CN106456661A - 抑制CKAP5基因表达的RNAi医药组合物 - Google Patents

抑制CKAP5基因表达的RNAi医药组合物 Download PDF

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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种抑制CKAP5基因表达的组合物、及包含该组合物的医药品等，所述组合物含有下述脂质粒子，所述脂质粒子含有作为药物的双链核酸和式(I)表示的阳离子性脂质，所述双链核酸中，反义链具有与序列号1～6中任一的CKAP5基因的mRNA的连续至少19个碱基的序列互补的碱基序列；式(I)中，R1及R2相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，L1及L2相同或不同，为‑CO‑O‑或‑O‑CO‑，a及b相同或不同，为1～3，R3为氢原子、碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。

Description

抑制CKAP5基因表达的RNAi医药组合物
技术领域
本发明涉及抑制CKAP5基因表达的组合物、包含该组合物的医药品等。
背景技术
细胞骨架相关蛋白5(Cytoskeleton-associated protein 5，CKAP5)是与微管相互作用的蛋白质，在人类中是由CKAP5基因编码的(参见“脱氧核糖核酸研究(DNA Res)”，第2卷，p.37-43；“欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)”，第234卷，p.406-13；“Entrez Gene(NCBI(美国国家生物技术信息中心)基因数据库)：CKAP5细胞骨架相关蛋白5”)。CKAP5还作为ch-TOG而为人所知，并且非洲爪蟾中的XMAP215为其同源物(参见“细胞分子生物学(Molecular Biology of the Cell)”，第15卷，p.1580-1590)。
CKAP5显示在微管形成中具有至少2个作用，一个是抑制由MCAK(KIF2C)导致的动粒微管的解聚，另一个是与中心体的形成也有关(参见“分子细胞生物学(Molecular andCellular Biology)”，第28卷，p.7199-7211)。已知CKAP5还与在乳腺癌中功能亢进的TACC1相互作用(参见“致癌基因(Oncogene)”，第22卷，p.8102-16；“生物化学学报(Biochem J)，第363卷，p.195-200”；“Entrez Gene(NCBI(美国国家生物技术信息中心)基因数据库)：TACC1转化，酸性含卷曲螺旋蛋白质1(acidic coiled-coil containing protein 1)”)。CKAP5在人类肝癌和大肠癌中高水平表达是已知的(参见“欧洲生物化学杂志(Eur JBiochem)”，第234卷，p.406-13)，此外，近年来，其还与MCL1、RRM1、USP8等一同作为多发性骨髓瘤的备选靶标而被报道(参见“癌症研究(Cancer Res)”，第72卷，p.757-68)。虽然基于这样的背景而认为CKAP5为抗癌剂的良好靶标，但是目前尚无以CKAP5为靶标的对癌等的有效治疗方法。
作为抑制靶基因的表达的方法，例如已知利用了RNA干扰(RNA interference，以下称为RNAi)的方法等，具体而言，报道了通过将具有与作为靶标的基因相同的序列的双链RNA导入到线虫中，从而可特异性地抑制该靶基因表达的现象(参见“自然(Nature)”，1998年，第391卷，第6669号，p.806-811)。另外发现，在果蝇中，通过导入21～23个碱基的长度的双链RNA来代替长的双链RNA，也可抑制靶基因的表达，其被命名为短干扰RNA(shortinterfering RNA，siRNA)(参见国际公开第01/75164号)。
关于RNAi，在体内(in vivo)试验中也得到了大量验证，报道了使用50个碱基对以下的siRNA在动物胚胎中的效果(参见美国专利申请公开第2002-132788号说明书)及在成年小鼠中的效果(参见国际公开第03/10180号)。另外，当将siRNA静脉内施予至小鼠胚胎时，在肾脏、脾脏、肺、胰脏及肝脏各器官中确认到了对特定的基因的表达抑制效果(参见“自然·遗传学(Nature Genetics)”，2002年，第32卷，第1号，p.107-108)。此外，还报道了在脑细胞中直接施予siRNA也可抑制特定的基因的表达(参见“自然·生物技术(NatureBiotechnology)”，2002年，第20卷，第10号，p.1006-1010)。
CKAP5 siRNA例如被记载于专利文献1等中。
含有siRNA类的医药品例如被记载于专利文献2、专利文献3、专利文献4等中。
专利文献2中公开了含有siRNA类、和例如1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)等的医药品。出于开发更柔软的阳离子性脂质、由此提高脂质体等的膜流动性的目的而使用了DLinDMA等，其特征在于，使作为结构上类似的阳离子性脂质的N-(2,3-二-(9-(Z)-十八碳烯酰基氧基))-丙烷-1-基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)及N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)的高级烷基成为至少包含2处不饱和位点的高级烷基。另外，专利文献3中公开了含有siRNA类、和例如2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)等的医药品。
另外，专利文献4中公开了例如反式-3,4-双(((Z)-十八碳-9-烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物I-3)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/045543号
专利文献2：国际公开第2005/121348号
专利文献3：国际公开第2009/086558号
专利文献4：国际公开第2011/136368号
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种抑制CKAP5基因表达的组合物、包含该组合物的医药品等。
用于解决课题的手段
本发明涉及以下的(1)～(23)。
(1)一种组合物，其含有下述脂质粒子，所述脂质粒子含有：
作为药物的双链核酸，其具有有义链及反义链，该有义链和该反义链具有至少25个碱基对，该反义链具有与序列号1～6中任一的CKAP5基因的mRNA的连续至少19个碱基的序列互补的碱基序列，具有最长为35个核苷酸的长度；和
式(I)表示的阳离子性脂质。
(式(I)中，R1及R2相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，
L1及L2相同或不同，为-CO-O-或-O-CO-，
a及b相同或不同，为1～3，
R3为氢原子、碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。)
(2)如上述(1)所述的组合物，其中，脂质粒子是进一步含有式(II)表示的阳离子性脂质的脂质粒子。
(式(II)中，R4及R5相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，
R6为氢原子、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为3～6的链烯基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。)
(3)如上述(2)所述的组合物，其中，R4及R5相同，为为十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
(4)如上述(2)所述的组合物，其中，R4及R5相同，为为十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。
(5)如上述(3)或(4)所述的组合物，其中，R6为氢原子、甲基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。
(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的组合物，其中，R3为氢原子或甲基。
(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的组合物，其中，L1及L2为-O-CO-，R1及R2相同，为十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
(8)如上述(1)～(6)中任一项所述的组合物，其中，L1及L2为-CO-O-，R1及R2相同，为十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基或2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基。
(9)如上述(1)～(8)中任一项所述的组合物，其中，作为药物含有下述双链核酸，所述双链核酸具有分别为序列号7及8、序列号9及10、序列号11及12、序列号13及14、序列号15及16、序列号17及18、或序列号19及20的有义链及反义链。
(10)如上述(1)～(9)中任一项所述的组合物，其中，阳离子性脂质与该双链核酸形成复合体，或者，形成阳离子性脂质组合中性脂质及/或高分子而成的物质与该双链核酸的复合体。
(11)如上述(1)～(9)中任一项所述的组合物，其中，阳离子性脂质与该双链核酸形成复合体，或者，形成阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子组合而成的物质与该双链核酸的复合体，脂质粒子是由该复合体和将该复合体封入的脂质膜构成的脂质粒子。
(12)一种抑制CKAP5基因的表达的方法，所述方法包括下述步骤：使用上述(1)～(11)中任一项所述的组合物，向细胞内导入该双链核酸。
(13)如上述(12)所述的方法，其中，细胞是位于哺乳类的肿瘤中的细胞。
(14)如上述(12)所述的方法，其中，细胞是位于哺乳类的大肠、胰脏、胃、小肠、肝脏或食道中的细胞。
(15)如上述(12)～(14)中任一项所述的方法，其中，向细胞内导入的方法是通过静脉内施予而向细胞内导入的方法。
(16)CKAP5相关疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向哺乳动物施予上述(1)～(11)中任一项所述的组合物的步骤。
(17)如上述(16)所述的方法，其中，施予的方法是静脉内施予。
(18)癌的治疗方法，所述治疗方法包括向哺乳动物施予上述(1)～(11)中任一项所述的组合物的步骤。
(19)如上述(18)所述的方法，其中，施予的方法是静脉内施予。
(20)用于治疗CKAP5相关疾病的医药品，其包含上述(1)～(11)中任一项所述的组合物。
(21)如上述(20)所述的医药品，其用于静脉内施予。
(22)癌的治疗剂，其包含上述(1)～(11)中任一项所述的组合物。
(23)如上述(22)所述的癌的治疗剂，其用于静脉内施予。
发明的效果
例如，将本发明的组合物施予至哺乳动物后，能在生物体内抑制CKAP5基因表达，治疗CKAP5相关疾病。
附图说明
[图1]表示以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠(xenograftmice)分别施予实施例1中得到的制剂1-A～1-B后48小时后的肿瘤中CKAP5 mRNA量。纵轴表示CKAP5 mRNA量的相对值。需要说明的是，相对值是以在对CKAP5的mRNA进行半定量时普遍表达的mRNA计，将各样品的HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1，hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1)的mRNA量作为内部对照，以与生理盐水(saline)的相对值的形式算出的。
[图2]表示以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠分别施予实施例2中得到的制剂1-C～1-F后48小时后的肿瘤中CKAP5 mRNA量。纵轴表示CKAP5 mRNA量的相对值。需要说明的是，相对值是以在对CKAP5的mRNA进行半定量时普遍表达的mRNA计，将各样品的HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1)的mRNA量作为内部对照，以与生理盐水的相对值的形式算出的。
[图3]表示以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠分别施予实施例2中得到的制剂1-D～1-E后48小时后的肿瘤中人CKAP5 mRNA量。纵轴表示CKAP5 mRNA量的相对值。需要说明的是，相对值是以在对CKAP5的mRNA进行半定量时普遍表达的mRNA计，将各样品的HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1)的mRNA量作为内部对照，以与生理盐水的相对值的形式算出的。
[图4]表示以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠分别施予实施例2中得到的制剂1-D～1-E后48小时后的骨髓细胞中小鼠CKAP5 mRNA量。纵轴表示CKAP5mRNA量的相对值。需要说明的是，相对值是以在对CKAP5的mRNA进行半定量时普遍表达的mRNA计，将各样品的HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1)的mRNA量作为内部对照，以与生理盐水的相对值的形式算出的。
[图5]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例3中得到的制剂1-B时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂施予组。
[图6]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例3中得到的制剂1-D时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂施予组。
[图7]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例3中得到的制剂1-E时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂施予组。
[图8]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例3中得到的制剂1-G时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂施予组。
[图9]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例4中得到的制剂1-A’及1-B”时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂1-A’施予组，黑三角表示制剂1-B”施予组。
[图10]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例5中得到的制剂1-B”’、1-C”及1-E”时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂1-E”施予组，黑三角表示制剂1-B”’施予组，黑方块表示制剂1-C”施予组。
[图11]表示在第0天及第7天以相当于siRNA为10mg/kg的量向MIAPaCa-2异种移植小鼠施予实施例5中得到的制剂1-B”’、1-D”及1-F”时的肿瘤体积的相对值的推移。纵轴表示以第0天为1时的肿瘤体积的相对值。横轴表示实验开始后的经过天数。白圆圈表示生理盐水施予组，黑圆圈表示制剂1-D”施予组，黑三角表示制剂1-B”’施予组，黑方块表示制剂1-F”施予组。
具体实施方式
本发明提供含有下述脂质粒子的组合物，所述脂质粒子含有：作为药物的具有使得CKAP5基因的表达降低或终止的能力的双链核酸、和阳离子性脂质。
另外，还提供将该组合物施予至哺乳动物、以抑制生物体内CKAP5基因表达、治疗CKAP5相关疾病的方法。
本发明还提供用于预防或治疗过度增殖性病症或疾病(例如白血病、黑色素瘤、细胞瘤、癌、肿瘤、腺瘤)或与不恰当的CKAP5基因的表达相关的1种以上的血管新生性疾病的方法。
本发明的组合物中的脂质粒子含有式(I)表示的阳离子性脂质。
(式(I)中，R1及R2相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，
L1及L2相同或不同，为-CO-O-或-O-CO-，
a及b相同或不同，为1～3，
R3为氢原子、碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。)
以下，有时也将式(I)表示的化合物称为化合物(I)。其他化学式编号的化合物也同样。
另外，本发明的组合物中的脂质粒子是含有化合物(I)及式(II)表示的阳离子性脂质的脂质粒子。
(式(II)中，R4及R5相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，
R6为氢原子、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为3～6的链烯基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。)
式(I)的各基团的定义中，作为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基，可举出例如十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等。
式(I)的各基团的定义中，作为碳原子数为12～24的直链状或支链状的链烯基，只要是包含1～3个双键的碳原子数为12～24的直链状或支链状的链烯基即可，可举出例如(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基、2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基、3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基等，可优选举出(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基等。
式(I)的各基团的定义中，作为碳原子数为12～24的直链状或支链状的炔基，只要是包含1～3个三键的碳原子数为12～24的直链状或支链状的炔基即可，可举出例如十二碳-11-炔基、十三碳-12-炔基、十五碳-6-炔基、十六碳-7-炔基、十五碳-4,6-二炔基、十六碳-5,7-二炔基、十七碳-8-炔基、十八碳-9-炔基等。
需要说明的是，化合物(I)中，R1及R2优选为相同的碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基。另外，R1及R2更优选为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基或链烯基，进一步优选为碳原子数为12～24的直链状的链烯基。
式(II)的各基团的定义中，作为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基，可举出例如十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等。
式(II)的各基团的定义中，作为碳原子数为12～24的直链状或支链状的链烯基，只要是包含1～3个双键的碳原子数为12～24的直链状或支链状的链烯基即可，可举出例如(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基、3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基等，可优选举出(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基等。
式(II)的各基团的定义中，作为碳原子数为12～24的直链状或支链状的炔基，只要是包含1～3个三键的碳原子数为12～24的直链状或支链状的炔基即可，可举出例如十二碳-11-炔基、十四碳-6-炔基、十六碳-7-炔基、十六碳-5,7-二炔基、十八碳-9-炔基等。
需要说明的是，化合物(II)中，R4及R5优选为相同的碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基。另外，R4及R5更优选为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基或链烯基，进一步优选为碳原子数为12～24的直链状的链烯基。
式(I)及式(II)的各基团的定义中，作为碳原子数为1～6的烷基，可举出例如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、环丙基甲基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、己基、环己基等，可优选举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、新戊基、己基等，可进一步优选举出甲基、乙基、丙基等。
作为碳原子数为3～6的链烯基，可举出例如烯丙基、1-丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等，可优选举出烯丙基等。
被取代的碳原子数为1～6的烷基中的烷基部分及被取代的碳原子数为3～6的链烯基中的链烯基部分分别与上述碳原子数为1～6的烷基及碳原子数为3～6的链烯基含义相同。
化合物(I)及化合物(II)中，结构中的氮原子的孤对电子上可以配位氢离子，该配位了氢离子的氮原子可以与制药上可接受的阴离子形成盐，化合物(I)及化合物(II)也包括氢离子配位于该氮原子的孤对电子而得到的化合物。
作为制药上可接受的阴离子，可举出例如氯化物离子、溴化物离子、硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子等无机离子，乙酸根离子、草酸根离子、马来酸根离子、富马酸根离子、柠檬酸根离子、苯甲酸根离子、甲磺酸根离子等有机酸离子等。
式(II)的定义中，吡咯烷-3-基、哌啶-3-基及哌啶-4-基分别包含键合于各自环中氮原子上的氢原子被改变为甲基或乙基而得到的基团。
作为单烷基氨基及二烷基氨基，分别可以为被1个、及相同或不同的2个下述基团取代的氨基，所述基团为碳原子数为1～6的烷基(与上文所述的含义相同)或者被氨基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基(与上文所述的含义相同)，可举出例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基、戊基氨基、己基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基、甲基丙基氨基、丁基甲基氨基、甲基戊基氨基、己基甲基氨基、氨基乙基氨基、氨基丙基氨基、(氨基乙基)甲基氨基、双(氨基乙基)氨基等，可优选举出甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、氨基丙基氨基、双(氨基乙基)氨基等。
化合物(II)中，氨基、单烷基氨基及二烷基氨基分别可以在氮原子的孤对电子上配位氢离子而形成铵基(ammonio)、单烷基铵基及二烷基铵基，氨基、单烷基氨基及二烷基氨基分别包括铵基、单烷基铵基及二烷基铵基。此时，在氨基、单烷基氨基及二烷基氨基的氮原子的孤对电子上配位了氢离子而成的铵基、单烷基铵基及二烷基铵基可以与制药上可接受的阴离子(与上文所述的含义相同)形成盐。
作为烷氧基，可以是被下述基团取代的羟基，所述基团为碳原子数为1～6的烷基(与上文所述的含义相同)或者被氨基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基(与上文所述的含义相同)，可举出例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、氨基乙氧基、甲基氨基乙氧基等，可优选举出甲氧基、乙氧基、氨基乙氧基、甲基氨基乙氧基等。
作为单烷基氨基甲酰基及二烷基氨基甲酰基，分别可以为被1个、及相同或不同的2个下述基团取代的氨基甲酰基，所述基团为碳原子数为1～6的烷基(与上文所述的含义相同)或者被氨基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基(与上文所述的含义相同)，可举出例如甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、丙基氨基甲酰基、丁基氨基甲酰基、戊基氨基甲酰基、己基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、乙基甲基氨基甲酰基、甲基丙基氨基甲酰基、丁基甲基氨基甲酰基、甲基戊基氨基甲酰基、己基甲基氨基甲酰基、氨基乙基氨基甲酰基、氨基丙基氨基甲酰基、(氨基乙基)甲基氨基甲酰基、双(氨基乙基)氨基甲酰基等，可优选举出甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基等。
化合物(I)中，当L1及L2为-O-CO-时，更优选地，R1及R2相同或不同，为十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基，进一步优选为相同或不同的十四烷基、十六烷基、十八烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。需要说明的是，在任一情况下，R1与R2相同均是进一步优选的。
另外，当L1及L2为-CO-O-时，更优选地，R1及R2相同或不同，为十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基或2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基，进一步优选为相同或不同的十三烷基、十五烷基、十七烷基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基或(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基。需要说明的是，在任一情况下，R1与R2相同均是优选的。
另外，更优选地，a及b同时为1。
另外，a及b同时为1、L1及L2为-CO-O-也是本发明的更优选的实施方式之一。此时，R1及R2更优选为相同或不同的(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基，最优选相同且为(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基。
另外，R3更优选为氢原子或甲基。
另外，a及b为1、L1及L2相同且为-CO-O-或-O-CO-(优选-CO-O-)、R3为甲基的实施方式也是本发明进一步优选的实施方式之一。R1及R2更优选为相同或不同的(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基，最优选相同且为(Z)-十七碳-8-烯基或(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基。
需要说明的是，当R3为氢原子时，L1及L2相同且为-CO-O-或-O-CO-(优选-CO-O-)的实施方式也是本发明的更优选实施方式之一。R1及R2更优选为相同或不同的(Z)-十七碳-5-烯基或(Z)-十七碳-8-烯基，最优选相同且为(Z)-十七碳-5-烯基或(Z)-十七碳-8-烯基。
化合物(II)中，R4及R5优选为相同或不同的十四烷基、十六烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，更优选为相同或不同的(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基，最优选相同且为(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
另外，R6优选为氢原子、甲基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基，更优选为氢原子、甲基或者被1个氨基、羟基或氨基甲酰基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基，最优选为氢原子、甲基等。
另外，R6为氢原子的实施方式也是本发明的更优选实施方式之一。此时，R4及R5更优选为相同或不同的十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，最优选相同且为(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基或(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
另外，R6为甲基的实施方式也是本发明的更优选实施方式之一。此时，R4及R5更优选为相同或不同的十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基，最优选相同且为(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基。
化合物(I)可利用与国际公开第2011/136368号中记载的制造方法同样的方法得到。需要说明的是，当上文定义的基团在该制造方法的条件下发生变化或不适于实施该制造方法时，可通过使用在有机合成化学中常用的保护基的导入及除去方法[例如，有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，第三版、T.W.Greene著，JohnWiley&Sons Inc.(1999年)等所记载的方法]等，来制造目标化合物。另外，根据需要，也可改变取代基导入等的反应工序的顺序。
接下来，说明化合物(II)的制造方法。需要说明的是，在以下所示的制造方法中，当上文定义的基团在该制造方法的条件下发生变化或不适于实施该制造方法时，可通过使用在有机合成化学中常用的保护基的导入及除去方法[例如，有机合成中的保护基，第三版、T.W.Greene著，John Wiley&Sons Inc.(1999年)等所记载的方法]等，来制造目标化合物。另外，根据需要，也可改变取代基导入等的反应工序的顺序。
制造方法1
化合物(II)可通过以下的方法来制造。
(式中，R4、R5及R6分别与上文所述的含义相同，Z表示氯原子、溴原子、碘原子、三氟甲磺酰基氧基、甲磺酰基氧基、苯磺酰基氧基、对甲苯磺酰基氧基等离去基团)
工序1及2
化合物(IIIb)可通过以下方法来制造：在无溶剂下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIIa)与化合物(IVa)反应5分钟～100小时。进而，化合物(II)可通过以下方法来制造：在无溶剂下或在溶剂中，根据需要优选在1～10当量的碱的存在下，在室温与200℃之间的温度下，使化合物(IIIb)与化合物(IVb)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出例如甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、水等，它们可以单独使用或混合使用。
作为碱，可举出例如碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙基胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)等。
化合物(IIIa)可作为市售品或利用已知的方法(例如，第5版实验化学讲座14“有机化合物的合成II”，第5版，p.351，丸善(2005年))或以此为基准的方法得到。
化合物(IVa)及化合物(IVb)可作为市售品或利用已知的方法(例如，第5版实验化学讲座13“有机化合物的合成I”，第5版，p.374，丸善(2005年))或以此为基准的方法得到。
R4与R5相同时的化合物(IIa)可通过在工序1中使用2当量以上的化合物(IVa)而得到。
制造方法2
化合物(II)中的R6为-CHRARB的化合物(IIb)也可通过以下的方法制造(式-CHRARB中，RA及RB相同或不同，为氢原子、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为2～5的链烯基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吗啉-2-基、吗啉-3-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～5的烷基或碳原子数为2～5的链烯基，或者与邻接的碳原子一起形成吡咯烷-3-基、哌啶-3-基或哌啶-4-基，除了RA及RB相同且为氢原子的情况之外，RA及RB的烷基、被取代的烷基的烷基部分、链烯基及被取代的链烯基的链烯基部分的碳原子数的总和为1～5，当RA及RB中的任一方是吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吗啉-2-基或吗啉-3-基时，该RA及RB中的另一方是氢原子、碳原子数为1～5的烷基、碳原子数为2～5的链烯基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吗啉-2-基、吗啉-3-基或者被相同或不同的1个或2个氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～5的烷基或碳原子数为2～5的链烯基，当RA及RB为被取代的烷基或链烯基时，该取代基的总数为2或3)。
(式中，R4、R5、RA及RB分别与上文所述的含义相同)
工序3
化合物(IIb)可通过以下方式来制造：在溶剂中，在优选1～大量过量的还原剂及根据需要在优选1～10当量的酸的存在下，在-20℃与150℃之间的温度下，使化合物(II)中R6为氢原子的化合物(IIc)与优选1～10当量的化合物(V)反应5分钟～72小时。
作为溶剂，可举出例如甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、水等，它们可以单独使用或混合使用。
作为还原剂，可举出例如三乙酰氧基硼氢化钠、氰化硼氢化钠等。
作为酸，可举出例如盐酸、乙酸等。
化合物(V)可作为市售品或利用已知的方法(例如，第5版实验化学讲座15“有机化合物的合成III”，第5版，p.1，丸善(2005年)；第5版实验化学讲座15“有机化合物的合成III”，第5版，p.153，丸善(2005年))或以此为基准而得到。
制造方法3
化合物(II)中的R6为-CH2-C(OH)RCRD的化合物(IId)也可利用以下的方法来制造(式-CH2-C(OH)RCRD中，RC及RD相同或不同，为氢原子、碳原子数为1～4的烷基、碳原子数为2～4的链烯基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吗啉-2-基、吗啉-3-基或者被相同或不同的1个或2个氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～4的烷基或碳原子数为2～4的链烯基，除了RC及RD相同且为氢原子的情况之外，RC及RD的烷基、被取代的烷基的烷基部分、链烯基及被取代的链烯基的链烯基部分的碳原子数的总和为1～4，RC及RD中的任一方是吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吗啉-2-基或吗啉-3-基时，该RC及RD中的另一方是氢原子、碳原子数为1～4的烷基、碳原子数为2～4的链烯基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吗啉-2-基、吗啉-3-基或者被1个氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～4的烷基或碳原子数为2～4的链烯基，RC及RD为被取代的烷基或链烯基时，该取代基的总数为2)。
(式中，R4、R5、RC及RD分别与上文所述的含义相同)
工序4
化合物(IId)可通过以下方式来制造：在溶剂中或在无溶剂下，在0℃与230℃之间的温度下，使化合物(IIc)与化合物(VI)反应5分钟至100小时。
作为溶剂，可举出例如甲醇、乙醇、1-丙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等，它们可以单独使用或混合使用。
化合物(VI)可作为市售品或利用已知的方法(例如，第5版实验化学讲座17“有机化合物的合成V”，第5版，p.186，丸善(2005年))或以此为基准而得到。
化合物(II)中的R4、R5或R6中包含的官能团的转化可利用已知的方法[例如，有机官能团转换(Comprehensive Organic Transformations)，第二版，R.C.Larock著，VchVerlagsgesellschaft Mbh(1999年)等所记载的方法]进行或以这些方法为基准进行。
上述各制造方法中的中间体及目标化合物可通过实施在有机合成化学中常用的分离纯化法例如过滤、萃取、洗涤、干燥、浓缩、重结晶、各种色谱法等而进行分离纯化。另外，也可不特别地对中间体进行纯化地供于下一反应。
化合物(I)及化合物(II)中，也可存在几何异构体、光学异构体等立体异构体、互变异构体等，化合物(I)及化合物(II)包含所有可能的异构体(包括上述这些在内)及它们的混合物。
化合物(I)及化合物(II)中的各原子的一部分或全部，也可各自用对应的同位素原子取代，化合物(I)及化合物(II)也包含这些用同位素原子取代而得到的化合物。例如，化合物(I)及化合物(II)中的氢原子的一部分或全部可以是原子量为2的氢原子(氘原子)。
化合物(I)及化合物(II)中的各原子的一部分或全部各自用对应的同位素原子取代而得到的化合物可使用市售的结构单元(building block)、利用与上述各制造方法同样的方法来制造。另外，化合物(I)及化合物(II)中的氢原子的一部分或全部经氘原子取代而得到的化合物例如也可使用以下方法合成：使用铱络合物作为催化剂，使用重水作为氘源，对醇、羧酸等进行氘代的方法[参见美国化学会志(Journal of the American ChemicalSociety，J.Am.Chem.Soc.)，Vol.124，No.10，2092(2002)]等。
将化合物(I)的具体例示于表1，将化合物(II)的具体例示于表2。但本发明中的化合物(I)及化合物(II)不限于这些。
[表1]
[表2]
另外，本发明中使用的作为药物的双链核酸是以下双链核酸：当被导入至哺乳类细胞中时、具有使CKAP5基因的表达降低或终止的能力，其具有有义链及反义链，该有义链和该反义链具有至少25个碱基对，该反义链具有与序列号1～6中任一的CKAP5基因的mRNA(CKAP5 mRNA)的靶标序列的连续至少19个碱基的序列互补的碱基序列，具有最长为35个核苷酸的长度。
作为双链核酸，只要是核苷酸及/或具有与该核苷酸同等的功能的分子聚合而成的双链的分子，就可以是任何分子，可举出例如作为核糖核苷酸的聚合物的RNA、作为脱氧核糖核苷酸的聚合物的DNA、包含RNA和DNA的嵌合核酸、及这些核酸中至少一个核苷酸被具有与该核苷酸同等功能的分子取代而得到的核苷酸聚合物。另外，包含至少一个核苷酸及/或具有与该核苷酸同等的功能的分子聚合而成的分子作为结构单元的衍生物也包括在本发明的双链核酸之内。进而，还可举出肽核酸(PNA)[化学研究述评(Acc.Chem.Res.),32,624(1999)]、氧肽核酸(OPNA)[美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.),123,4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.),122,6900(2000)]等。需要说明的是，本发明中，RNA中的尿嘧啶核苷U和DNA中的胸腺嘧啶核苷T可以互换读出。
作为与核苷酸具有同等功能的分子，可以举出例如核苷酸衍生物等。
作为核苷酸衍生物，只要是对核苷酸进行修饰而得的分子则可以为任何分子，例如与天然来源的RNA或者DNA相比为了提高核酸酶耐性或使其免受其他分解因子的影响而稳定化、为了提高与互补链核酸的亲和性、为了提高细胞透过性、或者为了使其可被观察到，适合使用对核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸进行修饰而得的分子等。
作为核苷酸衍生物，可以举出例如糖部修饰核苷酸、磷酸二酯键修饰核苷酸、碱基修饰核苷酸等。
作为糖部修饰核苷酸，只要为对核苷酸的糖的化学结构的一部分或者全部用任意的取代基进行了修饰或取代的产物、或者用任意的原子进行了取代的产物，则可以为任何物质，优选可以使用2’-修饰核苷酸。
作为糖部修饰核苷酸中的修饰基团，可举出例如2’-氰基、2’-烷基、2’-取代烷基、2’-链烯基、2’-取代链烯基、2’-卤素、2’-O-氰基、2’-O-烷基、2’-O-取代烷基、2’-O-链烯基、2’-O-取代链烯基、2’-S-烷基、2’-S-取代烷基、2’-S-链烯基、2’-S-取代链烯基、2’-氨基、2’-NH-烷基、2’-NH-取代烷基、2’-NH-链烯基、2’-NH-取代链烯基、2’-SO-烷基、2’-SO-取代烷基、2’-羧基、2’-CO-烷基、2’-CO-取代烷基、2’-Se-烷基、2’-Se-取代烷基、2’-SiH2-烷基、2’-SiH2-取代烷基、2’-ONO2、2’-NO2、2’-N3、2’-氨基酸残基(从氨基酸的羧酸中除去羟基而得到的基团)、2’-O-氨基酸残基(与上述氨基酸残基含义相同)等。另外，具有2’位的修饰基团与4’位的碳原子桥联而成的结构的桥联结构型人工核酸(Bridged NucleicAcid)(BNA)，更具体而言，2’位的氧原子与4’位的碳原子经亚甲基桥联的锁人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、及亚乙基桥联结构型人工核酸(Ethylene bridgednucleic acid)(ENA)[核酸研究(Nucleic Acid Research),32,e175(2004)]等也被包含在本发明中的在2’位被修饰基团取代的核苷酸内。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团，优选2’-氰基、2’-卤素、2’-O-氰基、2’-烷基、2’-取代烷基、2’-O-烷基、2’-O-取代烷基、2’-O-链烯基、2’-O-取代链烯基、2’-Se-烷基、2’-Se-取代烷基等，更优选2’-氰基、2’-氟、2’-氯、2’-溴、2’-三氟甲基、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-异丙基、2’-O-三氟甲基、2’-O-[2-(甲氧基)乙基]、2’-O-(3-氨基丙基)、2’-O-[2-(N,N-二甲基)氨基氧基]乙基、2’-O-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]、2’-O-{2-[2-(N,N-二甲基氨基)乙氧基]乙基}、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、2’-Se-甲基等，进一步优选2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟等，最优选2’-O-甲基、2’-O-乙基。
另外，关于糖部修饰核苷酸的修饰基团，还可以从其大小考虑来定义优选范围，从氟的大小考虑，优选相当于-O-丁基的大小的基团，从-O-甲基的大小考虑，更优选相当于-O-乙基的大小的基团。
糖部修饰核苷酸的修饰基团中的烷基与化合物(II)中的碳原子数为1～6的烷基含义相同。
糖部修饰核苷酸的修饰基团中的链烯基与化合物(II)中的碳原子数为3～6的链烯基含义相同。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团中的卤素，可举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
作为氨基酸残基中的氨基酸，可以举出例如脂肪族氨基酸(具体为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等)、羟基氨基酸(具体为丝氨酸、苏氨酸等)、酸性氨基酸(具体为天冬氨酸、谷氨酸等)、酸性氨基酸酰胺(具体为天冬酰胺、谷氨酰胺等)、碱性氨基酸(具体为赖氨酸、羟基赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等)、含硫氨基酸(具体为半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸等)、亚氨基酸(具体为脯氨酸、4-羟基脯氨酸等)等。
作为糖部修饰核苷酸的修饰基团中的取代烷基及取代链烯基中的取代基，可以举出例如卤素(与上文所述的含义相同)、羟基、巯基、氨基、氧代基(oxo)、-O-烷基(该-O-烷基的烷基部分与上文所述的烷基含义相同)、-S-烷基(该-S-烷基的烷基部分与上文所述的烷基含义相同)、-NH-烷基(该-NH-烷基的烷基部分与上文所述的烷基含义相同)、二烷基氨基氧基(该二烷基氨基氧基的2个烷基部分相同或不同，与上文所述的烷基含义相同)、二烷基氨基(该二烷基氨基的2个烷基部分相同或不同，与上文所述的烷基含义相同)、二烷基氨基亚烷基氧基(该二烷基氨基亚烷基氧基的2个烷基部分相同或不同，与上文所述的烷基含义相同，亚烷基部分表示从上文所述的烷基中除去1个氢原子而得到的基团)等，取代数优选为1～3。
作为磷酸二酯键修饰核苷酸，只要是对核苷酸的磷酸二酯键的化学结构的一部分或者全部用任意的取代基修饰或取代而得的核苷酸，或者用任意的原子取代而得的核苷酸，则可以为任意的核苷酸，可以举出例如磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代而得的核苷酸、磷酸二酯键被二硫代磷酸酯键取代而得的核苷酸、磷酸二酯键被膦酸烷基酯键取代而得的核苷酸、磷酸二酯键被氨基磷酸酯键取代而得的核苷酸等。
作为碱基修饰核苷酸，只要是对核苷酸的碱基的化学结构的一部分或者全部用任意的取代基修饰或取代而得的核苷酸，或者用任意的原子取代而得的核苷酸，则可以为任意的核苷酸，可以举出例如碱基内的氧原子被硫原子取代而得的核苷酸，氢原子被碳原子数为1～6的烷基取代而得的核苷酸，甲基被氢原子或碳原子数为2～6的烷基取代而得的核苷酸，氨基被碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为1～6的烷酰基等保护基保护的核苷酸。
进而，作为核苷酸衍生物，还可以举出在核苷酸或者糖部、磷酸二酯键或碱基的至少一方被修饰而得的核苷酸衍生物中加成脂质、磷脂、吩嗪、叶酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、色素等、其他化学物质而得到的产物，具体而言，可以举出经5’-多胺加成的核苷酸衍生物、经胆固醇加成的核苷酸衍生物、经甾体加成的核苷酸衍生物、经胆汁酸加成的核苷酸衍生物、经维生素加成的核苷酸衍生物、经Cy5荧光色素加成的核苷酸衍生物、经Cy3荧光色素加成的核苷酸衍生物、经6-荧光素(FAM)加成的核苷酸衍生物、及经生物素加成的核苷酸衍生物等。
另外，核苷酸衍生物也可以与双链核酸内的其他核苷酸或者核苷酸衍生物形成桥联结构(亚烷基结构、肽结构、核苷酸结构、醚结构、酯结构、及它们中的至少一者组合而成的结构等)。
双链核酸具有对于通过Dicer加工以产生siRNA来说足够的长度。根据本实施方式，双链核酸包含长度优选在26至30个核苷酸之间的有义链、和在生物学条件(在细胞的细胞质中观察到的条件等)下与有义链退火的反义链。
另外，双链核酸可以具有增强基于Dicer的该加工的某些特性。根据本实施方式，双链核酸具有对于通过Dicer加工以产生siRNA来说足够的长度、及以下特性中的至少1种(优选全部特性)，所述特性为：(i)双链核酸为非对称，例如，在反义链上具有3’突起。(ii)为了Dicer结合及加工，在有义链的3’末端含有核苷酸衍生物(与上文所述的含义相同)。作为适当的核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸(acyclonucleotide)及其类似物等核苷酸，以及以立体方式嵌缠了荧光分子及其类似物等而成的分子，优选包括脱氧核糖核苷酸。当使用核苷酸衍生物时，以双链核酸的长度不发生变化的方式，使核苷酸衍生物与双链核酸中的核糖核苷酸置换。(iii)有义链在5’末端包含磷酸。在5’末端包含磷酸是指，结合于5’末端的碱基的糖的5’位的羟基，被磷酸基或可被生物体内的核酸分解酶等转化为磷酸基的基团修饰。
另外，双链核酸优选在反义链、或有义链、或两种链中，具有1个或更多的2’-O-甲基修饰核苷酸。
最优选有义链包含25～28个核苷酸，有义链的3’末端的2个核苷酸是脱氧核糖核苷酸。有义链在5’末端包含磷酸。反义链包含26～30个核苷酸，而且，包含1～4个核苷酸的3’突出部。反义链及有义链具有1个或更多的2’-O-甲基修饰核苷酸。
例如，对于25个核苷酸有义链、及包含2个核苷酸的3’突出部的27个核苷酸反义链，当以有义链及反义链的5’末端的第一碱基为位置编号1进行计数时，作为2’-O-甲基修饰的位置，可举出有义链的位置编号1、2、4、6、8、12、14、16、18及23以及反义链的位置编号1、2、3、4、11、13、25及27、有义链的位置编号1、2、4、6、8、12、14、16、18及23以及反义链的位置编号1、2、3、4、11、13、21、23、25、26及27、有义链的位置编号1、2、4、6、8、12、14、16、18及23以及反义链的位置编号1、2、3、4、11、13、15、17、19、21、23、25、26及27等，在任一情况下，均优选有义链的3’末端的2个核苷酸是脱氧核糖核苷酸、反义链在5’末端包含磷酸。
本发明中使用的双链核酸包括核酸的结构中的磷酸部、酯部等中包含的氧原子等被例如硫原子等其他原子取代而得到的衍生物。
另外，结合于反义链及有义链的5’末端的碱基的糖的各自的5’位的羟基，可被磷酸基或上述的修饰基团、或者可被生物体内的核酸分解酶等转化为磷酸基或上述的修饰基团的基团修饰。
另外，结合于反义链及有义链的3’末端的碱基的糖的各自的3’位的羟基，可被磷酸基或上述的修饰基团、或者可被生物体内的核酸分解酶等转化为磷酸基或上述的修饰基团的基团修饰。
需要说明的是，本发明中使用的双链核酸可以使用已知的RNA或DNA合成法、及RNA或DNA修饰法来制造。
双链核酸可以以与CKAP5基因序列内的靶标序列相互作用的方式来设计。
双链核酸的1条链的序列与上文说明的靶标部位序列互补。双链核酸可使用本说明书中记载的方法化学合成。
RNA可通过酶合成或部分有机合成/全有机合成产生，另外，经修饰的核糖核苷酸可在体外(in vitro)利用酶合成或有机合成而导入。在一个实施方式中，各链可化学制备。以化学方式合成RNA分子的方法在本领域中已知[参见核酸研究(Nucleic AcidsResearch，Nucleic.Acids.Res.)，1998年，第32卷，p.936-948]。通常，双链核酸可通过使用固相寡核苷酸合成法来合成(例如，参见Usman等，美国专利第5,804,683号说明书；美国专利第5,831,071号说明书；美国专利第5,998,203号说明书；美国专利第6,117,657号说明书；美国专利第6,353,098号说明书；美国专利第6,362,323号说明书；美国专利第6,437,117号说明书；美国专利第6,469,158号说明书；Scaringe等,美国专利第6,111,086号说明书；美国专利第6,008,400号说明书；美国专利第6,111,086号说明书)。
单链核酸可使用固相亚磷酰胺法(参见核酸研究(Nucleic.Acids.Res.)，1993年，第30卷，p.2435-2443)来进行合成、脱保护、及在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上脱盐。寡聚物使用Amersham Source 15Q柱(1.0cm，高25cm(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ))、以15分钟工序的线性梯度通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)来纯化。梯度从90:10的缓冲液A:B变化至52:48的缓冲液A:B，缓冲液A为100mM Tris pH 8.5，以及，缓冲液B为100mM Tris pH 8.5(1M的NaCl)。以260nm监测试样，收集并合并与全长寡核苷酸种对应的峰，用NAP-5柱脱盐，并进行冷冻干燥。
各单链核酸的纯度可通过利用Beckman PACE 5000(Beckman Coulter，Inc.,Fullerton,Calif)的毛细管电泳(CE)来确定。CE毛细管具有100μm的内径，包含ssDNA 100RGel(Beckman-Coulter)。典型地，将约0.6nmol的寡核苷酸注射到毛细管中，在444V/cm的电场中运行，通过260nm下的UV吸光度来检测。改性Tris-硼酸-7M-尿素电泳缓冲液从Beckman-Coulter购入。可得到用于下文记载的实验中的、利用CE进行评价的结果至少为90％纯的单链核酸。化合物同一性可按照制造业者的推荐规程，通过利用VoyagerDE.TM.Biospectometry工作站(Applied Biosystems、Foster City、Calif.)的基质辅助激光解析电离-飞行时间型(MALDI-TOF)质谱法来验证。单链核酸的相对分子质量可在预想的分子质量的0.2％以内得到。
以100μM浓度将单链核酸再悬浮于100mM乙酸钾、30mM HEPES、pH 7.5的缓冲液中。以同等摩尔的量混合互补的有义链及反义链，得到50μM双链核酸的最终溶液。经5分钟将试样加热至95℃，在使用前冷却至室温。在-20℃下保存双链核酸。单链核酸被冷冻干燥，或在无核酸酶的水中在-80℃下贮存。
将本发明中使用的双链核酸的具体例示于表3。需要说明的是，与表中附有r、m及d的碱基结合的糖分别为核糖、2’位的羟基被-O-甲基取代的核糖及脱氧核糖。
[表3]
本发明中的脂质粒子是含有化合物(I)及双链核酸的脂质粒子、或含有化合物(I)及化合物(II)及双链核酸的脂质粒子，可举出例如含有下述复合体的脂质粒子、由该复合体及将该复合体封入的脂质膜构成的脂质粒子等，所述复合体是：化合物(I)与双链核酸的复合体、或化合物(I)及化合物(II)与双链核酸的复合体；或者下述物质与双链核酸的复合体，所述物质为化合物(I)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质、或化合物(I)及化合物(II)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质。脂质膜可以是脂质单层膜(脂质单分子膜)，也可以是脂质双层膜(脂质双分子膜)。需要说明的是，该脂质膜中可以含有化合物(I)、化合物(II)、中性脂质及/或高分子。另外，该复合体及/或该脂质膜中也可以含有化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质。
另外，作为本发明中的脂质粒子，还可举出例如由下述复合体以及将该复合体封入的脂质膜构成、在脂质膜中含有化合物(I)的脂质粒子等，所述复合体是：化合物(II)与双链核酸的复合体，或将化合物(II)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质、与双链核酸的复合体。此时的脂质膜也同样既可以是脂质单层膜(脂质单分子膜)，也可以是脂质双层膜(脂质双分子膜)。需要说明的是，该脂质膜中可以含有化合物(II)、中性脂质及/或高分子。另外，该复合体及/或该脂质膜中也可以含有化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质。
作为该复合体的形态，在任一情况下，均可举出双链核酸与由脂质单层形成的膜(反胶束)的复合体、双链核酸与脂质体的复合体、双链核酸与胶束的复合体等，可优选举出双链核酸与由脂质单层形成的膜的复合体或双链核酸与脂质体的复合体。
作为由该复合体及将该复合体封入的脂质双层膜构成的脂质粒子，可举出由该复合体及将该复合体封入的脂质双层膜构成的脂质体等。
需要说明的是，本发明中的脂质粒子中，可使用各为一种或多种的化合物(I)及化合物(II)，另外，化合物(I)及/或化合物(II)中，也可混合化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质。
作为化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质，可举出例如日本特开昭61-161246号公报(美国专利5049386号说明书)中公开的DOTMA、DOTAP等，国际公开第91/16024号及国际公开第97/019675号中公开的N-[1-(2,3-二油烯基氧基丙基)]-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(DORIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)等，国际公开第2005/121348号中公开的DLinDMA等，国际公开第2009/086558号中公开的DLin-K-DMA等，优选DOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、DLinDMA、DLin-K-DMA等有着具有2个非取代烷基的叔胺部位或具有3个非取代烷基的季铵部位的阳离子性脂质，可更优选举出该具有叔胺部位的阳离子性脂质。该叔胺部位及该季铵部位的非取代烷基更优选为甲基。
本发明中的脂质粒子可利用已知的制造方法或以此为基准来制造，可以是用任何制造方法制造出的脂质粒子。例如，在作为脂质粒子之一的脂质体的制造中，可应用已知的脂质体的制备方法。作为已知的脂质体的制备方法，可举出例如Bangham等的脂质体制备法(参见“分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)(J.Mol.Biol.)”，1965年，第13卷，第238-252页)、乙醇注入法(参见“细胞生物学杂志(Journal of Cell Biology)(J.Cell Biol.)”，1975年，第66卷，第621-634页)、法压法(参见“欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)(FEBS Lett.)”，1979年，第99卷，第210-214页)、冷冻熔化法(参见“生物化学与生物物理文献(Archives of Biochemistry and Biophysics)(Arch.Biochem.Biophys.)”，1981年，第212卷，第186-194页)、反相蒸发法(参见“美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Science United States ofAmerica)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”，1978年，第75卷，第4194-4198页)或pH梯度法(参见例如日本专利第2572554号公报、日本专利第2659136号公报等)等。作为制造脂质体时将脂质体分散的溶液，可以使用例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水或者氨基酸输注液等。另外，在制造脂质体时，还可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或者乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧化剂、例如甘油、葡萄糖或者氯化钠等等渗剂等。另外，也可以通过将脂质等溶解在例如乙醇等有机溶剂中、蒸馏除去溶剂后、添加生理盐水等、振荡搅拌、形成脂质体，由此来制造脂质体。
另外，本发明中的脂质粒子例如可通过如下方法等方法制造：将化合物(I)，化合物(I)及化合物(II)，化合物(I)、和化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质，或化合物(I)及化合物(II)、和化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质预先溶解在氯仿中，接着，加入双链核酸的水溶液和甲醇并进行混合，形成阳离子性脂质/双链核酸的复合体，进而提取出氯仿层，向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性脂质和水，形成油包水型(W/O)乳液，利用反相蒸发法进行处理，由此制造(参见日本特表2002-508765号公报)；将双链核酸溶解在酸性的电解质水溶液中，加入脂质(乙醇中)，将乙醇浓度降低至20v/v％，制备内含上述双链核酸的脂质体，进行分选过滤(sizing filtration)，通过透析除去过量的乙醇后，进一步提高试样的pH，透析除去附着在脂质体表面的双链核酸，由此制造(参见日本特表2002-501511号公报及参见“生物化学与生物物理学报(Biochimica et BiophysicaActa)”，2001年，第1510卷，第152-166页)等。
本发明中的脂质粒子中，由复合体及将该复合体封入的脂质双层膜构成的脂质体例如可按照国际公开第02/28367号及国际公开第2006/080118号等中记载的制造方法来制造。
另外，本发明中的脂质粒子中，例如下述脂质粒子等可通过以下方法得到，所述脂质粒子是：由下述复合体以及将该复合体封入的脂质膜构成，脂质膜中含有化合物(I)、化合物(II)、及/或化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的脂质粒子，所述复合体是化合物(I)与双链核酸的复合体、或化合物(I)及化合物(II)与双链核酸的复合体、或下述物质与双链核酸的复合体，所述物质为化合物(I)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质、或化合物(I)及化合物(II)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质；由下述复合体以及将该复合体封入的脂质膜构成，脂质膜中含有化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)的脂质粒子，所述复合体是化合物(II)与双链核酸的复合体，或将化合物(II)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质、与双链核酸的复合体，所述方法是：按照国际公开第02/28367号及国际公开第2006/080118号等中记载的制造方法，制造各复合体，不使该复合体溶解地将该复合体分散到水或0～20％乙醇水溶液中(A液)，另外，将各脂质膜成分溶解在乙醇水溶液中(B液)，混合A液和B液，进而适当地加入水。另外，A液及B液中的化合物(I)、化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质也可分别使用一种或多种。
需要说明的是，本发明中，由化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)与双链核酸的复合体，或将化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)、和中性脂质及/或高分子组合而成的物质与双链核酸的复合体，以及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)、化合物(II)、及/或化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的脂质粒子；由化合物(II)与核酸的复合体、或将化合物(II)和中性脂质及/或高分子组合而成的物质与核酸的复合体以及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)的脂质粒子等在制造中及制造后，由于复合体中的双链核酸与脂质膜中的阳离子性脂质的静电相互作用、复合体中的阳离子性脂质与脂质膜中的阳离子性脂质的融合，复合体及膜的结构发生位移而得到的脂质粒子，也分别包含在下述的各脂质粒子中，所述脂质粒子是：由化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)与双链核酸的复合体，或将化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)、和中性脂质及/或高分子组合而成的物质与双链核酸的复合体以及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)、化合物(II)、及/或化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的脂质粒子；由化合物(II)与核酸的复合体，或将化合物(II)、和中性脂质及/或高分子组合而成的物质与核酸的复合体以及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)的脂质粒子等。
作为本发明中的脂质粒子，更优选下述脂质粒子，其由化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)与双链核酸的复合体，或将化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)、和中性脂质及/或高分子组合而成的物质与双链核酸的复合体，以及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)、化合物(II)、或化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质；更优选下述脂质粒子，其由化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)与双链核酸的复合体，或将化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)、和中性脂质及/或高分子组合而成的物质与双链核酸的复合体，以及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)、或化合物(I)及化合物(II)；进一步优选下述脂质粒子，其由化合物(I)、或将化合物(I)和中性脂质组合而成的物质与双链核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)；或者由化合物(II)、或将化合物(II)和中性脂质组合而成的物质与双链核酸的复合体及将该复合体封入的脂质膜构成，在脂质膜中含有化合物(I)及化合物(II)。
该复合体中的化合物(I)及化合物(II)的分子的总数相对于该双链核酸的磷原子的数目优选为0.5～4倍，更优选为1.5～3.5倍，进一步优选为2～3倍。另外，该复合体中的化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的分子的总数相对于该双链核酸的磷原子的数目优选为0.5～4倍，更优选为1.5～3.5倍，进一步优选为2～3倍。
本发明的脂质粒子中，当由复合体及将该复合体封入的脂质膜构成时，该脂质粒子中的化合物(I)及化合物(II)的分子的总数相对于该双链核酸的磷原子的数目优选为1～10倍，更优选为2.5～9倍，进一步优选为3.5～8倍。另外，该脂质粒子中的化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的分子的总数相对于该双链核酸的磷原子的数目优选为1～10倍，更优选为2.5～9倍，进一步优选为3.5～8倍。
作为中性脂质，可以为单纯脂质、复合脂质或者衍生脂质中的任一种，例如可以举出磷脂(phospholipid)、甘油糖脂(glyceroglycolipid)、鞘糖脂(sphingoglycolipid)、鞘氨基醇(sphingoid)或者甾醇(sterol)等，但不限于此。
本发明的脂质纳米粒子中含有中性脂质时，相对于化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的分子的总数而言，中性脂质的分子的总数优选为0.1～1.8倍，更优选为0.3～1.1倍，进一步优选为0.4～0.9倍。本发明中的脂质粒子可以在复合体中含有中性脂质，也可以在将该复合体封入的脂质膜中含有中性脂质，更优选至少在将该复合体封入的脂质膜中含有中性脂质，进一步优选在该复合体及该将该复合体封入的脂质膜中均含有中性脂质。
作为中性脂质中的磷脂，可以举出例如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)(具体而言，大豆磷脂酰胆碱(soybean phosphatidylcholine)、蛋黄磷脂酰胆碱(egg yolkphosphatidylcholine)(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoyl phosphatidylcholine)(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine)(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine)(POPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoyl phosphatidylcholine)(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)等)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)(具体而言，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine)(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine)(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine)(DOPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dimyristoylphosphoethanolamine)(DMPE)、16-0-单甲基PE(16-0-monomethyl PE)、16-0-二甲基PE(16-0-dimethyl PE)、18-1-反式PE(18-1-trans PE)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine)(POPE)、1-硬酯酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine)(SOPE)等)、甘油磷脂(glycerophospholipid)(具体而言，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)、磷脂酸(phosphatidic acid)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(palmitoyloleoylphosphatidylglycerol)(POPG)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)等)、神经鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)(具体而言，神经鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸乙醇胺神经酰胺(ceramide phosphoethanolamine)、神经酰胺磷酸甘油(ceramidephosphoglycerol)、磷酸甘油磷酸神经酰胺(ceramide phosphoglycerophosphate)等)、甘油磷酸脂(glycerophosphonolipid)、神经鞘磷酸脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(natural lecithin)(具体而言蛋黄卵磷脂(egg yolk lecithin)、大豆卵磷脂(soybeanlecithin)等)或者氢化磷脂(hydrogenated phospholipid)(具体而言氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenated soybean phosphatidylcholine)等)等天然或者合成的磷脂。
作为中性脂质中的甘油糖脂，可以举出例如硫氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基甘油二酯(diglycosyl diglyceride)、二半乳糖甘油二酯(digalactosyl diglyceride)、半乳糖甘油二酯(galactosyl diglyceride)或者糖基甘油二酯(glycosyl diglyceride)等。
作为中性脂质中的鞘糖脂，可以举出例如半乳糖基脑苷脂(galactosylcerebroside)、乳糖脑苷脂(lactosyl cerebroside)或者神经节苷脂(ganglioside)等。
作为中性脂质中的鞘氨基醇，可以举出例如鞘氨糖(sphingan)、二十鞘氨糖(icosasphingan)、鞘氨醇(sphingosine)或者它们的衍生物等。作为衍生物，可以举出将例如鞘氨糖、二十鞘氨糖或者鞘氨醇等的-NH2转化为-NHCO(CH2)xCH3(式中，x为0～18的整数，其中优选6、12或者18)的产物等。
作为中性脂质中的甾醇，可以举出例如胆固醇(cholesterol)、二氢胆甾醇(dihydrocholesterol)、羊毛甾醇(lanosterol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、菜油甾醇(campesterol)、豆甾醇(stigmasterol)、菜子甾醇(brassicasterol)、麦角钙化甾醇(ergocasterol)、岩藻甾醇(fucosterol)或者3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterol)(DC-Chol)等。
作为中性脂质，可优选举出磷脂、甾醇等，可更优选举出磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇，可进一步优选举出磷脂酰乙醇胺、胆固醇及它们的组合。
作为高分子，可以举出例如蛋白质、白蛋白(albumin)、葡聚糖(dextran)、polyfect、脱乙酰壳多糖(chitosan)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)、例如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺(isopropylacrylamide)-丙烯基吡咯烷酮(acrylpyrrolidone)共聚物、聚乙二醇修饰树状聚体(dendrimer)、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸或者聚乙二醇化聚乳酸等高分子或者它们的盐中的1种以上。
此处，高分子中的盐，包括例如金属盐、铵盐、酸加成盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，可以举出例如锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐，镁盐、钙盐等碱土金属盐，铝盐或者锌盐等。作为铵盐，可以举出例如铵或者四甲基铵等盐。作为酸加成盐，可以举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或者磷酸盐等无机酸盐，及乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐或者柠檬酸盐等有机酸盐。作为有机胺加成盐，可以举出例如吗啉或者哌啶等的加成盐。作为氨基酸加成盐，可以举出例如甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者赖氨酸等的加成盐。
另外，本发明中的脂质粒子优选还含有水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。该水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物可以在复合体中含有，也可在将复合体封入的脂质膜中含有，更优选在复合体及将该复合体封入的脂质膜中均含有。
当本发明的脂质粒子中含有水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物时，水溶性高分子的脂质衍生物及脂肪酸衍生物的分子的总数相对于化合物(I)及化合物(II)、以及化合物(I)及化合物(II)以外的阳离子性脂质的分子的总数优选为0.05～0.3倍，更优选为0.07～0.25倍，进一步优选为0.1～0.2倍。
水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物优选为具有两面性的物质：具有分子的一部分与脂质粒子的其他构成成分通过例如疏水性亲和力、静电相互作用等进行结合的性质，并且具有其他部分与制造脂质粒子的时的溶剂通过例如亲水性亲和力、静电相互作用等进行结合的性质。
作为水溶性高分子的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可以举出例如聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、脱乙酰壳多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺、聚-L-赖氨酸、甘露聚糖、普鲁兰多糖(pullulan)、寡甘油(oligoglycerol)等或者它们的衍生物、与上述脂质粒子的定义中举出的中性脂质、化合物(I)或化合物(II)、或者例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸或月桂酸等脂肪酸结合而形成的产物、它们的盐等，较优选举出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物及它们的盐，更优选举出聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物及它们的盐。
作为聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可以举出例如聚乙二醇化脂质(具体而言，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具体而言，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DMPE)等)、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯蓖麻油(CREMOPHOR EL)等)、聚乙二醇山梨糖醇酐脂肪酸酯类(具体而言，聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯等)或者聚乙二醇脂肪酸酯类等，较优选举出聚乙二醇化脂质，进一步优选举出PEG-DSPE、PEG-DMPE。
作为聚甘油衍生物的脂质衍生物或者脂肪酸衍生物，可以举出例如聚甘油化脂质(具体而言，聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)或者聚甘油脂肪酸酯类等，较优选举出聚甘油化脂质。
另外，还可以任意地对本发明的脂质粒子进行基于例如水溶性高分子、聚氧乙烯衍生物等的表面改性(参见D.D.Lasic、F.Martin编，“Stealth Liposomes”(美国)，CRCPress Inc，1995年，第93-102页)。作为可以用于表面改性的高分子，可以举出例如葡聚糖、普鲁兰多糖、甘露聚糖、支链淀粉(Amylopectin)或者羟乙基淀粉等。作为聚氧乙烯衍生物，可以举出例如聚山梨醇酯80、普朗尼克F68、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇或者PEG-DSPE等。通过该表面改性，可以使脂质粒子中的复合体及脂质膜中含有水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。
本发明中的脂质粒子的平均粒径可以根据期望而自由选择，优选形成为下述平均粒径。作为调节平均粒径的方法，可以举出例如挤出法(extrusion method)、将较大的多层脂质体(MLV)等机械粉碎(具体而言，使用Manton-gaulin、高压微射流均质机(microfluidizer)等)的方法(参见R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm编著，“难溶药物的乳液和纳米混悬剂的配方(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of PoorlySoluble Drugs)”，德国，Scientific Publishers Stuttgart，1998年，第267-294页)等。
对于本发明中的脂质粒子的大小而言，平均粒径优选为约10nm～1000nm，更优选为约30nm～300nm，进一步优选为约50nm～200nm。
通过将本发明的组合物施予至哺乳类的细胞，可将本发明的组合物中的双链核酸导入到细胞内。
作为在体内将本发明的组合物向哺乳类的细胞导入的方法，按照能在体内进行的已知的转染步骤进行即可。例如，通过将本发明的组合物静脉内施予至包括人在内的哺乳动物，可送达至例如产生了癌或炎症的器官或部位，可向送达器官或部位的细胞内导入本发明的组合物中的双链核酸。作为产生了癌或炎症的器官或部位，没有特别限制，可举出例如胃、大肠、胰脏、胃、小肠、肝脏、肺、脾脏、肾脏、膀胱、皮肤、血管、眼球、食道等，可优选举出大肠、胰脏、胃、小肠、肝脏或食道。另外，通过将本发明的组合物静脉内施予至包括人在内的哺乳动物，可送达至例如血管、肝脏、肺、脾脏及/或肾脏，可向送达器官或部位的细胞内导入本发明的组合物中的双链核酸。血管、肝脏、肺、脾脏及/或肾脏的细胞可以是正常细胞。
在送达器官或部位的细胞内导入了本发明的组合物中的双链核酸后，可降低该细胞内的CKAP5基因的表达，治疗CKAP5相关疾病，例如白血病、黑色素瘤、细胞瘤、癌、肿瘤、腺瘤等。
即，通过将本发明的组合物施予至哺乳动物，可降低CKAP5基因的表达，治疗CKAP5相关疾病，例如白血病、黑色素瘤、细胞瘤、癌、肿瘤、腺瘤等。施予对象优选是人。
另外，本发明中的组合物还可作为在关于癌的治疗剂或预防剂的体内的药效评价模型中用于验证抑制CKAP5基因的有效性的工具使用。
当将本发明的组合物作为癌的治疗剂或预防剂使用时，作为施予途径，优选使用在治疗时最有效的施予途径，可优选举出静脉内施予或肌肉内施予，可更优选举出静脉内施予。
施予量根据施予对象的病状、年龄、施予途径等的不同而不同，例如以换算为双链核酸的1天施予量为约0.1μg～1000mg的量施予即可。
作为适合于静脉内施予或肌肉内施予的制剂，可以举出例如注射剂，通过上述方法制备的脂质粒子的分散液可以直接以例如注射剂等的形态使用，还可以从该分散液中通过例如过滤、离心分离等除去溶剂而进行使用，还可以将该分散液冷冻干燥而进行使用、及/或将加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖或甘氨酸等赋形剂的分散液冷冻干燥而进行使用。
在注射剂的情况下，优选在上述的脂质粒子的分散液、或将上述溶剂除去或进行冷冻干燥而得到的组合物中，混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水或氨基酸输注液等，配制成注射剂。另外，还可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或EDTA等抗氧化剂，或甘油、葡萄糖或氯化钠等等渗剂等，配制成注射剂。另外，还可以加入例如甘油等冷冻保存剂进行冷冻保存。
接下来，利用实施例、参考例及试验例具体地说明本发明。但本发明不受这些实施例及试验例的限制。
需要说明的是，参考例中所示的质子核磁共振谱(1H NMR)是在270MHz、300MHz或400MHz下测得的。根据化合物及测定条件不同，有时不能清楚地观测到交换性质子。需要说明的是，作为信号的多重度的符号，使用通常使用的符号，br表示是表观宽信号。
参考例1
甲基二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(化合物II-1)
向甲基胺(Aldrich公司制，约2mol/L的四氢呋喃溶液，10.5mL，21.0mmol)中加入甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，1.03g，3.00mmol)，使用微波反应装置于150℃加热搅拌90分钟。用乙酸乙酯稀释反应液，用2mol/L氢氧化钠水溶液洗涤，接着用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，在减压下进行浓缩，由此得到甲基((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺的粗产物。
向得到的粗产物中加入甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，0.93g，2.70mmol)及50％氢氧化钠水溶液(0.960g，12.0mmol)，在油浴上于135℃加热搅拌60分钟。冷却至室温后，用乙酸乙酯稀释反应液，用水洗涤，接着用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后过滤，在减压下进行浓缩。利用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～97/3)对得到的残余物进行纯化，得到化合物II-1(1.07g，67.2％)。
ESI-MS m/z:529(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.7Hz,6H),1.29(br s,32H),1.40-1.51(m,4H),1.97-2.06(m,8H),2.20(s,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,4H),2.77(t,J＝5.8Hz,4H),5.28-5.43(m,8H).
参考例2
甲基二((Z)-十六碳-9-烯基)胺(化合物II-2)
利用与参考例1同样的方法，使用甲基胺(Aldrich公司制，约2mol/L四氢呋喃溶液，10.0mL，20.0mmol)及甲磺酸(Z)-十六碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，1.21g，3.80mmol)，得到化合物II-2(0.491g，51.6％)。
ESI-MS m/z:477(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.7Hz,6H),1.29(br s,36H),1.46-1.57(m,4H),1.97-2.05(m,8H),2.33(s,3H),2.45(t,J＝7.9Hz,4H),5.29-5.41(m,4H).
参考例3
甲基二((11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基)胺(化合物II-3)
利用与参考例1同样的方法，使用甲基胺(Aldrich公司制，约2mol/L四氢呋喃溶液，16.0mL，32.0mmol)及甲磺酸(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，2.98g，8.00mmol)，得到化合物II-3(1.27g，54.4％)。
ESI-MS m/z:585(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.7Hz,6H),1.27(br s,40H),1.39-1.51(m,4H),2.01-2.09(m,8H),2.20(s,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,4H),2.79(d,J＝6.3Hz,4H),5.28-5.43(m,8H).
参考例4
二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)胺(化合物II-4)
利用与参考例1同样的方法，使用氨(东京化成工业公司制，约2mol/L甲醇溶液，18.0mL，36.0mmol)及甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，2.79g，8.10mmol)，得到化合物II-4(0.838g，36.2％)。
ESI-MS m/z:515(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.9Hz,6H),1.30(br s,33H),1.41-1.54(m,4H),2.01-2.09(m,8H),2.59(t,J＝7.2Hz,4H),2.77(t,J＝5.6Hz,4H),5.28-5.43(m,8H).
参考例5
二((Z)-十八碳-9-烯基)胺(化合物II-5)
利用与参考例1同样的方法，使用氨(东京化成工业公司制，约2mol/L甲醇溶液，12.0mL，24.0mmol)及甲磺酸(Z)-十八碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，1.87g，5.40mmol)，得到化合物II-5(0.562g，36.2％)。
ESI-MS m/z:519(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.7Hz,6H),1.29(br s,45H),1.41-1.52(m,4H),1.97-2.05(m,8H),2.58(t,J＝7.2Hz,4H),5.28-5.40(m,4H).
参考例6
甲基二((Z)-十八碳-9-烯基)胺(化合物II-6)
利用与参考例1同样的方法，使用甲基胺(Aldrich公司制，约2mol/L四氢呋喃溶液，11.2mL，22.4mmol)及甲磺酸(Z)-十八碳-9-烯基酯(Nu-Chek Prep,Inc公司制，2.11g，6.09mmol)，得到化合物II-6(1.20g，70.2％)。
ESI-MS m/z:533(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.6Hz,6H),1.27(br s,44H),1.39-1.50(m,4H),1.97-2.06(m,8H),2.20(s,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,4H),5.28-5.40(m,4H).
参考例7
反式-1-(叔丁氧基羰基)-3,4-双(((Z)-十八碳-9-烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物VII-1)
将参考国际公开第2006/100036号合成出的反式-3,4-双(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(156mg，0.674mmol)溶解在二氯甲烷(6mL)中，加入油酸(东京化成工业公司制，419mg，1.48mmol)、水溶性碳化二亚胺(WSCD)(国产化学公司制，297mg，1.55mmol)及4-二甲基氨基吡啶(东京化成工业公司制，DMAP(20.6mg，0.169mmol))，在室温下搅拌一夜。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行萃取。用水及饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥，然后在减压下进行浓缩。利用硅胶柱色谱法(己烷/氯仿＝50/50～0/100)对残余物进行纯化，由此得到化合物VII-1(280mg，54.6％)。
ESI-MS m/z:761(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.6Hz,6H),1.25-1.46(m,36H),1.46(s,9H),1.46-1.66(m,8H),1.97-2.04(m,8H),2.27-2.38(m,6H),3.10-3.23(m,2H),3.53-3.66(m,2H),4.03(dd,J＝10.8,6.0Hz,2H),4.14(dd,J＝10.8,6.0Hz,2H),5.28-5.40(m,4H).
参考例8
反式-1-(叔丁氧基羰基)-3,4-双(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物VII-2)
利用与参考例7同样的方法，使用参考国际公开第2006/100036号合成出的反式-3,4-双(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(150mg，0.674mmol)及亚油酸(Aldrich公司制，400mg，1.48mmol)，得到化合物VII-2(351mg，71.7％)。
ESI-MS m/z:757(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.21-1.45(m,26H),1.46(s,9H),1.47-1.68(m,6H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),2.26-2.38(m,6H),2.77(t,J＝5.9Hz,4H),3.10-3.23(m,2H),3.53-3.66(m,2H),4.03(dd,J＝11.0,6.0Hz,2H),4.14(dd,J＝11.0,6.0Hz,2H),5.28-5.43(m,8H).
参考例9
反式-3,4-双(((Z)-十八碳-9-烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物I-1)
将参考例7中得到的化合物VII-1(278mg，0.366mmol)溶解在二氯甲烷(6mL)中，加入三氟乙酸(0.563mL，7.31mmol)，在室温下进行3小时搅拌。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿萃取水层。用饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，在减压下进行浓缩。将得到的残余物溶解在少量的甲醇中，使其吸附于填充在塑料柱中的BONDESIL-SCX(VARIAN公司制，6g)的上部，用甲醇洗涤，接着，用氨·甲醇溶液(东京化成工业公司制，2mol/L)洗脱目标物。通过在减压下浓缩包含目标物的级分而得到化合物I-1(162mg，67.2％)。
ESI-MS m/z:661(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.6Hz,6H),1.27-1.35(m,40H),1.56-1.64(m,4H),2.01(q,J＝5.9Hz,8H),2.09-2.16(m,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,4H),2.72(dd,J＝11.3,5.5Hz,2H),3.11(dd,J＝11.3,7.1Hz,2H),3.99-4.12(m,4H),5.29-5.40(m,4H).
参考例10
反式-3,4-双(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物I-2)
利用与参考例9同样的方法，使用参考例8中得到的化合物VII-2(350mg，0.463mmol)，得到化合物I-2(224mg，73.6％)。
ESI-MS m/z:657(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.26-1.40(m,28H),1.57-1.66(m,4H),2.05(q,J＝6.6Hz,8H),2.09-2.17(m,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,4H),2.72(dd,J＝11.3,6.0Hz,2H),2.77(t,J＝6.2Hz,4H),3.11(dd,J＝11.3,7.3Hz,2H),3.99-4.13(m,4H),5.28-5.43(m,8H).
参考例11
反式-1-甲基-3,4-双(((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物I-3)
将参考例10中得到的化合物I-2(80mg，0.12mmol)溶解在1,2-二氯乙烷(1.5mL)、甲醇(1.5mL)中，经过多次来添加甲醛(0.091mL，1.22mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(AcrosOrganics公司制，129mg，0.610mmol)，在室温下进行1.5小时搅拌。向反应溶液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取水层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥后过滤，在减压下进行浓缩。利用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～93/7)对得到的残余物进行纯化，由此得到化合物I-3(66mg，81％)。
ESI-MS m/z:671(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.89(t,J＝6.8Hz,6H),1.25-1.40(m,28H),1.57-1.66(m,4H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),2.13-2.24(m,2H),2.27-2.37(m,9H),2.66(dd,J＝9.2,7.3Hz,2H),2.77(t,J＝5.7Hz,4H),3.99-4.12(m,4H),5.28-5.43(m,8H).
参考例12
反式-1-甲基-3,4-双(((Z)-十八碳-9-烯酰基氧基)甲基)吡咯烷(化合物I-4)
利用与参考例11同样的方法，使用参考例9中得到的化合物I-1(50mg，0.076mmol)，得到化合物I-4(47mg，92％)。
ESI-MS m/z:675(M+H)+；1H-NMR(CDCl3)δ:0.88(t,J＝6.6Hz,6H),1.26-1.35(m,40H),1.56-1.65(m,4H),2.01(q,J＝5.5Hz,8H),2.15-2.24(m,2H),2.27-2.37(m,9H),2.67(dd,J＝9.3,7.1Hz,2H),3.99-4.12(m,4H),5.29-5.40(m,4H).
实施例1
使用参考例1中得到的化合物II-1及参考例11中得到的化合物I-3、及表3的siRNAA或B，按照以下方式制造制剂。
将双链核酸溶解到蒸馏水中，配制成24mg/mL来使用(以下称为siRNA溶液)。
以化合物II-1/PEG-DSPE Na＝57.3/5.52mmol/L的量将各脂质悬浮于含有盐酸及乙醇的水溶液中，利用涡旋(vortex)搅拌混合机进行搅拌，以及反复进行加热，得到均匀的悬浮液。在室温下使该悬浮液通过0.2μm的聚碳酸酯膜滤器及0.05μm的聚碳酸酯膜滤器，得到了前导(lead)粒子的分散液。利用粒径测定装置(Zetasizer Nano ZS，MalvernInstruments公司制)测定得到的前导粒子的平均粒径，确认了在30nm～100nm的范围内。以3:1(＝前导粒子的分散液:siRNA溶液)的比例在得到的前导粒子的分散液中混合siRNA溶液，进而加入3倍量的蒸馏水，进行混合，从而制备了阳离子性脂质/双链核酸复合体粒子的分散液。
另一方面，以化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/胆固醇＝2.98/5.97/2.94/5.71/11.8mmol/L的量称量各脂质，并将其溶解在90vol％乙醇中，制备脂质膜构成成分的溶液。
将得到的脂质膜构成成分的溶液加热，然后以1:1的比例混合得到的阳离子性脂质/双链核酸复合体粒子的分散液，进而混合数倍量的蒸馏水，得到了粗制剂。
使用Amicon Ultra(Millipore公司制)对得到的粗制剂进行浓缩，进而将溶剂置换成生理盐水，使用0.2μm的滤器(东洋滤纸公司制)在洁净台内进行过滤。进而测定得到的制剂的siRNA浓度，使用生理盐水稀释至以siRNA浓度计为1.0mg/mL，由此，得到了制剂1-A及1-B(含有化合物II-1及化合物I-3作为脂质、含有siRNA A或B作为双链核酸的组合物)。使用粒径测定装置，测定了制剂中的脂质粒子的平均粒径。将结果示于表4。
[表4]
制剂 1-A 1-B
siRNA A B
得到的制剂的粒径(nm) 86 86
实施例2
使用参考例1中得到的化合物II-1及参考例11中得到的化合物I-3、及表3的siRNAC～F，利用与实施例1同样的方法得到制剂1-C～F(含有化合物II-1及化合物I-3作为脂质、含有siRNA C～F作为双链核酸的组合物)。用粒径测定装置进行测定。将结果示于表5。
[表5]
制剂 1-C 1-D 1-E 1-F
siRNA C D E F
得到的制剂的粒径(nm) 81 80 83 83
实施例3
使用参考例1中得到的化合物II-1及参考例11中得到的化合物I-3、及表3的siRNAB、D、E及G，利用与实施例1同样的方法得到制剂1-B’、1-D’、1-E’及1-G(含有化合物II-1及化合物I-3作为脂质、含有siRNA B、D、E及G作为双链核酸的组合物)。利用粒径测定装置进行测定。将结果示于表6。
[表6]
制剂 1-B’ 1-D’ 1-E’ 1-G
siRNA B D E G
得到的制剂的粒径(nm) 84 84 86 83
实施例4
使用参考例1中得到的化合物II-1及参考例11中得到的化合物I-3、及表3的siRNAA或B，利用与实施例1同样的方法得到制剂1-A’及1-B”(含有化合物II-1及化合物I-3作为脂质、含有siRNA A及B作为双链核酸的组合物)。利用粒径测定装置进行测定。将结果示于表7。
[表7]
制剂 1-A’ 1-B”
siRNA A B
得到的制剂的粒径(nm) 85 85
实施例5
使用参考例1中得到的化合物II-1及参考例11中得到的化合物I-3、及表3的siRNAB、C、D、E、及F，利用与实施例1同样的方法得到制剂1-B”’、1-C”、1-D”、1-E”及1-F”(含有化合物II-1及化合物I-3作为脂质、含有siRNA B、C、D、E及F作为双链核酸的组合物)。利用粒径测定装置进行测定。将结果示于表8。
[表8]
制剂 1-B”’ 1-C” 1-D” 1-E” 1-F”
siRNA B C D E F
得到的制剂的粒径(nm) 78 79 79 80 81
试验例1
使用实施例1中得到的制剂1-A～B，分别通过以下的方法实施了体内mRNA敲低(knockdown)评价试验。
作为来自人胰脏癌的细胞株的MIA PaCa-2由JCRB细胞库(Cell Bank)获得，使用包含10％灭活胎牛血清(GIBCO公司制)及1vol％青霉素-链霉素(GIBCO公司制，15140-122)的含高浓度葡萄糖的DMEM培养基(GIBCO公司制，11995-065)在37℃、5％CO2条件下进行培养。以1.6×108个细胞/mL的浓度将MIA PaCa-2悬浮在磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，将50μL该细胞悬浮液移植到SCID小鼠(由CLEA Japan获得)的背部皮下(8×106个细胞/0.05mL磷酸缓冲生理盐水(PBS)/只)。以肿瘤体积为指标进行分组，每组5只，将相当于siRNA为10mg/kg的量的实施例1中得到的各制剂静脉内施予至小鼠。对于生理盐水施予组，施予生理盐水10mL/kg。在施予前和施予48小时后测定小鼠的体重。测定体重后，对小鼠实施安乐死，摘出皮下肿瘤。立即用液氮将摘出的肿瘤冷冻，将其在-80℃保存直到使用。
针对得到的肿瘤样品，向放入了样品的2mL圆底试管(tube)中添加0.5mL的Trizol试剂(Invitrogen制，10296-028)及5mm的氧化锆球(Zirconia ball)(AS ONE制，5-4060-13)，用Tissue lyser II(QIAGEN制)在1/25freq、1.5分钟、2次的条件下将其破碎。破碎后进行离心(10000rpm，10分钟)，回收上清液，添加200μL的氯仿，剧烈搅拌，然后再次进行离心(15000rpm，15分钟)。利用200μL得到的上清，使用高通量核酸提取仪MagNA Pure 96(Roche制，5195322)及Cellular RNA Large Volume Kit(Roche制，5467535)遵循所附的使用说明来提取RNA。使用吸光光度计DropSense 96(Trinean制)测定提取的RNA的浓度，使用Transcriptor(Roche制，4897030)，对相当于500-1000ng的RNA进行逆转录。反应液、反应条件遵循Transcriptor所附的使用说明书。用dH2O将得到的cDNA样品稀释10倍，作为定量PCR(qPCR)的模板使用。qPCR反应中使用了TaqMan Gene Expression Master Mix(AppliedBiosystems制，4369542)、TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystems制，4331182)。PCR反应的条件遵循TaqMan Gene Expression所附的使用说明书。样品的mRNA量以将生理盐水施予组中的CKAP5的mRNA量作为1时的相对比例算出。
图1中示出肿瘤中CKAP5 mRNA量。
由图1可知，实施例1中得到的各制剂与生理盐水施予组相比，抑制了CKAP5基因的表达。
试验例2
使用实施例2中得到的制剂1-C～F，分别利用与试验例1同样的方法实施了体内mRNA敲低评价试验。
图2中示出肿瘤中CKAP5 mRNA量。
由图2可知，实施例2中得到的各制剂与生理盐水施予组相比，抑制了CKAP5基因的表达。
试验例3
使用实施例2中得到的制剂1-D～E，分别通过以下的方法实施了体内mRNA敲低评价试验。
作为来自人胰脏癌的细胞株的MIA PaCa-2由JCRB细胞库(Cell Bank)获得，使用包含10％灭活胎牛血清(GIBCO公司制)及1vol％青霉素-链霉素(GIBCO公司制，15140-122)的含高浓度葡萄糖的DMEM培养基(GIBCO公司制，11995-065)在37℃、5％CO2条件下进行培养。以1.6×108个细胞/mL的浓度将MIA PaCa-2悬浮在磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，将50μL该细胞悬浮液移植到SCID小鼠(由CLEA Japan获得)的背部皮下(8×106个细胞/0.05mLPBS/只)。以肿瘤体积为指标进行分组，每组5只，将相当于siRNA为10mg/kg的量的实施例2中得到的各制剂静脉内施予至小鼠。对于生理盐水施予组，施予生理盐水10mL/kg。在施予前和施予48小时后测定小鼠的体重。测定体重后，对小鼠实施安乐死，摘出皮下肿瘤及股骨内腔骨髓细胞。立即用液氮将摘出的肿瘤及骨髓细胞冷冻，将其在-80℃保存直到使用。
针对得到的肿瘤样品，利用与试验例1同样的方法提取RNA，由提取出的RNA得到cDNA，与试验例1同样地用作qPCR反应的模板。qPCR反应中使用了TaqMan Gene ExpressionMaster Mix(Applied Biosystems制，4369542)。此外，作为引物/探针，使用分别与人小鼠的各基因对应的TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystems制，4331182)。PCR反应的条件遵循TaqMan Gene Expression所附的使用说明书。样品的mRNA量以将生理盐水施予组中的人CKAP5及小鼠CKAP5的mRNA量作为1时的相对比例算出。
图3中示出肿瘤中人CKAP5 mRNA量。
图4中示出骨髓细胞中小鼠CKAP5 mRNA量。
由图3、4可知，实施例2中得到的各制剂与生理盐水施予组相比，抑制了肿瘤中CKAP5基因的表达，另一方面，几乎未抑制正常骨髓中CKAP5基因的表达。
试验例4
使用实施例3中得到的制剂1-B’、1-D’、1-E’及1-G，利用以下的方法实施了肿瘤增殖评价试验。
与试验例1同样地，使用将作为来自人胰脏癌的细胞株的MIA PaCa-2移植到SCID小鼠中而得到的异种移植模型来实施。以肿瘤体积为指标以每组6只实施了分组(第0天)。在第0天及第7天静脉内施予相当于siRNA为10mg/kg的量的实施例3中得到的各制剂。作为对照，施予了生理盐水10mL/kg。从第0天至第21天测定了各个体的肿瘤直径，使用下式算出了肿瘤体积、体积比。
[数学式1]
肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)×0.5
[数学式2]
体积比(V/V0)＝各时间点的肿瘤体积(mm3)÷第0天的肿瘤体积(mm3)
图5～图8中示出肿瘤体积的相对值的推移。
由图5～图8可知，进行体内药效评价试验的结果是，实施例3中得到的各制剂与生理盐水施予组相比，抗肿瘤作用强。
由此可知，向哺乳动物施予本发明的组合物后，在生物体内能使CKAP5基因的表达降低，能治疗CKAP5相关疾病。
试验例5
使用实施例4中得到的制剂1-A’及1-B”，利用以下的方法实施了肿瘤增殖评价试验。
与试验例1同样地，使用将作为来自人胰脏癌的细胞株的MIA PaCa-2移植到SCID小鼠中而得到的异种移植模型来实施。以肿瘤体积为指标以每组6只实施了分组(第0天)。在第0天及第7天静脉内施予相当于siRNA为10mg/kg的量的实施例4中得到的各制剂。作为对照，施予了生理盐水10mL/kg。从第0天至第21天测定了各个体的肿瘤直径，与试验例4同样地算出了肿瘤体积、体积比。图9中示出肿瘤体积的相对值的推移。
由图9可知，进行体内药效评价试验的结果是，实施例4中得到的各制剂与生理盐水施予组相比，抗肿瘤作用强。
由此可知，向哺乳动物施予本发明的组合物后，在生物体内能使CKAP5基因的表达降低，能治疗CKAP5相关疾病。
试验例6
使用实施例5中得到的制剂1-B”’、1-C”、1-D”、1-E”及1-F”，利用以下的方法实施了肿瘤增殖评价试验。
与试验例1同样地，使用将作为来自人胰脏癌的细胞株的MIA PaCa-2移植到SCID小鼠中而得到的异种移植模型来实施。以肿瘤体积为指标以每组6只实施了分组(第0天)。在第0天及第7天静脉内施予相当于siRNA为10mg/kg的量的实施例5中得到的各制剂。作为对照，施予了生理盐水10mL/kg。从第0天至第21天测定了各个体的肿瘤直径，与试验例4同样地算出了肿瘤体积、体积比。图10、11中示出肿瘤体积的相对值的推移。
由图10、11可知，进行体内药效评价试验的结果是，实施例5中得到的各制剂与生理盐水施予组相比，抗肿瘤作用强。
由此可知，向哺乳动物施予本发明的组合物后，在生物体内能使CKAP5基因的表达降低，能治疗CKAP5相关疾病。
产业上的可利用性
将本发明的组合物施予至哺乳动物后，在生物体内能抑制CKAP5基因表达，治疗CKAP5相关疾病。
序列表中文字
序列号1-CKAP5mRNA中的靶标
序列号2-CKAP5mRNA中的靶标
序列号3-CKAP5mRNA中的靶标
序列号4-CKAP5mRNA中的靶标
序列号5-CKAP5mRNA中的靶标
序列号6-CKAP5mRNA中的靶标
序列号7-siRNA有义链
序列号8-siRNA反义链
序列号9-siRNA有义链
序列号10-siRNA反义链
序列号11-siRNA有义链
序列号12-siRNA反义链
序列号13-siRNA有义链
序列号14-siRNA反义链
序列号15-siRNA有义链
序列号16-siRNA反义链
序列号17-siRNA有义链
序列号18-siRNA反义链
序列号19-siRNA有义链
序列号20-siRNA反义链
序列表
<110> 协和发酵麒麟株式会社
<110> 戴瑟纳制药公司
<120> 抑制CKAP5基因表达的RNAi医药组合物
<130> K04F5192
<150> JP 2014-115814
<151> 2014-06-04
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<223> CKAP5 mRNA中的靶标
<400> 1
uuaagugaau uugguuccaa a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> CKAP5 mRNA中的靶标
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<212> RNA
<213> 智人
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<223> CKAP5 mRNA中的靶标
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caguaaugga uaauaaaaau c 21
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<212> RNA
<213> 智人
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<223> CKAP5 mRNA中的靶标
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gauggaaaga aacuaauuuu c 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
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<223> CKAP5 mRNA中的靶标
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<212> RNA
<213> 智人
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<223> CKAP5 mRNA中的靶标
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acauugaacc auuucugaaa a 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
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<223> RNA
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<223> am
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<221> 经修饰碱基
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<223> gm
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<221> 经修饰碱基
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<223> um
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<221> 经修饰碱基
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<223> cm
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<223> um
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uuaagugaau uugguuccaa aauca 25
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<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
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<221> 经修饰碱基
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<223> um
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<221> 经修饰碱基
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<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
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<220>
<221> 经修饰碱基
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<220>
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<223> gm
<400> 8
ugauuuugga accaaauuca cuuaagg 27
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(2)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (6)..(6)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (8)..(8)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (18)..(18)
<223> um
<400> 9
caacaagaac uagaagcuaa auugg 25
<210> 10
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(2)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (3)..(4)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
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<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (25)..(27)
<223> gm
<400> 10
ccaauuuagc uucuaguucu uguuggg 27
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(2)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (5)..(5)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
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<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (17)..(18)
<223> am
<400> 11
caguaaugga uaauaaaaau ccaac 25
<210> 12
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(3)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (17)..(17)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (25)..(25)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
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<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (27)..(27)
<223> um
<400> 12
guuggauuuu uauuauccau uacugcu 27
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(2)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (6)..(7)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
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<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (18)..(19)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> gm
<400> 13
gauggaaaga aacuaauuuu caggt 25
<210> 14
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(3)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (17)..(17)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (25)..(26)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (27)..(27)
<223> am
<400> 14
accugaaaau uaguuucuuu ccaucca 27
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (6)..(6)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (18)..(18)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> cm
<400> 15
ggaugucauu cguaaagaug uucgt 25
<210> 16
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(2)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (3)..(3)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (17)..(17)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (25)..(25)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (26)..(27)
<223> um
<400> 16
acgaacaucu uuacgaauga cauccuu 27
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(2)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (5)..(5)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (17)..(17)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (18)..(18)
<223> am
<400> 17
acauugaacc auuucugaaa aautc 25
<210> 18
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(1)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(3)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (17)..(17)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (25)..(25)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (26)..(26)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (27)..(27)
<223> am
<400> 18
gaauuuuuca gaaaugguuc aauguca 27
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA/RNA 杂合分子
<220>
<223> siRNA有义
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNA
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (2)..(2)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (4)..(4)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (5)..(6)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (8)..(8)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (12)..(12)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (14)..(14)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (16)..(16)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (18)..(18)
<223> um
<400> 19
caacaagaac uagaagcuaa auugg 25
<210> 20
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (1)..(2)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (3)..(4)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (9)..(9)
<223> gm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (13)..(13)
<223> cm
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (15)..(15)
<223> am
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> um
<220>
<221> 经修饰碱基
<222> (25)..(27)
<223> gm
<400> 20
ccaauuuagc uucuaguucu uguuggg 27

Claims (23)

1.一种组合物，其含有下述脂质粒子，所述脂质粒子含有：
作为药物的双链核酸，所述双链核酸具有有义链及反义链，所述有义链和所述反义链具有至少25个碱基对，所述反义链具有与序列号1～6中任一的CKAP5基因的mRNA的连续至少19个碱基的序列互补的碱基序列，具有最长为35个核苷酸的长度；和
式(I)表示的阳离子性脂质，
式(I)中，R1及R2相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，
L1及L2相同或不同，为-CO-O-或-O-CO-，
a及b相同或不同，为1～3，
R3为氢原子、碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，脂质粒子是进一步含有式(II)表示的阳离子性脂质的脂质粒子，
式(II)中，R4及R5相同或不同，为碳原子数为12～24的直链状或支链状的烷基、链烯基或炔基，
R6为氢原子、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为3～6的链烯基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，R4及R5相同，为十二烷基、十三烷基、十四烷基、2,6,10-三甲基十一烷基、十五烷基、3,7,11-三甲基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、6,10,14-三甲基十五烷-2-基、十九烷基、2,6,10,14-四甲基十五烷基、二十烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
4.如权利要求2所述的组合物，其中，R4及R5相同，为十四烷基、十六烷基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(Z)-二十碳-11-烯基或(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基。
5.如权利要求3或4所述的组合物，其中，R6为氢原子、甲基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1～3个的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或吗啉基取代的碳原子数为1～6的烷基或碳原子数为3～6的链烯基。
6.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，R3为氢原子或甲基。
7.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，L1及L2为-O-CO-，R1及R2相同，为十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、(Z)-十四碳-9-烯基、(Z)-十六碳-9-烯基、(Z)-十八碳-6-烯基、(Z)-十八碳-9-烯基、(E)-十八碳-9-烯基、(Z)-十八碳-11-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯基、(Z)-二十碳-11-烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯基或3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基。
8.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，L1及L2为-CO-O-，R1及R2相同，为十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、二十三烷基、(Z)-十三碳-8-烯基、(Z)-十五碳-8-烯基、(Z)-十七碳-5-烯基、(Z)-十七碳-8-烯基、(E)-十七碳-8-烯基、(Z)-十七碳-10-烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、(Z)-十九碳-10-烯基、(10Z,13Z)-十九碳-10,13-二烯基、(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯基、2,6,10-三甲基十一碳-1,5,9-三烯基或2,6,10,14-四甲基十五碳-1-烯基。
9.如权利要求1～8中任一项所述的组合物，其中，作为药物含有下述双链核酸，所述双链核酸具有分别为序列号7及8、序列号9及10、序列号11及12、序列号13及14、序列号15及16、序列号17及18、或序列号19及20的有义链及反义链。
10.如权利要求1～9中任一项所述的组合物，其中，阳离子性脂质与所述双链核酸形成复合体，或者，形成阳离子性脂质组合中性脂质及/或高分子而成的物质与所述双链核酸的复合体。
11.如权利要求1～9中任一项所述的组合物，其中，阳离子性脂质与所述双链核酸形成复合体，或者，形成阳离子性脂质与中性脂质及/或高分子组合而成的物质与所述双链核酸的复合体，脂质粒子是由所述复合体和将所述复合体封入的脂质膜构成的脂质粒子。
12.一种抑制CKAP5基因的表达的方法，所述方法包括下述步骤：使用权利要求1～11中任一项所述的组合物，向细胞内导入所述双链核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中，细胞是位于哺乳类的肿瘤中的细胞。
14.如权利要求12所述的方法，其中，细胞是位于哺乳类的大肠、胰脏、胃、小肠、肝脏或食道中的细胞。
15.如权利要求12～14中任一项所述的方法，其中，向细胞内导入的方法是通过静脉内施予而向细胞内导入的方法。
16.CKAP5相关疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向哺乳动物施予权利要求1～11中任一项所述的组合物的步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其中，施予的方法是静脉内施予。
18.癌的治疗方法，所述治疗方法包括向哺乳动物施予权利要求1～11中任一项所述的组合物的步骤。
19.如权利要求18所述的方法，其中，施予的方法是静脉内施予。
20.用于治疗CKAP5相关疾病的医药品，其包含权利要求1～11中任一项所述的组合物。
21.如权利要求20所述的医药品，其用于静脉内施予。
22.癌的治疗剂，其包含权利要求1～11中任一项所述的组合物。
23.如权利要求22所述的癌的治疗剂，其用于静脉内施予。
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