PT1187852E - Expressão e exportação de proteínas interferão-alfa na forma de proteínas de fusão com fc - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "EXPRESSÃO E EXPORTAÇÃO DE PROTEÍNAS INTERFERÃO-ALFA NA FORMA DE PROTEÍNAS DE FUSÃO COM FC" Área da Invenção A invenção refere-se à expressão e secreção, em níveis elevados, em células de mamífero, de proteínas de fusão com Fc que têm a actividade biológica do Interferão-alfa e às respectivas formas estruturais e utilizações variadas, especialmente à sua capacidade para concentrar interferão-alfa no figado.

Contexto da Invenção A família de proteínas interferão-alfa (IFN-alfa) demonstrou ser útil no tratamento de uma variedade de doenças. Por exemplo, os interferões alfa 2a e 2b (marcas registadas Roferon e Intron A, respectivamente) têm sido utilizados no tratamento de hepatite B, C e D crónicas (doenças virais do fígado letais), condylomata acuminata (verrugas genitais), sarcoma de Kaposi relacionado com SIDA, leucemia de células pilosas, melanoma maligno, carcinoma de células basais, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, herpes I e II, varicela/herpes zoster e micose fungóide. Também foi estudada a eficácia de regimes de tratamento contendo interferão-alfa em cancro da próstata e leucemia mielógena crónica. A família interferão-alfa humana é a maior e mais complexa família de interferões. Os membros da família interferão-alfa têm sequências de aminoácidos semelhantes que os definem como um grupo distinto de outros interferões, isto é, estas proteínas têm tipicamente pelo 2 menos 35% de identidade de aminoácidos num alinhamento tipico de sequências proteicas. A base de dados SwissProt contém numerosas proteínas interferão-alfa humano, incluindo as proteínas alternativamente denominadas interferão-delta e interferão-ómega. Estas proteínas são tipicamente sintetizadas com uma sequência líder de cerca de 23 aminoácidos, e as proteínas maduras têm, tipicamente, um peso molecular de cerca de 19 kD. Uma vez que estas proteínas são tão semelhantes, quando interferão-alfa é obtido de uma fonte humana ou de outro mamífero e é extensamente purificado, muitas vezes obtém-se uma mistura de iso-espécies com actividades biológicas variáveis [Georgiadis et ai., Patente U.S. N° 4 732 683]. De modo semelhante, os cDNAs que codificam estas proteínas têm dimensões e propriedades suficientemente semelhantes para que um único conjunto de procedimentos possa ser utilizado para manipulá-los para a construção de plasmídeos. Em conformidade, seria útil dispor de um método para produzir e purificar de forma eficiente uma única espécie de interferão-alfa a partir de uma fonte de mamífero.

Devido ao seu tamanho relativamente pequeno de cerca de 19 kD (Lawn et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 5435), o interferão-alfa pode ser filtrado pelo rim. No entanto, quando é filtrado, o interferão-alfa é tipicamente absorvido e metabolizado por células tubulares do rim e, em consequência, habitualmente não é excretado. De acordo com a prática clínica corrente, o interferão-alfa formulado é administrado por injecção intramuscular, após o que os seus níveis no soro diminuem, com um tempo de semi-vida de cerca de 5 horas para o interferão-alfa 2a e 2 - 3 horas para o interferão-alfa 2b ("Physicians Desk Reference", 50a edição, 1996: 2145-2147 e 2364-2373). 3

Suplementarmente, devido à sua pequena dimensão, são necessárias injecções múltiplas e frequentes de interferão-alfa (em geral diariamente ou 3 vezes/semana), e pode registar-se uma variação significativa do nivel de interferão-alfa no paciente. Adicionalmente, as doses injectadas são grandes, variando desde cerca de 50 microgramas por dose para leucemia de células pilosas até 300 microgramas por dose para sarcoma de Kaposi relacionado com SIDA. Níveis elevados de interferão-alfa em circulação podem resultar em efeitos secundários significativos, incluindo toxicidades na pele, neurológicas, imunológicas e endócrinas. Pensa-se que o pequeno tamanho do interferão-alfa lhe permite passar pela barreira hematoencefálica e entrar no sistema nervoso central, sendo responsável por alguns dos efeitos secundários neurológicos. Em conformidade, seria útil aumentar a potência e tempo efectivo de semi-vida no soro em pacientes tratados com interferão-alfa minimizando simultaneamente os efeitos secundários. A patente WO 97/24137 revela uma proteína de fusão na qual interferão-alfa está fundido ao terminal N de uma porção Fc de um anticorpo. Esta molécula é considerada adequada para tratar hepatite porque tem um tempo de permanência mais longo na rede vascular em comparação com o interferão-alfa não fundido. Todavia, em regra, essa construção media ADCC ou fixação do complemento e, em consequência, é esperado que tenha uma concentração relativamente baixa no fígado.

Dada a elevada dosagem, baixa eficácia, curto tempo de semi-vida no soro, dificuldades de purificação e efeitos secundários do interferão-alfa, ou efeitos indesejados de 4 interferão-alfa em construções, são necessários na área métodos para aumentar a produção e melhorar as propriedades farmacológicas deste agente terapêutico.

Resumo da Invenção A presente invenção apresenta métodos e composições úteis para preparar e utilizar proteínas de fusão contendo interferão-alfa. Em particular, a invenção apresenta ácidos nucleicos, por exemplo, sequências de DNA ou RNA, que codificam uma proteína de fusão Fc de imunoglobulina-interferão-alfa, e métodos de expressão dos ácidos nucleicos para produzir essas proteínas de fusão. As proteínas de fusão podem facilitar a expressão em níveis elevados de interferão-alfa biologicamente activo. As proteínas de fusão são capazes de concentrar interferão-alfa no fígado. A proteína de fusão pode ser combinada com um transportador farmaceuticamente aceitável antes da administração a um mamífero, por exemplo, um humano. A presente invenção proporciona moléculas de ácidos nucleicos, por exemplo, moléculas de DNA ou RNA, que codificam uma proteína de fusão região Fc de imunoglobulina -interferão-alfa. A molécula de ácido nucleico codifica em série, na direcção 5' para 3', uma sequência de sinal, uma região Fc de imunoglobulina e pelo menos uma proteína-alvo, em que a proteína-alvo compreende interferão-alfa.

Numa especificação preferida, a região Fc de imunoglobulina compreende uma região conectora de imunoglobulina e preferivelmente compreende pelo menos um domínio de região constante pesada de imunoglobulina, por exemplo, um domínio constante pesado 2 (CH2) de imunoglobulina, um domínio constante pesado 3 (CH3) de 5 imunoglobulina e, dependendo do tipo de imunoglobulina utilizado para gerar a região Fc, opcionalmente um dominio de cadeia constante pesada 4 (CH4) de imunoglobulina. Numa especificação mais preferida, a região Fc de imunoglobulina não tem pelo menos um dominio constante pesado 1 (CHI) de imunoglobulina. Apesar das regiões Fc de imunoglobulinas se poderem basear em qualquer classe de imunoglobulinas, por exemplo, igA, IgD, IgE, IgG e IgM, são preferidas regiões Fc de imunoglobulinas à base de IgG. O ácido nucleico da invenção pode ser incorporado, em associação operativa, num vector de expressão replicável, que então pode ser introduzido numa célula-hospedeiro de mamifero competente para produzir a proteína de fusão à base de interferão-alfa. A proteína de fusão à base de interferão-alfa resultante é produzida eficientemente e segregada a partir da célula-hospedeiro de mamífero. A proteína de fusão à base de interferão-alfa segregada pode ser recolhida do meio de cultura sem submeter a célula-hospedeiro de mamífero a lise. O produto proteico pode ser avaliado quanto à actividade e/ou ser purificado, utilizando reagentes comuns consoante o desejado, e/ou clivado do parceiro de fusão, utilizando sempre técnicas convencionais.

As proteínas de fusão da presente invenção exibem propriedades biológicas melhoradas relativamente ao interferão-alfa nativo, como solubilidade aumentada, tempo de semi-vida no soro prolongado e ligação aumentada ao seu receptor. Estas propriedades podem melhorar significativamente a eficácia clínica do interferão-alfa. Numa especificação preferida, a proteína de fusão compreende, na direcção N para C-terminal, uma região Fc de 6 imunoglobulina e interferão-alfa, com outras fracções, por exemplo, um sítio de clivagem proteolítica, opcionalmente intercaladas entre a região Fc de imunoglobulina e o interferão-alfa. A proteína de fusão resultante é preferivelmente sintetizada numa célula que procede à glicosilação da região Fc em sítios de glicosilação normais, isto é, que habitualmente existem em anticorpos-modelo .

Noutra especificação, a proteína de fusão pode compreender uma segunda proteína-alvo, por exemplo, interferão-alfa maduro e completo ou respectivo fragmento bioactivo. Neste tipo de construção, a primeira e segunda proteínas-alvo podem ser proteínas iguais ou diferentes. A primeira e segunda proteínas-alvo podem estar ligadas entre si, directamente ou através de um agente de ligação polipeptídico. Alternativamente, ambas as proteínas-alvo podem estar ligadas, directamente ou via um agente de ligação polipeptídico, à região Fc de imunoglobulina. No último caso, a primeira proteína-alvo pode estar ligada a uma extremidade N-terminal da região Fc de imunoglobulina e a segunda proteína-alvo pode estar ligada a uma extremidade C-terminal da região Fc de imunoglobulina.

Noutro aspecto, a invenção proporciona métodos para produzir uma proteína de fusão que compreende uma região Fc de imunoglobulina e a proteína-alvo. 0 método compreende os passos seguintes: (a) proporcionar uma célula de mamífero contendo uma molécula de DNA que codifica essa proteína de fusão, com ou sem uma sequência de sinal, e (b) cultivar a célula de mamífero para produzir a proteína de fusão. A proteína de fusão resultante pode então ser recolhida, redobrada, se necessário, e purificada utilizando técnicas 7 de purificação convencionais bem conhecidas e utilizadas na área.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona métodos de tratamento de estados atenuados por interferão-alfa ou respectivas variantes activas por administração a um mamífero de uma quantidade eficaz de interferão-alfa produzido por uma construção de fusão da invenção.

Numa especificação preferida, as construções da invenção podem ser utilizadas no tratamento de uma perturbação do fígado, em que o interferão-alfa, em virtude da região Fc de imunoglobulina, fica localizado no fígado. As construções da invenção podem ser particularmente úteis no tratamento de perturbações do fígado que incluem, mas não se limitam a estas, doenças virais, como hepatite B, hepatite C ou hepatite D, cancro do fígado, bem como outros tipos de cancro envolvendo metástases localizadas no fígado.

Os objectivos, características e vantagens anteriores e outros da invenção tornar-se-ão claros a partir da descrição, figuras e reivindicações apresentadas a seguir.

Descrição Breve das Figuras

As Figuras IA - 1C são ilustrações esquemáticas de exemplos não limitativos de proteínas de fusão construídas de acordo com a invenção. A Figura 2 é um gráfico que apresenta as curvas de sobrevivência para grupos de ratinhos SCID injectados com suspensões de células Daudi e depois tratados com huFc-huIFN-alfa. No dia 0, os ratinhos foram injectados com 8 células Daudi. Nos dias 3-8, grupos de oito ratinhos foram injectados com PBS (losangos), 30 μg de huFc-huIFN-alfa (cruzes) ou com 60 μg de huFc-huIFN-alfa (triângulos). A Figura 3 é um gráfico que apresenta as taxas de crescimento de tumores subcutâneos de células Daudi em ratinhos SCID tratados com huFc-huIFN-alfa. Cerca de quatro semanas antes do tratamento, os ratinhos foram injectados subcutaneamente com células Daudi. Depois das células Daudi injectadas terem crescido formando tumores de 200 - 400 mm3, os ratinhos foram separados em grupos de oito e foram tratados, durante seis dias, com uma injecção de PBS (losangos), 30 μg de huFc-huIFN-alf a em PBS (quadrados) ou 60 μg de huFc-huIFN-alfa em PBS (triângulos).

Descrição Pormenorizada da Invenção

Muitos estados podem ser atenuados pela administração de interferão-alfa. Por exemplo, como discutido previamente, os interferões alfa 2a e 2b (marcas registadas Roferon e Intron A, respectivamente) são úteis no tratamento de hepatite B, C e D crónicas, condylomata acuminata (verrugas genitais), sarcoma de Kaposi relacionado com SIDA, leucemia de células pilosas, melanoma maligno, carcinoma de células basais, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, herpes I e II, varicela/herpes zoster e micose fungóide. Além disso, foram realizados estudos para avaliar a eficácia do interferão-alfa no tratamento de cancro da próstata e leucemia mielógena crónica.

Para o tratamento de hepatite, por exemplo, pode ser particularmente útil dispor de uma forma de interferão-alfa 9 que fique concentrada no fígado. Deste modo, a concentração de interferão-alfa noutros tecidos pode ser minimizada, reduzindo assim efeitos secundários. 0 tecido do fígado é o sítio primário para a remoção de complexos imunológicos solúveis, e receptores Fc abundam em macrófagos do fígado (células de Kupffer) (Benacerraf, B., et al. (1959) J. Immunol. 82: 131; Paul, W. E. (1993) "Fundamentais of Immunology" 3a edição, capítulo 5: 113-116). Em conformidade, ao fundir interferão-alfa a uma região Fc de imunoglobulina, a molécula de interferão-alfa pode ser preferivelmente dirigida para tecido do fígado, relativamente à mesma molécula de interferão-alfa sem a região Fc de imunoglobulina. 0 tipo de anticorpo IgG com a afinidade mais elevada para os receptores Fc é IgGl. No entanto, em contraste, a IgG4, por exemplo, tem uma afinidade aproximadamente 10 vezes mais baixa para o receptor Fc gama 1 (Anderson e Abraham (1980) J. Immunol. 125: 2735; Woof et al. (1986) Mol. Immunol. 2_3: 319). O Fc-gama 1 de IgGl, quando colocado no terminal C de um ligando, pode mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) contra células que expressam um receptor para esse ligando. Adicionalmente, Fc-gama 1, quando presente no terminal C de um ligando, pode mediar a ligação de Clq e fixação do complemento dirigidas contra células que expressam um receptor para esse ligando.

Em contraste com a IgGl, a IgG4 não fixa eficazmente o complemento. Este facto conduziu à proposta de que um interferão-alfa N-terminal poderia ser fundido a uma região Fc C-terminal de IgG4 (Chang, T. W., et al., Patente U.S. N° 5 723 125) . No entanto, quando a região Fc de IgG4 é separada da região Fab, o Fc de IgG4 fixa o complemento tão 10 bem quanto a região Fc de IgGl (Isenman, D. E., et ai. (1975) J. Immunol. 114: 1726). Com base neste resultado e no facto das sequências Fc de IgGl e IgG4 serem bastante semelhantes, sem pretender ficar restringido pela teoria, é contemplado que a região Fab de IgG4 bloqueia de forma estérica a ligação de C 1 q e a fixação do complemento porque a região conectora que liga as regiões Fab e Fc de lgG4 é mais pequena do que a região conectora de IgGl. Se a grande e volumosa região Fab de IgG4 for substituída por uma molécula pequena, como interferão-alfa, e o interferão-alfa e região Fc forem ligados por um agente de ligação flexível, é contemplado que essa fusão interferão-alfa-Fc-gama 4 fixe o complemento quando ligada a células com receptores de interferão-alfa. O efeito citotóxico devido à fusão de uma citoquina N-terminal e uma região Fc C-terminal é bem conhecido. Por exemplo, a fusão da citoquina interleuquina-2 (IL-2) a uma região Fc cria uma molécula que é capaz de fixar o complemento e causar lise de células que tenham o receptor da IL-2 (Landolfi, N. F., Patente U.S. N° 5 349 053).

Fusões nas quais uma região Fc é colocada no terminal N de um ligando (denominadas "imunofusinas" ou fusões "Fc-X", em que X é um ligando como Interferão-alfa) têm algumas propriedades biológicas distintivas e vantajosas (Lo et ai., Patentes U.S. N°s 5 726 044 e 5 541 087; Lo et al. (1998) Protein Engineering 11_: 495) . Em particular, essas proteínas de fusão podem ainda ligar-se aos receptores Fc relevantes em superfícies celulares. No entanto, quando o ligando se liga ao seu receptor numa superfície celular, a orientação da região Fc é alterada e as sequências que medeiam ADCC e fixação do complemento parecem ficar 11 obstruídas. Em resultado, a região Fc numa molécula Fc-X não medeia eficazmente ADCC ou fixação do complemento. Assim, espera-se que fusões Fc-X tenham as virtudes de tempo de semi-vida aumentado no soro e concentração relativa no fígado, com poucos efeitos prejudiciais de ADCC e fixação do complemento.

Uma característica das construções Fc-X da invenção é o facto de concentrarem a proteína-alvo, neste caso interferão-alfa, no fígado. A região Fc das cadeias gamai e gama3 exibe a afinidade mais elevada para o receptor Fc, em que a cadeia gama4 exibe uma afinidade reduzida e a cadeia gama 2 exibe afinidade extremamente baixa para o receptor Fc. Em conformidade, regiões Fc derivadas de cadeias gamai ou gama3 são preferivelmente utilizadas nas construções Fc-X da invenção porque têm as afinidades mais elevadas para receptores Fc e, assim, podem dirigir o interferão-alfa preferencialmente para tecidos do fígado. Isto contrasta com uma proteína X-Fc, por exemplo, uma proteína de fusão interferão-alfa-Fc, na qual a potencial vantagem de concentração no fígado deve ser equilibrada pelo facto desta proteína de fusão poder mediar funções efectoras, nomeadamente fixação do complemento e ADCC, dirigidas contra células com receptores para o interferão-alfa.

Assim, a invenção proporciona sequências de ácidos nucleicos que codificam e sequências de aminoácidos que definem proteínas de fusão compreendendo uma região Fc de imunoglobulina e pelo menos uma proteína-alvo, aqui referida como interferão-alfa. Nas Figuras IA - 1C ilustram-se três especificações exemplificativas de construções proteicas que especificam a invenção. Uma vez que são preferidas construções diméricas, todas são 12 ilustradas como dímeros com ligações cruzadas por um par de ligações dissulfureto entre cisteinas em subunidades adjacentes. Nas figuras, as ligações dissulfureto estão representadas ligando entre si as duas regiões Fc de cadeias pesadas de imunoglobulinas via uma região conectora de imunoglobulina em cada cadeia pesada e, assim, são caracteristicas de formas nativas destas moléculas. Não obstante construções incluindo a região conectora de Fc serem preferidas e ter sido mostrado serem promissoras como agentes terapêuticos, a invenção contempla que a formação de ligações cruzadas noutras posições poderá ser escolhida consoante o desejado. Suplementarmente, nalgumas circunstâncias podem produzir-se dimeros ou multimeros úteis na prática da invenção por associação não covalente, por exemplo, por interacção hidrófoba. Uma vez que construções homodiméricas são especificações importantes da invenção, as figuras ilustram essas construções. Todavia, deverá ser apreciado que estruturas heterodiméricas também são úteis na prática da invenção. A Figura 1 A ilustra uma construção dimérica produzida de acordo com os princípios apresentados aqui (ver, por exemplo, Exemplo 1). Cada monómero do homodímero compreende uma região Fc 1 de imunoglobulina incluindo uma região conectora, um domínio CH2 e um domínio CH3. 0 interferão-alfa 2 está directamente ligado, isto é, via uma ligação polipeptídica, ao terminal C da região Fc. Deve entender-se que a região Fc pode estar ligada a uma proteína-alvo via um agente de ligação polipeptídico (não mostrado).

As Figuras 1B e 1C ilustram construções proteicas da invenção que incluem, como proteína-alvo, múltiplas proteínas interferão-alfa dispostas em série e ligadas por 13 um agente de ligação. Na Figura 1B, a proteína-alvo compreende interferão-alfa completo 2, um agente de ligação polipeptídico constituído por resíduos glicina e serina 4 e uma variante activa de interferão-alfa 3. A Figura 1C difere da construção da Figura 1B no facto do domínio proteico mais C-terminal compreender uma segunda cópia completa de interferão-alfa 2. Apesar das Figuras IA - 1C representarem construções Fc-X, em que X é a proteína-alvo, é contemplado que proteínas úteis da invenção também podem ser representadas pela fórmula X-Fc-X, em que os Xs podem representar proteínas-alvo iguais ou diferentes.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "agente de ligação polipeptídico" designa uma sequência polipeptídica que pode ligar entre si duas proteínas que não estão naturalmente ligadas na natureza. 0 agente de ligação polipeptídico compreende preferivelmente uma pluralidade de aminoácidos, como alanina, glicina e serina, ou combinações desses aminoácidos. Preferivelmente, o agente de ligação polipeptídico compreende uma série de péptidos de glicina e serina com cerca de 10 - 15 resíduos de comprimento. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5 258 698. Contudo, é contemplado que o comprimento e composição de aminoácidos óptimos do agente de ligação podem ser determinados por experimentação de rotina.

Tal como é aqui utilizado, o termo "multivalente" refere-se a uma molécula recombinante que incorpora dois ou mais segmentos biologicamente activos. Os fragmentos proteicos que formam a molécula multivalente podem estar opcionalmente ligados por um agente de ligação polipeptídico que liga as partes constituintes e permite que cada uma funcione independentemente. 14

Tal como é aqui utilizado, o termo "bivalente" refere-se a uma molécula recombinante multivalente com a configuração Fc-X ou X-Fc, em que X é uma molécula-alvo. As regiões Fc de imunoglobulinas podem associar-se, por exemplo, via ligações dissulfureto inter-cadeias, para produzirem o tipo de construções apresentado na Fig. 1 A. Se a construção de fusão da invenção tiver a configuração Fc-X-X, a molécula de Fc resultante é a apresentada na Fig. 1C. As duas proteínas-alvo podem estar ligadas por um agente de ligação peptídico. Construções do tipo apresentado na Fig. IA podem aumentar a afinidade de ligação aparente entre a molécula-alvo e o seu receptor.

Tal como é aqui utilizado, o termo "multimérico" refere-se à associação estável de duas ou mais cadeias polipeptídicas covalentemente, por exemplo, por intermédio de uma interacção covalente, por exemplo, uma ligação dissulfureto, ou não covalentemente, por exemplo, por interacção hidrófoba. Pretende-se que o termo multímero abranja homomultímeros, em que as subunidades são iguais, bem como heteromultímeros, em que as subunidades são diferentes.

Tal como é aqui utilizado, o termo "dimérico" refere-se a uma molécula multimérica específica na qual duas cadeias polipeptídicas estão associadas de forma estável por interacções covalentes ou não covalentes. Essas construções estão apresentadas esquematicamente na Fig. IA. Deve entender-se que a região Fc de imunoglobulina incluindo pelo menos uma porção da região conectora, um domínio CH2 e um domínio CH3 forma tipicamente um dímero. É conhecido que muitos ligandos proteicos se ligam aos seus receptores na forma de um dímero. Se um ligando proteico X dimerizar 15 naturalmente, a fracção X numa molécula Fc-X irá dimerizar em muito maior extensão, uma vez que o processo de dimerização depende da concentração. A proximidade física das duas fracções X ligadas por Fc tornará a dimerização num processo intramolecular, desviando grandemente o equilíbrio em favor do dímero e aumentando a sua ligação ao receptor.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "interferão-alfa" designa não só interferão-alfa maduro completo, por exemplo, interferão-alfa 1 humano (ID SEQ NO: 8), interferão-alfa 2 humano (ID SEQ NO: 9), interferão-alfa 4 humano (ID SEQ NO: 10), interferão-alfa 5 humano (ID SEQ NO: 11), interferão-alfa 6 humano (ID SEQ NO: 12), interferão-alfa 7 humano (ID SEQ NO: 13), interferão-alfa 8 humano (ID SEQ NO: 14), interferão-alfa 10 humano (ID SEQ NO: 15), interferão-alfa 14 humano (ID SEQ NO: 16), interferão-alfa 16 humano (ID SEQ NO: 17), interferão-alfa 17 humano (ID SEQ NO: 18), interferão-alfa 21 humano (ID SEQ NO: 19), interferão delta-1 (ID SEQ NO: 20), II-l (interferão ómega-1) (ID SEQ NO: 21) e interferão-alfa 1 de ratinho (ID SEQ NO: 22), interferão-alfa 2 de ratinho (ID SEQ NO: 23), interferão-alfa 4 de ratinho (ID SEQ NO: 24), interferão-alfa 5 de ratinho (ID SEQ NO: 25), interferão-alfa 6 de ratinho (ID SEQ NO: 26), interferão-alfa 7 de ratinho (ID SEQ NO: 27), interferão-alfa 8 de ratinho (ID SEQ NO: 28) e interferão-alfa 9 de ratinho (ID SEQ NO: 29), mas também respectivas variantes e fragmentos bioactivos. Podem encontrar-se sequências conhecidas de interferão-alfa na GenBank. O termo fragmento bioactivo refere-se a qualquer fragmento proteico de interferão-alfa que tenha pelo menos 16 50%, mais preferivelmente pelo menos 70% e muito preferivelmente pelo menos 90% da actividade biológica da proteina modelo interferão-alfa humano da ID SEQ NO: 2, determinada utilizando o ensaio de inibição da proliferação celular do Exemplo 4. O termo variantes inclui espécies e variantes alélicas, bem como outras variantes de ocorrência natural ou ocorrência não natural, por exemplo, geradas por protocolos de engenharia genética, que sejam pelo menos 70% semelhantes ou 60% idênticas, mais preferivelmente pelo menos 75% semelhantes ou 65% idênticas e muito preferivelmente pelo menos 80% semelhantes ou 70% idênticas à proteina madura interferão-alfa humano revelada na ID SEQ NO: 2.

Para determinar se um polipéptido candidato tem a percentagem de semelhança ou identidade necessária relativamente a um polipéptido de referência, a sequência de aminoácidos candidata e a sequência de aminoácidos de referência são primeiramente alinhadas utilizando o algoritmo de programação dinâmica descrito em Smith e Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197, em combinação com a matriz de substituição BLOSUM62 descrita na Figura 2 de Henikoff e Henikoff (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8_9: 10915-10919. Para a presente invenção, um valor apropriado para a penalidade de inserção de hiato é -12 e um valor apropriado para a penalidade de extensão de hiato é -4. Programas computacionais que efectuam alinhamentos utilizando o algoritmo de Smith-Waterman e a matriz BLOSUM62, como o pacote de programas GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Inglaterra), estão comercialmente disponíveis e são amplamente utilizados pelos experimentados na área. 17

Depois de efectuado o alinhamento entre a sequência candidata e a de referência, pode calcular-se uma pontuação de semelhança percentual. Os aminoácidos individuais de cada sequência são comparados sequencialmente de acordo com a sua semelhança entre si. Se o valor da matriz BLOSUM62 correspondente aos dois aminoácidos alinhados for zero ou um número negativo, a pontuação de semelhança em pares é zero; de outro modo, a pontuação de semelhança em pares é 1,0. A pontuação de semelhança em bruto é a soma das pontuações de semelhança em pares dos aminoácidos alinhados. Em seguida, a pontuação em bruto é normalizada dividindo-a pelo número de aminoácidos da menor das sequências candidata ou de referência. A pontuação em bruto normalizada é a semelhança percentual. Alternativamente, para calcular uma identidade percentual, os aminoácidos alinhados de cada sequência são novamente comparados sequencialmente. Se os aminoácidos forem diferentes, a pontuação de identidade em pares é zero; de outro modo, a pontuação de identidade em pares é 1,0. A pontuação de identidade em bruto é a soma dos aminoácidos alinhados idênticos. Em seguida, a pontuação em bruto é normalizada dividindo-a pelo número de aminoácidos da menor das sequências candidata ou de referência. A pontuação em bruto normalizada é a identidade percentual. Para calcular semelhança e identidade percentuais ignoram-se inserções e deleções. Em conformidade, neste cálculo não se usam penalidades de hiato, apesar de serem usadas no alinhamento inicial.

Variantes também podem incluir outras proteínas mutantes de interferão-alfa com actividade do tipo interferão-alfa. Espécies e variantes alélicas incluem, mas não se limitam a estas, sequências de interferão-alfa 18 humano e de ratinho. Variantes de interferão-alfa humano estão apresentadas nas ID SEQ NOS: 8 - 21, e variantes de interferão-alfa de ratinho estão apresentadas nas ID SEQ NOS: 22 - 29.

Suplementarmente, a sequência de interferão-alfa pode compreender uma porção ou a totalidade da sequência de consenso apresentada na ID SEQ NO: 7, em que o interferão-alfa tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70% e muito preferivelmente pelo menos 90% da actividade biológica do interferão-alfa humano maduro da ID SEQ NO: 2, determinada utilizando o ensaio de inibição da proliferação celular do Exemplo 4.

Estas proteínas têm propriedades de purificação e outras propriedades biológicas muito semelhantes. Em particular, as propriedades de manipulação do DNA, expressão da proteína de fusão e purificação da proteína de fusão de proteínas Fc-Interferão-alfa são extremamente semelhantes. Por exemplo, o interferão-alfa 2a humano e interferão-alfa 2b humano diferem apenas num aminoácido, em que o interferão-alfa 2a tem um resíduo lisina na mesma posição em que o interferão-alfa 2b tem um resíduo arginina. O interferão-alfa 2a humano e o interferão-alfa 2b humano têm propriedades extremamente semelhantes e são intermutáveis para todas as finalidades conhecidas. A estrutura tridimensional do interferão-alfa foi resolvida por cristalografia de raios X (Ramaswamy et al. (1986) Structure 4_: 1453) . As sequências de proteínas interferão-alfa são tão semelhantes que a estrutura determinada é considerada a estrutura de toda a família de proteínas. A estrutura tridimensional do interferão-alfa, 19 tal como a do interferão-beta, é um dímero com um ião zinco na interface do dimero. No entanto, em solução, o interferão-alfa comporta-se como um monómero. Foi proposto, por analogia à citoquina IL-β e outros ligandos proteicos, que o interferão-alfa poderá dimerizar por ligação ao receptor (Radhakrishnan, R., et al. (1996) Structure _4: 1453; Karpusas, M., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94_: 11813) . A dimerização de um ligando pode aumentar a afinidade de ligação aparente entre o ligando e o seu receptor. Por exemplo, se uma fraeção interferão-alfa de uma proteína de fusão Fc-Interferão-alfa conseguir ligar-se a um receptor numa célula com uma certa afinidade, a segunda fraeção de interferão-alfa da mesma proteína de fusão Fc-Interferão-alfa poderá ligar-se a um segundo receptor na mesma célula com uma avidez (afinidade aparente) muito mais elevada. Isto pode acontecer devido à proximidade física da segunda fraeção interferão-alfa relativamente ao receptor depois da primeira fraeção interferão-alfa já estar ligada. No caso da ligação de um anticorpo a um antigene, a afinidade aparente poderá aumentar em pelo menos dez mil vezes, isto é, 104. Cada subunidade proteica, isto é, "X", tem a sua própria função independente, de modo que, numa molécula multivalente, as funções das subunidades proteicas poderão ser aditivas ou sinergéticas. Assim, a fusão da molécula Fc normalmente dimérica a interferão-alfa poderá aumentar a actividade do interferão-alfa. Em conformidade, construções do tipo apresentado na Figura IA poderão aumentar a afinidade de ligação aparente entre o interferão-alfa e o seu receptor. 20

As proteínas-alvo reveladas aqui são expressas na forma de proteínas de fusão com uma região Fc de uma imunoglobulina. Como é conhecido, cada região constante da cadeia pesada de imunoglobulina compreende quatro ou cinco domínios. Os domínios são denominados sequencialmente do modo seguinte: CHl-região conectora-CH2-CH3(-CH4) . As sequências de DNA dos domínios da cadeia pesada têm homologia cruzada entre as classes de imunoglobulinas; por exemplo, o domínio CH2 de IgG é homólogo ao domínio CH2 de IgA e IgD e ao domínio CH3 de IgM e IgE.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "região Fc de imunoglobulina" designa a porção carboxi-terminal da região constante da cadeia de uma imunoglobulina, preferivelmente da região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina, ou respectiva porção. Por exemplo, uma região Fc de imunoglobulina pode compreender 1) um domínio CHI, um domínio CH2 e um domínio CH3, 2) um domínio CHI e um domínio CH2, 3) um domínio CHI e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3 ou 5) uma combinação de dois ou mais domínios e uma região conectora de imunoglobulina. Numa especificação preferida, a região Fc de imunoglobulina compreende pelo menos uma região conectora de imunoglobulina, um domínio CH2 e um domínio CH3, e preferivelmente não tem o domínio CHI.

A classe de imunoglobulinas presentemente preferida de onde deriva a região constante da cadeia pesada é IgG (Igy) (subclasses γ 1, 2, 3 ou 4). As sequências de nucleótidos e aminoácidos de Fc γ-l humana estão apresentadas nas ID SEQ NOS: 3 e 4. Podem utilizar-se outras classes de imunoglobulinas, IgA (Iga) , IgD (Igô), IgE (Igs) e IgM 21 (Ιςμ). A escolha de regiões constantes de cadeias pesadas de imunoglobulinas apropriadas é discutida em pormenor nas Patentes U.S. N°s 5 541 087 e 5 726 044. Considera-se que a escolha de sequências de regiões constantes de cadeias pesadas de imunoglobulinas particulares de certas classes e subclasses de imunoglobulinas para obter um resultado particular pertence à experiência na área. A porção da construção de DNA que codifica a região Fc de imunoglobulina compreende preferivelmente pelo menos uma porção de um domínio conector e preferivelmente pelo menos uma porção de um domínio CH3 de Fcy ou dos domínios homólogos em qualquer uma de entre IgA, IgD, IgE ou IgM.

Dependendo da aplicação, podem utilizar-se genes de regiões constantes de espécies diferentes da humana, por exemplo, de ratinho ou rato. A região Fc de imunoglobulina utilizada como parceiro de fusão na construção de DNA pode geralmente provir de qualquer espécie de mamífero. Quando for indesejável induzir uma resposta imunológica na célula ou animal hospedeiro contra a região Fc, a região Fc pode derivar da mesma espécie da célula ou animal hospedeiro. Por exemplo, pode utilizar-se uma região Fc de imunoglobulina humana quando o animal ou célula-hospedeiro for humano; da mesma forma, pode utilizar-se uma região Fc de imunoglobulina murina quando o animal ou célula-hospedeiro for um ratinho.

Sequências de ácidos nucleicos que codificam e sequências de aminoácidos que definem uma região Fc de imunoglobulina humana úteis na prática da invenção são apresentadas nas ID SEQ NOS: 3 e 4. No entanto, é contemplado que podem encontrar-se outras sequências de região Fc de imunoglobulina úteis na prática da invenção, 22 por exemplo, pelas codificadas por sequências de nucleótidos reveladas nas bases de dados Genbank e/ou EMBL, por exemplo, AF045536.1 (Macaca fuscicularis), AF045537.1 (Macaca mulatta), AB016710 (Felix catus), K00752 (Oryctolagus cuniculus), U03780 (Sus scrofa), Z48947 (Camelus dromedarius), X62916 (Bos taurus), L07789 (Mustela vison), X69797 (Ovis aries), U17166 (Cricetulus migratorius), X07189 (Rattus rattus), AF57619.1 (Trichosurus vulpecula) ou AF035195 (Monodelphis domestica), cujas revelações são aqui incorporadas por referência.

Suplementarmente, é contemplado que substituições ou deleções de aminoácidos nas regiões constantes de cadeias pesadas de imunoglobulinas podem ser úteis na prática da invenção. Um exemplo pode incluir introduzir substituições de aminoácidos na parte superior da região CH2 para criar uma variante de Fc com afinidade reduzida para receptores Fc (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613). 0 habitualmente experimentado na área pode preparar essas construções utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular. A utilização de Fcyl como sequência da região Fc tem várias vantagens. Por exemplo, se a proteína de fusão com Fc se destinar a ser utilizada como agente biofarmacêutico, o domínio Fcyl pode conferir à proteína de fusão actividades de funções efectoras. As actividades de funções efectoras incluem as actividades biológicas tais como transferência placentária e tempo de semi-vida aumentado no soro. A região Fc de imunoglobulina também proporciona detecção por ELISA anti-Fc e purificação por ligação à proteína A de Staphylococcus aureus ("Proteína A") . 23

Contudo, em certas aplicações, pode ser desejável apagar da região Fc de imunoglobulina funções efectoras específicas, tais como ligação de receptores Fc e/ou fixação do complemento.

Entende-se que a presente invenção explora metodologias convencionais de DNA recombinante para gerar as proteínas de fusão com Fc úteis na prática da invenção. As construções de fusão com Fc são preferivelmente geradas ao nível do DNA e os DNAs resultantes são integrados em vectores de expressão e são expressos para produzirem as proteínas de fusão da invenção. Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "vector" designa qualquer ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos competente para ser incorporada numa célula-hospedeiro e para ser recombinada com o genoma da célula-hospedeiro e integrada neste, ou para se replicar de forma autónoma como um epissoma. Esses vectores incluem ácidos nucleicos lineares, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, RNA vectores, vectores virais e afins. Exemplos não limitativos de um vector virai incluem um retrovírus, um adenovírus e um vírus adeno-associado. Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "expressão genética" ou "expressão" de uma proteína-alvo designa a transcrição de uma sequência de DNA, tradução do transcrito de mRNA e secreção de um produto de proteína de fusão com Fc.

Um vector de expressão útil é pdCs (Lo et al. (1988) Protein Engineering Γ1: 495) , no qual a transcrição do gene Fc-X utiliza o intensificador/promotor do citomegalovírus humano e o sinal de poliadenilação de SV40. A sequência intensificadora e promotora do citomegalovírus humano utilizada foi derivada dos nucleótidos -601 até +7 da 24 sequência apresentada em Boshart et ai. (1985) Cell 41: 521. 0 vector também contém o gene mutante da di- hidrofolato redutase como marcador de selecção (Simonsen e Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. £0: 2495).

Uma célula-hospedeiro apropriada pode ser transformada ou transfectada com a sequência de DNA da invenção e ser utilizada para a expressão e/ou secreção da proteína-alvo. Células-hospedeiro presentemente preferidas para utilização na invenção incluem células de hibridoma imortal, células de mieloma NS/O, células 293, células de ovário de hamster chinês, células HELA e células COS.

Um sistema de expressão que tem sido utilizado para produzir expressão em níveis elevados de proteínas de fusão em células de mamífero é uma construção de DNA que codifica, na direcção 5' para 3', uma cassete de secreção, incluindo uma sequência de sinal e uma região Fc de imunoglobulina, e uma proteína-alvo. Várias proteínas-alvo foram expressas com êxito nesse sistema e incluem, por exemplo, IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, piG-H3, Receptor de IgG, PSMA e gpl20. Estas construções de expressão são reveladas nas Patentes U.S. N°s 5 541 087 e 5 726 044, atribuídas a Lo et al.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "sequência de sinal" designa um segmento que dirige a secreção da proteína de fusão com interferão-alfa e, em seguida, é clivado após tradução na célula-hospedeiro. A sequência de sinal da invenção é um polinucleótido que codifica uma sequência de aminoácidos que inicia o transporte de uma proteína através da membrana do retículo endoplasmático. Sequências de sinal que são úteis na 25 invenção incluem sequências de sinal da cadeia leve de anticorpos, por exemplo, anticorpo 14.18 (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125: 191), sequências de sinal da cadeia pesada de anticorpos, por exemplo, a sequência de sinal da cadeia pesada do anticorpo M0PC141 (Sakano et al. (1980) Nature 286: 5774) e quaisquer outras sequências de sinal que sejam conhecidas na área (ver, por exemplo, Watson (1984) Nucleic Acids Research 1_2: 5145) .

Sequências de sinal foram bem caracterizadas na área e sabe-se que contêm, tipicamente, 16 até 30 resíduos de aminoácidos, podendo conter mais ou menos resíduos de aminoácidos. Um péptido de sinal típico consiste em três regiões: uma região N-terminal básica, uma região central hidrófoba e uma região C-terminal mais polar. A região central hidrófoba contém 4 até 12 resíduos hidrófobos que procedem à ancoragem do péptido de sinal através da bicamada lipídica membranar durante o transporte do polipéptido nascente. Após a iniciação, o péptido de sinal é habitualmente clivado no lúmen do retículo endoplasmático por enzimas celulares, conhecidas como peptidases de sinal. Os potenciais sítios de clivagem do péptido de sinal seguem geralmente a "regra (-3, -1)". Assim, um péptido de sinal típico tem resíduos de aminoácidos pequenos e neutros nas posições -1 e -3 e não tem resíduos prolina nesta região. A peptidase de sinal irá clivar esse péptido de sinal entre os aminoácidos -1 e +1. Assim, a sequência de sinal pode ser clivada do terminal amino da proteína de fusão durante a secreção. Isto resulta na secreção de uma proteína de fusão com Fc que consiste na região Fc de imunoglobulina e na proteína-alvo. Uma discussão pormenorizada de sequências de péptidos de sinal é proporcionada por von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683. 26

Como será claro para o experimentado na área, a conveniência de uma sequência de sinal particular para utilização na cassete de secreção pode requerer alguma experimentação de rotina. Essa experimentação incluirá determinar a capacidade da sequência de sinal para dirigir a secreção de uma proteína de fusão com Fc e também uma determinação da configuração óptima, genómica ou de cDNA, da sequência a ser utilizada, para obter uma secreção eficiente de proteínas de fusão com Fc. Adicionalmente, o experimentado na área é capaz de criar um péptido de sinal sintético seguindo as regras apresentadas por von Heijne, referido acima, e testar a eficácia dessa sequência de sinal sintética por experimentação de rotina. Uma sequência de sinal também pode ser referida como "péptido de sinal", "sequência líder" ou "péptido líder". A fusão da sequência de sinal e da região Fc de imunoglobulina é por vezes referida aqui como cassete de secreção. Uma cassete de secreção exemplificativa útil na prática da invenção é um polinucleótido que codifica, na direcção 5' para 3', uma sequência de sinal dum gene da cadeia leve de imunoglobulina e uma região Fcyl do gene de imunoglobulina humana γΐ. A região Fcyl do gene Fcyl de imunoglobulina inclui preferivelmente pelo menos uma porção do domínio conector de imunoglobulina e pelo menos o domínio CH3, ou, mais preferivelmente, pelo menos uma porção do domínio conector, o domínio CH2 e o domínio CH3. Tal como é aqui utilizado, entende-se que a "porção" da região conectora de imunoglobulina designa uma porção da região conectora de imunoglobulina que contém pelo menos um, preferivelmente dois resíduos cisteína capazes de formar ligações dissulfureto inter-cadeias. 0 DNA que codifica a cassete de secreção pode estar na sua 27 configuração genómica ou na sua configuração de cDNA. Em certas circunstâncias poderá ser vantajoso produzir a região Fc a partir de sequências da cadeia pesada Fcy2 de imunoglobulina humana. Apesar de fusões com Fc baseadas em sequências γΐ e γ2 de imunoglobulina humana se comportarem de modo semelhante em ratinhos, as fusões com Fc baseadas nas sequências γ2 podem exibir características farmacocinéticas superiores em humanos.

Além disso, a substituição ou deleção de construções destas regiões constantes, em que um ou mais resíduos de aminoácidos dos domínios das regiões constantes estão substituídos ou deletados, também podem ser úteis. Um exemplo consistiria em introduzir substituições de aminoácidos na parte superior da região CH2 para criar uma variante de Fc com afinidade reduzida para receptores Fc (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613). O habitualmente experimentado na área pode preparar essas construções utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular.

Nos Exemplos revelados aqui foram produzidos níveis elevados de Fc-Interferão-alfa. Os clones iniciais produziram cerca de 50 pg/ml de Fc-Interferão-alfa, que foi possível purificar facilmente até à homogeneidade por cromatografia de afinidade com Proteína A. É frequente os níveis de expressão poderem ser aumentados várias vezes por subclonagem. Como afirmado acima, verifica-se que, quando interferão-alfa é expresso na forma de moléculas de fusão com Fc, se obtêm níveis elevados de expressão, presumivelmente por a porção Fc actuar como transportador, ajudando o polipéptido no terminal C a dobrar correctamente e a ser segregado eficientemente. Além disso, a região Fc 28 está glicosilada e tem carga muito elevada ao pH fisiológico; assim, a região Fc pode ajudar a solubilizar proteínas hidrófobas.

Para além dos niveis elevados de expressão, as proteínas de fusão com interferão-alfa exibiram tempos de semi-vida no soro mais longos em comparação com interferão-alfa isoladamente, em parte devido às suas maiores dimensões moleculares. Por exemplo, Fc-Interferão-alfa tem um tempo de semi-vida em circulação de 19,3 horas no ratinho (ver Exemplo 6), em comparação com 2-5 horas para o interferão-alfa ("Physicians Desk Reference", 50a edição, 1996: 2156-2147 e 2364-2373). O interferão-alfa, com um peso molecular de cerca de 19 kD, é suficientemente pequeno para ser eliminado eficientemente por filtração renal. Em contraste, Fc-Interferão-alfa tem um peso molecular de cerca de 100 kD, pois há duas fracções interferão-alfa ligadas a cada molécula de Fc (isto é, dois interferões-alfa, uma vez que Fc está na sua forma dimérica) . Essa estrutura dimérica pode exibir uma afinidade de ligação mais elevada para o receptor do interferão-alfa. Uma vez que a actividade do interferão-alfa é mediada pelo receptor, as proteínas de fusão com interferão-alfa bivalente serão potencialmente mais eficazes do que o próprio interferão-alfa.

Adicionalmente, conhecem-se muitos ligandos proteicos que se ligam aos seus receptores na forma de um dímero. Uma vez que o interferão-alfa pertence a uma classe de ligandos proteicos com fracas constantes de dimerização, a restrição física imposta pelo Fc no interferão-alfa torna dimerização num processo intramolecular, desse modo desviando o equilíbrio em favor do dímero e aumentando a sua ligação 29 aos receptores. Também podem ser introduzidos no monómero resíduos cisteína, por tecnologia comum de DNA recombinante, em sítios apropriados para estabilizar o dímero por formação de ligação dissulfureto covalentes.

As proteínas de fusão da invenção proporcionam vários benefícios clínicos importantes. Como demonstrado nos testes de actividade biológica na célula de Daudi e ensaios de efeito citopático (Exemplo 4), a actividade biológica de Fc-Interferão-alfa é significativamente mais elevada do que a do interferão-alfa.

Um aspecto importante da invenção é o facto das sequências e propriedades de várias proteínas interferão-alfa e DNAs codificadores serem bastante semelhantes. No contexto de fusões Fc-X, as propriedades de proteínas interferão-alfa e DNAs codificadores são essencialmente idênticas, de modo que é possível utilizar um conjunto comum de técnicas para gerar qualquer fusão de DNA de Fc-Interferão-alfa, para expressar a fusão, para purificar a proteína de fusão e para administrar a proteína de fusão para fins terapêuticos. A presente invenção também proporciona métodos para a produção de interferão-alfa de espécies não humanas na forma de proteínas de fusão com Fc. Proteínas de fusão com interferão-alfa não humano são úteis para estudos pré-clínicos de interferão-alfa, uma vez que estudos de eficácia e toxicidade de uma proteína-fármaco devem ser realizados em sistemas de modelos animais antes da realização de testes em seres humanos. Uma proteína humana poderá não funcionar num modelo de ratinho uma vez que a proteína poderá induzir uma resposta imunológica e/ou 30 exibir diferentes propriedades farmacocinéticas, desse modo distorcendo os resultados do teste. Em consequência, a proteína de ratinho equivalente é o melhor substituto para a proteína humana para a realização de testes num modelo de ratinho. A presente invenção proporciona métodos de tratamento de vários cancros, doenças virais, outras doenças, estados relacionados e respectivas causas por administração do DNA, RNA ou proteínas da invenção a um mamífero apresentando esse estado. Estados relacionados podem incluir, mas não se limitam a estes, hepatite B, hepatite C, hepatite D, verrugas genitais, leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi relacionado com SIDA, melanoma, cancro da próstata e outras formas de doenças virais e cancros. Considerando os papéis amplos desempenhados pelo interferão-alfa na modulação de respostas imunológicas, a presente invenção também proporciona métodos de tratamento de estados atenuados pela administração de interferão-alfa. Estes métodos incluem administrar a um mamífero com esse estado, que pode ou não estar directamente relacionado com infecção virai ou cancro, uma quantidade eficaz de uma composição da invenção.

As proteínas da invenção são úteis não só como agentes terapêuticos; o experimentado na área reconhecerá que as proteínas são úteis na produção de anticorpos para aplicações de diagnóstico. Da mesma forma, a administração apropriada do DNA ou RNA, por exemplo, num vector ou outro sistema de distribuição, para essas aplicações está incluída nos métodos de utilização da invenção. 31

Na forma de uma proteína de fusão com a Fc de imunoglobulina, Fc-Interferão-alfa pode ter uma distribuição em tecidos muito favorável e um modo de acção ligeiramente diferente para atingir eficácia clínica, especialmente considerando o seu longo tempo de semi-vida no soro e a dose elevada de proteína solúvel que pode ser administrada. Em particular, há um nível elevado de receptor Fc gama no fígado, que é o sítio da infecção pelos vírus causadores de hepatite B e hepatite D. Pensa-se que ocorrem efeitos secundários neurológicos do interferão-alfa porque a pequena dimensão do interferão-alfa permite-lhe atravessar a barreira hematoencefálica. A dimensão muito maior de Fc-Interferão-alfa reduz significativamente a extensão em que esta proteína atravessa a barreira hematoencefálica.

As composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer via que seja compatível com as moléculas particulares. É contemplado que as composições da presente invenção podem ser administradas a um animal por qualquer meio adequado, directamente (por exemplo, localmente, tal como por injecção, implantação ou administração tópica no locus de um tecido) ou sistemicamente (por exemplo, parentericamente ou oralmente). Quando a composição se destinar a ser administrada parentericamente, tal como por administração intravenosa, subcutânea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intra-orbital, intracerebral, intracraniana, intra-espinal, intraventricular, intratecal, intra-cisterna, intracapsular, intranasal ou por aerossol, a composição compreende preferivelmente parte de uma suspensão ou solução aquosa ou de fluido fisiologicamente compatível. 32

Assim, o transportador ou veículo é fisiologicamente aceitável de modo que, para além da distribuição da composição desejada no paciente, não afecte adversamente o equilíbrio electrolítico e/ou volúmico do paciente. Assim, o meio fluido para o agente pode compreender soro fisiológico normal. A invenção apresenta vectores de expressão para a transfecção e expressão in vivo de uma construção de proteína de fusão de interferão-alfa em tipos de células particulares de modo a reconstituir ou suplementar a função do interferão-alfa. Construções de expressão de construções de proteínas de fusão de interferão-alfa podem ser administradas em qualquer transportador biologicamente eficaz, por exemplo, qualquer formulação ou composição capaz de distribuir eficazmente a construção de proteína de fusão de interferão-alfa em células in vivo. Abordagens incluem a inserção do gene em questão em vectores virais, incluindo retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados e vírus herpes simplex 1 recombinantes ou plasmídeos bacterianos ou eucarióticos recombinantes.

Dosagens preferidas da proteína de fusão por administração situam-se na gama de 0,1 mg/m2 - 100 mg/m2, mais preferivelmente 1 mg/m2 - 20 mg/m2 e muito preferivelmente 2 mg/m2 - 6 mg/m2. No entanto, é contemplado que a dosagem óptima também depende da doença a ser tratada e da existência de efeitos secundários. Contudo, podem determinar-se dosagens óptimas utilizando experimentação de rotina. A administração da proteína de fusão pode ser feita por injecções periódicas de bolus ou por administração intravenosa ou intraperitoneal contínua a partir de um reservatório externo (por exemplo, a partir de 33 um saco intravenoso) ou interno (por exemplo, a partir de um implante bioerodivel). Suplementarmente, é contemplado que as proteínas de fusão da invenção também podem ser administradas no receptor pretendido juntamente com uma pluralidade de diferentes moléculas biologicamente activas. No entanto, é contemplado que a combinação óptima de proteína de fusão e outras moléculas, modos de administração e dosagens podem ser determinados por experimentação de rotina no âmbito da experiência na área. A invenção é suplementarmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Expressão de huFc-huInterferão-alfa (huFc-IFN- alfa)

Preparou-se mRNA a partir de células mononucleares do sangue periférico humano, tendo sido transcrito de forma reversa com transcriptase reversa. 0 cDNA resultante foi utilizado como modelo para Reacções em Cadeia de Polimerase (PCR) , para clonar e adaptar o cDNA de interferão-alfa humano para expressão na forma de uma proteína de fusão huFc-Interferão-alfa (huFc-IFN-alfa). 0 "primer" directo foi 5' C CCG GGT AAA TGT GAT CTG CCT CAG AC (ID SEQ NO: 5), em que a sequência CCCGGG (sítio de restrição XmaI)TAAA codifica o terminal carboxi da cadeia pesada de imunoglobulina, seguida da sequência (a cheio) que codifica o terminal N do interferão-alfa. 0 "primer" reverso foi 5' CTC GAG TCA ATC CTT CCT CCT TAA TC (ID SEQ NO: 6), que codifica a sequência carboxi-terminal (anti-sentido) do interferão-alfa com o seu codão de terminação da tradução (anti-codão, TCA), à qual se seguiu um sítio Xhol (CTCGAG). 34

Um produto de PCR de 517 pares de bases foi clonado e sequenciado. A análise de sequências confirmou que o produto de PCR codifica Interferão-alfa humano maduro adaptado para expressão, isto é, com um Xmal na extremidade 5' e um sitio Xhol na extremidade 3'. 0 vector de expressão pdCs-huFc-IFN-alfa foi construído do modo seguinte. 0 fragmento de restrição Xmal-Xhol contendo o cDNA de interferão-alfa humano foi ligado ao fragmento Xmal-Xhol do vector pdCs-huFc de acordo com Lo et al. (1998) Protein Engineering 1_1: 495. 0 termo huFc designa o fragmento Fc humano da imunoglobulina gama 1 humana. 0 vector resultante, pdCs-huFc-IFN-alfa, foi utilizado para transfectar células de mamífero para a expressão de huFc-IFN-alfa.

Exemplo 2. Transfecção e Expressão da Proteína

Para a transfecção transitória, o plasmídeo pdCs-huFc-IFN-alfa foi introduzido em células 293 de rim humano por coprecipitação de DNA plasmídico com fosfato de cálcio (Sambrook et al., editores (1989) "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, NI) ou por lipofecção utilizando Lipofectamina Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante.

Para obter clones transfectados de forma estável, introduziu-se DNA plasmídico em células NS/0 de mieloma de ratinho por electroporação. Em resumo, células NS/0 cresceram em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com soro fetal de bovino 10%, glutamina 2 mM e penicilina/estreptomicina. Cerca de 5xl06 células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato 35 (PBS) e foram novamente suspensas em 0,5 ml de PBS. Depois incubaram-se com as células 10 μς de DNA plasmidico linearizado numa Cuveta Gene Pulser (hiato de eléctrodos 0,4 cm, BioRad) em gelo durante 10 minutos. Realizou-se a electroporação utilizando um Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) com os parâmetros 0,25 V e 500 μΐ. Deixou-se as células recuperarem durante 10 minutos em gelo, após o que foram novamente suspensas em meio de crescimento e depois plaqueadas em placas de 96 cavidades. Seleccionaram-se os clones transfectados de forma estável por crescimento na presença de metotrexato (MTX) 100 nM, que foi introduzido dois dias pós-transfecção. As células foram nutridas de 3 em 3 dias mais duas ou três vezes, e clones resistentes ao MTX apareceram em 2 até 3 semanas. Avaliaram-se sobrenadantes dos clones por ELISA anti-Fc (ver Exemplo 3) para identificar produtores com alto rendimento. Os clones com produção de alto rendimento foram isolados e propagados em meio de crescimento que continha MTX 100 nM.

Para caracterização de rotina por electroforese em gel, as proteínas de fusão com Fc no meio condicionado foram ligadas a Proteína A Sefarose (Repligen, Cambridge, MA) e depois eluíram da proteína A Sefarose por ebulição num tampão padrão de amostra de proteína com ou sem 2-mercaptoetanol. Após electroforese num gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), visualizaram-se as bandas proteicas por coloração com azul de Coomassie. Por SDS-PAGE, a huFc-huInterferão-alfa tinha um PM aparente de cerca de 52 kD.

Para a purificação, as proteínas de fusão ligadas a Proteína A Sefarose eluíram num tampão de fosfato de sódio (NaH2P04 100 mM, pH 3, e NaCl 150 mM). Em seguida, o eluato 36 foi imediatamente neutralizado com 0,1 volumes de Tris-cloridrato 2 M, pH 8.

Exemplo 3. Procedimentos de ELISA

Determinou-se a concentração de produtos proteicos contendo Fc humana nos sobrenadantes de clones resistentes ao MTX e noutras amostras de teste por ELISA anti-huFc. Os procedimentos são descritos em pormenor abaixo. A. Revestimento de placas

Placas de ELISA foram revestidas com IgG anti-Humana de Cabra AffiniPure (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) a 5 pg/ml em PBS e 100 μΐ/cavidade em placas de 96 cavidades (Nunc-ImmunoPlate Maxisorp). As placas revestidas foram tapadas e incubadas a 4 °C durante a noite. Em seguida, as placas foram lavadas 4 vezes com Tween 0,05% (Tween 20) em PBS e foram bloqueadas com BSA 1%/soro de cabra 1% em PBS, 200 μΐ/cavidade. Após incubação com o tampão de bloqueio a 37 °C durante 2 horas, as placas foram lavadas 4 vezes com Tween 0,05% em PBS e foram secas em toalhas de papel. B. Incubação com amostras de teste e anticorpo secundário

Diluiram-se amostras de teste, consoante o apropriado, em tampão de amostra (BSA 1%/soro de cabra 1%/Tween 0,05% em PBS). Preparou-se uma curva padrão utilizando um anticorpo quimérico (com uma Fc humana) cuja concentração era conhecida. Para preparar uma curva padrão, fizeram-se diluições em série no tampão de amostra para dar origem a uma curva padrão variando desde 125 ng/ml até 3,9 ng/ml. Adicionaram-se à placa as amostras e padrões diluidos, 100 μΐ/cavidade, e incubou-se a placa a 37 °C durante 2 horas. 37

Após a incubação, a placa foi lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. Em seguida, adicionou-se a cada cavidade 100 μΐ do anticorpo secundário, a IgG anti-humana conjugada com peroxidase de rábano bravo (Jackon Immuno Research), diluída cerca de 1:120 000 no tampão de amostra. É necessário determinar a diluição exacta do anticorpo secundário para cada lote de IgG anti-humana conjugada com HRP. Após incubação a 37 °C durante 2 horas, a placa foi lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. C. Desenvolvimento

Adicionou-se a solução de substrato a placa a 100 μΐ/cavidade. Preparou-se a solução de substrato dissolvendo 30 mg de OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina (OPD)) (1 pastilha) em 15 ml de tampão de Ácido cítrico 0,025 M/Na2HPC>4 0,05 M, pH 5, que continha 0,03% de peróxido de hidrogénio adicionado de fresco. Deixou-se desenvolver a cor durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. O tempo do desenvolvimento está sujeito a alterações, dependendo da variabilidade entre lotes das placas revestidas, do anticorpo secundário, etc. A reacção foi terminada por adição de ácido sulfúrico 4 N, 100 μΐ/cavidade. A placa foi lida com um leitor de placas, ajustado para 490 e 650 nm e programado para subtrair a OD de fundo a 650 nm da OD a 490 nm.

Exemplo 4. Bioensaios

Comparou-se a bioactividade de huFc-huIFN-alfa com a do interferão-alfa humano (hu-IFN-alfa) interferão de leucócitos humanos da Sigma, St. Louis, MO) utilizando dois ensaios diferentes. O primeiro ensaio determina a inibição da proliferação da linha de células B linfoblastóides 38 humanas Daudi (ATCC CCL 213) . 0 segundo ensaio mede a inibição do efeito citopático do vírus da encefalomiocardite (EMCV) na linha de células A549 de carcinoma do pulmão humano (ATCC CCL 185). 0 interferão-alfa inibe a proliferação de células Daudi (linfoma de Burkitt humano). Células Daudi foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 sem soro e foram novamente suspensas em meio de crescimento que consistiu em RPMI 1640 e soro fetal de bovino inactivado pelo calor (56 °C) 20%. Em seguida, as células foram plaqueadas, a lxlO5 células/ml/cavidade, numa placa de 24 cavidades na presença de diferentes concentrações de alFH (2,1 x 106 Unidades internacionais/mg) e huFc-huIFN-alfa. Após 3-4 dias, verificou-se que 50 pg/ml de IFN-alfa na forma de huFc-huIFN-alfa foram tão eficazes quanto 750 pg/ml de huIFN-alfa para atingir 50 - 100% de inibição do crescimento de células Daudi. Como controlo, interferão-gama (Pharmingen, San Diego, CA) a 100 ng/ml não exibiu actividade neste ensaio. Este resultado demonstra que a inibição é específica do interferão-alfa.

Exemplo 5. Medição da Actividade Antiviral A replicação virai em culturas de células resulta frequentemente em citotoxicidade, um efeito conhecido como efeito citopático (CPE). Os interferões podem induzir um estado antiviral em culturas de células e proteger as células desse CPE. Pode quantificar-se a actividade antiviral do IFN-alfa por ensaios de redução do efeito citopático (CPER), como descrito em "Lymphokines and Interferons: A Practical Approach", editado por M. J. Clemens, A. G. Morris e A. J. H. Gearing, I.R.L. Press, Oxford, 1987. Compararam-se as actividades antivirais de 39 huFc-huIFN-alfa e huIFN-alfa utilizando a linha de células de carcinoma do pulmão humano A549 (ATCC CCL 185) e vírus da encefalomiocardite (ATCC VR 129B) de acordo com o protocolo de CPER descrito na referência acima. Verificou-se que as doses eficazes para originar 50% de CPER (isto é, 50% de protecção) eram 570 pg/ml (com base na quantidade de IFN-alfa) para huFc-huIFN-alfa e 500 pg/ml para huIFN-alfa. Em conformidade, o IFN-alfa em huFc-huIFN-alfa e huIFN-alfa tem actividade antiviral substancialmente equivalente.

Exemplo 6. Farmacocinética

Determinou-se a farmacocinética de huFc-huIFN-alfa num grupo de 4 ratinhos Balb/c. Injectaram-se vinte e cinco miligramas de huFc-huIFN-alfa na veia da cauda de cada ratinho. Obteve-se sangue por sangria retro-orbital imediatamente após a injecção (isto é, aos t = 0 minutos) e às 0,5, 1, 2, 4, 8 e 24 horas após a injecção. Recolheram-se amostras de sangue para tubos que continham heparina, para evitar a coagulação. Removeram-se células por centrifugação numa microcentrifugadora de alta velocidade Eppendorf durante 4 minutos. Mediu-se a concentração de huFc-huIFN-alfa no plasma por ELISA anti-huFc e análise de coloração "Western" com anticorpo anti-huFc, que também mostrou que o huFc-huIFN-alfa permaneceu intacto em circulação (banda de 52 kD para huFc-huIFN-alfa) . Não se conseguiu detectar nenhum produto de degradação (banda de 32 kD para huFc). Determinou-se o tempo de semi-vida em circulação de huFc-huIFN-alfa, que foi 19,3 horas, significativamente mais longo do que o tempo de semi-vida em circulação relatado do IFN-alfa humano, cerca de 2 até 5 horas ("Physicians Desk Reference", 50a edição, 1996: 2145-2147 e 2364-2373). 40

Exemplo 7. Tratamento do Crescimento Disseminado de Linfoma de Burkitt Humano em Ratinhos SCID Células Daudi (linfoma de Burkitt humano) cresceram nos ratinhos C.B-17 SCID (Imunodeficiência Combinada Grave) na forma de tumores disseminados (Ghetie et al. (1990) Intl. J. Câncer jL5: 481) . Cerca de 5xl06 células Daudi de uma única suspensão de células em 0,2 ml de PBSB foram injectadas intravenosamente em ratinhos SCID com 6-8 semanas de idade. Três dias depois, os ratinhos foram separados aleatoriamente em três grupos de oito e receberam diariamente injecções intraperitoneais de 0,2 ml de PBS, 30 μς de huFc-huIFN-alfa (contendo cerca de 12 μς de IFN-alfa) em PBS ou 60 μς de huFc-huIFN-alfa em PBS. Os ratinhos foram monitorizados diariamente. Os resultados estão apresentados na Figura 2.

Cerca do Dia 28 após a injecção de células Daudi, todos os ratinhos do grupo de controlo de PBS (losangos) desenvolveram paralisia dos membros traseiros. Os ratinhos deste grupo de controlo de PBS começaram a morrer no Dia 38 e cerca do Dia 61 todos os ratinhos do grupo de controlo morreram. Em contraste, os ratinhos dos grupos de tratamento sobreviveram muito mais tempo e de um modo dependente da dose. Para o grupo que recebeu 30 μρ de huFc-huIFN-alfa (cruzes), a primeira morte ocorreu no Dia 70 e todos os ratinhos morreram cerca do Dia 134. Para o grupo que recebeu 60 μg de huFc-huIFN-alfa (triângulos), a primeira morte só ocorreu no Dia 126 e mais quatro morreram no Dia 153. Os restantes ratinhos estavam doentes e foram submetidos a eutanásia. 41

Exemplo 8. Tratamento do Crescimento Localizado de Linfoma de Burkitt Humano em ratinhos SCID

Neste modelo, células Daudi cresceram nos ratinhos C.B-17 SCID na forma de tumores subcutâneos (Ghetie et ai. (1990) Int. J. Câncer 4L5: 481) . Cerca de 6xl06 células Daudi de uma única suspensão de células em 0,1 ml de PBS foram injectadas subcutaneamente em ratinhos SCID de 6 - 8 semanas de idade. O tratamento foi iniciado quando a dimensão dos tumores atingiu 200 - 400 mm3, o que demorou cerca de 4 semanas. Os ratinhos foram separados aleatoriamente em 3 grupos de 8 e cada grupo recebeu 6 injecções intraperitoneais diárias de 0,2 ml de PBS, 30 pg de huFc-huIFN-alfa em PBS ou 60 μg de huFc-huIFN-alfa em PBS. Os resultados estão apresentados na Figura 3. Mediu-se a dimensão dos tumores duas vezes por semana.

Os tumores dos ratinhos do grupo de controlo (losangos) cresceram rapidamente para um volume médio de 5602 mm3 (gama: 4343 - 6566 mm3) cerca do dia 35, após o que todos os ratinhos do grupo foram submetidos a eutanásia. Em contraste, o crescimento dos tumores dos ratinhos dos grupos de tratamento foram suprimidos de uma forma dependente da dose. Os grupos que receberam 30 pg e 60 pg de huFc-huIFN-alfa tinham volumes tumorais médios de 214 e 170 mm3, respectivamente, no dia 35, mais pequenos do que 268 e 267 mm3 antes do tratamento. De facto, os tumores subcutâneos retraíram completamente em 5 de 8 ratinhos no grupo que recebeu 30 pg de huFc-huIFN-alfa e em 4 de 8 ratinhos do grupo que recebeu 60 pg de huFc-huIFN-alfa. No entanto, sem tratamento adicional, alguns dos tumores regressaram e cresceram. Ainda assim, dois ratinhos do 42 grupo não apresentaram tumores até ao dia 205, quando a experiência foi terminada.

Exemplo 9. Tratamento de Doença do Fígado com Fc-Interferão-alfa É contemplado que uma doença do fígado, por exemplo, hepatite ou metástases no fígado, pode ser tratada mais eficazmente com Fc-Interferão-alfa do que com interferão-alfa ou interferão-alfa-Fc.

Por exemplo, é contemplado que Fc-interferão-alfa pode ser eficaz no tratamento de um modelo de ratinho no qual células tumorais formam metástases no fígado. Os ratinhos são anestesiados por injecção intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina em 0,2 ml de PBS cerca de 5 minutos antes da cirurgia. Depois realizam-se os passos seguintes numa hote de fluxo laminar, para assegurar esterilidade. A pele de cada ratinho é limpa com betadine e etanol. Células tumorais, como células Daudi, são inj ectadas em 100 microlitros de meio RPMI 1640, sem suplemento, por baixo da cápsula esplénica durante um período de cerca de um minuto, utilizando uma agulha de calibre 27. Após dois minutos, o pedículo esplénico é ligado com uma sutura de seda 4.0 e o baço é removido.

Algumas células são transportadas do sítio da injecção para o fígado, onde podem formar tumores metastáticos. Em seguida, ratinhos com tumores metastáticos no fígado são tratados com Fc-interferão-alfa. É contemplado que ratinhos tratados com Fc-interferão-alfa exibem uma redução significativa do crescimento tumoral relativamente a ratinhos tratados com uma quantidade equimolar de interferão-alfa ou proteína de fusão interferão-alfa-Fc. 43

Suplementarmente, é contemplado que o efeito específico de Fc-interferão-alfa é mais pronunciado no tratamento de doença do fígado do que no tratamento de perturbações localizadas noutros tecidos onde Fc-interferão-alfa não está concentrado. 44

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Lo, Kin-Ming Sun, Yaping Gillies, Stephen D. Lexigen Pharmaceuticals Corp. <120> Expressão e Exportação de Proteínas Interferão-Alfa na Forma de Proteínas de Fusão com Fc <130> <14 0> < 141 > LEX-009 PC <150> <151> US 60/134,895 1999-05-19 < 16 0 > 29 <17 0> Patent In Ver. 2.0 <210> <211> <212 > <213> 1 498 DNA Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(498) <223> Sequência de DNA de IFN alfa humano <400> 1 tgt gat ctg cct cag acc cac age etg ggt aat agg agg gsc ttg ata 48

Cys Asp Leu. Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Xis 1 5 10 15 etc ctg gea caa atg gga aga ate tet cct ttc tcc tgc ctg aag gac Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 2S 30 96 45 45 aga cat gac ttt gga ttc ccc cag gag gag ttt gat ggc aac cag ttc Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Aap Gly Asn Gin Phe 35 40 45 cag aag gct caa gcc ate çct gte ctc cat gag atg ate cag cag acc Gin Lys Ala Gin Ala Xle Pro Vai Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr 50 55 60 ttc aat ctc ttc age aca aag gac tea tet gct act tgg gaa cag age Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser 65 70 75 80 ctc cta gaa aaa ttt tcc act gaa ctt aac cag cag ctg aat gac ctg Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Aap Leu 85 90 95 gaa gcc tgc Stg ata cag gag gtt ggg gtg gaa gag act cec ctg atg Glu Ala Cys vai Ile Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Thr Pro Leu Hat 100 105 110 144 192 240 288 336 aat gtg gac tcc ate ctg gct gtg aag aaa tac ttc caa aga ate act Asn Vãl Asp Ser Ile Leu Ala vai Lys Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr 115 120 125 ctt tat ctg aca gag aag aaa tac age cct tgt gcc tgg gag gtt gte Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Val 130 13 S 140 aga gea gaa ate atg aga tcc ttc tet tta tea aaa att ttt caa gaa Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lya lie Phe Gin Glu 145 150 155 160 aga tta agg aag aag gat Arg Leu Arg Lys Lys Asp 165 384 432 480 498 <210 > 2 <211> 166

<212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys A9p 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Ala Gin. Ala Ile Pro Val Leu Kis Glu Met Ile Gin Gin Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser 65 70 75 80 46 46 Leu Leu Glu Lya Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn 85 90 Glu Ala Cys Vai Ile Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Thr PrO 100 105 110 Asn Vai Asp Ser lie Leu Ala Vai Lys Lys Tyr Phe Gin Arg 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu 130 135 140 Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe 145 150 155 Arg Leu Arg Lys Lys Asp 165

Agp Leu

Leu Met

Ils Thr

Val Vai

Gin Glu 160 <210 > 3 <211> 696

<212> DNA <213> Homo sapiens <2 2 Ο >

<2 21> CDS <222> (1)..(696) <223> Sequência de DNA de Fc humano <400> 3 gas ccc aaa tet tet gac aaa act cac aca tgc cca ceg tgc cca gça Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 cct gaa ctc ctg ggg gga ecg tea gte ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 aag gac acc ctc atg ate tec cgg acc cct gag gte aca tgc gtg gtg Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Val Val 35 40 45 gtg gac grg age ca c gaa gac cct gag gte aag ttc aac tgg tac gtg Val Asp Vai Ser Kis Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 gac ggc gtg gag gcg cat aat gee aag aca aag ceg cgg gag gag cag Asp Gly Vai Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 73 80 tac aac age acg tac cgt fftg gte age gte ctc acc gte ctg cac câg Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai vai Ser Vai Leu Thr Val Leu His Gin 85 90 95 gac tgg ctg aat sge aag gag tac aag tgc aag gte tec aac aaa gee Aap Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 48 96 144 192 240 288 336 47 etc cca gee ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gee aaa ggg cag ccc 384 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Qln Pro 115 120 125 cga gaa cca cag gtg tac aec ctg ccc cca tea cgg gag gag atg acc 432 Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 aag asc eag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age 460 Lys Asa Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 gac ate gee gtg gag teg gag age a&t ggg cag ccg gag aac aac tac 528 Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 no 175 aag acc acg cct cec gtg ctg gac tcc gac 930 tcc ttc ttc ctc tat 576 Lyg Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser ?he Phe Leu Tyr 180 185 190 age aag etc ace gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 624 Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe iô5 200 205 tea tgc tcc STtg atg cafc gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 672 Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu HiS Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220 age ctc tee ctg tcc eeg ggfc aaa 696 Ser Leu Ser Ser Pro Gly Lys 225 230 <210 > 4 <211> 232

<212 > PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 4

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 35 40 45 Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai 50 55 €0 Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala. Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 100 105 110 48

Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr 11« Ssr Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 ISO 155 ISO Asp He Ale Vai GlU Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 ISO Ser Lys Leu Thr Val ASP Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 1SS 200 205 Ser Cys Ser Vai Met Hls Glu Ala Leu His Asn Ris Tyr Thr Gin Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 22S 230 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> "Primer " directo de <4 0 0 > 5 cccgg; gtaaa tgtj gatctgc cteagai <210 > 6 <211 > 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <4 0 0 > CÍCÇjSl· 6 gtcaa tcc ttcctcc ttaatc <210> 7 <211> 162 <212> DNA <213> Homo sapiens <2 2 Ο > 49 <223> Sequência de consenso de IFN alfa em que Xaa, em qualquer posição para além das posições 24, 31, 70 e 129, representa qualquer aminoácido. <2 2 0 > <223> Xaa24 pode ser Ile ou Leu, Xaa31 pode ser Lys ou Gin, Xaa70 pode ser Thr ou Ser e Xaa 129 pode ser Leu ou Vai. <4 0 0 > 7 cys Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lêu xaa xaa xaa Xaa Xaa Leu Xaa

15 10 IS

Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Xaa Ser Pro Xaa Xaa Cys Leu Xaa Xaa 20 35 30

Arg xaa Asp Phe Xaa Xaa Pro Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gin Xaa 35 40 45

Xaa Xaa Xaa Gin Ala Xaa Xaa Vai Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gin Gin Xaa 50 55 60

Xaa Xaa Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ala Xaa Trp Xaa Xaa Thr 65 70 75 80

Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Gin Gin Leu Xaa Asp Leu 85 50 95

Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 100 105 110

Xaa Vai Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Vai Xaa Xaa Tyr Phe Xaa Xaa lie Xaa 115 120 125

Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Ser Xaa Cys Ala Trp Glu Xaa Xaa 130 135 140

Xaa xaa xaa xaa Mefc Arg xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa xaa Leu Xaa Xaa 145 150 155 160

Arg Leu <210 > 8 <211> 166

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-1 humana < 4 0 0 > 50

Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 is Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg Xle Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg His ASp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Ala Pro Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Leu Ile Gin Gin Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 80 95 Glu Ala Cys Vai Met Gin Glu Glu Arg Vai Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Vai Lys Lys Tyr Phe Arg Arg ile Thr 115 12 G 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu vai val 130 05 140 Arg Ala Glu Xle Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin GlU 145 ISO 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 9 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-2 humana <400> 9

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 S 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Arg Lys ile Ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

Arg Bis Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin 35 40 45

Lys Ala Glu Thr Xle Fro Vai Leu Eis Glu Met lie Gin Gin Ils Phe 50 55 60 51

Aan Leu lhe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Vai Ile Gin Gly Vai Gly Vai Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 10S 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pr© Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser 14 S ISO 1S5 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 10 <211> 166

<212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> Proteína IFN alfa-4 humana <4 0 0> 10

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Bis Asp Phe Gly phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly HÍS Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Thr Gin Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr &ô 55 60 Phe Αεη Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 65 SO S5 Glu Ala Cys Vai lie Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Thr Pro Leu Met ICO 105 110 52

Asa Vai Asp Set Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys 145 150 155 160

Arg Leu Axg Arg Lys Asp 165 <210> 11 <211> 166

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-5 humana <4 0 0 > 11

Cys Asp Leu Pró Gin Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Ile Met Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Met ile Gin Gin Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Met Met Gin Glu Vai Gly Vai Glu Asp Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Vai Asp Ser 11« Leu Thr Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140 Arg Ala Glu ne Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gin Glu 145 150 155 16 Q Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 53 <210> 12 <211> 166

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-6 humana <4 0 0> 12

Cys Asp Leu Pró Gin Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 S 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg lie Ser Leu Phe ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Glu phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Glu Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Vai Ile Gin Gin Thr 50 55 $0

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Vai Ala Trp Asp Glu Arg 65 70 75 §0

Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95

Glu Ala Cys vai Met Gin Glu Vai Trp Vai Gly Gly Thr Pro Leu Met 100 105 * lio

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vâl 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gin Glu 145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 13 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-7 humana <4 0 0> 13

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Xle 1 5 10 is 54

Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly Eis Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Thr Gin Ala 11« ser vai Leu Eis Glu Met Ile Gin Gin Thr 50 55 60 &he Asa Leu Pha Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser €5 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu 65 90 95 Glu Ala Cys Vai Ile Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Mefc Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 MO Arg Ala Glu Ile Met Arg ser Phe Ber phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys 145 1.50 155 160 Gly Leu Arg Arg Lys Asp 165 <210 > 14 <211> 166

<212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 Ο > <223> Proteína IFN alfa-8 humana <4 0 0 > 14

Cys Asp Leu Pro Gin Thr HiS Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5' 10 15 Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe GlU Phe Pro Gin GlU Glu Phe Asp Asp Lys Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Ala Gin Ala ile Ser Vai Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr 65 70 75 60 55

Leu Leu Asp Glu Píie Tyr Ile Glu Leu Asp Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 50 95

Glu Vai Leu Cys Asp Gin Glu Vai Gly Vai Ile Glu Ser Pro Leu Met 10Q 195 110

Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser cys Ala Trp Glu vai vai 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Ket Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gin Lys 145 150 155 ISO

Arg Leu Lys Ser Lys Glu 1S5 <210> 15 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-10 humana < 4 0 0 > 15

Glu Ala Cys Vai 100 Asn Glu Asp Ser 115 Gin Thr HÍS ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile S 10 15 Met Gly Arg Ile Ser Pro phe Ser Cys Leu Lys Asp 25 30 Arg Ile Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 40 45 Ala lie Ser Vai Leu Hís Glu Met Ile Gin Gin Thr 55 60 Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser 70 75 80 Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu @5 90 95 Ile Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Thr Pro Leu Ket 105 110 Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 120 125

Cys Asp Leu Pro 1

Leu Leu Gly Gin 20

Arg Bis Asp Phe 35

Gin Lys Ala Gin 50

Phe Asn Leu Phe 65

Leu Leu Glu Lys 56

Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys 145 ISO 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp 165 <210> 16 <211> 170

<212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0 > <223> Proteína IFN alfa-14 humana <400> 16

Cys Ser Leu Gly Cys Asn Léu Ser Gin Thr His Ser Leu Asn Asa Arg 1 S 10 15 Arg Thr Leu Met Leu Met Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser 20 25 30 Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp 35 40 45 Gly Asa Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met SÓ 55 60 Met Gin. Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala 65 70 75 80 Trp Asp Glu Thr Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gin Gin 05 50 95 Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu 100 105 110 Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe 115 120 125 Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 130 135 140 Trp GlU val Vai Arg Ala Glu xle Met Arg ser Phe ser Phe Ser Thr 145 150 155 160 Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp 165 170 <210> 17 <211> 166 <212> PRT 57 <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-16 humana <400> 17

Cys Asp Leu Pro Gin Thr Hís Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ale Leu Ile 1 5 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Vai Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met ile Gin Gin Thr 50 55 60

Phe Asa Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 50 55

Glu Ala Cys Vai Thr Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Ile Ala Leu Met

100 105 UO

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140

Arg Ala Glu ile Met Arg Ser Phe Ser Phe ser Thr Asn Leu Gin Lys 145 150 155 160

Gly Leu Arg Arg Lys Asp 165 <210> 18 <211> 166

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN alfa-17 humana <400> 18

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile 15 ÍÕ 15

Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 58

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Glu phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Thr Gin Ala Xle Ser Vai Leu Kís Glu Mefc ile Gin Gin Thr 50 S§ 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asn Leu 55 90 95 Glu Ale cys Vai He Gin Glu Vai Gly Met Glu Glu Thr Pr© Leu Met 100 105 110 Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr US 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pr© Qys Ala Trp Glu val Val os 135 140 Arg Ala Glu Xle Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys 145 150 155 160 lie Leu Arg Arg Lys Asp 165 <210 > 19 <211> 166

<212 > PRT <213> Homo sapiens <2 2 Ο > <223> Proteína IFN alfa-21 humana <4 0 0 > 19

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45 Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu HiS Glu Met Ile Gin Gin Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Asp Leu 8 5 90 95 59

Glu Ala Cys Vai He Gin Glu Vai Gly Vai Glu Gin Thr Pro Leu Met 10Q 105 110

Asn Vai Asp Ser He Leu Ala Vai Lys Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140

Arg Ala Glu IIe Met Arg ser phe Ser Leu Ser Lys He Phe Gin Glu 145 ISO 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 20 <211> 172

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Proteína IFN delta-1 humana <4 0 0 > 20

Cys Asp Leu Ser Gin Asn His val 1 5 Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu 20 Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gin 35 40 Gin Glu Alâ Gin Ala Ile Ser Val 50 55 Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His 65 70 Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly 85 Asp Ala Cys Leu Gly Gin Val Mefc 1G0 Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu 115 120 val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr 130 135

Leu Vai Gly Arg Lys Asn Leu Arg 10 15

Ser Pro Sis Phe Cys Leu Gin Asp 25 30

Glu Ket Vai Glu Gly Gly Gin Leu 45

Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ser 60

Ser ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 75 80

Leu Bis Gin Gin Leu Asp Asn Leu 00 05

Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly 105 110

Lys Arg Tyr Phe Gin Gly Ile His 125

Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Vai 140 60

Arg Leu Glu Ile Mefc Arg Ser Phe Ser Ser Leu ile Ser Leu Gin Glu 14 S ISO 155 160 Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro 165 170 <210 > 21 <211> 172 <212> PRT <213> Home 1 sapiens <220> <223> Proteína IFN ómega-1 humana <4 0 0 > 21 Cys Asp Leu Pro Gin Aan His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu Vai 1 5 10 15 Leu Leu Bis Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Vai Lys Gly Ser Gin Leu 35 40 45 Gin Lys Ala His Vai Met Ser Vai Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ile 50 55 60 Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His Gin Gin Leu Gin His Leu 85 SO 55 Glu Thr Cys Leu Leu Gin Vai Vai Gly Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala 100 105 110 XIe Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg 115 120 125 Vai Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu 'Vai Vai 130 135 140 Arg Mefc Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Ser Lys Asp ftrg Asp Leu Gly Ser Ser 165 170 <210> 22 <211> 166

<212> PRT <213> Mus musculus 61 <220> <223> Proteína IFN alfa-1 de ratinho <400> 22

Cys Asp Leu Pro Gin Thr Sis Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Thr 15 10 15

Leu Leu Vai Gin Mefc Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

Arg Lys Asp Phe Oly Phe Pro Gin Glu Lys vai Aap Ala Gin Gin Ile 35 40 45

Lys Lys Ala Gin Ala Ile Pro Vai Leu Ser Glu Leu Thr Gla Gin Ile 50 55 60

Leu Asn Ile Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr 65 70 75 S0

Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn Asp Leu Hia Gin Sla Leu Asn Asp Leu 85 S0 95

Gin Oly Cys Leu Met Gin Gin Vai Gly Vai Gin Glu Phe Pro Leu Thr 100 105 110

Gin Glu Asp Ala Leu Leu Ala Vàl Arg Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr 115 120 125

Vai Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro cys Ala Trp Glu Vai vai 130 135 140

Arg Ala Glu Vai Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Ala Asn Vai Leu Gly 145 ISO 1S5 160 Arg Leu Arg Glu Glu Lys 165 <210 > 23 <211 > 167 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Proteína IFN alfa-2 de ratinho <400> 23 Cys Asp Leu Pro His Thr Tyr Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Lys 1 5 10 15 vai Leu Ala Gin Met Arg Arg Leu Pro Phe Leu Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30

Arg Glu Asp Phe Gly Phe Pro Leu Glu Lys Vai Asp Asn Gin Gin Ile 35 40 45 62

Gin Lys Ala Gin Ala Ile Pro vai Leu Arg Asp Leu Thr Gin Gin Thr so 55 60

Leu Asn Leu Phe Thr Ser Lys Ala Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn A$p Leu His Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 SO 95

Gin Thr Cys Leu Met Gin Gin Vai Gly Vai Gin Glu Pro Pro Leu Thr 100 105 110

Gin Glu Asp Ala Leu Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr 115 120 125

Vai Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai vai 130 135 140

Arg Ala Glu Vai Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Vai Asn Leu Leu Pro 143 150 155 160

Arg Leu Ser Glu Glu Lya Glu 165 <210> 24 <211> 162

<212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> Proteína IFN alfa-4 de ratinho <4 0 0 > 24

His Thr Tyr Asn Leu Gly Asn Lys Arg Ala Leu Thr 5 10 15 Met Arg Arg Leu Pro Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 25 30 Gly Phe Pro Leu Glu Lys vai Asp Asn Gin Gin Ile 40 45 Ala Ile Leu Vai Leu Arg Asp Leu Thr Gin Gin Ile 55 60 Thr Ser Lys Asp Leu Ser Ala Thr Trp Asn Ala Thr 70 75 80 Phe Cys Asn Asp Leu His 6ln Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Met Gin Glu Pro Pro Leu Thr Gin Glu Asp Ser Leu 105 110

Cys Asp Leu Pro 1

Vai Leu Glu Glu 20

Arg Lys Asp Phe 35

Slrt Lys Ala Gin 50

Leu Asn Leu Phe 65

Leu Leu Asp Ser

Lys Ala Cys Vai 100 63

Leu Ma Vai Arg Thr Tyr Phe His Arg Ile Thr Vai Tyr Leu Arg Lys 115 120 12S

Lys Lys His Ser Léu Cys Ala Trp Glu Vai Ile Arg Ala Glu Val Trp 130 135 140

Arg Ala Leu ser Ser ser Thr Asa Leu Leu Ale Arg Leu Ser Glu Glu 145 150 155 160

Lys Glu <210 > 25 <211> 155

<212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> Proteína IFN alfa-5 de ratinho <4 0 0 > 25

Cys Asp Leu Leu Gin Thr His Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Thr 1 S 10 15 Leu Leu Val Lys Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Lys Val Gly Ala Gin Gin Ile 35 40 45 Gin Glu Ala Gin Ala Ile Pro val Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin val 50 55 60 Leu Asn Ile Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn Glu Val His Sln Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Lys Ala Cys Val Met Gin Gin Val Gly Val Gin Glu Ser Pro Leu Thr 100 105 110 Gin Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg ile Thr 115 120 125 Vai Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Val Asn. Leu Leu Ala 145 150 155 160 Arg Leu Ser Lys Glu Glu <210> 26 165 64 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Proteína IFN alfa-6 de ratinho <400> 26

Cys ASp Leu Pro Gin Thr Eis Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Thr 1 S 10 15 Leu Leu Vai Lys Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Lys ASp Phe Gly Phe Pro Gin GlU Lys Val Gly Ala Gin Gin Ile 35 40 45 Gin Glu Ala Gin Ala lie Pro Val Leu Thr Glu Leu Thr Gin Gin Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Phe Thr Ser Lys Asp ser Ser Ala Alà Trp Asn Ala Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn Asp Leu His Glu Leu Leu Asn Asp Leu S5 90 95 Gin Qly Cys Leu Met Gin Gin Val Glu Ile Gin Ala Leu Pro Leu Thr 100 105 110 Gin Glu Asp Ser Leu Leu Ala val Arg Thr Tyr Phe His Arg Ile Thr 115 120 125 Vai Phe Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Axg Ala GlU Vai Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Ala Lys Leu Leu Ala 145 150 155 160 Arg Leu Asn Glu Asp Glu 165 <210> 27 <211> 167 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Proteína IFN alfa-7 de ratinho <400> 27 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Asn Leu Arg Asn Lys Arg Ala Leu Thr 1 s 10 15 65 65 Leu Leu Vai Lys Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Lys Aâp Phe Gly Phe Pro Gin Ala Lys Val Asp Ala Gin Gin Ile 35 40 45 Gin Glu Ala Gin Ala Ile Pro val Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin Ile 50 55 60 Leu Asn Ile Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Ser Vai Cys Aan Asp Leu His Gin Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Gin Gly Cys Leu Met Gin Glu Val Gly Val Gin Glu Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Gin Glu Asp Ser Leu Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr 115 120 125 Vai Phe Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Ala Asn Leu Leu Ala 145 150 155 160 .Arg Leu Ser Glu Lys Lys Glu 165 <210 > 28 <211> 166 <212 > PRT <213> Mus musculus <2 2 Ο > <223> Proteína IFN alfa-8 de ratinho < 4 0 0 > 28 Cys Asp Leu Pro Gin Thr 1 5 Leu Leu Vai Lys Met Arg 20 Arg Lys Asp Phe Gly phe 35 Gin Glu Ala Gin Ala Ile 50

His Aan Leu Arg Aan Lys Arg Ala Leu Thr 10 IS

Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 25 30 pro Gin Glu Lys Vai Gly Ala Gin Gin Xle 40 45

Pro vai Leu Thr Glu Leu Thr Gin Gin Ile 55 60

Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr 65 70 75 80 66 1)¾¾ Leu Asp Ser Phe Cys Asa Asp Leu Sis Gin Leu Leu Asn Asp Leu «S 30 35

Gin Gly cys Leu Met Gin Gin vai Glu lie Gin Ala Leu Pro Leu Thr 100 105 uo

Gin Glu Asp Ser Leu Leu Ala Vâl Arg Thr Tyr Phe His Arg lie Thr 115 120 125

Vai Phe Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai 130 135 140

Arg Ala Glu Vai Trp Arg Ala Leu Ser Ser ser Ala Lys Leu Leu Ala 145 150 155 160

Arg Leu Asn Glu Asp Glu 155 <210> 29 <211> 167

<212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Proteína IFN alfa-9 de ratinho <4 0 0 > 29

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Asn Leu Arg Mn Lys Lys Ile lôu Thr 15 10 15

Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 3Q

Arg Lys Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Lys Vai Asp Ala Gin Gin Ile 35 40 45

Gin Glu Ala Gin Ala Ile Pro Vai Leu Ser Glu Leu Thr Gin Gin Ile 50 55 60

Leu Thr Leu Phe Thr Ser Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asn Ala Thr 65 70 75 80

Leu Leu Asp Ser Phe Cys Thr Gly Leu His Gin Leu Leu Asn Asp Leu 85 30 85

Gin Gly Cys Leu Met Gin Leu Vai Gly Met Lys Glu Leu Pro Leu Thr 100 105 110

Gin Glu Asp Ser Gin Leu Ala Met Lys Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr 115 120 125 67 Vál Tyx Léu Arg Glu Lys Lys Mis Ser Pro Cys Alã Trp Glu Vai Vál 130 135 Í40

Arg Ala Glu Vai Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Vai Asu Leu Leu Ala 14S 150 155 150

Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu 165

Lisboa, 31 de Outubro de 2007

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão com a actividade biológica de interferão-alfa e capaz de concentrar interferão-alfa no fígado, cuja proteína de fusão compreende, na direcção N para C-terminal, uma região Fc de imunoglobulina derivada de IgGl ou IgG3 e uma proteína-alvo que compreende interferão-alfa.

2. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 1, em que a região Fc compreende pelo menos uma região conectora de imunoglobulina, um domínio CH2 e um domínio CH3.

3. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a proteína-alvo compreende um segundo interferão-alfa completo ou respectivo fragmento bioactivo.

4. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 3, em que a primeira e segunda proteínas interferão-alfa estão ligadas entre si directamente ou por intermédio de um agente de ligação polipeptídico.

5. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 3 ou 4, em que a região Fc e a proteína-alvo estão ligadas entre si directamente ou por intermédio de um agente de ligação polipeptídico.

6. Proteína de fusão multimérica que compreende pelo menos duas proteínas de fusão como especificadas nas Reivindicações 1 até 5 associadas por intermédio de uma ligação covalente. 2

7. Molécula de DNA que codifica uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6.

8. Molécula de DNA da Reivindicação 7, em que a proteína de fusão compreende uma sequência de sinal, cuja sequência de sinal, cuja região Fc e cuja proteína-alvo são codificadas em série na direcção 5' para 3'.

9. Composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6 opcionalmente em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável.

10. Utilização de uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6 ou de uma composição farmacêutica da Reivindicação 9 para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de doenças do fígado.

11. Utilização de uma proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 10, em que a doença do fígado é hepatite. Lisboa, 31 de Outubro de 2007