KR20220015385A

KR20220015385A - 지질 나노 입자

Info

Publication number: KR20220015385A
Application number: KR1020217037647A
Authority: KR
Inventors: 유스케 사토; 히데요시 하라시마; 마나부 토케시; 마사토시 마에키
Original assignee: 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2022-02-08
Also published as: EP3967649A1; JPWO2020241679A1; CN114174522A; EP3967649A4; WO2020241679A1; US20220213509A1

Abstract

본 발명은 게놈 편집에 필요한 핵산 등을 내포하고 있으며, 유로를 이용한 알코올 희석법에 의해 제조하는 것이 가능하며, 게놈 편집 효율이 뛰어난 지질 나노 입자를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 지질 성분, DNA 뉴클레아제, 가이드 RNA 및 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 함유하고, 상기 지질 성분이 pH 감수성 양이온성 지질, 중성 인지질 및 폴리알킬렌글리콜 수식 지질을 함유하며, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 pH 감수성 양이온성 지질의 비율이 30~50몰%이며, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 중성 인지질의 비율이 20~50몰%이고, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 비율이 1~4몰%인, 지질 나노 입자이다.

Description

지질 나노 입자

본 발명은, CRISPR 시스템에 의한 게놈 편집에 이용되는 RNA-단백질 복합체(ribonucleoprotein；RNP)의 캐리어로서 유용한 지질 나노 입자에 관한 것이다.

본원은 2019년 5월 30일자로 일본에 출원된 특허 출원 제2019-101203호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.

게놈 편집 기술은, 목적으로 하는 임의의 게놈 DNA 영역에 선택적으로 변이의 도입 또는 유전자를 포함하는 임의의 DNA 서열을 삽입할 수 있는 바이오 테크놀러지이다. 유전성 질환이나 감염증 등의 여러가지 난치성 질환에 대한 근본적인 치료의 실현으로 연결되는 점에서, 게놈 편집 기술은 의약에 대한 응용이 기대되지 않았다. 그 중에서 제3 세대 게놈 편집 기술인 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins 9) 시스템은, 우수한 유전자 녹아웃(knock-out) 효율이나 설계의 간편함에서 현재 가장 주목을 받고 있는 기술이다. 본 시스템은 DNA 2중 가닥 절단(double-strand break；DSB) 활성을 가지는 Cas9 단백질과, 세균 유래의 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)로 이루어지는 키메라 RNA인 gRNA(guide RNA)의 RNP로서 기능한다. 따라서, 표적 세포 내에서 RNP를 발현시키거나, 또는 RNP 그 자체를 표적 세포 내에 송달함에 따라, 목적으로 하는 유전자 녹아웃을 유도하는 것이 가능하다. 또한, 도너 DNA를 동시에 송달함에 따라 유전자 녹인(knock-in)을 유도하는 것도 가능해진다.

게놈 편집 기술에서 표적 세포 내로의 송달 수단으로서는, DNA 또는 RNA를 도입함으로써 세포 내에서 RNP를 발현시키는 수법이나, RNP 그 자체를 세포에 직접 도입하는 수법이 있다. 전자의 경우, 바이러스 벡터나 비바이러스 벡터 등의 송달 기술이 어느 정도 확립되어 있기 때문에 비교적 용이하게 행할 수 있지만, Cas9 단백질의 발현이 비교적 장시간에 걸치기 때문에, 의도하지 않는 DNA 영역에서의 변이의 도입(오프 타겟 작용)이 생기기 쉽다. 한편, 후자의 경우 RNP는 표적 DNA 영역에서의 변이 도입 후 신속하게 분해·소실되기 때문에, 오프 타겟 작용이 최소한으로 억제된다. 특히 DSB를 수반하는 게놈 편집에서는, 편집된 세포가 생존하는 한 영속적으로 영향이 계속되기 때문에, 오프 타겟 작용의 억제는 매우 중요하다.

RNP 그 자체를 송달할 수 있는 기술의 개발은 여럿 보고되어 있다. 예를 들면, DNA Nanoclews를 이용하는 방법(비특허문헌 1), 생체 내 환원성 지질 나노 입자를 이용하는 방법(비특허문헌 2), 금 나노 입자와의 콘쥬게이트를 이용하는 방법(비특허문헌 3), 리피도이드를 이용하는 방법(비특허문헌 4), lecithin nano-liposomal particle를 이용하는 방법(비특허문헌 5)이 있다. 또한, 유전자 녹인을 유도한 예로서는 CRISPR-Gold(비특허문헌 6)가 보고되어 있다. 단, 모두 배양 세포에서의 유전자 녹다운의 유도에 고농도의 Cas9를 필요로 하는 등, 게놈 편집 효율의 과제가 남아 있다.

한편, 핵산 등을 내포하는 지질 나노 입자의 제조 방법으로서는, 유로를 이용한 알코올 희석법을 원리로 하는 것이 있다. 예를 들면, 2액의 순간 혼합을 달성할 수 있는 3차원 마이크로 믹서 내장 마이크로 유로를 이용함으로써 직경 30nm 정도의 지질 나노 입자를 양호하게 재현하여 제조 가능하다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7). 또한, 원료 용액을 흘리는 마이크로 사이즈의 유로에, 유로폭에 대해서 일정폭의 배플(방해판)을 양측면에서 엇갈리게 배치한 단순한 이차원적 구조의 유로 구조체를 이용함으로써, 종래의 3차원 믹서를 이용하는 유로 구조체보다 입경 제어성이 높은 나노 사이즈의 지질 입자 형성 시스템을 형성할 수 있는 것도 보고되어 있다(특허문헌 1). 이러한 나노 입자 제재의 제조 방법은, 최근에는 주로 지용성 약물이나, siRNA(short interfering RNA) 또는 mRNA 등의 핵산을 탑재한 지질 나노 입자(LNP)의 제조에 채용되고 있다. 예를 들면, siRNA 등의 핵산을 효율적으로 표적 세포 내에 송달하기 위한 캐리어가 되는 지질 나노 입자로서 pH 감수성 양이온성 지질을 구성 지질로서 포함하는 지질 나노 입자가 보고되어 있다(특허문헌 2).

국제 공개 제2018/190423호 국제 공개 제2018/230710호

Sun et al., Angewandte Chemie International Edition, 2015, vol.54, p.12029-12033. Wang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, vol.113, p.2868-2873. Mout et al., American Chemical Society Nano, 2017, vol.11, p.2452-2458. Li et al., Biomaterials, 2018, vol.178, p. 652-662. Cho et al., Journal of Nanobiotechnology, 2019, vol.17, p.19. Lee et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, vol.1, p.889-901. Leung et al., Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces, 2012, vol.116(34), p.18440-18450. Stroock et al., Science, 2002, vol.295, p.647-651

RNP 등의 단백질은 지금까지 이용되어 온 저분자 약물이나 핵산과 비교하여 알코올 등의 유기 용매, 완충액의 pH, 염 농도, 온도 등의 입자 제조시의 여러가지 물리적 파라미터에 의해 불가역적인 불활성화를 받기 쉽다. 이 때문에, 현재까지 알코올 희석법을 원리로 하는 RNP 탑재 지질 나노 입자 제재의 제조에 관한 보고는 없다.

본 발명은, 게놈 편집에 필요한 핵산 등을 내포하고 있고, 유로를 이용한 알코올 희석법에 의해 제조하는 것이 가능하며, 게놈 편집 효율이 뛰어난 지질 나노 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자 등은, CRISPR/Cas9 시스템에 의한 게놈 편집에서, crRNA, tracrRNA 및 Cas9단백질의 복합체인 RNP를 crRNA와 상보인 염기 서열 영역을 포함하는 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드(ssON)와 복합체화하여 음으로 대전시킴으로써, pH 감수성 양이온성 지질을 포함하는 특정 조성의 지질막 구조로 이루어지는 지질 나노 입자에 효율적으로 탑재할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 지질 나노 입자를 제공하는 것이다.

[1] 지질 성분, DNA 뉴클레아제, 가이드 RNA 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 함유하고,

상기 지질 성분이, 하기 일반식 (I)

[화학식 1]

[식 (I) 중, a는 3~5의 정수를 나타내며； b는 0 또는 1을 나타내고； R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 하기 일반식 (A)：

[화학식 2]

(식 (A) 중, q는 1~9의 정수를 나타내고； r은 0 또는 1을 나타내며； s는 1~3의 정수를 나타내고； t는 0 또는 1을 나타내고； u는 1~8의 정수를 나타내며； c는 0 또는 1을 나타내고; v는 4~12의 정수를 나타내고; q+2r+s+2t+u+c+v가 19 이상의 정수이지만, b와 c가 동시에 0이 되는 경우에는, q가 3~5의 정수이며, r 및 t가 1이고, s가 1이며, 또한 u+v가 6~10의 정수인 경우를 제외한다.)

로 나타내어지는 기를 나타내고； X는, 하기 일반식(B)：

[화학식 3]

(식 (B) 중, d는 0~3의 정수를 나타내고； R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기(상기 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기는 1개 또는 2개의 수소 원자가 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내지만, R³ 및 R⁴는 서로 결합하여 5~7원의 비방향족 헤테로 고리(상기 고리의 1개 또는 2개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되어 있어도 됨)를 형성해도 된다)

로 나타내어지는 기 또는 5~7원의 비방향족 헤테로 고리기(단, 상기 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합하고, 상기 고리의 1개 또는 2개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되고 있어도 됨)를 나타낸다〕

로 나타내어지는 pH 감수성 양이온성 지질, 중성 인지질 및 폴리알킬렌글리콜 수식 지질을 함유하고,

지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 pH 감수성 양이온성 지질의 비율이 30~50몰%이며,

지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 중성 인지질의 비율이 20~50몰%이고,

지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 비율이 1~4몰%인, 지질 나노 입자.

[2] 상기 중성 인지질이 탄소수 12~24의 포화 또는 불포화 지방산 잔기를 가지는 중성 글리세로 인지질인, 상기 [1]의 지질 나노 입자.

[3] 상기 중성 인지질이 탄소수 12~24의 불포화 지방산 잔기를 가지는 포스파티딜에탄올아민인, 상기 [1]의 지질 나노 입자.

[4] 상기 pH 감수성 양이온성 지질이 폴리에틸렌글리콜 수식 지질인, 상기 [1]~[3] 중 어느 하나의 지질 나노 입자.

[5] 상기 DNA 뉴클레아제가 Cas9 단백질이며,

상기 가이드 RNA가 crRNA와 tracrRNA로 이루어지는, 상기 [1]~[4] 중 어느 하나의 지질 나노 입자.

[6] 상기 Cas9 단백질이 RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성 중 어느 하나만을 가지는 단백질인, 상기 [5]의 지질 나노 입자.

[7] 상기 DNA 뉴클레아제가 Cpf1 단백질인, 상기 [1]~[4] 중 어느 하나의 지질 나노 입자.

[8] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나의 지질 나노 입자를 세포 내로 도입하는, 게놈 편집 방법.

[9] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나의 지질 나노 입자를, 유로 구조체를 이용하여 제조하는 방법으로서,

상기 유로 구조체가 서로 독립된 제1 유동체를 도입하는 제1 도입로 및 제2 유동체를 도입하는 제2 도입로가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성하고 있으며,

상기 희석 유로는 적어도 그 일부에 이차원적으로 굴곡된 유로 부위를 가지고,

상기 굴곡된 유로 부위는, 이보다 상류의 희석 유로의 축선 방향 내지 그 연장 방향을 X방향, 이 X방향과 수직으로 교차하는 희석 유로의 폭 방향을 Y방향으로 하고, 이보다 상류의 희석 유로의 유로폭을 y₀로 한 경우, Y방향에서 대향하는 희석 유로의 양측 벽면으로부터 교대로, 유로 중심측을 향하여 대략 Y방향(대략 +Y방향, 대략 -Y방향)으로, 1/2y₀이상 1y₀ 미만의 일정 높이 h₁, h₂...를 가지며, X방향으로 일정폭 x₁, x₂...를 가지고 돌출하고, 희석 유로의 유로폭을 규제하는 구조자가 일정 간격 d₁, d₂...를 가지고 적어도 2개 이상 마련되어 형성되어 있고,

상기 제1 도입로에서 상기 지질 성분을 에탄올에 용해시킨 지질 용액을 도입하고, 상기 제2 도입로에서 상기 DNA 뉴클레아제, 상기 가이드 RNA 및 상기 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 pH가 5.0 이상인 수용액을 도입하며, 총 유량이 1μL/분~100mL/분이고, 상기 지질 용액의 유속에 대한 상기 수용액의 유속의 비가 7 이상인, 지질 나노 입자의 제조 방법.

[10] 상기 유로 구조체가 제3 유동체를 도입하는 제3 도입로를 더 가지고 있으며,

상기 제1 도입로에서 도입된 제1 유동체가, 상기 제2 도입로에서 도입된 제2 유동체와 합류하기 전에, 상기 제3 도입로에서 도입된 제3 유동체와 접촉하도록 상기 제1 도입로, 상기 제2 도입로 및 상기 제3 도입로가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성하고 있는, 상기 [9]의 지질 나노 입자의 제조 방법.

본 발명에 따른 지질 나노 입자는, RNP가 pH 감수성 양이온성 지질을 포함하는 특정 조성의 지질막 구조로 이루어지는 지질 나노 입자에 탑재되어 있기 때문에, 표적 세포의 게놈 편집을 효율적으로 행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 지질 나노 입자는 지질막 구조에 탑재되는 RNP가 ssON을 포함하고 있고, 음으로 대전되어 있는 점에서, 알코올 희석법에 따라 제조할 수 있다.

도 1a는 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조에 이용되는 유로 구조체의 일실시 형태에서의 구조를 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조에 이용되는 유로 구조체의 일실시 형태에서의 구조를 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 2는 참고예 1 및 실시예 1에서 사용된 유로 구조체의 구조 모식도이다.
도 3은 참고예 2에서 사용된 유로 구조체의 구조 모식도이다.
도 4는 실시예 1에서 각 RNP 탑재 지질 나노 입자의 HeLa-GFP 세포에 대한 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 1에서 각 RNP 탑재 지질 나노 입자의 HeLa-GFP 세포에 대하여, 녹아웃 효율(%)에 대한 녹인 효율(%)의 비(［KI(%)］/［KO(%)］)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2에서 1차 스크리닝에서의 각 RNP 탑재 지질 나노 입자의 HeLa-GFP 세포에 대한 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 2에서 1차 스크리닝에서의 개수 평균 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 개수 평균 입자 지름의 예측 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 2에서 1차 스크리닝에서의 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 봉입률의 예측 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 9는 실시예 2에서 1차 스크리닝에서의 유전자 녹아웃 활성에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 유전자 녹아웃 활성의 예측 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 2에서 2차 스크리닝에서의 개수 평균 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 개수 평균 입자 지름의 예측 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 11은 실시예 2에서 2차 스크리닝에서의 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 봉입률의 예측 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예 2에서 2차 스크리닝에서의 유전자 녹아웃 활성에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 유전자 녹아웃 활성의 예측 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 13은 실시예 3에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 또는 B-9를 첨가한 세포의 세포 생존률(%)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 실시예 3에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 첨가한 세포를 4℃로 보존하고, 제타 전위와 PdI를 경시적으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 실시예 3에서 4℃ 보존 전후의 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9의 HeLa-GFP 세포에 대한 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 16a는 실시예 4에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 또는 B-9를 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.1nM이 되도록 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 16b는 실시예 4에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 또는 B-9를 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.3nM이 되도록 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 실시예 5에서 RNP 탑재 지질 나노 입자를 배지에 Cpf1 단백질 농도가 0.5, 1 또는 2nM이 되도록 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 실시예 6에서 Cas9n 단백질을 포함하는 RNP 탑재 지질 나노 입자 또는 Cas9 단백질을 포함하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 배지에 Cas9n 단백질 등의 농도가 0.1, 0.3, 1 또는 2nM이 되도록 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 19a는 실시예 7에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 또는 B-9를 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.5, 1, 3 또는 5nM이 되도록 첨가하여 배양한 HEK-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 19b는 실시예 7에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 또는 B-9를 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.5, 1, 3 또는 5nM이 되도록 첨가하여 배양한 HEK-GFP 세포에서의 BFP 양성 세포 비율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 실시예 7에서 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 또는 B-9를 첨가한 세포의 세포 생존률(%)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 실시예 8에서 RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입하기 전의 GFP 항상 발현 BMDM의 플로우사이트메트리 결과(A)와 RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입한 후의 GFP 항상 발현 BMDM의 플로우사이트메트리 결과(B)를 나타낸 도면이다.
도 22는 실시예 9에서 각 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.1, 0.3 또는 1nM이 되도록 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 23a는 실시예 10에서 Cas9 단백질을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 23b는 실시예 10에서 Cpf1 단백질을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가하여 배양한 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자는, CRISPR 시스템에서 표적 세포에 RNP를 도입하는 캐리어로서 사용되는 것으로, 게놈 편집에 이용되는 DNA 뉴클레아제, 가이드 RNA(gRNA) 및 ssON의 복합체인 RNP가 pH 감수성 양이온성 지질을 포함하는 특정 조성의 지질막 구조에 탑재되어 있는 지질 나노 입자이다. 상기 지질 나노 입자에 탑재되는 RNP로서는, Cas9 단백질, crRNAm, tracrRNA 및 ssON의 복합체를 들 수 있다. RNP 자체를 직접 지질 나노 입자에 탑재하여 표적 세포에 도입하기 때문에, Cas9 단백질 등의 DNA 뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 표적 세포 내에 도입하여 발현시키는 방법보다 오프 타겟 작용이 작다.

[DNA 뉴클레아제]

본 발명 및 본원 명세서에서, 지질 나노 입자에 탑재되는 DNA 뉴클레아제는 gRNA 의존적으로 DNA에 결합하고, gRNA의 일부와 접합하여 형성된 2중 가닥 DNA를 인식하여 절단하는 효소이다. 상기 DNA 뉴클레아제로서는, Cas9, Cpf1 등을 들 수 있다.

＜Cas9 단백질＞

본 발명 및 본원 명세서에서, Cas9 단백질은 gRNA 의존적으로 DNA에 결합하여, RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성의 적어도 하나를 가지는 단백질이다. RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성을 모두 구비하는 Cas9 단백질은, 게놈 DNA의 2중 가닥을 절단한다. RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성중 어느 하나만을 구비하는 Cas9 단백질은 게놈 DNA의 2중 가닥 중 어느 하나의 가닥만을 절단한다.

본 발명에서 이용되는 Cas9 단백질은, CRISPR계를 가지는 세균에 유래하는 야생형 Cas9 단백질일 수 있으며, 야생형 단백질을 개변한 변이형 단백질일 수도 있다. CRISPR계를 가지는 세균으로서는, 예를 들면 화농연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 수막염균(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 지오바실러스 스테로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 등을 들 수 있다. 또한, 야생형의 Cas9 단백질을 개변한 변이형 단백질로서는, RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성 중 어느 하나를 실활시키는 것과 같은 변이가 도입된 변이체를 들 수 있다. 상기 변이체로서는, 예를 들면, 야생형 Cas9 단백질의 10번째 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 변이체(Cas9(D10A))를 들 수 있다. Cas9(D10A)는 DNA 니카아제(nickase)로서 기능하기 때문에 Cas9 니카아제(Cas9n)라고도 불린다. 그 외, 야생형 Cas9 단백질의 뉴클레아제 활성에 영향을 주지 않는 변이가 도입된 변이형 단백질일 수 있다.

본 발명에서 이용되는 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질 또는 그 변이형 단백질에 각종 펩타이드를 부가한 것일 수 있으며, 다른 단백질과 융합시킨 키메라 단백질일 수도 있다. 상기 펩타이드로서는, 예를 들면, His 태그, Myc 태그, Flag 태그 등의 태그 펩타이드, 핵이행 시그널 펩타이드 등의 시그널 펩타이드 등을 들 수 있다. 야생형 또는 변이형 Cas9 단백질과 융합시키는 다른 단백질로서는, 예를 들면, GST, 형광 단백질 등을 들 수 있다.

＜Cpf1 단백질＞

본 발명 및 본원 명세서에서, Cpf1 단백질은 gRNA 의존적으로 DNA에 결합하고, RuvC 뉴클레아제 활성만을 가지는 단백질이다. RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성을 모두 구비하는 Cas9 단백질이 게놈 DNA의 2중 가닥을 절단하여 평활 말단을 형성하는데 대하여 Cpf1 단백질은 5' 돌출 말단을 형성한다.

본 발명에서 이용되는 Cpf1 단백질은 CRISPR/Cpf1 시스템을 가지는 세균에 유래하는 야생형 Cpf1 단백질일 수 있고, 야생형 단백질을 개변한 변이형 단백질일 수도 있다. CRISPR/Cpf1 시스템을 가지는 세균으로서는, 예를 들면, 애시드아미노코커스속균(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) 등을 들 수 있다. 또한, 야생형 Cpf1 단백질을 개변한 변이형 단백질로서는, 뉴클레아제 활성을 증대시키는 것과 같은 변이가 도입된 변이체나, 뉴클레아제 활성에 영향을 주지 않는 변이가 도입된 변이형 단백질을 들 수 있다.

본 발명에서 이용되는 Cpf1 단백질은 야생형 Cpf1 단백질 또는 그 변이형 단백질에 각종 펩타이드를 부가한 것일 수 있으며, 다른 단백질과 융합시킨 키메라 단백질일 수도 있다. 상기 펩타이드나 다른 단백질로서는 Cas9 단백질로 예시된 것과 동일한 것을 이용할 수 있다.

[gRNA]

본 발명 및 본원 명세서에서, gRNA는 DNA 뉴클레아제에 의해 절단시키는 게놈 DNA 상의 표적 서열(게놈 편집하는 대상의 염기 서열)에 접합 가능한 염기 서열을 가지는 RNA이다. 「표적 서열에 접합 가능한 염기 서열」이란, 표적 서열 이외의 영역의 인식을 억제하기 때문에, 통상은 표적 서열과 상동적(동일) 또는 상보적인 염기 서열이다. gRNA는 1개의 RNA로 이루어지는 것일 수 있으며, 2개 이상의 RNA가 복합체를 형성하고 있는 것일 수도 있다.

＜crRNA 및 tracrRNA＞

지질 나노 입자에 탑재되는 DNA 뉴클레아제가 Cas9 단백질인 경우, gRNA로서는 crRNA 및 tracrRNA를 이용할 수 있다. crRNA는 CRISPR계를 가지는 세균에 유래하며, tracrRNA의 일부와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역(tracrRNA와의 결합 영역)과 게놈 DNA 상의 표적 서열과 상동적 또는 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역(게놈 DNA 결합 영역)을 포함하는 단일 사슬 RNA이다. tracrRNA는 동일하게 CRISPR계를 가지는 세균에 유래하며, crRNA의 일부와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역(crRNA와의 결합 영역)을 가지고 있고, 상기 영역에서 crRNA와 하이브리다이즈하여 헤어핀 구조를 형성하는 단일 사슬 RNA이다. 상기 헤어핀 구조를 Cas9 단백질이 인식하여 RNP가 형성된다. crRNA와 tracrRNA는 각각 독립적인 단일 사슬 RNA일 수 있고, 양자가 적당한 RNA 링커를 개재하여 연결된 단일 사슬 RNA일 수도 있다. 한편, CRISPR계를 가지는 세균으로서는 상기한 바와 같은 것을 들 수 있다. Cas9 단백질, crRNA 및 tracrRNA는 모두 동종의 세균 유래일 수 있으며 서로 다른 종의 세균 유래일 수도 있다. 또한, crRNA 및 tracrRNA는 CRISPR/Cas9 시스템의 기능을 해치지 않는 한, 천연 RNA만으로 이루어지는 것일 수 있으며, 그 일부 또는 전부에 수식 RNA나 인공 핵산이 포함되어 있을 수도 있다.

＜Cpf1 단백질로 이용되는 gRNA＞

지질 나노 입자에 탑재되는 DNA 뉴클레아제가 Cpf1 단백질의 경우, gRNA로서는 crRNA와 마찬가지로 표적 서열을 포함하는 RNA이면 무방하고, tracrRNA는 불필요하다. 이 때문에, gRNA를 Cas9 단백질을 이용하는 경우보다 더 짧은 것으로 할 수 있다. 또한, gRNA는 CRISPR/Cpf1 시스템의 기능을 손상하지 않는 한, 천연 RNA만으로 이루어지는 것일 수 있으며, 그 일부 또는 전부에 수식 RNA나 인공 핵산이 포함되어 있을 수도 있다.

＜표적 서열＞

표적 서열은, 통상 PAM 서열이 그 직후에 오는 영역의 염기 서열을 선택한다. PAM 서열은 Cas9 단백질 등의 DNA 뉴클레아제에 인식되는 서열이며, 이용되는 Cas9 단백질 등의 DNA 뉴클레아제에 의존하여 결정된다. 예를 들면, Cas9 단백질이 인식하는 PAM 서열로서는, 5'-NGG(N：A, G, C, T)를 들 수 있으며, Cpf1 단백질이 인식하는 PAM 서열로서는, 5'-TTTV(V：A, G, C), 5'-TTTN(N：A, G, C, T)을 들 수 있다. crRNA 등의 gRNA 중의 표적 서열의 염기 길이는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 15~30 염기 길이 정도로 할 수 있고, 18~22 염기 길이가 바람직하다.

［ssON］

본 발명에서 이용되는 ssON은 gRNA의 일부와 접합 가능한 영역을 포함한다. 이에 따라, 지질 나노 입자에 탑재되는 DNA 뉴클레아제와 복합체를 형성하고 있는 상태의 gRNA와 접합 가능한 영역을 포함한다. 이에 따라, DNA 뉴클레아제, gRNA 및 ssON의 복합체인 RNP가 형성된다. ssON는 DNA만으로 이루어지는 올리고 뉴클레오타이드일 수 있으며, RNA만으로 이루어지는 올리고 뉴클레오타이드일 수 있고, DNA와 RNA를 모두 포함하는 키메라 올리고 뉴클레오타이드일 수도 있다. 또한, ssON은 사용되는 CRISPR 시스템의 기능을 해치지 않는 한, 천연 RNA나 DNA만으로 이루어지는 것일 수 있으며, 그 일부 또는 전부에 수식 핵산이나 인공 핵산이 포함되어 있을 수도 있다.

지질 나노 입자에 탑재되는 DNA 뉴클레아제가 Cas9 단백질인 경우, crRNA 중 tracrRNA와의 결합 영역 이외의 부분 영역과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 이 crRNA와 상보적인 영역(crRNA와의 결합 영역)을 개재하여, ssON와 crRNA는 하이브리다이즈한다. 즉, 본 발명에 따른 지질 나노 입자에 탑재되는 RNP는, crRNA와 tracrRNA, crRNA와 ssON가 서로 하이브리다이즈하여, 형성된 3자 복합체와 Cas9 단백질이 복합체화된 것이다. crRNA 중의 ssON과 하이브리다이즈하는 영역(ssON과의 결합 영역)은, crRNA가 tracrRNA, ssON과 동시에 하이브리다이즈하여 3자 복합체를 형성할 수 있으며, 이 3자 복합체가 Cas9 단백질이 인식하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, crRNA 중의 ssON과의 결합 영역은, 게놈 DNA 결합 영역의 일부 또는 전부를 포함하고 있을 수 있으며, 게놈 DNA 결합 영역과 동일할 수 있다. 또한, RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성 중 하나를 비활성화한 Cas9 니카아제(Cas9n)를 사용하는 더블 니킹법의 경우, 가이드 RNA는 2종류가 사용된다. 따라서, 지질 나노 입자에 탑재되는 DNA 뉴클레아제가 Cas9n이며, 더블 니킹법을 위한 RNP를 탑재한 지질 나노 입자의 경우, ssON은 각각의 가이드 RNA에 하이브리다이즈하는 2종류를 사용한다.

CRISPR 시스템에 의해, 절단된 게놈 DNA에 목적하는 유전자 단편을 녹인하는 경우, ssON은 이 녹인되는 도너 DNA로서 이용할 수도 있다. 예를 들면, crRNA 등의 gRNA와의 결합 영역 이외에, 녹인되는 유전자 단편의 양 말단에 상동 재조합을 위한 40~60bp의 상동 서열 영역(homology arms)이 부가된 영역을 구비한 ssON은 도너 DNA로서 기능한다.

Cas9 단백질이나 Cpf1 단백질은 핵산과는 달리 양전하를 띠고 있기 때문에, 지질막을 구성하는 지질 성분에 pH 감수성 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노 입자로의 탑재 효율이 낮다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 지질 나노 입자에서는, Cas9 단백질 등의 DNA 뉴클레아제와 복합체화되는 핵산이, crRNA와 tracrRNA 등의 gRNA뿐만 아니라 ssON도 포함된다. 이와 같이, RNP에 포함되어 있는 핵산량이 많기 때문에 RNP의 양전하가 억제되고 음전하가 강해져, pH 감수성 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노 입자에 효율적으로 탑재할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 ssON의 염기 길이는 RNP를 음으로 대전시키기 위해 충분한 길이이면 무방하며, gRNA, 예를 들면 crRNA와 tracrRNA의 염기 길이나, Cas9 단백질 등의 종류 등을 고려하여 적절하게 결정할 수 있다. ssON의 길이는, 예를 들면 50~500 염기 길이 정도로 할 수 있다.

게놈 DNA 상의 표적 서열의 결정, crRNA 및 tracrRNA 등의 gRNA의 염기 서열의 설계, ssON의 염기 서열의 설계 등은, 게놈 DNA의 염기 서열 정보에 기초하여 일반적으로 사용되는 분자 생물학적 툴을 이용하여 통상의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, gRNA의 설계는, CRISPR Design Tool(Horizon Discovery), TrueDesign Genome Editor(Invitrogen) 등의 설계 툴을 이용하여 행할 수 있다.

［지질 성분］

본 발명에 따른 지질 나노 입자는 지질막 구조체에 RNP가 탑재된 지질 나노 입자이다. 지질막 구조체를 구성하는 지질 성분에는 적어도 pH 감수성 양이온성 지질, 중성 인지질 및 폴리알킬렌글리콜 수식 지질이 함유되어 있다.

＜pH 감수성 양이온성 지질＞

본 발명에 따른 지질 나노 입자에 함유되어 있는 pH 감수성 양이온성 지질은 하기 일반식 (I)로 나타내어지는 양이온성 지질(이하, 「본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질」이라고 할 수 있다.)이다.

[화학식 4]

일반식 (I)에서, a는 3~5의 정수를 나타내지만, 바람직하게는 4이다.

b는 0 또는 1을 나타낸다. b가 0의 경우에는 -O-CO-기가 존재하지 않고, 단결합인 것을 의미한다.

일반식 (I)에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 하기 일반식 (A)로 나타내어지는 기를 나타낸다. 일반식 (A)에서, q는 1~9의 정수를 나타내고； r은 0 또는 1을 나타내고； s는 1~3의 정수를 나타내며； t는 0 또는 1을 나타내고； u는 1~8의 정수를 나타내고； c는 0 또는 1을 나타내고； v는 4~12의 정수를 나타낸다. 단, b와 c가 동시에 0이 되는 경우에는, q가 3~5의 정수이며, r 및 t가 1이고, s가 1이며, u+v가 6~10의 정수인 경우를 제외한다.

[화학식 5]

본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질로서는, 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 안정성의 면에서, R¹ 및 R²의 탄화수소 사슬이 비교적 긴 사슬인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질에서 R¹ 및 R²는 탄소수 20 이상의 기인 것, 즉, 일반식 (A)에서, q+2r+s+2t+u+c+v는 19 이상의 정수인 것이 바람직하다. 그 중에서도, 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질로서는, q+2r+s+2t+u+c+v가 19~33의 정수인 것이 바람직하고, 19~31의 정수인 것이 보다 바람직하고, 21~31의 정수인 것이 더 바람직하고, 21~27의 정수인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질의 R¹ 및 R²로서는, 일반식 (A)에서, r이 1이며, t가 0이고, q가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, s+u가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, c가 1이고, v가 4~12의 정수이며, q+s+u+v가 16 이상의 정수인 기； r이 0이고, t가 1이며, q+s가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, u가 5~8의 정수이고, c가 1이고, v가 4~12의 정수이며, q+s+u+v가 16이상의 정수인 기； r 및 t가 0이며, q+s+u가 13~23의 정수, 바람직하게는 15~21이며, c가 1이고, v가 4~12의 정수이며, q+s+u+v가 18이상의 정수인 기； r 및 t가 0이며, q+s+u가 13~23의 정수, 바람직하게는 15~21이며, c가 1이고, v가 6~10의 정수이고, q+s+u+v가 18 이상의 정수인 기；가 바람직하다.

본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질에서, R¹ 및 R²는 일반식 (A)로 나타내어지는 기일 수 있으며, 서로 다른 기여도 무방하나, 동일한 기인 것이 바람직하다.

일반식 (I)에서, X는 하기 일반식 (B)로 나타내어지는 기 또는 5~7원 비방향족 헤테로 고리기를 나타낸다. X가 나타내는 5~7원 비방향족 헤테로 고리기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합한다.

[화학식 6]

일반식 (B) 중 d는 0~3의 정수를 나타낸다. d가 0의 경우에는 -(CH₂)-기가 존재하지 않고, 단결합인 것을 의미한다.

일반식 (B) 중 R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 C_1-4 알킬기(탄소수 1~4의 알킬기) 또는 C_2-4 알케닐기(탄소수 1~4의 알케닐기)를 나타낸다. R³ 및 R⁴가 나타내는 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기는 1개 또는 2개의 수소 원자가 페닐기로 치환되어 있을 수 있다.

C_1-4 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, t-부틸기를 들 수 있다. C_2-4 알케닐기로서는, 비닐기, 1-프로페닐기, 2-프로페닐기, 1-메틸비닐기, 2-메틸-1-프로페닐기, 1-부테닐기, 2-부테닐기, 3-부테닐기를 들 수 있다.

일반식 (B) 중 R³ 및 R⁴는 서로 결합하여 5~7원 비방향족 헤테로 고리를 형성하고 있을 수 있다. R³ 및 R⁴가 서로 결합하여 형성되는 5~7원 비방향족 헤테로 고리로서는, 예를 들면, 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기 및 1-피페라지닐기를 들 수 있다. R³ 및 R⁴가 서로 결합하여 형성되는 5~7원 비방향족 헤테로 고리는, 고리중의 1개 또는 2개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되어 있을 수 있다. 상기 고리중의 2개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되어 있는 경우, 서로 동일한 기로 치환되어 있어도 되고, 서로 다른 기에 의해 치환되어 있어도 된다.

일반식 (I)에서, X가 5~7원 비방향족 헤테로 고리기인 경우, 그 헤테로 고리 기에 포함되는 헤테로 원자로서는, 질소 원자, 산소 원자 또는 유황 원자 등을 들 수 있다. 그 헤테로 고리기 중 헤테로 고리를 구성하는 헤테로 원자는 1개일 수 있으며, 동일 또는 다른 헤테로 원자가 2개 이상일 수도 있다. 그 헤테로 고리기 중의 헤테로 고리는 포화의 헤테로 고리일 수 있으며, 1개 또는 2개 이상의 이중 결합이 포함되어 있을 수도 있지만, 헤테로 고리가 방향 고리가 되는 경우는 없다.

본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질로서는, 일반식 (I)에서, a가 3~5의 정수이며, b가 1이고, X가 5~7원 비방향족 헤테로 고리기(단, 헤테로 고리기 중의 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합한다.), 바람직하게는 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기 또는 1-피페라지닐기(고리 중의 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합되어 있으며, 1개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되고 있을 수 있다.)이며, R¹ 및 R²가 각각 독립적으로, 일반식 (A) 중 r이 1이며, t가 0이고, q가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, s+u가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, c가 1이고, v가 4~12의 정수이며, q+s+u+v가 16 이상의 정수인 기, 인지질； 일반식 (I)에서, a가 3~5의 정수이며, b가 1이고, X가 5~7원 비방향족 헤테로 고리기(단, 헤테로 고리기 중의 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합한다.), 바람직하게는 1-피롤리디닐기, 1-피페리디닐기, 1-모르폴리닐기 또는 1-피페라지닐기(고리 중의 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합되어 있고, 1개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되고 있을 수 있다.)이고, R¹ 및 R²가 각각 독립적으로 일반식 (A) 중 r이 0이며, t가 1이고, q+s가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, u가 5~8의 정수이고, c가 1이며, v가 4~12의 정수이고, q+s+u+v가 16 이상의 정수인 기, 인지질； 일반식 (I)에서, a가 3~5의 정수이며, b가 0이며, X가 일반식 (B)에서, d가 0이며, R³ 및 R⁴가 각각 독립적으로 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기(R³ 및 R⁴가 나타내는 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기는, 1개 또는 2개의 수소 원자가 페닐기로 치환되어 있을 수 있다)이고, R¹ 및 R²가 각각 독립적으로, 일반식 (A) 중 r이 1이며, t가 0이며, q가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, s+u가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이고, c가 1이며, v가 4~12의 정수이고, q+s+u+v가 16 이상의 정수인 기, 인지질； 일반식 (I)에서, a가 3~5의 정수이며, b가 0이고, X가 일반식 (B)에서, d가 0이며, R³ 및 R⁴가 각각 독립적으로 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기(R³및 R⁴가 나타내는 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기는 1개 또는 2개의 수소 원자가 페닐기로 치환되어 있을 수 있다)이며, R¹ 및 R²가 각각 독립적으로, 일반식 (A) 중 r이 0이며, t가 1이며, q+s가 5~11의 정수, 바람직하게는 6~10의 정수이며, u가 5~8의 정수이고, c가 1이며, v가 4~12의 정수이고, q+s+u+v가 16 이상의 정수인 기, 인지질；이 바람직하다. 이러한 지질 중 R¹ 및 R²가 동일한 기인 지질이, 일반식 (I)로 나타내어지는 pH 감수성 양이온성 지질로서 보다 바람직하고, R¹ 및 R²가 동일한 기이며 a가 4인 지질이 특히 바람직하다.

일반식 (I)로 나타내어지는 pH 감수성 양이온성 지질의 pKa는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 4.0~9.0 정도, 바람직하게는 4.5~8.5 정도, 보다 바람직하게는 6~8정도로 선택할 수 있으며, 이 범위의 pKa를 부여하도록 각 치환기의 종류를 선택하는 것이 바람직하다.

일반식 (I)로 나타내어지는 pH 감수성 양이온성 지질은, 예를 들면, 본 명세서의 실시예에 구체적으로 나타낸 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 이 제조 방법을 참조하여, 원료 화합물, 시약 및 반응 조건 등을 적절하게 선택함으로써, 당업자는 일반식 (I)의 범위에 포함되는 임의의 지질을 용이하게 제조할 수 있다.

＜중성 인지질＞

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 지질 성분에 포함되는 중성 인지질(이하, 「본 발명의 중성 인지질」이라고 할 수 있다.)은 기 전체로서 전하가 중성이며, 인산기와 양으로 대전하고 있는 기가 적당한 연결기로 연결된 지질이다. 양으로 대전하고 있는 기로서는, 예를 들면, 암모늄기나 4급 암모늄기 등을 들 수 있다.

본 발명의 중성 인지질로서는, 글리세로 인지질 또는 스핑고 인지질이 바람직하다. 중성의 글리세로 인지질로서는, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린, 카르디올리핀, 플라스말로겐 등을 들 수 있다. 중성의 스핑고 인지질로서는, 스핑고미엘린, 세라마이드포스포릴글리세롤, 세라마이드포스포릴에탄올아민 등을 들 수 있다. 이러한 중성 글리세로 인지질 또는 중성 스핑고 인지질에서의 지방산 잔기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 탄소수 12~24의 포화 또는 불포화 지방산 잔기를 들 수 있으며, 탄소수 14~20의 포화 또는 불포화 지방산 잔기가 바람직하다. 구체적으로는, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키딘산, 아라키돈산, 베헨산, 리그노세르산 등의 지방산 유래의 아실기를 들 수 있다. 이러한 글리세로 지질 또는 스핑고 지질이 2 이상의 지방산 잔기를 가지는 경우, 모든 지방산 잔기가 동일한 기일 수 있으며, 서로 다른 기일 수도 있다.

본 발명의 중성 인지질로서는, 게놈 편집 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 점에서 탄소수 12~24의 포화 또는 불포화 지방산 잔기를 가지는 중성 글리세로 인지질이 바람직하고, 탄소수 12~24의 불포화 지방산 잔기를 가지는 중성 글리세로 인지질 또는 중성 스핑고 인지질이 더 바람직하고, 탄소수 12~24의 불포화 지방산 잔기를 가지는 중성 글리세로 인지질이 더욱 바람직하다. 그 중에서, 탄소수 12~24의 불포화 지방산 잔기를 가지는 탄소수 12~24의 불포화 지방산 잔기를 가지는 포스파티딜에탄올아민이 바람직하고, 탄소수 14~20의 지방산 잔기를 가지는 포스파티딜에탄올아민이 보다 바람직하고, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)이 특히 바람직하다.

＜폴리알킬렌글리콜 수식 지질＞

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 지질 성분에 포함되는 폴리알킬렌글리콜 수식 지질(이하, 「본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질」이라고 할 수 있다.)은 폴리알킬렌글리콜로 수식된 지질이면 특별히 한정되지 않지만, pH 감수성 양이온성 지질 및 중성 인지질은 제외된다. 폴리알킬렌글리콜은 친수성 폴리머이며, 폴리알킬렌글리콜 수식 지질을 지질막 구성 지질로서 이용하여 지질 나노 입자를 구축함으로써, 지질 나노 입자의 표면을 폴리알킬렌글리콜로 수식할 수 있다. 폴리알킬렌글리콜로 표면 수식함에 따라, 지질 나노 입자의 혈중 체류성 등의 안정성을 높일 수 있는 경우가 있다.

폴리알킬렌글리콜로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리테트라메틸렌글리콜, 폴리헥사메틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 폴리알킬렌글리콜의 중량 평균 분자량은, 예를 들면 300~10,000정도, 바람직하게는 500~10,000정도, 더욱 바람직하게는 1,000~5,000정도이다.

예를 들면, 지질의 폴리에틸렌글리콜에 의한 수식에는, 스테아릴화 폴리에틸렌글리콜(예를 들면, 스테아린산 PEG45(STR-PEG45) 등)을 이용할 수 있다. 그 외, N-[카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜-2000]-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파에탄올아민, n-[카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜-5000]-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜-750]-1,2-디스테아로로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜-2000]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, N-[카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜-5000]-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민 등의 폴리에틸렌글리콜 유도체 등을 이용할 수도 있지만, 폴리알킬렌글리콜화 지질은 이들에 한정되지 않는다.

＜그 외의 지질＞

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 구성 지질 중, 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질, 본 발명의 중성 인지질 및 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질 이외의 지질로서는, 일반적으로 리포솜을 형성할 때 사용되는 지질을 이용할 수 있다. 이러한 지질로서는, 예를 들면, 양 또는 음으로 대전한 인지질, 스테롤, 또는 포화 혹은 불포화의 지방산 등을 들 수 있다. 이들은 1종 또는 2종 이상을 조합하여 이용할 수 있다.

양 또는 음으로 대전한 인지질로서는, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 세라마이드포스포릴글리세롤포스페이트, 포스파티딘산 등을 들 수 있다. 스테롤로서는, 예를 들면, 콜레스테롤, 콜레스테롤 호박산, 라노스테롤, 디히드로라노스테롤, 데스모스테롤, 디히드로콜레스테롤 등의 동물 유래의 스테롤；스티그마스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 브라시카스테롤 등의 식물 유래의 스테롤(피토스테롤)；티모스테롤, 에르고스테롤 등의 미생물 유래의 스테롤 등을 들 수 있다.

＜지질 조성＞

본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질, 중성 지질 및 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질은 각각 1종류만일 수 있으며, 2종류 이상일 수도 있다. 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질이 2종류 이상인 경우, 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질의 양은 지질 나노 입자를 구성하는 지질 분자 중 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질에 상당하는 지질 분자의 합계량을 의미한다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 본 발명의 중성 지질이 2종류 이상인 경우, 본 발명의 중성 지질의 양은 지질 나노 입자를 구성하는 지질 분자 중 본 발명의 중성 지질에 상당하는 지질 분자의 합계량을 의미한다. 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질이 2종류 이상인 경우, 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 양은, 지질 나노 입자를 구성하는 지질 분자 중 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질에 상당하는 지질 분자의 합계량을 의미한다.

지질 나노 입자를 구성하는 지질 분자(지질 성분)의 전량에 차지하는 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질의 비율이 많을수록, 지질 나노 입자의 입자 지름이 작고, RNP의 봉입 효율이 높아지는 경향이 있다. 또한, 지질 나노 입자를 구성하는 지질 분자의 전량에 차지하는 본 발명의 중성 인지질의 비율이 많을수록, RNP의 봉입 효율이 높아지는 경향이 있다. 또한, 지질 나노 입자를 구성하는 지질 분자에 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질이 소량 포함되어 있음에 따라, 지질 나노 입자의 입자 지름이 충분히 작고, RNP의 봉입 효율이 충분히 높고, 게놈 편집 효율이 충분히 높아지는 경향이 있다. 보다 높은 게놈 편집 효율을 달성하기 위해서, 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질의 비율([본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질의 양(mol)］/(［지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질의 양(mol)］)×100%)이 30~50몰%이며, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 본 발명의 중성 인지질의 비율(［본 발명의 중성 인지질의 양(mol)］/(［지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질의 양(mol)］)×100%)이 20~50몰%이며, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 비율(［본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 양(mol)］/(［지질 나노 입자를 구성하는 전지질의 양(mol)］)×100%)이 1.0~4.0몰%인 것이 바람직하고, 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 본 발명의 pH 감수성 양이온성 지질의 비율이 40~50몰%이며, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 본 발명의 중성 인지질의 비율이 20~50몰%이며, 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 본 발명의 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 비율이 1.5~2.0인 것이 보다 바람직하다.

＜표면 수식＞

본 발명에 따른 지질 나노 입자에는 필요에 따라 적절한 표면 수식 등을 행할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자는, 표면을 친수성 폴리머 등으로 수식함으로써 혈중 체류성을 높일 수 있다. 이러한 수식기로 수식된 지질을 지질 나노 입자의 구성 지질로서 사용함으로써, 표면 수식을 행할 수 있는 경우도 있다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조시, 혈중 체류성을 높이기 위한 지질 유도체로서 예를 들면, 글리코포린, 강글리오시드 GM1, 포스파티딜이노시톨, 강글리오시드 GM3, 글루콘산 유도체, 글루타민산 유도체, 폴리글리세린 인지질 유도체 등을 이용할 수도 있다. 또한, 혈중 체류성을 높이기 위한 친수성 폴리머로서 폴리알킬렌글리콜 외에 덱스트란, 풀루란, 피콜, 폴리비닐알코올, 스티렌-무수 말레산 교호 공중합체, 디비닐 에테르-무수 말레산 교대 공중합체, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 키토산, 만난, 시클로덱스트린, 펙틴, 카라기난 등을 표면 수식에 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 핵내 이행을 촉진하기 위해서, 예를 들면, 지질 나노 입자를 3당 이상의 올리고당 화합물로 표면 수식할 수도 있다. 3당이상의 올리고당 화합물의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 3~10개 정도의 당 유닛이 결합된 올리고당 화합물을 이용할 수 있고, 바람직하게는 3~6개 정도의 당 유닛이 결합된 올리고당 화합물을 이용할 수 있다. 그 중에서, 바람직하게는 글루코오스의 3량체 내지 6량체인 올리고당 화합물을 이용할 수 있고, 더 바람직하게는 글루코오스의 3량체 또는 4량체인 올리고당 화합물을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 이소말토트리오스, 이소파노오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스 또는 말토헥사오스 등을 바람직하게 이용할 수 있으며, 이들 중 글루코오스가 α1-4결합한 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스 또는 말토헥사오스가 더욱 바람직하다. 특히 바람직한 것은 말토트리오스 또는 말토테트라오스이며, 가장 바람직한 것은 말토트리오스이다. 올리고당 화합물에 의한 지질 나노 입자의 표면 수식량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 총 지질량에 대해서 1~30몰% 정도, 바람직하게는 2~20몰% 정도, 보다 바람직하게는 5~10몰% 정도이다.

올리고당 화합물로 지질 나노 입자를 표면 수식하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 지질 나노 입자를 갈락토오스나 만노오스 등의 단당으로 표면을 수식한 리포솜(국제 공개 제2007/102481호)이 알려져 있으므로, 이 간행물에 기재된 표면 수식 방법을 채용할 수 있다. 상기 간행물에 명시된 전부를 참조에 의해 본 명세서의 개시로서 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 지질 나노 입자에는, 예를 들면, 온도 변화 감수성 기능, 막 투과 기능, 유전자 발현 기능 및 pH 감수성 기능 등 중 어느 하나 또는 2개 이상의 기능을 부여할 수 있다. 이러한 기능을 적절하게 부가함으로써 지질 나노 입자의 혈액중의 체류성을 향상시켜, 간장이나 비장 등의 세망내피계 조직에 의한 포착률을 저하시킴과 함께, 표적 세포에서의 엔도사이토시스 후에 엔도솜으로부터 효율적으로 지질 나노 입자를 탈출시켜 핵 내에 이행시킬 수 있어, 핵 내에서 높은 게놈 편집 활성을 달성하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명에 따른 지질 나노 입자는, 세포 표면의 수용체나 항원에 대해서 특이적으로 결합 가능한 항체 등의 물질로 수식을 실시할 수도 있으며, 세포의 핵 내로의 물질 송달 효율을 개선할 수 있다. 예를 들면, 표적 조직 또는 장기에 특이적으로 발현하는 생체 성분에 대한 단일 클론 항체를 지질 나노 입자의 표면에 배치하는 것이 바람직하다. 이 수법은, 예를 들면, STEALTH LIPOSOME(제233-244페이지, CRC Press, Inc. 발행, Danilo Lasic 및 Frank Martin편) 등에 기재되어 있다. 지질 나노 입자의 구성 성분으로서 단일 클론 항체나 그 프래그먼트(예를 들면, Fab 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, 또는 Fab＇ 프래그먼트 등) 중의 메르캅토기와 반응할 수 있는 지질 유도체, 예를 들면, 폴리(에틸렌글리콜)-α-디스테아로일포스파티딜에탄올아민ω-말레인이미드, α-［N-(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포릴-에틸)카르바밀)-ω-[3-[2-(2,5-디히드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)에탄카르복사미드］프로필｝-폴리(옥시-1,2-에탄디일) 등의 말레인이미드 구조를 가지는 지질 유도체를 함유시킴으로써, 단일 클론 항체를 지방 지질 나노 입자의 막의 표면에 결합시킬 수 있다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 표면을, 연속한 복수개의 아르기닌 잔기를 포함하는 폴리펩타이드(이하, 「폴리아르기닌」이라고 부른다.)로 수식해도 된다. 폴리아르기닌으로서는, 바람직하게는 4~20개가 연속한 아르기닌 잔기를 포함하는 폴리펩타이드, 더 바람직하게는 4~20개가 연속한 아르기닌 잔기만으로 이루어지는 폴리펩타이드, 특히 바람직하게는 옥타아르기닌 등을 이용할 수 있다. 리포솜 등의 지질 나노 입자의 표면을 옥타아르기닌 등의 폴리아르기닌으로 수식함으로써, 리포솜에 봉입된 RNP의 세포내 송달 효율을 향상시킬 수 있다(Journal of Controlled Release, 98, pp.317-323, 2004； 국제 공개 제2005/32593호). 폴리아르기닌에 의한 지질 나노 입자 표면의 수식은 상기의 간행물에 기재된 방법에 따라, 예를 들면 지질 수식 폴리아르기닌, 예를 들면 스테아릴화 옥타아르기닌 등을 지질 나노 입자의 구성 지질로서 사용함으로써 용이하게 행할 수 있다. 상기 간행물의 개시 및 이 간행물에서 인용된 모든 문헌의 개시를 참조에 의해 본 명세서의 개시로서 포함한다.

［그 외의 성분］

본 발명에 따른 지질 나노 입자는, 토코페롤, 갈산 프로필, 팔미틴산 아스코르빌, 또는 부틸화 히드록시톨루엔 등의 항산화제, 하전 물질, 및 막 폴리펩타이드 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 더 포함하고 있을 수 있다. 양하전을 부여하는 가전 물질로서는, 예를 들면, 스테아릴아민, 올레일아민 등의 포화 혹은 불포화 지방족 아민； 디올레오일트리메틸암모늄프로판 등의 포화 혹은 불포화 양이온성 합성 지질； 또는, 양이온성 폴리머 등을 들 수 있으며, 음전하를 부여하는 가전 물질로서는, 예를 들면, 다이세틸포스페이트, 콜레스테릴헤미숙시네이트, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산 등을 들 수 있다. 막 폴리펩타이드로서는, 예를 들면, 막 표재성 폴리펩타이드 또는 막내재성 폴리펩타이드 등을 들 수 있다. 이러한 물질의 배합량은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

［지질 나노 입자］

본 발명에 따른 지질 나노 입자는, 지질 성분으로 이루어지는 지질막 구조체이며, RNP를 탑재하고 있다. RNP의 지질 나노 입자로의 봉입률이 더 높아지는 점에서, 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 지질 나노 입자에 탑재되어 있는 RNP의 비율(［RNP의 양(mol)］/(［지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질의 양(mol)］)×100%)은 1.8~3.6×10^-2몰%인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 크기는, 표적 세포가 생체 내의 비교적 심부에 존재하는 경우에도 높은 송달 효율을 얻기 쉬운 점에서, 평균 입자 지름이 80nm 이하인 것이 바람직하고, 평균 입자 지름이 50nm 이하인 것이 보다 바람직하고, 40nm 이하인 것이 더 바람직하고, 30nm 이하인 것이 더욱 바람직하고, 10~30nm인 것이 특히 바람직하다. 한편, 지질 나노 입자의 평균 입자 지름이란, 동적 광산란법(Dynamic light scattering：DLS)에 의해 측정된 개수 평균 입자 지름을 의미한다. 동적 광산란법에 따른 측정은, 시판하는 DLS 장치 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 다분산 지수(PDI)는 0.05~0.1 정도, 바람직하게는 0.06~0.08 정도, 더욱 바람직하게는 약 0.07 정도이다. 제타 전위는 5.5mV~6.0mV의 범위, 바람직하게는 5.8mV 정도로 할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 수계 용매에 분산된 형태로서 단일막 리포솜, 다중층 리포솜, 구상 미셀 또는 부정형의 층상 구조물 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 지질 나노 입자로서는 단일막 리포솜, 다중층 리포솜인 것이 바람직하다.

［제조 방법］

본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조 방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업자가 이용 가능한 임의의 방법을 채용할 수 있다. 일례를 들면, 모든 지질 성분을 클로로포름 등의 유기 용매에 용해하여, 증발기에 의한 감압 건고나 분무 건조기에 의한 분무 건조를 행함으로써 지질막을 형성한 후, RNP 등을 포함하는 수계 용매를 건조한 상기의 혼합물에 첨가하여, 호모지나이저 등의 유화기, 초음파 유화기 또는 고압 분사 유화기 등에 의해 유화함으로써 제조할 수 있다. 또한, 리포솜을 제조하는 방법으로서 잘 알려져 있는 방법, 예를 들면, 역상 증발법 등에 의해서도 제조할 수 있다. 지질 나노 입자의 크기를 제어하고자 하는 경우에는, 공경이 구비된 멤브레인 필터 등을 이용하여, 고압하에서 익스트루젼(압출 여과)을 행할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자는 유로를 이용한 알코올 희석법에 의해 제조할 수 있다. 제조에 사용하는 유로로서는, 2액의 순간 혼합을 달성할 수 있는 3차원 마이크로믹서 내장 마이크로 유로여도 무방하지만, 입경 제어성이 높은 나노 사이즈의 지질 입자 형성 시스템을 형성할 수 있는 점에서, 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 원료 용액을 흘리는 마이크로 사이즈의 유로에 유로 폭에 대해서 일정폭의 배플(방해판)을 양측면에서 엇갈리게 배치한 단순한 이차원적 구조의 유로 구조체를 이용하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 도 1a에 나타낸 바와 같은 유로 구조체(이하, 「본 발명의 유로 구조체」라고 할 수 있다.)를 사용하는 것이 바람직하다. 그 상류측(도면 좌측)에서, 서로 독립된 제1 유동체를 도입하는 제1 도입로(10) 및 제2 유동체를 도입하는 제2 도입로(20)가 각각 일정 길이를 가지고 합류하고, 그 하류측을 향해 하나의 희석 유로(30)를 형성하고 있다. 상기 희석 유로(30)는 적어도 그 일부에서 2차원적으로 굴곡된 유로 부위(50)를 가지며, 상기 굴곡된 유로 부위(50)는, 이보다 상류의 희석 유로의 축선 방향 내지 그 연장 방향을 X방향, 이 X방향과 수직으로 교차하는 희석 유로의 폭 방향을 Y방향으로 하고, 이보다 상류의 희석 유로의 유로 폭을 y₀로 한 경우에, Y방향에서 대향하는 희석 유로의 양측 벽면으로부터 교대로, 유로 중심 측을 향하여 대략 Y방향(대략 +Y방향, 대략 -Y방향)으로 1/2y₀ 이상 1y₀ 미만의 일정 높이(h₁, h₂...)를 가지며, 또한 X방향으로 일정폭(x₁, x₂...)을 가지고 돌출하며, 희석 유로의 유로폭을 규제하는 구조자(40)가 일정 간격(d₁, d₂...)을 가지고 적어도 2개 이상 마련됨으로써 형성되어 있는 것이다. 즉, 상기 구조자(40)가 존재하는 부위에는, X방향에서 일정 길이(x₁, x₂...)의 사이, 희석 유로의 유로폭(y₁, y₂...)이 1/2y₀ 이하, 특히 1/2y₀ 이하 1/40y₀ 이상으로 규제되게 된다.

한편, 본 발명의 유로 구조체는, 개념적으로는 도 1a에 예시하고 상기에 설명한 바와 같이, 마이크로 사이즈의 유로에 대략 직사각형의 배플을 양측면으로부터 엇갈리게 배치한 형상이지만, 실제상에서는 이와 같이 유로 상에 별체적인 배플을 배치함에 따라 구성되는 것에 한정되는 것은 아니다. 즉, 이러한 배플을 배치함으로써 형성되는 유로에 상응하도록 동일한 형상의 유로가 형성되는 한, 구조자(40)의 구성은 특별히 한정되지 않으며, 상기한 바와 같은 구조자(40)를 구성하도록 유로 구조체의 벽면을(거의 일정 두께를 유지하면서) 소정 형상으로 굴곡시키면서, 일체적으로 형성하고, 상기에 규정한 바와 같이 굴절하여 축소 확대되는 이차원 구조의 유로 형상을 구성하는 것일 수도 있으며, 본 발명의 유로 구조체에는 당연히 이러한 양태가 포함된다. 이러한 이차원 구조의 유로는, 예를 들면, 열가소성 수지, 열강화성 수지, 자외선 경화성 수지, 금속 내지 유리질 재료 등을 이용한 사출 성형, 주조 성형, 3차원 프린터를 이용한 성형 등에 의해 비교적 용이하게 형성할 수 있다.

제1 도입로(10)와 제2 도입로(20)가 합류한 후의 희석 유로(30)의 유로폭(y₀)은, 형성하고자 하는 나노 사이즈의 지질 입자의 입경의 크기에 따라서도 어느 정도 좌우되지만, 대표적으로는 20~1,000μm 정도, 보다 바람직하게는 100~200μm 정도인 것이 바람직하다. 소망하는 나노 사이즈, 구체적으로는, 예를 들면 약 10~100nm의 입경 범위내 사이즈인 입경의 지질 입자를 얻는데 있어서는, 상기한 바와 같은 범위내의 유로폭(y₀)으로 지질 용액을 희석 매체로 희석하는 것이 어느 정도 필요한 조건이다.

또한, 각 구조자(40)의 높이(h₁, h₂...)(Y방향 길이)로서는, 그보다 상류측의 희석 유로(30)의 유로폭(y₀)에 대해서 1/2y₀ 이상 1y₀ 미만, 바람직하게는 1/2y₀이상 39/40y₀ 이하, 더 바람직하게는 1/2y₀ 이상 3/4y₀ 이하이며, 상기 각 구조자(40)가 존재함에 따라, 그보다 상류측의 희석 유로(30)의 유로폭(y₀)으로부터 유로폭(y1, y2...)을 1/2y₀ 미만이고 0보다 큰 폭으로 축소시킨다. 한편, 굴곡된 유로 부위(50)에서 복수 설치되는 상기 구조자(40)의 각각의 높이(h₁, h₂...)는 반드시 동일할 필요는 없으며, 상기한 소정의 조건을 만족시키는 한, 각각 달라도 무방하다. 이에 의해 형성되는 유로폭(y₁, y₂...)도 각각 다를 수 있다. 예를 들면, 하류 방향으로 갈수록 각 구조자(40)의 각각의 폭(h₁, h₂...)이 점차 길어지고 유로폭(y₁, y₂...)이 좁아지는 양태여도 무방하다. 각 구조자(40)의 높이(h₁, h₂...)(Y방향 길이)가 소정의 것으로서, 이들이 존재하는 부위의 유로폭(y₁, y₂...)이 1/2y₀ 미만의 폭으로 좁혀짐으로써, 분자 확산의 효율이 향상된다.

얻으려고 하는 지질 입자의 크기나, 구조자(40)의 수, 각 믹서 구조자(40)의 폭(X방향 길이)(x₁, x₂...), 인접하는 각 구조자(40) 간의 간격(d₁, d₂...) 등 그 외의 조건에 따라서도 좌우되며 특별히 한정되는 것도 아니지만, 구체적으로는 예를 들면, 상류의 희석 유로의 유로폭(y₀)이 200μm인 경우에, 상기 구조자(40)의 각각의 높이(h₁, h₂...)는 100μm~200μm 미만이 되는 것이 바람직하다. 따라서, 각 구조자(40)가 존재하는 위치에서의 유로폭(y₁, y₂...)은 1/2y₀ 미만이고 0보다 큰 폭인, 100μm 미만 정도가 된다.

또한, 각 구조자(40)의 폭(X방향 길이)(x₁, x₂...)으로서는, 얻으려고 하는 지질 입자의 크기나, 구조자(40)의 수, 각 구조자(40)의 높이 h₁, h₂...(Y방향 길이), 인접하는 각 구조자(40) 간의 간격(d₁, d₂...) 등의 그 외의 조건에 의해서도 좌우되지만, 상류의 희석 유로의 유로 폭(y₀)에 대하여 1/10y₀ 이상 5y₀ 이하 정도의 길이가 되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 상류의 희석 유로의 유로폭(y₀)이 20~1,000μm, 대표적으로는 200μm인 경우, 상기 구조자(40)의 각각의 폭(x₁, x₂...)은 20μm~1,000μm 정도가 되는 것이 바람직하다. 각 구조자(40)의 각각의 폭(x₁, x₂...)은 반드시 동일할 필요는 없으며, 상기한 소정의 조건을 만족하는 한, 각각 달라도 무방하다. 예를 들면, 하류 방향으로 갈수록 점차 폭(x₁, x₂...)이 길어지는 양태일 수 있다.

또한, 인접하는 각 구조자(40) 간의 간격(d₁, d₂...)으로서는, 얻으려고 하는 지질 입자의 크기나, 구조자(40)의 수, 각 구조자(40)의 높이(h₁, h₂...)(Y방향 길이), 각 구조자(40)의 폭(X방향 길이)(x1, x2...) 등의 그 외의 조건에 의해서도 좌우되지만, 상류의 희석 유로의 유로 폭(y₀)에 대하여 1/10y₀ 이상 5y₀ 이하 정도의 길이가 되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 상류의 희석 유로의 유로 폭(y₀)이 20~1,000μm, 대표적으로는 200μm인 경우, 인접하는 각 구조자(40) 간의 간격(d₁, d₂...)은 20μm~1,000μm 정도가 되는 것이 바람직하다. 인접하는 각 구조자(40) 간의 간격(d₁, d₂...)은 반드시 동일할 필요는 없으며, 상기한 소정의 조건을 만족하는 한, 각각 달라도 무방하다. 예를 들면, 하류 방향으로 갈수록 점차 간격(d₁, d₂...)이 좁아지는 양태일 수 있다.

한편, 본 발명의 유로 구조체에서, 상류의 희석 유로의 축선 방향 내지 그 연장 방향을 X방향, 이 X방향과 수직으로 교차하는 희석 유로의 폭 방향을 Y방향이라고 한 경우, 상기한 바와 같이 각 구조자(40)는 양측 벽면으로부터 교대로 유로 중심측을 향하여 대략 Y방향(대략 +Y방향, 대략 -Y방향)으로 연장되어 있고, 유로 방향(X방향)과 대략 직각으로 대향하는 벽면을 가지지만, 이 각도는 반드시 엄밀하게 90˚일 필요는 없고, 어느 정도 경사진 것이어도 유효한 구성이 될 수 있으며, 특별히 한정되지 않지만 구체적으로는, 예를 들면, 30~150˚정도, 보다 바람직하게는 40~140˚, 특히 바람직하게는 80~100˚의 범위이면 허용된다. 또한, 각 구조자(40)의 유로 중심측의 모서리부의 형상으로서도 어느 정도의 라운드는 허용되며, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 R50μm 이하, 보다 바람직하게는 R20μm 이하이면 허용되는 경우도 있을 수 있다. 그러나, 보다 제어성 높고 균일한 나노 사이즈의 지질 입자를 얻는데 있어서는, 이러한 허용차는 가능한 한 적은 것이 바람직하다. 또한, 도 1a에 나타내는 실시 형태에서는, 유로 구조체에서의 상류의 희석 유로의 축선 방향 내지 그 연장 방향인 X방향은 편의상 직선 형상으로 표현되고 있지만, 이 X방향은 어디까지나 희석 유로의 축선 방향을 나타내는 것이며, 실제상으로는 이러한 직선 형상인 것에 한정되지 않으며, 예를 들면, 어느 곡률을 가지고 만곡된 것일 수도 있다. 한편, 이러한 경우에는, 이 X방향과 수직으로 교차하는 희석 유로의 폭 방향인 Y방향은, 그 단위 길이의 부위에서의 X방향과 수직인 방향을 가리키게 된다.

또한, 본 발명의 유로 구조체는, 상기한 바와 같이 이차원적 구조의 유로 구조체이기 때문에, 그 유로의 깊이 방향(도 1a에서의 종이 두께 방향)의 사이즈는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 10~1,000μm정도, 보다 바람직하게는 50~200μm정도로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자를 알코올 희석법에 의해 제조할 때 이용되는 유로로서는, 도 1a에 나타내는 유로 구조체 내의 희석 유로(30)가 3차원적인 흐름을 일으킬 수 있는 유로이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 유로 구조체는 희석 유로(30)의 적어도 그 일부에서, 이차원적으로 굴곡된 유로 부위(50) 대신, 유로 벽면에 형성된 홈 또는 미세 돌기에 의해 카오틱한 흐름이 생기는 카오틱 마이크로믹서(스태거드 헤링본 믹서)(비특허문헌 8)일 수 있다.

본 발명의 유로 구조체가 도 1a에 나타낸 바와 같이, 제1 유동체를 도입하는 제1 도입로(10) 및 제2 유동체를 도입하는 제2 도입로(20)가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성하고 있는 경우에는, 제1 도입로에서 지질 성분을 에탄올에 용해시킨 지질 용액을, 제2 도입로에서 Cas9 단백질, crRNA, tracrRNA 및 ssON을 함유하는 수용액(RNP 함유 수용액)을 각각 도입한다. 희석 유로에서, 지질 용액은 RNP 함유 수용액에 의해 희석되고 이 과정에서 RNP를 탑재한 지질 나노 입자가 제조된다.

본 발명의 유로 구조체는 서로 독립적인 복수의 도입로를 가지고 있으며, 그들 도입로가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성하고 있을 수 있으며, 3개의 도입로를 가지고 있을 수도 있다. 본 발명의 유로 구조체가 3개의 도입로를 가지는 경우, 제1 도입에서 도입된 제1 유동체가 제2 도입로에서 도입된 제2 유동체와 합류하기 전에, 제3 도입로에서 도입된 제3 유동체와 접촉하도록 제1 도입로, 제2 도입로 및 제3 도입로가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성할 수 있다.

예를 들면, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 희석 유로(30)로의 합류 지점이 서로 가장 떨어져 있는 도입로를 제1 도입로(10) 및 제2 도입로(20)로 하고, 남는 도입로를 제3 도입로(60)로 한 경우에는, 제1 도입로(10)에서 지질 성분을 에탄올에 용해시킨 지질 용액을 도입하고, 제2 도입로(20)에서 RNP 함유 수용액을 도입하고, 제3 도입로(60)에서 RNP 함유 수용액의 조제에 이용한 수계 용매를 각각 도입한다. 제1 도입로(10)에서 도입된 지질 용액은, 우선 제3 도입로(60)에서 도입된 수계 용매와 합류하고, 그 후에 제2 도입로(20)에서 도입된 RNP 함유 수용액과 합류한다. RNP 함유 수용액이 고농도의 에탄올 용액인 지질 용액과 직접 접촉하는 것을 피할 수 있기 때문에, RNP 함유 수용액중의 단백질이 희석 유로(30), 특히 그 입구 부근에서 고농도 에탄올에 의해 응집되는 것을 억제할 수 있다.

본 발명의 유로 구조체에서의 희석은 분자 확산에 의존하게 된다. 원료가 되는 지질 용액의 희석 속도가 빠를수록, 생성되는 지질 입자의 사이즈가 작아진다. 따라서, 구조자(배플)의 폭이나 길이, 배치를 조정함에 따라 원료 용액의 희석 속도를 제어할 수 있어, 종래보다 입경 제어성이 높은 지질 나노 입자를 형성하는 것이 가능하다.

RNP 함유 수용액은, Cas9 단백질, crRNA, tracrRNA 및 ssON을 수계 용매에 용해시킴으로써 조제할 수 있다. 상기 수계 용매는 게놈 편집 활성을 유지한 상태에서 RNP를 지질 용액에 혼합 가능한 수계 용매이며, 제조된 지질 나노 입자가 안정적으로 분산 가능하면 특별히 한정되지 않는다. 상기 수계 용매로서는, 예를 들면, 인산 완충액, 구연산 완충액, 인산 완충 생리 식염액 등의 완충액, 생리 식염수, 세포 배양용 배지 등을 들 수 있다. 이들 수계 용매(분산매)는,, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스, 이노시톨, 리보오스, 자일로스당의 단당류； 유당, 자당, 셀로비오스, 트레할로스, 말토오스 등의 이당류； 라피노즈, 멜레지토스 등의 3 당류； 시클로덱스트린 등의 다당류； 에리스리톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 말티톨 등의 당 알코올； 글리세린, 디글리세린, 폴리글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜모노알킬에테르, 디에틸렌글리콜모노알킬에테르, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올； 등을 더 가할 수 있다.

RNP 함유 수용액의 pH가 낮으면 제조된 RNP를 탑재한 지질 나노 입자의 게놈 편집 활성이 저하되는 경우가 있다. 이 때문에, RNP 함유 수용액의 pH는 5.0 이상이 바람직하고, 5.0~8.5의 범위 내인 것이 보다 바람직하고, 5.0~8.0의 범위 내인 것이 더 바람직하고, 5.0~7.5의 범위 내인 것이 더욱 바람직하다. 또한, RNP 함유 수용액의 pH는 6이상이 바람직하고, 6~8.5의 범위 내인 것이 보다 바람직하고, 6~8의 범위 내인 것이 더 바람직하고, 6~7.5의 범위 내인 것이 더욱 바람직하다.

지질 용액과 RNP 함유 수용액의 유속비는 지질 용액의 희석 속도에 영향을 주며, 나아가서는 생성하는 지질 입자의 사이즈에 영향을 준다. 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조에 있어서는, 평균 입자 지름이 충분히 작고 표적 세포로의 흡수 효율이 높은 지질 나노 입자를 제조하는 점에서, 지질 용액의 유속에 대한 RNP 함유 수용액의 유속의 비는 7 이상이 바람직하고, 7~10이 보다 바람직하고, 7~9가 더욱 바람직하다.

지질 용액과 RNP 함유 수용액의 총 유량은 특별히 한정되는 것은 아니며, 1μL/분~100mL/분의 범위 내에서 적절하게 조정할 수 있다. 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조에서는, 지질 용액과 RNP 함유 수용액의 총 유량은 50μL/분~1mL/분의 범위 내가 바람직하고, 50~800μL/분의 범위 내가 보다 바람직하고, 50~600μL/분의 범위 내가 더 바람직하고, 50~500μL/분의 범위 내가 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자는 표적 세포에 게놈 편집을 행하기 위한 RNP를 송달하는 캐리어이다. 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 표적 세포 내에 도입함으로써, 게놈 편집을 행할 수 있다. 표적 세포가 배양 세포인 경우, 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 배양 배지에 첨가한다. 표적 세포가 동물의 체내 세포인 경우, 본 발명에 따른 지질 나노 입자를 동물에 투여한다. 투여 경로는 특별히 한정되지 않지만, 경정맥 투여, 경장 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 경비 투여, 경폐 투여 등의 비경구 투여인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지질 나노 입자가 투여되는 동물은 특별히 한정되지 않으며, 사람일 수 있고, 사람 이외의 동물일 수도 있다. 비인간 동물로서는, 소, 돼지, 말, 양, 염소, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 쥐, 햄스터, 모르모트 등의 포유 동물이나, 닭, 메추리, 오리 등의 조류 등을 들 수 있다.

실시예

다음으로 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

［참고예 1］

도 1a에 나타낸 바와 같은 유로 구조체를 포함하는 제조 장치를 이용하여, RNP를 탑재한 지질 나노 입자를 조제하기 위한 조건을 검토하였다. 구체적으로는 RNP를 용해하는 완충액의 pH, 에탄올에 대한 RNP 용액의 유속비(flow rate ratio; FRR), 및 에탄올과 RNP 용액의 총 유속(total flow rate; TFR)을 검토하였다.

도 2에, 실제로 사용한 제조 장치의 구조를 모식적으로 나타낸다. 도 2의 (A)는 전체의 구조의 모식도이며, (B)는 믹서 내장 마이크로 유로(유로 구조체)의 사시도이며, (C)는 희석 유로(104c) 일부의 확대도이다. 도 2의 (A)에 나타낸 바와 같이, 지질 용액을 탑재한 실린지(101)와 RNP 용액을 탑재한 실린지(102)를 각각 유량 제어 장치(103)에 설치하고, 이를 믹서 내장 마이크로 유로(104)의 제1 도입로의 주입구(104a)와 제2 도입로의 주입구(104b)에 튜브(105)로 연결하고, 희석 유로(104c)의 주출구(104d)를, 제조된 지질 나노 입자를 회수하는 회수 용기(106)에 튜브(105)로 연결하였다.

이 조건 검토에서는 지질에 의한 영향을 제외하기 위해, 지질 용액 대신 에탄올을 이용하였다. 또한, RNP 용액으로서 화농연쇄구균 유래 Cas9 단백질(160 kDa)(제품명: 「Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3」, Integrated DNA technologies사제), GFP(green fluorescent protein) 유전자중의 표적 서열(서열번호 1, 20 염기 길이)과 상보적인 염기 서열을 포함하는 crRNA(서열번호 2, 36 염기 길이, 1~20번째 영역이 표적 서열과 상보적인 염기 서열이다.) 및 tracrRNA(서열번호 3, 67 염기 길이)를, 몰비 1：1：1이 되도록 완충액에 용해시킨 용액(RNP 용액)을 이용하였다. crRNA와 racrRNA는 GFP 안정 발현 HeLa(HeLa-GFP) 세포의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에 의해 증폭하여 얻었다. pH6의 완충액은 MES 완충액(20mM　MES, 50mM　NaCl, pH 6.0)을 이용하여 pH 4.0, 5.0 또는 5.5의 완충액은 구연산 완충액(20mM　구연산, 50mM　NaCl, pH 4.0, 5.0 또는 5.5)을 이용하였다.

RNP 용액과 에탄올을 각각 도 2에 기재된 제조 장치의 마이크로 유로 내에 송액한 후, 희석 유로에서 배출된 용액을 회수하여, 투석막(MWCO: 12,000-14,000)에 넣고 PBS(-) 중에서 4℃, 2시간 이상 투석을 행함으로써 버퍼 교환과 알코올의 제거를 행하였다. 플루오레사민에 의해, 투석 후의 RNP 용액의 Cas9 단백질 농도를 정량 한 후, 상기 RNP 용액을, 표적 서열을 포함하는 2중 가닥 DNA(dsDNA)(서열번호 4, 0.25pmol)에 Cas9 단백질량 환산으로 2 또는 5당량(몰비)이 되도록 혼합하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후의 반응 용액을 아가로스 전기 영동하여, DNA 절단 효율을 평가하였다. RNP를 혼합하고 있지 않은 dsDNA를 네가티브 컨트롤로 하고, 마이크로 유로 내를 통과하고 있지 않은 RNP를 dsDNA에 가한 샘플을 포지티브 컨트롤로 하였다. 각 샘플에 대하여 포지티브 컨트롤 중, 표적 dsDNA에 대해서 5당량의 RNP를 가한 샘플에서의 절단 활성을 1로 했을 때의 상대적인 절단 활성을 산출하였다. 정량적인 해석에는 화상 해석 소프트웨어 Image J를 이용하였다.

RNP 용액을 pH 6.0의 완충액으로 조제하고, FRR은 9.0으로 하고, TFR을 50~500μL/분의 범위로 하여 실험을 행하여, TFR의 영향을 조사하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 표 중 「N. C.」는 네가티브 컨트롤의 결과를, 「P. C.」는 포지티브 컨트롤의 결과를 각각 가리킨다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 총 유속에서 포지티브 컨트롤과 동일한 정도의 절단 활성을 가지고 있으며, 총 유속에 의한 DNA 절단 활성으로의 영향은 인정되지 않았기 때문에, 이후의 실험에서는 보다 혼합 속도가 큰 500μL/분을 채용하였다.

RNP 용액을 pH 6.0의 완충액으로 조제하고, TFR은 500μL/분으로 하고, FRR을 3.0~9.0의 범위로 하여 실험을 행하여, FRR의 영향을 조사하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, FRR이 5.0 이하인 범위에서, FRR의 저하에 수반하여 DNA 절단 활성의 저하가 인정되었다. 한편, FRR이 7.0 이상의 범위에서는 포지티브 컨트롤과 동일한 정도의 활성을 나타내고, 마이크로 유로로의 송액의 영향은 인정되지 않았다. 이 결과로부터, 이후의 실험에서는 FFR은 9.0을 채용하였다.

TFR은 500μL/분으로 하고, FRR을 9.0으로 하고, RNP 용액을 조제하는 완충액의 pH를 4.0~6.0의 범위로 하여 실험을 행하여, RNP 용액의 pH의 영향을 조사하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, pH 6.0에서는 포지티브 컨트롤과 동일한 정도의 DNA 절단 활성을 유지한 한편, pH 5.5 이하의 범위에서 pH의 저하에 수반하여 DNA 절단 활성의 현저한 저하가 인정되었다. 이 결과로부터, 이후의 실험에서는 RNP 용액의 조제에는 pH 6.0의 완충액을 채용하였다.

［참고예 2］

본 발명에 따른 지질 나노 입자를 카오틱 믹서를 탑재한 제조 장치를 사용하여 제조 가능한지 어떤지를 조사하였다. 구체적으로는, RNP를 용해하는 완충액의 pH, 에탄올에 대한 RNP 용액의 유속비(FRR) 및 에탄올과 RNP 용액의 총 유속(TFR)을 검토하였다. 지질 나노 입자의 제조는, 참고예 1에서 사용한 제조 장치 중 믹서 내장 마이크로 유로(104)가 도 3에 기재된 카오틱 믹서 내장 마이크로 유로(107)인 제조 장치를 이용하여 행하였다. 도 3의 (A)는 카오틱 믹서 내장 마이크로 유로(유로 구조체)의 사시도이며, 도 3의(B)는 희석 유로(107c) 일부의 확대도이다.

이 조건 검토에서는, 참고예 1과 마찬가지로 지질에 의한 영향을 제외하기 위해 지질 용액 대신 에탄올을 이용하고, RNP 용액으로서 화농연쇄구균 유래 Cas9 단백질(160kDa), GFP 유전자 중의 표적 서열(서열번호 1, 20 염기 길이)과 상보적인 염기 서열을 포함하는 crRNA(서열번호 2, 36 염기 길이) 및 tracrRNA(서열번호 3, 67 염기 길이)를, 몰비 1：1：1이 되도록 완충액에 용해시킨 용액(RNP 용액)을 이용하였다. pH 6~6.6의 완충액은 MES 완충액(20mM　MES, 50 mM　NaCl, pH 6.0)을 이용하고, pH 5.5의 완충액은 구연산 완충액(20mM　구연산, 50mM　NaCl, pH 5.5)를 이용하였다.

RNP 용액과 에탄올을 도 3에 기재된 제조 장치의 마이크로 유로 내에, TFR이 500μL/분, FRR이 9인 조건으로 송액하고, 희석 유로에서 배출된 RNP 용액을 회수하여, 참고예 1과 동일하게 하여 투석하였다. 투석 후의 RNP 용액을 참고예 1과 동일하게 하여, dsDNA에 Cas9 단백질량 환산으로 5당량(몰비)이 되도록 혼합하고, 37℃에서 1시간 반응시켜, DNA 절단 효율을 평가하였다. 각 샘플에 대하여, 표적 dsDNA에 대해 5당량의 RNP를 가한 포지티브 컨트롤의 절단 활성을 1로 했을 때의 상대적인 절단 활성을 산출하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 참고예 1과 마찬가지로, pH 6.0에서는 포지티브 컨트롤과 동일한 정도의 DNA 절단 활성을 유지한 한편, pH 5.5에서는 DNA 절단 활성의 현저한 저하가 인정되었다.

RNP 용액을 pH 6.0의 완충액으로 조제하고, TFR는 500μL/분으로 하고, FRR을 5.0, 7.0 또는 9.0으로 하여 동일한 실험을 행하여, FRR의 영향을 조사하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. FRR이 5.0에서는 DNA 절단 활성은 약간 낮았는데 대하여, FRR가 7.0 이상의 범위에서는 포지티브 컨트롤과 동일한 정도의 활성을 나타내고, 마이크로 유로로의 송액의 영향은 인정되지 않았다.

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 지질 나노 입자는, 도 3에 기재된 제조 장치를 이용한 경우에도, 도 2에 기재된 제조 장치를 이용한 경우와 동일한 조건으로 지질 나노 입자를 제조할 수 있음이 밝혀졌다. 즉, 본 발명에 따른 지질 나노 입자의 제조에서 믹서의 구조 선택성은 낮음이 시사되었다.

[실시예 1］

GFP 유전자의 녹아웃을 행하기 위한 RNP를 탑재한, 지질 조성이 다른 지질 나노 입자를 제조하여 HeLa-GFP 세포에 대한 GFP 녹아웃 활성을 조사하였다. 또한, GFP 유전자를 BFP(blue fluorescent protein) 유전자로 개변하는 녹인을 행하기 위한 RNP를 탑재한, 지질 조성이 다른 지질 나노 입자를 제조하여 HeLa-GFP 세포에 대한 GFP 녹인 활성을 조사하였다. 지질 나노 입자의 제조는 참고예 1에서 사용한 제조 장치를 이용하여 행하였다.

지질 나노 입자의 구성 지질로서 pH 감수성 양이온성 지질로서 CL4H6(pKa ~6.25, 특허문헌 2)을, 중성 인지질로서 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DSPC) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(DOPE)을, 그 외의 지질로서 콜레스테롤(chol) 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG-DMG)을 이용하였다.

[화학식 7]

지질 나노 입자의 제조에는, 표 6에 기재된 5종류의 지질 조성의 지질 성분을 사용하였다.

Cas9 단백질, crRNA 및 tracrRNA는 참고예 1에서 사용한 것과 동일한 것을 이용하였다.

GFP의 녹아웃을 행하기 위한 RNP를 제조할 때, GFP 녹아웃용 ssON으로서 표적 서열(서열번호 1)을 포함하는 게놈 DNA의 부분 영역과 동일한 염기 서열로 이루어지는 132 염기 길이의 DNA(서열번호 5, 68~87번째의 영역이 표적 서열과 동일한 염기 서열이다.)를 이용하였다.

GFP로부터 BFP로 개변하는 녹인을 행하기 위한 RNP를 제조할 때, BFP 녹인용 ssON으로서 녹아웃용으로 이용한 ssON의 3염기(65, 67 및 72번째의 염기)에 변이를 도입한 DNA(서열번호 6)를 이용하였다. 변이 서열의 도입에 의해, 호몰로지 의존적 수복(homology-dependent repair; HDR) 경로가 기능하면, GFP의 형광단을 구성하는 아미노산(트레오닌-티로신-글리신)이 BFP의 형광단을 구성하는 아미노산(세린-히스티딘-글리신)으로 치환된다.

＜GFP 녹아웃 활성의 측정＞

160nM의 Cas9 단백질, 160nM의 crRNA, 160nM의 tracrRNA 및 160nM의 ssON을, 참고예 1에서 사용한 pH 6.0의 완충액에 용해하여 RNP 용액을 조제하고, 제2 도입로의 주입구(104b)에 연결한 실린지(102)에 충전하였다. 또한, 지질의 에탄올 용액(총 지질: 8.20mM)을 제1 도입로의 주입구(104a)에 연결한 실린지(101)에 충전하였다. FRR이 9.0, TFR이 500μL/분인 송액 조건으로 마이크로 유로 내에 송액하여, RNP 탑재 지질 나노 입자를 제조하였다. 제조된 RNP 탑재 지질 나노 입자를 참고예 1과 동일하게 하여 투석한 후, 입자 계측기 「zetasizer nano ZS ZEN3600」(Marvern제)를 이용하여 동적 광산란법에 의해, 개수 평균 입자 지름(nm), 다분산 지수(polydispersity index; PdI) 및 ζ전위(mV)를 측정하였다(n=3, Mean±SD). 또한, gRNA 및 ssON의 지질 나노 입자로의 봉입률(%) 및 지질 나노 입자 용액중 농도를, Ribogreen assay(Thermo Fisher Scientific사제)에 의해 측정하였다(n=3, Mean±SD). gRNA 및 ssON의 지질 나노 입자 용액중 농도의 측정값으로부터, RNP 탑재 지질 나노 입자의 제조에 사용한 gRNA 및 ssON의 총량에 대한, 도 3에 기재된 장치에 의한 희석 및 투석에 의한 정제 후에 회수된 핵산 총량의 비율(회수율: %)을 산출하였다.

측정 결과를 표 7에 나타낸다. DOPE 함유량이 20%인 조성의 지질 나노 입자 에서, 입자 지름이 작고, 봉입률이 높은 경향이 인정되었다.

각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에, Cas9 단백질 농도가 0.3, 1 또는 5nM가 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지 교환한 후, 1일 후에 세포를 회수하여 플로우사이트메트리에 의해 GFP 녹아웃 효율(%)(세포 전체에 차지하는, GFP 형광을 발하고 있지 않은 세포의 비율(%))을 측정하였다. 비교 대상으로서, RNP의 도입에 사용 실적이 있는 시판의 트랜스펙션 시약 「Lipofectamine RNAiMAX」(Thermo Fisher Scientific사제)를 이용하였다.

각 RNP 탑재 지질 나노 입자의 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과(n=3, Mean±SD)를 도 4에 나타낸다. 중성 인지질 함유량이 많을수록, 보다 높은 녹아웃 활성을 나타냈다. 또한, 중성 인지질로서 DOPE를 포함한 RNP 탑재 지질 나노 입자가, DSPC를 포함하는 RNP 탑재 지질 나노 입자보다 더 높은 녹아웃 활성을 나타내었다. 또한, 중성 인지질 함유량이 많거나, 또는 중성 인지질로서 DOPE를 포함하는 RNP 탑재 지질 나노 입자는 「Lipofectamine RNAiMAX」보다 높은 녹아웃 활성을 나타내었다.

＜GFP 녹인 활성의 측정＞

GFP 녹아웃용 ssON 대신 녹인용 ssON를 이용하여, 지질 조성에 대하여 DSPC 함유량을 20%(표 6중, 「20% (DSPC)」) 또는 DOPE 함유량을 20%(표 6중, 「20% (DOPE)」)로 한 것 이외에는 동일하게 하여, RNP 탑재 지질 나노 입자를 제조하였다. 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.3, 1 또는 5nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지를 교환한 후, 1일 후에 세포를 회수하여 플로우사이트메트리에 의해 녹인 효율(%)(세포 전체에 차지하는, BFP 형광을 발하고 있는 세포의 비율(%))을 측정하였다. BFP는 GFP보다 형광 파장이 단파장측이기 때문에, 녹인에 의해 GFP 유전자가 BFP 유전자로 개변된 세포는 플로우사이트메트리에 의해 정량적으로 식별 가능하다. 각 RNP 탑재 지질 나노 입자에 대하여 녹아웃 효율(%)에 대한 녹인 효율(%)의 비(［KI(%)］/［KO(%)］)를 구한 결과를 도 5에 나타낸다. 이 결과, 변이를 도입한 ssON을 이용한 경우, 모든 RNP 탑재 지질 나노 입자에서 4~5%의 유전자 녹인 효율을 나타냈다.

［실시예 2］

지질 나노 입자의 제재 처방이 유전자 녹아웃 활성에 미치는 영향을 조사하였다.

＜1차 스크리닝＞

검토 항목으로서 pH 감수성 양이온성 지질(CL) 함유량(30, 40, 50mol%), 중성 인지질(PL) 함유량(20, 35, 50mol%), PEG-DMG 함유량(1, 2. 5, 4mol%), pH 감수성 양이온성 지질의 종류(CL4H6 또는 CL15H6(pKa~7.25, 특허문헌 2)), 중성 인지질의 종류(DSPC 또는 DOPE) 및 RNP/lipid비(1.8, 2.7, 3.6×10^-4 mol)의 6 인자로 하였다.

연속 변수에 대해서는 3수준, 카테고리컬 인자에 대해서는 2수준을 선출하고, 전체 조합 324가지 방법 중 실험 계획법(Design of Experiment; DoE)의 하나인 결정적 스크리닝 계획에 의해, 표 8에 기재된 14가지 방법의 처방을 선발하였다. 지질 조성은, pH 감수성 양이온성 지질(CL):중성 인지질(PL):콜레스테롤: PEG-DMG=X:Y:(100-X-Y):Z(mol%)(X: 표 8 중의 「CL［%］」란의 수치, Y: 표 8 중의 「PL［%］」란의 수치)로 하였다.

[화학식 8]

지질 성분과 지질과 RNP의 비율을 표 8의 처방으로 한 것 이외에는, 실시예 1에서의 GFP 녹아웃용 RNP 탑재 지질 나노 입자와 동일하게 하여, GFP 녹아웃용 RNP 탑재 지질 나노 입자를 제조하였다. 얻어진 RNP 탑재 지질 나노 입자의 개수 평균 입자 지름(nm), PdI, gRNA 및 ssON의 지질 나노 입자로의 봉입률(%)을 실시예 1과 동일하게 하여 측정하였다.

또한, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.1, 0.5 또는 2nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지를 교환한 후 3일 후에 세포를 회수하여, 실시예 1과 동일하게 하여 플로우사이트메트리에 의해 GFP 녹아웃 효율(%)을 측정하였다. 결과를 표 9에 나타낸다. 또한, 도 6에 GFP 녹아웃 효율(%)의 측정 결과를 나타낸다.

개수 평균 입자 지름에 대하여 통계 해석을 행하였다. 개수 평균 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 주효과 및 두 인자간 교호 작용의 결과를 표 10에, 개수 평균 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 개수 평균 입자 지름의 예측 프로파일을 도 7에 각각 나타낸다. pH 감수성 양이온성 지질 함유량, PEG-DMG 함유량, pH 감수성 양이온성 지질의 종류 및 중성 인지질이, 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 인자로서 검출되었다. 보다 상세하게는, pH 감수성 양이온성 지질 함유량을 증가시키거나, PEG-DMG 함유량을 2.5mol% 근방으로 하거나, pH 감수성 양이온성 지질로서 CL4H6를 사용하거나, 중성 인지질로서 DOPE를 사용함으로써, 입자 지름을 작게 제어할 수 있음이 밝혀졌다. 특히, PEG 지질량 및 중성 인지질의 종류의 영향이 큰 인자인 것이 밝혀졌다.

봉입률에 대해 마찬가지로 통계 해석을 행하였다. 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 주효과 및 두 인자간 교호 작용의 결과를 표 11에, 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 봉입률의 예측 프로파일을 도 8에 각각 나타낸다. 이 결과, 모든 인자가 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 것이 밝혀졌다. 보다 상세하게는, pH 감수성 양이온성 지질 함유량을 증가시키고, 중성 인지질 함유량을 증가시키고, PEG-DMG 함유량을 감소시키고, pH 감수성 양이온성 지질로서 CL15H6를 이용하고, 중성 인지질로서 DOPE를 이용하고, RNP/lipid비를 낮춤으로써, 봉입률이 향상되는 것이 분명해졌다. 중성 인지질의 종류가 가장 큰 영향을 주는 인자였다.

유전자 녹아웃 활성(%)에 대해 마찬가지로 통계 해석을 행하였다. 유전자 녹아웃 활성(%)에 유의미하게 영향을 주는 주효과 및 두 인자간 교호 작용의 결과를 표 12에, 유전자 녹아웃 활성(%)에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 유전자 녹아웃 활성(%)의 예측 프로파일을 도 9에 각각 나타낸다. PEG-DMG 함유량, pH 감수성 양이온성 지질의 종류 및 중성 인지질의 종류가, 녹아웃 활성에 유의미한 영향을 미치는 인자로서 분류되었다. 보다 상세하게는, PEG-DMG 함유량을 1mol% 정도로 하고, pH 감수성 양이온성 지질을 CL4H6로 하고, 중성 인지질을 DOPE로 함으로써, 유전자 녹아웃 활성이 향상되는 것이 밝혀졌다. 특히 양이온성 지질의 종류 및 중성 인지질의 종류가 영향의 큰 인자였다.

실제로, 유전자 녹아웃 활성을 향상시키는 조건을 만족한 처방인 A-7 및 A-11의 처방에서는, 다른 지질 나노 입자와 비교하여 높은 녹아웃 활성을 나타내고(도 6), RNP의 IC₅₀(50% 억제 농도)은 0.1nM 이하(Cas9 단백질 농도 환산)였다. 또한, 최대 녹아웃 효율은 95% 이상에 이르렀다(도 6).

＜2차 스크리닝＞

1차 스크리닝의 결과를 받아, 2차 스크리닝을 행하였다. 실험계는, 1차 스크리닝과 동일한 실험계에서 평가하였다.

검토 항목으로서, pH 감수성 양이온성 지질(CL) 함유량(30, 40, 50mol%), 중성 인지질(PL) 함유량(20, 35, 50mol%) 및 PEG-DMG 함유량(1.0, 2.0, 3.0mol%)의 3인자 3수준으로 하고, 전체 조합 27가지 방법 중, 결정적 스크리닝 계획에 의해 표 13에 기재된 9가지 방법의 처방을 선발하였다. 지질 조성은, pH 감수성 양이온성 지질(CL):중성 인지질(PL):콜레스테롤:PEG-DMG=X:Y:(100-X-Y):Z(mol%)(X： 표 13 중의 「CL［%］」란의 수치, Y: 표 13중의 「PL［%］」란의 수치)로 하였다. pH 감수성 양이온성 지질은 CL4H6를, 중성 인지질은 DOPE를 각각 이용하였다.

지질 성분과 지질과 RNP의 비율을 표 13의 처방으로 한 것 이외에는, 1차 스크리닝과 동일하게 하여, GFP 녹아웃용 RNP 탑재 지질 나노 입자를 제조하여, 얻어진 RNP 탑재 지질 나노 입자의 개수 평균 입자 지름(nm), PdI, gRNA 및 ssON의 지질 나노 입자로의 봉입률(%)을 측정하였다. 또한, 1차 스크리닝과 동일하게 하여, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를 HeLa-GFP 세포에 첨가하여, GFP 녹아웃 효율(%)을 측정하였다. 결과를 표 13에 나타낸다.

개수 평균 입자 지름에 관하여 통계 해석을 행하였다. 개수 평균 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 주효과의 결과를 표 14에, 개수 평균 입자 지름에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 개수 평균 입자 지름의 예측 프로파일을 도 10에 각각 나타낸다. PEG 지질량을 증가시킴으로써, 입자 지름을 작게 제어할 수 있음이 밝혀졌다.

봉입률에 대해 동일하게 통계 해석을 행하였다. 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 주효과의 결과를 표 15에, 봉입률에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 봉입률의 예측 프로파일을 도 11에 각각 나타낸다. 이 결과, pH 감수성 양이온성 지질 함유량을 증가시키는 중성 인지질 함유량을 증가시키거나, 또는 PEG-DMG 함유량을 감소시킴으로써 봉입률이 향상되는 것이 밝혀졌다.

유전자 녹아웃 활성(%)에 대해 동일하게 통계 해석을 행하였다. 유전자 녹아웃 활성(%)에 유의미하게 영향을 주는 주효과의 결과를 표 16에, 유전자 녹아웃 활성(%)에 유의미하게 영향을 주는 인자를 변화시켰을 때의 유전자 녹아웃 활성(%)의 예측 프로파일을 도 12에 각각 나타낸다. PEG-DMG 함유량을 감소시키거나, 또는 pH 감수성 양이온성 지질 함유량을 40mol% 이상으로 증가시킴으로써 유전자 녹아웃 활성이 향상되는 것이 밝혀졌다.

이러한 결과로부터, pH 감수성 양이온성 지질로서 CL4H6를 이용하고, 그 함유량을 40~50mol%로 하고, 중성 인지질로서 DOPE를 이용하고, 그 함유량을 20~50mol%로 하고, PEG 지질량을 1.5~2.0mol%로 하고, RNP/lipid비를 3.6×10^-4mol 이상으로 함으로써, 개수 평균 입자 지름이 작고, RNP의 봉입 효율이 높고, 유전자 녹아웃 활성(%) 또한 높은 양호한 RNP 탑재 지질 나노 입자를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

［실시예 3］

실시예 2에서 제조한 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 및 B-9에 대해, 세포 독성 및 보존 안정성을 조사하였다.

＜세포 독성의 평가＞

각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에, Cas9 단백질 농도가 0,3, 0.5 또는 1nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 1일 후, WST-8 어세이를 행하였다. WST-8 어세이는, 세포수 측정용 키트(제품명: 「Cell Counting Kit-8」, 도진 가가쿠사제)를 이용하여 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 대신 PBS(-)를 HeLa-GFP 세포의 배지에 첨가한 세포를 컨트롤로 하고, 마찬가지로 WST-8 어세이를 행하였다.

각 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가한 세포의 세포 생존률(［RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가한 세포의 WST-8 어세이의 측정값］/［컨트롤 세포의 WST-8 어세이의 측정값］×100: %)을 산출하였다. 결과를 도 13에 나타낸다. RNP 탑재 지질 나노 입자의 양에 관계없이, RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 및 B-9를 도입시킨 세포의 세포 생존률은 거의 100%였다. 즉, 이러한 RNP 탑재 지질 나노 입자는 HeLa 세포에서는 현저한 세포 독성을 나타내지 않았다.

＜보존 안정성의 평가＞

실시예 2와 동일하게 하여 제조한 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 4℃에서 보존하고, 보존 후의 물성과 녹아웃 활성을 조사하였다. 구체적으로는, 경시적으로 제타 전위와 PdI를 측정하였다. 또한, 4℃ 보존전과 4℃로 2주간 보존한 후의 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 Cas9 단백질 농도가 0.3nM이 되도록 배지에 첨가함으로써 HeLa-GFP세포에 도입하여, GFP 녹아웃 활성을 조사하였다. 제타 전위, PdI 및 GFP 녹아웃 활성은, 실시예 1과 동일하게 하여 측정하였다.

제타 전위와 PdI의 측정 결과를 도 14에, GFP 녹아웃 활성의 측정 결과를 도 15에 각각 나타낸다. 이 결과, RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9는, 4℃에서 보존함으로써, 제조 후 적어도 2주간은 물성과 녹아웃 활성이 둘다 보존전과 동일한 정도의 상태가 유지되고 있었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 RNP 탑재 지질 나노 입자가 실용상 충분한 보존 안정성을 가지고 있음이 확인되었다.

［실시예 4］

RNP 탑재 지질 나노 입자에 탑재하는 ssON의 염기 길이가 녹아웃 활성에 주는 영향을 조사하였다.

GFP 녹아웃용 ssON으로서 실시예 2에서도 이용한 132 염기 길이의 DNA(서열번호 5), 20 염기 길이의 DNA(서열번호 5의 68~87번째의 영역과 동일한 염기 서열), 60 염기 길이의 DNA(서열번호 5의 48~107번째의 영역과 동일한 염기 서열) 또는 60 염기 길이의 DNA를 RNA로 한 것(서열번호 7)를 이용하였다.

우선, ssON으로서 132 염기 길이의 DNA, 20 염기 길이의 DNA, 60 염기 길이의 DNA, 또는 60 염기 길이의 RNA를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9 및 B-4를 제조하였다. 계속해서, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.1nM 또는 0.3nM가 되도록 첨가하여 배양을 실시하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지 교환한 후, 3일간 배양한 후에 세포를 회수하여 플로우사이트메트리에 의해 GFP 녹아웃 효율(%)(세포 전체에 차지하는, GFP 형광을 발하고 있지 않은 세포의 비율(%))을 측정하였다. Cas9 단백질 농도가 0.1nM이 되도록 RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입한 세포의 결과를 도 16a에, Cas9 단백질 농도가 0.3nM이 되도록 RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입한 세포의 결과를 도 16b에 각각 나타낸다.

이 결과, RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 및 B-9에서 모두, ssON의 염기 길이가 길어질수록 유전자 녹아웃 활성이 증대되는 경향이 관찰되었다. 또한, 동일한 염기 길이의 경우, ssON가 DNA의 경우보다 RNA 쪽이 녹아웃 활성이 높은 경향도 관찰되었다.

［실시예 5］

Cas9 대신, RNA 의존성 DNA 뉴클레아제 Cpf1를 탑재한 지질 나노 입자를 제조하고, 그 유전자 녹아웃 활성을 조사하였다.

우선, Cas9 단백질 대신 Cpf1 단백질(제품명：「Alt-R A.s. Cas12a(Cpf1)Ultra」, Integrated DNA technologies사제)를 이용하고, gRNA로서 참고예 1에서 이용한 crRNA와 tracrRNA 대신 41 염기 길이의 RNA(서열번호 8) 또는 100 염기 길이의 RNA(서열번호 9)를 이용하고, ssON으로서 120 염기 길이의 RNA(서열번호 10) 또는 60 염기 길이의 RNA(서열번호 10의 27~86번째의 영역과 동일한 염기 서열. 서열번호 11)를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 제조하였다. 계속해서, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에 Cpf1 단백질 농도가 0.5, 1 또는 2nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지 교환한 후 3일간 더 배양한 후에 세포를 회수하여, 플로우사이트메트리에 의해 GFP 녹아웃 효율(%)(세포 전체에 차지하는, GFP 형광을 발하지 않은 세포의 비율(%))을 측정했다.

GFP 녹아웃 효율의 측정 결과를 도 17에 나타낸다. 도면 중, 「NT」는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가하지 않는 배지에서 배양한 세포의 결과를 나타낸다. 「gGFP」는, 41 염기 길이의 RNA(서열번호 8)를 이용한 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가하지 않는 배지에서 배양한 세포의 결과, 「gGFP+59」는 100 염기 길이의 RNA(서열번호 9)를 이용한 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가하지 않는 배지에서 배양한 세포의 결과를 각각 나타낸다. 「ssON」란 중 「-」는, ssON을 포함하지 않는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 첨가하지 않는 배지에서 배양한 세포의 결과를 나타낸다. 또한, 0.5nM, 1nM, 2nM의 각 컬럼은, 각각 RNP 탑재 지질 나노 입자를 Cpf1 단백질 농도가 0.5, 1 또는 2nM이 되도록 배지에 첨가한 세포의 결과를 나타낸다.

도 17에 나타낸 바와 같이, Cas9 단백질을 이용한 경우와 마찬가지로 RNP에 ssON을 가함으로써 GFP 녹아웃 활성이 개선되었다. 또한, 첨가하는 ssON의 염기 길이가 길수록 녹아웃 활성이 증대되는 경향이 관찰되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 지질 나노 입자는 CRISPER/Cas9 시스템 뿐만 아니라 CRISPER/Cpf1 시스템에서의 RNP를 도입하는 캐리어로서 유용함이 밝혀졌다.

［실시예 6］

Cas9에 의한 오프 타겟 효과(표적으로 하지 않는 gRNA 영역으로의 변이 도입)를 감소시키는 수법으로서 RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성 중 하나를 비활성화한 Cas9 니카아제(Cas9n)를 2쌍 조합하여 사용하는 더블 니킹법이 알려져 있다. 이 더블 니킹법에 사용하는 RNP를 탑재한 지질 나노 입자를 제조하고, 그 유전자 녹아웃 활성을 조사하였다.

우선, Cas9 단백질 대신 Cas9n 단백질(제품명：「Alt-R S.p. Cas9 D10A Nickase V3」, Integrated DNA technologies사제)를 이용하고, gRNA로서, 참고예 1에서 사용한 tracrRNA, 및 GFP 유전자 중의 제1 표적 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 crRNA(서열번호 12, 36 염기 길이)와 제2 표적 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 crRNA(서열번호 13, 36 염기 길이)를 이용하고, ssON을 사용하지 않은 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 제조하였다. 비교 대상으로서 실시예 2와 동일하게 하여 Cas9 단백질을 포함하는 RNP를 탑재한 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 제조하였다.

계속해서, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에 Cas9n 단백질 또는 Cas9 단백질의 농도가 0.1, 0.3, 1 또는 2nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지를 교환한 후, 3일간 더 배양한 후에 세포를 회수하여, 플로우사이트메트리에 의해 GFP 녹아웃 효율(%)(세포 전체에 차지하는, GFP 형광을 발하지 않은 세포의 비율(%))을 측정하였다.

측정 결과를 도 18에 나타낸다. Cas9n 단백질을 탑재한 RNP 탑재 지질 나노 입자 또한, Cas9 단백질을 탑재한 RNP 탑재 지질 나노 입자와 마찬가지로 높은 GFP 녹아웃 활성이 있었다. 특히, Cas9n 단백질 농도가 2nM이 되도록 첨가한 세포에서는 GFP 녹아웃 효율은 98%였다. 이 결과로부터, 본 발명에 따른 특정 지질 조성의 지질 나노 입자는, Cas9n 단백질을 이용한 더블 니킹법에서의 RNP를 도입하는 캐리어로서 유용한 것이 분명하고, 이 더블 니킹법에서의 RNP에, 각각의 gRNA와 하이브리다이즈하는 ssON를 더 함유시킨 RNP도, 더블 니킹법에서의 RNP를 도입하는 캐리어로서 유용함이 시사되었다.

[실시예 7］

실시예 2에서 제조한 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 및 B-9에 대하여, GFP 안정 발현 HEK(HEK-GFP) 세포에 도입하여, 녹아웃 활성, 녹인 활성 및 세포 독성을 조사하였다.

＜GFP 녹아웃 활성의 측정＞

우선, 실시예 2와 동일하게 하여, GFP 녹아웃용 ssON를 포함하는 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9 및 B-4를 제조하였다. 계속해서, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HEK-GFP 세포의 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.5, 1, 3 또는 5nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 3일 후에 배지를 교환한 후, 3일 후에 세포를 회수하여 플로우사이트메트리에 의해 녹아웃 효율(%)(세포 전체에 차지하는, GFP 형광을 발하지 않은 세포의 비율(%))을 측정하였다. 측정 결과를 도 19a에 나타낸다. RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9 및 B-4 중 어느 것을 도입한 세포에서도 최대 약 97%의 녹아웃 효율이었다.

＜GFP 녹인 활성의 측정＞　

우선, GFP 녹아웃용 ssON 대신, 실시예 1에서 사용한 GFP 녹인용 ssON을 이용한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9 및 B-4를 제조하였다. 계속해서, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 상기의 GFP 녹아웃 활성의 측정과 마찬가지로 HEK-GFP 세포에 도입하여 배양한 후 회수하여 플로우사이트메트리를 행하여, 녹인 효율(%)(세포 전체에 차지하는, BFP 형광을 발하고 있는 세포의 비율(%))을 측정하였다. 측정 결과를 도 19b에 나타낸다. RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9 및 B-4 중 어느 것을 도입한 세포에서도 최대 약 23%의 녹인 효율이었다.

＜세포 독성＞

각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HEK-GFP 세포의 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 1일 후에, 실시예 3과 동일하게 하여 WST-8 어세이를 행하여 세포 생존률(%)을 측정하였다. 결과를 도 20에 나타낸다. RNP 탑재 지질 나노 입자의 양에 관계없이, RNP 탑재 지질 나노 입자 B-4 및 B-9를 도입시킨 세포의 세포 생존률은 거의 100%였다. 즉, 이러한 RNP 탑재 지질 나노 입자는 HEK 세포 에서도 HeLa 세포와 마찬가지로 현저한 세포 독성을 나타내지 않았다.

［실시예 8］

실시예 2에서 제조한 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9에 대하여, GFP를 항상 발현하고 있는 골수 유래 대식 세포(BMDM)에 도입하여, GFP 녹아웃 활성을 조사하였다.

＜GFP 항상 발현 BMDM＞

GFP를 항상 발현하고 있는 BMDM은, GFP 항상 발현 마우스(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)마우스)(암컷, 6주령)로부터 회수한 것을 이용하였다. 구체적으로는, GFP 항상 발현 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 채취하여, 40μm 셀 스트레이너를 통과시킨 후 가용화 버퍼(제품명：「ACK lysing buffer」, Gibco사제)를 이용하여 적혈구를 제거하였다. 계속해서, 상기 골수 세포를 recombinant mouse M-CSF(종농도: 50ng/mL, BioLegend사제) 및 비동화 FBS(최종 농도: 10%)를 포함하는 배지에서 7일간 배양함으로써 BMDM를 얻었다.

＜GFP 녹아웃 활성의 측정＞

우선, 실시예 2와 동일하게 하여 GFP 녹아웃용 ssON을 포함하는 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 제조하였다. 계속해서, RNP 탑재 지질 나노 입자를, BMDM를 배양하고 있는 배지에 Cas9 단백질 농도가 8nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 1일 후에 배지를 교환한 후, 2일 후에 세포를 회수하여 플로우사이트메트리를 행하였다.

RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입하기 전의 BMDM의 플로우사이트메트리의 결과를 도 21의 (A)에, RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입한 후의 BMDM의 플로우사이트메트리의 결과를 (B)에 각각 나타낸다. RNP 탑재 지질 나노 입자 도입 전의 BMDM는 거의 모든 세포가 GFP의 형광을 발하고 있었지만, RNP 탑재 지질 나노 입자 도입 후의 BMDM에서는 GFP 형광을 발하지 않는 세포의 비율이 증대되어 있었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 지질 나노 입자는 생체로부터 채취된 세포에 대해서도 게놈 편집 등에 이용되는 RNP를 도입하는 캐리어로서 유용한 것이 명백하다.

［실시예 9］

참고예 1 등에서 사용된 도 2에 기재되어 있는 제조 장치의 믹서 내장 마이크로 유로(104)가 도 1b에 나타낸 바와 같은 3개의 도입로를 가지는 유로(107)로 치환된 장치를 이용하여, RNP 탑재 지질 나노 입자를 제조하여 물성과 GFP 녹아웃 활성을 조사하였다.

＜RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9의 제조＞

도 1b와 마찬가지로, 제1 도입로(도면 중 상방의 도입로)에서 지질의 에탄올 용액을, 제2 도입로(도면 중 하방의 도입로)에서 RNP 용액을, 제3 도입로(도면 중 중앙의 도입로)에서 PBS(-)를, 각각의 FRR(유속비: ［지질의 에탄올 용액의 유속(x)］/［PBS(-)의 유속(y)］/［RNP 용액의 유속(z)］)이 표 17에 기재된 바와 같이 되도록 도입한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9를 제조하였다. 한편, 표 16 중 FRR가 x/y/z=9/0/1인 경우에는, 참고예 1에서 이용한 2개의 도입로의 제조 장치를 이용하여 제조하였다.

얻어진 RNP 탑재 지질 나노 입자의 개수 평균 입자 지름(nm), PdI, gRNA 및 ssON의 지질 나노 입자로의 봉입률(%)을 실시예 1과 동일하게 하여 측정하였다. 측정 결과를 표 17에 나타낸다. 이 결과, 3개의 도입로를 가지는 제조 장치를 이용한 경우에도, 2개의 도입로를 가지는 제조 장치를 이용한 실시예 2에서 얻어진 RNP 탑재 지질 나노 입자와 동등 이상의 물성의 RNP 탑재 지질 나노 입자를 제조할 수 있었다.

제조 후의 제조 장치를 확인한 결과, 참고예 1에서 이용한 2개의 도입로의 제조 장치를 사용한 경우에는, 희석 유로의 입구 부근에서 지질의 에탄올 용액과 RNP 용액의 계면상에 응집물이 형성되어 있었다. 이에 대하여, 3개의 도입로를 가지는 제조 장치를 이용하여 중앙의 도입로에서 PBS를 도입하여 제조한 경우에는, 희석 유로에 응집물은 확인되지 않았다.

얻어진 RNP 탑재 지질 나노 입자를 실시예 4와 동일하게 하여, 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.1, 0.3 또는 1nM이 되도록 첨가하고 HeLa-GFP 세포에 도입하여, GFP 녹아웃 활성을 조사하였다. 결과를 도 22에 나타낸다. 모든 RNP 탑재 지질 나노 입자에서, 실시예 2에서 얻어진 RNP 탑재 지질 나노 입자와 동등 이상의 GFP 녹아웃 활성을 가지고 있었다.

이러한 결과로부터, 도 1b에 나타내는 바와 같은 3개의 도입로를 가지는 믹서 내장 마이크로 유로를 이용함으로써, 충분한 물성과 유전자 녹아웃 활성을 나타내는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 믹서 내장 마이크로 유로내에서의 응집물의 생성을 피해 안정적으로 제조할 수 있음이 확인되었다.

［실시예 10］

RNP 탑재 지질 나노 입자의 제조시의 RNP 용액의 pH가, 제조된 RNP 탑재 지질 나노 입자의 녹아웃 활성에 주는 영향을 조사하였다.

RNP 용액을 조제할 때의 완충액으로서 pH 6.0 또는 6.3의 완충액은 MES 완충액(20mM　MES, 50mM　NaCl, pH 6.0 또는 6.3)을 이용하고, pH 4.0, 5.0 또는 5.5의 완충액은 구연산 완충액(20mM　구연산, 50mM　NaCl, pH 4.0, 5.0 또는 5.5)을 이용한 것 이외에는, 실시예 2에서 제조한 RNP 탑재 지질 나노 입자 B-9와 동일하게 하여, Cas9 단백질을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 조제하였다. 또한, Cas9 단백질 대신 실시예 5에서 사용한 Cpf1 단백질을 이용한 것 이외에는 동일하게 하여 Cpf1 단백질을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 조제하였다.

계속해서, 각 RNP 탑재 지질 나노 입자를, 전날에 파종한 HeLa-GFP 세포의 배지에 Cas9 단백질 농도가 0.1nM 또는 0.3nM이 되도록, 또는 Cpf1 단백질 농도가 0.5nM, 1.0nM 또는 2.0nM이 되도록 첨가하여 배양을 행하였다. RNP 탑재 지질 나노 입자 첨가로부터 2일 후에 배지 교환한 후 3일간 더 배양한 후에 세포를 회수하여, 플로우사이트메트리에 의해 GFP 녹아웃 효율(%)(세포 전체에 차지하는, GFP 형광을 발하지 않은 세포의 비율(%))을 측정하였다. Cas9 단백질을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입한 세포의 결과를 도 23a에, Cpf1 단백질을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자를 도입한 세포의 결과를 도 23b에 각각 나타낸다.

이 결과, Cas9 단백질과 Cpf1 단백질 중 어느 것을 함유하는 RNP 탑재 지질 나노 입자에서도, 조제시의 pH가 5.0 이상인 경우, 유전자 녹아웃 활성이 유지되고 있었다.

10…제1 도입로 20…제2 도입로
30 희석 유로 31…합류점
40…구조자 50…굴곡된 유로 부위
60…제3 도입로 101, 102…실린지
103…유량 제어 장치 104…믹서 내장 마이크로 유로
104a…제1 도입로의 주입구 104b…제2 도입로의 주입구
104c…희석 유로 104d…희석 유로의 주출구
105…튜브 106…회수 용기
107…카오틱믹서 내장 마이크로 유로 107a…제1 도입로의 주입구
107b…제2 도입로의 주입구 107c…희석 유로
107d…희석 유로의 주출구

SEQUENCE LISTING <110> Hokkaido University <120> Lipid nanoparticle <130> OSQ-06635 / IMP213891 <160> 13 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Aequorea coerulescens <220> <223> partial of GFP gene <400> 1 acggcgtgca gtgcttcagc 20 <210> 2 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized crRNA <400> 2 gcugaagcac ugcacgccgu guuuuagagc uaugcu 36 <210> 3 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized tracrRNA <400> 3 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60 gugcuuu 67 <210> 4 <211> 617 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized dsDNA <400> 4 tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 60 agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 120 agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 180 gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 240 acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 300 tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 360 aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 420 tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 480 aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 540 ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 600 acgagaagcg cgatcac 617 <210> 5 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN for GFP knock out <400> 5 ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 60 ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 120 ttcaagtccg cc 132 <210> 6 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN for BFP knock in <400> 6 ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 60 ctgagccacg gggtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 120 ttcaagtccg cc 132 <210> 7 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN for GFP knock out <400> 7 ccucgugacc acccugaccu acggcgugca gugcuucagc cgcuaccccg accacaugaa 60 <210> 8 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized gRNA <400> 8 uaauuucuac ucuuguagau cgucgccguc cagcucgacc a 41 <210> 9 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized gRNA <400> 9 cgaucgcucg guuaggagag accccagacg cuccggccau acgcgagucc accaugaauu 60 aauuucuacu cuuguagauc gucgccgucc agcucgacca 100 <210> 10 <211> 120 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN <400> 10 auggugagca agggcgagga gcuguucacc gggguggugc ccauccuggu cgagcuggac 60 ggcgacguaa acggccacaa guucagcgug uccggcgagg gcgagggcga gggcgaugcc 120 <210> 11 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN <400> 11 caccggggug gugcccaucc uggucgagcu ggacggcgac guaaacggcc acaaguucag 60 <210> 12 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized crRNA <400> 12 gggcacgggc agcuugccgg guuuuagagc uaugcu 36 <210> 13 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized crRNA <400> 13 cucgugacca cccugaccua guuuuagagc uaugcu 36

Claims

지질 성분, DNA 뉴클레아제, 가이드 RNA 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 함유하고,
상기 지질 성분이, 하기 일반식 (I)
[화학식 1]

[식 (I) 중, a는 3~5의 정수를 나타내며； b는 0 또는 1을 나타내고； R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 하기 일반식 (A)：
[화학식 2]

(식 (A) 중, q는 1~9의 정수를 나타내고； r은 0 또는 1을 나타내며； s는 1~3의 정수를 나타내고； t는 0 또는 1을 나타내고； u는 1~8의 정수를 나타내며； c는 0 또는 1을 나타내고; v는 4~12의 정수를 나타내고; q+2r+s+2t+u+c+v가 19 이상의 정수이지만, b와 c가 동시에 0이 되는 경우에는, q가 3~5의 정수이며, r 및 t가 1이고, s가 1이며, 또한 u+v가 6~10의 정수인 경우를 제외한다.)
로 나타내어지는 기를 나타내고； X는, 하기 일반식(B)：
[화학식 3]

(식 (B) 중, d는 0~3의 정수를 나타내고； R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기(상기 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기는 1개 또는 2개의 수소 원자가 페닐기로 치환되어 있어도 됨)를 나타내지만, R³ 및 R⁴는 서로 결합하여 5~7원의 비방향족 헤테로 고리(상기 고리의 1개 또는 2개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되어 있어도 됨)를 형성해도 된다)
로 나타내어지는 기 또는 5~7원의 비방향족 헤테로 고리기(단, 상기 기는 탄소 원자에 의해 (O-CO)b-에 결합하고, 상기 고리의 1개 또는 2개의 수소 원자가 C_1-4 알킬기 또는 C_2-4 알케닐기로 치환되고 있어도 됨)를 나타낸다〕
로 나타내어지는 pH 감수성 양이온성 지질, 중성 인지질 및 폴리알킬렌글리콜 수식 지질을 함유하고,
지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 pH 감수성 양이온성 지질의 비율이 30~50몰%이며,
지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 중성 인지질의 비율이 20~50몰%이고,
지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질량에 대한 상기 폴리알킬렌글리콜 수식 지질의 비율이 1~4몰%인, 지질 나노 입자.
제1항에 있어서,
상기 중성 인지질이 탄소수 12~24의 포화 또는 불포화 지방산 잔기를 가지는 중성 글리세로 인지질인, 지질 나노 입자.
제1항에 있어서,
상기 중성 인지질이 탄소수 12~24의 불포화 지방산 잔기를 가지는 포스파티딜에탄올아민인, 지질 나노 입자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 pH 감수성 양이온성 지질이 폴리에틸렌글리콜 수식 지질인, 지질 나노 입자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DNA 뉴클레아제가 Cas9 단백질이며,
상기 가이드 RNA가 crRNA와 tracrRNA로 이루어지는, 지질 나노 입자.
제5항에 있어서,
상기 Cas9 단백질이 RuvC 뉴클레아제 활성과 HNH 뉴클레아제 활성 중 어느 하나만을 가지는 단백질인, 지질 나노 입자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DNA 뉴클레아제가 Cpf1 단백질인, 지질 나노 입자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 지질 나노 입자를 세포 내로 도입하는, 게놈 편집 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 지질 나노 입자를, 유로 구조체를 이용하여 제조하는 방법으로서,
상기 유로 구조체가 서로 독립된 제1 유동체를 도입하는 제1 도입로 및 제2 유동체를 도입하는 제2 도입로가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성하고 있으며,
상기 희석 유로는 적어도 그 일부에 이차원적으로 굴곡된 유로 부위를 가지고,
상기 굴곡된 유로 부위는, 이보다 상류의 희석 유로의 축선 방향 내지 그 연장 방향을 X방향, 이 X방향과 수직으로 교차하는 희석 유로의 폭 방향을 Y방향으로 하고, 이보다 상류의 희석 유로의 유로폭을 y₀로 한 경우, Y방향에서 대향하는 희석 유로의 양측 벽면으로부터 교대로, 유로 중심측을 향하여 대략 Y방향(대략 +Y방향, 대략 -Y방향)으로, 1/2y₀이상 1y₀ 미만의 일정 높이 h₁, h₂...를 가지며, X방향으로 일정폭 x₁, x₂...를 가지고 돌출하고, 희석 유로의 유로폭을 규제하는 구조자가 일정 간격 d₁, d₂...를 가지고 적어도 2개 이상 마련되어 형성되어 있고,
상기 제1 도입로에서 상기 지질 성분을 에탄올에 용해시킨 지질 용액을 도입하고, 상기 제2 도입로에서 상기 DNA 뉴클레아제, 상기 가이드 RNA 및 상기 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 pH가 5.0 이상인 수용액을 도입하며, 총 유량이 1μL/분~100mL/분이고, 상기 지질 용액의 유속에 대한 상기 수용액의 유속의 비가 7 이상인, 지질 나노 입자의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 유로 구조체가 제3 유동체를 도입하는 제3 도입로를 더 가지고 있으며,
상기 제1 도입로에서 도입된 제1 유동체가, 상기 제2 도입로에서 도입된 제2 유동체와 합류하기 전에, 상기 제3 도입로에서 도입된 제3 유동체와 접촉하도록 상기 제1 도입로, 상기 제2 도입로 및 상기 제3 도입로가 각각 일정 길이를 가지고 합류하여 하나의 희석 유로를 형성하고 있는, 지질 나노 입자의 제조 방법.