CN114174522A - 脂质纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种内含有基因组编辑所需的核酸等，能够通过使用流道而进行的醇稀释法制造，且基因组编辑效率优异的脂质纳米粒子。本发明为一种脂质纳米粒子，其含有脂质成分、DNA核酸酶、向导RNA、单链寡核苷酸，所述脂质成分含有pH敏感性阳离子型脂质、中性磷脂、聚亚烷基二醇修饰脂质，所述pH敏感性阳离子型脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为30摩尔％～50摩尔％，所述中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为20摩尔％～50摩尔％，所述聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为1摩尔％～4摩尔％。

Description

脂质纳米粒子
技术领域
本发明涉及一种脂质纳米粒子，该脂质纳米粒子能够用作用于通过CRISPR系统进行的基因组编辑的RNA-蛋白质复合物(ribonucleoprotein，RNP)的载体。
本申请基于2019年5月30日在日本提交的特愿2019-101203号专利申请主张优先权，并将其内容引用在本申请中。
背景技术
基因组编辑技术是可以向作为所需的任意的基因组DNA区域选择性地导入变异或插入包含基因的任意的DNA序列的生物技术。基因组编辑技术有望实现对于遗传性疾病、感染等各种顽固性疾病的根治，因此人们期待将基因组编辑技术应用于医药。其中，第三代基因组编辑技术CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins 9)系统的基因敲除效率优异且设计简便，因此是目前最受关注的技术。本系统作为由具有DNA双链切断(double-strand break；DSB)活性的Cas9蛋白和嵌合RNA即gRNA组成的RNP而起作用，其中，该嵌合RNA即gRNA由来自细菌的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating CRISPRRNA)构成。因此，通过在靶细胞内表达RNP或将RNP本身输送至靶细胞内，可以诱导所需的基因敲除。并且，通过同时输送供体DNA，还可以诱导基因敲入。
作为基因组编辑技术中向靶细胞内输送的手段，具有：通过导入DNA或RNA而在细胞内表达RNP的方法、将RNP本身直接导入细胞的方法。在前者的情况下，已经在一定程度上建立了病毒载体、非病毒载体等的输送技术，因此能够较容易地进行，但Cas9蛋白的表达跨时较长，因此容易发生向不期待的DNA区域内导入变异(脱靶效应)。另一方面，在后者的情况下，在靶DNA区域中导入变异之后，RNP快速分解、消失，因此，能够将脱靶效应抑制为最小程度。特别是在伴随DSB的基因组编辑中，只要编辑后的细胞存活，则影响将一直持续，因此对于脱靶效应的抑制至关重要。
已经报道有多种能够输送RNP本身的技术的开发。例如有：使用DNA纳米线团(DNANanoclews)的方法(非专利文献1)、使用体内还原性脂质纳米粒子的方法(非专利文献2)、使用与金纳米粒子的偶联物的方法(非专利文献3)、使用类脂质(lipidoid)的方法(非专利文献4)、使用卵磷脂纳米脂质颗粒(lecithin nano-liposomal particle)的方法(非专利文献5)。另外，作为诱导基因敲入的例子，报道有CRISPR-Gold(非专利文献6)。但是，这些方法都在基因组编辑效率方面存在待解决课题，例如为了在培养细胞中诱导基因敲减，均需要高浓度的Cas9等。
另一方面，作为内含核酸等的脂质纳米粒子的制造方法，有以使用流道的醇稀释法为原理的方法。例如，报道有：通过使用可以实现两种液体瞬间混合的内置三维微型混合器的微型流道，可以重现性良好地制造直径30nm左右的脂质纳米粒子(非专利文献7)。另外，还报道有：通过使用单纯的二维结构的流道结构体，与现有的使用三维混合器的流道结构体相比，能够形成粒径可控性更高的纳米尺寸的脂质粒子形成系统(专利文献1)，所述单纯的二维结构的流道结构体在流通原料溶液的微型尺寸的流道上，从两侧面交错配置有相对于流道宽度为一定宽度的挡板(扰流板)。近年来，这些纳米粒子制剂的制造方法主要用于制造负载有脂溶性药物、siRNA(short interfering RNA)或mRNA等核酸的脂质纳米粒子(LNP)。例如，就作为用于向靶细胞内高效地输送siRNA等核酸的载体的脂质纳米粒子而言，报道有包含pH敏感性阳离子型脂质作为构成脂质的脂质纳米粒子(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/190423号
专利文献2：国际公开第2018/230710号
非专利文献
非专利文献1：Sun et al.,Angewandte Chemie International Edition,2015,vol.54,p.12029-12033.
非专利文献2：Wang et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2016,vol.113,p.2868-2873.
非专利文献3：Mout et al.,American Chemical Society Nano,2017,vol.11,p.2452-2458.
非专利文献4：Li et al.,Biomaterials,2018,vol.178,p.652-662.
非专利文献5：Cho et al.,Journal of Nanobiotechnology,2019,vol.17,p.19.
非专利文献6：Lee et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,vol.1,p.889-901.
非专利文献7：Leung et al.,Journal of Physical Chemistry C NanomaterInterfaces，2012，vol.116(34),p.18440-18450.
非专利文献8：Stroock et al.,Science,2002,vol.295,p.647-651
发明内容
发明所要解决的技术课题
与一直以来使用的低分子药物、核酸相比，RNP等蛋白质更容易因醇等有机溶剂、缓冲液的pH、盐浓度、温度等粒子制造时的各种物理参数而受到不可逆灭活。因而，现今为止尚未有以醇稀释法为原理的负载有RNP的脂质纳米粒子制剂的制造的相关报告。
本发明的目的在于提供一种脂质纳米粒子，其内含有基因组编辑所需的核酸等，可以通过使用流道的醇稀释法来制造，且基因组编辑效率优异。
本发明的发明人发现，在利用CRISPR/Cas9系统进行的基因组编辑中，通过将crRNA、tracrRNA、及Cas9蛋白的复合物RNP进一步和包含与crRNA互补的碱基序列区域的单链寡核苷酸(ssON)形成复合物并使其帯负电，能够高效地负载于由包含pH敏感性阳离子型脂质的特定组成的脂质膜结构构成的脂质纳米粒子，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的脂质纳米粒子。
(1)一种脂质纳米粒子，
所述脂质纳米粒子含有脂质成分、DNA核酸酶、向导RNA、单链寡核苷酸，
所述脂质成分含有下述通式(I)表示的pH敏感性阳离子型脂质、中性磷脂、及聚亚烷基二醇修饰脂质，
[化学式1]
(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X (I)
式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1；R1和R2分别独立地表示下述通式(A)表示的基团，
[化学式2]
CH3-(CH2)q-(CH＝CH)r-(CH2)s-(CH＝CH)t-(CH2)u-(CO-O)c-(CH2)v- (A)
式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；s表示1～3的整数；t表示0或1；u表示1～8的整数；c表示0或1：v表示4～12的整数；q+2r+s+2t+u+c+v为19以上的整数，但在b和c同时为0的情况下，则如下情况除外：q为3～5的整数，r及t为1，s为1，且u+v为6～10的整数；
X表示下述通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基，其中，该基团通过碳原子键合于(O-CO)b-，该环的1个或2个氢原子可以被C1-4烷基或C2-4烯基取代，
[化学式3]
-(CH2)d-N(R3)(R4) (B)
式(B)中、d表示0～3的整数；R3和R4分别独立地表示C1-4烷基或C2-4烯基，其中，该C1-4烷基或C2-4烯基的1个或2个氢原子可以被苯基取代，R3和R4也可以彼此键合而形成5～7元非芳香族杂环，其中，该环的1个或2个氢原子可以被C1-4烷基或C2-4烯基取代，
所述pH敏感性阳离子型脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为30摩尔％～50摩尔％，
所述中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为20摩尔％～50摩尔％，
所述聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为1摩尔％～4摩尔％。
(2)根据所述(1)的脂质纳米粒子，其中，所述中性磷脂为具有碳原子数12～24的饱和或不饱和的脂肪酸残基的中性甘油磷脂。
(3)根据所述(1)的脂质纳米粒子，其中，所述中性磷脂为具有碳原子数12～24的不饱和的脂肪酸残基的磷脂酰乙醇胺。
(4)根据所述(1)～(3)中任一项的脂质纳米粒子，其中，所述pH敏感性阳离子型脂质为聚乙二醇修饰脂质。
(5)根据所述(1)～(4)中任一项的脂质纳米粒子，其中，所述DNA核酸酶为Cas9蛋白，所述向导RNA由crRNA和tracrRNA构成。
(6)根据所述(5)的脂质纳米粒子，其中，所述Cas9蛋白为具有RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的仅一者的蛋白质。
(7)根据所述(1)～(4)中任一项的脂质纳米粒子，其中，所述DNA核酸酶为Cpf1蛋白。
(8)一种基因组编辑方法，向细胞内导入所述(1)～(7)中任一项的脂质纳米粒子。
(9)一种脂质纳米粒子的制造方法，其使用流道结构体制造所述(1)～(7)中任一项的脂质纳米粒子，
所述流道结构体中，彼此独立的、导入第一流体的第一导入通道和导入第二流体的第二导入通道分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道，
所述稀释流道至少在其一部分上具有二维弯曲的流道部位，
该弯曲的流道部位形成为：在将与弯曲的流道部位相比更靠近上游处的稀释流道的轴线方向或其延长方向作为X方向，将与该X方向垂直相交的稀释流道的宽度方向作为Y方向，将与该弯曲的流道部位相比更靠近上游处的稀释流道的流道宽度作为y0的情况下，按照一定间隔d1、d2……设有至少两个以上构件，该构件交替地从Y方向上相对的稀释流道的两侧壁面起朝向流道中心侧突出，以限制稀释流道的流道宽度，所述构件在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上具有1/2y0以上且小于1y0的一定高度h1、h2……，且在X方向上具有一定宽度x1、x2……，
从所述第一导入通道导入使所述脂质成分溶解于乙醇而成的脂质溶液，从所述第二导入通道导入含有所述DNA核酸酶、所述向导RNA、及所述单链寡核苷酸的pH为5.0以上的水溶液，且使总流量为1μL/分钟～100mL/分钟，且所述水溶液的流速相对于所述脂质溶液的流速的比为7以上。
(10)根据所述(9)的脂质纳米粒子的制造方法，其中，
所述流道结构体还具有导入第三流体的第三导入通道，
以使得从所述第一导入通道导入的第一流体在与从所述第二导入通道导入的第二流体汇流之前，与从所述第三导入通道导入的第三流体接触的方式，所述第一导入通道、所述第二导入通道和所述第三导入通道分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道。
作为本发明的脂质纳米粒子，由于RNP负载于由包含pH敏感性阳离子型脂质的特定组成的脂质膜结构构成的脂质纳米粒子，因此，能够高效地进行靶细胞的基因组编辑。另外，由于负载于脂质膜结构的RNP包含ssON，并带有负电，因此，本发明的脂质纳米粒子能够通过醇稀释法来制造。
附图说明
图1A是示意性示出用于制造本发明的脂质纳米粒子的流道结构体的一种实施方式中的结构的图。
图1B是示意性示出用于制造本发明的脂质纳米粒子的流道结构体的一种实施方式中的结构的图。
图2是参考例1及实施例1中使用的流道结构体的结构的示意图。
图3是参考例2中使用的流道结构体的结构的示意图。
图4是示出实施例1中各负载有RNP的脂质纳米粒子对于HeLa-GFP细胞的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图5是示出实施例1中各负载有RNP的脂质纳米粒子对于HeLa-GFP细胞的敲入效率(％)相对于敲除效率(％)的比([KI(％)]/[KO(％)])的测定结果的图。
图6是示出实施例2中初筛时各负载有RNP的脂质纳米粒子对于HeLa-GFP细胞的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图7是示出实施例2中改变初筛时显著影响个数平均粒径的因子时的个数平均粒径的预测曲线的图。
图8是示出实施例2中改变初筛时显著影响包封率的因子时的包封率的预测曲线的图。
图9是示出实施例2中改变初筛时显著影响基因敲除活性的因子时的基因敲除活性的预测曲线的图。
图10是示出实施例2中改变二次筛选时显著影响个数平均粒径的因子时的个数平均粒径的预测曲线的图。
图11是示出实施例2中改变二次筛选时显著影响包封率的因子时的包封率的预测曲线的图。
图12是示出实施例2中改变二次筛选时显著影响基因敲除活性的因子时的基因敲除活性的预测曲线的图。
图13是示出实施例3中添加负载有RNP的脂质纳米粒子B-4或B-9后的细胞的细胞存活率(％)的测定结果的图。
图14是示出实施例3中将添加负载有RNP的脂质纳米粒子B-9后的细胞在4℃下储存，并经时测定Zeta电位和PdI而得到的结果的图。
图15是示出实施例3中4℃下储存前后的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9对于HeLa-GFP细胞的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图16A是示出实施例4中将负载有RNP的脂质纳米粒子B-4或B-9添加到培养基使得Cas9蛋白浓度达到0.1nM并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图16B是示出实施例4中将负载有RNP的脂质纳米粒子B-4或B-9添加到培养基使得Cas9蛋白浓度达到0.3nM并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图17是示出实施例5中将负载有RNP的脂质纳米粒子添加到培养基使得Cpf1蛋白浓度达到0.5nM、1nM或2nM并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图18是示出实施例6中将包含Cas9n蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子或包含Cas9蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子添加到培养基使得Cas9n蛋白等的浓度达到0.1nM、0.3nM、1nM或2nM并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图19A是示出实施例7中将负载有RNP的脂质纳米粒子B-4或B-9添加到培养基使得Cas9蛋白浓度达到0.5nM、1nM、3nM或5nM并进行培养后的HEK-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图19B是示出实施例7中将负载有RNP的脂质纳米粒子B-4或B-9添加到培养基使得Cas9蛋白浓度达到0.5nM、1nM、3nM或5nM并进行培养后的HEK-GFP细胞中的BFP阳性细胞比例(％)的测定结果的图。
图20是示出实施例7中添加负载有RNP的脂质纳米粒子B-4或B-9后的细胞的细胞存活率(％)的测定结果的图。
图21是示出实施例8中导入负载有RNP的脂质纳米粒子前的持续表达GFP的BMDM的流式细胞分析的结果(A)、和导入负载有RNP的脂质纳米粒子后的持续表达GFP的BMDM的流式细胞分析的结果(B)的图。
图22是示出实施例9中将各负载有RNP的脂质纳米粒子B-9添加到培养基使得Cas9蛋白浓度达到0.1nM、0.3nM或1nM并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图23A是示出实施例10中添加含有Cas9蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
图23B是示出实施例10中添加含有Cpf1蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子并进行培养后的HeLa-GFP细胞中的GFP敲除效率(％)的测定结果的图。
具体实施方式
本发明的脂质纳米粒子在CRISPR系统中被用作向靶细胞导入RNP的载体，是用于基因组编辑的DNA核酸酶、向导RNA(gRNA)、及ssON的复合物RNP负载于包含pH敏感性阳离子型脂质的特定组成的脂质膜结构而成的脂质纳米粒子。作为负载于该脂质纳米粒子的RNP，可列举Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA及ssON的复合物。由于将RNP本身直接负载于脂质纳米粒子并导入靶细胞，因此，与将编码Cas9蛋白等DNA核酸酶的基因导入靶细胞内并使其表达的方法相比，脱靶效应更小。
[DNA核酸酶]
在本发明及本申请说明书中，负载于脂质纳米粒子的DNA核酸酶是一种gRNA依赖性地结合至DNA，识别并切断与gRNA的一部分配对而形成的双链DNA的酶。作为该DNA核酸酶，可列举Cas9、Cpf1等。
<Cas9蛋白>
在本发明及本申请说明书中，Cas9蛋白是一种gRNA依赖性地结合至DNA，并具有RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的至少一者的蛋白质。具备RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性这二者的Cas9蛋白切断基因组DNA的双链。具备RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的仅一者的Cas9蛋白切断基因组DNA的双链中的仅一条链。
本发明中使用的Cas9蛋白可以为来自具有CRISPR体系的细菌的野生型Cas9蛋白，也可以为改变野生型蛋白质而成的变异型蛋白质。作为具有CRISPR体系的细菌，例如可列举：化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、齿密螺旋体(Treponema denticola)等。另外，作为改变野生型Cas9蛋白而成的变异型蛋白质，可列举：导入了使RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中任意一者失活之类的变异的变异体。作为该变异体，例如可列举野生型Cas9蛋白的第10个天冬氨酸被丙氨酸取代的变异体(Cas9(D10A))。Cas9(D10A)作为DNA切口酶起作用，因此也被称为Cas9切口酶(Cas9n)。此外，也可以是导入了不会对野生型Cas9蛋白的核酸酶活性产生影响的变异的变异型蛋白质。
本发明中使用的Cas9蛋白可以为向野生型Cas9蛋白或其变异型蛋白质中添加各种肽而成的蛋白质，也可以为与其它蛋白质融合后的嵌合蛋白。作为该肽，可列举例如：His标签、Myc标签、Flag标签等标签肽、核定位信号肽等信号肽等。作为与野生型或变异型的Cas9蛋白融合的其它蛋白质，可列举例如：GST、荧光蛋白等。
<Cpf1蛋白>
在本发明及本申请说明书中，Cpf1蛋白是一种gRNA依赖性地结合至DNA，且仅具有RuvC核酸酶活性的蛋白质。具备RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性这二者的Cas9蛋白切断基因组DNA的双链而形成平滑末端，而Cpf1蛋白则形成5’突出末端。
本发明中使用的Cpf1蛋白可以为来自具有CRISPR/Cpf1系统的细菌的野生型Cpf1蛋白，也可以为改变野生型蛋白质而成的变异型蛋白质。作为具有CRISPR/Cpf1系统的细菌，例如可列举：氨基酸球菌属菌(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)等。另外，作为改变野生型Cpf1蛋白而成的变异型蛋白质，可列举：导入诸如增大核酸酶活性之类的变异的变异体、导入不会对核酸酶活性产生影响的变异的变异型蛋白质。
本发明中使用的Cpf1蛋白可以为向野生型Cpf1蛋白或其变异型蛋白质添加了各种肽而成的蛋白质，也可以为与其它蛋白质融合后的嵌合蛋白。作为该肽及其它蛋白质，可以使用与Cas9蛋白中所列举的物质相同的物质。
[gRNA]
在本发明及本申请说明书中，gRNA是具有可以与被DNA核酸酶切断的基因组DNA上的靶序列(基因组编辑对象的碱基序列)配对的碱基序列的RNA。“可以与靶序列配对的碱基序列”抑制靶序列以外的区域的识别，因此，其通常是与靶序列同源(相同)或互补的碱基序列。gRNA可以由一条RNA构成，也可以由两条以上的RNA形成复合物。
<crRNA和tracrRNA>
在负载于脂质纳米粒子的DNA核酸酶为Cas9蛋白的情况下，作为gRNA，可以使用crRNA及tracrRNA。crRNA是如下这样的单链RNA：其来源于具有CRISPR体系的细菌，且包含由与tracrRNA的一部分互补的碱基序列构成的区域(与tracrRNA结合的区域)、和由与基因组DNA上的靶序列同源或互补的碱基序列构成的区域(基因组DNA结合区域)。tracrRNA同样也是来源于具有CRISPR体系的细菌的单链RNA，其具有由与crRNA的一部分互补的碱基序列构成的区域(与crRNA结合的区域)，在该区域内与crRNA杂交而形成发夹结构。Cas9蛋白识别该发夹结构，从而形成RNP。crRNA和tracrRNA可以为分别独立的单链RNA，也可以为两者通过适当的RNA接头连接而成的单链RNA。需要说明的是，作为具有CRISPR体系的细菌，可列举如上所述细菌。Cas9蛋白、crRNA及tracrRNA可以均来自相同种类的细菌，也可以来自彼此不同种类的细菌。另外，只要不损害CRISPR/Cas9系统的功能，则crRNA及tracrRNA可以仅由天然的RNA构成，也可以在其一部分或全部中包含修饰RNA或人工核酸。
<Cpf1蛋白与使用的gRNA>
在负载于脂质纳米粒子的DNA核酸酶为Cpf1蛋白的情况下，作为gRNA，与crRNA相同地，只要为包含靶序列的RNA即可，无须tracrRNA。因而，可以使gRNA比使用Cas9蛋白时更短。另外，只要不损害CRISPR/Cpf1系统的功能，则gRNA可以仅由天然的RNA构成，也可以在其一部分或全部中包含修饰RNA或人工核酸。
<靶序列>
靶序列通常选择紧随其后即为PAM序列的区域的碱基序列。PAM序列是被Cas9蛋白等DNA核酸酶识别的序列，依赖于所使用的Cas9蛋白等DNA核酸酶来确定。例如，作为Cas9蛋白所识别的PAM序列，可列举5'-NGG(N：A、G、C、T)，作为Cpf1蛋白所识别的PAM序列，可列举5'-TTTV(V：A、G、C)、5'-TTTN(N：A、G、C、T)。crRNA等gRNA中的靶序列的碱基长度不受特别限定，可以设为例如15～30碱基长度左右，优选18～22碱基长度。
[ssON]
本发明中使用的ssON包含能够与gRNA的一部分配对的区域。由此，包含能够与和负载于脂质纳米粒子的DNA核酸酶形成了复合物的状态的gRNA配对的区域。由此，形成DNA核酸酶、gRNA、及ssON的复合物RNP。ssON可以为仅由DNA构成的寡核苷酸，也可以为仅由RNA构成的寡核苷酸，还可以为包含DNA和RNA这二者的嵌合寡核苷酸。另外，只要不损害所使用的CRISPR系统的功能，则ssON可以仅由天然的RNA或DNA构成，也可以在其一部分或全部中包含修饰核酸或人工核酸。
在负载于脂质纳米粒子的DNA核酸酶为Cas9蛋白的情况下，包含由与crRNA中与tracrRNA结合的区域以外的部分区域互补的碱基序列构成的区域。经由该与crRNA互补的区域(与crRNA结合的区域)，ssON和crRNA进行杂交。即，负载于本发明的脂质纳米粒子的RNP是crRNA和tracrRNA、crRNA和ssON彼此杂交，所形成的三者复合物与Cas9蛋白形成复合物而成的。作为crRNA中与ssON杂交的区域(与ssON结合的区域)，只要crRNA能够同时与tracrRNA和ssON杂交而形成三者复合物，且该三者复合物能够形成Cas9蛋白所识别的发夹结构，则没有特别限定。例如，crRNA中与ssON结合的区域可以包含基因组DNA结合区域的一部分或全部，也可以与基因组DNA结合区域相同。另外，在使用使RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中之一者失活的Cas9切口酶(Cas9n)的双切刻(double-nicking)法的情况下，使用两种向导RNA。故而，在负载于脂质纳米粒子的DNA核酸酶为Cas9n、脂质纳米粒子负载有用于双切刻法的RNP的情况下，使用与各向导RNA杂交的两种ssON。
在通过CRISPR系统向切断后的基因组DNA敲入目标基因片段的情况下，ssON也能够用作该敲入的供体DNA。例如，除与crRNA等的gRNA结合的区域以外，还具备在敲入的基因片段的两个末端添加有用于同源重组的40～60bp的同源序列区域(homology arms)的区域的ssON，用作供体DNA。
Cas9蛋白及Cpf1蛋白与核酸不同，带有正电荷，因此，其负载于在构成脂质膜的脂质成分中包含pH敏感性阳离子型脂质的脂质纳米粒子的负载效率低。针对此点，在本发明的脂质纳米粒子中，与Cas9蛋白等DNA核酸酶形成复合物的核酸不仅包含crRNA和tracrRNA等gRNA，还包含ssON。如此一来，由于RNP中所含的核酸量较多，因此，RNP的正电荷被抑制，负电荷增强，从而能够高效地负载于包含pH敏感性阳离子型脂质的脂质纳米粒子。本发明中使用的ssON的碱基长度只要为足以使RNP带负电的长度即可，可以考虑gRNA例如crRNA和tracrRNA的碱基长度、及Cas9蛋白等的种类等而适当确定。ssON的长度例如可以设为50～500碱基长度左右。
关于基因组DNA上的靶序列的确定、crRNA及tracrRNA等gRNA的碱基序列的设计、ssON的碱基序列的设计等，可以基于基因组DNA的碱基序列信息，利用通常使用的分子生物学工具，并通过常规方法来进行。例如，gRNA的设计可以使用CRISPR Design Tool(HorizonDiscovery)、TrueDesign Genome Editor(Invitrogen)等设计工具来进行。
[脂质成分]
本发明的脂质纳米粒子是在脂质膜结构体上负载RNP而成的脂质纳米粒子。构成脂质膜结构体的脂质成分中至少含有pH敏感性阳离子型脂质、中性磷脂、及聚亚烷基二醇修饰脂质。
<pH敏感性阳离子型脂质>
本发明的脂质纳米粒子中含有的pH敏感性阳离子型脂质是下述通式(I)表示的阳离子型脂质(以下，有时称为“本发明的pH敏感性阳离子型脂质”。)。
[化学式4]
(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X (I)
通式(I)中，a表示3～5的整数，优选为4。
b表示0或1。在b为0的情况下，表示不存在-O-CO-基，为单键。
通式(I)中，R1及R2分别独立地表示下述通式(A)表示的基团。通式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；s表示1～3的整数；t表示0或1；u表示1～8的整数；c表示0或1；v表示4～12的整数。其中，在b和c同时为0的情况下，则如下情况除外：q为3～5的整数，r及t为1，s为1，且u+v为6～10的整数。
[化学式5]
CH3-(CH2)q-(CH＝CH)r-(CH2)s-(CH＝CH)t-(CH2)u-(CO-O)c-(CH2)v- (A)
作为本发明的pH敏感性阳离子型脂质，从本发明的脂质纳米粒子的稳定性方面考虑，优选R1及R2的烃链为较长链。具体而言，在本发明的pH敏感性阳离子型脂质中，优选R1及R2为碳原子数20以上的基团，即，通式(A)中，q+2r+s+2t+u+c+v为19以上的整数。其中，作为本发明的pH敏感性阳离子型脂质，优选q+2r+s+2t+u+c+v为19～33的整数，更优选为19～31的整数，进一步优选为21～31的整数，更进一步优选为21～27的整数。
作为本发明的pH敏感性阳离子型脂质的R1及R2，优选如下基团：通式(A)中，r为1，t为0，q为5～11的整数，优选为6～10的整数，s+u为5～11的整数，优选为6～10的整数，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为16以上的整数的基团；r为0，t为1，q+s为5～11的整数，优选为6～10的整数，u为5～8的整数，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为16以上的整数的基团；r及t为0，q+s+u为13～23的整数，优选为15～21，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为18以上的整数的基团；r及t为0，q+s+u为13～23的整数，优选为15～21，c为1，v为6～10的整数，q+s+u+v为18以上的整数的基团。
在本发明的pH敏感性阳离子型脂质中，R1及R2只要为通式(A)表示的基团即可，可以为彼此不同的基团，但优选为相同的基团。
通式(I)中，X表示下述通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基。X所示的5～7元非芳香族杂环基通过碳原子键合于(O-CO)b-。
[化学式6]
-(CH2)d-N(R3)(R4) (B)
通式(B)中，d表示0～3的整数。在d为0的情况下，表示不存在-(CH2)-基，为单键。
通式(B)中，R3及R4分别独立地表示C1-4烷基(碳原子数1～4的烷基)或C2-4烯基(碳原子数1～4的烯基)。R3及R4所表示的C1-4烷基或C2-4烯基的1个或2个氢原子可以被苯基取代。
作为C1-4烷基，可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。作为C2-4烯基，可列举：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基。
通式(B)中，R3及R4可以彼此键合而形成5～7元非芳香族杂环。作为R3及R4彼此键合而形成的5～7元非芳香族杂环，可列举例如：1-吡咯烷基、1-呱啶基、1-吗啉基、及1-哌嗪基。R3及R4彼此键合所形成的5～7元非芳香族杂环的环中的1个或2个氢原子可以被C1-4烷基或C2-4烯基取代。在该环中的2个氢原子被C1-4烷基或C2-4烯基取代的情况下，可以被彼此相同的基团取代，也可以被彼此不同的基团取代。
通式(I)中，在X为5～7元非芳香族杂环基的情况下，作为该杂环基中所含的杂原子，能够列举：氮原子、氧原子或硫原子等。构成该杂环基中的杂环的杂原子可以为1个，相同或不同的杂原子也可以为2个以上。该杂环基中的杂环可以为饱和的杂环，可以包含1个或2个以上双键，但杂环不是芳香环。
作为本发明的pH敏感性阳离子型脂质，优选如下脂质：
通式(I)中，a为3～5的整数，b为1，X为5～7元非芳香族杂环基(其中，通过杂环基中的碳原子键合于(O-CO)b-)，优选为1-吡咯烷基、1-呱啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基(通过环中的碳原子键合于(O-CO)b-，1个氢原子可以被C1-4烷基或者C2-4烯基取代)，R1及R2分别独立地为：通式(A)中，r为1，t为0，q为5～11的整数，优选为6～10的整数，s+u为5～11的整数，优选为6～10的整数，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为16以上的整数的基团；
通式(I)中，a为3～5的整数，b为1，X为5～7元非芳香族杂环基(其中，通过杂环基中的碳原子键合于(O-CO)b-。)，优选为1-吡咯烷基、1-呱啶基、1-吗啉基或1-哌嗪基(通过环中的碳原子键合于(O-CO)b-，1个氢原子可以被C1-4烷基或者C2-4烯基取代。)，R1及R2分别独立地为：通式(A)中，r为0，t为1，q+s为5～11的整数，优选为6～10的整数，u为5～8的整数，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为16以上的整数的基团；
通式(I)中，a为3～5的整数，b为0，X为：通式(B)中，d为0，R3及R4分别独立地为C1-4烷基或C2-4烯基(R3及R4所表示的C1-4烷基或C2-4烯基的1个或2个氢原子可以被苯基取代)的基团，R1及R2分别独立地为：通式(A)中，r为1，t为0，q为5～11的整数，优选为6～10的整数，s+u为5～11的整数，优选为6～10的整数，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为16以上的整数的基团；
通式(I)中，a为3～5的整数，b为0，X为：通式(B)中，d为0，R3及R4分别独立地表示C1-4烷基或C2-4烯基(R3及R4所表示的C1-4烷基或C2-4烯基的1个或2个氢原子可以被苯基取代)的基团，R1及R2分别独立地为：通式(A)中，r为0，t为1，q+s为5～11的整数，优选为6～10的整数，u为5～8的整数，c为1，v为4～12的整数，q+s+u+v为16以上的整数的基团。
这些脂质中，作为通式(I)表示的pH敏感性阳离子型脂质，R1及R2为相同的基团的脂质更加优选，特别优选R1及R2为相同的基团、且a为4的脂质。
通式(I)表示的pH敏感性阳离子型脂质的pKa不受特别限定，例如为4.0～9.0左右，优选为4.5～8.5左右，更优选选择6～8左右，优选以赋予该范围的pKa的方式来选择各取代基的种类。
通式(I)表示的pH敏感性阳离子型脂质能够通过例如本说明书的实施例中具体示出的方法容易地制造。通过参照该制造方法，适当选择原料化合物、试剂及反应条件等，本领域技术人员能够容易地制造通式(I)的范围中所包含的任意的脂质。
<中性磷脂>
本发明的脂质纳米粒子的脂质成分中所含的中性磷脂(以下，有时称为“本发明的中性磷脂”)是基团整体的电荷为中性，磷酸基和带正电的基团通过适当的连接基团连接的脂质。作为带正电的基团，可列举例如铵基及季铵基等。
作为本发明的中性磷脂，优选甘油磷脂或鞘磷脂。作为中性的甘油磷脂，可列举：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、心磷脂、缩醛磷脂等。作为中性的鞘磷脂，可列举：神经鞘磷脂、神经酰胺磷酰甘油、神经酰胺磷酰乙醇胺等。这些中性甘油磷脂或中性鞘磷脂中的脂肪酸残基不受特别限定，可以列举例如碳原子数12～24的饱和或不饱和的脂肪酸残基，优选碳原子数14～20的饱和或不饱和的脂肪酸残基。具体而言，能够列举来自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、花生四烯酸、山萮酸、木蜡酸等脂肪酸的酰基。在这些甘油脂质或鞘脂质具有2个以上脂肪酸残基的情况下，全部的脂肪酸残基可以为相同的基团，也可以为彼此不同的基团。
作为本发明的中性磷脂，从进一步提高基因组编辑效率方面考虑，优选具有碳原子数12～24的饱和或不饱和的脂肪酸残基的中性甘油磷脂，更优选具有碳原子数12～24的不饱和的脂肪酸残基的中性甘油磷脂或中性鞘磷脂，进一步优选具有碳原子数12～24的不饱和的脂肪酸残基的中性甘油磷脂。其中，优选具有碳原子数12～24的不饱和的脂肪酸残基的磷脂酰乙醇胺，更优选具有碳原子数14～20的脂肪酸残基的磷脂酰乙醇胺，特别优选二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
<聚亚烷基二醇修饰脂质>
本发明的脂质纳米粒子的脂质成分中所含的聚亚烷基二醇修饰脂质(以下，有时称为“本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质”)只要为经聚亚烷基二醇修饰的脂质，则没有特别限定，但pH敏感性阳离子型脂质及中性磷脂除外。聚亚烷基二醇为亲水性聚合物，通过将聚亚烷基二醇修饰脂质用作脂质膜构成脂质来构建脂质纳米粒子，能够将脂质纳米粒子的表面用聚亚烷基二醇修饰。通过用聚亚烷基二醇进行表面修饰，有时能够提高脂质纳米粒子的血中滞留性等稳定性。
作为聚亚烷基二醇，例如可以使用：聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚己二醇等。聚亚烷基二醇的重均分子量为例如300～10,000左右，优选为500～10,000左右，进一步优选为1,000～5,000左右。
例如，利用聚乙二醇对脂质进行修饰时，可以使用硬脂酰化聚乙二醇(例如硬脂酸PEG45(STR-PEG45)等)。此外，也可以使用：N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、n-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺等聚乙二醇衍生物等，但聚亚烷基二醇化脂质不限于这些。
<其它脂质>
在本发明的脂质纳米粒子的构成脂质中，作为除本发明的pH敏感性阳离子型脂质、本发明的中性磷脂和本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质以外的脂质，可以使用通常形成脂质体时所使用的脂质。作为这样的脂质，例如可列举：带正电或负电的磷脂、甾醇或者饱和或不饱和的脂肪酸等。可以使用一种或组合使用两种以上这些脂质。
作为带正电或负电的磷脂，可以列举：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、神经酰胺磷酰基甘油磷酸酯、磷脂酸等。作为甾醇，例如可列举：胆固醇、胆固醇琥珀酸、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、链甾醇、二氢胆固醇等来自动物的甾醇；豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、油菜甾醇等来自植物的甾醇(植物甾醇)；霉菌甾醇、麦角甾醇等来自微生物的甾醇等。
<脂质组成>
构成本发明的脂质纳米粒子的本发明的pH敏感性阳离子型脂质、中性脂质及本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质分别可以仅为一种，也可以为两种以上。在构成本发明的脂质纳米粒子的本发明的pH敏感性阳离子型脂质为两种以上的情况下，本发明的pH敏感性阳离子型脂质的量表示构成脂质纳米粒子的脂质分子中相当于本发明的pH敏感性阳离子型脂质的脂质分子的合计量。同理，在构成本发明的脂质纳米粒子的本发明的中性脂质为两种以上的情况下，本发明的中性脂质的量表示构成脂质纳米粒子的脂质分子中相当于本发明的中性脂质的脂质分子的合计量。在构成本发明的脂质纳米粒子的本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质为两种以上的情况下，本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质的量表示构成脂质纳米粒子的脂质分子中相当于本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质的脂质分子的合计量。
本发明的pH敏感性阳离子型脂质占构成脂质纳米粒子的脂质分子(脂质成分)的总量的比例越多，则越具有脂质纳米粒子的粒径小，RNP的包封效率升高的倾向。另外，本发明的中性磷脂占构成脂质纳米粒子的脂质分子的总量的比例越多，则越具有RNP的包封效率升高的倾向。另外，通过使构成脂质纳米粒子的脂质分子中包含少量本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质，具有充分减小脂质纳米粒子的粒径，充分提高RNP的包封效率，充分提高基因组编辑效率的倾向。为了实现更高的基因组编辑效率，优选本发明的pH敏感性阳离子型脂质相对于构成本发明的脂质纳米粒子的总脂质量的比例([本发明的pH敏感性阳离子型脂质的量(mol)]/[构成脂质纳米粒子的总脂质量(mol)]×100％)为30摩尔％～50摩尔％，本发明的中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例([本发明的中性磷脂的量(mol)]/[构成脂质纳米粒子的总脂质的量(mol)]×100％)为20摩尔％～50摩尔％，本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例([本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质的量(mol)]/[构成脂质纳米粒子的总脂质的量(mol)]×100％)为1.0摩尔％～4.0摩尔％，更优选本发明的pH敏感性阳离子型脂质相对于构成本发明的脂质纳米粒子的总脂质量的比例为40摩尔％～50摩尔％，本发明的中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为20摩尔％～50摩尔％，本发明的聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为1.5摩尔％～2.0摩尔％。
<表面修饰>
可以根据需要对本发明的脂质纳米粒子进行适当的表面修饰等。
本发明的脂质纳米粒子能够通过用亲水性聚合物等进行表面修饰来提高血中滞留性。某些情况下也可以通过将经这些修饰基团修饰的脂质用作脂质纳米粒子的构成脂质而进行表面修饰。
制造本发明的脂质纳米粒子时，作为用于提高血中滞留性的脂质衍生物，也可以利用例如：血型糖蛋白、神经节苷脂GM1、磷脂酰肌醇、神经节苷脂GM3、葡萄糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物等。另外，作为用于提高血中滞留性的亲水性聚合物，除聚亚烷基二醇之外，还可以将葡聚糖、普鲁兰多糖、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、角叉菜胶等用于表面修饰。
另外，为了促进本发明的脂质纳米粒子的核内转运，例如也可以用3糖以上的寡糖化合物对脂质纳米粒子进行表面修饰。3糖以上的寡糖化合物的种类不受特别限定，可以使用例如3～10个左右的糖单元键合而成的寡糖化合物，可以优选使用3～6个左右的糖单元键合而成的寡糖化合物。其中，可以优选使用作为葡萄糖的三聚体至六聚体的寡糖化合物，可以进一步优选使用作为葡萄糖的三聚体或四聚体的寡糖化合物。更具体而言，可以适当地使用异麦芽三糖、异戊糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖等，其中，进一步优选葡萄糖α1-4键合而成的麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。特别优选麦芽三糖或麦芽四糖，最优选麦芽三糖。利用寡糖化合物对脂质纳米粒子进行的表面修饰量不受特别限定，例如，相对于总脂质量为1摩尔％～30摩尔％左右，优选为2摩尔％～20摩尔％左右，更优选为5摩尔％～10摩尔％左右。
用寡糖化合物对脂质纳米粒子进行表面修饰的方法不受特别限定，例如已知有将脂质纳米粒子用半乳糖及甘露糖等单糖进行表面修饰后的脂质体(国际公布第2007/102481号)，因此可以采用该出版物中记载的表面修饰方法。上述出版物的公开的全部内容通过参考而包含在本说明书的公开内容中。
另外，可以向本发明的脂质纳米粒子赋予例如温度变化敏感性功能、膜渗透功能、基因表达功能及pH敏感性功能等中的任意一个或两个以上的功能。通过适当添加这些功能，能够提高脂质纳米粒子在血液中的滞留性，降低肝及脾等的网状内皮系统组织的捕捉率，并且，在靶细胞的内吞作用之后能够高效地使脂质纳米粒子从核内体中脱出并转运至核内，从而能在核内实现很高的基因组编辑活性。
另外，也可以用能够与细胞表面的受体或抗原特异性结合的抗体等物质对本发明的脂质纳米粒子实施修饰，能够改善向细胞的核内输送物质的效率。优选将针对在例如靶组织或脏器中特异表达的生物体成分的单克隆抗体配置于脂质纳米粒子的表面。该方法记载于例如STEALTH LIPOSOME(第233-244页，CRC Press,Inc.发行，Danilo Lasic及FrankMartin编著)等。通过含有能够与单克隆抗体或其的片段(例如，Fab片段、F(ab')2片段、或Fab’片段等)中的巯基进行反应的脂质衍生物，例如聚(乙二醇)-α-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-ω-马来酰亚胺、α-[N-(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰基-乙基)氨基甲酰基)-ω-[3-[2-(2,5-二氢-2,5-二氧杂-1H-吡咯-1-基)乙烷甲酰胺]丙基}-聚(氧基-1,2-乙炔基)等具有马来酰亚胺结构的脂质衍生物作为脂质纳米粒子的构成成分，能够使单克隆抗体结合于脂质纳米粒子的膜的表面。
也可以用包含连续的多个精氨酸残基的多肽(以下，称为“聚精氨酸”。)来修饰本发明的脂质纳米粒子的表面。作为聚精氨酸，可以优选使用包含4～20个连续的精氨酸残基的多肽，进一步优选使用仅由4～20个连续的精氨酸残基构成的多肽，特别优选使用八精氨酸等。通过将脂质体等脂质纳米粒子的表面用八精氨酸等聚精氨酸修饰，能够提高被脂质体包封的RNP的细胞内输送效率(Journal of Controlled Release,98,pp.317-323,2004；国际公布第2005/32593号)。按照上述出版物中记载的方法，将例如脂质修饰聚精氨酸，例如硬脂化八精氨酸等用作脂质纳米粒子的构成脂质，由此能够容易地利用聚精氨酸进行脂质纳米粒子表面的修饰。上述出版物的公开内容及该出版物中引用的全部文献的公开内容通过参考而包含在本说明书的公开内容中。
[其它成分]
本发明的脂质纳米粒子可以进一步包含选自生育酚、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、或丁基化羟基甲苯等抗氧化剂、带电物质及膜多肽等中的一种或两种以上的物质。作为赋予正电荷的带电物质，可以列举例如：硬脂胺、油胺等的饱和或者不饱和脂肪族胺；二油酰基三甲基铵丙烷等的饱和或者不饱和阳离子型合成脂质；或阳离子型聚合物等，作为赋予负电荷的带电物质，可以列举例如：磷酸二鲸蜡酯、胆固醇琥珀酸单酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。作为膜多肽，可列举例如：膜表面多肽或膜内源性多肽等。这些物质的调配量不受特别限定，可以根据目的适当选择。
[脂质纳米粒子]
本发明的脂质纳米粒子是由脂质成分构成的脂质膜结构体，负载有RNP。从RNP被脂质纳米粒子包封的包封率进一步提高方面考虑，负载于该脂质纳米粒子的RNP相对于构成本发明的脂质纳米粒子的总脂质量的比例([RNP的量(mol)]/[构成脂质纳米粒子的总脂质的量(mol)]×100％)优选为1.8～3.6×10-2摩尔％。
关于本发明的脂质纳米粒子的大小，从即使在靶细胞存在于生物体内的较深处时也容易得到高输送效率方面考虑，平均粒径优选为80nm以下，平均粒径更优选为50nm以下，进一步优选为40nm以下，更进一步优选为30nm以下，特别优选为10nm～30nm。需要说明的是，脂质纳米粒子的平均粒径表示通过动态光散射法(Dynamic light scattering：DLS)测得的个数平均粒径。通过动态光散射法进行的测定可以使用市售的DLS装置等通过常规方法来进行。
本发明的脂质纳米粒子的多分散指数(PDI)为0.05～0.1左右，优选为0.06～0.08左右，进一步优选为约0.07左右。Zeta电位可以采用5.5mV～6.0mV的范围，优选采用5.8mV左右。
本发明的脂质纳米粒子的形式没有特别限定，例如，作为分散于水性溶剂的形式，可以列举：单膜脂质体、多层脂质体、球形胶束或无定形的层状结构物等。作为本发明的脂质纳米粒子，优选为单膜脂质体、多层脂质体。
[制造方法]
本发明的脂质纳米粒子的制造方法不受特别限定，可以采用本领域技术人员可利用的任意的方法。其一例为，将全部的脂质成分溶解于氯仿等有机溶剂，利用蒸发器进行减压干固或利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，由此形成脂质膜之后，将包含RNP等的水性溶剂添加于干燥后的上述混合物，再通过均质机等乳化机、超声波乳化机或高压喷射乳化机等进行乳化，由此能够制造本发明的脂质纳米粒子。另外，还可以通过已周知的制造脂质体的方法，例如反相蒸发法等进行制造。在想要控制脂质纳米粒子的大小的情况下，只要使用孔径一致的膜过滤器等，在高压下进行萃取(挤压过滤)即可。
本发明的脂质纳米粒子可以通过使用流道的醇稀释法来制造。作为用于制造的流道，可以为内置可实现两种液体瞬间混合的三维微型混合器的微型流道，但从能够形成粒径可控性高的纳米尺寸的脂质粒子形成系统方面考虑，优选使用如专利文献1中记载那样的单纯的二维结构的流道结构体，该流道结构体在流通原料溶液的微型尺寸的流道上，从两侧面交错配置有相对于流道宽度为一定宽度的挡板(扰流板)。
具体而言，优选使用如图1A所示的流道结构体(以下，有时称为“本发明的流道结构体”)。在其上游侧(附图左侧)，彼此独立的、导入第一流体的第一导入通道10、和导入第二流体的第二导入通道20分别具有一定长度并汇流，朝向其下游侧形成一个稀释流道30。所述稀释流道30至少在其一部分具有二维弯曲的流道部位50，该弯曲的流道部位50形成为：在将与弯曲的流道部位50相比更靠近上游处的稀释流道的轴线方向或其延长方向作为X方向，将与该X方向垂直相交的稀释流道的宽度方向作为Y方向，将与弯曲的流道部位50相比更靠近上游处的稀释流道的流道宽度作为y0的情况下，按照一定间隔d1、d2……设有至少两个以上构件40，该构件40交替地从在Y方向上相对的稀释流道的两侧壁面起朝向流道中心侧突出，以限制稀释流道的流道宽度，该构件40在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上具有1/2y0以上且小于1y0的一定高度h1、h2……，且在X方向上具有一定宽度x1、x2……。即，在存在所述构件40的部位，在X方向上的一定长度x1、x2……的区域，稀释流道的流道宽度y1、y2……被限制为1/2y0以下，特别是1/2y0以下且1/40y0以上。
需要说明的是，从概念上讲，如图1A所示及前面说明的那样，本发明的流道结构体的形状是在微型尺寸的流道上从两侧面交错配置有大致矩形的挡板，而实际上，并不限于这样通过在流道上配置独立的挡板来构成。即，只要能够以与通过配置这样的挡板所形成的流道相应的方式形成同样形状的流道，则构件40的构成没有特别限定，也可以使流道结构体的壁面(在保持大致固定的壁厚的同时)弯曲为规定形状，并一体形成，构成如前述所规定那样的弯折并扩张、收缩的二维结构的流道形状，以构成前述那样的构件40，当然，本发明的流道结构体也包括这样的方案。这样的二维结构的流道可以通过利用例如热塑性树脂、热固性树脂、紫外线固化树脂、金属或玻璃质材料等的注塑成型、铸造成形、利用三维打印机的成型等而较容易地形成。
第一导入通道10和第二导入通道20汇流后的稀释流道30的流道宽度y0也一定程度受想要形成的纳米尺寸的脂质粒子的粒径的大小影响，代表性地，优选设为20μm～1000μm左右，更优选设为100μm～200μm左右。为了获得所需的纳米尺寸，具体而言例如约10μm～100nm的粒径范围内的尺寸的粒径的脂质粒子，一定程度上，在如上所述那样的范围内的流道宽度y0内用稀释介质稀释脂质溶液是必要的条件。
另外，作为各构件40的高度h1、h2……(Y方向长度)，相对于与各构件40相比更靠近上游侧处的稀释流道30的流道宽度y0，采用1/2y0以上且小于1y0，优选采用1/2y0以上且39/40y0以下，进一步优选采用1/2y0以上且3/4y0以下，由于存在该各构件40，将流道宽度y1、y2……从与各构件40相比更靠近上游侧处的稀释流道30的流道宽度y0缩小为小于1/2y0且大于0的宽度。需要说明的是，在弯曲的流道部位50处设置的多个该构件40各自的高度h1、h2……不一定必须相同，只要满足上述的规定条件，则也可以彼此不同。由此形成的流道宽度y1、y2……也可以分别不同。例如，也可以是如下方案：随着往下游方向，各构件40各自的高度h1、h2……逐渐变长，流道宽度y1、y2……逐渐变窄。各构件40的高度h1、h2……(Y方向长度)是规定的高度，通过将存在各构件40的部位的流道宽度y1、y2……缩小为小于1/2y0的宽度，分子扩散的效率提高。
虽然也受想要获得的脂质粒子的大小、构件40的数量、各混合器构件40的宽度(X方向长度)x1、x2……、相邻的各构件40之间的间隔d1、d2……等其它条件影响，并不受特别限定，不过，具体而言，例如，在上游的稀释流道的流道宽度y0为200μm的情况下，该构件40各自的高度h1、h2……优选采用100μm以上且小于200μm。因此，存在各构件40的位置处的流道宽度y1、y2……为小于1/2y0且大于0的宽度，即小于100μm左右。
另外，作为各构件40的宽度(X方向长度)x1、x2……，虽然其也受想要获得的脂质粒子的大小、构件40的数量、各构件40的高度h1、h2……(Y方向长度)、相邻的各构件40间的间隔d1、d2……等其它条件影响，不过，相对于上游的稀释流道的流道宽度y0，优选采用1/10y0以上且5y0以下左右的长度。具体而言，例如，在上游的稀释流道的流道宽度y0为20μm～1000μm，代表性地为200μm的情况下，该构件40各自的宽度x1、x2……优选采用20μm～1000μm左右。各构件40各自的宽度x1、x2……不一定必须相同，只要满足上述的规定条件，则也可以分别不同。例如，也可以为随着往下游方向，宽度x1、x2……逐渐变长的方案。
另外，作为相邻的各构件40间的间隔d1、d2……，其也受想要获得的脂质粒子的大小、构件40的数量、各构件40的高度h1、h2……(Y方向长度)、各构件40的宽度(X方向长度)x1、x2……等其它条件影响，不过相对于上游的稀释流道的流道宽度y0，优选采用1/10y0以上且5y0以下左右的长度。具体而言，例如，在上游的稀释流道的流道宽度y0为20μm～1000μm，代表性地为200μm的情况下，相邻的各构件40间的间隔d1、d2……优选采用20μm～1000μm左右。相邻的各构件40间的间隔d1、d2……不一定必须相同，只要满足上述的规定条件，则也可以分别不同。例如，也可以为随着往下游方向，间隔d1、d2……逐渐变窄的方案。
需要说明的是，在本发明的流道结构体中，在将上游的稀释流道的轴线方向或其延长方向作为X方向，将与该X方向垂直相交的稀释流道的宽度方向作为Y方向的情况下，如上所述，各构件40交替地从两侧壁面朝向流道中心侧沿大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)延长，且具有与流道方向(X方向)成大致直角的壁面，该角度不一定为严格的90°，即使一定程度倾斜也能够形成有效的结构，并没有特别限定，具体而言，例如，只要在30°～150°左右，更优选40°～140°，特别优选80°～100°的范围内，则是容许的。并且，作为各构件40的流道中心侧的角部的形状，也容许一定程度的圆角，并没有特别限定，例如有些情况下只要为R50μm以下，更优选为R20μm以下，则是容许的。然而，在获得可控性高且均匀的纳米尺寸的脂质粒子方面，优选这些公差尽可能较小。另外，在图1A所示的实施方式中，为了方便起见，流道结构体的上游的稀释流道的轴线方向或其延长方向即X方向呈现为直线状，但该X方向仅表示稀释流道的轴线方向，实际上并不限于这样的直线状，例如可以为具有某一曲率地弯曲的形状。需要说明的是，在这样的情况下，与该X方向垂直相交的稀释流道的宽度方向即Y方向是指与其单位长度的部位处的X方向垂直的方向。
另外，由于本发明的流道结构体如上所述那样为二维结构的流道结构体，因此作为该流道的深度方向(图1A中的纸厚方向)的尺寸，其没有特别限定，例如优选为10μm～1000μm左右，更优选为50μm～200μm左右。
作为通过醇稀释法制造本发明的脂质纳米粒子时所使用的流道，只要其为图1A所示的流道结构体中的稀释流道30能够产生三维流的流道，则不受特别限定。例如，本发明的流道结构体也可以是在稀释流道30的至少一部分通过形成于流道壁面的凹槽或微小突起代替二维弯曲的流道部位50来形成混沌流的混沌微型混合器(交叉人字形混合器)(非专利文献8)。
如图1A所示，在本发明的流道结构体中，导入第一流体的第一导入通道10和导入第二流体的第二导入通道20分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道的情况下，分别从第一导入通道导入使脂质成分溶解于乙醇而成的脂质溶液，从第二导入通道导入含有Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA及ssON的水溶液(含RNP的水溶液)。在稀释流道中，脂质溶液被含RNP的水溶液稀释，在该过程中，制得负载有RNP的脂质纳米粒子。
本发明的流道结构体只要具有彼此独立的多个导入通道，且这些导入通道分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道即可，也可以具有三个导入通道。在本发明的流道结构体具有三个导入通道的情况下，第一导入通道、第二导入通道及第三导入通道可以分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道，以使从第一导入通道导入的第一流体在与从第二导入通道导入的第二流体汇流之前，与从第三导入通道导入的第三流体接触。
例如，在如图1B所示，在将向稀释流道30汇合的汇流地点彼此距离最远的导入通道作为第一导入通道10和第二导入通道20，将剩余的导入通道作为第三导入通道60的情况下，分别从第一导入通道10导入使脂质成分溶解于乙醇而成的脂质溶液，从第二导入通道20导入含RNP的水溶液，从第三导入通道60导入用于制备含RNP的水溶液的水性溶剂。从第一导入通道10导入的脂质溶液首先与从第三导入通道60导入的水性溶剂汇流，然后与从第二导入通道20导入的含RNP的水溶液汇流。由于避免了含RNP的水溶液与作为高浓度的乙醇溶液的脂质溶液直接接触，因此，能够抑制含RNP的水溶液中的蛋白质在稀释流道30、特别是其入口附近因高浓度乙醇而凝聚。
本发明的流道结构体中的稀释依赖于分子扩散。作为原料的脂质溶液的稀释速度越快，则生成的脂质粒子的尺寸越小。因此，通过调节构件(挡板)的宽度及长度、配置，能够控制原料溶液的稀释速度，能够形成粒径可控性比以往更高的脂质纳米粒子。
含RNP的水溶液能够通过将Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA及ssON溶解于水性溶剂来制备。该水性溶剂是能够在保持基因组编辑活性的状态下将RNP混合于脂质溶液的水性溶剂，且只要制造出的脂质纳米粒子能够稳定分散，就没有特别限定。作为该水性溶剂，可以列举例如：磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲生理食盐液等缓冲液、生理盐水、用于细胞培养的培养基等。这些水性溶剂(分散介质)可以进一步加入葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等单糖类；乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类；棉籽糖、松三糖等三糖类；环糊精等多糖类；赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等糖醇；甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇等。
若含RNP的水溶液的pH低，则制造的负载有RNP的脂质纳米粒子的基因组编辑活性可能降低。因而，含RNP的水溶液的pH优选5.0以上，更优选在5.0～8.5的范围内，进一步优选在5.0～8.0的范围内，更进一步优选在5.0～7.5的范围内。另外，含RNP的水溶液的pH也优选在6以上，更优选在6～8.5的范围内，进一步优选在6～8的范围内，更进一步优选在6～7.5的范围内。
脂质溶液与含RNP的水溶液的流速比会影响脂质溶液的稀释速度，进而影响生成的脂质粒子的尺寸。在制造本发明的脂质纳米粒子时，从制造平均粒径充分小、被靶细胞摄取的摄取效率高的脂质纳米粒子方面考虑，含RNP的水溶液的流速相对于脂质溶液的流速的比优选为7以上，更优选为7～10，进一步优选为7～9。
脂质溶液与含RNP的水溶液的总流量不受特别限定，可以在1μL/分钟～100mL/分钟的范围内适当调节。制造本发明的脂质纳米粒子时，脂质溶液与含RNP的水溶液的总流量优选在50μL/分钟～1mL/分钟的范围内，更优选在50μL/分钟～800μL/分钟的范围内，进一步优选在50μL/分钟～600μL/分钟的范围内，更进一步优选在50μL/分钟～500μL/分钟的范围内。
本发明的脂质纳米粒子是输送用于对靶细胞进行基因组编辑的RNP的载体。通过向靶细胞内导入本发明的脂质纳米粒子，能够进行基因组编辑。在靶细胞为培养细胞的情况下，将本发明的脂质纳米粒子添加到培养基。在靶细胞为动物体内的细胞的情况下，将本发明的脂质纳米粒子向动物进行给药。给药途径不受特别限定，优选为静脉给药、肠内给药、肌内给药、皮下给药、经皮给药、经鼻给药、经肺给药等非经口给药。
施用本发明的脂质纳米粒子的动物没有特别限定，可以为人，也可以为人以外的动物。作为非人动物，可列举：牛、猪、马、绵羊、山羊、猴、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等哺乳动物、及鸡、鹌鹑、鸭等鸟类等。
实施例
接下来将示出实施例以进一步对本发明进行详细说明，但本发明不限定于以下的实施例。
[参考例1]
对用于使用包含如图1A所示那样的流道结构体的制造装置来制备负载有RNP的脂质纳米粒子的条件进行探讨。具体而言，探讨了溶解RNP的缓冲液的pH、RNP溶液相对于乙醇的流速比(flow rate ratio，即FRR)、及乙醇和RNP溶液的总流速(total flow rate，即TFR)。
图2中示意性示出了实际使用的制造装置的结构。图2的(A)是整体的结构的示意图，图2的(B)是内置有混合器的微型流道(流道结构体)的立体图，图2的(C)是稀释流道104c的一部分的放大图。如图2的(A)所示，将负载有脂质溶液的注射器101、和负载有RNP溶液的注射器102分别设置于流量控制装置103，通过软管105将其连接于内置有混合器的微型流道104的第一导入通道的注入口104a和第二导入通道的注入口104b，通过软管105将稀释流道104c的出口104d连接于回收所制造的脂质纳米粒子的回收容器106。
在探讨该条件时，为了排除脂质的影响，使用乙醇来代替脂质溶液。另外，作为RNP溶液，使用将来自化脓性链球菌的Cas9蛋白(160kDa)(产品名：“Alt-RS.p.Cas9 NucleaseV3”，IntegratedDNA technologies公司制)、包含与GFP(green fluorescent protein)基因中的靶序列(序列号1，20碱基长度)互补的碱基序列的crRNA(序列号2，36碱基长度，第1～20个区域为与靶序列互补的碱基序列。)、及tracrRNA(序列号3，67碱基长度)以摩尔比1：1：1溶解于缓冲液而得到的溶液(RNP溶液)。crRNA和racrRNA通过以稳定表达GFP的HeLa(HeLa-GFP)细胞的基因组DNA为模板的PCR进行扩增而得到。pH 6的缓冲液使用MES缓冲液(20mM MES，50mM NaCl，pH 6.0)，pH 4.0、pH 5.0或pH 5.5的缓冲液使用柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸，50mM NaCl，pH 4.0，pH 5.0，或pH 5.5)。
将RNP溶液和乙醇分别供液至图2中记载的制造装置的微型流道内，然后回收从稀释流道排出的溶液，放入透析膜(MWCO：12,000-14,000)，在PBS(-)中于4℃下进行2小时以上透析，由此，置换缓冲液，除去醇。通过荧光胺将透析后的RNP溶液的Cas9蛋白浓度定量之后，按照以Cas9蛋白的量换算达到2或5当量(摩尔比)的方式，将该RNP溶液混合于包含靶序列的双链DNA(dsDNA)(序列号4，0.25pmol)，在37℃下使其反应1小时。将反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并评价DNA切断效率。将未混合RNP的dsDNA作为阴性对照，将未通入微型流道内的RNP加入dsDNA中而得到的样品作为阳性对照。针对各样品，算出将阳性对照中向靶dsDNA中加入5当量的RNP而得到的样品中的切断活性作为1时的相对切断活性。定量分析使用图像分析软件Image J。
用pH 6.0的缓冲液制备RNP溶液，FRR设为9.0，TFR设为50～500μL/分钟的范围进行实验，并调查TFR的影响。将结果示于表1。表中，“N.C.”表示阴性对照的结果，“P.C.”表示阳性对照的结果。如表1所示，在所有总流速下均具有与阳性对照相同程度的切断活性，未见总流速对DNA切断活性的影响，因此，在后面的实验中，采用了混合速度更大的500μL/分钟。
[表1]
Figure BDA0003459242970000241
用pH 6.0的缓冲液制备RNP溶液，TFR设为500μL/分钟，FRR设为3.0～9.0的范围进行实验，调查FRR的影响。将结果示于表2。如表2所示，FRR在5.0以下的范围时，随着FRR的降低可见DNA切断活性降低。另一方面，在FRR为7.0以上的范围时，显示出与阳性对照相同程度的活性，未见向微型流道供液的影响。根据该结果，在后面的实验中，FFR采用9.0。
[表2]
Figure BDA0003459242970000242
TFR设为500μL/分钟，FRR设为9.0，制备RNP溶液的缓冲液的pH设为4.0～6.0的范围进行实验，调查RNP溶液的pH的影响。将结果示于表3。如表3所示，pH 6.0时，维持与阳性对照相同程度的DNA切断活性，另一方面，pH 5.5以下的范围时，随着pH的降低可见DNA切断活性显著降低。根据该结果，在后面的实验中，RNP溶液的制备采用pH 6.0的缓冲液。
[表3]
Figure BDA0003459242970000251
[参考例2]
调查是否可以使用负载有混沌混合器的制造装置来制造本发明的脂质纳米粒子。具体而言，探讨了溶解RNP的缓冲液的pH、RNP溶液相对于乙醇的流速比(FRR)、及乙醇和RNP溶液的总流速(TFR)。使用参考例1中使用的制造装置中内置有混合器的微型流道104为图3中记载的内置有混沌混合器的微型流道107的制造装置来制造脂质纳米粒子。图3的(A)为内置有混沌混合器的微型流道(流道结构体)的立体图，图3的(B)为稀释流道107c的一部分的放大图。
探讨该条件时，与参考例1相同地，为了排除脂质的影响，使用乙醇代替脂质溶液，作为RNP溶液，使用将来自化脓性链球菌的Cas9蛋白(160kDa)、包含与GFP基因中的靶序列(序列号1，20碱基长度)互补的碱基序列的crRNA(序列号2，36碱基长度)、及tracrRNA(序列号3，67碱基长度)按照摩尔比1：1：1溶解于缓冲液而得到的溶液(RNP溶液)。pH 6～pH 6.6的缓冲液使用MES缓冲液(20mM MES，50mM NaCl，pH 6.0)，pH 5.5的缓冲液使用柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸，50mM NaCl，pH 5.5)。
在TFR为500μL/分钟，FRR为9的条件下，将RNP溶液和乙醇供液至图3中记载的制造装置的微型流道内，回收从稀释流道排出的RNP溶液，与参考例1相同地进行透析。与参考例1相同地，按照以Cas9蛋白的量换算达到5当量(摩尔比)的方式，将透析后的RNP溶液混合于dsDNA，在37℃下使其反应1小时，并评价DNA切断效率。针对各样品，算出将向靶dsDNA加入5当量的RNP而得到的阳性对照的切断活性设为1时的相对切断活性。将结果示于表4。与参考例1相同地，pH 6.0时，维持了与阳性对照相同程度的DNA切断活性，另一方面，pH 5.5时，可见DNA切断活性显著降低。
[表4]
pH 5.5 6.0 6.2 6.4 6.6
相对切断活性 0.46 1.01 0.93 0.95 0.88
用pH 6.0的缓冲液制备RNP溶液，TFR设为500μL/分钟，FRR设为5.0、7.0或9.0，进行相同的试验，调查FRR的影响。将结果示于表5。FRR为5.0时，DNA切断活性略微降低，而FRR为7.0以上的范围时，显示出与阳性对照相同程度的活性，未见向微型流道供液的影响。
[表5]
FRR 5 7 9
相对切断活性 0.83 0.94 1.00
由这些结果可知，作为本发明的脂质纳米粒子，即使在使用图3中记载的制造装置的情况下，也能够在与使用图2中记载的制造装置的情况相同的条件下制造脂质纳米粒子。即，提示了在制造本发明的脂质纳米粒子时，对混合器结构的选择性低。
[实施例1]
制造了负载有用于GFP基因敲除的RNP的、脂质组成不同的脂质纳米粒子，调查了对于HeLa-GFP细胞的GFP敲除活性。另外，还制造了负载有用于将GFP基因变为BFP(bluefluorescent protein)基因即用于进行敲入的RNP的、脂质组成不同的脂质纳米粒子，调查了对于HeLa-GFP细胞的GFP敲入活性。使用参考例1中使用的制造装置来制造脂质纳米粒子。
作为脂质纳米粒子的构成脂质，使用CL4H6(pKa～6.25，专利文献2)作为pH敏感性阳离子型脂质，使用1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)作为中性磷脂，使用胆固醇(chol)及1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)作为其它脂质。
[化学式7]
Figure BDA0003459242970000271
制造脂质纳米粒子时使用表6中记载的五种脂质组成的脂质成分。
[表6]
脂质组成[mol％]
10％(DSPC) CL4H6/chol/DSPC/PEG-DMG＝50/40/10/2.5
20％(DSPC) CL4H6/chol/DSPC/PEG-DMG＝50/30/20/2.5
10％(DOPE) CL4H6/chol/DOPE/PEG-DMG＝50/40/10/2.5
20％(DOPE) CL4H6/chol/DOPE/PEG-DMG＝50/30/20/2.5
0％ CL4H6/chol/DSPC/PEG-DMG＝50/50/0/2.5
Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA使用与参考例1中使用的物质相同的物质。
在制造用于进行GFP敲除的RNP时，作为用于GFP敲除的ssON，使用由与包含靶序列(序列号1)的基因组DNA的部分区域相同的碱基序列构成的132碱基长度的DNA(序列号5，第68～87个区域是与靶序列相同的碱基序列)。
在制造用于进行从GFP变为BFP的敲入的RNP时，作为用于BFP敲入的ssON，使用向用于敲除的ssON的3个碱基(第65、第67、及第72个碱基)导入变异后的DNA(序列号6)。若通过导入变异序列，同源依赖性修复(homology-dependent repair；HDR)路径起作用，则构成GFP的荧光团的氨基酸(苏氨酸-酪氨酸-甘氨酸)被构成BFP的荧光团的氨基酸(丝氨酸-组氨酸-甘氨酸)取代。
<GFP敲除活性的测定>
将160nM Cas9蛋白、160nM crRNA、160nM tracrRNA和160nM ssON溶解于参考例1中使用的pH 6.0的缓冲液，从而制备RNP溶液，并填充到连接于第二导入通道的注入口104b的注射器102。另外，将脂质的乙醇溶液(总脂质：8.20mM)填充到连接于第一导入通道的注入口104a的注射器101。在FRR为9.0、TFR为500μL/分钟的供液条件下供液至微型流道内，从而制造负载有RNP的脂质纳米粒子。将制造的负载有RNP的脂质纳米粒子与参考例1同样地进行透析之后，使用粒度测量仪“zetasizer nano ZS ZEN3600”(Marvern制)，通过动态光散射法，测定个数平均粒径(nm)、多分散指数(polydispersity index；PdI)及ζ电位(mV)(n＝3，Mean±SD)。另外，用Ribogreen assay(Thermo Fisher Scientific公司制)测定gRNA和ssON包封到脂质纳米粒子的包封率(％)及在脂质纳米粒子溶液中的浓度(n＝3，Mean±SD)。由gRNA及ssON在脂质纳米粒子溶液中的浓度的测定值，算出利用图3中记载的装置进行稀释及通过透析进行纯化后所回收的核酸总量相对于用于制造负载有RNP的脂质纳米粒子的gRNA及ssON的总量的比例(回收率：％)。
[表7]
Figure BDA0003459242970000281
将测定结果示于表7。在DOPE含量为20％的组成的脂质纳米粒子中，可见粒径小，包封率高的倾向。
将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度达到0.3nM、1nM或5nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，于再一天后回收细胞，通过流式细胞分析测定GFP敲除效率(％)(未发出GFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。作为比较对象，使用有记录用于导入RNP的市售的转染试剂“Lipofectamine RNAiMAX”(Thermo Fisher Scientific公司制)。
将各负载有RNP的脂质纳米粒子的GFP敲除效率(％)的测定结果(n＝3，Mean±SD)示于图4。中性磷脂含量越多，显示出越高的敲除活性。另外，包含DOPE作为中性磷脂的负载有RNP的脂质纳米粒子显示出比包含DSPC的负载有RNP的脂质纳米粒子更高的敲除活性。另外，中性磷脂含量多或包含DOPE作为中性磷脂的负载有RNP的脂质纳米粒子显示出比“Lipofectamine RNAiMAX”更高的敲除活性。
<GFP敲入活性的测定>
使用用于敲入的ssON代替用于GFP敲除的ssON，并将脂质组成设为DSPC含量为20％(表6中，“20％(DSPC)”)或DOPE含量为20％(表6中，“20％(DOPE)”)，除此之外，同样地制造负载有RNP的脂质纳米粒子。将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度为0.3nM、1nM或5nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，然后，于再一天后回收细胞，通过流式细胞分析测定敲入效率(％)(发出BFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。BFP与GFP相比荧光波长在短波长侧，因此通过敲入而GFP基因变为BFP基因的细胞可以通过流式细胞分析来定量识别。针对各负载有RNP的脂质纳米粒子，求得敲入效率(％)相对于敲除效率(％)的比([KI(％)]/[KO(％)])，并将结果示于图5。其结果，在使用导入了变异的ssON的情况下，所有负载有RNP的脂质纳米粒子均显示出4％～5％的基因敲入效率。
[实施例2]
调查脂质纳米粒子的制剂处方对基因敲除活性带来的影响。
<初筛>
作为探讨项目，采用pH敏感性阳离子型脂质(CL)含量(30mol％、40mol％、50mol％)、中性磷脂(PL)含量(20mol％、35mol％、50mol％)、PEG-DMG含量(1mol％、2.5mol％、4mol％)，pH敏感性阳离子型脂质的种类(CL4H6或CL15H6(pKa～7.25，专利文献2))，中性磷脂的种类(DSPC或DOPE)、以及RNP/脂质比(1.8×10-4mol、2.7×10-4mol、3.6×10-4mol)这六个因子。
针对连续变量选出三个水平，针对分类因子选出2个水平，在全部324种组合之中，通过作为实验设计法(Design of Experiment；DoE)之一的确定性筛选设计，选出表8中记载的14种处方。脂质组成采用pH敏感性阳离子型脂质(CL)：中性磷脂(PL)：胆固醇：PEG-DMG＝X：Y：(100-X-Y)：Z(mol％)(X：表8中的“CL[％]”栏的数值，Y：表8中的“PL[％]”栏的数值)。
[表8]
Figure BDA0003459242970000301
[化学式8]
Figure BDA0003459242970000302
将脂质成分、脂质、及RNP的比率设为表8的处方，除此之外，与实施例1中的用于GFP敲除的负载有RNP的脂质纳米粒子同样地制造用于GFP敲除的负载有RNP的脂质纳米粒子。与实施例1相同地测定了所得到的负载有RNP的脂质纳米粒子的个数平均粒径(nm)、PdI、以及gRNA和ssON包封到脂质纳米粒子的包封率(％)。
另外，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度为0.1nM、0.5nM或2nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，于再三天后回收细胞，与实施例1相同地，通过流式细胞分析测定GFP敲除效率(％)。将结果示于表9。另外，将GFP敲除效率(％)的测定结果示于图6。
[表9]
Figure BDA0003459242970000311
对个数平均粒径进行统计分析。将显著影响个数平均粒径的主效果及两个因子之间相互作用的结果示于表10，将改变显著影响个数平均粒径的因子时的个数平均粒径的预测曲线示于图7。作为显著影响粒径的因子，检测到了pH敏感性阳离子型脂质含量、PEG-DMG含量、pH敏感性阳离子型脂质的种类、以及中性磷脂。更详细而言，明确了通过增加pH敏感性阳离子型脂质含量，或者使PEG-DMG含量为2.5mol％左右，或者使用CL4H6作为pH敏感性阳离子型脂质，或者使用DOPE作为中性磷脂，能够进行控制以减小粒径。特别地，明确了PEG脂质量和中性磷脂的种类是影响较大的因子。
[表10]
Figure BDA0003459242970000321
对包封率同样地进行统计分析。将显著影响包封率的主效果及两个因子间的相互作用的结果示于表11，将改变显著影响包封率的因子时的包封率的预测曲线示于图8。其结果表明，全部因子均显著影响包封率。更详细而言，明确了通过增加pH敏感性阳离子型脂质含量，增加中性磷脂含量，减少PEG-DMG含量，使用CL15H6作为pH敏感性阳离子型脂质，使用DOPE作为中性磷脂，以及降低RNP/脂质比，将提高包封率。中性磷脂的种类是影响最大的因子。
[表11]
Figure BDA0003459242970000322
Figure BDA0003459242970000331
对基因敲除活性(％)同样地进行统计分析。将显著影响基因敲除活性(％)的主效果及两个因子间的相互作用的结果示于表12，将改变显著影响基因敲除活性(％)的因子时的基因敲除活性(％)的预测曲线示于图9。PEG-DMG含量、pH敏感性阳离子型脂质的种类、以及中性磷脂的种类被鉴定为是对敲除活性带来显著影响的因子。更详细而言，明确了通过使PEG-DMG含量为1mol％左右，pH敏感性阳离子型脂质为CL4H6，中性磷脂为DOPE，将提高基因敲除活性。特别地，阳离子型脂质的种类及中性磷脂的种类是影响较大的因子。
[表12]
Figure BDA0003459242970000332
实际上，在满足提高基因敲除活性的条件的处方A-7及A-11的处方中，与其它脂质纳米粒子相比显示出更高的敲除活性(图6)，RNP的IC50(50％抑制浓度)为0.1nM以下(Cas9蛋白浓度换算)。另外，最大敲除效率达到95％以上(图6)。
<二次筛选>
在初筛的结果的基础上，进行二次筛选。通过与初筛相同的试验系统进行评价。
作为探讨项目，设置pH敏感性阳离子型脂质(CL)含量(30mol％、40mol％、50mol％)、中性磷脂(PL)含量(20mol％、35mol％、50mol％)、及PEG-DMG含量(1.0mol％、2.0mol％、3.0mol％)三个因子三个水平，在全部27种组合之中，通过确定性筛选设计选出表13中记载的9种处方。脂质组成采用pH敏感性阳离子型脂质(CL)：中性磷脂(PL)：胆固醇：PEG-DMG＝X：Y：(100-X-Y)：Z(mol％)(X：表13中的“CL[％]”栏的数值，Y：表13中的“PL[％]”栏的数值)。pH敏感性阳离子型脂质使用CL4H6，中性磷脂使用DOPE。
[表13]
Figure BDA0003459242970000341
将脂质成分、脂质及RNP的比率设为表13的处方，除此之外，与初筛同样地制造用于GFP敲除的负载有RNP的脂质纳米粒子，测定所得到的负载有RNP的脂质纳米粒子的个数平均粒径(nm)、PdI、以及gRNA和ssON包封到脂质纳米粒子的包封率(％)。再与初筛同样地，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到HeLa-GFP细胞，测定GFP敲除效率(％)。将结果示于表13。
对个数平均粒径进行统计分析。将显著影响个数平均粒径的主效果的结果示于表14，将改变显著影响个数平均粒径的因子时的个数平均粒径的预测曲线示于图10。明确了通过增加PEG脂质量，能够进行控制以减小粒径。
[表14]
Figure BDA0003459242970000342
针对包封率同样地进行统计分析。将显著影响包封率的主效果的结果示于表15，将改变显著影响包封率的因子时的包封率的预测曲线示于图11。其结果表明，通过增加pH敏感性阳离子型脂质含量，增加中性磷脂含量，或减少PEG-DMG含量，将提高包封率。
[表15]
Figure BDA0003459242970000351
针对基因敲除活性(％)同样地进行统计分析。将显著影响基因敲除活性(％)的主效果的结果示于表16，将改变显著影响基因敲除活性(％)的因子时的基因敲除活性(％)的预测曲线示于图12。明确了通过减少PEG-DMG含量或将pH敏感性阳离子型脂质含量增加至40mol％以上，将提高基因敲除活性。
[表16]
Figure BDA0003459242970000352
由这些结果可知，通过使用CL4H6作为pH敏感性阳离子型脂质，且使其含量为40mol％～50mol％，使用DOPE作为中性磷脂，且使其含量为20mol％～50mol％，使PEG脂质量为1.5mol％～2.0mol％，使RNP/脂质比为3.6×10-4mol以上，得到了良好的负载有RNP的脂质纳米粒子，其个数平均粒径小，RNP的包封效率高，基因敲除活性(％)也较高。
[实施例3]
针对实施例2中制造的负载有RNP的脂质纳米粒子B-4及B-9，调查了细胞毒性及储存稳定性。
<细胞毒性的评价>
将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度为0.3nM、0.5nM或1nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经一天后，进行WST-8检测。WST-8检测使用细胞数测定用试剂盒(产品名：“Cell Counting Kit-8”，同仁化学公司制)来进行。将PBS(-)代替负载有RNP的脂质纳米粒子添加到HeLa-GFP细胞的培养基而得到的细胞作为对照，同样地进行WST-8检测。
算出添加了各负载有RNP的脂质纳米粒子后的细胞的细胞存活率([添加了负载有RNP的脂质纳米粒子后的细胞的WST-8检测的测定值]/[对照细胞的WST-8检测的测定值]×100：％)。将结果示于图13。无论负载有RNP的脂质纳米粒子的量多少，导入负载有RNP的脂质纳米粒子B-4及B-9后的细胞的细胞存活率均大致为100％。即，这些负载有RNP的脂质纳米粒子在HeLa细胞中未显示出显著的细胞毒性。
<储存稳定性的评价>
将与实施例2同样地制造的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9在4℃下储存，并调查储存后的物性和敲除活性。具体而言，经时测定了Zeta电位和PdI。另外，将4℃储存前和4℃下储存两周后的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9添加到培养基，使Cas9蛋白浓度为0.3nM，由此导入HeLa-GFP细胞，并调查GFP敲除活性。与实施例1同样地测定了Zeta电位、PdI以及GFP敲除活性。
将Zeta电位和PdI的测定结果示于图14，将GFP敲除活性的测定结果示于图15。其结果，通过将负载有RNP的脂质纳米粒子B-9在4℃下储存，制造后至少两周内，物性和敲除活性这二者维持与储存前相同程度的状态。由这些结果确认，本发明的负载有RNP的脂质纳米粒子具有足以实用的储存稳定性。
[实施例4]
调查了负载于负载有RNP的脂质纳米粒子的ssON的碱基长度对敲除活性的影响。
作为用于GFP敲除的ssON，使用实施例2中也使用了的132碱基长度的DNA(序列号5)、20碱基长度的DNA(与序列号5的第68～87个区域相同的碱基序列)、60碱基长度的DNA(与序列号5的第48～107个区域相同的碱基序列)、或由60碱基长度的DNA得到的RNA(序列号7)。
首先，作为ssON，使用132碱基长度的DNA、20碱基长度的DNA、60碱基长度的DNA、或60碱基长度的RNA，除此之外，与实施例2同样地制造负载有RNP的脂质纳米粒子B-9及B-4。接下来，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度达到0.1nM或0.3nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，再培养3天后回收细胞，通过流式细胞分析测定GFP敲除效率(％)(未发出GFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。将以使Cas9蛋白浓度达到0.1nM的方式导入了负载有RNP的脂质纳米粒子的细胞的结果示于图16A，将以使Cas9蛋白浓度为0.3nM的方式导入了负载有RNP的脂质纳米粒子的细胞的结果示于图16B。
其结果，在负载有RNP的脂质纳米粒子B-4及B-9中，均观察到ssON的碱基长度越长，基因敲除活性越增大的倾向。另外，在相同碱基长度的情况下，还观察到与ssON为DNA的情况相比，ssON为RNA的情况下敲除活性更高的倾向。
[实施例5]
制造代替Cas9而负载有RNA依赖性DNA核酸酶Cpf1的脂质纳米粒子，并调查其基因敲除活性。
首先，使用Cpf1蛋白(产品名：“Alt-RA.s.Cas12a(Cpf1)Ultra”，Integrated DNAtechnologies公司制)来代替Cas9蛋白，使用41碱基长度的RNA(序列号8)或100碱基长度的RNA(序列号9)作为gRNA来代替参考例1中使用的crRNA和tracrRNA，使用120碱基长度的RNA(序列号10)或60碱基长度的RNA(与序列号10的第27～86个区域相同的碱基序列。序列号11)作为ssON，除此之外，与实施例2同样地制造负载有RNP的脂质纳米粒子B-9。接下来，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cpf1蛋白浓度达到0.5nM、1nM或2nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，再培养3天后回收细胞，通过流式细胞分析测定GFP敲除效率(％)(未发出GFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。
将GFP敲除效率的测定结果示于图17。图中，“NT”表示通过未添加负载有RNP的脂质纳米粒子的培养基所培养的细胞的结果。“gGFP”表示通过未添加使用41碱基长度的RNA(序列号8)的负载有RNP的脂质纳米粒子的培养基所培养的细胞的结果，“gGFP+59”表示通过未添加使用100碱基长度的RNA(序列号9)的负载有RNP的脂质纳米粒子的培养基所培养的细胞的结果。“ssON”栏中，“-”表示通过未添加不含ssON的搭载有RNP的脂质纳米粒子的培养基所培养的细胞的结果。另外，0.5nM、1nM、2nM的各柱分别表示以使Cpf1蛋白浓度达到0.5nM、1nM或2nM的方式将负载有RNP的脂质纳米粒子添加到培养基的细胞的结果。
如图17所示，与使用Cas9蛋白的情况相同地，向RNP中加入ssON，由此改善了GFP敲除活性。另外，观察到所添加的ssON的碱基长度越长，敲除活性越增大的倾向。这些结果表明，本发明的脂质纳米粒子不仅可以作为CRISPER/Cas9系统中的导入RNP的载体，还可以作为CRISPER/Cpf1系统中的导入RNP的载体。
[实施例6]
作为减少Cas9导致的脱靶效应(向非靶gRNA区域导入变异)的方法，已知有将使RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的一者失活后的Cas9切口酶(Cas9n)2对组合使用的双切刻(double-nicking)法。制造用于该双切刻法的负载有RNP的脂质纳米粒子，并调查其基因敲除活性。
首先，使用Cas9n蛋白(产品名：“Alt-R S.p.Cas9 D10A Nickase V3”，IntegratedDNA technologies公司制)来代替Cas9蛋白，使用参考例1中使用的tracrRNA、包含与GFP基因中的第一靶序列互补的碱基序列的crRNA(序列号12，36碱基长度)、以及包含与第二靶序列互补的碱基序列的crRNA(序列号13，36碱基长度)作为gRNA，，不使用ssON，除此之外，与实施例2同样地制造负载有RNP的脂质纳米粒子B-9。作为比较对象，与实施例2同样地，制造负载了包含Cas9蛋白的RNP的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9。
接下来，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9n蛋白或Cas9蛋白的浓度达到0.1nM、0.3nM、1或2nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，再培养3天后回收细胞，通过流式细胞分析测定GFP敲除效率(％)(未发出GFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。
将测定结果示于图18。负载了Cas9n蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子也与负载了Cas9蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子同样地具有高GFP敲除活性。特别是，在以使Cas9n蛋白浓度为2nM的方式进行添加的细胞中，GFP敲除效率为98％。由该结果表明，本发明的特定的脂质组成的脂质纳米粒子可以用作在使用Cas9n蛋白的双切刻(double-nicking)法中导入RNP的载体，并表明，使该双切刻(double-nicking)法中的RNP中进一步含有与每个gRNA杂交的ssON而得到的RNP，也可以用作在双切刻(double-nicking)法中导入RNP的载体。
[实施例7]
将实施例2中制造的负载有RNP的脂质纳米粒子B-4及B-9导入稳定表达GFP的HEK(HEK-GFP)细胞，并调查敲除活性、敲入活性以及细胞毒性。
<GFP敲除活性的测定>
首先，与实施例2同样地制造用于GFP敲除的包含ssON的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9及B-4。接下来，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HEK-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度到达0.5nM、1nM、3nM或5nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经三天后更换培养基，于再三天后回收细胞，通过流式细胞分析测定敲除效率(％)(未发出GFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。将测定结果示于图19A。无论是导入负载有RNP的脂质纳米粒子B-9和B-4中哪一种的细胞，最大敲除效率均为约97％。
<GFP敲入活性的测定>
首先，使用实施例1中使用的用于GFP敲入的ssON代替用于GFP敲除的ssON，除此之外，与实施例2同样地制造负载有RNP的脂质纳米粒子B-9及B-4。接下来，与前述GFP敲除活性的测定同样地，将各负载有RNP的脂质纳米粒子导入HEK-GFP细胞并进行培养，然后回收并进行流式细胞分析，测定敲入效率(％)(发出BFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。将测定结果示于图19B。无论是导入负载有RNP的脂质纳米粒子B-9及B-4中的哪一种的细胞，最大敲入效率均为约23％。
<细胞毒性>
将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HEK-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度达到0.5nM、1nM、2nM、3nM、4nM或5nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经一天后，与实施例3同样地进行WST-8检测，测定细胞存活率(％)。将结果示于图20。无论负载有RNP的脂质纳米粒子的量多少，导入负载有RNP的脂质纳米粒子B-4及B-9后的细胞的细胞存活率均大致为100％。即，这些负载有RNP的脂质纳米粒子在HEK细胞中也与HeLa细胞同样地，未显示出显著的细胞毒性。
[实施例8]
将实施例2中制造的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9导入持续表达GFP的来自骨髄的巨噬细胞(BMDM)，调查GFP敲除活性。
<持续表达GFP的BMDM>
持续表达GFP的BMDM使用的是从持续表达GFP的小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠)(雌，6周龄)中回收的BMDM。具体而言，从持续表达GFP的小鼠的股骨及胫骨中采集骨髄细胞，并使其通过40μm细胞滤网，然后使用增溶缓冲液(产品名：“ACK lysing buffer”，Gibco公司制)除去红细胞。接下来，将该骨髄细胞用包含重组小鼠M-CSF(最终浓度：50ng/mL，BioLegend公司制)及灭活FBS(最终浓度：10％)的培养基培养7天，由此得到BMDM。
<GFP敲除活性的测定>
首先，与实施例2同样地，制造包含用于GFP敲除的ssON的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9。接下来，将负载有RNP的脂质纳米粒子添加到正在培养BMDM的培养基，使Cas9蛋白浓度达到8nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经一天后更换培养基，于再两天后回收细胞，并进行流式细胞分析。
将导入负载有RNP的脂质纳米粒子前的BMDM的流式细胞分析的结果示于图21(A)，将导入负载有RNP的脂质纳米粒子后的BMDM的流式细胞分析的结果示于图21(B)。导入负载有RNP的脂质纳米粒子前的BMDM，几乎全部细胞发出GFP的荧光，而导入负载有RNP的脂质纳米粒子后的BMDM，未发出GFP荧光的细胞的比例增大。这些结果表明，对于从生物体中采集的细胞，本发明的脂质纳米粒子也可以用作导入用于基因组编辑等的RNP的载体。
[实施例9]
使用将参考例1等中使用的图2中记载的制造装置的内置有混合器的微型流道104替换为具有如图1B所示那样的三个导入通道的流道107的装置，制造负载有RNP的脂质纳米粒子，并调查物性和GFP敲除活性。
<负载有RNP的脂质纳米粒子B-9的制造>
与图1B同样地，从第一导入通道(图中，上方的导入通道)导入脂质的乙醇溶液，从第二导入通道(图中，下方的导入通道)导入RNP溶液，从第三导入通道(图中，中间的导入通道)导入PBS(-)，使各自的FRR(流速比：[脂质的乙醇溶液的流速(x)]/[PBS(-)的流速(y)]/[RNP溶液的流速(z)])达到如表17中所记载的，除此之外，与实施例2同样地制造负载有RNP的脂质纳米粒子B-9。需要说明的是，表17中，在FRR为x/y/z＝9/0/1的情况下，使用参考例1中使用的两个导入通道的制造装置来制造。
与实施例1同样地测定所得到的负载有RNP的脂质纳米粒子的个数平均粒径(nm)、PdI、以及gRNA和ssON包封到脂质纳米粒子的包封率(％)。将测定结果示于表17。其结果，即使在使用具有三个导入通道的制造装置的情况下，也能够制造出具有与使用具有两个导入通道的制造装置的实施例2中得到的负载有RNP的脂质纳米粒子同等以上的物性的负载有RNP的脂质纳米粒子。
[表17]
FRR(x/y/z) 个数平均粒径[nm] PdI 包封率[％]
9/0/1 147.4 0.213 95.0
8/1/1 130.5 0.121 94.8
7/2/1 115.8 0.134 95.2
6/3/1 115.2 0.128 93.6
5/4/1 131.1 0.117 94.6
对制造后的制造装置情况进行了确认，在使用参考例1中使用的具有两个导入通道的制造装置的情况下，在稀释流道的入口附近，在脂质的乙醇溶液与RNP溶液的界面上形成有凝聚物。与此相对，在使用具有三个导入通道的制造装置从中央的导入通道导入PBS进行制造的情况下，稀释流道中无凝聚物。
与实施例4同样地，将得到的负载有RNP的脂质纳米粒子添加到培养基，使Cas9蛋白浓度达到0.1nM、0.3nM或1nM，并导入到HeLa-GFP细胞，调查GFP敲除活性。将结果示于图22。全部负载有RNP的脂质纳米粒子均具有与实施例2中得到的负载有RNP的脂质纳米粒子同等以上的GFP敲除活性。
由这些结果确认，通过使用具有如图1B所示那样的三个导入通道的内置有混合器的微型流道，能够避免在内置有混合器的微型流道内生成凝聚物，稳定地制造显示出充分的物性和基因敲除活性的负载有RNP的脂质纳米粒子。
[实施例10]
调查了制造负载有RNP的脂质纳米粒子时的RNP溶液的pH值对制造的负载有RNP的脂质纳米粒子的敲除活性产生的影响。
作为制备RNP溶液时的缓冲液，pH 6.0或pH 6.3的缓冲液使用MES缓冲液(20mMMES，50mM NaCl，pH 6.0或pH 6.3)，pH 4.0、pH 5.0或pH 5.5的缓冲液使用柠檬酸缓冲液(20mM柠檬酸，50mM NaCl，pH 4.0，pH 5.0，或pH 5.5)，除此之外，与实施例2中制造的负载有RNP的脂质纳米粒子B-9相同地，制备含有Cas9蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子。另外，使用实施例5中使用的Cpf1蛋白代替Cas9蛋白，除此之外，同样地制备含有Cpf1蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子。
接下来，将各负载有RNP的脂质纳米粒子添加到前一天接种的HeLa-GFP细胞的培养基，使Cas9蛋白浓度达到0.1nM或0.3nM，或使Cpf1蛋白浓度达到0.5nM、1.0nM或2.0nM，并进行培养。自添加负载有RNP的脂质纳米粒子起经两天后更换培养基，再培养3天后回收细胞，通过流式细胞分析测定GFP敲除效率(％)(未发出GFP荧光的细胞占全部细胞的比例(％))。将导入有含有Cas9蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子的细胞的结果示于图23A，将导入有含有Cpf1蛋白的负载有RNP的脂质纳米粒子的细胞的结果示于图23B。
其结果，在制备时的pH为5.0以上的情况下，含有Cas9蛋白和Cpf1蛋白中任意一者的负载有RNP的脂质纳米粒子都保持基因敲除活性。
标号的说明
10…第一导入通道，20…第二导入通道，30稀释流道，31…汇流点，40…构件，50…弯曲的流道部位，60…第三导入通道，101、102…注射器，103…流量控制装置，104…内置有混合器的微型流道，104a…第一导入通道的注入口，104b…第二导入通道的注入口，104c…稀释流道，104d…稀释流道的出口，105…软管，106…回收容器，107…内置有混沌混合器的微型流道，107a…第一导入通道的注入口，107b…第二导入通道的注入口，107c…稀释流道，107d…稀释流道的出口。
序列表
<110> 国立大学法人北海道大学
<120> 脂质纳米粒子
<130> OSQ-06634
<160> 13
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Aequorea coerulescens
<220>
<223> partial of GFP gene
<400> 1
acggcgtgca gtgcttcagc 20
<210> 2
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized crRNA
<400> 2
gcugaagcac ugcacgccgu guuuuagagc uaugcu 36
<210> 3
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized tracrRNA
<400> 3
agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60
gugcuuu 67
<210> 4
<211> 617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized dsDNA
<400> 4
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 60
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 120
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 180
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 240
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 300
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 360
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 420
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 480
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 540
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 600
acgagaagcg cgatcac 617
<210> 5
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN for GFP knockout
<400> 5
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 60
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 120
ttcaagtccg cc 132
<210> 6
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN for BFP knockin
<400> 6
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 60
ctgagccacg gggtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 120
ttcaagtccg cc 132
<210> 7
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN for GFP knockout
<400> 7
ccucgugacc acccugaccu acggcgugca gugcuucagc cgcuaccccg accacaugaa 60
<210> 8
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized gRNA
<400> 8
uaauuucuac ucuuguagau cgucgccguc cagcucgacc a 41
<210> 9
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized gRNA
<400> 9
cgaucgcucg guuaggagag accccagacg cuccggccau acgcgagucc accaugaauu 60
aauuucuacu cuuguagauc gucgccgucc agcucgacca 100
<210> 10
<211> 120
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN
<400> 10
auggugagca agggcgagga gcuguucacc gggguggugc ccauccuggu cgagcuggac 60
ggcgacguaa acggccacaa guucagcgug uccggcgagg gcgagggcga gggcgaugcc 120
<210> 11
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized ssODN
<400> 11
caccggggug gugcccaucc uggucgagcu ggacggcgac guaaacggcc acaaguucag 60
<210> 12
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized crRNA
<400> 12
gggcacgggc agcuugccgg guuuuagagc uaugcu 36
<210> 13
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthesized crRNA
<400> 13
cucgugacca cccugaccua guuuuagagc uaugcu 36

Claims (10)

1.一种脂质纳米粒子，
所述脂质纳米粒子含有脂质成分、DNA核酸酶、向导RNA、单链寡核苷酸，
所述脂质成分含有下述通式(I)表示的pH敏感性阳离子型脂质、中性磷脂、聚亚烷基二醇修饰脂质，
[化学式1]
(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X (I)
式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1；R1和R2分别独立地表示下述通式(A)表示的基团，
[化学式2]
CH3-(CH2)q-(CH＝CH)r-(CH2)s-(CH＝CH)t-(CH2)u-(CO-O)c-(CH2)v- (A)
式(A)中，q表示1～9的整数；r表示0或1；s表示1～3的整数；t表示0或1；u表示1～8的整数；c表示0或1；v表示4～12的整数；q+2r+s+2t+u+c+v为19以上的整数，但在b和c同时为0的情况下，则如下情况除外：q为3～5的整数，r及t为1，s为1，且u+v为6～10的整数；
X表示下述通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基，其中，该基团通过碳原子键合于(O-CO)b-，该环的1个或2个氢原子可以被C1-4烷基或C2-4烯基取代，
[化学式3]
-(CH2)d-N(R3)(R4) (B)
式(B)中，d表示0～3的整数；R3和R4分别独立地表示C1-4烷基或C2-4烯基，其中，该C1-4烷基或C2-4烯基的1个或2个氢原子可以被苯基取代，但R3和R4也可以彼此键合而形成5～7元非芳香族杂环，其中，该环的1个或2个氢原子可以被C1-4烷基或C2-4烯基取代，
所述pH敏感性阳离子型脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为30摩尔％～50摩尔％，
所述中性磷脂相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为20摩尔％～50摩尔％，
所述聚亚烷基二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例为1摩尔％～4摩尔％。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中，
所述中性磷脂为具有碳原子数12～24的饱和或不饱和的脂肪酸残基的中性甘油磷脂。
3.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中，
所述中性磷脂为具有碳原子数12～24的不饱和的脂肪酸残基的磷脂酰乙醇胺。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的脂质纳米粒子，其中，
所述pH敏感性阳离子型脂质为聚乙二醇修饰脂质。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的脂质纳米粒子，其中，
所述DNA核酸酶为Cas9蛋白，
所述向导RNA由crRNA和tracrRNA构成。
6.根据权利要求5所述的脂质纳米粒子，其中，
所述Cas9蛋白为具有RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的仅一者的蛋白质。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的脂质纳米粒子，其中，
所述DNA核酸酶为Cpf1蛋白。
8.一种基因组编辑方法，向细胞内导入权利要求1～7中任一项所述的脂质纳米粒子。
9.一种脂质纳米粒子的制造方法，其使用流道结构体制造权利要求1～7中任一项所述的脂质纳米粒子，
所述流道结构体中，彼此独立的、导入第一流体的第一导入通道和导入第二流体的第二导入通道分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道，
所述稀释流道至少在其一部分上具有二维弯曲的流道部位，
该弯曲的流道部位形成为：在将与弯曲的流道部位相比更靠近上游处的稀释流道的轴线方向或其延长方向作为X方向，将与该X方向垂直相交的稀释流道的宽度方向作为Y方向，将与弯曲的流道部位相比更靠近上游处的稀释流道的流道宽度作为y0的情况下，按照一定间隔d1、d2……设有至少两个以上构件，该构件交替地从在Y方向上相对的稀释流道的两侧壁面起朝向流道中心侧突出，以限制稀释流道的流道宽度，所述构件在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上具有1/2y0以上且小于1y0的一定高度h1、h2……，且在X方向上具有一定宽度x1、x2……，
从所述第一导入通道导入使所述脂质成分溶解于乙醇而成的脂质溶液，从所述第二导入通道导入含有所述DNA核酸酶、所述向导RNA和所述单链寡核苷酸的pH为5.0以上的水溶液，使总流量为1μL/分钟～100mL/分钟，且所述水溶液的流速相对于所述脂质溶液的流速的比为7以上。
10.根据权利要求9所述的脂质纳米粒子的制造方法，其中，
所述流道结构体还具有导入第三流体的第三导入通道，
以使得从所述第一导入通道导入的第一流体在与从所述第二导入通道导入的第二流体汇流之前，与从所述第三导入通道导入的第三流体接触的方式，所述第一导入通道、所述第二导入通道和所述第三导入通道分别具有一定长度并汇流而形成一个稀释流道。
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