KR20070022279A - 인터페론-알파 폴리펩티드 및 컨쥬게이트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터페론-알파 폴리펩티드 및 컨쥬게이트와, 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드, 컨쥬게이트 및 핵산을 포함하는 조성물; 상기 폴리펩티드, 컨쥬게이트 및 핵산을 포함하거나 또는 발현하는 세포; 상기 폴리펩티드, 컨쥬게이트 및 핵산을 제조하는 방법; 그리고 상기 폴리펩티드, 컨쥬게이트 및 핵산을 사용하는 방법을 포함한다.

Description

인터페론-알파 폴리펩티드 및 컨쥬게이트{INTERFERON-ALPHA POLYPEPTIDES AND CONJUGATES}

관련 출원에 대한 참고 문헌

본 출원은 35 U.S.C.§119(e)에 따라서, 본원에 그 전체가 참고 문헌으로 인용되어 있는, 2004년 5월 19일자 출원된 미국 가출원 제 60/572,504호를 기초로 우선권을 주장한다.

본 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 폴리뉴클레오티드 및 이로부터 암호화된 폴리펩티드, 폴리펩티드의 컨쥬게이트(conjugate), 벡터, 세포, 항체, 그리고 상기 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 컨쥬게이트의 이용 및 제조 방법에 관한 것이다.

인터페론-알파는 사이토카인 유전자의 다양한 나선 다발형 상과의 일원이다[Sprang, S. R.외 다수. (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:815∼827]. 인간의 인터페론-알파는 아미노산 수준에서 85∼98%의 서열 상동성을 공유하는 유사유전자 및 20개 이상의 일렬 중복 존재하는 비 대립 유전자 군에 의해 암호화된다[Henco, K.외 다수. (1985) J. Mol. Biol. 185:227∼260]. 활성 인터페론-알파 단백질을 발현하는 유전자는 유전자 위치에 따라서 13개의 군으로 분류된다. 공지의 발현 인간 인터페론-알파 단백질 및 이의 대립형질 변이체에 관하여는 문헌[Allen G. and Diaz M. O. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:181∼184.]에 도표로 나타내었다.

인터페론-알파는 다양한 유형의 세포 증식을 억제하고, 특히 종종 암과 관련된 다양한 세포 증식형 질병, 구체적으로 혈액암 예를 들어, 백혈병의 치료에 유용한 것으로 알려져 있다. 이 단백질은 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 저도 림프종, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 신장 세포 암종, 비뇨기성 방광 종양 및 난소암에 대하여 항증식 활성을 나타낸다[Bonnem, E. M.외 다수, (1984) J. Biol. Response Modifiers 3: 580; Oldham, R.K.(1985) Hospital Practice 20:71).].

인터페론-알파는 또한 다양한 유형의 바이러스성 감염에 대해서도 유용하다[Finter, N. B.외 다수. (1991) Drugs 42 (5):749]. 인터페론-알파는 인간 파필로마 바이러스 감염, B형 간염 및 C형 간염의 감염에 대해서도 활성을 갖는다[Finter, N. B.외 다수 , 1991, 상동; Kashima, H.외 다수 (1988) Laryngoscope 98: 334; Dusheiko, G. M.외 다수. (1986) J. Hematology 3 (Supple.2):S199; Davis, GL외 다수 (1989) N. England J. Med. 321:1501)]. 임의의 자가면역성 질환 및 염증성 질환의 병인에 있어서 인터페론 및 인터페론 수용체의 역할도 또한 연구된 바 있다[Benoit, P.외 다수 (1993) J. Immunol. 150 (3):707)].

비록 이 단백질이 다수의 질병 치료에 있어서 치료학적 가치를 갖는다 하여도, 의약 용도로서 최적화되지는 않았다. 예를 들어, 투여량-제한적 독성, 수용체 교차 반응성 및 짧은 혈청 반감기는 다수의 사이토카인의 임상적 유용성을 상당히 떨어뜨린다[Dusheiko, G. (1997) Hepatology 26:112S∼ 12 IS; Vial, T. and Descotes, J. (1994) Drug Experience 10:115∼150; Funke, I.외 다수. (1994) Ann. Hematol. 68: 49∼52; Schomburg, A.외 다수. (1993) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 119:745∼755)]. 인터페론 투여시 수반되는 다양하고 심각한 부작용 프로필로서는 감기 유사 증상, 피로감, 환각, 발열, 간 효소 증가 및 백혈구 감소증을 포함한다[Pontzer, C. H.외 다수. (1991) Cancer Res. 51: 5304; Oldham, 1985, 상동].

C형 간염 바이러스(HCV)는 증식 속도가 매우 빠른 비숙주 통합 RNA 바이러스(nonhost integrated RNA virus)로서, 유전자의 다양성과 깊은 관련이 있다. HCV RNA중 6개 이상의 유전자형 및 30개 이상의 아형이 동정되었다. HCV 유전자형은 IFN-알파 치료법에 대한 반응성의 예보성 지표인 것으로 밝혀졌다. HCV 제2 및 제 3 유전자형으로 감염된 환자는 일반적으로 인터페론 치료에 반응을 잘하는 것으로 알려졌다. 제4, 5 및 6 유전자형으로 감염된 환자들은 이보다는 반응성이 떨어지는 성향이 있다. HCV 제1 유전자형으로 감염된 환자들은 인터페론 치료에 거의 반응하지 않는 성향이 있어서, 제1 유전자형 환자들 중 약 50%는 IFN-알파 치료에 대해 "무반응자"로 분류된다. 제1 유전자형은 현재 가장 널리 알려져 있는 C형 간염의 한 형태로서, 미국에서는 약 70%, 유럽에서는 약 50%의 환자들이 이에 감염되어 있는 것으로 확인된다. 분명한 점은 HCV 감염, 구체적으로 제1 유전자형 변이체에 대하여 더욱 효과적인 치료법의 개발이 절실히 필요하다는 점이다.

제1 유전자형 HCV(및 기타 아형)가 중요 IFN 반응성 단백질 예를 들어, dsRNA∼활성화 세린/트레오닌 단백질 키나제 PKR을 억제함으로써 IFN-알파 시그널링 경로를 상당히 약화시킨다는 유전적 및 생화학적 증거들이 있다[Katze M. G.,외 다수. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2(9):675∼687]. 이와 같은 항바이러스성 반응의 활성 억제 및 유전자 다양성으로 인하여, HCV(구체적으로 제1 유전자형)는 숙주의 면역 감시를 피하는 능력을 갖게 되며, 그 결과 만성 감염 속도가 증가하게 된다. HCV의 과도한 유전자 이종성은 임상 경로의 변형, 백신 개발의 곤란성 및 치료에 대한 반응성의 결여를 잠재적으로 설명해주는, 중요한 진단학적 및 임상학적 함축성을 내포한다.

본 발명은 항바이러스성 및/또는 면역조절 효능이 강화된 인터페론-알파 분자에 대한 필요성을 반영한 것이다. 본 발명은 신규의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 폴리펩티드 컨쥬게이트, 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 그리고 이러한 분자들을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 분자들은 다양한 분야 예를 들어, 구체적으로 바이러스 감염, 질환 및 바이러스 감염과 관련된 질병들을 치료 및 예방하는 방법에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 본 발명은 이러한 요구 및 기타 필요성을 실현한 것이다.

발명의 개요

본 발명은 신규의 폴리펩티드 예를 들어, 이러한 폴리펩티드의 변이체 및 이 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분과 공유적으로 결합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 컨쥬게이 트를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것을 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 이러한 폴리펩티드, 컨쥬게이트 및 핵산을 제조 및 사용하는 방법과, 보다 상세히 연구함에 따라서 명백해지는 기타 특징들을 제공한다.

제1측면에 있어서, 본 발명은 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하는데, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44 (예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 10, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44 중 어느 하나)중 어느 하나로서 동정되는 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 그리고 이 폴리펩티드를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된, 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또 는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산, 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치 의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 추가로 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부 예를 들어, H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 이러한 폴리펩티드를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 13과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 및 114번 위치의 Pro(위치번호는 서열 번호 13에 관한 것임)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 서열 번호 13과 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산, 예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 추가로 서열 번호 13에 대한 하나 이상의 치환부 예를 들어, H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택되는 치환부(들)를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드들 중 일부는 추가로 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트 및 이 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 대한 하나 이상의 치환부 예를 들어, M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P 및 E160D로 이 루어진 군에서 선택되는 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 P26L; H47Q; T51V; S55P/F; V56L; H58Y; L60M; F90Y; M93L; N95D; N113K; V114E; R125Q; T132K; 및L154F로 이루어진 군에서 선택되는 서열 번호 36에 대한 하나 이상의 치환부를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 이러한 폴리펩티드를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 38과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 21번 위치 Ala; 24번 위치 Pro; 48번 위치 Ala 또는 Leu; 51번 위치 Pro; 55번 위치 Ala; 65번 위치 Ala; 68번 위치 Pro; 90번 위치 Ala; 93번 위치 Pro; 111번 위치 Ala; 114번 위치 Pro; 124번 위치 Ala; 127번 위치 Pro; 및 160번 위치 Glu(위치 번호는 서열 번호 38에 관한 것임)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 서열 번호 38과 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산, 예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 추가로 서열 번호 38에 대한 하나 이상의 치환부 예를 들어, P26L; H47Q; V51T; F55P/S; L56V; Y58H; L60M; F90Y; M93L; N95D; N113K; V114E; R125Q; T132K; 및 F154L로 이루어진 군에서 선택되는 치환부(들)를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드들 중 일부는 추가로 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트 및 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 그리고 이 폴리펩티드의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 예를 들어, 전술한 본 발명의 폴리펩티드 중 일부의 것과, 이 폴리펩티드의 결합기에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공하는데, 여기서 상기 컨쥬게이트는 인터페론-알파 활성을 나타낸다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 비-폴리펩티드 부분은 중합체(예를 들어, 산화폴리알킬렌 분자 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 예를 들어, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)) 또는 당 부분이다. 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분은 예를 들어, 시스테인, 리신, 폴리펩티드의 N-말단 아미노기, 또는 폴리펩티드의 생체내 글리코실화 위치에 결합될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 컨쥬게이트의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것을 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포 및 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포들을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

제2측면에서, 본 발명은 바이러스 감염 세포내에서 바이러스 증식을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 바이러스-감염된 세포와 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 바이러스-감염된 세포와 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스-감염된 세포내에서 바이러스 복사체 수를 감소시키는 방법을 제공한다.

제3측면에서, 본 발명은 인터페론-알파에 반응성인 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 질환을 나타내는 개체에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 질환과 관련된 증상을 경감시키는데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 질환들로서는 만성 C형 간염의 감염, 만성 B형 간염의 감염, 모상 세포 백혈병, 악성 흑색종, 여포성 림프종, 첨형 콘딜로마, AIDS-관련 카포시 육종, 비호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병, 기저 세포암, 다발성 골수종, 유암종, 방광암, 크론병, 피부 T 세포 림프종, 신장 세포 암종, 다발성경화증 및 AIDS를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 사용하여 인터페론-알파에 반응성인 증상 예를 들어, 전술한 증상들을 치료하는 방법을 포함한다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 특징 들은 이하 상술한 발명의 상세한 설명 및 첨부 도면을 통하여 보다 명백해질 것이다.

도 1a 및 도 1b는 HCV 감염된 세포에 IFN-알파 처리를 한 후 바이러스의 소멸률을 경시적으로 나타낸 2가지 형태의 그래프를 나타내는 것이다[A.무반응 개체의 동력학; B. 반응 개체의 동력학]

도 2는 다음과 같은 인간 인터페론-알파(huIFN-알파) 폴리펩티드 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드 서열(서열 번호 13)의 배열을 나타내는 것이다: huIFN-알파 1a(서열 번호 45),huIFN-알파 2b(서열 번호 46), huIFN- 알파 4b(서열 번호 48), huIFN-알파 5(서열 번호 49), huIFN-알파 6(서열 번호 50), huIFN-알파 7(서열 번호 51), huIFN-알파 8b(서열 번호 52), huIFN-알파 10a(서열 번호 53), huIFN-알파 14a(서열 번호 54), huIFN-알파 16(서열 번호 55), huIFN-알파 17b(서 열 번호 56) 및 huIFN-알파 21b(서열 번호 57). huIFN-알파 서열에 대한 명명 관습은 문헌[Allen G. and Diaz M. O. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:181∼184]에 따른다. 서열 번호 13과 동일한 서열 번호 45∼46 및 48∼57의 아미노산 잔기 위치는 마침표 "."로, 그리고 서열중 갭은 대쉬 "/"로 표시하였다.

도 3은 인간 인터페론-알파 폴리펩티드 서열인 서열 번호 45∼46 및 48∼57을 갖는 본 발명의 폴리펩티드 서열(서열 번호 38)의 배열을 나타내는 것이다. 서열 번호 38과 동일한 서열 번호 45∼46 및 48∼57중 아미노산 잔기 위치는 마침표 "."로, 서열 내갭은 대쉬"/"로 표시하였다.

도 4는 BLOSUM62 치환 매트릭스를 나타내는 것이다.

도 5a, 5b 및 5c는 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 최적 서열 배열을 결정하는데 사용된 배열 스코어의 계산 결과를 나타내는 예이다: BLOSUM62 매트릭스, 갭 개방 페널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1.

도 6 및 도 7은 각각 OripBR∼URA3∼IacI_14epi18∼mut2 및 OripBR∼URA3∼lacI_25epil9∼mut라 명명된 이. 콜라이(E.Coli) 발현 벡터를 나타내는 것이다.

도 8은 대표적인 PEG화 인터페론-알파 컨쥬게이트의 위치상 이성체의 양이온 교환 HPLC를 통한 분리 결과를 나타내는 것이다.

도 9는 도 8의 양이온 교환 HPLC 분리물로부터 얻은 분획의 SDS-PAGE 겔 결과를 나타내는 것이다.

정의

본원에서 달리 정의하지 않거나 또는 본 명세서 전체에 걸쳐서, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당업자들에 의해 일반적으로 이해되고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.

"폴리펩티드 서열"(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 등)은 천연 생성된 아미노산 또는 인공적인 아미노산 유사체를 포함하는 아미노산의 중합체, 또는 문맥에 따라서 아미노산 중합체를 표시하는 문자열을 의미한다. 유전자 암호의 축퇴성에 의하여, 하나 이상의 핵산 또는 이의 상보성 핵산 즉, 특정 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산은 폴리펩티드 서열로부터 결정될 수 있다.

"폴리뉴클레오티드 서열"(예를 들어, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 등)은 뉴클레오티드 A, C, T, U, G 또는 기타 천연 생성된 뉴클레오티드 또는 인공적인 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 뉴클레오티드 중합체이거나, 또는 문맥에 따라서 핵산을 표시하는 문자열을 의미한다. 소정의 핵산 또는 상보적 핵산은 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열로부터 결정될 수 있다.

소정의 아미노산 중합체 또는 핵산 중합체의 번호 매김은, 임의의 소정 중합체 성분(예를 들어, 아미노산, 뉴클레오티드, 일반적으로 "잔기"라 칭하여지는 것) 의 위치가 소정의 중합체중 성분의 실제 번호순 위치에 의해 지정되기보다는, 선택된 아미노산 또는 핵산 중합체의 동일하거나 동등한 위치에 의해 지정될 때, 선택된 아미노산 중합체 또는 핵산 중합체의 번호 매김에 "상응"하거나 또는 이와 "관련"된다. 그러므로, 예를 들어, 소정의 폴리펩티드 서열 내 소정의 아미노산 위치의 번호 매김은 참고 서열로서 사용된 선택된 폴리펩티드 서열 내 동일 또는 동등한 아미노산 위치에 상응한다.

본원에 있어서, "동등한 위치"(예를 들어, "동등한 아미노산 위치" 또는 "동등한 핵산 위치" 또는 "동등한 잔기 위치")는, 본원에 기술된 바와 같은 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되었을 때, 참고 폴리펩티드(또는 참고 폴리뉴클레오티드) 서열의 상응하는 위치와 함께 정렬된 시험 폴리펩티드(또는 시험 폴리뉴클레오티드) 서열의 위치(예를 들어, 아미노산 위치 또는 핵산 위치 또는 잔기 위치)로서 정의된다. 시험 폴리펩티드의 동등한 아미노산 위치는 참고 폴리펩티드의 해당 위치와 동일한 번호의 위치 번호를 가질 필요는 없으며; 이와 유사하게, 시험 폴리뉴클레오티드의 동등한 핵산 위치는 참고 폴리뉴클레오티드의 해당 위치와 동일한 번호의 위치 번호를 가질 필요는 없다. 그 예로서, 도 2는 공지의 다양한 인간 인터페론-알파 폴리펩티드 서열과 함께 최적 정렬된 본 발명의 폴리펩티드 서열(서열 번호 13)을 나타낸다. 이 예에서, 서열 번호 13의 48번 아미노산 위치는 서열 번호 46(huIFN-알파 2b)의 47번 아미노산 위치(즉, "동등한" 아미노산 위치)와 동등한 아미노산 위치인 것으로 간주되는데, 그 이유는 서열 번호 13의 48번 아미노산은 서열 번호 46의 47번 아미노산과 정렬되기 때문이다. 다시 말하면, 서열 번호 13의 48번 아미노산 위치는 서열 번호 46의 47번 아미노산 위치에 "상응"한다. 이와 유사하게, 서열 번호 13의 잔기 A48(Ala48)은 예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 F48(Phe48)에 상응하는 것으로 이해되므로 예를 들어, 서열 번호 13에 대한 치환부 A48L은 예를 들어, 서열 번호 1에 대한 치환부 F48L에 상응하는 것으로 이해된다(이하, 다른 서열에서도 마찬가지임).

2개의 폴리펩티드 서열들은 이들이 지정된 매개 변수 즉, 지정된 아미노산 치환 매트릭스, 갭 실존 패널티(갭 개방 패널티 라고도 칭함) 및 갭 연장 패널티를 사용하여 정렬될때, 서열의 그 쌍에 대하여 가능한 최고 유사성 스코어에 도달하도록 "최적으로 정렬"된다. 상기 BLOSUM62 매트릭스[Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.'Acad. Sci. USA 89 (22):10915∼10919]는 종종 폴리펩티드 서열 정렬 알고리즘(예를 들어, BLASTP)에서 디폴트 스코어링 치환 매트릭스로서 사용된다. 상기 갭 실존 패널티는 정렬된 서열들 중 어느 하나에 단일 아미노산 갭을 도입시키기 위해 부과되는 것이며, 갭 연장 패널티는 갭중 각각의 잔기 위치에 대하여 부과되는 것이다. 달리 언급이 없다면, 본원에 사용된 정렬 매개 변수는 다음과 같다: BLOSUM62 스코어링 매트릭스, 갭 실존 패널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1. 이하 "% 서열 동일성"이라는 표제의 섹션에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 최고 가능 유사 스코어에 도달하기 위하여 정렬 스코어는 정렬이 시작되고 끝나는 각각의 서열 중 아미노산 위치(예를 들어, 정렬 윈도우)로써 정의되며, 임의로는 하나 또는 둘 다의 서열에 하나의 갭 또는 다수의 갭을 삽입시킴으로써 정의될 수도 있다.

아미노산 위치 및 아미노산 치환부를 동정하는데 사용된 용어는 다음과 같다: 예를 들어, 서열 번호 1에 있어서, F48은 참고 아미노산 서열 내 48번 위치가 페닐알라닌(Phe) 잔기에 의해 점유되어 있는 경우를 나타낸다. F48A는 48번 위치의 페닐알라닌 잔기가 알라닌(Ala) 잔기로 치환되었음을 나타낸다. 대안적 치환부는 "/"로 표시되는데, 예를 들어, F48A/L은 48번 위치의 페닐알라닌 잔기가 알라닌 또는 루신 잔기로 치환된 아미노산 서열을 의미한다. 복수의 치환부는 때때로 "+"로 표시되는데, 예를 들어, H47Q + F48A/L은 47번 위치의 히스티딘 잔기가 글루타민 잔기로 치환된 치환부 및 48번 위치의 페닐알라닌 잔기가 알라닌 또는 루신 잔기로 치환된 치환부를 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 결실부는 "*"로 표시된다. 예를 들어, H47*는 47번 위치의 히스티딘 잔기가 결실된 것을 나타낸다. 2 이상의 연속 아미노산의 결실부 예를 들어, R161*-E166*은 R161-E166을 포함하는 잔기의 결실부(예를 들어, 161, 162, 163, 164 및 166번 잔기 결실부)가 결실된 것을 나타낸다. 삽입부는 다음과 같이 나타낸다: 부가의 세린 잔기가 47번 위치의 히스티딘 잔기 뒤에 삽입된 경우는 H47HS. 치환부 및 삽입부가 함께 존재할 경우에는 다음과 같이 나타낸다: 47번 위치의 히스티딘 잔기가 세린 잔기와 치환되었고 47번 위치 아미노산 잔기 다음에 알라닌 잔기가 삽입된 경우는 H47SA.

달리 표시하지 않는다면, 본원에 언급된 아미노산 잔기의 위치 번호는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 것이다. 근원 폴리펩티드에 대한 일례 및 변형예는 일반적으로 본원에 서열 번호 1에 관해서(또는 다른 특정 서열에 관해서) 제공되며, 이러한 일례는 본 발명의 기타 폴리펩티드에 속하고, 본원에 기술된 변형예는 본원에 기술된 기타 폴리펩티드 중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에 가하여질 수 있다. 그러므로, 일례로서, 서열 번호 1에 대한 치환부 F48L은 서열 번호 13의 치환부 A48L에 상응하는 것으로 이해된다(이하 같음).

"인터페론-알파 활성을 나타내는(예를 들어, 나타내거나 또는 갖는)"이란 용어는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트가 참고 인터페론-알파 폴리펩티드(예를 들어, 인간 인터페론-알파 폴리펩티드 예를 들어, huIFN-알파 2b(본원에 있어서 서열 번호 46), huIFN-알파 2a(본원에 있어서 서열 번호 47), huIFN-알파 8b(본원에 있어서 서열 번호 51), 또는 기타 당 업계에 공지된 임의의 인터페론 알파 폴리펩티드 예를 들어, 문헌[Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 상동]에 나열된 것이 나타내는 하나 이상의 활성을 갖는 경우를 의미한다. 이러한 활성으로서는 예를 들어 다음 중 하나 이상의 것에 의하여 입증되는 바와 같은, 인터페론-알파 수용체를 통한 시그널링 능력을 포함한다: 바이러스-감염된 세포내 바이러스 복제의 억제("항바이러스 활성"); 원형의 T 세포가 T_H1 표현형으로 분화하는 것을 강화하고/강화하거나, 원형의 T 세포가 T_H2 표현형으로 분화하는 것을 억제하는 것("T_H1 분화 활성"); 또는 세포 증식의 억제("항증식 활성"). 하나 이상의 인터페론-알파 활성은 당 업계에 공지된/공지되었거나 본 발명의 실시예에 기술된 검정법을 사용하여 검정된다.

인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 그것이 측정 가능한 활성 예를 들어, 측정 가능한 항바이러스 활성, 항증식 활성 또는 T_H1 분화 활성(예를 들어, 당 업계에 공지되고/공지되었거나 본 발명의 실시예에 기술된 검정법으로 측정되는 활성)을 나타낼 때 그러한 활성을 갖는 것으로 간주된다. 당 업자는 측정 가능한 활성을 이루는 것은 수행된 검정법의 특성에 따라서 부분적으로 달라지지만, 일반적인 지침으로서의 측정 가능한 활성은 시험 화합물(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)의 존재하에 발생하는 검정 시그널이 시험 화합물의 부재하에 발생하는 검정 시그널과 정량적으로 상이한 활성이라는 사실을 인식한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 특정 참고 인터페론-알파의 공지 활성 모두를 나타낼 필요는 없으며, 또는 참고 인터페론-알파와 동일한 정도로 활성을 나타낼 필요도 없다는 사실을 이해할 것이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트가 나타내는 활성(예를 들어, EC₅₀, 특이 활성 또는 기타 활성과 관련된 수준에 의해 입증되는 것)은 참고 인터페론-알파가 나타내는 특정 활성과 거의 동등하거나, 그보다 작거나 또는 그보다 클 수 있다.

"변이체"란, 근원 폴리펩티드 서열의 아미노산중 하나 이상의 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 변이체는 근원 폴리펩티드 서열 총 잔기 수의 10% 이하, 예를 들어, 잔기의 8% 이하 예를 들어, 근원 폴리펩티드 서열 총 잔기수의 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하가 상이한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산), 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산 또는 1∼2개 위치의 아미노산)이 상이한 서열을 포함할 수 있다.

"근원 폴리펩티드" 또는 "근원 인터페론-알파"란 용어는, 본 발명에 따라서 변형된 폴리펩티드 서열을 나타내는 것이다. 근원 폴리펩티드 서열은 천연 생성된 IFN-알파(예를 들어, 포유 동물 IFN-알파 예를 들어, 유인원 IFN-알파 예를 들어, 인간 IFN-알파 예를 들어, 본원에서 서열 번호 45∼57로서 동정된 huIFN-알파 폴리펩티드, 또는 기타 huIFN-알파 서열 예를 들어, 본원 및/또는 문헌[Allen G. 및 Diaz M.O. (1996), 상동]에 기술된 서열)의 서열일 수 있다. 근원 폴리펩티드 서열은 천연 생성되지 않은(즉, "합성된") 인터페론-알파 예를 들어, IFN-알파 Con1(서열 번호 58)의 서열일 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 변형될 근원 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드 그 자체 예를 들어, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44중 임의의 것일 수 있다.

어떠한 목적물이 "천연 생성"되었다는 의미는 그것이 사람에 의해 인공적으로 제조된 것과는 구별되는, 자연에서 발견될 수 있다는 의미이다. 예를 들어, 자연 환경에서 분리될 수 있으며 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 원생 동물, 곤충, 식물 또는 포유 동물 조직)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 생성되는 것이다. 어떤 목적물이 "천연 생성되지 않았다"(또는 "합성된" 또는 "인공적인")라는 의미는 그 목적물이 천연 생성되지 않은 즉, 목적물이 사람에 의해 인공적으로 제조된 것과는 구별되는, 자연에서 발견될 수 없다는 의미이다.

"단편" 또는 "종속 서열"이란 용어는 전체 서열중 임의의 부분으로서, 전체 서열보다는 작되, 전체는 아닌 부분을 의미한다. 그러므로, 단편 또는 종속 서열이란, 아미노산의 보다 긴 서열(예를 들어, 폴리펩티드) 또는 핵산의 보다 긴 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에 의해 고려되는 단편 중 하나의 유형은 아미노산 잔기가 근원 서열의 N-말단 또는 C-말단(또는 둘 다)로부터 제거된 단편인데; 이러한 폴리펩티드를 각각 "N-말단이 절단된(N-terminally truncated)" 또는 "C-말단이 절단된(C-terminally truncated)" 폴리펩티드라 한다. N-말단으로부터 처음 4개 이상의 아미노산이 결실되면 인터페론-알파 활성에 그리 큰 영향을 미치지는 않는다는 사실이 공지되어 있다[Lydon, N.B.외 다수. (1985) Biochemistry 24: 4131∼41]. 뿐만 아니라, 인터페론-알파 활성을 보유하는 변이체는 7번 및 11번 사이의 아미노산이 C-말단으로부터 결실되어 있다는 사실도 문헌[Cheetham B. F.외 다수. (1991) Antiviral Res. 15(1):27∼39; Chang N.T.외 다수. (1983) Arch. Biochem Biophys. 221 (2): 585~589; Franke A.E.외 다수. (1982) DNA 1(3):223∼230)]에 개시되어 있다.

"수용체" 예를 들어, "인터페론-알파 수용체"("I형 인터페론 수용체"라고도 알려져 있음)는 인터페론-알파에 의해 세포내에서 활성화되는 수용체로서, 예를 들어 인터페론-알파에 결합하여 세포내 시그널링을 개시하며, 그 예로서는 수용체 서브유닛 IFNAR-2 및 IFNAR-1을 포함하는 I형 인터페론 수용체가 있다[Domanski외 다수. (1998) J. Biol.Chem. 273 (6):3144∼3147; Mogensen외 다수, (1999) Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069∼1098]. 본 발명의 내용중 수용체는 또한 인터페론-알파와 결합하되 막에 반드시 결합할 필요는 없으며/없거나 세포내 시그널링을 개시하는 예를 들어, 세포외 결합 도메인을 포함하는 수용체 분자의 가용형("가용성 수용체"라고도 알려짐)과 같은 막 결합부가 흠결된 수용체 분자와 같은 전장 수용체 분자의 절단형을 포함하는 의미이다.

2개의 분자 예를 들어, 리간드 및 수용체 사이의 "특이적 결합 친화도"란, 분자 혼합물중 하나의 분자와 다른 분자들의 선호적인 결합을 의미한다. 이 분자의 결합은 결합 친화도가 약 1×10⁴~1×10⁹ M^-1 이상(즉, K_D가 약 10^-4∼10^-9 M 이하)이면 통상 특이적인 것으로 간주된다. 리간드 및 수용체의 결합 친화도는 당 업자에게 공지된 표준 기술로써 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 널리 공지된 기술의 비제한적인 예로서는 바이어코어(등록상표) 기술(Biacore AB, 스웨덴), 등온 역가 미세열량계(MicroCal LLC, 미국 메사츄세츠 노스앰톤), ELISA 및 FACS를 포함한다. 예를 들어, FACS 또는 기타 분류 방법들은 연합 결합쌍 일원(예를 들어, 수용체 예를 들어, 가용성 수용체)에 특이적으로 결합하는 분자 집단(예를 들어, 세포 표면에 디스플레이된 리간드)을 선택하는데에 사용될 수 있다. 리간드-수용체의 복합체는 예를 들어, 형광성(예를 들어, 상기 복합체와 이 복합체를 인지하는 형광성 항체의 반응)에 의해 검출 및 분류될 수 있다. 연합된 결합쌍의 일원(예를 들어, 수용체)가 결합하는 목적 분자는 풀링되어 보다 낮은 농도의 수용체의 존재하에 재분류된다. 수용체 농도를 점점 낮추면서(대표적인 농도 범위는 리간드-수용체 상호 작용의 특성에 따라서 10^-6∼10^-9 M 즉, 1 마이크로 몰(μM)에서 1 나노몰(nM)까지임) 분류 작업을 복수 회 수행함으로써, 수용체에 대해 특이적인 결합 친화도를 나타내는 목적 분자의 군집을 분리할 수 있다.

폴리펩티드, 핵산 또는 기타 성분들은 보통 (기타 펩티드, 폴리펩티드, 단백질(예를 들어, 복합체 예를 들어, 천연 서열을 수반할 수 있는 중합효소 및 리보좀), 핵산, 세포, 합성 시약, 세포 오염 물질, 세포 성분 등)와 결합된 성분 예를 들어, 근본적으로 유래된 세포 내에 일반적으로 결합된 기타 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리될 때에 "분리되었다"고 한다. 폴리펩티드, 핵산 또는 기타 성분은 천연 환경의 기타 성분들로부터 부분적으로 또는 완전히 회수 또는 분리되어, 성분의 조성물, 혼합물 또는 집합물 중에 다량으로 존재하는(즉, 몰을 기초로 하였을 때, 조성물 중 임의의 기타 화학종보다 더욱 풍부하게 존재하는) 화학종이 되는 때에 분리된다. 몇몇 경우에 있어서, 이러한 분리물은 약 60%, 70% 또는 75%, 통상적으로 약 80% 이상, 또는 바람직하게는 약 90% 이상의 분리 화학 종으로 이루어져 있다.

"실질적으로 순수한" 또는 "분리된" 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA), 폴리펩티드, 단백질, 또는 조성물이란, 또한 목적 화학종(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)이 약 50, 60 또는 70 중량%(몰을 기준) 이상의 현존하는 모든 거대 분자 화학종을 포함하는 경우를 의미한다. 실질적으로 순수하거나 또는 분리된 조성물은 또한 조성물내에 약 80, 90 또는 95 중량% 이상의 현존하는 모든 거대 분자 화학 종을 포함한다. 분리된 목적 화학 종들은 또한 근본적으로 균질하게(종래의 검출 방법으로써는 조성물내에 오염 화학종이 검출될 수 없을 정도로) 정제될 수도 있는데, 여기서 상기 조성물은 본질적으로 단일 거대 분자 화학종의 유도체들을 포함한다. "정제된"이란 용어는 일반적으로 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질이 전기 영동 겔 상에서 본질적으로 하나의 밴드를 형성하는 경우를 의미한다. 통상적으로 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질은 약 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상 및 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수한 것을 의미한다.

"분리된 핵산"이란 용어는, 본 발명의 핵산이 유래된 유기체의 천연 생성 게놈 내에 바로 연속되어 존재하는(즉, 한쪽은 5' 말단에, 다른 한쪽은 3' 말단에 존재하는) 암호화 서열 양쪽에 바로 연속되어 존재하지 않는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 의미할 수 있다. 그러므로, 이 용어는 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 제조된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편을 포함하며, 여기서 상기 cDNA 또는 게놈 DNA 단편은 벡터에 도입되어 유기체 예를 들어, 그것이 원래 유래된 바이러스와 상이하거나 또는 이와 동일한 종의 게놈으로 통합화되며, 이로써 부가 암호화 서열에 결합하여 그 결과 키메라 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 임의의 기타 DNA 서열과는 독립적인 잡종 유전자를 형성하게 된다. 상기 DNA는 이중 사슬 또는 단일 사슬의, 센스 또는 안티센스일 수 있다.

"재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 "재조합 폴리펩티드"란, 각각 하나 이상의 근원 핵산 또는 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 또는 핵산을 포함할 수 있는 천연 생성되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 근원 핵산 또는 폴리펩티드는 천연 생성된 핵산 또는 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 그 자체가 돌연변이 유발되었거나 또는 기타 유형의 변형이 일어난 것일 수 있다. 핵산 또는 폴리펩티드는 그것이 합성 또는 인공 제조 또는 조작되었거나, 또는 합성 또는 인공 제조 또는 조작된 폴리펩티드 또는 핵산으로부터 유래되었을 때 "재조합"되었다고 간주될 수 있다. 재조합 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)은 통상적으로 함께 포함되어 있지 않거나, 통상적으로 서로 결합되어 있지 않거나, 또는 통상적으로 서로 분리되어 있는 서열의 2 이상의 절편을 조합(예를 들어 인공 조합)시켜 제조될 수 있다. 재조합 핵산은 상이한 근원으로부터 유래된 핵산 절편 및/또는 인공적으로 합성된 핵산 절편들을 서로 연결시키거나 또는 이것들을 조합함으로써 형성된 핵산 분자를 포함할 수 있다. "재조합 폴리펩티드"란 종종 클로닝된 핵산 또는 재조합 핵산으로부터 유래된 폴리펩티드를 의미한다. 상이한 핵산 또는 아미노산 서열이 유래된 근원 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 때때로 상동성(즉, 동일하거나 또는 유사한 구조 및/또는 기능을 갖거나, 또는 이를 암호화하는 폴리펩티드를 암호화하는)이며, 또한 예를 들어, 유기체의 상이한 분리물, 혈청형, 변종, 종 또는 상이한 질병 상태로부터 유래되기도 한다.

예를 들어, 세포, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 단백질 또는 폴리펩티드를 참고로 하여 사용될 때 "재조합체"란 용어는, 통상적으로 이종성(또는 외래) 핵산을 도입하거나, 또는 천연 핵산을 변경함으로써 변형된 세포, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 또는 이종 아미노산을 도입함으로써 변형된 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이렇게 변형된 세포로부터 유래된 세포를 나타낸다. 재조합 세포는 천연형(재조합되지 않은 형)의 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열을 발현하거나, 또는 비정상적으로 발현되거나, 소량 발현되거나 또는 거의 발현되지 않는 천연 핵산 서열을 발현한다. 세포를 기준으로 하였을 때 "재조합체"란 용어는, 세포가 이종 핵산을 복제하거나, 또는 이종 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하는 경우를 의미한다. 재조합 세포는 세포의 천연(재조합되지 않은) 형태내에서 발견되지 않는 암호화 서열을 포함할 수 있다. 재조합 세포는 또한 천연 형태의 세포내에서 발견되는 암호화 서열을 포함할 수도 있으며, 여기서 상기 암호화 서열은 인공적인 방법으로 변형되어 세포로 재도입된다. 상기 용어는 또한 세포로부터 핵산을 제거하지 않고 변형된 세포에 대하여 내인성인 핵산을 함유하는 세포들을 포함하며; 여기서, 상기 변형으로서는 유전자 치환, 위치∼특이적 돌연변이, 재조합법 및 관련 기술에 의하여 얻어지는 변형들을 포함한다.

"재조합적으로 생산된"이란 용어는, 화학적 합성 방법, 핵산 절편의 반복 서열 재조합법 또는 뉴클레오티드의 기타 다양성 형성 방법(예를 들어, 셔플링), 또는 핵산의 분리된 절편의 조작 방법 예를 들어, 당업자에게 공지된 유전자 조작 기술에 의한 조작 방법에 의해 일반적으로 이루어지는 인공 조합을 의미한다. "재조합적으로 발현된"이란 용어는, 통상적으로 발현될 수 있거나 또는 보급될 수 있을 경우 시험관내에서 재조합 핵산을 제조하는 기술 및 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서 재조합 핵산을 세포내로 운반하는 기술을 의미한다.

"재조합 발현 카세트" 또는 단순히 "재조합 카세트"란, 재조합 생성 또는 합성된 서열과 상응하는 숙주내 구조 유전자를 발현시킬 수 있는 핵산 인자를 보유하는, 재조합 생성 또는 합성된 핵산 구조물을 의미한다. 발현 카세트는 최소한 프로모터를 포함하며, 임의적으로는 전사 종결 시그널을 포함하기도 한다. 통상적으로, 제조합 발현 카세트는 전사될 핵산(예를 들어, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)과, 프로모터를 포함한다. 발현에 필요하거나 또는 발현에 도움이 되는 부가적인 요소도 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 또한 숙주 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 유도하는 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 유전자 발현에 영향을 미치는 전사 종결 시그널, 인핸서 및 기타 핵산 서열은 또한 발현 카세트 내에 포함될 수도 있다.

"면역원"이란, 면역 반응을 유발시킬 수 있는 물질을 의미하는데, 여기에는 예를 들어, 항원, 자가 면역 질환을 유도하는 역할을 하는 자가 항원 및 암 세포상에 발현되는 종양 관련 항원을 포함한다. 면역 반응성은 일반적으로 제제 예를 들어, 항원 또는 이의 단편 또는 이러한 제제를 암호화하는 핵산에 대한 세포 반응 또는 항체 매개성 반응의 진행을 의미한다. 몇몇 경우에 있어서, 이러한 반응은 CTL, B 세포, 또는 목적 항원을 발현시키는 항원 제공 세포에 대해 특이적으로 생성되는 T 세포의 다양한 군중 하나 이상 또는 이들을 조합 생성하는 것을 포함한다.

"항원"이란, 숙주내에서 항체의 형성을 유도할 수 있는 물질 또는 이 물질과 반응성인 림프구의 특정 군집을 생성시킬 수 있는 물질을 의미한다. 항원은 통상적으로 숙주에 대해 외래 물질인 거대 분자(예를 들어, 단백질 및 다당류)이다.

"애쥬반트"란, 항원의 면역 자극성 또는 약물의 약학적 효능(들)을 강화하는 물질을 의미한다. 애쥬반트는 항원에 대한 면역 반응을 비특이적으로 강화시킬 수 있다. 예를 들어, "프룬트 완전 애쥬반트"는 면역원, 유화제 및 마이코박테리아를 함유하는 오일과 물의 유액이다. 다른 예로서 "프룬트 불완전 애쥬반트"는 상기 완전 애쥬반트와 동일하되, 마이코박테리아는 함유하지 않는 유액이다.

벡터는 선택된 핵산에 의한 세포 형질 도입 또는 형질 감염, 또는 세포내 핵산의 발현을 촉진시키는 성분 또는 조성물이다. 벡터로서는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, YAC, 박테리아, 폴리리신 등을 포함한다. "발현 벡터"는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구조물 또는 서열로서, 숙주 세포내 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정 핵산 요소를 보유한다. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 상기 발현 벡터는 통상적으로 프로모터에 작동 가능하도록 연결되어 전사될 수 있는 핵산을 포함한다. 전사될 핵산은 통상적으로 프로모터의 유도 또는 제어하에 있다.

"실질적으로 전장인 폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "실질적으로 전장인 폴리펩티드 서열"이란, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열 길이의 50% 이상, 일반적으로 약 60%, 70% 또는 75% 이상, 일반적으로 약 80% 이상, 또는 통상적으로 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 서열을 의미한다.

"면역 검정법"이란 용어는 항원에 결합하거나 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 면역원을 사용하는 검정법을 포함한다. 상기 면역 검정법은 통상적으로 항원을 분리, 표적화 및/또는 정량화하는 특정 항체의 특이적 결합 특성을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본원에 사용된 "개체"란 용어는 유기체 즉, 포유 동물 예를 들어, 사람, 사람 이외의 유인원(예를 들어, 비비 원숭이, 오랑우탄, 원숭이), 마우스, 돼지, 소, 염소, 고양이, 토끼, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 말, 원숭이, 양 또는 기타 사람 이외의 포유 동물; 비포유동물 예를 들어, 비포유동물성 척추 동물 예를 들어, 조류(예를 들어, 닭이나 오리) 또는 어류 및 비포유동물성 무척추 동물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"약학 조성물"이란 용어는 개체 예를 들어, 동물 또는 사람에 약학적 용도로 사용하기에 적합한 조성물을 의미한다. 약학 조성물은 일반적으로 유효량의 활성 제제 및 담체 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.

"유효량"이란 용어는 의도로 하는 결과를 얻기에 충분한 투여량 또는 양을 의미한다. 의도로 하는 결과는 투여량 또는 일정량의 수용체에서 발생하는 객관적 또는 주관적 개선을 포함할 수 있다.

"예방 치료"란, 개체 즉, 질병, 병상 또는 의학적 질환의 징후나 증상을 나타내지 않거나, 또는 질병, 병상 또는 질환의 초기 징후나 증상만을 나타내는 개체에 수행되는 치료를 의미하는 것으로서, 이 치료는 질병, 병상 또는 의학적 질환으로의 진행 위험성을 감소, 예방 또는 경감시키기 위해 수행된다. 예방 치료는 질병 또는 질환을 예방적으로 치료하는 작용을 한다. "예방 활성"이란, 병상, 질병 또는 질환의 징후나 증상을 나타내지 않는 개체, 또는 병상, 질병 또는 질환의 초기 징후나 증상만을 나타내는 개체에 투여되어 개체의 병상, 질병 또는 질환으로의 진행 위험성을 감소, 예방 또는 경감시키고자 할 때, 제제 예를 들어, 핵산, 벡터, 유전자, 폴리펩티드, 단백질, 물질 또는 이의 조성물의 활성을 의미한다. "예방학적으로 유용한" 제제 또는 화합물(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)란, 병상, 질병 또는 질환의 진행을 감소, 예방, 치료 또는 경감시키는데에 유용한 제제 또는 화합물을 의미한다.

"치료적 처치"란, 병상, 질병 또는 질환의 증상이나 징후를 나타내는 개체에 수행되는 처치로서, 이와 같은 병상, 질병 또는 질환의 징후 또는 증상을 경감시키거나 또는 없애기 위해 개체에 수행되는 것이다. "치료학적 활성"이란, 제제 예를 들어, 핵산, 벡터, 유전자, 폴리펩티드, 단백질, 물질 또는 이들의 조성물의 활성으로서, 이러한 징후 또는 증상을 앓고 있는 개체에 투여되었을 때, 병상, 질병 또는 질환의 징후 또는 증상을 없애거나 또는 경감시키는 활성을 말한다. "치료학적으로 유용한" 제제 또는 화합물(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)이란 병상, 질병 또는 질환의 징후 또는 증상을 경감, 치료 또는 없애는 데에 유용한 제제 또는 화합물을 의미한다.

"유전자"란 용어는 넓은 의미로 생물학적 기능과 관련된 임의의 DNA 절편을 의미한다. 유전자는 이의 발현에 필요한 암호화 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. 유전자는 또한 예를 들어, 기타 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현성 DNA 핵산 절편(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 기타 조절 영역)을 포함한다. 유전자는 예를 들어, 목적 근원으로부터 클로닝하거나, 공지 또는 예측 서열 정보를 통하여 합성함으로써 다양한 근원으로부터 얻을 수 있으며, 목적 매개 변수를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.

일반적으로, 이하에 사용된 명명법 및 이하 기술된 세포 배양, 분자 유전학, 분자 생물학, 핵산 화학 및 단백질 화학에 있어서의 실험 방법은 널리 공지된 사항들이며, 당업자에 의하여 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1∼3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (이하 "Sambrook") 및 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel외 다수, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc. (1994, 1999 증보판) (이하"Ausubel")]에 개시된 기술들은 재조합 핵산법, 핵산 합성법, 세포 배양법 및 트랜스 유전자 도입법 예를 들어, 전기 천공법, 주입법, 유전자 총, 피부를 통한 압착법 및 리포팩션에 사용된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성법 및 정제 단계는 본 명세서에 따라서 수행된다. 기술 및 방법은 일반적으로 당 업계의 통상적인 방법과 본 명세서를 통해 제공된 다양한 참고 문헌에 따라서 수행된다. 이러한 방법은 당 업자에게 널리 알려진 것으로서 열람자의 편의를 위하여 제공된다.

본원에 사용된 "항체"란, 면역글로불린 유전자 또는 이 면역글로불린 유전자 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 의미한다. 항체란 용어는 전체 항체 및 이의 결합 단편을 의미하는 것으로서 사용된다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변부 유전자와, 다양한 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 순서대로 각각 면역 글로불린 군 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다. 통상의 면역글로불린(예를 들어, 항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 이루어져 있는데, 이들 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 KDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50∼70 KDa)를 보유한다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식의 역할을 갖는 약 100∼110개 이상의 아미노산의 가변부를 규정한다. 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)란 용어는 각각 경쇄 및 중쇄를 의미한다.

항체는 또한 단일 팔(arm)로 된 복합 모노클로날 항체, 단일 사슬 항체 예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 서로 연결되어(직접적으로 또는 펩티드 링커를 통하여) 연속적 폴리펩티드, 그리고 다이아바디(diabody), 트리바디(tribody) 및 테트라바디(tetrabody)를 형성하는 단일 사슬 Fv(sFv) 항체를 포함한다[Pack외 다수 (1995) J Mol Biol 246:28;Biotechnol 11:1271; 및 Biochemistry 31:1579]. 상기 항체로서는 예를 들어, 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 인간화, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편 등이 있다.

"에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 분자 예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄가 군을 형성한 화학적으로 활성인 표면으로 이루어져 있으며, 일반적으로 특이적 3차원 구조 특성 및 특이적 하전 특성을 보유한다. 구조적 및 비구조적 에피토프는, 전자는 변성 용매가 존재할 때 유리되고 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

항체의 "항원 결합 단편"은, 항원과 결합하는 항체의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편이다. 항원 결합 부위는 항원 결합에 기여, 관여, 또는 영향을 미치는 항체의 아미노산에 의해 형성된다. 본원에 그 자체가 모든 목적으로 인용되어 있는 문헌[Scott, T. A. and Mercer, E. I., Concise Encyclopedia: Biochemistry and Molecular Biology (de Gruyter, 3d ed. 1997) 및 Watson, J. D.외 다수 , Recombinant DNA (2d ed. 1992) (이하 "Watson, Recombinant DNA")]을 참고하시오.

"스크리닝"이란 용어는 일반적으로 본 발명의 최적 분자 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및 이를 포함하는 관련 융합 폴리펩티드, 그리고 이러한 분자들을 암호화하는 핵산을 동정하는 방법을 의미한다. 이러한 각각의 분자들의 특성 중 일부 예를 들어, 리간드 또는 수용체에 결합하거나, 세포 증식을 억제하거나, 바이러스 감염 세포내 바이러스의 복제를 억제하거나, 세포 사이토카인 생성을 유도 또는 억제하거나, 면역 반응을 변형 예를 들어, 목적 면역 반응을 유도 또는 억제하는 각 분자의 능력이 시험 시스템내, 시험관내, 세포외 또는 생체내 수행되는 선별 및 스크리닝에 이용된다. 항원의 경우, 항원의 몇몇 특성들 예를 들어, 항원 발현, 폴딩(folding), 안정성, 면역원성 및 몇몇 관련 항원으로부터 유래된 에피토프의 존재 여부가 선별 및 스크리닝에 사용될 수 있다.

"선별"이란, 동정 및 물리적 분리가 예를 들어, 선별 마커 발현[즉, 특정 유전 환경에서 마커를 발현하는 세포는 생존하는 반면에 다른 세포들은 사멸(아니면 그 반대)하는 현상]에 의해 동시에 수행되는 스크리닝의 한 형태를 의미한다. 스크리닝 마커로서는 예를 들어, 루시페라제, 베타-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질 등을 포함한다. 선별 마커로서는 약물 및 독소 내성 유전자 등을 포함한다. 다른 방식의 선별 방법은 검출 가능한 현상 예를 들어, 리간드의 수용체와의 결합, 효소와 기질의 반응, 또는 직접적으로나(예를 들어, 발색 기질 또는 리간드 이용), 간접적으로(예를 들어, 발색 2차 항체와의 반응) 검출 가능한 시그널을 발생시킬 수 있는 기타 임의의 물리적 방법을 바탕으로 한 물리적 분류법을 포함한다. 물리적 분류법에 의한 선별은 다양한 방법 예를 들어, 전체 세포내에서 수행되거나 또는 미세 적가 방식으로 수행되는 FACS에 의해 수행될 수 있다.

본원에 사용된 "외인성" 핵산, "외인성 DNA 절편", "이종 서열" 또는 "이종 핵산"이란, 특정 숙주 세포에 대한 외래 근원으로부터 기원된 것이거나, 또는 동일한 기원으로부터 유래된 것이라면, 그 원시 형태로부터 변형된 것을 의미한다. 그러므로, 숙주 세포내 이종 유전자는 특정 숙주 세포에 내인성이되 변형된 유전자를 포함한다. 본원에 개시된 방법에 있어서 이종 서열의 변형은 통상적으로 반복 서열 재조합법을 수행함으로써 이루어질 수 있다. 상기 용어는 세포에 대해 외래 또는 이종성이거나, 세포에 상동성이되 그 인자가 보통의 경우에는 발견되지 않는 숙주 세포 핵산내 위치에 있는 DNA 절편을 의미한다. 외인성 DNA 절편은 발현되어 외인성 폴리펩티드를 생성한다.

"핵산"이란 용어는 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 특별히 한정하지 않는다면, 상기 용어는 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 보유하고 천연 생성 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 물질 대사를 일으키는 천연 뉴클레오티의 공지의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지정하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환체) 및 상보성 서열, 그리고 명확히 개시된 서열을 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈중 세번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 수행될 수 있다[Batzer외 다수 (1991) Nucleic Acid Res 19: 5081; Ohtsuka외 다수 (1985) J Biol Chem 260: 2605∼2608; Cassol외 다수 (1992); Rossolini외 다수 (1994) Mol Cell Probes 8:91∼98]. 핵산이란 용어는 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 암호화되는 mRNA와 호환적으로 사용된다.

"유전자로부터 유래된 핵산"이란, 유전자를 합성하는 핵산 또는 이의 종속 서열을 의미하는 것으로서, 궁극적으로 주형으로 사용된다. 그러므로, mRNA, mRNA로부터 역전사된 cDNA, 이 cDNA로부터 증폭된 DNA, 증폭된 DNA로부터 전사된 RNA 등은 모두 유전자로부터 유래되며, 이와같이 유래된 생성물의 검출은 시료중 원래 유전자 및/또는 유전자 전사물이 존재하고/존재하거나 다량 존재함을 나타내는 지표이다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련이 있도록 배치될때 "작동 가능하도록 연결"된 것이라고 한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 암호화 서열의 전사를 증가시키면 그것은 암호화 서열에 작동 가능하도록 연결된 것이다. 작동 가능하도록 연결되었다는 의미는, 연결된 DNA 서열이 통상적으로 연속적으로 존재하며, 2개의 단백질 암호화 영역을 연결할 필요가 있는 경우, 해독 틀 내에 연속하여 존재한다는 의미이다. 그러나, 인핸서는 수 킬로베이스씩 프로모터로부터 분리되고 인트론 서열의 길이가 다양할 수 있을때 일반적으로 작동을 하게 되므로, 몇몇 폴리뉴클레오티드 요소는 작동 가능하도록 연결될 수 있되 연속적일 수는 없다.

"사이토카인"이란 용어는, 예를 들어, 인터루킨, 인터페론, 케모카인, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자 및 형질 전환 성장 인자를 포함한다. 일반적으로 이들은 면역 시스템 세포의 성숙, 활성화, 증식 및 분화를 조절하는 저분자량 단백질이다.

본 명세서 및 청구의 범위 중, 예를 들어, 하나의 비-폴리펩티드 부분, 하나의 아미노산 잔기, 하나의 치환부, 하나의 완충액, 하나의 양이온 등에 있어서 "하나의" 성분이란 의미는, 달리 언급이 없거나 또는 해당 사항이 아닌 특정한 경우로부터 명확하지 않다면, 상기 성분이 하나 이상 존재함을 의미한다. 예를 들어, "A, B 및 C로 이루어진 군에서 선택된 성분"이란 표현은 A, B 및 C의 모든 조합 예를 들어, A, B, C, A+B, A+C, B+C 또는 A+B+C를 포함하는 것이다.

다양한 부가의 용어들은 본원에 정의 또는 특성 규명되어 있다.

본 발명의 분자 및 방법

본 발명의 분자(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 컨쥬게이트 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)는 인터페론-알파에 의한 치료에 반응성인 질병 또는 질환 특히, 바이러스 감염 예를 들어, HCV에 의한 감염과 관련된 질병 의 치료에 유용하다.

치료전 만성 HCV 감염 환자의 바이러스 수는 통상적으로 혈청 1㎖당 10⁴∼10⁷개의 HCV RNA 복사체 범위이다. IFN-알파 처리시, 이 환자의 바이러스 수는 2가지의 뚜렷한 감소형 선형 지수의 형태로 변화한다[도 1b; Neumann A.U.외 다수 (1998) Science 282:103∼107]. IFN-알파 치료 후 처음 이틀 이내에 나타나는 바이러스 수의 급속한 초기 감소는 감염된 간 세포내 바이러스 생성에 있어서 인터페론-알파 매개 감소 및 감염에 대한 원형 세포의 부대적 보호로 인한 현상인 것으로 보인다. 바이러스 생성 속도는 약 이틀(즉, 바이러스 소멸률이 두 번째로 덜 급속하게 선형 지수 형태로 변화하는 것이 관찰되는 시기) 경과시 새로이 정상 상태에 도달하게 된다. 바이러스 소멸률의 이와 같은 두 번째 단계는 일반적으로 부분적으로는 감염된 간 세포의 T 세포 매개성 사멸로 인한 것으로 생각된다[Neumann외 다수, 상동]. IFN-알파는 항원 특이적 T 세포가 T_H1 세포로 분화되는 것을 자극함으로써 이와 같은 생물 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 리바비린(Ribavirin)의 작용 방식은 T_H1 반응의 증가로 인하며, 이는 IFN-알파의 병용 치료법에 있어서의 효능의 역학적 근간을 이루는 것으로 생각된다. 현재 수행되는 인터페론-알파 치료법에 무반응성인 HCV 감염 환자(일반적으로 "무반응자"라 칭함)는 보다 좁은 형태의 바이러스 수 감소 프로필을 나타낸다(도 1a).

본 발명은 내재된 기작의 특정 이론에 국한되지 않지만, 대리 검정 시스템(이하 보다 상세히 설명함)에 있어서 항바이러스 활성은 예를 들어, 바이러스 소멸의 제1 단계에서 인터페론-알파 효능의 전조가 될 수 있다. 실시예에 기술되어 있는 대표적인 항바이러스 검정법은 인간 간 세포내 HCV에의 효과에 대한 대리 시스템과 같이, HuH7 인간 간 유래 세포에서 뇌척수 심근염 바이러스(EMCV)의 세포 변성 효과에 대한 IFN-알파의 보호 효과를 모니터한다. 기타 유용한 바이러스/세포 검정 시스템으로서는 WISH 인간 양막 유래 세포내 EMCV, HeLa 인간 자궁 경부 암종 세포내 EMCV, HuH7 세포내 포진성 구내염 바이러스(VSV), HeLa 세포내 백시니아 바이러스(VV), HepG2 인간 감암 세포내 황열 바이러스(YFV), 그리고 일차 CD4+ T 세포내 인간 면역결핍증 바이러스(HIV)를 포함한다. 실시예 2는 EMCV/HuH7 및 EMCV/HeLa 항바이러스 활성 검정법에서 본 발명의 각각의 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 나타낸다.

감염된 간 세포내 HCV에 대한 효능을 모니터하는데 유용한 기타 대리 검정 시스템으로서는 예를 들어, 문헌[Lohmann V.외 다수, (1999) Science 285 (5424):285∼293; Randall G. and Rice C. M. (2001) Curr Opin Infect Dis 14 (6):743∼7477; 및 Bartenschlager, R. (2002) Nature Reviews/Drug Discovery 1:911]에 개시된 HCV 레플리콘 시스템을 포함한다. HCV 항바이러스 효능을 모니터하는데 유용한 생체내 숙주 시스템의 예로서는 문헌[Mercer외 다수 (2001) Nature Medicine 7(8):927∼933]에 개시된 키메라 인간 간 SCID 마우스가 있다.

어떠한 이론에 국한되지 않고, IFN-알파에 의한 T_H1 분화의 강화 및/또는 T_H2 분화의 억제는 예를 들어, 바이러스 소멸의 제2 단계에서 인터페론-알파 효능에 기여하는 인자일 수 있다. 이 이론에 따르면, 진화된 IFN-알파 즉, 생물 활성에 있어서의 효능(즉, T_H1 분화의 강화 및/또는 T_H2 분화의 억제)이 증가된 IFN-알파는 예를 들어, 동일한 투여량으로 투여되는, 현재 승인된 치료적 인터페론-알파 분자에 비하여 그 효능이 증가된 것으로 예측된다. 본원의 실시예에 기술된 대표적인 검정법은, T_H1 표현형(예를 들어, IFN-감마) 및/또는 T_H2 표현형(예를 들어, IL-5, IL-4)과 관련된 사이토카인의 생산 여부를 ELISA 또는 세포내 염색법 및 FACS 분류법을 통해 측정함으로써, 원형 T_H0 세포상에 IFN-알파에 의해서 T_H1 분화의 강화 및/또는 T_H2 분화의 억제 여부를 모니터한다. 실시예 3에서는 본 발명의 각 폴리펩티드의 T_H1 분화 활성을 나타낸다.

IFN-알파 분자의 치료 효능은 투여량∼한정 독성 예를 들어, 혈소판 감소증 및 호중구 감소증으로 인해 부분적으로 감소하는 경향이 있다. 비록 본 발명은 내재되어 있는 기작에 관한 특정 이론에 국한되지는 않지만, 이러한 독성은 혈소판 및 호중구 전구체상에서 IFN-알파의 항증식 효과와 관련되어 있으며, 대리 검정 시스템(본원에 기술되어 있음)에서 항증식 활성은 인터페론-알파 분자의 상대적 독성의 징후가 될 수 있다는 사실을 제안할 수 있다. 그러므로, IFN-알파 치료법과 관련된 투여량-제한 독성은, 예를 들어, 현재 승인된 치료적 인터페론-알파 분자 예를 들어, ROFERON(등록상표) A(인터페론 알파-2a, 재조합체; HoffmanN-La Roche Inc.), INTRON(등록상표) A(인터페론 알파-2b, 재조합체; Schering Corporation) 및 INFERGEN(등록상표)(인터페론 알파콘-1; InterMune, Inc.)에 비하여 항증식 활성이 감소된 IFN-알파 분자에 있어서는 경감될 수 있다. 본원의 실시예에 기술된 대표적인 항증식 활성 검정법은 인간 다우디(Daudi) 림프구양 세포의 증식에 대한 IFN-알파의 효과를 모니터한다. 대안적으로, 또는 이에 부가하여, 투여량-제한 독성은 치료학적으로 보다 활성인 분자 즉, 현재 승인된 분자보다 낮은 투여 농도 또는 적은 투여 횟수로도 투여될 수 있는 분자를 투여함으로써 감소될 수 있다. 실시예 4는 본 발명의 각 폴리펩티드의 다우디 항증식 활성을 나타내는 것이다.

신규의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 폴리펩티드는 인터페론-알파에 의한 치료에 반응성인 질병 및 질환 특히, 바이러스 감염과 관연된 질병 예를 들어, HCV 감염의 치료에 유용하다. 본 발명의 몇몇 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성 예를 들어, 항바이러스 활성, 항증식 활성 및/또는 T_H1 분화 활성을 나타낸다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는 다음과 같은 특성들 중 하나 이상을 나타낸다: 참고 IFN-알파 폴리펩티드에 비하여 증가 또는 감소된 T_H1 분화 활성; IFN-알파 폴리펩티드에 비하여 증가 또는 감소된 항바이러스 활성; 참고 IFN-알파 폴리펩티드에 비하여 증가 또는 감소된 항증식 활성. 상기 참고 IFN-알파 폴리펩티드는 천연 생성되지 않는 인터페론-알파 서열 예를 들어, IFN-알파 Con1(서열 번호 58)을 포함할 수 있거나, 또는 천연 생성된(즉, 야생형인) 인터페론-알파 폴리펩티드의 서열을 포함할 수 있다. 천연 생성된 인터페론-알파 폴리펩티드 서열의 예로서는 인간 IFN-알파 폴리펩티드 서열 예를 들어, huIFN-알파 2b (서열 번호 46), huIFN-알파 2a (서열 번호 47), huIFN-알파 2c (34번 위치가 Arg인 서열 번호 46), huIFN-알파 8b (서열 번호 52), huIFN-알파 8a (98번 위치가 Val, 99번 위치가 Leu, 100번 위치가 Cys이며 101번 위치가 Asp인 서열 번호 52), huIFN-알파 8c (161번 위치가 Asp이고 162∼166개 위치의 아미노산이 결실된 서열 번호 52), huIFN-알파 14a (서열 번호 54), huIFN-알파 14c (152번 위치가 Leu인 서열 번호 54), 또는 기타 천연 생성된 인간 인터페론 알파 폴리펩티드 서열 예를 들어, 문헌[Allen G. and Diaz M.O. (1996), 상동]에 나열된 서열을 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은, 참고 인터페론-알파 분자 예를 들어, 현재 치료제로서 사용되는 분자(예를 들어, ROFERON-A, INTRON A, 또는 INFERGEN)에 비하여 바이러스 감염 세포로부터 바이러스를 제거하는 효능이 강화된 인터페론-알파 폴리펩티드를 제공한다. 대표적인 바이러스로서는 플래비바이러스 (Flaviviridae) 군 바이러스, 예를 들어, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스 및 바이러스성 소 설사 바이러스; 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 군 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스; 피코나바이러스(Picornaviridae) 군 바이러스, 예를 들어, 뇌척수 심근염 바이러스, 인간 리노바이러스 및 A형 간염 바이러스; 레트로바이러스(Retroviridae) 군 바이러스 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 T-림프구 영양 바이러스 및 로우스 육종 바이러스; 코로나바이러스(Coronaviridae) 군 바이러스, 예를 들어, SARS 코로나바이러스; 래비도바이러스(Rhabdoviridae) 군 바이러스 예를 들어, 광견병 바이러스 및 포진성 구내염 바이러스, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 군 바이러스 예를 들어, 호흡기 질환 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스, 파필로마바이러스(Papillomaviridae) 군 바이러스, 예를 들어, 인간 파필로마바이러스 및 헤르페스바이러스 (Herpesviridae)군 바이러스 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이 참고 분자에 비하여 강화된 효능은 강화된 항바이러스 활성, 강화된 T_H1∼분화 활성 또는 둘 다로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 인터페론-알파 폴리펩티드는 특히 현재 사용되는 인터페론-알파 분자를 사용한 치료에 반응을 나타내지 않는 바이러스 또는 바이러스 변종 예를 들어, HCV의 제1 유전자형을 제거하는데 유용하다.

본 발명의 몇몇 폴리펩티드는 참고 IFN-알파 분자에 비하여 증가된 비율의 (항바이러스 활성/항증식 활성) 및/또는 참고 IFN-알파 분자에 비하여 증가된 비율의 (T_H1 분화 활성/항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 특성을 나타내는 폴리펩티드는 특히 바이러스 감염 예를 들어, 상기 나열한 바이러스 감염의 치료에 효과적일 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 일부는 예를 들어, HCV 치료에 있어서 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비하여 강화된 치료 효능을 2단계 바이러스 소멸 프로필 중 어느 하나 또는 둘 다의 형태로 제공하며/하거나, 감소된 독성을 나타낼 수 있다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 제1 유전자형 HCV의 치료에 있어서 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비하여 강화된 치료 효능을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 컨쥬게이트를 제공하는 것인데, 여기서 상기 컨쥬게이트는 본 발명의 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하고, 인터페론-알파 활성(예를 들어, 상기 나열한 활성들 중 하나 이상의 활성)을 나타내며, 기타 바람직한 특성 예를 들어, 비 컨쥬게이트화 폴리펩티드에 비하여 증가된 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기 및/또는 감소된 항원성을 나타내기도 한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 참고 인터페론-알파 분자 예를 들어, PEGASYS(등록상표)(페그인터페론 알파-2a; HoffmanN-La Roche, Inc.) 또는 PEG-INTRON(등록상표)(페그인터페론 알파-2b; Schering Corporation)과 같이 현재 치료제로서 사용되고 있는 분자에 비하여, 바이러스 감염 세포로부터 바이러스를 소멸시키는 효능이 강화될 수 있다. 대표적인 바이러스로서는 플래비바이러스 군 바이러스, 예를 들어, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스 및 바이러스성 소 설사 바이러스; 헤파드나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스; 피코나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 뇌척수 심근염 바이러스, 인간 리노바이러스 및 A형 간염 바이러스; 레트로바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 T-림프구 영양 바이러스 및 로우스 육종 바이러스; 코로나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, SARS 코로나바이러스; 래비도바이러스 군 바이러스 예를 들어, 광견병 바이러스 및 포진성 구내염 바이러스, 파라믹소바이러스 군 바이러스 예를 들어, 호흡기 질환 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스, 파필로마바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 인간 파필로마바이러스 및 헤르페스바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이 참고 분자에 비하여 강화된 효능은 강화된 항바이러스 활성, 강화된 T_H1-분화 활성 또는 둘 다로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 인터페론-알파 컨쥬게이트는 특히 현재 사용되는 인터페론-알파 분자를 사용한 치료에 반응을 나타내지 않는 바이러스 또는 바이러스 변종 예를 들어, HCV의 제1 유전자형을 제거하는데 유용하다.

본 발명의 컨쥬게이트 중 일부는 참고 IFN-알파 분자에 비하여 높은 비율의 (항바이러스 활성/항증식 활성)을 나타내며/나타내거나, 참고 IFN-알파 분자에 비하여 높은 비율의 (T_H1 분화 활성/항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 특성을 나타내는 컨쥬게이트는 바이러스 감염 예를 들어, 상기 나열한 바이러스 예를 들어, HCV에 의한 감염의 치료에 특히 효과적일 수 있다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 예를 들어, HCV 치료에 있어서 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비하여 강화된 치료 효능을 2단계 바이러스 소멸 프로필 중 어느 하나 또는 둘 다의 형태로 제공하며/제공하거나, 감소된 독성을 나타낼 수 있다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 제1 유전자형 HCV의 치료에 있어서 현재 승인된 인터페론-알파 분자에 비하여 강화된 치료 효능을 제공할 수 있다.

바이러스 감염 세포에서 바이러스 복제를 억제하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적인데, 이 방법은 바이러스 감염 세포에 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 상기 세포에서 바이러스 증식을 억제하는데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 바이러스 감염 세포내 바이러스 복사체 수를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 바이러스 감염 세포에 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 상기 세포에서 바이러스 복사체 수를 감소시키는데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 바이러스로서는 플래비바이러스 군 바이러스, 예를 들어, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스 또는 바이러스성 소 설사 바이러스; 헤파드나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스; 피코나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 뇌척수 심근염 바이러스, 인간 리노바이러스 또는 A형 간염 바이러스; 레트로바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 T-림프구 영양 바이러스 또는 로우스 육종 바이러스; 코로나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, SARS 코로나바이러스; 래비도바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 광견병 바이러스 또는 포진성 구내염 바이러스, 파라믹소바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 호흡기 질환 바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스, 파필로마바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 인간 파필로마바이러스 또는 헤르페스바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스일 수 있다. 상기 바이러스는 예를 들어, RNA 바이러스 예를 들어, HCV, DNA 바이러스 예를 들어, HBV, 또는 레트로바이러스 예를 들어, HIV일 수 있다. 상기 세포는 배지중에 존재하거나 또는 포유 동물로부터 분리된 것(즉, 시험관내 또는 생체외)일 수 있거나, 또는 생체내 예를 들어, 포유 동물내(예를 들어, 문헌[Mercer외 다수(2001) Nature Medicine. 7(8):927-933]에 개시된 바와 같은 SCID 마우스 모델), 유인원 또는 사람 내에 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 T_H0 세포의 T_H1 분화를 강화시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 T_H0 세포를 포함하는 군집에 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 상기 군집에서 T_H1 표현형과 관련된 사이토카인(예를 들어, IFN-감마)의 생성을 증가시키고/증가시키거나, T_H2 표현형과 관련된 사이토카인(예를 들어, IL-4 또는 IL-5)의 생성을 감소시키는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 군집은 배지중에 존재할 수 있거나 또는 포유 동물로부터 분리된 것(즉, 시험관내 또는 생체외)일 수 있거나, 또는 생체내 예를 들어, 포유 동물, 유인원 또는 사람에 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 세포 군집의 증식을 억제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 세포 군집과 본 발명의 폴리펩티드, 변이체 또는 컨쥬게이트를 세포 군집의 증식을 감소시키는데 유효한 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 세포 군집은 배지중에 또는 포유 동물로부터 분리되어(즉, 시험관내 또는 생체외) 존재할 수 있거나, 또는 생체내 예를 들어, 포유 동물내, 유인원내 또는 사람에 존재할 수 있다.

본 발명의 상기 목적 또는 기타 목적은 이하에 보다 상세히 설명되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드

본 발명은 신규한 인터페론-알파 폴리펩티드, 즉 본원에서 통합하여 "본 발명의 폴리펩티드"라 칭하여지는 폴리펩티드를 제공한다. "본 발명의 폴리펩티드(들)"이란 용어에는, 본원에 개시된 폴리펩티드 서열의 변이체들이 포함된다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질과, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 컨쥬게이트를 포함하기도 한다.

다양한 인터페론-알파 암호화 서열의 단편은 반복적으로 재조합되어 본 발명의 폴리펩티드가 유래된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리를 형성한다. 반복적 서열 재조합법의 기질로서 사용되는 재조합 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 얻는 방법 및/또는 핵산에 다양성을 가하는 방법에 관하여도 본원에 기술되어 있다.

본 발명의 대표적인 폴리펩티드로서는, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44 (즉, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 10, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44)로서 동정된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 추가로 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 F48A/L 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 이들 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1에 대한 치환부 F48A를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; V51A/P; Q52P/E; A53T; F55A/S; L56V; F65A; F57L; Y58H; M61I; F68P; L111A; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 F55A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; F48A/L; V51A; Q52P/E; A53T; L56V; F65A; F57L; Y58H; M61I; F68P; L111A; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 F65A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; F48A/L; V51A/P; Q52P/E; A53T; F55A/S; L56V; F57L; Y58H; M61I; F68P; L111A; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 L111A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; F48A/L; V51A/P; Q52P/E; A53T; F55A/S; L56V; F65A; F57L; Y58H; M61I; F68P; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 13과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 및 114번 위치의 Pro(위치 번호는 서열 번호 13에 관한 것임)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 13과 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 13에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 대한 치환부 즉, M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부(들)를 하나 이상 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, P26L; H47Q; T51V; S55P/F; V56L; H58Y; L60M; F90Y; M93L; N95D; N113K; V114E; R125Q; T132K; 및 L154F로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 대한 F48A/L 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 36에 관한 F48A 치환부를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, M21A; I24P; P26L; H47Q; T51V/P; S55P/F/A; V56L; H58Y; L60M; F65A; F68P; F90Y/A; M93L/P; N95D; L111A; N113K; V114E/P; F124A; R125Q; I127P; T132K; L154F; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 관한 F90A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, M21A; I24P; P26L; H47Q; F48A/L; T51V/P; S55P/F/A; V56L; H58Y; L60M; F65A; F68P; M93L/P; N95D; L111A; N113K; V114E/P; F124A; R125Q; I127P; T132K; L154F; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 관한 E160D 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, M21A; I24P; P26L; H47Q; F48A/L; T51V/P; S55P/F/A; V56L; H58Y; L60M; F65A; F68P; F90Y/A; M93L/P; N95D; L111A; N113K; V114E/P; F124A; R125Q; I127P; T132K 및 L154F로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 38과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 21번 위치의 Ala; 24번 위치의 Pro; 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 90번 위치의 Ala; 93번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro; 124번 위치의 Ala; 127번 위치의 Pro; 및 160번 위치의 Glu(위치 번호는 서열 번호 38에 관한 것임)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 서열 번호 38과 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 38에 대한 치환부(들) 즉, P26L; H47Q; V51T; F55P/S; L56V; Y58H; L60M; F90Y; M93L; N95D; N113K; V114E; R125Q; T132K; 및 F154L로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트, 그리고 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드로서 간주되는 기타 변형체로서는 이하 "인터페론-알파 컨쥬게이트" 단락에 기술된 것들을 포함한다.

근원 폴리펩티드에 대한 구체예 및 변형예가 일반적으로 본원에서 서열 번호 1(또는 서열 번호 36 또는 기타 몇몇 특정 서열)의 서열에 관하여 제공된 반면에, 개시된 변형은 또한 본원에 개시된 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것(예를 들어, 서열 번호 2∼5 및 서열 번호 37∼44로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드)의 동등한 아미노산 위치에 가하여질 수 있다는 사실을 이해하여야 할 것이다. 그러므로, 예를 들어, 서열 번호 1에 관한 F48L 치환부는 예를 들어, 서열 번호 13의 A48L 치환부에 상응하는 것으로 이해된다.

이하 표는 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 중 일부의 서열을 제공하는 것이다. 명확성을 위하여, 상기 서열은 참고 서열들 즉, 서열 번호 1(표 1a∼1b) 또는 서열 번호 36(표 2)에 관하여 나타내었다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 인터페론-알파 활성 예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성을 나타낸다.

서열 변이체

전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 36에 대한 하나 이상의 치환부를 포함한다. 이러한 폴리펩티드 중 일부는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 중 일부는 길이가 약 151개의 아미노산인 서열 예를 들어, 약 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 또는 165개의 아미노산인 서열을 포함하는데, 상기 아미노산은 근원 폴리펩티드 서열(예를 들어, 서열 번호 2∼35 또는 서열 번호 37∼44 중 하나의 서열)에 관하여 1∼15개의 아미노산이 결실된 부분에 해당한다. 몇몇 경우에 있어서, 1∼11개 예를 들어, 1∼10개 예를 들어, 1∼7개 예를 들어, 1∼5개 예를 들어, 1∼3개의 아미노산이 C-말단으로부터 결실되어 있는데 즉, 이 폴리펩티드는 근원 폴리펩티드 서열(예를 들어, 서열 번호 2∼35 또는 서열 번호 37∼44 중 어느 하나의 서열)에 비하여 C-말단이 1∼11개의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산 잔기) 예를 들어, 1∼10개, 1∼7개 예를 들어, 1∼5개 또는 1∼3개의 아미노산 잔기 만큼 절단되어 있다. 대안적으로 또는 부가하여, 이러한 폴리펩티드 중 일부는 근원 폴리펩티드 서열(예를 들어, 서열 번호 2∼35 또는 서열 번호 37∼44 중 어느 하나의 서열)에 비하여 N-말단이 1∼4개의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 개의 아미노산 잔기) 만큼 절단되어 있는데 예를 들어, N-말단으로부터 1∼4개, 1∼3개, 1∼2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들) 만큼 제거되어 있다. 이들 폴리펩티드 중 일부는 N-말단에 메티오닌을 추가로 포함한다. 이들 폴리펩티드 중 일부는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

다른 구체예로서, 본 발명의 일부 폴리펩티드는 서열 번호 1에 관하여 1∼16개의 아미노산 치환부(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 아미노산 치환부)를 함유하는 서열 예를 들어, 1∼14개, 또는 1∼12개, 또는 1∼10개, 또는 1∼8개, 또는 1∼6개, 또는 1∼5개, 또는 1∼4개, 또는 1∼3개 또는 1∼2개의 아미노산 치환부를 함유하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 치환부는 F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나 이상이다. 본 발명의 기타 폴리펩티드는 서열 번호 36에 관하여 1∼16개의 아미노산 치환부(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 아미노산 치환부)를 함유하는 서열 예를 들어, 1∼14개, 또는 1∼12개, 또는 1∼10개, 또는 1∼8개, 또는 1∼6개, 또는 1∼5개, 또는 1∼4개, 또는 1∼3개 또는 1∼2개의 아미노산 치환부를 함유하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 치환부는 M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나 이상이다. 하나 이상의 부가 아미노산 치환부는 예를 들어, 치환군(예를 들어, 보존적 치환군) 예를 들어, 이하 제시된 것들 중 하나의 세트에 따라서 폴리펩티드 서열 중에 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 부가하여, 하나 이상의 부가 아미노산 치환부는 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기를 도입하거나 제거한 폴리펩티드 서열중에서 생성될 수 있다. 그 예로서는 하나 이상의 N-말단 글리코실화 부위(들)의 도입, 하나 이상의 시스테인 잔기(들) 또는 리신 잔기(들)의 도입, 하나 이상의 N-글리코실화 부위(들)의 제거 및/또는 하나 이상의 리신(들) 또는 히스티딘(들)의 제거를 포함한다. 이러한 폴리펩티드들 중 일부는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

비제한적 실시예로서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 1과 총 16개 이하의 위치가 상이한 서열(즉, 예를 들어, 전술한 바와 같은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 조합하여 발생 될 수 있는 서열)을 보유할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 치환부 중 일부 또는 모두는 이하 정의된 치환 군에 따른 치환부이거나, 또는 그렇지 않다.

본 발명에 따른 아미노산 치환부는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환부를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환에 관한 표는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 하나의 예가 이하 표 3에 제공되어 있는데, 이 표는 서로 "보존적 치환"으로 간주될 수 있는 아미노산을 함유하는 6개의 대표적 군을 제시하고 있다.

보존적 치환군
1	알라닌(A)	글리신(G)	세린(S)	트레오닌(T)
2	아스파르트산(D)	글루탐산(E)
3	아스파라긴(N)	글루타민(Q)
4	아르기닌(R)	리신(K)	히스티딘(H)
5	이소루신(I)	루신(L)	메티오닌(M)	발린(V)
6	페닐알라닌(F)	티로신(Y)	트립토판(W)

아미노산의 기타 치환군도 예측할 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 기능 또는 화학 구조 또는 조성(예를 들어, 산성, 염기성, 지방성, 방향성, 황함유)에 의하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 지방성인 것들을 분류하면 다음과 같은 것들을 포함할 수 있다: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루신(L), 이소루신(I). 서로 보존적 치환을 하는 것으로 생각되는 아미노산을 함유하는 기타 군은 다음의 것들을 포함할 수 있다: 방향성: 페닐알라닌(F), 티로신(T), 트립토판(W); 황함유: 메티오닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q). 또한 아미노산의 추가 분류법에 관하여는 문헌[Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company]을 참조하시오. 상기 치환군과 관련된 본원의 폴리펩티드 서열의 목록은 보존적으로 치환된 폴리펩티드 서열 모두의 발현 목록을 제공한다.

서열 상동성 %

하나의 측면에서, 본 발명은 각각 서열 상동성이 서열 번호 1∼35 중 임의의 하나에 관하여 90% 이상(예를 들어, 아미노산 서열 상동성이 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상)인 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 서열은 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro 중 하나 이상을 포함한다(상기 아미노산 위치는 서열 번호 1에 관함). 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

본 발명은 또한 각각 서열 상동성이 서열 번호 36∼44 중 임의의 하나에 관하여 90% 이상(예를 들어, 아미노산 서열 상동성이 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상)인 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 서열은 21번 위치의 Ala; 24번 위치의 Pro; 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 90번 위치의 Ala; 93번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro; 124번 위치의 Ala; 127번 위치의 Pro; 및 160번 위치의 Asp 중 하나 이상을 포함한다(상기 아미노산 위치는 서열 번호 36에 관함). 몇몇 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

서열(폴리펩티드 또는 핵산)이 다른 서열과 유사한 정도는 2개의 서열에 대하여 유사한 구조적 및 기능적 특성에 관한 지표를 제공한다. 따라서, 본 발명의 내용에서 임의의 주어진 대표적 서열과 유사한 서열을 갖는 서열은 본 발명의 특징이다. 구체적으로, 이하에 정의한 바와 같은 서열의 상동성 %를 갖는 서열은 본 발명의 특징이다.

서열 관계를 결정하는 다양한 방법이 사용될 수 있는데, 이러한 방법으로서는 예를 들어, 수동식 정렬 및 컴퓨터 보조 서열 정렬 및 분석법이 있다. 서열 정렬을 수행하는 컴퓨터 프로그램으로서는 다양한 것들이 있는데, 이하 기술된 바와 같이, 정렬은 당업자에 의하여 수동으로 제공될 수 있다

전술한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 폴리펩티드 및 핵산 서열은 동일할 필요는 없으나, 본 발명의 해당 폴리펩티드 서열 또는 본 발명의 핵산 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 이러한 변화가 적용될 때 예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 사용시, 또는 투여 또는 진단시 임의의 이점을 제공할 수 있는 경우 본 발명의 폴리펩티드에 여러 가지 변화 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 보존적으로 또는 비 보존적으로 가할 수 있다. 본 발명의 핵산에는 또한 다양한 변화 예를 들어, 하나 이상의 코돈에 하나 이상의 핵산에 대한 하나 이상의 치환이 가하여져 특정 코돈이 동일하거나 상이한 아미노산을 암호화하게 되어, 그 결과 서열 내에 침묵 변이(본원에 정의된 바와 같음) 또는 비 침묵 변이, 또는 하나 이상의 핵산(또는 코돈)에 대한 하나 이상의 결실을 초래할 수 있다. 핵산은 또한 변형되어 발현 시스템(예를 들어, 박테리아 또는 포유 동물)내에서 최적의 발현을 위해 제공되는 하나 이상의 코돈을 포함할 수 있지만, 원하는 경우, 상기 하나 이상의 코돈은 여전히 동일한 아미노산(들)을 암호화하게 된다. 이러한 핵산 변화는 이의 치료학적 또는 예방학적 사용 또는 투여시, 또는 진단시 특정한 이점을 제공할 수 있다. 핵산 및 폴리펩티드는 이것들이 본 발명의 각 핵산 또는 폴리펩티드 내 서열과 실질적으로 동일한(이하 기술됨) 서열을 포함하는 한, 다수의 방식으로 변형될 수 있다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 있어서 "동일한" 또는 "상동성"이란 용어는, 이하 기술된 바와 같은 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안으로 관찰하여 측정되는 바와 같이 최대 유사성에 대해 비교 및 정렬될 때, 2개 이상의 서열이 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정 % 보유하는 경우를 의미한다.

참고 서열(즉, 의문 서열(query sequence))에 대한 표제 서열의 "서열 상동성 %"("상동성 %")이란, 표제 서열이 비교 길이에 걸쳐 존재하는 의문 서열에 대하여 특정 % 만큼 동일(즉, 폴리펩티드 서열에 대하여 아미노산 대 아미노산, 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드를 기준으로 하였을 때 동일)함을 의미한다.

의문 서열에 대한 표제 서열의 서열 상동성 %은 다음과 같이 계산된다. 우선, 특정 정렬 매개 변수를 갖는 서열 비교 알고리즘을 사용하여 2개 서열의 최적 정렬을 결정한다. 이러한 최적 정렬 결정은 이하에 기술된 바와 같이 컴퓨터를 사용하여 수행될 수 있거나, 또는 수동식으로 계산될 수 있다. 이후, 2개의 최적 정렬 서열들을 비교 길이에 대해 비교하고, 최적 정렬 내 양 서열에 존재하는 동일 잔기의 위치 번호를 측정하는데, 이로써 매치되는 위치의 번호를 알 수 있다. 이후 매치된 위치의 수를 비교 길이(달리 특정하지 않으면, 의문 서열의 길이)내 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 의문 서열에 대한 표제 서열의 서열 상동성 %을 얻는다.

폴리펩티드 서열에 관하여, 통상적으로 하나의 서열은 "의문 서열"(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 서열)로서 간주되는 데, 이때 하나 이상의 기타 서열 즉, "표제 서열(들)"(예를 들어, 서열 데이터베이스에 존재하는 서열)이 비교된다. 서열 비교 알고리즘은 지정된 정렬 매개 변수를 사용하여 의문 서열과 표제 서열(들) 사이의 최적 정렬을 결정한다. 의문 서열을 서열 데이터베이스 예를 들어, GENBANK(등록상표)(Genetic Sequence Data Bank; 미국 보건복지성) 또는 GENESEQ(등록상표)(Thomson Derwent; STN상에서는 DGENE(등록상표)로서 시판되기도 함)와 비교할 때에는, 일반적으로 의문 서열 및 정렬 매개 변수만을 캄퓨터에 입력하고; 입력 의문 서열 및 데이터베이스에 존재하는 각 표제 서열 사이의 최적 정렬은 일반적으로 원하는 수의 표제 서열 만큼에 대해서 복구된다.

2개의 서열이 특정 매개 변수 즉, 특정 아미노산 치환 매트릭스, 갭 실존 패널티(갭 개방 패널티라고도 함) 및 갭 연장 패널티를 사용하여 정렬하여 서열 쌍에 대해 가능한 유사성 스코어가 최고에 도달하게 될 때, 2개의 폴리펩티드 서열들은 "최적 정렬"되었다고 한다. BLOSUM62 매트릭스(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915∼10919)가 종종 폴리펩티드 서열 정렬 알고리즘(예를 들어, 이하 기술된 BLASTP)내에서 디폴트 스코어링 치환 매트릭스로서 사용된다. 정렬된 서열중 어느 하나에 단일 아미노산 갭을 도입하기 위하여 갭 실존 패널티가 부과되고, 갭 내에 각 잔기 위치에 대하여는 갭 연장 패널티가 부과된다. 달리 언급이 없으면, 본원에 사용된 정렬 매개 변수는 다음과 같다: BLOSUM62 스코어링 매트릭스, 갭 실존 패널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1. 정렬 스코어는 정렬이 개시 및 종결되는 부분(예를 들어, 정렬 윈도우)에서의 각 서열의 아미노산 위치로써 정의되며, 임의로는 하나 또는 2개의 서열에 하나의 갭 또는 다수의 갭을 삽입하여 가능한 유사성 스코어의 최고 값에 도달하게 함으로써 정의되기도 한다.

2 이상 서열 사이 최적 정렬은 수동식으로 결정될 수도 있지만(이하 기술함), 그 과정은 컴퓨터 수행 정렬 알고리즘 예를 들어, BLAST(등록 상표)(국립 의학 도서관) 예를 들어, BLASTP(폴리펩티드 서열 용) 및 BLASTN(핵산 서열 용)[Altschul외 다수, (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389∼3402]을 사용하면 촉진되며, 이는 다양한 소스 예를 들어, 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information (NCBI)) 웹사이트를 통해 공중이 이용 가능하게 되어 있다. 컴퓨터화된 BLAST 인터페이스를 사용할 경우, 선택 사항이 "저 복잡성 필터(low complexity filter)"를 사용하도록 존재하면, 이 선택 사항은 배제시킨다(즉, 필터링 하지 않음).

2개의 폴리펩티드 서열 사이의 최적 정렬은 또한 상기 지정된 동일한 정렬 매개 변수(매트릭스 = BLOSUM62, 갭 개방 패널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1)을 이용하는 BLASTP 알고리즘을 수동으로(즉, 컴퓨터의 도움 없이) 계산하여 결정될 수도 있다. 우선, 2개의 서열들을 처음에 눈으로 관찰하면서 정렬시킨다. 이후 초기 정렬 스코어는 다음과 같이 계산한다: 정렬의 각 위치(즉, 정렬된 잔기의 각 쌍)에 대하여 BLOSUM62 매트릭스에 따라서 수치를 할당한다(도 4). 정렬에 존재하는 각각의 잔기쌍에 할당된 수치들의 총 합은 처음의 정렬 스코어가 된다. 만일 정렬된 2개의 서열들이 매우 유사하면, 상기 초기 정렬은 종종 가능한 정렬 스코어의 최고 값을 제공한다. 상기 최고 가능 정렬 스코어를 갖는 정렬은 사용된 정렬 매개 변수를 기초로 하는 최적 정렬이다. 도 5의 A는 2개의 서열 즉, "의문" 서열 즉, 본원에서 서열 번호 1(상)의 29∼50번 잔기로서 동정된 서열과, "표제" 서열 즉, 본원에서 서열 번호 8(하)의 30∼52번 잔기로서 동정된 서열에 대한 정렬 스코어를 계산하는 방법에 대한 예를 나타내는 것이다. 상기 서열들은 눈으로 관찰하여 정렬되고, 각각의 정렬된 아미노산 쌍에 대한 BLOSUM62 매트릭스에 의해 할당된 수치는 정렬의 아래에 각 위치별로 나타내었다[눈으로 알아보기 쉽도록, 정렬 내 각각의 동일한 아미노산 쌍은 굵은 글씨로 표시함]. 이와 같은 예를 통하여, 상기 초기 정렬은 최고의 가능 정렬 스코어(정렬된 위치 각각의 아래에 나타낸 수치의 총합)를 제공하고; 상기 2개의 서열들의 임의의 정렬은, 갭이 존재하거나 존재하지 않거나, 정렬 스코어가 보다 낮아지게 된다.

몇몇 경우에 있어서, 보다 높은 정렬 스코어는 정렬에 하나 이상의 갭을 도입시킴으로써 얻어질 수 있다. 갭이 그 정렬에 도입되기만 하면, 갭 개방 패널티가 할당되고, 또한 갭 연장 패널티는 그 갭 중의 각 잔기 위치에 대하여 평가된다. 그러므로, 전술한 정렬 매개 변수(예를 들어, 갭 개방 패널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1)를 사용하면, 그 정렬 중에 존재하는 하나의 잔기의 갭은 그 갭에 할당된 값 즉, -(11+(1×1))=-12에 해당하게 되고; 3개의 잔기의 갭은 그 갭에 할당된 값 즉, -(11+(3×1))=-14에 해당하게 될 것이다. 정렬에 도입된 각각의 신규한 갭에 대해 이러한 계산법을 반복 수행한다. 도 5의 B 및 C는 갭 패널티에도 불구하고, 갭이 정렬에 도입되면 어떻게 보다 높은 정렬 스코어가 얻어질 수 있는지를 나타내는 예이다. 도 5의 B는 눈으로 관찰함으로써 얻어진 서열 번호 1(상, 의문 서열)의 29∼50번 잔기 및 서열 번호 46(이하, 표제 서열)의 30∼50번 잔기의 초기 정렬을 나타내는 것으로서, 이를 통하여 초기 정렬 스코어 67을 얻을 수 있다. 도 5의 C는 정렬 스코어에 서열 번호 46중 하나의 잔기 갭을 도입하였을때의 효과를 나타내는 것으로서; 갭 패널티가 ∼12임에도 불구하고, 2개 서열의 전체 정렬 스코어는 88까지 증가한다. 이 예에서, 도 5의 C에 나타낸 정렬은 가능한 정렬 스코어의 최고 값을 제공하므로, 이들 2개 서열의 최적 정렬에 해당하게 되고; 상기 2개의 서열들의 임의의 정렬(갭이 존재하거나 또는 존재하지 않거나)은 정렬 스코어가 낮아지게 된다.

전술한 바와 같이, 비교적 짧은 서열들을 사용한 서열 정렬 계산법의 예들은 예시의 목적으로서만 제공된 것으로서; 실제에 있어서, 사용된 정렬 매개 변수(BLOSUM62 매트릭스, 갭 개방 패널티 = 11 및 갭 연장 패널티 = 1)는 일반적으로 길이가 85개 이상인 아미노산의 폴리펩티드 서열에 대해 사용된다. NCBI 웹사이트는 다음과 같은 여러 가지 길이를 갖는 서열(전술한 바와 동일한 방법을 따르는 컴퓨터-원조 계산법 및 수동식 정렬 계산법에 적당한 길이를 갖는 서열)에 대한 정렬 매개 변수를 제공한다. 길이가 50∼85개 아미노산인 서열에 있어서, 최적 매개 변수는 BLOSUM80 매트릭스(Henikoff 및 Henikoff, 상동), 갭 개방 패널티 = 10 및 갭 연장 패널티 = 1이다. 길이가 35∼50개 아미노산인 서열에 있어서, 최적 매개 변수는 PAM70 매트릭스(Dayhoff, M. O., Schwartz, R. M. & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins. " In Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 3, M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345∼352, Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, DC.), 갭 개방 패널티 = 10 및 갭 연장 패널티 = 1이다. 길이가 35개 미만 아미노산인 서열에 있어서, 최적 매개 변수는 PAM30 매트릭스(Dayhoff, M. O., 상동), 갭 개방 패널티 = 9 및 갭 연장 패널티 = 1이다.

일단 서열이 최적으로 정렬되면, 의문 서열에 관한 표제 서열의 상동성 %은 동일한 잔기 쌍을 함유하는 최적 정렬 내 위치의 수를 계수하여, 이를 비교 길이내 잔기의 수(달리 특정하지 않는 한, 의문 서열 내 잔기의 수)로 나누고, 여기에 100을 곱함으로써 계산된다. 도 5에 나타낸 예들로 돌아가서, 각 예에서, 의문 서열로 지정된 서열은 그 길이가 22개의 아미노산이다. 도 5의 A에 나타낸 정렬에서, 정렬된 20개의 아미노산 잔기 쌍(굵은 글씨로 나타냄)은 의문 서열(상)과 표제 서열(하)의 최적 정렬에서와 동일하다. 그러므로, 이와 같은 특정 표제 서열은 의문 서열에 대해서 (20/22)×100 = 91.1%의 상동성을 갖는데; 다시 말하면, 도 5의 A에 나타낸 정렬중 표제 서열은 의문 서열에 대해서 91% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 도 5의 C에 나타낸 정렬에 있어서 최적 정렬중 18 쌍의 아미노산 잔기(굵은 글씨로 나타냄)는 동일하므로; 특정 표제 서열은 의문 서열에 대해 (18/22)×100 = 81.8%의 상동성을 갖는데; 다시 말하면, 도 5의 C에 나타낸 정렬중 표제 서열은 의문 서열에 대해서 81% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는다.

폴리펩티드에 대하여 사용된 "실질적 상동성"(또는 "실질적으로 상동성인")이라는 용어는, 통상적으로 2개의 아미노산 서열(즉, 의문 서열과 표제 서열)이 BLASTP 알고리즘(전술한 바와 같이 적당한 매개 변수 사용)을 이용하여(수동으로 또는 컴퓨터를 통하여) 최적으로 정렬될 때, 표제 서열은 의문 서열에 대하여 약 60% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 아미노산 서열 상동성 %을 갖는다. 몇몇 경우에 있어서, 실질적 상동성은 약 100개 이상의 아미노산 잔기 예를 들어, 약 110, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 또는 166개 이상의 아미노산 잔기 만큼의 비교 길이에 걸쳐 존재한다.

이와 유사하게, 2개의 핵산 서열에 대해서 사용될 때, 실질적 상동성(또는 실질적으로 상동성인)이란 용어는, 2개의 핵산 서열(즉, 의문 서열 및 표제 서열)이 BLASTN 알고리즘을 이용하여(수동으로 또는 컴퓨터를 통하여) 전술한 바와 같이 적당한 매개 변수를 이용하였을 때 최적으로 정렬될 경우, 표제 서열은 의문 서열에 대하여 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 핵산 서열 상동성 %를 갖는다. 핵산 서열의 정렬 알고리즘에 사용된 매개 변수는 다음과 같다: 매치 보상값 = 1, 미스매치 패널티 = ∼3, 갭 실존 패널티 = 5, 갭 연장 패널티 = 2 (BLASTN 알고리즘에서는 치환 매트릭스를 사용하지 않음). 몇몇 경우에 있어서, 비교 길이에 대한 실질적 상동성은 약 300개 이상의 뉴클레오티드 잔기 예를 들어, 약 330, 360, 375, 390, 405, 420, 435, 450, 465, 480, 483, 486, 489, 492, 495 또는 498개 이상의 뉴클레오티드 잔기에 걸쳐서 존재한다.

부가적 양태

본 발명의 폴리펩티드는 보다 큰 폴리펩티드 서열 예를 들어, 융합 단백질 예를 들어, 폴리펩티드의 안정화 또는 검출 또는 정제를 위해 하나 이상의 도메인 또는 종속 서열을 부가할 때 생성되는 서열의 일부로서 존재할 수 있다. 폴리펩티드 정제 종속 서열은 예를 들어, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열, GST 융합체, 또는 당 업계에 "태그" 또는 검출/정제 종속 서열로서 공지된 것들중 임의의 것을 포함할 수 있다. 이러한 부가적 도메인 또는 종속 서열은 본 발명의 폴리펩티드 활성에 아무런 영향도 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않거나, 또는 사후 합성 프로세싱 단계 예를 들어, 프로테아제 처리, 인테인의 도입 등에 의해 제거될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 Ig 분자 예를 들어, 인간 IgG Fc("결정화 가능한 단편" 또는 단편 보체 결합) 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인에 융합된 융합 단백질과, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. Fc는 세포 및 보체의 C1q 성분상에서 항체 수용기와 결합하는 기능을 갖는 항체의 일부이다. 이러한 융합 단백질 및 이를 암호화하는 핵산은 예방적 및/또는 치료적 약물 또는 진단 도구로서 유용하다[Challita∼Eid, P.외 다수 (1998) J. Immunol 160: 3419∼3426; Sturmhoefel, K.외 다수(1999) Cancer Res 59: 4964∼4972)]. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하며, 알부민 분자 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)[미국 특허 제 5,876,969 호]에 융합되어 있는 융합 단백질과, 이 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 Ig 및 알부민 융합 단백질은 증가된 폴리펩티드 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기, 감소된 폴리펩티드 항원성, 증가된 폴리펩티드 저장 안정성, 또는 증가된 생체적합성 예를 들어, 증가된 AUC_SC를 나타낼 수 있으므로, 이는 예방적 및/또는 치료적 약물로서 유용할 수 있다.

본 발명의 임의의 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수도 있다. 상기 변형된 아미노산은 예를 들어, 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오틴화된 아미노산, 지질부에 컨쥬게이트화된 아미노산, 또는 유기 유도체화 제제에 컨쥬게이트화된 아미노산일 수 있다. 변형된 아미노산의 존재는 예를 들어, (a) 폴리펩티드 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기의 증가, (b) 폴리펩티드 항원성의 감소, (c) 폴리펩티드 저장 안정성의 증가, 또는 (d) 생체 적합성의 증가 예를 들어, AUC_SC의 증가에 있어서 유익할 수 있다. 아미노산(들)은 예를 들어, 재조합 생성시 동시 번역되거나 또는 사후 번역되어 변형되며(예를 들어, 포유 동물 세포내 발현중 N-X-S/T 모티브에서의 N-결합 글리코실화), 또는 합성 방법에 의해 변형된다. 이러한 양상은 본원의 "인터페론-알파 컨쥬게이트" 섹션에 보다 상세히 기술되어 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드와, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 함유하는 조성물일 수 있다. 대표적인 조성물 및 부형제 및 담체는 이하에 기술되어 있다.

폴리펩티드의 제조

본 발명의 폴리펩티드를 제조 및 분리하는 재조합 방법은 본원에 기술되어 있다. 재조합적 생산 방법 이외에, 상기 폴리펩티드는 고체상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있다[Stewart외 다수, (1969) Solid∼Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J. (1963) J Am Chem Soc 85: 2149∼2154]. 펩티드 합성법은 수동식 기술 또는 자동화 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성법은 예를 들어, 제조자에 의해 제공되는 지침에 따라서 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 431A 펩티드 합성기 (Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 종속 서열은 독립적으로 화학 합성될 수 있으며, 화학적 방법과 병행되어 전장 폴리펩티드 또는 이의 단편을 제공할 수 있다. 대안적으로, 이러한 서열은 폴리펩티드 생성을 전문으로 하는 다수의 회사들로부터 주문할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 대부분 예를 들어, 이하에 기술된 바와 같이 암호화 핵산을 발현시키고 폴리펩티드를 회수함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 또한 포함된다. 이러한 방법중 하나는 세포 군집에 본원에 개시된 본 발명의 임의의 핵산을 도입하는 과정[여기서, 상기 핵산은 암호화된 폴리펩티드를 제조하는데 효과적인 조절 서열에 작동 가능하도록 연결됨], 이 세포들을 배양 배지중에서 배양하여 폴리펩티드를 발현시키는 과정 및 상기 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 분리시키는 단계를 포함한다. 세포에 의한 흡수(트랜스펙션) 및/또는 폴리펩티드의 발현을 촉진시키기에 충분한 양의 핵산이 사용된다. 상기 핵산은 본원에 기술된 임의의 전달 방법 예를 들어, 주입, 유전자 총, 수동 흡수 등에 의해 상기 세포에 도입된다. 상기 핵산은 벡터 예를 들어, 재조합 발현 벡터 예를 들어, DNA 플라스미드 벡터 또는 본원에 기술된 임의의 벡터의 일부일 수 있다. 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터 또는 핵산은 본원에 기술된 바와 같이 제조 및 제형화될 수 있다. 이러한 핵산 또는 발현 벡터는 생체내 포유 동물의 세포 군집에 도입될 수 있거나, 또는 포유 동물의 선택된 세포(예를 들어, 종양 세포)는 포유 동물 및, 생체외에서 이러한 세포 군집에 암호화된 폴리펩티드의 흡수 및 발현에 충분한 양만큼 도입된 핵산 발현 벡터로부터 제거될 수 있다. 또는, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터 또는 핵산은 시험관내 배양된 세포를 사용하여 제조된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법은 세포 군집에 본원에 기술된 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 암호화된 폴리펩티드의 발현 및 벡터의 흡수가 일어날 수 있는 양만큼 제형의 형태로 도입시키는 단계; 본원에 기술된 임의의 도입/전달 방식으로 발현 벡터를 포유 동물에 투여하는 단계; 및 포유 동물 또는 포류 동물의 부산물로부터 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.

항체

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 항원성 단편)은 예를 들어, 폴리펩티드 및 이의 단편의 활성, 분배 및 발현과 관련된 진단적, 치료적 또는 예방적 용도를 갖는 항체를 생산하는데 사용된다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 항체들로서는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료용 및/또는 예방용으로서는 수용체 결합능이 결여된 항체가 특히 바람직하다.

항체 유도용 폴리펩티드는 생물 활성을 필요로 하지 않지만; 그 폴리펩티드 또는 펩티드는 항원성이어야 한다. 특이 항체를 유도하는데 사용되는 펩티드는 약 10개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 15개 또는 20개 이상의 아미노산, 또는 약 25개 또는 30개 이상의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 보유할 수 있다. 폴리펩티드의 짧은 단편은 다른 단백질 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 및 키메라 분자에 대하여 생성된 항체와 융합될 수 있다.

폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조 방법은 당 업자에게 공지되어 있으며, 다수의 항체가 시판되고 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology, John Colligan외 다수, eds., Vols. I∼IV (John Wiley & Sons, Inc., NY, 1991 and 2001 Supplement); 및 Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites외 다수(eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 여기에 인용된 참고 문헌; 및 Goding(1996) Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2nd ed.) Academic Press, New York, NY; 및 Kohler and Milstein(1975) Nature 256: 495∼497]을 참조하시오. 항체 생산에 적당한 기타 기술들로서는 파아지 또는 유사한 벡터내 재조합 항체 라이브러리의 선별법을 포함한다. 문헌[Huse외 다수 (1989) Science 246:1275∼1281; 및 Ward외 다수 (1989) Nature 341: 544∼546]을 참조하시오. 특이적 모노클로날 및 폴리클로날 항체와 항혈청은 일반적으로 K_D 약 0.1μM 이상, 바람직하게는 약 0.01μM 이상 및 가장 통상적이고 바람직하게는 0.001μM 이상으로 결합할 것이다.

키메라(인간화된) 항체의 제조 방법에 관한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,482,856 호에 개시되어 있다. 인간화 및 기타 항체 생산 및 조작 기술에 관한 부가 설명은 문헌[Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty외 다수(1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty), and Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul)]에서 찾아볼 수 있다.

하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대해 완전히 인간화된 항체를 제공한다. 인간화된 항체는 환자에 있어 특히 항체가 생체내 치료적 및/또는 예방적 용도로서 사용될 경우에 바람직하다. 인간 항체는 특징적으로 인간 면역글로불린 서열들로 이루어져 있다. 본 발명의 인간 항체는 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다[예를 들어, Larrick외 다수의 미국 특허 제5,001,065호 및 Borrebaeck McCafferty and Paul, 상동]. 하나의 측면에서, 본 발명의 인간 항체는 처음에는 트리오마 세포(trioma cell)에서 생산된다. 이 항체를 암호화하는 유전자는 이후 다른 세포 예를 들어, 인간 이외의 포유 동물 세포에서 클로닝 및 발현된다. 트리오마 기술에 의한 인간 항체의 제조에 대한 일반적인 연구에 관하여는 문헌[Ostberg외 다수(1983), Hybridoma 2: 361∼367, Ostberg, 미국 특허 제 4,634,664 호 및 Engelman외 다수, 미국 특허 제 4,634,666 호]에 기술되어 있다. 이러한 방법에 의하여 얻어진 항체 생산 세포주를 트리오마라 칭하는데, 그 이유는 3개의 세포 즉, 2개의 인간 세포 및 1개의 마우스 세포로부터 유래되었기 때문이다. 트리오마는 항체를 인간 세포로부터 제조된 보통의 하이브리도마 보다 더욱 안정적으로 생산하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 폴리펩티드에 관하여 고려되는 기타 용도는 본 발명의 명세서를 통하여 제공된다.

인터페론-알파 컨쥬게이트

다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44 중 임의의 하나의 아미노산 서열과, 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하며, 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다. 상기 컨쥬게이트는 또한 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다는 사실을 이해하게 될 것이다.

다른 측면에서, 상기 컨쥬게이트는 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 컨쥬게이트는 또한 서열 번호 1에 대한 치환부 즉, F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환부; 그리고 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하나 이상의 치환부를 포함하며, 여기서 상기 치환부는 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 [예를 들어, 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 상이한 잔기에 대한 아미노산 잔기의 치환, 또는 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 부가의 아미노산 잔기의 삽입에 의하여] 도입시킨다. 상기 컨쥬게이트는 또한 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타내는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 F48A/L 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 1에 대한 치환부 F48A를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; V51A/P; Q52P/E; A53T; F55A/S; L56V; F65A; F57L; Y58H; M61I; F68P; L111A; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 F55A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; F48A/L; V51A/P; Q52P/E; A53T; L56V; F65A; F57L; Y58H; M61I; F68P; L111A; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 F65A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; F48A/L; V51A/P; Q52P/E; A53T; F55A/S; L56V; F57L; Y58H; M61I; F68P; L111A; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 1에 관한 L111A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 1에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; F48A/L; V51A/P; Q52P/E; A53T; F55A/S; L56V; F65A; F57L; Y58H; M61I; F68P; N113K; V114E/P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 13과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 및 114번 위치의 Pro (위치 번호는 서열 번호 13에 관한 것임)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 13과 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산, 또는 0∼1개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 13에 대한 치환부(들) 즉, H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 36에 대한 치환부 즉, M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P; 및 E160DP로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환부; 그리고 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하나 이상의 치환부를 추가로 포함하며, 여기서 상기 치환부는 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 [예를 들어, 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 상이한 잔기에 대한 아미노산 잔기의 치환, 또는 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 부가의 아미노산 잔기의 삽입에 의하여] 도입시킨다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 관한 F48A/L 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 36에 대한 치환부 F48A를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, M21A; I24P; P26L; H47Q; T51V/P; S55P/F/A; V56L; H58Y; L60M; F65A; F68P; F90Y/A; M93L/P; N95D; L111A; N113K; V114E/P; F124A; R125Q; I127P; T132K; L154F; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 관한 F90A 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, M21A; I24P; P26L; H47Q; F48A/L; T51V/P; S55P/F/A; V56L; H58Y; L60M; F65A; F68P; M93L/P; N95D; L111A; N113K; V114E/P; F124A; R125Q; I127P; T132K; L154F; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 서열 번호 36에 대한 E160D 치환부를 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 36과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 36에 대한 치환부(들) 즉, M21A; I24P; P26L; H47Q; F48A/L; T51V/P; S55P/F/A; V56L; H58Y; L60M; F65A; F68P; F90Y/A; M93L/P; N95D; L111A; N113K; Vl14E/P; F124A; R125Q; I127P; T132K; 및 L154F로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 각각 (a) 서열 번호 38과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고 (b) 21번 위치의 Ala; 24번 위치의 Pro; 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 90번 위치의 Ala; 93번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro; 124번 위치의 Ala; 127번 위치의 Pro; 및 160번 위치의 Glu(위치 번호는 서열 번호 38에 관한 것임)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개 예를 들어, 1개 또는 2개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 서열 번호 38과 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 컨쥬게이트중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 상기 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 서열 번호 38에 대한 치환부(들) 즉, P26L; H47Q; V51T; F55P/S; L56V; Y58H; L60M; F90Y; M93L; N95D; N113K; V114E; R125Q; T132K; 및 F154L로 이루어진 군에서 선택된 치환부를 하나 이상 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 인터페론-알파 활성(예를 들어, 항바이러스 활성, T_H1 분화 활성 및/또는 항증식 활성)을 나타낸다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.

"컨쥬게이트"(또는 호환적으로 "폴리펩티드 컨쥬게이트" 또는 "컨쥬게이트화된 폴리펩티드"라고도 함)란 용어는, 본 발명의 폴리펩티드 중 하나 이상이 하나 이상의 비-폴리펩티드에 공유 결합하여 형성된, (구성면에서) 이종인 분자를 의미한다. "공유 결합"이란 용어는 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분이 서로 직접 공유 결합되었거나, 또는 개입부(들)(intervening moiety) 예를 들어, 브리지, 스페이서 또는 연결부(들)를 통하여 상호 간접적으로 공유 결합된 경우를 의미한다. 바람직하게, 컨쥬게이트화된 폴리펩티드는 관련 농도 및 조건에서 가용성인데 즉, 혈액과 같은 생리 유체 내에서 가용성이다. 본 발명의 컨쥬게이트화된 폴리펩티드의 예로서는 글리코실화 및/또는 PEG화 폴리펩티드를 포함한다. "비 컨쥬게이트화된(non-conjugated) 폴리펩티드"란 용어는 컨쥬게이트화된 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분을 의미하는 것으로 사용된다.

"비-폴리펩티드 부분(non-polypeptide moiety)"이란 용어는, 폴리펩티드의 결합기에 컨쥬게이트화될 수 있는 분자를 의미한다. 비-폴리펩티드 부분의 바람직한 예로서는 중합체 분자, 당 부분, 지방 친화성 화합물 또는 유기성 유도체화 제제 특히, 중합체 분자 또는 당 부분을 포함한다. 비-폴리펩티드 부분은 폴리펩티드의 결합기를 통하여 폴리펩티드에 연결된다는 사실을 이해할 것이다. 폴리펩티드에 결합된 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 중합체 분자(들)의 수가 명시되는 경우를 제외하고, 폴리펩티드에 결합된 "비-폴리펩티드 부분"에 관한 모든 용어 또는 본 발명에 사용된 용어는 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 참고로 할 것이다.

"중합체 분자"란 용어는 2 이상의 단량체가 공유 결합하여 생성된 분자를 의미하는 것으로서, 여기서 상기 단량체는 아미노산 잔기가 아니다. "중합체"란 용어는 "중합체 분자"와 호환적으로 사용될 수 있다.

"당 부분"이란 용어는 생체내 또는 시험관내 글리코실화 예를 들어, N-글리코실화 또는 O-당화에 의해 결합된 탄수화물 분자를 의미한다.

"N-글리코실화 부위"는 N-X-S/T/C 서열을 갖는데, 여기서 X는 프롤린을 제외한 아미노산 잔기이고, N은 아스파라긴이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌이며, 가장 바람직하게는 트레오닌이다.

"O-글리코실화 부위"는 세린 또는 트레오닌 잔기의 OH-기를 포함한다.

"결합기"란 용어는, 관련 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 중합체 분자 또는 당 부분에 커플링할 수 있는 아미노산 잔기를 의미한다. 유용한 결합기 및 몇몇 해당 비-폴리펩티드 부분의 비제한적 예를 이하 표 4에 나타내었다.

해당 비-폴리펩티드 부분의 유용한 결합기 및 예
결합기	아미노산	비-폴리펩티드 부분의 예	컨쥬게이트화 방법/ 활성화 PEG의 예	참고 문헌
-NH2	N-말단, Lys	중합체 예를 들어, PEG	mPEG-SPA mPEG2-NHS mPEG2-부티릴 ALD	Nektar Inc.2003 Catalog
-COOH	C-말단, Asp, Glu	중합체 예를 들어, PEG, 당 부분	mPEG-Hz 시험관내 커플링	Nektar Inc.2003 Catalog
-SH	Cys	중합체 예를 들어, PEG, 당 부분	mPEG-VS mPEG2-MAL 시험관내 커플링	Nektar Inc.2003 Catalog; Delgado외 다수, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4):249∼304 (1992)
-OH	Ser, Thr, OH-	당 부분	생체내 O-결합 당화
-CONH2	N-글리코실화 부위의 일부로서의 Asn	당 부분	생체내 N-결합 당화
방향성 잔기	Phe, Tyr, Trp	당 부분	생체내 커플링
-CONH2	Gln	당 부분	시험관내 커플링	Yan 및 Wold, Biochemistry, 1984, Jul 31; 23(16):3759∼65
알데히드 케톤	산화 탄수화물	중합체 예를 들어, PEG, PEG-히드라지드	PEG화	Andresz외 다수, 1978, Makromol. Chem 179:301; WO 92/16555, WO 00/23114
구아니디노	Arg	당 부분	시험관내 커플링	Lundblad 및 Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI
이미다졸 고리	His	당 부분	시험관내 커플링	구아니딘에 관함

생체내 N-글리코실화에 있어서, "결합기"란 용어는 N-글리코실화 부위[N-X-S/T/C 서열의 경우, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, N은 아스파라긴이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌이며, 가장 바람직하게는 트레오닌임]를 구성하는 아미노산 잔기를 나타내는 특별한 경우에 사용된다. N-글리코실화 부위의 아스파라긴 잔기는 글리코실화시 당 부분이 결합되는 부위이지만, 이러한 결합은 N-글리코실화 부위의 기타 아미노산 잔기가 존재하지 않는다면 이루어질 수 없다. 따라서, 비-폴리펩티드 부분이 당 부분이고 컨쥬게이트화가 N-글리코실화에 의해 이루어질 때, 본 발명의 폴리펩티드 아미노산 서열의 변경과 관련하여 사용되는 "비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기"란 용어는, N-글리코실화 부위를 구성하는 아미노산 잔기중 하나, 둘 또는 이들 모두가, 기능성 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열에 도입되어 상기 서열로부터 제거되거나, 또는 기능성 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열내에 보유[예를 들어, N-글리코실화 부위의 일부를 구성하는 기존의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로 치환하거나 또는 그 반대로 치환함으로써 보유]되는 방식으로 변형된 것으로 이해된다.

"도입한다"(즉, "도입된" 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 "도입")라는 용어는 주로 기존의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기와 치환시키는 것을 의미하나, 부가의 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 의미할 수도 있다.

"제거한다"(즉, "제거된" 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 "제거")라는 용어는 주로 제거될 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기와 치환하는 것을 의미하나, 제거될 아미노산 잔기를 (치환하지 않고) 결실시키는 것을 의미할 수도 있다.

"비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기"란 용어는, (도입된 아미노산 잔기의 경우) 비-폴리펩티드 부분이 결합하는 아미노산 잔기 또는 (제거된 아미노산 잔기의 경우) 이미 결합된 아미노산 잔기를 나타내는 것이다.

"기능적 생체내 반감기(functional in vivo half-life)"란 용어는, 통상적인 의미로 사용되는 것으로서, 폴리펩티드 생물 활성의 50%가 체내/표적 기관에 존재하는 시간, 또는 폴리펩티드 활성이 처음의 50%가 되는 시간을 의미하는 것이다. 기능적 생체내 반감기는 실험 동물 예를 들어, 래트, 마우스, 토끼, 개 또는 원숭이에서 측정될 수 있다. 바람직하게, 기능적 생체내 반감기는 인간을 제외한 유인원 예를 들어, 원숭이에서 측정된다. 뿐만 아니라, 기능적 생체내 반감기는 정맥내 또는 피하 투여된 시료에 대하여 측정될 수 있다.

기능적 생체내 반감기를 측정하는 대안으로서, "혈청 반감기"를 측정할 수 있는데, 이는 혈장 또는 혈류내 순환 폴리펩티드의 50%가 제거되기 이전의 시간을 의미한다. 혈청 반감기의 측정은 종종 기능적 생체내 반감기를 측정하는 것보다 간단하며, 혈청 반감기의 크기는 일반적으로 기능적 생체내 반감기 크기에 대한 좋은 지표가 된다. 대안적으로 혈청 반감기란 용어는, "혈장 반감기", "혈류 반감기", "혈청 소멸률", "혈장 소멸률" 및 "소멸 반감기"를 포함한다. 상기 혈청 반감기는 기능적 생체내 반감기 측정법과 관련하여 전술한 바와 같이 측정될 수 있다.

"혈청"이란 용어는, 통상적인 의미로 사용되는 것으로서, 피브리노겐 및 기타 응혈 인자를 제외한 혈장을 의미한다.

생체내 반감기 또는 혈청 반감기에 대하여 사용된 "증가된"이란 용어는, 본 발명의 컨쥬게이트 관련 반감기가 참고 분자 예를 들어, 야생형 인터페론-알파 예를 들어, 인간 인터페론-알파 예를 들어, 서열 번호 45∼서열 번호 56 중 어느 하나(또는 본원 및/또는 문헌[Allen G. and Diaz M. O. (1996), 상동]에 기술된 기타 huIFN-알파 서열), 또는 상응하는 비 컨쥬게이트 폴리펩티드의 반감기에 비하여 통계학적으로 상당히 증가한 경우를 의미하는 것이다. 그러므로, 본 발명의 목적 컨쥬게이트는 기능적 생체내 반감기 또는 혈청 반감기가 전술한 참고 분자에 비하여 증가된 컨쥬게이트를 포함한다.

"AUC_SC" 또는 "피하 투여시 곡선의 밑면적"이란 용어는 통상적인 의미로 사용되는 것으로서, 즉, 혈청중 인터페론-알파-활성 대 시간 곡선에서의 아래 면적을 의미하며, 여기서 컨쥬게이트화된 분자는 실험 동물에 피하 투여된다. 일단 실험 인터페론-알파 활성 시점이 측정되면, AUC_SC는 컴퓨터 프로그램 예를 들어, GraphPad Prism 3.01에 의해 편리하게 계산될 수 있다.

상기 AUC_SC에 대하여 사용된 "증가된"이란 용어는, 피하 투여시 본 발명의 컨쥬게이트에 대한 곡선의 밑면적이 상당하는 조건하에서 측정되었을 때 참고 분자 예를 들어, 야생형 인터페론-알파 예를 들어, 인간 인터페론-알파 예를 들어, 서열 번호 45∼서열 번호 56 중 어느 하나(또는 본원 및/또는 문헌[Allen G. and Diaz M. O. (1996), 상동]에 기술된 기타 huIFN-알파 서열), 또는 상응하는 비 컨쥬게이트 폴리펩티드의 반감기에 비하여 통계학적으로 상당히 증가한 경우를 의미하는 것이다. 분명한 점은, 본 발명의 컨쥬게이트 및 참고 분자에 대하여 동일한 정도의 인터페론-알파 활성이 나타나야 한다는 점이다. 결과적으로, 상이한 인터페론-알파 분자들 사이의 직접적 비교를 위하여, 상기 AUC_SC 값은 통상적으로 표준화 즉, AUC_SC/투여량으로 표시되어야 한다.

"T_{max , sc}"란 용어는, 혈청 중 인터페론-알파 활성이 가장 높게 관찰될 경우, 혈청중 인터페론-알파 활성 대 시간 곡선에서의 시점에 대해 사용된다.

근원 폴리펩티드에 대한 구체예 및 변형예들은 일반적으로 본원에 서열 번호 1에 관하여 제공되는 반면에, 개시된 변형예는 또한 전술한 본 발명의 기타 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 2∼35, 서열 번호 37∼44 및 이들의 변형체)중 임의의 것의 동등한 아미노산 위치에서 생성될 수도 있다는 것을 이해할 것이다.

비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기를 제거 및/또는 도입함으로써, 선택한 비-폴리펩티드 부분에 대한 분자의 컨쥬게이트화를 더욱 촉진시키고, 컨쥬게이트화 패턴을 최적화(예를 들어, 인터페론-알파 분자 표면상에 비-폴리펩티드 부분을 최적으로 분포시키고, 이로써 그의 기능을 거의 손상시키지 않고 에피토프 및 기타 폴리펩티드 표면부를 효과적으로 차단)하기 위해 이 폴리펩티드를 특이적으로 순응시킬 수 있다. 예를 들어, 결합기를 도입함으로써, 인터페론-알파 폴리펩티드는 관련 비-폴리펩티드 부분이 결합하는 특이적 아미노산 잔기 중에서 변형되는데, 이로써 컨쥬게이트화가 보다 효율적이고, 특이적이며/특이적이거나 과도하게 행하여 진다. 하나 이상의 결합기를 제거함으로써, 폴리펩티드 일부중 비-폴리펩티드 부분으로의 컨쥬게이트화 즉, 상기 폴리펩티드의 기능성 부위에 위치하거나 또는 이에 근접한 아미노산 잔기에 불리한 컨쥬게이트화를 피할 수 있다[이러한 부위에서의 컨쥬게이트화는 수용체 인지능의 손상으로 인하여 생성되는 컨쥬게이트의 인터페론-알파 활성을 불활성화시키거나 또는 감소시킬 수 있기 때문임]. 뿐만 아니라, 다른 결합기에 인접하여 위치하는 결합기를 제거하는 것이 유리할 수도 있다.

비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기는, 그것이 제거되거나 또는 도입될 경우, 비-폴리펩티드 부분의 특성을 기초로 하여 선택되며, 몇몇 경우에 있어서는 사용된 컨쥬게이트화 방법을 기초로 하여 선택되기도 한다.예를 들어, 비-폴리펩티드 부분이 중합체 분자 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 산화폴리알킬렌 유래 분자일 때, 결합기로서 작용할 수 있는 아미노산 잔기는 시스테인, 리신(및/또는 폴리펩티드의 N-말단 아미노기), 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 비-폴리펩티드 부분이 당 부분일 때, 상기 결합기는 생체내 또는 시험관내 N-글리코실화 부위 또는 O-글리코실화 부위 바람직하게는 N-글리코실화 부위이다.

몇몇 경우에 있어서, 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기가 인터페론-알파 폴리펩티드로 도입되거나 또는 이로부터 제거될 때, 변형될 인터페론-알파 폴리펩티드의 위치는 편리하게는 다음과 같이 선택될 수 있다.

변형될 위치 예를 들어, 측쇄의 25% 이상 예를 들어, 측쇄의 50% 이상이 용매에 노출된 아미노산 잔기에 의해 점유된 위치는 인터페론-알파 폴리펩티드의 표면에 위치할 수 있다. 이러한 위치는 본원의 "재료 및 방법" 부분에 기술된 바와 같이 인간 인터페론-알파 2a 분자의 3D 구조의 분석 결과를 기초로 하여 동정된다.

결합기의 최적 분포를 측정하기 위하여, 인터페론-알파 분자의 표면에 위치하는 아미노산 잔기들 사이의 거리는 인터페론-알파 폴리펩티드의 3D 구조를 기초로 하여 계산하였다. 더욱 구체적으로, 이러한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기의 CB 사이의 거리, 또는 결합기를 포함하는 다른 아미노산 잔기의 CB와 아미노산 잔기의 작용기(리신은 NZ, 아스파르트산은 CG, 글루탐산은 CD 및 시스테인은 SG) 사이의 거리를 측정하였다. 글리신의 경우, CA는 CB를 대신하여 사용되었다. 본 발명의 컨쥬게이트의 인터페론-알파 폴리펩티드 부분에 있어서, 상기 거리들 중 임의의 거리는, 이종 컨쥬게이트화를 방지 또는 감소시키기 위하여, 그리고 결합기를 예를 들어, 에피토프가 차단되도록 균일하게 분포시키기 위하여 8 Å 이상 예를 들어, 10 Å 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 컨쥬게이트의 인터페론-알파 폴리펩티드 부분에 있어서 인터페론-알파의 수용체 결합 부위에 위치하거나 또는 여기에 근접하여 위치하는 몇몇 결합기는 예를 들어, 그러한 기를 포함하는 아미노산 잔기의 치환에 의하여 제거된다. 몇몇 경우에 있어서, 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하는 아미노산 잔기 예를 들어, 시스테인 또는 리신은 종종 인터페론 알파 분자의 수용체 결합 위치 또는 이에 근접한 위치에 도입된다.

인터페론-알파 폴리펩티드를 변형시키는 다른 방법으로서는, 비-폴리펩티드 부분에 컨쥬게이트화시켜, 근원 인터페론-알파에 존재하는 에피토프를 차단함으로써, 이를 변형, 파괴 또는 불활성화시키는 방법이 있다. 인터페론-알파 폴리펩티드의 에피토프는 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 사용하여 동정될 수 있다. 문헌[Romagnoli외 다수 , J. Biol Chem., 1999, 380 (5):553∼9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11∼20, Van de Water외 다수, Clin Immunol Immunopathol, 1997,85(3):229∼35, SainT-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77∼81 및 Lane DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268∼71]을 참고하시오. 한가지 방법은 예를 들어, 9 개의 아미노산 잔기로 이루어진 랜덤한 올리고펩티드를 발현시키는 파아지 디스플레이 라이브러리를 확립하는 것이다. 인간 인터페론-알파에 대해 특이적인 항혈청으로부터 얻은 IgG1 항체는 면역침전법에 의해 정제되며, 반응성 파아지는 면역블럿팅에 의해 동정된다. 정제된 반응성 파아지의 DNA를 서열 결정함으로써, 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 인터페론-알파의 3D구조상 서열의 위치 결정으로 결정될 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 미국 특허 제 5,041,376 호에 기술된 방법에 따라서 동정될 수 있다. 이로써 동정된 구조상 영역은 이후 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기의 도입을 위한 표적 영역으로서 선택될 수 있는 에피토프를 이룬다. 바람직하게, 인터페론-알파의 하나 이상 예를 들어, 2개, 3개 또는 4개의 에피토프는 본 발명에 따른 비-폴리펩티드 부분에 의해 차단된다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 야생형 인간 인터페론-알파 예를 들어, 시판중인 임의의 인터페론-알파에 비하여 하나 이상의 차단된 에피토프를 갖는다. 이는 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 소정의 에피토프 근방(즉, 1차 서열의 4개 아미노산 잔기 이내, 또는 3차 서열의 약 10 Å 이내)에 도입함으로써 이루어질 수 있다. 상기 10 Å의 거리는 CB(글리신의 경우에는 CA) 사이에서 측정된다. 이러한 특이적 도입에 관하여는 이하 섹션에 기술되어 있다.

결합기를 제거하는 경우, 이러한 기를 포함하고 상기 정의된 위치를 점유하는 관련 아미노산 잔기는, 의문의 비-폴리펩티드 부분에 대한 결합기를 포함하지 않는 상이한 아미노산 잔기와 치환될 수 있거나, 또는 결실될 수 있다. N-글리코실화기의 제거는 또한 모티브 N-X-S/T/C내에 아미노산 잔기를 삽입하거나 또는 제거함으로써 이루어질 수 있다.

결합기를 도입하는 경우, 이러한 기를 포함하는 아미노산 잔기는 예를 들어, 이 위치를 점유하고 있는 아미노산 잔기를 치환함으로써 상기 위치에 도입된다.

컨쥬게이트화에 유용하며 인터페론-알파 폴리펩티드에 존재하는 결합기의 정확한 수는 컨쥬게이트화에 의하여 얻어지는 효과에 따라서 달라진다. 얻어지는 효과는 예를 들어, 컨쥬게이트화의 특성 및 정도에 따라서 달라진다[예를 들어, 비-폴리펩티드 부분이 컨쥬게이트화되어야 하거나 또는 컨쥬게이트화가 일어나지 않아야 하는 경우, 비-폴리펩티드 부분의 동정, 폴리펩티드에 바람직하거나 또는 컨쥬게이트화될 수 있는 비-폴리펩티드 부분의 수]. 예를 들어, 면역원성이 감소되는 것이 바람직할 경우, 결합기의 수(및 위치)는 대부분 또는 모든 에피토프를 차단하는데 충분하여야 한다. 이는 보통 인터페론-알파 폴리펩티드가 차단되는 비율이 보다 클 때 얻어진다. 에피토프의 효과적인 치단은 보통 컨쥬게이트화에 유용한 결합기의 총 수가 1∼6개 예를 들어, 1∼5개 예를 들어, 1∼3개 예를 들어 1개, 2개 또는 3개일 때에 이루어진다.

기능적 생체내 반감기는 컨쥬게이트의 분자량에 따라서 달라지므로, 반감기가 증가하는데 필요한 결합기의 수는 의문 비-폴리펩티드 부분의 분자량에 따라서 달라진다. 이러한 컨쥬게이트들 중 일부는 1∼6개 예를 들어, 1∼5개 예를 들어, 1∼3개 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 비-폴리펩티드 부분을 포함하며, 이들의 분자량은 각각 약 2∼40 kDa 예를 들어, 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 12 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa 또는 약 40 kDa이다.

본 발명의 컨쥬게이트화에 있어서, 컨쥬게이트화될 수 있는 결합기중 일부, 대부분 또는 거의 모두는 관련 비-폴리펩티드 부분에 의하여 점유되어 있다.

본 발명의 컨쥬게이트는 다음과 같은 개선된 특성들중 하나 이상을 나타낼 수 있다:

예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트는 인간 인터페론-알파[예를 들어, 서열 번호 45∼57에 정의된 폴리펩티드 중 임의의 것, 또는 본원에 기술된 기타 huIFN-알파중 임의의 것 및/또는 문헌(Allen G. and Diaz M.O. (1996), 상동)에 기술된 것], 또는 상응하는 비 컨쥬게이트화된 폴리펩티드에 비하여 감소된 예를 들어, 비 컨쥬게이트화된 폴리펩티드 또는 인간 인터페론-알파에 비하여 10% 이상 예를 들어, 25% 이상 예를 들어, 50% 이상 예를 들어, 75% 이상 감소된 면역원성을 나타낼 수 있다.

다른 측면에서, 컨쥬게이트는 인간 인터페론-알파(예를 들어, 본원에 정의된 서열 번호 45∼57의 폴리펩티드 또는 본원 및/또는 문헌(Allen G. and Diaz M.O. (1996), 상동)에 기술된 임의의 기타 huIFN-알파)로 처치된 환자로부터 얻은 중화 항체와의 반응성이 감소되거나 또는 이와 반응을 하지 않을 수 있거나, 또는 이의 중화율이 해당 비 컨쥬게이트화된 폴리펩티드에 비하여 10% 이상 예를 들어, 25% 이상 예를 들어, 50% 이상 예를 들어, 75% 이상 감소할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 컨쥬게이트는 참고 분자 예를 들어, 인간 인터페론-알파[예를 들어, 본원에 서열 번호 45∼57로서 정의된 폴리펩티드 중 임의의 것 또는 본원 및/또는 문헌(Allen G. and Diaz M.O. (1996), 상동)에 기술된 임의의 기타 huIFN-알파], 또는 상응하는 비 컨쥬게이트화된 폴리펩티드에 비하여 그의 기능적 생체내 반감기 및/또는 혈청 반감기가 증가할 수 있다. 특히 바람직한 컨쥬게이트는 상기 컨쥬게이트의 기능적 생체내 반감기(또는 혈청 반감기)와 상기 참고 분자의 기능적 생체내 반감기(또는 혈청 반감기) 사이의 비율이, 1.25 이상 예를 들어, 1.50 이상 예를 들어, 1.75 이상 예를 들어, 2 이상 예를 들어, 3 이상 예를 들어, 4 이상 예를 들어, 5 이상 예를 들어, 6 이상 예를 들어, 7 이상 예를 들어, 8 이상인 컨쥬게이트이다. 전술한 바와 같이, 반감기는 실험 동물 예를 들어, 래트 또는 원숭이에서 편리하게 측정되며, 이는 정맥내 투여 또는 피하 투여하여 측정된다.

추가의 측면에서, 컨쥬게이트는 생체 적합성이 참고 분자 예를 들어, 인간 인터페론-알파[예를 들어, 본원에 서열 번호 45∼57로서 정의된 폴리펩티드 중 임의의 것 또는, 본원 및/또는 문헌(Allen G. and Diaz M.O. (1996), 상동)에 기술된 임의의 기타 huIFN-알파] 또는 해당 비 컨쥬게이트화된 폴리펩티드에 비하여 증가될 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 AUC_SC가 참고 분자 예를 들어, 인간 인터페론-알파 또는 상응하는 비 컨쥬게이트화 폴리펩티드에 비하여 증가될 수 있다. 그러므로, 대표적인 컨쥬게이트는 상기 컨쥬게이트의 AUC_SC와 상기 참고 분자의 AUC_SC 사이의 비율이, 피하 투여될 때 특히, 실험 동물 예를 들어 래트 또는 원숭이에 피하 투여될 때, 1.25 이상 예를 들어, 1.50 이상 예를 들어, 2 이상 예를 들어, 3 이상 예를 들어, 4 이상 예를 들어, 5 이상 예를 들어, 6 이상 예를 들어, 7 이상 예를 들어, 8 이상 예를 들어, 9 이상 또는 10 이상 예를 들어, 12 이상 예를 들어, 14 이상 예를 들어, 16 이상 예를 들어, 18 이상 또는 20 이상인 컨쥬게이트이다. 이와 유사하게, 본 발명의 컨쥬게이트 중 일부는, 피하 투여될 때 특히, 실험 동물 예를 들어 래트 또는 원숭이에 피하 투여될 때, 상기 컨쥬게이트에 대한 T_max와 상기 참고 분자 예를 들어, 인간 인터페론-알파 또는 해당 비 컨쥬게이트화 폴리펩티드에 대한 T_max 사이의 비율이 1.2 이상 예를 들어, 1.4 이상 예를 들어, 1.6 이상 예를 들어, 1.8 이상 예를 들어, 2 이상 예를 들어, 2.5 이상 예를 들어, 3 이상 예를 들어, 4 이상 예를 들어, 5 이상 예를 들어, 6 이상 예를 들어, 7 이상 예를 들어, 8 이상 예를 들어, 9 이상 예를 들어, 10 이상인 컨쥬게이트이다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트의 항바이러스 활성의 크기는, 인간 인터페론-알파[예를 들어, 본원에 서열 번호 45∼57로서 정의된 폴리펩티드 중 임의의 것 또는, 본원 및/또는 문헌(Allen G. and Diaz M.O. (1996), 상동)에 기술된 임의의 기타 huIFN-알파] 또는 해당 비 컨쥬게이트화 폴리펩티드의 활성 크기에 비하여, 감소(예를 들어, 약 75% 이상, 약 50% 이상, 약 25% 이상, 약 10% 이상까지) 또는 증가(약 10% 까지)될 수 있거나, 또는 거의 동일(예를 들어, 약 +/- 10% 또는 약 +/- 5%)할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트의 항증식 활성에 비하여 항바이러스 활성의 정도는 다양할 수 있는데 즉, 인간 인터페론-알파의 경우보다 높거나, 낮거나 또는 거의 동일하거나, 또는 상응하는 비 컨쥬게이트화된 폴리펩티드의 경우보다 높거나, 낮거나 또는 거의 동일할 수 있다.

비-폴리펩티드 부분이 리신 잔기 또는 N-말단 아민에 결합하는 본 발명의 컨쥬게이트

하나의 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내며, 하나 이상의 리신 잔기 및/또는 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44로부터 선택된 서열을 포함하는 인터페론-알파 폴리펩티드의 N-말단 아미노기에 컨쥬게이트화된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다. 이들 컨쥬게이트 중 일부는 K31, K50, K71, K84, K122, K134, K135 및 K165로 부터 선택된 리신 잔기; 예를 들어, K31, K122, K135 및 K165로 부터 선택된 리신 잔기에 결합된 비-폴리펩티드 부분을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 K31, K122 및 K135로부터 선택된 리신 잔기에 결합되어 있는 비-폴리펩티드 부분을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 K122 및 K135로부터 선택된 리신 잔기에 결합되어 있는 비-폴리펩티드 부분을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 K31 및 K122; 또는 K31 및 K135로부터 선택된 리신 잔기에 결합된 비-폴리펩티드 부분을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고, 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기에 컨쥬게이트화되어 있는 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 여기서 상기 인터페론-알파 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산[예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산]이 상이하고 (b) F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 포함하는 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이 관점에 따른 일부 컨쥬게이트는 하나 이상의 분리된 리신 잔기 및/또는 하나 이상의 분리된 히스티딘 잔기 및/또는 하나 이상의 도입된 리신 잔기를 포함한다.

본 발명은 또한 인터페론-알파 활성을 나타내고, 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기에 컨쥬게이트화되어 있는 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 제공하는 것으로서, 여기서 상기 인터페론-알파 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 13과 0∼16개 위치의 아미노산[예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산]이 상이하고 (b) 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 및 114번 위치의 Pro(위치 번호는 서열 번호 13에 관함)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 13에 대한 하나 이상의 치환부(들)를 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이 관점에 따른 몇몇 컨쥬게이트는 하나 이상의 분리된 리신 잔기 및/또는 하나 이상의 분리된 히스티딘 잔기 및/또는 하나 이상의 도입된 리신 잔기를 포함한다.

다른 관점에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고, 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기에 컨쥬게이트화되어 있는 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 여기서 상기 인터페론-알파 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산[예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산]이 상이하고 (b) M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 36에 대한 하나 이상의 치환부를 포함하는 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이 관점에 따른 일부 컨쥬게이트는 하나 이상의 분리된 리신 잔기 및/또는 하나 이상의 분리된 히스티딘 잔기 및/또는 하나 이상의 도입된 리신 잔기를 포함한다.

본 발명은 또한 인터페론-알파 활성을 나타내고, 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기에 컨쥬게이트화되어 있는 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 여기서 상기 인터페론-알파 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 38과 0∼16개 위치의 아미노산[예를 들어, 0∼15개 위치의 아미노산, 0∼14개 위치의 아미노산, 0∼13개 위치의 아미노산, 0∼12개 위치의 아미노산, 0∼11개 위치의 아미노산, 0∼10개 위치의 아미노산, 0∼9개 위치의 아미노산, 0∼8개 위치의 아미노산, 0∼7개 위치의 아미노산, 0∼6개 위치의 아미노산, 0∼5개 위치의 아미노산, 0∼4개 위치의 아미노산, 0∼3개 위치의 아미노산, 0∼2개 위치의 아미노산 또는 0∼1개 위치의 아미노산]이 상이하고 (b) 21번 위치의 Ala; 24번 위치의 Pro; 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 90번 위치의 Ala; 93번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro; 124번 위치의 Ala; 127번 위치의 Pro; 및 160번 위치의 Glu(위치 번호는 서열 번호 13에 관함)중 하나 이상을 포함하는 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 48번 위치에 Ala을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 P26L; H47Q; V51T; F55P/S; L56V; Y58H; L60M; F90Y; M93L; N95D; N113K; V114E; R125Q; T132K; 및 F154L로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 38에 대한 하나 이상의 치환부(들)를 추가로 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이 관점에 따른 몇몇 컨쥬게이트는 하나 이상의 분리된 리신 잔기 및/또는 하나 이상의 분리된 히스티딘 잔기 및/또는 하나 이상의 도입된 리신 잔기를 포함한다.

본 발명의 컨쥬게이트 중 일부는 상이한 아미노산 잔기에 대한 아미노산 잔기의 치환부, 또는 아미노산 잔기의 결실부를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 이로써 하나 이상의 리신 예를 들어, 하나 이상의 K31, K50, K71, K84, K122, K133, K134, K135 및/또는 K165를 본 발명의 폴리펩티드 예를 들어, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44중 하나로부터 제거한다. 제거될 하나 이상의 리신 잔기(들)는 임의의 기타 아미노산 예를 들어, Arg(R) 또는 Gln(Q)과 치환될 수 있거나, 또는 결실될 수 있다.

아민 반응성 컨쥬게이트화 제제가 사용될 경우, 히스티딘 잔기에 대한 컨쥬게이트화 가능성을 방지하거나 또는 최소화시키는 것이 유리할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일부 컨쥬게이트는 하나 이상의 히스티딘 예를 들어, H7, H11, H34 및/또는 H47(서열 번호 1에 관함)를 본 발명의 임의의 폴리펩티드 서열 예를 들어, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44중 어느 하나로부터 제거하는 결실 또는 치환이 일어난 폴리펩티드 서열을 포함한다. 제거될 하나 이상의 히스티딘 잔기(들)는 임의의 기타 아미노산으로 치환될 수 있으며, Arg(R) 또는 Gln(Q)으로 치환될 수 있거나, 또는 결실될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 치환부 H34Q; H47Q; 또는 H34Q+H47Q를 포함한다.

대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 일부 컨쥬게이트들은, 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기 예를 들어, 그 측쇄의 25% 이상, 예를 들어 50% 이상이 표면에 노출된 아미노산 잔기에 의해 리신이 근원 서열(예를 들어, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44중 어느 하나) 내부 위치로 도입되는 변형이 일어난 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 컨쥬게이트 중 일부는 다음과 같은 서열 번호 1에 대한 치환부 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 치환부로 인하여 25% 이상의 미분 ASA를 보유하는 분자 표면에 노출된 것으로 예측되는 위치에 리신 잔기가 도입되고, 이러한 아미노산 잔기 위치는 서열 번호 1에 관한 것이다 : D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, G10K, R12K, R13K, M16K, A19K, Q20K, R22K, R23K, I24K, S25K, L26K, F27K, S28K, L30K, R33K, H34K, D35K, R37K, Q40K, E41K, E42K, D44K, N46K, H47K, Q49K, V51K, Q52K, E59K, Q62K, Q63K, N66K, S69K, T70K, D72K, S74K, A75K, D78K, E79K, T80K, L81K, E83K, I87K, F90K, Q91K, N94K, D95K, E97K, A98K, V100K, M101K, Q102K, E103K, V104K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, M112K, N113K, V114K, D115K, L118K, R121K, Q125K, R126K, T128K, L129K, T132K, E133K, Y136K, S137K, P138K, A146K, M149K, R150K, S153K, F154K, N157K, Q159K, E160K, S161K, L162K, R163K, S164K 및 E166K.

본 발명의 컨쥬게이트 중 일부는 다음과 같은 서열 번호 1에 대한 치환부를 하나 이상 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 50% 이상의 미분 ASA를 보유하는 분자 표면에 노출된 것으로 예측되는 위치에 리신 잔기가 도입되고, 이러한 아미노산 잔기 위치는 서열 번호 1에 관련된 것이다 : 즉, D2K, L3K, P4K, Q5K, T6K, H7K, S8K, L9K, R12K, R13K, M16K, A19K, S25K, F27K, S28K, R33K, H34K, D35K, R37K, E41K, D44K, N46K, H47K, Q49K, N66K, A75K, D78K, E79K, T80K, E83K, I87K, F90K, Q91K, N94K, D95K, M101K, Q102K, E103K, G105K, E107K, E108K, T109K, P110K, L111K, V114K, D115K, L118K, R121K, Q125K, R126K, L129K, T132K, E133K, P138K, R150K, E160K, L162K, R163K, S164K 및 E166K.

일반적으로 서열 번호 1(또는 기타 몇몇 특정 서열)과 관련하여 근원 폴리펩티드에 대한 변형예가 본원에 제공되어 있지만, 개시된 변형은 또한 본원에 기술되어 있는 본 발명의 기타 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44 및 이의 변형체)의 동등한 아미노산 위치에 가하여질 수도 있다는 사실을 이해하여야 한다. 그러므로, 하나의 예로서, 서열 번호 1에 대한 치환부 H47K는 서열 번호 37내 Q47K와 상응하는 것으로 이해된다.

본 발명의 이러한 측면에 대하여 고려되는 비-폴리펩티드 부분은 중합체 분자 예를 들어, "중합체 분자에의 컨쥬게이트화" 섹션에 언급된 임의의 분자 예를 들어, PEG, mPEG 또는 mPEG2를 포함한다. 상기 리신 함유 폴리펩티드 및 중합체 분자 사이의 컨쥬게이트화는, 예를 들어, 1 단계 방법 또는 상기 섹션에 언급된 단계적 방식과 같은 임의의 적당한 방식 예를 들어, "중합체 분자에의 컨쥬게이트화" 섹션에 기술된 바와 같이 이루어질 수 있다. 인터페론-알파 폴리펩티드를 PEG화하는 대표적 방법은 예를 들어, 본원의 실시예 5에 기술된 바와 같이 리신 반응성 PEG를 사용하여 리신에 PEG를 공유적으로 결합시키는 것이다. 매우 특이적인 다수의 리신 반응성 PEG(예를 들어, 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 숙신이미딜 부타노에이트(SBA), N-히드록실숙신이미드(NHS)및 알데히드(예를 들어, 부티르 ALD) 및 상이한 크기(예를 들어, 2∼40 kDa 예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa)의 선형 또는 분지형 PEG가 시판중에 있다[Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, USA; 또는 SunBio, Anyang City, South Korea].

다른 측면에서, 본 발명은 컨쥬게이트 군집을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 상기 군집의 컨쥬게이트 대다수는 각각 폴리펩티드의 N-말단 아미노기 또는 단일 리신 잔기에 공유적으로 결합되어 있는 단일의 비-폴리펩티드 부분(예를 들어, 단일 중합체 분자 예를 들어, 단일 PEG 예를 들어, 선형 PEG 또는 분지형 PEG)을 함유한다. 예를 들어, "모노 컨쥬게이트화된(monoconjugated)" (예를 들어, "모노 PEG화된") 본 발명의 조성물은 상기 컨쥬게이트의 하나 이상의 "위치 이성체"를 포함하며, 여기서 상기 각 위치 이성체는 폴리펩티드의 단일 리신 잔기에 공유적으로 결합되어 있는 단일의 비-폴리펩티드 부분(예를 들어, 단일 PEG 분자)를 함유한다.

본 발명은 컨쥬게이트 군집을 포함하는 모노 PEG화된 조성물을 포함하는데, 여기서 상기 군집의 컨쥬게이트 대다수는 각각 본 발명의 폴리펩티드의 단일 리신 잔기에 공유적으로 결합되어 있는 단일 PEG 분자(예를 들어, 선형 또는 분지형 PEG 예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 또는 40 kDa mPEG 또는 mPEG2 분자)를 함유하는 위치 이성체이다.

이러한 위치 이성체중 일부는 K31, K50, K71, K84, K122, K134, K135 및 K165로부터 선택된 리신 잔기에 공유적으로 결합되어 있는 단일 PEG 분자를 함유한다. 이러한 위치 이성체중 일부는 K31, K122, K135 및 K165로부터 선택된 리신 잔기에 공유적으로 결합된 단일의 PEG 분자를 함유한다. 이러한 위치 이성체중 일부는 K31, K122 및 K135로부터 선택된 리신 잔기에 공유적으로 결합되어 있는 단일의 PEG 분자 예를 들어, K31 및 K122; K31 및 K135; 또는 K122 및 K135로부터 선택된 리신 잔기에 공유 결합된 단일의 PEG 분자를 함유한다.

본원의 실시예 5는 본 발명의 모노 PEG화된 조성물의 제조 방법을 기술하고 있다. 실시예 5의 방법에 따라서 40 kDa의 분지화된 PEG(mPEG2-NHS)와 반응하는 본 발명의 폴리펩티드(본원에서는 14 epi18(서열 번호 13)이라 표시함)의 모노 PEG화 조성물은 주요한 2가지 위치 이성체를 함유하는데, 이들 중 하나는 Lys122에 공유 결합된 단일의 PEG 부분을 보유하고, 다른 하나는 Lys135에 공유 결합된 PEG 부분을 보유한다. 따라서, 본 발명은 조성물(예를 들어, 모노 PEG화된 조성물)을 포함하는데, 상기 조성물은 서열 번호 13의 서열을 포함하는 폴리펩티드 컨쥬게이트를 포함하고, 상기 PEG 부분은 Lys122 또는 Lys135에 공유적으로 결합되어 있다. 본 발명은 또한 조성물(예를 들어, 모노 PEG화 조성물)을 포함하며, 상기 조성물은 서열 번호 13의 서열을 포함하는 폴리펩티드 컨쥬게이트를 포함하고, 여기서 40 kDa PEG 부분(예를 들어, 40 kDa 분지형 PEG 부분)은 Lys122 또는 Lys135에 공유적으로 결합되어 있다.

모노 PEG화된 본 발명의 다른 대표적 폴리펩티드(본원에서는 25 epi19(서열 번호 38)이라 표시함)의 조성물은, 실시예 5의 방법에 따라서 40 kDa의 분지형 PEG(mPEG2-NHS)와 반응할 때, 주요한 3가지 위치 이성체를 함유하는데, 이들 중 하나는 Lys31에 공유 결합된 단일의 PEG 부분을 보유하고, 다른 하나는 Lys122에 공유 결합된 단일의 PEG 부분을 보유하며, 또한 나머지 하나는 Lys135에 공유 결합된 단일의 PEG 부분을 보유한다. 따라서, 본 발명은 조성물(예를 들어, 모노 PEG화된 조성물)을 포함하는데, 상기 조성물은 서열 번호 38의 서열을 포함하는 폴리펩티드 컨쥬게이트를 포함하고, 상기 PEG 부분은 Lys31, Lys122 또는 Lys135에 공유적으로 결합되어 있다. 본 발명은 또한 조성물(예를 들어, 모노 PEG화 조성물)을 포함하며, 상기 조성물은 서열 번호 38의 서열을 포함하는 폴리펩티드 컨쥬게이트를 포함하고, 여기서 40 kDa PEG 부분(예를 들어, 40 kDa 분지형 PEG 부분)은 Lys31, Lys122 또는 Lys135에 공유적으로 결합되어 있다.

비-폴리펩티드 부분이 시스테인 잔기와 결합할 때의 본 발명의 컨쥬게이트

하나의 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고, 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 시스테인 잔기에 컨쥬게이트화된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산(예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12번 위치의 아미노산, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼10번 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산 또는 1∼2개 위치의 아미노산)이 상이하고, (b) F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 포함하는 서열을 포함한다. 본 측면에 따른 몇몇 컨쥬게이트는 하나 이상의 시스테인 잔기가 도입되어 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 인터페론-알파 활성을 나타내고, 인터페론-알파 폴리펩티드의 하나 이상의 시스테인 잔기에 컨쥬게이트화된 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산(예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼10번 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산 또는 1∼2개 위치의 아미노산)이 상이하고, (b) M21A; I24P; F48A/L; T51P; S55A; F65A; F68P; F90A; M93P; L111A; V114P; F124A; I127P; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 36에 대한 하나 이상의 치환부를 포함하는 서열을 포함한다. 본 측면에 따른 몇몇 컨쥬게이트는 하나 이상의 시스테인 잔기가 도입되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트들 중 일부는 다음과 같은 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 추가로 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 치환부로 인하여 25% 이상의 미분 ASA를 보유하는 분자 표면에 노출된 것으로 예측되는 위치에 시스테인 잔기가 도입되고, 이러한 아미노산 잔기 위치는 서열 번호 1에 관한 것이다 : D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, G10C, R12C, R13C, M16C, A19C, Q20C, R22C, R23C, I24C, S25C, L26C, F27C, S28C, L30C, K31C, R33C, H34C, D35C, R37C, Q40C, E41C, E42C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, V51C, Q52C, E59C, Q62C, Q63C, N66C, S69C, T70C, K71C, D72C, S74C, A75C, D78C, E79C, T80C, L81C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, E97C, A98C, V100C, M101C, Q102C, E103C, V104C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, M112C, N113C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, Q125C, R126C, T128C, L129C, T132C, E133C, K134C, K135C, Y136C, S137C, P138C, A146C, M149C, R150C, S153C, F154C, N157C, Q159C, E160C, S161C, L162C, R163C, S164C, K165C 및 E166C.

본 발명의 컨쥬게이트들 중 일부는 다음과 같은 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 추가로 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 치환부로 인하여 50% 이상의 미분 ASA를 보유하는 분자 표면에 노출된 것으로 예측되는 위치에 시스테인 잔기가 도입되고, 이러한 아미노산 잔기 위치는 서열 번호 1에 관한 것이다 : D2C, L3C, P4C, Q5C, T6C, H7C, S8C, L9C, R12C, R13C, M16C, A19C, S25C, F27C, S28C, K31C, R33C, H34C, D35C, R37C, E41C, D44C, N46C, H47C, Q49C, K50C, N66C, K71C, A75C, D78C, E79C, T80C, E83C, K84C, I87C, F90C, Q91C, N94C, D95C, M101C, Q102C, E103C, G105C, E107C, E108C, T109C, P110C, L111C, V114C, D115C, L118C, R121C, K122C, Q125C, R126C, L129C, T132C, E133C, K135C, P138C, R150C, E160C, L162C, R163C, S164C, K165C 및 E166C.

근원 폴리펩티드에 대한 구체예 및 변형예가 일반적으로 본원에서 서열 번호 1(또는 기타 몇몇 특정 서열)의 서열에 관하여 제공된 반면에, 개시된 변형은 또한 본원에 개시된 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것(예를 들어, 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44로부터 선택된 서열 및 이의 변형체)의 동등한 아미노산 위치에 가하여질 수 있다는 사실을 이해하여야 할 것이다. 그러므로, 예를 들어, 서열 번호 1에 관한 H47C 치환부는 예를 들어, 서열 번호 37의 Q47C에 상응하는 것으로 이해된다.

몇몇 예에 있어서, 2 이상의 도입된 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합의 형성을 방지하기 위해서는 단일의 시스테인 잔기 만이 도입된다.

인터페론 알파에 있어서, 이황화 결합은 1/99번 위치 및 29/139번 위치의 시스테인 사이에 형성된다. 상기 29/139번 위치의 이황화 결합은 생물 활성에 필수적인 반면에, 상기 1/99번 위치의 결합은 생물 활성에 큰 영향을 끼치지 않고서 감소될 수 있다[Beilharz M. W.외 다수, (1986) J. Interferon Res. 6(6):677∼685]. 그러므로, 본 발명의 다른 측면에서, C1 또는 C99 중 어느 하나가 바람직하게는 치환 예를 들어, C1S 또는 C99S에 의해 제거되면, 이로써 비-폴리펩티드 부분에 대한 컨쥬게이트화에 유용한 나머지 시스테인 잔기를 떠나게 된다.

본 발명의 이러한 측면에서 고려되는 비-폴리펩티드 부분으로서는 중합체 분자 예를 들어, "중합체 분자에의 컨쥬게이트화" 섹션에 언급된 분자 중 임의의 분자 예를 들어, PEG 또는 mPEG를 포함한다. 시스테인 함유 폴리펩티드 및 중합체 분자 사이의 컨쥬게이트화는 임의의 적당한 방식 예를 들어, 1 단계 방법 또는 상기 섹션에 언급된 단계적 방식과 같은 임의의 적당한 방식 예를 들어, "중합체 분자에의 컨쥬게이트화" 섹션에 언급된 방식으로 이루어질 수 있다. 인터페론-알파 폴리펩티드를 PEG화 시키는 대표적인 방법은 시스테인 반응성 PEG를 사용하여 시스테인 잔기에 PEG를 공유적으로 결합시키는 것이다. 매우 특이적인 다수의 시스테인 반응성 PEG로서, 상이한 기(예를 들어, 오르토피리딜∼이황화물(OPSS), 말레이미드(MAL) 및 비닐설폰(VS))를 보유하고 상이한 크기를 갖는(예를 들어, 2∼40 kDa 예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa) 선형 또는 분지형 PEG는 시판중에 있다[Nektar Therapeutics Inc., Huntsville, AL, USA; 또는 SunBio, Anyang City, South Korea].

본 발명의 컨쥬게이트의 비-폴리펩티드 부분

전술한 바와 같이, 본 발명의 컨쥬게이트의 비-폴리펩티드 부분은 일반적으로 중합체 분자, 지방 친화성 화합물, 당 부분(예를 들어, 생체내 N-글리코실화에 의한 당 부분) 및 유기 유도체화 제제로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 제제들 모두는 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분에 바람직한 특성 예를 들어, 감소된 면역원성, 증가된 기능적 생체내 반감기, 증가된 혈청 반감기, 증가된 생체 적합성 및/또는 증가된 AUC_SC를 제공할 수 있다. 상기 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분은 종종 한가지 유형의 비-폴리펩티드 부분에 컨쥬게이트화되지만, 상이한 유형인 2 이상의 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 중합체 분자 및 당 부분에도 컨쥬게이트화될 수도 있다. 2 이상의 상이한 비-폴리펩티드 부분으로의 컨쥬게이트화는 동시적으로 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 비-폴리펩티드 부분(들)의 선택은 특히 컨쥬게이트화에 의하여 이루어지는 바람직한 효과에 따라 달라진다. 예를 들어, 당 부분은 면역원성의 감소에 특히 유용한 반면에, 중합체 분자 예를 들어, PEG는 기능적 생체내 반감기 및/또는 혈청 반감기의 증가에 특히 유용하다. 중합체 분자 및 당 부분을 병용하면 면역원성의 감소와 기능성 생체내 또는 혈청 반감기의 증가를 촉진시킬 수 있다.

다음의 섹션 "지방 친화성 화합물에의 컨쥬게이트화", "중합체 분자에의 컨쥬게이트화", "당 부분에의 컨쥬게이트화" 및 "유기 유도체화 제제에의 컨쥬게이트화"에는 특이한 유형의 비-폴리펩티드 부분에의 컨쥬게이트화에 관하여 기술되어 있다.

지방 친화성 화합물에의 컨쥬게이트화

지방 친화성 화합물에의 컨쥬게이트화를 위해서, 다음의 폴리펩티드 기들이 결합기로 작용할 수 있다: 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단, 아미노산 잔기 Ser, Thr 또는 Tyr의 히드록시기, Lys의 ε-아미노기, Cys의 -SH기 또는 Asp 및 Glu의 카복시기. 폴리펩티드 및 지방 친화성 화합물은 각각 직접적으로 또는 링커를 이용하여 컨쥬게이트화될 수 있다. 지방 친화성 화합물은 천연 화합물 예를 들어, 포화 또는 불포화 지방산, 지방산 디케톤, 테르펜, 프로스타글란딘, 비타민, 카로티노이드 또는 스테로이드, 또는 합성 화합물 예를 들어, 탄산, 알콜, 아민 및 1개 이상의 알킬, 아릴, 알케닐을 보유하는 설폰산, 또는 기타 다수의 불포화 화합물일 수 있다. 폴리펩티드 및 지방 친화성 화합물 사이의 컨쥬게이트화는, 임의적으로는 당 업계에 공지된 방법에 따라 링커를 통하여 수행될 수 있다[예를 들어, Bodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 및 WO 96/12505].

중합체 분자에의 컨쥬게이트화

폴리펩티드에 커플링될 중합체 분자는 임의의 적당한 중합체 분자 통상적으로, 분자량이 약 300∼100,000 Da 예를 들어, 약 1000∼50,000 Da 예를 들어, 약 1000∼40,000 Da의 범위인, 천연 또는 합성 동종 중합체 또는 이종 중합체일 수 있다. 더욱 구체적으로, 중합체 분자 예를 들어, PEG 구체적으로, mPEG는 통상적으로 분자량이 약 2, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40 또는 50 kDa 특히, 분자량이 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 12 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa 또는 약 40 kDa일 것이다. 상기 PEG 분자는 분지형(예를 들어, mPEG2)이거나 비 분지형(즉, 선형)일 수 있다.

본원에 있어서 중합체 분자에 관하여 사용될 때, "약"이란 용어는, 대략 평균의 분자량을 나타내는 것으로서, 소정의 중합체 제제에 있어서 분자량 분포가 임의적일 것이라는 사실을 반영한다.

상기 상동 중합체의 예로서는 폴리올(즉, 폴리-OH), 폴리아민(즉, 폴리-NH₂)및 폴리카복시산(즉, 폴리-COOH)를 포함한다. 이종 중합체는 하나 이상의 상이한 커플링기 예를 들어, 히드록실기 및 아민기를 포함하는 중합체를 의미한다.

적당한 중합체 분자의 예로서는 산화폴리알킬렌(PAO) 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜(PAG) 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 분지형 PEG(PEG2), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리(비닐프롤리돈), 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말산 부수물, 덱스트란 예를 들어, 카복시메틸-덱스트란, 또는 면역원성을 감소시키고/감소시키거나 기능적 생체내 반감기 및/또는 혈청 반감기를 증가시키기에 적당한 임의의 기타 생중합체로 이루어진 군에서 선택된 중합체 분자를 포함한다. 일반적으로 폴리알킬렌 글리콜-유래 중합체는 생체 적합성, 비독성, 비항원성, 비면역원성으로서, 다양한 수용해성을 가지며, 생유기체로부터 용이하게 배출된다.

PEG는 예를 들어, 다당류 예를 들어, 덱스트란에 비하여 교차 결합할 수 있는 반응기가 적기 때문에, 바람직한 중합체 분자이다. 특히, 커플링 화학 반응이 비교적 간단하므로(하나의 반응기만이 폴리펩티드상 결합기와의 컨쥬게이트화에 관여함) 단일 기능성 PEG 예를 들어, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이 바람직하다. 결과적으로, 교차 결합의 위험성은 없어지게 되고, 생성된 폴리펩티드 컨쥬게이트는 더욱 균일화되어 중합체 분자와 폴리펩티드와의 반응은 보다 제어하기 용이하다.

중합체 분자(들)를 폴리펩티드에 공유적으로 결합시키기 위하여, 중합체 분자의 히드록실 말단기는 활성화된 형태 즉, 반응성 작용기[예를 들어, 1차 아미노기, 히드라지드(HZ), 티올, 숙시네이트(SUC), 숙신이미딜 숙시네이트(SS), 숙신이미딜 숙신아미드(SSA), 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 숙신이미딜 부타노에이트(SBA), 숙신이미딜 카복시메틸레이트(SCM), 벤조트리아졸 카보네이트(BTC), N- 히드록시숙신이미드(NHS), 알데히드, 니트로페닐카보네이트(NPC) 및 트레실레이트(TRES)]를 보유하는 형태로서 제공되어야 한다. 적당한 활성화 중합체 분자들이 예를 들어, 판매원[Nektar Therapeutics, Inc., Huntsville, AL, USA; PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK; 또는 SunBio Corporation, Anyang City, South Korea]들로부터 시판되고 있다. 대안적으로, 중합체 분자들은 업계에 공지된(예를 들어, WO 90/13540) 종래의 방법으로써 활성화될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 활성화 선형 또는 분지형 중합체 분자의 구체예는 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 문헌[Nektar Therapeutics, Inc. 2003 Catalog ("Nektar Molecule Engineering: Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced Pegylation, Catalog 2003")]에 개시되어 있다. 활성화 PEG 중합체의 구체예로서는 다음과 같은 선형 PEG 즉, NHS-PEG , SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, IODO-PEG 및 MAL-PEG와, 분지형 PEG 예를 들어, PEG2-NHS, PEG2-MAL, 그리고 본원에 모두 참고 문헌으로서 인용되어 있는 미국 특허 제 5,932,462 호 및 동 제 5,643,575 호에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 추가로, 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 다음과 같은 공보들에는 유용한 중합체 분자 및/또는 PEG화 화학에 관하여 개시되어 있다: 미국 특허 제 5,824,778호, 동 제 5,476,653 호, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, 미국 특허 제 4,902,502 호, 동 제 5,281,698 호, 동 제 5,122,614 호, 동 제 5,219,564 호, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W0 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, 미국 특허 제 5,736,625 호, WO 98/05363, EP 809 996, 미국 특허 제5,629,384 호, WO 96/41813, WO 96/07670, 미국 특허 제 5,473,034 호, 동 제 5,516,673 호, EP 605 963, 미국 특허 제 5,382,657 호, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316.

폴리펩티드 및 활성화 중합체 분자의 컨쥬게이트화는 통상의 방법 예를 들어, 다음과 같은 문헌(여기에는 중합체 분자의 활성화에 적당한 방법도 개시되어 있음)에 기술된 방법을 사용하여 수행된다 : Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson외 다수, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.

시스테인 잔기의 PEG화를 위하여 폴리펩티드는 보통 PEG화 이전에 환원제 예를 들어, 디티오트레이톨(DDT)로 처리된다. 상기 환원제는 이후 임의의 통상적인 방법 예를 들어, 탈염에 의해 제거된다. 시스테인 잔기에의 PEG 컨쥬게이트화는 통상적으로 적당한 완충액(pH 6∼9)중 4∼25℃에서 약 16 시간 이하 동안 진행된다. 시스테인 잔기에의 커플링을 위한 활성화 PEG 중합체의 예로서는 다음과 같은 선형 및 분지형 PEG를 포함한다: 비닐설폰-PEG (PEG-VS) 예를 들어, 비닐설폰-mPEG (mPEG-VS); 오르토피리딜-디설파이드-PEG (PEG-OPSS) 예를 들어, 오르토피리딜-디설파이드-mPEG (mPEG-OPSS); 및 말레이미드-PEG (PEG-MAL) 예를 들어, 말레이미드-mPEG (mPEG-MAL) 및 분지형 말레이미드-mPEG2 (mPEG2∼MAL).

리신의 페그화(pegylation)에서는 종종 PEG-N-히드록실숙신이미드(예를 들어, mPEG-NHS 또는 mPEG2-NHS), 또는 에스테르 예를 들어, PEG 숙신이미딜 프로피오네이트(예를 들어, mPEG-SPA) 또는 PEG 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들어, mPEG-SBA)를 사용한다. 거의 동일한 몰량의 PEG와 단백질이 혼합되면 실온 및 pH 8∼9.5에서 30분 이내에 하나 이상의 PEG가 단백질에 결합될 수 있다. 일반적으로 PEG : 단백질 아미노기의 몰 비는 1∼5에서 1인 것으로 충분할 것이다. pH를 상승시키면 반응 속도가 증가하는 반면에, pH를 낮추면 반응 속도는 감소하게 된다. 이와 같이 고도로 반응성인 활성 에스테르는 생리적 pH에서 커플링될 수 있으나, 그 보다 반응성이 낮은 유도체들은 통상적으로 더 높은 pH를 필요로 한다. 불안정한 단백질이 사용되면, 저온에서 수행될 수도 있다. 저온 조건하에서는, 반응 시간이 길어질 수 있다.

N-말단 PEG화는 N-말단 아미노산의 α-아미노기의 pKa 값(약 7.6∼8.0)과 리신의 ε-아미노기의 pKa 값(약 10) 사이의 차이에 따라서 촉진된다. N-말단 아미노기의 PEG화는 종종 PEG-알데히드(예를 들어, mPEG-프로피온알데히드 또는 mPEG-부틸알데히드)를 사용하는데, 이들은 아민에 대해 더욱 선택적이므로, 히스티딘의 이미다졸기와의 반응성이 떨어지는 것으로 파악되며: 뿐만 아니라, 리신의 컨쥬게이트화에 사용된 PEG 시약(예를 들어, mPEG-SPA, mPEG-SBA 또는 mPEG-NHS)는 또한 N-말단 아민의 컨쥬게이트화에 사용될 수도 있다. PEG-알데히드의 N-말단 아미노기로의 컨쥬게이트화는 통상적으로 적당한 완충액(예를 들어, 100 mM 아세트산 나트륨 또는 100 mM 이인산 나트륨 완충액 및 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드)중 pH 약 5.0에서 밤새도록 온도에 변화를 주었을 때(약 4℃에서 25℃ 까지) 일어난다. 유용한 N-말단 PEG화 방법 및 화학적 현상은 또한 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 미국 특허 제 5,985,265 호 및 미국 특허 제 6,077,939 호에 개시되어 있다.

통상적으로, 선형 PEG 또는 mPEG 중합체의 분자량은 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 12 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa 또는 약 30 kDa일 것이다. 분지형 PEG(PEG2 또는 mPEG) 중합체의 분자량은 통상적으로 약 10 kDa, 약 20 kDa 또는 약 40 kDa일 것이다. 몇몇 경우에 있어서, 고분자량 분지형 PEG2 시약 예를 들어, 20 kDa 또는 40 kDa PEG2 예를 들어, 리신의 PEG화에 있어서는 mPEG2-NHS, 시스테인의 PEG화에 있어서는 mPEG2-MAL 또는 N-말단 PEG화에 있어서는 MPEG2-알데히드(모두 Nektar Therapeutics, Inc(Huntsville AL)로부터 시판됨)가 사용될 수 있다. PEG2 화합물의 분지형 구조는 비교적 큰 분자 부피를 형성하여, 소수의 결합된 분자들(또는 하나의 결합된 분자)은 PEG화된 분자에 목적으로 하는 특성을 부과할 수 있다.

당 업자는 사용된 활성화 방법 및/또는 컨쥬게이트화의 화학적 현상이 인터페론-알파 폴리펩티드의 결합기(들)과 중합체의 작용기(예를 들어, 아미노, 히드록실, 카복실, 알데히드 또는 설프히드릴)에 따라서 달라짐을 알게 될 것이다. 상기 PEG화는 폴리펩티드상의 모든 사용 가능한 결합기(즉, 폴리펩티드 표면에 노출된 결합기)에의 컨쥬게이트화로 유도될 수 있거나, 또는 특정 결합기 예를 들어, 시스테인 잔기, 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기로 유도될 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, 컨쥬게이트화는 단일 단계 또는 다단계 방식(예를 들어, WO 99/55377에 개시된 바와 같은 방식)으로 행하여질 수 있다.

몇몇 경우에 있어서, 중합체의 컨쥬게이트화는 다수의 사용 가능한 중합체 결합기가 중합체 분자와 반응할 수 있도록 짜여진 조건하에서 수행된다. 이는 폴리펩티드와 관련하여 적당한 몰 과량의 중합체에 의해 수행된다. 활성화 중합체 분자 : 폴리펩티드의 통상적인 몰비는 약 1000^-1 이하 예를 들어, 약 200^-1 이하 또는 약 100^-1 이하이다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 비율은 약간 낮을 수도 있다[예를 들어, 약 50^-1 이하, 10^-1 이하 또는 5^-1 이하]. 또한 동일한 몰비가 적용될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 중합체 분자를 링커를 통하여 폴리펩티드에 커플링시키는 것을 고려해 볼 수도 있다. 적당한 링커는 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 예로서는 염화시안산염이 있다[Abuchowski외 다수, (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578∼3581; 미국 특허 제 4,179,337 호; Shafer외 다수 , (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375∼378)].

컨쥬게이트화 이후, 당 업계에 공지된 방법에 따라서 예를 들어, 1차 아민을 반응 혼합물에 부가함으로써 잔류하는 활성 중합체 분자를 블로킹시키고, 그 결과 생성된 불활성화 중합체 분자를 적당한 방법에 의해 제거한다.

당 부분과 인터페론-알파의 아미노산 잔기를 생체내 공유 커플링시키는 것은 당 치환체의 수와 프로필을 변형시키거나 또는 증가시키는데에 사용될 수 있다. 사용된 커플링 방법에 따라서, 탄수화물(들)은 a) 아르기닌 및 히스티딘(Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI), b) 유리 카복시기(예를 들어, 아스파라긴 또는 글루타민의 C-말단 아미노산 잔기의 유리 카복시기), c) 예를 들어, 시스테인의 유리 설프히드릴기, d) 예를 들어, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 히드록시프롤린의 유리 히드록실기, e) 예를 들어, 페닐알라닌 또는 트립토판의 방향성 잔기 또는 f) 글루타민의 아미노기에 결합될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 당 부분에 대한 결합기의 예를 이룰수 있는데, 여기서 상기 당 부분은 인터페론-알파 폴리펩티드에 도입되고/도입되거나 제거될 수 있다. 적당한 시험관내 커플링 방법에 관하여는 WO 87/05330 및 문헌[Aplin외 다수 , CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259∼306, 1981]에 개시되어 있다. 당 부분 또는 PEG와, 단백질 및 펩티드 결합 Gln 잔기의 시험관내 커플링은 또한 글루타민 전이 효소(TGases)[예를 들어, 문헌(Sato외 다수, 1996 Biochemistry 35, 13072∼13080) 또는 EP 725145]에 의하여 수행될 수도 있다.

당 부분에의 커플링

하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 변형된 인터페론-알파 폴리펩티드의 생체내 글리코실화를 수행하기 위하여, 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 글리코실화 진핵 발현 숙주에 삽입된다. 발현 숙주 세포는 곰팡이(사상 곰팡이 또는 효모), 곤충, 포유 동물 세포, 트랜스게닉 식물 세포 또는 트랜스게닉 동물 세포로부터 선택될 수 있다. 뿐만 아니라, 글리코실화는 유전자 치료시 본 발명의 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분 또는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 사용할 때 인간의 몸속에서 일어날 수 있다. 하나의 측면에서, 숙주 세포로서는 포유 동물 세포 예를 들어, CHO 세포, COS 세포, BHK 또는 HEK 세포 예를 들어, HEK293, 또는 곤충 세포 예를 들어, SF9 세포, 또는 효모 세포 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 임의의 기타 적당한 글리코실화 숙주 예를 들어, 이하에 상세히 기술된 것이 있다. 임의적으로, 생체내 글리코실화에 의하여 인터페론-알파 폴리펩티드에 결합된 당 부분은 당 전이 효소[예를 들어, GlycoAdvance(상표명) 테크놀로지(Neose, Horsham, PA, USA)]에 의해 더욱 변형된다. 그러므로, 예를 들어, 발현후 글리코실화된 인터페론-알파 폴리펩티드의 시알화 및 CHO 세포에 의한 후속 발현 및 생체내 글리코실화를 증가시킬 수 있다.

유기 유도체화 제제에의 커플링

인터페론-알파 폴리펩티드의 공유적 변형은 폴리펩티드의 결합기(들)과 유기 유도체화 제제를 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 적당한 유도체화 제제 및 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 가장 흔한 시스테이닐 잔기는 α-할로아세테이트(및 상응하는 아민) 예를 들어, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응하여, 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 생성한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(4-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸을 반응시켜 유도체화되기도 한다. 디에틸피로카보네이트는 비교적 히스티딜 측쇄에 특이적이므로 히스티딜 잔기는 pH 5.5∼7.0에서 디에틸피로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화된다. 브롬화 파라-브로모페나실 도 유용할 수 있는데; 이 반응은 바람직하게는 0.1 M 카코딜나트륨(pH 6.0)중에서 수행된다. 리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 무수물 또는 기타 카복시산 무수물과 반응한다. 이 제제를 사용한 유도체화는 리시닐 잔기의 하전을 역으로 뒤집는 효과를 나타낸다. α∼아미노 함유 잔기를 유도체화시키기 위한 기타 적당한 제제로서는 이미도에스테르 예를 들어, 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제 촉매화 반응을 포함한다. 아르기닐 잔기는 하나 이상의 통상적 시약, 그 중에서도 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린과 반응함으로써 변형된다. 구아니딘 작용기의 pKa가 높기 때문에 아르기닌 잔기의 유도체화 반응은 알칼리 조건에서 수행될 필요가 있다. 더욱이, 상기 시약들은 리신기 및 아르기닌 구아니디노기와 반응할 수 있다. 카복실 측기(아스파틸 또는 글루타밀 또는 C-말단 아미노산 잔기)는 카보디이미드(R-N=C=N-R'; 여기서 R 및 R'는 상이한 알킬기임) 예를 들어, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 또한, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

작용 부위의 블로킹

과도한 중합체 컨쥬게이트화가 이 중합체가 컨쥬게이트화될 인터페론-α 폴리펩티드의 활성을 상실시킬 수 있기 때문에, 작용 부위에 위치하는 결합기를 제거하거나 또는 컨쥬게이트화 이전에 작용 부위를 차단시키는 것이 유리할 수 있다. 후자의 방법은 본 발명의 추가의 양상을 이룬다[예를 들어, 작용 부위에 인접하여위치할 수 있는 리신 잔기를 제거함으로써, 상기와 같이 추가로 예시한 첫번째 기술]. 더욱 구체적으로, 두 번째 방법에 따르면, 인터페론-알파 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분 사이의 컨쥬게이트화는 폴리펩티드의 작용 부위가 이 폴리펩티드의 작용 부위에 결합할 수 있도록 도와주는 조력 분자에 의해 차단되는 조건하에서 수행된다. 바람직하게, 상기 조력 분자는 폴리펩티드의 작용 부위 예를 들어, 수용체 구체적으로, I형 인터페론 수용체를 특이적으로 인지하는 분자이다. 대안적으로, 상기 조력 분자는 항체 구체적으로, 인터페론-알파 폴리펩티드를 인지하는 모노클로날 항체일 수 있다. 특히, 상기 조력 분자는 중화 모노클로날 항체일 수 있다.

폴리펩티드는 컨쥬게이트화 수행 이전에 조력 분자와 상호 작용을 할 수 있다. 이로써 폴리펩티드의 작용 부위는 차단되거나 보호되어, 결과적으로 비-폴리펩티드 부분 예를 들어, 중합체에 의한 유도체화에 이용될 수 없게 된다. 조력 분자로부터 유리됨에 따라서, 비-폴리펩티드 부분과 폴리펩티드 사이의 컨쥬게이트는 최소한 부분적으로 보존된 작용 부위로 회복될 수 있다.

차단된 작용 부위를 보유하는 폴리펩티드의 중합체, 지방 친화성 화합물, 유기 유도체화 제제 또는 임의의 기타 화합물로의 후속 컨쥬게이트화는 보통의 방식 예를 들어, 상기 "...에 대한 컨쥬게이트화" 섹션에 기술된 바와 같이 수행된다.

폴리펩티드의 작용 부위가 컨쥬게이트화되는 것을 차단하는데 사용되는 조력 분자의 특성에 상관없이, 상기 조력 분자는 분자의 일부분 중 선택된 비-폴리펩티드 부분에 대한 소수의 결합기로부터 유리되거나 또는 이를 포함하는 것이 바람직하며, 이때 이러한 기에의 컨쥬게이트화는 조력 분자로부터 컨쥬게이트화된 폴리펩티드를 탈착시키는 것을 방해하게 된다. 이로써, 폴리펩티드의 차단되지 않은 부분에 존재하는 결합기에의 선택적 컨쥬게이트화가 이루어질 수 있으며, 컨쥬게이트화의 반복 진행시 상기 조력 분자를 재사용할 수 있게 된다. 예를 들어, 비-폴리펩티드 부분이 결합기로서 리신 또는 N-말단 아미노산 잔기의 엡실론 아미노기를 보유하는 중합체 분자 예를 들어, PEG이면, 상기 조력 분자는 실질적으로 컨쥬게이트화 가능한 엡실론 아미노기, 바람직하게는 임의의 엡실론 아미노기로부터 유리되는 것이 바람직하다. 따라서, 몇몇 경우 상기 조력 분자는 폴리펩티드의 작용 부위에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드인데, 이때 상기 단백질 또는 펩티드는 선택된 비-폴리펩티드 부분에 대한 컨쥬게이트 가능한 임의의 결합기로부터 유리된다.

추가의 양상에서, 조력 분자는 처음에 고체상 예를 들어, 컬럼 팩킹 재료 예를 들어, 세파덱스 또는 아가로스 비드, 또는 표면 예를 들어, 반응 용기에 공유 결합된다. 이후, 폴리펩티드는 조력 분자를 운반하는 컬럼 재료상에 로딩되어, 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 전술한 "...에 대한 컨쥬게이트화" 섹션에 기술된 바와 같은 방법에 따라서 컨쥬게이트화된다. 이 과정은 조력 분자로부터 폴리펩티드 컨쥬게이트가 용리에 의해 분리될 수 있도록 만든다. 폴리펩티드 컨쥬게이트는 폴리펩티드 컨쥬게이트가 실질적으로 분해되지 않는 생리 화학적 조건하에서 종래의 기술에 의해 용리된다. 폴리펩티드 컨쥬게이트를 함유하는 유동상은 조력 분자가 공유 결합되어 체류하고 있는 상기 고체상으로부터 분리된다. 이러한 분리 과정은 다른 방식으로도 수행될 수 있다: 예를 들어, 조력 분자는 특이적 결합제(예를 들어, 스트렙타비딘)에 의해 인지될 수 있는 제2의 분자(예를 들어, 비오틴)로써 유도체화될 수 있다. 특이 결합제는 고체상에 결합되어, 후속 용리시 폴리펩티드 컨쥬게이트가 아닌 조력 분자-제2의 분자 복합체를 체류시키게 될 제2의 조력 고체상 컬럼을 통과함으로써, 상기 폴리펩티드 컨쥬게이트가 조력 분자-제2 분자 복합체로부터 분리될 수 있도록 만든다. 폴리펩티드 컨쥬게이트는 임의의 적당한 방식으로 조력 분자로부터 방출될 수 있다. 탈보호는 조력 분자가 그것이 결합되어 있는 인터페론-알파의 작용 부위로부터 해리되는 조건을 제공함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 중합체가 컨쥬게이트화된 항체와 항유전자형 항체 간의 복합체는 pH를 산성 또는 알칼리성으로 조정함으로써 해리시킬 수 있다.

태깅된 인터페론-알파 폴리펩테드에의 컨쥬게이트화

다른 측면에서, 인터페론-알파 폴리펩티드는 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 가하여진 태그 즉, 아미노산 서열 또는 통상적으로 1∼30개 예를 들어, 1∼20개 또는 1∼15개 또는 1∼10개 또는 1∼5개의 아미노산 잔기로 구성된 펩티드를 보유하는 융합 단백질로서 발현된다. 정제를 신속하고 용이하게 할 수 있도록 만들기 위함 이외에, 상기 태그는 태깅된 폴리펩티드와 비-폴리펩티드 부분 사이의 컨쥬게이트화를 위한 편리한 도구가 된다. 특히, 상기 태그는 미세 역가 평판 또는 기타 담체 예를 들어, 상자성 비드에서의 컨쥬게이트화에 사용될 수 있는데, 여기서 상기 태깅된 펩티드는 태그를 통하여 고정될 수 있다. 예를 들어, 미세 역가 평판에 태깅된 폴리펩티드에 컨쥬게이트화시키는 것은, 태깅된 폴리펩티드가 배양액(주로, 어떠한 정제 과정도 거치지 않은 배양액)으로부터 직접 미세 역가 평판에 고정되어 컨쥬게이트화될 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서, 이 과정(발현에서부터 컨쥬게이트화까지)의 총 단계 수는 감소될 수 있다. 더욱이, 상기 태그는 컨쥬게이트화될 고정화 폴리펩티드에 대한 친화도를 개선시키는 스페이서 분자로서의 기능을 할 수 있다. 태깅된 폴리펩티드를 사용하는 컨쥬게이트화는 본원에 개시되어 있는 비-폴리펩티드 부분중 임의의 것 예를 들어, PEG와 같은 중합체 분자에 대한 과정일 수 있다.

사용될 특이적 태그의 정체는 이 태그가 폴리펩티드와 함께 발현될 수 있고 적당한 표면 또는 담체 재료에 고정화될 수 있는 한, 중요하지 않다. 다수의 적당한 태그가 시판되고 있다[Unizyme Laboratories, Denmark]. 이러한 태그에 대한 항체도 시판되고 있다[ADI, Aves Lab and Research Diagnostics].

본 발명의 폴리뉴클레오티드

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산(본원에서는 폴리뉴클레오티드라고도 칭함)[총칭하여 "본 발명의 핵산(또는 폴리뉴클레오티드)"라고 함]을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다양한 분야에서 유용하다. 전술한 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데에 유용하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 치료, DNA 백신 접종 및 면역 요법(이하에 보다 상세히 기술함)에 유용한 발현 벡터에 도입될 수 있다.

하나의 양상에서, 본 발명은 각각 서열 번호 2∼35 및 서열 번호 37∼44로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 대표적 핵산 서열로서는 서열 번호 59∼61(각각 서열 번호 10의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 62∼64 및 89(각각 서열 번호 13의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 65∼67(각각 서열 번호 15의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 68∼70(각각 서열 번호 23의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 71∼73(각각 서열 번호 27의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 74∼76(각각 서열 번호 30의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 77∼79(각각 서열 번호 37의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 80∼82 및 90(각각 서열 번호 38의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 서열 번호 83∼85(각각 서열 번호 41의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함); 및 서열 번호 86∼88(각각 서열 번호 44의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 각각 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 여기서 상기 아미노산 서열은 (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산)이 상이하고, (b) F48A/L, V51P, F55A, F65A, F68P, L111A 및 V114P로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 치환부를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 일부 폴리펩티드는 하나 이상의 부가적 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

본 발명은 또한 각각 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 여기서 상기 아미노산 서열은 (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 위치의 아미노산 예를 들어, 1∼15개 위치의 아미노산, 1∼14개 위치의 아미노산, 1∼13개 위치의 아미노산, 1∼12개 위치의 아미노산, 1∼11개 위치의 아미노산, 1∼10개 위치의 아미노산, 1∼9개 위치의 아미노산, 1∼8개 위치의 아미노산, 1∼7개 위치의 아미노산, 1∼6개 위치의 아미노산, 1∼5개 위치의 아미노산, 1∼4개 위치의 아미노산, 1∼3개 위치의 아미노산, 또는 1∼2개 위치의 아미노산)이 상이하고, (b) M21A, I24P, F48A/L, T51P, S55A, F65A, F68P, F90A, M93P, L111A, V114P, F124A, I127P 및 E160D로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 36에 대한 하나 이상의 치환부를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 일부 폴리펩티드는 하나 이상의 부가적 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

본 발명은 또한 각각 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 여기서 상기 아미노산 서열은 각각 서열 상동성이 서열 번호 1∼35 중 임의의 것에 대해서 90% 이상(예를 들어, 아미노산 서열 상동성이 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상)이며, 여기서 상기 아미노산 서열은 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 및 114번 위치의 Pro (위치 번호는 서열 번호 1에 관함) 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드 중 일부는 추가로 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 암호화된 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

본 발명은 또한 각각 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 상보적 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 여기서 상기 아미노산 서열은 각각 서열 상동성이 서열 번호 36∼44중 임의의 것에 대해서 90% 이상(예를 들어, 아미노산 서열 상동성이 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상)이며, 여기서 상기 아미노산 서열은 21번 위치의 Ala; 24번 위치의 Pro; 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 90번 위치의 Ala; 93번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro; 124번 위치의 Ala; 127번 위치의 Pro; 및 160번 위치의 Asp (위치 번호는 서열 번호 36에 관함)중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드 중 일부는 추가로 하나 이상의 부가 아미노산(들) 예를 들어, N-말단에 부가된 메티오닌을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 암호화된 폴리펩티드는 인터페론-알파 활성을 나타낸다.

추가의 양상

본 발명의 폴리뉴클레오티드중 임의의 것(전술한 것 포함)은 하나 이상의 부가 아미노산 서열 예를 들어, 분비/국소화 서열, 폴리펩티드의 가용화 또는 고정화에 유용한 서열(예를 들어, 세포 표면 디스플레이용), 폴리펩티드의 검출 및/또는 정제에 유용한 서열(예를 들어, 폴리펩티드 정제 종속 서열 예를 들어, 에피토프 태그, 폴리히스티딘 서열 등)을 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드중 하나 이상을 포함하는 세포를 제공한다. 이러한 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드중 임의의 것을 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 벡터로서는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 또는 바이러스 단편을 포함할 수 있다. 이러한 벡터로서는 이하 기술된 바와 같은 발현 벡터를 포함할 수 있는데, 원하는 경우, 핵산은 프로모터에 작동 가능하도록 연결된다. 뿐만 아니라, 다른 양상에서, 본 발명은 부형제 또는 담체와 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것 하나 이상, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 세포 또는 숙주를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 약학 조성물일 수 있으며, 상기 부형제 또는 담체는 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체일 수 있다.

본 발명은 또한 2 이상의 본 발명의 핵산 또는 이의 단편(예를 들어, 재조합용 기질)을 포함하는 조성물을 포함한다. 이 조성물은 재조합 핵산의 라이브러리를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 라이브러리는 전술한 바와 같은 핵산을 2개 이상, 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상 또는 100개 이상 포함한다. 상기 핵산은 임의적으로 발현 벡터에 작동 가능하도록 클로닝되어 발현 벡터를 형성하게 된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편, 그리고 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 적당한 담체 예를 들어, 약학적 담체와 함께 치료용 또는 예방용으로 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 및/또는 예방학적 유효량의 화합물과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로서는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제형은 투여 방식에 맞추어져야 한다. 핵산, 폴리펩티드 및 단백질의 투여 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에 관하여는 이하 보다 상세히 기술되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 중 임의의 것 하나 이상을 제한 엔도뉴클레아제, RNAse 또는 DNAse로 절단하여 제조된[예를 들어, 전술한 재조합 방식중 임의의 방식으로 제조된] 조성물; 및 본 발명의 핵산중 하나 이상을 기계적 방법으로 단편화 또는 전단하여(예를 들어, 초음속 처리, 와류 처리 등) 제조된 조성물을 포함하는데, 여기서 상기 조성물은 또한 본원에 기술된 방법에서 재조합용 기질을 제공하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 또한 본원의 핵산중 임의의 것을 하나 이상 절단하여 제조된 조성물을 제공한다. 이와 같은 절단 방법으로서는 기계적 절단법, 화학적 절단법 또는 효소적 절단법을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 효소적 절단법은 제한 엔도뉴클레아제, RNAse 또는 DNAse로 절단하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 단편화된 핵산 중 하나 이상을 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 핵산 중합 효소의 존재하에서 항온 처리하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 조성물도 본 발명에 포함된다. 그 결과 생성된 조성물은 전술한 다수의 재조합 방법을 위한 재조합 혼합물을 형성한다. 핵산 중합 효소는 RNA 중합 효소, DNA 중합 효소 또는 RNA-유도 DNA 중합 효소(예를 들어, "역전사효소")일 수 있으며; 상기 중합 효소는 예를 들어, 열안정성 DNA 중합 효소(예를 들어, VENT, TAQ 등)일 수 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 하나 이상의 핵산과 상응하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 조성물은 재조합 기질로서 유용하며, 이는 본 발명의 양상이 된다. 편의상, 이와 같이 단편화, 전단화 또는 올리고뉴클레오티드 합성된 혼합물을 단편화된 핵산 세트라 칭한다.

본 발명은 또한 인터페론-알파 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 핵산은 본 발명의 핵산중 하나 이상을 돌연변이 시키거나 또는 재조합시킴으로써 제조된다.

폴리뉴클레오티드의 제조

본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 단편은 공지의 합성 방법인, 표준적인 고체상 방법에 의해 제조될 수 있다. 통상적으로 약 100개 이하의 염기로 이루어진 단편은 개별적으로 합성된 후, 서로 결합하여(예를 들어, 효소적 또는 화학적 결찰 방법, 또는 중합 효소 매개성 재조합 방법에 의함) 필수적인 임의의 목적 연속 서열을 형성한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 화학 합성법 예를 들어, 문헌[Beaucage외 다수, (1981) Tetrahedron Letters 22:1859∼69]에 기술되어 있는 고전적인 포스포라미디트 방법, 또는 예를 들어, 문헌[Matthes외 다수(1984) EMBO J 3:801∼05]에 기술되어 있는 통상적으로 자동화 합성 방법으로 수행되는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 포스파라미디트 방법에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동화 DNA 합성기에서 합성된 후 정제, 어닐링, 결찰되어 적당한 벡터에 클로닝된다.

더욱이, 임의의 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 다양한 상업적 공급원 예를 들어, 오페론 테크놀로지사(Operon Technologies Inc.; Alameda, CA) 등으로부터 주문 제작될 수 있다. 이와 유사하게, 펩티드 및 항체들은 다양한 상업적 공급원 예를 들어, 셀텍 펩티드(Celtek Peptides; Nashville, TN); 워싱톤 바이오테크놀로지사Washington Biotechnology, Inc.; Baltimore MD); 글로발 펩티드 서비스(Global Peptide Services; Ft. Collin CO) 중 임의의 공급원으로부터 주문 제작될 수 있다.

본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드는 또한 인터페론-알파 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 혼성화 또는 PCR 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리(예를 들어, 통상적인 반복 서열 재조합법에서와 같이 상동성 핵산을 재조합하여 제조된 라이브러리)를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. cDNA 클론의 스크리닝 및 분리 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기술에 관하여는 문헌[예를 들어, Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152, Acad. Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook(상동) 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, (상동)]에 기술되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 일부는 천연 생성된 서열을 예를 들어, 돌연변이유발법, 반복 서열 재조합법(예를 들어, 셔플링) 또는 올리고뉴클레오티드 재조합법에 의해 변형시켜 얻을 수 있다. 다른 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본원에 인용된 참고 문헌에 기술된 바와 같이 컴퓨터상에서(in silico) 또는 올리고뉴클레오티드 재조합법에 의해 제조될 수 있다.

본원에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드로서는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열 및 최소한으로 엄중한 조건하에서 본원에 정의된 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 암호화 서열은 특정 폴리펩티드 또는 도메인, 이 폴리펩티드의 특정 부분 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 암호화 서열은 전술한 바와 같이 인터페론 알파 활성을 나타내는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다(암호가 될 수 있다). 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있으며, 이로서는 mRNA, cRNA, 합성 RNA 및 DNA, 그리고 cDNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 이중 사슬 또는 단일 사슬일 수 있으며, 단일 사슬일 경우, 이는 암호화 사슬 또는 비 암호화 사슬(안티센스, 상보 사슬)일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는데, 이때 상기 암호화 서열은 (i) 분리된 형태, (ii) 하나 이상의 부가 암호화 서열과 혼재하여 예를 들어, 융합 단백질, 전구 단백질, 프리프로 단백질(prepro-protein) 등을 암호화하는 형태, (iii) 비 암호화 서열 예를 들어, 인트론, 조절 인자 예를 들어, 프로모터(예를 들어, 천연 생성 또는 재조합 또는 셔플링된 프로모터), 종결 인자, 또는 적당한 숙주내에서 암호화 서열의 발현에 효과적인 5'- 및/또는 3'-비번역 부위와 혼재하는 상태 및/또는 (iv) 암호화 서열이 이종 유전자인 벡터, 세포 또는 숙주 환경내에 존재하는 형태로 존재한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 통상적인 핵산의 구성 제제 예를 들어, 담체, 완충액, 애쥬반트, 부형제 등(당 업자에게 공지된 제제들)과 함께 발견될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 단편은 통상적으로 약 200개 이상 예를 들어, 약 250개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 460개, 약 470개 이상의 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단편은 매우 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있으며/있거나 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드 특성을 하나 이상 보유하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

변형된 암호화 서열

당업자에 의해 이해될 바와 같이, 암호화 서열을 개질하여 특정 숙주내에서 그의 발현을 강화시키는 것이 유리하다. 유전자 암호는 64개의 가능한 코돈을 갖는 것으로서 풍부하게 존재하지만, 대부분의 유기체는 이들 코돈의 하위세트를 선호적으로 사용한다. 종류별로 가장 자주 사용되는 코돈은 최적 코돈인 것으로 간주되며, 거의 사용되지 않는 코돈은 희귀 또는 사용 빈도가 낮은 코돈으로 분류된다[예를 들어, Zhang, S. P.외 다수 (1991) Gene 105: 61∼72)]. 코돈은 숙주가 선호하는 코돈을 반영하도록 치환될 수 있는데, 이 과정을 "코돈 최적화" 또는 "종별 코돈 편향 조절(controlling for species codon bias)"라고 부른다.

특정 원핵 생물 숙주 또는 진핵 생물 숙주에 의해 선호되는 코돈을 함유하는 개질 암호화 서열[예를 들어, Murray, E.외 다수 (1989) Nuc Acids Res 17:477∼508; Griswold외 다수, (2003) Protein Expr. Purif. 27(1):134∼42]은 예를 들어, 번역 속도를 증가시키거나, 원하는 특성 예를 들어, 비 최적화 서열로부터 제조된 전사체 보다 긴 반감기를 갖는 재조합 RNA 전사체를 생성하도록 제조될 수 있다. 번역 종결 코돈은 또한 숙주의 선호도를 반영하도록 변형될 수도 있다. 예를 들어, 에스.세레비지애 및 포유 동물에 대한 바람직한 종결 코돈은 각각 UAA 및 UGA이다. 외떡잎 식물에 대한 바람직한 종결 코돈은 UGA인 반면에, 곤충 및 이. 콜라이는 종결 코돈으로서 UAA를 선호한다[Dalphin, M. E.외 다수(1996) Nucl. Acids Res. 24:216∼218)].

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 다양한 이유로 인해서 본 발명의 암호화 서열을 변형하도록 조작될 수 있으며, 이러한 조작으로서는 예를 들어, 클로닝을 개질시키는 변형, 유전자 생성물의 가공 및/또는 발현(이에 한정되는 것은 아님)을 포함한다. 예를 들어, 변형은 당 업계에 널리 공지된 기술 예를 들어, 위치-배향 돌연변이 유발법으로써 도입되어, 새로운 제한 위치가 삽입되거나, 글리코실화 패턴이 변경되거나, 결합기(예를 들어, 페그화 또는 기타 컨쥬게이트화 용 결합기)가 도입 또는 제거되거나, 코돈 선호도가 변경되거나 스플라이싱 부위가 도입될 수 있다.

침묵 변이

유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 기능적으로 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정 폴리펩티드를 암호화하게 된다. 예를 들어, 이하 표(표 5a∼5b)에 나열된 코돈을 관찰하여 보면, 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG 및 CGU는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화함을 알 수 있다. 그러므로, 핵산 서열중 모든 위치 즉, 아르기닌이 코돈에 의해 특정되는 위치에서 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변경하지 않고 전술한 해당 코돈중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이체를 "침묵 변이체"라 한다. RNA 서열의 U는 DNA 서열의 T에 해당하는 것임을 이해해야 한다.

그러므로, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 다수의 핵산 서열이 생성될 수 있으며, 이들 중 일부는 본원에 명백하게 개시되어 있는 핵산 서열에 대한 최소의 서열 상동성을 보유할 수 있다는 사실은 당 업자에 의하여 이해될 것이다. 당 업자는 핵산내 각각의 코돈[AUG 및 UGC 제외(이들은 각각 메티오닌 및 트립토판에 대한 유일한 코돈임)]이 기능적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 표준 기술에 의해 변형될 수 있다는 사실을 알게 될 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 각 핵산의 침묵 변이는 임의의 개시된 서열내에 잠재되어 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 각각의, 그리고 모든 가능한 변이[가능한 코돈 선택에 바탕을 둔 조합을 선택함으로써 얻을 수 있는 변이]를 제공한다. 이러한 조합은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 응용될 수 있는, 표준 트리플릿(코돈) 유전자 암호(예를 들어, 표 5a∼5b에 제시된 것)에 따라서 이루어진다. 본원의 모든 핵산의 모든 변이는 특이적으로 제공되며, 유전자 암호와 함께 서열을 고려하여 기술될 수 있다. 당 업자는 본원에 나열된 서열의 임의의 침묵 치환을 발생시킬 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 사용

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다양한 용도 예를 들어, 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드 발현 벡터를 통상적으로 발현시킴으로써 본 발명의 폴리펩티드를 재조합 생산(즉, 발현)하는 경우; 치료제; 예방약; 진단 도구; 면역원; 애쥬반트; 상보성 또는 부분적으로 상보성인 핵산의 존재에 대한 진단 프로브(예를 들어, 야생형 인터페론-알파 핵산의 검출 포함); 추가의 반응 예를 들어, 신규 및/또는 개선된 변이체를 제조하기 위한 반복적 서열 재조합 반응 또는 돌연 변이 반응을 위한 기질로서의 용도 등을 갖는다.

벡터, 프로모터 및 발현 시스템

본 발명은 또한 상기 광범위하게 기술한 바와 같은 핵산 서열을 하나 이상 포함하는 재조합 구조물을 포함한다. 이 구조물은 본 발명의 핵산 서열이 전향 또는 역방향으로 삽입된 벡터 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 등을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 구조물은 추가로 조절 서열 예를 들어, 이 핵산 서열에 작동 가능하도록 연결된 프로모터를 포함한다. 다수의 적당한 벡터 및 프로모터로서는 당 업자에게 공지된 것들이 있으며, 이는 시판중에 있다.

본원에 유용한 분자생물학적 기술 예를 들어, 벡터 및 프로모터를 사용하는 기술 및 기타 다수의 관련 토픽을 다루는 일반적인 교과서로서는 문헌[Berger, (상동); Sambrook (1989), (상동) 및 Ausubel, (상동)]들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 상동성 핵산 제조를 위한 시험관내 증폭 방법을 통하여 당 업자가 충분히 실시할 수 있는 기술 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-레플리카제 증폭법 및 기타 RNA 중합효소 매개 기술(예를 들어, NASBA)에 관하여는 문헌[Berger, Sambrook 및 Ausubel, (상동) 및 Mullis외 다수(1987) 미국 특허 제4,683,202 호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis외 다수, eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (October 1,1990) C&EN 36∼47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81∼94; (Kwoh외 다수 (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1173∼1177; Guatelli외 다수 (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1874∼1878; Lomeli외 다수(1989) J Clin Chem 35: 1826∼1831; Landegren외 다수 (1988) Science 241: 1077∼1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291∼294; Wu 및 Wallace (1989) Gene 4: 560∼569; Barringer외 다수 (1990) Gene 89: 117∼122 및 Sooknanan 및 Malek (1995) Biotechnology 13:563∼564]에 개시되어 있다. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 개선된 방법에 관하여는 문헌[Wallace외 다수, 미국 특허 제 5,426,039 호]에 기술되어 있다. PCR에 의해 큰 핵산을 증폭시키는 개선된 방법[40 킬로베이스(Kb) 이하로 이루어진 PCR 앰플리콘이 생성됨]에 관하여는 문헌[Cheng외 다수(1994) Nature 369: 684∼685] 및 여기에 인용된 참고 문헌에 요약되어 있다. 당 업자는 본질적으로 임의의 RNA는 제한 절단, 역전사 효소 및 중합효소를 사용하는 PCR 증폭 및 서열 결정에 적당한 이중 사슬 DNA로 전환될 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 문헌[Ausubel, Sambrook 및 Berger, (상동)]을 참조하시오.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질 도입된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 숙주 세포는 본 발명의 벡터 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 사용하여 유전적으로 조작(예를 들어, 형질 도입, 형질 전환 또는 형질 감염)된다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 유전자를 증폭시키는데 적당하게 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 배양 조건 예를 들어, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있으며, 이는 본원에 인용된 참고 문헌 예를 들어, 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York ] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌, 그리고 당 업계의 숙련자에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 비 동물 세포 예를 들어, 식물, 효모, 곰팡이 및 박테리아 등에서 제조될 수 있다. 문헌[Sambrook, Berger 및 Ausubel]에 더하여, 세포 배양에 관한 상세한 설명은 문헌[Payne외 다수(1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg NY); Atlas & Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편은 폴리펩티드 발현용인 다수의 발현 벡터 중 임의의 것에 포함될 수 있다. 이러한 벡터로서는 염색체, 비 염색체 및 합성 DNA 서열 예를 들어, SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파아지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파아지 DNA의 조합체로부터 유래된 벡터, 바이러스 DNA 예를 들어, 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 광견병 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스 등을 포함한다. 세포에 유전 물질을 형질 도입시키는 임의의 벡터, 그리고 복제를 원하는 경우, 관련 숙주내에서 복제 가능하고 생존할 수 있는 벡터가 사용될 수 있다.

발현 벡터 내 핵산 서열은 적당한 전사 조절 서열(프로모터)에 작동 가능하도록 연결되어 mRNA 합성을 유도한다. 이러한 프로모터의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이 lac 또는 trp 프로모터, 파아지 람다 P_L 프로모터, CMV 프로모터, 및 기타 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스내에서 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 프로모터. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위와 전사 종결자를 포함하기도 한다. 벡터는 임의로 발현을 증가시키는데 적당한 서열 예를 들어, 인핸서를 포함한다. 뿐만 아니라, 발현 벡터는 임의로 하나 이상의 선별 가능한 마커 유전자를 포함하는데, 여기서 상기 마커 유전자는 형질 전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특징 예를 들어, 진핵 세포 배양시에는 디하이드로폴레이트 환원 효소 내성 또는 네오마이신 내성, 예를 들어, 이. 콜라이에서는 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 적당한 DNA 서열, 적당한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터는 숙주가 폴리펩티드를 발현할 수 있도록 적당한 숙주를 형질 전환시키는데 사용될 수 있다. 적당한 발현 숙주의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: 박테리아 세포 예를 들어, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium); 곰팡이 세포 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애, 피차 파스토리스 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 곤충 세포 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 포유 동물 세포 예를 들어, CHO, COS, BHK, HEK 293 또는 보위 흑색종(Bowes melanoma); 식물 세포 등. 모든 세포 또는 세포주가 전체가 기능성인 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 생산할 수 있어야 하는 것은 아니며: 예를 들어, 박테리아 또는 기타 발현 시스템 내에서는 폴리펩티드의 항원성 단편이 생산될 수 있다. 본 발명은 사용된 숙주 세포에 한정되는 것은 아니다.

박테리아 시스템에서, 폴리펩티드 또는 이의 단편용으로 사용되는지 여부에 따라서 다수의 발현 벡터가 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 폴리펩티드 또는 이의 단편이 항체 유도용으로 필요한 때, 용이하게 정제되는 융합 단백질을 고도로 발현시키는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로서는 다기능 이. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터 예를 들어, BLUESCRIPT(Stratagene)[여기에서는, 뉴클레오티드 암호화 서열이 벡터의 틀 내에 아미노 말단 Met 및 베타-갈락토시다제의 7개의 후속 잔기서열과 함께 결찰되어 잡종 단백질이 생산됨]; pIN 벡터(Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264: 5503∼5509); pET 벡터(Novagen, Madison WI) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이와 유사하게, 효모인 사카로마이세스 세레비지애에서는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위하여 구성적 또는 유도적 프로모터 예를 들어, 알파 인자, 알콜 산화 효소 및 PGH를 함유하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다. 문헌[Ausubel, (상동), Berger, (상동) 및 Grant외 다수 (1987) Methods in Enzymology 153:516∼544]을 참고하시오.

포유 동물 숙주 세포에서, 다수의 발현 시스템 예를 들어, 바이러스계 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용될 경우, 암호화 서열은 임의로 말기 프로모터(late promoter) 및 3 원성 리더 서열(tripartite leader sequence)로 이루어진 아데노바이러스 전사/번역 복합체에 결찰될 수 있다. 바이러스 게놈의 불필수 E1 또는 E3 영역에 삽입된 결과, 감염된 숙주 세포 내에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 생존 바이러스가 생산된다[Logan and Shenk(1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655∼3659]. 뿐만 아니라, 포유 동물 숙주 세포내 발현을 증가시키기 위하여 전사 인핸서 예를 들어, 루 육종 바이러스(RSV) 인핸서가 사용된다. 숙주 세포, 배지, 발현 시스템 및 이의 제조 방법은 다양한 포유 동물 인터페론-알파(예를 들어, 인간 인터페론-알파)의 클로닝 및 발현용으로 공지된 것들을 포함한다.

부가의 발현 인핸서

특이적 개시 시그널은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열 및/또는 이의 단편을 효과적으로 번역하는 것을 원조할 수 있다. 이러한 시그널로서는 예를 들어, ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함할 수 있다. 암호화 서열, 이의 개시 코돈 및 상류 서열이 적당한 발현 벡터내에 삽입될 경우, 어떠한 부가 번역 조절 시그널도 필요하지 않다. 그러나, 오로지 암호화 서열(예를 들어, 성숙 단백질 암호화 서열) 또는 이의 일부가 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 핵산 전사 조절 시그널이 제공되어야 한다. 뿐만 아니라, 개시 코돈은 전체 삽입물의 전사를 확정하기 위하여 올바른 해독틀 내에 존재하여야 한다. 외인성 전사 인자 및 개시 코돈은 다양한 근원 즉, 천연 또는 합성 근원으로부터 얻을 수 있다. 발현 효율은 사용하기에 적합한 세포 시스템에 인핸서를 도입시켜 증가시킬 수 있다[예를 들어, Scharf D.외 다수 (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125∼62; 및 Bittner외 다수 (1987) Methods in Enzymol 153:516∼544)].

분비/ 국소화 서열

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 틀 내에서 분비/국소화 서열을 암호화하는 핵산에 융합되어, 원하는 세포 구획, 막 또는 기관으로의 폴리펩티드 발현을 표적화하거나, 또는 막간 공간이나 세포 배양 배지로의 분비를 유도할 수 있다. 이러한 서열은 당 업자에게 공지되어 있으며, 분비 리더 또는 시그널 펩티드, 기관 표적화 서열(예를 들어, 핵내 국소화 서열, ER 체류 시그널, 미토콘드리아 운반 서열, 염색체 운반 서열), 막 국소화/앵커 서열(예를 들어, 종결 이전 서열, GPI 앵커 서열) 등을 포함한다.

발현 숙주

추가의 양상에서, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산, 벡터 또는 기타 구조물 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 진핵 세포 예를 들어, 포유 동물 세포, 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있거나, 또는 상기 숙주 세포는 원핵 세포 예를 들어, 박테리아 세포일 수 있다. 상기 구조물을 숙주 세포에 도입시키는 것은 생체내, 생체외 또는 시험관내 방법에 있어서 칼슘 포스페이트 형질 감염, DEAE-덱스트란 매개 형질 감염, 전기 천공법, 유전자 또는 백신 총, 주입 또는 기타 통상의 기술에 의해 수행될 수 있다[예를 들어, Davis, L., Dibner, M., and Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biology].

숙주 세포 변종은 임의로 그의 삽입 서열의 발현을 조절하는 능력, 또는 바람직한 방식으로 발현된 단백질을 가공하는 능력에 대해서 선택된다. 이러한 단백질의 변형 방법으로서는 아세틸화, 카복실화, 글리코실화, 인산화, 지방화 및 아실화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질의 "전구" 또는 "프리프로" 형태를 절단하는 번역 후 가공은 또한 올바른 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 위해 중요할 수도 있다. 상이한 숙주 세포 예를 들어, 이. 콜라이, 바실러스 속(Bacillus sp.), 효모 또는 포유 동물 세포 예를 들어, CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK293, WI38 등은 이러한 사후 번역 활성에 대한 특이적인 세포 기구 및 특징적인 기작을 가지며, 도입된 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공이 확인되도록 선택될 수 있다.

안정한 발현법은 재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산에 이용될 수 있다. 예를 들어, 안정하게 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포주는, 복제의 바이러스 기원 또는 내인성 발현 인자 및 선별 가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 형질 도입될 수 있다. 벡터를 도입시킨 후, 세포가 선별 배지에 대해 스위칭(switching)되기 이전에 세포를 1∼2일 동안 부영양 배지에서 생장시킬 수 있다. 선별 가능한 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이며, 이 마커의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 성장 및 회수를 가능하게 만든다. 예를 들어, 안정하게 형질 전환된 세포의 내성 군집은 그 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 통해 증식될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질 전환된 숙주 세포는 세포 배양액으로부터 얻은 암호화 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건하에서 배양될 수도 있다. 재조합 세포에 의해 제조된 폴리펩티드는 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라서 분비, 막 결합 또는 세포내 포함될 수 있다. 당 업자에 의해 이해될 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포의 막을 통해 성숙한 폴리펩티드를 분비시키는 시그널 서열로써 디자인될 수 있다.

부가 서열

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 임의로 틀 내에서 마커 서열과 융합된 암호화 서열을 포함하며, 여기서 상기 마커 서열은 예를 들어, 암호화된 폴리펩티드의 정제 및/또는 검출을 도와 준다. 이러한 정제용 종속 서열로서는 고정화된 금속상에서 정제를 가능하게 하는 금속 킬레이트화 펩티드 예를 들어, 히스티딘∼트립토판 모듈, 글루타치온에 결합하는 서열(예를 들어, GST), 헤마글루티닌(HA) 태그[인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응; Wilson,I.외 다수(1984) Cell 37:767)], 말토스 결합 단백질 서열, FLAG 연장/친화도 정제 시스템에 이용되는 FLAG 에피토프 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로테아제∼절단 가능한 폴리펩티드 링커 서열을 정제 도메인 및 폴리펩티드 서열 사이에 도입시키는 것은 정제를 촉진하는 데에 유용하다.

예를 들어, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 하나의 발현 벡터는 엔테로키나제 절단 부위에 의해 구분된 폴리히스티딘 영역에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 위하여 제공된다. 히스티딘 잔기는 IMIAC(고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피; Porath외 다수(1992) Protein Expression and Purification 3: 263∼281)을 바탕으로 하는 정제 방법을 촉진하는데, 여기서 상기 엔테로키나제 절단 부위는 폴리히스티딘 영역으로부터 유래되는 목적 폴리펩티드를 분리시키는 방법을 제공한다. pGEX 벡터(Promega; Madison,WI)는 글루타치온 S-전이 효소(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 리간드-아가로스 비드에의 흡착[예를 들어, GST-융합의 경우 글루타치온-아가로스] 후, 유리 리간드의 존재하에서 용리시킴으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법에 있어서 부가 구조물은 단백질 및 이를 암호화하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 단백질은 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이 Ig 분자 예를 들어, 인간 IgG Fc("결정화 가능한 단편" 또는 결합 보체 단편) 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인(및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)에 융합된 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 하나 이상의 단편)을 포함한다. Fc는 세포상 항체 수용부 및 보체의 C1q 성분에 결합하는 데에 관여하는 항체의 일부이다. 이러한 융합 단백질 또는 이의 단편, 그리고 이를 암호화하는 핵산은 예방약 및/또는 치료약 또는 진단 도구로서 유용할 수도 있다[예를 들어, Challita-Eid, P.외 다수(1998) J Immunol 160:3419∼3426; Sturmhoefel, K.외 다수(1999) Cancer Res 59:4964∼4972].

폴리펩티드 생산 및 회수

적당한 숙주 변종으로의 형질 도입 및 이 숙주 변종을 적당한 세포 밀도가 될때까지 성장시킨 후, 선별된 프로모터를 적당한 방법(예를 들어, 온도 변화 또는 화학 유도)에 의하여 유도시키고, 세포를 추가로 더 배양한다. 세포는 통상적으로 원심 분리에 의해 수득되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되며, 그 결과 추가의 정제를 위한 가공되지 않은 추출물이 얻어진다. 단백질 발현에 사용된 진핵 세포 또는 미생물 세포는 임의의 편리한 방법 예를 들어, 냉동-해동 순환법, 초음파 분해법, 기계적 분쇄법 또는 세포 용해제를 사용하는 방법, 또는 당 업자에게 널리 공지된 기타의 방법에 의해 분쇄될 수 있다.

이미 밝힌 바 있듯이, 다수의 참고 문헌내 기술들이 다수의 세포 예를 들어, 박테리아, 식물, 동물(특히 포유 동물) 및 원시 박테리아 기원 세포를 배양 및 생산하는데 유용하다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Ausubel, and Berger (상동) 및, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York 및 여기에 인용되어 있는 참고 문헌; Doyle and Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W. H. Freeman and Company; 및 Ricciardelli외 다수 (1989) In vitro Cell Dev Biol 25:1016∼1024]을 참고하시오. 식물 세포 배양 및 재생에 관하여는 예를 들어, 문헌[Payne외 다수 (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 및 Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6]을 참고하시오. 일반적으로 세포 배양 배지에 관하여는 문헌[Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]에 개시되어 있다. 세포 배양에 관한 부가 정보는 시판중인 문헌[예들어, Life Science Research Cell Culture Catalogue; Sigma∼Aldrich, Inc(St Louis, MO) ("Sigma-LSRCCC") 및 예를 들어, Plant Culture Catalogue and supplement; Sigma-Aldrich, Inc(St Louis, MO) ("Sigma-PCCS")]에 개시되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 당 업계에 널리 알려진 다수의 방법 중 임의의 방법으로 재조합 세포 배양액으로부터 회수 및 정제될 수 있으며, 이때 상기 방법으로서는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 본원에 제시된 태깅 시스템 중 임의의 것을 사용하는 방법), 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한다. 단백질 재폴딩 단계는 성숙한 단백질 또는 이의 단편의 구성을 완결시키는데에 사용될 수 있다. 마지막으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에 사용될 수 있다. 상기 "상동"이라고 나타낸 참고 문헌들 이외에, 다수의 정제 방법에 관하여도 당 업계에 널리 공지되어 있는데, 예를 들어, 문헌[Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag외 다수(1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ]에 개시되어 있다.

시험관내 발현 시스템

세포 유리 전사/번역 시스템은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데에도 사용될 수 있다. 이러한 시스템중 일부는 시판중에 있다. 시험관내 전사 및 번역 방법에 관한 일반적인 지침은 문헌[Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volume 37, Garland Publishing, NY]에 개시되어 있다.

생체내 용도 및 사용 분야

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이 폴리뉴클레오티드의 상보체(예를 들어, 안티센스 또는 리보자임 분자)는 임의로 세포에 투여되어 치료학적으로 유용한 방법을 수행할 수 있거나, 또는 치료학적으로 유용한 생산물을 발현시킬 수 있다. 이와 같은 생체내 사용 예를 들어, 유전자 치료에는 세포내에서 유전자 발현을 변경시킬 수 있는 다수의 기술을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 치료학적 및/또는 예방학적으로 유용한 폴리펩티드 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위해 유전자를 도입하는 것을 포함한다.

생체내 폴리펩티드 발현

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특히 당 업자에게 널리 공지된 기술을 사용하는 생체내 치료용으로 유용하다. 예를 들어, 배양된 세포는 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA) 및/또는 예를 들어, 하나 이상의 항원, 사이토카인, 기타 보조 자극 분자, 애쥬반트 등을 암호화하는 기타 폴리뉴클레오티드 서열로 세포외에서 조작되고, 이후 상기 조작된 세포는 환자에게 투여된다. 세포는 또한 하나 이상의 폴리펩티드 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항원 펩티드를 생체내에서 발현시키기 위해 생체내에서 조작될 수 있다.

생체내 유기체 형질 도입 및 발현에 적당한 다수의 바이러스 벡터가 공지되어 있다. 이러한 벡터로서는 레트로바이러스 벡터[예를 들어, Miller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158:1∼24; Salmons and Gunzburg (1993) Human Gene Therapy 4:129∼141; Miller외 다수 (1994) Methods in Enzymology 217: 581∼599) 참조] 및 아데노-관련 벡터[Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3:533∼539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158: 97∼129 참조]를 포함한다. 사용되는 기타 바이러스 벡터로서는 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 신드비스 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로 이 벡터들에 관하여는 문헌[예를 들어, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Latchman(1994) Molec Biotechnol 2:179-195; 및 Johanning외 다수(1995) Nucl Acids Res 23:1495-1501]에 개시되어 있다.

하나의 측면에서, 천연두 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이 천연두 바이러스 벡터는 본 발명의 폴리펩티드 예를 들어, eIL-2 폴리펩티드를 암호 들어, 화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질 감염되며, 이는 면역 반응 강화시 예를 들어, T 세포 증식 강화 또는 개선이 바람직할 경우, 예방, 치료 및 진단용으로서 유용하다. 바이러스 벡터에 관하여는 문헌[예를 들어, Berencsi외 다수, J Infect Dis (2001)183(8):1171∼9; Rosenwirth외 다수, Vaccine 2001 Feb 8;19(13∼14):1661∼70; Kittlesen외 다수 , J Immunol (2000) 164(8):4204∼11; Brown외 다수 Gene Ther 2000 7(19): 1680∼9; Kanesa-thasan외 다수, Vaccine (2000) 19(4∼5):483∼91; Sten (2000) Drug 60(2):249∼71]에 기술되어 있다. 이러한 벡터 및 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물은 또한 본 발명의 양상을 이룬다.

유전자 치료 및 유전자 백신은 만성 감염성 질병(예를 들어, HIV 감염, 바이러스성 간염), 그리고 비감염성 질병 예를 들어, 암과 선천적인 결함 예를 들어, 효소 결핍증 중 일부 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 세포와 함께 사용될 수 있다. 핵산 및 벡터를 세포에 생체내, 생체외 및 시험관내 방식으로 도입하는 몇몇 방법들이 사용되고 있으며, 이러한 방법들은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에도 사용될 수 있다. 이러한 방법으로서는 리포좀계 유전자 전달 방법[Debs and Zhu (1993) WO 93/24640 및 미국 특허 제5,641,662 호; Mannino and Gould∼Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682∼691; 미국 특허 제 5,279,833 호(Rose); Brigham (1991) WO 91/06309; 및 Felgner외 다수(1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7413∼7414; Brigham외 다수(1989) Am J Med Sci 298: 278∼281; Nabel외 다수(1990) Science 249:1285∼1288; Hazinski외 다수(1991) Am J Resp Cell Molec Biol 4: 206∼209; 및 Wang and Huang (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 7851∼7855)]; 예를 들어, 암을 치료하기 위한 아데노바이러스 벡터 매개 유전자 전달 방법[예를 들어, Chen외 다수(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3054∼3057; Tong외 다수(1996) Gynecol Oncol 61:175∼179; Clayman외 다수(1995) Cancer Res. 5:1∼6; O'Malley외 다수(1995) Cancer Res 55:1080∼1085; Hwang외 다수(1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13:7∼16; Haddada외 다수(1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt.3):297∼306; Addison외 다수(1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8522∼8526; Colak외 다수(1995) Brain Res 691: 76∼82; Crystal (1995) Science 270: 404∼410; Elshami외 다수(1996) Human Gene Ther 7:141∼148; Vincent외 다수 (1996) J Neurosurg 85:648∼654)] 및 기타 다수의 방법을 포함한다. 치료적 폴리뉴클레오티드 서열을 레트로바이러스 게놈의 일부로서 보유하고 있는 복제∼결함 레트로바이러스 벡터는 또한 간단한 MuLV 벡터와 관련하여 사용되고 있다. 예를 들어, 문헌[Miller외 다수(1990) Mol Cell Biol 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4:43 및 Cornetta외 다수(1991) Hum Gene Ther 2:215)]을 참고하시오. 리간드 특이적으로 커플링된 핵산 운반 시스템, 양이온계 핵산 운반 시스템(Wu 및 Wu(1988)J Biol Chem, 263:14621∼14624)도 사용될 수 있다. 네이키드 DNA(naked DNA) 발현 벡터 또한 문헌[Nabel외 다수(1990), 상동); Wolff외 다수(1990) Science, 247: 1465∼1468]에 개시되어 있다. 일반적으로, 이러한 방법들은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 적당한 벡터에 도입함으로써 본 발명에 적용될 수 있다.

본 발명의 핵산을 환자에 도입시킴으로써 본 발명에 적용 가능한 유전자 치료 방법에 관하여 기술되어 있는 일반적인 문헌으로서는 문헌[Robbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, NJ, 및 Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England]을 포함한다.

안티센스 기술

유전자 치환 핵산과 같이 본 발명의 핵산을 발현시키는 것 이외에, 핵산의 발현이 세포내에서 더 이상 바람직하지 않을 때(또는 일단 그와 같이 되면), 핵산은 또한 예를 들어, 본 발명의 핵산 발현을 감소 조절하기 위한 발현의 센스 및 안티센스 억제에도 유용하다. 이와 유사하게, 본 발명의 핵산 또는 이의 종속 서열 또는 안티센스 서열은 또한 천연 생성되는 상동성 핵산의 발현을 차단시키는 데에 사용될 수도 있다. 다수의 센스 및 안티센스 기술이 당 업계에 공지되어 있는데 예를 들어, 문헌[Lichtenstein and Nellen (1997) Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press at Oxford University, Oxford, England, 및 Agrawal (1996) Antisense Therapeutics Humana Press, NJ] 및 이 문헌에 인용되어 있는 참고 문헌에 공지되어 있다.

프로브로서의 사용

통상적으로 12개 이상 바람직하게는, 15개 이상 더욱 바람직하게는, 20개 이상, 30개 이상 또는 50개 이상의 염기를 보유하는 폴리뉴클레오티드(본원에서는 올리고뉴클레오티드라고도 칭함)의 사용도 고려해 볼 수 있으며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 고도로 엄중한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 혼성화된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 방법에 따라서 프로브, 프라이머, 센스 및 안티센스 제제 등으로서 사용될 수 있다.

핵산 혼성화

핵산은 통상적으로 용액 중에서 결합시 "혼성화"된다. 핵산은 다수의 널리 특성 규명된 물리화학적 힘 예를 들어, 수소 결합, 용매 배제, 염기 축적 등에 의해서 혼성화된다. 핵산 혼성화에 대한 충분한 지침은 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, " (Elsevier, New York) (이하 "Tjissen") 및 Ausubel(상동) Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 1) and Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2)]에 개시되어 있으며, 이 문헌에는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 DNA 및 RNA의 합성, 표지화, 검출 및 정량에 대하여 상세히 기술되어 있다.

2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 지표는 2개의 분자가 최소한 엄중한 조건하에서 서로 혼성화되는 점이다. "...에 특이적으로 혼성화된다"라는 표현은 분자가 특정 뉴클레오티드 서열이 복합 혼합물(예를 들어, 총 세포 DNA 또는 RNA)중에 존재하는 때 엄중한 조건하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합, 이중체 형성 또는 혼성화됨을 의미한다. "실질적으로 결합한다"는 용어는 프로브 핵산 및 표적 핵산 사이의 상보적 혼성화를 의미하며, 이는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 바람직하게 검출할 수 있는 혼성화 배지의 엄중도를 감소시킴으로써 미스 매치를 최소화시킬 수 있다.

핵산 혼성화 실험 예를 들어, 서던 및 노던 혼성화에 있어서 "엄중한 혼성화 세척 조건(stringent hybridization wash condition)" 및 "엄중한 혼성화 조건(stringent hybridization condition)"은 상이한 환경 매개 변수에 따라 달라지며, 또한 이에 따라 상이하게 되는 서열을 의미한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌[Tijssen (1993)(상동) 및 Hames and Higgins 1 및 Hames and Higgins 2, (상동)]에 개시되어 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 일반적으로 "고도로 엄중한" 혼성화 및 세척 조건은 특정의 이온 세기 및 pH에서 특이 서열에 대한 용융점(T_m)보다 낮은, 약 5℃ 이하로 맞출수 있다[이하 기술된 바와 같이, 고도로 엄중한 조건은 비교적 용어로서도 언급될 수 있다]. 상기 T_m은 (특정 이온 세기 및 pH하에서) 완전히 매치된 프로브에 시험 서열의 50%가 혼성화되는 온도이다. 다시 말하면, 상기 T_m은 소정의 조건하에서 핵산 서열 이중체가 50% 변성되는 온도를 나타내는 것으로서, 핵산 혼성체의 안정성에 대한 직접적 측정 수단이 된다. 그러므로, 상기 T_m은 이중 나선 구조에서 랜덤한 코일의 형태로 전이되는 중간 시점에 해당하는 온도로서; 이는 뉴클레오티드의 긴 연장부의 길이, 뉴클레오티드 조성 및 이온 세기에 따라서 달라진다. 통상적으로 "엄중한 조건"하에서, 이 프로브는 그의 표적 종속 서열에 혼성화될 것이지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않을 것이다. "매우 엄중한 조건"은 특정 프로브에 대한 T_m과 동일하도록 선택된다.

혼성화 이후, 혼성화되지 않은 핵산 물질은 연속 세척에 의해 제거될 수 있으며, 이의 엄중도는 목적으로 하는 결과에 따라서 조정할 수 있다. 낮은 엄중도 세척 조건(예를 들어, 고농도 염 및 저온)에서는 감수성은 증가하지만, 비특이적 혼성화 시그널과 고도의 백그라운드 시그널을 발생시킬 수 있다. 높은 엄중도 조건(예를 들어, 저농도 염 및 혼성화 온도에 근접한 고온)은 통상적으로 특이적 시그널만을 유지시키는 경우에 백그라운드 시그널을 낮춘다. 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고 문헌으로 인용되어 있는 문헌[Rapley, R. and Walker, J. M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998) (이하 "Rapley and Walker")]을 참고하시오.

DNA-RNA 이중체의 T_m은 이하 등식 (1)을 사용하여 계산할 수 있다:

T_m(℃) = 81.5℃ + 16.6(log₁₀M) + 0.41(% G + C) - O.72(%f) - 500/n

[상기 식 중, M은 1가 양이온(일반적으로 Na+)의 몰농도이고, (%G+C)는 구아노신(G) 및 시토신(C) 뉴클레오티드의 %를 나타내는 것이며, (%f)는 형식화 %이며, n은 혼성체의 뉴클레오티드 염기 수(즉, 길이)를 나타낸다]

예를 들어, 문헌[Rapley and Walker, 상동]을 참고하시오.

RNA-DNA 이중체의 T_m은 이하 등식 (2)를 사용하여 계산할 수 있다:

T_m(℃) = 79.8℃ + 18.5(log₁₀M) + 0.58 (%G + C)- 11.8(%G + C)² - 0.56 (%f) - 820/n

[상기 식 중, M은 1가 양이온(일반적으로 Na⁺)의 몰농도이고, (%G+C)는 구아노신(G) 및 시토신(C) 뉴클레오티드의 %를 나타내는 것이며, (%f)는 포름아미드 %이며, n은 혼성체의 뉴클레오티드 염기 수(즉, 길이)를 나타낸다]

상기 등식 1 및 2는 통상적으로 혼성 이중체가 약 100∼200 뉴클레오티드보다 긴 경우에만 정확하다.

50개의 뉴클레오티드보다 짧은 핵산 서열의 T_m은 다음과 같이 계산할 수 있다:

T_m(℃) = 4(G + C) + 2(A + T),

[상기 식 중, A(아데닌), C, T(티민) 및 G는 상응하는 뉴클레오티드의 수임]

서던 블럿 또는 노던 블럿시 100개 이상의 상보성 잔기를 보유하는 상보성 핵산의 필터상에서의 혼성화를 위한 엄중한 혼성화 조건의 일례는, 50% 포르말린(또는 포름아미드) 및 1 ㎎ 헤파린 존재하에 42℃에서 밤새도록 혼성화를 수행하는 것이다. 엄중한 세척 조건의 일례는, 0.2 × SSC 세척액 존재하에 65℃에서 15분 동안 수행하는 것이다[Sambrook(상동)의 SSC 완충액에 관한 설명 참조]. 종종 저 엄중도 세척으로 백그라운드 프로브 시그널을 없앰으로써 고도의 엄중도 세척이 수행된다. 저 엄중도 세척의 일례는, 2 × SSC 세척액 존재하에 40℃에서 15분 동안 수행하는 것이다. 고도로 엄중한 세척 조건의 일례는, 0.15M NaCl의 존재하에, 72℃에서 약 15분 동안 수행하는 것이다. 예를 들어, 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체의 중간 정도의 엄중도 세척의 일례는 1 × SSC의 존재하에, 45℃에서 15분 동안 수행하는 것이다. 예를 들어, 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체의 저 엄중도 세척의 일례는 4∼6 × SSC의 존재하에, 40℃에서 15분 동안 수행하는 것이다. 짧은 프로브(예를 들어, 약 10∼50개의 뉴클레오티드)에 있어서, 엄중한 조건은 통상적으로 염 농도가 약 1.0 M 미만의 Na⁺ 이온이고, 통상적으로는 이온 농도(또는 기타 염 농도)가 약 0.01∼1.0 M Na⁺이고, pH는 7.0∼8.3이며, 온도는 통상적으로 약 30℃ 이상이다. 엄중한 조건은 또한 탈염제 예를 들어, 포름아미드를 첨가함으로써 얻어질 수도 있다.

일반적으로, 시그널 대 잡음비(signal to noise ratio)는 특정 혼성화 검정법에서 관련 없는 프로브에서 관찰되는 시그널 대 잡음비보다 2배 또는 2.5배 내지 5배(또는 그 이상) 높은데, 이는 특이적 혼성화가 검출됨을 시사하는 것이다. 본 발명의 내용 중 2개의 서열 사이에서 일어나는 최소한으로 엄중한 혼성화(at least stringent hybridization)의 검출을 통하여, 예를 들어, 본원의 서열 목록에 제공된 본 발명의 핵산에 대한 구조적 유사성 또는 상동성이 비교적 크다는 사실을 알 수 있다.

"고도로 엄중한" 조건은 특정 이온 세기 및 pH에서 특이적 서열에 대한 용융점(T_m)보다 낮거나 또는 약 5℃가 되도록 선택된다. 목적 뉴클레오티드 서열과 밀접한 관련이 있거나 또는 동일한 표적 서열(예를 들어, 프로브)은 고도로 엄중한 조건하에서 동정될 수 있다. 저 엄중도 조건은 상보성이 떨어지는 서열에 적당하다. 예를 들어, 문헌[Rapley and Walker; Sambrook, 상동]을 참고하시오.

본 발명의 핵산을 동정하는데에는 비교 혼성화가 수행될 수 있으며, 이 비교 혼성화 방법은 본 발명의 핵산을 구별하는 바람직한 방법이 된다. 본 발명의 내용중 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 고도로 엄중한 혼성화의 검출 결과는 예를 들어, 본원의 서열 목록에 제공된 핵산에 대하여 비교적 강한 구조적 유사성/상동성이 있음을 나타낸다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 고도로 엄중한 혼성화를 통하여 구조의 유사성 또는 상동성, 뉴클레오티드 염기 조성, 배열 또는 순서가 엄중한 혼성화 조건에 의해 검출되는 것보다 크다는 사실을 알 수 있다. 특히, 본 발명의 내용 중 고도로 엄중한 혼성화의 검출로써 예를 들어, 본원의 서열 목록에 제공된 핵산에 대하여 구조적 유사성 또는 구조적 상동성(예를 들어, 뉴클레오티드 구조, 염기 조성, 배열 또는 순서)이 강함을 알 수 있다. 예를 들어, 엄중한 조건하에서 본원의 대표적인 핵산에 혼성화되는 시험 핵산을 동정하는 것이 바람직하다.

그러므로, 엄중한 혼성화의 측정 기준은, 고도로 엄중한 조건(또는 매우 엄중한 조건, 또는 그보다 더욱 엄중한 혼성화 조건, 또는 그보다 더더욱 엄중한 혼성화 조건)하에서 본 발명에 나열된 핵산(예를 들어, 서열 번호 59∼88의 핵산 서열 및 이의 상보성 폴리뉴클레오티드 서열) 중 하나에 혼성화되는 능력이다. 엄중한 혼성화(예를 들어, 고도로 엄중한, 그보다 더욱 엄중한 또는 그보다 더더욱 엄중한 혼성화 조건) 및 세척 조건은 임의의 시험 핵산에 대해서 실험적으로 용이하게 결정할 수 있다.

예를 들어, 고도로 엄중한 혼성화 및 세척 조건을 결정하는데 있어서, 혼성화 및 세척 조건은 [예를 들어, 혼성화 또는 세척중에 온도를 높이거나, 염 농도를 감소시키거나, 세제 농도를 높이고/높이거나 유기 용매 예를 들어, 포르말린의 농도를 높이거나 함으로써] 선택된 기준 세트에 부합하게 될 때까지 점차적으로 그 정도를 높여간다. 예를 들어, 혼성화 및 세척 조건은 서열 번호 59∼88로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 프로브와 이의 상보성 폴리뉴클레오티드 서열이 이것들과 완전하게 매치되는 상보성 표적(즉, 서열 번호 59∼88로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열과 이의 상보성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)에 결합할 때까지, 혼성화 및 세척 조건은 그 정도가 점진적으로 증가하는데, 이때 시그널 대 잡음비는 매치되지 않는 표적에 프로브가 혼성화될 때 관찰되는 것보다 2.5배 이상높고, 임의로는 5배 이상 높다. 이러한 경우, 매치되지 않는 표적은 예를 들어, 공지의 인터페론-알파 핵산 서열[예를 들어, 본원이 출원될 당시에 공용인 데이터베이스 예를 들어, GeneBank 또는 GENESEQ에 있는 인터페론-알파 핵산 서열]에 상응하는 핵산이다.

시험 핵산은 그것의 2분의 1 이상이 프로브 및 완전히 매치되는 상보성 표적에 혼성화될 때 프로브 핵산에 특이적으로 혼성화되는 것으로 파악되는데, 즉, 시그널 대 잡음비가 특정 조건 즉, 완전히 매치되는 프로브가 완전히 매치되는 상보성 표적에 시그널 대 잡음비 약 2.5배∼10배 이상 통상적으로, 5배∼10배로 결합하는 조건 하에서 표적에 프로브가 혼성화될 때의 2분의 1 이상일 때 프로브 핵산에 특이적으로 혼성화되는 것이며, 여기서 상기 시그널 대 잡음비는 매치되지 않는 표적 핵산 예를 들어, 상기 제시된 공지의 인터페론-알파 핵산 서열중 임의의 것에 혼성화될 때 관찰되는 것에 비한 것이다. 이러한 핵산들중 일부에 있어서, 엄중한 조건은, 암호화 올리고뉴클레오티드에 대하여 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드가, 상기 암호화 올리고뉴클레오티드에 시그널 대 잡음비가 상기 제시한 공지의 인터페론-알파 서열에 상응하는 조절 핵산에 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드의 혼성화의 경우보다 약 5배 이상이 되도록 암호화 올리고뉴클레오티드에 혼성화되도록 선택된다.

보다 높은 엄중도 혼성화 및 세척 조건은, 완전하게 매치되는 상보성 표적 핵산에 프로브가 결합하기 위한 시그널 대 잡음비가, 매치되지 않는 표적 핵산 예를 들어, 상기 제시한 공지의 인터페론-알파 핵산 서열중 임의의 것에 혼성화될 때 관찰되는 경우보다 10배 이상이 될 때까지 혼성화 및 세척 조건의 엄중도가 증가하게 되는 조건을 말한다. 그러한 조건하에서 프로브에 혼성화되는 표적 핵산은 보다 높은 엄중도 조건하에서 시그널 대 잡음비가 완전히 매치되는 상보성 표적 핵산의 그것에 비하여 2분의 1 이상이 되도록 프로브에 결합하는 것으로 파악된다.

이와 유사하게, 더욱 높은 수준의 엄중도는 관련 혼성화 검정법의 혼성화 및/또는 세척 조건을 점진적으로 강화시킴으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 및 세척 조건의 엄중도는 완전히 매치되는 상보적 표적 핵산에 프로브가 결합하기 위한 시그널 대 잡음비가 매치되지 않는 표적 핵산 예를 들어, 상기 제시된 공지의 인터페론-알파 핵산 서열 중 임의의 것에 혼성화되는 때 관찰되는 것보다 10배, 20배, 50배, 100배 또는 500배 이상이 될 때까지 증가된다. 이러한 조건하에서 프로브에 시그널 대 잡음비가 완전히 매치되는 상보성 표적 핵산의 2분의 1 이상으로 혼성화되는 표적 핵산은 더더욱 고도의 엄중도 조건하에서 프로브에 결합하는 것으로 파악된다.

고도, 더욱 고도 및 더더욱 고도의 엄중도 조건하에서 서열 번호 59∼88에 나타낸 하나 이상의 핵산에 혼성화되는 표적 핵산은 본 발명의 양상이다. 이러한 핵산의 예로서는 소정의 핵산 서열에 비하여 하나 또는 소수의 침묵 또는 보존적 핵산 치환이 일어난 핵산을 포함한다.

치료적 용도

다양한 인터페론-알파 폴리펩티드 및 인터페론-알파 컨쥬게이트가 승인되었으며, 또는 다양한 질환 예를 들어, 만성 C형 간염, 만성 B형 간염, 모상 세포 백혈병, 악성 흑색종, 여포성 림프종, 첨형 콘딜로마, AIDS-관련 카포시 육종, 비호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병, 기저 세포암, 다발성 골수종, 유암종, 방광암, 크론병, 피부 T 세포 림프종, 신장 세포 암종, 다발성경화증 및 AIDS의 치료를 위한 임상 개발중에 있다. 따라서, 본 발명은 인터페론-알파에 반응성인 증상 예를 들어, 전술한 증상을 치료하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 상기 질환을 앓고 있는 개체에게 상기 질환과 관련된 증상을 경감시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물(즉, "본 발명의 조성물")을 사용하여 인터페론-알파에 반응성인 질환 예를 들어, 상기 열거한 질환, 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 컨쥬게이트에 반응성인 기타 질환을 치료하는 것을 포함한다.

바이러스 감염 및 바이러스 감염과 관련된 증상의 치료

하나의 측면에서, 본 발명은 바이러스 감염된 개체를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 조성물을 개체내 바이러스 수준을 감소시키고/감소시키거나 이 바이러스 감염과 관련된 증상 및 질환을 경감시키는데 유효한 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 치료 방법의 대상에 해당하는 대표적인 바이러스 감염으로서는 플래비바이러스 군 바이러스, 예를 들어, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스 또는 바이러스성 소 설사 바이러스에 의한 감염; 헤파드나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스에 의한 감염; 피코나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 뇌척수 심근염 바이러스, 인간 리노바이러스 또는 A형 간염 바이러스에 의한 감염; 레트로바이러스 군 바이러스 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 T-림프구 영양 바이러스 또는 로우스 육종 바이러스에 의한 감염; 코로나바이러스 군 바이러스, 예를 들어, SARS 코로나바이러스에 의한 감염; 래비도바이러스 군 바이러스 예를 들어, 광견병 바이러스 또는 포진성 구내염 바이러스에 의한 감염, 파라믹소바이러스 군 바이러스 예를 들어, 호흡기 질환 바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스에 의한 감염, 파필로마바이러스 군 바이러스, 예를 들어, 인간 파필로마바이러스에 의한 감염 또는 헤르페스바이러스 군 바이러스 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스에 의한 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하에서는 대표적인 바이러스 감염과 이러한 감염과 관련된 질병 및 질환을 본 발명의 폴리펩티드 및 컨쥬게이트를 사용하여 치료하는 방법에 대한 비제한적인 실시예를 제공하는데, 여기에는 본 발명의 폴리펩티드 및 컨쥬게이트에 대하여 제안된 투여 스케쥴과 이러한 치료의 효능을 모니터하기 위한 방법을 포함한다. 기타 바이러스 감염 및 이러한 바이러스 감염과 관련된 질병 및 질환의 치료를 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 투여 스케쥴과, 이러한 치료의 효능을 모니터하기 위한 방법은 당 업자에 의하여 파악 가능한 것이다.

C형 간염 바이러스

하나의 측면에서, 본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)가 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상을 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에게 유효량 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 HCV 감염 환자를 치료하는데 사용되는 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. HCV 감염된 것으로 진단되는 환자는 혈중 HCV RNA 및/또는 혈청중 항HCV 항체가 존재하는 환자를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로 임상 승인된 인터페론-알파 폴리펩티드 예를 들어, ROFERON(등록상표)-A (인터페론 알파-2a, 재조합체; HoffmanN-La Roche Inc.), INTRON(등록상표)-A (인터페론 알파-2b, 재조합체; Schering Corporation) 및 INFERGEN(등록상표) (인터페론 알파콘-1; InterMune, Inc.)를 사용하는 HCV 치료 방법에서 적용되는 것과 유사한 투여량 및 횟수로 투여될 것이다. 만성 HCV 치료에 대한 ROFERON 또는 INTRON A의 대표적인 추천 투여 스케쥴은, 예를 들어, 24∼48주 동안 1주일에 3회, 3백만 IU(대략 15 마이크로그램(mcg)) 피하 주사하는 것이다. 만성 HCV 치료에 대한 INFERGEN의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 예를 들어, 24∼48주 동안 1주일에 3회, 9 mcg 피하 주사하는 것이다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약물동태학과 환자의 크기 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 이 폴리펩티드는 전술한 경우보다 적은 양(예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 mcg) 및/또는 적은 횟수(예를 들어, 1주일에 1회 또는 1주일에 2회)로 투여될 수 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 일반적으로 임상적으로 승인된 인터페론-알파 컨쥬게이트 예를 들어, PEGASYS(등록상표) (페그인터페론 알파-2a; HoffmanN-La Roche, Inc.) 또는 PEG-INTRON(등록상표) (페그인터페론 알파-2b; Schering Corporation)을 사용하는 HCV 치료법에서 적용되는 것과 유사한 투여량 및 투여 횟수로 투여될 것이다. 만성 HCV 치료용인 PEGASYS에 있어서 대표적 추천 투여 스케쥴은 예를 들어, 24∼48 주 동안 1주일에 1번씩 180 mcg 피하 주사하는 것이다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트의 분자량, 활성 및 약물동태학과 환자의 크기 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 이 컨쥬게이트는 전술한 경우보다 적은 양(예를 들어, 약 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 mcg) 및/또는 적은 횟수(예를 들어, 10일에 1회 또는 2주일에 1회)로 투여될 수 있다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 하나 이상의 부가 치료제(들)와 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 소분자 항바이러스 약물 예컨대, 리바비린(Ribavirin)과 함께 투여될 수 있는데, 이 리바비린은 상품명 COPEGUS(등록상표)(HoffmanN-La Roche, Inc) 및 REBETOL(등록상표)(Schering Corporation)로 시판되고 있다. 소분자 항바이러스 약물에 대한 대안으로 또는 이에 더하여, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 하나 이상의 부가적인 사이토카인 예를 들어, IFN-감마[상품명 Actimmune(등록상표)(인터페론 감마∼lb; InterMune, Inc.], IL-2[상품명 PROLEUKIN(등록상표) IL-2 (알데스루킨 재조합 인간 인터루킨-2 (rhIL-2); Chiron Corp.] 또는 IL-12 (인터루킨-12)와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 정확한 투여량과 투여 횟수는 다수의 인자 예를 들어, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 특이 활성 및 약물동태학적 특성, 그리고 치료될 질환의 특성(예를 들어, 치료받을 C형 간염 바이러스의 유전자형)에 따라서 달라질 것이며, 이러한 인자들은 당 업자에게 공지되어 있다. 보통, 투여량은 치료될 증상의 심각성 또는 진행을 막거나 경감시킬 수 있어야 한다. 이러한 투여량을 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이라 칭할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물은 치료될 증상, 투여량, 투여 스케쥴, 이와 같은 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 유효량은 단독 투여할지 또는 기타 치료제와 함께 투여할지 여부, 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 혈청 반감기 및 기타 약물동태학적 특성, 그리고 환자의 크기, 연령 및 전반적인 건강 상태에 따라서 달라진다는 점은 당 업자에게 명백할 것이다. 투여량 및 투여 횟수는 공지의 기술을 사용함으로써 당 업자에 의해 파악 가능하다.

치료 효능은 바이러스 수(viral load)를 측정함으로써 예를 들어, 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, COBAS AMPLICOR(등록상표) HCV Test, v 2.0 또는 COBAS AMPLICOR HCV MONITOR(등록상표) Test, v 2.0 (양자 모두 Roche Diagnostics에서 시판)과 같이 정량적 PCR계 시험 방법을 사용하여 바이러스 RNA 수준을 모니터함으로써 혈청 또는 혈장의 역가 또는 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 전반적인 치료 과정에 걸쳐서, 치료전 바이러스 수(일반적으로 만성 HCV 환자의 경우 바이러스 수는 10⁵∼10⁷ HCV RNA 복사체/㎖임)에 비하여 2 log 단위 이상, 3 log 단위 이상, 4 log 단위 이상, 5 log 단위 이상, 6 log 단위 이상 또는 7 log 단위 이상까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 예를 들어, 약 500 복사체/㎖ 혈청 미만 또는 약 100 복사체/㎖ 혈청 미만(본질적으로 검출 불가능한 정도)의 수준까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HCV 감염 환자의 혈청 중 HCV RNA의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전 당시의 HCV RNA 수준에 비하여 HCV RNA의 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

치료의 효능은 HCV 감염과 관련된 증상(예를 들어, 간 손상)을 나타내는 매개 변수 징후를 측정함으로써 대안적으로 또는 그에 추가하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈청 알라닌 아미노기 전이효소(ALT)의 수준은 표준적인 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, ALT 수준이 약 50 국제단위/㎖(IU/㎖)인 혈청은 정상으로 간주된다. ALT 수준이 더욱 높아지면 간 손상이 진행중이라는 징후가 될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 ALT 수준이 정상보다 높은 환자에서 이 ALT 수준을 약 50 IU/㎖ 혈청 미만까지 감소시키는 데 유효한 양이다. 그러므로, 본 발명은 HCV 감염 환자[초기 ALT 수준은 50 IU/㎖ 이상임]의 혈청내 ALT 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 ALT 수준을 약 50 IU/㎖ 미만으로 감소시키는 데 유효한 양으로 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

인간 면역결핍증 바이러스

다른 측면에서, 본 발명은 인간 면역결핍증 바이러스(HIV) 감염 환자 예를 들어, HIV-1 또는 HIV-2 감염 환자, 또는 이 HIV 감염과 관련된 질병 또는 질환 예를 들어, AIDS 관련 카포시 육종 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 환자에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상을 포함하는 본 발명의 조성물을 유효량 투여하는 것을 포함하며, 이때 임의로는 이하에 기술된 기타 항바이러스 치료제도 함께 투여될 수도 있다. 본 발명은 또한 HIV 감염 환자 또는 HIV 감염과 관련된 질병 또는 질환 환자를 치료하는데에 사용하기 위한 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. HIV 감염된 것으로 진단된 환자로서는 혈중 HIV RNA 또는 전바이러스 DNA의 수준이 검출 가능한 정도인 환자 및/또는 혈청 중 p24 항원 또는 항HIV 항체의 수준이 검출 가능한 정도인 환자를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로 예를 들어, ROFERON(등록상표)-A (인터페론 알파-2a, 재조합체; HoffmanN-La Roche Inc.), INTRON(등록상표) A (인터페론 알파-2b, 재조합체; Schering Corporation) 및 INFERGEN(등록상표) (인터페론 알파콘-1; InterMune, Inc.)와 같은 인터페론-알파 폴리펩티드를 사용하는 HIV 치료법에서 적용되는 것과 유사한 투여량과 투여 횟수로 투여될 것이다. 전술한 바와 같이, 만성 HCV 치료를 위한 ROFERON 또는 INTRON A의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 24∼48주 동안 1주일에 3회씩 3 백만 IU(대략 15 마이크로그램(mcg)) 피하 주사하는 것이고, 만성 HCV 치료를 위한 INFERGEN의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 24∼48주 동안 1주일에 3회씩 9 mcg 피하 주사하는 것이다. AIDS 관련 카포시 육종의 치료를 위한 ROFERON의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 10∼12 주 동안 하루에 3천 6백만 단위씩 투여하고, 이후 1주일에 3회, 3천 6백만 단위를 투여하는 것이다. AIDS 관련 카포시 육종의 치료를 위한 INTRON A의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 1주일에 3회, 3 천만 IU/㎡ 피하 투여하는 것이다. 이러한 투여 스케쥴은 HIV 또는 HIV 감염과 관련된 질병 또는 질환의 치료를 위하여 본 발명의 폴리펩티드 투여에 대한 유용한 범위를 제공한다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약물동태학과 환자의 크기, 연령 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 전술한 것보다 적은 양 및/또는 적은 횟수로 투여될 수 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 일반적으로 인터페론-알파 컨쥬게이트 예를 들어, PEGASYS(등록상표) (페그인터페론 알파-2a; HoffmanN-La Roche, Inc.) 또는 PEG-INTRON(등록상표) (페그인터페론 알파-2b; Schering Corporation)을 사용하는 HIV 치료법에서 적용되는 것과 유사한 투여량 및 투여 횟수로 투여될 것이다. HIV 치료용인 PEG-INTRON의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 예를 들어, 24∼48 주 동안 약 1.0∼3.0 mcg/㎏/주, 피하 투여하는 것이다. 이러한 투여 스케쥴은 HIV 치료를 위한 본 발명의 컨쥬게이트 투여량에 유용한 범위를 제공한다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트의 분자량, 활성 및 약물동태학과 환자의 크기, 연령 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 이 컨쥬게이트는 전술한 경우보다 적은 양(예를 들어, 약 0.1, 0.25, 0.50 또는 0.75 mcg/㎏/주) 및/또는 적은 횟수(예를 들어, 10일에 1회 또는 2주일에 1회)로 투여될 수 있다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 하나 이상의 부가의 치료제(들)와 함께 투여된다. 현재 사람의 HIV-1 감염에 대한 임상 치료법으로서는 다수∼약물 병행 요법[일반적으로 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법("HAART")라고 칭함]을 포함한다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 HAART 화합물 또는 기타 항바이러스 치료 화합물과 함께 투여될 수 있다. 뉴클레오시드 역전사효소 억제제("NRTI"), 비 뉴클레오시드 역전사효소 억제제("NNRTI") 및 HIV 프로테아제 억제제("PI")의 다양한 조합이 적용되는 HAART의 통상적인 성분에 관하여는 예를 들어, 본원에 각각 참고 문헌으로 인용되어 있는 문헌[A. M. Vandamme외 다수 (1998) Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 9:187∼203; "Drugs for HIV Infection" in The Medical Letter Vol. 39 (Issue 1015) December 5, 1997, pages 111∼116; 및 공표된 미국 특허 출원 US 20020182179 A1]에 기술되어 있다. HIV 감염 환자가 또한 HCV에도 감염되면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 항바이러스 약물 예를 들어, 리바비린[상품명 COPEGUS(등록상표)(HoffmanN-La Roche, Inc) 및 REBETOL(등록상표)(Schering Corporation)로 시판됨]과 함께 투여되고 HAART도 병행될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 정확한 투여량과 투여 횟수, 그리고 예를 들어, HAART 및/또는 리바비린과 같은 부가의 치료제 투여는 다수의 인자 예를 들어, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 특이 활성 및 약물동태학적 특성, 그리고 치료될 질환의 특성(예를 들어, 추가의 바이러스 예를 들어 HCV의 감염 여부)에 따라서 달라질 것이며, 이러한 인자들은 당 업자에게 공지되어 있다. 보통, 투여량은 치료될 증상의 심각성 또는 진행을 막거나 경감시킬 수 있어야 한다. 이러한 투여량을 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이라 칭할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 유효량은 치료될 증상, 투여량, 투여 스케쥴, 이와 같은 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물을 단독 투여할지 또는 기타 치료제와 함께 투여할지 여부, 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 혈청 반감기 및 기타 약물동태학적 특성, 그리고 환자의 크기, 연령 및 전반적인 건강 상태에 따라서 달라진다는 점은 당 업자에게 명백할 것이다. 투여량 및 투여 횟수는 공지의 기술을 사용함으로써 당 업자에 의해 파악 가능하다.

전술한 일반적인 용도 이외에도, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 다음과 같은 HIV 감염 환자의 하위 세트별로 투여될 수 있다: 예를 들어, 전술한 바와 같이 HAART에 대한 애쥬반트 치료용 투여 세트; 바이러스 수가 일반적으로 많은 초기 환자에 있어서의 단일 요법 또는 병행 요법용 투여 세트; 조직화된 치료 중단(STI) 또는 "약물 휴일(drug holiday)"이 진행중인 환자에 대한 항바이러스 면역조절제의 병행 요법용 투여 세트; HAART 선택권이 제한된 환자에 있어서의 구조 요법용 투여 세트; HAART 내성 바이러스의 출현을 지연시키기 위하여 HAART 요법을 개시하지 않고서 바이러스 수를 항상 감시하는 항바이러스 치료법용 투여 세트.

치료 효능은 바이러스 수를 예를 들어, 정량적 RT-PCR계 시험법 예를 들어, AMPLICOR HIV-1 MONITOR(등록상표) Test, v 1.5 (Roche Diagnostics)를 사용하여 HIV-1 바이러스 RNA 수준을 모니터하는 것과 같은, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 혈청 또는 혈장내 바이러스의 역가 또는 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 전반적인 치료 과정에 걸쳐서, 치료전 바이러스 수에 비하여 0.5 log 단위 이상, 1 log 단위 이상, 2 log 단위 이상, 3 log 단위 이상, 4 log 단위 이상, 5 log 단위 이상, 6 log 단위 이상 또는 7 log 단위 이상까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 예를 들어, 약 50∼약 100 HIV-1 RNA 복사체/㎖ 혈청 미만(본질적으로 검출 불가능한 정도)의 수준까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HIV 감염 환자의 혈청 중 HIV RNA의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전 당시의 HIV RNA 수준에 비하여 HCV RNA의 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

치료 효능은 HIV 복제에 대한 혈청 마커(예를 들어, 혈중 HIV p24 항원의 존부)에 따라 측정되는 것에 부가적 또는 대안적일 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 혈중 p24의 수준을 치료 개시 이전의 수준보다 50%, 25%, 10% 또는 5% 감소시키기에 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 p24 항원의 수준을 본질적으로 검출 불가능한 수준으로 감소시키는 데에 충분한 양이다. 본 발명은 HIV 감염 환자의 혈청중 p24 항원 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전에 존재하는 p24 항원의 수준에 비하여 p24 항원 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

B형 간염 바이러스

다른 측면에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 환자에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상을 포함하는 본 발명의 조성물을 유효량 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 HBV 감염된 환자의 치료용인 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.

HBV 감염된 것으로 진단받은 환자는 혈청중 검출 가능한 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 나타낸다. 만성 HBV 감염은 추가로 "복제형" 또는 "비복제형"으로 분류된다. 복제형 감염에 있어서, 환자는 일반적으로 바이러스 DNA 및 검출 가능한 HBeAg[바이러스가 다량 복제되는 조건하에서 합성되는 HBV 예비-코어 유전자의 대안적으로 가공된 단백질임]의 혈청 중 농도가 비교적 높다. 그러나, 상기 예비∼코어 유전자에 돌연변이가 일어난 HBV 희귀 변종에 있어서, 복제형 감염은 검출 가능한 혈청 HBeAg가 존재하지 않는 경우에 발생할 수 있다. 만성 B형 간염 및 복제형 감염 환자는 일반적으로 예후가 눈에 띄지 않으므로, HBeAg가 존재하지 않는 경우보다 간경변 및/또는 간세포암으로 진행될 가능성이 더욱 높다. 비복제형 감염에 있어서, 간 내 바이러스 복제 비율은 낮으며, 혈청 HBV DNA 농도는 일반적으로 낮고 간염 Be 항원(HBeAg)은 검출되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로 예를 들어, INTRON(등록상표) A(인터페론 알파-2b, 재조합체; Schering Corporation)와 같은 임상 승인된 인터페론-알파 폴리펩티드를 사용하는 HBV 치료 방법에 적용되는 것과 유사한 투여량 및 투여 횟수로 투여될 것이다. 성인의 경우 만성 HBV 치료를 위한 INTRON A의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 1주일에 3천만∼3천 5백만 IU[16 주 동안 하루에 한 번씩 5 백만 IU(qd), 또는 1주일에 3회씩 천만 IU(tiw)] 피하 주사 또는 근육내 주사하는 것이다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약물동태학, 및 환자의 크기 및 건강 상태; 이에 한정되는 것은 아님)에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 전술한 경우보다 적은 양(예를 들어, 1주일에 약 5백만, 1천만, 1천5백만, 2천만 또는 2천5백만 IU)으로 및/또는 적은 횟수(예를 들어, 1주일에 1회 또는 1주일에 2회)로 투여될 수 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 일반적으로 현 임상 실험중인 인터페론-알파 컨쥬게이트 예를 들어, PEGASYS(등록상표) (페그인터페론 알파-2a; HoffmanN-La Roche, Inc.)를 사용하는 HBV 치료법에서 적용되는 것과 유사한 투여량 및 투여 횟수로 투여될 것이다. 만성 HBV 치료용인 PEGASYS의 대표적인 투여 스케쥴은 전체 24 주 동안 1주일에 1번씩 90∼270 mcg 주사하는 것이다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트의 분자량, 활성 및 약물동태학과 환자의 크기 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 이 컨쥬게이트는 전술한 경우보다 적은양(예를 들어, 약 25, 50, 75, 100, 125, 150 또는 200 mcg) 및/또는 적은 횟수(예를 들어, 10일에 1회 또는 2주일에 1회)로 투여될 수 있다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 하나 이상의 추가의 치료제(들)과 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 항바이러스 약물 예를 들어, 라미부딘(3TC라고도 함)[상표명 Epivir-HBV(등록상표)(GlaxoSmithKline)로 시판], 또는 아데포비르 디피복실[상표명 Hepsera(등록상표)(Gilead Sciences)로 시판]과 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 정확한 투여량과 투여 횟수는 다수의 인자 예를 들어, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 특이 활성 및 약물동태학적 특성, 그리고 치료될 질환의 특성(예를 들어, 만성 HBV 감염의 경우, 감염은 복제형인지 또는 비복제형인지 여부)에 따라서 달라질 것이며, 이러한 인자들은 당 업자에게 공지되어 있다. 보통, 투여량은 치료될 증상의 심각성 또는 진행을 막거나 경감시킬 수 있어야 한다. 이러한 투여량을 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이라 칭할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 유효량은 치료될 증상, 투여량, 투여 스케쥴, 이와 같은 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물을 단독 투여할지 또는 기타 치료제와 함께 투여할지 여부, 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 혈청 반감기 및 기타 약물동태학적 특성, 그리고 환자의 크기, 연령 및 전반적인 건강 상태에 따라서 달라진다는 점은 당 업자에게 명백할 것이다. 투여량 및 투여 횟수는 공지의 기술을 사용함으로써 당 업자에 의해 파악 가능하다.

치료 효능은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 바이러스 수 예를 들어, 혈청 또는 혈장 중 바이러스 DNA 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. HBV DNA 수준을 모니터하는 방법으로서는 정량적 PCR계 시험법 예를 들어, COBAS AMPLICOR HBV MONITOR(등록상표) Test, v 2.0 또는 AMPLICOR HBV MONITOR(등록상표) Test, v 2.0 (양자 모두 Roche Diagnostics사 제조)을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 DNA를 예를 들어, 약 500,000 복사체/㎖ 혈청 미만 또는 약 100,000 복사체/㎖ 혈청 미만 또는 약 10,000 복사체/㎖ 혈청 미만으로 감소시키거나, 또는 본질적으로 검출 불가능한 정도(예를 들어, 약 1000 복사체/㎖ 혈청 미만, 약 500 복사체/㎖ 혈청 미만, 또는 약 200 복사체/㎖ 혈청 미만)까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HBV 감염된 환자의 혈청 중 HBV DNA의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전 당시의 HBV DNA 수준에 비하여 HBV DNA의 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

치료 효능은 HBV 복제에 대한 기타 혈청 마커 예를 들어, HBeAg를 측정함으로써 부가적 또는 대안적으로 측정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 혈청중 HBeAg의 수준을 치료 개시 이전의 수준보다 50%, 25%, 10% 또는 5%로 감소시키기에 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 HBeAg의 수준을 본질적으로 검출 불가능한 수준으로 감소시키는 데에 충분한 양이다. 본 발명은 HBV 감염된 환자의 혈청중 HBeAg의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전에 존재하는 HBeAg의 수준에 비하여 HBeAg 항원 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

전술한 바와 같이, HBV 감염되었음을 나타내는 다른 혈청 마커는 HBsAg이다. 그러므로, 치료 효능은 혈청중 HBsAg의 수준을 측정함으로써 부가적 또는 대안적으로 측정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 혈청 중 HBsAg의 수준을 치료 개시 이전의 수준보다 50%, 25%, 10% 또는 5%로 감소시키기에 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 HBsAg의 수준을 본질적으로 검출 불가능한 수준으로 감소시키는 데에 충분한 양이다. 본 발명은 HBV 감염된 환자의 혈청중 HBsAg의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전에 존재하는 HBsAg의 수준에 비하여 HBsAg 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

치료의 효능은 HBV 감염과 관련된 증상(예를 들어, 간 손상)을 나타내는 매개 변수를 측정함으로써 대안적으로 또는 그에 추가하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈청 알라닌 아미노기 전이효소(ALT)의 수준은 표준적인 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, ALT 수준이 약 50 국제단위/㎖(IU/㎖) 미만인 혈청은 정상으로 간주된다. ALT 수준이 더욱 높아지면 간 손상이 진행중이라는 지표가 될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 ALT 수준이 정상보다 높은 환자에서 이 ALT 수준을 약 50 IU/㎖ 혈청 미만까지 감소시키는 데 유효한 양이다. 그러므로, 본 발명은 HBV 감염된 환자[초기 ALT 수준은 50 IU/㎖ 이상임]의 혈청내 ALT 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 ALT 수준을 약 50 IU/㎖ 미만으로 감소시키는 데 유효한 양으로 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

제1형 인간 T-림프영양성 바이러스

본 발명의 다른 측면에서, 제1형 인간 T-림프영양성 바이러스(HTLV-1) 감염된 환자, 또는 이 HTLV-1 감염과 관련된 질병 또는 질환 예를 들어, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), HTLV-1 관련 척수증(HAM), 열대성 경직 하반신 마비(TSP), 포도막염 또는 관절증 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상을 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에게 유효량 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 HTLV-1 감염된 환자, 또는 HTLV-1 감염과 관련된 질병 또는 질환 환자의 치료용인 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 중 하나 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. HTLV-1 감염된 것으로 진단된 환자로서는 혈중 HTLV-1 전바이러스성 DNA 및/또는 혈청중 HTLV-1 항원에 대한 항체가 생성된 환자를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로 예를 들어, ROFERON(등록상표)-A (인터페론 알파-2a, 재조합체; HoffmanN-La Roche Inc.) 및 INTRON(등록상표) A (인터페론 알파-2b, 재조합체; Schering Corporation)과 같은 임상 승인된 인터페론-알파 폴리펩티드를 사용하는 HCV 또는 암 치료법에서 적용되는 것과 유사한 투여량과 투여 횟수로 투여될 것이다. 만성 HCV 치료를 위한 ROFERON 또는 INTRON A의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 예를 들어, 24∼48주 동안 1주일에 3회씩 3 백만 IU(약 15 마이크로그램(mcg)) 피하 주사하는 것이다. 모상 세포 백혈병의 치료를 위한 ROFERON의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 16∼24 주 동안 하루에 3백만∼5백만 단위씩 피하 주사하고, 이후 이 상태를 유지하기 위해서 1주일에 3회, 3백만 단위를 투여하는 것이다. 모상 세포 백혈병의 치료를 위한 INTRON A의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 6개월 동안 1주일에 3회씩 2백만 IU/㎡(체표면적의 제곱 미터)를 피하 투여하는 것이다. 이러한 투여 스케쥴은 HTLV-1 감염 또는 HTLV-1 감염과 관련된 질병 또는 질환 예를 들어, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), HTLV-1 관련 척수증(HAM) 또는 열대성 경직 하반신 마비(TSP)의 치료를 위하여 본 발명의 폴리펩티드 투여에 대한 유용한 범위를 제공한다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약물동태학과 환자의 크기, 연령 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 전술한 것보다 적은 양 및/또는 적은 횟수로 투여될 수 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 일반적으로 임상 승인된 인터페론-알파 컨쥬게이트 예를 들어, PEGASYS(등록상표) (페그인터페론 알파-2a; HoffmanN-La Roche, Inc.) 또는 PEG-INTRON(등록상표) (페그인터페론 알파-2b; Schering Corporation)을 사용하는 HCV 치료 또는 암 치료시 적용되는 것과 유사한 투여량 및 투여 횟수로 투여될 것이다. 만성 HCV 치료용인 PEGASYS의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 예를 들어, 24∼48 주 동안 1주일에 한번씩 180 mcg를 피하 주사하는 것이다. 만성 골수종 백혈병 치료를 위한 PEG-INTRON의 대표적인 추천 투여 스케쥴은 예를 들어, 52주 동안 일주일에 한 번씩 6 mcg/㎏ 체중 투여하는 것이다. 이러한 투여 스케쥴은 HTLV-1 감염 또는 HTLV-1 감염과 관련된 질병 또는 질환 예를 들어, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), HTLV-1 관련 척수증(HAM) 또는 열대성 경직 하반신 마비(TSP)의 치료용인 본 발명의 컨쥬게이트 투여에 대한 유용한 범위를 제공한다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트의 분자량, 활성 및 약물동태학과 환자의 크기, 연령 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 전술한 것보다 적은 양 및/또는 적은 횟수로 투여될 수 있다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 하나 이상의 부가적 치료제(들)와 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 항레트로바이러스 약물 예를 들어, 지도부딘(AZT) 및/또는 라미부딘(3TC)와 함께 투여될 수 있다. 뿐만 아니라, 말초 혈액 줄기 세포 이식, 통상의 화학 요법 또는 자가 이식 또는 동종 이계 골수 이식에 따른 다량 투여 화학 요법과 병행 투여될 수도 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 기타 면역요법 제제 예를 들어, 항인터루킨-2 수용체 모노클로날 항체와 함께 투여될 수 있거나, 또는 바이러스 항원에 대하여 생성된 세포 독성 T-세포와 함께 주사될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 정확한 투여량과 투여 횟수는 다수의 인자 예를 들어, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 특이 활성 및 약물동태학적 특성, 그리고 치료될 질환의 특성에 따라서 달라질 것이며, 이러한 인자들은 당 업자에게 공지되어 있다. 보통, 투여량은 치료될 증상의 심각성 또는 진행을 막거나 경감시킬 수 있어야 한다. 이러한 투여량을 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이라 칭할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 유효량은 치료될 증상, 투여량, 투여 스케쥴, 이와 같은 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물을 단독 투여할지 또는 기타 치료제와 함께 투여할지 여부, 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 혈청 반감기 및 기타 약물동태학적 특성, 그리고 환자의 크기, 연령 및 전반적인 건강 상태에 따라서 달라진다는 점은 당 업자에게 명백할 것이다. 투여량 및 투여 횟수는 공지의 기술을 사용함으로써 당 업자에 의해 파악 가능하다.

예를 들어, 정량적 PCR[Saito외 다수, (2004) J. Infect Dis. 189(1):29∼40]에 의해 혈중 HTLV-1 전바이러스 DNA 수준을 측정하는 방법과 같이 업계에 공지된 방법을 사용하여 HTLV-1 바이러스 수를 측정함으로써 치료 효능을 측정할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 전체 처리 과정에 걸쳐서 치료 이전의 바이러스 수와 비교하여 0.5 log 단위 이상 예를 들어, 1 log 단위 이상, 2 log 단위 이상, 3 log 단위 이상, 4 log 단위 이상, 5 log 단위 이상, 6 log 단위 이상 또는 7 log 단위 이상까지 감소시키는데 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 본질적으로 검출 불가능한 정도까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HTLV-1 감염된 환자의 혈액중 HTLV-1 전바이러스 DNA의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 치료 개시 이전의 상태에 비하여 HTLV-1 전바이러스 DNA의 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

치료 효능은 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 시판중인 시험 도구 예를 들어, INNO∼LIA(상표명) HTLV I/II (Innogenetics; Gent Belgium) 및 Abbott HTLV∼I/HTLV∼II EIA (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL)를 사용하여 혈청 중 항HTLV-1 항체의 역가를 측정함으로써 대안적으로 또는 부가하여 측정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 혈청중 항HTLV-1 항체의 역가를 치료 개시 이전 역가의 50%, 25%, 10% 또는 5%로 감소시키는데에 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 혈청 중 항HTLV-1 항체의 역가를 본질적으로 검출 불가능한 정도로 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HTLV-1 감염된 환자의 혈청 중 항HTLV-1 항체의 역가를 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전의 상태에 비하여 혈청 중 항HTLV-1 항체의 역가를 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

인간 유두종 바이러스

다른 측면에 있어서, 본 발명은 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염 환자, 또는 HPV 감염과 관련된 질병 또는 증상 예를 들어, 손발 사마귀 및 구강 점막 병변, 항문 및 생식기 공동(cavaty)을 나타내는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다양한유형의 HPV는 비교적 해가 없는 반면에, 다수의 기타 유형들은 성적 접촉을 통해 퍼지며, 자궁경부암 및 기타 생식기 암에서 발생할 수 있는 생식기 또는 성병으로 인한 사마귀(첨형 콘딜로마라고 칭함)를 일으킨다. 본 방법은 HPV 감염된 환자에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 하나 이상 포함하는 본 발명의 조성물을 유효량 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 HPV 감염된 환자, 또는 HPV 감염과 관련된 질병 또는 질환의 환자를 치료하는데에 사용되는 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 하나 이상 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. HPV 감염된 것으로 진단된 환자로서는 생검 생식기 조직에 HPV 바이러스 DNA가 존재하고, 때로는(항상 그런 것은 아님) 생식기 조직에 가시적인 병변을 나타내는 환자를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 일반적으로 예를 들어, INTRON(등록상표) A (인터페론 알파-2b, 재조합체; Schering Corporation)와 같이 임상 승인된 인터페론-알파 폴리펩티드를 사용하는 HPV 치료 방법에 적용되는 것과 유사한 투여량 및 투여 횟수로 투여된다. 첨형 콘딜로마의 치료를 위하여 추천된 INTRON A의 투여량은 각 병변당 1백만 IU를 주사하는 것이고, 5개 이상의 병변에 대해서는 3주 동안 1주일에 하루 걸러서 3회씩, 25∼30 게이지 바늘이 장착된 투베르쿨린 시린지 또는 유사 시린지를 사용한다. 6∼10개의 첨형 콘딜로마를 보유하는 환자는 상기 투여 스케쥴에 의한 치료중 두 번째(연속) 치료 과정에 들어감으로써, 치료 과정당 5개 이하의 첨형 콘딜로마가 추가로 치료될 수 있다. 10개 초과의 첨형 콘딜로마를 보유하는 환자는 얼마나 많은 첨형 콘딜로마가 존재하는지에 따라서 추가의 과정에 들어갈 수 있다. 인터페론은 대안적 또는 부가적으로 국소 도포 예를 들어, 크림 또는 연고 형태로 도포될 수 있다[Stentella외 다수(1996) Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 23(1):29∼36)]. 이러한 투여 스케쥴은 HPV 감염, 또는 HPV 감염과 관련된 질병 또는 증상 예를 들어, 첨형 콘딜로마의 치료를 위한 본 발명의 폴리펩티드의 유용한 투여 범위를 제공한다. 다수의 인자(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 및 약물동태학과 환자의 크기, 연령 및 건강 상태(이에 한정되지는 않음))에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 전술한 것보다 적은 양 및/또는 적은 횟수로 투여될 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 일반적으로 발병한 조직내 HPV 바이러스 DNA의 양을 감소시키거나, 또는 감염된 개체내 생식기 병변의 크기 및/또는 수를 감소시키는데 유효한 투여량으로 예를 들어, 병변내 또는 국소 투여될 것이다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 하나 이상의 부가 치료제(들)과 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 항HPV 치료제 예를 들어, 포도필록스(Podofilox)(콘딜록스; Condylox) 및/또는 포도필린(Podophyllin)(포도덤; Pododerm, 포도콘∼25; PodocoN-25)와 함께 투여된다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 정확한 투여량과 투여 횟수는 다수의 인자 예를 들어, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 특이 활성 및 약물동태학적 특성, 그리고 치료될 질환의 특성에 따라서 달라질 것이며, 이러한 인자들은 당 업자에게 공지되어 있다. 보통, 투여량은 치료될 증상의 심각성 또는 진행을 막거나 경감시킬 수 있어야 한다. 이러한 투여량을 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이라 칭할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물은 치료될 증상, 투여량, 투여 스케쥴, 이와 같은 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물을 단독 투여할지 또는 기타 치료제와 함께 투여할지 여부, 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물의 혈청 반감기 및 기타 약물동태학적 특성, 그리고 환자의 크기, 연령 및 전반적인 건강 상태에 따라서 달라진다는 점은 당 업자에게 명백할 것이다. 투여량 및 투여 횟수는 공지의 기술을 사용함으로써 당 업자에 의해 파악 가능하다.

치료 효능은 HPV 바이러스 수를 측정함으로써 예를 들어, 생검 조직내 HPV 바이러스 DNA의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 전체 처리 과정에 걸쳐서 치료 이전의 바이러스 수와 비교하여 0.5 log 단위 이상 예를 들어, 1 log 단위 이상, 2 log 단위 이상, 3 log 단위 이상, 4 log 단위 이상, 5 log 단위 이상, 6 log 단위 이상 또는 7 log 단위 이상까지 감소시키는데 충분한 양이다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 바이러스 수를 본질적으로 검출 불가능한 정도까지 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HPV 감염된 환자의 조직 중 HPV 바이러스 DNA의 수준을 감소시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시 이전의 상태에 비하여 HPV 바이러스 DNA의 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

치료의 효능은 감염된 개체의 생식기 병변(첨형 콘딜로마)의 크기와 수를 관찰함으로써 부가적으로 또는 대안적으로 측정될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 조성물의 유효량은 감염된 개체내 첨형 콘딜로마의 크기 및/또는 수를 감소시키는데에 충분한 양이다. 본 발명은 HPV 감염된 환자에서 첨형 콘딜로마의 크기 및/또는 수를 감소시키는 방법을 포함하는데, 여기서 이 방법은 본 발명의 조성물을 치료 개시전 환자에 비하여 환자의 첨형 콘딜로마 크기 및/또는 수를 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

제형 및 투여 경로

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 치료 제형은 통상적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물내에 포함되어 투여된다. 이러한 약학 조성물은 당 업계에 공지되어 있는 방법으로 제조되어 보관 안정성이 충분하고 사람이나 동물에 투여하기에 적당한 폴리펩티드 약제로 될 수 있다.

약형

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 "그 자체" 및/또는 이의 염 형태로 사용될 수 있다. 안정한 염으로서는 알칼리 금속 또는 알칼리토금속 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘을 보유하는 염, 그리고 아연 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 염 또는 착물은 결정형 및/또는 부정형의 구조로서 존재할 수 있다.

부형제

"약학적으로 허용 가능한" 담체 또는 부형제란, 사용된 투여량 및 농도에서 그것이 투여된 환자에 어떠한 부작용도 일으키지 않는 담체 또는 부형제를 의미한다. 이와 같은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 당 업계에 널리 공지되어 있다[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)].

약의 혼합물

본 발명의 조성물은 단독으로 투여되거나 또는 기타 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 리바비린은 종종 IFN-알파와 함께 투여될 때 예를 들어, HCV 치료와 같은 항바이러스 치료에 있어서 효능을 상승시키는 것으로 파악된다. 바이러스 표적(바이러스 프로테아제, 바이러스 중합효소, 바이러스 복제 복합체의 조립체)과 숙주 표적(바이러스 프로세싱에 필요한 숙주 프로테아제, 바이러스 표적 예를 들어, NS5A의 인산화에 필요한 숙주 키나제 및 바이러스 IRES를 효율적으로 이용하는데 필요한 숙주 인자의 억제제) 모두에 대한 다양한 소분자가 개발되고 있다. 기타 사이토카인 예를 들어, IL-2, IL-12, IL-23, IL-27 또는 IFN-감마도 함께 투여될 수 있다. 이러한 제제는 동일한 약학 조성물의 일부로서 통합될 수 있거나 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트로부터 각각 투여될 수도 있는데, 이러한 경우 다른 치료 스케쥴과 동시에 또는 그 스케쥴에 따라서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트 또는 조성물은 다른 치료법에 대한 애쥬반트로서 사용될 수도 있다.

환자

본 발명의 목적을 위한 "환자"에는 사람과 기타 포유 동물을 모두 포함한다. 그러므로 본 발명의 방법은 사람 치료 및 수의학적 분야 모두에 적용될 수 있다.

조성물 및 투여 경로의 유형

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 겔, 동결 건조 또는 압착 고체의 형태로 제형화될 수 있다. 바람직한 형태는 치료될 구체적 증상에 따라 달라질 것이며, 이는 당 업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 제형의 투여는 다양한 방식 예를 들어, 경구, 피하, 정맥내, 뇌내, 비강내, 경피, 복강내, 근육내, 폐내, 질내, 직장내, 안구내 또는 임의의 허용 가능한 방식으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비록 당 업계에 널리 공지된 기술 예를 들어, 펌프(예를 들어, 피하 삼투 펌프) 또는 이식법을 사용하는 급속 투여가 허용 가능할지라도, 제형은 주입에 의하여 연속적으로 투여될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 제형은 용액 또는 스프레이로서 직접 도포될 수 있다.

비경구 투여

약학 조성물의 일례는 비경구 투여용으로 고안된 용액이다. 다수의 경우에서 약학 용액 제형이 즉석 사용에 적당한 액체 형태로 제공될지라도, 그러한 비경구 제형은 동결 또는 동결 건조 형태로서도 제공될 수 있다. 전자의 경우, 조성물은 사용전 해동되어야 한다. 후자의 형태는 어떠한 저장 환경에 놓여 있을지라도 조성물내에 함유된 활성 화합물의 안정성을 강화시키기 위하여 자주 사용되는데, 그 이유는 동결 건조된 제제는 일반적으로 액체 형태의 제제보다 더 안정하다는 것을 당업자들이 인식하고 있기 때문이다. 이러한 동결 건조 제제는 하나 이상의 적당한 약학적 허용 가능 희석제 예를 들어, 주사용 멸균수 또는 멸균 생리 염수 용액을 첨가함으로써 사용 전 재구성된다.

비경구 투여 제형은 저장용으로서 제조될 수 있는데, 예를 들어, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장제, 비이온계 세척제, 산화방지제 및/또는 기타 다양한 첨가제와 같이, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 부형제, 약학적 허용 담체(모두 "부형제"라 칭함)중 하나 이상과, 원하는 정도의 순도를 보유하는 폴리펩티드를 적당히 혼합함으로써 제조된 동결 건조 제형 또는 수용액으로서 제조될 수 있다.

완충제는 pH를 생리적 조건과 유사한 범위로 유지시켜주는 것을 돕는다. 이 완충제는 통상적으로 약 2∼약 50 mM의 농도 범위로 존재한다. 본 발명에 사용하기 적당한 완충제로서는 유기산 및 무기산 모두와 이의 염을 포함하며, 상기 완충제의 예로서는 시트르산염 완충제(예를 들어, 시트르산나트륨-시트르산이나트륨의 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨의 혼합물, 시트르산-시트르산나트륨의 혼합물 등), 숙시네이트 완충제(예를 들어, 숙신산-숙신산나트륨의 혼합물, 숙신산-수산화나트륨의 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨의 혼합물 등), 타르타르산 완충제(예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨의 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨의 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨의 혼합물 등), 푸마르산 완충제(예를 들어, 푸마르산-푸마르산나트륨의 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨의 혼합물, 푸마르산나트륨-푸마르산이나트륨의 혼합물 등), 글루콘산염 완충제(예를 들어, 글루콘산-글리콘산나트륨의 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨의 혼합물, 글루콘산-글리콘산칼륨의 혼합물 등), 옥살산염 완충제(예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨의 혼합물, 옥살산-수산화나트륨의 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨의 혼합물 등), 락트산염 완충제(예를 들어, 락트산-락트산나트륨의 혼합물, 락트산-수산화나트륨의 혼합물, 락트산-락트산칼륨의 혼합물 등) 및 아세트산염 완충제(예를 들어, 아세트산-아세트산 나트륨의 혼합물, 아세트산-수산화나트륨의 혼합물 등)를 포함한다. 추가로 인산염 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염 예를 들어, 트리스를 포함할 수도 있다.

보존제는 미생물의 성장을 지연시키기 위하여 첨가되는데, 이 보존제는 통상적으로 약 0.2∼1%(w/v)의 양으로 첨가된다. 본 발명에 사용하기에 적당한 보존제로서는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄, 할로겐화벤잘코늄(예를 들어, 염화벤잘코늄, 브롬화벤잘코늄 또는 요드화벤잘코늄), 염화헥사메토늄, 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥사놀 및 3-펜타놀을 포함한다.

등장제는 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위하여 첨가되며, 이 등장제의 예로서는 다가 당 알콜, 바람직하게는 삼가 또는 그보다 다가인 당 알콜 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 다가 알콜은 다른 성분들의 상대량을 고려하였을 때 0.1∼25 중량%, 통상적으로는 1∼5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

안정화제란, 치료제를 용해시키거나, 변성 또는 용기 벽에의 결합을 방지하는 것을 도와주는, 팽화제로부터 첨가제까지의 기능을 가질 수 있는 광범위한 부형제를 의미한다. 통상적인 안정화제는, 다가 당 알콜(상기 열거함); 아미노산 예를 들어, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오미틴, L-루신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기당 또는 당 알콜 예를 들어, 락토스, 트레할로스, 스타치오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등 예를 들어, 시클리톨 예를 들어, 이노시톨; 폴리에틸렌글리콜; 아미노산 중합체; 황함유 환원제 예를 들어, 우레아, 글루타치온, 티온산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 폴리펩티드(즉 10개 미만의 잔기); 단백질 예를 들어, 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 단당류 예를 들어, 자일리톨, 만노즈, 프록토스 및 글루코스; 이당류 예를 들어, 락토스, 말토스 및 수크로스; 삼당류 예를 들어, 라피노스 및 다당류 예를 들어, 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 통상적으로 활성 단백질 중량을 기준으로 0.1∼10,000 중량부의 범위내에 존재한다.

비이온계 계면활성제 또는 세척제("습윤제"라고도 알려짐)는 치료제의 용해를 돕고 치료 폴리펩티드가 교반시 응집을 유발하지 않도록 보호하기 위해 존재할 수 있는데, 이 계면활성제는 또한 제형을 전단 표면 스트레스에 노출시켜 폴리펩티드의 변성을 일으키지 않도록 만든다. 적당한 비이온계 계면활성제로서는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉(Pluronic)(등록상표) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(Tween(등록상표)-20, Tween(등록상표)-80 등)을 포함한다.

기타 부가적 부형제의 예로서는 팽화제 또는 충전제(예를 들어, 녹말), 킬레이트화제(예를 들어, EDTA), 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 보조용매를 포함한다.

활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이트화 기술 또는 경계 중합으로 제조된 미세캡슐 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로스, 젤라틴 또는 폴리∼(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 미소 에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 거대 에멀젼(macroemulsion) 내에 포집될 수도 있다. 이러한 기술에 관하여는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 상동]에 개시되어 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 조성물은 액체 조성물 예를 들어, 수성 조성물이고, 하기 화학식을 갖는 설포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체를 포함한다.

[상기 식 중, n은 4, 5 또는 6이고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 R₉는 각각 독립적으로 -0- 또는 -0-(C₂-C₆ 알킬)-S0₃기이며, 여기서 R₁, R₂ 또는 R₃중 하나 이상은 독립적으로 -0-(C₂-C₆ 알킬)-S0₃기이고; S₁, S₂, S₃, S₄, S₅, S₆, S₇, S₈ 및 S₉는 각각 독립적으로 H⁺를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 양이온임]

여기서, n이 4일 때, 설포알킬 에테르 시클로덱스트린은 또한 α∼설포알킬 에테르 시클로덱스트린이라 칭할 수도 있다. 유사한 방식으로, n이 5일 때에는, β-설포알킬 에테르 시클로덱스트린이라 칭할 수 있으며, n이 6일 때에는, 설포알킬 에테르 시클로덱스트린은 γ-설포알킬 에테르 시클로덱스트린으로 칭할 수도 있다.

추가의 구체예에서, n은 5 또는 6이다. 바람직한 구체예에서, n은 6이다.

추가의 구체예에서, R₁, R₂ 또는 R₃는 독립적으로 -OCH₂CH₂CH₂S0₃, -OCH₂CH₂CH₂CH₂S0₃ 및 -OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂S0₃로 이루어진 군에서 선택된다. 가장 바람직하게, R₁, R₂ 또는 R₃는 독립적으로 -OCH₂CH₂CH₂CH₂S0₃이다.

추가의 구체예에서, S₁, S₂, S₃, S₄, S₅, S₆, S₇, S₈ 및 S₉는 각각 독립적으로 H⁺, 알칼리 금속(예를 들어, Li⁺, Na⁺, K⁺), 알칼리토금속(예를 들어, Ca⁺², Mg⁺²), 암모늄 이온 및 아민 양이온 예를 들어, (C₁-C₆)알킬아민, 피페리딘, 피라진, (C₁-C₆)알카놀아민 및 (C₄-C₈)시클로알카놀아민의 양이온으로부터 선택된 약학적 허용 양이온이다. 가장 바람직하게, S₁, S₂, S₃, S₄, S₅, S₆, S₇, S₈ 및 S₉는 각각 독립적으로 H⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, 특히 Na⁺로 이루어진 군에서 선택된 약학적 허용 양이온이다.

상기 설포알킬 에테르 시클로덱스트린은 1∼18개의 설포알킬기(n이 4일때), 1∼21개의 설포알킬기(n이 5일때) 또는 1∼21개의 설포알킬기(n이 6일때)를 함유할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, n이 5인 설포알킬 에테르 유도체는 평균적으로 2∼20개의 설포알킬기(구체적으로, 설포부틸기) 예를 들어, 3∼10개의 설포알킬기(구체적으로, 설포부틸기), 더욱 바람직하게 4∼9개의 설포알킬기(구체적으로 설포부틸기), 더더욱 바람직하게 5∼9개의 설포알킬기(구체적으로 설포부틸기) 예를 들어, 6∼8개의 설포알킬기(구체적으로 설포부틸기) 예를 들어, 7개의 설포알킬기(구체적으로 설포부틸기)를 포함한다.

몇몇 경우에 있어서, 상기 설포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체는 염, 구체적으로 β-시클로덱스트린 설포부틸 에테르(즉, n이 5개)의 나트륨 염으로서, 평균적으로 7개의 설포부틸기를 함유한다. 이 설포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체는 또한 SBE7-β-CD 라고도 칭하며, Captisol(등록상표)(Cydex, Overland Park, Kansas)로서 시판되고 있다.

"C₁-C₆ 알킬"이란 용어는 1∼6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 직쇄형 알킬기를 나타낸다. 통상적으로 C₁-C₆ 알킬기로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, n-헥실 및 이소-헥실을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"C₂-C₆ 알킬"이란 용어는 2∼6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 직쇄형 알킬기를 나타낸다. 통상적으로 C₂-C₆ 알킬기로서는 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, n-헥실 및 이소-헥실을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 설포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체에 관한 보다 상세한 설명은 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 WO 03/002152의 "설포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체"라는 섹션(pp.37∼49)에서 살펴볼 수 있다.

생체내 투여용으로 사용될 비경구 제형은 멸균 상태이어야 한다. 이러한 멸균 상태는 예를 들어, 멸균 여과막에 의한 여과를 통하여 용이하게 이룰 수 있다.

서방형 제제

서방형 제제의 적당한 예로서는 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스, 적당한 형태 예를 들어, 필름이나 미세캡슐의 형태를 갖는 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로서는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드, L-글루탐산과 에틸 L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예를 들어, ProLease(등록상표) 테크놀로지 또는 Lupron Depot(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사 가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체 예를 들어, 에틸렌∼비닐 아세테이트 및 락트산∼글리콜산은 장기간 예를 들어, 100일 이하 또는 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있지만, 임의의 히드로겔은 그보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킬 수 있다. 캡슐화된 폴리펩티드가 장기간 체내에 남으면, 이 폴리펩티드는 37℃에서 습기에 노출되어 있는 상태가 되므로 변성되거나 또는 응집되어, 그 결과 생물 활성을 잃고 면역원성이 변질될 수 있다. 관련된 기전에 따라서 안정화시키기 위한 합리적 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 티오-디설파이드 교환을 통해 응집 기전이 분자내 S-S 결합을 형성하는 것으로 관찰되면, 설프히드릴 잔기를 개질시키고, 산성 용액으로부터 동결 건조시키며, 수분 함량을 조절하고, 적당한 부가제를 사용하여, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 만들어 안정화시킬 수 있다.

경구 투여

경구 투여를 위해, 약학 조성물은 고체 형태 또는 액체 형태 예를 들어, 캡슐, 정제, 현탁액, 유액 또는 용액의 형태로 존재할 수 있다. 이 약학 조성물은 소정량의 활성 성분을 함유하는 투여 단위의 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 사람 또는 기타 포유 동물의 매일 투여시의 적당한 투여형은 환자의 상태와 기타 인자에 따라서 매우 다양할 수 있으나, 통상의 방법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

경구 투여용 고체 투여형으로서는 캡슐, 정제, 좌약, 분말 및 과립을 포함할 수 있다. 이러한 고체 투여형에 있어서, 활성 화합물은 하나 이상의 불활성 희석제 예를 들어, 수크로스, 락토스 또는 녹말과 함께 혼합될 수 있다. 이러한 투여형은 또한 보통 사용될 때 부가 물질 예를 들어, 윤활제 예를 들어, 스테아르산마그네슘을 포함할 수도 있다. 캡슐, 정제 및 환약의 경우, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수도 있다. 정제 및 환약은 부가로 장용피 코팅되어 제조될 수도 있다.

폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 애쥬반트 예를 들어, 락토스, 수크로스, 녹말 가루, 알카논산의 셀룰로스 에스테르, 스테아르산, 활석, 스테아르산마그네슘, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 알긴산나트륨, 폴리비닐∼피롤리돈 및/또는 폴리비닐 알콜과 혼합될 수 있으며, 또한 통상의 투여를 위하여 정제화되거나 또는 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 이것들은 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 오일(예를 들어, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 목화씨 오일 또는 참기름), 트라가칸트 검 및/또는 다양한 완충제에 용해될 수 있다. 기타 애쥬반트 및 투여 방식은 제약업계에 널리 공지되어 있다. 담체 또는 희석제는 시간 지연성 물질 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 포함할 수 있거나 또는 왁스를 함께 포함할 수 있거나, 또는 기타 당 업계에 널리 공지된 물질을 포함할 수도 있다.

약학 조성물은 통상적인 약학 작용 예를 들어, 안정화시킬 수 있으며/있거나 통상의 애쥬반트 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충전제 등 예를 들어, 본원에 개시된 물질을 함유할 수 있다.

경구 투여용 액체 투여형은 약학적으로 허용 가능한 유액, 용액, 현탁액, 시럽 및 당 업계에서 일반적으로 사용되고 있는 불활성 희석제 예컨대, 물을 함유하는 엘릭시르를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 애쥬반트 예를 들어, 습윤제, 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수도 있다.

폐내 전달

제트 분무기 또는 초음속 분무기에 사용하기 적당한 제형은 통상적으로 예를 들어, 용액 1㎖당 컨쥬게이트 약 0.01∼25 ㎎, 바람직하게는 약 0.1∼10 ㎎/㎖의 농도로 물에 용해된 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 포함할 것이다. 상기 제형은 또한 완충제 및 단순 당(예를 들어, 단백질 안정화 및 삼투압 조절용) 및/또는 농도 0.1∼10 ㎎/㎖의 사람 혈청 알부민을 포함할 수도 있다. 사용될 수 있는 완충제의 예로서는 아세트산나트륨, 시트르산염 및 글리신이 있다. 바람직하게, 완충제는 용액의 pH를 3∼9로 조정하는데 적당한 조성 및 몰농도를 가질 것이다. 일반적으로 완충제의 몰농도는 1∼50 mM인 것이 본 목적에 적당하다. 사용될 수 있는 당의 예로서는 락토스, 말토스, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스 및 자일리톨이 있는데, 이는 일반적으로 제형의 1∼10 중량%의 양으로 존재한다.

분무기용 제형은 또한 에어로졸 형성시 용액의 분무화에 의해 유발되는 단백질의 표면 유도성 응집을 감소시키거나 또는 방지하는 계면 활성제를 함유할 수도 있다. 다양한 종래의 계면 활성제로서는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르일 수 있다. 그 양은 일반적으로 제형의 0.001∼4 중량%일 것이다. 본 발명의 목적으로 사용하는데 특히 바람직한 계면 활성제로서는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트가 있다.

본 발명의 액체 입자의 적당한 분산액을 제조하는 방법 및 특정 제형에 관하여는 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있는 WO 94/20069, 미국 특허 제 5,915,378 호, 미국 특허 제 5,960,792 호, 미국 특허 제 5,957,124 호, 미국 특허 제 5,934,272 호, 미국 특허 제 5,915,378 호, 미국 특허 제 5,855,564 호, 미국 특허 제 5,826,570 호 및 미국 특허 제 5,522,385 호에 기술되어 있다.

계량형 투입 흡입기에 사용되는 제형은 일반적으로 미분 분말을 포함할 것이다. 이 분말은 액체 컨쥬게이트 제형을 동결 건조한 후 분쇄하여 제조될 수 있으며, 안정화제 예를 들어, 사람 혈청 알부민(HSA)을 함유할 수도 있다. 통상적으로, 0.5%(w/w) 이상의 HSA가 첨가된다. 뿐만 아니라, 필요한 경우 이 제제에 하나 이상의 당이나 당 알콜을 첨가할 수 있다. 그 예로서는 락토스, 말토스, 만니톨, 소르비톨, 소르비토스, 트레할로스, 자일리톨 및 자일로스를 포함한다. 이 제형에 첨가되는 양은 존재하는 컨쥬게이트의 약 0.01∼200 %(w/w), 바람직하게는 약 1∼50%(w/w)일 수 있다. 이러한 제형은 이후 동결 건조되어 원하는 입도가 될 때까지 분쇄된다.

적당한 크기가 된 입자는 이후 계면 활성제의 도움을 받아 추진제중에 현탁된다. 상기 추진제는 이 목적으로 사용되는 종래의 물질중 임의의 것일 수 있으며, 그 예로서는 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본 또는 히드로카본 예를 들어, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 이의 혼합물이 있다. 적당한 계면 활성제로서는 소르비탄 트리올레이트 및 간장콩 레시틴을 포함한다. 올레산도 계면 활성제로서 유용할 수 있다. 이후 이 혼합물을 전달 장치에 로딩시킨다. 본 발명에 사용하기에 적당한, 시판중인 계량 투여 흡입기의 예로서는 벤톨린 계량 투여 흡입기(Ventolin metered dose inhaler; Glaxo Inc.제조, Research Triangle Park, NC, USA)가 있다.

분말 흡입기용 제형은 컨쥬게이트를 함유하는 미분 건조 분말을 포함할 것이며, 또한 팽화제 예를 들어, 락토스, 소르비톨, 수크로스 또는 만니톨을 포함할 수도 있으며, 이 성분들은 장치에 들어있는 분말의 분산을 촉진시키는 양 예를 들어, 제형의 50∼90 중량%만큼 존재한다. 이 분말의 입자는 폐 내에서 공기 역학적 특성(입자 밀도 약 1 g/㎠, 평균 직경 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 0.5∼5 ㎛, 가장 바람직하게는 1.5∼3.5 ㎛)을 가져야 한다. 본원에 교시된 바에 따른 용도에 적당한 분말 흡입기의 예로서는 스핀헤일러(Spinhaler) 분말 흡입기[Fisons Corp., Bedford, MA, USA]가 있다.

이러한 기구에 사용되는 분말은 미국 특허 제 5,997,848 호, 미국 특허 제 5,993,783 호, 미국 특허 제 5,985,248 호, 미국 특허 제 5,976,574 호, 미국 특허 제 5,922,354 호, 미국 특허 제 5,785,049 호 및 미국 특허 제 5,654,007호에 개시된 방법에 의하여 제조 및/또는 전달될 수 있다.

치료 생산물의 폐내 전달용으로 고안된 기계적 장치로서는 분무기, 계량 투여 흡입기 및 분말 흡입기(모두 당업자에게 공지된 것들임)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 수행에 적당한, 시판중인 장치의 구체예로서는 울트라벤트 분무기(Ultravent nebulizer; Mallinckrodt, Inc., St. Louis, MO, USA); 아콘(Acorn) II 분무기(Marquest Medical Products, Englewood, CO, USA); 벤톨린(Ventolin) 계량 투여 흡입기(Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC, USA); 스핀헤일러( Spinhaler) 분말 흡입기(Fisons Corp., Bedford, MA, USA), "스탠딩 클라우드(standing cloud)" 장치(Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, CA, USA); 에어(AIR) 흡입기(Alkermes, Cambridge, MA, USA); 및 AERx 폐내 약물 전달 시스템(Aradigm Corporation, Hayward, CA, USA)이 있다.

키트

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 세포, 방법, 조성물 및 시스템과, 장치를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 임의로 다음과 같은 발명중 하나 이상을 포함한다:(1) 본원에 개시된 장치, 시스템, 시스템 성분 또는 장치 성분; (2) 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 또는 폴리뉴클레오티드; 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 발현 벡터; 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포; 또는 이러한 성분중 임의의 것을 하나 이상 포함하는 조성물을 포함하는 하나 이상의 키트 성분; (3) 본원에 개시된 임의의 방법 예를 들어, 치료 또는 예방 방법을 수행하기 위한 지시, 상기 (2)에 정의된 성분 중 임의의 것 또는 이러한 성분 중 임의의 것의 임의의 조성물을 사용하기 위한 지시; 및/또는 본원에 개시된 임의의 장치, 시스템 또는 부품을 작동하기 위한 지시; (4) 상기 성분 또는 조성물 중 하나 이상을 담아두기 위한 용기; 및 (5) 팩키징 물질.

추가의 양상에서, 본 발명은 임의의 장치, 성분, 조성물의 용도, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 검정법을 수행하고/수행하거나, 임의의 장치, 성분, 조성물을 사용하기 위한 전술한 키트, 또는 본원에 개시된 임의의 검정법 또는 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

이하 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이지, 본 발명의 사상 또는 범위를 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 표면에 접근 가능한 잔기의 측정

접근 가능한 표면적(ASA)

컴퓨터 프로그램 액서스(B. Lee and F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379∼400 (1971)) 제2판(저작권; 1983 Yale University)을 사용하여 구조내 각 원자의 접근 가능한 표면적(ASA)을 계산하였다. 이 방법은 통상적으로 크기가 1.4 Å인 프로브를 사용하며, 이 프로브의 중앙부에 의해 형성되는 표면적으로서 접근 가능한 표면적(ASA)을 한정한다. 이 계산을 하기 전에 모든 물 분자 및 모든 수소 원자는 단백질과 직접적인 관련이 없는 기타 원자에서와 같이, 배위 세트로부터 제거되어야 한다.

측쇄의 미분 ASA

측쇄의 미분 ASA는 측쇄에 존재하는 원자의 ASA 총합을 연장된 ALA∼x∼ALA 트리펩티드내 잔기 유형의 측쇄 원자 ASA를 나타내는 수치로 나누어 계산한다. 문헌[Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507∼530]을 참조하시오. 본 실시예에 있어서, CA 원자는 글리신 잔기의 측쇄의 일부분으로 간주되되, 나머지 잔기에 대해서는 그렇지 않다. 다음의 수치는 측쇄에 대한 표준 100% ASA 로서 사용된다.

구조내에서 확인되지 않는 잔기는 그것이 가변성 부위에 존재하는 잔기인 것으로 추측될 때 100% 노출된 것으로 정의한다. NMR 구조 전체를 분석하는 경우, 전체의 평균 ASA 수치가 사용된다.

3차원 구조를 얻을 수 없을 때 표면에 노출되는 잔기의 측정:

3차원 구조를 얻을 수 없을때 또는 구조가 표면 접근 가능성을 측정하기에 충분한 만큼 파악이 불가능하면(예를 들어, CA 원자의 위치만 알 경우), 표면 접근 가능성은 다음과 같이 준비되는 서열의 정렬로부터 추론될 수 있다:

A. 구조가 공지되어 있되, 표면 접근 가능성을 측정하기에 충분할 정도로 파악이 불가능하면:

상세하지 않은 구조는 Molecular Simulations, Inc.에서 시판되는 MODELER 프로그램을 사용하여 서열 군의 공지의 구조에 대한 구조계 서열 정렬에 포함된다.

B. 구조가 공지되지 않으면:

서열은 프로그램 ClustalW의 "프로필/구조 정렬" 사양을 사용하여 제조될 수 있는, 미리 정해진 서열의 정렬 예를 들어, 서열 군의 공지된 구조의 서열에 정렬된다(Thompson외 다수 (1994) Nucleic Acids Research 22:4673∼4680).

상기 A 또는 B에서 얻어지는 서열 정렬로부터, 공지의 구조를 갖는 기타 서열중 하나 이상에 노출된 잔기와 동등한 위치에 있는, 분석될 서열 내존재하는 잔기는 노출된 것으로 정의한다. 노출의 정도는 다른 서열내에 존재하는 동등한 잔기에 대한 가장 큰 값으로 정한다. 분석될 서열이 삽입부에 있을 경우(즉, 다른 서열내에 동등한 잔기가 존재하지 않는 경우), 이 잔기는 완전히 노출된 것으로 정의되며, 이는 회전/루프 부위에 위치할 가능성이 높다. 구조가 상세히 파악되지 않을 경우, 구조내 관찰되지 않는 잔기는 완전히 노출된 것으로 정의되며, 이는 가변성 부위인 것으로 생각된다.

원자간 거리 측정

원자간 거리는 분자 그래픽 소프트웨어 예를 들어, InsightII(등록상표) 98.0 (Molecular Simulations, Inc.)를 사용하면 용이하게 측정된다.

II. 단백질 발현 및 정제

A. CHO 세포로부터의 발현 및 정제

안정적으로 형질 감염되고 G418로 선별되어 클론 세포주를 확립한 중국 햄스터 난소(CHO) K1 세포(ATCC: CCL-61)에서 본 발명의 폴리펩티드 중 일부를 제조하였다.

1. CHO 발현 구조물:

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 SV40 프로모터의 제어하에 있고 N-말단 리더 서열을 암호화하는 서열과 함께 해독 틀 내에 있으며, 임의로는 하나 또는 두 개의 C-말단 태그 서열과도 함께 해독 틀 내에 있는 CHO 발현 벡터에 클로닝하였다. 상기 리더 서열은 일반적인 리더 서열, IFN 알파 6 리더 서열 또는 변형 IFN 알파 6 리더 서열중 어느 하나이고, C-말단 표적은 E-태그(Amersham Biosciences) 및/또는 His-태그를 포함한다. 플라스미드는 XL1-Blue 세포내에서 생산하였다.

2. IFN-알파 폴리펩티드를 발현하는 안정한 서브클론의 선별:

재료:

배양 배지:

G418, FBS 및 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유하는 DMEM-F12 (PSG; Gibco/Invitrogen);

1 x PBS (Gibco/Invitrogen);

트립신/EDTA

항E-태그 항체∼HRP 컨쥬게이트 (Amersham BioSciences)

ECL 플러스 웨스턴 블럿팅 검출 시약 (Amersham BioSciences)

방법:

안정한 형질 감염체를 FBS 및 페니실린을 함유하는 DMEM/F-12 배지내에서 G418로 선별하여 수득하였다. 세포를 50 ㎖ 선별 배지가 담긴 T175 플라스크에 나누어 넣고 이를 37℃인 CO₂ 항온 처리기에서 약 24 시간 동안 또는 세포의 80%가 합류점(confluence)을 형성할 때까지 항온 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 여기에 2.5 ㎖의 트립신/EDTA를 첨가한 다음, 이를 37℃에서 3∼5 분 동안 항온 처리하여 세포를 수집하였다. 세포를 베크만 모델 벤치 톱 원심분리기(Beckman Model bench top centrifuge)에서 30분 동안 1000g에서 원심 분리하여 수집 및 회수하였다. 세포를 PBS 중에서 한 번 세척한 다음, 1% FBS를 함유하는 PBS 3 ㎖내에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 측정한 다음 PBS/FBS를 사용하여 1 × 10⁶ 세포/㎖가 되게 만들었다. 각각의 IFN-알파에 대해서, 폴리펩티드 세포를 DakoCytomation MoFlo 분류기에서 2∼5개의 96 웰 평판(선별 배지 200 ㎖ 함유)으로 분류하였다. 이 평판을 37℃의 항온 처리기에서 10∼14일 동안 항온 처리하여 분류된 세포가 생장하도록 만들었다. 먼저 닷 블럿 분석법으로 고농도 발현에 대한 각 IFN-알파 폴리펩티드에 대해 2개의 서브클론을 선별한 다음, 이들을 항E-태그 항체-HRP 컨쥬게이트 및 화학발광 검출법을 이용하는 웨스턴 블럿 분석법으로 확인하였다.

3. 단백질 발현:

재료:

DMEM-F12 배지(Gibco/Invitrogen)

울트라 CHO 배지(BioWhittaker)

CHO III A 배지(Gibco/Invitrogen)

Ex-Cyte 성장 강화 배지 보충물(Serologicals Proteins)

ITSA (결합 배양용인 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 보충물; Gibco/Invitrogen)

페니실린/스트렙토마이신 (P/S)

FBS, PBS, 트립신

방법:

제1일: 하나의 T-175 플라스크로부터 얻은 세포를 10% FBS 및 1 × P/S 를 함유하는 300㎖의 DMEM-F12가 담긴 하나의 롤러 병(1700㎠)에 넣고 이를 37℃의 CO₂ 항온 처리기에서 성장시켰다.

제3일: 배지를 300㎖의 신선한 DMEM-F12-FBS-P/S로 바꿨다.

제5일: 배지를 1/1000 Ex-Cyte 및 P/S를 함유하는 300㎖의 울트라 CHO로 바꿨다.

제7일: 배지를 300㎖ CHO III A + P/S 생산 배지로 대체하였다.

8일, 9일 및 10일째 되는 날에 상청액을 수집하였다. 이 상청액들을 베크만 쿨터 알레그라 6R 벤치 탑 원심 분리기내 2000g에서 20분 동안 원심 분리하고, 0.2μ PES 보틀 탑 멸균 필터를 사용하여 여과한 다음, 이를 정제하기 위해 4℃에 보관하였다.

4. 단백질 정제:

본 발명의 폴리펩티드 중 일부를 C-말단에 13개의 아미노산 E-태그 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현시켰다. 이러한 폴리펩티드를 E-태그 친화성 컬럼을 사용하여 다음과 같이 정제하였다.

재료:

재조합 파아지 항체 시스템 정제 모듈(Amersham BioSciences, Cat. No.17∼1362∼01).

지름 16㎜이고 높이 25㎜인 (충전층 부피 5 ㎖) 항 E-태그 컬럼과 관련 완충제를 함유하는 정제 키트.

방법:

롤러 병 내에 있는 CHO∼HK1 세포로부터 수집한 상청액을, 2800g에서 20분 동안 원심 분리하고 0.2μ PES 보틀 탑 필터 모듈을 사용하여 여과함으로써 투명하게 만들었다. RPAS 결합 완충제로 평형화된 E-태그 컬럼으로 이 상청액을 로딩(150 ㎝/h; 5 ㎖/분)하였다. 이 컬럼을 5CV(컬럼 부피)의 결합 완충제로 세척하고, 단백질을 RPAS 용리 완충액과 함께 75 ㎝/h(2.5 ㎖/분)로 용리시켰다. 용리 분획을 0.05 부피의 1 M Tris∼Cl(pH 8.0)로 중화시키고, PBS로 투석시킨 다음, 0.1∼1.5 ㎎/㎖로 농축시킨 후, 그 분취액을 -80℃에 냉동 보관하였다. 검정용 시료를 0.5% BSA를 함유하는 PBS중 50 ㎍/㎖의 농도로 제조하여, 그 분취액을 -80℃에 냉동 보관하였다. 통상적으로 시료를 SDS-PAGE로 분석한 다음, Invitrogen으로부터 공급받은 재료, 시약 및 방법으로 쿠마쉬 염색을 하였다.

통상적으로 단백질 농도를 IFN-알파 표준을 사용하는 BCA 검정법으로 측정하였는데, 이 농도는 아미노산 분석에 의해 확인될 수 있다.

B. 이. 콜라이로부터의 발현 및 정제

본 발명의 폴리펩티드 중 일부를 이. 콜라이에서 봉입체(inclusion body)로서 생산하였으며, 이를 다음과 같이 정제 및 재폴딩하였다.

1a. 이. 콜라이 발현 구조물

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 이. 콜라이내에서 보다 발현이 잘 되도록 개질시켰다. 이러한 개질은 34∼39번 뉴클레오티드 위치의 희귀 Arg-Arg 코돈 쌍인 AGGAGG와 64∼69번 뉴클레오티드 위치의 AGGAGA(위치 번호는 서열 번호 59에 관한 것임)를 각각 이. 콜라이내에서 선호되는 Arg-Arg 코돈쌍인 CGTCGC로 치환시키거나, 또는 암호화 서열 내희귀한 Arg 코돈의 대부분 또는 전부인 AGA 및 AGG를 이. 콜라이내에서 선호되는 Arg 코돈인 CGC 또는 CGT로 치환하는 것을 포함한다. 메티오닌 코돈(ATG)도 또한 암호화 서열의 5' 말단에 부가되었다. 이러한 방식으로 개질된 대표적인 암호화 서열로서는 서열 번호 60∼61, 서열 번호 63∼64, 서열 번호 66∼67, 서열 번호 69∼70, 서열 번호 72∼73, 서열 번호 75∼76, 서열 번호 78∼79, 서열 번호 81∼82, 서열 번호 84∼85 및 서열 번호 87∼88을 포함한다. 암호화 서열은 T7 프로모터의 조절하에 있고 선별 마커가 카나마이신인 pET-42 발현 벡터(Novagen), 또는 T7 프로모터의 조절하에 있고 선별 마커가 카나마이신인 pQE80-칸 발현 벡터(Qiagen)으로 삽입하였다.

1b. 단백질 발현

인터페론 암호화 서열을 함유하는 pET-42 벡터를 표준적인 방법을 사용하여 이. 콜라이 변종 예를 들어, BL21 (DE3)으로 형질 전환시키고, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 아가 평판상에 도말한 다음 37℃에서 항온 처리하였다. 18∼24 시간 경과후, 3개의 콜로니를 각각 찍어내어 이를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 보유하는 2xYT 5㎖ 함유 튜브에 옮기고, 이를 37℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 밤새 처리한 배양액을 사용하여 50 ㎍/㎖ 카나마이신과 2xYT를 100㎖ 함유하는 2세트의 플라스크에 접종하였다. 37℃에서의 이 배양액의 성장 여부를 OD₆₀₀에서 모니터하였다. 이 배양액을 37℃에서 3 시간 동안 OD₆₀₀이 0.5∼0.8가 되도록 1 mM IPTG로 유도시켰다. 펠렛화된 세포를 SDS 시료 완충액 중에서 용해시켜 IPTG 유도된 배양액의 발현 여부를 SDS-PAGE로 분석하였다. 유도되지 않은 해당 배양액 세트를 사용하여 1㎖ 분취액을 얻어내어 동결 세포 및 25% 글리세롤을 첨가함으로써 -80℃인 동결 저장물을 준비하였다. 인터페론 암호화 서열을 함유하는 pQE80∼Kan 벡터를 이. 콜라이 변종 W3110 또는 W3110-fhuA에 형질 전환시켰다. 발현 여부는 전술한 바와 같이 확인하였다.

밤새 처리한 배양액 25㎖와 4x1L 2xYT 배지 및 카나마이신을 항온 처리하여 더욱 큰 규모의 진탕 플라스크 발현을 수행하였다. OD₆₀₀에서 배양액을 모니터하고, 이를 0.5∼0.8 OD 단위에서 1mM IPTG로 유도하였다. 유도 후 3시간 경과한 후 세포를 5000g에서 원심 분리하여 수집한 다음 이를 -80℃에 보관하였다. 이것을 프렌치 프레스 또는 APV 1000 균질기(10,000 psi)에 2∼3회 통과시켜 세포를 분쇄하고, "IB의 분리" 및 기타 후속 섹션에 기술된 바와 같이 처리하였다.

미량 원소 용액 및 40mg/ℓ 카나마이신이 보충된 테러픽 발효액(Terrific Broth; TB) 배지가 들어있는 10ℓ들이 비.브라운(B.Braun) 생물 반응기에서 유가식 발효를 수행하였다. 이 생물 반응기에 밤새 처리한 TB 배지중 배양액 400㎖를 접종하여 발효를 개시하였다. 초기 성장 단계 동안 교반 속도를 바꾸어 줌으로써 용해된 산소(DO)를 50%로 유지시켰다. 배양액의 OD₆₀₀이 5.0에 도달하였을 때, 글리세롤/아미노산을 0.5㎖/분으로 공급하기 시작하였고, 이때의 교반 속도는 1000rpm으로 맞추었다. 나머지 발효 과정 동안에는 DO가 40%로 유지되도록 공급 속도를 조정하였다. OD₆₀₀이 25에 도달하였을 때, 배양액에 IPTG를 첨가하여 최종 농도가 1 mM이 되도록 하였다. 유도후 3시간 경과하였을 때, 베크만 원심분리기에서 10000 xg로 원심 분리하여 세포를 수집한 다음, 세포 평판을 ∼60℃에 보관하였다. 수집시 OD₆₀₀는 통상적으로 약 35∼40이었다.

2a. 이. 콜라이 발현 구조물(고농도 발현)

이하의 실시예는 이. 콜라이 발현 시스템(EP 0972838)에 클로닝된 2개의 대표적인 본 발명의 폴리펩티드 발현이, 이. 콜라이내 진핵 세포 유전자의 발현 수준을 높일 수 있음을 보여주는 것이다. 14epi8(서열 번호 13) 및 25epi19(서열 번호 38)의 아미노산 서열에 상응하는 암호화 서열(둘 다 N-말단에 부가 Met 함유)을, 희귀 코돈 생성을 방지하는 "역번역"/"EcoHigh-데이터베이스" 기능을 갖는 서열 분석 프로그램 GCG(Genetic Computer Group, Inc., Wisconsin USA, Version 7.1, March 1992) 기능 및 유전자 발현에 유해한 잠재 2차 구조를 예측 및 방지하기 위한 MFold/Plotfold (-menu=f 또는 -menu=g) 기능을 사용하여 mRNA 2차 구조 및 코돈 관행(Griswold외 다수, Protein Expr Purif. 2003 Jan;27(1):134∼42)에 따라서 최적화시켰다. 이러한 방식으로 최적화된 암호화 서열을 서열 번호 89 및 서열 번호 90에 각각 제공하였다.

최적화된 DNA 서열을 부가 lacI 유전자와 함께 OripBR-URA3에 클로닝하였다. 생성된 벡터 즉, OripBR-URA3-lacI-14epi18-mut2 (도 6) 및 OripBR-URA3-lacI-25epi19-mut (도 7)을 반응성(competent) 이. 콜라이 UT5600(ΔpyrF) 세포에 형질 전환시켰다(EP 0972838). 형질 전환된 세포를 우라실을 첨가하지 않은 최소 M9∼배지 아가 평판 상에서 선별하였다.

M9-아가 평판:

멸균 아가로스 저장 용액(최종 농도 15g/ℓ) 430㎖

M9-염 용액 50 ㎖

1M MgS0₄ 0.5 ㎖

1M CaCl₂ 0.05 ㎖

20% 글루코스 5 ㎖

비타민 B1 (c = 1 ㎎/㎖) 2.5 ㎖

10% 코사미노산 25 ㎖

L-트립토판 (c = 5 ㎎/㎖) 5 ㎖

L-루신 (c = 5 ㎎/㎖) 5 ㎖

L-프롤린 (c = 5 ㎎/㎖) 2.5 ㎖

2b. 단백질 발현

상기 2a에 따라서 형질 전환된 세포를 진탕 플라스크에 접종한 다음, 이를 37℃에서 배양하였다. 여기에 1 mM IPTG를 첨가하여 OD₅₇₈ = 1에서 유도시켰다. 7시간 경과후 세포를 수집하고, SDS-PAGE 겔 상에서 세포 펠렛을 분석하였다. 사용된 배지는 다음과 같다:

코사미노산 120 g

NH₄Cl 3.9 g

트립토판 5.5 g

루신 5.5 g

프롤린 5.5 g

4300 ㎖ H₂0에 용해된 글리세린 85 g, 및

K₂HP0₄*3H₂0 91.5 g

600 ㎖ H₂0중에 용해된 시트르산 8.0 g, 및

티아민(5 mg/ml) 17.5 ㎖

MgS0₄ x 7H₂0 (1M) 17.5 ㎖

pH = 7.0

(H₂O를 사용하여 5000 ㎖로 맞춤)

3. 봉입체(IB)의 분리, 용해, 설폰화 및 재폴딩

IB를 분리하기 위하여, 해동된 세포 평판을 10 ㎖/g 세포 반죽(cell paste)이 되도록 1 × PBS에서 재현탁시킨후, 균질 슬러리가 얻어질 때까지 혼합하였다. 이 세포를 17,000∼19,000 psi의 마이크로플루다이저(microfluidizer)에 2회 통과시켜 분쇄하였다. 세포 용해물에 1% Tris-X100을 가하고, 10분 동안 혼합한 다음, 2∼8℃, 60분 동안 10,000g에서 원심 분리시켜 IB를 회수하였다. 상기 IB 펠렛을 1% TritoN-X100을 함유하는 PBS로 재현탁하여 1회 세척하고, 상기와 같이 원심 분리하여 회수한 다음, 이를 -80℃에 보관하였다.

3a. 용해/재폴딩 방법 1:

IB를 용해시키기 위하여, IB 펠렛을 우레아 완충액(50 mM Tris-Cl, 200 mM NaCl, 8 M 우레아-HCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8.0)중에 재현탁시켜 세포 반죽 1g당 10 ㎖ 완충액이 되도록 만들었다. 이 현탁액을 30분 동안 혼합한 다음, 2∼8℃, 30분 동안 10,000 g에서 원심 분리시켰다. 펠렛을 DTT를 함유하지 않는 우레아 완충액중에서 1회 재현탁시켜 세척하고, 전술한 바와 같이 원심 분리한 다음 물로 2회 세척하였다. 세척된 펠렛을 구아니딘 완충액(50 mM Tris-Cl, 200 mM NaCl, 8 M 구아니딘-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)중에 용해시켜 펠렛 1g당 10 ㎖ 완충액이 되도록 만들고, 이를 30∼60분 동안 혼합시킨 다음 2∼8℃, 10,000g에서 30분 동안 원심 분리하였다. 용해된 IFN을 함유하는 상청액에 10 ㎎/㎖ 아황산나트륨 및 5 ㎎/㎖의 사황산나트륨을 가하여, 2∼8℃에서 16 시간 동안 일어나는 술폰화 반응을 개시하였다. 술폰화 이후, IFN 용액을 물로 2배 희석시키고, 이를 2∼8℃, 10,000g에서 원심 분리하여 IFN 펠렛을 회수하였다. 이 펠렛을 물로 2회 세척한 다음 전술한 바와 같이 구아니딘 완충액에 재현탁시켰다. 술폰화된 IFN의 단백질 농도를 280㎚에서의 흡광도를 이용하여 측정하였다.

재폴딩 과정은 2∼8℃의 구아니딘 완충액중 술폰화된 IFN을 재폴딩 완충액(50 mM Tris-Cl, 20 mM NaCl, 2 mM 환원 글루타치온, 1 mM 산화 글루타치온)중 최종 농도 100 ㎎/㎖가 될 때까지 희석시킴으로써 개시되었다. 재폴딩은 2∼8℃에서 6∼8 시간 동안 천천히 혼합한 후, 여기에 CuSO₄를 첨가하여 최종 농도 2μM로 만든 다음 16∼20 시간 동안 추가로 재폴딩시킴으로써 수행되었다. 재폴딩 반응의 과정은 SDS-PAGE 및 역상 HPLC로 모니터되었다.

3b. 용해/재폴딩 방법 2:

14epi18을 용해시키기 위하여, IB 펠렛을 구아니딘 완충액(7 M Guanidine, 20 mM Na₂HP0₄, 10 mM DTE, pH 8.0) 중에 IB 반죽 1 g당 4 ㎖ 완충액이 되도록 재현탁시켰다. 이 현탁액을 2 시간 동안 혼합하고, 용해시킨 다음, 7M 구아니딘 완충액 및 20 mM NaH₂P0₄ (pH 5.0)를 함유하는 완충액에 대해 10 kDa 컷-오프 막(cuT-off membranes)을 사용하여 실온에서 8 부피 이상으로 다이아필터링하였다.

재폴딩을 위해, 상기 용해된 단백질을 20 mM Na₂HP0₄, 0.8 M 아르기닌 및 2 μM CuS0₄(pH 7.5)를 함유하는 폴딩 완충액으로 희석시켰다. 2∼8℃에서 72 시간 동안 천천히 혼합하여 최종 단백질 농도가 약 0.5 ㎎/㎖ 단백질이 될 때까지 재폴딩을 수행하였다. 상기 재폴딩 반응 진행은 역상 HPLC로 모니터하였다.

3b. 용해/재폴딩 방법 3:

25epi19를 용해시키기 위하여, IB 슬러리를 용해 완충액(8 M 염화구아니디늄, 100 mM DTT, 50 mM Tris pH 8.3)중에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 30분 동안 실온에서 혼합하였다. 이후 HCl을 사용하여 pH를 4.5로 맞추었다. 5K 막을 사용하여 용해물을 더 농축시킨 다음, HCl로 pH 4.5로 맞춘 10배 부피의 7.2 M 염화구아니딘에 대해 다이아필터링하였다.

재폴딩을 위해, 상기 용해된 단백질을 폴딩 완충액(0.8 M 아르기닌, 50 mM 인산칼륨, 2 mM GSH, 1 mM GSSG, pH7.8)으로 희석시켰다. 재폴딩은 2∼8℃에서 밤새도록 수행되었으며, 이때의 최종 농도는 약 1 ㎎/㎖ 단백질이었다.

4. 정제

4a. 정제 방법 1:

재폴딩된 IFN을 3단계 크로마토그래피로 정제하였다. 재폴딩 용액을 80% 암모늄 설페이트 포화 농도(중량/부피)로 만들고, 이를 0.2 μM 필터로 통과시킨 다음 에퀼 완충액(50mM Tris-Cl, 0.8 M 암모늄 설페이트, pH 8.0)으로 평형화된 20 ㎖들이 부틸 세파로스 급속 유동 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 컬럼(Amersham Biosciences)에 200 ㎝/h의 속도로 로딩하였다. 상기 HIC 컬럼을 8 컬럼 부피(CV)의 에퀼 완충액으로 세척하고, 이를 8CV의 세척 완충액(50 mM Tris-Cl, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 8.0)으로 세척하였다. IFN을 15% 포화 농도의 암모늄 설페이트를 첨가하거나 또는 첨가하지 않은 채, 50 mM Tris∼HCl(pH8.0)과 함께 용리시켰다.

0.5 M 아세트산나트륨을 사용하여 상기 HIC 풀을 50 mM 아세트산 나트륨으로 맞추고(pH 4.5 저장액), 이를 2배 희석시켰다. 이와 같이 조정된 풀을 90 ㎝/h의 속도로, 50 mM 아세트산나트륨 및 100 mM NaCl(pH 5.0)로 평형화된 5 ㎖들이 HiTrap CM 세파로스 급속 유동 컬럼(Amersham Biosciences)에 로딩시켰다. 로딩후 컬럼을 평형 완충액 5 CV로 세척하고, 20 CV(구배 = 100∼650 mM) NaCl로 IFN을 용리시켰다. 280 ㎚에서의 흡광도에 근거하여 IFN을 함유하는 피크 분획을 풀링하였다.

2 M 1,3-디아미노프로판 저장액(pH 약 10)을 사용하여 CM 세파로스 풀을 20 mM 1,3-디아미노프로판으로 조정하였다. 이 시료를 200 ㎝/h의 속도로, 50 mM 1,3-디아미노프로판산나트륨 및 100 mM NaCl(pH 10.0)로 평형화된 5 ㎖들이 HiTrap Q 세파로스 급속 유동 컬럼(Amersham Biosciences)에 로딩시켰다. 로딩후 컬럼을 평형 완충액 5 CV로 세척하고, 20 CV(구배 = 100∼650 mM) NaCl 또는 100∼1000 mM NaCl로 IFN을 용리시켰다. 280 ㎚에서의 흡광도에 근거하여 IFN을 함유하는 분획을 풀링한 다음, 이를 250∼500 부피의 50 mM 아세트산나트륨, 150 mM NaCl(pH 5.0) 또는 50 mM 붕산나트륨(pH 9.0)에 대해 즉시 투석하였다. 투석후, IFN 시료를 생물안전 캐비넷(biosafety cabinet)내에서 0.2 μM 필터로 멸균 여과시키고, 280 ㎚에서의 흡광도로 농도를 측정한 다음, 이 시료를 최장 1주일 동안 2∼8℃에 보관하거나, 또는 이 시료 분취액을 그보다 더 오랜 기간 동안 ∼80℃에 보관하였다. 활성 검정을 위하여, 이 시료를 일반적으로 0.5% BSA, PBS (pH 7.4) 5, 20 및 50 ㎍/㎖로 제형화하여 -80℃에 동결 보관하였다.

4b. 정제 방법 2:

2단계 크로마토그래피를 사용하여 재폴딩된 14epi18을 정제하였다. KCl로 재폴딩 용액의 pH를 8.0 및 약 190 mS/㎝으로 맞추고, 5㎛ 필터로 여과한 다음, 2.0 M KCl, 20 mM K₂HP0₄, 0.8 M 아르기닌(pH 8.0)으로 구성된 평형화 완충액중에서 평형화시킨 부틸-세파로스 급속 유동 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 컬럼(General Electric Healthcare) 상에 75 ㎝/h의 속도로 로딩하였다. 상기 HIC 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 2.0 M KCl, 20 mM K₂HP0₄, 0.8 M 아르기닌(pH 8.0)으로 세척하였다. 14epi18을 0.4 M KCl, 20 mM K₂HP0₄(pH 8.0)와 함께 용리시켰다. 용리는 역상 HPLC로 모니터하였다.

용리액을 증류수로 희석시켜 전도율 약 3 mS/㎝가 되도록 만들었다. pH는 6.8로 맞추었다. 이렇게 조정된 풀을 25 mM 아세트산암모늄(pH 6.8)으로 평형화시킨 Q-세파로스 급속 유동 컬럼(GE Healthcare) 상에 50 ㎝/h의 속도로 로딩하였다. 로딩후, 컬럼을 평형화 완충액으로 세척하였다. 14epi18에 pH 4.0 까지 선형 구배를 걸어주어 용리시켰다. 폴딩된 14epi18을 함유하는 피크 분획을 역상 HPLC 분석법을 기초로 하여 풀링시켰다.

4c. 정제 방법 3:

2단계 크로마토그래피를 사용하여 재폴딩된 25epi19를 정제하였다. 재폴딩 용액을 1.3 M NaCl로 맞추고 그 용액을 2개의 필터(0.8/0.3 ㎛ → 0.45/0.2 ㎛)가 합체된 필터로 여과하였다. 단백질을 평형 완충액(0.8 M 아르기닌, 1.3 M 염화나트륨, 50 mM 인산칼륨, pH 8.0)으로 평형화된 부틸 세파로스 급속 유동 컬럼(General Electric Healthcare) 상에 50∼150 ㎝/h로 로딩하였다. 시료를 로딩시킨후, 컬럼을 3 CV 평형화 완충액과 3 CV 세척 완충액(20 mM 인산칼륨, 2 M 염화나트륨, pH 7.5)으로 세척하였다. 용리 단계는 용리 완충액(20 mM 인산칼륨, pH 7.5)을 50∼100 ㎝/h의 속도로 흘려보냄으로써 수행하였다. UV 280에서의 측정치에 따라서 피크를 풀링하였다.

전도율이 10 mS/㎝ 이하임을 확인한 후, 풀을 30 mM 아세트산암모늄(pH 5.9)로 평형화된 Q-세파로스 급속 유동 컬럼(GE Healthcare)상에 50∼75 ㎝/h의 속도로 로딩하였다. 로딩후, 기준치(UV280)에 도달할 때까지 컬럼을 평형화 완충액으로 세척하였다. 25epi19에 pH 3.5가 될 때까지 선형 구배를 걸어주었다. 폴딩된 25epi19를 함유하는 피크 분획을 역상 HPLC 분석 결과 및 SDS-PAGE 결과에 따라서 풀링하였다.

III. 활성 검정법

A1. HuH7-EMCV 항바이러스 검정법

이하에서는 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 컨쥬게이트의 항바이러스 활성에 대한 대표적인 검정법을 제시하였다. 본 검정법은 약물의 항바이러스 효능을 평가하는데 사용되는 세포계 투여량 반응 검정법으로서, 때때로 "세포 독성 효과로부터의 보호"(또는 PCPE) 검정법 또는 세포 변성 효과(CPE) 억제 검정법이라고도 부른다. 요약하면, 세포를 약물로 항온 처리한 다음 바이러스에 노출시킨다. 약물이 존재하지 않는 경우에는 바이러스에 노출된 세포는 사멸한다. 약물의 농도를 증가시킴에 따라서 더 높은 비율의 세포가 생존하게 된다. 생존하는 세포의 수를 직접 측정하거나(예를 들어, 눈으로 계측), 또는 대사율을 측정하여 간접적으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 대사 염료 예를 들어, MTT 또는 WST-1을 세포 생존율의 간접 측정 수단으로서 사용할 수 있다. 생세포는 이러한 염료를 대사화하여 분광법(광학 밀도)으로 정량가능한 대사 산물을 생성한다.

재료 및 시약:

HuH7 세포: 사람 간암 세포주(Dr. Michael Lai 제공, USC∼Surgery Department, LosAngeles, CA). 이 세포주는 일본 오사카에 위치하는 셀 뱅크 오브 재패니즈 컬렉션 오브 리서치 바이오소스(Cell Bank of Japanese Collection of Research Bioresources; JCRB)/헬스 사이언스 리서치 리소스 뱅크(Health Science Research Resources Bank (HSRRB)로부터도 구할 수 있다. HuH7 세포주는 원래 J. Sato 박사 실험실(Okayama University School of Medicine)에서 분화가 잘된 간세포 암종을 보유하는 일본인 남성 환자(57세)로부터 확립된 것이다[Nakabayashi, H.,외 다수 (1982) Cancer Res. 42(9):3858∼63)]. 이 세포주는 B형 간염 표면 항원에 대하여 음성이었다.

VERO 세포: 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 신장 세포주 (ATCC # CCL-81). 이 세포주는 1962년 일본 치바현에 위치하는 치바 대학교에서 정상인 성체 아프리카 녹색 원숭이의 신장으로부터 얻은 것이다. 1964년에 VERO 세포주(기탁 번호 93)을 국립 보건원(NIH)으로 옮겼다.

뇌심근염 바이러스(EMCV) : 변종 조직 배양액(ATCC # VR-129B). 뇌심근염 바이러스(EMCV)의 변종 조직 배양액을 ATCC(# VR-129B)로부터 구입하였다. HuH7 항바이러스 검정을 위하여, 고 역가의 바이러스 저장물을 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 생산하였다. L929 세포상 플라크 검정법으로 베로 생산 EMCV 저장물의 바이러스 역가를 측정한 결과 1.1 x 10⁸ PFU/㎖였다.

완전 DMEM:

둘베코 개질 이글 배지(DMEM, Gibco Cat. No. 11965∼092)

10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 x 페니실린-스트렙토마이신(PS, Gibco Cat. No. 15140∼122)

환원 혈청 DMEM:

둘베코 개질 이글 배지(DMEM, Gibco Cat. No. 11965∼092)

2% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 x 페니실린-스트렙토마이신(PS, Gibco Cat. No. 15140∼122)

트립신/EDTA (Gibco Cat. No. 25300∼054)

WST-1 (Roche; Cat. No.1 644 807)

HuH7 세포를 습도 5%인 CO₂ 항온 처리기내에 있는 37℃의 완전 DMEM 배지중에 넣었다. 이 세포를 트립신으로 수집하고, 합류 상태 최종 밀도가 T175 플라스크내 25 ㎖당 1∼2 ×10⁶ 세포가 되었을 때 1주일에 두 번씩 나누었다. 검정 하루전, 세포를 트립신 처리하고 새로운 T175 플라스크에 25 ㎖당 4.5 ×10⁶ 세포가 될 때까지 접종하여, 세포가 검정 전 대수기에 있는지 여부를 확인하였다.

HuH7-EMCV 항바이러스 검정 과정:

고역가의 EMCV 바이러스 저장물을 VERO 세포내에서 증폭시켰다. HuH7 세포 단일층 상에서의 EMCV 바이러스 사멸 곡선을 통하여 세포의 95%가 사멸하는 치명적인 농도(LC₉₅)를 측정하였다. 간단히 말해서, HuH7 세포를 첫날에 96-웰 미소역가 평판상에 웰 당 6 x 10⁴ 세포로 도말하였다. 바이러스를 DMEM + 2% FBS 중에서 1:3으로 10회 연속 희석시키고, 이를 두 번째 날에 세포에 첨가하였다. 감염후 24 시간 경과 시, 테트라졸륨 염 대사 검정법, WST-1 (Roche)으로 세포 생존 여부를 측정하였다. HuH7-EMCV 검정법에 대하여 측정된 LC₉₅에서의 MOI는 0.034 (PFU/세포)였다. 바이러스 저장물의 역가는 L929 세포 상에서 표준 플라크 검정법으로 측정하였다.

검정 수행 첫날, 트립신으로 대수기의 HuH7 세포를 수집하여, 이를 환원 혈청 DMEM에 재현탁하고, 원심 분리로 농축시켰다. 5 T175 플라스크 세포에 해당하는 세포 펠렛을 10 ㎖의 환원 혈청 DMEM중에 재현탁시키고, 이를 40 미크론 나일론 세포 여과기로 여과시킨 다음, 혈구 계측기로 계수하였다. 트리판 블루 배제법으로 세포 생존능을 측정하였다. 이후 세포를 환원 혈청 DMEM에 최종 밀도 6 × 10⁵ 세포/㎖가 될 때까지 재현탁시켰다. 희석 세포 100 ㎕를 96-웰 검정 평판의 각 웰에 각각 가하고(6 ×10⁴ 세포/웰), 이 평판을 습도가 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 4 시간 동안 항온 처리하였다.

투여량-반응 분석법으로 "참고" 인터페론 알파 및 본 발명의 인터페론 알파 폴리펩티드("시험 시료")의 효능을 측정하였다. 평판 당 일반적으로 하나의 시험 시료과 하나의 참고 IFN-알파가 존재하며, 각각 IFN-알파 처리/EMCV 감염된 세포의 복제 곡선 3개와, IFN-알파 처리만 한 세포의 복제 곡선 2개가 얻어진다. IFN-알파 처리만 한 세포가 HuH7 세포상 IFN-알파의 잠재적 항증식 효과를 억제하는지 여부에 대하여 검정하였다. 참고 IFN-알파에 대한 투여량-반응 곡선은 일반적으로 100 ng/㎖에서 0.05 ng/㎖까지 8회에 걸쳐서 3배 희석시킨 결과로 이루어졌다. IFN-알파 시험 시료에 대해서는, 일반적으로 5 ng/㎖에서 0.002 ng/㎖까지 3배 희석시켰다. 바이러스 처리되었으나, IFN-알파 처리되지 않은 세포의 웰 8개와 세포만이 존재하는 웰(대조군)을 전개시켰다.

환원 혈청 DMEM을 사용하여 IFN-알파 희석액을 준비하였다. 희석된 IFN-알파 제제 100 ㎕를 검정용 평판으로 옮겼다. 이 검정용 평판을 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기에서 16 시간 동안 항온 처리하였다.

이틀째 되는 날, 세포에 EMC 바이러스를 접종하였다. 검정용 평판의 각 웰로부터 배지를 흡입해 뽑아냈다. EMCV 저장물을 DMEM + 2% FBS 중에서 1:5400으로 희석시켰다. 희석된 바이러스 100 ㎕(처음 접종한 세포당 0.034 바이러스 입자에 해당)를 각 웰에 첨가하였다. 이 세포를 바이러스와 함께 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 24 시간 동안 항온 처리하였다.

사흘째 되는 날, 각 웰에 생존하는 세포의 수를 WST-1 검정법으로 정량하였다. 검정용 평판의 각 웰로부터 배지를 흡입하여 뽑아냈다. 상기 WST-1 시약을 환원 혈청 DMEM중에서 1:20으로 희석시키고, 이 희석된 WST-1 시약 100 ㎕를 각 웰에 가한 다음, 세포를 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 60분 동안 항온 처리하였다. 각 웰에 생존하는 세포의 수를 평판 판독기로 450 ㎚에서의 OD를 측정함으로써 정량하였다.

분석:

IFN-알파 참고 시료 및 시험 시료의 항바이러스 효능을 다음의 등식으로 계산하였다:

항바이러스 효능 = (생존 세포_C+I+V - 생존 세포_C+V)/(생존 세포_C+I - 생존 세포_C+V)*100%

[여기서, C + V = HuH7 세포 + EMCV, C + I = HuH7 세포 + IFN-α이고 C + I + V = HuH7 세포 + IFN-α + EMCV 임]

비선형 회귀 분석으로(GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc.) 사용) 투여량-반응성 곡선을 분석하였다. 다음의 등식을 사용하여 곡선을 다듬었다(curve fit):

Y = 최저값 + {(최고값-최저값)/(1 + 10^{(LogEC50-X)기울기})}

최저값은 최저 평탄역에서의 Y값이고; 최고값은 정점 평탄역에서의 Y값이며; LogEC50은 반응이 최저값과 최고값의 중간일 때의 X값이다. 레벤버그∼마르쿼드(Levenberg-Marquardt) 방법을 사용하여 알고리즘을 최적화하였다.

A2. HeLa-EMCV 및 WISH-EMCV 항바이러스 검정법

HeLa(사람 자궁경부 암종 유래 세포주) 및 WISH (사람 양막 조직 유래 세포주) 세포는 또한 본 발명의 인터페론 알파 폴리펩티드 및 컨쥬게이트의 항바이러스 효능을 평가하는 유용한 대리 검정법을 제공한다. 본 검정법은 전술한 HuH7-EMCV 검정법과 유사한 방식으로 수행하되, 다음과 같은 변형을 가하여 수행하였다.

재료 및 시약:

HeLa 세포: 사람 자궁경부암 세포주(ATCC # CCL-2). 이 HeLa 세포주는 35세 여성의 자궁경부 선암종으로부터 유래된 것이다. 상기 HeLa 세포는 사람 유두종 바이러스(HPV-18) 서열을 보유하는 것으로 보고되었다. 이 세포주의 ATCC 기탁 번호는 107이다.

WISH 세포: 사람 상피 세포주(ATCC # CCL-25). 이 WISH 세포주는 배양후 35일 경과시의 1차적 사람 양막 세포를 계대 배양하였을 때 변형되어 나타나는 콜로니로부터 확립되었다. 이 WISH 세포주는 HeLa 마커 염색체를 포함한다. 이 세포의 ATCC 기탁 번호는 170이다.

L-929 세포: 쥐 섬유아세포주(ATCC # CCL-1). 이 L-929 세포주는 1948년 근원 변종인 변종 L를 95회 계대 배양하여 분리한 단일 세포 클론이다. 태어난 지 100일 된 정상 수컷 C[3]H/An 마우스의 피하 유륜 조직 및 지방 조직으로부터 변종 L을 분리하였다.

EMCV: 조직 배양 적응된 변종(ATCC # VR-129B). 뇌척수 심근염 바이러스(EMCV)의 조직 배양 적응된 변종을 ATCC(# VR-129B)로부터 구입하였다. HeLa 및 WISH의 항바이러스 검정을 위하여, 고역가 EMCV 저장물을 L929 세포 내에서 제조하였다. L929 제조된 바이러스 저장물의 바이러스 역가는 L929 세포상 플라크 검정 결과를 기초로 하였을 때 4.0 × 10⁸ PFU/㎖였다.

완전 MEM:

최소 필수 배지 (MEM, Gibco Cat. No.10370-021)

10% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (PSG, Gibco Cat. No. 10378-016)

1mM 피루브산나트륨 (Gibco Cat. No. #11360-070)

환원 혈청 MEM:

최소 필수 배지 (MEM, Gibco Cat. No. 10370-021)

2% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 × 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (PSG, Gibco Cat. No. 10378-016)

1 mM 피루브산나트륨 (Gibco Cat. No. #11360-070)

습도 5%이고 37℃인 CO₂ 항온 처리기에서 HeLa 세포를 완전 MEM 배지에 넣었다. 이 세포를 트립신으로 수집한 다음, 합류 상태 최종 밀도가 T175 플라스크내 25 ㎖당 2∼4 ×10⁶ 세포가 될 때까지 1주일에 두 번씩 나누었다. 검정 하루전, 세포를 트립신 처리하고 새로운 T175 플라스크에 25 ㎖당 6 ×10⁶ 세포 밀도가 될 때까지 접종하여, 세포가 검정 전 대수기에 있는지 여부를 확인하였다.

습도 5%이고 37℃인 CO₂ 항온 처리기에서 WISH 세포를 완전 MEM 배지에 넣었다. 이 세포를 트립신으로 수집한 다음, 합류 상태 최종 밀도가 T175 플라스크 내 25 ㎖당 5∼6 ×10⁶ 세포가 될 때까지 1주일에 두 번씩 나누었다. 검정 하루전, 세포를 트립신 처리하고 새로운 T175 플라스크에 25 ㎖당 10 ×10⁶ 세포가 될 때까지 접종하여, 세포가 검정 전 대수기에 있는지 여부를 확인하였다.

HeLa-EMCV 항바이러스 검정 과정:

검정 수행 첫날, 트립신으로 대수기의 HeLa 세포를 수집하여, 이를 환원 혈청 MEM에 재현탁하고, 원심 분리로 농축시켰다. 5개의 T175 플라스크 세포에 해당하는 세포 펠렛을 10 ㎖의 환원 혈청 MEM중에 재현탁시키고, 이를 40 미크론 나일론 세포 여과기로 여과시킨 다음, 쿨터 계측기로 계수하였다. 혈구 계측기를 사용하는 트리판 블루 배제법으로 세포 생존능을 측정하였다. 이후 세포를 환원 혈청 MEM에 최종 밀도 1 × 10⁵ 세포/㎖가 될 때까지 재현탁시켰다. 희석 세포 100 ㎕를 96-웰 검정 평판에 각각 가하고(1 × 10⁴ 세포/웰), 이 평판을 습도가 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 24 시간 동안 항온 처리하였다.

투여량-반응 분석법으로 "참고" 인터페론 알파 및 본 발명의 인터페론 알파 폴리펩티드("시험 시료")의 효능을 측정하였다. 평판 당 일반적으로 하나의 시험 시료과 하나의 참고 IFN-알파가 존재하며, 각각으로부터 IFN-알파 처리/EMCV 감염된 세포의 복제 곡선 3개와, IFN-알파 처리만 한 세포의 복제 곡선 2개가 얻어진다. IFN-알파 처리만 한 세포가 HeLa 세포상 IFN-알파의 잠재적 항증식 효과를 억제하는지 여부에 대하여 검정하였다. 참고 IFN-알파에 대한 투여량∼반응 곡선은 일반적으로 60 ng/㎖에서 0.0008 ng/㎖까지 8회에 걸쳐서 5배 희석시켰다. IFN-알파 시험 시료에 대해서는, 일반적으로 5 ng/㎖에서 0.00006 ng/㎖까지 5배 희석시zls 결과로 이루어졌다. 바이러스 처리되었으나 IFN-알파 처리되지 않은 세포의 웰 8개와 세포만이 존재하는 웰(대조군)을 전개시켰다.

환원 혈청 MEM을 사용하여 IFN-알파 희석액을 준비하였다. 희석된 IFN-알파 제제 100 ㎕를 검정용 평판으로 옮겼다. 이 검정용 평판을 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기에서 16 시간 동안 항온 처리하였다.

사흘째 되는 날, 세포에 EMC 바이러스를 접종하였다. 검정용 평판의 각 웰로부터 배지를 흡입해 뽑아냈다. EMCV 저장물을 MEM + 2% FBS내에서 1:133으로 희석시켰다. 희석된 바이러스 100 ㎕(3 × 10⁵ 바이러스 입자에 해당)를 각 웰에 가하였다. 이 세포를 바이러스와 함께 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 24 시간 동안 항온 처리하였다.

나흘째 되는 날, 각 웰에 생존하는 세포의 수를 WST-1 검정법으로 정량하였다. 검정용 평판의 각 웰로부터 배지를 흡입하여 뽑아냈다. 상기 WST-1 시약을 환원 혈청 MEM중에서 1:20으로 희석시키고, 이 희석된 WST-1 시약 100 ㎕를 각 웰에 가한 다음, 세포를 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 60분 동안 항온 처리하였다. 평판 판독기를 사용하여 450 ㎚에서의 OD를 측정함으로써 각 웰에 생존하는 세포의 수를 정량하였다.

WISH-EMCV 항바이러스 검정 과정:

검정 수행 첫날, 트립신으로 대수기의 WISH 세포를 수집하여, 이를 환원 혈청 MEM에 재현탁하고, 원심 분리로 농축시켰다. 5개의 T175 플라스크 세포에 해당하는 세포 펠렛을 10 ㎖의 환원 혈청 MEM중에 재현탁시키고, 이를 40 미크론 나일론 세포 여과기로 여과시킨 다음, 쿨터 계측기로 계수하였다. 혈구 계측기를 사용하는 트리판 블루 배제법으로 세포 생존능을 측정하였다. 이후 세포를 환원 혈청 MEM에 최종 밀도 3 × 10⁵ 세포/㎖가 될 때까지 재현탁시켰다. 희석 세포 100 ㎕를 96-웰 검정 평판의 각 웰에 가하고(3 ×10⁴ 세포/웰), 이 평판을 습도가 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 4 시간 동안 항온 처리하였다.

투여량-반응 분석법으로 "참고" 인터페론 알파 및 본 발명의 인터페론 알파 폴리펩티드("시험 시료")의 효능을 측정하였다. 평판 당 일반적으로 하나의 시험 시료과 하나의 참고 IFN-알파가 존재하며, 각각 IFN-알파 처리/EMCV 감염된 세포의 복제 곡선 3개와, IFN-알파 처리만 한 세포의 복제 곡선 2개가 얻어진다. IFN-알파 처리만 한 세포가 HeLa 세포상 IFN-알파의 잠재적 항증식 효과를 억제하는지 여부에 대하여 검정하였다. 참고 IFN-알파에 대한 투여량∼반응 곡선은 일반적으로 100 ng/㎖에서 0.0001 ng/㎖까지 8회에 걸쳐서 10배 희석시킨 결과로 이루어졌다. IFN-알파 시험 시료에 대해서는, 일반적으로 5 ng/㎖에서 0.00006 ng/㎖까지 5배 희석시켰다. 바이러스 처리되었으나 IFN-알파 처리되지 않은 세포의 웰 8개와 세포만이 존재하는 웰(대조구)을 전개시켰다.

환원 혈청 MEM을 사용하여 IFN-알파 희석액을 준비하였다. 희석된 IFN-알파 제제 100 ㎕를 검정용 평판으로 옮겼다. 이 검정용 평판을 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기에서 16 시간 동안 항온 처리하였다.

이틀째 되는 날, 세포에 EMC 바이러스를 접종하였다. 검정용 평판의 각 웰로부터 배지를 흡입해 뽑아냈다. EMCV 저장물을 MEM + 2% FBS내에 1:267로 희석시켰다. 희석된 바이러스 100 ㎕(MOI 약 5에 해당)를 각 웰에 가하였다. 이 세포를 바이러스와 함께 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 24 시간 동안 항온 처리하였다.

사흘째 되는 날, 각 웰에 생존하는 세포의 수를 WST-1 검정법으로 정량하였다. 검정용 평판의 각 웰로부터 배지를 흡입하여 뽑아냈다. 상기 WST-1 시약을 환원 혈청 MEM중에서 1:20으로 희석시키고, 이 희석된 WST-1 시약 100 ㎕를 각 웰에 가한 다음, 세포를 습도 5%인 37℃의 CO₂ 항온 처리기 내에서 60분 동안 항온 처리하였다. 각 웰에 생존하는 세포의 수를 평판 판독기로 450 ㎚에서의 OD를 측정함으로써 정량하였다.

B. T _H 1 분화 검정법:

이하에서는 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 T_H1 분화 활성에 대한 대표적인 검정법을 제공한다.

검정 과정:

검정 개시일(검정 하루 전), 스탠포드 혈액 은행으로부터 500 ㎖ 혈액에서 얻은 백혈구 및 적혈구를 함유하는 사람의 연층(buffy coat)(25∼30 ㎖)을 입수하여, 이를 실온에 밤새도록 방치하였다. 각 연층을 조심스럽게 T75 플라스크에 옮기고, PBS로 100 ㎖가 될 때까지 희석하였다. 각 연층에 대해서, Histopaque/Ficoll (Sigma H8889) 13 ㎖를 4개의 50 ㎖들이 원심 분리 튜브에 피펫으로 적가하였고, 희석된 혈액 시료 25 ㎖를 Histopaque/Ficoll의 상층에 조심스럽게(계면을 파괴하지 않도록) 씌웠다. 이후 이 튜브를 20분 동안 원심 분리(20℃, 2500 rpm)시켰다. 3 ㎖들이 플라스틱 운반 피펫을 사용하여 PBMC를 함유하는 단핵 세포층을 50 ㎖들이 원추형 튜브 2개에 옮겼다[2개의 Histopaque/Ficoll/연층 튜브로부터 얻은 세포를 하나의 튜브에 옮겨 담음]. 이후 PBMC를 PBS로 50 ㎖/튜브가 될 때까지 희석시켜 이를 10분 동안 원심 분리(20℃, 1000 rpm)하여 혈소판을 제거하였다. PBS를 제거한 후, PBMC와 남아 있는 RBC를 혼합하여 응집되는 것을 막았다. RBC 용해 완충액(염화암모늄 완충액) 10 ㎖를 첨가한 후, 세포가 담긴 튜브 2개를 하나의 튜브로 합하였다. 하나의 공여자로부터 유래된 RBC와 전체 PBMC를 함유하는 각 튜브를 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 혈액 세포를 세포 흡입기(70um, Falcon Cat. No.2350)로 여과하여 이 혈액 세포에 생성될 수 있는 혈병을 제거하였다. PBS를 첨가하여 전체 부피가 50 ㎖가 되도록 한 다음, 이를 10분 동안 원심 분리(20℃, 1000 rpm)하였다. 마지막으로 혈구 계측기를 사용하여 세포 수를 계수하였다.

그 다음, 각 PBMC 제제 분획을 예비 염색한 후 FACS로 분석하여 PBMC 제제(원형 T_H0 비율 = 15% 이상)를 선택하였다. PBMC 300 ㎕를 20 ㎕ FITC-컨쥬게이트화 항인간 CD45RA(Pharmigen, Cat. No. 555488), 20 ㎕ Cy-크롬 컨쥬게이트화 항인간 CD4(Pharmigen, Cat. No. 555348), 5 ㎕ PE-컨쥬게이트화 항인간 CD8 (Pharmigen, Cat. No. 555367), 5 ㎕ PE-컨쥬게이트화 항인간 CD14(Pharmigen, Cat. No. 555398) 및 5 ㎕ PE-컨쥬게이트화 항인간 CD20(Pharmigen, Cat. No. 555623)으로 염색하고, 이를 얼음 속에서 45분 동안 항온 처리하였다. 이 세포를 PBS로 세척하고, 1 ㎖ PBS중에 재현탁 한 다음, 40 ㎛ 세포 흡입기 (Falcon, Cat. No. 2340)로 여과하였다. 원형 T_HO 세포(CD4 및 CD45RA에 양성이고, CD8, CD14, CD20에 음성)의 비율을 FACS로 정량한 다음, 15% 이상의 원형 T_HO 세포를 함유하는 PBMC 제제를 검정용으로 선택하였다.

선택된 PBMC 제제를 500 ㎕ FITC-컨쥬게이트화 항인간 CD45RA, 500 ㎕ Cy-크롬 컨쥬게이트화 항인간 CD4, 200 ㎕ PE-컨쥬게이트화 항인간 CD8, 50 ㎕ PE-컨쥬게이트화 항인간 CD14 및 50 ㎕ PE-컨쥬게이트화 항인간 CD20으로 염색하고, 이를 얼음속에서 60분 동안 항온 처리하였다. 이후 세포를 PBS로 세척하고, 여기에 PI를 가한 다음, 10 ㎖ PBS로 세포를 희석시킨 후, 40 ㎛ 세포 흡입기로 여과하였다. 이 세포를 FACS 분류하고, 1 x 10⁴개의 원형 T_HO 세포(CD4 및 CD45RA에 대해 양성이고, CD8, CD14 및 CD20에 대해 음성)를 MOFLO로써 160 ㎕ DMEM + 페니실린-스트렙토마이신 + 2 mM 글루타민 및 10% 소 태아 혈청(Hyclone Cat. No. SH30071.03)을 함유하는 96 웰 둥근 바닥 평판의 각 웰에 옮겼다.

1.7 ㎕의 Dynabeads CD3/CD28 T 세포 증폭물(Dynal, Cat. No. 111.32)을 각 웰에 가하였다. 몫 대 몫 변수(loT-to-lot variance)를 없애기 위해 실험 전에 Dynabeads의 자극 효과를 보정하였다. 그 다음, 20 ㎕/웰의 단백질 시료를 검정용 평판에 가하였다. 일반적으로 IL-4 및 IL-12 기준(R&D Systems로부터 구함)에 대한 농도 범위는 0.04 pg/㎖ ∼ 10 ng/㎖였으며, IFN-알파 시험 시료 및 IFN-알파 참고 시료에 대한 농도 범위는 0.76 pg/㎖ ∼ 200 ng/㎖였다.

세포를 37℃이고 습도 5%인 CO₂ 항온 처리기에서 6일 동안 항온 처리하였다. 각 웰에서 얻은 상청액을 수집하여 IFN-γ 함량을 ELISA(R&D Systems, Cat. # DIF50)로 정량함으로써 T_H1 분화 정도를 측정하였다.

분석:

반응성 = IFN-γ 농도 (pg/㎖)

곡선을 보정하기 위해 다음의 등식을 사용하였다:

Y = 최저값 + {(최고값 - 최저값)/(1+10^{(LogEC50 - X)기울기})}

최저값 변수는 최저 평탄역에서의 Y값이고; 최고값은 정점 평탄역에서의 Y값이며; LogEC50은 반응이 최저값과 최고값의 중간일 때의 X값이다. 레벤버그∼마르쿼드(Levenberg∼Marquardt) 방법을 사용하여 알고리즘을 최적화하였다.

C.다우디(Daudi) 항증식 검정법

이하에서는 본 발명의 인터페론-알파 폴리펩티드 및 컨쥬게이트의 항증식 활성에 대한 대표적인 검정법을 제공한다.

재료:

다우디 세포: 사람 버킷 림프종 세포(ATCC Number: # CCL-213). 이 다우디 세포주는 1967년에 버킷 림프종을 앓고 있는 16세 흑인 남성 환자로부터 얻었다. 이 세포주는 엡스타인∼바 바이러스에 대해 양성 반응을 나타낸다.

완전 RPMI:

RPMI 1640 (RPMI, Gibco Cat. No. 11875∼143)

10% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)

1 × 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (PSG, Gibco Cat. No. 10378∼01)

현탁액에서 생장한 다우디 버킷 림프종 세포를 37℃ 및 습도 5%인 C0₂ 항온 처리기내에 있는 완전 RPMI 50 ㎖를 함유하는 T175 조직 배양 플라스크에 담았다. 합류 현상이 나타날 때 이 세포를 1:10으로 희석하였다.

검정 과정:

다우디 세포를 회전 침전(spin down)시키고 이를 1 × PBS로 세척하였다. 세포수를 10⁵ 세포/㎖로 맞추었다. 80 ㎕의 배양 배지를 96 웰 둥근 바닥 검정용 평판의 각 웰에 가한 후, 각 웰에 세포 100 ㎕(10⁴ 세포/웰)를 옮겼다.

IFN-알파 참고 물질과 IFN-알파 시험 시료를 11회 희석시켜(200 ng/㎖ → 0.2 pg/㎖)(4배 희석), 이를 배양 배지를 사용하여 희석 평판 내에 넣었다. 이후 희석된 IFN-알파 제제 20 ㎕를 검정용 평판에 옮겼다.

세포를 37℃ 및 습도 5%인 C0₂ 항온 처리기 내에서 항온 처리하였다. 48 시간 경과 후, 메틸∼³H 티미딘 1μCi(Amersham Pharmacia, Cat. No. TRK758)를 각 웰에 가한 후, 이를 37℃ 및 습도 5%인 C0₂ 항온 처리기 내에서 24 시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음날, 세포를 수집한 후, 통합된 티민의 양을 측정하였다.

대안적으로, 다우디 항증식성 검정법은 인터페론 처리후 배양액 웰 내에 존재하는 ATP 양을 바탕으로 하여, 생존하는 즉, 대사 활성인 활성 다우디 세포의 수를 측정함으로써 수행할 수도 있다. 이 과정에서, 96 웰 둥근 바닥 검정용 평판내에 50㎕의 부피 즉, 8000개의 다우디 세포를 도말하였다. 인터페론 희석액을 첨가하기 이전에 37℃의 5% CO₂ 항온 처리기 내에서 2 시간 동안 이 세포를 항온 처리하였다. 인터페론을 6 배(9 회) 희석시켰다[일반적으로 5∼10 ng/㎖에서 출발). 인터페론을 첨가한 후, 세포를 습도 5%인 CO₂ 항온 처리기 내 37℃에서 72 시간 동안 항온 처리하였다. 이후 100 ㎕의 CellTiter-Glo(상표명)(Promega, Cat #G7572)를 첨가하여 각 웰 내에 생존하는 세포의 수를 측정하였다. 세포 및 CellTiter∼Glo(상표명) 시약을 2분 동안 혼합한 후, 실온의 암실에서 30∼60분 동안 항온 처리하였다. Analyst HT 기구를 사용하여 각 웰에 대한 발광 시그널의 양을 측정하였다.

분석:

IFN-알파 참고 물질 및 시료의 EC₅₀을 다음의 등식을 이용하여 계산하였다:

Y = 최저값 +{(최고값 - 최저값)/(1 + 10^{(LogEC50-X)기울기 )}}

최저값은 최저 평탄역에서의 Y값이고; 최고값은 정점 평탄역에서의 Y값이며; LogEC50은 반응이 최저값과 최고값의 중간에서 일어날 때의 X값이다. 레벤버그∼마르쿼드(Levenberg∼Marquardt) 방법을 사용하여 알고리즘을 최적화하였다.

실시예 1: 인터페론-알파 표면에 접근 가능한 잔기의 측정

인간 인터페론-α2α 잔기의 표면 노출:

문헌[Klaus외 다수, J. Mol. Biol., 274: 661∼675 (1997)]에 제시된 인간 인터페론-알파 2a의 24 NMR 구조를 기초로 하여, 측쇄의 미분 ASA를 계산하였다. 이하의 번호 매김은 인간 인터페론-알파 2a 단백질의 성숙 서열(본원에서는 서열 번호 47로 지정)을 기초로 한 것이다. 이 구조 중 Cys1-Cys98 및 Cys29-Cys138에는 각각 2개의 이황화 결합이 관여한다는 사실에 주목해야 할 것이다. ASA 및 미분 ASA를 측쇄의 ASA에 초점을 맞춰 계산하여 24개의 구조의 평균값을 구한 결과, 이하의 잔기들은 25% 이상의 미분 ASA 값을 갖는다는 사실을 알 수 있었다: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, G10, R12, R13, M16, A19, Q20, R22, K23, I24, S25, L26, F27, S28, L30, K31, R33, H34, D35, G37, Q40, E41, E42, G44, N45, Q46, Q48, K49, A50, E51, E58, Q61, Q62, N65, S68, T69, K70, D71, S73, A74, D77, E78, T79, L80, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, E96, A97, V99, I100, Q101, G102, V103, G104, T106, E107, T108, P109, L110, M111, K112, E113, D114, L117, R120, K121, Q124, R125, T127, L128, K131, E132, K133, K134, Y135, S136, P137, C138, A145, M148, R149, S152, L153, N156, Q158, E159, S160, L161, R162, S163, K164 및 E165[위치 번호는 본원에 서열 번호 47로 지정되어 있는 인터페론-알파 2a 서열의 위치에 관하여 메겨짐].

이하의 잔기들은 50% 이상의 미분 ASA 값을 갖는다는 사실을 알 수 있었다: D2, L3, P4, Q5, T6, H7, S8, L9, R12, R13, M16, A19, S25, F27, S28, K31, R33, H34, D35, G37, E41, G44, N45, Q46, Q48, K49, N65, K70, A74, D77, E78, T79, D82, K83, T86, Y89, Q90, N93, D94, I100, Q101, G102, G104, T106, E107, T108, P109, L110, E113, D114, L117, R120, K121, Q124, R125, L128, K131, E132, K134, P137, R149, E159, L161, R162, S163, K164 및 E165[위치 번호는 본원에 서열 번호 47로 지정되어 있는 인터페론-알파 2a 서열의 위치에 관하여 메겨짐].

서열 번호 1에 상응하는 잔기의 표면 노출:

다수의 인터페론 알파 서열 예를 들어, 공지의 인간 인터페론 알파 서열 모두(인터페론-알파 2 아형 제외)와 본 발명의 임의의 폴리펩티드에 있어서, 인간 인터페론-알파 2 아형(subtype) 예를 들어, 인터페론-알파 2b(서열 번호 46) 및 인터페론-알파 2a(서열 번호 47)의 44번 위치 뒤에 아미노산이 삽입되어 있기 때문에, 표면 노출된 잔기의 위치 번호는 44번 위치 이후로 하나씩 이동하게 될 것이다[예를 들어, 도 2에 나타낸 서열의 경우, hIFN 알파 2b (서열 번호 46)로 지정된 서열의 번호에관하여 매김].

상기 분석 결과를 기초로 하여, 다음의 위치들(서열 번호 1에 관하여 번호가 메겨짐)은 25% 이상의 미분 ASA를 갖는 아미노산 잔기를 함유하는 것으로 추정된다: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 59, 62, 63, 66, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 128, 129, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 146, 149, 150, 153, 154, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 및 166번 위치.

이와 유사하게, 다음의 위치들(서열 번호 1에 관하여 다시 번호가 메겨짐)은 평균 50% 이상의 측쇄 미분 ASA를 갖는 아미노산 잔기를 함유하는 것으로 추정된다: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 25, 27, 28, 31, 33, 34, 35, 37, 41, 44, 46, 47, 49, 50, 66, 71, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 87, 90, 91, 94, 95, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 114, 115, 118, 121, 122, 125, 126, 129, 132, 133, 135, 138, 150, 160, 162, 163, 164, 165 및 166번 위치.

실시예 2: 인터페론-알파 폴리펩티드의 항바이러스 활성

만성 HCV 감염 환자의 초기 바이러스 수는 10⁴∼10⁷ HCV RNA 복사체/㎖였다. IFN-알파를 처리하자, 바이러스 수는 특징적으로 2개의 분명한 대수 선형 감소기에 접어들었는데, 이는 2개의 독립된 기작이 진행됨을 나타내는 것이다(도 1b). 바이러스 수의 초기 감소는 처음에 약 2일 동안 발생하였는데, 이는 IFN-알파 치료를 받았음에도 불구하고 감염된 간 세포에 의해 바이러스 생산 속도가 감소되었기 때문인 것으로 추측된다.

주요 HCV 감염 기술은 바이러스가 시험관내에서 성장하지 못하고, 오로지 감염 가능한 동물 모델에서만 배양된다는 점을 바탕으로 한다. 그러나, 유용한 것으로 간주되는, 시험관 내 복제 바이러스는 HCV 바이러스 복제를 대신하는 것이다. 생체내 HCV 항바이러스 활성을 예시하는 것으로 추측되는 시험관내 대리 검정법은 상기 "재료 및 방법" 섹션에 기술되어 있는 검정법 즉, 뇌 심근염 바이러스(EMCV)를 사용하여 사람 세포주 HuH7 (간암 유래), HeLa (자궁경부암 유래) 및 WISH (양막 조직 유래)내 바이러스 감염의 세포 독성 효과(CPE)로부터 시험 분자가 세포를 보호하는 능력을 측정하는 검정법을 포함한다.

이하 표 7a 및 7b는 상기 "재료 및 방법" 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 수행된 각각의 CPE 검정법에 있어서 다양한 IFN-알파 폴리펩티드의 상대적 항바이러스 활성을 제공하는 것이다. TwoWay ANOVA(인자: 시료, 실험)(α= 0.05) 이후, 평균 비교치에 대한 Bonferroni 사후 검정(α = 0.05) 또는 Fisher 사후 검정 결과, 활성에 상당한 차이를 보였다. (+/-) 표시는 항바이러스 활성이 참고 인터페론의 항바이러스 활성과 통계학적으로 구분이 안 됨을 나타내는 것이고; ND는 측정되지 않음을 나타내는 것이다.

실시예 3: 인터페론-알파 폴리펩티드의 T _H 1 활성

T_H1 검정법은 배양액 상청액에서 검출되는 IFN-감마의 양에 의해 측정되는 바와 같이 IFN-알파에 의해 원형 T 세포가 T_H1 세포로 분화되는 것이 강화되었는지 여부를 모니터하기 위해 디자인되었다. 표 8은 상기 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 검정된 다양한 IFN-알파 폴리펩티드의 상대적 T_H1 활성을 제공한다.

시료	서열 번호	IFN-알파 2a에 대한 배수
14epi18	서열 번호 13	>30×
25epi19	서열 번호 38	>30×
IFN-알파 Con1	서열 번호 58	10∼15×
IFN-알파 2a	서열 번호 47	1(ref)

실시예 4: 인터페론-알파 폴리펩티드의 항증식 활성

IFN-알파는 항바이러스 반응을 나타내는데 필요한 투여량보다 더 많이 투여하였을때 항증식 효과를 나타냄에도 불구하고, 다수의 세포 유형의 증식을 억제한다. 다우디 세포는 IFN-알파 감수성인 인간 유래의 EVB 형질 전환된 B 세포주이다. 이 IFN-알파 반응성 세포주는 본 발명의 IFN-알파 폴리펩티드의 항증식 효과에 대한 유용한 프로브로서 이용된다. 뿐만 아니라, 거핵구계세포 및 호중구에 IFN-알파를 다량 투여하였을 경우의 항증식 활성은 각각 혈소판 감소증 및 호중구 감소증에 기여하는 것으로 생각된다. 상기 다우디 항증식 검정법은 기타 림프양 세포 유형의 항증식 효과에 대한 유용한 대리 검정법으로 이용될 수 있다.

이하 표 9a 및 9b는 상기 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 검정된 다양한 IFN-알파 폴리펩티드의 상대적 항증식 활성을 제공하는 것으로서, huIFN-알파 2a (EC₅₀huIFN-알파 2a/ EC₅₀ 시료)에 상대적인 항증식 활성의 배수로 나타낸 것이다. 검정 조건하에서, 참고 인터페론의 항증식 활성은 0.01배 이상인 것으로 관찰되었다.

실시예 5: 인터페론-알파 폴리펩티드의 페그화

이하에서는 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는 대표적인 방법을 제공한다.

Cys-PEG화

유리 시스테인을 함유하는 본 발명의 폴리펩티드는 다음과 같이 시스테인- PEG화될 수 있다. 우선 폴리펩티드를 동 몰 농도의 TCEP(트리스카복시에틸포스핀)으로 4℃에서 30분 동안 50 mM MES 및 100 mM NaCl(pH 6.0) 중에서 환원시켰다. 이후 환원된 폴리펩티드를 4배 몰 과량의 mPEG-MAL 시약(PEG 부분 예를 들어, 20 kDa 또는 30 kDa의 선형 mPEG, 또는 40 kDa의 분지형 mPEG2)과 1 시간 동안 4℃의 동일한 조건하에서 반응시켰다. 페그화된 반응 혼합물을 50mM MES(pH 6.0) 및 100mM NaCl로 평형화된 SP-세파로스 HP 컬럼에 로딩하였다. 10 CV(컬럼 부피) 세척 단계 이후, 0 → 600 mM NaCl로 구배를 걸어주어 PEG화된 분획과 PEG화되지 않은 분획을 분별하였다. 분획을 수집한 다음 분취액을 SDS-PAGE로 분석하였다. 모노PEG화된 화학종을 함유하는 분획을 풀링한 다음, 전술한 바와 같이 이를 인터페론-알파 활성에 대한 검정용으로 제형화하였다.

N-말단 PEG화

4℃에서 4∼8 시간 동안 5배 몰 과량의 PEG 시약:폴리펩티드를 사용함으로써, mPEG-부티르알데히드(PEG 부 예를 들어, 20 kDa 또는 30 kDa 선형 mPEG, 또는 40 kDa 분지형 mPEG2 보유)를 사용하는 N-말단 PEG화를, 50 mM MES, (pH 5.5), 100 mM NaCl 및 20 mM 소듐 시아노보로하이드리드 중에서, 또는 50 mM 아세트산나트륨, (pH 5.5), 100 mM NaCl 및 20 mM 소듐 시아노보로하이드리드 중에서 수행할 수 있다. 50 mM MES (pH 5.5), 100 mM NaCl로 평형화된 SP-세파로스 HP 컬럼상에서 크로마토그래피하여[농도 구배: 50 mM MES(pH 5.5) 중 NaCl 100 → 600 mM] 컨쥬게이트를 분리하였다. 모노PEG화된 화학종을 함유하는 분획을 풀링하여 전술한 바와 같이 인터페론-알파 활성 검정용으로 제형화한 다음, 예를 들어, 분석 HPLC, 아미노산 분석법 및/또는 MALDI∼TOF 질량 분광법을 사용하여 추가로 특성 규명하였다.

리신 PEG화

일반적으로, 리신-PEG화는 문헌[Foser외 다수(2003) Protein Expression & Purification 30: 78∼87]에 기술된 방법을 사용하여 수행되었다. 간단히 요약하면, 폴리펩티드를 약 1 시간에서 밤새도록 4℃의 온도에서 50 mM 붕산염 완충액(pH 9.0) 중 mPEG2-NHS : 폴리펩티드의 몰 비가 약 3:1∼5:1이 되도록 40 kDa mPEG2-NHS와 반응시켰다. 양이온 교환 크로마토그래피로써 컨쥬게이트를 분리하였다. 모노PEG화된 화학종을 함유하는 분획을 풀링하고, 전술한 바와 같이 인터페론-알파 활성 검정용으로 제형화하였다. 상기 방법에 따라서 제조된 모노PEG화 IFN-알파 컨쥬게이트는 HeLa-EMCV 검정법에서 PEG화되지 않은 근원 폴리펩티드의 경우보다는 낮았지만 항바이러스 활성을 나타냈다.

몇몇 경우에 있어서, 전술한 바와 같이 얻어진 모노PEG화 풀을 폴리설포에틸 A 컬럼(2.1 ㎜ID x 200 ㎜L, 5m, 1000Å, PolyLC사)를 이용하는 양이온 교환 HPLC에 의해 추가로 분석하여, PEG-이성체 프로필을 특성 규명하였다. 이동상은 완충액 A[5 mM KH₂P0₄, 40% 1∼프로판올, 1% 디에틸렌 글리콜, pH 3.0] 및 완충액 B[완충액 A와 동일하되, 200 mM NaCl 포함]이었다. 80분에 걸쳐 0.1 ㎖/분의 속도로 20℃에서 이동상 B에 50% → 75%의 구배를 걸어주어 PEG 위치 이성체를 분리하였으며, 이를 214 ㎚에서 확인하였다.

도 8은 인터페론-알파 폴리펩티드 B 9 × l4EC4와 40 kDa mPEG2-NHS의 반응으로부터 얻어진 모노PEG화된 풀을 전술한 바에 따라서 양이온 교환 HPLC로써 분리한 결과를 나타내는 것이다. 피크를 나타내는 물질을 수집하여 SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 9). 도 9의 레인 2와 레인 9는 HPLC 컬럼에 로딩하기 이전의 시료가 다량의 모노PEG화 단백질을 함유한다는 것을 보여주는 것이다. 피크 1∼4(도 9의 레인 3∼6)는 모노PEG화된 풀 중에 존재하는 소량의 디PEG화된 IFN에 해당한다. 작은 피크 5(도 9의 레인 7)는 대략 동일한 비율의 디PEG화, 모노PEG화 및 저분자량 화학종을 포함한다. 피크 6∼11(도 9의 레인 10∼15)은 모노PEG화된 IFN 폴리펩티드의 위치 이성체에 해당한다.

폴리펩티드 14epi18(서열 번호 13)을 다음과 같이 리신-PEG화하였다. Q-세파로스 크로마토그래피 단계의 용리액(상기 "재료 및 방법" 섹션을 통하여 얻어짐)을 농도가 2 ㎎/㎖ 미만이 되도록 농축시켰다. PEG화를 위해 완충액을 50 mM 붕산나트륨(pH 9.0)으로 교체하였다. 폴리펩티드를 문헌[Foser외 다수(2003) Protein Expression & Purification 30:78∼87]에 기술된 바와 같이 단백질에 대한 PEG 시약의 몰 비가 4:1 또는 5:1이 되도록 40 kDa mPEG2-NHS와 반응시켰다. 이후 4℃에서 1시간 30분 동안 PEG화 반응을 진행시켰다. 양이온 교환 크로마토그래피로써 반응 혼합물로부터 모노PEG화된 14epi18을 정제하였다. 염 농도를 1 M NaCl까지 증가시키면서 3단계로 용리시켜, 올리고PEG화, 모노PEG화 및 PEG화되지 않은 화학종을 분리하였다. 모노PEG화 14epil8 피크는 추가의 분석을 위해 0.33 ㎎/㎖의 농도로 제조하였다. 이와 같이 얻어진 모노PEG화 14epi18 조성물은 Lys122 및 Lys135가 주로 모노PEG화된 위치 이성체 군을 포함하였다.

폴리펩티드 25epi19(서열 번호 38)를 다음과 같이 리신-PEG화하였다. Q-세파로스 크로마토그래피 단계의 용리액(상기 "재료 및 방법" 섹션을 통하여 얻어짐)을 농도가 2 ㎎/㎖ 미만이 되도록 농축시켰다. PEG화를 위해 완충액을 50 mM 붕산나트륨(pH 9.0)으로 교체하였다. 폴리펩티드를 문헌[Foser외 다수(2003) Protein Expression & Purification 30:78∼87]에 기술된 바와 같이 단백질에 대한 PEG 시약의 몰 비가 4:1이 되도록 40 kDa mPEG2-NHS와 반응시켰다. 이후 4℃에서 밤새도록 PEG화 반응을 진행시켰다. 양이온 교환 크로마토그래피로써 반응 혼합물로부터 모노PEG화된 25epi19를 정제하였다. 염 농도를 750 mM NaCl까지 증가시키면서 3단계로 용리시켜, 올리고PEG화, 모노PEG화 및 PEG화되지 않은 화학종을 분리하였다. 모노PEG화 25epi19 피크를 용리 완충액중에서 2 ㎎/㎖ 미만의 농도로 농축시켜 추가 분석용으로 마련하였다. 이와 같이 얻어진 모노PEG화 25epi19 조성물은 Lys31, Lys122 및 Lys135가 주로 모노PEG화된 위치 이성체 군을 포함하였다.

전술한 바와 같이 제조된 모노PEG화된 l4epi18 및 모노PEG화된 25epi19는 모두 HeLa-EMCV 항바이러스 검정법에서의 모노PEG화 IFN-알파 2a의 경우보다 항바이러스 활성이 10배 더 높았다.

실시예 6 : 시차 주사 열량법

시차 주사 열량법(DSC) 실험을 수행하여 본 발명의 일부 폴리펩티드의 안정성을 측정하였다. 농도 100∼325 ㎍/㎖인 단백질 시료를 포스페이트 완충 염수(PBS)로 완충액-교환시킨 다음, MicroCal VP-DSC(MicroCal, Northampton, MA)를 사용하여 DSC시켰다. 열 용량(C_p) 대 온도 그래프로부터 용융점(T_m)을 산정하였다. 산정된 T_m은 다음과 같았다: B9X14EC4(서열1) 58.4℃; 14epi16(서열 번호 11) 64.2℃; 및 14epi18(서열 번호 13) 59.5℃. 루신(서열 번호 11) 또는 알라닌(서열 번호 13) 중 어느 하나에 대한 48번 위치에 존재하는 페닐알라닌 잔기(서열 번호 1)의 치환은 폴리펩티드 안정성에 어떠한 유해한 효과도 나타내지 않는 것으로 파악되었다.

실시예 7 : 생체내 검정법

본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 약물 동태적(PK) 및 약물 동력학적(PD) 프로필의 측정

생물학적 반감기 또는 혈청 반감기의 측정은 문헌에 기술된 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 반감기는 ELISA법을 사용하여 측정될 수 있으며, 그 결과 예를 들어, 피하 투여 또는 근육내 투여 이후의 인터페론-알파의 혈청내 수치를 파악할 수 있다. 피하 투여된 인터페론-알파의 약물 동태를 측정하기 위해 ELISA법을 이용하는 것에 관하여는 문헌[Rostaing외 다수(1998), J. Am. Soc. Nephrol.9(12):2344∼48. Merimsky외 다수(1991), Cancer Chemother. Pharmacol. 27(5);406∼8]에 기술되어 있으며, 여기에는 근육내 투여된 인터페론-알파의 혈청내 수치를 측정하는 것에 관하여 기술되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트의 약물 동태(PK) 및 약물 동력학(PD) 프로필은 다음 방법에 따라서 시아노몰거스 원숭이(마카카 패시큘라리스; Macaca facsicularis)를 이용하여 연구되었다. 본 연구에서는 평균 체중이 5∼6 ㎏인 3∼4년생 암컷 동물을 사용하였다. 도착시로부터 치료 개시시 사이 최소 6주 동안 실험 동물을 환경에 적응시켰으며, 이때 연구에 대비하여 가둬둔 상태에는 최소 3주 동안 적응시켰다. 이 실험 동물들은 스테인레스 강으로된 그물형 우리(540 × 810 × 760 ㎜ 이상)에 한 마리씩 가두어 두었으며, 이 동물들에게 물에 불린 시판 유인원 먹이(100 g/동물/일)(화학 오염 물질 및 박테리아 오염 물질이 없도록 처리)를 계속 주었다. 뿐만 아니라, 매일 이 동물들에게 과일(사과 또는 바나나)도 주었다. 마취에 필요한 모든 과정을 수행하기 이전에는 동물들을 굶겼다.

연구 개시 3일 전과 연구 개시 당일 화합물 투여 이전에, 모든 동물들로부터 혈액 시료를 채취하였다. 연구 내내, 결박하여 놓은 동물(마취시키지 않은 상태임)의 대퇴부 또는 두부/복재 혈관으로부터 혈액 시료(전혈 1㎖)을 채취하였다. 혈액 채취 동안에는 계속 정상적으로 먹이를 공급하여 주었다. 시료들을 항응고제를 첨가하지 않은 튜브에 모은 다음, 4℃에서 10분 동안 원심 분리(3000 rpm; 약 1760 g)하였다. 이후 혈청 시료를 2개의 분취액(각각 약 200 ㎕씩 함유)으로 나누어 담은 후, 이를 -20℃에 보관하였다.

연구 개시 이전에, 본 발명의 컨쥬게이트를 20 mM 아세트산나트륨(pH 6.0)과 140 mM 염화나트륨 중에 제제화하였다. 연구 개시시에, 에틸 알콜 수용액으로 국소 소독한 후 멸균 시린지 및 바늘을 사용하여 동물 1마리당 한 번씩 피하 투여하였다[30 mcg 컨쥬게이트/㎏ 동물 체중 (4마리) 또는 300 mcg/㎏(4마리)]. 컨쥬게이트 투여 이후 다음과 같은 시점에서 혈액 시료를 수집하였다: 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 144 시간, 240 시간, 336 시간, 456 시간, 552 시간, 600 시간, 624 시간, 648 시간, 672 시간, 696 시간, 720 시간 및 744 시간 경과시.

매일 동물을 관찰하여 치료에 대한 어떤 임상 증상 또는 반응이 있는지 여부를 관찰하였다. 또한 매일 주사 부위를 눈으로 검사하여 국부 내성을 평가하였다. 치료 개시 이전과 연구 종결시에 상세한 임상 관찰을 수행하였다.

연구 종결 후 ELISA 검정법을 사용하여, 분리된 혈청 시료내 컨쥬게이트의 농도를 측정하였다. 이후 시아노몰거스 원숭이 체내에 형성된 컨쥬게이트의 생체내 반감기를 특정 시점에서의 화합물의 혈청내 농도를 기초로 하여 측정하였다.

본 발명의 컨쥬게이트를 처리한 시아노몰거스 원숭이 체내에서의 약물 동력학적 반응을 시판중인 RIA (Eiken Chemical Co., Tokyo) 및 시판중인 ELISA (IBL Immuno Biological Laboratories, Hamburg.)를 각각 사용하여 각 혈청 시료 내 2',5'-올리고아데닐레이트 합성 효소와 네오프테린의 수치를 측정함으로써 평가하였다. 이들 2개의 생물 마커(혈청 시료내 인터페론 활성에 대한 생물 마커)의 측정된 농도를 기준으로, 곡선 아래의 표면적(AUC)을 계산하여 2회 투여시 각각에 대한 각 화합물의 생체내 활성을 정량하였다.

시험관내 면역원성의 측정

참고 분자에 관한 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 감소된 면역원성은 ELISA법을 이용하여 참고 분자 또는 제제에 상대적인 분자의 면역반응 특히, 공지된 인터페론-알파 단백질의 면역반응을 측정함으로써 측정될 수 있다. ELISA법은 참고 단백질 처리된 환자로부터 얻은 항체를 바탕으로 한다. 면역원성은 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트가 검정법에서 참고 분자 또는 제제의 경우보다 통계학적으로 상당히 낮은 반응성을 나타낼 경우, 감소되는 것으로 보인다.

전술한 발명은 명확성과 이해를 돕기 위하여 어느 정도 상세히 기술되었지만, 본원에 개시된 사항들을 통하여 당업자들은 본 발명의 진정한 사상에서 벗어나지 않도록 변형할 수 있고 상세한 설명을 부연할 수도 있음을 알게 될 것이다. 본원에 개시된 실시예 및 구체예는 단지 예시적 목적으로 기술된 것으로서, 당업자에 의해서 다양한 변형 또는 변경이 가하여질 수 있을 것이며, 또한 이러한 변형 또는 변경은 본원의 사상 및 범위, 그리고 첨부된 청구의 범위 내에 포함될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 전술한 모든 기술 및 장치들은 다양한 방식으로 병용할 수 있다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌들은 인용된 각각의 공보, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌들에서와 마찬가지의 목적으로, 그 자체로서 참고 문헌으로 인용된 것이며/것이거나, 기타 문헌들은 각각 모든 목적을 위해 그 자체로서 참고 문헌으로 본원에 인용되어 있는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Maxygen, Inc. F. Hoffmann-LaRoche AG <120> INTERFERON-ALPHA POLYPEPTIDES AND CONJUGATES <130> 0280.310WO <150> US 60/572,504 <151> 2004-05-19 <160> 90 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct B9x14EC4 <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe 35 40 45 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu 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ctgaaggaca gacatgattt cggattcccc 120 gaggaggagt ttgatggcca ccaggcccag aaggttcaag ccatctccgt tctccatgag 180 ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240 accctcctag aaaaattcta cattgaactt taccagcaac tgaatgacct ggaagcatgt 300 gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360 gtgaggaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420 gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480 gaaagcttac gcagcaagga a 501 <210> 86 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct 25epi29c1 <400> 86 tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60 atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120 gaggagtttg atggccacca gttccagaag actcaagcca tctccgttct ccatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240 ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300 atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat 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ccacagcctg agtaaccgtc gcactctgat gctcatggca 60 caaatgcgtc gcatctctcc tttctcctgc ctgaaggaca gacatgattt cggattcccc 120 gaggaggagt ttgatggcca ccagttccag aagactcaag ccatctccgt tctccatgag 180 ctgatccagc agaccttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag 240 accctcctag aaaaattcta cattgaactt ttccagcaaa tgaataacct ggaagcatgt 300 gtgatacagg aggttggggt ggaagagatt gccctgatga atgtggactc catcctggct 360 gtgaggaaat acttccgtcg catcactctc tatctgacag agaagaaata cagcccttgt 420 gcctgggagg ttgtcagagc agaaatcatg agatctttct ctttttcaac aaacttgcaa 480 gatagcttac gcagcaagga a 501 <210> 89 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct 14epi18m2 <220> <221> CDS <222> (57)...(560) <400> 89 caattgtgag cggataacaa tttcacacag aattcattaa agaggagaaa ttaact atg 59 Met 1 tgc gac ctg ccg cag acc cac tcc ctt gga cac cgt cgg acc atg atg 107 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met 5 10 15 ctg cta gct cag atg cgt aga ata tcc ctg ttc tcc tgc ctt aag gac 155 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 cgt cac gac ttc cgt ttc ccc cag gaa gaa ttt gat ggt aac cac gct 203 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Ala 35 40 45 cag aaa gtt cag gct atc ttc ctg ttt tac gaa atg atg cag caa acc 251 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr 50 55 60 65 ttc aac ctg ttc tcc acc aaa gac tcc tcc gcg gct tgg gac gaa acc 299 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 70 75 80 ctg ctg gaa aaa ttc tac atc gaa ctg ttc cag cag atg aac gat cta 347 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu 85 90 95 gaa gca tgc gtt atg cag gaa gta ggt gtt gaa gag acc cca ctg atg 395 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 aac gtt gac tcc atc ctg gct gtc cgg aaa tac ttc cag cgt atc acc 443 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 ctg tac ctg act gaa aaa aaa tac tcc ccg tgc gct tgg gaa gtt gtg 491 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 145 cgc gct gaa atc atg cgt tcc ttc tcc ttc tcc acc aac ctg cag gaa 539 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu 150 155 160 tcc ctg cgt tcc aaa gaa taa taagcttaat tagctgagc 579 Ser Leu Arg Ser Lys Glu * 165 <210> 90 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct 25epi19m <220> <221> CDS <222> (57)...(560) <400> 90 caattgtgag cggataacaa tttcacacag aattcattaa agaggagaaa ttaact atg 59 Met 1 tgc gac ctg ccg cag acc cac tcc ctt tct aac cgt aga acc ctg atg 107 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met 5 10 15 ctg atg gct cag atg cgt cgt att tct ccg ttc tct tgc ctt aag gat 155 Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 cgt cac gac ttc ggt ttc cca gaa gag gaa ttt gac ggt cac cag gct 203 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Ala 35 40 45 cag aaa gtt cag gct atc ttc ctg ctg tac gag ctc atc cag caa acc 251 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr 50 55 60 65 ttc aac ctg ttc tct acc aaa gac tct tcc gcg gct tgg gac gaa acc 299 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 70 75 80 ctg ctg gag aaa ttt tac atc gaa ctg ttc cag caa atg aac aat cta 347 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu 85 90 95 gaa gca tgt gtt atc cag gaa gtt ggt gtt gaa gag atc gct ctg atg 395 Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met 100 105 110 aac gtt gac tcc atc ctg gct gtt cgt aaa tac ttc cgt cgc atc acc 443 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 ctg tac ctg acc gaa aaa aag tac tcc ccg tgc gct tgg gaa gtt gta 491 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 145 cgt gct gaa atc atg aga tct ttc tcc ttc tcc acc aac ctg cag gaa 539 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu 150 155 160 tcc ctg cgt tcc aaa gaa taa taagcttaat tagctgagc 579 Ser Leu Arg Ser Lys Glu * 165

Claims (79)

1. (a) 서열 번호 1과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고,

   (b) F48A/L; V51P; F55A; F65A; F68P; L111A; 및 V114P로 이루어진 군에서 선택되는, 서열 번호 1에 대한 치환부를 하나 이상 포함하는

   서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드로서, 항바이러스 활성을 나타내는 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1과 1∼10개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, 서열 번호 1과 1∼8개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, H47Q; V51A; Q52P/E; A53T; F55S; L56V; F57L; Y58H; M61I; N113K; V114E; 및 E160D로 이루어진 군에서 선택되는 치환부를 하나 이상 더 포함하는 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서, 서열 번호 2∼35로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드.
6. 제1항에 있어서, 상기 서열은 서열 번호 1에 대한 치환부 F48A/L을 포함하는 것인 폴리펩티드.
7. 제6항에 있어서, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 30, 서열 번호 34 및 서열 번호 35로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드.
8. (a) 서열 번호 13과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고,

   (b) 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 및 114번 위치의 Pro 중 하나 이상을 포함하는

   서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드로서, 항바이러스 활성을 나타내는 폴리펩티드.
9. 제8항에 있어서, 상기 서열은 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함하는 것인 폴리펩티드.
10. 제8항에 있어서, 서열 번호 13과 0∼8개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
11. 서열 번호 13의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있으며, 항바이러스 활성을 나타내는 분리 또는 재조합 폴리펩티드.
12. (a) 서열 번호 36과 1∼16개 위치의 아미노산이 상이하고,

    (b) M21A, I24P, F48A/L, T51P, S55A, F65A, F68P, F90A, M93P, L111A, V1 14P, F124A, I127P 및 E160D로 이루어진 군에서 선택되는, 서열 번호 36에 대한 치환부를 하나 이상 포함하는

    서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드로서, 항바이러스 활성을 나타내는 폴리펩티드.
13. 제12항에 있어서, 서열 번호 36과 1∼10개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
14. 제12항에 있어서, 서열 번호 36과 1∼8개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
15. 제12항에 있어서, P26L, H47Q, T51V, S55P/F, V56L, H58Y, L60M, F90Y, M93L, N95D, N113K, V114E, R125Q, T132K 및 L154F로 이루어진 군에서 선택되는 치환부를 하나 이상 더 포함하는 폴리펩티드.
16. 제12항에 있어서, 서열 번호 37∼44로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드.
17. 제12항에 있어서, 상기 서열은 서열 번호 36에 대한 치환부 F48A/L을 포함하는 것인 폴리펩티드.
18. 제17항에 있어서, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드.
19. 제12항에 있어서, 서열 번호 44의 서열을 포함하는 폴리펩티드.
20. (a) 서열 번호 38과 0∼16개 위치의 아미노산이 상이하고,

    (b) 21번 위치의 Ala; 24번 위치의 Pro; 48번 위치의 Ala 또는 Leu; 51번 위치의 Pro; 55번 위치의 Ala; 65번 위치의 Ala; 68번 위치의 Pro; 90번 위치의 Ala; 93번 위치의 Pro; 111번 위치의 Ala; 114번 위치의 Pro; 124번 위치의 Ala; 127번 위치의 Pro; 및 160번 위치의 Glu 중 하나 이상을 포함하는

    서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드로서, 항바이러스 활성을 나타내는 폴리펩티드.
21. 제20항에 있어서, 상기 서열은 48번 위치에 Ala 또는 Leu을 포함하는 것인 폴리펩티드.
22. 제20항에 있어서, 서열 번호 38과 0∼8개 위치의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드.
23. 서열 번호 38의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있으며, 항바이러스 활성을 나타내는 분리 또는 재조합 폴리펩티드.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 항바이러스 활성은 huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a의 항바이러스 활성과 동일하거나 또는 그보다 더 큰 것인 폴리펩티드.
25. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 항바이러스 활성은 huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a의 항바이러스 활성보다 2배 이상 더 큰 것인 폴리펩티드.
26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 huIFN-알파 2b 또는 huIFN-알파 2a가 나타내는 항바이러스 활성/항증식 활성의 비율보다 2배 이상 더 큰 항바이러스 활성/항증식 활성의 비율을 나타내는 것인 폴리펩티드.
27. (a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 및

    (b) 상기 폴리펩티드에 공유 결합된 비-폴리펩티드 부분

    을 포함하는 컨쥬게이트.
28. 제27항에 있어서, 2 이상의 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트.
29. 제27항에 있어서, 시스테인 잔기에 공유 결합된 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트.
30. 제27항에 있어서, 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기에 공유 결합된 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트.
31. 제27항에 있어서, 리신 잔기에 공유 결합된 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트.
32. 제27항에 있어서, N-말단 아미노기에 결합된 비-폴리펩티드 부분을 포함하는 컨쥬게이트.
33. 제27항에 있어서, 상기 비-폴리펩티드 부분이 중합체인 컨쥬게이트.
34. 제33항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 컨쥬게이트.
35. 제34항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 리신 잔기에 공유 결합된 40 kDa mPEG2 부분인 컨쥬게이트.
36. 제27항에 있어서, 상기 비-폴리펩티드 부분은 당인 컨쥬게이트.
37. 제36항에 있어서, 상기 당은 폴리펩티드의 N-글리코실화 부위에 결합된 것인 컨쥬게이트.
38. (a) 서열 번호 13의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드; 및

    (b) 폴리펩티드의 리신 잔기에 공유 결합된 PEG 부분

    을 포함하는 컨쥬게이트로서, 항바이러스 활성을 나타내는 컨쥬게이트.
39. 제38항에 있어서, 상기 PEG 부분은 40 kDa mPEG2 부분인 컨쥬게이트.
40. 제39항에 있어서, 상기 40 kDa mPEG2 부분은 Lys 122 및 Lys 135로부터 선택되는 리신 잔기에 공유 결합된 것인 컨쥬게이트.
41. (a) 서열 번호 38의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드; 및

    (b) 폴리펩티드의 리신 잔기에 공유 결합된 PEG 부분

    을 포함하는 컨쥬게이트로서, 항바이러스 활성을 나타내는 컨쥬게이트.
42. 제41항에 있어서, 상기 PEG 부분은 40 kDa mPEG2 부분인 컨쥬게이트.
43. 제42항에 있어서, 상기 40 kDa mPEG2 부분은 Lys 31, Lys 122 및 Lys 135로부터 선택되는 리신 잔기에 공유 결합된 것인 컨쥬게이트.
44. (a) 서열 번호 13의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드와, Lys 122에 공유 결합된 40 kDa mPEG2 부분을 포함하는 컨쥬게이트; 및

    (b) 서열 번호 13의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드와, Lys 135에 공유 결합된 40 kDa mPEG2 부분을 포함하는 컨쥬게이트

    를 포함하는 조성물로서, 항바이러스 활성을 나타내는 조성물.
45. (a) 서열 번호 38의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드와, Lys 31에 공유 결합된 40 kDa mPEG2 부분을 포함하는 컨쥬게이트;

    (b) 서열 번호 38의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드와, Lys 122에 공유 결합된 40 kDa mPEG2 부분을 포함하는 컨쥬게이트; 및

    (c) 서열 번호 38의 서열을 포함하고, N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수도 있는 폴리펩티드와, Lys 135에 공유 결합된 40 kDa mPEG2 부분을 포함하는 컨쥬게이트

    를 포함하는 조성물로서, 항바이러스 활성을 나타내는 조성물.
46. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
47. 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
48. 제44항 또는 제45항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는 조성물.
49. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
50. 제49항에 있어서, 서열 번호 13의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
51. 제50항에 있어서, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64 및 서열 번호 89로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
52. 제49항에 있어서, 서열 번호 38의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
53. 제52항에 있어서, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 82 및 서열 번호 90으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
54. 제49항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
55. 제49항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
56. 제55항에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터인 벡터.
57. 제56항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
58. 제49항의 폴리뉴클레오티드 및 부형제를 포함하는 조성물.
59. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,

    숙주 세포를 포함하는 배양액을 제공하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계;

    상기 배양액을 상기 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건 하에 배양하는 단계; 및

    상기 폴리펩티드를 회수하는 단계

    를 포함하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 숙주 세포는 글리코실화 숙주 세포인 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포인 방법.
62. 제59항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
63. 제62항에 있어서, 폴리펩티드를 회수하는 단계는

    (a) 상기 폴리펩티드를 포함하는 봉입체(inclusion body; IB)를 분리하는 단계;

    (b) 상기 IB를 용해시켜 비폴딩 폴리펩티드를 얻는 단계;

    (c) 상기 비폴딩 폴리펩티드를 재폴딩시켜, 재폴딩 폴리펩티드를 얻는 단계; 및

    (d) 상기 재폴딩 폴리펩티드를 정제하는 단계

    를 포함하는 것인 방법.
64. 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서,

    (i) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및

    (ii) 상기 폴리펩티드에 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 결합시키는 단계

    를 포함하며, 생성된 컨쥬게이트는 항바이러스 활성을 나타내는 것인 방법.
65. 제64항에 있어서, 폴리펩티드를 제공하는 단계는

    숙주 세포를 포함하는 배양액을 제공하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계;

    상기 배양액을 상기 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건 하에 배양하는 단계; 및

    상기 폴리펩티드를 회수하는 단계

    를 포함하는 것인 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 숙주 세포는 글리코실화 숙주 세포 또는 박테리아 숙주 세포인 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이인 방법.
68. 제67항에 있어서, 폴리펩티드를 회수하는 단계는

    (a) 상기 폴리펩티드를 포함하는 봉입체(IB)를 분리하는 단계;

    (b) 상기 IB를 용해시켜 비폴딩 폴리펩티드를 얻는 단계;

    (c) 상기 비폴딩 폴리펩티드를 재폴딩시켜, 재폴딩 폴리펩티드를 얻는 단계; 및

    (d) 상기 재폴딩 폴리펩티드를 정제하는 단계

    를 포함하는 것인 방법.
69. 제64항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 하나 이상의 비-폴리펩티드 부분을 결합시키는 단계는 폴리펩티드와 40 kDa mPEG2-NHS를 mPEG2-NHS 대 폴리펩티드의 몰비 약 3:1∼5:1로 pH 9 및 4℃에서 1 시간 내지 밤새도록 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법.
70. 바이러스 감염 세포 내 바이러스 복사체 수를 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물을, 세포 내 바이러스 복사체 수를 감소시키는 데 유효한 양으로 세포에 투여하여, 상기 세포 내에서 바이러스 복사체 수를 감소시키는 것을 포함하는 방법.
71. HCV 감염 환자의 혈청 중 HCV RNA의 수준을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물을, 치료 개시 전에 존재하는 HCV RNA 수준에 비하여 HCV RNA 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법.
72. HBV 감염 환자의 혈청 중 HBV DNA의 수준을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물을, 치료 개시 전에 존 재하는 HBV DNA 수준에 비하여 HBV DNA 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법.
73. HIV 감염 환자의 혈청 중 HIV RNA의 수준을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물을, 치료 개시 전에 존재하는 HIV RNA 수준에 비하여 HIV RNA 수준을 감소시키는 데 유효한 양으로 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법.
74. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물.
75. 질병 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
76. 바이러스 질환 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
77. 바이러스 감염 세포 내 바이러스 복사체 수를 감소시키기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
78. 바이러스 감염 환자의 혈청 중 바이러스 수준을 감소시키는 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
79. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 HCV, HBV 또는 HIV인 용도.

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