CN116367718A

CN116367718A - 脂质纳米粒子

Info

Publication number: CN116367718A
Application number: CN202180067522.1A
Authority: CN
Inventors: 佐藤悠介; 原岛秀吉; 桥场一毅; 田口将光; 坂元左知子; 宍户卓矢; 大津彩夏; 前田佳己
Original assignee: Hokkaido University NUC; Nitto Denko Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; Nitto Denko Corp
Priority date: 2020-10-02
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2023-06-30
Also published as: WO2022071582A1; KR20230080451A; CA3194148A1; AU2021355199A1; TW202228652A; JPWO2022071582A1; IL301837A; EP4223314A1; US20240024252A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种作为可选择性地递送至肝脏或脾脏的基因递送载体的脂质纳米粒子，其含有下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质，式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1；R¹和R²各自独立地表示通式(A)表示的基团；式(A)中，R¹¹和R¹²各自独立地表示直链状或支链状的C_2‑15烷基；c表示0或1：v表示4～12的整数；X表示通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基团；式(B)中，d表示0～3的整数；R³和R⁴各自独立地表示C_1‑4烷基或C_2‑4链烯基，R³和R⁴可以相互键合形成5～7元非芳香族杂环。(R¹)(R²)C(OH)‑(CH₂)a‑(O‑CO)b‑X (I)(R¹¹)(R¹²)‑CH‑(CO‑O)_c‑(CH₂)_v‑ (A)‑(CH₂)d‑N(R³)(R⁴) (B)

Description

脂质纳米粒子

技术领域

本发明涉及一种作为可选择地递送至肝脏或脾脏的基因递送载体有用的脂质纳米粒子。

背景技术

作为用于封入脂溶性药物、siRNA(short interfering RNA，短干扰RNA)、mRNA等核酸并向靶细胞递送的载体，利用脂质纳米粒子(LNP)。例如，作为用于将siRNA等核酸高效地递送到靶细胞内的载体的脂质纳米粒子，报告了含有在生理性pH下为电中性、在胞饮体等弱酸性pH环境下转化为阳离子性的pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质的脂质纳米粒子(专利文献1和非专利文献1)。

作为pH敏感性阳离子性脂质，例如Jayaraman等开发了DLin-MC3-DMA，在小鼠肝脏中的第七因子(F7)敲减中，实现了0.005mg siRNA/kg的ED₅₀(非专利文献2)。本发明者们迄今为止也开发了独自的pH敏感性阳离子性脂质YSK05和YSK13-C3，作为F7敲减时的ED₅₀，分别实现了0.06、0.015mg siRNA/kg(非专利文献3-5)。另外，Maier等开发了对MC3-DMA赋予生物降解性而得到的L319，并报告了其兼顾0.01mg siRNA/kg的ED₅₀和高安全性(非专利文献6-8)。然而，也清楚了含有这些pH敏感性阳离子性脂质的脂质纳米粒子的胞饮体脱出效率仍然仅为百分之几左右(非专利文献9)，期望开发出能够进一步提高生物利用度的技术。

此外，Dong等通过高通量筛选发现了独自的脂质样物质cKK-E12，在F7敲减中，实现了0.002mg siRNA/kg的ED₅₀(非专利文献10)。该技术在活性方面在文献层面最为优异，但没有高给药量下的毒性、脂质的生物降解性等安全方面的见解。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2018/230710号

专利文献2：国际公开第2018/190423号

非专利文献

非专利文献1：Sato et al.,Journal of Controlled Release,2019,vol.295,p.140-152.

非专利文献2：Jayaraman et al.,Angewandte Chemie International Edition,2012,vol.51,p.8529-8533.

非专利文献3：Watanabe et al.,Scientific Reports,2014,4：4750,DOI：10.1038/srep04750.

非专利文献4：Yamamoto et al.,Journal of Hepatology,2016,vol.64,p.547-555.

非专利文献5：Sato et al.,Molecular Therapy,2016,vol.24,p.788-795.

非专利文献6：Maier et al.,Molecular Therapy,2013,vol.21(8),p.1570-1578.

非专利文献7：Wittrup et al.,Nature Biotechnology,2015,vol.33(8),p.870-876.

非专利文献8：Xu et al.,Molecular Pharmaceutics,2014,vol.11,p.1424-1434.

非专利文献9：Gilleron et al.,Nature Biotechnology,2013,vol.31(7),p.638-646.

非专利文献10：Dong,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,2014,vol.111(11),p.3955-3960.

非专利文献10：Leung et al.,Journal of Physical Chemistry C

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供可作为可选择性地递送至肝脏或脾脏的基因递送载体的脂质纳米粒子、以及提供稳定性优异的脂质纳米粒子。

用于解决课题的手段

本发明者们发现，包含具有支链型的烃链的pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质的脂质纳米粒子对肝脏或脾脏的选择性高，作为在肝脏或脾脏中特异性地高表达的基因递送载体是有用的，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下的脂质纳米粒子。

[1-1]一种脂质纳米粒子，其含有下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质：

[化学式1]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)_a-(O-CO)b-X (I)

[式(I)中，a表示3～5的整数；b表示0或1；R¹和R²各自独立地表示下述通式(A)表示的基团；

[化学式2]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

(式(A)中，R¹¹和R¹²各自独立地表示直链状或支链状的C_5-15烷基；c表示0或1：v表示4～12的整数)；

X表示下述通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基团(其中，所述基团可以通过碳原子与(O-CO)b-键合、所述环的1个或2个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)：

[化学式3]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

(式(B)中，d表示0～3的整数；R³和R⁴各自独立地表示C_1-4烷基或C_2-4链烯基(所述C_1-4烷基或C_2-4链烯基中，1个或2个氢原子可以被苯基取代)，R³和R⁴可以相互键合形成5～7元非芳香族杂环(所述环的1个或2个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)。

[1-2]根据所述[1-1]的脂质纳米粒子，其还含有甾醇和聚烷撑二醇修饰脂质。

[1-3]根据所述[1-1]或[1-2]的脂质纳米粒子，其含有核酸。

[1-4]根据所述[1-3]的脂质纳米粒子，其中，所述核酸为siRNA。

[1-5]根据所述[1-3]的脂质纳米粒子，其中，所述核酸为mRNA或质粒DNA。

[1-6]根据所述[1-3]～[1-5]中任一项的脂质纳米粒子，其中，所述核酸是在肝脏细胞内表达的基因。

[1-7]一种医药用组合物，其以所述[1-1]～[1-6]中任一项的脂质纳米粒子为有效成分。

[1-8]根据所述[1-7]的医药用组合物，其用于基因治疗。

[1-9]一种外来基因的表达方法，其中，将作为所述[1-1]～[1-6]中任一项的脂质纳米粒子的封入有在肝脏细胞内表达的目标外来基因的脂质纳米粒子给药至受试动物(其中，人除外)，使所述外来基因在所述受试动物的肝脏内表达。

[2-1]一种脂质纳米粒子，其含有下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物、以及核酸，其中，所述核酸为mRNA或质粒DNA：

[化学式4]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)a-(O-CO)b-X (I)

[化学式5]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

(式(A)中，R¹¹和R¹²各自独立地表示直链状或支链状的C_2-15烷基；c表示0或1：v表示4～12的整数)；

[化学式6]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

[2-2]根据[2-1]的脂质纳米粒子，其中，所述pH敏感性阳离子性脂质由下述式表示：[化学式7-1]

[化学式7-2]

[化学式7-3]

[化学式7-4]

[化学式7-5]

[化学式7-6]

[化学式7-7]

[化学式7-8]

[3-1]一种脾脏递送用医药组合物，其含有下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物：

[化学式8]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)_a-(O-CO)b-X (I)

[化学式9]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

[化学式10]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

[3-2]根据[3-1]的医药组合物，其中，所述pH敏感性阳离子性脂质由下述式表示：[化学式11-1]

[化学式11-2]

[化学式11-3]

[化学式11-4]

[化学式11-5]

[化学式11-6]

[化学式11-7]

[化学式11-8]

[4-1]下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物：

[化学式12]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)_a-(O-CO)b-X (I)

[化学式13]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH²)v- (A)

[化学式14]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

(式(B)中，d表示0～3的整数；R³和R⁴各自独立地表示C_1-4烷基或C_2-4链烯基(所述C_1-4烷基或C_2-4链烯基中，1个或2个氢原子可以被苯基取代)，R³和R⁴可以相互键合形成5～7元非芳香族杂环(所述环的1个或2个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)；

其中，下述式的pH敏感性阳离子脂质除外：

[化学式15]

[4-2]根据[4-1]的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物，其中，所述pH敏感性阳离子脂质由下述式表示：

[化学式16-1]

[化学式16-2]

[化学式16-3]

[化学式16-4]

[化学式16-5]

[化学式16-6]

[化学式16-7]

[化学式16-8]

[化学式16-9]

[化学式16-10]

[化学式16-11]

[5-1]一种脂质纳米粒子制剂，其含有：

(i)甾醇或甾醇衍生物，

(ii)聚烷撑二醇修饰脂质，

(iii)核酸，

(iv)缓冲剂，

(v)二糖，和

(vi)下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物：

[化学式17]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)a-(O-CO)b-X (I)

[化学式18]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

[化学式19]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

[5-2]根据[5-1]的脂质纳米粒子制剂，其中，所述pH敏感性阳离子脂质由下述式表示：[化学式20-1]

[化学式20-2]

[化学式20-3]

[化学式20-4]

[化学式20-5]

[化学式20-6]

[化学式20-7]

[化学式20-8]

[化学式20-9]

[化学式20-10]

[化学式20-11]

[5-3]根据[5-1]或[5-2]的脂质纳米粒子制剂，其中，所述核酸为mRNA。

[5-4]根据[5-1]～[5-3]中任一项的脂质纳米粒子制剂，其中，脂质纳米粒子混悬于水溶液中。

[5-5]根据[5-4]的脂质纳米粒子制剂，其中，所述二糖的浓度为1重量％～20重量％。

[5-6]根据[5-4]或[5-5]中任一项的脂质纳米粒子制剂，其在25℃下为pH6.8～pH8.0。

[5-7]根据[5-1]～[5-3]中任一项的脂质纳米粒子制剂，其经冷冻干燥。

[5-8]一种再混悬制剂，其是在[5-7]的脂质纳米粒子制剂中添加水或水溶液而成的。

[6-1]下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物的制造方法，

[化学式21]

(R¹)(R²C(OH)-(CH²)a-(O-CO)b-X (I)

[化学式22]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

[化学式23]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

其中，所述pH敏感性阳离子脂质的化学式由下述式表示：

[化学式24]

所述制造方法至少包含使烷基羧酸和卤代烷在有机锂、二甲基丙烯脲(DMPU)和四氢呋喃(THF)的存在下反应而得到支链脂肪酸的工序。

[6-2]根据[6-1]的制造方法，其中，所述工序中的所述四氢呋喃(THF)与所述二甲基丙烯脲(DMPU)的容积比为10：1～1：1(v/v)。

[6-3]根据[6-1]或[6-2]的制造方法，其中，所述有机锂为二异丙基酰胺锂(LDA)。

[6-4]根据[6-1]～[6-3]中任一项的制造方法，其中，所述卤代烷为碘代烷。

[6-5]根据[6-1]～[6-4]中任一项的制造方法，其还包含通过反相色谱法对支链脂肪酸进行精制的工序。

[6-6]下式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物的制造方法，

[化学式25]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)a-(O-CO)b-X (I)

[化学式26]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

[化学式27]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

其中，所述pH敏感性阳离子脂质的化学式由下述式表示：[化学式28-1]

[化学式28-2]

[化学式28-3]

[化学式28-4]

[化学式28-5]

[化学式28-6]

[化学式28-7]

[化学式28-8]

[化学式28-9]

[化学式28-10]

[化学式28-11]

[化学式28-12]

所述制造方法至少包含对使丙二酸酯与卤代烷在碱存在下反应而得到的反应液进行水解处理和加热处理而得到支链脂肪酸的工序。

[6-7]根据[6-6]的制造方法，其中，所述丙二酸酯为丙二酸二甲酯。

[6-8]根据[6-6]或[6-7]的制造方法，其中，所述卤代烷为碘代烷。

[6-9]根据[6-6]～[6-8]中任一项的制造方法，其中，所述碱选自由氢化钠、氢化钙、乙醇钠和双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂组成的组。

[6-10]根据[6-6]～[6-9]中任一项的制造方法，其中，所述水解处理使用氢氧化钠、氢氧化钙和氢氧化锂中的任一种。

[6-11]根据[6-6]～[6-10]中任一项的制造方法，其中，与所述水解处理同时和/或之后在120℃～170℃下进行所述加热处理。

[6-12]根据[6-6]～[6-11]中任一项的制造方法，其还包含通过反相色谱法对支链脂肪酸进行精制的工序。

发明效果

本发明的脂质纳米粒子可使所封入的基因在肝脏或脾脏内高表达。因此，该脂质纳米粒子作为基因治疗中使用的肝脏特异性基因递送载体或脾脏特异性基因递送载体是有用的。另外，本发明的脂质纳米粒子的稳定性优异。

附图说明

图1是表示在实施例1中测定各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子的pKa的结果的图。图1(A)是使用CL4F6、CL4G6或CL4H6制备的脂质纳米粒子的结果，图1(B)是使用CL15F6、CL15G6或CL15H6制备的脂质纳米粒子的结果。

图2是表示在实施例1中算出给药了各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的相对血浆中F7酶活性(％)的结果的图。图2(A)是给药了使用CL4F6、CL4G6或CL4H6制备的脂质纳米粒子的小鼠的结果，图2(B)是给药了使用CL15F6、CL15G6或CL15H6制备的脂质纳米粒子的小鼠的结果。

图3是表示在实施例2中给药了各NlucmRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的肝脏和脾脏中的Nluc活性(RLU/mg蛋白)的测定结果的图。

图4是表示在实施例3中导入了各pFluc搭载脂质纳米粒子的HeLa-GFP细胞的Fluc活性的测定结果的图。

图5是表示在实施例3中给药了各pFluc搭载脂质纳米粒子的小鼠的肝脏和脾脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)的测定结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式具体地进行说明。在本申请说明书中，“X1～X2(X1和X2是满足X1＜X2的实数)”是指“X1以上且X2以下”。

本发明的脂质纳米粒子是含有下述通式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质(以下有时称为“本发明的pH敏感性阳离子性脂质”)的脂质纳米粒子。作为脂质纳米粒子的构成脂质，通过具备通式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质，本发明的脂质纳米粒子对肝脏或脾脏的选择性高。

[化学式29]

(R¹)(R²)C(OH)-(CH₂)a-(O-CO)b-X (I)

通式(I)中，a表示3～5的整数，优选为4。

b表示0或1。b为0时不存在-O-CO-基，是指单键。

通式(I)中，R¹和R²各自独立地表示下述通式(A)表示的基团。通式(A)中，R¹¹和R¹²各自独立地表示直链状或支链状的C_2-15烷基(碳原子数为2～15的烷基)；c表示0或1；v表示4～12的整数。

[化学式30]

(R¹¹)(R¹²)-CH-(CO-O)c-(CH₂)v- (A)

作为直链状或支链状的C_2-15烷基，可举出：

正乙基；

正丙基、1-甲基乙基；

正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基；

正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基；

正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1-甲基-2,2-二甲基丁基；

正庚基、1-甲基己基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、1-乙基戊基、1,1-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1-甲基-3,3-二甲基丁基、2-甲基-3,3-二甲基丁基；

正辛基、1-甲基庚基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、5-甲基庚基、6-甲基庚基、1-乙基己基、1,1-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、5,5-二甲基己基、1-甲基-4,4-二甲基戊基、2-甲基-4,4-二甲基戊基、3-甲基-4,4-二甲基戊基；

正壬基、1-甲基辛基、2-甲基辛基、3-甲基辛基、4-甲基辛基、5-甲基辛基、6-甲基辛基、7-甲基辛基、1-乙基庚基、1,1-二甲基庚基、2,2-二甲基庚基、3,3-二甲基庚基、4,4-二甲基庚基、5,5-二甲基庚基、6,6-二甲基庚基、1-甲基-5,5-二甲基己基、2-甲基-5,5-二甲基己基、3-甲基-5,5-二甲基己基、4-甲基-5,5-二甲基己基；

正癸基、1-甲基壬基、2-甲基壬基、3-甲基壬基、4-甲基壬基、5-甲基壬基、6-甲基壬基、7-甲基壬基、8-甲基壬基、1-乙基辛基、1,1-二甲基辛基、2,2-二甲基辛基、3,3-二甲基辛基、4,4-二甲基辛基、5,5-二甲基辛基、6,6-二甲基辛基、7,7-二甲基辛基、1-甲基-6,6-二甲基庚基、2-甲基-6,6-二甲基庚基、3-甲基-6,6-二甲基庚基、4-甲基-6,6-二甲基庚基、5-甲基-6,6-二甲基庚基；

正十一烷基、1-甲基癸基、2-甲基癸基、3-甲基癸基、4-甲基癸基、5-甲基癸基、6-甲基癸基、7-甲基癸基、8-甲基癸基、9-甲基癸基、1-乙基壬基、1,1-二甲基壬基、2,2-二甲基壬基、3,3-二甲基壬基、4,4-二甲基壬基、5,5-二甲基壬基、6,6-二甲基壬基、7,7-二甲基壬基、8,8-二甲基壬基、1-甲基-7,7-二甲基辛基、2-甲基-7,7-二甲基辛基、3-甲基-7,7-二甲基辛基、4-甲基-7,7-二甲基辛基、5-甲基-7,7-二甲基辛基、6-甲基-7,7-二甲基辛基；

正十二烷基、1-甲基十一烷基、2-甲基十一烷基、3-甲基十一烷基、4-甲基十一烷基、5-甲基十一烷基、6-甲基十一烷基、7-甲基十一烷基、8-甲基十一烷基、9-甲基十一烷基、10-甲基十一烷基、1-乙基癸基、1,1-二甲基癸基、2,2-二甲基癸基、3,3-二甲基癸基、4,4-二甲基癸基、5,5-二甲基癸基、6,6-二甲基癸基、7,7-二甲基癸基、8,8-二甲基癸基、9,9-二甲基癸基、1-甲基-8,8-二甲基壬基、2-甲基-8,8-二甲基壬基、3-甲基-8,8-二甲基壬基、4-甲基-8,8-二甲基壬基、5-甲基-8,8-二甲基壬基、6-甲基-8,8-二甲基壬基、7-甲基-8,8-二甲基壬基；

正十三烷基、1-甲基十二烷基、2-甲基十二烷基、3-甲基十二烷基、4-甲基十二烷基、5-甲基十二烷基、6-甲基十二烷基、7-甲基十二烷基、8-甲基十二烷基、9-甲基十二烷基、10-甲基十二烷基、11-甲基十二烷基、1-乙基十一烷基、1,1-二甲基十一烷基、2,2-二甲基十一烷基、3,3-二甲基十一烷基、4,4-二甲基十一烷基、5,5-二甲基十一烷基、6,6-二甲基十一烷基、7,7-二甲基十一烷基、8,8-二甲基十一烷基、9,9-二甲基十一烷基、10,10-二甲基十一烷基、1-甲基-9,9-二甲基癸基、2-甲基-9,9-二甲基癸基、3-甲基-9,9-二甲基癸基、4-甲基-9,9-二甲基癸基、5-甲基-9,9-二甲基癸基、6-甲基-9,9-二甲基癸基、7-甲基-9,9-二甲基癸基、8-甲基-9,9-二甲基癸基；

正十四烷基、1-甲基十三烷基、2-甲基十三烷基、3-甲基十三烷基、4-甲基十三烷基、5-甲基十三烷基、6-甲基十三烷基、7-甲基十三烷基、8-甲基十三烷基、9-甲基十三烷基、10-甲基十三烷基、11-甲基十三烷基、12-甲基十三烷基、1-乙基十二烷基、1,1-二甲基十二烷基、2,2-二甲基十二烷基、3,3-二甲基十二烷基、4,4-二甲基十二烷基、5,5-二甲基十二烷基、6,6-二甲基十二烷基、7,7-二甲基十二烷基、8,8-二甲基十二烷基、9,9-二甲基十二烷基、10,10-二甲基十二烷基、11,11-二甲基十二烷基、1-甲基-10,10-二甲基十一烷基、2-甲基-10,10-二甲基十一烷基、3-甲基-10,10-二甲基十一烷基、4-甲基-10,10-二甲基十一烷基、5-甲基-10,10-二甲基十一烷基、6-甲基-10,10-二甲基十一烷基、7-甲基-10,10-二甲基十一烷基、8-甲基-10,10-二甲基十一烷基、9-甲基-10,10-二甲基十一烷基；

正十五烷基、1-甲基十四烷基、2-甲基十四烷基、3-甲基十四烷基、4-甲基十四烷基、5-甲基十四烷基、6-甲基十四烷基、7-甲基十四烷基、8-甲基十四烷基、9-甲基十四烷基、10-甲基十四烷基、11-甲基十四烷基、12-甲基十四烷基、13-甲基十四烷基、1-乙基十三烷基、1,1-二甲基十三烷基、2,2-二甲基十三烷基、3,3-二甲基十三烷基、4,4-二甲基十三烷基、5,5-二甲基十三烷基、6,6-二甲基十三烷基、7,7-二甲基十三烷基、8,8-二甲基十三烷基、9,9-二甲基十三烷基、10,10-二甲基十三烷基、11,11-二甲基十三烷基、12,12-二甲基十三烷基、1-甲基-11,11-二甲基十二烷基、2-甲基-11,11-二甲基十二烷基、3-甲基-11,11-二甲基十二烷基、4-甲基-11,11-二甲基十二烷基、5-甲基-11,11-二甲基十二烷基、6-甲基-11,11-二甲基十二烷基、7-甲基-11,11-二甲基十二烷基、8-甲基-11,11-二甲基十二烷基、9-甲基-11,11-二甲基十二烷基、10-甲基-11,11-二甲基十二烷基等。

通式(A)中，R¹¹和R¹²各自独立地优选为直链状或支链状的C_2-12烷基(碳原子数为2～12的烷基)，更优选为直链状或支链状的C_5-12烷基(碳原子数为5～12的烷基)，进一步优选为直链状或支链状的C_5-10烷基(碳原子数为5～10的烷基)，最优选为直链状或支链状的C_6-9烷基(碳原子数为6～9的烷基)。另外，本发明的pH敏感性阳离子脂质中，R¹和R²只要是通式(A)表示的基团即可，可以是彼此相同的基团，也可以是不同的基团。

通式(I)中，X表示下述通式(B)表示的基团或5～7元非芳香族杂环基团。X所表示的5～7元非芳香族杂环基团通过碳原子与(O-CO)b-键合。

[化学式31]

-(CH₂)d-N(R³)(R⁴) (B)

通式(B)中，d表示0-3的整数。d为0时不存在-(CH₂)-基，是指单键。

通式(B)中，R³和R⁴各自独立地表示C_1-4烷基(碳原子数为1-4的烷基)或C_2-4链烯基(碳原子数为1-4的链烯基)。R³和R⁴所表示的C_1-4烷基或C_2-4链烯基中的1个或2个氢原子可以被苯基取代。R³和R⁴只要是C_1-4烷基或C_2-4链烯基即可，可以是彼此相同的基团，也可以是不同的基团。

作为C_1-4烷基，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。作为C_2-4链烯基，可举出乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基。

通式(B)中，R³和R⁴可以相互键合形成5～7元非芳香族杂环。作为R³和R⁴相互键合形成的5～7元非芳香族杂环，例如可举出1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、及1-哌嗪基。R³和R⁴相互键合形成的5～7元非芳香族杂环中，环中的1个或2个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代。所述环中的2个氢原子被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代时，可以被彼此相同的基团取代，也可以被彼此不同的基团取代。

通式(I)中，X为5～7元非芳香族杂环基团时，作为该杂环基团中所含的杂原子，可举出氮原子、氧原子、或硫原子等。构成该杂环基团中的杂环的杂原子可以是1个，相同或不同的杂原子也可以是2个以上。该杂环基团中的杂环可以是饱和的杂环，也可以含有1个或2个以上的双键，但杂环不会成为芳香环。

作为本发明的pH敏感性阳离子脂质，在通式(I)中，优选R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状或支链状的C_2-12烷基、c为1、v为6-10的整数的基团，a为3-5的整数，b为1，X为5～7元非芳香族杂环基团(其中，通过杂环基团中的碳原子与(O-CO)b-键合)、优选为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合、1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；或通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状或支链状的C_2-12烷基、c为1、v为6-10的整数的基团，a为3-5的整数，b为0，X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基或C_2-4链烯基(R³和R⁴所表示的C_1-4烷基或C_2-4链烯基中，1个或2个氢原子可以被苯基取代)的化合物。另外，通式(I)中，优选R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状或支链状的C_5-12烷基、c为1、v为6-10的整数的基团，a为3-5的整数，b为1，X为5～7元非芳香族杂环基团(其中，通过杂环基团中的碳原子与(O-CO)b-键合)、优选为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合、1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；或通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状或支链状的C_5-12烷基、c为1、v为6-10的整数的基团，a为3-5的整数，b为0，X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基或C_2-4链烯基(R³和R⁴所表示的C_1-4烷基或C_2-4链烯基中，1个或2个氢原子可以被苯基取代)的化合物。其中，作为本发明的pH敏感性阳离子脂质，通式(I)中，优选R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状或支链状的C_6-9烷基、c为1、v为6-10的整数的基团，且a为3-5的整数，b为1，X为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合、1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；或通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状或支链状的C_6-9烷基、c为1、v为6-10的整数的基团，且a为3-5的整数，b为0，X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基的化合物。

作为本发明的pH敏感性阳离子脂质，更优选为通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为1，X为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合，1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为支链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为1，X为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合，1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为0，X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基的化合物；通式(I)中，R¹和R²各自独立地为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为支链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为0，X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基的化合物。

作为本发明的pH敏感性阳离子脂质，特别优选为在通式(I)中，R¹和R²为相同基团、且为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为1，X为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合，1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；通式(I)中，R¹和R²为相同基团、且为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为支链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为0，X为为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-吗啉基、或1-哌嗪基(可以通过环中的碳原子与(O-CO)b-键合，1个氢原子可以被C_1-4烷基或C_2-4链烯基取代)的化合物；通式(I)中，R¹和R²为相同基团、且为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为直链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为0、X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基的化合物；通式(I)中，R¹和R²为相同基团、且为通式(A)中的R¹¹和R¹²各自独立地为支链状的C_6-9烷基、c为1、v为6～10的整数的基团，且a为3～5的整数，b为0、X为通式(B)中的d为0、R³和R⁴各自独立地为C_1-4烷基的化合物。

作为本发明的pH敏感性阳离子性脂质，例如为具有下述结构的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物：[化学式32-1]

[化学式32-2]

[化学式32-3]

[化学式32-4]

[化学式32-5]

[化学式32-6]

[化学式32-7]

[化学式32-8]

[化学式32-9]

[化学式32-10]

[化学式32-11]

[化学式32-12]

[化学式32-13]

[化学式32-14]

本发明在一个方面涉及本发明的pH敏感性阳离子脂质。

通式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质的pKa没有特别限定，例如可以在4.0～9.0左右、优选4.5～8.5左右中选择，优选按照赋予该范围的pKa的方式选择各取代基的种类。

通式(I)表示的pH敏感性阳离子性脂质例如可以通过本说明书的实施例中具体表示的方法容易地制造。通过参照该制造方法，适当选择原料化合物、试剂和反应条件等，本领域技术人员能够容易地制造包括在通式(I)的范围内的任意脂质。

通式(A)表示的基团是具备-CO-O-基上连接有2条烃链(R¹¹和R¹²)的支链结构的基团。即，在本发明的pH敏感性阳离子性脂质中具备2条支链型的烃链(R¹和R²)，这些烃链成为埋入脂质纳米粒子的脂质膜中的疏水性支架。本发明的脂质纳米粒子通过将具备由支链型结构构成的疏水性支架的本发明的pH敏感性阳离子脂质作为脂质的构成成分，具有对肝脏或脾脏的选择性高的特征。

构成本发明的脂质纳米粒子的本发明的pH敏感性阳离子性脂质可以仅为1种，也可以为2种以上。构成本发明的脂质纳米粒子的本发明的pH敏感性阳离子脂质为2种以上时，本发明的pH敏感性阳离子脂质的量是指构成脂质纳米粒子的脂质分子中的、相当于本发明的pH敏感性阳离子脂质的脂质分子的合计量。

本发明的pH敏感性阳离子脂质在构成脂质纳米粒子的脂质分子中所占的比例越多，脂质纳米粒子向靶细胞的摄入效率越高。因此，在本发明的脂质纳米粒子中，本发明的pH敏感性阳离子性脂质的量相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例([本发明的pH敏感性阳离子性脂质的量(mol)]/([构成脂质纳米粒子的总脂质的量(mol)])×100％)优选为20摩尔％以上。另一方面，若pH敏感性阳离子性脂质在构成脂质纳米粒子的脂质分子中所占的比例过多，则有时难以充分减小粒径。从获得脂质纳米粒子向靶细胞的摄入效率充分且粒径充分小的脂质纳米粒子的方面出发，本发明的pH敏感性阳离子性脂质的量相对于构成本发明的脂质纳米粒子中的脂质纳米粒子的总脂质量的比例更优选为30摩尔％以上，进一步优选为30～70摩尔％，更进一步优选为40～60摩尔％。

作为本发明的脂质纳米粒子的构成脂质中的除本发明的pH敏感性阳离子性脂质以外的脂质，可以使用通常形成脂质体时所使用的脂质。作为这样的脂质，例如可举出磷脂、甾醇或甾醇衍生物、糖脂、或者饱和或不饱和的脂肪酸等。它们可以使用1种或组合使用2种以上。

作为磷脂，可举出磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、心磷脂、缩醛磷脂、神经酰胺磷酰甘油磷酸酯、磷脂酸等甘油磷脂；鞘磷脂、神经酰胺磷酰甘油、神经酰胺磷酰乙醇胺等鞘磷脂等。另外，也可以使用蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等天然物来源的磷脂。甘油磷脂和鞘磷脂中的脂肪酸残基没有特别限定，例如可举出碳原子数为12～24的饱和或不饱和的脂肪酸残基，优选碳原子数为14～20的饱和或不饱和的脂肪酸残基。具体而言，可举出月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、花生四烯酸、山萮酸、二十四烷酸等脂肪酸来源的酰基。在这些甘油磷脂或鞘脂质具有2个以上的脂肪酸残基的情况下，所有的脂肪酸残基可以是相同的基团，也可以是彼此相同的基团。

作为甾醇或甾醇衍生物，例如可举出胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、羊毛甾醇、双氢羊毛甾醇、链甾醇、二氢胆固醇等动物来源的甾醇；豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等植物来源的甾醇(植物甾醇)；酵母甾醇、麦角甾醇等微生物来源的甾醇等。作为糖脂，例如可举出磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯等甘油糖脂；半乳糖基脑苷酯、乳糖脑苷酯、神经节苷脂等鞘糖脂质；等。作为饱和或不饱和的脂肪酸，例如可举出棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等碳原子数为12～20的饱和或不饱和的脂肪酸。

作为本发明的脂质纳米粒子的构成脂质，除了本发明的pH敏感性阳离子性脂质以外，优选还含有中性脂质，更优选还含有磷脂或甾醇，进一步优选还含有甾醇，更进一步优选还含有胆固醇。

本发明的脂质纳米粒子优选含有聚烷撑二醇修饰脂质作为脂质成分。聚烷撑二醇为亲水性聚合物，通过使用聚烷撑二醇修饰脂质作为脂质膜构成脂质来构建脂质纳米粒子，能够用聚烷撑二醇对脂质纳米粒子的表面进行修饰。通过用聚烷撑二醇进行表面修饰，有时能够提高脂质纳米粒子的血中滞留性等稳定性。

作为聚烷撑二醇，例如可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亚甲基二醇、聚六亚甲基二醇等。聚烷撑二醇的分子量例如为300～10,000左右，优选为500～10,000左右，进一步优选为1,000～5,000左右。

例如，在利用聚乙二醇的脂质的修饰中，可以使用硬脂化聚乙二醇(例如硬脂酸PEG45(STR-PEG45)等)。此外，还可以使用N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、n-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)等聚乙二醇衍生物等，但聚烷撑二醇化脂质并不限定于这些。

关于聚烷撑二醇修饰脂质相对于构成本发明的脂质纳米粒子的总脂质量的比例，只要是不损害本发明的pH敏感性阳离子脂质的肝脏选择性或脾脏选择性，具体而言，将本发明的脂质纳米粒子用作基因载体时的肝脏特异性基因表达活性或脾脏特异性基因表达活性的量就没有特别限定。例如，聚烷撑二醇修饰脂质相对于构成脂质纳米粒子的总脂质量的比例优选为0.5～3摩尔％。

本发明的脂质纳米粒子可以根据需要进行适当的表面修饰等。

本发明的脂质纳米粒子通过用亲水性聚合物等修饰表面，能够提高血中滞留性。通过将用这些修饰基团修饰了的脂质用作脂质纳米粒子的构成脂质，有时还能够进行表面修饰。

在制造本发明的脂质纳米粒子时，作为用于提高血中滞留性的脂质衍生物，例如还可以利用血型糖蛋白(glycophorin)、神经节苷脂GM1、磷脂酰肌醇、神经节苷脂GM3、葡萄糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物等。另外，作为用于提高血中滞留性的亲水性聚合物，除了聚烷撑二醇以外，还可以在表面修饰中使用葡聚糖、普鲁兰多糖、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、糖淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、卡拉胶等。

另外，为了促进本发明的脂质纳米粒子的核内转移，例如也可以用3糖以上的低聚糖化合物对脂质纳米粒子进行表面修饰。3糖以上的低聚糖化合物的种类没有特别限定，例如可以使用键合有3～10个左右的糖单元的低聚糖化合物，优选使用键合有3～6个左右的糖单元的低聚糖化合物。其中，优选使用属于葡萄糖的3聚体或6聚体的低聚糖化合物，进一步优选使用属于葡萄糖的3聚体或4聚体的低聚糖化合物。更具体而言，可以优选使用异麦芽三糖、异潘糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖等，其中，进一步优选α1-4键合有葡萄糖的麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。特别优选为麦芽三糖或麦芽四糖，最优选为麦芽三糖。使用低聚糖化合物进行的脂质纳米粒子的表面修饰量没有特别限定，例如相对于总脂质量为1～30摩尔％左右，优选为2～20摩尔％左右，更优选为5～10摩尔％左右。

用低聚糖化合物对脂质纳米粒子进行表面修饰的方法没有特别限定，例如已知用半乳糖或甘露糖等单糖对脂质纳米粒子进行了表面修饰的脂质体(国际公开第2007/102481号)，因此可以采用该刊物中记载的表面修饰方法。上述出版物的全部公开通过参照包含在本申请说明书的公开中。

另外，可以赋予本发明的脂质纳米粒子以例如温度变化敏感性功能、膜透过功能、基因表达功能和pH敏感性功能等中的任意1个或2个以上的功能。通过适当添加这些功能，能够提高脂质纳米粒子在血液中的滞留性，使脂质纳米粒子在靶细胞中的内吞作用后高效地从胞饮体中脱出，能够在肝脏细胞内或肝脏细胞内更高效地表达所封入的核酸。

本发明的脂质纳米粒子可以含有选自由生育酚、没食子酸丙酯、棕榈酸抗坏血酸酯或丁基化羟基甲苯等抗氧化剂、电荷物质和膜多肽等组成的组中的1种或2种以上的物质。作为赋予正电荷的电荷物质，例如可举出硬脂酰胺、油胺等饱和或不饱和脂肪族胺等；作为赋予负电荷的电荷物质，例如可举出磷酸二鲸蜡酯、胆固醇琥珀酸单酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。作为膜多肽，例如可举出膜表面性多肽、或膜内在性多肽等。这些物质的配合量没有特别限定，可以根据目的适当选择。

关于本发明的脂质纳米粒子的大小，从容易得到向生物体内的肝脏细胞或脾脏细胞高的递送效率的方面出发，平均粒径优选为400nm以下，平均粒径更优选为300nm以下，平均粒径进一步优选为200nm以下，更进一步优选为150nm以下。其中，脂质纳米粒子的平均粒径是指通过动态光散射法(Dynamic light scattering：DLS)测定的个数平均粒径。利用动态光散射法进行的测定可以使用市售的DLS装置等通过常规方法进行。

本发明的脂质纳米粒子的多分散度指数(PDI)为0.01～0.7左右、优选为0.01～0.6左右、进一步优选为0.03～0.3左右。pH7.4下的ζ电位可以为-50mV～5mV的范围、优选为-45mV～5mV的范围。

本发明的脂质纳米粒子的形态没有特别限定，例如作为分散在水系溶剂中的形态，可举出单膜脂质体、多层脂质体、球状胶束、或不定形的层状结构物等。作为本发明的脂质纳米粒子，优选为单膜脂质体、多层脂质体。

本发明的脂质纳米粒子优选在被脂质膜覆盖的粒子内部内包需要向靶细胞内递送的目标成分。作为本发明的脂质纳米粒子的粒子内部内包的成分，只要是能够内包的大小就没有特别限定。本发明的脂质纳米粒子中可以封入核酸、糖类、肽类、低分子化合物、金属化合物等任意物质。

作为本发明的脂质纳米粒子中内包的成分，优选核酸。作为核酸，可以是DNA，也可以是RNA，也可以是它们的类似物或衍生物(例如，肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯DNA等)。本发明的脂质纳米粒子中内包的核酸可以是单链核酸，也可以是双链核酸，可以是线状，也可以是环状。

在本发明的一个方式中，本发明的脂质纳米粒子包含本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物和核酸。

本发明的脂质纳米粒子中内包的核酸优选包含用于在靶细胞内表达的外来基因，更优选为为了通过被摄入到细胞内而使外来基因在细胞内表达而发挥功能的核酸。该外来基因可以是靶细胞(优选肝脏细胞和脾脏细胞)的基因组DNA中本来包含的基因，也可以是基因组DNA中未包含的基因。作为这样的核酸，可举出包含由编码所要表达的目的基因的碱基序列构成的核酸的基因表达载体。该基因表达载体可以在所导入的细胞内作为染色体外基因存在，也可以通过同源重组纳入基因组DNA中。

作为本发明的脂质纳米粒子中内包的基因表达载体，没有特别限定，可以使用通常在基因治疗等中使用的载体。作为本发明的脂质纳米粒子中内包的基因表达载体，优选为质粒载体等核酸载体。质粒载体可以保持环状，也可以以预先切断为线状的状态封入本发明的脂质纳米粒子中。基因表达载体可以根据所要表达的对象基因的碱基序列信息，利用通常使用的分子生物学工具通过常规方法设计，并可以通过公知的各种方法来制造。

本发明的脂质纳米粒子中内包的核酸也优选为控制靶细胞内存在的靶基因的表达的功能性核酸。作为该功能性核酸，可举出反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、siRNA、microRNA、mRNA等。另外，也可以是成为在细胞内表达siRNA的siRNA表达载体的质粒DNA(pDNA)。作为siRNA表达载体，可以由市售的siRNA表达载体制备，另外，也可以对其进行适当改变。作为本发明的脂质纳米粒子中内包的核酸，特别是从对肝脏或脾脏的选择性良好的方面出发，优选为mRNA或pDNA。

在本发明的一个方式中，本发明的脂质纳米粒子包含本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物、和核酸，其中，所述核酸为mRNA或质粒DNA。

本发明的脂质纳米粒子的制造方法没有特别限定，可以采用本领域技术人员可利用的任意方法。举一个例子，可以通过将全部脂质成分溶解于氯仿等有机溶剂中，进行利用蒸发器的减压干燥、利用喷雾干燥机的喷雾干燥来形成脂质膜后，添加到将含有要封入到该脂质纳米粒子中的成分、例如核酸等的水系溶剂干燥而得到的上述混合物中，进一步通过均化器等乳化机、超声波乳化机或高压喷射乳化机等进行乳化来制造。另外，作为制造脂质体的方法，也可以通过公知的方法、例如反相蒸发法等来制造。在想要控制脂质纳米粒子的大小的情况下，使用孔径一致的膜滤器等在高压下进行挤压(挤出过滤)即可。

水系溶剂(分散介质)的组成没有特别限定，例如可举出磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水等缓冲液、生理盐水、细胞培养用的培养基等。这些水系溶剂(分散介质)可以使脂质纳米粒子稳定地分散，但也可以进一步加入葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类、乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类、棉籽糖、松三糖等三糖类、环糊精等多糖类、赤藓醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇等糖醇等糖(水溶液)、甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇(水溶液)等。为了稳定地长期保存分散在该水系溶剂中的脂质纳米粒子，从抑制凝聚等物理稳定性的方面出发，优选尽可能排除水系溶剂中的电解质。另外，从脂质的化学稳定性的方面出发，优选将水系溶剂的pH从弱酸性设定为中性附近(pH为3.0～8.0左右)，和/或通过氮气鼓泡等除去溶解氧。

本发明的脂质纳米粒子也可以通过使用了流路的醇稀释法来制造。该方法是将在醇溶剂中溶解有脂质成分的溶液和使脂质纳米粒子中包含的水溶性成分溶解于水系溶剂而成的溶液从各自的流路导入、使其合流从而制造脂质纳米粒子的方法。通过使用能够实现2液的瞬间混合的三维微混合器内置微流路，能够再现良好地制造直径为30nm左右的脂质纳米粒子(非专利文献11)。作为在制造中使用的流路，从能够形成粒径控制性高的纳米尺寸的脂质粒子形成系统的方面出发，优选使用如专利文献2中记载的在使原料溶液流动的微尺寸的流路中，将相对于流路宽度为一定宽度的挡板(baffle)配置为距两侧面彼此不同的单纯的二维结构的流路结构体。作为醇稀释法中使用的水系溶剂，可以使用上述溶剂。

在对得到的脂质纳米粒子的水性分散物进行冷冻干燥或喷雾干燥的情况下，当使用例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类、乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类、棉籽糖、松三糖等三糖类、环糊精等多糖类、赤藓醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇等糖醇等糖(水溶液)时，有时能够改善稳定性。另外，在对上述水性分散物进行冷冻的情况下，当使用例如上述糖类、甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇(水溶液)时，有时能够改善稳定性。

在本发明的一个方式中，本发明的脂质纳米粒子经冷冻干燥。

本发明在一个方面涉及一种脂质纳米粒子制剂，其含有本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物。本发明在另一个方面涉及一种脂质纳米粒子制剂，其含有(i)甾醇或甾醇衍生物、(ii)聚烷撑二醇修饰脂质、(iii)核酸、(iv)缓冲剂、(v)二糖和(vi)本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物。

作为甾醇或甾醇衍生物，例如可举出胆固醇、谷甾醇等，优选为胆固醇。

作为聚烷撑二醇修饰脂质，例如可举出聚乙二醇修饰脂质、聚丙二醇修饰脂质等，优选为聚乙二醇修饰脂质。

作为核酸，例如可举出siRNA、pDNA、mRNA等，优选为mRNA。

作为缓冲剂，例如可举出HEPES缓冲剂、磷酸缓冲剂、Tris缓冲剂等。

作为二糖，例如可举出乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等，优选为蔗糖。脂质纳米粒子制剂中的二糖的浓度例如为1重量％～20重量％，优选为5重量％～15重量％。

甾醇或甾醇衍生物与pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物的摩尔比例如为68.5：20～28.5：60。

在本发明中，脂质纳米粒子制剂可以通过使脂质纳米粒子混悬在水溶液中来制备。

本发明的脂质纳米粒子制剂的pH在25℃下例如为5.5～8.5、优选为6.8～8.0。

本发明在一个方面涉及一种再混悬制剂，其是将脂质纳米粒子制剂通过添加水或水溶液进行再混悬而成的。

本发明的脂质纳米粒子的稳定性优异。本发明的脂质纳米粒子例如在-80℃下保管的情况下稳定1周或1周以上，和/或在5℃下保管的情况下稳定1周、2周、3周、4周、5周或5周以上，和/或在25℃下保管的情况下稳定1周、2周、3周、4周、5周或5周以上，和/或在40℃下保管的情况下稳定3天、1周、2周、3周、4周、5周或5周以上。

关于脂质纳米粒子的品质，例如可以将脂质纳米粒子在规定的温度下静置，将保管规定期间后的平均粒径、PDI及核酸封入率与刚制作后的值进行比较，将全部满足以脂质纳米粒子制备日为基准平均粒径维持在±20nm以内、PDI为0.2以下且保持高均匀性、核酸封入率也维持在80％以上这3个条件的脂质纳米粒子定义为品质保持良好的脂质纳米粒子。

例如，可以按照以下的基准进行评价：

良好：粒径为刚制作后的粒径±20nm以内，且PDI为0.2以下，且封入率为80％以上；

不够良好：粒径超过刚制成后的粒径±20nm，或封入率小于80％。

例如，可以将在5℃下的静置时品质保持1周以上良好的脂质纳米粒子、或在40℃下的静置时品质保持1周以上良好的脂质纳米粒子评价为稳定性优异的脂质纳米粒子。

当将封入有基因表达载体的本发明的脂质纳米粒子给药至动物个体时，封入在该脂质纳米粒子中的基因表达载体与其他脏器相比，在肝脏或脾脏中选择性地表达。同样地，当将封入有siRNA表达载体的本发明的脂质纳米粒子给药至动物个体时，封入在该脂质纳米粒子中的siRNA表达载体与其他脏器相比，在肝脏或脾脏中选择性地表达，该表达载体所靶向的基因的表达得到抑制。例如，当将封入有在肝脏细胞内或脾脏细胞内表达的目标外来基因的本发明的脂质纳米粒子给药至受试动物时，能够在该受试动物的肝脏或脾脏内使该外来基因表达。

通过对该肝脏或脾脏具有高选择性的基因表达活性，本发明的脂质纳米粒子作为以肝脏或脾脏为靶的基因表达载体发挥功能。在本发明的脂质纳米粒子中，在封入有需要在肝脏细胞内或脾脏细胞内表达的目标外来基因后，通过给药至受试动物，在该受试动物的肝脏内或脾脏内该外来基因表达。因此，本发明的脂质纳米粒子作为在基因治疗中使用的医药用组合物的有效成分是有用的，特别是作为在以肝脏或脾脏为靶向脏器的基因治疗中使用的医药用组合物的有效成分是有用的。

本发明在一个方面涉及一种肝脏递送用的医药用组合物，其含有本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物。

本发明在另一个方面涉及一种脾脏递送用的医药用组合物，其含有本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物。

本发明的脂质纳米粒子给药的动物没有特别限定，可以是人，也可以是除人以外的动物。作为非人动物，可举出牛、猪、马、绵羊、山羊、猴、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等哺乳动物、鸡、鹌鹑、鸭子等鸟类等。

本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物例如通过将作为基本骨架的7-(4-(二丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇或5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基1-甲基哌啶-4-羧酸酯与支链脂肪酸缩合来合成。

本发明在一个方面涉及本发明的pH敏感性阳离子性脂质、其立体异构体或立体异构体的混合物的制造方法。在本发明的一个方式中，本发明的pH敏感性阳离子性脂质的制造方法至少包含使烷基羧酸与卤代烷在有机锂、二甲基丙烯脲(DMPU)和四氢呋喃(THF)的存在下反应而得到支链脂肪酸的工序(工序A)。

在该方法中，烷基羧酸例如为辛酸、癸酸、十三烷酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六碳烯酸。

在该方法中，卤代烷例如为1-碘己烷、1-碘丁烷、2-碘己烷、1-溴己烷、碘甲烷、碘乙烷、1-碘丙烷、1-碘丁烷、1-碘戊烷、1-碘己烷、1-碘庚烷、1-碘辛烷、1-碘壬烷、1-碘十二烷、1-碘十一烷、1-碘十二烷、1-碘十三烷、1-碘十四烷、1-碘十五烷、1-碘十六烷。

在该方法中，有机锂例如为二异丙基氨基锂(LDA)、叔丁基锂、正丁基锂。

在本发明的一个方式中，本发明的pH敏感性阳离子性脂质的制造方法至少包含对使丙二酸酯与卤代烷在碱存在下反应而得到的反应液进行水解处理和加热处理而得到支链脂肪酸的工序(工序B)。

在该方法中，丙二酸酯例如为丙二酸二甲酯、丙二酸二乙酯、丙二酸二异丙酯，优选为丙二酸二甲酯。

在该方法中，卤代烷例如为碘代烷，碘代烷例如为1-碘己烷、1-碘丙烷、2-碘己烷。

在该方法中，碱例如为氢化钠、氢化钙、乙醇钠和双(三甲基硅烷基)酰胺锂，优选为氢化钠。

在该方法中，水解处理例如使用氢氧化钠、氢氧化钙和氢氧化锂中的任一种来进行。

在该方法中，加热处理与水解处理同时和/或在之后、优选在120℃～170℃、更优选在150℃～170℃下进行。

该方法还包含通过反相色谱法对支链脂肪酸进行精制的工序。

在用于合成以下化合物的支链脂肪酸中，与工序B相比，通过工序A进行可收率更为良好得到支链脂肪酸。

[化学式33]

在用于合成以下化合物的支链脂肪酸中，与工序A相比，通过工序B进行可收率更为良好地得到支链脂肪酸。

[化学式34-1]

[化学式34-2]

[化学式34-3]

[化学式34-4]

[化学式34-5]

[化学式34-6]

[化学式34-7]

[化学式34-8]

[化学式34-9]

[化学式34-10]

[化学式34-11]

[化学式34-12]

在本发明的一个方式中，用于合成本发明的pH敏感性阳离子性脂质的支链脂肪酸例如可以通过日本专利第2756756号中记载的方法得到。

实施例

接着，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

I.CL4F6、CL4G6、CL15F6和CL15G6的合成

[合成例1]CL4F6的合成

将通过专利文献1中记载的方法合成的7-(4-(二丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇(1.0mmol)溶解于5mL的二氯甲烷中，接着加入癸酸2-己基酯(2.20mmol)、DMAP(N,N-二甲基-4-氨基吡啶)(0.20mmol)和EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(3.0mmol)，在室温下使其反应一晚。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去后，用乙酸乙酯进行混悬，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪蒸馏除去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱[洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)]进行精制，得到7-(4-(二丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基双(2-己基癸酸酯)(CL4F6)。

[合成例2]CL4G6的合成

除了使用2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸酯代替癸酸2-己基酯以外，与合成例1同样地操作，得到7-(4-(二丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基双(2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸酯)(CL4G6)。

[合成例3]CL15F6的合成

将通过专利文献1中记载的方法合成的5,11-二羟基5-(6-羟基己基)十一烷基1-甲基哌啶-4-羧酸酯(1.00mmol)溶解于10mL的二氯甲烷中。接着，加入癸酸2-己基酯(2.20mmol)、DMAP(0.20mmol)和EDCI(3.0mmol)，在室温下使其反应一晚。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去后，用乙酸乙酯进行混悬，通过过滤除去不溶物。将滤液用0.5N氧化钠水溶液和饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪蒸馏除去溶剂，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱[洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)]进行精制，得到7-羟基-7-(4-((1-甲基哌啶)-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基双(2-己基癸酸酯)(CL15F6)。

[合成例4]CL15G6的合成

除了使用2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸酯代替癸酸2-己基酯以外，与合成例3同样地操作，得到7-羟基-7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基双(2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸酯(CL15G6)。

II.使用了CL4F6、CL4G6、CL15F6、及CL15G6的脂质纳米粒子的制作及评价

＜脂质纳米粒子的制备＞

在以后的实验中，只要没有特别记载，脂质纳米粒子是通过使用了流路的醇稀释法制备的。作为流路，使用了内置有混合器的微流体设备“iLiNP”(Lilac Pharma公司制)。

具体而言，首先，将调整为脂质浓度为8mM的乙醇溶液和调整为siRNA浓度为71.1μg/mL的醋酸缓冲液(25mM、pH为4.0)分别以0.375mL/分钟和1.125mL/分钟送液到微流路内，回收从流路排出的脂质纳米粒子溶液。将该脂质纳米粒子溶液加入到透析膜(MWCO为12,000～14,000)上，使外水相为20mM MES缓冲液(pH为6.0)、在4℃下透析2小时以上。然后，将外水相替换为PBS(-)(pH为7.4)，进一步在4℃下透析2小时以上后，从透析膜回收脂质纳米粒子溶液。

＜脂质纳米粒子的构成脂质＞

CL4F6、CL4G6、CL15F6及CL15G6使用合成例1～4中合成的化合物。

7-(4-(二丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基二油酸酯(CL4H6)和7-羟基-7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基二油酸酯(CL15H6)使用通过专利文献1中记载的方法合成的化合物。

[化学式35-1]

[化学式35-2]

此外，作为中性脂质，使用了胆固醇(chol)和聚乙二醇2000修饰二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)。

＜脂质纳米粒子的平均粒径、PDI(多分散指数)及ζ电位的测定＞

使用利用动态光散射法的分析装置“Zetasizer Nano ZS ZEN3600”(Malvern公司制)测定脂质纳米粒子在PBS(-)中的平均粒径(个数平均值)及PDI、和在10mM HEPES缓冲液(pH为7.4)中的ζ电位。

＜脂质纳米粒子的pKa的测定＞

脂质纳米粒子的pKa使用对甲苯氨基-2-萘磺酸(TNS)进行测定。首先，将TNS(终浓度：0.75μM)和脂质纳米粒子(终浓度：30mM)在调整为各pH的缓冲液中混合。用酶标仪测定所制备的混合液的荧光强度。将测定值中的最高值和最低值分别记为100％和0％带电率，将表示50％带电率的pH计算为pKa。

＜脂质纳米粒子的核酸封入率＞

脂质纳米粒子的siRNA、mRNA和pDNA的封入率使用Ribogreen(life technologies公司制)进行测定。

[实施例1]

以50：50：1的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇和PEG-DMG，通过醇稀释法，制作搭载有针对F7的siRNA的脂质纳米粒子(F7 siRNA搭载脂质纳米粒子)。作为pH敏感性阳离子性脂质，使用CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6、或CL15H6。以下，将使用pH敏感性阳离子性脂质X制造的脂质纳米粒子称为X-LNP。例如，将使用pH敏感性阳离子性脂质CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6或CL15H6制造的脂质纳米粒子分别称为CL4F-LNP、CL4G6-LNP、CL4H6-LNP、CL15F-LNP、CL15G6-LNP或CL15H6-LNP。另外，将针对F7的siRNA的碱基序列示于表1。

表中，大写字母表示天然型RNA(仅T为天然型DNA)，小写字母表示2’-fluoro修饰体，^*表示硫代磷酸酯键。

表1

针对F7的siRNA	碱基序列	序列号
			正义链	GGAucAucucAAGucuuAC*T	1
反义链	GuAAGAcuuGAGAuGAuccT*T	2

所制备的各脂质纳米粒子的平均粒径为80～120nm，siRNA封入率为90％以上。将测定各脂质纳米粒子的pKa得到的结果示于图1(A)及图1(B)。如图1所示，使用支架结构为支链型的CL4F6、CL4G6、CL15F6或CL15G6制造的脂质纳米粒子与使用支架结构为直链型的CL4H6或CL15H6制造的脂质纳米粒子相比，显示出更低的pKa。

接着，将所制备的各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子给药至ICR小鼠(4周龄、雌性)，研究了体内(in vivo)F7敲减活性。具体而言，向ICR小鼠以0.003～0.1mg siRNA/kg静脉内给药各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子，测定24小时后的血浆中F7酶活性。将未处理小鼠的血浆中F7酶活性记为100％，算出给药了各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的相对血浆中F7酶活性(％)。将结果示于图2(A)及图2(B)。图2(B)是以0.1mg siRNA/kg静脉内给药了各F7siRNA搭载脂质纳米粒子的结果。如图2所示，使用支架结构为支链型的CL4F6、CL4G6、CL15F6或CL15G6制造的脂质纳米粒子与使用支架结构为直链型的CL4H6或CL15H6制造的脂质纳米粒子相比，显示出同等的体内F7敲减活性。由这些结果可知，将CL4F6、CL4G6、CL15F6、及CL15G6作为构成脂质的脂质纳米粒子作为siRNA递送载体是有用的。

[实施例2]

代替siRNA制备搭载有mRNA的脂质纳米粒子，研究了体内基因表达活性。mRNA使用通过对编码了NanoLuc(注册商标)荧光素酶(Nluc)(Promega公司制)的pDNA进行体外(invitro)转录反应而制备的mRNA(NlucmRNA)。

首先，以60：10：40：1的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、胆固醇和PEG-DMG，通过醇稀释法，制作了搭载有NlucmRNA的脂质纳米粒子(NlucmRNA搭载脂质纳米粒子)。作为pH敏感性阳离子性脂质，使用了CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6、或CL15H6。

表2

研究了所制备的脂质纳米粒子的平均粒径、PDI、ζ电位及mRNA封入率。将测定结果示于表2。表2中，“CL”是指阳离子性脂质。通过动态光散射法算出的平均粒径均为70～130nm(表2)。所制备的脂质纳米粒子中，仅有CL15H6-LNP形成了PDI大且均匀性低的粒子(表2)。关于mRNA封入率，CL4H6-LNP低于80％，但含有其他阳离子性脂质的LNP均显示90％以上。

接着，将所制备的各NlucmRNA搭载脂质纳米粒子给药至ICR小鼠(4周龄、雌性)，研究了体内基因表达活性。具体而言，向ICR小鼠以0.04mg mRNA/kg静脉内给药各NlucmRNA搭载脂质纳米粒子，测定24小时后的肝脏和脾脏中的Nluc活性。Nluc活性使用发光光度计测定(RLU)，用通过BCA法定量的蛋白质量进行校正。

将给药了各NlucmRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的肝脏和脾脏中的Nluc活性(RLU/mg蛋白)的测定结果示于图3。图3(A)是肝脏中的Nluc活性的测定结果，图3(B)是脾脏中的Nluc活性的测定结果。此外，通过将肝脏中的基因表达活性除以脾脏中的基因表达活性，算出基因表达的肝脏选择性。图3(C)是表示给药了各NlucmRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的[肝脏中的Nluc活性]/[脾脏中的Nluc活性]的计算结果的图。如图3(A)所示，在肝脏中，在给药了CL4F6-LNP、CL15F6-LNP和CL15G6-LNP的小鼠中，显示了与给药了CL4H6-LNP的小鼠同等的Nluc活性。另外，如图3(C)所示，给药了CL4F6-LNP及CL4G6-LNP的小鼠与给药了CL4H6-LNP的小鼠相比，显示出较高的肝脏选择性。同样地，给药了CL15F6-LNP及CL15G6-LNP的小鼠与给药了CL15H6-LNP的小鼠相比，显示出较高的肝脏选择性。由这些结果可知，含有支架结构为支链型的pH敏感性阳离子性脂质的脂质纳米粒子在封入有mRNA的情况下，与含有支架结构为直链型的pH敏感性阳离子性脂质的脂质纳米粒子相比，对肝脏的选择性更高，作为特异性地向肝脏递送的递送载体是有用的。

[实施例3]

代替siRNA制备搭载有pDNA的脂质纳米粒子，研究了体内基因表达活性。pDNA使用了在CMV启动子下表达萤火虫荧光素酶(Fluc)的质粒(p Fluc)。

＜体外基因表达活性＞

首先，以50：10：40：1.5的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、DSPC、胆固醇和PEG-DMG，通过醇稀释法制备了搭载有pFluc的脂质纳米粒子(pFluc搭载脂质纳米粒子)。作为pH敏感性阳离子性脂质，使用CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6、或CL15H6。另外，使微流路中的N/P比为9。

表3

研究了所制备的脂质纳米粒子的平均粒径、PDI、ζ电位及mRNA封入率。将测定结果示于表3。表3中，“CL”是指阳离子性脂质。通过动态光散射法算出的平均粒径均为90～150nm(表3)。关于pDNA封入率，CL4H6-LNP及CL15H6-LNP分别为70％及82％。另一方面，含有其他阳离子性脂质的脂质纳米粒子的pDNA封入率显示了90％以上的良好的值。

向培养细胞中导入pFluc搭载脂质纳米粒子，研究了体外基因表达活性。具体而言，向在96孔板中培养的HeLa-GFP细胞中以0.0625μgpDNA/孔转染pFluc搭载脂质纳米粒子，测定24小时后的Fluc活性。作为阳性对照，使用导入试剂“Lipofectamine 3000”(Thermo Fisher Scientific公司制)将pFluc导入HeLa-GFP细胞。Fluc活性使用发光光度计测定(RLU)，用通过BCA法定量的蛋白质量进行校正。

将导入了各pFluc搭载脂质纳米粒子的HeLa-GFP细胞的Fluc活性的测定结果示于图4。图中，“Lipo3K”是指使用Lipofectamine 3000进行了基因导入的阳性对照。如图4所示，导入了CL15F6-LNP的细胞与导入了CL4H6-LNP、CL15H6-LNP和阳性对照的细胞相比，显示出更高的活性。

＜体外基因表达活性＞

除了使微流路中的N/P比为6以外，与上述同样地制备了pFluc搭载脂质纳米粒子。

表4

研究了所制备的脂质纳米粒子的平均粒径、PDI、ζ电位及mRNA封入率。将测定结果示于表4。表4中，“CL”是指阳离子性脂质。通过动态光散射法算出的平均粒径均为70～125nm(表4)。关于pDNA封入率，CL4F6-LNP、CL4G6-LNP、CL15F6-LNP及CL15G6-LNP均显示了90％以上的良好的值。

接着，将所制备的各pFluc搭载脂质纳米粒子给药至ICR小鼠(4周龄、雌性)，并研究了体内基因表达活性。具体而言，向ICR小鼠以0.5mg mRNA/kg静脉内给药各pFluc搭载脂质纳米粒子，测定6小时后的肝脏和脾脏中的Fluc活性。Fluc活性使用发光光度计测定(RLU)，用通过BCA法定量的蛋白质量进行校正。

将给药了各pFluc搭载脂质纳米粒子的小鼠的肝脏和脾脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)的测定结果示于图5。图5(A)是肝脏中的Fluc活性的测定结果，图5(B)是脾脏中的Fluc活性的测定结果。此外，通过将肝脏中的基因表达活性除以脾脏中的基因表达活性，算出基因表达的肝脏选择性。图5(C)是表示给药了各pFluc搭载脂质纳米粒子的小鼠的[肝脏中的Fluc活性]/[脾脏中的Fluc活性]的计算结果的图。如图5(A)所示，肝脏中的Fluc活性在给药了CL4F6-LNP及CL15F6-LNP的小鼠与给药了CL4H6-LNP及CL15H6-LNP的小鼠相比，更为优异。另外，如图5(C)所示，给药了CL4F6-LNP及CL4G6-LNP的小鼠与给药了CL4H6-LNP的小鼠相比，显示出较高的肝脏选择性。同样地，给药了CL15F6-LNP及CL15G6-LNP的小鼠与给药了CL15H6-LNP的小鼠相比，显示出较高的肝脏选择性。由这些结果可知，对具有相同的亲水性部位的脂质之间进行比较，在封入了pDNA的情况下，含有支架结构为支链型的pH敏感性阳离子性脂质的脂质纳米粒子与含有支架结构为直链型的pH敏感性阳离子性脂质的脂质纳米粒子相比，对肝脏的选择性更高，作为特异性地向肝脏递送的递送载体是有用的。

III.CL4F6衍生物和CL15F6衍生物的合成

＜CL4F6和CL4F6衍生物的合成＞

CL4F6和作为CL4F6衍生物的CL4F 6-2、CL4F 6-4、CL4F 7-3、CL4F 7-4、CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 8-5、CL4F 8-6、CL4F 9-3、CL4F9-4、CL4F 9-5、CL4F 9-6、CL4F 9-7、CL4F10-2、CL4F 10-4、CL4F 10-5、CL4F 10-7、CL4F 10-8、CL4F 11-5、CL4F 11-6、CL4F 11-7、CL4F 11-9、CL4F 12-4、CL4F 12-6、CL4F 12-10、CL4F 13-3、CL4F 14-2、CL4F 16-0和CL4F16-1的合成如下进行。

将通过专利文献1中记载的方法合成的7-(4-(二丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇(1.0mmol)溶解于5mL的二氯甲烷中，接着，加入支链脂肪酸(2.40mmol)、DMAP(N,N-二甲基-4-氨基吡啶)(0.10mmol)和EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(3.0mmol)，在室温下使其反应一晚。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去后，用乙酸乙酯进行混悬，然后用0.5N氢氧化钠水溶液及饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去，得到粗产物。通过将粗产物供于ODS化硅胶色谱[洗脱溶剂；乙腈/异丙醇(50：50)：水(0.1％TFA)(连续梯度)]和硅胶色谱[洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)]进行精制，得到CL4F6或CL4F6衍生物。

＜CL15F6和CL15F6衍生物的合成＞

CL15F6和作为CL15F6衍生物的CL15F 6-2、CL15F 6-4、CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 10-5、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F 12-10、CL15F 13-3、CL15F 14-2、CL15F 16-0和CL15F 16-1的合成如下进行。

将通过专利文献1中记载的方法合成的5,11-二羟基-5-(6-羟基己基)十一烷基1-甲基哌啶-4-羧酸酯(1.00mmol)溶解于10mL的二氯甲烷中。接着，加入癸酸2-己基酯(2.40mmol)、DMAP(0.10mmol)和EDCI(3.0mmol)，在室温下使其反应一晚。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去后，用乙酸乙酯进行混悬，然后用0.5N氢氧化钠水溶液及饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去，得到粗产物。通过将粗产物供于ODS化硅胶色谱[洗脱溶剂；乙腈/异丙醇(50：50)：水(0.1％TFA)(连续梯度)]和硅胶色谱[洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)]进行精制，得到CL15F6或CL15F6衍生物。

上述支链脂肪酸以直链脂肪酸或丙二酸二甲酯为原料如下合成。

＜以直链脂肪酸为原料的支链脂肪酸的合成＞

将直链脂肪酸(10.28mmol)溶解于36mL的THF中，接着，在-20℃以下滴加二异丙基酰胺锂(24mmol)，在0℃下搅拌30分钟。接着，加入DMPU(18mL)，在0℃下搅拌60分钟。接着，加入碘烷烃(23.2mmol)，在10℃下使其反应一晚。用2N盐酸淬灭后，用二甲醚稀释，用饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去，得到粗产物。通过将粗产物供于ODS化硅胶色谱[洗脱溶剂；乙腈/异丙醇(50：50)：水(10mM乙酸铵)(连续梯度)]进行精制，得到支链脂肪酸。

＜以丙二酸二甲酯为原料的支链脂肪酸的合成＞

将NaH(7.56mmol)溶解于18mL的THF中，在0℃下搅拌10分钟。接着，加入丙二酸二甲酯(7.56mmol)，在0℃下搅拌10分钟。接着，加入任意的碘烷烃(7.56mmol)，在室温下使其反应一晚。加入NaH(11.34mmol)，在0℃下搅拌10分钟。接着，加入任意的碘烷烃(11.34mmol)，在室温下使其反应一晚。用醋酸淬灭后，用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去。将除去溶剂的成分用16mL的乙醇溶解，加入5mL的8N氢氧化钠水溶液，在60℃下使其反应一晚。用6N盐酸中和后，用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水进行分液清洗。在有机层中加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发仪将溶剂蒸馏除去后，在160℃下加热2小时，得到粗产物。通过将粗产物供于ODS化硅胶色谱[洗脱溶剂；乙腈/异丙醇(50：50)：水(10mM乙酸铵)(连续梯度)]进行精制，得到支链脂肪酸。

就CL4F 7-4、CL4F 8-5、CL4F 9-6和CL4F 10-7的合成中使用的支链脂肪酸而言，与在原料中使用丙二酸二甲酯的方法相比，在原料中使用直链脂肪酸的方法能够收率更为良好地得到支链脂肪酸。

就CL4F 6-2、CL4F 6-4、CL4F 7-3、CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 8-6、CL4F 9-3、CL4F9-4、CL4F 9-5、CL4F 9-7、CL4F 10-2、CL4F 10-4、CL4F 10-5、CL4F6、CL4F 10-8、CL4F 11-5、CL4F 11-6、CL4F 11-7、CL4F 11-9、CL4F 12-4、CL4F 12-6、CL4F 12-10、CL4F 13-3、CL4F14-2、CL4F 16-1、CL15F 6-2、CL15F 6-4、CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 10-5、CL15F6、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F11-6、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F 12-10、CL15F 13-3、CL15F 14-2、及CL15F16-1的合成中使用的支链脂肪酸而言，与原料中使用直链脂肪酸的方法相比，原料中使用丙二酸二甲酯的方法能够收率更为良好地得到支链脂肪酸。

IV.使用了CL4F6衍生物及CL15F6衍生物的脂质纳米粒子的制备及评价

1.mRNA搭载脂质纳米粒子的制备及评价

＜mRNA搭载脂质纳米粒子(m RNA-LNP)的制备＞

脂质纳米粒子通过使用了流路的醇稀释法来制备。作为流路，使用混合器内置微流体设备“NanoAssemblr”(Precision NanoSystems公司制)。

具体而言，首先，将调整为脂质浓度为8mM的乙醇溶液及调整为mRNA浓度为46.1μg/mL的柠檬酸缓冲液(50mM、pH为3.5)分别以3mL/分钟及9mL/分钟送液至微流路内，回收从流路排出的脂质纳米粒子溶液。将该脂质纳米粒子溶液用20mM HEPES缓冲液(9％蔗糖、pH为7.45)稀释10倍后，用超滤单元浓缩，回收脂质纳米粒子溶液。

＜脂质纳米粒子的构成脂质＞

以50：10：38.5：1.5的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、油化产业)、胆固醇(Nacalai Tesque)、及DMG-PEG2K(油化产业)，通过醇稀释法，制作搭载有FlucmRNA的脂质纳米粒子(FlucmRNA搭载脂质纳米粒子)。FlucmRNA使用了TriLink Biotechnologies公司的CleanCap(注册商标)FLuc mRNA(5moU)。

＜脂质纳米粒子的平均粒径及PDI的测定＞

使用利用动态光散射法的分析装置“Zetasizer Nano ZSP”(Malvern公司制)测定脂质纳米粒子在PBS(-)中的平均粒径(ζ-平均)及PDI。

＜脂质纳米粒子的pKa的测定＞

脂质纳米粒子的pKa使用对甲苯氨基-2-萘磺酸(TNS)进行测定。首先，将TNS(终浓度：0.75μM)和脂质纳米粒子(终浓度：60μM)在调整为各pH的缓冲液中混合。用酶标仪测定所制备的混合液的荧光强度。关于激发波长，将测定值中的pH为3.5时的测定值记为100％带电率，将pH为9.5时的测定值记为0％带电率，将表示50％带电率的pH作为pKa算出。

＜脂质纳米粒子的核酸封入率＞

脂质纳米粒子的siRNA及mRNA的封入率用Ribogreen试剂测定。准备按照使脂质纳米粒子的浓度以核酸浓度计达到8μg/mL的方式用TE缓冲液稀释而得到的溶液作为纳米粒子表面核酸浓度测定用溶液。另外，按照使脂质纳米粒子的浓度以核酸浓度计达到1.2μg/mL、X-triton100达到1％(w/w)的方式添加，准备总核酸浓度测定用溶液。在96孔板(黑色、聚苯乙烯制、平底、Corning公司制)的孔内将100μL的Ribogreen(注册商标)试剂(Quant-iT^TM RiboGreen^TM RNA Reagent，Thermofisher Scientific公司制)与各溶液100μL充分混合，用酶标仪测定激发波长485nm、测定波长528nm下的荧光强度。利用与上述同样地测定荧光强度而制成的标准曲线进行含有1％X-triton100的核酸溶液(核酸浓度：0～2.5μg/mL)的核酸浓度的计算。通过以下的计算式，算出各脂质纳米粒子的核酸封入率。

封入率％＝(总核酸浓度测定用溶液的核酸浓度(μg/mL)-纳米粒子表面核酸浓度测定用溶液的核酸浓度(μg/mL))÷总核酸浓度测定用溶液的核酸浓度(μg/mL)×100

＜结果＞

研究了所制备的脂质纳米粒子的平均粒径、PDI及mRNA封入率、pKa。将CL4F6衍生物纳米粒子的测定结果示于表5及6，将CL15F6衍生物纳米粒子的测定结果示于表7。作为对照，使用具有以下结构的D-Lin-MC3-DMA(MC3)(MedChemExpress公司制)。

[化学式36]

通过动态光散射法算出的表5的CL4F6衍生物纳米粒子的平均粒径均为60～220nm，除了CL4F 16-0-LNP以外，均形成了PDI小且均匀性高的粒子。关于mRNA封入率，CL4F6-2-LNP和CL4F 16-1-LNP低于80％，但含有其他阳离子性脂质的LNP均显示80％以上。

关于表7的CL15F6的衍生物纳米粒子的平均粒径，CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP超过300nm，但含有其他阳离子性脂质的LNP均为90～200nm。除了CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP、CL15F 16-0-LNP、CL15H6-LNP以外，均形成了PDI小且均匀性高的粒子。mRNA封入率在CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP低于80％，但含有其他阳离子性脂质的LNP均显示80％以上。

接着，将所制备的各FlucmRNA搭载脂质纳米粒子给药至Balb/c小鼠(日本CharlesRiver、7周龄、雌性)，研究了体内基因表达活性。具体而言，向Balb/c小鼠以0.1mg mRNA/kg静脉内给药各FlucmRNA搭载脂质纳米粒子，测定6小时后的肝脏和脾脏中的Fluc活性。Fluc活性是将用PBS溶解至15mg/mL的VivoGlo Luciferin，In Vivo Grade(Promega，P1041)以每1只小鼠1.5mg的方式从尾静脉给药，然后通过体内成像系统(Perkin Elmer，IVIS200)进行测定。Fluc活性的单位是最大发光波长约560nm下的每单位面积的发光强度(AvgRadiance[p/s/cm²/sr])。

将给药了各FlucmRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的肝脏和脾脏中的Fluc活性(AvgRadiance[p/s/cm²/sr])的测定结果示于表5～7。

表5和6的CL4F6衍生物纳米粒子在肝脏中的Fluc活性显示了，在给药了含有CL4F8-6、CL4F 9-7或CL4F 11-6的FlucmRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠中，比给药了含有CL4F6的FlucmRNA脂质纳米粒子的小鼠高的Fluc活性。另一方面，脾脏中的CL4F6衍生物纳米粒子的Fluc活性显示了，在给药了含有CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 9-3、CL4F 10-2、CL4F 8-6、CL4F10-4、CL4F 10-5、CL4F 12-4、CL4F 13-3、CL4F 14-2、CL4F 7-4、CL4F 8-5、CL4F 9-4、或CL4F9-5的FlucmRNA脂质纳米粒子的小鼠中，比给药了含有CL4F6的FlucmRNA脂质纳米粒子的小鼠高的Fluc活性。

表7的CL15F6衍生物纳米粒子在肝脏中的Fluc活性表示了，在给药了含有CL15F9-7、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 10-8、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-10或CL15F14-2的FlucmRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠中，比给药了含有CL15F6的FlucmRNA脂质纳米粒子的小鼠高的Fluc活性。表7的CL15F6在脾脏中的Fluc活性表示了，在给药了含有CL15F 6-4、CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 10-5、CL15F 13-3、CL15F 11-6、CL15F 10-8、CL15F 11-7、CL15F 11-9或CL15F 14-2的FlucmRNA脂质纳米粒子的小鼠中，比给药了含有CL15F6的FlucmRNA脂质纳米粒子的小鼠高的Fluc活性。

表5

表6

表7

2.siRNA搭载脂质纳米粒子的制备及评价

＜siRNA搭载脂质纳米粒子的制备＞

代替mRNA制备搭载有siRNA的脂质纳米粒子，研究了体内F7敲减活性。除了使微流路中的N/P比为6以外，与上述同样地制备siRNA搭载脂质纳米粒子。将针对F7的siRNA的碱基序列示于表8。表中，大写字母表示天然型RNA(仅T为天然型DNA)，小写字母表示2’-fluoro修饰体，^*表示硫代磷酸酯键。

表8

首先，以50：10：38.5：1.5的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、胆固醇和PEG-DMG，通过醇稀释法，制作搭载有针对F7的siRNA的脂质纳米粒子(F7 siRNA搭载脂质纳米粒子)。

＜结果＞

研究了所制备的脂质纳米粒子的平均粒径、PDI、siRNA封入率和pKa。将CL4F6衍生物纳米粒子的测定结果示于表9及10，将CL15F6衍生物纳米粒子的测定结果示于表11。CL4F6衍生物纳米粒子的平均粒径为60～280nm，siRNA封入率在CL4F 6-2-LNP低于90％，但含有其他阳离子性脂质的LNP均显示90％以上。除了CL4F 16-2-LNP以外，均形成了PDI小且均匀性高的粒子。

CL15F6衍生物纳米粒子的平均粒径在CL15F 6-2-LNP超过300nm，但含有其他阳离子性脂质的LNP均为85～290nm。siRNA封入率在全部的LNP均显示90％以上。除了CL15F 6-2-LNP、CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP、CL15F 16-0-LNP以外，均形成了PDI小且均匀性高的粒子。

接着，将所制备的各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子给药至Balb/c小鼠(日本CharlesRiver、5周龄、雌性)，研究了体内F7敲减活性。具体而言，向BALB/c小鼠以0.025mg siRNA/kg静脉内给药含有表9中记载的脂质的F7 siRNA搭载脂质纳米粒子、以0.025mg siRNA/kg静脉内给药表10和11中记载的脂质的F7 siRNA搭载脂质纳米粒子，使用BIOPHEN FVII(Biophen，A221304)测定24小时后的血浆中F7酶活性。将未处理组小鼠的血浆中F7酶活性记为100％，算出给药了各F7 siRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的相对血浆中F7酶活性(％)。此外，将给药了含有MC3的F7 siRNA搭载脂质纳米粒子的小鼠的相对血浆中F7酶活性(％)记为1，算出比率。将CL4F6衍生物纳米粒子的测定结果示于表9及10，将CL15F6衍生物纳米粒子的测定结果示于表11。

表9和10的含有CL4F 10-4、CL4F 8-5、CL4F 9-5、或CL4F 12-6的F7 siRNA搭载脂质纳米粒子显示了比含有MC3的F7 siRNA搭载脂质纳米粒子高的敲减活性。

表11的含有CL15F 9-7、CL15F 11-5、CL15F 12-4、CL15F 11-6、CL15F 10-8、CL15F11-7、CL15F 11-9、或CL15F 12-10的F7 siRNA搭载脂质纳米粒子显示了比含有MC3的F7siRNA搭载脂质纳米粒子高的敲减活性。

表9

表10

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表11

3.pDNA搭载脂质纳米粒子的制备及评价

＜pDNA搭载脂质纳米粒子的制备＞

代替mRNA制备搭载有编码了eGFP的pDNA的脂质纳米粒子，研究了体外时的eGFP的发光。编码了eGFP的pDNA通过将编码了eGFP的基因插入到pCMV-LacI from LacSwitch IIMammalian Expression System(Agilent公司)来制作。

pDNA搭载脂质纳米粒子与mRNA搭载脂质纳米粒子同样地制备。

＜脂质纳米粒子的构成脂质＞

以50：10：38.5：1.5的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、油化产业)、胆固醇(Nacalai Tesque)、及DMG-PEG2K(油化产业)。

＜脂质纳米粒子的平均粒径及PDI的测定＞

脂质纳米粒子的平均粒径及PDI的测定通过与mRNA-LNP的平均粒径的测定相同的方法进行。

＜脂质纳米粒子的核酸封入率＞

脂质纳米粒子的pDNA的封入率使用Picogreen(注册商标)试剂(Quant-i T^TMdsDNA Assay Kit，broad range，Thermofisher Scientific公司制)进行测定。在pDNA的封入率测定中，使纳米粒子表面核酸浓度测定用溶液的核酸浓度为1.6μg/mL，使总核酸浓度测定用溶液的核酸浓度为24ng/mL，使标准曲线中使用的核酸浓度为0～0.5μg/mL，作为测定试剂，使用Picogreen(注册商标)试剂(Quant-iT^TM dsDNA Assay Kit，broad range，Thermofisher Scientific公司制)，除此以外，通过与siRNA及mRNA的封入率测定方法相同的方法进行。

封入率％＝(总核酸浓度测定用溶液的核酸浓度(μg/mL)-纳米粒子表面核酸浓度测定用溶液的核酸浓度(μg/mL))÷(总核酸浓度测定用溶液的核酸浓度(μg/mL))×100

＜结果＞

将结果示于下表。将所制备的脂质纳米粒子在40℃下静置，在保管各期间后，按照以下的基准评价品质是否良好地得到保持：

良好(〇)：粒径为刚制作后的粒径±20nm以内，且PDI为0.2以下，且封入率为80％以上；

不够良好(×)：粒径超过刚制成后的粒径±20nm，或封入率小于80％。

对于在40℃下静置1周以上品质保持良好的脂质纳米粒子，评价为稳定性优异。

表12

4.脂质纳米粒子的保存稳定性评价

＜脂质纳米粒子的制备＞

＜脂质纳米粒子的构成脂质＞

以50：10：38.5：1.5的摩尔比组成使用pH敏感性阳离子性脂质、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、胆固醇和PEG-DMG，通过醇稀释法，制作搭载有FlucmRNA的脂质纳米粒子(FlucmRNA搭载脂质纳米粒子)。FlucmRNA使用了TriLink Biotechnologies公司的CleanCap(注册商标)FLuc mRNA(5moU)。

＜脂质纳米粒子的平均粒径及PDI的测定＞

使用利用了动态光散射法的分析装置“Zetasizer Nano ZSP”(Malvern公司制)测定脂质纳米粒子在PBS(-)中的平均粒径(ζ-平均)及PDI。

＜脂质纳米粒子的核酸封入率＞

脂质纳米粒子的mRNA的封入率使用Ribogreen(life technologies公司制)进行测定。

＜保存稳定性评价＞

将脂质纳米粒子在-80℃、5℃、25℃、40℃的各温度下静置，在保管各期间后，测定平均粒径、PDI及核酸封入率。将全部满足以LNP制备日为基准平均粒径维持在±20nm以内、PDI为0.2以下且保持高均匀性、核酸封入率也维持在80％以上这3个条件的脂质纳米粒子判断为品质保持良好。

＜结果＞

将各FlucmRNA搭载脂质纳米粒子在-80℃、5℃、25℃、40℃下分别静置，在保管各期间后，测定平均粒径、PDI及核酸封入率，其结果将判断为脂质纳米粒子的品质保持良好的期间示于表13及14。对于5℃下静置1周以上品质保持良好的脂质纳米粒子，可以评价为稳定性优异。

表13

表14

5.具有各种组成的脂质纳米粒子的制作及评价

＜脂质纳米粒子的制备＞

具体而言，首先，将调整为脂质浓度为8mM的乙醇溶液和调整为核酸浓度为46.1μg/mL的柠檬酸缓冲液(50mM、pH为3.5)分别以3mL/分钟和9mL/分钟送液到微流路内，回收从流路排出的脂质纳米粒子溶液。将该脂质纳米粒子溶液用20mM HEPES缓冲液(9％蔗糖、pH为7.45)稀释10倍后，用超滤单元浓缩，回收脂质纳米粒子溶液。

＜脂质纳米粒子的构成脂质＞

按表15～18中记载的组成制备脂质。作为pH敏感性阳离子性脂质，使用CL4F 10-5、CL4F 9-7、CL4F 8-4、CL4F6、CL15 10-5和CL15F6。作为其他脂质，使用胆固醇(NacalaiTesque公司)、β谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇(22,23-Dihydrostigmasterol)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、5-豆甾烯-3β-醇(5-Stigmasten-3β-ol)、α-二氢岩藻甾醇(α-Dihydrofucosterol)、24α-乙基胆甾醇(24α-Ethylcholesterol)、Sigma-All)、DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、COATSOME MC-8080、油化产业)、DMG-PEG2K(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(1,2-Dimyrixyl-rac-glycero-3-methylpolyoxyethylen)、SUNBRIGHT GM-020、油化产业株式会社)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、COATSOME MC-8181、油化产业)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、COATSOME ME-8181、油化产业)、DPPC(1,2-双十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、COATSOME MC-6060、油化产业)。作为mRNA，使用Fluc表达mRNA(CleanCapFluc mRNA(5moU)、TriLink Biotechnologies公司)、mCherry表达mRNA(CleanCap mCherrymRNA(5moU)、TriLink Biotechnologies公司)。

＜保存稳定性评价＞

将所制备的脂质纳米粒子在40℃静置，保管各期间后，测定平均粒径、PDI及核酸封入率。按照以下的基准评价品质是否保持良好：

良好(〇)：粒径在刚制成后的粒径±20nm以内，且PDI为0.2以下，且封入率为80％以上；

对于在40℃下静置1周以上品质保持良好的脂质纳米粒子，可以评价为稳定性优异。

＜体外时的荧光素酶表达活性的测定＞

作为细胞培养用培养基，使用在E-MEM培养基(含有L-葡聚糖、酚红、丙酮酸钠、非必需氨基酸、1,500mg/L碳酸氢钠)(产品编号055-08975、和光纯药公司)中添加了10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum Characterized、Corning公司)和10％抗生素(青霉素-链霉素(10,000U/mL)、Thermo Fisher公司)而得到的培养基。将人胚胎肾细胞293(HEK293细胞)以2.0×10⁴cells/孔添加于96孔白色板(SIGMA公司)，在37℃、5％CO₂气氛下培养一晚后，以mRNA含量换算计添加脂质纳米粒子100ng/孔。在相同条件下培养24小时后，添加300μg/mL的荧光素溶液(Beetle luciferin，Promega公司)100μg/孔，利用多功能酶标仪(EnSightmultimode plate reader，Perkin Elmer公司)测定发光强度。此时，在仅添加了培养基的孔和未添加脂质纳米粒子的细胞孔中添加上述荧光素溶液，同样地进行测定，采用将培养基孔的发光强度作为背景减去而得到的值。需要说明的是，未添加脂质纳米粒子的细胞孔的发光强度为背景以下。

＜体外时的mCherry表达活性的测定＞

作为细胞培养用培养基，使用在E-MEM培养基(含有L-葡聚糖、酚红、丙酮酸钠、非必需氨基酸、1,500mg/L碳酸氢钠)(产品编号055-08975、和光纯药公司)中添加了10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum Characterized、Corning公司)和1％抗生素(青霉素-链霉素(10,000U/mL)、Thermo Fisher公司)而得到的培养基。将人胚胎肾细胞293(HEK293细胞)以2.0×10⁴cells/孔添加于96孔黑色板(SIGMA公司)，在37℃、5％CO₂气氛下培养一晚后，以mRNA含量换算计添加脂质纳米粒子1000ng/孔。在相同条件下培养24小时后，用多功能酶标仪(Ensight multimode plate reader，Perkin Elmer公司)测定荧光强度(激发波长587nm/荧光波长610nm)。此时，也准备仅添加了培养基的孔、以及未添加脂质纳米粒子的细胞孔，同样地进行测定，采用将培养基孔的发光强度作为背景减去而得到的值。需要说明的是，未添加脂质纳米粒子的细胞孔的荧光强度为背景以下。

表15

表16

表17

表18

＜结果＞

将结果示于下表19～23。

表19

表20

表21

表22

表23

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