BA22 BA26 BA41 CA53 DA22 NA14 ZA752 ZB032 ZB332 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA75 ZB03 ZB33 4H045 AA10 AA11 BA20 BA41 CA30 CA40 DA16 DA75 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】融合タンパク質をコードする核酸分子であって、以下：（ａ）シグナル配列（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域；および（ｃ）インターフェロン−αを含む標的タンパク質配列を含み、ここで、該シグナル配列、該免疫グロブリンＦｃ領域および該標的タン
パク質配列が、連続的に５’→３’の方向にコードされる、核酸分子。
【請求項２】前記免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域を
含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域
および免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子
。
【請求項４】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域
および免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイ
ンおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンγ配列の一
部を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】前記免疫グロブリンγが、ヒト免疫グロブリンγ１である、
請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】哺乳動物細胞をトランスフェクトするための複製可能発現ベ
クターであって、該ベクターが請求項１に記載の核酸分子を含む、複製可能発現
ベクター。
【請求項９】前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載の
複製可能発現ベクター。
【請求項１０】請求項１に記載の核酸分子を保有する、哺乳動物細胞。
【請求項１１】アミノ酸末端からカルボン酸末端の方向で、免疫グロブリ
ンＦｃ領域およびインターフェロン−αを含む標的タンパク質を含む、融合タン
パク質。
【請求項１２】前記インターフェロン−αが、配列番号２、７または８〜
２１に記載されるアミノ酸配列、あるいはその種または対立遺伝子改変体を含む
、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】前記標的タンパク質が、ポリペプチドリンカーによって連
結される少なくとも２つのインターフェロン−α分子を含む、請求項１１に記載
の融合タンパク質。
【請求項１４】前記免疫グロブリンＦｃ領域を前記標的タンパク質に連結
するポリペプチドリンカーをさらに含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領
域および免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインを含む、請求項１１に記載の融合
タンパク質。
【請求項１６】前記重鎖定常領域ドメインが、ＣＨ３ドメインを含む、請
求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメ
インおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】共有結合を介して連結される請求項１１に記載の少なくと
も２つの融合タンパク質を含む、マルチマータンパク質。
【請求項１９】前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項１８に
記載のタンパク質。
【請求項２０】融合タンパク質を産生する方法であって、以下の工程：（ａ）請求項１０に記載の前記哺乳動物細胞を提供する工程；および（ｂ）該融合タンパク質を産生するために該哺乳動物細胞を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】前記融合タンパク質を回収するさらなる工程を包含する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記融合タンパク質を精製するさらなる工程を包含する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】前記免疫グロブリンＦｃ領域と前記標的タンパク質との間
に差し挟まれるタンパク質分解性切断部位において、該標的タンパク質から該免
疫グロブリンＦｃ領域を、タンパク質分解酵素を用いて切断するさらなる工程を
包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】インターフェロン−αの投与によって軽減される状態を処
置するための方法であって、請求項１に記載の前記核酸を該状態を有する哺乳動
物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】インターフェロン−αの投与によって軽減される状態を処
置するための方法であって、請求項８に記載の前記ベクターを該状態を有する哺
乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】インターフェロン−αの投与によって軽減される状態を処
置するための方法であって、請求項１１に記載の前記融合タンパク質を該状態を
有する哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】インターフェロン−αの投与によって軽減される状態を処
置するための方法であって、請求項１８に記載のタンパク質を該状態を有する哺
乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】前記状態が、肝臓障害である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】前記肝臓障害が、肝炎である、請求項２８に記載の方法。