JP2008505985A - インターフェロン−αポリペプチドおよび結合体 - Google Patents

インターフェロン−αポリペプチドおよび結合体 Download PDF

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Abstract

本発明は、インターフェロン−αポリペプチドおよび結合体、ならびにこのポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、これらのポリペプチド、結合体、および核酸を含む組成物；上記ポリペプチド、結合体、および核酸を含む細胞、または上記ポリペプチド、結合体、および核酸を発現する細胞；上記ポリペプチド、結合体、および核酸を作製する方法；ならびに上記ポリペプチド、結合体、および核酸を使用する方法を包含する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願番号第１０／８４８，８２７号（２００４年３月１９日出願））の一部継続出願であり、この米国特許出願番号第１０／８４８，８２７号は、米国特許出願番号第１０／７１４，８１７号（２００３年１１月１７日出願）の一部継続出願であり、この米国特許出願番号第１０／７１４，８１７号は、米国仮特許出願番号第６０／５０２，５６０号（２００３年９月１２日出願）および米国仮特許出願番号第６０／４２７，６１２号（２００２年１１月１８日出願）の利益を主張する。これらの各々の開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、概して、ポリヌクレオチドおよびそれらからコードされるポリペプチド、そのポリペプチドの結合体、ならびにそのポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび結合体を産生するベクター、細胞、抗体、およびそのポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび結合体を用いる方法に関する。
（発明の背景）
インターフェロンαは、サイトカイン遺伝子の多様ならせん状バンドルスーパーファミリーのメンバーである（Ｓｐｒａｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８１５−８２７）。ヒトインターフェロンαは、アミノ酸レベルで８５〜９８％の配列同一性を共有する、２０を超える直列複製非対立遺伝子のファミリーによりコードされる（Ｈｅｎｃｏ，Ｋ．ら（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８５：２２７−２６０）。活性インターフェロンαタンパク質を発現する遺伝子は、遺伝子座により１３ファミリーに分類されている。公知の発現されたヒトインターフェロンαタンパク質およびその対立遺伝子改変物（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、表にされている（Ａｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１６：１８１−１８４）。
インターフェロンαは、種々の型の細胞増殖を阻害することが示されており、そして癌（特に、白血病のような血液学的悪性腫瘍）と頻繁に関連する、種々の細胞増殖障害の処置のために特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、低悪性度リンパ腫、カポージ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱腫瘍および卵巣癌に対して抗増殖活性を示した（非特許文献１；非特許文献２）。
インターフェロンαはまた、種々の型のウイルス感染に対して有用である（非特許文献３）。インターフェロンαは、ヒトパピローマウイルス感染、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染に対して活性を有する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。特定の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因学におけるインターフェロンおよびインターフェロンレセプターの役割も研究されている（非特許文献７）。
これらのタンパク質は、多くの疾患の処置における治療的価値を保有するが、これらは、医薬品としての用途に最適化されてきた。例えば、容量限定毒性、レセプター交差反応性および血清の短い半減期は、これらのサイトカインの多くの臨床的有用性を有意に減少させる（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。インターフェロン投与に伴う多様かつ重篤な副作用プロフィールとしては、インフルエンザ様症状、疲労、幻覚を含む神経性障害、発熱、肝臓酵素上昇および白血球減少症が挙げられる（非特許文献１２；非特許文献２）。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非常に高い複製率を有する非宿主統合型ＲＮＡウイルスであり、そのため広範な遺伝的多様性に関連する。ＨＣＶ ＲＮＡの少なくとも６つの遺伝子型および３０以上のサブタイプが、同定されている。ＨＣＶ遺伝子型は、ＩＦＮ−α治療に対する応答の予測変数として示されている。ＨＣＶ遺伝子型２およびＨＣＶ遺伝子型３により感染した患者は、一般にインターフェロン治療に対してよく応答することが見出されている。遺伝子型４、遺伝子型５および遺伝子型６に感染した患者は、あまり良く応答しない傾向がある。ＨＣＶ遺伝子型１に感染した患者は、ＩＦＮ−α治療に対して非常に乏しい応答をする傾向がある（遺伝子型１の患者の約５０％は、インターフェロン治療に対して「非応答者」として分類される）。遺伝子型１は、現在最も優勢な形態のＣ型肝炎ウイルスであり、米国における患者のおよそ７０％およびヨーロッパにおける患者の５０％が感染している。明らかに、ＨＣＶ感染、特に遺伝子１の変種のための、より効果的な治療法に対する差し迫った必要性が存在する。
遺伝子型１ＨＣＶ（および他のサブタイプ）は、重要なＩＦＮ応答性タンパク質（例えば、ｄｓＲＮＡ活性化セリン／スレオニンプロテインキナーゼＰＫＲ）を阻害することにより、ＩＦＮ−αシグナル伝達経路を活発に減衰させるという遺伝学的証拠および生化学的証拠が存在する（非特許文献１３）。おそらくこの遺伝的多様性および抗ウイルス応答の積極的な阻害の結果として、ＨＣＶ（特に遺伝子型１）は、宿主の免疫監視機構から逃れ、高確率の慢性感染症を導く能力を有する。ＨＣＶのこの広範な遺伝子変異性は、診断上かつ臨床上の重要な意味を有し、臨床経過における変動、ワクチン開発の困難性、および治療に対する応答の欠如の潜在的な原因となる。
Ｂｏｎｎｅｍ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ，１９８４年，３，ｐ．５８０ Ｏｌｄｈａｍ，Ｒ．Ｋ．，Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９８５年，２０，ｐ．７１ Ｆｉｎｔｅｒ，Ｎ．Ｂ．ら，Ｄｒｕｇｓ，１９９１年，４２（５），ｐ．７４９ Ｋａｓｈｉｍａ，Ｈ．ら，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，１９８８年，９８，ｐ．３３４ Ｄｕｓｈｅｉｋｏ，Ｇ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８６年，３（補遺２）：Ｓ１９９ Ｄａｖｉｓ，ＧＬら，Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８９年，３２１，ｐ．１５０１ Ｂｅｎｏｉｔ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３年，１５０（３），ｐ．７０７ Ｄｕｓｈｅｉｋｏ，Ｇ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９７年，２６：１１２Ｓ−１２１Ｓ Ｖｉａｌ，Ｔ．およびＤｅｓｃｏｔｅｓ，Ｊ．，Ｄｒｕｇ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，１９９４年，１０，ｐ．１１５−１５０ Ｆｕｎｋｅ，Ｉ．ら，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９４年，６８，ｐ．４９−５２ Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９３年，１１９，ｐ．７４５−７５５ Ｐｏｎｔｚｅｒ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９１年，５１，ｐ．５３０４ Ｋａｔｚｅ Ｍ．Ｇ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２年，２（９），ｐ．６７５−６８７
本発明は、現在臨床に用いられているインターフェロンαと比較して、増強された抗ウイルス効力および／または増強された免疫調節効力を示すインターフェロンα分子の必要性に取り組む。本発明は、新規のインターフェロンαポリペプチドおよびポリペプチド結合体、このポリペプチドをコードする核酸、ならびにこのような分子を使用する方法を提供する。このような分子は、種々の適用において有益な用途を有する分子であり、この用途は、例えば、治療的処置および予防的処置、特にウイルス感染ならびにウイルス感染に関連する疾患および状態ための治療的処置および予防的処置を含む。本発明は、これらの要求および他の要求を満たす。
（発明の要旨）
本発明は、新規のポリペプチド（改変体および融合ポリペプチドを含む）を提供する。本発明はまた、１つ以上の非ポリペプチド部分と共有結合した本発明のポリペプチドを含む結合体を提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドのいずれかをコードする核酸、ならびにそのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、そのようなポリペプチド、結合体および核酸を作製する方法、ならびにそのようなポリペプチド、結合体および核酸を用いる方法、そしてさらなる概説の際に明らかな他の特徴を提供する。
一局面において、本発明は、単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチド、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４のうちの１つ）として同定される配列を含むポリペプチド提供する。
本発明はまた、各々配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３の１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７、または配列番号５３））から０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、０〜１４個のアミノ酸位置、０〜１２個のアミノ酸位置が、０〜１０個のアミノ酸位置が、０〜８個のアミノ酸位置が、０〜６個のアミノ酸位置が、０〜５個のアミノ酸位置が、０〜４個のアミノ酸位置が、０〜３個のアミノ酸位置が、０〜２個のアミノ酸位置が、または０〜１個のアミノ酸位置が））異なる配列を含む単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを提供する。いくつかの例では、上記ポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、配列番号１〜１５、４７または５３の１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）に対して、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位および１６２位のうちの１つ以上に置換を含む。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、４７位にＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位にＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位にＧｌｎ位、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位にＡｌａまたはＴｈｒ；５５位にＰｈｅ、ＳｅｒまたはＰｒｏ；５６位にＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位にＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位にＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位にＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位にＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位にＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位にＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位にＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位にＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位にＡｌａまたはＶａｌ；７６位にＡｌａまたはＴｈｒ；７７位にＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位にＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位にＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位にＴｈｒ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇ；８３位にＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位にＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位にＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位にＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位にＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位にＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位にＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位にＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位にＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位にＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位にＡｒｇまたはＳｅｒ；（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３およびＳｅｒ１４０（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかのそのようなポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４を含む。本発明はまた、これらのポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質および結合体、そのようなポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチドを作製する方法を提供する。
いくつかの本発明のポリペプチドは、１つ以上の置換（Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｇ１０Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｑ２０Ｃ、Ｒ２２Ｃ、Ｒ２３Ｃ、Ｉ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｌ２６Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ３０Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｒ３３Ｃ、Ｈ３４Ｃ、Ｄ３５Ｃ、Ｒ３７Ｃ、Ｑ４０Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｅ４２Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｖ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｅ５９Ｃ、Ｑ６２Ｃ、Ｑ６３Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｓ６９Ｃ、Ｔ７０Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｄ７８Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｔ８０Ｃ、Ｌ８１Ｃ、Ｅ８３Ｃ、Ｋ８４Ｃ、Ｉ８７Ｃ、Ｆ９０Ｃ、Ｑ９１Ｃ、Ｎ９４Ｃ、Ｄ９５Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｖ１００Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｖ１０４Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｍ１１２Ｃ、Ｎ１１３Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｑ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｔ１２８Ｃ、Ｌ１２９Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｋ１３４Ｃ、Ｋ１３５Ｃ、Ｙ１３６Ｃ、Ｓ１３７Ｃ、Ｐ１３８Ｃ、Ａ１４６Ｃ、Ｍ１４９Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｃ、Ｎ１５７Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（または配列番号１に対して同等の位置）、ならびにそれらの組み合わせから選択される置換が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
いくつかの本発明のポリペプチドは、１つ以上の置換（Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｇ１０Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｒ２２Ｋ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２４Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｌ２６Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｌ３０Ｋ、Ｒ３３Ｋ、Ｈ３４Ｋ、Ｄ３５Ｋ、Ｒ３７Ｋ、Ｑ４０Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｅ４２Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｖ５１Ｋ、Ｑ５２Ｋ、Ｅ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｑ６３Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ｓ６９Ｋ、Ｔ７０Ｋ、Ｎ７２Ｋ、Ｓ７４Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｄ７８Ｋ、Ｅ７９Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｌ８１Ｋ、Ｅ８３Ｋ、Ｉ８７Ｋ、Ｆ９０Ｋ、Ｑ９１Ｋ、Ｎ９４Ｋ、Ｄ９５Ｋ、Ｅ９７Ｋ、Ａ９８Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｍ１１２Ｋ、Ｎ１１３Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｑ１２５Ｋ、Ｒ１２６Ｋ、Ｔ１２８Ｋ、Ｌ１２９Ｋ、Ｔ１３２Ｋ、Ｙ１３６Ｋ、Ｓ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１４６Ｋ、Ｍ１４９Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１５３Ｋ、Ｆ１５４Ｋ、Ｎ１５７Ｋ、Ｑ１５９Ｋ、Ｒ１６１Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（または配列番号１に対して同等の位置）、ならびにそれらの組み合わせから選択されル置換が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、異なるアミノ酸残基に対するアミノ酸の１つ以上の置換、またはアミノ酸残基の１つ以上の欠失を含み、これは、本発明のいずれかのポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））から１つ以上のリジン（例えば、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０および／またはＫ１６５（配列番号１に対して））を除く。除かれるべき１つ以上のリジン残基は、任意の他のアミノ酸で置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。
本発明のいくつかのポリペプチドは、異なるアミノ酸残基に対するアミノ酸の１つ以上の置換、またはアミノ酸残基の１つ以上の欠失を含み、これは、本発明のいずれかのポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））から１つ以上のヒスチジン（例えば、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ３４および／またはＨ４７（配列番号１に対して））を除く。除かれるべき１つ以上のヒスチジンは、任意の他のポリペプチドで置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。
本発明のいくつかのポリペプチドは、１つ以上の置換（Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｇ１０Ｎ＋Ｒ１２Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｑ２０Ｎ＋Ｒ２２Ｓ／Ｔ、Ｒ２２Ｎ＋Ｉ２４Ｓ／Ｔ、Ｒ２３Ｎ、Ｒ２３Ｎ＋Ｓ２５Ｔ、Ｉ２４Ｎ＋Ｌ２６Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｌ２６Ｎ、Ｌ２６Ｎ＋Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｌ３０Ｎ＋Ｄ３２Ｓ／Ｔ、Ｋ３１Ｎ＋Ｒ３３Ｓ／Ｔ、Ｒ３３Ｎ＋Ｄ３５Ｓ／Ｔ、Ｈ３４Ｎ＋Ｆ３６Ｓ／Ｔ、Ｄ３５Ｎ＋Ｒ３７Ｓ／Ｔ、Ｒ３７Ｎ＋Ｐ３９Ｓ／Ｔ、Ｑ４０Ｎ＋Ｅ４２Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｅ４２Ｎ＋Ｄ４４Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｖ５１Ｎ＋Ａ５３Ｓ／Ｔ、Ｑ５２Ｎ＋Ｉ５４Ｓ／Ｔ、Ｅ５９Ｎ＋Ｍ６１Ｓ／Ｔ、Ｑ６２Ｎ、Ｑ６２Ｎ＋Ｔ６４Ｓ、Ｑ６３Ｎ＋Ｆ６５Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｓ６９Ｎ＋Ｋ７１Ｓ／Ｔ、Ｔ７０Ｎ＋Ｎ７２Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ｓ７４Ｔ、Ｓ７４Ｎ＋Ａ７６Ｓ／Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｄ７８Ｎ、Ｄ７８Ｎ＋Ｔ８０Ｓ、Ｅ７９Ｎ＋Ｌ８１Ｓ／Ｔ、Ｔ８０Ｎ＋Ｌ８２Ｓ／Ｔ、Ｌ８１Ｎ＋Ｅ８３Ｓ／Ｔ、Ｅ８３Ｎ＋Ｆ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ８４Ｎ＋Ｙ８６Ｓ／Ｔ、Ｉ８７Ｎ＋Ｌ８９Ｓ／Ｔ、Ｆ９０Ｎ＋Ｑ９２Ｓ／Ｔ、Ｑ９１Ｎ＋Ｍ９３Ｓ／Ｔ、Ｌ９６Ｓ／Ｔ、Ｄ９５Ｎ＋Ｅ９７Ｓ／Ｔ、Ｅ９７Ｎ＋Ｃ９９Ｓ／Ｔ、Ａ９８Ｎ＋Ｖ１００Ｓ／Ｔ、Ｖ１００Ｎ＋Ｑ１０２Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｖ１０４Ｎ＋Ｖ１０６Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｍ１１２Ｎ＋Ｖ１１４Ｓ／Ｔ、Ｎ１１３Ｎ＋Ｄ１１５Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｑ１２５Ｎ＋Ｉ１２７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｎ＋Ｔ１２８Ｓ、Ｔ１２８Ｎ＋Ｙ１３０Ｓ／Ｔ、Ｌ１２９Ｎ＋Ｌ１３１Ｓ／Ｔ、Ｔ１３２Ｎ＋Ｋ１３４Ｓ／Ｔ、Ｋ１３３Ｎ＋Ｋ１３５Ｓ／Ｔ、Ｋ１３４Ｎ＋Ｙ１３６Ｓ／Ｔ、Ｋ１３５Ｎ、Ｋ１３５Ｎ＋Ｓ１３７Ｔ、Ｙ１３６Ｎ＋Ｐ１３８Ｓ／Ｔ、Ｐ１３８Ｎ、Ｐ１３８Ｎ＋Ｓ１４０Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｉ１４８Ｓ／Ｔ、Ｍ１４９Ｎ、Ｍ１４９Ｎ＋Ｓ１５１Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｓ１５３Ｎ、Ｓ１５３Ｎ＋Ｓ１５５Ｔ、Ｆ１５４Ｎ＋Ｆ１５６Ｓ／Ｔ、Ｑ１５９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｒ１６１Ｎ＋Ｒ１６３Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ（または配列番号１に対して同等の位置）、ならびにそれらの組み合わせから選択される置換が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
本発明はまた、上記ポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質および結合体、そのようなポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチドを作製する方法およびそのようなポリペプチドを使用する方法を提供する。
別の局面において、本発明は、各々配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを提供する。いくつかのそのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。いくつかの例では、上記配列は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）と少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、例えば、配列番号１〜１５のうちの１つに対して、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位および１６２位のうちの１つ以上に置換を含む。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、４７位にＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位にＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位にＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位にＡｌａまたはＴｈｒ；５５位にＰｈｅ、ＳｅｒまたはＰｒｏ；５６位にＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位にＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位にＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位にＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位にＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位にＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位にＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位にＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位にＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位にＡｌａまたはＶａｌ；７６位にＡｌａまたはＴｈｒ；７７位にＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位にＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位にＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位にＴｈｒ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇ；８３位にＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位にＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位にＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位にＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位にＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位にＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位にＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位にＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位にＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位にＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位にＡｒｇまたはＳｅｒ（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３およびＳｅｒ１４０（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかのそのようなポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４から選択される配列を含む。本発明はまた、上記ポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質および結合体、そのようなポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチドを作製する方法を提供する。
別の局面において、本発明は、親ポリペプチドの改変体である単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを提供し、各々の改変体は、その親ポリペプチド配列に対して少なくとも１つのアミノ酸位置が親ポリペプチド配列と異なる改変体配列を含み、ここで、親ポリペプチド配列は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））である。いくつかの例では、上記改変体は、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性および／または抗増殖活性）を示す。いくつかの例では、上記改変体配列は、１〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、１〜１４個のアミノ酸位置が、１〜１２個のアミノ酸位置が、１〜１０個のアミノ酸位置が、１〜８個のアミノ酸位置が、１〜６個のアミノ酸位置が、１〜５個のアミノ酸位置が、１〜４個のアミノ酸位置が、１〜３個のアミノ酸位置が、または１〜２個のアミノ酸位置が））、親ポリペプチド配列と異なる。いくつかの例では、上記改変体配列は、配列番号１〜１５のうちの１つに対して、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位および１６２位のうちの１つ以上に置換を含む。いくつかの例では、上記改変体配列は、４７位にＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位にＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位にＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位にＡｌａまたはＴｈｒ；５５位にＰｈｅ、ＳｅｒまたはＰｒｏ；５６位にＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位にＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位にＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位にＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位にＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位にＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位にＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位にＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位にＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位にＡｌａまたはＶａｌ；７６位にＡｌａまたはＴｈｒ；７７位にＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位にＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位にＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位にＴｈｒ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇ；８３位にＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位にＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位にＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位にＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位にＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位にＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位にＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位にＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位にＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位にＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位にＡｒｇまたはＳｅｒ；（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、上記改変体配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３およびＳｅｒ１４０（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかのそのような改変体配列は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４から選択される配列を含む。本発明はまた、このような改変体のいずれかを含む融合タンパク質および結合体、このような改変体のいずれかをコードする核酸、ならびにそのような改変体を作製する方法を提供する。
別の局面において、本発明は、親インターフェロンαポリペプチドの改変体である単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを提供し、各々の改変体は、少なくとも１つのアミノ酸位置が上記親インターフェロンαポリペプチドと異なる改変体配列を含み、ここで、上記改変体配列は、Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３およびＳｅｒ１４０（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、上記親インターフェロンαポリペプチド配列は、天然に存在するヒトインターフェロンαの配列（例えば、配列番号３１〜配列番号４２または配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ）、あるいは天然に存在しない（例えば、合成の）インターフェロンαの配列（例えば、配列番号４３）である。いくつかの例では、上記改変体配列は、１〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、１〜１４個のアミノ酸位置が、１〜１２個のアミノ酸位置が、１〜１０個のアミノ酸位置が、１〜８個のアミノ酸位置が、１〜６個のアミノ酸位置が、１〜５個のアミノ酸位置が、１〜４個のアミノ酸位置が、１〜３個のアミノ酸位置が、または１〜２個のアミノ酸位置が））上記親インターフェロンαポリペプチド配列と異なる。いくつかの例では、上記改変体は、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。本発明はまた、これらの改変体のいずれかを含む融合タンパク質および結合体、これらの改変体のいずれかをコードする核酸、ならびにそのような改変体を作製する方法を提供する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、上に記載される本発明のポリペプチド（改変体を含む））とそのポリペプチドの結合基に結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分とを含む結合体を提供し、ここで、この結合体はインターフェロンα活性を示す。いくつかの例では、上記非ポリペプチド部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧもしくはｍＰＥＧ）、または糖部分である。上記少なくとも１つの非ポリペプチド部分は、システインに結合されても、リジンに結合されても、上記ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合されても、上記ポリペプチドのインビボグリコシル化部位に結合されてもよい。本発明はまた、そのような結合体を作製する方法、およびそのような結合体を用いる方法を提供する。
本発明はまた、結合体の集団を含むモノＰＥＧ化された組成物を提供し、ここで、上記集団の大多数の結合体は、各々本発明のポリペプチドの１つのリジン残基に共有結合した単一のＰＥＧ分子（例えば、直鎖状のＰＥＧもしくは分枝したＰＥＧ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａもしくは４０ｋＤａのｍＰＥＧ分子またはｍＰＥＧ２分子（例えば、３０ｋＤａのｍＰＥＧ２分子または４０ｋＤａのｍＰＥＧ２分子）））を含む位置異性体である。本発明はまた、そのような組成物を作製する方法、およびそのような組成物を用いる方法を提供する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドのいずれか（改変体を含む）をコードする単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。本発明はまた、そのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにそのような核酸を含む宿主細胞を培養する工程を包含する本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。
別の局面において、本発明は、ウイルスに感染した細胞のウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法は、そのウイルスに感染した細胞を本発明のポリペプチドまたは結合体と接触させる工程を包含する。本発明はまた、ウイルスに感染した細胞中のウイルスのコピー数を減少させる方法を提供し、この方法は、そのウイルスに感染した細胞を本発明のポリペプチドまたは結合体と接触させる工程を包含する。
別の局面において、本発明は、ウイルスに感染した患者の血清中のウイルスレベルを低下させるための方法を提供し、この方法は、処置の開始時点のレベルと比較してその血清中のウイルスレベルを低下させるために有効な量で、本発明のポリペプチドまたは結合体をその患者に投与する工程を包含する。
本発明のこれらの目的および特徴、ならびに他の目的および特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明が読まれると、より完全に明らかとなる。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中または本明細書の残りの部分に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語または科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
「ポリペプチド配列」（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなど）は、状況に応じて、天然に存在するアミノ酸もしくは人工アミノ酸アナログ、またはアミノ酸ポリペプチドを表す一連の特徴を含む、アミノ酸のポリマーである。遺伝暗号の縮重を考慮して、特定のポリペプチド配列をコードする、１以上の核酸またはその相補核酸は、ポリペプチド配列から決定され得る。
「ポリヌクレオチド配列」（例えば、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）は、状況に応じて、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇまたは他の天然に存在するヌクレオチドもしくは人工のヌクレオチドアナログ、または核酸を表す一連の特徴を含む、ポリマーである。所定の核酸またはその相補核酸のいずれもが、任意の特定のポリヌクレオチド配列から決定され得る。
所定のアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けは、任意の所定のポリマー成分（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、総称して「残基」とも呼ばれる）が、所定のポリマーにおけるその成分の実際の数字位置ではなく、選択されたアミノ酸または核酸ポリマー中の同じかまたは等価な位置を参照して称される場合、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けに「対応する」かまたは「と比較される」。従って、例えば、所定のポリペプチド配列における所定のアミノ酸位置の番号付けは、参照配列として用いられる選択されたポリペプチド配列における同じかまたは等価なアミノ酸位置に対応する。
「等価な位置」（例えば、「等価なアミノ酸位置」または「等価な残基位置」）は、本明細書中に記載される通りの整列アルゴリズムを用いて参照ポリペプチド配列の対応する位置と整列する、試験ポリペプチド配列の位置（例えば、アミノ酸位置または残基位置）として、本明細書中で定義される。試験ポリペプチド配列の等価なアミノ酸位置は、試験ポリペプチドの対応する位置と同じ数字位置番号を有する必要はない。一例として、図２は、種々の公知のヒトインターフェロンαポリペプチド配列と整列した、本発明のポリペプチドの配列（配列番号１）を示す。この例では、配列番号１のアミノ酸位置番号４７は、配列番号３２（ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ）のアミノ酸位置番号４６の等価なアミノ酸位置である（すなわち、等価である）と考えられる。なぜなら、配列番号１のアミノ酸番号４７は、配列番号３２のアミノ酸番号４６と整列するからである。言い換えると、配列番号１のアミノ酸位置４７は、配列番号３２のアミノ酸位置４６に対応する。同様に、配列番号１における残基Ｈ４７は、例えば、配列番号５における残基Ｑ４７と対応すると理解され、その結果、例えば、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、例えば、配列番号５における置換Ｑ４７Ｃ（など）に対応すると理解される。
２つのポリペプチド配列は、その配列のペアについて可能性のある最も高い類似性スコアに達するように、規定されたパラメータ（すなわち、規定されたアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ（ギャップ開始ペナルティとも称される）およびギャップ伸長ペナルティ）を用いてそれらの配列が整列される場合に、「最適に整列される」。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５−１０９１９）は、多くの場合、（ＢＬＡＳＴＰのような）ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズムにおけるデフォルトのスコア付け置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティは、整列された配列の１つにおける単一のアミノ酸ギャップの導入に対して課せられ、ギャップ伸長ペナルティは、そのギャップ中の各々の残基位置に対して課せられる。他に示されない限り、本明細書で使用されるアラインメントパラメータは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。アラインメントスコアは、以下の「配列同一性パーセント」と表題が付けられた節により詳細に記載されるように、アラインメントが開始および終了する各々の位置のアミノ酸位置によって（例えば、アラインメントウインドウ）、そして必要に応じて、一方もしくは両方の配列への１つのギャップまたは複数のギャップの挿入によって、可能性のある最も高い類似性スコアに達するように規定される。
アミノ酸位置およびアミノ酸置換を同定するために用いられる用語は、以下の通りに例示される：Ｈ４７は、参照アミノ酸配列（例えば、配列番号１）におけるヒスチジン（Ｈｉｓ）残基によって占められる位置番号４７を示す。Ｈ４７Ｑは、４７位のヒスチジン残基がグルタミン（Ｇｌｎ）残基によって置換されたことを示す。代替的な置換は、「／」によって示される。例えば、Ｈ４７Ｓ／Ｔは、４７位のヒスチジン残基がセリンまたはスレオニン残基で置換されるアミノ酸配列を意味する。複数の置換は、「＋」によって示されることもあり得る。例えば、Ｈ４７Ｑ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔは、４７位でのヒスチジン残基のグルタミン残基での置換および５１位でのバリン残基のセリンまたはスレオニン残基での置換を含むアミノ酸配列を意味する。欠失は、アスタリスク（ａｓｔｅｒｉｘ）によって示される。例えば、Ｈ４７＊は、４７位のヒスチジン残基が欠失されたことを示す。２以上の連続したアミノ酸の欠失は、以下のように示され得る：例えば、Ｒ１６１＊−Ｅ１６６＊は、残基Ｒ１６１−Ｅ１６６の欠失（すなわち、残基１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６が欠失していること）を示す。挿入は、以下のようにして示される：４７位に位置するヒスチジン残基の後ろでのさらなるセリン残基の挿入は、Ｈ４７ＨＳと示される。置換と挿入との組み合わせは、以下のように示される：４７位のヒスチジン残基のセリン残基での置換および４７位のアミノ酸残基の後ろでのアラニン残基の挿入は、Ｈ４７ＳＡと示される。
他に示されない限り、本明細書中に記載されるアミノ酸残基の位置の番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列に対してであることが理解されるべきである。親ポリペプチドに対する例および改変は、一般に、配列番号１の配列に対して（または別の特定の配列に対して）本明細書中に提供され、この例は、本発明の他のポリペプチドに関し、そして本明細書中に記載される改変は、本明細書中に記載の他のポリペプチドのいずれかの等価なアミノ酸位置においてなされ得る。従って、一例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、配列番号５における置換Ｑ４７Ｃに対応する、などと理解される。
用語「インターフェロンα活性を示している（または示す、または有している、または有する）」は、本発明のポリペプチドまたは結合体が、参照インターフェロンαポリペプチド（例えば、ヒトインターフェロンαポリペプチド、例えば、配列番号３２として本明細書中で特定されるｈｕＩＦＮ−α ２ｂ、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして本明細書中で特定されるｈｕＩＦＮ−α ２ａ、配列番号３７として本明細書中で特定されるｈＩＦＮ−α ８ｂ、または当該分野で公知の任意の他のヒトインターフェロンαポリペプチド（例えば、本明細書の図２および図４に示されるインターフェロンαポリペプチド、ならびに／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６，前出）に列挙されるインターフェロンαポリペプチド））によって示される少なくとも１つの活性を有することを示すことを意図する。このような活性としては、例えば、以下のうちの１以上によって証明されるような、インターフェロンαレセプターを通してシグナルを発する能力が挙げられる：ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害（「抗ウイルス活性」）；ＴＨ１表現型への未刺激Ｔ細胞の分化の増強またはＴＨ２表現型への未刺激Ｔ細胞の分化の抑制（「ＴＨ１分化活性」）；あるいは細胞増殖の阻害（「抗増殖活性」）。この１以上のインターフェロンα活性は、当該分野で公知の、および／または実施例に記載の、アッセイを用いてアッセイされる。
インターフェロンα活性を示すポリペプチドまたは結合体は、（例えば、当該分野で公知の、および／または実施例に記載の、アッセイによって決定した場合）これらが測定可能な活性（例えば、測定可能な抗ウイルス活性、抗増殖活性、またはＴＨ１分化活性）を提示する場合、このような活性を有すると考えられる。当業者は、行われるアッセイの性質に部分的に依存して、どれが、測定可能な活性を構成するかを認識するが、一般的ガイドラインとして、測定可能な活性は、試験化合物（例えば、本発明のポリペプチド）の存在下で作製されたアッセイシグナルが、その試験化合物の非存在下で作製されたアッセイシグナルとは定量可能に異なる、活性である。本発明のポリペプチドまたは結合体が、特定の参照インターフェロンαの既知の活性の全てを示す必要も、参照インターフェロンαと同じ程度までこのような活性を示す必要もないことが理解されるべきである。いくつかの例では、（例えば、ＥＣ５０、比活性、または活性に関連する他の値によって実証されるような）本発明のポリペプチドまたは結合体によって示される活性は、参照インターフェロンαによって示される特定の活性の大きさとほぼ等価であってもよく、小さくてもよく、または大きくてもよい。
「改変体」は、１以上のアミノ酸位置が、親ポリペプチド配列のアミノ酸位置と異なる配列を含むポリペプチドである。例えば、改変体は、親ポリペプチド配列の残基の総数の１０％まで（例えば、親ポリペプチド配列の残基の総数の８％まで（例えば、５％、４％、３％、２％または１％まで）の残基）が親ポリペプチド配列と異なる配列を含み得る。例えば、配列番号１の改変体は、１〜１６個のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸位置）において（例えば、１〜１５のアミノ酸位置において、１〜１４のアミノ酸位置において、１〜１３のアミノ酸位置において、１〜１２のアミノ酸位置において、１〜１１のアミノ酸位置において、１〜１０のアミノ酸位置において、１〜９のアミノ酸位置において、１〜８のアミノ酸位置において、１〜７のアミノ酸位置において、１〜６のアミノ酸位置において、１〜５のアミノ酸位置において、１〜４のアミノ酸位置において、１〜３のアミノ酸位置において、または１〜２のアミノ酸位置において）配列番号１と異なる配列を含み得る。
用語「親ポリペプチド」または「親インターフェロンα」は、本発明に従って改変されるポリペプチド配列を示すことが意図される。この親ポリペプチド配列は、天然に存在するＩＦＮ−αのポリペプチド配列（例えば、哺乳動物ＩＦＮ−α、例えば、霊長類ＩＦＮ−α、例えば、ヒトＩＦＮ−α、例えば、本明細書中で配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして特定されるｈｕＩＦＮ−αポリペプチド、あるいは本明細書および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６），前出に記載される他のｈｕＩＦＮ−α配列）であり得る。この親ポリペプチド配列は、天然に存在しない（すなわち、「合成の」）インターフェロンα（例えば、ＩＦＮ−α Ｃｏｎ１（配列番号４３））のポリペプチド配列であり得る。いくつかの例では、改変されるべき親ポリペプチド自体は、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ）であり得る。
対象に適用される場合、「天然に存在する」とは、この対象が、人によって人工的に生成されるのとは異なって天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得、そして人によって実験室において意図的には改変されてない、生物（ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物または哺乳動物の組織を含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。対象に適用される場合、「天然に存在しない」（「合成」または「人工」ともいう）は、この対象が、天然に存在しない、すなわち、この対象が、人によって人工的に生成されたものと区別して天然に見出すことができないことを意味する。
「フラグメント」または「部分配列」は、配列全体までの、しかし配列全体は含まない、配列全体のうちの任意の部分である。従って、フラグメントまたは部分配列とは、アミノ酸（例えば、ポリペプチド）または核酸（例えば、ポリヌクレオチド）のより長い配列の一部を含む、アミノ酸配列または核酸配列をいう。
本発明によって意図される１つの型のフラグメントは、アミノ酸残基が、親ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端（または両方）から除去されている、フラグメントである；そのようなポリペプチドは、それぞれ、「Ｎ末端短縮型」または「Ｃ末端短縮型」であると考えられる。Ｎ末端からの少なくとも最初の４アミノ酸の欠失は、インターフェロンα活性に対して顕著には影響を与えないことが公知である（Ｌｙｄｏｎ，Ｎ．Ｂ．ら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：４１３１−４１）。さらに、７〜１１のアミノ酸がＣ末端から欠失されている、インターフェロンα活性を保持する改変体が記載されている（Ｃｈｅｅｔｈａｍ Ｂ．Ｆ．ら（１９９１）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．１５（１）：２７−３９；Ｃｈａｎｇ Ｎ．Ｔ．ら（１９８３）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２１（２）：５８５−５８９；Ｆｒａｎｋｅ Ａ．Ｅ．ら（１９８２）ＤＮＡ １（３）：２２３−２３０）。
「レセプター」（例えば、「インターフェロンαレセプター」（Ｉ型インターフェロンレセプターとしても公知））は、インターフェロンαによって細胞中で活性化される（例えば、インターフェロンαを結合して、細胞内シグナル伝達を開始する）レセプターである（例えば、Ｉ型レセプターは、レセプターサブユニットＩＦＮＡＲ−２およびＩＦＮＡＲ−１を含む）（Ｄｏｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（６）：３１４４−３１４７；Ｍｏｇｅｎｓｅｎら，（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１０６９−１０９８）。本発明の状況では、レセプターもまた、インターフェロンαを結合するが、膜に必ずしも結合しないかもしれないか、そして／または細胞内シグナル伝達を開始する、細胞外結合ドメインを含む、膜結合部分（例えば、可溶性形態のレセプター分子）を欠く、短縮形態の全長レセプター分子（例えば、レセプター分子）（「可溶性レセプター」としても公知）を包含することを意味する。
２つの分子（例えば、リガンドおよびレセプター）の間の「特異的結合親和性」は、分子の混合物中での１つの分子の、他の分子への優先的結合を意味する。これらの分子の結合は、代表的に、結合親和性が、約１×１０４Ｍ−１〜約１×１０９Ｍ−１以上（すなわち、約１０４〜１０−９Ｍ以下のＫＤ）であるとき、特異的であると考えられる。リガンドとレセプターとの結合親和性は、当業者に公知の標準技術によって測定され得る。結合親和性を測定するための周知の技術の非限定的な例としては、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、等温力価測定微小熱量測定（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ ＵＳＡ）、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳが挙げられる。例えば、ＦＡＣＳまたは他の選別方法は、関連した結合対メンバーに特異的に結合する分子集団（例えば、細胞表面に提示されたリガンド（例えば、レセプター（例えば、可溶性レセプター）））を選択するために用いられ得る。リガンド−レセプター複合体は、例えば、（例えば、この複合体を、この複合体を認識する蛍光抗体と反応させることによって）蛍光によって検出および選別され得る。関連した結合対メンバー（例えば、レセプター）に結合する目的の分子はプールされ、そしてより低濃度のレセプターの存在下で再選別される。漸減濃度（代表的な濃度範囲は、リガンド−レセプター相互作用の性質に依存して、１０−６Ｍから１０−９Ｍ（すなわち、１マイクロモル濃度（μＭ）から１ナノモル濃度（ｎＭ））以下のオーダーである）のレセプターの存在下で複数回選別を実施することによって、そのレセプターに対して特異的結合親和性を示す目的の分子集団が単離され得る。
ポリペプチド、核酸または他の成分は、それが通常会合している成分（他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質（複合体、例えば、ネイティブ配列に関連し得る、ポリメラーゼおよびリボソームが挙げられる）、核酸、細胞、合成試薬、細胞夾雑物、細胞成分など）から（例えば、元々由来した細胞中で通常会合している他の成分から）部分的または完全に分離された場合、「単離」されている。ポリペプチド、核酸または他の成分は、その天然環境の他の成分から部分的または完全に回収または分離されており、その結果、これが、その組成物、混合物または成分収集物中に存在する主な種である（すなわち、モル濃度に基づいて、これが、その組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）場合、単離されている。いくつかの例では、この調製物は、約６０％、７０％または７５％よりも多く、代表的には約８０％より多く、または好ましくは約９０％よりも多くの単離された種からなる。
「実質的に純粋な」または「単離された」核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、ポリペプチド、タンパク質、または組成物）はまた、対象種（例えば、核酸またはポリペプチド）が、存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約５０重量パーセント、６０重量パーセントまたは７０重量パーセント（モル濃度に基づく）を占めることを意味する。実質的に純粋な組成物、または単離された組成物はまた、組成物中に存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約８０重量パーセント、９０重量パーセント、または９５重量パーセントを占め得る。単離された対象種はまた、本質的に均質（夾雑種が従来の検出方法によってこの組成物中に検出できない）になるまで精製され得、ここで、この組成物は、本質的に単一の高分子種の誘導体からなる。用語「精製された」は、一般的に、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを示す。これは代表的に、この核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、少なくとも約５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、７５％純粋、より好ましくは少なくとも約８５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋であることを意味する。
用語「単離された核酸」は、本発明の核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中の、直接連続しているコード配列（すなわち、一方は５’において、そして一方は３’末端において）の両方と、直接は連続していない核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を言及し得る。従って、この用語は、このようなｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントが、ベクター中に組み込まれようと、それが元々由来する生物と同じかまたは異なる種（例えば、ウイルス）のゲノムに組み込まれようと、キメラポリペプチドをコードするさらなるコード配列に連結されてハイブリッド遺伝子を形成しようと、または任意の他のＤＮＡ配列とは独立していようと、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成された、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントを包含する。このＤＮＡは、二本鎖または一本鎖の、センスまたはアンチセンスであり得る。
「組換えポリヌクレオチド」または「組換えポリペプチド」は、それぞれ、１より多くの供給源核酸またはポリペプチドに由来する核酸またはアミノ酸配列を含み得る、天然に存在しない、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、供給源核酸またはポリペプチドは、天然に存在する核酸もしくはポリペプチドであり得るか、またはそれ自体が、変異誘発または他の種類の改変に供されていてもよい。核酸またはポリペプチドは、これが合成もしくは人工もしくは操作されたものであるか、または合成もしくは人工もしくは操作されたポリペプチドもしくは核酸に由来する場合、「組換え」とみなされ得る。組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、代表的には一緒に含まれないか、代表的には互いに関連していないか、さもなければ代表的には互いに分離されている、配列の少なくとも２つのセグメントの組み合わせ（例えば、人工的組み合わせ）によって作製され得る。組換え核酸は、異なる供給源由来の、および／または人工的に合成された核酸セグメントを一緒に連結することまたは組み合わせることによって形成された核酸分子を含み得る。「組換えポリペプチド」は、しばしば、クローニングされたかまたは組換えの核酸から生じたポリペプチドを言及する。異なる核酸またはアミノ酸配列が誘導される供給源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、時々、相同（すなわち、同じかまたは類似の構造および／または機能をコードするポリペプチドを有するかまたはコードする）であり、そしてしばしば、例えば、様々な単離体、血清型、株、種、生物、または異なる疾患状態由来である。
用語「組換え」は、例えば、細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質またはポリペプチドを参照して用いられる場合、代表的に、細胞、ポリヌクレオチド、またはベクターが、異種（もしくは外来）核酸の導入もしくはネイティブ核酸の改変によって改変されていること、またはこのタンパク質もしくはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって改変されていること、またはこの細胞がこのように改変された細胞に由来することを示す。組換え細胞は、ネイティブの（非組換え）形態の細胞中に見出されない核酸配列を発現するか、またはさもなければ異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されないネイティブ核酸配列を発現する。用語「組換え」は、細胞を参照して用いられる場合、この細胞が、異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるポリペプチドを発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞を中に見出されないコード配列を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブ形態の細胞中にコード配列を含み得、ここで、このコード配列は、改変されてこの細胞中に人工的手段によって再度導入される。この用語はまた、この細胞由来の核酸を除去することなく改変された細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を包含する；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、組換えおよび関連の技術によって得られる改変が挙げられる。
用語「組換え的に産生される」とは、化学合成手段、核酸セグメントの再帰的配列組換え、もしくはヌクレオチドの他の種々の生成方法（例えば、シャッフリング）、または核酸の単離されたセグメントを、例えば当業者に公知の遺伝子操作技術により操作することのうちのいずれかによって通常達成される、人工組換えをいう。「組換え的に発現される」とは、代表的に、インビトロでの組換え核酸の産生のための技術、およびインビボ、インビトロ、もしくはエキソビボ（ここで、細胞は発現され得るかもしくは増殖され得る）での組換え核酸の細胞への移行をいう。
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」とは、構造遺伝子の発現をそのような配列と適合性の宿主においてもたらすことが可能な核酸エレメントを含む、遺伝子組み換えまたは合成された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター、および必要に応じて、転写終結シグナルを含む。代表的には、組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、望ましいポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現をもたらす際に必要であるかまたは役に立つ、さらなる因子もおまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞から発現されるタンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響を与える他の核酸配列もまた、発現カセット中に含まれ得る。
「免疫原」とは、免疫応答を惹起し得る物質をいう。免疫原としては、例えば、抗原、自己抗原（これは、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす）、および癌細胞において発現される腫瘍関連抗原が挙げられる。免疫応答とは、一般的には、因子（例えば、抗原もしくはそのフラグメント）またはそのような因子をコードする核酸に対する、細胞性応答または抗体媒介性応答の発生を指す。いくつかの場合において、そのような応答は、目的の抗原を発現する抗原提示細胞に特異的に対する、ＣＴＬ、Ｂ細胞または種々のクラスのＴ細胞のうちの少なくとも１つもしくはそれらの組み合わせの生成を含む。
「抗原」とは、宿主における抗体の形成を惹起し得る物質、またはその物質と反応性であるリンパ球の特定の集団を生成し得る物質を指す。抗原は、代表的には、その宿主に対して外来の高分子（例えば、タンパク質および多糖）である。
「アジュバント」とは、抗原の免疫刺激特性または薬物の薬理学的特性を増強する物質を指す。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強し得る。例えば、「フロイント完全アジュバント」は、免疫原と、乳化剤と、マイコバクテリアとを含む、油と水とのエマルジョンである。別の例である「フロイント不完全アジュバント」は、マイコバクテリア以外は同じである。
ベクターは、選択された核酸により細胞形質導入もしくは細胞トランスフェクション、またはその細胞中の核酸の発現を容易にするための成分または組成物である。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、細菌、ポリリジンなどが挙げられる。「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え生成または合成生成された核酸構築物もしくは核酸配列である。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。この発現ベクターは、代表的には、プロモーターに作動可能に連結された転写されるべき核酸を含む。転写されるべき核酸は、代表的には、このプロモーターの指示下または制御下にある。
「ポリヌクレオチド配列の実質的に全長」または「ポリペプチド配列の実質的に全長」とは、一定長のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の少なくとも５０％、一般的は少なくとも約６０％、７０％、もしくは７５％、通常は少なくとも約８０％、または代表的には少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上を指す。
用語「免疫アッセイ」とは、抗原に結合もしくは特異的に結合する抗体または免疫原を使用するアッセイを包含する。この免疫アッセイは、代表的には、その抗原を単離、標的化、および／または定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することによって特徴付けられる。
用語「被験体」とは、本明細書中で使用される場合、生物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、オランウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、もしくは他の非ヒト哺乳動物；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物脊椎動物（例えば、鳥類（例えば、ニワトリもしくはアヒル）または魚類）および非哺乳動物無脊椎動物が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「薬学的組成物」とは、被験体（動物またはヒトを含む）における薬学的使用のために適切な組成物を意味する。薬学的組成物は、一般的には、有効量の活性成分と、キャリア（例えば、薬学的に受容可能なキャリアが挙げられる）とを含む。
用語「有効量」とは、望ましい結果を生じるために充分な投与量または量を意味する。望ましい結果とは、その投与量または量のレシピエントにおける、客観的もしくは主観的な改善を包含する。
「予防的処置」とは、疾患、病理、もしくは医学的障害の徴候も症状も提示しない被験体、または疾患、病理、もしくは医学的障害の初期徴候もしくは初期症状のみを提示する被験体に投与される処置であって、処置は、その疾患、病理、もしくは医学的障害が発症する危険を、消失するため、予防するため、または減少するために行われる。予防的処置は、疾患または障害に対する防止的処置として機能する。「予防的活性」とは、疾患、病理、もしくは障害の徴候も症状も提示しない被験体、または疾患、病理、もしくは障害の初期徴候もしくは初期症状のみを提示する被験体に投与された場合に、病理、疾患もしくは障害を発症するその被験体の危険を消失、防止、または減少する、薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組み合わせ）の活性である。「予防的に有用な」薬剤または化合物（例えば、核酸もしくはポリペプチド」とは、病理、疾患、もしくは障害の発症を消失、防止、処置、または減少する際に有用な、薬剤または化合物を指す。
「治療的処置」とは、疾患、病理、もしくは障害の徴候もしくは症状を提示する被験体に投与される処置であって、処置は、それらの病理、疾患、もしくは障害の徴候もしくは症状を消失または除去するために、その被験体に行われる。「治療活性」とは、病理、疾患、もしくは障害の徴候もしくは症状を、そのような徴候または症状に罹患している被験体に投与された場合に除去または消失する薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、もしくはそれらの組み合わせ）の活性である。「治療的に有用な」薬剤または化合物（例えば、核酸またはポリペプチド）とは、その薬剤または化合物が、病理、疾患、もしくは障害のそのような徴候または症状を消失、処置または排除する際に有用である。
用語「遺伝子」とは、生物学的機能に関係する任意のＤＮＡセグメントを広範に指す。遺伝子は、その発現のために必要なコード配列および／または調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡ核酸セグメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の調節領域）を含む。遺伝子は、種々の供給源（目的の供給源からのクローニング、または既知配列情報もしくは推定配列情報からの合成を含む）から入手され得、望ましいパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
一般的には、本明細書中で以後使用される命名法、ならびに下記の細胞培養における実験室手順、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、およびタンパク質化学は、周知のものであり、当業者によって一般的に使用される。標準的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）Ｖｏｌ．１〜３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｌｏｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（本明細書中で以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業（１９９４〜１９９９補遺）（本明細書中以後「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されるもの）は、組換え核酸法、組換え合成、細胞培養法、およびトランスジーン組み込みのために使用される（例えば、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、皮膚を通しての押し付け、およびリポフェクション）。一般的に、オリゴヌクレオチド合成工程および精製工程が、仕様に従って実施される。上記技術および手順は、一般的には、当該分野における従来方法、およびこの文書全体を通して提供される種々の一般的参考文献に従って、実施される。その中における手順は、当業者にとって周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的または部分的にコードされる、１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質をいう。用語「抗体」は、抗体全体およびその結合フラグメントを意味するために使用される。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ定常領域遺伝子、λ定常領域遺伝子、α定常領域遺伝子、γ定常領域遺伝子、δ定常領域遺伝子、ε定常領域遺伝子、およびμ定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、次いで、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。代表的な免疫グロブリン（例えば、抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う、約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖（ＶＬ）」および「可変重鎖（ＶＨ）」は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
抗体はまた、単一アームの複合モノクローナル抗体、単鎖抗体（単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体（可変重鎖および可変軽鎖が一緒に（直接にかまたはペプチドリンカーを介して）結合されて連続ポリペプチドを形成している）を含む）、ならびにディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）（Ｐａｃｋら（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４６：２８；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：１２７１；およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９）を包含する。上記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメントなどである。
用語「エピトープ」とは、抗体に特異的に結合可能であるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常は、分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖）の化学的に活性な表面グルーピングからなり、エピトープは、通常は、特定の３次元構造特徴、ならびに特定の電荷特徴を有する。高次構造エピトープおよび非高次構造エピトープは、前者に結合するが後者には結合しないことが、変性溶媒の存在下では失われる点で、区別される。
抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合する抗体のペプチドフラグメントまたはポリペプチドフラグメントである。抗原結合部位は、その抗原の結合に寄与するか、その抗原の結合に関与するか、またはその抗原の結合に影響を与える、その抗体のアミノ酸によって決定される。Ｓｃｏｔｔ，Ｔ．Ａ．およびＭｅｒｃｅｒ，Ｅ．Ｉ．，Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，第３版、１９９７）、ならびにＷａｔｓｏｎ，ＪＤ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ（第２版、１９９２）（本明細書中以後「Ｗａｔｓｏｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」）（これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
用語「スクリーニング」とは、一般的に、本発明の最適な分子（例えば、本発明のポリペプチド、ならびにそれを含む関連する融合ポリペプチド、およびそのようなすべての分子をコードする核酸）を同定するプロセスを記載する。これらの個々の分子のいくつかの特性は、例えば、個々の分子が、リガンドもしくはレセプターに結合する能力、細胞増殖を阻害する能力、ウイルス感染細胞においてウイルス複製を阻害する能力、細胞サイトカイン生成を誘導もしくは阻害する能力、試験系またはインビトロ適用、エキソビボ適用もしくはインビボ適用において免疫応答を変化させる（例えば、望ましい免疫応答を誘導もしくは阻害する）能力を、選択およびスクリーニングする際に使用され得る。抗原の場合、その抗原のいくつかの特性は、いくつかの関連する抗原由来のエピトープの選択およびスクリーニング（抗原発現、フォールディング、安定性、免疫原性および存在を含む）する際に使用され得る。
「選択」とは、同定および物理的分離が（例えば、選択マーカーの発現によって）同時に達成され、その後、いくつかの遺伝的環境においては、そのマーカーを発現する細胞は生存するが他の細胞は死ぬ（またはその逆）を可能にする、スクリーニング形式である。スクリーニングマーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β―ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質などが挙げられる。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子などが挙げられる。別の選択様式は、検出可能な事象（例えば、レセプターへのリガンドの結合、基質と酵素との反応、または検出可能なシグナルを直接（例えば、発色基質もしくは発色リガンドを使用することにより）もしくは間接（たとえば、発色二次抗体との反応により）に生成し得る他の物理的プロセスに基づく、物理的選別を含む。物理的選別による選択は、種々の方法（例えば、全細胞計形式または微小液滴形式での、ＦＡＣＳ）によって、達成され得る。
「外因性核酸」、「外因性ＤＮＡセグメント」、「異種配列」または「異種核酸」とは、本明細書中で使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来性の供給源に由来するもの、または同じ供給源に由来する場合にはその元の形態から改変されているものである。従って、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが改変されている遺伝子を包含する。本明細書中に記載される適用における異種配列の改変は、代表的には、再帰的配列組換えの使用を介して生じる。この用語は、その細胞に対して外来性もしくは異種であるＤＮＡセグメント、またはその細胞に対して同種であるがその宿主細胞の核酸内のそのエレメントが通常は見出されない位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを生じるように発現される。
用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態である、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、およびそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同じ結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。他のように示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存改変体（例えば、縮重コドン置換）、および相補的配列、ならびに明示的に示される配列もまた、暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（もしくはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８）。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＡＮ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
「遺伝子から誘導された核酸」とは、その合成のために、その遺伝子もしくはその部分配列が最終的にはテンプレートとして役立った、核酸を指す。従って、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、そのｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、すべて、その遺伝子から誘導され、そのような誘導生成物は、サンプルにおけるもとの遺伝子および／または遺伝子転写物の、存在および／もしくは量の指標である。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置された場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を増加する場合には、そのコード配列と作動可能に連結されている。「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が、代表的には連続しており、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合には、連続しかつ読取り枠中にある。しかし、エンハンサーは、プロモーターと数キロベース（ｋｂ）離れている場合に機能し、イントロン配列は、可変長であり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されているが連続はしていないものであり得る。
用語「サイトカイン」としては、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血増殖因子、腫瘍壊死因子、およびトランスホーミング増殖因子が挙げられる。一般的に、これらは、免疫系細胞の成熟、活性化、増殖および分化を調節する、低分子量タンパク質である。
本明細書および特許請求の範囲において、例えば、非ポリペプチド部分、アミノ酸残基、置換、緩衝液、カチオンなどの文脈における、「ある」成分（「ａ」 ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に対する言及は、そうでないように言及されない限り、またはこれが当てはまらないことがその特定の文脈から明らかではない場合には、１つ以上のそのような成分を指すことが意図される。例えば、表現「Ａ、ＢおよびＣからなる群より選択される成分」は、Ａ、Ｂ、およびＣのすべての組み合わせ（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、またはＡ＋Ｂ＋Ｃ）を包含することが意図される。
種々のさらなる用語が、本明細書中で規定されるかまたは他の方法で特徴付けられる。
（本発明の分子および方法）
本発明の分子（例えば、本発明のポリペプチド、本発明の結合体、およびこれらのポリペプチドをコードする核酸）は、インターフェロンαによる処置に応答性である疾患および状態（特に、ウイルス感染（例えば、ＨＣＶによる感染）に関連する疾患および状態）の処置に有用である。
慢性ＨＣＶ感染を有する患者は、代表的には、処置前に、１ｍｌの血清当たり、１０４〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡの範囲のウイルス負荷を有する。ＩＦＮ−αでの処置の際に、これらの患者におけるウイルス負荷は、特徴的には、２つの別個の対数線形相の減少を起こす（図１Ｂ；Ｎｅｕｍａｎｎ Ａ．Ｕ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１０３〜１０７）。最初の２日間のＩＦＮ−α治療において生じるウイルス負荷の迅速な初期減少は、感染した肝細胞におけるウイルス生成のインターフェロンα媒介性減少、および同時に生じる感染に対する未刺激細胞の防御に起因すると考えられる。ウイルス生成速度は、約２日間で新たな定常状態に達し、この時、ウイルスクリアランスのあまり迅速ではない第２の対数線形相が観察される。この第２のウイルスクリアランス段階は、一般的には、感染した肝細胞のＴ細胞媒介性死滅に部分的には起因すると考えられる（Ｎｅｒｕｍａｎｎら、前出）。ＩＦＮ−αは、抗原特異的Ｔ細胞がＴＨ１細胞へと分化するのを刺激するのを介して、この生物学的応答において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、リバビリンの作用様式は、ＴＨ１応答の増強に起因すると考えられ、そしてＩＦＮ−αを用いる併用療法におけるその効力の機構的基礎であると考えられる。現在使用中であるインターフェロンα治療に対して非応答性であるＨＣＶ感染患者（一般的に「非応答者」と呼ばれる）は、かなり狭いウイルス負荷クリアランス特性を示す（図１Ａ）。
本発明は、基礎となる機構の特定の理論によって限定されることは意図されないが、代理アッセイ系（例えば、本明細書中により詳細に記載される系）における抗ウイルス活性は、例えば、ウイルスクリアランスの第１段階において、インターフェロンαの効力の前兆であり得ることが提唱される。実施例の節において記載される例示的な抗ウイルスアッセイは、ヒト肝細胞におけるＨＣＶに対する有効性のための代理系として、ＨｕＨ７ヒト肝臓由来細胞において、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性効果を保護する際のＩＦＮ−αの有効性をモニターする。実施例２は、ＥＭＣＶ／ＨｕＨ７抗ウイルス活性アッセイにおける本発明の代表的なポリペプチドの抗ウイルス活性を示す。予備実験は（データは示さず）は、本発明のポリペプチドが他のウイスル／細胞系（ＷＩＳＨヒト羊膜組織由来の細胞におけるＥＭＣＶ、ＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞におけるＥＭＣＶ、ＨｕＨ７細胞における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＨａＬａ細胞におけるワクシニアウイルス（ＶＶ）、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞における黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、およびヒト一次ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられる）において抗ウイルス活性を示すことを示す。このことは、本発明のポリペプチドが広範囲のウイルスおよび細胞型に対して抗ウイルス活性を示すことを示唆する。
感染した肝細胞中のＨＣＶ複製に対する他の代理アッセイ系としては、例えば、Ｌｏｈｍａｎｎ Ｖ．ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（５４２４）：２８５−３；Ｒａｎｄａｌｌ Ｇ．およびＲｉｃｅ Ｃ．Ｍ．（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４（６）：７４３−７；およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １：９１１に記載されるようなＨＣＶレプリコン系が挙げられる。ＨＣＶ抗ウイルス効力をモニタリングするのに有用なインビボ系の例は、Ｍｅｒｃｅｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（８）：９２７−９３３に記載されるようなキメラヒト肝臓ＳＣＩＤマウスである。
ＩＦＮ−αによるＴＨ１分化の増強および／またはＴＨ２分化の抑制は、例えば、ウイルスクリアランスの第２段階において、インターフェロンαの効力に寄与する因子であり得ることが、さらに提唱されるが、理論によって限定されるわけではない。この理論に従うと、これらの生物学的活性（すなわち、ＴＨ１分化の増強および／またはＴＨ２分化の抑制）の増加した効力を有する進化したＩＦＮ−αは、例えば、同じ投与量で投与される現在認可された治療用インターフェロンα分子と比較して、増加した効力を有すると推定される。本明細書中の実施例の節において記載される例示的アッセイは、ＥＬＩＳＡを介するか、または細胞内染色およびＦＡＣＳ選別を介して、ＴＨ１表現型に関連するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）および／またはＴＨ２表現型に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−４）の生成を測定することによって、未刺激ＴＨ０細胞に対するＩＦＮ−αによるＴＨ１分化の増強および／またはＴＨ２分化の抑制をモニターする。
ＩＦＮ−α分子の治療効力は、用量限定的毒性（例えば、血小板減少症および好中球減少症）に部分的には起因して、減少する傾向がある。本発明は、基礎となる機構の特定の理論によって限定されることが意図されないが、そのような毒性は、血小板前駆体および好中球前駆体に対するＩＦＮ−αの抗増殖効果に関係し得ること、および代理アッセイ系（例えば、本明細書中に記載される系）における抗増殖活性は、インターフェロンα分子の相対的毒性の前兆となり得ることが提唱される。従って、ＩＦＮ−α治療に関連する用量限定的毒性は、例えば、現在認可されている治療用インターフェロンα分子（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα―２ａ、組換え型；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα―２ｂ、組換え型；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（インターフェロンαｃｏｎ−１；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．））と比較して減少した抗増殖活性を示すＩＦＮ−α分子において、減少され得る。本明細書中の実施例の節において記載される例示的抗増殖活性アッセイは、ヒトＤａｕｄｉリンパ系細胞の増殖に対するＩＦＮ−αの効果をモニターする。あるいは、またはさらに、用量限定的毒性は、より治療上活性な分子の投与の結果として減少され得、このことは、現在認可されている分子よりも低濃度または低頻度での投与を可能にする。
新規なインターフェロンαポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする核酸を提供することが、本発明の目的である。本発明のポリペプチドは、インターフェロンαによる処置に応答性である疾患および障害（特に、ウイルス感染（例えば、ＨＣＶによる感染）に関連する疾患）の処置に有用である。本発明のいくつかのポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および／またはＴＨ１分化活性）を示す。本発明のいくつかのポリペプチドは、以下の特性のうちの１つ以上の示す：参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較して増加もしくは減少した抗ウイルス活性；参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較して増加もしくは減少したＴＨ１分化活性；参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較して増加もしくは減少した抗増殖活性。参照ＩＦＮ−αポリペプチドは、天然に存在しないインターフェロンα（例えば、ＩＦＮ−α Ｃｏｎ１）の配列（配列番号４３）を含み得るか、あるいは天然に存在する（すなわち、野生型）インターフェロンαポリペプチドの配列を含み得る。天然に存在するインターフェロンαポリペプチドの配列の例としては、ヒトＩＦＮ−αポリペプチドの配列（例えば、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ２ａ（２３位がＬｙｓである配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ２ｃ（３４位がＡｒｇである配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｂ（配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α８ａ（９８位がＶａｌであり、９９位がＬｅｕであり、１００位がＣｙｓであり、１０１位がＡｓｐである配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｃ（１６１位がＡｓｐであり、１６２位〜１６６位のアミノ酸が欠失している配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）、ｈｕＩＦＮ−α １４ｃ（１５２位がＬｅｕである配列番号３９）、または他の任意の天然に存在するヒトインターフェロンαポリペプチドの配列（例えば、本明細書の図２および図４に示される配列（配列番号３１〜４２）、ならびに／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に列挙される配列））が、挙げられる。
別の局面において、本発明は、参照インターフェロンα分子（例えば、治療剤として現在利用されるインターフェロンα分子（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ、ＩＮＴＲＯＮ ＡまたはＩＮＦＥＲＧＥＮ））と比較して、ウイルス感染細胞からウイルスを除去することにおいて増強された効力を示すインターフェロンαポリペプチドを提供する。例示的なウイルスとしては、フラビウイルス科のウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスおよびウシウイルス性下痢ウイルス）ヘパドナウイルス科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ピコルナウイルス科のウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；レトロウイルス科のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）；コロナウイルス科のウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス）；ラブドウイルス科のウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス科のウイルス（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス）、ならびにヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。このような増強された効力は、参照分子と比較して増強された抗ウイルス活性、増強されたＴＨ１分化活性、またはその両方から生じ得る。例えば、本発明のいくつかのインターフェロンαポリペプチドは、現在使用されているインターフェロンα分子での処置に対する応答性の乏しいウイルスまたはウイルス株（例えば、遺伝子型１のＨＣＶ）をクリアランスすることにおいて特に有用であり得る。
本発明のいくつかのポリペプチドは、参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（抗ウイルス活性／抗増殖活性）比、および／または参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（ＴＨ１分化活性／抗増殖活性）比を示す。そのような特性を示すポリペプチドは、ウイルス感染（例えば、上に列挙したウイルスによる感染）の処置において特に有効であり得る。そのようないくつかのポリペプチドは、例えば、上記の二段階性ウイルスクリアランスプロフィールの一方の段階もしくは両方の段階において、ＨＣＶ処置において現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得、かつ／または減少した毒性を示し得る。そのようないくつかのポリペプチドは、遺伝子型１のＨＣＶの処置において、現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得る。
結合体を提供することが本発明の別の目的であり、そのような結合体は、本発明のポリペプチドに結合した１つ以上の非ポリペプチド部分を含み、この結合体は、インターフェロンα活性（例えば、上記に列挙された活性のうちの１つ以上）を示し、そして必要に応じて、他の望ましい特性（例えば、非結合型ポリペプチドと比較して、増加した血清半減期、および／または機能的なインビボ半減期、および／または減少した抗原性）を示す。そのようないくつかの結合体は、参照インターフェロンα分子（例えば、現在治療剤として使用されているインターフェロンα結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグインターフェロンα―２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）もしくはＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグインターフェロンα―２ｂ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と比較して、ウイルスに感染した細胞からウイルスをクリアランスする際に増強された効力を示す。例示的なウイルスとしては、フラビウイルス科のウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスおよびウシウイルス性下痢ウイルス）ヘパドナウイルス科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ピコルナウイルス科のウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；レトロウイルス科のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）；コロナウイルス科のウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス）；ラブドウイルス科のウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス科のウイルス（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス）、ならびにヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような増強された効力は、その参照分子と比較して、増強された抗ウイルス活性、増強されたＴＨ１分化活性、またはその両方から生じ得る。例えば、本発明のいくつかのインターフェロンα結合体は、
現在使用されているインターフェロンα分子での処置に対する応答性の乏しいウイルスまたはウイルス株（例えば、遺伝子型１のＨＣＶ）をクリアランスすることにおいて特に有用であり得る。
本発明のいくつかの結合体は、参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（抗ウイルス活性／抗増殖活性）比、および／または参照ＩＦＮ−α分子と比較して増加した（ＴＨ１分化活性／抗増殖活性）比を示す。そのような特性を示す結合体は、ウイルス感染（例えば、上に列挙したウイルス（例えば、ＨＣＶ）による感染）の処置において特に有効であり得る。そのようないくつかの結合体は、例えば、上記の二段階性ウイルスクリアランスプロフィールの一方の段階もしくは両方の段階において、ＨＣＶ処置において現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得、かつ／または減少した毒性を示し得る。そのようないくつかのポリペプチドは、遺伝子型１のＨＣＶの処置において、現在認可されているインターフェロンα分子を超えて増強された治療効力を提供し得る。
ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害する方法を提供することが、本発明の別の目的である。この方法は、ウイルス感染細胞に、本発明のポリペプチドまたは結合体をその細胞におけるウイルス複製を阻害するために有効な量で投与する工程を包含する。本発明はまた、ウイルス感染細胞においてウイルスのコピー数を減少させる方法を提供し、この方法は、そのウイルス感染細胞に、その細胞におけるそのウイルスのコピー数を減少させるために有効な量で、本発明のポリペプチドまたは結合体を投与する工程を包含する。上記ウイルスは、例えば、フラビウイルス科のウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスおよびウシウイルス性下痢ウイルス）ヘパドナウイルス科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ピコルナウイルス科のウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；レトロウイルス科のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）；コロナウイルス科のウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス）；ラブドウイルス科のウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス科のウイルス（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス）、あるいはヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）のウイルスであり得る。上記ウイルスは、例えば、ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＣＶ）、ＤＮＡウイルス（例えば、ＨＢＶ）、またはレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ）であり得る。上記細胞は、培養中であっても、または哺乳動物から単離されていても（すなわち、インビトロもしくはエキソビボ）よく、あるいは、インビボ（例えば、哺乳動物（例えば、Ｍｅｒｃｅｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（８）：９２７〜９３３）に記載されるようなＳＣＩＤマウスモデル）、霊長類、またはヒト）中に有り得る。
本発明はまた、ＴＨ０細胞のＴＨ１分化を増強する方法を提供し、この方法は、ＴＨ０細胞を含む集団に、上記集団におけるＴＨ１表現型に関係するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の生成を増加するため、および／またはＴＨ２表現型に関係するサイトカイン（例えば、ＩＬ−４もしくはＩＬ−５）の生成を減少するために有効な量で、本発明のポリペプチドもしくは結合体を投与する工程を包含する。この集団は、培養中であっても、または哺乳動物から単離されていても（すなわち、インビトロもしくはエキソビボ）よく、あるいは、インビボ（例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト）中に有り得る。
本発明はまた、細胞集団の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、その細胞集団を、その細胞集団の増殖を減少するために有効な量で、本発明のポリペプチドまたは結合体と接触させる工程を包含する。その細胞集団は、培養中であっても、または哺乳動物から単離されていても（すなわち、インビトロもしくはエキソビボ）よく、あるいは、インビボ（例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト）中に有り得る。
本発明のこれらの目的および他の目的が、以下により詳細に考察される。
（本発明のポリペプチド）
本発明は、新規のインターフェロンαポリペプチドを提供し、これらは、本明細書中で集合的に「本発明のポリペプチド」と称される。用語「本発明のポリペプチド」は、全体にわたって、本明細書に開示されるポリペプチド配列の改変体を包含することが意図される。また、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、および本発明のポリペプチドを含む結合体が、本発明に含まれる。
種々のインターフェロンαをコードする配列のフラグメントが、再帰的に組換えられて、組換えポリヌクレオチドを含むライブラリーが形成され、そのライブラリーからいくつかの本発明のポリペプチドが発見された。組換えポリヌクレオチドのライブラリーを得るための方法、および／または再帰的な配列組換えのための基質として使用される核酸の多様性を得るための方法もまた、下に記載される。
例示的な本発明のポリペプチドとしては、配列番号１６〜３０（例えば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０）として本明細書で同定される核酸によってコードされる、配列番号１〜１５（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５）として本明細書で同定される配列を含むポリペプチドが挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号４４〜１０４（例えば、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４）として本明細書で同定される配列を含むポリペプチドが挙げられる。いくつかのそのようなポリペプチドはさらに、Ｎ末端に付加されたさらなるアミノ酸（例えば、メチオニン）を含む。本発明はまた、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および結合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。
本発明はまた、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））と、０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、０〜１６個の位置が、０〜１５個の位置が、０〜１４個の位置が、０〜１３個の位置が、０〜１２個の位置が、０〜１１個の位置が、０〜１０個の位置が、０〜９個の位置が、０〜８個の位置が、０〜７個の位置が、０〜６個の位置が、０〜５個の位置が、０〜４個の位置が、０〜３個の位置が、０〜２個の位置が、または０〜１個の位置が））異なる配列を含むポリペプチドを包含する。いくつかの例では、上記ポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。いくつかのそのようなポリペプチドはさらに、Ｎ末端に付加されたさらなるアミノ酸（例えば、メチオニン）を含む。本発明はまた、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および結合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。
いくつかの例では、本発明のポリペプチドの配列は、配列番号１〜１５、４および５３のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）に対して１つ以上の位置（４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位および１６２位が挙げられるが、これらに限定されない）で異なるアミノ酸に対するアミノ酸の置換を含む。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、４７位にＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位にＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位にＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位にＡｌａまたはＴｈｒ；５５位にＰｈｅ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ；５６位にＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位にＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位にＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位にＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位にＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位にＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位にＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位にＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位にＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位にＡｌａまたはＶａｌ；７６位にＡｌａまたはＴｈｒ；７７位にＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位にＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位にＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位にＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇ；８３位にＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位にＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位にＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位にＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位にＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位にＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位にＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位にＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位にＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位にＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位にＡｒｇまたはＳｅｒ；（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。本発明はまた、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および結合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。
いくつかの本発明のポリペプチドは、親分子がその分子の表面に曝される（例えば、表面に曝されるその側鎖のうちの少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％）を有すると計算される）アミノ酸残基を含むと予測される位置に置換を含む。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、１つ以上の位置に異なるアミノ酸に対するアミノ酸の置換を含み、この１つ以上の位置としては、配列番号１〜１５、４７および５３のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）に対して２５％を超える部分接触可能表面積（Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ（ＡＳＡ））を有するアミノ酸残基を含む以下の位置：２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、１６位、１９位、２０位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、３０位、３１位、３３位、３４位、３５位、３７位、４０位、４１位、４２位、４４位、４６位、４７位、４９位、５０位、５１位、５２位、５９位、６２位、６３位、６６位、６９位、７０位、７１位、７２位、７４位、７５位、７８位、７９位、８０位、８１位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、９４位、９５位、９７位、９８位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１８位、１２１位、１２２位、１２５位、１２６位、１２８位、１２９位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４６位、１４９位、１５０位、１５３位、１５４位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５および１６６位が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、１つ以上の位置に異なるアミノ酸に対するアミノ酸の置換を含み、この１つ以上の位置としては、配列番号１〜１５、４７および５３のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）に対して５０％を超えるＡＳＡを有するアミノ酸残基を含む以下の位置：２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、１６位、１９位、２０位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、３０位、３１位、３３位、３４位、３５位、３７位、４０位、４１位、４２位、４４位、４６位、４７位、４９位、５０位、５１位、５２位、５９位、６２位、６３位、６６位、６９位、７０位、７１位、７２位、７４位、７５位、７８位、７９位、８０位、８１位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、９４位、９５位、９７位、９８位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１８位、１２１位、１２２位、１２５位、１２６位、１２８位、１２９位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４６位、１４９位、１５０位、１５３位、１５４位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位および１６６位が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの本発明のポリペプチドは、システイン残基を２５％を超える部分ＡＳＡを有する位置に導入する１つ以上の以下の置換：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｇ１０Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｑ２０Ｃ、Ｒ２２Ｃ、Ｒ２３Ｃ、Ｉ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｌ２６Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ３０Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｒ３３Ｃ、Ｈ３４Ｃ、Ｄ３５Ｃ、Ｒ３７Ｃ、Ｑ４０Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｅ４２Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｖ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｅ５９Ｃ、Ｑ６２Ｃ、Ｑ６３Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｓ６９Ｃ、Ｔ７０Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｄ７８Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｔ８０Ｃ、Ｌ８１Ｃ、Ｅ８３Ｃ、Ｋ８４Ｃ、Ｉ８７Ｃ、Ｆ９０Ｃ、Ｑ９１Ｃ、Ｎ９４Ｃ、Ｄ９５Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｖ１００Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｖ１０４Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｍ１１２Ｃ、Ｎ１１３Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｑ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｔ１２８Ｃ、Ｌ１２９Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｋ１３４Ｃ、Ｋ１３５Ｃ、Ｙ１３６Ｃ、Ｓ１３７Ｃ、Ｐ１３８Ｃ、Ａ１４６Ｃ、Ｍ１４９Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｃ、Ｎ１５７Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（または配列番号１に対して同等の位置）、ならびにそれらの組み合わせを含む。
いくつかの本発明のポリペプチドは、リジン残基を２５％を超える部分ＡＳＡを有する位置に導入する１つ以上の以下の置換：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｇ１０Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｒ２２Ｋ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２４Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｌ２６Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｌ３０Ｋ、Ｒ３３Ｋ、Ｈ３４Ｋ、Ｄ３５Ｋ、Ｒ３７Ｋ、Ｑ４０Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｅ４２Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｖ５１Ｋ、Ｑ５２Ｋ、Ｅ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｑ６３Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ｓ６９Ｋ、Ｔ７０Ｋ、Ｎ７２Ｋ、Ｓ７４Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｄ７８Ｋ、Ｅ７９Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｌ８１Ｋ、Ｅ８３Ｋ、Ｉ８７Ｋ、Ｆ９０Ｋ、Ｑ９１Ｋ、Ｎ９４Ｋ、Ｄ９５Ｋ、Ｅ９７Ｋ、Ａ９８Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｍ１１２Ｋ、Ｎ１１３Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｑ１２５Ｋ、Ｒ１２６Ｋ、Ｔ１２８Ｋ、Ｌ１２９Ｋ、Ｔ１３２Ｋ、Ｙ１３６Ｋ、Ｓ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１４６Ｋ、Ｍ１４９Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１５３Ｋ、Ｆ１５４Ｋ、Ｎ１５７Ｋ、Ｑ１５９Ｋ、Ｒ１６１Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（または配列番号１に対して同等の位置）、ならびにそれらの組み合わせを含む。
いくつかの本発明のポリペプチドは、異なるアミノ酸残基に対するアミノ酸の置換、アミノ酸残基の欠失を含み、これは、本発明のいずれかのポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）））から１つ以上のリジン（例えば、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０、および／またはＫ１６５（配列番号１に対して））を除く。除かれるべき１つ以上のリジンは、任意の他のアミノ酸で置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。いくつかのそのようなポリペプチドは、置換Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ；Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；またはＫ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒを含む。他の例示的な置換としては、Ｋ７１Ｅ；Ｋ８４Ｅ；Ｋ１３３Ｅ／Ｇ；およびＫ１６０Ｅが挙げられる。
いくつかの本発明のポリペプチドは、本発明のいずれかのポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）））から１つ以上のヒスチジン（例えば、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ３４、および／またはＨ４７（配列番号１に対して））を除く置換または欠失を含む。除かれるべき１つ以上のヒスチジンは、任意の他のアミノ酸で置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。いくつかのそのようなポリペプチドは、置換Ｈ３４Ｑ；Ｈ４７Ｑ；またはＨ３４Ｑ＋Ｈ４７Ｑを含む。
いくつかの本発明のポリペプチドは、異なるアミノ酸に対するアミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の挿入を含み、これは、Ｎ−結合型グリコシル化部位（Ｎ７２ Ｓ７３ Ｓ７４（配列番号１に対して））を除くか、他の場合はＮ−結合型グリコシル化部位の空間的配置を崩壊させる。この部位の除去は、多くの方法で（例えば、Ｎ７２の欠失またはＮ７２の異なるアミノ酸での置換、Ｓｅｒ７３のＰｒｏでの置換，Ｓｅｒ７４のＳｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓ以外のアミノ酸での置換、あるいは７３位と７４位との間のＳｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓ以外のアミノ酸残基の挿入によって）達成され得る。例えば、いくつかのそのようなポリペプチドは、置換Ｎ７２Ｄを含む。
いくつかの本発明のポリペプチドは、例えば、潜在的なプロテアーゼ感受性部位の存在を最小限にするために、またはいくつかの例ではアミン反応性結合（例えば、ＰＥＧ化）試薬に対して潜在的に反応性の部位を除くために、１つ以上のアミノ酸置換、１つ以上の塩基性残基もしくは１つ以上の塩基性残基の対（例えば、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）を除く欠失または挿入を含む。例えば、Ｃ末端付近の二塩基性配列の除去は、Ｌｙｓ１６０、Ａｒｇ１６１、Ａｒｇ１６３、Ａｒｇ１６４およびＬｙｓ１６５のうちの１つ以上（配列番号１に対して）の除去によって達成され得る。除かれるべき１つ以上のＬｙｓまたはＡｒｇは、例えば、欠失されても、ＬｙｓでもＡｒｇでもない任意のアミノ酸で置換されてもよい。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、Ｌｙｓ１６０、Ａｒｇ１６１およびＡｒｇ１６４のＬｙｓでもＡｒｇでもないアミノ酸での１つ以上の置換（例えば、置換Ｌｙｓ１６０Ｇｌｕ；Ａｒｇ１６１Ｓｅｒ／Ｃｙｓ；およびＡｒｇ１６４Ｓｅｒ／Ｃｙｓのうちの１つ以上）を含む。あるいは、またはさらに、いくつかのそのようなポリペプチドは、Ｌｙｓ１６０、Ａｒｇ１６１、Ａｒｇ１６３、Ａｒｇ１６４およびＬｙｓ１６５のうちの１つ以上の欠失を含み、これは、個々の欠失（例えば、Ｋ１６５＊）または１つ以上の群（Ｃ末端切断（例えば、Ｋ１６５＊−Ｅ１６６＊）を含む）によってであり得る。
本発明のポリペプチドについて企図される他の改変としては、以下および表題「インターフェロンα結合体」の節において記載されるものが挙げられる。
親ポリペプチドに対する例および改変が、本明細書中で概して配列番号１に対して（またはいくつかの他の特定の配列に対して）提供されるが、開示された改変は、本明細書に記載される本発明の他のポリペプチド（例えば、配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４から選択される配列を含むポリペプチドが挙げられる、ならびにその改変体）のいずれの等価なアミノ酸位置においてもなされ得ることが理解される。したがって、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、配列番号５における置換Ｑ４７Ｃに対応する、などが理解される。
以下の表は、本発明のいくつかのインターフェロンαポリペプチドの配列を提供する。明瞭さのために、これらの配列は、参照配列である配列番号３（表１）または配列番号１２（表２）に対して示される。いくつかのそのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性および／または抗増殖活性）を示す。
Figure 2008505985
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 。
（改変体）
別の局面において、本発明は、親インターフェロンαポリペプチドの改変体である単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを提供し、この改変体は、少なくとも１つのアミノ酸位置が親ポリペプチド配列と異なる配列を含み、この改変体配列は、４７位にＨｉｓ，５１位にＶａｌ，５５位にＰｈｅ，５６位にＬｅｕ，５８位にＴｙｒ，１３３位にＬｙｓおよび１４０位にＳｅｒ（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、上記親インターフェロンαポリペプチド配列は、天然に存在するヒトインターフェロンαの配列（例えば、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ２ａ（配列番号３２で、２３位＝Ｌｙｓである）、ｈｕＩＦＮ−α ２ｃ（配列番号３２で、３４位＝Ａｒｇである）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｂ（配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α ８ａ（配列番号３３で、９８位＝Ｖａｌ、９９＝Ｌｅｕ、１００＝Ｃｙｓおよび１０１＝Ａｓｐである）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｃ（配列番号３３で、１６１位＝Ａｓｐでありそして１６２位〜１６６位のアミノ酸が欠失している）、ｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）、ｈｕＩＦＮ−α １４ｃ（配列番号３９で、１５２位＝Ｌｅｕである）、あるいは任意の他の天然に存在するインターフェロンαポリペプチドの配列（例えば、本明細書の図２および図４に示される配列、および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）、（前出）に列挙される配列）である。いくつかの例では、上記親インターフェロンαポリペプチド配列は、天然に存在しない（すなわち、合成の）インターフェロンαの配列（例えば、ＩＦＮ−αＣｏｎ１（配列番号４３））である。いくつかの例では、改変されるべき親ポリペプチドは、それ自体、本発明のポリペプチド（配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ）であり得る。いくつかの例では、上記改変体配列は、１〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が），（例えば、１〜１４個のアミノ酸位置が，１〜１２個のアミノ酸位置が，１〜１０個のアミノ酸位置が，１〜８個のアミノ酸位置が，１〜６個のアミノ酸位置が，１〜５個のアミノ酸位置が，１〜４個のアミノ酸位置が，１〜３個のアミノ酸位置がまたは１〜２個のアミノ酸位置が）親ポリペプチド配列と異なる。いくつかのそのような改変体は、インターフェロンα活性を示す。本発明はまた、これらの改変体を含む融合タンパク質および結合体、ならびにこれらの改変体をコードする単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。
（配列改変体）
上述のように、本発明のポリペプチドは、０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が），（例えば、０〜１６個の位置が、０〜１５個の位置が、０〜１４個の位置が、０〜１３個の位置が、０〜１２個の位置が、０〜１１個の位置が、０〜１０個の位置が、個の位置が、０〜９個の位置が、０〜８個の位置が、０〜７個の位置が、０〜６個の位置が、０〜５個の位置が、０〜４個の位置が、０〜３個の位置が、０〜２個の位置が、または０〜１個の位置が）、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３））と異なる配列を含むポリペプチドを包含する。いくつかのそのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
例えば、いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、長さ約１５０アミノ酸（例えば、約１５１アミノ酸、約１５２アミノ酸、約１５３アミノ酸、約１５４アミノ酸、約１５５アミノ酸、約１５６アミノ酸、約１５７アミノ酸、約１５８アミノ酸、約１５９アミノ酸、約１６０アミノ酸、約１６１アミノ酸、約１６２アミノ酸、約１６３アミノ酸、約１６４アミノ酸、または約１６５アミノ酸を有する配列（親ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１５のうちの１つ）に対して１〜１６アミノ酸の欠失に対応する）を包含する。いくつかの場合において、１〜１１アミノ酸（例えば、１〜１０アミノ酸、例えば、１〜７アミノ酸、例えば、１〜５アミノ酸、例えば、１〜３アミノ酸）が、Ｃ末端から欠失される。すなわち、上記ポリペプチドは、親ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３の１つ）に対して、１〜１１アミノ酸残基（例えば、１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、３アミノ酸残基、４アミノ酸残基、５アミノ酸残基、６アミノ酸残基、７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、または１１アミノ酸残基）（例えば、１〜１０アミノ酸残基、１〜７アミノ酸残基、例えば、１〜５アミノ酸残基、または１〜３アミノ酸残基）の分、Ｃ末端が短縮されている。あるいは、またはそれに加えて、いくつかのそのようなポリペプチドは、親ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３の１つ）に対して、１〜１１アミノ酸残基（例えば、１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、３アミノ酸残基、４アミノ酸残基、５アミノ酸残基、６アミノ酸残基、７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、または１１アミノ酸残基）（例えば、１〜１０アミノ酸残基、１〜７アミノ酸残基、例えば、１〜５アミノ酸残基、または１〜３アミノ酸残基）の分、Ｎ末端が短縮されている。いくつかのそのようなポリペプチドは、Ｎ末端にメチオニンをさらに含む。いくつかのそのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
別の例として、いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、配列番号１〜１５，４７または５３の１つに対して０〜１６個のアミノ酸置換（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸置換（例えば、０〜１４または０〜１２または０〜１０または０〜８または０〜６または０〜５または０〜４または０〜３または０〜２または０〜１個のアミノ酸置換））を含む配列を含む。いくつかの例では、アミノ酸置換のうちの１つ以上は、例えば、以下に示されるような置換基（例えば、保存的置換基）にしたがってなされる。いくつかのそのようなポリペプチドはインターフェロンα活性を示す。
本発明のいくつかのポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）に対して０〜１６個のアミノ酸置換（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸置換（例えば、０〜１４または０〜１２または０〜１０または０〜８または０〜６または０〜５または０〜４または０〜３または０〜２または０〜１個のアミノ酸置換）を含み、上記置換のうちの少なくとも１つは結合基を含むアミノ酸残基を非ポリペプチド部分に導入する。例としては、上およびに表題「インターフェロンα結合体」の節に記載されるような１つ以上のＮ−グリコシル化部位、または１つ以上のシステイン残基もしくはリジン残基の導入が挙げられる。いくつかのそのようなポリペプチドはインターフェロンα活性を示す。
本発明のいくつかのポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）に対して０〜１６個のアミノ酸置換または欠失または挿入（例えば、０〜１４または０〜１２または０〜１０または０〜８または０〜６または０〜５または０〜４または０〜３または０〜２または０〜１個のアミノ酸置換または欠失または挿入（あるいはそれらの組み合わせ））を含む配列を含み、上記置換または欠失（あるいはそれらの組み合わせ）のうちの少なくとも１つは、非ポリペプチド部分に対する結合基を含む親ポリペプチド配列からアミノ酸残基を除くか、またはアミノ酸挿入の場合は、そのような結合基に必要とされる空間的配置を崩壊させる（例えば、Ｎ−グリコシル化 Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフを崩壊させるようなアミノ酸の挿入）。例としては、上およびに表題「インターフェロンα結合体」の節に記載されるような、親ポリペプチド配列からのＮ−グリコシル化部位の除去、またはリジン残基、ヒスチジン残基もしくはシステイン残基の除去が挙げられる。いくつかのそのようなポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
非限定的例として、本発明のポリペプチドは、配列番号３または配列番号３とは合計１６個までの位置において異なる（これは、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および／またはアミノ酸挿入（上記のものを含む）の組み合わせであり得る）配列を有し得る。いくつかの場合において、上記置換のうちのどれも、下記に詳説される置換に従う置換ではないか、いくつかまたはすべてが、下記に詳説される置換に従う置換である。
本発明に従うアミノ酸置換としては、１つ以上の保存的アミノ酸置換が挙げられるが、それには限定されない。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。一例が、下記の表（表３）に提供されており、この表は、互いにとって「保存的置換」であると見なされ得るアミノ酸を含む６つの例示的グループを示す。
Figure 2008505985
 。
他のアミノ酸置換グループが、想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似する類似する機能または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、イオウ含有）によってグループ分けされ得る。例えば、脂肪族基グループは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）を含む。互いにとって保存的置換であると見なされるアミノ酸を含む他のグループとしては、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；イオウ含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）が挙げられる。また、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙを、さらなるアミノ酸グループのために参照のこと。本明細書におけるポリペプチド配列の列挙は、上記の置換グループと組み合わせて、すべての保存的に置換されるポリペプチド配列の列挙を表わす。
（配列同一性パーセント）
一局面において、本発明、各々配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つに対して（例えば、配列番号１〜１５、４７および５３のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）に対して、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％，、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性）を有する配列を含む単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを提供する。いくつかの例では、上記ポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。いくつかの例では、上記ポリペプチド配列は、１つ以上のアミノ酸位置が（例えば、１６個までの位置が（例えば、１〜１６個の位置、１〜１５個の位置、１〜１４個の位置、１〜１３個の位置、１〜１２個の位置、１〜１１個の位置、１〜１０個の位置、１〜９個の位置、１〜８個の位置、１〜７個の位置、１〜６個の位置、１〜５個の位置、１〜４個の位置、１〜３個の位置、または１〜２個の位置）、配列番号１〜１５および４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３）と異なる。例として、本発明にしたがって別のアミノ酸に置換され得るいくつかの位置としては、配列番号１〜１５および４４〜１０４のうちの１つに対して、４７位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、６０位、６１位、６４位、６９位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、９０位、９３位、１３３位、１４０位、１５４位、１６０位、１６１位および１６２位のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、上記配列は、４７位にＨｉｓまたはＧｌｎ；５１位にＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；５２位にＧｌｎ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；５３位にＡｌａまたはＴｈｒ；５５位にＰｈｅ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ；５６位にＬｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａ；５７位にＰｈｅまたはＬｅｕ；５８位にＴｙｒまたはＨｉｓ；６０位にＭｅｔ、ＬｅｕまたはＶａｌ；６１位にＭｅｔまたはＩｌｅ；６４位にＴｈｒまたはＩｌｅ；６９位にＳｅｒまたはＴｈｒ；７１位にＬｙｓまたはＧｌｕ；７２位にＡｓｎまたはＡｓｐ；７５位にＡｌａまたはＶａｌ；７６位にＡｌａまたはＴｈｒ；７７位にＴｒｐまたはＬｅｕ；７８位にＡｓｐまたはＧｌｕ；７９位にＧｌｕまたはＧｌｎ；８０位にＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇ；８３位にＧｌｕまたはＡｓｐ；８４位にＬｙｓまたはＧｌｕ；８５位にＰｈｅまたはＬｅｕ；８６位にＴｙｒ、ＣｙｓまたはＳｅｒ；８７位にＩｌｅまたはＴｈｒ；９０位にＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；９３位にＭｅｔまたはＬｅｕ；１３３位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１４０位にＳｅｒまたはＡｌａ；１５４位にＰｈｅまたはＬｅｕ；１６０位にＬｙｓまたはＧｌｕ；１６１位にＡｒｇまたはＳｅｒ；および１６２位にＡｒｇまたはＳｅｒ；（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。本発明の配列において企図される他の置換は、上および「インターフェロンα結合体」の節に記載される。本発明はまた、そのようなポリペプチドを含む融合タンパク質、そのようなポリペプチドを含む結合体、およびそのようなポリペプチドをコードする単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。
別の局面において、本発明は、配列番号１６〜３０のうちの１つ以上に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性パーセントを有する核酸を提供する。いくつかのそのような核酸は、本発明に記載されるようなインターフェロンα活性を示すポリペプチドをコードする。
配列（ポリペプチドまたは核酸）が別の配列と類似する程度は、その２つの配列についての類似する構造的特性および機能的特性の指標を提供する。従って、本発明に関して、所定の例示的配列に対して類似する配列を有する配列は、本発明の特徴である。特に、下記に規定される配列同一性パーセントを有する配列は、本発明の特徴である。
配列の関係を決定するための種々の方法が、使用され得、それには、手動アラインメントおよびコンピュータ支援型配列アラインメントおよびコンピュータ支援型配列分析が挙げられる。配列アラインメントを実施するための種々のコンピュータプログラムが、利用可能であり、またはアラインメントが、下記に記載されるように、当業者によって手動で調整され得る。
上記のように、本発明において使用されるポリペプチドの配列および核酸の配列は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸の対応する配列とは同じである必要はないが、実質的に同じであり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の変化（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換（保存的もしくは非保存的）（例えば、そのような変化が、そのポリペプチドの使用（例えば、その治療的使用もしくは予防的使用、または治療的投与もしくは予防的投与、または診断適用）において特定の利点を提供し得るものを含む）に供され得る。本発明の核酸はまた、種々の変化（例えば、１つ以上のコドンにおける１つ以上の核酸の置換の結果、特定のコドンが同じアミノ酸または異なるアミノ酸をコードするようになり、サイレント変化（本明細書において規定される）または非サイレント変化を生じるようなもの）、あるいは上記配列における１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の欠失）に供され得る。上記核酸はまた、発現系（例えば、細菌発現系または哺乳動物発現系）における最適な発現を提供する１つ以上のコドンを含むように改変され得るが、望ましい場合には、上記１つ以上のコドンは、依然として同じアミノ酸を含む。そのような核酸変化は、その核酸の治療的または予防的な使用もしくは投与、または診断適用において、特定の利点を提供し得る。上記の核酸およびポリペプチドは、それらが本発明の個々の核酸またはポリペプチドにおける配列と（下記に規定されるように）実質的に同一である配列を含む限りは、多数の方法で改変され得る。
用語「同一」または「同一性」とは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、下記の配列比較アルゴリズムを使用してかまたは目視検査によって決定されるような、最大類似性について比較および整列した場合に、同じであるかまたは特定の割合の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列を指す。
参照「すなわち、照会」配列に対する対象配列の配列同一性パーセント（「同一性％」）とは、その対象配列が、比較する長さにわたって上記照会配列に対して特定の割合だけ（すなわち、ポリペプチド配列に関してはアミノ酸毎に、ポリヌクレオチド配列に関してはヌクレオチド毎に）同じであることを、意味する。
照会配列に対する対象配列の配列同一性パーセントは、以下の通りに計算される。第一に、その２つの配列の最適アラインメントは、特定のアラインメントパラメータを用いる配列比較アルゴリズムを使用して、決定される。この最適アラインメントの決定は、コンピュータを使用して実施されてもよいし，または下記のように、手動で算出されてもよい。その後、最適に整列されたその２つの配列は、その比較する長さにわたって比較される。両方の配列中に同じ残基が存在するその最適アラインメント中の位置数が決定され、それによって、一致した位置の数が提供される。その後、一致した位置の数が、その比較する長さの全位置数（これは、そうではないと特定されない限りは、その照会配列の長さである）によって除算され、その後、その結果に１００が乗算されて、その照会配列に対する対象配列の配列同一性パーセントが得られる。
ポリペプチド配列に関して、代表的には、１つの配列（例えば、本発明のポリペプチド配列）が、「照会配列」と見なされ、この照会配列に対して、１つ以上の他の配列（すなわち、「対象配列」（例えば、配列データベース中に存在する配列））が、比較される。その配列比較アルゴリズムは、その照会配列と対象配列との間の最適アラインメントを決定するために、指摘されたアラインメントパラメータを使用する。配列データベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ；Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ および Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）またはＧＥＮＥＳＥＱ（登録商標）（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｄｅｒｗｅｎｔ；ＳＴＮにおけるＤＧＥＮＥ（登録商標）としても利用可能である））に対して照会配列を比較する場合、通常、その照会配列およびアラインメントパラメータが、コンピュータに入力され；その入力照会配列と、そのデータベース中に存在する各対象配列との間の最適アラインメントが、一般的には、望ましい数の対象配列まで戻される。
２つのポリペプチド配列は、規定されたパラメータ（すなわち、規定されたアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ（または、ギャップ開始ペナルティともいう）、およびギャップ伸長ペナルティ）を使用してそれらの配列を整列させて、その配列対にとって可能な最高の類似性スコアに到達した場合に、「最適に整列されている」。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５〜１０９１９）が、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（例えば、下記のＢＬＡＳＴＰ）におけるデフォルトスコアリング置換マトリックスとして、しばしば使用される。そのギャップ存在ペナルティは、整列された配列のうちの１つにおける１つのアミノ酸ギャップの導入について課せられ、そのギャップ伸長ペナルティは、そのギャップにおける各残基位置について課せられる。そうではないと述べられない限り、本明細書において使用されるアラインメントパラメータは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。そのアラインメントスコアは、そのアラインメントが始まりそして終端する各配列のアミノ酸位置（例えば、アラインメントウィンドウ）によって、そして必要に応じて、一方の配列または両方の配列中に１つもしくは複数のギャップを挿入することによって、可能な最高の類似性スコアに到達するように規定される。
２つ以上の配列の間の最適なアラインメントは、（下記のように）手動で決定され得るが、そのプロセスは、コンピュータにより実施されるアラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（例えば、ポリペプチド配列に関してはＢＬＡＳＴＰ、核酸配列に関してはＢＬＡＳＴＮ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２に記載され、そして種々の供給源（例えば、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｗｅｂｓｉｔｅ）を介して公に利用可能である）の使用によって容易になる。コンピュータ化ＢＬＡＳＴインターフェースを使用する場合、「低複雑度フィルター」を使用する選択肢が存在する場合、この選択肢は、無効にされるべきである（すなわち、フィルターなし）。
図３は、本発明のポリペプチド（Ｂ９ｘ１４、配列番号３）とヒトＩＦＮ−α １４ａ（ＬｅＩＦ Ｈとしてもまた公知、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２０−２６；配列番号３９）（これは、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースおよびＧＥＮＥＳＥＱデータベースに対する問い合わせ配列である配列番号３のＢＬＡＳＴＰ検索で取り出される最も密接に関係する配列であった）との、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ開始ペナルティ１１、ギャップ伸長ペナルティ１を用いるアラインメントを示す。これらの２つの配列は、１６６アミノ酸の長さにわたって１８個のアミノ酸位置が異なり（すなわち、配列番号３９は１８個のアミノ酸位置が配列番号３と異なる）；さらに、（（１６６−１８）／１６６）ｘ １００＝８９なので、配列番号３９は、配列番号３と８９％同一である。
図５は、本発明の別のポリペプチド（Ｂ９ｘ２５、配列番号１２）とヒトＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）（これは、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースおよびＧＥＮＥＳＥＱデータベースに対する問い合わせ配列である配列番号１２のＢＬＡＳＴＰ検索で取り出される最も密接に関係する配列であった）との、上で指定したパラメータを用いるアラインメントを示す。配列番号３９は、１６６アミノ酸の長さにわたって２０個のアミノ酸位置が配列番号１２と異なり；さらに、（（１６６−２０）／１６６）ｘ １００＝８８なので、配列番号３９は、配列番号１２と８８％同一である。
２つのポリペプチド配列の間の最適なアラインメントはまた、上記で特定されたパラメータ（マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１）を使用して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの手動計算（すなわち、コンピュータの支援なし）によって決定され得る。始めに、その２つの配列は、最初に、目視検査によって整列される。その後、初期アラインメントスコアが、以下のように算出される：そのアラインメントの個々の位置各々について（すなわち、整列した各残基対について）、数値が、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスに従って割り当てられる（図６）。そのアラインメント中の各残基対に対して割り当てられた値の合計が、初期アラインメントスコアである。整列しているその２つの配列が非常に類似する場合、しばしば、この初期アラインメントは、可能な最高のアラインメントスコアを提供する。その可能な最高のアラインメントスコアを有するアラインメントは、使用されるアラインメントパラメータに基づく最適アラインメントである。図７Ａは、２つの配列（すなわち、配列番号３の残基２９〜５０として本明細書において同定される「照会配列」（上側）；および配列番号５の残基３０〜５２として本明細書において同定される「対象配列」（下側））についてのアラインメントスコアの算出例を示す。上記配列は、目視検査によって整列された。整列された各アミノ酸対についてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスによって割り当てられた数値が、このアラインメント中の各位置の下に示される（視覚化を助けるために、このアラインメント中の同じアミノ酸対各々が、太字で示される）。この例において、この初期アラインメントは、可能な最高アラインメントスコア（整列された各位置の下に示される値の合計）を提供した；これらの２つの配列の他のどのアラインメントも（ギャップがあろうとなかろうと）、これによりも低いアラインメントスコアを生じる。
いくつかの場合において、より高いアラインメントスコアが、アラインメント中に１つ以上のギャップを導入することによって、取得され得る。ギャップがいつアラインメント中に導入されようとも、ギャップ開始ペナルティが導入され、さらに、ギャップ伸長ペナルティが、そのギャップ中の各残基位置について評価される。従って、上記のアラインメントパラメータ（ギャップ開始ペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１を含む）を使用して、上記アラインメント中の１残基のギャップは、そのギャップに割り当てられた−（１１＋（１ｘ１））＝−１２という値に対応する；３残基のギャップは、そのギャップに割り当てられた−（１１＋（３ｘ１））＝−１４という値に対応する；などである。この計算は、上記アラインメント中に導入された各ギャップ各々について反復される。図７Ｂおよび図７Ｃは、アラインメント中へのギャップ導入が、ギャップペナルティにも関わらず、より高いアラインメントスコアをどのようにもたらし得るかを示す例を示す。図７Ｂは、目視検査によってなされた配列番号３の残基２９〜５０（上側、照会）と、配列番号３２の残基３０〜５０（下側、対象）との初期アラインメントを示し、これは、初期アラインメントスコア６７を生じる。図７Ｃは、そのアラインメントスコアに対する配列番号３２中の１残基ギャップの導入の影響を示す。−１２のギャップペナルティにも関わらず、その２つの配列の全体的アラインメントスコアは、８８まで増加する。この例において、図７Ｃにおいて示されるアラインメントは、可能な最高アラインメントスコアを提供し、従って、これらの２つの配列の最適アラインメントである。これらの２つの配列の他のどのアラインメントは（ギャップを含もうが含むまいが）、それよりも低いアラインメントスコアを生じる。
上記の配列アラインメント算出の例（これは、比較的短い配列を使用する）は、例示目的のためだけに提供されることが、理解されるべきである。実際、使用されるアラインメントパラメータ（ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス，ギャップ開始ペナルティ＝１１，およびギャップ伸長ペナルティ＝１）が、８５アミノ酸長以上のポリペプチド配列について一般的に意図される。ＮＣＢＩウェブサイトは、他の長さの配列について以下のアラインメントパラメータ（これは、上記の同じ手順を使用して、コンピュータ支援型アラインメント算出および手動アラインメント算出のために適切である）を提供する。５０〜８５アミノ酸長の配列について、最適なパラメータは、ＢＬＯＳＵＭ８０マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（前出））、ギャップ開始ペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。３５〜５０アミノ酸長の配列について、最適なパラメータは、ＰＡＭ７０マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．＆Ｏｒｃｕｔｔ，Ｂ．Ｃ．（１９７８）「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ タンパク質ｓ．」Ａｔｌａｓ ｏｆ タンパク質 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３，Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５〜３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、ギャップ開始ペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。３５アミノ酸長未満の配列について、最適なパラメータは、ＰＡＭ３０マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（前出））、ギャップ開始ペナルティ＝９、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。
一旦、それらの配列が最適に整列された後、照会配列に対する対象配列の同一性パーセントが、同じ残基対を含む最適アラインメント中の位置数を計数し、それを比較長の残基数（これは、そうではないと特定されない限りは、照会配列中の残基数である）で除算し、そしてその数に１００を乗算することによって、算出される。図７において示される例に戻ると、各例において、照会配列として示される配列は、２２アミノ酸長である。図７Ａのアラインメントに関して、２０対の整列されたアミノ酸残基（太字で示される）が、照会配列（上側）と対象配列（下側）との最適アラインメントにおいて同じである。従って、この特定の対象配列は、（２０／２２）ｘ１００＝９１．１％の同一性を照会配列に対して有する；換言すれば、図７Ａのアラインメントにおける対象配列は、照会配列に対して少なくとも９１％のアミノ酸配列同一性を有する。図７Ｃに示されるアラインメントにおいて、最適なアラインメントにおける１８対のアミノ酸残基（太字で示される）が同じである；従って、この特定の対象配列は、（１８／２２）ｘ１００＝８１．８％の同一性を照会配列に対して有する；換言すると、図７Ｃのアラインメントにおける対象配列は、照会配列に対して少なくとも８１％のアミノ酸配列同一性を有する。
ポリペプチドに対して適用される場合、用語「実質的な同一性」（または「実質的に同一である」）とは、２つのアミノ酸配列（すなわち、照会配列および対象配列）が上記の適切なパラメータを使用してＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを（手動でかまたはコンピュータを介して）使用して最適に整列された場合、対象配列は、照会配列に対して、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有することを、代表的には意味する。いくつかの場合において、実質的な同一性が、少なくとも約１００アミノ酸残基（例えば、少なくとも約１１０アミノ酸残基、約１２０アミノ酸残基、約１２５アミノ酸残基、約１３０アミノ酸残基、約１３５アミノ酸残基、約１４０アミノ酸残基、約１４５アミノ酸残基、約１５０アミノ酸残基、約１５５アミノ酸残基、約１５６アミノ酸残基、約１５７アミノ酸残基、約１５８アミノ酸残基、約１５９アミノ酸残基、約１６０アミノ酸残基、約１６１アミノ酸残基、約１６２アミノ酸残基、約１６３アミノ酸残基、約１６４アミノ酸残基、約１６５アミノ酸残基、または約１６６アミノ酸残基）の比較長にわたって存在する。
同様に、２つの核酸配列に関して適用される場合、用語「実質的同一性（または実質的に同一）」とは、２つの核酸配列（すなわち、照会配列および対象配列）が、下記の適切なパラメータを使用してＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを（手動でかまたはコンピュータを介して）最適に整列された場合に、対象配列が、照会配列に対して、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有することを意味する。核酸配列アラインメントについて使用されるパラメータは、マッチリワード（ｍａｔｃｈ ｒｅｗａｒｄ） １、ミスマッチペナルティ −３、ギャップ存在ペナルティ ５、ギャップ伸長ペナルティ ２（置換マトリックスは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにおいて使用されない）である。いくつかの場合において、実質的な同一性が、少なくとも約３００ヌクレオチド残基（例えば、少なくとも約３３０ヌクレオチド、約３６０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約３９０ヌクレオチド、約４０５ヌクレオチド、約４２０ヌクレオチド、約４３５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４６５ヌクレオチド、約４８０ヌクレオチド、約４８３ヌクレオチド、約４８６ヌクレオチド、約４８９ヌクレオチド、約４９２ヌクレオチド、約４９５ヌクレオチド、約または４９８ヌクレオチド）の比較長にわたって存在する。
（さらなる局面）
本発明のどのポリペプチドも、より大きなポリペプチド配列の一部として存在し得る（例えば、融合タンパク質（例えば、そのポリペプチドの安定化もしくは検出もしくは精製のために１つ以上のドメインもしくは部分配列を付加した際に生じる）。ポリペプチド精製部分配列としては、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、ＧＳＴ融合物、または当該分野で公知の他の任意の検出／精製用の部分配列または「タグ」が挙げられ得る。これらのさらなるドメインまたは部分配列は、本発明のポリペプチドの活性に対してほとんどまたは全く影響を有さないか、あるいは、プロテアーゼによる処置、インテリンを含めることなどの合成後処理工程によって除去され得る。
本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるようなポリペプチド）を、Ｉｇ分子（例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃ（「フラグメント結晶化可能」またはフラグメント補体結合」ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインと融合して含む、融合タンパク質を包含し、そしてそのような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。Ｆｃは、細胞上にある抗体レセプターおよび補体Ｃ１ｑ成分に対する結合の担う抗体部分である。これらの融合タンパク質およびそのコード核酸は、予防的薬物および／または治療的薬物として、または診断ツールとして、有用である（また、例えば、Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ，Ｐ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３４１９〜３４２６；Ｓｔｕｒｍｈｏｅｆｅｌ，Ｋ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：４９６４〜４９７２）を参照のこと）。本発明はまた、本発明のポリペプチドを、例えば、米国特許第５，８７６，９６９号に記載されるように、アルブミン分子（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））に融合されて含む融合タンパク質を包含し、そしてその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。そのＩｇ−アルブミン融合タンパク質は、増加したポリペプチド血清半減期および／または機能的インビボ半減期、低下したポリペプチド抗原性、増加したポリペプチド貯蔵安定性、または増加するバイオアベイラビリティ（例えば、増加したＡＵＣＳＣ）を示し得、従って、予防的薬物および／または治療的薬物として有用であり得る。
本発明のどのポリペプチドも、１つ以上の改変型アミノ酸を含み得る。その改変型アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分に結合体化したアミノ酸、または有機誘導体化剤に結合体化したアミノ酸であり得る。改変型アミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチド血清半減期および／または機能的インビボ半減期を増加すること、（ｂ）ポリペプチド抗原性を低下すること、（ｃ）ポリペプチド貯蔵安定性を増加すること、または（ｄ）バイオアベイラビリティを増加すること（例えば、ＡＵＣｓｃを増加すること）において、有利であり得る。アミノ酸は、組換え生成の間に同時翻訳的にかまたは翻訳後に改変される（例えば、哺乳動物細胞における発現の間におけるＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフでのＮ−結合型グリコシル化）か、または合成手段によって改変される。この局面は、本明細書において「インターフェロンα結合体」と題される節において、より詳細に記載される。
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのポリペプチドと、賦形剤またはキャリアとを含む、組成物を提供する。一局面において、上記組成物は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちの１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）と０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が）異なるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドと、キャリアまたは賦形剤とを含む。その組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含む組成物であり得る。例示的な組成物および賦形剤およびキャリアは、下記に記載される。
（ポリペプチドの生成）
本発明のポリペプチドを生成および単離するための組換え方法が、本明細書において記載される。組換え生成に加えて、上記ポリペプチドは、固相技術を使用して直接的ペプチド合成によって生成され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．（１９６３）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９〜２１５４を参照のこと）。ペプチド合成は、手動技術または自動化を使用して実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ ペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を、製造業者により提供される指示書に従って使用して、達成され得る。例えば、部分配列が、別個に化学合成され得、そして化学的方法を使用して合わされ得て、全長ポリペプチドまたはそのフラグメントを提供し得る。あるいは、部分配列が、ポリペプチド生成を専門とする多数の会社から購入され得る。より一般的には、本発明のポリペプチドは、（例えば、下記のように）コード核酸を発現させることおよびポリペプチドを回収することによって、生成され得る。
本発明のポリペプチドを生成するための方法もまた、包含される。そのような一方法は、本明細書中に記載される本発明の任意の核酸（これは、コードされるポリペプチドを生成するために有効な調節配列に作動可能に連結されている）を、細胞集団中に導入する工程；その細胞を培養培地中で培養してそのポリペプチドを発現させる工程；そしてそのポリペプチドを上記細胞または培養培地から単離する工程；を包含する。上記細胞により取り込み（トランスフェクション）および／または上記ポリペプチドの発現を容易にするのに十分な量の核酸が、利用される。その核酸は、本明細書中に記載される任意の送達方法（例えば、注入、遺伝子十、受動取り込みなどが挙げられる）によって、そのような細胞中に導入される。上記核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター（ＤＮＡプラスミドベクターまたは本明細書中に記載される任意のベクター）が挙げられる）の一部であり得る。上記核酸または本発明の核酸を含むベクターは、本明細書上記の通りに調製および処方され得る。そのような核酸または発現ベクターは、インビボで哺乳動物細胞集団中に導入され得るか、またはその哺乳動物の選択された細胞（例えば、腫瘍細胞）が、その哺乳動物から取り出され得、上記核酸発現ベクターが、コードされるポリペプチドの取り込みおよび発現が生じるために十分な量でそのような細胞集団中にエキソビボで導入され得る。あるいは、核酸または本発明の核酸を含むベクターが、インビトロで培養細胞を使用して生成される。一局面において、本発明のポリペプチドを生成する方法は、細胞集団中に、本明細書中に記載される本発明の任意の核酸を含む組換え発現ベクターを、そのベクターの取り込みおよびコードされるポリペプチドの発現が生じるような量および処方で導入する工程；本明細書中に記載される任意の導入形式／送達形式によって、哺乳動物中に上記発現ベクターを投与する工程；およびその哺乳動物からかまたはその哺乳動物の副産物から、上記ポリペプチドを単離する工程；を包含する。
（抗体）
本発明の別の局面において、本発明のポリペプチド（またはその抗原性フラグメント）は、例えば、ポリペプチドおよびそのフラグメントの活性、分布、ならびに発現に関連する、例えば、診断的用途、治療的用途、または予防的用途を有する抗体を生成するために使用される。本発明のポリペプチドに対する抗体は、当該分野で周知の方法によって生成され得る。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定はされない。抗体（例えば、レセプター結合をブロックする抗体）が、治療的用途および／または予防的用途のために特に好ましい。
抗体誘導のためのポリペプチドは、生物学的活性を必要としない；しかし、そのポリペプチドまたはペプチドは、抗原性であるべきである。特定の抗体を誘導するために使用されるペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸（好ましくは、少なくとも約１５アミノ酸または約２０アミノ酸、または少なくとも約２５アミノ酸または約３０アミノ酸）からなるアミノ酸配列を有し得る。短いポリペプチドストレッチが、別のタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）と融合され得、そのキメラ分子に対して、抗体が生成され得る。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者にとって公知であり、多くの抗体が、利用可能である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｖｏｌｓ． Ｉ−ＩＶ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９１および２００１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏラットｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ，およびその中で引用された参考文献；ならびにＧｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７を参照のこと。抗体調製のための他の適切な技術としては、ファージベクターまたは同様のベクターにおける組換え抗体ライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６を参照のこと。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は、通常は、少なくとも約０．１μＭ（好ましくは、少なくとも約０．０１μＭ以上、最も代表的には好ましくは、０．００１μＭ以上）のＫＤで結合する。
キメラ（ヒト化）抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号において見出され得る。ヒト化および他の抗体生成技術および操作技術に関するさらなる詳細は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）（１９９５） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、ならびにＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ）において見出され得る。
一局面において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対する、完全ヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、その抗体がヒト患者において治療剤および／または予防剤として使用される適用において、特に望ましい。ヒト抗体は、特徴的なヒト免疫グロブリン配列からなる。本発明のヒト抗体は、広範な種類の方法を使用して生成され得る（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，００１，０６５号、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ およびＰａｕｌ（前出）を、概説のために参照のこと）。一局面において、本発明のヒト抗体は、トリオーマ細胞においてまず生成される。その後、その抗体をコードする遺伝子が、クローン化され、他の細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞）において発現される。トリオーマ技術によりヒト抗体を生成するための一般的アプローチは、Ｏｓｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１〜３６７，Ｏｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号、ならびにＥｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６３４，６６６号によって記載されている。この方法によって取得される抗体産生細胞株は、トリオーマと呼ばれる。なぜなら、これらは、３つの細胞（２つのヒト細胞および１つのマウス細胞）に由来するからである。トリオーマは、ヒト細胞から生成される通常のハイブリドーマよりも安定に抗体を生成することが見出されている。
本発明のポリペプチドについて企図される他の用途が、本明細書全体にわたって提供される。
（インターフェロンα結合体）
別の局面において、本発明は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むインターフェロンα活性を示すポリペプチドと、上記ポリペプチドに結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分（例えば、上記ポリペプチドに結合した、１個〜６個、１個〜５個、１個〜４個、１個〜３個（例えば、１個または２個）の非ポリペプチド部分）とを含む、結合体に関する。上記結合体はまた、インターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示すことが、理解される。
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を示すポリペプチドを含む結合体に関し、このポリペプチドは、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３の１つ）のアミノ酸配列と、非ポリペプチド部分に対する結合基を含む導入されたアミノ酸残基または除去されたアミノ酸残基から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む。本発明にしたがって導入されるべきアミノ酸残基および／または除去されるべきアミノ酸残基の例は、以下の節でさらに詳細に記載される。上記結合体それ自体もインターフェロンα活性を示すことが理解される。
別の局面において、上記結合体は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３のうちの１つ）と、０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が），（例えば、０〜１４個のアミノ酸位置が、０〜１２個のアミノ酸位置が、０〜１０個のアミノ酸位置が、０〜８個のアミノ酸位置が、０〜６個のアミノ酸位置が、０〜５個のアミノ酸位置が、０〜４個のアミノ酸位置が、０〜３個のアミノ酸位置が、０〜２個のアミノ酸位置が、または０〜１個のアミノ酸位置が）異なるアミノ酸配列を含む。本発明の一局面において、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基が（例えば、アミノ酸残基の非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基での置換、または非ポリペプチド部分に対する結合基を含むさらなるアミノ酸残基の挿入によって）導入される。
用語「結合体」（または互換可能に「ポリペプチド結合体」または「結合体化ポリペプチド」）とは、本発明の１つ以上のポリペプチドと、１つ以上の非ポリペプチド部分との共有結合によって形成された、（複合体という意味で）不均質な分子を示すことが意図される。用語「共有結合」とは、上記ポリペプチドおよび上記非ポリペプチド部分が、互いに直接的に共有結合しているか、または介在部分（例えば、架橋、スペーサー、または結合部分）を介して間接的に共有結合していることを、意味する。好ましくは、結合体化ポリペプチドは、適切な濃度および条件にて可溶性である（すなわち、生理的液体（例えば、血液）において可溶性である）。本発明の結合体化ポリペプチドの例としては、グリコシル化ポリペプチドおよび／またはペグ化ポリペプチドが挙げられる。用語「非結合体化ポリペプチド」上記結合体化ポリペプチドのポリペプチド部分を指すために使用され得る。
用語「非ポリペプチド部分」とは、上記ポリペプチドの結合基に結合可能な分子を意味することが意図される。非ポリペプチド部分の好ましい例としては、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物、または有機誘導体化剤（特に、ポリマー分子または糖部分）が挙げられる。上記非ポリペプチド部分は、上記ポリペプチドの結合基を介して上記ポリペプチドに結合されることが、理解される。上記ポリペプチドに結合している非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子）の数が明示されている場合を除き、上記ポリペプチドに結合しているかまたは本発明において他のように使用される「非ポリペプチド部分」に関するあらゆる言及は、上記ポリペプチドに結合している１つ以上の非ポリペプチド部分に対する言及である。
用語「ポリマー分子」は、２つ以上のモノマーの共有結合によって形成される分子であって、そのモノマーはどれもアミノ酸残基ではない、分子として定義される。用語「ポリマー」は、用語「ポリマー分子」と互換可能に使用され得る。
用語「糖部分」は、インビボまたはインビトロでのグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化）によって結合している糖質分子を示すことが意図される。
「Ｎ−グリコシル化部位」は、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、Ｘは、任意のアミノ酸残基（プロリン以外である）であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、スレオニンまたはシステインのうちのいずれかであり、好ましくは、セリンまたはスレオニンであり、最も好ましくは、スレオニンである。
「Ｏ−グリコシル化部位」は、セリン残基またはスレオニン残基のＯＨ基を含む。
用語「結合基」は、適切な非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子または糖部分）にカップリング可能なアミノ酸残基を示すことが意図される。有用な結合基およびいくつかの対応する非ポリペプチド部分の非限定的例が、下記表４に提供される。
Figure 2008505985
 。
インビボＮ−グリコシル化について、用語「結合基」は、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、Ｘは、任意のアミノ酸残基（プロリン以外である）であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、スレオニンまたはシステインのいずれかであり、好ましくは、セリンまたはスレオニンであり、最も好ましくは、スレオニンである）を構成するアミノ酸残基を示すために、通常ではない様式で使用される。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン残基は、糖部分がグリコシル化の間に結合しているものであるが、そのような結合は、そのＮ−グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しない限り、達成され得ない。従って、上記非ポリペプチド部分が、糖部分であり、上記結合体化が、Ｎ−グリコシル化によって達成される場合、用語「非ポリペプチド部分のための結合基を構成するアミノ酸残基」とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の変化に関連して使用される場合には、機能的なＮ−グリコシル化部位がそのアミノ酸配列中に導入されるか、その配列から除去されるか、または機能的なＮ−グリコシル化部位が、そのアミノ酸配列中に保持される（例えば、セリン残基（これは、Ｎ−グリコシル化部位の一部を既に構成する）をスレオニン残基で置換すること、またはその逆による）ような様式で変化される、Ｎ−グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基のうちの１つ、２つ、またはすべてとして、理解されるべきである。
用語「導入する」（すなわち、「導入される」アミノ酸残基、アミノ酸残基の「導入」）とは、存在するアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置換することを意味することが主に意図されるが、さらなるアミノ酸残基の挿入もまた、意味し得る。
用語「除去する」（すなわち、「除去される」アミノ酸残基、アミノ酸残基の除去）とは、除去されるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを意味することが主に意図されるが、除去されるアミノ酸残基の（置換を伴わない）欠失も意味し得る。
用語「非ポリペプチド部分のための結合基を構成するアミノ酸残基」とは、そのアミノ酸残基は、非ポリペプチド部分が（導入されるアミノ酸残基の場合には）結合するアミノ酸残基であるか、または（除去されるアミノ酸残基の場合には）結合しているアミノ酸残基を示すことが、意図される。
用語「機能的インビボ半減期」は、その通常の意味で使用される。すなわち、上記ポリペプチドの生物学的活性のうちの５０％が、身体／標的器官中に依然として存在する時間、または上記ポリペプチドの活性が初期値の５０％である時間である。機能的インビボ半減期は、実験動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはサル）において決定され得る。好ましくは、機能的インビボ半減期は、非ヒト霊長類（例えば、サル）において決定される。さらに、機能的インビボ半減期は、静脈内投与または皮下投与されたサンプルについて決定され得る。
機能的インビボ半減期を決定することの代替法として、「血清半減期」が、決定され得る。すなわち、上記ポリペプチドのうちの５０％が、クリアランスされる前に結晶または血流中を循環する時間である。血清半減期の決定は、しばしば、機能的インビボ半減期を決定するよりも簡単であり、血清半減期の大きさは、通常は、機能的インビボ半減期の大きさの良い指標である。あるいは、血清半減期に対する用語としては、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が挙げられる。血清半減期は、機能的インビボ半減期の決定に関して上記されたように決定され得る。
用語「血清」は、その通常の意味で、すなわち、フィブリノーゲンおよび他の凝固因子を含まない血漿として、使用される。
用語「増加した」とは、機能的インビボ半減期または血清半減期について使用される場合には、本発明の結合体の関連する半減期が、参照分子（例えば、野生型インターフェロンα（例えば、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３１〜配列番号４２（または本明細書中ならびに／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載されるような、他のｈｕＩＦＮ−α配列）のうちの１つ））、または対応する非結合体化ポリペプチド）の半減期と比較して統計的に有意に増加されることを示すために、使用される。従って、本発明の興味深い結合体は、上記の参照分子と比較して増加した機能的インビボ半減期または増加した血清半減期を有する結合体を包含する。
用語「ＡＵＣｓｃ」または「「皮下投与された場合の曲線下面積」とは、その通常の意味で、すなわち、時間−血清中のインターフェロンα活性曲線（結合体化分子が、実験動物に皮下投与されている）の下の面積として、使用される。一旦、実験的なインターフェロンα活性の時点が決定された後に、ＡＵＣｓｃは、コンピュータプログラム（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０１）によって簡便に計算され得る。
用語「増加した」とは、ＡＵＣｓｃについて使用される場合、皮下投与された場合の本発明の結合体についての曲線下面積が、参照分子（例えば、野生型インターフェロンα（例えば、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３１〜配列番号４２（または本明細書中ならびに／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載されるような、他のｈｕＩＦＮ−α配列）のうちの１つ））、または対応する非結合体化ポリペプチド）のＡＵＣｓｃと比較して、同等の条件下で決定された場合に、統計的に有意に増加されることを示すために、使用される。明らかに、同じ量のインターフェロンα活性が、本発明の結合体および参照分子に関して投与されるべきである。結果的に、種々のインターフェロンα分子の間での直接比較を行うために、ＡＵＣｓｃ値は、代表的には、正規化される（すなわち、ＡＵＣｓｃ／投与用量として表わされる）べきである。
用語「Ｔｍａｘ，ｓｃ」は、時間−血清中のインターフェロンα活性において、血清中の最高インターフェロンα活性が観察される時点に関して使用される。
親ポリペプチドに対する改変の例が、配列番号１の配列に関して本明細書において一般的に提供されるが、開示される改変はまた、上記される本発明の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および４４〜１０４ならびにそれらの改変体）のいずれかの同等のアミノ酸位置においてもなされ得ることが、理解される。
非ポリペプチド部分のための結合基を構成するアミノ酸残基を除去および／または導入することによって、上記ポリペプチドを特に適合させて、その分子が、選択された非ポリペプチド部分に対する結合体化に対してより感受性になるようにすること、結合体化パターンを最適化すること（例えば、インターフェロンα 分子の表面上における非ポリペプチド部分の最適な分布を確保し、それによって、例えば、そのポリペプチドのエピトープおよび他の表面部分を、その機能を有意には損なうことなく有効に隠すこと）が、可能である。例えば、結合基の導入によって、インターフェロンαポリペプチドは、関連する非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基の含有量が変化し、それによって、より効率的、特異的、かつ／または広範な結合体化が、達成される。１つ以上の結合基の除去によって、そのポリペプチドの部分にある非ポリペプチド部分に対する結合体化（そのような結合体化は、例えば、そのポリペプチドの機能的部位もしくはその付近に位置するアミノ酸残基にとって、不利である（なぜなら、そのような部位における結合体化は、レセプター認識の減損に起因して、生じる結合体の不活化またはインターフェロンα活性低下を生じ得るからである））を回避することが、可能である。さらに、別の結合基の近くに位置する結合基を除去することが、有利であり得る。
非ポリペプチド部分のための結合基を構成するアミノ酸残基は、それが除去されようと導入されようと、その非ポリペプチド部分の性質、そしていくつかの場合においては、使用される結合体化方法に基づいて選択されることが、理解される。例えば、その非ポリペプチド部分がポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシド由来分子）である場合、結合基として機能可能なアミノ酸残基は、システイン、リジン（および／または上記ポリペプチドのＮ末端アミノ基）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群より選択される。その非ポリペプチド部分が、糖部分である場合、その結合基は、インビボまたはインビトロでのＮ−グリコシル化部位またはＯ−グリコシル化部位（好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位）である。
いくつかの場合において、非ポリペプチド部分のための結合基が、上記インターフェロンαポリペプチドに導入されるかまたはそれから除去される場合、改変されるインターフェロンαポリペプチドの位置は、以下のようにして簡便に選択され得る：
改変される位置は、そのインターフェロンαポリペプチドの表面に位置し得る（例えば、その側鎖の２５％よりも多くが溶媒に露出している（例えば、その側鎖の５０％よりも多くが溶媒に露出している）アミノ酸残基によって占められた位置）。そのような位置は、位置は、本明細書虫の「方法および材料」の節に記載されるように、ヒトインターフェロンα２ａの３次元構造分析に基づいて同定された。
あるいはまたはさらに、改変されるべき位置は、（例えば、図２および図４に示されるアラインメントで示されるような）インターフェロンαタンパク質配列ファミリーの分析に基づいて同定され得る。以下の実施例の目的のために、図２のアラインメントの最上列に示されるように配列番号１は、改変されるべき親インターフェロンαと考えられ得、そしてそのアラインメントの残りのヒトインターフェロンα配列は、そのファミリーの他のメンバーであると考えられる。例えば、親配列で改変されるべき位置は、親インターフェロンα以外の１つ以上のファミリーメンバーが、（ａ）（そのようなアミノ酸残基が親配列に導入されるべきである場合）関連する結合基を含むアミノ酸残基で占められるか、または（ｂ）（そのようなアミノ酸残基が親配列から除去されるべきである場合）親インターフェロンαでは関連する結合基を含むアミノ酸残基で占められるが、１つ以上のファミリーメンバーでは関連する結合基を含むアミノ酸残基で占められない位置、であり得る。
結合基の最適な分布を決定するために、上記インターフェロンα分子の表面上に位置するアミノ酸残基間の距離が、インターフェロンαポリペプチドの３次元構造に基づいて算出された。より具体的には、そのような結合基を構成するアミノ酸残基のＣＢの間の距離、または結合基を構成する１つのアミノ酸残基の官能基（リジンについてはＮＺ、アスパラギン酸についてはＣＧ、グルタミン酸についてはＣＤ、システインについてはＳＧ）と、結合基を構成する別のアミノ酸残基のＣＢとの間の距離が、決定された。グリシンの場合、ＣＢの代わりに、ＣＡが使用された。本発明の結合体のインターフェロンαポリペプチド部分において、上記距離のいずれもが、８Åよりも大きく（例えば、１０Åよりも大きく）、不均質な結合体化を回避もしくは低減し、そして結合基の均一な分布を（例えば、エピトープ遮蔽のため）提供する。
さらに、本発明の結合体のインターフェロンαポリペプチド部分において、いくつかの場合には、インターファ論αのレセプター結合部位もしくはその付近にある結合基が、例えば、そのような基を含むアミノ酸残基の置換によって、除去される。いくつかの場合において、非ポリペプチド部分を構成する結合基（例えば、システインまたはリジン）は、しばしば、そのインターフェロンα分子のレセプター結合部位もしくはその付近には導入されない。
インターフェロンαポリペプチドを改変するための別のアプローチは、親インターフェロンα中に存在するエピトープを、非ポリペプチド部分との結合体化によって、遮蔽し、それによって改変もしくは破壊またはそうでなければ不活化することである。インターフェロンαポリペプチドのエピトープは、当該分野で公知の方法（エピトープマッピングとしても公知である）の使用によって、同定され得る。例えば、Ｒｏｍａｇｎｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９，３８０（５）：５５３〜９，ＤｅＬｉｓｓｅｒ ＨＭ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９，９６：１１〜２０，Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１９９７，８５（３）：２２９〜３５，Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ ＪＭ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９９７，１１９（１）：７７〜８１，およびＬａｎｅ ＤＰおよびＳｔｅｐｈｅｎ ＣＷ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，５（２）：２６８〜７１を参照のこと。一つの方法は、（例えば、９アミノ酸残基の）ランダムなオリゴペプチドを発現する、ファージディスプレイライブラリーを確立することである。ヒトインターフェロンαに対する特異的血清に由来するＩｇＧ１抗体が、免疫沈降によって精製され、その反応性ファージが、イムノブロッティングによって同定される。精製した反応性ファージのＤＮＡを配列決定することによって、上記オリゴヌクレオチドの配列が決定され得、その後、上記インターフェロンαの３次元構造における配列の位置決定がされ得る。あるいは、エピトープは、米国特許第５，０４１，３７６号に従って同定され得る。上記構造においてそのように同定された領域は、後に、非ポリペプチド部分のための結合基の導入のための標的領域として選択され得るエピトープを構成する。好ましくは、インターフェロンαの少なくとも１つのエピトープ（例えば、２つ、３つ、または４つのエピトープ）が、本発明に従って非ポリペプチド部分によって遮蔽される。従って、一局面において、本発明の結合体は、野生型ヒトインターフェロンα（市販の任意のインターフェロンαを含む）と比較して、少なくとも１つの遮蔽されたエピトープを有する。これは、非ポリペプチド部分のための結合基を、所定のエピトープの近傍（すなわち、一次配列において４アミノ酸残基以内、または三次配列において約１０Å以内）に位置する位置へと導入することによって、なされる。そのような具体的な導入は、以下の節において記載される。
結合基の除去の場合において、そのような基を含みかつ上記で定義される位置を占める適切なアミノ酸残基が、当該非ポリペプチド部分のための結合基を含まない別のアミノ酸残基で置換され得るか、または除去され得る。Ｎ−グリコシル化基の除去はまた、モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ内のアミノ酸残基の挿入もしくは除去によって、達成され得る。
結合基の導入の場合、そのような基を含むアミノ酸残基が、上記の位置に、（例えば、そのような位置を占めるアミノ酸残基の置換によって）導入される。
結合体化のために利用可能でありかつ上記インターフェロンαポリペプチド中に存在する、結合基の正確な数は、結合体化によって達成されることが望まれる効果に依存する。得られる効果は、例えば、結合体化の性質および程度（例えば、非ポリペプチド部分の正体、上記ポリペプチドに結合することが望まれるかまたは可能である非ポリペプチド部分の数、それらが結合されるべきかまたは結合体化が回避されるべきかなど）に依存する。例えば、免疫原性の低下が望まれる場合、結合基の数（および位置）は、ほとんどまたはすべてのエピトープを遮蔽するために十分であるべきである。これは、通常は、より大きな比率の上記インターフェロンαポリペプチドが遮蔽される場合に、得られる。エピトープの有効な遮蔽は、通常は、結合体化のために利用可能な結合基の総数が、１個〜６個の結合基の範囲（例えば、１個〜５個（例えば、１個〜３個（例えば、１個、２個または３個の結合基））の範囲）になる場合に、達成される。
機能的インビボ半減期は、すなわち、上記結合体の分子量に依存性であり、従って、増加した半減期を提供するために必要な結合基の数は、当該非ポリペプチド部分の分子量に依存する。いくつかのそのような結合体は、１個〜６個、例えば、１個〜５個（例えば、１個〜３個（例えば、１個、２個、または３個）の非ポリペプチド部分を含み、その非ポリペプチド部分は、各々、約２〜４０ｋＤａ（例えば、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。
本発明の結合体において、いくつか、ほとんど、または実質的にすべての結合可能な結合基は、関連する非ポリペプチド部分によって占められている。
本発明の結合体は、以下の改善された特性のうちの１つ以上を示し得る：
例えば、上記結合体は、ヒトインターフェロンα（例えば、本明細書において配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして定義されるポリペプチド、または本明細書中および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載される他の任意のｈｕＩＦＮのうちのいずれか）と比較して、または対応する非結合体化ポリペプチドと比較して、低下した免疫原性（例えば、非結合体化ポリペプチドまたはヒトインターフェロンαと比較して、少なくとも１０％の低下、例えば、少なくとも２５％の低下、例えば、少なくとも５０％の低下、例えば、少なくとも７５％の低下）を示す。
別の局面において、上記結合体は、ヒトインターフェロンα（例えば、本明細書において配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして定義されるポリペプチド、または本明細書中および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載される他の任意のｈｕＩＦＮのうちのいずれか）または対応する非結合体化ポリペプチドで処置した患者に由来する中和抗体と、低下した反応を示し得るかまたは反応しないものであり得る（例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも７５％の中和低下）。
本発明の別の局面において、上記結合体は、参照分子（例えば、ヒトインターフェロンα（例えば、本明細書において配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして定義されるポリペプチド、または本明細書中および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載される他の任意のｈｕＩＦＮのうちのいずれか））と比較して、または対応する非結合体化ポリペプチドと比較して、増加した機能的インビボ半減期および／または増加した血清半減期を示し得る。特に好ましい結合体は、その結合体の機能的インビボ半減期（または血清半減期）と、参照分子の機能的インビボ半減期（または血清半減期）との間の比が、少なくとも１．２５（例えば、少なくとも１．５０、例えば、少なくとも１．７５、例えば、少なくとも２、例えば、少なくとも３、例えば、少なくとも４、例えば、少なくとも５、例えば、少なくとも６、例えば、少なくとも７、例えば、少なくとも８）である、そのような結合体である。上記のように、その半減期は、実験動物（例えば、ラットまたはサル）において簡便に決定され、そして静脈内投与または皮下投与に基づき得る。
さらなる局面において、上記結合体は、参照分子（例えば、ヒトインターフェロンα（例えば、本明細書において配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして定義されるポリペプチド、または本明細書中および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載される他の任意のｈｕＩＦＮのうちのいずれか））と比較して、または対応する非結合体化ポリペプチドと比較して、増加したバイオアベイラビリティを示し得る。例えば、上記結合体は、参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαまたは対応する非結合体化ポリペプチド）と比較して、増加したＡＵＶＳＣを示し得る。従って、例示的な結合体は、皮下投与した場合（特に、実験動物（例えば、ラットまたはサル）中に皮下投与した場合）に、その結合体のＡＵＶＳＣと、その参照分子のＡＵＶＳＣとの間の比が、少なくとも１．２５、例えば、少なくとも１．５、例えば、少なくとも２、例えば、少なくとも３、例えば、少なくとも４、例えば、少なくとも５、または少なくとも６、例えば、少なくとも７、例えば、少なくとも８、例えば、少なくとも９、または少なくとも１０、例えば、少なくとも１２、例えば、少なくとも１４、例えば、少なくとも１６、少なくとも１８、または少なくとも２０である、そのような結合体である。同様に、本発明のいくつかの結合体は、その結合体についてのＴｍａｘと、参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαまたは対応する非結合体化ポリペプチド）のＴｍａｘとの間の比が、皮下投与した場合（特に、実験動物（例えば、ラットまたはサル）中に皮下投与した場合）に、少なくとも１．２、例えば、少なくとも１．４、例えば、少なくとも１．６、例えば、少なくとも１．８、例えば、少なくとも２、例えば、少なくとも２．５、例えば、少なくとも３、例えば、少なくとも４、例えば、少なくとも５、例えば、少なくとも６、例えば、少なくとも７、例えば、少なくとも８、例えば、少なくとも９、例えば、少なくとも１０である、そのような結合体である。
いくつかの場合において、本発明の結合体の抗ウイルス活性の大きさは、ヒトインターフェロンα（例えば、本明細書において配列番号３１〜４２、配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして定義されるポリペプチド、または本明細書中および／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）（前出）に記載される他の任意のｈｕＩＦＮのうちのいずれか）のものまたは対応する非結合体化ポリペプチドのモノに対して、低下（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約５０％、少なくとも約２５％、少なくとも約１０％）し得るか、または増加（例えば、少なくとも約１０％）し得るか、または等しい（例えば、約＋／−１０％以内または約＋／−５％以内）であり得る。いくつかの場合において、本発明の結合体の抗ウイルス活性の大きさは、変化し得、従って、ヒトインターフェロンαのものまたは対応する非結合体化ポリペプチドのものよりも高いものか、低いものか、もしくはほぼ同じものであり得る。
（非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合する本発明の結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を示し、インターフェロンαの少なくとも１つのシステイン残基に結合された少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、そのアミノ酸配列は、親インターフェロンαポリペプチド（例えば、配列番号１〜１５および４４〜１０４のうちのいずれか（例えば配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つ）のアミノ酸配列を含むインターフェロンαポリペプチド）の配列と、０〜１６個のアミノ酸位置が、少なくとも１つのシステイン残基が（例えば、置換または挿入によって）親インターフェロンαではその分子の表面に曝されているアミノ酸残基によって占められる位置（好ましくは、表面に曝されるその側鎖のうちの少なくとも２５％（例えば、５０％）を有する位置）に導入されているという点で異なる。代表的に、上記結合体は、例えば、配列番号１〜１５、４７または５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、１〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、１〜１４個のアミノ酸位置が、１〜１２個のアミノ酸位置が、１〜１０個のアミノ酸位置が、１〜８個のアミノ酸位置が、１〜６個のアミノ酸位置が、１〜５個のアミノ酸位置が、１〜４個のアミノ酸位置が、１〜３個のアミノ酸位置が、または１〜２個のアミノ酸位置が））異なるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの結合体は、配列番号１に対して、２５％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測される位置にシステイン残基を導入する以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｇ１０Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｑ２０Ｃ、Ｒ２２Ｃ、Ｒ２３Ｃ、Ｉ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｌ２６Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ３０Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｒ３３Ｃ、Ｈ３４Ｃ、Ｄ３５Ｃ、Ｒ３７Ｃ、Ｑ４０Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｅ４２Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｖ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｅ５９Ｃ、Ｑ６２Ｃ、Ｑ６３Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｓ６９Ｃ、Ｔ７０Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｄ７８Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｔ８０Ｃ、Ｌ８１Ｃ、Ｅ８３Ｃ、Ｋ８４Ｃ、Ｉ８７Ｃ、Ｆ９０Ｃ、Ｑ９１Ｃ、Ｎ９４Ｃ、Ｄ９５Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｖ１００Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｖ１０４Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｍ１１２Ｃ、Ｎ１１３Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｑ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｔ１２８Ｃ、Ｌ１２９Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｋ１３４Ｃ、Ｋ１３５Ｃ、Ｙ１３６Ｃ、Ｓ１３７Ｃ、Ｐ１３８Ｃ、Ａ１４６Ｃ、Ｍ１４９Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｃ、Ｎ１５７Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（上記アミノ酸残基位置は配列番号１の位置に対してである）。いくつかの例では、上記の位置の中で、４７位、５１位および１３３位のアミノ酸残基のうちの１つ以上は、システインで置換されない。
例えば、いくつかのそのような本発明の結合体は、配列番号１に対して、５０％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測される位置にシステイン残基を導入する以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む：Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｒ３３Ｃ、Ｈ３４Ｃ、Ｄ３５Ｃ、Ｒ３７Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｄ７８Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｔ８０Ｃ、Ｅ８３Ｃ、Ｋ８４Ｃ、Ｉ８７Ｃ、Ｆ９０Ｃ、Ｑ９１Ｃ、Ｎ９４Ｃ、Ｄ９５Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｑ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｌ１２９Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｋ１３５Ｃ、Ｐ１３８Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（上記アミノ酸残基位置は配列番号１の位置に対してである）。いくつかの例では、４７位および１３３位のアミノ酸残基のうちの一方または両方は、システインで置換されない。
上記のように、いくつかの例では、インターフェロンαの潜在的なレセプター結合部位の外側に（すなわち、およそ２９位〜４０位、７９位〜９６位および１２４位〜１４１位（位置は配列番号１に対して番号付けされる）の外側に）システイン残基が導入されることが好ましくあり得る。したがって、いくつかの例では、１つ以上のシステイン残基は、配列番号１に対して、Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｇ１０Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｑ２０Ｃ、Ｒ２２Ｃ、Ｒ２３Ｃ、Ｉ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｌ２６Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｅ４２Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｖ５１Ｃ、Ｑ５２Ｃ、Ｅ５９Ｃ、Ｑ６２Ｃ、Ｑ６３Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｓ６９Ｃ、Ｔ７０Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｎ７２Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｖ１００Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｖ１０４Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｍ１１２Ｃ、Ｎ１１３Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ａ１４６Ｃ、Ｍ１４９Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｃ、Ｎ１５７Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（２５％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測され、推定レセプター結合部位の一部ではない位置）からなる群より選択される。いくつかの例では、４７位および５１位のうちの一方または両方は、システインで置換されない。
他の局面において、システイン置換は、配列番号１に対して、Ｄ２Ｃ、Ｌ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｑ５Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｈ７Ｃ、Ｓ８Ｃ、Ｌ９Ｃ、Ｒ１２Ｃ、Ｒ１３Ｃ、Ｍ１６Ｃ、Ａ１９Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｅ４１Ｃ、Ｄ４４Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｈ４７Ｃ、Ｑ４９Ｃ、Ｋ５０Ｃ、Ｎ６６Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｍ１０１Ｃ、Ｑ１０２Ｃ、Ｅ１０３Ｃ、Ｇ１０５Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１０９Ｃ、Ｐ１１０Ｃ、Ｌ１１１Ｃ、Ｖ１１４Ｃ、Ｄ１１５Ｃ、Ｌ１１８Ｃ、Ｒ１２１Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１５０Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣおよびＥ１６６Ｃ（５０％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測され、推定レセプター結合部位の一部ではない位置）からなる群より選択される。いくつかの例では、４７位はシステインで置換されない。
いくつかのそのような本発明の結合体は、配列番号１に対して、置換Ｓ２５Ｃ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ３０Ｃ、Ｋ３１Ｃ、Ｎ４６Ｃ、Ｋ７１Ｃ、Ｓ７４Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｅ７９Ｃ、Ｅ１０７Ｃ、Ｅ１０８Ｃ、Ｔ１３２Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｐ１３８ＣおよびＫ１３５Ｃのうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む。
別の局面において、１つ以上のシステイン残基が、Ｃ末端にまたはＣ末端付近に、置換（例えば、配列番号１に対して、Ｑ１５９Ｃ、Ｋ１６０Ｃ、Ｒ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｒ１６３Ｃ、Ｒ１６４Ｃ、Ｋ１６５ＣまたはＥ１６６Ｃ）、あるいは挿入（例えば、Ｅ１６６ＥＣ（本明細書では１６７Ｃとも称される））のいずれかによって導入される。システイン残基はまた、本明細書に記載されるインターフェロンα分子のＣ末端が切断されたフラグメントにおいて、置換または挿入によって導入され得ることが理解される。
いくつかの場合において、１つだけのシステイン残基が、導入される２つ以上のシステイン残基の間のジスルフィド架橋の形成を回避するために、導入される。
インターフェロンαにおいて、ジスルフィド結合が、１／９９位および２９／１３９位におけるしステインの間で形成される。そのジスルフィド結合２９／１３９は、生物学的活性のために必須であるが、１／９９結合は、生物学的活性に有意には影響を与えることなく還元され得る（Ｂｅｉｌｈａｒｚ Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．６（６）：６７７〜６８５）。従って、本発明の別の局面において、Ｃ１またはＣ９９のうちの一方が、好ましくは、置換（例えば、Ｃ１ＳまたはＣ９９Ｓ）によって除去され、それによって、非ポリペプチド部分に対する結合体化のために利用可能なもう一方のシステイン残基が残る。
本発明のこの局面において企図される非ポリペプチド部分としては、ポリマー分子（例えば、「ポリマー分子に対する結合体化」と題する節において記載される分子（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）のうちのいずれか）が挙げられる。そのシステイン含有ポリペプチドと上記ポリマー分子との間での結合体化は、任意の適切な様式（例えば、「ポリマー分子に対する結合体化」の節において記載されるような様式）で、例えば、一工程方法を使用してかまたはその節において言及される段階的様式で、達成され得る。上記インターフェロンαポリペプチドをペグ化するための例示的方法は、例えば、システイン反応性ＰＥＧを使用して、ＰＥＧをシステイン残基に共有結合することである。種々の基（例えば、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、マレイミド（ＭＡＬ）、およびビニルスルホン（ＶＳ））を有する多数の非常に特異的なシステイン反応性ＰＥＧと、種々のサイズの直鎖状もしくは分枝状のＰＥＧ（例えば、２〜４０ｋＤａ、例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａ）とが、市販されている（例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ，またはＳｕｎＢｉｏ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａから）。
親ポリペプチドに対する改変の例が概して配列番号１に対して（またはいくつかの他の特定の配列に対して）本明細書で提供されるが、開示された改変はまた本明細書に記載される本発明の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにそれらの改変体が挙げられる）のいずれかの同等のアミノ酸位置においてもなされ得ることが理解される。したがって、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｃは、配列番号５のＱ４７Ｃに対応する、などが理解される。
（非ポリペプチド部分がリジン残基に結合する本発明の結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を示し、そして配列番号１〜１５および４４〜１０４から選択される配列を含むインターフェロンαポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基および／またはＮ末端アミノ基に結合された少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含むか、あるいは配列番号１〜１５および４４〜１０４のうちのいずれか（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）と０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、０〜１４個のアミノ酸位置が、０〜１２個のアミノ酸位置が、０〜１０個のアミノ酸位置が、０〜８個のアミノ酸位置が、０〜６個のアミノ酸位置が、０〜５個のアミノ酸位置が、０〜４個のアミノ酸位置が、０〜３個のアミノ酸位置が、０〜２個のアミノ酸位置が、または０〜１個のアミノ酸位置が））異なる配列を含む、結合体に関する。この局面にしたがういくつかの結合体は、少なくとも１つの除かれたリジン残基および／または少なくとも１つの除かれたヒスチジン残基、ならびに／あるいは少なくとも１つの導入されたリジン残基を含む。いくつかのそのような結合体は、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０およびＫ１６５（位置は配列番号１に対して番号付けされる）から選択されるリジン残基（例えば、Ｋ３１、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０およびＫ１６５から選択されるリジン残基）に結合された非ポリペプチド部分を含む。いくつかのそのような結合体は、Ｋ３１、Ｋ１２２、Ｋ１３３およびＫ１３５から選択されるリジン残基に結合された非ポリペプチド部分を含む。いくつかのそのようなポリペプチドは、Ｋ３１、Ｋ１２２およびＫ１３５から選択されるリジン残基に結合された非ポリペプチド部分を含む。いくつかのそのような結合体は、Ｋ１２２およびＫ１３５；Ｋ３１およびＫ１２２；またはＫ３１およびＫ１３５から選択されるリジン残基に結合された非ポリペプチド部分を含む。
いくつかの本発明の結合体は、アミノ酸残基の異なるアミノ酸での置換、またはアミノ酸残基の欠失含むポリペプチド配列を含み、これは１つ以上のリジン（例えば、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０および／またはＫ１６５（配列番号１に対して））を本発明のいずれかのポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３のうちの１つ）から除く。除去されるべき１つ以上のリジン残基は、任意の他のアミノ酸で置換されてもＡｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。いくつかのそのような結合体は、置換Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ；Ｋ３１Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒ；またはＫ３１Ｒ＋Ｋ１２２Ｒ＋Ｋ１３３Ｒを含む。他の例示的な置換としては、Ｋ７１Ｅ；Ｋ８４Ｅ；Ｋ１３３Ｅ／Ｇ；およびＫ１６０Ｅが挙げられる。
アミン反応性結合化学が利用される例において、ヒスチジン残基に対する結合の可能性を回避するかまたは最小限にすることが有利であり得る。したがって、いくつかの本発明の結合体は、１つ以上のヒスチジンを本発明のいずれかのポリペプチド配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）から除く置換または欠失（例えば、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ３４および／またはＨ４７（配列番号１に対して））を含むポリペプチド配列を含む。除去されるべき１つ以上のヒスチジン残基は、任意の他のアミノ酸で置換されても、Ａｒｇ（Ｒ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置換されても、欠失されてもよい。いくつかのそのような結合体は、置換Ｈ３４Ｑ；Ｈ４７Ｑ；またはＨ３４Ｑ＋Ｈ４７Ｑを含む。
あるいは、またはさらに、いくつかの本発明の結合体は、親配列（例えば、配列番号１〜１５、４７または５３の１つ）においてその分子の表面に曝されるアミノ酸残基によって占められる位置（例えば、表面に曝されるその側鎖のうちの少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％）を有する位置）にリジンを導入する改変を含むポリペプチド配列を含む。いくつかのそのような結合体は、配列番号１に対して、２５％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測される位置にリジン残基を導入する以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｇ１０Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｒ２２Ｋ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２４Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｌ２６Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｌ３０Ｋ、Ｒ３３Ｋ、Ｈ３４Ｋ、Ｄ３５Ｋ、Ｒ３７Ｋ、Ｑ４０Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｅ４２Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｖ５１Ｋ、Ｑ５２Ｋ、Ｅ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｑ６３Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ｓ６９Ｋ、Ｔ７０Ｋ、Ｎ７２Ｋ、Ｓ７４Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｄ７８Ｋ、Ｅ７９Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｌ８１Ｋ、Ｅ８３Ｋ、Ｉ８７Ｋ、Ｆ９０Ｋ、Ｑ９１Ｋ、Ｎ９４Ｋ、Ｄ９５Ｋ、Ｅ９７Ｋ、Ａ９８Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｍ１１２Ｋ、Ｎ１１３Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｑ１２５Ｋ、Ｒ１２６Ｋ、Ｔ１２８Ｋ、Ｌ１２９Ｋ、Ｔ１３２Ｋ、Ｙ１３６Ｋ、Ｓ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１４６Ｋ、Ｍ１４９Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１５３Ｋ、Ｆ１５４Ｋ、Ｎ１５７Ｋ、Ｑ１５９Ｋ、Ｒ１６１Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ，（上記アミノ酸残基位置は配列番号１に対する位置がある）。いくつかの例では、上記位置の中で、４７位、５１位、５２位および１５４位のアミノ酸残基のうちの１つ以上は、リジンで置換されない。
いくつかのそのような本発明の結合体は、５０％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測される位置にリジン残基を導入する以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む：Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｒ３３Ｋ、Ｈ３４Ｋ、Ｄ３５Ｋ、Ｒ３７Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｄ７８Ｋ、Ｅ７９Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｅ８３Ｋ、Ｉ８７Ｋ、Ｆ９０Ｋ、Ｑ９１Ｋ、Ｎ９４Ｋ、Ｄ９５Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｑ１２５Ｋ、Ｒ１２６Ｋ、Ｌ１２９Ｋ、Ｔ１３２Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ，（上記アミノ酸残基位置は配列番号１に対する位置がある）。いくつかの例では、上記位置の中で、４７位はリジンで置換されない。
上に示されるように、いくつかの例では、インターフェロンαの潜在的なレセプター結合部位の外側に（すなわち、およそ２９位〜４０位、７９位〜９６位および１２４位〜１４１位の外側に（位置は配列番号１に対して番号付けされる））リジン残基を導入することが好ましくあり得る。したがって、いくつかの例では、１つ以上のリジン置換は、配列番号１に対して、Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｇ１０Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｒ２２Ｋ、Ｒ２３Ｋ、Ｉ２４Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｌ２６Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｅ４２Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｖ５１Ｋ、Ｑ５２Ｋ、Ｅ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｑ６３Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ｓ６９Ｋ、Ｔ７０Ｋ、Ｎ７２Ｋ、Ｓ７４Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｅ９７Ｋ、Ａ９８Ｋ、Ｖ１００Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｖ１０４Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｍ１１２Ｋ、Ｎ１１３Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ａ１４６Ｋ、Ｍ１４９Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｓ１５３Ｋ、Ｆ１５４Ｋ、Ｎ１５７Ｋ、Ｑ１５９Ｋ、Ｒ１６１Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（２５％を超える表面に曝される側鎖を有し、推定レセプター結合部位の一部に結合しない残基）からなる群より選択される。いくつかの例では、４７位、５１位および１５４位のうちの１つ以上は、リジンで置換されない。
いくつかの例では、１つ以上のリジン置換は、配列番号１に対して、Ｄ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｐ４Ｋ、Ｑ５Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｈ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｒ１２Ｋ、Ｒ１３Ｋ、Ｍ１６Ｋ、Ａ１９Ｋ、Ｓ２５Ｋ、Ｆ２７Ｋ、Ｓ２８Ｋ、Ｅ４１Ｋ、Ｄ４４Ｋ、Ｎ４６Ｋ、Ｈ４７Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｎ６６Ｋ、Ａ７５Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｑ１０２Ｋ、Ｅ１０３Ｋ、Ｇ１０５Ｋ、Ｅ１０７Ｋ、Ｅ１０８Ｋ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１１０Ｋ、Ｌ１１１Ｋ、Ｖ１１４Ｋ、Ｄ１１５Ｋ、Ｌ１１８Ｋ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１５０Ｋ、Ｌ１６２Ｋ、Ｒ１６３Ｋ、Ｒ１６４ＫおよびＥ１６６Ｋ（５０％を超える表面に曝される側鎖を有し、推定レセプター結合部位の一部に結合しない残基）からなる群より選択される。いくつかの例では、４７位はリジンで置換されない。
本発明のこの局面で企図される非ポリペプチド部分は、表題「ポリマー分子に対する結合」の節に記載されるポリマー分子（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）を含む。リジンを含むポリペプチドと上記ポリマー分子との間の結合は、例えば、表題「ポリマー分子に対する結合」の節に記載されるように任意の適切な様式で（例えば、その節で言及される一段階方法または段階的方法で）達成され得る。インターフェロンαをＰＥＧ化するための例示的な方法は、リジン反応性のＰＥＧを用いてＰＥＧをリジン残基に共有結合させることである。多くの特異性の高いリジン反応性ＰＥＧ（例えば、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびアルデヒド（例えば、ＢｕｔｙｒＡＬＤ））ならびに様々なサイズの直鎖もしくは分枝のＰＥＧ（例えば、２〜４０ｋＤａ、例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａ）が、例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ、またはＳｕｎＢｉｏ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａから市販されている。
別の局面において、本発明は、結合体の集団を含む組成物を包含し、この集団の大多数の結合体は、各々そのポリペプチドの単一のリジン残基またはＮ末端アミノ基に共有結合された単一の非ポリペプチド部分（例えば、単一のポリマー分子（例えば、単一のＰＥＧ（例えば、直鎖のＰＥＧまたは分枝のＰＥＧ）））を含む。例えば、「モノ結合体化した（ｍｏｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」（例えば、「モノＰＥＧ化した）本発明の組成物は、その結合体の１つ以上の「位置異性体」を含み、ここで、各々の位置異性体は、そのポリペプチドの単一のリジン残基に共有結合された単一の非ポリペプチド部分（例えば、単一のＰＥＧ分子）を含む。
本発明は、結合体の集団を含むモノＰＥＧ化した組成物を包含し、この集団の大多数の結合体は、各々本発明のポリペプチドの単一のリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子（例えば、直鎖のＰＥＧもしくは分枝のＰＥＧ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａもしくは４０ｋＤａのｍＰＥＧ分子またはｍＰＥＧ２分子（例えば、３０ｋＤａのｍＰＥＧ２分子または４０ｋＤａのｍＰＥＧ２分子）））を含む位置異性体を含む。本明細書の実施例５は、本発明の例示的なモノＰＥＧ化した組成物の調製を記載する。
いくつかのそのような位置異性体は、例えば、Ｋ３１、Ｋ５０、Ｋ７１、Ｋ８４、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０および／またはＫ１６５（位置は配列番号１に対して番号付けされる）から選択されるリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子を含む。いくつかのそのような位置異性体は、Ｋ３１、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｋ１３５、Ｋ１６０およびＫ１６５から選択されるリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子を含む。いくつかのそのような位置異性体は、Ｋ３１、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３５、Ｋ１６０およびＫ１６５から選択されるリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子を含む。いくつかのそのような位置異性体は、Ｋ３１、Ｋ１２２、Ｋ１３３、Ｋ１３５およびＫ１６５から選択されるリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子を含む。いくつかのそのような位置異性体は、Ｋ３１、Ｋ１２２およびＫ１３５から選択されるリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子を含む。いくつかのそのような位置異性体は、Ｋ３１およびＫ１２２；Ｋ３１およびＫ１３５；またはＫ１２２およびＫ１３５から選択されるリジン残基に共有結合された単一のＰＥＧ分子を含む。上記ＰＥＧ分子は、直鎖のＰＥＧまたは分枝のＰＥＧ（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａもしくは４０ｋＤａの直鎖または分枝のＰＥＧ（例えば、３０ｋＤａのｍＰＥＧ２分子または４０ｋＤａのｍＰＥＧ２分子））であり得る。
親配列に対する改変の例が概して配列番号１に対して（またはいくつかの他の特定の配列に対して）本明細書で提供されるが、開示された改変はまた本明細書に記載される本発明の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにそれらの改変体が挙げられる）のいずれかの同等のアミノ酸位置においてもなされ得ることが理解される。したがって、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｋは、配列番号５におけるＱ４７Ｋに対応する、などが理解される。
（非ポリペプチド部分が糖部分である本発明の結合体）
別の局面において、本発明は、インターフェロンα活性を示し、そしてインターフェロンαポリペプチドに結合された少なくとも１つの糖部分を含む結合体に関し、そのアミノ酸配列は、配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）と、１〜１６個のアミノ酸位置が、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位（好ましくは、インビボＮ−グリコシル化部位）が（好ましくは置換によって）親インターフェロンαポリペプチドがその分子の表面に曝されるアミノ酸残基で占められる位置（例えば、表面に曝されるその側鎖のうちの少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％）を有する位置）に導入されているという点で異なる。代表的に、上記結合体は、例えば、配列番号１〜１５、４７または５３のいずれかのアミノ酸配列と、１〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、１〜１４個のアミノ酸位置が、１〜１２個のアミノ酸位置が、１〜１０個のアミノ酸位置が、１〜８個のアミノ酸位置が、１〜６個のアミノ酸位置が、１〜５個のアミノ酸位置が、１〜４個のアミノ酸位置が、１〜３個のアミノ酸位置が、または１〜２個のアミノ酸位置が））異なるアミノ酸配列を含む。
Ｎ−グリコシル化部位は、その部位のＮ−残基（Ａｓｎ）が所定の位置に配置されるような方法で導入される。同様に、Ｏ−グリコシル化部位は、そのような部位を構成しているＳ（Ｓｅｒ）残基またはＴ（Ｔｈｒ）残基がその部位に配置されるように導入される。インビボＮ−グリコシル化部位の導入に関連して用語「表面に曝されるその側鎖のうちの少なくとも２５％（または５０％）」が用いられる場合、この用語が糖部分が実際に結合される位置におけるアミノ酸側鎖の表面接近可能性を指すことが理解されるべきである。多くの場合において、糖部分が実際に結合されるアスパラギン残基に対して位置＋２にセリン残基またはスレオニン残基が導入されること、およびセリン残基またはスレオニン残基が導入されるこれらの位置が覆われる（すなわち、その分子の表面に曝されるそれらの側鎖のうちの２５％（または５０％）未満を有する）ことが可能であることが必要である。
いくつかの本発明の結合体は、配列番号１に対して、２５％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測される位置にＮ−グリコシル化部位を導入する以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む：Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｇ１０Ｎ＋Ｒ１２Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｑ２０Ｎ＋Ｒ２２Ｓ／Ｔ、Ｒ２２Ｎ＋Ｉ２４Ｓ／Ｔ、Ｒ２３Ｎ、Ｒ２３Ｎ＋Ｓ２５Ｔ、Ｉ２４Ｎ＋Ｌ２６Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｌ２６Ｎ、Ｌ２６Ｎ＋Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｌ３０Ｎ＋Ｄ３２Ｓ／Ｔ、Ｋ３１Ｎ＋Ｒ３３Ｓ／Ｔ、Ｒ３３Ｎ＋Ｄ３５Ｓ／Ｔ、Ｈ３４Ｎ＋Ｆ３６Ｓ／Ｔ、Ｄ３５Ｎ＋Ｒ３７Ｓ／Ｔ、Ｒ３７Ｎ＋Ｐ３９Ｓ／Ｔ、Ｑ４０Ｎ＋Ｅ４２Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｅ４２Ｎ＋Ｄ４４Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｖ５１Ｎ＋Ａ５３Ｓ／Ｔ、Ｑ５２Ｎ＋Ｉ５４Ｓ／Ｔ、Ｅ５９Ｎ＋Ｍ６１Ｓ／Ｔ、Ｑ６２Ｎ、Ｑ６２Ｎ＋Ｔ６４Ｓ、Ｑ６３Ｎ＋Ｆ６５Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｓ６９Ｎ＋Ｋ７１Ｓ／Ｔ、Ｔ７０Ｎ＋Ｎ７２Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ｓ７４Ｔ、Ｓ７４Ｎ＋Ａ７６Ｓ／Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｄ７８Ｎ、Ｄ７８Ｎ＋Ｔ８０Ｓ、Ｅ７９Ｎ＋Ｌ８１Ｓ／Ｔ、Ｔ８０Ｎ＋Ｌ８２Ｓ／Ｔ、Ｌ８１Ｎ＋Ｅ８３Ｓ／Ｔ、Ｅ８３Ｎ＋Ｆ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ８４Ｎ＋Ｙ８６Ｓ／Ｔ、Ｉ８７Ｎ＋Ｌ８９Ｓ／Ｔ、Ｆ９０Ｎ＋Ｑ９２Ｓ／Ｔ、Ｑ９１Ｎ＋Ｍ９３Ｓ／Ｔ、Ｌ９６Ｓ／Ｔ、Ｄ９５Ｎ＋Ｅ９７Ｓ／Ｔ、Ｅ９７Ｎ＋Ｃ９９Ｓ／Ｔ、Ａ９８Ｎ＋Ｖ１００Ｓ／Ｔ、Ｖ１００Ｎ＋Ｑ１０２Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｖ１０４Ｎ＋Ｖ１０６Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｍ１１２Ｎ＋Ｖ１１４Ｓ／Ｔ、Ｎ１１３Ｎ＋Ｄ１１５Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｑ１２５Ｎ＋Ｉ１２７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｎ＋Ｔ１２８Ｓ、Ｔ１２８Ｎ＋Ｙ１３０Ｓ／Ｔ、Ｌ１２９Ｎ＋Ｌ１３１Ｓ／Ｔ、Ｔ１３２Ｎ＋Ｋ１３４Ｓ／Ｔ、Ｋ１３３Ｎ＋Ｋ１３５Ｓ／Ｔ、Ｋ１３４Ｎ＋Ｙ１３６Ｓ／Ｔ、Ｋ１３５Ｎ、Ｋ１３５Ｎ＋Ｓ１３７Ｔ、Ｙ１３６Ｎ＋Ｐ１３８Ｓ／Ｔ、Ｐ１３８Ｎ、Ｐ１３８Ｎ＋Ｓ１４０Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｉ１４８Ｓ／Ｔ、Ｍ１４９Ｎ、Ｍ１４９Ｎ＋Ｓ１５１Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｓ１５３Ｎ、Ｓ１５３Ｎ＋Ｓ１５５Ｔ、Ｆ１５４Ｎ＋Ｆ１５６Ｓ／Ｔ、Ｑ１５９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｒ１６１Ｎ＋Ｒ１６３Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ。いくつかの例では、上記位置の中で、４７位、５１位、１３３位および１４０位のうちの１つ以上のアミノ酸残基は、上に示されるように改変されない。Ｓ／Ｔは、セリン残基またはスレオニン残基（好ましくは、スレオニン残基）の置換を示す。
いくつかの本発明の結合体は、配列番号１に対して、５０％を超える部分ＡＳＡを有する分子表面で曝されると予測される位置にＮ−グリコシル化部位を導入する以下の置換のうちの１つ以上を含むポリペプチド配列を含む：Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｒ３３Ｎ＋Ｄ３５Ｓ／Ｔ、Ｈ３４Ｎ＋Ｆ３６Ｓ／Ｔ、Ｄ３５Ｎ＋Ｒ３７Ｓ／Ｔ、Ｒ３７Ｎ＋Ｐ３９Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｄ７８Ｎ、Ｄ７８Ｎ＋Ｔ８０Ｓ、Ｅ７９Ｎ＋Ｌ８１Ｓ／Ｔ、Ｔ８０Ｎ＋Ｌ８２Ｓ／Ｔ、Ｅ８３Ｎ＋Ｆ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ８４Ｎ＋Ｙ８６Ｓ／Ｔ、Ｉ８７Ｎ＋Ｌ８９Ｓ／Ｔ、Ｆ９０Ｎ＋Ｑ９２Ｓ／Ｔ、Ｑ９１Ｎ＋Ｍ９３Ｓ／Ｔ、Ｌ９６Ｓ／Ｔ、Ｄ９５Ｎ＋Ｅ９７Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｑ１２５Ｎ＋Ｉ１２７Ｓ／Ｔ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｎ＋Ｔ１２８Ｓ、Ｌ１２９Ｎ＋Ｌ１３１Ｓ／Ｔ、Ｔ１３２Ｎ＋Ｋ１３４Ｓ／Ｔ、Ｋ１３３Ｎ＋Ｋ１３５Ｓ／Ｔ、Ｋ１３５Ｎ、Ｋ１３５Ｎ＋Ｓ１３７Ｔ、Ｐ１３８Ｎ、Ｐ１３８Ｎ＋Ｓ１４０Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ。いくつかの例では、上記位置の中で、４７位、５１位、１３３位および１４０位は、上に示されるように改変されない。Ｓ／Ｔは、セリン残基またはスレオニン残基（好ましくは、スレオニン残基）の置換を示す。
いくつかの例では、インターフェロンαの潜在的なレセプター結合部位の外側に（すなわち、およそ２９位〜４０位、７９位〜９６位および２４位〜１４１位（位置は配列番号１に対して番号付けされる）の外側に）Ｎ−グリコシル化部位が導入されることが好ましくあり得る。したがって、１つ以上のＮ−グリコシル化部位の導入をもたらす置換としては、Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｇ１０Ｎ＋Ｒ１２Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｑ２０Ｎ＋Ｒ２２Ｓ／Ｔ、Ｒ２２Ｎ＋Ｉ２４Ｓ／Ｔ、Ｒ２３Ｎ、Ｒ２３Ｎ＋Ｓ２５Ｔ、Ｉ２４Ｎ＋Ｌ２６Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｌ２６Ｎ、Ｌ２６Ｎ＋Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｅ４２Ｎ＋Ｄ４４Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｖ５１Ｎ＋Ａ５３Ｓ／Ｔ、Ｑ５２Ｎ＋Ｉ５４Ｓ／Ｔ、Ｅ５９Ｎ＋Ｍ６１Ｓ／Ｔ、Ｑ６２Ｎ、Ｑ６２Ｎ＋Ｔ６４Ｓ、Ｑ６３Ｎ＋Ｆ６５Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｓ６９Ｎ＋Ｋ７１Ｓ／Ｔ、Ｔ７０Ｎ＋Ｎ７２Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ｓ７４Ｔ、Ｓ７４Ｎ＋Ａ７６Ｓ／Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｅ９７Ｎ＋Ｃ９９Ｓ／Ｔ、Ａ９８Ｎ＋Ｖ１００Ｓ／Ｔ、Ｖ１００Ｎ＋Ｑ１０２Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｖ１０４Ｎ＋Ｖ１０６Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｍ１１２Ｎ＋Ｖ１１４Ｓ／Ｔ、Ｎ１１３Ｎ＋Ｄ１１５Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ａ１４６Ｎ＋Ｉ１４８Ｓ／Ｔ、Ｍ１４９Ｎ、Ｍ１４９Ｎ＋Ｓ１５１Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｓ１５３Ｎ、Ｓ１５３Ｎ＋Ｓ１５５Ｔ、Ｆ１５４Ｎ＋Ｆ１５６Ｓ／Ｔ、Ｑ１５９Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｒ１６１Ｎ＋Ｒ１６３Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ（２５％を超える表面に曝される側鎖を有し、推定結合部位の一部を形成しない残基）のうちの１つ以上が挙げられ得る。いくつかの例では、上記位置の中で、４７位および５１位のうちの一方または両方のアミノ酸残基は、上に示されるように改変されない。Ｓ／Ｔは、セリン残基またはスレオニン残基（好ましくは、スレオニン残基）の置換を示す。
いくつかの例では、置換は、Ｄ２Ｎ＋Ｐ４Ｓ／Ｔ、Ｌ３Ｎ＋Ｑ５Ｓ／Ｔ、Ｐ４Ｑ、Ｐ４Ｑ＋Ｔ６Ｓ、Ｑ５Ｎ＋Ｈ７Ｓ／Ｔ、Ｔ６Ｎ、Ｔ６Ｎ＋Ｓ８Ｔ、Ｈ７Ｎ＋Ｌ９Ｓ／Ｔ、Ｓ８Ｎ＋Ｇ１０Ｓ／Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｈ１１Ｓ／Ｔ、Ｒ１２Ｎ、Ｒ１２Ｎ＋Ｔ１４Ｓ、Ｒ１３Ｎ＋Ｍ１５Ｓ／Ｔ、Ｍ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ａ１９Ｎ＋Ｍ２１Ｓ／Ｔ、Ｓ２５Ｎ＋Ｆ２７Ｓ／Ｔ、Ｓ２８Ｎ＋Ｌ３０Ｓ／Ｔ、Ｅ４１Ｎ＋Ｆ４３Ｓ／Ｔ、Ｄ４４Ｎ＋Ｎ４６Ｓ／Ｔ、Ｆ４８Ｓ／Ｔ、Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｖ５１Ｓ／Ｔ、Ｋ５０Ｎ＋Ｑ５２Ｓ／Ｔ、Ｆ６８Ｓ／Ｔ、Ｋ７１Ｎ、Ｋ７１Ｎ＋Ｓ７３Ｔ、Ａ７５Ｎ＋Ｗ７７Ｓ／Ｔ、Ｍ１０１Ｎ＋Ｅ１０３Ｓ／Ｔ、Ｑ１０２Ｎ＋Ｖ１０４Ｓ／Ｔ、Ｅ１０３Ｎ＋Ｇ１０５Ｓ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ＋Ｅ１０７Ｓ／Ｔ、Ｅ１０７、Ｅ１０７Ｎ＋Ｔ１０９Ｓ、Ｅ１０８Ｎ＋Ｐ１１０Ｓ／Ｔ、Ｌ１１１Ｎ＋Ｎ１１３Ｓ／Ｔ、Ｖ１１４Ｎ、Ｖ１１４Ｎ＋Ｓ１１６Ｔ、Ｄ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｌ１１８Ｎ＋Ｖ１２０Ｓ／Ｔ、Ｒ１２１Ｎ＋Ｙ１２３Ｓ／Ｔ、Ｋ１２２Ｎ＋Ｆ１２４Ｓ／Ｔ、Ｒ１５０Ｎ＋Ｆ１５２Ｓ／Ｔ、Ｋ１６０Ｎ＋Ｌ１６２Ｓ／Ｔ、Ｌ１６２Ｎ＋Ｒ１６４Ｓ／Ｔ、Ｒ１６３Ｎ＋Ｋ１６５Ｓ／ＴおよびＲ１６４Ｎ＋Ｅ１６６Ｓ／Ｔ（５０％を超える表面に曝される側鎖を有し、推定結合部位の一部を形成しない残基）からなる群より選択される。いくつかの例では、上記位置の中で、４７位および５１位のうちの一方または両方のアミノ酸残基は、上に示されるように改変されない。Ｓ／Ｔは、セリン残基またはスレオニン残基（好ましくは、スレオニン残基）の置換を示す。
導入されたＮ−グリコシル化部位の効率的な利用を得るために、およそ１２５ Ｎ−末端アミノ酸残基内（例えば、およそ１００ Ｎ−末端アミノ酸残基内（例えば、７５ Ｎ−末端アミノ酸残基内または５０ Ｎ−末端アミノ酸残基内））の上記置換のうちのいずれかを選択することが望ましい。
本発明の結合体のインターフェロンαポリペプチド部分がグリコシル化される場合、単一の導入されたインビボグリコシル化部位（例えば、単一の導入されたインビボＮ−グリコシル化部位）を含み得る。しかし、親ポリペプチドの表面に存在するエピトープを効率的に保護するために、そのポリペプチドが１つよりも多いインビボグリコシル化部位（例えば、２〜５個のインビボグリコシル化部位（例えば、２、３、４または５個のインビボグリコシル化部位）を含むことが望ましくあり得る。
親配列に対する改変の例が概して配列番号１に対して（またはいくつかの他の特定の配列に対して）本明細書で提供されるが、開示された改変はまた本明細書に記載される本発明の他のポリペプチド（配列番号２〜１５および配列番号４４〜１０４ならびにそれらの改変体が挙げられる）のいずれかの同等のアミノ酸位置においてもなされ得ることが理解される。したがって、例として、配列番号１に対する置換Ｈ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔは、配列番号５におけるＱ４７Ｎ＋Ｑ４９Ｓ／Ｔに対応する、などが理解される。
（本発明の結合体の非ポリペプチド部分）
上記のように、本発明の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（例えば、例としてインビボＮ−グリコシル化）および有機誘導体化剤からなる群より一般的に選択される。これらの因子はすべて、上記結合体のポリペプチド部分に対して望ましい特性（例えば、低下した免疫原性、増加した機能的インビボ半減期、増加した血清半減期、増加したバイオアベイラビリティ、および／または増加したＡＵＣｓｃ）を付与し得る。上記結合体のポリペプチド部分は、しばしば、唯１つの型の非ポリペプチド部分に結合体化されるが、また２つ以上の異なる型の非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子および糖部分など）に結合体化されてもよい。２つ以上の非ポリペプチド部分に対する結合体化は、同時または連続的に行われ得る。非ポリペプチド部分の選択は、その結合体化によって達成されることが望まれる効果に特に依存する。例えば、糖部分は、低下した免疫原性のために特に有用であることが見出されているが、一方、ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ）は、機能的インビボ半減期および／または血清半減期を増加するために特に有用である。ポリマー分子と糖部分との組み合わせを使用することは、免疫原性の低下と、機能的インビボまたは血清半減期の増加とを増強し得る。
以下の「親油性化合物に対する結合体化」、「ポリマー分子に対する結合体化」、「糖部分に対する結合体化」および「有機誘導体化剤に結合体化」の節において、特定の型の非ポリペプチド部分に対する結合体化が、記載される。
（親油性化合物に対する結合）
親油性化合物に対する結合体化のために、以下のポリペプチド基が、結合基として機能し得る：上記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端、アミノ酸残基Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒのヒドロキシ基、Ｌｙｓのε−アミノ基、ＣｙｓのＳＨ基、またはＡｓｐおよびＧｌｕのカルボキシル基。上記ポリペプチドと親油性化合物とは、直接的にか、またはリンカーの使用によって、結合体化され得る。親油性化合物は、天然化合物（例えば、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロチノイド、もしくはステロイド）、または合成化合物（例えば、１つ以上のアルキル、アリール、またはアルケニルを含む、炭酸；１つ以上のアルキル、アリール、またはアルケニルを含む、アルコール；１つ以上のアルキル、アリール、またはアルケニルを含む、アミン；および１つ以上のアルキル、アリール、またはアルケニルを含む、スルホン酸；または他の多不飽和化合物）であり得る。上記ポリペプチドと親油性化合物との間の結合体化（必要に応じて、リンカーを介する）は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６およびＷＯ ９６／１２５０５に記載される方法）に従って行われ得る。
（ポリマー分子に対する結合）
ポリペプチドに結合されるべきポリマー分子は、任意の適切なポリマー分子（例えば、天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマー）であり得、代表的に約３００〜１００，０００Ｄａの範囲、例えば、約１，０００〜５０，０００Ｄａ（例えば、約１，０００〜４０，０００Ｄａの範囲）の分子量を有する。より詳細には、このポリマー分子（例えば、ＰＥＧ、特にｍＰＥＧ）は、代表的に２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａもしくは５０ｋＤａの分子量（特に、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａもしくは、約４０ｋＤａの分子量）を有する。ＰＥＧ分子は、分枝状であってもよく（例えば、ｍＰＥＧ２）、または分枝状でなくともよい（すなわち、直鎖状）。
本明細書においてポリマー分子について使用される場合、語「約」は、おおよその平均分子量を示し、そして所定のポリマー調製物中に、通常、特定の分子量の分布があるという事実を反映する。
ホモポリマーの例としては、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）が挙げられる。ヘテロポリマーは、１以上の異なる結合基（例えば、へドロキシ基およびアミン基）を含むポリマーである。
適切なポリマー分子の例としては、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）（ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））が挙げられる）、分枝ＰＥＧ（ＰＥＧ２）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリ−（ビニルピロリドン）、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチルデキストランを含むデキストラン、あるいは免疫原性を減少し、ならびに／または機能的インビボ半減期および／もしくは血清半減期を増加するために適した任意の他の生体高分子からなる群より選択されるポリマー分子が挙げられる。一般的に、ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは、生体適合性、無毒性、非抗原性、非免疫原性であり、種々の水溶性特性を有し、そして生体から容易に分泌される。
ＰＥＧは、使用されるに好ましいポリマー分子である。なぜなら、例えばデキストランのような多糖類と比べて、数個の架橋し得る反応基しか有さないからである。特に、単官能性のＰＥＧ、例えばモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が、該当する。なぜなら、その結合化学が比較的単純（ただ１つの反応基が、ポリペプチド上の結合基（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）との結合に利用可能）だからである。結果として、架橋の危険性が消失し、得られるポリペプチド結合体はより均一であり、かつポリマー分子とポリペプチドとの反応は制御し易い。
ポリマー分子のポリペプチドへの共有結合を達成するため、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性形態で、すなわち、反応性の官能基とともに提供されなければならない（その例としては、一級アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオール、スクシネート（ＳＵＣ）、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルスクシナミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾールカルボネート（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）、およびトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）（ＴＲＥＳ））が挙げられる。適切に活性化されたポリマー分子が市販されている（例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ；ＰｏｌｙＭＡＳＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｐｌｃ，ＵＫ；またはＳｕｎＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａより）。あるいは、ポリマー分子は、当該分野で公知の従来の方法（例えば、ＷＯ９０／１３５４０に開示されるような方法）によって活性化され得る。本発明における使用に適切な活性化された直鎖状もしくは分枝状ポリマー分子の特定の例は、本明細書中に参考として援用される、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．２００３ カタログ（「Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ２００３」）に記載される。活性化されたＰＥＧポリマーの特定の例としては、以下の直鎖状ＰＥＧ：ＮＨＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ、ＳＣＭ−ＰＥＧ、 ＮＯＲ−ＰＥＧ、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧ、ならびに分枝したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ２−ＭＡＬ）、ならびにＵＳ５，９３２，４６２およびＵＳ５，６４３，５７５（これら両方は、本明細書において参考として援用される）に開示されるようなＰＥＧポリマーが挙げられる。さらに、以下の刊行物（本明細書において参考として援用される）は、有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化化学物質を開示する：ＵＳ ５，８２４，７７８、ＵＳ ５，４７６，６５３、ＷＯ ９７／３２６０７、ＥＰ ２２９，１０８、ＥＰ ４０２，３７８、ＵＳ ４，９０２，５０２、ＵＳ ５，２８１，６９８、ＵＳ ５，１２２，６１４、ＵＳ ５，２１９，５６４、ＷＯ ９２／１６５５５、ＷＯ ９４／０４１９３、ＷＯ ９４／１４７５８、ＷＯ ９４／１７０３９、ＷＯ ９４／１８２４７、ＷＯ ９４／２８０２４、ＷＯ ９５／００１６２、ＷＯ ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ ９５／３３４９０、ＷＯ ９６／０００８０、ＷＯ ９７／１８８３２、ＷＯ ９８／４１５６２、ＷＯ ９８／４８８３７、ＷＯ ９９／３２１３４、ＷＯ ９９／３２１３９、ＷＯ ９９／３２１４０、ＷＯ ９６／４０７９１、ＷＯ ９８／３２４６６、ＷＯ ９５／０６０５８、ＥＰ ４３９ ５０８、ＷＯ ９７／０３１０６、ＷＯ ９６／２１４６９、ＷＯ ９５／１３３１２、ＥＰ ９２１ １３１、ＵＳ ５，７３６，６２５、ＷＯ ９８／０５３６３、ＥＰ ８０９ ９９６、ＵＳ ５，６２９，３８４、ＷＯ ９６／４１８１３、ＷＯ ９６／０７６７０、ＵＳ ５，４７３，０３４、ＵＳ ５，５１６，６７３、ＥＰ ６０５ ９６３、ＵＳ ５，３８２，６５７、ＥＰ ５１０ ３５６、ＥＰ ４００ ４７２、ＥＰ １８３ ５０３およびＥＰ １５４ ３１６。
ポリペプチドと活性化されたポリマー分子との結合は、例えば、以下の参考文献に開示されるような任意の従来の方法（これらの参考文献はまた、ポリマー分子の活性化のための適切な方法を開示する）の使用によって実行される：ＨａｒｒｉｓおよびＺａｌｉｐｓｋｙ（編）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＺＣ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２），「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（１９９３），「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．。
システイン残基のＰＥＧ化のため、ポリペプチドは、通常、ＰＥＧ化の前にジチオスレイトール（ＤＤＴ）のような還元剤で処理される。還元剤は、その後任意の従来の方法によって（例えば、脱塩によって）除去される。ＰＥＧのシステイン残基への結合は、代表的に、適切な緩衝液（ｐＨ６〜９）中において、４℃〜２５℃の種々の温度で、約１６時間までの期間で起こる。システイン残基と結合するための活性化されたＰＥＧポリマーの例としては、以下の直鎖状および分枝状のＰＥＧが挙げられる：ビニルスルホン−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＶＳ）（例えば、ビニスルホン−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＶＳ）；オルトピリジル−ジスルフィド−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＰＳＳ）（例えば、オルトピリジル−ジスルフィド−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ）；ならびにマレイミド−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＭＡＬ）（例えば、マレイミド−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）および分枝状マレイミド−ｍＰＥＧ２（ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ））。
リジンのＰＥＧ化には、しばしばＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨＳもしくはｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）、またはエステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）もしくはＰＥＧスクシンイミジルブタノエート（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ））を利用する。ほぼ等モル量のＰＥＧとタンパク質とが混合される場合、１種以上のＰＥＧが、ｐＨ８〜９．５、室温で、３０分以内にタンパク質に結合され得る。タンパク質アミノ基に対するＰＥＧのモル比が、１に対して１〜５であれば、通常十分である。ｐＨが上昇すると反応速度は上昇し、一方ＰＨが低下すると反応速度は低下する。これらのより反応性の高い活性エステルは生理学的ｐＨで結合し得るが、より反応性の低い誘導体は、代表的に、より高いｐＨを必要とする。不安定なタンパク質が使用されている場合、低温もまた利用され得る。低温条件下では、より長い反応時間が使用され得る。
Ｎ末端ＰＥＧ化は、Ｎ末端アミノ酸のα−アミノ基のｐＫａ値（約７．６〜８．０）とリジンのε−アミノ基のｐＫａ値（約１０）との間の差によって促進される。Ｎ末端アミノ基のＰＥＧ化には、ＰＥＧ−アルデヒド（例えば、ｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドまたはｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）をしばしば利用する（これらは、アミンに対してより選択的であり、したがってヒスチジンのイミダゾール基と反応する可能性がより低い）；加えて、リジン結合のために使用されるＰＥＧ試薬（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）はまた、Ｎ末端アミンの結合のために使用され得る。Ｎ末端アミノ基に対するＰＥＧ−アルデヒドの結合は、代表的に、適切な緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、または２０ｍＭナトリウムシアノボロヒドライドを含む１００ｍＭナトリウムビスホスフェート緩衝液）中において、ｐＨ約５．０で一晩、約４℃〜２５℃の種々の温度で起こる。有用なＮ末端ＰＥＧ化法および化学はまた、米国特許第５，９８５，２６５号および同第６，０７７，９３９号（これら両方は、本明細書において参考として援用される）に開示される。
代表的に、直鎖状のＰＥＧもしくはｍＰＥＧポリマーは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。分枝状ＰＥＧ（ＰＥＧ２もしくはｍＰＥＧ２）ポリマーは、代表的に、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの例では、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａのＰＥＧ２のような、より高い分子量の分枝状ＰＥＧ試薬（例えば、リジンＰＥＧ化のためのｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、システインＰＥＧ化のためのｍＰＥＧ２−ＭＡＬ、もしくはＮ−末端ＰＥＧ化のためのＭＰＥＧ２−アルデヒドが挙げられる；これら全ては、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬから入手可能）が使用され得る。ＰＥＧ２化合物の分枝構造は比較的大きな分子容を生じ、したがってより少ない結合分子（もしくは１つの結合分子）が、ＰＥＧ化された分枝の所望の特徴を与え得る。
当業者は、使用される活性法および／または結合化学が、インターフェロン−αポリペプチドの結合基およびポリマーの官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドもしくはスルフヒドリル）に依存することを認識している。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の全ての利用可能な結合基（すなわち、ポリペプチドの表面に露出される結合基）への結合に方向付けられ得るか、または特定の結合基（例えば、システイン残基、リジン残基もしくはＮ−末端アミノ基）に方向付けられ得る。さらに、この結合は、一工程または段階的様式で（例えば、ＷＯ９９／５５３７７に開示されるように）実現され得る。
いくつかの例では、ポリマー結合は、可能な限り多数の利用可能なポリマー結合基とポリマー分子とを反応させることを目的とする条件下で行われる。これは、ポリペプチドに対して適切なモル過剰のポリマーによって達成される。活性化されたポリマー分子のポリペプチドに対する代表的なモル比は、約１０００−１まで（例えば、約２００−１までもしくは約１００−１まで）である。いくつかの場合では、この比はある程度低いが、例えば、約５０−１、１０−１もしくは５−１までである。等モル比もまた使用され得る。
本発明に従って、リンカーを通じてポリマー分子をポリペプチドに結合することが、また検討される。適切なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は、塩化シアヌルである（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５７８−３５８１；ＵＳ４，１７９，３３７；Ｓｈａｆｅｒら（１９８６），Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．（編）２４，３７５−３７８）。
この結合に続いて、残りの活性化されたポリマー分子は、当該分野で公知の方法に従って（例えば、反応混合物への一級アミンの添加により）ブロックされ、そして得られた不活性化ポリマー分子は適切な方法で除去される。
インターフェロンαのアミノ酸残基への糖分子のインビトロ共有結合は、糖置換基の数またはプロフィールを改変または増加するのに使用され得る。使用される結合様式に依存して、炭水化物が以下に結合される：ａ）アルギニンおよびヒスチジン（ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＮｏｙｅｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＩ）；ｂ）（例えば、Ｃ末端アミノ酸残基、アスパラギンもしくはグルタミンの）遊離カルボキシル基；ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システイン）；ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニン、チロシンもしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）；ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニンもしくはトリプトファンの芳香族残基）、またはｆ）グルタミンのアミド基。これらのアミノ酸残基は、インターフェロンαポリペプチドにおいて導入および／もしくは除去され得る糖部分に対する結合基の例を構成する。インビトロ結合の適切な方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６，１９８１に開示される。タンパク質結合Ｇｌｎ残基およびペプチド結合Ｇｌｎ残基への糖部分またはＰＥＧのインビトロ結合はまた、例えば、Ｓａｔｏら、１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１３０７２−１３０８０またはＥＰ７２５１４５によって記載されるように、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）によって実行され得る。
（糖部分に対する結合）
１以上のグリコシル化部位の導入によって改変されたインターフェロン−αポリペプチドのインビボグリコシル化を達成するため（「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明の結合体」の節を参照のこと）、この結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列が、グリコシル化する真核生物発現宿主に挿入される。発現宿主は、真菌（糸状菌もしくは酵母）、昆虫、哺乳動物細胞から、トランスジェニック植物細胞から、またはトランスジェニック動物から選択され得る。さらに、グリコシル化は、本発明の結合体のポリペプチド部分または遺伝子治療おける本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、ヒト体内で達成され得る。１つの局面において、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫもしくはＨＥＫ２９３のようなＨＥＫ細胞）、または昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、または酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓもしくは任意の他の適切なグリコシル化宿主（例えば、以下にさらに記載されるような宿主）である。必要に応じて、インビボグリコシル化によってインターフェロン−αポリペプチドに結合された糖部分は、糖転移酵素の使用によって（例えば、Ｎｅｏｓｅ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ，ＵＳＡによって販売されるＧｌｙｃｏＡｄｖａｎｃｅＴＭ技術を用いて）さらに改変される。これらによって、例えば、ＣＨＯ細胞による発現およびインビボグリコシル化に続くグリコシル化インターフェロン−αポリペプチドのシアリル化を増進することが可能である。
（有機誘導体化剤に対する結合）
インターフェロン−αポリペプチドの共有結合性改変は、ポリペプチドの結合基を有機誘導化剤と反応させることによって行われ得る。適切な有機誘導体化剤および方法は、当該分野で公知である。例えば、最も一般的なシステイニル残基は、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応し、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（４−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７でのジエチルピロカルボネートとの反応によって、誘導体化される。なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的だからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ６．０で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸もしくは他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な薬剤としては、イミドエステル（例えば、メチルピコリンイミデート）；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロボロヒドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。アルギニル残基は、一もしくはいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジエン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ条件で行われる反応を必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基およびアルギニンのグアニジノ基と反応し得る。カルボキシル側基（アスパラチルもしくはグルタミル、またはＣ−末端アミノ酸残基）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に改変される（ここで、ＲおよびＲ’は、異なるアルキル基（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）である）。さらに、アスパラチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
（官能部位のブロッキング）
過剰なポリマー結合は、そのポリマーが結合されるインターフェロン−αポリペプチドの活性の消失をもたらし得るため、官能部位に位置する結合基を除去すること、または結合前に官能部位をブロックすることは、有利であり得る。これらの後者の戦略は、本発明のさらなる局面を構成する（第一戦略は、上記にさらに例示される、例えば、官能部位に近接して配置され得るリジン残基の除去による）。より具体的には、第二戦略に従って、インターフェロン−αポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合は、このポリペプチドの官能部位が、このポリペプチドの官能基に結合し得るヘルパー分子によってブロックされる条件下で行われる。好ましくは、このヘルパー分子は、ポリペプチドの１つの官能部位（例えば、レセプター、特にＩ型インターフェロンレセプター）を特異的に認識する分子である。あるいは、このヘルパー分子は、抗体、特にインターフェロン−αポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であり得る。特に、このヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体であり得る。
ポリペプチドは、結合を達成する前にヘルパー分子と相互作用し得る。これにより、ポリペプチドの官能部位が遮断されるかまたは保護されて、結果としてポリマーのような非ポリペプチド部分による誘導体化のために利用できなくなることが確実となる。ヘルパー分子からのその溶出に続いて、非ポリペプチド部分とポリペプチドとの間の結合は、少なくとも部分的に保存された官能部位によって回復され得る。
ブロックされた官能部位を有するポリペプチドの、ポリマー、親油性化合物、有機誘導化剤または他の任意の化合物とのその後の結合は、通常の方法で（例えば、「・・・に対する結合」という表題の上記の節に記載されるように）行われる。
ポリペプチドの官能部位の結合からの遮断に使用されるヘルパー分子の性質に関係なく、ヘルパー分子が、その分子の一部に選択された非ポリペプチド部分に対する結合基を全く含まないかほとんど含まないことが、このような基との結合がヘルパー分子からの結合されたポリペプチドの脱離を妨害する場合には望ましい。これによって、ポリペプチドの非遮断部分に存在する結合基との選択的結合が達成され得、そしてこのヘルパー分子を結合の繰り返しサイクルのために再使用することが可能となる。例えば、非ポリペプチド部分が、結合基としてリジンのεアミノ基もしくはＮ−末端アミノ酸残基を有するＰＥＧのようなポリマー分子である場合、ヘルパー分子が実質的に結合可能なεアミノ基を含まないこと、好ましくはεアミノ基を全く含まないことが所望される。したがって、いくつかの例では、ヘルパー分子は、ポリペプチドの官能部位と結合し得るタンパク質もしくはペプチドであり、このタンパク質もしくはペプチドは、選択された非ポリペプチド部分に対していかなる結合可能な結合基も含まない。
さらなる局面においては、ヘルパー分子は、初めにカラムパッキング材料のような固相（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘもしくはアガロースビーズ、または表面（例えば、反応容器））に共有結合される。続いて、ポリペプチドは、ヘルパー分子を有するカラム材料にローディングされて、当該分野で公知の方法に従って（例えば、「・・・との結合」という表題の上記の章に記載されるように）結合が行われる。この手順は、ポリペプチド結合体を溶出することによってヘルパー分子から分離することを可能にする。ポリペプチド結合体は、ポリペプチド結合体の実質的分解をもたらさない物理化学的条件下で、従来技術によって溶出される。ポリペプチド結合体を含む流体相は、ヘルパー分子が共有結合したままの固相から分離される。分離は、他の方法で達成され得る。例えば、ヘルパー分子は、特異的結合剤（例えば、ストレプトアビジン）によって認識され得る第二分子（例えば、ビオチン）で誘導体化される。特異的結合剤は、固相に連結され得、それによって、第二ヘルパー−固相カラム（これは、後の溶出の際、ヘルパー分子−第二分子複合体を保持するが、ポリペプチド結合体は保持しない）上の通過を通して、ヘルパー分子−第二分子複合体からのポリペプチド結合の分離を可能にする。ポリペプチド結合体は、任意の適切な形式でヘルパー分子から放出される。脱保護は、ヘルパー分子が、結合するインターフェロン−αの官能部位から解離する条件を提供することによって、達成される。例えば、ポリマーが結合する抗体と抗イディオタイプ抗体との間の複合体は、ｐＨを酸性もしくはアルカリ性ｐＨへと調整することによって解離し得る。
（タグ化インターフェロン−αポリペプチドの結合）
別の局面において、インターフェロン−αポリペプチドは、タグを有する融合タンパク質（すなわち、例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加された、代表的に１〜３０（例えば、１〜２０もしくは１〜１５もしくは１〜１０もしくは１〜５）のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列もしくはペプチド）として発現される。タグは、迅速および簡易な精製を可能にするほかに、タグ化ポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合を達成するのに便利な手段である。特に、タグは、マイクロタイタープレートや他のキャリア（例えば、タグ化ポリペプチドが、そのタグを介して固定される常磁性ビーズ）中での結合を実現するために使用され得る。例えば、マイクロタイタープレートにおけるタグ化ポリペプチドへの結合は、タグ化ポリペプチドが培養ブロスからマイクロタイタープレートに（原則的にいずれの精製もなしで）直接的に固定され得、そして結合に供され得るという利点を有する。これによって、プロセス工程の総数（発現から結合まで）が減少され得る。さらに、タグは、結合されるべき固定されたポリペプチドに対する改善した接触性を保証するスペーサー分子として機能し得る。タグ化ポリペプチドを用いた結合は、本明細書において開示される非ポリペプチド部分のいずれかに対する（例えば、ＰＥＧのようなポリマー分子に対する）。
使用されるべき特定のタグの同定は、タグが、ポリペプチドとともに発現され得る限り、および適切な表面もしくはキャリア材料上に固定され得る限り、重要ではない。多くの適切なタグは、例えば、Ｕｎｉｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから市販されている。このようなタグに対する抗体は、例えば、ＡＤＩ，Ａｖｅｓ Ｌａｂ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されている。
（本発明のポリヌクレオチド）
本発明は、単離された核酸または組み換え型の核酸（本明細書において、やはりポリヌクレオチドを呼ばれる）を提供する。これらは、正確には「本発明の核酸（もしくはポリヌクレオチド）」と呼ばれ、本発明のポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、種々の用途に有用である。上記で議論されるように、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを産生するに有用である。加えて、本発明のポリヌクレオチドは、以下でより詳細に記載されるような遺伝子治療、ＤＮＡワクチン接種、および免疫治療に有用な発現ベクターに組み込まれ得る。
一局面において、本発明は、各々（ａ）配列番号１６〜３０から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１〜１５および４４〜１０４から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列、から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。
本発明はまた、各々配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）と、０〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、０〜１６個の位置が、０〜１５個の位置が、０〜１４個の位置が、０〜１３個の位置が、０〜１２個の位置が、０〜１１個の位置が、０〜１０個の位置が、０〜９個の位置が、０〜８個の位置が、０〜７個の位置が、０〜６個の位置が、０〜５個の位置が、０〜４個の位置が、０〜３個の位置が、０〜２個の位置が、または０〜１個の位置が））異なる配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。いくつかの例では、コードされるポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
本発明はまた、各々配列番号１〜１５および配列番号４４〜１０４のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１２、配列番号４７または配列番号５３の１つ）に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％あるいはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸もしくは組換え核酸を提供する。いくつかの例では、コードされるポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
本発明はまた、各々親インターフェロンαポリペプチドの改変体であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸もしくは組換え核酸を提供し、コードされる改変体は、少なくとも１つのアミノ酸位置が親インターフェロンαポリペプチド配列と異なる配列を含み、ここで、その改変体配列は、４７位にＨｉｓ、５１位にＶａｌ、５５位にＰｈｅ、５６位にＬｅｕ、５８位にＴｙｒ、１３３位にＬｙｓおよび１４０位にＳｅｒ（位置は配列番号１に対して番号付けされる）のうちの１つ以上を含む。いくつかの例では、親インターフェロンαポリペプチド配列は、天然に存在するヒトインターフェロンαの配列（例えば、配列番号３１〜配列番号４２のいずれか１つ、または配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ，あるいは本明細書ならびに／またはＡｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６），（前出）に記載されるような他のｈｕＩＦＮ−α配列）、あるいは天然に存在しない（すなわち、合成の）インターフェロンα（例えば、ＩＦＮ−αＣｏｎ１（配列番号４３））の配列である。いくつかの例では、改変体配列は、１〜１６個のアミノ酸位置が（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸位置が（例えば、１〜１０個のアミノ酸位置が、１〜５個のアミノ酸位置が、または１〜３個のアミノ酸位置が））親ポリペプチド配列と異なる。いくつかの例では、この改変体はインターフェロンα活性を示す。
別の局面において、本発明は、各々配列番号１６〜３０のうちの１つの実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸もしくは組換え核酸を提供し、このポリヌクレオチド配列は、インターフェロンα活性を示すポリペプチドをコードする。
（さらなる局面）
任意の本発明の核酸（上記に記載されるポリヌクレオチドを含む）は、少なくとも１つの付加的なアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードし得る。これらの付加的な配列は、例えば、分泌／局在化配列、ポリペプチドの可溶化もしくは固定化（例えば、細胞表面提示のため）に有用な配列、ポリペプチドの検出および／もしくは精製に有用な配列（例えば、エピトープタグのようなポリペプチド精製配列、ポリヒスチジン配列など）のような配列である。別の局面において、本発明は、１以上の本発明の核酸を含む細胞を提供する。このような細胞は、本発明の核酸によってコードされる１以上のポリペプチドを発現し得る。
本発明はまた、本発明の任意の核酸を含むベクターを提供する。このようなベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、またはウイルスフラグメントが挙げられる。このようなベクターは発現ベクターを含み、所望される場合、その核酸は、本明細書および以下で議論されるプロモーターを含むプロモーターに作動可能に連結される。さらに、別の局面において、本発明は、賦形剤もしくはキャリア、および本発明の核酸のいずれかのうちの少なくとも１つ、またはベクター、細胞、またはこのような核酸を含む宿主を含有する組成物を提供する。このような組成物は、薬学的組成物であり得、そして賦形剤もしくはキャリアは、薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリアであり得る。
本発明はまた、本発明の二つ以上の核酸またはそれらのフラグメント（例えば、組換えのための基質としてのフラグメント）を含有する組成物を包含する。その組成物は、組換え核酸のライブラリーを含み得、そのライブラリーは、上記の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００以上の核酸を含む。この核酸は、必要に応じて発現ベクター中にクローン化され、発現ライブラリーを提供する。
本発明の核酸およびそのフラグメント、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターは、適切なキャリア（例えば、薬学的キャリア）と組み合わされて、治療的用途または予防的用途に使用され得る。そのような組成物は、治療上有効な量および／または予防上有効な量の化合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を包含する。そのようなキャリアまたは賦形剤には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。その処方物は、その投与様式に合うはずである。核酸、ポリペプチドおよびタンパク質の投与方法は、当該分野において周知であり、以下でさらに議論される。
本発明はまた、本発明の核酸のいずれかのうちの１つ以上を、（例えば、上で記述された特定の組換え形式で実行されるように）制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅで消化することにより産生される組成物；および本発明の１つ以上の核酸を、機械的方法（例えば、超音波処理、ボルテックスなど）でフラグメント化またはせん断することにより産生される組成物を含む。そしてその機械的方法はまた、本明細書に記載の方法における組換えのための基質を提供するのにも使用され得る。本発明はまた、本発明の核酸のいずれかのうちの少なくとも１つを切断することにより産生される組成物を提供する。この切断は、機械的切断、化学的切断、または酵素的切断を含み得、そしてこの酵素的切断は、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅでの切断を含み得る。
本発明にさらに含まれるのは、本発明の１つ以上のフラグメント化された核酸を、リボヌクレオチド三リン酸またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下でインキュベートすることを含むプロセスにより生産される組成物である。得られた組成物は、上で記述された組換えフォーマットの多くの形態について組換え混合物を形成する。核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）であり得る；このポリメラーゼは、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ、ＴＡＱなど）であり得る。
同様に、本発明の１つ以上の核酸に対応するオリゴヌクレオチドのセットを含有する組成物は、組換え基質として有用であり、そして本発明の特徴である。便宜のため、これらのフラグメント化された混合物、せん断された混合物、またはオリゴヌクレオチド合成混合物は、フラグメント化された核酸のセットとして言及される。
本発明はまた、インターフェロン−α活性（本発明の少なくとも１つの核酸に変異を導入することまたは本発明の少なくとも１つの核酸を組換えることにより産生される）を示すポリペプチドをコードする、単離された核酸または組換え核酸を提供する。
（ポリヌクレオチドの作製）
本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸フラグメントは、公知の合成方法に従って、標準的固相法で調製され得る。代表的には、約１００塩基までのフラグメントは、個々に合成され、その後、（例えば、酵素的連結法もしくは化学的連結法によって、またはポリメラーゼ媒介性組換え法によって）連結され、任意の所望の連続配列を基本的に形成する。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、古典的ホスホラミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９〜６９に記載の方法）、または、例えば、Ｍａｔｔｈｅｓら（１９８４）、ＥＭＢＯ Ｊ ３：８０１〜０５に記載の方法を用いて）化学合成により調製され得る（代表的には、自動合成法で実行される）。ホスホラミダイト法に従い、オリゴヌクレオチドが合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成され）、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター中に連結される。
さらに、基本的にどのポリヌクレオチドも、種々の市販の供給源（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）およびその他多数）のうち、任意の供給源から特別注文され得る。同様に、ペプチドおよび抗体は、種々の供給源（例えば、Ｃｅｌｔｅｋ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ）；Ｇｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎ ＣＯ）およびその他多数）のうち、任意の供給源から特別注文され得る。
本発明の特定のポリヌクレオチドはまた、インターフェロン−αポリペプチドおよびそれらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るかまたはＰＣＲ増幅し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリー（例えば、代表的な反復配列組換え法におけるような、相同核酸の組換えにより産生されるライブラリー）をスクリーニングすることによって取得され得る。ｃＤＮＡクローンのスクリーニングおよび単離の手順は、当業者に周知である。そのような技術は、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２巻，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）に記載されている。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、天然に存在する配列の変更（例えば、突然変異誘発、反復配列組換え（例えば、シャッフリング））、またはオリゴヌクレオチド組換えにより取得され得る。他の場合では、このようなポリヌクレオチドは、コンピュータ内でまたは本明細書に引用される参考文献に記載されるようなオリゴヌクレオチド組換え法を通して作製され得る。
本明細書にさらに詳細に記述のように、本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列、および少なくともストリンジェントな条件下で本明細書に規定される配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。コード配列とは、特定のポリペプチドまたは上記ポリペプチドのドメイン、領域、もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列をいう。コード配列は、上に記載のようにインターフェロン活性を示す本発明のポリペプチドをコードし得る。本発明のそのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態であり得るか、またはＤＮＡの形態であり得る。そして、本発明のそのポリヌクレオチドとしては、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ならびにｃＤＮＡが挙げられ得る。そのポリペプチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。そして一本鎖の場合、そのポリヌクレオチドは、コード鎖であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖、相補鎖）であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）単離物としての本発明のポリペプチドのコード配列、（ｉｉ）例えば、融合タンパク質、プレタンパク質、プレプロタンパク質などをコードするように、１つ以上の追加のコード配列と組み合わせた本発明のポリペプチドのコード配列、（ｉｉｉ）非コード配列（例えば、イントロン、制御エレメント（例えば、プロモーター（例えば、天然に存在するプロモーターまたは組換えプロモーターもしくはシャッフルプロモーター）、ターミネーターエレメント、または適切な宿主細胞中でのコード配列の発現に有効な５’および３’非翻訳領域）と組み合わせた本発明のポリペプチドのコード配列、ならびに／あるいは（ｉｖ）コード配列が異種遺伝子である、ベクター、細胞、宿主環境における本発明のポリペプチドのコード配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドはまた、代表的な核酸の組成処方物（当業者に知られているように、キャリア、緩衝液、アジュバント、賦形剤などを含む処方物を含む）との組み合わせで見出され得る。ポリヌクレオチドフラグメントは、代表的には少なくとも約２００ヌクレオチド塩基（例えば、少なくとも約２５０塩基、少なくとも約３００塩基、少なくとも約３５０塩基、少なくとも約４００塩基、少なくとも約４５０塩基、少なくとも約４６０塩基、少なくとも約４７０塩基、あるいはそれ以上の塩基）を含む。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチドフラグメントは、高ストリンジェントな条件下で本明細書に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、そして／または本明細書に記載の本発明のポリペプチドの特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
（改変コード配列）
当業者に理解され得るように、コード配列を改変し、特定の宿主中での発現を増大することは好都合であり得る。遺伝コードは、６４個の可能性のあるコドンに関して重複しているが、ほとんどの生物は、優先的にこれらのコドンのサブセットを用いる。ある種において最も頻繁に使用されるコドンは、最適コドンと考えられ、それほど頻繁に使用されないコドンは、まれに使用されるコドンまたは低使用のコドン（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９１），Ｇｅｎｅ １０５：６１〜７２を参照のこと）として分類される。宿主の好ましいコドン使用を反映するように、コドンは置換され得る。これは、「コドンの最適化」または「種コドン（ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｄｏｎ）の偏りについての制御」と呼ばれることのあるプロセスである。
例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む改変コード配列（例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．ら（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７〜５０８を参照のこと）が調製され得、翻訳速度を増加したり、または所望の特性（例えば、非最適化配列から産生された転写物と比較して、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生する。翻訳終止コドンはまた、宿主の優先度を反映するように改変され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにとって好ましい終止コドンおよび哺乳動物にとって好ましい終止コドンは、それぞれ、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物にとって好ましい終止コドンはＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは、終止コドンとしてＵＡＡを使うことを好む（Ｄａｌｐｈｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２１６〜２１８）。
本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のコード配列を種々の理由で変更するために、操作され得る。そしてその変更としては、その遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を改変する変更が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、変更は当該分野で周知の技術（例えば、新たな制限酵素部位を挿入するための部位指向性突然変異誘発、グリコシル化パターンを変更するための部位指向性突然変異誘発、結合基（例えば、ペグ化もしくは他の結合のための結合基）を導入または除去するための部位指向性突然変異誘発、コドンの優先度を変化させるための部位指向性突然変異誘発、スプライス部位を導入するための部位指向性突然変異誘発など）の技術を用いて導入され得る。
（サイレントバリエーション）
遺伝コードの縮重のために、非常に多くの機能的に同一の核酸は、任意の既定ペプチドをコードする。例えば、以下のコドン表（表５）は、コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧおよびＣＧＵの全てが、アミノ酸アルギニンをコードすることを示す。従って、アルギニンがコドンにより特定される核酸配列中の各々の部位において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなしに、上で記述された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸バリエーションは、「サイレントバリエーション」である。ＲＮＡ配列におけるＵが、ＤＮＡ配列のＴに対応することは理解されるべきである。
Figure 2008505985
 。
従って、遺伝コードの縮重により、本発明のポリペプチドをコードする多数の核酸配列が産生され得、これらのうちのいくつかは、本明細書で明確に開示される核酸配列に対して最小限の配列同一性を有し得るということは、当業者によって理解される。当業者は、核酸における各々のコドン（ＡＵＧおよびＵＧＣを除き、通常はそれぞれメチオニンおよびトリプトファンに対する唯一のコドンである）は、機能的に同じポリペプチドをコードするので、標準的技術により改変され得るということを理解する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された任意の配列において暗黙的（ｉｍｐｌｉｃｉｔ）である。本発明はまた、可能性のあるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによりなされ得る、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の、各々および全ての可能性のあるバリエーションを提供する。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に適用される場合、これらの組み合わせは、標準的トリプレット（コドン）遺伝子コード（例えば、表５に記載されているような）に従って作られる。本明細書のあらゆる核酸の、このようなすべてのバリエーションは、遺伝子コードと組み合わせた配列を考慮して、詳細に提供され、そして記述される。技術の１つは、本明細書に連挙された配列の、任意のサイレント置換を十分に生成し得る。
（ポリヌクレオチドの用途）
本発明のポリヌクレオチドには、種々の用途がある。これらの用途は、例えば、本発明のポリペプチドの組換え産生（すなわち、発現）（代表的には、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列を含むプラスミド発現ベクターの発現による）；治療剤として；予防薬として；診断用ツールとして；免疫原として；アジュバントとして；相補的核酸または部分的相補的核酸の存在についての診断プローブ（野生型インターフェロン−α核酸の検出を含む）；さらなる反応（例えば、新規改変体および／もしくは改善改変体を産生するための反復配列組換え反応または変異反応）の基質として、などである。
（ベクター、プロモーターおよび発現系）
本発明はまた、上で広く記述されたような核酸配列のうちの１つ以上を含む組換え構築物を含む。その構築物は、本発明の核酸配列が順方向または逆方向に挿入されているベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを含む。いくつかの場合、構築物はさらに調節配列（例えば、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む）を含む。適切なベクターおよびプロモーターの多数は、当業者に公知であり、そして市販されている。
本明細書で有用な分子生物学的技術（ベクターの使用、プロモーターの使用および他の多くの関連するトピックの使用が挙げられる）を記述する一般的な教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ（前出）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（前出），およびＡｂｓｕｂｅｌ（前出）が挙げられる。例えば、本発明の相同性核酸の産生については、インビトロ増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む）に通じた人に指示するために十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ（すべて前出）ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（「Ｉｎｎｎｉｓ」）；Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ ３６〜４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１〜９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４〜１８７８；Ｌｏｍｅｌｉら（１９８９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３５：１８２６〜１８３１；Ｌａｎｄｅｒｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７〜１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１〜２９４；Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０〜５６９；Ｂｅｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７〜１２２およびＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３〜５６４）が挙げられる。増幅された核酸をインビトロでクローニングする改良方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。大きな核酸をＰＣＲによって増幅する改良方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４〜６８５およびその中の参考文献に要約されている。その改良方法では、４０キロベース（ｋｂ）までのＰＣＮアンプリコンが産生される。当業者は、基本的にいかなるＲＮＡも、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、制限消化、ＰＣＲ増幅、および配列決定に適した二本鎖ＤＮＡへと変えられ得ることを理解する。Ａｕｓｕｂｅｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）を参照のこと。
本発明はまた、本発明のベクターを用いて形質導入された宿主細胞を提供し、組換え技術によって本発明のポリペプチドの産生を提供する。宿主細胞は、本発明のベクターを用いて、（例えば、形質導入されるか、形質転換されるかまたはトランスフェクトされ）遺伝的に操作される。そのベクターは、例えば、クローニングベクターであり得るか、または発現ベクターであり得る。そのベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または遺伝子を増幅するのに適切であるように改変された、従来の栄養培地で培養され得る。その培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現用に選択された宿主細胞に対して、以前用いられた条件であり、そしてその培養条件は、当業者に理解され、そして本明細書に引用された参考文献（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその参考文献を含む）において明白である。
本発明のポリペプチドはまた、非動物細胞（例えば、植物、酵母、真菌、細菌など）中で産生され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、例えば、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｎｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＮＹ）；Ａｔｌａｓ＆Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬにおいて見出される。
本発明のポリヌクレオチドおよびそのフラグメントは、ポリペプチド発現用の種々の発現用発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターには、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡの結合体由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス（ｆｏｗｌ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、仮性狂犬病ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス）およびその他多くのものの誘導体）が挙げられる。遺伝的物質を細胞中に形質導入する任意のベクター、および、複製が所望される場合には、適切な宿主中で複製可能でかつ生存可能なベクターが使用され得る。
発現ベクター中の核酸配列は、適切な転写制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍＲＮＡ合成を指令する。そのようなプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＬＴＲプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージλＰＬプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーター。その発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。そのベクターは、必要に応じて、発現を増幅するのに適切な配列（例えば、エンハンサー）を含む。さらに、その発現ベクターは、必要に応じて、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型上の特性（例えば、真核生物細胞培養物に対するジヒドロ葉酸還元酵素耐性もしくはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性）を提供する。
本発明のポリペプチドをコードする適切なＤＮＡ配列、および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換し、その宿主にそのポリペプチドを発現させるために使用され得る。適切な発現宿主の例としては、以下が挙げられる：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ＢＨＫ，ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。全ての細胞または細胞株が、本発明の機能的なポリペプチドおよびそのフラグメントを十分に産生し得る必要があるわけではないということが理解される；例えば、そのポリペプチドの抗原性フラグメントは、細菌発現系または他の発現系において産生され得る。本発明は、使用される宿主細胞に限定されない。
細菌系では、多くの発現ベクターが、そのポリペプチドおよびそのフラグメントの意図された用途に応じて選択され得る。例えば、大量のそのポリペプチドまたはそのフラグメントが、抗体の誘導に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。そのようなベクターとしては、配列をコードするヌクレオチドが、ベクター中にインフレームでアミノ末端メチオニンおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列と連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））が挙げられるが、これらに限定されない；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４；５５０３〜５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）；など。
同様に、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅにおいて、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α−因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多くのベクターが本発明のポリペプチドの産生のために使用され得る。総説として、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出），Ｂｅｒｇｅｒ（前出），およびＧｒａｎｔら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６〜５４４を参照のこと。
哺乳動物宿主細胞においては、多数の発現系（例えば、ウイルスベースの系）が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、必要に応じてコード配列が、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に連結され得る。ウイルスゲノムを、非必須なＥ１およびＥ３領域中に挿入することにより、感染宿主細胞中で本発明のポリペプチドを発現し得る、生存可能なウイルスを生じる（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３６５５〜３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）は、哺乳動物宿主細胞での発現を増大するために用いられる。宿主細胞、培地、発現系、および産生方法は、種々の哺乳動物インターフェロン−α（例えば、ヒトインターフェロン−α）のクローニングおよび発現について公知のものを含む。
（さらなる発現要素）
特定の開始シグナルは、本発明のポリヌクレオチドコード配列および／またはそのフラグメントの効率的な翻訳を補助し得る。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよびその隣接配列を含み得る。コード配列、コード配列の開始コドンおよび上流の配列が適切な発現ベクター中に挿入された場合、さらなる翻訳制御シグナルは、必要とされ得ない。しかし、コード配列（例えば、成熟タンパク質コード配列）またはその一部分のみが、挿入された場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性核酸転写制御シグナルが提供されねばならない。さらに、開始コドンは、挿入部分全体の転写を保証するために、正確なリーディングフレーム中に存在しなければならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、種々の起源を有し得、天然および合成の両方のものであり得る。発現効率は、使用中の細胞系に適したエンハンサーの含有により増大され得る。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ２０：１２５〜６２；およびＢｉｔｔｎｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６〜５４４を参照のこと）。
（分泌／局在化配列）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、分泌／局在化配列をコードする核酸にインフレームで融合され得、ポリペプチドの発現を所望の細胞コンパートメント、膜もしくは細胞小器官に標的化するか、またはポリペプチドの分泌を細胞膜周辺腔（に方向付けるか、）もしくは細胞培養培地中に方向付ける。そのような配列は当業者に公知であり、そのような配列として、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、細胞小器官標的化配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列、葉緑体輸送シグナル）、膜局在化／アンカー配列（例えば、終止トランスファー配列、ＧＰＩアンカー配列）などが挙げられる。
（発現宿主）
さらなる局面において、本発明は、上記の本発明の核酸、ベクターまたは他の構築物の任意のものを含有する宿主細胞に関する。その宿主細胞は、真核生物細胞（例えば、哺乳乳動物細胞、酵母細胞または植物細胞）であっても原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であってもよい。その構築物の宿主細胞中への導入は、インビボ、エキソビボまたはインビトロの方法について、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃もしくはワクチン銃、注射または他の一般的技術により達成され得る（例えば、Ｄａｖｉｓ、Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。
宿主細胞系統は、必要に応じて、挿入される配列の発現を調節する能力または発現タンパク質を所望の様式で処理する能力に関して選択される。このようなタンパク質の改変として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アシル化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後プロセシング（タンパク質の「プレ（ｐｒｅ）」形態または「プレプロ（ｐｒｅｐｒｏ）」形態を切断する）はまた、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。種々の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，酵母または哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８など））は、そのような翻訳後の活性について、特異的細胞性機構および特徴的機序を有しており、そして導入される外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。
安定な発現は、組換えタンパク質の、長期で多産の生産のために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、形質導入される。そのベクターの導入に続いて、細胞は、１日〜２日間にわたって富化培地中で増殖され、その後、選択培地に切り替えられ得る。選択可能なマーカーの目的は、選択への耐性を与えることであり、そして選択可能マーカーの存在は、導入される配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。例えば、安定に形質転換された細胞の耐性集塊は、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖され得る。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、必要に応じて、コードされたタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下で、培養される。組換え細胞により産生されたポリペプチドは、使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌されるか、膜に結合されるか、または細胞内に含まれ得る。当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、成熟ポリペプチドの、原核生物細胞または真核生物細胞の膜を通しての分泌を指向するシグナル配列で設計され得る。
（追加配列）
本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて、インフレームでマーカー配列（例えば、コードされたポリペプチドの精製および／または検出を促進する）に融合されたコード配列を含む。そのような精製部分配列には、金属キレートペプチド（例えば、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール）、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ延長／親和性精製系において使用されるＦＬＡＧエピトープなどが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインとポリペプチド配列との間の、プロテアーゼ−切断可能ポリペプチドリンカー配列の含有は、精製を促進するのに有用である。
例えば、本明細書に記載の組成物および方法において使用可能な１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位から分離されたポリヒスチジン領域に融合された本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。そのヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー、Ｐｏｒａｔｈら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３：２６３〜２８１に記載のように）による精製を促進する。一方、そのエンテロキナーゼ切断部位は、所望のポリペプチドをポリヒスチジン領域から分離する方法を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、必要に応じて、外来ペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合物の場合には、グルタチオン−アガロース）に対する吸着、次いで遊離リガンドの存在下での抽出により溶解した細胞から容易に精製され得る。
本明細書に記載の組成物および方法のさらなる構築物は、タンパク質およびそれらをコードする核酸を提供する。この構築物は、例えば、本明細書に記載のように、Ｉｇ分子（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ（「結晶化可能なフラグメント」つまりフラグメント補体結合）ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列）に融合された本発明のポリペプチド（または１つ以上のそのフラグメント）とを含む。Ｆｃは、細胞上の抗体レセプターおよび補体のＣ１ｑ成分への結合を担う、抗体の一部である。これらの融合タンパク質またはそのフラグメントおよびそれらをコードする核酸は、必要に応じて、予防薬物および／もしくは治療薬物として、または診断用具として、有用である（また、例えば、Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ，Ｐ．ら（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３４１９〜３４２６；Ｓｔｕｒｍｈｏｅｆｅｌ，Ｋ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：４９６４〜４９７２を参照のこと）。
（ポリペプチド産生および回収）
適切な宿主株の形質導入および宿主株の適切な細胞密度までの増殖に続き、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度変更または化学的誘導）により誘導される。そして細胞は、さらなる期間培養される。細胞は、代表的には、遠心分離により回収され、機械的手段または化学的手段により崩壊され、そしてその結果生じた粗製抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に使用される真核生物細胞または細菌細胞は、任意の便利な方法（凍結融解循環、超音波処理、機械的崩壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または当業者に周知の他の方法）により崩壊され得る。
記述のように、多くの細胞（細菌細胞、植物細胞、動物（特に哺乳動物）および古細菌系（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｒｉｇｉｎ）を含む）の培養および産生に関する多くの参考文献が、入手可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ，およびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）、ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびこの文献中に引用されている参考文献；ＤｏｙｌｅおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９） Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第４版 Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；およびＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら．（１９８９） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５：１０１６−１０２４を参照のこと。植物細胞培養および再生については、例えば、Ｐａｙｎｅら．（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３） Ｒ．Ｒ．Ｄ．Ｃｒｏｙ （編） Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．ＩＳＢＮ ０ １２ １９８３７０ ６を参照のこと。細胞培養培地は、一般に、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬに示される。細胞培養のためのさらなる情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）ならびに例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＰｌａｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅおよび別冊（「Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ」）などのような入手可能な商業用印刷物において見出される。
本発明のポリペプチドは、組換え細胞培養物から当該分野で周知の多くの方法のうちの任意の方法（硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載のタッギングシステムの任意のものの使用）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）により、回収ならびに精製され得る。タンパク質の再フォールディング工程は、所望の場合、成熟タンパク質またはそのフラグメントの立体配置を完成させる際に使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終精製工程において使用され得る。記述された参考文献（前出）に加えて、種々の精製方法（例えば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら．（１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版 Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 第３版 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版 Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；ならびにＷａｌｋｅｒ（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪに記載されているものを含む）は、当該分野で周知である。
（インビトロ発現系）
無細胞転写／翻訳系がまた、本発明のポリヌクレオチドを用いて本発明のポリペプチドを生成するために使用され得る。いくつかのこのような系は、市販されている。インビトロでの転写および翻訳のプロトコルに対する一般的なガイドは、Ｔｙｍｍｓ（１９９５） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹにおいて見出される。
（インビボでの使用および適用）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは、このポリヌクレオチドの相補体（例えば、アンチセンスまたはリボザイム分子を含む）は、必要に応じて細胞に投与されて、治療的に有用なプロセスを達成するか、または、治療的に有用な生成物を発現する。これらのインビボでの適用（遺伝子治療を含む）は、遺伝子発現が細胞において変更され得る多数の技術を含む。このような方法としては、例えば、本発明のポリペプチドのような治療的および／または予防的に有用なポリペプチドの発現のための遺伝子の導入が挙げられる。
（インビボでのポリペプチド発現）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の技術を用いるインビボ治療適用に特に有用である。例えば、培養細胞を、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および／または、例えば、少なくとも１種の抗原、サイトカイン、他の同時刺激分子、アジュバントなどをコードする他のポリヌクレオチド配列を用いて、エキソビボで加工され、加工された細胞が次いで、患者にもどされる。細胞はまた、インビボで、本発明のポリペプチドおよび／または抗原性ペプチドを含む、１種以上のポリペプチドの発現のために、インビボで加工され得る。
生物体のインビボでの形質導入および発現のために適切な多数のウイルスベクターが公知である。このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：１−２４；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｕｒｇ（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５８１−５９９を参照のこと）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９において総説されている）が挙げられる。使用される他のウイルスベクターとしては、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１：５１−６４；Ｌａｔｃｈｍａｎ（１９９４）Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２：１７９−１９５；およびＪｏｈａｎｎｉｎｇら（１９９５）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：１４９５−１５０１に一般的に記載されているような、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびシンドビスウイルスベクターが挙げられる。
一局面において、ポックスウイルスベクターが使用され得る。ポックスウイルスベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされ、そして、予防的適用、治療的適用および診断的適用において有用であり、ここで、免疫応答の増強（例えば、Ｔ細胞増殖の増加または改善）が望ましい。例えば、Ｂｅｒｅｎｃｓｉら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２００１）１８３（８）：１１７１−９；Ｒｏｓｅｎｗｉｒｔｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００１ Ｆｅｂ ８；１９（１３−１４）：１６６１−７０；Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６４ （８）：４２０４−１１；Ｂｒｏｗｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ ７（１９）：１６８０−９；Ｋａｎｅｓａ−ｔｈａｓａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１９（４−５）：４８３−９１；Ｓｔｅｎ（２０００）Ｄｒｕｇ ６０（２）：２４９−７１で議論されているウイルスベクターを参照のこと。このようなベクターおよび受容可能な賦形剤を含む組成物がまた、本発明の特徴である。
遺伝子治療および遺伝的ワクチンは、慢性感染性疾患（例えば、ＨＩＶ感染症、ウイルス性肝炎）、ならびに、非感染性疾患（癌および酵素不全のような先天性の欠損のいくつかの形態）を治療するための方法を提供し、そして、このような方法は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、このようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞）と共に用いされ得る。核酸およびベクターを細胞内に導入するためのいくつかのアプローチが、インビボ、エキソビボおよびインビトロで用いられており、本発明のポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドを含むベクターと共に用いられ得る。これらのアプローチは、リポソームベースの遺伝子送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３）ＷＯ ９３／２４６４０ならびに米国特許第５，６４１，６６２号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ，米国特許第号５，２７９，８３３；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１４；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ４：２０６−２０９；ならびにＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５）；アデノウイルスベクター媒介性の遺伝子送達（例えば、癌を処置するため（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７；Ｔｏｎｇら（１９９６）Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ６１：１７５−１７９；Ｃｌａｙｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１−６；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：１０８０−１０８５；Ｈｗａｎｇら（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３：７−１６；Ｈａｄｄａｄａら（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５（Ｐｔ．３）：２９７−３０６；Ａｄｄｉｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：８５２２−８５２６；Ｃｏｌａｋら（１９９５）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ６９１：７６−８２；Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０；Ｅｌｓｈａｍｉら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：１４１−１４８；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ８５：６４８−６５４を参照のこと）などを含む。特に、単純ＭｕＬＶベクターに関して、レトロウイルスゲノムの一部として治療的ポリヌクレオチド配列を有する複製欠損型レトロウイルスベクターがまた用いられる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：４２３９（１９９０）；Ｋｏｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ ＮＩＨ Ｒｅｓ ４：４３およびＣｏｒｎｅｔｔａら（１９９１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２：２１５）を参照のこと。リガンド特異的なカチオンベースの輸送系に結合した核酸輸送（ＷｕおよびＷｕ（１９８８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６３：１４６２１−１４６２４）がまた用いられる。裸のＤＮＡ発現ベクターがまた記載されている（Ｎａｂｅｌら（１９９０），前出）；Ｗｏｌｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）。一般に、これらのアプローチは、本発明のポリペプチドをコードする核酸を適切なベクターに組み込むことによって本発明に適合され得る。
本発明の核酸を患者に導入することによって本発明に適合され得る遺伝子治療プロトコルを記載する、一般的な文書としては、例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪおよびＪｏｙｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄが挙げられる。
（アンチセンス技術）
遺伝子置換核酸としての本発明の核酸の発現に加えて、この核酸はまた、例えば、核酸の発現がもはや細胞内で所望でない場合に、本発明の核酸の発現をダウンレギュレートするための、発現のセンスおよびアンチセンスの抑制に有用である。同様に、本発明の核酸、または、そのサブ配列もしくはアンチセンス配列もまた用いて、天然に存在する相同な核酸の発現をブロックし得る。種々のセンスおよびアンチセンスが当該分野で公知であり、例えば、ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＮｅｌｌｅｎ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＥｎｇｌａｎｄならびにＡｇｒａｗａｌ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ、ならびに、これらに引用される参考文献に示されている。
（プローブとしての使用）
また意図されるのは、ポリヌクレオチドの使用であり、このポリヌクレオチドは、本明細書中でオリゴヌクレオチドとも呼ばれ、代表的に、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも２０塩基、少なくとも３０塩基、もしくは少なくとも５０塩基、またはそれ以上の塩基を有し、高度にストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントにハイブリダイズする。このポリヌクレオチドは、上記のような方法に従って、プローブ、プライマー、センス因子およびアンチセンス因子などとして使用され得る。
（核酸ハイブリダイゼーション）
核酸は、代表的には溶液中で、これらが会合しているときに「ハイブリダイズ」している。核酸は、水素結合、溶媒除去、塩基スタッキングなどのような種々の十分に特徴付けられた物理化学的な力によってハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対するさらなるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（本明細書中以後「Ｔｊｉｓｓｅｎ」）ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，前出、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ １）に見出され、そして、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ２）は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出および定量についての詳細を提供する。
２つの核酸配列が実質的に同一であるという指標は、２つの分子が、少なくともストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。句「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が、複雑な混合（例えば、総細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下での、特定のヌクレオチド配列のみに対する１つの分子の結合、二重鎖化またはハイブリダイゼーションをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させて、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成し得る、わずかなミスマッチを含む。
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノザンハイブリダイゼーション）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対するさらなるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）前出ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ １ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ２，前出に見出される。
本発明の目的のためには、一般に、「高度にストリンジェント」なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が選択されて、これらは、所望のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される（以下に記載されるように、高度にストリンジェントな条件はまた、比較用語で言及され得る）。Ｔｍは、（所望のイオン強度およびｐＨ下で）５０％の試験配列が、好ましくはマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。言い換えると、Ｔｍは、核酸二重鎖が所定の条件下で５０％変性している温度を意味し、これは、核酸ハイブリッドの安定性の直接的な指標を表す。従って、Ｔｍは、ヘリックスからランダムコイルへの変遷の中間点に対応する温度に対応し；これは、ヌクレオチドの長いストレッチについての長さ、ヌクレオチドの組成およびイオン強度に依存する。代表的には、「ストリンジェントな条件」下で、プローブは、その標的サブ配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。「非常にストリンジェントな条件」とは、特定のプローブに対するＴｍに等しくなるように選択される。
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない核酸物質が、一連の洗浄により除去され得、そのストリンジェンシーは、所望の結果に依存して調節され得る。低いストリンジェンシーの洗浄条件（例えば、高塩濃度および低温を用いる）は、感度を高めるが、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生じ得る。より高いストリンジェンシーの条件（例えば、低塩濃度およびハイブリダイゼーション温度に近い高温を用いる）は、代表的には特異的なシグナルのみを残したまま、バックグラウンドシグナルを低下させる。Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）（本明細書中、以下「ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ」）（これらは、その全体が、あらゆる目的のために本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下の等式（１）を用いて推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ
ここで、Ｍは、単価カチオン（通常はＮａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）は、グアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）は、ホルムアミドの割合であり、そして、ｎは、ハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ，前出を参照のこと。
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下の等式（２）を用いて推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−１１．８（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ
ここで、Ｍは一価カチオン（通常はＮａ＋）であり、（％Ｇ＋Ｃ）は、グアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）は、ホルムアミドの割合であり、そして、ｎは、ハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。Ｉｄ。上記の等式１および２は、代表的に、約１００〜２００ヌクレオチドより長いハイブリッド二重鎖についてのみ正確である。同書。
５０ヌクレオチドより短い核酸配列のＴｍは、以下のように算出され得る：
Ｔｍ（℃）＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
ここで、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）およびＧは、対応するヌクレオチドの数である。
サザンブロットまたはノザンブロットにおける、フィルター上に１００以上の相補的な残渣を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃にて、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ ホルマリン（またはホルムアミド）であり、ハイブリダイゼーションは、一晩行なわれる。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ前出を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシーの洗浄が、低ストリンジェンシーの洗浄に先立ち、バックグラウンドプローブシグナルを除く。低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃にて１５分間の２×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーの洗浄条件の例は、７２℃にて約１５分間の０．１５Ｍ ＮａＣｌである。例えば、１００ヌクレオチド以上の二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、４５℃にて１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００ヌクレオチド以上の二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃にて１５分間の４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件は、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３にて、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオンの塩濃度、代表的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）を含み、温度は代表的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成され得る。
一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されるものの２×または２．５×〜５×（これ以上）の信号雑音比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の文脈における、２つの配列間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に提供される本発明の核酸に対する比較的強い構造類似性または相同性を示す。
上記のように、「高度にストリンジェント」な条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。目的のヌクレオチド配列（例えば、プローブ）に近いか、または、同一な標的配列は、高ストリンジェンシーな条件下で同定され得る。より低いストリンジェンシー条件は、あまり相補的でない配列に適している。例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（全て前出）を参照のこと。
比較ハイブリダイゼーションを用いて、本発明の核酸を同定し得、そして、この比較ハイブリダイゼーション法は、本発明の核酸を識別する好ましい方法である。本発明の文脈における２つのヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に提供される核酸に対する、比較的強い構造類似性／または相同性を示す。２つのヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件により検出されるものよりも高い、構造、ヌクレオチド塩基組成、配列または順序の類似性もしくは相同性の程度を示す。特に、本発明の文脈における高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に提供される核酸に対して、強力な構造類似性または構造相同性（例えば、ヌクレオチド構造、塩基組成、配列または順序）を示す。例えば、ストリンジェントな条件下で、本明細書中の例示的な核酸にハイブリダイズする試験核酸を同定することが望ましい。
従って、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの１つの指標は、本発明の列挙される核酸（例えば、配列番号１６〜３０の核酸配列、および、これらの相補的なポリヌクレオチド配列）のうちの１つに、高度にストリンジェントな条件下で（または、非常にストリンジェントな条件下、または超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、もしくは、超−超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で）、ハイブリダイズする能力である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、高度なストリンジェント、超高度なストリンジェンシー、または、超−超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を含む）および洗浄条件は、任意の試験核酸について、容易に実験的に決定され得る。
例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を決定する際に、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、選択された一連の判定基準が満たされるまで、（例えば、温度を増加させること、塩濃度を減少させること、界面活性剤の濃度を増加させること、および／またはハイブリダイゼーションまたは洗浄中の有機溶媒（例えば、ホルマリン）の濃度を増加させることによって）次第に増加される。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、配列番号１６〜３０から選択される１つ以上の核酸配列およびその相補的なポリヌクレオチド配列を含むプローブが、マッチしていない標的に対するプローブのハイブリダイゼーションについて観察されたものに対して少なくとも２．５×、そして必要に応じて、５×以上の信号対雑音比で、完全にマッチした相補的標的（再度、配列番号１６〜３０から選択される１つ以上の核酸配列およびその相補的なポリヌクレオチド配列）に結合するまで、次第に増加される。この場合、マッチしていない標的は、例えば、公知のインターフェロン核酸配列（例えば、本出願の出願時に、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧＥＮＥＳＥＱのような公的データベース中に存在するインターフェロン核酸配列）に対応する核酸である。
試験核酸は、完全にマッチした相補的な標的に、少なくともプローブに対して１／２ハイブリダイズする場合に、すなわち、完全にマッチするプローブが、完全にマッチする相補的標的に、マッチしていない標的核酸（例えば、上記のような公知のインターフェロン−α核酸）のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されるものの、少なくとも約２．５×〜１０×、代表的には、５×〜１０×の信号対雑音比で結合する条件下での標的に対するプローブのハイブリダイゼーションの、少なくとも１／２の信号対雑音比でハイブリダイズする場合に、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言われる。このような核酸のいくつかについて、ストリンジェントな条件は、コードオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、上記のような公知のインターフェロン−α配列に対応するコントロール核酸完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについてのものの、少なくとも約５×高い信号対雑音比でハイブリダイズするように選択される。
超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、完全にマッチした相補的な標的核酸に対するプローブの結合についての信号対雑音比が、マッチしていない標的核酸（例えば、上記のような公知のインターフェロン−α核酸）のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されたものの、少なくとも１０×高くなるまで、増加される。このような条件下で、完全にマッチした相補的標的核酸のものの少なくとも１／２の信号対雑音比でハイブリダイズする標的核酸は、超高度なストリンジェンシー条件下でプローブに結合すると言われる。
同様に、なお高いレベルのストリンジェンシーが、関連するハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を次第に増加させることによって決定され得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーは、完全にマッチした相補的標的核酸に対するプローブの結合についての信号対雑音比が、マッチしていない標的核酸（例えば、上記のような公知のインターフェロンα核酸）に対するハイブリダイゼーションについて観察されたものの、少なくとも１０×、２０×、５０×、１００×または５００×になるまで、増加される。このような条件下で、完全にマッチした相補的標的核酸のものの少なくとも１／２の信号対雑音比でハイブリダイズする標的核酸は、超−超高度なストリンジェンシーの条件下でプローブに結合すると言われる。
超高度な、および超−超高度なストリンジェンシーの条件下で、配列番号１６〜３０により表される核酸にハイブリダイズする標的核酸が、本発明の１つの特徴である。このような核酸の例としては、所定の核酸配列と比較して、１または２〜３のサイレントもしくは保存的な核酸置換を有する核酸が挙げられる。
（配列組換えのための基質および形式）
本発明のポリヌクレオチドおよびそのフラグメントは、必要に応じて、種々の組換えおよび再帰的な配列組換え反応のいずれかのための基質として使用され、さらに、例えば、所望の特性を有するポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドを生成するために、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋに示されるような標準的なクローニング法で種々の組換えおよび再帰的な配列組換え反応を使用するために使用される。種々のそのような反応は公知であり、本発明者らおよびその共同研究者らによって開発された方法を含む。
本明細書に記載される１つ以上の特性を有する分子を生成および同定するためのプロトコルを生成する種々の多様性が利用可能であり、当該分野で記載されている。これらの手順は、別個に、および／または組み合わされて使用されて、１つ以上の核酸の改変体または核酸のセット、ならびにコードされたタンパク質の改変体が生成され得る。個々にそして集合的に、これらの手順は、例えば、新しくかつ／または改善された特徴を有する核酸、タンパク質、経路、細胞および／または生物を操作するかまたは迅速に進化させるために有用な、多様化された核酸および核酸のセット（例えば、核酸ライブラリーが挙げられる）を生成する強力で広範に利用可能な方法を提供する。区別および分類は明瞭さのために次の議論の中でなされるが、これらの技術が多くの場合相互に排他的ではないことが理解される。実際に、種々の方法が、多様な配列改変体を入手するために、単独でまたは組み合わせて、同時にまたは連続して使用され得る。
本明細書で記載される多様性を生成する手順のいずれかの結果は、１つ以上の核酸の生成であり得、これらの核酸は、望ましい特性を有するかもしくは望ましい特性を与える核酸、または望ましい特性を有するかもしくは望ましい特性を与えるタンパク質をコードする核酸について選択またはスクリーニングされ得る。本明細書の１つ以上の方法または当業者に利用可能な他の方法による多様化の後、生成された任意の核酸が所望の活性もしくは特性（例えば、インターフェロンαレセプターに対する変化した結合親和性、変化した抗ウイルス活性もしくは抗増殖活性、ＴＨ１分化を誘導する変化した能力、サイトカイン産生を誘導もしくは阻害する変化した能力）について選択され得る。これは、例えば、自動化されたもしくは自動化可能な形式で、当該分野におけるアッセイならびにこの節および以下の実施例の節で議論される本発明のアッセイのうちのいずれかによって検出し得る任意の活性を同定することを含み得る。種々の関連する特性（または関連しない特性さえも）が、実施者の判断により同時にまたは連続して評価され得る。
本明細書に記載されるようなポリペプチドをコードする改変された核酸配列を生成するための種々の多様性を生成する方法の説明は、以下の公報およびその中で引用される参考文献に見出される：Ｓｏｏｎｇ，Ｎら（２０００）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５（４）：４３６−４３９；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４：１−４；Ｎｅｓｓら（１９９９）「ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇら（１９９９）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７９３−７９７；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら（１９９７）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎら（１９９７）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓら（１９９６）「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ａ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ’ｈｅａｄｐｉｅｃｅ ｄｉｍｅｒ’」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９６）「Ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ」Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ｐｐ．４４７−４５７；ＣｒａｍｅｒｉおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｒｅａｔｅｓ ａｌｌ ｔｈｅ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１９４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐａｃｅ」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；ならびにＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１。
用語「シャッフリング」は、同一でない配列間の組換え示すために本明細書で使用され、いくつかの例では、シャッフリングは、相同組換えまたは非相同組換え（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔ系）による交差を包含し得る。シャッフリングは、種々様々な形式（例えば、インビトロシャッフリング形式およびインビボシャッフリング形式、コンピュータ内での（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）シャッフリング形式、二本鎖もしくは一本鎖テンプレートのいずれかを用いるシャッフリング形式、プライマーベースのシャッフリング形式、核酸の断片化ベースのシャッフリング形式ならびにオリゴヌクレオチド媒介性シャッフリング形式（これらのすべては同一でない配列間の組換え事象に基づき、本明細書で以下により詳細に記載されるかまたは参照される）、ならびに他の類似の組換えベースの形式が挙げられる）を使用することによって行われ得る。
多様性を生成する変異方法としては、例えば、部位指向性の変異誘発（Ｌｉｎｇら（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５４（２）：１５７−１７８；Ｄａｌｅら（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２３７：１−７；およびＫｕｎｋｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ． ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））；ウラシルを含むテンプレートを用いる変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４，３６７−３８２；およびＢａｓｓら（１９８８）「Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５）；オリゴヌクレオチド指向性の変異誘発（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８−５００；およびＺｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９８７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−３５０）；ホスホロチオエート改変型ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｙ−Ｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７９１−８０２；およびＳａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８０３−８１４）；ギャップ二重鎖ＤＮＡを用いる変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ」１５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒら（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７２０７；およびＦｒｉｔｚら（１９８８）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：６９８７−６９９９）が挙げられる。
さらなる適切な方法としては、ポイントミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７），修復不全の宿主株を用いる変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：４４３１−４４４３；およびＣａｒｔｅｒ（１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３８２−４０３），欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８６）「Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：５１１５），制限選択および制限増殖（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｐｈｉｌ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ａ ３１７：４１５−４２３），全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら（１９８４）「Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ（１９８８）「Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）」Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６３６１−６３７２；Ｗｅｌｌｓら（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ」Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒoｍら（１９８５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：３３０５−３３１６），二本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１；ならびにＡｒｎｏｌｄ（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５）が挙げられる。上記方法の多くについてのさらなる詳細は、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４におけるＭｅｔｈｏｄｓに見出され得、これはまた、種々の変異誘発方法に伴うトラブルシューティングの問題についての有用な調節を記載する。
る。
種々の多様性を生成する方法に関連するさらなる詳細は、以下の米国特許、ＰＣＴ公報およびＰＣＴ出願、ならびにＥＰＯ公報に見出され得る：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日），「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２２日）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年１１月３日），「ＤＮＡ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０日）「Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；Ｍｉｎｓｈｕｌｌらに対する米国特許第５，８３７，４５８号（１９９８年１１月１７日），「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＷＯ ９５／２２６２５，ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉ，「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚによるＷＯ ９６／３３２０７「Ｅｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＷＯ ９７／２００７８「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ９７／３５９６６「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１４０２「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１３８３「Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１３６９「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ ９９／４１３６８「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＥＰ ７５２００８「ＤＮＡ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；ＳｔｅｍｍｅｒによるＥＰ ０９３２６７０「Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ Ｕｐｔａｋｅ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ ９９／２３１０７「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＡｐｔらによるＷＯ ９９／２１９７９「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ」；ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ ９８／３１８３７「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ９８／２７２３０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ ９８／２７２３０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、ＷＯ ００／００６３２，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ ００／０９６７９，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ ９８／４２８３２「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｎｄｏｍ ｏｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ ９９／２９９０２「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＶｉｎｄによるＷＯ ９８／４１６５３「Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」、ＢｏｒｃｈｅｒｔらによるＷＯ ９８／４１６２２「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、ならびにＰａｔｉおよびＺａｒｌｉｎｇによるＷＯ ９８／４２７２７「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＰａｔｔｅｎらによるＷＯ ００／１８９０６「Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ Ｇｅｎｅｓ」；ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ ００／０４１９０「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ ００／４２５６１「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ ００／４２５６０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ＷｅｌｃｈらによるＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ならびにＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」。
配列改変方法（例えば、変異、組換えなど）のうちの数種の異なる一般的なクラスは、本発明に利用可能であり、例えば、上および以下に示される。以下は、本発明の文脈において多様性を生成するために好ましい形式（例えば、特定の組換えベースの多様性生成形式）のうちの様々な型のいくつかを例示する。
核酸は、上の参考文献で議論される種々の技術（例えば、組換えられるべき核酸のＤＮＡｓｅ消化、その後の核酸の連結および／またはＰＣＲ再構築）のいずれかによってインビトロで組換えられ得る。例えば、性的ＰＣＲ変異誘発が、インビトロで、ＤＮＡ分子と異なるが関連するＤＮＡ配列との間で、配列類似性に基づいて、そのＤＮＡ分子のランダムな（または疑似的にランダムな、あるいはランダムでない）断片化が組換えに続く場合に使用され得、その後ポリメラーゼ伸長反応によって交差が固定される。このプロセスおよび多くのプロセスの改変形が上の参考文献のうちの数個（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１）に記載されている。
同様に、核酸は、インビボで、例えば、細胞中の核酸間で組換えが起こるようにすることによって、再帰的に組換えられ得る。多くのそのようなインビボ組換え形式は、上に示される参考文献に示される。そのような形式は、他の形式と同様に、必要に応じて、目的の核酸間の直接的な組換えを提供するか、または目的の核酸を含むベクター、ウイルス、プラスミドなどの間の組換えを提供する。そのような手順に関連する詳細は、上に示される参考文献に見出される。
全ゲノム組換え方法はまた、細胞または他の生物の全ゲノムが組換えられる場合に使用され得、必要に応じて、所望のライブラリー成分（例えば、本発明の経路に対応する遺伝子）を含むゲノム組換え混合物をスパイクする工程を包含する。これらの方法は、多くの適用（標的遺伝子の同一性がわからないものが挙げられる）を有する。そのような方法の詳細は、例えば、ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ ９８／３１８３７「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；」および例えば、ｄｅｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＰＣＴ／ＵＳ９９／１５９７２（これもまた「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」という表題である）に見いだされる。
合成組換え方法もまた、目的の標的に対応するオリゴヌクレオチド（１つより多くの親核酸に対応するオリゴヌクレオチドが挙げられる）が合成されＰＣＲ反応もしくは連結反応で再構築され、それによって新しい組換え核酸が生成される場合に使用され得る。オリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド付加方法によって作製され得るか、または例えば、トリヌクレオチド合成アプローチによって作製され得る。そのようなアプローチに関連する詳細は、上に示される参考文献に見出され、例えば、ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ ００／４２５６１「Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＷｅｌｃｈらによるＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ ００／４２５６０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」が挙げられる。
コンピュータ内での組換え方法は、相同な（または非相同な）核酸に対応する配列の束（ｓｔｒｉｎｇ）を組換えるために遺伝的アルゴリズムが使用される場合に行われ得る。得られる組換え配列の束は、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝子再構築技術と合わせてその組換え配列に対応する核酸を合成することによって、核酸に変換される。このアプローチは、ランダムな変異体、部分的にランダムな改変体、または設計された改変体を生成し得る。コンピュータ内での組換え、ならびに設計された疑似的にランダムな組換え方法もしくは設計されたランダムな組換え方法に関連する多くの詳細（対応する核酸（および／またはタンパク質）の生成、ならびに（例えば、交差部位選択に基づいて）設計された核酸および／またはタンパク質と合わせて、コンピュータシステムにおける遺伝的アルゴリズム、遺伝的オペレータの使用が挙げられる）は、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ ００／４２５６０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ ００／４２５５９「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」に記載されている。コンピュータ内での組換えに関連する広範な詳細は、これらの出願に見出される。この方法論は、一般的に、コンピュータ内での分子の組換えを提供することおよび／または対応する核酸もしくはタンパク質の生成において、本発明に適用可能である。
例えば、多様な核酸もしくは核酸フラグメントを一本鎖テンプレートにハイブリダイズさせ、その後重合および／または連結して全長配列を再生成し、その後必要に応じてテンプレートを分解し、そして得られた改変型核酸を回収することによって、天然の多様性を得る多くの方法が同様に使用され得る。一本鎖テンプレートを使用する一方法において、ゲノムライブラリーに由来するフラグメント集団が、反対の鎖に対応する一部のまたは多くの場合ほぼ全長のｓｓＤＮＡもしくはＲＮＡにアニーリングされる。次いで、この集団からの複合キメラ遺伝子の構築が、ハイブリダイズしていないフラグメント末端のヌクレアーゼベースの除去、このようなフラグメント間のギャップを埋めるための重合、そしてその後の一本鎖連結によって媒介される。親ポリヌクレオチド鎖は、消化（例えば、ＲＮＡまたはウラシルを含む場合）、変性条件下での磁気的分離（このような分離を助長する様式で標識されている場合）および他の利用可能な分離／精製方法によって除去され得る。あるいは、親鎖は、必要に応じて、キメラ鎖と同時に精製され、その後のスクリーニング工程およびプロセシング工程の間に除去される。このアプローチに関連するさらなる詳細は、例えば、Ａｆｆｈｏｌｔｅｒによる「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」ＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５に見出される。
別のアプローチにおいて、一本鎖分子は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換され、そしてそのｄｓＤＮＡ分子はリガンド媒介性結合によって固体支持体に結合される。結合していないＤＮＡの分離後、選択されたＤＮＡ分子がその支持体から離され、適切な宿主細胞に導入されてプローブにハイブリダイズする配列が豊富なライブラリーが生成される。この様式で生成されたライブラリーは、本明細書に記載される手順のいずれかを用いるさらなる多様化のために望ましい基質を提供する。
上記の一般的な組換え形式のいずれかは、反復様式（例えば、変異／組換えまたは他の多様性生成方法、、必要に応じてその後の１以上の選択方法の１回以上のサイクル）で実行されて、より多様な組換え核酸のセットが生成され得る。
ポリヌクレオチド連鎖停止方法を使用する変異誘発もまた、提案されており（例えば、Ｓｈｏｒｔに対する米国特許第５，９６５，４０８号，「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、および上記の参考文献を参照のこと）、本発明に適用され得る。このアプローチにおいて、配列類似性の領域を共有する１つ以上の遺伝子に対応する二本鎖ＤＮＡが、その遺伝子に特異的なプライマーの存在下または非存在下で、結合および変性される。次いで、一本鎖ポリヌクレオチドがアニーリングされ、ポリメラーゼおよび連鎖停止試薬（例えば、紫外線照射、γ線照射もしくはＸ線照射；エチジウムブロミドまたは他のインターカレーター；ＤＮＡに結合するタンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質、転写活性因子、またはヒストン）；多環式芳香族炭化水素；三価クロムまたは三価クロム塩；あるいは迅速な熱サイクルによって媒介される短縮重合など）の存在下でインキュベートされ、部分的に二重鎖の分子が生成される。次いで、この部分的に二重鎖の分子（例えば、部分的に伸長した鎖を含む）は、変性され、そしてその後の複製もしくは部分的複製のラウンドで再アニーリングされ、種々の程度の配列類似性を共有し、始めのＤＮＡ分子の集団に対して多様化されたポリヌクレオチドが得られる。必要に応じて、生成物または生成物の部分的プールが、プロセスの１つ以上の段階で増幅され得る。上記のような連鎖停止方法によって生成されるポリヌクレオチドは、任意の他の組換え形式の適切な基質である。
多様性はまた、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５に記載される「ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ」（「ＩＴＣＨＹ」）と称される組換え手順を用いて、核酸もしくは核酸の集団において生成され得る。このアプローチは、必要に応じて１つ以上のインビトロ組換え方法またはインビボ組換え方法の基質として役立ち得る最初の改変体のライブラリーを生成するために使用され得る。また、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９６：３５６２−６７；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、（１９９９），「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照されたい。
個々のヌクレオチドまたは隣接するヌクレオチドの群もしくは隣接していないヌクレオチドの群の変化を生じる変異方法は、ヌクレオチド多様性を導入するために好んで使用され得る。多くの変異誘発方法は、上に引用される参考文献に見出される；変異誘発方法に関連するさらなる詳細は、以下に見出され得、これらもまた本発明に適用され得る。例えば、誤りがちのＰＣＲが核酸改変体を生成するために使用され得る。この技術を用いて、高い割合の点変異がＰＣＲ産物の全長にわたって得られるようなＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下で、ＰＣＲが行われる。このような技術の例は、上記の参考文献（例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５およびＣａｌｄｗｅｌｌら（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：２８−３３）に見出される。同様に、アセンブリＰＣＲが、小さいＤＮＡフラグメントの混合物からのＰＣＲ産物の構築に関するプロセスで使用され得る。多くの様々なＰＣＲ反応が、同じ反応混合物で並行して起こり得、１つの反応の産物が別の反応の産物をプライミングする。
オリゴヌクレオチド指向性変異誘発は、目的の核酸配列に部位特異的変異を導入するために使用され得る。そのような技術の例は、上記の参考文献および例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５３−５７に見出される。同様に、カセット変異誘発は、二本鎖ＤＮＡ分子の小さい領域を天然配列と異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置き換えるプロセスで、使用され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、完全にランダム化された天然配列および／または部分的にランダム化された天然配列を含み得る。
再帰的アンサンブル変異誘発は、表現型が関連する変異体の多様な集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を生成するためにタンパク質変異誘発のためのアルゴリズムが使用されるプロセスである。この方法は、コンビナトリアルカセット変異誘発の成功したラウンドをモニタリングするためにフィードバック機構を使用する。このアプローチの例は、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５に見出される。指数関数的アンサンブル変異誘発は、高いパーセンテージの独特かつ機能的な変異体を含むコンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。目的の配列中の残基の小集団が、各々の変更した位置が、機能性タンパク質をもたらすアミノ酸を同定するために並行してランダム化される。そのような手順の例は、ＤｅｌｅｇｒａｖｅおよびＹｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：１５４８−１５５２にある。
インビボ変異誘発は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株において１つ以上のＤＮＡ修復経路において変異をもたらすＤＮＡを増殖させることによって、目的の任意のクローン化ＤＮＡにおいてランダム変異を生成するために使用され得る。これらの「変異誘発」株は、野生型の親のランダム変異割合よりも高いランダム変異割合を有する。これらの株の１つにおいてＤＮＡを増殖させることは、最終的に、そのＤＮＡ内にランダム変異を生成する。そのような手順は、上に示される参考文献に記載されている。
ゲノム（例えば、細菌ゲノム、真菌ゲノム、動物ゲノムまたは植物ゲノム）に多様性を導入するための他の手順は、上記および／または参照される方法と併せて使用され得る。例えば、上記の方法に加えて、種々の種を形質転換するために適切な核酸マルチマーを産生する技術が提案されている（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ 米国特許第５，７５６，３１６号および上記の参考文献を参照のこと）。そのようなマルチマー（互いに一致しない遺伝子（例えば、天然の多様性に由来するかまたは部位指向性変異誘発、誤りがちなＰＣＲ、変異原性細菌株の通過などの適用による）からなる）を用いる適切な宿主の形質転換は、例えば、上記のようなインビボ組換えプロセスによって、ＤＮＡ多様化のための核酸多様性の供給源を提供する。
あるいは、部分的な配列類似性の領域を共有するモノマーポリヌクレオチドの多重度は、宿主種に転換され、宿主細胞によってインビボで再結合され得る。その後の細胞分裂のラウンドは、ライブラリー（そのメンバーは、単一の相同な集団またはモノマーポリヌクレオチドのプールを含む）を生成するために使用され得る。あるいは、モノマー核酸が標準的な技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはクローンニング）によって回収され、上記のような組換え形式のいずれか（再帰的組換え形式が挙げられる）で再結合され得る。
多種発現ライブラリーを生成するための方法が記載されており（上に示される参考文献に加えて、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９８）米国特許第５，７８３，４３１号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥＬ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳ，」およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）米国特許第５，８２４，４８５号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥＬ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳ」を参照のこと）、そして目的のタンパク質活性を同定するためのそれらの使用が提案されている（上に示される参考文献に加えて、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９５８，６７２号「ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＣＬＯＮＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＮＡ ＦＲＯＭ ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」を参照のこと）。多種発現ライブラリーとしては、一般的に、発現カセット中で適切な制御配列に作動可能に連結された複数の種もしくは株に由来するｃＤＮＡ配列またはゲノム配列を含むライブラリーが挙げられる。このｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列は、必要に応じて、多様性をさらに高めるためにランダムに連結される。ベクターは、宿主生物（例えば、細菌種、真核細胞）の１つよりも多い種での形質転換および発現のために適切なシャトルベクターであり得る。いくつかの場合において、ライブラリーは、目的のタンパク質をコードする配列または目的の核酸にハイブリダイズする配列を予め選択することによって偏りをもたされる。任意のそのようなライブラリーは、本明細書に記載される方法のいずれかのための基質として提供され得る。
上記の手順は、大部分は、核酸および／コードされるタンパク質の多様性を増大させることに向いている。しかし、多くの場合、多様性だけが有用であるとは限らず、例えば、機能性が有用であり、わずかな望ましい改変体を同定するためにスクリーニングもしくは選択されるべき改変体のバックグラウンドを単に増大させることに寄与する。いくつかの適用において、例えば、組換えベースの変異誘発手順によって、または他の場合には機能性産物をコードする核酸に対して基質に偏りをかけるように、多様化の前に、ライブラリー（例えば、増幅したライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、標準型ライブラリーなど）または他の基質核酸を予め選択または予めスクリーニングすることが望ましい。例えば、抗体操作の場合、記載した方法のいずれかによる操作の前に、インビボ組換え事象を利用することによって、機能性抗原結合部位を有する抗体に対して多様性生成プロセスに偏りをかけることが可能である。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーに由来する再結合されたＣＤＲは、本明細書に記載される方法のいずれかにしたがって多様化される前に、増幅されフレームワーク領域に再構築され得る（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔら（１９９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒｍｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ａ ｍａｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ ２１５：４７１）。
ライブラリーは、望ましい酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸に対して偏りをかけられ得る。例えば、特定の活性を示すライブラリーからクローンを同定した後、そのクローンは、ＤＮＡ改変を導入するための任意の公知の方法を用いて変異誘発され得る。次いで、変異誘発された相同体を含むライブラリーは、所望の活性（これは、最初に特定された活性と同じかまたは異なり得る）についてスクリーニングされる。そのような手順の例は、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９３９，２５０号「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＥＮＺＹＭＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ ＢＹ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ」に提案されている。所望の活性は、当該分野で公知の任意の方法によって同定され得る。例えば、ＷＯ ９９／１０５３９は、遺伝子ライブラリーに由来する抽出物を代謝的に豊富な細胞から得られた成分と合わせ、所望の活性を示す組み合わせを同定することによってスクリーニングされ得る遺伝子ライブラリーを提案する。また、（例えば、ＷＯ ９８／５８０８５によって）生物活性な基質をライブラリーのサンプルに挿入し、蛍光分析器（例えば、フローサイトメトリーデバイス、ＣＣＤ、蛍光光度計または分光光度計）を用いて本明細書に記載されるような所望の活性の産物に対応する生物活性の蛍光を検出することによって同定され得る、所望の活性を有するクローンが提案されている。
ライブラリーはまた、特定の特徴（選択された核酸プローブに対するハイブリダイゼーション）を有する核酸に対して偏りをかけられ得る。例えば、ＷＯ ９９／１０５３９の出願は、所望の活性（例えば、酵素活性、例えば：リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、またはアシラーゼ）をコードするポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡ配列の中から以下の様式で同定され得ることを提案する。ゲノムＤＮＡの集団に由来する一本鎖ＤＮＡ分子は、リガンドに結合したプローブにハイブリダイズされる。ゲノムＤＮＡは、培養された微生物もしくは培養されていない微生物、または環境サンプルのいずれかに由来し得る。あるいは、ゲノムＤＮＡは、多細胞生物またはそれに由来する組織に由来し得る。第２の鎖合成は、捕捉媒体から事前に離してもしくは事前に離さずに、捕捉で使用したハイブリダイゼーションプローブから直接、または当該分野で公知の他の広範なストラテジーによって行われ得る。あるいは、単離された一本鎖ゲノムＤＮＡ集団は、さらにクローニングすることなく断片化され、直接、例えば、上記のような一本鎖テンプレートを使用する組換えベースのアプローチで使用され得る。
核酸およびポリペプチドを生成する「非確率論的な」方法が、Ｓｈｏｒｔ「Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＷＯ ００／４６３４４で主張される。これらの方法（提案された非確率論的なポリヌクレオチド再構築および部位飽和変異誘発が挙げられる）は、同様に本発明に適用される。ドープオリゴヌクレオチドもしくは変性オリゴヌクレオチドを用いるランダム変異誘発またはセミランダム変異誘発もまた、例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０８：５６４−８６； ＬｉｍおよびＳａｕｅｒ（１９９１）「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ「Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９：３５９−７６；ＢｒｅｙｅｒおよびＳａｕｅｒ（１９８９）「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５１Ｆ ｔｏ ｌａｍｂｄａ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１３３５５−６０）；ならびに「Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」（Ｃｒｅａ，Ｒ；米国特許第５，８３０，６５０号および同第５，７９８，２０８号、および欧州特許 ０５２７８０９号Ｂ１に記載される。
多様化の前にライブラリーを富化するために適切な上記の技術のいずれかが、多様性を生成する方法によって生成された産物、または産物のライブラリーをスクリーニングするためにも使用され得ることが容易に理解される。
変異誘発、ライブラリー構成および他の多様性生成方法のためのキットもまた、市販されている。例えば、キットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ 部位指向性変異誘発キット；およびＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ 二本鎖部位指向性変異誘発キット），Ｂｉｏ／Ｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば、上記のＫｕｎｋｅｌ法を用いる），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、５ プライム ３ プライムキット）； Ｇｅｎｐａｋ Ｉｎｃ，Ｌｅｍａｒｇｏ Ｉｎｃ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ（例えば、上記のＥｃｋｓｔｅｉｎ法を用いる），ならびにＡｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ（例えば、上記のＣａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ法を用いる）から入手される。
上記の参考文献は、多くの変異形式（組換え、再帰的組換え、再帰的変異および他の変異形式を用いる組み合わせまたは組換え、ならびにこれらの形式の多くの改変形が挙げられる）を提供する。使用される多様性生成形式にかかわらず、本発明の核酸は、組換え核酸の多様なセット（例えば、相同核酸、および対応するポリペプチドのセットが挙げられる）を生成するために（互いに、または関連する（あるいは関連しない）配列で）組換えられ得る。
上記の形式のいずれかを単独でまたは組み合わせて用いて本発明の１つ以上のポリヌクレオチド配列を１つ以上のさらなる核酸で組換えることによって生成される組換え核酸はまた、本発明の一部を形成する。１つ以上のさらなる核酸は、本発明の別のポリヌクレオチドを含み得る；必要に応じて、あるいは、またはさらに、１つ以上の核酸は、例えば、天然に存在するインターフェロンαもしくはそのサブシーケンス、または任意の相同インターフェロンαもしくはそのサブシーケンス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の利用可能な文献で見出されるようなもの）をコードする核酸、あるいは例えば、任意の他の相同核酸もしくは非相同核酸またはそのフラグメントを含み得る（上に示される特定の組換え形式、特に合成的またはコンピュータ内で行われる形式は、組換えに対する相同性を必要としない）。
（治療的用途）
種々のインターフェロン−αポリペプチドおよびインターフェロン−α結合体が認可されており、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、ヘアリーセル白血病、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、尖圭コンジローム、ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、基底細胞癌、多発性骨髄腫、類癌腫、膀胱癌、クローン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腎細胞癌、多発性硬化症、およびＡＩＤＳのようなウイルス疾患または状態の処置のために臨床開発中である。したがって、本発明は、インターフェロンαポリペプチドおよび／またはインターフェロンα結合体に関連する疾患または状態（例えば、上記の状態、あるいは本発明のポリペプチドまたは結合体に関連する任意の他の疾患または状態）を処置するために、本発明の１つ以上のポリペプチドまたは結合体を含む組成物の使用を企図する。
（ウイルス感染およびウイルス感染に関連した状態の処置）
一局面において、本発明は、ウイルスに感染した患者を処置する方法を提供し、この方法は、その患者に、その被験体におけるウイルスレベルを減少させるために、および／またはこのウイルス感染と関連した症状もしくは状態を改善するために有効な量の、本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明の処置方法について企図される例示的なウイルス感染としては、フラビウイルス科のウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスおよびウシウイルス性下痢ウイルス）による感染；ヘパドナウイルス科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）による感染；ピコルナウイルス科のウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）による感染；レトロウイルス科のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、シミアン免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス）による感染；コロナウイルス科のウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス）による感染；ラブドウイルス科のウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）による感染、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、ＲＳウイルスおよびパラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス科のウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス）による感染、およびヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス）による感染が挙げられるが、これらに限定されない。
以下は、例示的なウイルス感染ならびにこのような感染と関連した疾患および状態の、本発明のポリペプチドおよび結合体を用いる処置のための非限定的な例（本発明のポリペプチドおよび結合体のための示唆される投与スケジュールおよびこのような処置の有効性をモニターするアプローチが挙げられる）を提供する。他のウイルス感染ならびにウイルス感染と関連した疾患および状態の処置のための本発明のポリペプチドおよび結合体の投与スケジュール、ならびにこのような処置の有効性をモニターするアプローチは、当業者によって確かめられ得る。
（Ｃ型肝炎ウイルス）
一局面において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者を処置する方法を提供し、この方法は、その患者に、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体を含む、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＣＶに感染した患者を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。ＨＣＶに感染していると診断された患者は、血液中のＨＣＶ ＲＮＡを示し、そして／または血清中に抗ＨＣＶ抗体を示す患者を含む。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、臨床用に認可されたインターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ、組換え型；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、組換え型；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（インターフェロンαｃｏｎ−１；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、一般に、ＨＣＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量および頻度で投与される。慢性ＨＣＶの処置のためのＲＯＦＥＲＯＮまたはＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、１週間に３回皮下注射による３００万ＩＵ（約１５μｇ（ｍｃｇ））である。慢性ＨＣＶの処置のためのＩＮＦＥＲＧＥＮの例示的な推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、１週間に３回皮下注射による９ｍｃｇである。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、そのポリペプチドは、上記よりも低用量（例えば、約２ｍｃｇ、３ｍｃｇ、４ｍｃｇ、５ｍｃｇ、６ｍｃｇ、７ｍｃｇ、または８ｍｃｇ）および／または低頻度（例えば、１週間に１回または１週間に２回）で投与され得る。
同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、臨床用に認可されたインターフェロン−α結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）またはＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ｂ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用するＨＣＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量または頻度で投与される。慢性ＨＣＶの処置のためのＰＥＧＡＳＹＳの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、１週間に１回の皮下注射による１８０ｍｃｇである。多くの要因（本発明の結合体の分子量、活性、および薬物動態、ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、その結合体は、上記よりも低い量（例えば、約２５ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、７５ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２５ｍｃｇ、または１５０ｍｃｇ）および／または低頻度（例えば、１０日毎に１回、または２週間毎に１回）で投与され得る。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドまたは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。例えば、本発明のポリペプチドまたは結合体は、抗ウイルス薬物（例えば、リバビリン（これは、名称ＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ）およびＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の下で販売されている）と組み合わせて投与され得る。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質（例えば、処置されるＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型））、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させ得るはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
処置の有効性は、ウイルス負荷を測定することによって、例えば、当該分野で公知の方法を使用して、血清または血漿中のウイルスの力価またはレベルを決定することによって（例えば、定量的ＰＣＲベースの試験（例えば、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＨＣＶ Ｔｅｓｔ，ｖ２．０またはＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＣＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ，ｖ２．０（ともに、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから）を用いてウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって）決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置前のウイルス負荷（通常、慢性ＨＣＶ患者について、１０５〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／ｍｌの範囲である）と比較して、少なくとも２ｌｏｇ単位、少なくとも３ｌｏｇ単位、少なくとも４ｌｏｇ単位、少なくとも５ｌｏｇ単位、少なくとも６ｌｏｇ単位または少なくとも７ｌｏｇ単位、処置期間にわたってウイルス負荷の減少を達成するために十分な量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベル（例えば、約５００コピー／ｍｌ血清未満または約１００コピー／ｍｌ血清未満）までウイルス負荷を減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＣＶに感染した患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少する方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＣＶ ＲＮＡレベルと比較して、ＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりに、または加えて、ＨＣＶ感染と関連した状態（例えば、肝臓損傷）を示すパラメータを測定することによって、決定され得る。例えば、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルは、標準的アッセイを使用して測定され得る。一般に、約５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）血清未満のＡＬＴレベルは、正常であるとみなされる。より高いＡＬＴレベルは、進行している肝臓損傷の指標であり得る。いくつかの場合において、有効量の本発明の組成物は、正常ＡＬＴレベルより高い患者におけるＡＬＴレベルを、約５０ＩＵ／ｍｌの血清未満に低下させるに有効な量である。従って、本発明は、５０ＩＵ／ｍｌより高い初期ＡＬＴレベルを示す、ＨＣＶに感染した患者の血清ＡＬＴレベルを低下させる方法を包含し、この方法は、約５０ＩＵ／ｍｌ未満にＡＬＴレベルを低下するに有効な量の本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
（ヒト免疫不全ウイルス）
別の局面において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）に感染した患者、またはＨＩＶ感染と関連した疾患もしくは状態（例えば、ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫）を処置する方法を提供し、この方法は、その患者に、１種以上の本発明のポリペプチドもしくは結合体を、必要に応じて、下記の他の抗ウイルス治療剤と合わせて含む、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＩＶに感染した患者またはＨＩＶ感染と関連する疾患もしくは状態を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１種以上の本発明のポリペプチドもしくは結合体、および薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含む。ＨＩＶに感染していると診断された患者は、血液中でＨＩＶ ＲＮＡまたはプロウイルスＤＮＡの検出可能なレベルを示す、かつ／または血清中で検出可能なレベルのｐ２４抗原もしくは抗ＨＩＶ抗体を示す患者を包含する。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、一般に、インターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ、組換え；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ，組換え；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（インターフェロンαｃｏｎ−１；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．）を用いるＨＩＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の投与量および頻度において投与される。上記のように、慢性ＨＣＶの処置のためのＲＯＦＥＲＯＮもしくはＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的な推奨される投与スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたって、皮下注射により、３００万ＩＵ（約１５μｇ（ｍｃｇ））を１週間に３回である。そして慢性ＨＣＶの処置のためのＩＮＦＥＲＧＥＮの例示的な推奨される投与スケジュールは、例えば、２４〜４８時間にわたって、皮下注射により、１週間に３回、９ｍｃｇである。ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫の処置のためのＲＯＦＥＲＯＮの例示的な推奨される投与スケジュールは、１０〜１２週間にわたって、１日に３６００万単位、次いで、１週間に３回、３６００万単位である。ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫の処置のためのＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的な推奨される投与スケジュールは、皮下投与される、１週間に３回の３０００万ＩＵ／ｍ２である。このような投与スケジュールは、ＨＩＶまたはＨＩＶ感染と関連した疾患もしくは状態の処置のための、本発明のポリペプチドの投与量についての有用な範囲を提供する。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態、ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、本発明のポリペプチドは、上記より低い量で、および／または低い頻度で投与され得る。
同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、インターフェロン−α結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）もしくはＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ｂ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用するＨＩＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の投与量および頻度で投与される。ＨＩＶの処置のためのＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮの例示的な投与スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたって、皮下注射によって、約１．０ｍｃｇ／ｋｇ／週〜３．０ｍｃｇ／ｋｇ／週の間である。このような投与スケジュールは、ＨＩＶの処置のための、本発明の結合体の投与量についての有用な範囲を提供する。多くの要因（本発明の結合体の分子量、活性および薬物動態、ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、この結合体は、上記より低い量で（例えば、約０．１、０．２５、０．５０、もしくは０．７５ｍｃｇ／ｋｇ／週）、および／または低い頻度で（例えば、１０日毎に１回、２週間毎に１回）投与され得る。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドもしくは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。ヒトにおけるＨＩＶ−１感染の現在の臨床処置は、高活性抗レトロウイルス療法（「ＨＡＡＲＴ」）と一般によばれる多剤併用療法を含む。本発明のポリペプチドもしくは結合体は、従って、ＨＡＡＲＴまたは他の抗ウイルス治療化合物と組み合わせて投与され得る。ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（「ＮＲＴＩ」）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（「ＮＮＲＴＩ」）およびＨＩＶプロテアーゼインヒビター（「ＰＩ」）の種々の組み合わせを包含する、ＨＡＡＲＴ代表的な成分は、例えば、Ａ．Ｍ．Ｖａｎｄａｍｍｅら（１９９８） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，９：１８７−２０３；「Ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒ Ｖｏｌ．３９（１０１５発行） Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ５，１９９７，１１１−１１６頁；発行された米国特許出願第２００２０１８２１７９ Ａ１号に記載される；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。ＨＩＶ感染患者が、ＨＣＶにも感染している場合、本発明のポリペプチドまたは結合体は、ＨＡＡＲＴと一緒に、リバビリン（これは、ＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ）およびＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の名称の下で販売されている）のような抗ウイルス剤と組み合わせて、投与され得る。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与、ならびにＨＡＡＲＴおよび／もしくはリバビリンのようなさらなる治療剤の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質（例えば、処置されるＨＣＶのようなさらなるウイルス感染の存在））、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させ得るはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
上記の一般的な用途に加えて、本発明のポリペプチドもしくは結合体は、ＨＩＶに感染した患者の以下のサブセットに：例えば、上記のＨＡＡＲＴに対する補助療法として；ウイルス負荷が一般的に高い場合の初期段階の患者における単独療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）もしくは併用療法として；意図的治療中断（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎｓ；ＳＴＩ）または「薬物休止（ｄｒｕｇ ｈｏｌｉｄａｙ）」を受けている患者について併用される抗ウイルス剤および免疫調節剤として；ＨＡＡＲＴ選択肢が制限されている患者における救助療法として；ＨＡＡＲＴ耐性ウイルスの出現を遅らせるために、ＨＡＡＲＴ療法を開始しないでウイルス負荷を抑えるための抗ウイルス処置法として。投与され得る。
処置の有効性は、ウイルス負荷を、例えば、当該分野で公知の方法を用いて血清もしくは血漿中のウイルスのレベルもしくは力価を測定することによって（例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲベースの試験（例えば、ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＩＶ−１ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標） Ｔｅｓｔ，ｖ１．５（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって）決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置の前のウイルス負荷と比較すると、処置の過程にわたって、少なくとも０．５ｌｏｇ単位、少なくとも１ｌｏｇ単位、少なくとも２ｌｏｇ単位、少なくとも３ｌｏｇ単位、少なくとも４ｌｏｇ単位、少なくとも５ｌｏｇ単位、少なくとも６ｌｏｇ単位、少なくとも７ｌｏｇ単位まで、ウイルス負荷の減少を達成するに十分な量である。いくつかの場合、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベル（例えば、約５０〜１００コピー ＨＩＶ−１ ＲＮＡ／ｍｌ血清未満）までウイルス負荷を減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＩＶに感染した患者の血清中のＨＩＶ ＲＮＡのレベルを減少する方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＩＶ ＲＮＡレベルと比較して、ＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりにまたはさらに、ＨＩＶレプリコンについての血清マーカー（例えば、血清中のＨＩＶ ｐ２４抗原の存在）によって決定され得る。いくつかの場合、本発明の組成物の有効量は、処置の開始前に存在するレベルの５０％、２５％、１０％もしくは５％にまで、血液中のｐ２４抗原のレベルを減少させるに十分である量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベルにまでｐ２４のレベルを減少させるために十分な量である。本発明は、ＨＩＶに感染した患者の血清中のｐ２４抗原レベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するｐ２４抗原レベルと比較して、ｐ２４抗原のレベルを減少させるために有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
（Ｂ型肝炎ウイルス）
別の局面において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者を処置する方法を提供し、この方法は、その患者に、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体を含む本発明の組成物の有効量を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＢＶに感染した患者を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１以上の本発明のポリペプチドまたは結合体および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。
ＨＢＶに感染したと診断される患者は、血清中に、検出可能なＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を示す。慢性ＨＢＶ感染は、「複製」または「非複製」のいずれかとしてさらに分類される。複製感染において、その患者は、通常、ウイルスＤＮＡおよび検出可能なＨＢｅＡｇの比較的高い血清濃度を有し、このＨＢｅＡｇは、高いウイルス複製の条件下で合成されるＨＢＶプレコア遺伝子の選択的プロセシングタンパク質である。しかし、そのプレコア遺伝子において変異を有する稀なＨＢＶ株において、複製感染は、検出可能な血清ＨＢｅＡｇの非存在下で起こり得る。慢性Ｂ型肝炎および複製感染を有する患者は、一般に、より悪い予後を有し、かつＨＢｅＡｇなしのものよりも、肝硬変および／または肝細胞癌種を発症する可能性が高い。非複製感染において、肝臓におけるウイルス複製の速度は低く、血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度は、一般に低く、かつ肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は検出されない。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、一般に、臨床用に認可されたインターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロン−２ｂ、組換え；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＨＢＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量および頻度で投与される。成体の慢性ＨＢＶの処置のためのＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的に推奨される投薬スケジュールは、１６週間にわたる、５００万ＩＵ／日（ｑｄ）または１週間に３回（ｔｉｗ）の１０００万ＩＵ／日である。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、本発明のポリペプチドは、上記よりも低い量（例えば、１週間あたり約５００万ＩＵ、１０００万ＩＵ、１５００万ＩＵ、２０００万ＩＵ、または２５００万ＩＵ）および／または低頻度（例えば、１週間に１回または１週間に２回）で投与され得る。
同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、現在臨床試験を行っているインターフェロン−α結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）を使用するＨＢＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量または頻度で投与される。慢性ＨＢＶの処置のためのＰＥＧＡＳＹＳの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４週間にわたる、１週間に１回の注射による９０ｍｃｇ〜２７０ｍｃｇである。多くの要因（本発明の結合体の分子量、活性、および薬物動態、ならびに患者の大きさおよび健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、その結合体は、上記よりも低い量（例えば、約２５ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、７５ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２５ｍｃｇ、または１５０ｍｃｇ）および／または低頻度（例えば、１０日毎に１回、または２週間毎に１回）で投与され得る。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドまたは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。例えば、本発明のポリペプチドまたは結合体は、抗ウイルス薬物（例えば、ラミブジン（３ＴＣとしても知られる）（これは、名称Ｅｐｉｖｉｒ−ＨＢＶ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）の下で販売されている）またはアデフォビルジピボキシル（これは、名称Ｈｅｐｓｅｒａ（登録商標）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の下で販売されている））と組み合わせて投与され得る。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質（例えば、慢性Ｂ型肝炎の場合、感染が複製か被覆性か）、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させ得るはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
処置の有効性は、ウイルス負荷を測定することによって、例えば、当該分野で公知の方法を使用して、血清または血漿中のウイルスの力価またはレベルを決定することによって（例えば、定量的ＰＣＲベースの試験（例えば、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＨＣＶ Ｔｅｓｔ，ｖ２．０またはＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＣＶ ＭＯＮＩＴＯＲ（登録商標）Ｔｅｓｔ，ｖ２．０（ともに、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから）を用いてウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって）決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、ウイルスＤＮＡを、例えば、約５００，０００コピー／ｍｌ血清未満または約１００，０００コピー／ｍｌ血清未満または約１０，０００コピー／ｍｌ血清未満に、あるいは本質的に検出不能であるレベル（例えば、約１０００コピー／ｍｌ血清未満、約５００コピー／ｍｌ血清未満、約２００コピー／ｍｌ血清未満）に減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢＶ ＤＮＡのレベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＢＶ ＤＮＡレベルと比較して、ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりに、または加えて、ＨＢＶ複製のための他の血清マーカー（例えば、ＨＢｅＡｇ）を測定することにより決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置の開始前に存在するレベルの５０％、２５％、１０％もしくは５％にまで、血清中のＨＢｅＡｇのレベルを減少させるに十分である量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、ＨＢｅＡｇのレベルを本質的に検出不能であるレベルに減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢｅＡｇのレベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始間に存在するＨＢｅＡｇレベルと比較して、ＨＢｅＡｇのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
上記で議論されるように、ＨＢＶ感染を示す別の血清マーカーは、ＨＢｓＡｇである。従って、その処置の有効性は、代わりに、または加えて、血清中のＨＢｓＡｇのレベルを測定することにより決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置の開始前に存在するレベルの５０％、２５％、１０％もしくは５％にまで、血清中のＨＢｅＡｇのレベルを減少させるに十分である量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、ＨＢｓＡｇのレベルを本質的に検出不能であるレベルに減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢｓＡｇのレベルを減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始間に存在するＨＢｓＡｇレベルと比較して、ＨＢｓＡｇのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
その処置の有効性は、代わりに、または加えて、ＨＢＶ感染と関連した状態（例えば、肝臓損傷）を示すパラメータを測定することによって、決定され得る。例えば、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルは、標準的アッセイを使用して測定され得る。一般に、約５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）血清未満のＡＬＴレベルは、正常であるとみなされる。より高いＡＬＴレベルは、進行している肝臓損傷の指標であり得る。いくつかの場合において、有効量の本発明の組成物は、正常ＡＬＴレベルより高い患者におけるＡＬＴレベルを、約５０ＩＵ／ｍｌの血清未満に低下させるに有効な量である。従って、本発明は、５０ＩＵ／ｍｌより高い初期ＡＬＴレベルを示す、ＨＢＶに感染した患者の血清ＡＬＴレベルを低下させる方法を包含し、この方法は、約５０ＩＵ／ｍｌ未満にＡＬＴレベルを低下させるに有効な量の本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
（ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型）
別の局面において、本発明は、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１））に感染した患者、またはＨＴＬＶ−１感染と関連する疾患もしくは状態（例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー（ＨＡＭ）、局所的痙性対麻痺（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｐａｓｔｉｃ Ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ（ＴＳＰ））、ブドウ膜炎、もしくは関節症）を処置する方法を提供する。この方法は、その患者に、１種以上の本発明のポリペプチドもしくは結合体を含む、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＴＬＶ−１に感染した患者、またはＨＴＬＶ−１感染と関連する疾患もしくは状態を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１種以上の本発明のポリペプチドもしくは結合体、および薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含む。ＨＴＬＶ−１感染を有すると診断された患者は、血液中でＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡおよび／または血清中でＨＴＬＶ−１抗原に対する抗体を示す患者を含む。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、一般に、臨床的に認可されているインターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ，組換え；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）およびＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ，組換え；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用するＨＣＶ治療レジメンもしくは腫瘍学治療レジメンにおいて使用されるものに類似の投与量および頻度において投与される。慢性ＨＣＶの処置のためのＲＯＦＥＲＯＮもしくはＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的な推奨される投与スケジュールは、例えば、２４〜４８週間にわたる、皮下注射による、１週間に３回の３００万ＩＵ（約１５マイクログラム（ｍｃｇ））である。ヘアリーセル白血病の処置のためのＲＯＦＥＲＯＮの例示的な推奨さえる投与スケジュールは、１６〜２４週間にわたる皮下注射による１日に３００万〜５００万単位、次いで、維持のための１週間に３回の３００万単位である。ヘアリーセル白血病の処置のためのＩＮＴＲＯＮ Ａの例示的な推奨さえる投与スケジュールは、６ヶ月にわたる１週間に３回皮下に投与される２００万ＩＵ／ｍ２（体表の平方メートル）である。このような投与スケジュールは、ＨＴＬＶ−１感染、またはＨＴＬＶ−１感染と関連する疾患もしくは状態（例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー（ＨＡＭ）、局所的痙性対麻痺（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｐａｓｔｉｃ Ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ（ＴＳＰ））の処置のための、本発明のポリペプチドの投与量の有用な範囲を提供する。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態、ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、そのポリペプチドは、上記よりも低い量および／または低頻度で投与され得る。
同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、現在臨床的に認可されたインターフェロン−α結合体（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）を使用するＨＣＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の用量または頻度で投与される。慢性ＨＣＶの処置のためのＰＥＧＡＳＹＳの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、２４週間にわたる、１週間に１回の皮下注射による１８０ｍｃｇである。慢性骨髄性白血病の処置のためのＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮの例示的に推奨される投薬スケジュールは、例えば、５２週間にわたる、皮下注射による１週間に１回の６ｍｃｇ／ｋｇ体重である。このような投与スケジュールは、ＨＴＬＶ−１感染またはＨＴＬＶ−１感染と関連する疾患もしくは状態（例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー（ＨＡＭ）、局所的痙性対麻痺（Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｐａｓｔｉｃ Ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ（ＴＳＰ））の処置のための、本発明の結合体の投与量の有用な範囲を提供する。多くの要因（本発明の結合体の分子量、活性および薬物動態、ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、その結合体は、上記よりも低い量および／または低頻度で投与され得る。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドまたは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。例えば、本発明のポリペプチドまたは結合体は、抗ウイルス薬物（例えば、ジドブジン（ＡＺＴ）および／またはラミブジン（３ＴＣ）と組み合わせて投与され得る。本発明のポリペプチドまたは結合体はまた、末梢血幹細胞移植、従来の化学療法、または自己もしくは同種異系の骨髄移植を伴う高用量化学療法と組み合わせて、投与され得る。あるいは、本発明のポリペプチドまたは結合体は、他の免疫療法と、例えば、抗インターロイキン−２レセプターモノクローナル抗体またはウイルス抗原に対して施行される細胞傷害性Ｔ細胞の注射と組み合わせられ得る。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させ得るはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
処置の有効性は、ＨＴＬＶ−１ウイルス負荷を測定することによって、例えば、当該分野で公知の方法（例えば、定量的ＰＣＲベースの試験（例えば、Ｓａｉｔｏら，（２００４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１８９（１）：２９−４０により記載される）を使用して、血液中のＨＴＬＶ−１ウイルスのレベルを測定することによって決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置の前のウイルス負荷と比較すると、処置の過程にわたって、少なくとも０．５ｌｏｇ単位、少なくとも１ｌｏｇ単位、少なくとも２ｌｏｇ単位、少なくとも３ｌｏｇ単位、少なくとも４ｌｏｇ単位、少なくとも５ｌｏｇ単位、少なくとも６ｌｏｇ単位、少なくとも７ｌｏｇ単位まで、ウイルス負荷の減少を達成するに十分な量である。いくつかの場合、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベルまでウイルス負荷を減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＴＬＶ−１に感染した患者の血液中のＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡのレベルを減少する方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡレベルと比較して、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりに、または加えて、血清中の抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を、当該分野で公知の方法を用いて（例えば、 ｓｕｃｈ ａｓ ＩＮＮＯ−ＬＩＡＴＭ ＨＴＬＶ Ｉ／ＩＩ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｇｅｎｔ Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＡｂｂｏｔｔ ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩ ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）のような市販の試験によって）測定することによって、決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置の開始前に存在する力価の５０％、２５％、１０％もしくは５％にまで、血清中の抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を減少させるに十分である量である。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を本質的に検出不能であるレベルに減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＴＬＶ−１に感染した患者の血清中の抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始間に存在する抗ＨＴＬＶ−１抗体力価と比較して、抗ＨＴＬＶ−１抗体力価を減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
（ヒトパピローマウイルス）
別の局面において、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者、またはＨＰＶ感染と関連する疾患もしくは状態（例えば、手および足のいぼ、または口腔、肛門および生殖器の粘膜の病変）を処置する方法を提供する。いくつかの型のＨＰＶは、比較的無害であるが、他の型は、性的接触を通じて拡がり、生殖器いぼおよび性病いぼ（尖圭コンジロームといわれる）を生じ、これらは、子宮頚癌および他の生殖器の癌を生じ得る。この方法は、ＨＰＶに感染した患者に、１種以上の本発明のポリペプチドもしくは結合体を含む、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明はまた、ＨＰＶに感染した患者、またはＨＰＶ感染と関連する疾患もしくは状態を処置することにおいて使用するための組成物を提供し、この組成物は、１種以上の本発明のポリペプチドもしくは結合体、および薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含む。ＨＰＶ感染を有すると診断された患者は、生検した組織（例えば、生殖器組織）中でＨＰＶウイルスＤＮＡを示す患者、および例えば生殖器組織上の目に見える病変を示す患者を含む。
本発明のポリペプチドを含む組成物は、一般に、臨床的に認可されているインターフェロン−αポリペプチド（例えば、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ，組換え；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用するＨＰＶ治療レジメンにおいて使用されるものに類似の投与量および頻度において投与される。尖圭コンジロームの処置のためのＩＮＴＲＯＮ Ａの推奨される投与量は、３週間にわたる、隔日で１週間に３回、ツベルクリン用シリンジもしくは類似のシリンジおよび２５ゲージ〜３０ゲージの針を使用して、５つの病変部までで、各病変部に１００万ＩＵである。６〜１０個のコンジロームを有する患者は、１回の処置過程につき５つまでのコンジロームを処置する上記の投与スケジュールにおいて、２回目の（連続した）処置過程を受け得る。１０個より多いコンジロームを有する患者は、どのくらい多くのコンジロームが存在するかに依存して、さらなる連続処置を受け得る。代わりに、もしくは加えて、インターフェロンが局所的に（例えば、クリーム剤形態または軟膏形態で（例えば、Ｓｔｅｎｔｅｌｌａら（１９９６） Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２３（１）：２９−３６に記載される））適用され得る。このような投与スケジュールは、ＨＰＶ感染、またはＨＰＶ感染と関連する疾患もしくは状態（例えば、尖圭コンジローム）の処置のための、本発明のポリペプチドの投与量の有用な範囲を提供する。多くの要因（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態、ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態が挙げられるが、これらに限定されない）に依存して、そのポリペプチドは、上記よりも低い量および／または低頻度で投与され得る。同様に、本発明の結合体を含む組成物は、一般に、罹患組織におけるＨＰＶウイルスＤＮＡの量を減少させるために、または感染個体における生殖器病変の大きさおよび／もしくは数を減少させるために有効な量で、例えば、病変内にまたは局所的に投与される。
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドもしくは結合体は、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。例えば、本発明のポリペプチドもしくは結合体は、抗ＨＰＶ治療剤（例えば、ポドフィロックス（コンジロックス）および／もしくはポドフィリン（Ｐｏｄｏｄｅｒｍ，Ｐｏｄｏｃｏｎ−２５）と組み合わせて投与され得る。
本発明のポリペプチドまたは結合体の投与の正確な量および頻度は、多くの要因（例えば、そのポリペプチドまたは結合体の比活性および薬物動態特性、ならびに処置される状態の性質、とりわけ、当業者に公知の他の要因に依存する。通常、その用量は、処置される適応症の重篤度または拡がりを防止または減少させ得るはずである。このような用量は、「有効」量または「治療有効」量といわれ得る。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特に、その処置される状態、用量、投与スケジュール、そのポリペプチドまたは結合体または組成物が単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、そのポリペプチド、結合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢、および全身の健康状態に依存することは、当業者に明らかである。投与の投薬量および頻度は、公知の技術を使用して当業者によって確認できる。
処置の有効性は、ＨＰＶウイルス負荷を測定することによって、例えば、生検により得られた組織におけるＨＰＶウイルスＤＮＡのレベルを測定することによって決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、処置の前のウイルス負荷と比較すると、処置の過程にわたって、少なくとも０．５ｌｏｇ単位、少なくとも１ｌｏｇ単位、少なくとも２ｌｏｇ単位、少なくとも３ｌｏｇ単位、少なくとも４ｌｏｇ単位、少なくとも５ｌｏｇ単位、少なくとも６ｌｏｇ単位、少なくとも７ｌｏｇ単位まで、ウイルス負荷の減少を達成するに十分な量である。いくつかの場合、本発明の組成物の有効量は、本質的に検出不能であるレベルまでウイルス負荷を減少させるに十分な量である。本発明は、ＨＰＶに感染した患者の組織中のＨＰＶウイルスＤＮＡのレベルを減少する方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するＨＰＶウイルスＤＮＡレベルと比較して、ＨＰＶウイルスＤＮＡのレベルを減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
処置の有効性は、代わりに、または加えて、感染個体における生殖器の病変部（コンジローム）の大きさもしくは数を観察することによって決定され得る。いくつかの場合において、本発明の組成物の有効量は、感染個体におけるコンジロームの大きさおよび／もしくは数を減少するに十分な量である。本発明は、ＨＰＶに感染した患者におけるコンジロームの大きさおよび／もしくは数を減少させる方法を包含し、この方法は、処置の開始前に存在するコンジロームの大きさおよび／もしくは数と比較して、この患者におけるコンジロームの大きさおよび／もしくは数を減少させるに有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
（処方物および投与経路）
本発明のポリペプチドまたは結合体の治療用処方物は、代表的には、１種以上の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む組成物中で投与される。このような薬学的組成物は、十分に保存安定性でかつヒトまたは動物への投与に適したポリペプチド薬品を生じるように当該分野でそれ自体公知の様式で調製され得る。
（薬物形態）
本発明のポリペプチドまたは結合体は、「そのまま」使用され得るか、そして／またはその塩形態で使用され得る。適切な塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム）との塩、ならびに例えば、亜鉛塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらの塩または錯体は、結晶および／または非晶質構造として存在し得る。
（賦形剤）
「薬学的に受容可能」とは、使用される投薬量および濃度において、投与される患者においていかなる望ましくない効果も引き起こさないキャリアまたは賦形剤を意味する。このような薬学的に受容可能なキャリアおよび賦形剤は、当該分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＬ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，編，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。
（薬物の混合）
本発明の薬学的組成物は、単独でまたは他の治療剤とともに投与され得る。例えば、リバビリンは、ＩＦＮ−αと同時に同時投与され、ＨＣＶ処置の効力を増加することが示されている。種々の低分子が、ウイルス標的（ウイルスプロテアーゼ、ウイルスポリメラーゼ、ウイルス複製複合体のアセンブリ）および宿主標的（ウイルスプロセシングに必要とされる宿主プロテアーゼ、ＮＳ５Ａのようなウイルス標的のリン酸化に必要とされる宿主キナーゼ、およびウイルスＩＲＥＳを効率的に利用するのに必要とされる宿主因子のインヒビター）の両方に対して開発されている。他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、またはＩＦＮ−γ）は、同時投与される。これらの薬剤は、同じ薬学的組成物の一部として組み込まれ得るか、または本発明のポリペプチドまたは結合体とは別々に、同時にまたは別の処置スケジュールに従って、投与され得る。さらに、本発明のポリペプチド、結合体または薬学的組成物は、他の治療に対するアジュバントとして使用され得る。
（患者）
本発明の目的で、「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を包含する。従って、本方法は、ヒト治療適用および獣医適用の両方に適用可能である。
（組成物の型および投与経路）
本発明のポリペプチドまたは結合体を含む薬学的組成物は、種々の形態（例えば、液体、ゲル、凍結乾燥された形態として、または圧縮固体として）処方され得る。好ましい形態は、処置される特定の適応症に依存し、当業者に明らかである。
本発明の処方物の投与は、種々の方法で実行され得、これには、経口的、皮下的、静脈内的、大脳内的、鼻内的、経皮的、腹腔内的、筋肉内的、肺内的、膣内的、直腸的、眼内的、または任意の他の受容可能な様式が挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、ポンプ（例えば、皮下浸透圧ポンプ）または移植のような当該分野で周知の技術を使用して、ボーラス注射が受容可能であるが、注入によって連続的に投与され得る。いくつかの例において、処方物は、液剤、クリーム、軟膏剤または噴霧剤として直接的に適用され得る。
（非経口物）
薬学的組成物の例は、非経口投与にために設計された溶液である。多くの場合において、薬学的処方物が液体形態で提供されるが、迅速な使用に適切な場合、このような非経口処方物はまた、凍結形態または凍結乾燥形態で提供され得る。前者の場合、組成物は、使用の前に解凍されなければならない。後者形態は、しばしば、幅広い種々の状態下で組成物に含まれる活性化合物の安定性を向上するために使用される。なぜなら、凍結乾燥調製物は、一般的に、それらの液体対応物よりも安定であることが認識されているからである。このような凍結乾燥調製物は、注入のための滅菌水または滅菌生理学的生理食塩水溶液のような一種以上の適切な薬学的受容可能な希釈剤の添加によって、使用の前に、再構成される。
非経口物は、所望の程度の純度を有するポリペプチドを、当該分野において代表的に使用される一種以上の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（これら全てが、「賦形剤」と呼ばれる）（例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および／または他の雑多な添加剤）と混合することによって、凍結乾燥処方物または水溶液としての保存のために調製され得る。
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲のｐＨを維持するのに役立つ。これらは、代表的に、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に適切な緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方ならびにそれらの塩が挙げられ、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など
）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、ならびに酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）である。さらなる可能性は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩（例えば、Ｔｒｉｓ）である。
保存剤は、微生物増殖を遅らせるために添加され、そして代表的に、約０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の量で添加される。本発明での使用に適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。
等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするために添加され、多水酸基糖アルコール、好ましくは、三価またはより高次の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール）が挙げられる。多水酸基アルコールは、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％と２５重量％との間、代表的には１重量％〜５重量％の量で存在し得る。
安定化剤は、幅広いカテゴリーの賦形剤を示し、これは、機能において、充填剤から、治療剤を溶解させるかまたは変性を妨げるかもしくは容器の壁への接着を妨げるのに役立つ添加剤までの範囲であり得る。代表的な安定化剤は、多水酸基糖アルコール（上に挙げられる）；アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど）、有機糖または糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど）（イノシトールのようなシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、ナトリウムチオグリコレート、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム）；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、およびスクロース）；三糖（例えば、ラフィノース）、ならびに多糖（例えば、デキストラン）であり得る。安定化剤は、代表的に、活性タンパク質重量に基づいて、０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在する。
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても公知）は、治療剤を溶解させるのを助けるため、そして治療ポリペプチドを撹拌誘導凝集から保護するために存在し得、これはまた、ポリペプチドの変性を引き起こさないで、表面応力を剪断するために処方物が曝露されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０など）が挙げられる。
さらなる雑多な賦形剤としては、充填剤またはフィラー（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が挙げられる。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション（ｃｏａｓｅｒｖａｔｉｏｎ）技術によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン）中に閉じ込められ得る。このような技術は、上記、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示される。
本発明の一局面において、この組成物は、液体組成物（例えば、水性組成物）であり、以下の式：
Figure 2008505985
 のスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含み、ここで、ｎは、４、５、または６であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、それぞれ、独立して、−Ｏ−基または−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６アルキル）−ＳＯ３−基であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３の少なくとも１つが、独立して、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６アルキル）−ＳＯ３−基であり；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、およびＳ９は、それぞれ、独立して、薬学的に受容可能なカチオン（Ｈ＋を含む）である。
ｎ＝４の場合、スルホアルキルエーテルシクロデキストリンが、α−スルホアルキルエーテルシクロデキストリンであり得ることが注意されるべきである。類似の様式において、ｎ＝５である場合、用語β−スルホアルキルエーテルシクロデキストリンが使用され得、そしてｎ＝６である場合、スルホアルキルエーテルシクロデキストリンはまた、γ−スルホアルキルエーテルシクロデキストリンと呼ばれ得る。
さらなる実施形態において、ｎは、５または６である。好ましい実施形態において、ｎ＝６である。
なおさらなる実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３は、独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−からなる群より選択される。最も好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３は、独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−である。
さらなる実施形態において、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、およびＳ９は、それぞれ、独立して、Ｈ＋、アルカリ金属（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２）、アンモニウムイオンおよびアミンカチオン（例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミン、ピペリジン、ピラジン、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノールアミンおよび（Ｃ４〜Ｃ８）シクロアルカノールアミンのようなアミンカチオンから選択される薬学的に受容可能なカチオンである。最も好ましくは、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、およびＳ９は、それぞれ独立して、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋からなる群より選択される薬学的に受容可能なカチオン（特に、Ｎａ＋）である。
スルホアルキルエーテルシクロデキストリンは、１〜１８個のスルホアルキル基（ｎ＝４の場合）、１〜２１個のスルホアルキル基（ｎ＝５の場合）、または１〜２１個（ｎ＝６の場合）を含み得る。本発明の好ましい実施形態において、ｎ＝５およびスルホアルキルエーテル誘導体は、平均して、２〜２０個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、例えば、３〜１０個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、より好ましくは、４〜９個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、さらにより好ましくは、５〜９個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）、例えば、６〜８個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）（例えば、７個のスルホアルキル基（特に、スルホブチル基）を含む。
いくつかの例において、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテル（すなわち、ｎ＝５）の塩、特に、ナトリウム塩であり、これは、平均して、７個のスルホブチル基を含む。このスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体はまた、ＳＢＥ７−β−ＣＤと呼ばれ、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）（Ｃｙｄｅｘ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｋｎａｎｓａｓ）として入手可能である。
用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を表す。代表的なＣ１〜Ｃ６アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびイソ−ヘキシルが挙げられるがこれらに限定されない。
用語「Ｃ２〜Ｃ６アルキル」は、２〜６個の炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を表す。代表的なＣ２〜Ｃ６アルキル基としては、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびイソ−ヘキシルが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中に開示されるポリペプチドおよびスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含む組成物に関するさらなる詳細は、ＷＯ０３／００２１５２、特に、３７〜４９頁の「Ｔｈｅ ｓｕｌｆｏａｌｋｙｌ ｅｔｈｅｒ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ」と題されたセクションに見出され得、本明細書中において参考として援用される。
インビボ投与に使用される非経口処方物は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に達成される。
（徐放調製物）
徐放調製物の適切な例は、ポリペプチドまたは結合体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、フィルムまたはマイクロカプセルのような適切な形態を有する。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＬｕｐｒｏｎ（登録商標））（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが１００日までまたは１００日を超えて長期間、分子を放出し得るものの、特定のヒドロゲルは、より短い期間の間、タンパク質を放出する。カプセル化されたポリペプチドが長期間体内に残る場合、これらは、３７°の水蒸気への曝露の結果として変性し得るかまたは凝集し得、生物的活性の喪失および免疫原性の可能な変化を生じする。合理的な戦略は、関与する機構に依存して安定化のために考え出され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、そして特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
（経口投与）
経口投与について、薬学的組成物は、固体形態または液体形態（例えば、カプセル、錠剤、懸濁液、エマルジョンまたは溶液の形態）であり得る。薬学的組成物は、好ましくは、所定量の活性成分を含む投薬単位の形態で作製される。ヒトまたは他の哺乳動物に適切な毎日の用量は、患者の状態および他の因子に依存して幅広く変化し得るが、慣用的な方法を使用して当業者によって決定され得る。
経口投与のための固体投薬形態としては、カプセル、錠剤、坐剤、散剤および顆粒剤が挙げられ得る。このような固体投薬形態において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンのような少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。このような投薬形態はまた、通常の実行のように、さらなる物質（例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤）を含み得る。カプセル、錠剤および丸剤の場合、投薬形態はまた、緩衝剤を含み得る。錠剤および丸剤は、さらに、腸溶性コーティングで調製され得る。
ポリペプチドまたは結合体は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリジン、および／またはポリビニルアルコールのようなアジュバントと混合され得、そして簡便な投与のために錠剤にされ得るかまたはカプセル化され得る。あるいは、これらは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、オイル（例えば、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油）、トラガカントゴムおよび／または種々の緩衝剤中に溶解され得る。他のアジュバントおよび投与様式は、薬学の分野において周知である。キャリアまたは希釈剤は、時間遅延材料（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）を単独でまたはワックス、もしくは当該分野で周知の他の材料と含み得る。
薬学的組成物は、滅菌のような従来の薬学的操作に供され得、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、フィラーなど（例えば、本明細書中において他で開示される）のような従来のアジュバントを含み得る。
経口投与のための液体投薬形態としては、当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤（例えば、水）を含む、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられ得る。このような組成物はまた、湿潤剤、甘味料、矯味矯臭剤および芳香剤を含み得る。
（経口投与）
経口投与について、薬学的組成物は、固体形態または液体形態（例えば、カプセル、錠剤、懸濁液、エマルジョンまたは溶液の形態）であり得る。薬学的組成物は、好ましくは、所定量の活性成分を含む投薬単位の形態で作製される。ヒトまたは他の哺乳動物に適切な毎日の用量は、患者の状態および他の因子に依存して幅広く変化し得るが、慣用的な方法を使用して当業者によって決定され得る。
経口投与のための固体投薬形態としては、カプセル、錠剤、坐剤、散剤および顆粒剤が挙げられ得る。このような固体投薬形態において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンのような少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。このような投薬形態はまた、通常の実行のように、さらなる物質（例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤）を含み得る。カプセル、錠剤および丸剤の場合、投薬形態はまた、緩衝剤を含み得る。錠剤および丸剤は、さらに、腸溶性コーティングで調製され得る。
ポリペプチドまたは結合体は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリジン、および／またはポリビニルアルコールのようなアジュバントと混合され得、そして簡便な投与のために錠剤にされ得るかまたはカプセル化され得る。あるいは、これらは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、オイル（例えば、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油）、トラガカントゴムおよび／または種々の緩衝剤中に溶解され得る。他のアジュバントおよび投与様式は、薬学の分野において周知である。キャリアまたは希釈剤は、時間遅延材料（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）を単独でまたはワックス、もしくは当該分野で周知の他の材料と含み得る。
薬学的組成物は、滅菌のような従来の薬学的操作に供され得、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、フィラーなど（例えば、本明細書中において他で開示される）のような従来のアジュバントを含み得る。
経口投与のための液体投薬形態としては、当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤（例えば、水）を含む、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられ得る。このような組成物はまた、湿潤剤、甘味料、矯味矯臭剤および芳香剤を含み得る。
（肺送達）
ジェットまたは超音波のいずれかで噴霧器とともに使用するために適切な処方物は、代表的に、例えば、溶液１ｍＬ当たり、約０．００１〜２５ｍｇの結合体、好ましくは、約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、水中に溶解されたポリペプチドまたは結合体を含む。処方物はまた、緩衝液および単純な糖（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の調節のため）、ならびに／または０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の範囲のヒト血清アルブミンを含み得る。使用され得る緩衝液の例は、酢酸ナトリウム、シトレート、およびグリシンである。好ましくは、緩衝液は、溶液を３〜９の範囲のｐＨに調節するのに適切な組成およびモル濃度を有する。一般的に、１ｍＭ〜５０ｍＭの緩衝液モル濃度が、この目的に適する。利用され得る糖の例は、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、およびキシロースであり、通常、処方物の１重量％〜１０重量％の範囲の量である。
噴霧器処方物はまた、エアロゾルを形成する際の溶液の微粒子化によって引き起こされるタンパク質の表面誘導凝集を減少させるかまたは妨げるための界面活性剤を含み得る。種々の従来の界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）が使用され得る。量は、一般的に、処方物の０．００１重量％〜４重量％の間の範囲である。本発明の目的のための特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
本発明の液体粒子の適切な分散を生成する特定の処方物および方法は、ＷＯ ９４／２００６９、ＵＳ ５，９１５，３７８、ＵＳ ５，９６０，７９２、ＵＳ ５，９５７，１２４、ＵＳ ５，９３４，２７２、ＵＳ ５，９１５，３７８、ＵＳ ５，８５５，５６４、ＵＳ ５，８２６，５７０およびＵＳ ５，５２２，３８５（これらは、これによって、参考として援用される）に記載される。
計量用量吸入器デバイスで使用するための処方物は、一般的に、微細に分割された粉末を含む。この粉末は、凍結乾燥し、次いで、液体結合体処方物を粉砕することによって作製され得、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような安定化剤を含み得る。代表的には、０．５％（ｗ／ｗ）より多くが添加される。さらに、一種以上の糖または糖アルコールが、必要な場合に、調製物に添加され得る。例としては、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトール、およびキシロースが挙げられる。処方物に添加される量は、存在する結合体の約０．０１〜２００％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約１〜５０％の範囲であり得る。次いで、このような処方物は、凍結乾燥され、所望の粒子サイズに粉砕される。
次いで、適切なサイズの粒子は、界面活性剤の補助とともに噴霧剤中に懸濁される。噴霧剤は、この目的のために使用される任意の従来の材料（例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはこれらの組み合わせ）であり得る。適切な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンが挙げられる。オレイン酸はまた、界面活性剤として有用であり得る。次いで、この混合物は、送達デバイスに装填される。本発明における使用に適切な市販の計量用量吸入器の例は、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡによって製造される、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量用量吸入器である。
粉末吸入器のための処方物は、結合体を含む微細に分割された乾燥粉末を含み、また、ラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールのような充填剤を、デバイスからの粉末の分散を容易にする量（例えば、処方物の５０重量％〜９０重量％）で含み得る。粉末の粒子は、１０ミクロメートル未満の中央直径（ｍｅｄｉａｎ ｄｉａｍｅｔｅ）、好ましくは、０．５〜５ミクロメートルの間、最も好ましくは、１．５〜３．５ミクロメートルの間を有する約１ｇ／ｃｍ２の密度を有する粒子に対応する、肺中での空気力学特性を有する。本明細書中の技術に従った使用に適切な粉末吸入器の例は、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡによって製造されたＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
これらのデバイスの粉末は、ＵＳ５，９９７，８４８、ＵＳ５，９９３，７８３、ＵＳ５，９８５，２４８、ＵＳ５，９７６，５７４、ＵＳ５，９２２，３５４、ＵＳ５，７６８５，０４９およびＵＳ５，６５４，００７に開示される方法によって作製および／または送達され得る。
治療製品の肺送達のために設計された機械的デバイスとしては、噴霧器、計量用量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されず、これらの全てが、当業者によく知られている。本発明の実施に適切な市販のデバイスの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡによって製造された、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ；Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ，ＵＳＡによって製造されたＡｃｏｒｎ ＩＩ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ；Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡによって製造されるＶｅｎｔｏｌｉｎ ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ ｉｎｈａｌｅｒ；Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡによって製造されるＳｐｉｎｈａｌｅｒ ｐｏｗｄｅｒ ｉｎｈａｌｅｒ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡの「ｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｌｏｕｄ」デバイス；Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡによって製造されるＡＩＲ ｉｎｈａｌｅｒ；およびＡｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡによって製造されるＡＥＲｘ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍである。
（キット）
本発明はまた、本発明のポリペプチド、結合体、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、方法、組成物、およびシステム、ならびに装置を含むキットを提供する。本発明のキットは、必要に応じて、本発明の以下の少なくとも１つを含む：（１）本明細書中に記載される装置、システム、システム要素、または装置要素；（２）本発明のポリペプチドまたは結合体またはポリヌクレオチド；本発明のポリペプチドをコードするプラスミド発現ベクター；本発明のポリペプチドを発現する細胞；または任意のこのような成分の少なくとも１つを含む組成物を含む少なくとも１つのキット成分；（３）本明細書中に記載される任意の方法（治療方法または予防方法を含む）を実行するための説明書、（２）において同定される任意の成分または任意のこのような成分の任意の組成を使用するための説明書；および／または本明細書中に記載される任意の装置、システムもしくは成分を操作するための説明書；（４）少なくとも１つのこのような成分または組成物を保持するための容器；ならびに（５）包装材料。
さらなる局面において、本発明は、上記および本明細書中に記載の任意の装置、成分、組成物またはキットの使用のため、本明細書中に記載される任意の方法またはアッセイの実施のため、および／または本明細書中に記載される任意のアッセイまたは方法を実施するための任意の装置、成分、組成物またはキットの使用のために提供される。
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明の精神または範囲をいかなるようにも制限しない。
（材料および方法）
（Ｉ．表面接近可能残基の決定）
（接近可能表面積（ＡＳＡ））
コンピュータプログラムＡｃｃｅｓｓ（Ｂ．ＬｅｅおよびＦ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００（１９７１））ｖｅｒｓｉｏｎ ２（著作権 １９８３ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して、構造の個々の原子の接近可能表面積（ＡＳＡ）を計算した。この方法は、代表的に、１．４Åのプローブサイズを使用し、プローブの中心によって形成される面積として、接近可能表面積（Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ（ＡＳＡ））を規定する。この計算の前に、全ての水分子および全ての水素原子を、座標セット（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｅｔ）から除去するべきである。なぜなら、他の原子が、タンパク質に直接関係しないからである。
（側鎖の部分（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）ＡＳＡ）
側鎖原子の部分ＡＳＡは、側鎖の原子のＡＳＡの合計を伸長されたＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチドのその残基の型の側鎖のＡＳＡを表す値によって除算することによって計算される。Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０，５０７−５３０を参照のこと。この例について、ＣＡ原子は、グリシン残基の側鎖の一部としてみなされるが、残りの残基については、そうではない。以下の値は、側鎖についての標準１００％ＡＳＡとして使用される（表６）：
Figure 2008505985
 。
構造において検出されていない残基は、１００％曝露を有するとして規定される。なぜなら、これらは、可撓性領域に存在すると考えられる。ＮＭＲ構造のアンサンブルが分析される場合、アンサンブルの平均ＡＳＡ値が使用される。
（三次元構造が利用可能でない場合の表面曝露残基の決定）
三次元構造が利用可能でない場合、またはこの構造が、表面接近可能性を決定するのに十分に詳細ではない場合（例えば、ＣＡ原子の位置のみが公知である場合）、表面接近可能性は、以下のようになされる配列アラインメントから推測され得る：
Ａ：構造が公知であるが、表面接近可能性を決定するのに十分に詳細ではない場合：
低い詳細構造が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．から利用可能なＭＯＤＥＬＥＲプログラムを使用して、配列ファミリーの公知の構造に対する構造ベースの配列アラインメントに含まれる、
Ｂ．構造が公知でない場合：
配列は、プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）の「ｐｒｏｆｌｅ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」選択肢を使用して調製され得る配列ファミリーの公知の構造の配列を含む所定の配列アラインメントに対して整列される。
ＡまたはＢにおいて得られる配列アラインメントから、公知の構造を有する他の配列の少なくとも１つに曝露される残基に等価な位置で分析される配列の残基を、曝露されると規定する。曝露の程度は、他の配列の等価な残基について、最も大きな値であるようにとられる。分析される配列が挿入である（すなわち、他の配列に等価な残基が存在しない）場合、この残基は、この残基は、完全に曝露されているとして規定される。なぜなら、ターン／ループ領域に位置することが最も確からしいからである。低い詳細構造が存在する場合、構造内に観察されないこれらの残基は、完全に曝露されていると規定される。なぜなら、これらは、可撓性領域にあると考えられるからである。
（原子間距離の決定）
原子間距離は、分子グラフィックソフトウェア（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ製のＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（登録商標）９８．０）を使用して容易に決定される。
（ＩＩ．タンパク質発現および精製）
（Ａ．ＣＨＯ細胞からの発現および精製）
本発明のいくつかのポリペプチドは、安定にトランスフェクトされ、そしてクローン細胞株を確立するためにＧ４１８で選択されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）中で産生された。
（１．ＣＨＯ発現構築物：）
本発明のポリペプチドをコードする核酸を、ＣＨＯ発現ベクターへと、ＳＶ４０プロモーターの制御かでかつＮ末端リーダー配列をコードする配列、および必要に応じて、１つまたは２つのＣ末端タグ配列とインフレームで、クローニングした。このリーダー配列は、汎用リーダー配列（ｇｅｎｅｒｉｃ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である、ＩＦＮα６リーダーもしくは改変ＩＦＮα６リーダー配列のいずれかであり、Ｃ末端タグには、Ｅ−ｔａｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および／またはＨｉｓ−ｔａｇを含めた。プラスミド生成は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞において行った。
（２．ＩＦＮ−αポリペプチドを発現する安定なサブクローンの選択：）
材料：
培養培地：Ｇ４１８、ＦＢＳおよびペニシリン、ストレプトマイシンならびにグルタミン［ＰＳＧ］（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２；
１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
トリプシン／ＥＤＴＡ
抗Ｅ−タグ抗体−ＨＲＰ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）
ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）。
（手順）安定なトランスフェクト体を、ＦＢＳおよびペニシリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中でＧ４１８による選択により生成した。細胞を、５０ｍｌの選択培地を有するＴ１７５フラスコに分け、３７℃ ＣＯ２インキュベータ中で、約２４時間、または細胞が８０％のコンフルーエンスに達するまでインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、その後、２．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを添加し、３７℃で３〜５分間インキュベートすることにより回収した。細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ卓上遠心分離機で、１０００ｇで３０分間遠心することにより、回収した。細胞を一回ＰＢＳ中で洗浄し、１％ ＦＢＳを含む３ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞密度を測定し、ＰＢＳ／ＦＢＳを用いて、１×１０６細胞／ｍｌに調整した。各ＩＦＮαポリペプチドについて、細胞を、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｏＦｌｏ選別機で、２００ｍｌの選択培地を含む２〜５個の９６ウェルプレート中に選別した。このプレートを、選別した細胞が増殖するのを可能にするために、３７℃インキュベータ中で１０〜１４日間インキュベートした。各ＩＦＮαポリペプチドに対して二つのサブクローンを、ドットブロット分析による最初の高いレベルの発現に関して選択し、その後、Ｅ−タグ抗体ＨＲＰ結合体および化学発光検出を使用して、ウエスタンブロット分析により確認した。
（３．タンパク質発現）
（材料）
ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｕｌｔｒａ ＣＨＯ培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
ＣＨＯ ＩＩＩ Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｅｘ−Ｃｙｔｅ 増殖増強培地サプリメント（血清学的タンパク質）
ＩＴＳＡ（インスリン、トランスフェリン、付着培養のためのセレニウムサプリメント；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）
ＦＢＳ、ＰＢＳ、トリプシン。
（手順）
１日目：細胞を、１つのＴ−１７５フラスコから１つのローラーボトル（１７００ｃｍ２）に、１０％ ＦＢＳおよび１×Ｐ／Ｓを含む３００ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２中に移し、３７℃ ＣＯ２インキュベータ中で増殖させた。
３日目：培地を、３００ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ−Ｆ１２−ＦＢＳ−Ｐ／Ｓに交換した。
５日目：培地を、１／１０００ Ｅｘ−ＣｙｔｅおよびＰ／Ｓを含む３００ｍｌの得るトラＣＨＯに交換した。
７日目：培地を、３００ｍｌのＣＨＯ ＩＩＩＡ＋Ｐ／Ｓ生成培地と置換した。
上清を、８日目、９日目および１０日目で収集した。この上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ卓上遠心分離機で、２０００ｇで２０分間遠心し、０．２μ ＰＥＳボトルトップ滅菌フィルターを使用してろ過し、精製のために４℃で保存した。
（４．タンパク質精製）
本発明のいくつかのポリペプチドを、Ｃ末端に１３アミノ酸のＥ−タグ配列を含有する融合タンパク質として発現させた。このようなポリペプチドを、以下のように、Ｅ−タグアフィニティーカラムを使用して精製した。
（材料）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｒｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号１７−１３６２−０１）。精製キットは、直径１６ｍｍ×高さ２５ｍｍ（５ｍｌ総容積）抗Ｅ−タグカラムおよび対応する緩衝液。
（手順）ローラーボトル中のＣＨＯ−ＨＫ１細胞から収集した上清を、２８００×ｇで２０分間の遠心および０．２μボトルトップフィルターモジュールを使用するろ過の組み合わせを用いて精製した。上清を、ＲＰＡＳ結合緩衝液中で１５０ｃｍ／時間（５ｍｌ／分）で平衡化したＥ−タグカラム上にローディングした。このカラムを、５ＣＶ（カラム容積）の結合緩衝液で洗浄し、タンパク質を、ＲＰＡＳ溶出緩衝液により７５ｃｍ／時間（２．５ｍｌ／分）で溶出した。溶出画分を０．０５容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０により中和し、ＰＢＳ中に透析し、０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、アリコート中で、−８０℃で凍結保存した。アッセイのためのサンプルを５０μｇ／ｍｌで、０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中に処方し、−８０℃でアリコート中に凍結保存した。サンプルを、慣用的にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た物質、試薬およびプロトコルを使用するクーマシー染色を行なった。タンパク質濃度を、ＩＦＮ−α標準を使用するＢＣＡアッセイによって測定し、その濃度を、アミノ酸分析によって確認した。
（Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉからの発現および精製）
本発明のいくつかのポリペプチドを、封入体としてＥ．ｃｏｌｉ中に産生し、それを以下のように精製し、リフォールディングした。
（１．Ｅ．ｃｏｌｉ発現構築物）
いくつかの場合において、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける改善された発現のために改変した。このような改変は、３４位〜３９位の稀なＡｒｇ−Ａｒｇコドン対ＡＧＧＡＧＧおよび６４位〜６９位のＡＧＧＡＧＡ（配列番号１８に対する番号付けの位置）を、各々、Ａｒｇ−Ａｒｇコドン対（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて好ましいＣＧＴＣＧＣ）で置き換えること、およびコード配列の５’末端に対してメチオニンコドン（ＡＴＧ）を付加することを包含していた。そのコード配列を、カナマイシン選択マーカーを有するＴ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−４２発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと、またはカナマイシン選択マーカーを有するＴ５プロモーターの制御下でｐＱＥ８０−Ｋａｎ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）へと配置した。
（２．タンパク質発現）
インターフェロンコード配列を含むｐＥＴ−４２ベクターを、標準的な方法を使用してＢＬ２１（ＤＥ３）のようなＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天プレート上に配置し、３７℃でインキュベートした。１８〜２４時間後、三個の別々のコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する５ｍｌの２×ＹＴを含むチューブ中に移し、３７℃で一晩インキュベートした。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する１００ｍｌの２×ＹＴを含む２組のフラスコに接種するために一晩の培養物を使用した。３７℃での培養物の増殖を、ＯＤ６００でモニタリングした。この培養物を、３７℃で３時間の１ｍＭのＩＰＴＧにより、０．５〜０．８のＯＤ６００で誘導した。ＩＰＴＧ誘導した培養物を、ペレット化した細胞をＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解させることにより、発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。対応する誘導していない組の培養物を、２５％ グリセロールを添加し、１ｍｌのアリコート中で−８０℃で細胞を凍結することによって凍結ストックを調整するために使用した。インターフェロンコード配列を含むｐＱＥ８０−Ｋａｎベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０またはＷ３１１０−ｆｈｕＡに形質転換した。発現を、上記のように確認した。
より大きなスケールの振盪フラスコでの発現を、４×１Ｌの２×ＹＴ培地＋カナマイシンに、２５ｍｌの一晩培養物を接種することによって、行った。培養を、ＯＤ６００でモニターし、０．５〜０．８のＯＤ単位で１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導して３時間後、５０００ｇでの遠心分離により細胞を採取し、−８０℃で凍結保存した。細胞を、１０，０００ｐｓｉでのフレンチプレスまたはＡＰＶ １０００ホモジナイザーの２〜３回の通過を用いて破壊し、「ＩＢの単離」および続く節で記載されるように処理される。
流加培養醗酵を、微量元素溶液および４０ｍｇ／Ｌカナマイシンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）培地中で、Ｂ．Ｂｒａｕｎバイオリアクターにおいて１０Ｌスケールで行った。醗酵を、ＴＢ培地中の４００ｍｌの一晩培養物をバイオリアクターに接種することによって開始した。初期の増殖期の間に、溶存酸素（ＤＯ）は、攪拌速度を変えることによって、５０％で維持した。培養物のＯＤ６００が５．０に達したとき、グリセロール／アミノ酸供給を、０．５ｍｌ／分間で開始し、１０００ｒｐｍに攪拌を設定した。この供給速度を、醗酵プロセスの残りについて４０％でＤＯを維持するために調節した。ＯＤ６００が２５に達したとき、培養物を、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、誘導した。接種して３時間後、細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離器での１００００×ｇの遠心分離により採取し、細胞ペーストを、−６０℃で保存した。採取時のＯＤ６００は、代表的には、３５〜４０あたりであった。
（３．封入体（ＩＢ）の単離、可溶化、スルホン化およびリフォールディング）
ＩＢを単離するために、解凍した細胞ペーストを、細胞ペースト１グラムあたり１０ｍｌの１×ＰＢＳで再懸濁し、均一になるまで混合し、スラリーを得た。細胞を、１７，０００〜１９，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを２回通して、破壊した。この細胞溶解物を、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００へと調整し、１０分間混合し、ＩＢを、２〜８℃で６０分間１０，０００ｇで遠心分離することによって回収した。このＩＢペレットを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中に再懸濁することにより１回洗浄し、上記のように遠心分離することによって回収し、−８０℃で凍結保存した。
ＩＢを可溶化するために、このＩＢペレットを、細胞ペースト１ｇあたり１０ｍｌの緩衝液で、尿素緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ 尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）中に再懸濁した。この懸濁液を、３０分間混合し、１０，０００ｇで３０分間、２〜８℃で遠心分離した。このペレットを、ＤＴＴなしの尿素緩衝液中で再懸濁することによって１回洗浄し、上記のように遠心分離し、水で２回洗浄した。この洗浄したペレットを、ペレット１ｇあたり１０ｍｌ緩衝液で、グアニジン緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に可溶化し、３０〜６０分間混合し、１０，０００ｇで３０分間、２〜８℃で遠心分離した。この可溶化したＩＦＮを含む懸濁液を、１０ｍｇ／ｍｌ 亜硫酸ナトリウムおよび５ｍｇ／ｍｌ ナトリウムテトラチオネートに調節して、スルホン化プロセスを開始した。このプロセスを、２〜８℃で１６時間行った。スルホン化の後、このＩＦＮ溶液を、水で２倍希釈し、このＩＦＮペレットを、１０，０００ｇで２〜８℃で遠心分離することによって回収した。このペレットを水で２回洗浄し、上記のように、グアニジン緩衝液に再懸濁した。このスルホン化したＩＦＮのタンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度により決定した。
このリフォールディングプロセスを、スルホン化したＩＦＮを、２〜８℃においてグアニジン緩衝液中、終濃度がリフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ 酸化型グルタチオン）中で１００ｍｇ／ｍｌになるまで希釈することによって開始した。リフォールディングを、６〜８時間にわたってゆっくりと混合しながら、２〜８℃で行い、その後、ＣｕＳＯ４を終濃度が２ｍＭになるまで添加し、その後、さらに１６〜２０時間のリフォールディングを行った。リフォールディング反応の進行を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣによってモニターした。
（４．精製）
そのリフォールディングしたＩＦＮを、３回のクロマトグラフィー工程を用いて精製した。このリフォールディング溶液を、８０％硫酸アンモニウム（重量／容積）に調節し、０．２μＭ フィルターを通して濾過し、２００ｃｍ／ｈで、平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．８Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０）中で平衡化した２０ｍｌのブチルセファロースファーストフロー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に充填した。このＨＩＣカラムを、８カラム容積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で洗浄し、その後、８ＣＶの洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０）で洗浄した。ＩＦＮを、１５％飽和濃度の硫酸アンモニウムを含むかまたは含まない、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中の１５％硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０で溶出した。
このＨＩＣプールを、０．５Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５のストックを用いて、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムに調節し、２倍希釈した。この調節したプールを、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０中で平衡化した、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＣＭセファロースファーストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に９０ｃｍ／ｈで充填した。充填した後、そのカラムを平衡化緩衝液条件下で５ＣＶで洗浄し、ＩＦＮを、１００〜６５０ｍＭ ＮａＣｌの２０ＣＶの勾配を用いて溶出した。ＩＦＮを含むピーク画分を、２８０ｎｍの吸光度に基づいてプールした。
このＣＭセファロースプールを、ｐＨを約１０に設定した２Ｍ １，３ ジアミノプロパンストックを用いて、２０ｍＭ １，３ ジアミノプロパンに調節した。このサンプルを、５０ｍＭ １，３ ジアミノプロパン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０中で平衡化した、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｑセファロースファーストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２００ｃｍ／ｈで充填した。充填した後、そのカラムを、平衡化条件下で５ＣＶの緩衝液で洗浄し、ＩＦＮを、１００〜５００ｍＭ ＮａＣｌの２０ＣＶの勾配を用いて溶出した。ＩＦＮを含む画分を、２８０ｎｍの吸光度に基づいてプールし、２５０〜５００容積の５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ５．０または５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０に対して直ぐに透析した。透析後、このＩＦＮサンプルを、バイオセイフティーキャビネット中で、０．２μＭフィルターを用いて滅菌濾過し、濃度を、２８０ｎｍの吸光度で測定し、サンプルを、１週間までの期間またはアリコート中では２〜８℃で保存したか、または長期間の保存のためには−８０℃で保存した。活性アッセイのために、そのサンプルを、一般に、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および５０μｇ／ｍｌで０．５％ ＢＳＡ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中に処方し、−８０℃でアリコートで凍結保存した。
（ＩＩＩ．活性アッセイ）
（Ａ．ＥＭＣＶ−ＨｕＨ７抗ウイルスアッセイ）
インターフェロンαポリペプチドおよび本発明の結合体の抗ウイルス活性に対する例示的なアッセイを以下に提供する。このアッセイは、薬物の抗ウイルス有効性を評価するために使用される細胞ベースの用量反応アッセイであり、そして、ときおり、「細胞変性効果からの防御（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」（またはＰＣＰＥ）アッセイと称される。手短には、細胞を薬物と一緒にインキュベートし、ウイルスに曝露する。薬物の非存在下で、細胞を、ウイルスに曝露して死滅させた。薬物の濃度を増加させると、細胞の生存の割合は増加する。生存細胞の数を、直接（例えば、視覚的に計数することにより）または代謝速度を測定することにより間接的に測定し得る。例えば、代謝色素（例えば、ＭＴＴまたはＷＳＴ−１）を、細胞生存の間接的な指標として使用し得る。生存細胞は、このような色素を代謝し、分光分析（光学濃度）により定量化され得る代謝生成物を形成する。
（材料）
細胞：
ＨｕＨ７細胞：ヒト肝臓癌細胞株（Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌａｉ、ＵＳＣ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡから入手した）。この細胞株はまた、Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （ＪＣＲＢ）／Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ），Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎから得られ得る。ＨｕＨ７細胞株は、最初は、Ｄｒ．Ｊ．Ｓａｔｏ（Ｏｋａｙａｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の研究室で、よく分化した肝細胞癌腫を有する５７歳の日本人男性から樹立された（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．ら，（１９８２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２（９）：３８５８−６３）。この細胞株は、Ｂ型肝炎表面抗原に対してネガティブである。
ＶＥＲＯ細胞：アフリカサバンナモンキー腎臓細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）
Ｌ−９２９細胞：マウス線維芽細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）
ウイルス：脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）：組織培養適合株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１２９Ｂ）。高力価のウイルスストックをＶＥＲＯ細胞の経路によって自家生成した。
完全培地：
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９６５−０９２）
１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３）
１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ，Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）
少量血清（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ）培地：
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９６５−０９２）
２％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３）
１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ，Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）
トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．２５３００−０５４）
ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ６４４ ８０７）。
ＨｕＨ７細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベータ中で、３７℃で完全ＤＭＥＭで維持した。この細胞をトリプシンを用いて収集し、Ｔ１７５フラスコ中で２５ｍｌあたり１〜２×１０６細胞の最終密度のコンフルエントまで、週に二回分割した。アッセイの前日に、細胞をトリプシン処理し、細胞が、アッセイの前に対数期であることを確実にするために、新しいＴ７５フラスコ中に、２５ｍｌあたり４．５×１０６細胞の密度で播種した。
（手順）
高力価のＥＭＣＶウイルスストックをＶＥＲＯ細胞中で増殖させた。９５％の細胞が死滅する致死濃度（ＬＣ９５）を、ＨｕＨ７細胞単層のＥＭＣＶウイルス死滅曲線により決定した。手短かには、ＨｕＨ７細胞を一日目に９６ウェルマイクロタイタープレート上に、ウェルあたり６×１０４細胞で配置した。ウイルスを、１０の希釈ポイントで、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中で１：３に連続希釈し、二日目に細胞に添加した。感染の２４時間後、細胞生存を、テトラゾリウム塩代謝アッセイ、ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）により決定した。ＨｕＨ７−ＥＭＣＶアッセイのために決定したＬＣ９５は、０．０３４のＭＯＩ（ＰＦＵ／細胞）に対応した。ウイルスストックの力価を、Ｌ９２９細胞上の標準的なプラークアッセイにより決定した。
このアッセイの一日目に、対数期のＨｕＨ７細胞を、トリプシンを用いて収集し、少量血清培地中に再懸濁し、遠心分離により濃縮した。その細胞ペレット（細胞の５個のＴ１７５フラスコに対応する）を、ｗｅｒｅ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｉｎ １０ｍｌの少量血清培地培地中に再懸濁し、４０ミクロンナイロン細胞濾過器を通して濾過し、血球計算板で数えた。細胞生存性を、トリパンブルー排除により決定した。その細胞を、６×１０５細胞／ｍｌの最終密度まで 少量血清培地中に再懸濁した。１００μｌの希釈細胞を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加し（６×１０４細胞／ウェル）、そして、プレートを３７℃で加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で４時間インキュベートした。
「参照」インターフェロンαポリペプチドおよび本発明のインターフェロンαポリペプチド（「試験サンプル」とも称される）の力価を、用量反応分析により測定した。一般に、プレートあたり１つの試験サンプルおよび１つの参照ＩＦＮ−αが存在し、それぞれは、ＩＦＮ−α処理／ＥＭＣＶチャレンジ細胞の三つの複製曲線およびＩＦＮα処理のみの二つの複製曲線を有する。後者を、ＨｕＨ７細胞上のＩＦＮ−αの潜在的な抗増殖効果についてコントロールに対してアッセイした。参照ＩＦＮ−αに対する用量反応曲線は、一般に、１００ｎｇ／ｍｌ〜０．０５ｎｇ／ｍｌの範囲の８個の三倍希釈物からなる。ＩＦＮ−α試験サンプルについては、三倍希釈物は一般的に、５ｎｇ／ｍｌ〜０．００２ｎｇ／ｍｌの範囲である。８個のウェルの各細胞をＩＦＮ−α無しにウイルスで処理し、細胞のみをコントロールとして行なった。
ＩＦＮ−α希釈物を、少量血清培地を使用して調製した。１００μｌの希釈ＩＦＮ−α調製物を、アッセイプレートに移した。このアッセイプレートを、加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で１６時間インキュベートした。
二日目、細胞をＥＭＣウイルスでチャレンジした。培地をアッセイプレートの各ウェルから吸引した。ＥＭＣＶストックを、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中で、１：５４００に希釈した。１００μｌの希釈ウイルス（これは、細胞あたり０．０３４ウイルス粒子に相当する）を、各ウェルに添加した。この細胞を加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で２４時間ウイルスとともにインキュベートした。
三日目、各ウェル中の生存能力のある細胞の数を、ＷＳＴ−１アッセイにより定量した。培地をアッセイプレートの各ウェルから吸引した。ＷＳＴ−１試薬を、少量血清培地中で１：２０に希釈し、１００μｌの希釈ＷＳＴ−１試薬を各ウェルに添加し、細胞を加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で６０分間インキュベートした。各ウェル中の生存能力のある細胞の数を、プレートリーダー上で４５０ｎｍでＯＤを測定することにより定量した。
（分析）
ＩＦＮα参照および試験サンプルの抗ウイルス力価を、以下の式：
抗ウイルス力価＝（生存能力のある細胞Ｃ＋Ｉ＋Ｖ−生存能力のある細胞Ｃ＋Ｖ）／（生存能力のある細胞Ｃ＋Ｉ−生存能力のある細胞Ｃ＋Ｖ）＊１００％
を用いて計算した。
ここで、Ｃ＋Ｖ＝ＨｕＨ７細胞＋ＥＭＣＶ、Ｃ＋Ｉ＝ＨｕＨ７細胞＋ＩＦＮ−α、およびＣ＋Ｉ＋Ｖ＝ＨｕＨ７細胞＋ＩＦＮ−α＋ＥＭＣＶ
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて非線形回帰によって分析した。以下の式：
Figure 2008505985
 を、曲線のあてはめに使用した。
ボトムは、底のプラトー値におけるＹ値であり；トップは、最高のプラトー値におけるＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの間の中間である場合のＸ値である。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ方法を、最適化アルゴリズムとして使用した。
（Ｂ．ＴＨ１分化アッセイ）
インターフェロンαポリペプチドおよび本発明の結合体のＴＨ１分化活性に対する例示的なアッセイを以下に提供する。
（アッセイ手順）
白血球を含むヒト軟膜（２５〜３０ｍｌ）および５００ｍｌの血液から調製された赤血球を、アッセイ開始の日にＳｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから収集し、室温で保存した。各軟膜を注意深く、Ｔ７５フラスコに移し、ＰＢＳで１００ｍｌに希釈した。各軟膜について、１３ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ／Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ Ｈ８８８９）をピペットで四個の５０ｍｌ遠心管に移し、２５ｍｌの希釈した血液サンプルを、境界面を崩壊させることなく、慎重にＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ／Ｆｉｃｏｌｌの上面に被せた。次いで、この管を２０分間遠心した（２０℃、２５００ｒｐｍ）。３ｍｌのプラスチックの移動ピペット（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｉｐｅｔｔｅ）を使用して、上面の血漿を単核細胞層に取り出し、その後ＰＢＭＣを２つの５０ｍｌ円錐管に移した（２個のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ／Ｆｉｃｏｌｌ／軟膜管の細胞を１つの管に）。次いで、ＰＢＭＣを、ＰＢＳを含む５０ｍｌ／管に希釈し、１０分間遠心して（２０℃、１０００ｒｐｍ）血小板を除去した。ＰＢＳの除去後、凝集を防止するために、ＰＢＭＣおよび残存するＲＢＣを混合した。５ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液（塩化アンモニウム緩衝液）を添加し、二つの管の細胞を１つの管に合わせた。ここで、各管は、一のドナーからの総ＰＢＭＣ単離体およびＲＢＣ単離体を含み、これを、室温で１０分間インキュベートした。潜在的な血球の塊を、細胞を細胞ろ過器（７０μｍ、Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号２３５０）でろ過することにより除去した。ＰＢＳを、５０ｍｌの総体積に添加し、その後、１０分間遠心（２０℃、１０００ｒｐｍ）した。最後に血球計数器を使用して細胞の数を計数した。
次に、各ＰＢＭＣ調製物の画分を前染色し、ＦＡＣＳにより分析し、１５％より多い割合の未刺激Ｔｈ０細胞を有するＰＢＭＣ調製物を選択した。２ｍｌのＰＢＭＣを、２０μｌ ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５ＲＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５４８８）、２０μｌ Ｃｙ−クロム結合抗ヒトＣＤ４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３４８）、１０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３６７）、１０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３９８）および１０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５６２３）で染色し、氷上で４５分間インキュベートした。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、４０μｍ細胞ろ過器（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号２３４０）でろ過した。未処理のＴＨ０細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに対してポジティブであって、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に対してネガティブ）をＦＡＣＳにより定量し、１５％より多い未処理のＴＨ０細胞を含むＰＢＭＣ調製物をアッセイのために選択した。
選択したＰＢＭＣ調製物を、８００μｌ ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、５００μｌのＣｙ−クロム結合抗ヒトＣＤ４、２００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８、５０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４および５０μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２０を用いて染色し、氷上で６０分間インキュベートした。この細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＩを添加し、そして、細胞を１０ｍｌ／ｍｌのＰＢＳで希釈した後、４０μｍ細胞ろ過器でろ過した。その細胞をＦＡＣＳ選別し、１×１０４の未処理ＴＨ０細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに対してポジティブであって、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に対してネガティブ）を、ＭＯＦＬＯによって９６ウェル丸底プレートの各ウェル（１６０μｌのＤＭＥＭ＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋２ｍＭのグルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）を含む）中に移した。
選択したＰＢＭＣ調製物を、８００μｌ ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、８００μｌのＣｙ−クロム結合抗ヒトＣＤ４、５００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８、２００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４および２００μｌ ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２０を用いて染色し、氷上で６０分間インキュベートした。この細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＩを添加し、そして、細胞を２０ｍｌ／ｍｌのＰＢＳで希釈した後、４０μｍ細胞ろ過器でろ過した。その細胞をＦＡＣＳ選別し、１×１０４の未処理ＴＨ０細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに対してポジティブであって、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に対してネガティブ）を、ＭＯＦＬＯによって９６ウェル丸底プレートの各ウェル（１６０μｌのＤＭＥＭ＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋２ｍＭのグルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）を含む）中に移した。
２０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔエキスパンダー（Ｄｙｎａｌ、カタログ番号１１１．３２）を各ウェルに添加した。ロット間の変動を避けるために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの刺激効果を、実験の前に、較正した。次に、２０μｌ／ウェルのタンパク質サンプルをアッセイプレートに添加した。一般的に、ＩＬ−４およびＩＬ−１２標準（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）に対する濃度は、０．０４ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＩＦＮ−α試験サンプルおよびＩＦＮ−α参照サンプルに対する濃度範囲は、０．７６ｐｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌであった。
この細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で７日間インキュベートした。各ウェル由来の上清を回収し、ＴＨ１発現の程度を、ＩＦＮγ含有量の定量化を介して、標準的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
（分析）
反応＝ＩＦＮ−γ濃度（ｐｇ／ｍｌ）。
以下の式：
Figure 2008505985
 を、曲線のあてはめに使用した。
変数ボトムは、底のプラトー値におけるＹ値であり；トップは、最高のプラトー値におけるＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの間の中間である場合のＸ値である。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ方法を、最適化アルゴリズムとして使用した。
（Ｃ．Ｄａｕｄｉ抗増殖アッセイ）
インターフェロン−αポリペプチドおよび本発明の結合体の抗増殖活性についての例示的なアッセイを以下に提供する。
（細胞株の維持）
懸濁液中で増殖させたＤａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ細胞を、５０ｍｌ培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７１．０３） ＋ １×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ，Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１５１４０−１２２）＋２ｍＭグルタミン）を含むＴ１７５組織培養フラスコで、加湿した５％ ＣＯ２インキュベータ中３７℃で維持した。この細胞を、コンフルエントになったときに、１：１０に分割した。
（アッセイ手順）
Ｄａｕｄｉ細胞を、遠沈し、１×ＰＢＳで洗浄した。その細胞数を、１０５細胞／ｍｌに調節した。８０μｌの培養培地を、９６ウェル丸底アッセイプレートにおける各ウェルに添加し、次いで、１００μｌの細胞（１０４細胞／ウェル）を各ウェルに移した。
ＩＦＮ−α参照物質およびＩＦＮ−α試験サンプルの１１個の希釈物（２００ｎｇ／ｍｌ〜０．２ｐｇ／ｍｌの範囲（４倍希釈））を、培養培地を用いて希釈プレート中に調製した。次に、２０μｌの希釈ＩＦＮ−α調製物を、アッセイプレートに移した。
その細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃でインキュベートした。４８時間後、１μＣｉのメチル−３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＲＫ７５８）を各ウェルに添加し、続いて、加湿した５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で２４時間インキュベートした。その細胞を、次の日に採取し、チミジンの取り込みを決定した。
（分析）
ＩＦＮ−α参照およびサンプルのＥＣ５０を、以下の式を用いて計算した：
Figure 2008505985
 ここでボトムは、底のプラトー値におけるＹ値であり；トップは、最高のプラトー値におけるＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの間の中間である場合のＸ値である。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ方法を、最適化アルゴリズムとして使用した。
（実施例１：インターフェロン−αの表面接近残基の決定）
（ヒトインターフェロン−α ２ａ残基の表面露出：）
Ｋｌａｕｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７４：６６１−６７５（１９９７）によって報告されたヒトインターフェロン−α ２ａの２４個のＮＭＲ構造に基づいて、側鎖の部分ＡＳＡを、計算した。以下で使用される配列番号付けは、ヒトインターフェロン−α ２ａタンパク質（本明細書で配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして同定される）の成熟配列に基づく。この構造は、それぞれ、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ９８およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３８に関連する２つのジスルフィド架橋を含むことに注意のこと。ＡＳＡおよび部分ＡＳＡを計算し、２４個の構造の平均をとり、側鎖のＡＳＡに焦点を合わせることによって、以下の残基が、２５％より大きい部分ＡＳＡを有することが決定された：Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｑ５、Ｔ６、Ｈ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｇ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｍ１６、Ａ１９、Ｑ２０、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｌ２６、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｇ３７、Ｑ４０、Ｅ４１、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｎ４５、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ４９、Ａ５０、Ｅ５１、Ｅ５８、Ｑ６１、Ｑ６２、Ｎ６５、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｋ７０、Ｄ７１、Ｓ７３、Ａ７４、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｌ８０、Ｄ８２、Ｋ８３、Ｔ８６、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｅ９６、Ａ９７、Ｖ９９、Ｉ１００、Ｑ１０１、Ｇ１０２、Ｖ１０３、Ｇ１０４、Ｔ１０６、Ｅ１０７、Ｔ１０８、Ｐ１０９、Ｌ１１０、Ｍ１１１、Ｋ１１２、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｌ１１７、Ｒ１２０、Ｋ１２１、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｔ１２７、Ｌ１２８、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｙ１３５、Ｓ１３６、Ｐ１３７、Ｃ１３８、Ａ１４５、Ｍ１４８、Ｒ１４９、Ｓ１５２、Ｌ１５３、Ｎ１５６、Ｑ１５８、Ｅ１５９、Ｓ１６０、Ｌ１６１、Ｒ１６２、Ｓ１６３、Ｋ１６４およびＥ１６５（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして本明細書で同定されたインターフェロン−α ２ａ配列のものに対する位置番号付け）。
以下の残基が、平均してそれらの側鎖の５０％より大きい部分ＡＳＡを有することが決定された： Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｑ５、Ｔ６、Ｈ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｍ１６、Ａ１９、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｋ３１、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｇ３７、Ｅ４１、Ｇ４４、Ｎ４５、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ４９、Ｎ６５、Ｋ７０、Ａ７４、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｄ８２、Ｋ８３、Ｔ８６、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｉ１００、Ｑ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１０４、Ｔ１０６、Ｅ１０７、Ｔ１０８、Ｐ１０９、Ｌ１１０、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｌ１１７、Ｒ１２０、Ｋ１２１、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｌ１２８、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３４、Ｐ１３７、Ｒ１４９、Ｅ１５９、Ｌ１６１、Ｒ１６２、Ｓ１６３、Ｋ１６４およびＥ１６５（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋとして本明細書で同定されたインターフェロン−α ２ａ配列のものに対する位置番号付け）。
（配列番号１に対応する残基の表面露出：）
公知のヒトインターフェロンα配列（ＩＦＮ−α ２サブタイプは除く）および本発明の特定のポリペプチドの全てを含む、多くのインターフェロンα配列における、ヒトインターフェロン−α ２サブタイプ（例えば、インターフェロン−α ２ｂ（配列番号３２）およびインターフェロン−α ２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ）の４４位の後ろのアミノ酸の挿入のために、表面露出残基の位置の番号付けは、ｈＩＦＮα ２ｂ（配列番号３２）と示される配列の番号付けと比較して、例えば、アラインメントの図２において示される配列において、位置番号４４の１残基後ろまでシフトされる。
上記の分析に基づくと、以下の位置（配列番号１に比較して番号付け）は、２５％より大きい部分ＡＳＡを有するアミノ酸残基を含むと考えられる：２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、１６位、１９位、２０位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、３０位、３１位、３３位、３４位、３５位、３７位、４０位、４１位、４２位、４４位、４６位、４７位、４９位、５０位、５１位、５２位、５９位、６２位、６３位、６６位、６９位、７０位、７１位、７２位、７４位、７５位、７８位、７９位、８０位、８１位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、９４位、９５位、９７位、９８位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１８位、１２１位、１２２位、１２５位、１２６位、１２８位、１２９位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４６位、１４９位、１５０位、１５３位、１５４位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、および１６６位。
同様に、再度配列番号１と比較して番号付けされた以下の位置は、それらの側鎖の平均して５０％より大きい部分ＡＳＡを有するアミノ酸残基を含むと考えられる：２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１２位、１３位、１６位、１９位、２５位、２７位、２８位、３１位、３３位、３４位、３５位、３７位、４１位、４４位、４６位、４７位、４９位、５０位、６６位、７１位、７５位、７８位、７９位、８０位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、９４位、９５位、１０１位、１０２位、１０３位、１０５位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１４位、１１５位、１１８位、１２１位、１２２位、１２５位、１２６位、１２９位、１３２位、１３３位、１３５位、１３８位、１５０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、および１６６位。
（実施例２：インターフェロン−αポリペプチドの抗ウイルス活性）
慢性ＨＣＶ感染を有する患者は、１０４〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／ｍｌの範囲において初期ウイルス負荷を有する。ＩＦＮ−αで処置すると、そのウイルス負荷は、２つの異なる機構を反映する減少の２つの異なる対数直線期を特徴的に受ける（図１Ｂ）。ウイルス負荷における初期の低下は、ほぼ最初の２日間で起こり、ＩＦＮ−α治療に直面した感染肝臓細胞によるウイルス生成の速度の減少に起因していると考えられる。
ＨＣＶの主要な技術的困難性は、このウイルスがインビトロで増殖させられないことであり、ごく最近になって扱いやすい動物モデルにおいて培養されていることである。しかし、ＨＣＶウイルス複製にとっての有用な代理であると考えられる、インビトロで複製するウイルスが存在する。インビボでのＨＣＶ抗ウイルス活性が推測されると考えられるインビトロ代理アッセイとしては、上記の材料および方法において記載したアッセイが挙げられる。このアッセイは、ヒト肝臓由来の細胞株ＨｕＨ７においてＥＭＣ ＲＮＡを用いて、試験分子がウイルス感染の細胞変性効果から細胞を防御する能力を測定する。
本発明のいくつかのＩＦＮ−αポリペプチドの抗ウイルス活性を、上記の材料および方法の節で記載されるＥＭＣＶ／ＨｕＨ７抗ウイルスアッセイでアッセイした。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＥＣ５０（そのアッセイにおいて最大保護的応答の半分を生じるサンプル濃度）が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいかもしくはそれより低いことによって証明されるように、参照分子（例えば、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）またはｈｕＩＦＮ−α ２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ））の抗ウイルス活性とほぼ等しいかそれより大きい抗ウイルス活性を示した。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、（そのポリペプチドのＥＣ５０がそれぞれ、参照分子のＥＣ５０よりも約０．６６倍以下、約０．５倍以下、約０．２５倍以下、約０．２倍以下、または約０．１倍以下であることによって証明されるように）参照分子よりも、少なくとも約１．５倍大きい、少なくとも約２倍大きい、少なくとも約４倍大きい、少なくとも約５倍大きい、または少なくとも約１０倍大きい抗ウイルス活性を示した。
以下の表７は、同じ条件下でアッセイしたＩＦＮ−α Ｃｏｎ１およびヒトＩＦＮ−α ２ｂと比較した、本発明の例示的なＩＦＮ−αポリペプチドの相対的抗ウイルス活性を示す（ｈｕＩＦＮ−α ２ｂに対する抗ウイルス活性（ｈｕＩＦＮ−α ２ｂのＥＣ５０／サンプルのＥＣ５０）として表される）。
Figure 2008505985
 。
（実施例３：インターフェロンαポリペプチドのＴＨ１分化活性）
慢性ＨＣＶ感染を有する患者は、１ｍｌあたり１０４〜１０７コピーのＨＣＶ ＲＮＡの範囲の初期ウイルス量を有する。ＩＦＮ−αでの処置の際、このウイルス量は、特徴的に、２つの異なる機構を反映する低下の２つの異なる対数線形相となる（図１）。ウイルス量の初期の減少は、およそ最初の２日間で起こり、ＩＦＮ治療に応じて感染した肝細胞によるウイルス産生の速度の減少に起因すると考えられる。これは、およそ２日後に新しい定常状態をもたらし、そのときに第２のあまり迅速でないウイルスクリアランスの対数線形相が観察される。この第２の相は、抗原特異的Ｔ細胞による感染した肝細胞の死滅に起因すると考えられる。ＩＦＮ−α治療は、ＴＨ１細胞に分化するための抗原特異的Ｔ細胞の刺激によるこの生物学的応答において重要な役割を果たすと考えられる。
特定の理論に制限されることなく、ＴＨ０細胞からＴＨ１細胞の分化を刺激する改善された能力を有するインターフェロンαがウイルスクリアランスのより強力な第２相を示し得、そしてそれゆえウイルスクリアランスにおいて改善された効力を有し得ることが提案される。この作業仮説に基づいて、血液ドナーから単離された未刺激ＴＨ０細胞におけるインターフェロンαのＴＨ１分化活性を測定するために、アッセイを開発した。
いくつかの本発明のＩＦＮ−αポリペプチドのＴＨ１分化活性を、上の材料および方法の節に記載されるようにアッセイした。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのＥＣ５０（そのアッセイにおいて最大インターフェロン−γ産生の半分を生じるサンプル濃度）が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいことによって証明されるように、参照分子（例えば、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）またはｈｕＩＦＮ−α ２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ））のＴＨ１分化活性とほぼ等しいＴＨ１分化活性を示す。いくつかの本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのＥＣ５０が参照分子のＥＣ５０よりも低いことによって証明されるように、参照分子のＴＨ１分化活性よりも大きいＴＨ１分化活性を示した。例えば、ポリペプチドＢ９ｘ１４（配列番号３）およびＢ９ｘ２５（配列番号１２）は、参照ポリペプチドｈｕＩＦＮ−α ２ａよりも少なくとも１０倍大きいＴＨ１分化活性（すなわち、少なくとも１０倍低いＥＣ５０）を示した。
（実施例４インターフェロンαポリペプチドの抗増殖活性）
ＩＦＮ−αは、多くの細胞型の増殖を阻害するが、抗増殖効果は、抗ウイルス応答に必要とされるより高い用量で起こる。Ｄａｕｄｉ細胞は、ＩＦＮ−α感受性であるヒト由来ＥＶＢ形質転換Ｂ細胞株である。このＩＦＮ−α応答性細胞株は、本発明のＩＦＮ−αポリペプチドの抗増殖効果の有用なプローブとして働く。さらに、高用量での巨核球および好中球に対するＩＦＮ−αの抗増殖活性は、それぞれ、血小板減少症および好中球減少症の一因になると考えられている。このＤａｕｄｉ抗増殖アッセイは、これらの他のリンパ細胞型に対する抗増殖効果にとっての有用な代理アッセイとして働き得る。
いくつかの本発明のＩＦＮ−αポリペプチドの抗増殖活性を、上の材料および方法の節に記載されるようにアッセイした。いくつかの本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのＥＣ５０（そのアッセイにおいて最大チミジン取り込みの半分を生じる濃度）が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいことによって証明されるように、参照分子（例えば、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）またはｈｕＩＦＮ−α ２ａ（配列番号３２＋Ｒ２３Ｋ））の抗増殖活性とほぼ等しい抗増殖活性を示す。いくつかの本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのＥＣ５０が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいかまたはそれよりも低い（例えば、約０．７５倍、約０．５倍、または約０．２５倍）ことによって証明されるように、参照分子の抗増殖活性とほぼ等しいかまたはそれよりも大きい抗増殖活性を示す。いくつかの本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのＥＣ５０が参照分子のＥＣ５０とほぼ等しいかまたはそれよりも大きいことによって証明されるように、参照分子の抗増殖活性とほぼ等しいかまたはそれよりも低い抗増殖活性を示す。いくつかのそのような本発明のポリペプチドは、（そのポリペプチドのＥＣ５０がそれぞれ、参照分子のＥＣ５０の少なくとも約１．３倍以上、少なくとも約１．５倍以上、倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、または少なくとも１０倍以上であることによって証明されるように）参照分子の抗増殖活性よりも約０．７５倍以下、約０．６６倍以下、約０．５倍以下、約０．２５倍以下、約０．２倍以下、または約０．１倍以下の抗増殖活性を示す；そのような本発明のポリペプチドは、いずれにせよ測定可能な抗増殖活性を示す。
以下の表８は、同じ条件下でアッセイしたＩＦＮ−α ２ｂおよびＩＦＮ−α Ｃｏｎ１と比較した、本発明の例示的なポリペプチドの相対的抗増殖活性を示す（ｈｕＩＦＮ−α ２ｂに対する抗増殖活性（ｈｕＩＦＮ−α ２ｂのＥＣ５０／サンプルのＥＣ５０）として表される）。
Figure 2008505985
 。
（実施例５：インターフェロン−αポリペプチドのＰＥＧ化）
以下は、本発明の結合体を調製するためのいくつかの例示的な手順を提供する。
（Ｃｙｓ−ＰＥＧ化）
遊離システインを含む本発明のポリペプチド（例えば、Ｂ９ｘ１４ＣＨＯ６（配列番号４９）、これは１６４位にシステインを含む）は、以下のようにシステイン−ＰＥＧ化され得る。ポリペプチドを、まず、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０中、４℃にて３０分間、等モル濃度のＴＣＥＰ（トリスカルボキシエチルホスフィン）で部分的に還元する。次いで、還元されたポリペプチドを、同じ条件下、４℃にて１時間、４倍モル過剰のｍＰＥＧ−ＭＡＬ試薬（２０ｋＤａもしくは３０ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧ、または、４０ｋＤａの分枝ｍＰＥＧ２のようなＰＥＧ部分）と反応させる。ＰＥＧ化された反応混合物を、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳＰ−セファロースＨＰカラム上に充填する。１０ＣＶ（カラム容積）の洗浄工程の後、０〜６００ｍＭ ＮａＣｌの勾配を適用して、ＰＥＧ化されている画分とＰＥＧ化されていない画分とを分画する。画分を回収し、アリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。モノＰＥＧされた種を含む画分をプールし、上記のように、インターフェロン−α活性についてのアッセイのために処方する。
（Ｎ末端ＰＥＧ化）
配列番号４７を含む本発明のポリペプチドを、最初に、透析またはゲル濾過によって５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）に緩衝液交換し、そして１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その後、そのポリペプチドを透析によって１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４）に緩衝液交換した。透析の間に時折形成された沈殿物をすぐに再溶解させた。タンパク質溶液を４℃に冷却した。タンパク質よりも４倍〜１０倍のモル過剰の乾燥粉末ｍＰＥＧ２−ブチルＡＬＤ４０ｋＤａ（Ｎｅｋｔａｒ；Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）をそのタンパク質溶液に添加し、攪拌棒を用いて攪拌した。この攪拌速度を泡立たせずにできるだけ早く保った。その後、１００ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ４）中の１／１０体積の２００ｍＭ ＮＡＣＮＢＨ３を添加した。この反応は数時間後に完了したが、一晩放置し得る。この溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４）（必要に応じて、０．０５％ ＴＷＥＥＮ８０を含む）で５倍〜１０倍に希釈した。このサンプルを濾過し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰＦＦカラムにロードした。このカラムを、１０〜１５カラム容積の開始緩衝液で広範に洗浄した。同じ緩衝液の１００ｍｍ〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配を使用して、非ＰＥＧ化タンパク質からＰＥＧ化タンパク質を分離した。ＰＥＧ化タンパク質を含む画分をプールし、インターフェロンα活性アッセイに対して配合し、いくつかの例では、アミノ酸分析および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によってさらに特徴付けした。予備実験は、配列番号４７を含む本発明のポリペプチドが、上に記載されるようにＮ末端がＰＥＧ化された場合に、リジンモノＰＥＧ化ｈｕＩＦＮ−α ２ａ結合体よりも１０倍を超える抗ウイルス活性を示すことを示す。
（Ｌｙｓ−ＰＥＧ化）
リジンＰＥＧ化を、本質的にＦｏｓｅｒら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３０：７８−８７に記載されるような手順を用いて行った。配列番号４７を含む本発明のポリペプチドを、透析またはゲル濾過によって５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）に緩衝液交換し、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。この溶液を２℃〜８℃に冷却した。タンパク質よりも３倍〜４倍のモル過剰の乾燥粉末ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ ４０ｋＤａ（Ｎｅｋｔａｒ；Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）をこのタンパク質溶液に添加し、そして攪拌棒を用いて攪拌した。この攪拌速度を泡立たせずにできるだけ早く保った。この反応は約１時間後に完了し（しかし、いくつかの例では、一晩（例えば、８時間）行い得る）、その後、反応物を５０ｍｍ酢酸ナトリウム、１００ｍｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５）（必要に応じて、０．０５％ ＴＷＥＥＮＥ８０を含む）で８倍〜１０倍に希釈した。このサンプルを濾過し、５０ｍｍ酢酸ナトリウム、１００ｍｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰＦＦカラムにロードした。このカラムを１０〜１５カラム容量の開始緩衝液で広範に洗浄した。同じ緩衝液の１００ｍｍ〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いて、非ＰＥＧ化タンパク質からＰＥＧ化タンパク質を分離した。モノＰＥＧ化種を含む画分をプールし、上記のようなインターフェロンα活性アッセイに対して配合した。モノＰＥＧ化Ｂ９ｘ１４ＥＣ４組成物は、モノＰＥＧ化ＩＦＮ−α ２ａよりも１０倍を超える抗ウイルス活性を示した。
いくつかの場合において、上記のようにして得られたモノＰＥＧ化プールを、ＰＥＧ−アイソマープロフィールを特徴づけるために、ポリスルホエチルＡカラム（２．１ｍｍＩＤ×２００ｍｍＬ、５ｍ、１０００Ａ°、ＰｏｌｙＬＣ製）を用いるカチオン交換ＨＰＬＣによりさらに分析した。移動相は、緩衝液Ａ：５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、４０％ １−プロパノール、１％ ジエチルグリコール、ｐＨ３．０、および緩衝液Ｂ：２００ｍＭ ＮａＣｌを含むＡと同じであった。ＰＥＧ位置異性体を、２０℃で、０．１ｍｌ／分で８０分間にわたる５０％〜７５％移動相Ｂの勾配を用いて分離した（検出は２１４ｎｍ）。
図８は、上記の手順に従う、インターフェロン−αポリペプチドＢ９ｘ１４ＥＣ４と４０ｋＤａ ｍＰＥＧ２−ＮＨＳとの反応から得られたモノＰＥＧ化したプールのカチオン交換ＨＰＬＣによる分離を示す。このピークを収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図９）。図９のレーン２およびレーン９は、ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ＨＰＬＣカラムに適用する前のサンプルがモノＰＥＧ化タンパク質を主に含むことを示す。ピーク１〜４（図９のレーン３〜６）は、モノＰＥＧ化したプール中の小さな割合のジＰＥＧ化ＩＦＮに対応する。小さなピーク５（図９のレーン７）は、ほぼ等しい割合のジＰＥＧ化種、モノＰＥＧ化種および低分子量種を含む。ピーク６〜１１（図９のレーン１０〜１５）は、モノＰＥＧ化ＩＦＮポリペプチドの位置異性体に対応する。
（実施例６：インビボアッセイ）
（本発明のポリペプチドまたは結合体の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび薬力学（ＰＤ）プロフィールの測定）
生物学的半減期または血清半減期の測定は、文献に記載される多数の方法で実施し得る。例えば、生物学的半減期は、例えば、皮下投与または筋肉内投与後のインターフェロン−αの血清レベルを検出するＥＬＩＳＡ法を用いて決定され得る。皮下投与されたインターフェロン−αの薬物動態を決定するためのＥＬＩＳＡ法の使用は、例えば、Ｒｏｓｔａｉｎｇら（１９９８），Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９（１２）：２３４４−４８により記載されている。Ｍｅｒｉｍｓｋｙら（１９９１），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２７（５）；４０６−８は、筋肉内投与されたインターフェロン−αの血清レベルの決定を記載する。
例えば、本発明の結合体の薬物動態（ＰＫ）プロフィールおよび薬力学（ＰＤ）プロフィールは、以下の手順に従って、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において研究され得る。平均体重５〜６ｋｇの３〜４歳齢のメス動物を、研究において使用する。動物を、到着してから処置の開始の間までに（研究飼育条件に最低３週間慣れさせるとともに）最低６週間慣れさせる。それらを、ステンレス鋼のメッシュケージ（少なくとも５４０×８１０×７６０ｍｍ）中で１匹ずつ飼育し、化学的汚染および細菌汚染の非存在について分析した膨脹させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）完全に市販の霊長類用飼料（１００ｇ／動物／日）で維持する。さらに、動物には、果実（リンゴまたはバナナ）を１日に１回与える。動物を、麻酔を要する全ての手順の前に、絶食させる。
研究開始の三日前、および化合物を投与する前の研究開始の当日に、血液サンプルを、全ての動物から採取した。研究の間中、血液サンプル（全血１ｍｌ）を、麻酔をしていない手で保定した動物の大腿静脈または橈側皮静脈／伏在静脈から採血する。通常の供給レジメンを、収集の間に維持する。サンプルを、抗凝固剤なしのチューブ中に集め、３０００ｒｐｍ（約１７６０ｇ）で１０分間、４℃で遠心分離する。次いで、血清サンプルを、２つのアリコートに分け（各約２００μｌ）、−２０℃で保存する。
研究の開始前に、本発明の結合体を、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）および１４０ｍＭ 塩化ナトリウム中に処方する。研究開始時に、その結合体を、エチルアルコール水溶液で局所的に消毒した後に、皮下に導入した滅菌シリンジおよび針を用いて、３０ｍｃｇ 結合体／ｋｇ 動物体重（４匹の動物）、または３００ ｍｃｇ／ｋｇ（４匹の動物）のいずれかで、動物１匹あたり１回投与する。血液サンプルを、結合体を投与してから以下の時点で集める：４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、１４４時間後、２４０時間後、３３６時間後、４５６時間後、５５２時間後、６００時間後、６２４時間後、６４８時間後、６７２時間後、６９６時間後、７２０時間後および７４４時間後。
その動物を、任意の臨床的徴候または処置に対する反応を検出するために毎日観察する。注射の部位を、局所的寛容性を評価するために毎日肉眼で評価する。詳細な臨床調査を、処置の開始前および研究終了時に行う。
単離された血清サンプル中の結合体の濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、研究の完了後に決定する。次いで、カニクイザルにおける結合体のインビボ半減期を、特定の時点での化合物の血清濃度に基づいて決定する。
カニクイザルにおける本発明の結合体での処置に対する薬力学応答は、血清サンプルの各々において、市販のＲＩＡ（Ｅｉｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ）および市販のＥＬＩＳＡ（ＩＢＬ Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ．）を用いて、それぞれ、２’，５’−オリゴアデニレートシンターゼおよびネオプテリンのレベルを評価することによって評価される。血清サンプル中のインターフェロン活性についてのこれら２つのバイオマーカーの測定される濃度に基づいて、曲線下面積（ＡＵＣ）を、２つの投与量の各々において、各化合物のインビボ活性を定量するために決定する。
（インビトロ免疫原性の決定）
参照分子に対する本発明のポリペプチドまたは結合体の免疫原性の減少を、参照分子または調製物（代表的には（公知のインターフェロン−αタンパク質）に対するこの分子の免疫原性を測定する、ＥＬＩＳＡ法を使用することによって決定し得る。ＥＬＩＳＡ法は、参照タンパク質で処置された患者に由来する抗体に基づく。免疫原性は、本発明のポリペプチドまたは結合体が、参照分子もしくは調製物よりも、アッセイにおいて統計的に有意に低い応答を有する場合に、減少したと考えられる。
上記の本発明は、明確にする目的および理解する目的のためにいくらか詳細に記載されているが、種々の形式および詳細の変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本開示を読むことによって、当業者に明らかである。本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、これらを考慮する種々の改変または変更が、当業者によって示唆され、本出願の精神および範囲、ならびに、添付の特許請求の範囲内に含まれ得ることが理解される。例えば、上記の全ての技術および装置が、種々の組合せで使用され得る。本出願中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願および／または他の文献が、あらゆる目的でその全体が本明細書中に参考として援用されていると示されるのと同じ程度に、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
図１Ａおよび図１Ｂは、ＩＮＦ−α処置後のＨＣＶ感染細胞からのウイルスクリアランスについての二相時間経過（Ａ．非応答者反応速度；Ｂ．応答者反応速度）を示す。 図２は、本発明のポリペプチドの配列（配列番号１）と以下のヒトインターフェロンαポリペプチド配列：ｈｕＩＦＮ−α １ａ（配列番号３１）、ｈｕＩＦＮ−α ２ｂ（配列番号３２）、ｈｕＩＦＮ−α ４ｂ（配列番号３３）、ｈｕＩＦＮ−α ５（配列番号３４）、ｈｕＩＦＮ−α ６（配列番号３５）、ｈｕＩＦＮ−α ７（配列番号３６）、ｈｕＩＦＮ−α ８ｂ（配列番号３７）、ｈｕＩＦＮ−α １０ａ（配列番号３８）、ｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）、ｈｕＩＦＮ−α １６（配列番号４０）、ｈｕＩＦＮ−α １７ｂ（配列番号４１）およびｈｕＩＦＮ−α ２１ｂ（配列番号４２）とのアラインメントを示す。ｈｕＩＦＮ−α配列についての命名法は、Ａｌｌｅｎ Ｇ．およびＤｉａｚ Ｍ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１６：１８１−１８４に従う。矢印は、配列番号３１〜配列番号４２のいずれにも存在しない、配列番号１の残基Ｈｉｓ４７、Ｖａｌ５１、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５６、Ｔｙｒ５８、Ｌｙｓ１３３およびＳｅｒ１４０を示す。配列番号１と同一である配列番号３１〜４２のアミノ酸残基の位置はピリオド（．）で示され、配列中のギャップはダッシュ（−）で示される。 図３は、以下のパラメータ：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ開始ペナルティ１１、ギャップ伸長ペナルティ１を用いる、本発明のポリペプチドの配列とｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）（ＬｅＩＦ Ｈ；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２０−２６）とのアラインメントである。配列番号３と同一である配列番号３９におけるアミノ酸位置は、ピリオド（．）で示される。 図４は、本発明のポリペプチドの配列とヒトインターフェロンαポリペプチド配列（配列番号３１〜配列番号４２）とのアラインメントを示す。配列番号８と同一である配列番号３１〜４２におけるアミノ酸残基の位置は、ピリオド（．）で示され、配列中のギャップはダッシュ（−）で示される。 図５は、以下のパラメータ：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ開始ペナルティ１１、ギャップ伸長ペナルティ１を用いる、本発明のポリペプチドの配列とｈｕＩＦＮ−α １４ａ（配列番号３９）（ＬｅＩＦ Ｈ；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２０−２６）とのアラインメントを示す。配列番号１２と同一である配列番号３９におけるアミノ酸位置は、ピリオド（．）で示される。 図６は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを示す。 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、以下のパラメータ：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ開始ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１を用いる、最適配列アラインメントを決定するために使用されるアラインメントスコアの計算例を示す。 図８は、例示的なモノＰＥＧ化したインターフェロンα結合体の位置異性体のカチオン交換ＨＰＬＣによる分離を示す。 図９は、図８のカチオン交換ＨＰＬＣ分離に由来する画分のＳＤＳ＿ＰＡＧＥゲルを示す。

Claims (24)

  1. （ａ）必要に応じてＮ末端にメチオニンをさらに含む配列番号３、配列番号１２、配列番号４７、配列番号５３、配列番号１、配列番号８、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から選択される配列と０〜１６個のアミノ酸位置が異なる配列を含むポリペプチド；ならびに
    （ｂ）該ポリペプチドのリジン残基と共有結合する４０ｋＤａのｍＰＥＧ２部分
    を含む結合体であって、
    該結合体が、抗ウイルス活性を示す、結合体。
  2. 配列番号３と０〜１６個のアミノ酸位置が異なる配列を含む、請求項１に記載の結合体。
  3. 配列番号３と０〜８個のアミノ酸位置が異なる配列を含む、請求項２に記載の結合体。
  4. 配列番号１２と０〜１６個のアミノ酸位置が異なる配列を含む、請求項１に記載の結合体。
  5. 配列番号１２と０〜８個のアミノ酸位置が異なる配列を含む、請求項４に記載の結合体。
  6. 請求項１に記載の結合体と薬学的に受容可能な賦形剤とを含む組成物。
  7. 請求項１に記載の結合体を調製するための方法であって、該方法は、
    （ｉ）項目（ａ）のポリペプチドを提供する工程、および
    （ｉｉ）４０ｋＤａのｍＰＥＧ２を該ポリペプチドのリジン残基に結合させる工程
    を包含し、得られる結合体が抗ウイルス活性を示す、方法。
  8. 前記ポリペプチドを提供する工程が、
    宿主細胞を含む培養物を提供する工程であって、該宿主細胞が核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含み、該核酸が該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、工程、
    該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で該培養物を培養する工程、および
    該ポリペプチドを回収する工程
    を包含する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記宿主細胞が、グリコシル化宿主細胞または細菌宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記細菌宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドを回収する工程が、
    （ａ）該ポリペプチドを含む封入体（ＩＢ）を単離する工程；
    （ｂ）該ＩＢを可溶化し、それによってアンフォールディングしたポリペプチドを得る工程；
    （ｃ）該アンフォールディングしたポリペプチドをリフォールディングし、それによってリフォールディングしたポリペプチドを得る工程；および
    （ｄ）該リフォールディングしたポリペプチドを精製する工程
    を包含する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記４０ｋＤａのｍＰＥＧ２を前記ポリペプチドのリジン残基に結合させる工程が、
    該ポリペプチドと、３倍〜４倍のモル過剰の４０ｋＤａのｍＰＥＧ２−ＮＨＳとを、ｐＨ９、２〜８℃で１〜８時間反応させる工程
    を包含する、請求項７に記載の方法。
  13. ウイルスに感染した患者の血清中のウイルスレベルを低下させるための方法であって、該方法は、処置の開始前時点のレベルと比較して該血清中の該ウイルスレベルを低下させるために有効な量で、請求項１〜６に記載の結合体を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  14. 前記ウイルスが、ＨＣＶ、ＨＩＶまたはＨＢＶである、請求項１３に記載の方法。
  15. ウイルスに感染した細胞中のウイルスのコピー数を減少させるための方法であって、該方法は、該細胞中のウイルスのコピー数を減少させるために有効な量で、請求項１〜６に記載の結合体を該細胞に投与し、それによって該細胞中の該ウイルスのコピー数を減少させる工程を包含する、方法。
  16. ＨＣＶに感染した患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡレベルを低下させるための方法であって、該方法は、処置の開始前時点のＨＣＶ ＲＮＡレベルと比較して該ＨＣＶ ＲＮＡレベルを低下させるために有効な量で、請求項１〜６に記載の結合体を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  17. ＨＢＶに感染した患者の血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベルを低下させるための方法であって、該方法は、処置の開始前時点のＨＢＶ ＤＮＡレベルと比較して該ＨＢＶ ＤＮＡレベルを減少させるために有効な量で、請求項１〜６に記載の結合体を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  18. ＨＩＶに感染した患者の血清中のＨＩＶ ＲＮＡレベルを低下させるための方法であって、該方法は、処置の開始前時点のＨＩＶ ＲＮＡレベルと比較して該ＨＩＶ ＲＮＡレベルを減少させるために有効な量で、請求項１〜６に記載の結合体を該患者に投与する工程を包含する、方法。
  19. 医薬として使用するための、請求項１〜６に記載の結合体。
  20. 疾病の処置において使用するための医薬の製造のための、請求項１〜６に記載の結合体の使用。
  21. ウイルス疾患の処置において使用するための医薬の製造のための、請求項１〜６に記載の結合体の使用。
  22. ウイルスに感染した細胞中のウイルスのコピー数を減少させるための医薬の製造のための、請求項１〜６に記載の結合体の使用。
  23. ウイルスに感染した患者の血清中のウイルスレベルを低下させるための医薬の製造のための、請求項１〜６に記載の結合体の使用。
  24. 前記ウイルスが、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはＨＩＶである請求項２２〜２３のいずれかに記載の使用。
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