ES2291205T3 - Expresion y exportacion de proteinas interferon alfa como proteinas de fusion fc. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que tiene una actividad biológica del interferón-alfa y que son capaces de concentrar el interferón-alfa en el hígado, dicha proteína de fusión que comprende en la dirección N a C-terminal una región Fc de inmunoglobulina que deriva del IgG1 o IgG3 y una proteína objetivo que comprende interferón-alfa.
Description
Expresión y exportación de proteínas interferón
alfa como proteínas de fusión Fc
La invención se relaciona con la expresión y la
secreción de alto nivel en células de mamífero de proteínas de
fusión Fc, que tienen la actividad biológica del interferón alfa, y
las varias formas y usos estructurales de éstos, especialmente su
capacidad para concentrar interferón alfa en el hígado.
La familia de las proteínas del interferón alfa
(IFN-alfa) ha probado ser útil en el tratamiento de
una variedad de enfermedades. Por ejemplo, los interferones alfa 2a
y 2b (nombres comerciales Roferon e Intron A, respectivamente) se
han utilizado en el tratamiento de hepatitis crónica B, C y D
(enfermedades virales del hígado que amenazan la vida), condiloma
acuminado (verrugas genitales), sarcoma de Kaposi relacionado con
SIDA, leucemia de tricoleucocito, melanoma maligno, carcinoma de
célula basal, mieloma múltiple, carcinoma de célula renal, herpes I
y II, varicela/herpes zoster, y micosis fúngica. También se ha
estudiado la eficacia de los regímenes de tratamiento que contienen
interferón alfa en cáncer de próstata y leucemia mielógena
crónica.
La familia del interferón alfa humano es la
familia de interferones más grande y más compleja. Los miembros de
la familia del interferón alfa tienen secuencias similares de
aminoácido que los definen como un grupo diferente de los otros
interferones; es decir, estas proteínas tienen típicamente por lo
menos 35% de identidad de aminoácido en un alineamiento de
secuencia de proteína típico. La base de datos SwissProt contiene
numerosas proteínas de interferón alfa humano, que incluye las
proteínas alternativamente denominadas interferón delta e
interferón omega. Estas proteínas típicamente se sintetizan con una
secuencia líder de aproximadamente 23 aminoácidos, y las proteínas
maduras tienen típicamente un peso molécula de aproximadamente 19
kD. En razón a que estas proteínas son muy similares, cuando se
obtiene el interferón alfa de una fuente humana u otro mamífero y
se purifica completamente, se obtiene a menudo una mezcla de
isoespecies con actividades biológicas variantes [Georgiadis et
al., Patente U.S. No. 4,732,683]. De manera similar, los cADN
que codifican estas proteínas tienen tamaños y propiedades
suficientemente similares que puede utilizar un simple conjunto de
procedimientos para manipularlas para propósitos de construcción de
plásmido. De acuerdo con esto, sería útil tener un método para
producir y purificar eficientemente unas especies simples de
interferón alfa proveniente de una fuente de mamífero.
En razón a su tamaño relativamente pequeño de
aproximadamente 19 kD (Lawn et al. (1981) PROC. NATL, ACAD.
Sci. U.S.A. 78: 5435), el interferón alfa puede ser filtrado por el
riñón. Sin embargo, cuando se filtra, el interferón alfa es
típicamente absorbido y metabolizado por las células tubulares del
riñón y, por lo tanto, no es usualmente excretado. De acuerdo a la
práctica clínica habitual, el interferón alfa formulado se
administra mediante inyección intramuscular, después de lo cual sus
niveles en el suero disminuyen con una semivida de aproximadamente
5 horas para el interferón alfa 2a y 2-3 horas para
el interferón alfa 2b (PHYSICIANS DESK REFERENCE, edición 50, 1996:
2145-2147 y 2364-2373).
Adicionalmente, en razón a su tamaño pequeño, se
requieren inyecciones múltiples frecuentes de interferón alfa
(usualmente diariamente o 3 veces/semana), y puede haber una
variación significativa en el nivel de interferón alfa en el
paciente. Además, las dosis inyectadas son grandes, varían desde
aproximadamente 50 microgramos por dosis para leucemia de
tricoleucocito hasta 300 microgramos por dosis para sarcoma de
Kaposi relacionado con SIDA. Los altos niveles de interferón alfa
en circulación pueden dar como resultado efectos colaterales
significativos, que incluyen toxicidades de la piel, neurológicas,
inmunes y endocrinas. Se cree que el tamaño pequeño del interferón
alfa le permite pasar a través de la barrera hematoencefálica e
ingresar al sistema nervioso central, incidiendo en algunos de los
efectos colaterales neurológicos. De acuerdo con esto, sería útil
incrementar la potencia y efectividad de la semivida del suero en
pacientes que son tratados con interferón
\hbox{alfa aunque al
mismo tiempo minimizar los efectos colaterales.}
La WO 97/24137 describe una proteína de fusión,
en donde el interferón alfa se fusiona al N-terminal
de una porción Fc de un anticuerpo. Esta molécula es considerada
adecuada para tratar hepatitis en razón a que ésta tiene un mayor
tiempo de retención en la vasculatura comparado con el interferón
alfa no fusionado. Sin embargo, como regla, tal construcción media
el ADCC o la fijación de complemento y, por lo tanto, se espera que
tenga una concentración relativamente baja en el hígado.
Dada la alta dosis, la baja eficacia, la corta
semivida del suero, las dificultades en la purificación, y los
efectos colaterales del interferón alfa, o los efectos indeseables
del interferón alfa para las construcciones, subsiste la necesidad
en la técnica de métodos para mejorar la producción y mejorar las
propiedades farmacológicas de este agente terapéutico.
La presente invención caracteriza métodos y
composiciones útiles para elaborar y utilizar proteínas de fusión
que contienen interferón alfa. En particular, la invención
caracteriza ácidos nucleicos, por ejemplo, las secuencias de ADN o
ARN, que codifican una proteína de fusión de inmunoglobulina
interferón alfa Fc, y métodos para expresar el ácido nucleico para
producir tales proteínas de fusión. Las proteínas de fusión pueden
facilitar el alto nivel de expresión del interferón alfa
biológicamente activo. Las proteínas de fusión son capaces de
concentrar el interferón alfa en el hígado. La proteína de fusión se
puede combinar con un portador farmacéuticamente aceptable antes de
la administración a un mamífero, por ejemplo, un humano.
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ADN o ARN, que codifican
una proteína de fusión de interferón alfa de la región Fc de
inmunoglobulina. La molécula de ácido nucleico codifica en serie en
una dirección 5' a 3', una secuencia de señal, una región Fc de
inmunoglobulina, y por lo menos una proteína objetivo, en donde la
proteína objetivo comprende el interferón alfa.
En una modalidad preferida, la región Fc de
inmunoglobulina comprende una región de pivoteo de inmunoglobulina
y comprende preferiblemente por lo menos un dominio de región pesada
constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio pesado
constante 2 (CH2) de inmunoglobulina, un dominio pesado constante 3
(CH3) de inmunoglobulina, y dependiendo del tipo de inmunoglobulina
utilizada para generar la región Fc, opcionalmente un dominio de
cadena pesada constante 4 (CH4) de inmunoglobulina. En una modalidad
más preferida, la región Fc de inmunoglobulina carece por lo menos
de un dominio pesado constante 1 (CH1) de inmunoglobulina. Aunque
las regiones Fc de inmunoglobulina se pueden basar en cualquier
clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, se
prefieren las regiones Fc de inmunoglobulina basadas en IgG.
El ácido nucleico de la invención se puede
incorporar en asociación operativa en un vector de expresión
replicable que puede ser entonces introducido en una célula
anfitriona de mamífero competente para producir la proteína de
fusión con base en interferón alfa. La proteína de fusión resultante
con base en interferón alfa se produce eficientemente y se secreta
de la célula anfitriona de mamífero. La proteína de fusión secretada
con base en el interferón alfa se puede recolectar del medio de
cultivo sin lisar la célula anfitriona de mamífero. El producto de
proteína se puede ensayar para actividad y/o purificar utilizando
los reactivos comunes según se desee, y/o dividir del compañero de
fusión, utilizando todas las técnicas convencionales.
Las proteínas de fusión de la presente invención
demuestran propiedades biológicas mejoradas sobre el interferón
alfa nativo tal como una solubilidad incrementada, una semivida de
suero prolongada y una unión incrementada a su receptor. Estas
propiedades pueden mejorar significativamente la eficacia clínica
del interferón alfa. En una modalidad preferida, la proteína de
fusión comprende, en una dirección N a C-terminal,
una región Fc de inmunoglobulina e interferón alfa, con otras
porciones, por ejemplo, un sitio de división proteolítico,
opcionalmente interpuesto entre la región Fc de inmunoglobulina y el
interferón alfa. La proteína de fusión resultante se sintetiza
preferiblemente en una célula que glicosila la región Fc a los
sitios de glicosilación normales, es decir, que existe usualmente
en anticuerpos plantilla.
En otra modalidad, la proteína de fusión puede
comprender una segunda proteína objetivo, por ejemplo, un interferón
alfa de longitud completa o un fragmento bioactivo de esta. En este
tipo de construcción la primera y segunda proteínas objetivo pueden
ser proteínas iguales o diferentes. La primera y la segunda
proteínas objetivo se pueden enlazar juntas, bien sea directamente
o por medio de un ligador de polipéptido. Alternativamente, ambas
proteínas objetivo se pueden ligar bien sea directamente o por vía
de un ligador de polipéptido, a la región Fc de inmunoglobulina. En
el último caso, la primera proteína objetivo se puede conectar a un
extremo N-terminal de la región Fc de
inmunoglobulina y la segunda proteína objetivo se puede conectar al
extremo C-terminal de la región Fc de
inmunoglobulina.
En otro aspecto, la invención proporciona
métodos para producir una proteína de fusión que comprende una
región Fc de inmunoglobulina y la proteína objetivo. El método
comprende las etapas de (a) suministrar una célula de mamífero que
contenga una molécula de ADN que codifica tal proteína de fusión,
con o sin una secuencia de señal, y (b) cultivar la célula de
mamífero para producir la proteína de fusión. La proteína de fusión
resultante puede ser entonces cosechada, replegada, si es necesario,
y purificada utilizando técnicas de purificación convencionales
bien conocidas y utilizadas en la técnica.
En aún otro aspecto, la invención proporciona
métodos para tratar condiciones aliviadas por el interferón alfa o
las variantes activas de éstos al administrar a un mamífero una
cantidad efectiva del interferón alfa producido por la construcción
de fusión de la invención.
En una modalidad preferida, las construcciones
de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de un
trastorno hepático, en donde el interferón alfa en virtud de la
región Fc de inmunoglobulina se localiza dentro del hígado. Las
construcciones de la invención pueden ser particularmente útiles en
el tratamiento de trastornos hepáticos que incluyen, pero no están
limitados a, enfermedades virales tales como la hepatitis B,
hepatitis C o hepatitis D, cáncer del hígado así como también otros
tipos de cáncer que involucran metástasis localizadas en el
hígado.
Los anteriores y otros objetos, características
y ventajas de la invención serán evidentes de la descripción,
dibujos, y reivindicaciones que siguen.
Las Figuras 1A-1C son
ilustraciones esquemáticas de ejemplos no limitantes de proteínas de
fusión construidas de acuerdo con la invención.
La Figura 2 es una gráfica que muestra las
curvas de supervivencia para los grupos de ratones SCID inyectados
con suspensiones de células Daudi y luego tratados con
huFc-hulFN-alfa. En el día 0, los
ratones se inyectaron con células Daudi. En los días
3-8, los grupos de ocho ratones se inyectaron en PBS
(diamantes), 30 \mug de
huFc-hulFN-alfa (cruces), o con 60
\mug de huFc-hulFN-alfa
(triángulos).
La Figura 3 es una gráfica que muestra las tasas
de crecimiento de los tumores subcutáneos de las células Daudi en
ratones SCID tratados con
huFc-hulFN-alfa. Aproximadamente
cuatro semanas antes del tratamiento, los ratones se inyectaron
subcutáneamente con células Daudi. Cuando las células Daudi
inyectadas habían crecido para formar tumores de
200-400 mm^{3}, los ratones fueron elegidos en
grupos de ocho y se trataron durante seis días con una inyección de
PBS (diamantes), 30 \mug de
huFc-hulFN-alfa en PBS (cuadrados),
o con 60 \mug de huFc-hulFN-alfa
en PBS (triángulos).
Muchas condiciones se pueden aliviar mediante la
administración del interferón-alfa. Por ejemplo,
como se discutió previamente, los interferones alfa 2a y 2b
(nombres comerciales Roferon e Intron A, respectivamente) son
útiles en el tratamiento de hepatitis B, C y D crónica, condiloma
acuminado (verrugas genitales), sarcoma de Kaposi relacionado con
SIDA, leucemia de tricoleucocito, melanoma maligno, carcinoma de
célula basal, mieloma múltiple, carcinoma de célula renal, herpes I
y II, varicela/herpes zoster, y micosis fúngica. Adicionalmente, se
han desarrollado estudios para evaluar la eficacia del
interferón-alfa en el tratamiento de cáncer de
próstata y leucemia mielógena crónica.
Para el tratamiento de la hepatitis, por
ejemplo, puede ser particularmente útil tener una forma de
interferón-alfa que se concentre en el hígado. De
esta manera, se puede minimizar la concentración del
interferón-alfa en otros tejidos, reduciendo por lo
tanto los efectos colaterales. El tejido hepático es el sitio
principal para la remoción de los complejos inmunes solubles, y los
receptores Fc son abundantes en macrófagos hepáticos (células
Kupffer)(Benacerraf, B. et al. (1959) J. IMMUNOL. 82: 131;
Paul, W.E. (1993) FUNDAMENTALS OF IMMUNOLOGY, 3ra ed. Cap.
5:113-116). De acuerdo con esto al fusionar el
interferón-alfa a una región Fc de inmunoglobulina,
la molécula de interferón-alfa se puede apuntar
preferiblemente al tejido hepático con relación a la misma molécula
de interferón-alfa a la que le falta la región Fc de
inmunoglobulina. El tipo IgG del anticuerpo que tiene la afinidad
más alta para los receptores Fc es IgG1. Sin embargo, en contraste,
el IgG4, por ejemplo, tiene una afinidad inferior a aproximadamente
10 veces para el receptor gama Fc I (Anderson y Abraham (1980) J.
IMMUNOL. 125:2735; Woof et al. (1986) MOL. IMMUNOL. 23:319).
El Fc-gama 1 proveniente del IgG1, cuando se coloca
en el terminal C de un ligando, puede mediar la citotoxicidad
mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) contra las
células que expresan un receptor para ese ligando. Además, el
Fc-gama 1, cuando está presente en el terminal C de
un ligando, puede mediar la unión de C1q y la fijación de
complemento dirigida contra la células que expresan un receptor
para ese ligando.
En contraste al IgG1, el IgG4 no fija
efectivamente el complemento. Esto ha conducido a la propuesta de
que el interferón-alfa N-terminal
se podría fusionar a la región Fc C-terminal desde
el IgG4 (Chang, T.W. et al., Patente U.S. No. 5,723,125).
Sin embargo, cuando la región Fc del IgG4 se separa de la región
Fab, el Fc del IgG4 fija el complemento así como también la región
Fc del IgG1 (Isenman, D.E. et al. (1975) J. IMMUNOL.
114:1726). Con base en este resultado y el hecho de que las
secuencias Fc del IgG1 y el IgG4 son muy similares, sin querer
estar ligados por ninguna teoría, se contempla que la región Fab del
IgG4 bloquea estéricamente la unión C 1 q y la fijación de
complemento porque la región de pivoteo que conecta las regiones
IgG4 Fab y Fc es más corta que el pivoteo del IgG1. Si la región
Fab grande, con masa del IgG4 se reemplaza por una molécula pequeña,
tal como el interferón-alfa, y el
interferón-alfa y la región Fc se conectan por un
enlazador flexible, se contempla que tal fusión
interferón-alfa Fc gama 4 fijaría el complemento
cunado se une a las células que llevan los receptores del
interferón-alfa.
El efecto citotóxico debido a la fusión de una
citoquina N-terminal y una región Fc
C-terminal es bien conocido. Por ejemplo, la fusión
de la citoquina
interleuquin-2(IL-2) a una
región Fc crea una molécula que es capaz de fijar el complemento y
causar la lisis de las células que llevan el receptor
IL-2 (Landolfi, N.F., Patente U.S. No.
5,349,053).
Las fusiones en las cuales una región Fc se
coloca en el N-terminal de un ligando (denominada
"inmunofusiones" o fusiones "Fc-X", donde
X es un ligando tal como el interferón-alfa) tienen
un número de propiedades biológicas distintivas, ventajosas (Lo
et al., Patentes U.S. Nos. 5,726,044 y 5,541,087; Lo et
al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495). En particular, tales
proteínas de fusión pueden aún unirse a los receptores Fc relevantes
sobre las superficies celulares. Sin embargo, cuando el ligando se
une a su receptor sobre una superficie de la célula, la orientación
de la región Fc se altera y las secuencias que median el ADCC y la
fijación de complemento parece ser ocluida. Como resultado, la
región Fc en una molécula Fc-X no media el ADCC o la
fijación de complemento efectivamente. Así, las fusiones
Fc-X se espera que tengan las virtudes de
incrementar la semivida del suero y la concentración relativa en el
hígado, con pocos efectos deletéreos provenientes del ADCC y de la
fijación de complemento.
Una característica de las construcciones
Fc-X de la invención es concentrar la proteína
objetivo, en este caso el interferón-alfa, en el
hígado. La región Fc proveniente de las cadenas gama1 y gama3
muestra la afinidad más alta para el receptor Fc, con la cadena
gama4 mostrando una afinidad reducida y la cadena gama2 mostrando
una afinidad extremadamente baja al receptor Fc. De acuerdo con
esto, las regiones Fc derivadas de las cadenas gama1 o gama3 se
utilizan preferiblemente en las construcciones Fc-X
de la invención porque ellas tienen las afinidades más altas para
los receptores Fc y así pueden apuntar al
interferón-alfa preferencialmente a los tejidos
hepáticos. Esto es en contraste a la proteína X-Fc,
por ejemplo, una proteína de fusión de
interferón-alfa Fc donde la ventaja potencial de la
concentración en el hígado se debe balancear por el hecho de que
esta proteína de fusión puede mediar las funciones efectuadoras, a
saber la fijación de complemento y el ADCC, dirigido contra las
células que llevan los receptores para el
interferón-alfa.
La invención suministra así secuencias de ácido
nucleico que codifican unas secuencias de ácido nucleico que define
las proteínas de fusión que comprenden una región Fc de
inmunoglobulina y por lo menos una proteína objetivo, denominada
aquí como interferón-alfa. Tres modalidades de
ejemplo de construcciones de proteína con una modalidad de la
invención se ilustran en los dibujos como Figuras
1A-1C. En razón a que se prefieren las
construcciones diméricas, todas se ilustran como dímeros reticulados
por un par de uniones disulfuro entre cisteínas en
sub-unidades adyacentes. En los dibujos, las uniones
disulfuro se describen como enlazando juntas las dos regiones Fc de
cadena pesada de inmunoglobulina por vía de una región de pivoteo de
inmunoglobulina dentro de cada una de las cadenas pesadas, y así
son características de formas nativas de estas moléculas. Aunque
las construcciones que incluyen la región de pivoteo del Fc se
prefieren y se han mostrado prometedoras como agentes terapéuticos,
la invención contempla que la reticulación en otras posiciones se
puede escoger como se desee. Adicionalmente, bajo algunas
circunstancias, los dímeros o multímeros útiles en la práctica de
la invención se pueden producir mediante una asociación no
covalente, por ejemplo, mediante interacción hidrófoba. En razón a
que las construcciones homodiméricas son modalidades importantes de
la invención, los dibujos ilustran tales construcciones. Se debe
apreciar, sin embargo, que las estructuras heterodiméricas también
son útiles en la práctica de la invención.
La Figura 1 A ilustra una construcción dimérica
producida de acuerdo con los principios establecidos aquí (ver, por
ejemplo, Ejemplo 1). Cada monómero del homodímero comprende una
región Fc 1 de inmunoglobulina que incluye una región de pivoteo,
un dominio CH2 y un dominio CH3. Unido directamente, es decir, por
vía de una unión de polipéptido, a la terminal C de la región Fc
está el interferón-alfa 2. Se debe entender que la
región Fc se puede unir a una proteína objetivo por vía de un
ligador de polipéptido (no mostrado).
Las Figuras 1B y 1C describen las construcciones
de proteína de la invención que incluyen como una proteína objetivo
varias proteínas de interferón-alfa dispuestas en
tándem y conectadas por un ligador. En la Figura 1B, la proteína
objetivo comprende interferón-alfa 2 de longitud
completa, un ligador de polipéptido hecho de residuos de glicina y
serina 4, y una variante activa del interferón-alfa
3. La Figura 1C difiere de la construcción de la Figura 1B en que
la mayoría del dominio de proteína con terminal C comprende una
segunda, copia de longitud completa del
interferón-alfa 2. Aunque las Figuras
1A-1C representan las construcciones
Fc-X, donde X es la proteína objetivo, se contempla
que las proteínas útiles de la invención también se pueden
describir por la fórmula X-Fc-X, en
donde las X pueden representar las mismas o diferentes proteínas
objetivo.
Como se utiliza aquí, el término "ligador de
polipéptido" se entiende que significa una secuencia de
polipéptido que puede enlazar dos proteínas que naturalmente no
están ligadas juntas. El ligador de polipéptido comprende
preferiblemente una pluralidad de aminoácidos tal como alanina,
glicina y serina o combinaciones de tales aminoácidos.
Preferiblemente, el ligador de polipéptido comprende una serie de
péptidos de glicina y serina aproximadamente 10-15
residuos en longitud. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. No.
5,258,698. Se contempla, sin embargo, que la longitud del ligador
óptimo y la composición del aminoácido se pueden determinar mediante
experimentación de rutina.
Como se utiliza aquí, el término
"multivalente" se refiere a la molécula recombinante que
incorpora dos o más segmentos biológicamente activos. Los
fragmentos de proteína que forman la molécula multivalente
opcionalmente se pueden ligar a través de un ligador de polipéptido
que une las partes constituyentes y permite que cada uno funcione
independientemente.
Como se utiliza aquí, el término
"bivalente" se refiere a una molécula recombinante multivalente
que tiene la configuración Fc-X o
X-Fc, donde X es una molécula objetivo. Las regiones
Fc de inmunoglobulina pueden asociarse, por ejemplo, vía uniones
disulfuro intercadena, para producir el tipo de construcciones
mostradas en las Figs. 1A. Si la construcción de fusión de la
invención tiene la configuración
Fc-X-X, la molécula Fc resultante
se muestra en la Fig. 1C. Las dos proteínas objetivo se puede ligar
a través de un ligador de péptido. Las construcciones del tipo
mostrado en la Fig. 1A puede incrementar la aparente afinidad de
unión entre la molécula objetivo y su receptor.
Como se utiliza aquí, el término
"multimérico" se refiere a la asociación estable de dos o más
cadenas de polipéptido covalentemente, por ejemplo, por medio de
una interacción covalente, por ejemplo, una unión disulfuro, o no
covalentemente, por ejemplo, mediante una interacción hidrófoba. El
término multímero pretende comprender ambos homomultímeros, en
donde las sub-unidades son las mismas, así como
también, heteromultímeros, en donde las
sub-unidades son diferentes.
Como se utiliza aquí, el término "dimérico"
se refiere a una molécula multimérica específica donde dos cadenas
de polipéptido están establemente asociadas a través de
interacciones covalentes o no covalentes. Tales construcciones se
muestran esquemáticamente en la Fig. 1A. Se debe entender que la
región Fc de inmunoglobulina que incluye por lo menos una porción
de la región de pivoteo, un dominio CH2 y un dominio CH3, forma
típicamente un dímero. Muchos ligandos de proteína son conocidos
por unirse a sus receptores como un dímero. Si un ligando de
proteína X se dimeriza naturalmente, la porción X en una molécula
Fc-X se dimerizará en mucha mayor proporción, en
razón a que el proceso de dimerización es dependiente de la
concentración. La proximidad física de las dos porciones X
conectadas por Fc haría la dimerización un proceso intramolecular,
cambiando mayormente el equilibrio a favor del dímero y mejorando
su unión al receptor.
Como se utiliza aquí, el término
"interferón-alfa" se entiende que significa no
solamente el interferón-alfa maduro de longitud
completa, por ejemplo, interferón-alfa humano 1 (SEQ
ID NO:8), interferón-alfa 2 humano (SEQ ID NO:9),
interferón-alfa 4 humano (SEQ ID NO:10),
interferón-alfa 5 humano (SEQ ID NO:11),
interferón-alfa 6 humano (SEQ ID NO:12),
interferón-alfa 7 humano (SEQ ID NO:13),
interferón-alfa 8 humano (SEQ ID NO:14),
interferón-alfa 10 humano (SEQ ID NO:15),
interferón-alfa 14 humano (SEQ ID NO:16),
interferón-alfa humano 16 (SEQ ID NO:17),
interferón-alfa humano 17 (SEQ ID NO:18),
interferón-alfa humano 21 (SEQ ID NO:19), interferón
delta-1 (SEQ ID NO:20), II,1 (interferón
omega-1) (SEQ ID NO:21), e
interferón-alfa de ratón 1 (SEQ ID NO:22),
interferón-alfa de ratón 2 (SEQ ID NO:23),
interferón-alfa de ratón 4 (SEQ ID NO:24),
interferón-alfa de ratón 5 (SEQ ID NO:25),
interferón-alfa de ratón 6 (SEQ ID NO:26),
interferón-alfa de ratón 7 (SEQ ID NO:27),
interferón-alfa de ratón 8 (SEQ ID NO:28), e
interferón-alfa de ratón 9 (SEQ ID NO:29), sino
también las variantes y los fragmentos bioactivos de éstos. Las
secuencias conocidas del interferón-alfa se pueden
encontrar en el GenBank.
El término fragmento bioactivo se refiere a
cualquier fragmento de proteína de interferón-alfa
que tenga por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 70%, y
más preferiblemente por lo menos 90% de la actividad biológica de
la proteína de interferón-alfa humano plantilla de
la SEQ ID NO: 2, como se determinó utilizando el ensayo de
inhibición de proliferación celular del Ejemplo 4. El término
variantes incluye especies y variantes alélicas, así como también
otras variantes de ocurrencia natural o de ocurrencia no natural,
por ejemplo, generadas por protocolos de ingeniería genética, que
son por lo menos 70% similares o 60% idénticas, más preferiblemente
por lo menos 75% similares o 65% idénticas, y más preferiblemente
por lo menos 80% similares o 70% idénticas a la proteína de
interferón-alfa humano madura descrita en la SEQ ID
NO: 2.
Para determinar si un polipéptido candidato
tiene la similitud o identidad porcentual de requisito a un
polipéptido de referencia, la secuencia de aminoácido de candidato
y la secuencia de aminoácido de referencia son alineadas primero
utilizando el algoritmo de programación dinámico descrito en Smith y
Waterman (1981) J. MOL. BIOL. 147: 195-197, en
combinación con la matriz de sustitución BLOSUM62 descrita en la
Figura 2 de Henikoff y Henikoff (1992), "Matrices de sustitución
de aminoácido proveniente de bloques de proteínas", PROC. NATL.
ACAD. SCI. USA 89:10915-10919. Para la presente
invención, un valor apropiado para la pena de inserción de espacio
es -12, y un valor apropiado para la pena de extensión de espacio
es -4. Los programas de computadora que desarrolla los
alineamientos utilizando el algoritmo de Smith y Waterman y la
matriz BLOSUM62, tal como la suite del programa GCG (Oxford
Molecular Group, Oxford, Inglaterra), están comercialmente
disponibles y ampliamente utilizados por aquellos expertos en la
técnica.
Una vez que se hace el alineamiento entre la
secuencia candidato y la de referencia, una calificación de
similitud porcentual se puede calcular. Los aminoácidos
individuales de cada secuencia se comparan de manera secuencial de
acuerdo a su similitud uno con el otro. Si el valor en la matriz
BLOSUM62 corresponde a los dos aminoácidos alineados es cero o un
número negativo, la calificación de similitud a manera de pares es
cero; de otra manera la calificación de similitud a manera de pares
es 1.0. La calificación de similitud bruta es la suma de las
calificaciones de similitud a manera de pares de los aminoácidos
alineados. La calificación bruta es entonces normalizada al
dividirla por el número de aminoácidos en la más pequeña de las
secuencias de candidato o de referencia. La calificación bruta
normalizada es la similitud porcentual. Alternativamente, para
calcular cualquier identidad porcentual, los aminoácidos alineados
para cada secuencia de nuevo se comparan secuencialmente. Si los
aminoácidos no son idénticos, la calificación de identidad de manera
pareada es cero; de otra manera la calificación de identidad a
manera de par es 1.0. La calificación de identidad bruta es la suma
de los aminoácidos alineados idénticos. La calificación bruta es
entonces normalizada al dividirla por el número de aminoácidos en
la más pequeña de las secuencias candidato o de referencia. La
calificación bruta normalizada es la identidad porcentual. Las
inserciones y supresiones se ignoran para los propósitos de calcular
la similitud y la identidad porcentual. De acuerdo con esto, las
penas de espacio no son utilizadas en este cálculo, aunque ellas se
utilizan en el alineamiento inicial.
Las variantes también pueden incluir otras
proteínas mutantes de interferón-alfa que tengan una
actividad similar al interferón-alfa. Las especies
y variantes alélicas, incluyen, pero no están limitadas a las
secuencias de interferón-alfa humano y de ratón.
Las variantes de interferón-alfa humano se muestran
en la SEQ ID NO: 8-21, y las variantes de
interferón-alfa de ratón se muestran en la SEQ ID
NO: 22-29.
Adicionalmente, las secuencias de
interferón-alfa pueden comprender una porción o toda
la secuencia de consenso establecida en la SEQ ID NO: 7, en donde
el interferón-alfa tiene por lo menos 50%, más
preferiblemente por lo menos 70%, y más preferiblemente por lo
menos 90% de la actividad biológica del
interferón-alfa humano maduro de la SEQ ID NO: 2,
como se determinó utilizando el ensayo de inhibición de
proliferación de célula del Ejemplo 4.
Estas proteínas tienen unas propiedades de
purificación muy similares y otras propiedades biológicas. En
particular, la manipulación del ADN, la expresión de la proteína de
fusión, y las propiedades de purificación de la proteína de fusión
de las proteínas del interferón-alfa Fc son
extremadamente similares. Por ejemplo, el
interferón-alfa humano 2a y el
interferón-alfa humano 2b difieren solamente por un
aminoácido, mientras que el interferón-alfa 2a
tiene un residuo de lisina en la misma posición que el
interferón-alfa 2b tiene un residuo de arginina. El
interferón-alfa humano 2a y el
interferón-alfa humano 2b tienen propiedades
extremadamente similares y son intercambiables para todos los
propósitos conocidos.
La estructura tridimensional del
interferón-alfa se ha resuelto mediante
cristalografía de rayos X (Ramaswamy et al. (1986) STRUCTURE
4: 1453). Las secuencias de las proteínas del
interferón-alfa son tan similares que la estructura
determinada se considera como una estructura para la familia
completa de proteínas. La estructura tridimensional del
interferón-alfa, como aquella del
interferón-beta, es un dímero con un ión zinc en la
interfaz del dímero. Sin embargo, en solución, el
interferón-alfa se comporta como un monómero. Se ha
propuesto, por analogía con la citoquina IL-6 y
otros ligandos de proteína, que el interferón-alfa
se puede dimerizar luego de la unión del receptor (Radhakrishnan,
R. et al. (1996) STRUCTURE 4: 1453: Karpusas. M. et
al. (1997) PROC. NAT. ACAD. SCI. USA 94: 11813).
La dimerización de un ligando puede incrementar
la afinidad de unión evidente entre el ligando y su receptor. Por
ejemplo, si una porción de interferón-alfa de una
proteína de fusión de interferón-alfa Fc se puede
unir a un receptor sobre una célula sobre con una cierta afinidad,
la segunda porción de interferón-alfa de la misma
proteína de fusión de interferón-alfa Fc puede
unirse a un segundo receptor en la misma célula con una avidez
mucho mayor (afinidad evidente). Esto puede ocurrir en razón a la
proximidad física de la segunda porción del
interferón-alfa al receptor después de que la
primera porción del interferón-alfa ya está unida.
En el caso de una unión de anticuerpo a un antígeno, la afinidad
aparente se puede incrementar por lo menos diez mil veces, es
decir, 10^{4}. Cada subunidad de proteína, es decir, "X",
tiene su propia función independiente de tal forma que en una
molécula multivalente, las funciones de las subunidades de proteína
pueden ser aditivas o sinérgicas. Así, la fusión de la molécula Fc
normalmente dimérica al interferón-alfa puede
incrementar la actividad del interferón-alfa. De
acuerdo con esto, las construcciones del tipo mostrado en la Figura
1A puede incrementar la afinidad de unión evidente entre el
interferón-alfa y su
receptor.
receptor.
Las proteínas objetivo descritas aquí se
expresan como proteínas de fusión con una región Fc de una
inmunoglobulina. Como es conocido, cada región constante de cadena
pesada de inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los
dominios se denominan secuencialmente como sigue:
CH1-pivoteo- CH2-CH3(-CH4). Las
secuencias de ADN de los dominios de cadena pesada tienen homología
cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo, el
dominio CH2 de IgG es homólogo al dominio CH2 de un IgA e IgD, y al
dominio CH3 de IgM e IgE.
Como se utiliza aquí, el término "región Fc de
inmunoglobulina" se entiende que significa una porción carboxilo
terminal de una región constante de cadena de inmunoglobulina,
preferiblemente una región constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, o una porción de éstas. Por ejemplo, una región Fc
de inmunoglobulina puede comprender 1) un dominio CH1, un dominio
CH2, y un dominio CH3, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un
dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un domino CH3, o
5) una combinación de dos o más dominios y una región de pivoteo de
inmunoglobulina. En una modalidad preferida la región Fc de
inmunoglobulina comprende por lo menos una región de pivoteo de
inmunoglobulina un dominio CH2 y un dominio CH3, y preferiblemente
carece del dominio CH1.
La clase preferida habitualmente de
inmunoglobulina de la cual se deriva la región constante de cadena
pesada es IgG (Ig\gamma) (las subclases \gamma 1, 2, 3, o 4).
Las secuencias de nucleótido y de aminoácido del Fc
\gamma-1 humano se establecen en la SEQ ID NOS: 3
y 4. Se pueden utilizar otras clases de inmunoglobulina, IgA
(Ig\alpha), IgD (Ig\delta), IgE (Ig\varepsilon) e IgM
(Ig\mu). La elección de las regiones constantes de cadena pesada
de inmunoglobulina apropiada se discute en detalle en las Patentes
U.S. Nos. 5,541,087, y 5,726,044. La elección de las secuencias de
región constante de cadena pesada de inmunoglobulina particulares
de ciertas clases y subclases de inmunoglobulina para lograr un
resultado particular se considera que están dentro del nivel del
experto. La porción de la construcción de ADN que codifica la región
Fc de inmunoglobulina comprende preferiblemente por lo menos una
porción de un dominio de pivoteo, y preferiblemente por lo menos
una porción de un dominio CH_{3} del Fc\gamma o los dominios
homólogos en cualquiera del IgA, IgD, o IgM.
Dependiendo de la aplicación, los genes de la
región constante de las especies diferentes de la humana, por
ejemplo, de ratón o de rata se pueden utilizar. La región Fc de
inmunoglobulina utilizada como un compañero de fusión en la
construcción del ADN generalmente puede formar cualquiera de las
especies de mamífero. Donde es indeseable elicitar una respuesta
inmune en la célula anfitriona o animal contra la región Fc, la
región Fc se puede derivar de las mismas especies que la célula
anfitriona o animal. Por ejemplo, una región Fc de inmunoglobulina
humana se puede utilizar cuando el animal anfitrión o la célula es
humana; de manera similar, una región Fc de inmunoglobulina de
murino se puede utilizar donde el animal anfitrión o la célula será
un ratón.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican,
y las secuencias de aminoácido que definen una región Fc de
inmunoglobulina humana útiles en la práctica de la invención se
establecen en la SEQ ID NO: 3 y 4. Sin embargo, se contempla que
otras secuencias de la región Fc de inmunoglobulina útiles en la
práctica de la invención se pueden encontrar, por ejemplo, por
aquellas codificadas por las secuencias de nucleótidos descritas en
las bases de datos Genbank y/o EMBL, por ejemplo, AF045536.1
(Macaca fuscicularis), AF045537.1 (Macaca mulatta),
AB016710 (Felix catus), K00752 (Oryctolagus
cuniculus), U03780 (Sus scrofa), Z48947 (Camelus
dromedarius), X62916 (Bos taurus), L07789 (Mustela
visión), X69797 (Ovis aries), U17166 (Cricetulus
migratorius), X07189 (Rattus rattus), AF57619.1
(Trichosurus vulpecula), o AF035195 (Monodelphis
domestica), cuyas descripciones se incorporan aquí como
referencia.
Adicionalmente, se contempla que la sustitución
o supresión de los aminoácidos dentro de las regiones constantes de
cadena pesada de inmunoglobulina pueden ser útiles en la práctica de
la invención. Un ejemplo puede incluir introducir sustituciones de
aminoácido en la región CH2 superior para crear una variante Fc con
afinidad reducida para los receptores Fc (Cole et al. (1997)
J. IMMUNOL. 159:3613). Una persona medianamente versada en la
técnica puede preparar tales construcciones utilizando técnicas de
biología molecular bien conocidas.
El uso de la secuencia de la región Fc como la
Fc\gammal humano tiene varias ventajas. Por ejemplo, si la
proteína de fusión Fc va a ser utilizada como un biofarmacéutico, el
dominio Fc\gammal puede conferir actividades de función
efectuadora a la proteína de fusión. Las actividades de función
efectuadora incluyen las actividades biológicas tales como la
transferencia de placenta y una semivida del suero incrementada. La
región Fc de inmunoglobulina también suministra para la detección
mediante ELISA anti-Fc y la purificación a través de
la unión de la proteína A de Staphylococcus aureus
("Proteína A"). En ciertas aplicaciones, sin embargo, puede
ser deseable suprimir las funciones efectuadoras específicas de la
región Fc de inmunoglobulina, tal como la unión del receptor Fc y/o
la fijación de complemento.
Se entiende que la presente invención explota
las metodologías de ADN recombinantes convencionales para generar
las proteínas de fusión Fc útiles en la práctica de la invención.
Las construcciones de la fusión Fc se generan preferiblemente a un
nivel de ADN, y los ADN resultantes integrados en vectores de
expresión, y expresados para producir las proteínas de fusión de la
invención. Como se utiliza aquí, el término "vector" se
entiende que significa cualquier ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótido competente a ser incorporada en una célula
anfitriona y a ser recombinada con e integrada en el genoma de
célula anfitriona, o para replicarse autónomamente como un episoma.
Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos,
fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores virales y similares.
Los ejemplos no limitantes de un vector viral incluyen un
retrovirus, un adenovirus y un virus adeno asociado. Como se
utiliza aquí, el término "expresión de gen" o "expresión"
de una proteína objetivo, se entiende que significa la trascripción
de una secuencia de ADN, la traducción del transcripto de mARN, y
la secreción de un producto de proteína de fusión Fc.
Un vector de expresión útil es el pdCs (Lo et
al. (1988) PROTEIN ENGINEERING 11:495, en la cual la
trascripción del gen Fc-X utiliza el
mejorador/promotor del citomegalovirus humano y la señal de
poliadenilación SV40. La secuencia del mejorador y el promotor del
citomegalovirus humano utilizada se derivó de los nucleótidos -601
a +7 de la secuencia suministrada en Boshart et al. (1985)
CELL 41:521. El vector también contiene el gen de dihidrofolato
reductasa mutante como un marcador de selección (Simonsen y Levinson
(1983) PROC. NAT. ACAD. Sci. USA 80:2495).
Una célula anfitriona apropiada se puede
transformar o transfectar con la secuencia de ADN de la invención,
y se utiliza para la expresión y/o secreción de la proteína
objetivo. Habitualmente las células anfitriones preferidas para uso
en la invención incluyen células de hibridoma inmortales, células de
mieloma NS/O, las células 293, las células de ovario de hámster
Chino, las células HELA, y las células COS.
Un sistema de expresión que se ha utilizado para
producir la expresión de alto nivel de las proteínas de fusión en
células de mamífero es una construcción de ADN que codifica, en la
dirección 5' a 3', un cassette de secreción, que incluye una
secuencia de señal y una región Fc de inmunoglobulina, y una
proteína objetivo. Varias proteínas objetivas se han expresado
exitosamente en tal sistema e incluye, por ejemplo, IL2, CD26, Tat,
Rev, OSF-2, \betaIG-H3, Receptor
IgE, PSMA, y gp 120. Estas construcciones de expresión se describen
en las Patentes U.S. Nos. 5,541,087 y 5,726,044 de Lo et
al.
Como se utiliza aquí, el término "secuencia de
señal" se entiende que significa un segmento que dirige la
secreción de la proteína de fusión del
interferón-alfa y posteriormente se divide siguiendo
la traducción en la célula anfitriona. La secuencia de señal de la
invención es un polinucleótido que codifica una secuencia de
aminoácido que inicia el transporte de una proteína a través de la
membrana del retículo endoplasmático. Las secuencias de señal que
son útiles en la invención incluyen secuencias de señal de cadena
ligera de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo 14.18 (Gillies et.
al. (1989) J. IMMUNOL. METH. 125:191), las secuencias de señal
de cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, la secuencia de señal
de cadena pesada de anticuerpo MOPC141 (Sakano et al. (1980)
NATURE 286:5774), y cualquier otras secuencias de señal que son
conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Watson (1984) NUCLEIC
ACIDS RESEARCH 12:5145).
Las secuencias de señal han sido bien
caracterizadas en la técnica y son conocidas típicamente por
contener 16 a 30 residuos de aminoácido, y pueden contener más o
menos residuos de aminoácido. Un péptido de señal típica consiste
de tres regiones: una región N-terminal básica, una
región hidrófoba central, y una región terminal C más polar. La
región hidrófoba central contiene 4 a 12 residuos hidrófobos que
anclan el péptido de señal a través de la bicapa lípida de membrana
durante el transporte del polipéptido naciente. Luego de la
iniciación, el péptido de señal se divide usualmente dentro del
lúmen del retículo endoplasmático mediante enzimas celulares
conocidas como peptidazas de señal. Los sitios de división
potenciales del péptido de señal generalmente siguen la "regla
(-3,-1)". Así un péptido de señal típico tiene residuos de
aminoácido pequeños, neutros en las posiciones -1 y -3 y carecen de
residuos de prolina en esta región. La peptidaza de señal dividirá
tal péptido de señal entre los aminoácidos -1 y +1. Así, la
secuencia de señal se puede dividir del amino terminal de la
proteína de fusión durante la secreción. Esto da como resultado la
secreción de una proteína de fusión Fc que consiste de la región Fc
de inmunoglobulina y la proteína objetivo. Una discusión detallada
de las secuencias de péptido de señal se suministra por von Heijne
(1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14: 4683.
Como sería evidente para un experto en la
técnica, la adecuabilidad de una secuencia de señal particular para
el uso en el cassette de secreción puede requerir alguna
experimentación de rutina. Tal experimentación incluirá determinar
la capacidad de la secuencia de señal para dirigir la secreción de
una proteína de fusión Fc y también una determinación de la
configuración óptima, genómica o de cADN, de la secuencia a ser
utilizada con el fin de lograr secreción eficiente de las proteínas
de fusión Fc. Adicionalmente, un experto en la técnica es capaz de
crear un péptido de señal sintético siguiendo las reglas presentadas
por von Heijne, referenciadas anteriormente, y ensayando para la
eficacia de tal secuencia de señal sintética mediante
experimentación de rutina. Una secuencia de señal también se puede
referenciar como un "péptido de señal", "secuencia líder",
o "péptidos líderes".
La fusión de la secuencia de señal y la región
Fc de inmunoglobulina es algunas veces denominada aquí como
cassette de secreción. Un cassette de secreción de ejemplo útil en
la práctica de la invención es un polinucleótido que codifica, en
una dirección 5' a 3', una secuencia de señal de un gen de cadena
ligera de inmunoglobulina y una región Fc\gamma1 del gen
\gamma1 de inmunoglobulina humana. La región Fc\gamma1 del gen
Fc\gamma1 de inmunoglobulina incluye preferiblemente por lo menos
una porción del domino de pivoteo de inmunoglobulina y por lo menos
el dominio CH3, o más preferiblemente por lo menos una porción del
domino de pivoteo, el dominio CH2 y el dominio CH3. Como se utiliza
aquí, la "porción" de la región de pivoteo de inmunoglobulina
se entiende que significa una porción del pivoteo de
inmunoglobulina que contiene por lo menos uno, preferiblemente dos
residuos de cisteína capaces de formar uniones disulfuro
intercadena. El ADN que codifica el cassette de secreción puede
estar en su configuración genómica o en su configuración de cADN.
Bajo ciertas circunstancias, puede ser ventajoso producir la región
Fc proveniente de las secuencias de cadena pesada Fc\gamma2 de
inmunoglobulina humana. Aunque las fusiones Fc basadas en las
secuencias \gamma1 y \gamma2 de inmunoglobulina humana se
comportan de manera similar en ratones, las fusiones Fc basadas en
las secuencias \gamma2 pueden desplegar farmacocinéticas
superiores en humanos.
Además, la sustitución o la supresión de las
construcciones de estas regiones constantes, en las cuales uno o
más residuos de aminoácido de los dominios de región constante se
sustituyen o se suprimen también serían útiles. Un ejemplo sería
introducir las sustituciones de aminoácido en la región CH2 superior
para crear una variante de Fc con una afinidad reducida para los
receptores Fc (Cole et al. (1997) J. IMMUNOL. 159: 3613). Un
experto en la técnica puede preparar tales construcciones utilizando
técnicas de biología molecular bien conocidas.
En los Ejemplos descritos aquí, fueron
producidos altos niveles de interferón-alfa Fc. Los
clones iniciales produjeron aproximadamente 50 \mug/mL de
interferón-alfa Fc, que se podrían purificar
fácilmente hasta homogeneidad mediante la cromatografía de afinidad
de la Proteína A. Los niveles de expresión a menudo se pueden
incrementar varias veces mediante sub-clonación.
Como se estableció anteriormente, se encuentra que cuando el
interferón-alfa se expresa como las moléculas de
fusión Fc, se obtienen altos niveles de expresión, presumiblemente
porque la porción Fc actúa como un portador, ayudando al
polipéptido en el terminal C a doblarse correctamente y a ser
secretado eficientemente. Más aún, la región Fc es glicosilada y
altamente cargada a pH fisiológico, así la región Fc puede ayudar a
solubilizar las proteínas hidrófobas.
Además de los altos niveles de expresión, las
proteínas de fusión de interferón-alfa exhibieron
mayores vidas medias de suero comparadas con el
interferón-alfa solo, debido en parte a sus tamaños
moleculares mayores. Por ejemplo, el
interferón-alfa Fc tiene una semivida circulante de
19.3 horas en ratón (ver Ejemplo 6), comparado con
2-5 horas para el interferón-alfa
(PHYSICIANS DESK REFERENCE, edición 50,
1996:2156-2147 y 2364-2373). El
interferón-alfa que tiene un peso molecular de
aproximadamente 19 kD, es suficientemente pequeño para ser limpiado
eficientemente mediante filtración renal. En contraste, el
interferón-alfa Fc tiene un peso molecular de
aproximadamente 100 kD en razón a que existen dos porciones de
interferón-alfa unidas a cada molécula Fc (es
decir, dos interferones-alfa en razón a que el Fc
está en su forma dimérica). Tal estructura dimérica puede exhibir
una afinidad de unión mayor al receptor de
interferón-alfa. En razón a que la actividad del
interferón-alfa es mediada por el receptor, las
proteínas de fusión del interferón-alfa bivalente
serán potencialmente más eficaces que el
interferón-alfa mismo.
Adicionalmente, muchos ligandos de proteína son
conocidos por unirse a sus receptores como un dímero. En razón a
que el interferón-alfa pertenece a una clase de
ligandos de proteína con constantes de dimerización débiles, la
restricción física impuesta por el Fc sobre el
interferón-alfa haría la dimerización un proceso
intramolecular, así, cambiando el equilibrio a favor del dímero y
mejorando su unión a los receptores. Los residuos de cisteína
también se pueden introducir mediante tecnología de ADN recombinante
estándar al monómero en lugares apropiados para estabilizar el
dímero a través de la formación de unión disulfuro covalente.
Las proteínas de fusión de la invención
suministran varios beneficios clínicos importantes. Como se demostró
en las pruebas de actividad biológica en la célula Daudi y los
ensayos de efecto citopático (Ejemplo 4), la actividad biológica
del interferón-alfa Fc es significativamente
superior que aquella del interferón-alfa.
Un aspecto importante de la invención es que las
secuencias y las propiedades de varias proteínas de
interferón-alfa y de los ADN codificantes son muy
similares. En el contexto de las fusiones Fc-X, las
propiedades de las proteínas del interferón-alfa y
los ADN codificantes son esencialmente idénticos, de tal forma que
un conjunto común de técnicas se pueden utilizar para generar
cualquier fusión de ADN de interferón-alfa Fc, para
expresar la fusión, para purificar la proteína de fusión, y
administrar la proteína de fusión para propósitos terapéuticos.
La presente invención también suministra métodos
para la producción de interferón-alfa de especies no
humanas como proteínas de fusión Fc. Las proteínas de fusión
interferón-alfa no humanas son útiles para estudios
preclínicos del interferón-alfa porque se deben
desarrollar estudios de eficacia y toxicidad de una droga de
proteína en sistemas de modelos animales antes de ser ensayados en
seres humanos. Una proteína human puede no trabajar en un modelo de
ratón en razón a que la proteína puede elicitar una respuesta
inmune, y/o exhibir diferentes farmacocinéticos sesgando los
resultados de la prueba. Por lo tanto la proteína de ratón
equivalente es el mejor subrogado para la proteína humana para
ensayar en un modelo de ratón.
La presente invención suministra métodos para
tratar varios cánceres, enfermedades virales, otras enfermedades,
condiciones relacionadas y causas de éstas al administrar el ADN,
ARN o las proteínas de la invención a un mamífero que tiene tal
condición. Las condiciones relacionadas pueden incluir, pero no
están limitadas a, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, verrugas
genitales, leucemia de tricoleucocito, sarcoma de Kaposi relacionado
con SIDA, melanoma, cáncer de próstata y otras formas de enfermedad
viral y cáncer. En vista de los amplios papeles jugados por el
interferón-alfa en modular las respuestas inmunes,
la presente invención también suministra métodos para tratar
condiciones aliviadas por la administración del
interferón-alfa. Estos métodos incluyen administrar
a un mamífero que tiene la condición, que puede o no estar
directamente relacionado con la infección viral o el cáncer, una
cantidad efectiva de una composición de la invención.
Las proteínas de la invención no solamente son
útiles como agentes terapéuticos, sino que un experto en la técnica
reconoce que las proteínas son útiles en la producción de
anticuerpos para uso diagnóstico. De manera similar, la
administración apropiada del ADN o el ARN, por ejemplo, en un vector
u otro sistema de suministro para tales usos, se incluye en los
métodos de uso de la invención.
Como una proteína de fusión con la
inmunoglobulina Fc, el interferón-alfa Fc puede
tener una distribución de tejido muy favorable y un modo
ligeramente diferente de acción para lograr la eficacia clínica,
especialmente en vista de su larga la semivida del suero y la alta
dosis de proteína soluble que se puede administrar. En particular,
existe un alto nivel de receptor gama Fc en el hígado, que es el
sitio de la infección por los virus que causan la hepatitis B y la
hepatitis D. Los efectos colaterales neurológicos del
interferón-alfa se cree que ocurren por el tamaño
pequeño del interferón-alfa que le permite cruzar la
barrera sangre-cerebro. El tamaño mucho mayor del
Fc-interferón-alfa reduce
significativamente la proporción a la cual esta proteína cruza la
barrera sangre-cerebro.
Las composiciones de la presente invención se
pueden administrar mediante cualquier ruta que sea compatible con
las moléculas particulares. Se contempla que las composiciones de la
presente invención se pueden suministrar a un animal por cualquier
medios adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, como por
inyección, implantación o administración tópica a un locus de
tejido) o sistemáticamente (por ejemplo, parenteralmente u
oralmente). Donde la composición va a ser suministrada
parenteralmente, tal como mediante administración intravenosa,
subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal,
rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal,
intraespinal, intraventricular, intratecal, intracistenal,
intracapsular, intranasal o de aerosol, la composición
preferiblemente comprende parte de una suspensión o solución de
fluido acuoso o fisiológicamente compatible. Así, el portador o
vehículo es fisiológicamente aceptable de tal forma que además del
suministro de la composición deseada al paciente, éste no afecta de
manera adversa el electrolitro del paciente y/o el balance del
volumen. El medio fluido para el agente puede comprender así
solución salina fisiológica normal.
La invención caracteriza vectores de expresión
para la transfección in vivo y la expresión de una
construcción de proteína de fusión del
interferón-alfa en particular los tipos de célula
con el fin de reconstituir o suplementar la función del
interferón-alfa. Las construcciones de expresión de
las construcciones de la proteína de fusión del
interferón-alfa, se pueden administrar en cualquier
portador biológicamente efectivo, por ejemplo, cualquier
formulación o composición capaz de suministrar efectivamente la
construcción de la proteína de fusión del
interferón-alfa a las células in vivo. Las
aproximaciones incluyen la inserción del gen objeto en vectores
virales que incluyen retrovirus recombinantes, adenovirus, virus
adeno asociados, y el virus-1 herpes simplex, o
bacterias recombinantes o plásmidos eucarióticos.
Las dosis preferidas de la proteína de fusión
por administración están dentro del rango de 0.1 mg/m^{2} - 100
mg/m^{2}, más preferiblemente, 1 mg/m^{2} - 20 mg/m^{2}, y más
preferiblemente 2 mg/m^{2} - 6 mg/m^{2}. Se contempla que la
dosis óptima, sin embargo, también dependa de la enfermedad a ser
tratada y de la existencia de los efectos colaterales. Sin embargo,
las dosis óptimas se pueden determinar utilizando experimentación
de rutina. La administración de la proteína de fusión puede ser
mediante inyecciones de bolo periódicas, o mediante la
administración intravenosa o intraperitoneal continua proveniente de
un reservorio externo (por ejemplo, de una bolsa intravenosa) o
interna (por ejemplo, de un implante bioerodable). Además, se
contempla que las proteínas de fusión de la invención también se
pueden administrar al receptor pretendido junto con una pluralidad
de diferentes moléculas biológicamente activas. Se contempla, sin
embargo, que la combinación óptima de la proteína de fusión y otras
moléculas, modos de administración, dosis se puedan determinar
mediante experimentación de rutina que correspondan al nivel del
experto en la técnica.
La invención se ilustra además por medio de los
siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo
1
El mARN se preparó de células mononulceares de
sangre periférica humana y se transcribió de manera inversa con
transcriptaza inversa. El cADN resultantes se utilizó como plantilla
para Reacciones de Cadena de Polimeraza (PCR) para clonar y adaptar
el cADN de interferón-alfa humano para la expresión
como una proteína de fusión de
Interferón-alfa-huFc
(huFc-IFN-alfa). El cebador
adelantado fue 5' C CCG GGT AAA TGT GAT CTG CCT CAG AC (SEQ ID NO:
5), donde la secuencia CCCGGG (sitio de restricción Xmal) TAAA
codifica el carboxi terminal de la cadena pesada de
inmunoglobulina, seguido por la secuencia (en negrilla) que codifica
el terminal N del interferón-alfa. El cebador
inverso fue 5'CTC GAG TCA ATC CTT CCT CCT TAA TC (SEQ ID NO: 6), que
codifica la secuencia carboxi terminal
(contra-sentido) del interferón-alfa
con su traducción del codón STOP (anticodón, TCA), y esta fue
seguida por un sitio Xhol (CTCGAG). Un producto PCR de 517 pares
base se clonó y se secuenció. El análisis de secuencia confirmó que
el producto PCR codifica el interferón-alfa humano
maduro adaptado para la expresión, es decir, con un Xmal en el
extremo 5' y un sitio Xhol en el extremo 3'.
El vector de expresión
pdCs-huFc-IFN-alfa
fue construido como sigue. El fragmento de restricción
Xmal-Xhol que contiene el cADN del
interferón-alfa humano estaba ligado al fragmento
Xmal-Xhol del vector pdCs-huFc de
acuerdo a Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495.
El huFc es el fragmento Fc humano de la inmunoglobulina gama humana
1. El vector resultante,
pdCs-huFc-IFN-alfa,
se utilizó para transfectar células de mamífero para la expresión
del huFc-IFN-alfa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para la transfección transitoria, se introdujo
el plásmido
pdCs-huFc-IFN-alfa
en 293 células de riñón humano mediante coprecipitación del ADN de
plásmido con fosfato de calcio (Sambrook et al. eds. (1989)
"MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL", Cold
Spring Harbor Press, N.Y.) o mediante lipofección utilizando
Lipofectamina Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante.
Con el fin de obtener clones establemente
transfectados, el ADN de plásmido se introdujo en células NS/0 de
mieloma de ratón mediante electroporación. En resumen, las células
NS/0 fueron crecidas en un medio de Eagle modificado de Dulbecco
suplementado con 10% de suero de bovino fetal, 2 mM de glutamina y
penicilina/estreptomicina. Aproximadamente 5x10^{6} células se
lavaron una vez con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y
resuspendidas en 0.5 mL de PBS. Diez \mug de ADN de plásmido
linearizado fueron entonces incubadas con las células en una Cubeta
Gene Pluser (0.4 cm de espacio de electrodo, BioRad) sobre hielo
durante 10 min. La electroporación se desarrolló utilizando un Gene
Pulser (BioRad, Hercules, CA) con configuraciones de 0.25 V y 500
\muF. A las células se les permitió cubrirse durante 10 min. sobre
hielo, después de lo cual ellas fueron resuspendidas en medio de
crecimiento y luego puestas en placa sobre dos placas de 96 pozos.
Los clones establemente transfectados se seleccionaron por
crecimiento en la presencia de 100 nM de metrotrexato (MTX), que se
introdujo dos días post-transfección. Las células se
alimentaron cada 3 días durante dos a tres veces, y los clones
resistentes a MTX aparecieron en 2 a 3 semanas. Los sobrenadantes
provenientes de los clones se ensayaron mediante ELISA
anti-Fc (ver Ejemplo 3) para identificar productores
altos. Los clones de alta producción se aislaron y propagaron en el
medio de crecimiento que contiene 100 nM de MTX.
Para la caracterización de rutina mediante
electroforesis de gel, las proteínas de fusión Fc en el medio
acondicionado se unieron a la Proteína A Sefarosa (Repligen,
Cambridge, MA) y luego eluídas de la Proteína A Sefarosa mediante
ebullición en un amortiguador de muestra de proteína estándar con o
sin 2-mercaptoetanol. Después de electroforesis
sobre una electroforesis de gel de
poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio
(SDS-PAGE), las marcas de proteína fueron
visualizadas mediante teñido con Coomassie blue. Mediante
SDS-PAGE, el
huFc-interferón-alfahul tuvo un MW
aparente de aproximadamente 52 kD.
Para la purificación, las proteínas de fusión
unidas sobre la Proteína A Sefarosa fueron eluídas en un
amortiguador de fosfato de sodio (100 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 3, y
150 mM de NaCl). El eluido fue entonces inmediatamente neutralizado
con 0.1 de volumen de Tris-clorhidrato 2 M, pH
8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La concentración de los productos de proteína
que contienen Fc humano en los sobrenadantes de los clones
resistentes a MTX y a otras muestras se determinó mediante
anti-huFc ELISA. Los procedimientos se describen en
detalle adelante.
Las placas ELISA fueron recubiertas con IgG
anti-Humano de Cabra AffiniPure (H+L) (Jackson
Immuno. Research Laboratories, West Grove, PA) a 5 \mug/mL en
PBS, y 100 \muL/pozo en placas de 96 pozos (placa
Nunc-Immuno Maxisorp). Las placas recubiertas
fueron cubiertas e incubadas a 4ºC durante toda la noche. Las placas
fueron entonces lavadas 4 veces con 0.05% de Tween (Tween 20) en
PBS, y bloqueadas con 1% de BSA/1% de suero de cabra en PBS, 200
\muL/pozo. Después de la incubación con el amortiguador de bloque
a 37ºC durante 2 hrs, las placas se lavaron 4 veces con 0.05% de
Tween en PBS y secadas unidas sobre toallas de papel.
Las muestras de prueba fueron diluidas según
fuera apropiado en un amortiguador de muestra (1% BSA/1% de suero
de cabra/0.05% de Tween en PBS). Una curva estándar se preparó
utilizando un anticuerpo quimérico (con un Fc humano), cuya
concentración fue conocida. Para preparar una curva estándar, las
diluciones en serie fueron hechas en el amortiguador de muestra
para dar una curva estándar que varía desde 125 ng/mL a 3.9 ng/mL.
Las muestras diluidas y los estándares fueron agregados a la placa,
100 \muL/pozo y la placa incubada a 37ºC durante 2 hr. Después de
la incubación, la placa se lavó 8 veces con 0.05% de Tween en PBS. A
cada pozo le fue agregado entonces 100 \muL de anticuerpo
secundario, el IgG anti-humano conjugado a
peroxidaza de cola de caballo (Jackson Immuno Research), se diluyó
en alrededor de 1:120,000 en el amortiguador de muestra. La
dilución exacta del anticuerpo secundario tiene que ser determinada
por cada uno de los lot IgG anti-humano conjugados
a HRP. Después de la incubación a 37ºC durante 2 hr, la placa se
lavó 8 veces con 0.05% de Tween en PBS.
La solución del sustrato se agregó a la placa a
100 \muL/pozo. La solución del sustrato se preparó al disolver 30
mg de OPD (clorhidrato de o-fenilenodiamina (OPD)),
(1 tableta) en 15 mL de ácido cítrico 0.025 M/amortiguador de
Na_{2}HPO_{4} 0.05M, pH 5, que contenía 0.03% de peróxido de
hidrógeno recientemente agregado. El color se le permitió
desarrollarse durante 30 min. a temperatura ambiente en la
oscuridad. El tiempo de desarrollo está sujeto a cambio,
dependiendo de la variabilidad de lote a lote de las placas
recubiertas, el anticuerpo secundario, etc. La reacción se detuvo
al agregar ácido sulfúrico 4N, 100 \muL/pozo. La placa se leyó por
un lector de placa que se ajustó tanto 490 como a 650 nm y se
programó para sustraer el OD de transfondo a 650 nm desde el OD a
490 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La bioactividad del
huFc-hulIFN-alfa se comparó con
aquella del interferón-alfa humano
(hu-IFN-alfa) interferón de
leucocito humano de Sigma, St. Louis, MO) utilizando dos ensayos
diferentes. El primer ensayo determina la inhibición de la
proliferación de la línea de célula B de limfoblastoide humano Daudi
(ATCC CCL 213). El segundo ensayo mide la inhibición del efecto
citopático del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) sobre la
línea celular A549 de carcinoma de pulmón humano (ATCC CCL 185).
El interferón-alfa inhibe la
proliferación de células Daudi (linfoma Burkett humano). Las células
Daudi se lavaron con RPMI libre de suero 1640 dos veces, y se
resuspendieron en medio de crecimiento que consistía de RPMI 1640 y
20% de suero de bovino fetal inactivado con calor (56ºC). Las
células fueron entonces puestas en placa a 1x10^{5}
células/mL/pozo sobre una placa de 24 pozos en la presencia de
diferentes concentraciones de \alphaIFH (2.1 x 10^{6} unidades
internacionales/mg) y
huFc-huIFN-alfa. Después de
3-4 días, se encontró que 50 pg/mL de
IFN-alfa en la forma de
huFc-huIFN-alfa fueron tan efectivas
como 750 pg/mL de huIFN-alfa en logar
50-100% de inhibición del crecimiento de las células
Daudi. Como un control, el interferón-gama
(Pharmingen, San Diego, CA) a 100 ng/mL no mostró actividad en este
ensayo. Esto demuestra que la inhibición es específica del
interferón-alfa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La replicación viral en el cultivo de célula a
menudo resulta en citotoxicidad, un efecto conocido como efecto
citopático (CPE). Los interferones pueden inducir un estado
antiviral en los cultivos de célula y protegen las células de tal
CPE. La actividad antiviral IFN-alfa se puede
cuantificar mediante ensayos de reducción de efecto citopático
(CPER), como se describe en "Lymphokines and Interferons: A
Practical Approach", editado por M.J. Clemens, A.G. Morris y
A.J.H. Gearing. I.R.L. Press, Oxford, 1987. Las actividades
antivirales del huFc-huIFN-alfa y
el huIFN-alfa se compararon utilizando la línea de
célula de carcinoma de pulmón humano A549 (ATCC CCL 185) y el virus
de la encefalmiocarditis (ATCC VR 129B) de acuerdo con el protocolo
CPER descrito en la referencia anterior. Las dosis efectivas para
dar 50% de CPER (es decir, 50% de protección) se encontraron que
eran 570 pg/mL (con base en la cantidad de IFN-alfa)
para huFc-huIFN-alfa y 500 pg/mL
para huIFN-alfa. De acuerdo con esto, el
IFN-alfa en el
huFc-huIFN-alfa y el
huIFN-alfa tienen sustancialmente actividad
antiviral equivalente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los farmacocinéticos del
huFc-huIFN-alfa se determinaron en
un grupo de 4 ratones Balb/c. Veinticinco miligramos de
huFc-huIFN-alfa se inyectaron en la
vena de la cola de cada ratón. Se obtuvo sangre mediante sangrado
retro-orbital inmediatamente después de la
inyección (es decir, a t=0 min), y a 0.5, 1, 2, 4, 8, y 24 hr post
inyección. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos que
contenían heparina para evitar el taponamiento. Las células se
removieron mediante centrifugación en una
micro-centrífuga de alta velocidad Eppendorf durante
4 min. La concentración del
huFc-huIFN-alfa en el plasma se
midió mediante anti-huFc ELISA y análisis Western
blot con anticuerpo anti-huFc, que también mostró
que el huFc-huIFN-alfa permaneció
intacto en circulación (banda de 52 kD para
huFc-huIFN-alfa). Ningún producto de
degradación (banda de 32 kD para huFc) se podría detectar. La
semivida circulante del
huFc-huIFN-alfa se determinó que era
19.3 hr, que es significativamente mayor que la semivida circulante
reportada del IFN-alfa humano de aproximadamente 2 a
5 hr (PHYSICIANS DESK REFERENCE, edición 50,
1996:2145-2147 y 2364-2373).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Las células Daudi (linfoma Brukitt humano)
crecieron en ratones C.B-17 SCID (Deficiencia Inmune
Combinada Severa) como tumores diseminados (Ghetie et al.
(1990) INTL. J. CANCER: 45:481). Aproximadamente 5x10^{6} células
Daudi de una suspensión de células simples en 0.2 mL de PBSB se
inyectaron intravenosamente en ratones SCID de 6-8
semanas de edad. Tres días más tarde, los ratones fueron
aleatorizados en tres grupos de ocho y recibieron inyecciones
intraperitoneales diariamente de 0.2 mL de PBS, 30 \mug de
huFc-huIFN-alfa (que contienen
aproximadamente 12 \mug de IFN-alfa) en PBS, o 60
\mug de huFc-huIFN-alfa en PBS.
Los ratones se monitorearon diariamente. Los resultados se
presentan en la Figura 2.
El día 28 después de la inyección de la célula
Daudi, todos los ratones en el grupo de PBS de control (diamantes)
habían desarrollado parálisis de sus patas traseras. Los ratones en
este grupo de control PBS iniciaron muriendo en el Día 38 y para el
Día 61, todos los ratones en el grupo de control murieron. En
contraste, los ratones en los grupos de tratamiento sobrevivieron
mucho más, y de una manera dependiente de dosis. Para el grupo que
recibió 30 \mug de huFc-huIFN-alfa
(cruces), la primera muerte ocurrió en el Día 70, y todos los
ratones habían muerto para el Día 134. Cuatro del grupo que
recibieron 60 \mug de
huFc-huIFN-alfa (triángulos), la
primera muerte no ocurrió hasta el Día 126, y cuatro más murieron el
Día 153. El resto de los ratones enfermaron y fueron sometidos a
eutanasia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
En este modelo, las células Daudi crecieron en
los ratones C.B-17 SCID como tumores subcutáneos
(Ghetie et al. (1990) INT. J. CANCER: 45-481).
Aproximadamente 6x10^{6} células Daudi de una suspensión de
células simples en 0.1 mL de PBSB se inyectaron subcutáneamente en
ratones SCID de 6-8 semanas de edad. El tratamiento
inició cuando el tamaño del tumor alcanzó 200-400
mm^{3}, que tomó aproximadamente 4 semanas. Los ratones fueron
aleatorizados en tres grupos de 8, y cada grupo recibió 6
inyecciones intraperitoneales diariamente de 0.2 mL de PBS, 30
\mug de huFc-huIFN-alfa en PBS, o
60 \mug de huFc-huIFN-alfa en PBS.
Los resultados se muestran en la Figura 3. El tamaño de los tumores
se midió dos veces a la semana.
Los tumores en los ratones del grupo de control
(diamantes) crecieron rápidamente hasta un volumen medio de 5602
mm^{3} (rango: 4343-6566 mm^{3}) hasta el día
35, después de lo cual todos los ratones en el grupo fueron
sometidos a eutanasia. En contraste, el crecimiento de los tumores
en los ratones en los grupos de tratamiento fue suprimido de una
manera dependiente de dosis. Los grupos que recibieron 30 \mug y
60 \mug de huFc-huIFN-alfa tenían
volúmenes de tumor medio de 214 y 170 mm^{3}, respectivamente, en
el día 35, los cuales fueron más pequeños que los 268 y 267
mm^{3} antes del tratamiento. De hecho, los tumores subcutáneos
se habían encogido completamente en 5 de 8 ratones en el grupo que
recibió 30 \mug de huFc-huIFN-alfa
y 4 de 8 ratones en el grupo que recibió 60 \mug de
huFc-huIFN-alfa. Sin tratamiento
adicional, sin embargo, algunos de los tumores regresaron y
crecieron. Sin embargo, dos ratones en el grupo permanecieron libres
de tumor hasta el día 205, cuando se terminó el experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se contempla que la enfermedad hepática, por
ejemplo, hepatitis o metástasis del hígado, se puede tratar más
efectivamente con Fc-interferón-alfa
que con interferón-alfa o
interferón-alfa-Fc.
Por ejemplo, se contempla que el
Fc-interferón-alfa puede ser
efectivo en el tratamiento de un modelo de ratón en el cual las
células de tumor hicieron metástasis al hígado. Los ratones se
anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de
quetamina y 5 mg/kg de xilazina en 0.2 ml de PBS aproximadamente 5
minutos antes de cirugía. Las siguientes etapas entonces son
desarrolladas en una caperuza de flujo laminar para asegurar la
esterilidad. La piel de cada ratón se limpió con betadina y etanol
células Tumorales, tales como las células Daudi, se inyectan en 100
microlítros de RPMI 1640 medio sin suplemento inmediatamente por
debajo de la cápsula esplénica durante un período de
aproximadamente un minuto utilizando una aguja calibre 27. Después
de dos minutos, el pedículo esplénico se liga con una sutura de
seda 4.0 y el vaso se remueve.
Algunas células se llevan desde el sitio de la
inyección hacia el hígado, donde ellas pueden formar tumores
metastáticos. Los ratones con tumores hepáticos metastáticos
entonces se tratan con
Fc-interferón-alfa. Se contempla
que los ratones tratados con
Fc-interferón-alfa muestran una
reducción significativa en el crecimiento tumoral con relación a
los ratones tratados con una cantidad equimolar de
interferón-alfa o proteína de fusión de
interferón-alfa-Fc.
Adicionalmente, se contempla que el efecto
específico del Fc-interferón-alfa
sea más pronunciado en tratamiento de enfermedad hepática que en
tratamiento de trastornos localizados a otros tejidos donde el
Fc-interferón-alfa no se
concentra.
<110> Lo, Kin-Ming
\hskip1cmSun, Yaping
\hskip1cmGillies, Stephen D.
\hskip1cmLexigen Pharmaceuticals Corp.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión y Exportación de Proteínas
Interferón Alfa Como Proteínas de Fusión
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LEX-009 PC
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/134,895
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999.05.19
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia ADN alfa IFN humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 696
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(696)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia ADN Fc humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR delantero
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgggtaaa tgtgatctgc ctcagac
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgagtcaa tccttcotcc ttaatc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia consenso alfa IFN en donde
Xaa en cualquier posición a pesar de las posiciones 24, 31, 70 y
129 representan cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa24 can be Ile or Leu, Xaa31 can
be Lys or Gln, Xaa70 can be Thr or Ser and Xaa 129 can be Leu or
Val.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-1 IFN
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-2 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-4 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-5 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-6 IFN
Humana
\newpage
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-7 IFN
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-8 IFN
humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-10 IFN
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-14 IFN
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-l6 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alta-17 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-21 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína delta-1 IFN
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína omega-1 IFN
humana
\newpage
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-1 IFN
de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-2 IFN
de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-4 IFN
de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-5 IFN
de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-6 IFN
de ratón
\newpage
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<400> 26
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-7 IFN
de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-8 IFN
de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína alfa-9 IFN
de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Una proteína de fusión que tiene una
actividad biológica del interferón-alfa y que son
capaces de concentrar el interferón-alfa en el
hígado, dicha proteína de fusión que comprende en la dirección N a
C-terminal una región Fc de inmunoglobulina que
deriva del IgG1 o IgG3 y una proteína objetivo que comprende
interferón-alfa.
2. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 1, en donde la región Fc comprende por lo menos una
región de pivoteo de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio
CH3.
3. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 1 o 2, en donde la proteína objetivo comprende un
segundo interferón-alfa de longitud completa o un
fragmento bioactivo de éstos.
4. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 3, en donde la primera y la segunda proteína de
interferón-alfa están ligadas directamente o por
medio de un ligador de polipéptido.
5. Una proteína de fusión de acuerdo a la
reivindicación 3 o 4, en donde la región Fc y la proteína objetivo
están ligadas directamente o por medio de un ligador de
polipéptido.
6. Una proteína de fusión multimérica que
comprende por lo menos dos proteínas de fusión como se especifica en
las reivindicaciones 1 a 5 asociadas por medio de un enlace
covalente.
7. Una molécula de ADN que codifica una proteína
de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.
8. Una molécula de ADN de la reivindicación 7,
en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de señal,
dicha secuencia de seña, dicha región Fc y dicha proteína objetivo
se codifican en serie en una dirección 5' a 3'.
9. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína de fusión de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 opcionalmente juntas con un portador
farmacéuticamente aceptable.
10. El uso de una proteína de fusión de acuerdo
a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composición
farmacéutica de la reivindicación 9 para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades hepáticas.
11. El uso de una proteína de fusión de acuerdo
a la reivindicación 10, en donde la enfermedad hepática es
hepatitis.
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|---|---|---|---|
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