TW202404641A - 用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明所欲解決的問題在於提供一種脂質奈米粒子，其可用作用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物。 本發明的解決手段是藉由一種用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物等來解決上述問題，該用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物：式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1 － 4烷基或C 2 － 4烯基，式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數，式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1 － 4烷基或C 2 － 4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1 － 4烷基或C 2 － 4烯基。

Description

用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物
本發明有關一種脂質奈米粒子，其可用作用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物。
作為用以將脂溶性藥物和siRNA(short interfering RNA，小型干擾RNA)、mRNA等核酸進行封裝並輸送至目標細胞的載子，已利用有一種脂質奈米粒子(LNP)。例如，作為成為用以將siRNA等核酸有效地輸送至目標細胞內的載子的脂質奈米粒子，已報導有一種脂質奈米粒子，其包含酸鹼應答性(pH-sensitive)陽離子性脂質作為構成脂質，該酸鹼應答性陽離子性脂質在生理性pH中為電中性，在胞內體等弱酸性pH環境下會變化為陽離子性(專利文獻1及非專利文獻1)。
作為酸鹼應答性陽離子性脂質，例如Jayaraman等人開發了一種DLin-MC3-DMA，並在小鼠肝臟的第7因子(F7)基因減量(knock-down)模式中的ED 50(半數有效劑量)達到0.005mg siRNA/kg(公斤)(非專利文獻2)。截至目前為止，本發明人也開發了獨特的酸鹼應答性陽離子性脂質YSK05及YSK13-C3，並分別在F7基因減量模式中達成0.06、0.015mg siRNA/kg的ED 50(非專利文獻3～5)。又，Maier等人報導指出開發出一種可對MC3-DMA賦予生物可分解性的L319，並且其兼具ED 50為0.01mg siRNA/kg且高安全性(非專利文獻6～8)。然而，已知包含該等酸鹼應答性陽離子性脂質之脂質奈米粒子的胞內體脫離效率仍僅為數%程度(非專利文獻9)，而期望開發一種能夠使生體可用率進一步提升的技術。
進一步，Dong等人經由高速篩選(high through put screening)發現一種獨特類脂質物質cKK-E12，其在F7基因減量模式中達成0.002mg siRNA/kg的ED 50(非專利文獻10)。該技術在活性層面為在文獻中最為優異者，但是卻沒有在高投予量時的毒性和脂質生物可分解性等安全層面的見解。 [先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：國際公開第2018/230710號 專利文獻2：國際公開第2018/190423號
非專利文獻1：Sato et al., Journal of Controlled Release, 2019, vol.295, p.140-152. 非專利文獻2：Jayaraman et al., Angewandte Chemie International Edition, 2012, vol.51, p.8529-8533. 非專利文獻3：Watanabe et al., Scientific Reports, 2014, 4:4750, DOI: 10.1038/srep04750. 非專利文獻4：Yamamoto et al., Journal of Hepatology, 2016, vol.64, p.547-555. 非專利文獻5：Sato et al., Molecular Therapy, 2016, vol.24, p.788-795. 非專利文獻6：Maier et al., Molecular Therapy, 2013, vol.21(8), p.1570-1578. 非專利文獻7：Wittrup et al., Nature Biotechnology, 2015, vol.33(8), p.870-876. 非專利文獻8：Xu et al., Molecular Pharmaceutics, 2014, vol.11, p.1424-1434. 非專利文獻9：Gilleron et al., Nature Biotechnology, 2013, vol.31(7), p.638-646. 非專利文獻10：Dong, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, vol.111(11), p.3955-3960. 非專利文獻11：Leung et al.，Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces，2012，vol.116(34)，p.18440-18450.
[發明所欲解決的問題]
本發明的目的在於提供一種脂質奈米粒子，其可用作用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物。 [解決問題的技術手段]
本發明人發現一種脂質奈米粒子可用作用於輸送至癌症之醫藥組成物或免疫賦活用組成物，該脂質奈米粒子包含具備支鏈型的烴鏈之酸鹼應答性陽離子性脂質作為構成脂質，從而完成本發明。
亦即，本發明提供以下脂質奈米粒子。 [1-1] 一種脂質奈米粒子，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性(pH sensitive)陽離子性脂質： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 5-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。
[1-2] 如前述[1-1]所述之脂質奈米粒子，其中，進一步含有固醇及聚烷二醇修飾脂質。 [1-3] 如前述[1-1]或[1-2]所述之脂質奈米粒子，其中，含有核酸。 [1-4] 如前述[1-3]所述之脂質奈米粒子，其中，前述核酸為siRNA。 [1-5] 如前述[1-3]所述之脂質奈米粒子，其中，前述核酸為mRNA或質體DNA。
[1-6] 如前述[1-3]～[1-5]中任一項所述之脂質奈米粒子，其中，前述核酸為可在肝臟細胞內表現的基因。 [1-7] 一種醫藥用組成物，其以前述[1-1]～[1-6]中任一項所述之脂質奈米粒子作為有效成分。 [1-8] 如前述[1-7]所述之醫藥用組成物，其被使用於基因治療。 [1-9] 一種外來基因的表現方法，其對受試動物(但是人類除外)投予封裝有目的在於在肝臟細胞內表現的外來基因之脂質奈米粒子，而在前述受試動物的肝臟內使前述外來基因表現，該脂質奈米粒子為前述[1-1]～[1-6]中任一項所述之脂質奈米粒子。
[2-1] 一種脂質奈米粒子，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物及核酸： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 2-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基；其中， 前述核酸為mRNA或質體DNA。
[2-2] 如[2-1]所述之脂質奈米粒子，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示：
。
[3-1] 一種脾臟輸送用的醫藥組成物，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 2-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。
[3-2] 如[3-1]所述之醫藥組成物，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示：
[4-1] 一種酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物，該酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式(I)表示： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基)； 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 2-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數； 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基；並且， 該酸鹼應答性陽離子性脂質不包括下述式的酸鹼應答性陽離子性脂質： 。
[4-2] 如[4-1]所述之酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示：
[5-1] 一種脂質奈米粒子製劑，其包含： (i)固醇或固醇衍生物； (ii)聚烷二醇修飾脂質； (iii)核酸； (iv)緩衝劑； (v)雙醣；及， (vi)由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物， 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 2-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。
[5-2] 如[5-1]所述之脂質奈米粒子製劑，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示：
[5-3] 如[5-1]或[5-2]所述之脂質奈米粒子製劑，其中，前述核酸為mRNA。 [5-4] 如[5-1]～[5-3]中任一項所述之脂質奈米粒子製劑，其中，脂質奈米粒子被懸浮於水溶液中。 [5-5] 如[5-4]所述之脂質奈米粒子製劑，其中，前述雙醣的濃度為1重量%～20重量%。
[5-6] 如[5-4]或[5-5]所述之脂質奈米粒子製劑，其中，該脂質奈米粒子製劑在25℃中為pH6.8～pH8.0。 [5-7] 如[5-1]～[5-3]中任一項所述之脂質奈米粒子製劑，其中，該脂質奈米粒子製劑是冷凍乾燥而成。 [5-8] 一種再懸浮製劑，其在[5-7]所述之脂質奈米粒子製劑中添加水或水溶液而成。
[6-1] 一種酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物的製造方法，該酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式(I)表示： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 2-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基；其中， 前述酸鹼應答性陽離子性脂質的化學式由下述式表示， ， 該製造方法至少包含下述步驟：在有機鋰、二甲基丙烯脲(DMPU)及四氫呋喃(THF)的存在下，使烷基羧酸與鹵化烷基進行反應來獲得支鏈脂肪酸。
[6-2] 如[6-1]所述之製造方法，其中，前述步驟中的前述四氫呋喃(THF)與前述二甲基丙烯脲(DMPU)的容積比為10：1～1：1(v/v)。 [6-3] 如[6-1]或[6-2]所述之製造方法，其中，前述有機鋰為二異丙胺鋰(Lithium diisopropylamide，LDA)。 [6-4] 如[6-1]～[6-3]中任一項所述之製造方法，其中，前述鹵化烷基為碘化烷基。 [6-5] 如[6-1]～[6-4]中任一項所述之製造方法，其中，進一步包含藉由逆相層析術來精製支鏈脂肪酸的步驟。
[6-6] 一種酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物的製造方法，該酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式(I)表示： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 2-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基；其中， 前述酸鹼應答性陽離子性脂質的化學式由下述式表示，
， 該製造方法至少包含將反應液進行水解處理及加熱處理，來獲得支鏈脂肪酸的步驟，該反應液是在鹼的存在下使丙二酸酯與鹵化烷基進行反應而獲得。
[6-7] 如[6-6]所述之製造方法，其中，前述丙二酸酯為丙二酸二甲酯。 [6-8] 如[6-6]或[6-7]所述之製造方法，其中，前述鹵化烷基為碘化烷基。 [6-9] 如[6-6]～[6-8]中任一項所述之製造方法，其中，前述鹼選自由氫化鈉、氫化鈣、乙醇鈉及雙(三甲基甲矽烷基)胺鋰所組成之群組。 [6-10] 如[6-6]～[6-9]中任一項所述之製造方法，其中，前述水解處理使用氫氧化鈉、氫氧化鈣及氫氧化鋰中任一種。 [6-11] 如[6-6]～[6-10]中任一項所述之製造方法，其中，與前述水解處理同時實行及/或在前述水解處理之後於120℃～170℃中實行前述加熱處理。 [6-12] 如[6-6]～[6-11]中任一項所述之製造方法，其中，進一步包含藉由逆相層析術來精製支鏈脂肪酸的步驟。
[7-1] 一種用於輸送至癌症之醫藥組成物，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。 [7-2] 如[7-1]所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其包含： (i)固醇或固醇衍生物； (ii)聚烷二醇修飾脂質；及， (iii)緩衝劑。
[7-3] 如[7-2]所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其中，前述聚烷二醇修飾脂質包含1,2-二硬脂醯基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG)。
[7-4] 如[7-1]～[7-3]中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示：
[7-5] 如[7-1]～[7-4]中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其進一步包含核酸。 [7-6] 如[7-5]所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其中，前述核酸是選自由siRNA、mRNA、適體及質體DNA所組成之群組中的至少1種。 [7-7] 如[7-1]～[7-6]中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其是脂質奈米粒子的懸浮液。 [7-8] 如[7-7]所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其在25℃中為pH6.8～pH8.0。
[7-9] 如[7-7]或[7-8]所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其包含1重量%～20重量%的二糖。 [7-10] 如[7-1]～[7-6]中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其是脂質奈米粒子的冷凍乾燥製劑。 [7-11] 一種癌症治療用醫藥組成物，用以治療具有癌症之個體，該醫藥組成物包含[7-1]～[7-10]中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物。
[8-1] 一種免疫賦活用組成物，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。
[8-2] 如[8-1]所述之免疫賦活用組成物，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示：
[8-3] 如[8-1]或[8-2]所述之免疫賦活用組成物，其包含選自由siRNA、mRNA、適體及質體DNA所組成之群組中的核酸。 [8-4] 如[8-1]～[8-3]中任一項所述之免疫賦活用組成物，其是脂質奈米粒子的懸浮液。 [8-5] 如[8-4]所述之免疫賦活用組成物，其在25℃中為pH6.8～pH8.0。 [8-6] 如[8-4]或[8-5]所述之免疫賦活用組成物，其包含1重量%～20重量%的二糖。 [8-7] 如[8-1]～[8-3]中任一項所述之免疫賦活用組成物，其是脂質奈米粒子的冷凍乾燥製劑。 [發明的功效]
本發明的脂質奈米粒子，能夠使受到封裝的基因在肝臟或脾臟內高度表現。因此，該脂質奈米粒子有助於作成使用於基因治療的肝臟特異性基因輸送載子或脾臟特異性基因輸送載子。又，本發明的脂質奈米粒子在穩定性方面優異。
以下，具體說明本發明的實施態樣。在本說明書中，「X1～X2(X1與X2為滿足X1〈X2的實數)，意指「X1以上且X2以下」。
本發明的脂質奈米粒子為含有由下述通式(I)表示的酸鹼應答性陽離子脂質(以下，有時稱為「本發明的酸鹼應答性陽離子脂質」)之脂質奈米粒子。作為脂質奈米粒子的構成脂質，藉由具備由通式(I)表示的酸鹼應答性陽離子脂質，本發明的脂質奈米粒子對於肝臟或脾臟的選擇性高。
通式(I)中，a表示3～5的整數，較佳為4。 b表示0或1。當b為0時不存在－O－CO－基，而意指單鍵。
通式(I)中，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團。通式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基(碳數1～15的烷基)，c表示0或1，v表示4～12的整數。
作為直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基，可列舉： 正甲基； 正乙基； 正丙基、1-甲基乙基； 正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基； 正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基； 正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1-甲基-2,2-二甲基丁基； 正庚基、1-甲基己基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、1-乙基戊基、1,1-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1-甲基-3,3-二甲基丁基、2-甲基-3,3-二甲基丁基； 正辛基、1-甲基庚基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、5-甲基庚基、6-甲基庚基、1-乙基己基、1,1-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、5,5-二甲基己基、1-甲基-4,4-二甲基戊基、2-甲基-4,4-二甲基戊基、3-甲基-4,4-二甲基戊基； 正壬基、1-甲基辛基、2-甲基辛基、3-甲基辛基、4-甲基辛基、5-甲基辛基、6-甲基辛基、7-甲基辛基、1-乙基庚基、1,1-二甲基庚基、2,2-二甲基庚基、3,3-二甲基庚基、4,4-二甲基庚基、5,5-二甲基庚基、6,6-二甲基庚基、1-甲基-5,5-二甲基己基、2-甲基-5,5-二甲基己基、3-甲基-5,5-二甲基己基、4-甲基-5,5-二甲基己基； 正癸基、1-甲基壬基、2-甲基壬基、3-甲基壬基、4-甲基壬基、5-甲基壬基、6-甲基壬基、7-甲基壬基、8-甲基壬基、1-乙基辛基、1,1-二甲基辛基、2,2-二甲基辛基、3,3-二甲基辛基、4,4-二甲基辛基、5,5-二甲基辛基、6,6-二甲基辛基、7,7-二甲基辛基、1-甲基-6,6-二甲基庚基、2-甲基-6,6-二甲基庚基、3-甲基-6,6-二甲基庚基、4-甲基-6,6-二甲基庚基、5-甲基-6,6-二甲基庚基； 正十一烷基、1-甲基癸基、2-甲基癸基、3-甲基癸基、4-甲基癸基、5-甲基癸基、6-甲基癸基、7-甲基癸基、8-甲基癸基、9-甲基癸基、1-乙基壬基、1,1-二甲基壬基、2,2-二甲基壬基、3,3-二甲基壬基、4,4-二甲基壬基、5,5-二甲基壬基、6,6-二甲基壬基、7,7-二甲基壬基、8,8-二甲基壬基、1-甲基-7,7-二甲基辛基、2-甲基-7,7-二甲基辛基、3-甲基-7,7-二甲基辛基、4-甲基-7,7-二甲基辛基、5-甲基-7,7-二甲基辛基、6-甲基-7,7-二甲基辛基； 正十二烷基、1-甲基十一烷基、2-甲基十一烷基、3-甲基十一烷基、4-甲基十一烷基、5-甲基十一烷基、6-甲基十一烷基、7-甲基十一烷基、8-甲基十一烷基、9-甲基十一烷基、10-甲基十一烷基、1-乙基癸基、1,1-二甲基癸基、2,2-二甲基癸基、3,3-二甲基癸基、4,4-二甲基癸基、5,5-二甲基癸基、6,6-二甲基癸基、7,7-二甲基癸基、8,8-二甲基癸基、9,9-二甲基癸基、1-甲基-8,8-二甲基壬基、2-甲基-8,8-二甲基壬基、3-甲基-8,8-二甲基壬基、4-甲基-8,8-二甲基壬基、5-甲基-8,8-二甲基壬基、6-甲基-8,8-二甲基壬基、7-甲基-8,8-二甲基壬基； 正十三烷基、1-甲基十二烷基、2-甲基十二烷基、3-甲基十二烷基、4-甲基十二烷基、5-甲基十二烷基、6-甲基十二烷基、7-甲基十二烷基、8-甲基十二烷基、9-甲基十二烷基、10-甲基十二烷基、11-甲基十二烷基、1-乙基十一烷基、1,1-二甲基十一烷基、2,2-二甲基十一烷基、3,3-二甲基十一烷基、4,4-二甲基十一烷基、5,5-二甲基十一烷基、6,6-二甲基十一烷基、7,7-二甲基十一烷基、8,8-二甲基十一烷基、9,9-二甲基十一烷基、10,10-二甲基十一烷基、1-甲基-9,9-二甲基癸基、2-甲基-9,9-二甲基癸基、3-甲基-9,9-二甲基癸基、4-甲基-9,9-二甲基癸基、5-甲基-9,9-二甲基癸基、6-甲基-9,9-二甲基癸基、7-甲基-9,9-二甲基癸基、8-甲基-9,9-二甲基癸基； 正十四烷基、1-甲基十三烷基、2-甲基十三烷基、3-甲基十三烷基、4-甲基十三烷基、5-甲基十三烷基、6-甲基十三烷基、7-甲基十三烷基、8-甲基十三烷基、9-甲基十三烷基、10-甲基十三烷基、11-甲基十三烷基、12-甲基十三烷基、1-乙基十二烷基、1,1-二甲基十二烷基、2,2-二甲基十二烷基、3,3-二甲基十二烷基、4,4-二甲基十二烷基、5,5-二甲基十二烷基、6,6-二甲基十二烷基、7,7-二甲基十二烷基、8,8-二甲基十二烷基、9,9-二甲基十二烷基、10,10-二甲基十二烷基、11,11-二甲基十二烷基、1-甲基-10,10-二甲基十一烷基、2-甲基-10,10-二甲基十一烷基、3-甲基-10,10-二甲基十一烷基、4-甲基-10,10-二甲基十一烷基、5-甲基-10,10-二甲基十一烷基、6-甲基-10,10-二甲基十一烷基、7-甲基-10,10-二甲基十一烷基、8-甲基-10,10-二甲基十一烷基、9-甲基-10,10-二甲基十一烷基； 正十五烷基、1-甲基十四烷基、2-甲基十四烷基、3-甲基十四烷基、4-甲基十四烷基、5-甲基十四烷基、6-甲基十四烷基、7-甲基十四烷基、8-甲基十四烷基、9-甲基十四烷基、10-甲基十四烷基、11-甲基十四烷基、12-甲基十四烷基、13-甲基十四烷基、1-乙基十三烷基、1,1-二甲基十三烷基、2,2-二甲基十三烷基、3,3-二甲基十三烷基、4,4-二甲基十三烷基、5,5-二甲基十三烷基、6,6-二甲基十三烷基、7,7-二甲基十三烷基、8,8-二甲基十三烷基、9,9-二甲基十三烷基、10,10-二甲基十三烷基、11,11-二甲基十三烷基、12,12-二甲基十三烷基、1-甲基-11,11-二甲基十二烷基、2-甲基-11,11-二甲基十二烷基、3-甲基-11,11-二甲基十二烷基、4-甲基-11,11-二甲基十二烷基、5-甲基-11,11-二甲基十二烷基、6-甲基-11,11-二甲基十二烷基、7-甲基-11,11-二甲基十二烷基、8-甲基-11,11-二甲基十二烷基、9-甲基-11,11-二甲基十二烷基、10-甲基-11,11-二甲基十二烷基等。
通式(A)中，R 11及R 12較佳是各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 1-12烷基(碳數1～12的烷基)，更佳是直鏈狀或支鏈狀的C 2-12烷基(碳數2～12的烷基)，進一步較佳是直鏈狀或支鏈狀的C 5-12烷基(碳數5～12的烷基)，再進一步較佳是直鏈狀或支鏈狀的C 5-10烷基(碳數5～10的烷基)，最佳是直鏈狀或支鏈狀的C 6-9烷基(碳數6～9的烷基)。又，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質中，R 1及R 2只要是由通式(A)表示的基團即可，可以是互為相同的基團，也可以是不同的基團。
通式(I)中，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基。X所表示的5～7員非芳香族雜環基，藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上。
通式(B)中，d表示0～3的整數，當d為0時，不存在－(CH 2)－基而意指單鍵。 通式(B)中，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基(碳數1～4的烷基)或C 2-4烯基(碳數1～4的烯基)。R 3及R 4所表示的C 1-4烷基或C 2-4烯基中，1個或2個氫原子可被取代為苯基。R 3及R 4只要是C 1-4烷基或C 2-4烯基即可，可以互為相同的基團，也可以是不同的基團。
作為C 1-4烷基，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基和三級丁基。作為C 2-4烯基可列舉：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基。
通式(B)中，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環。作為R 3及R 4互相鍵結所形成的5～7員非芳香族雜環，可列舉例如：1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基及1-哌嗪基。R 3及R 4互相鍵結所形成的5～7員非芳香族雜環，環中的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。當該環中的2個氫原子被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基時，可以由互為相同的基團取代，也可以由互為不同的基團取代。
通式(I)中，當X為5～7員非芳香族雜環基時，作為該雜環基所包含的雜原子，能夠列舉氮原子、氧原子或硫原子等。該雜環基中構成雜環的雜原子，可以為1個，也可以是2個以上的相同或不同的雜原子。該雜原子中的雜環，可以是飽和雜環，也可以包含1個或2個以上的雙鍵，但是雜環不為芳香環。
作為本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質，較佳是：通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 1-12烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，a為3～5的整數，b為1，X為5～7員非芳香族雜環基(其中，藉由雜環基中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上)，並且X較佳是1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；及，通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 1-12烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基或C 2-4烯基(R 3及R 4所示的C 1-4烷基或C 2-4烯基中的1個或2個氫原子可被苯基取代)。較佳是：通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 2-12烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，a為3～5的整數，b為1，X為5～7員非芳香族雜環基(其中，藉由雜環基中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上)，並且X較佳是1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；及，通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 2-12烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基或C 2-4烯基(R 3及R 4所示的C 1-4烷基或C 2-4烯基中的1個或2個氫原子可被苯基取代)。又，較佳是：通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 5-12烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，a為3～5的整數，b為1，X為5～7員非芳香族雜環基(其中，藉由雜環基中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上)，並且X較佳是1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；及，通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 5-12烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基或C 2-4烯基(R 3及R 4所示的C 1-4烷基或C 2-4烯基中的1個或2個氫原子可被苯基取代)。該等之中，作為本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質，較佳是：通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為1，X為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；及，通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀或支鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基。
作為本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質，更佳是：通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為1，X為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為支鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為1，X為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基；通式(I)中的R 1及R 2各自獨立且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為支鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基。
作為本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質，特佳是：通式(I)中的R 1及R 2為相同的基團且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為1，X為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；通式(I)中的R 1及R 2為相同的基團且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為支鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為1，X為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-嗎啉基或1-哌嗪基(藉由環中的碳原子鍵結在(O－CO) b－上，並且1個氫原子可被C 1-4烷基或C 2-4烯基取代)；通式(I)中的R 1及R 2為相同的基團且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為直鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基；通式(I)中的R 1及R 2為相同的基團且滿足下述條件之化合物，通式(A)之中，R 11及R 12各自獨立地為支鏈狀的C 6-9烷基、c為1、v為6～10的整數的基團，且a為3～5的整數，b為0，X在通式(B)之中，d為0，R 3及R 4各自獨立地為C 1-4烷基。
作為本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質，例如是具有下述結構之酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物。
本發明的另一態樣，關於一種本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質。 由通式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質的pKa並無特別限定，例如能夠在4.0～9.0左右選擇，較佳是4.5～8.5左右，並且較佳是以能夠達成該範圍的pKa的方式來選擇各取代基的種類。
由通式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質，例如能夠容易地藉由本說明書的實施例所具體敘述的方法來製造。參照該製造方法，並藉由適當地選擇原料化合物、試劑及反應條件等，本發明所述技術領域中具有通常知識者即能夠容易地製造包含在通式(I)範圍的任意脂質。
由通式(A)表示的基團，是具備在－CO－O－基上連結有2條烴鏈(R 11及R 12)之支鏈結構之基。亦即，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質中，具備2條支鏈型的烴鏈(R 1及R 2)，並且該等烴鏈會成為埋入脂質奈米粒子的脂質膜中的疏水性支架。本發明的脂質奈米粒子，藉由將具備由支鏈型結構所構成的疏水性支架之本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質設為脂質的構成成分，而具有對肝臟或脾臟的選擇性高這樣的特徵。
構成本發明的脂質奈米粒子的本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質，可以僅為1種，也可以為2種以上。當構成本發明的脂質奈米粒子的本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質為2種以上時，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的量，意指在構成脂質奈米粒子的脂質分子之中相當於本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的脂質分子的合計量。
本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質在構成脂質奈米粒子的脂質分子中所佔的比例越多，脂質奈米粒子對目標細胞的引入效率會變得越高。因此，在本發明的脂質奈米粒子中，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的量相對於構成脂質奈米粒子的總脂質量的比例([本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的量(mol)]/([構成脂質奈米粒子的總脂質量(mol)])×100%)，較佳是20莫耳%以上。另一方面，若酸鹼應答性陽離子性脂質在構成脂質奈米粒子的脂質分子中所佔的比例過多，有時會難以使粒徑充分地縮小。從獲得脂質奈米粒子對目標細胞的引入效率充分且粒徑充分地小的脂質奈米粒子這點來看，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的量相對於本發明的脂質奈米粒子中的構成奈米粒子的總脂質量的比例，更佳是30莫耳%以上，進一步較佳是30～70%莫耳，進一步更佳是40～60莫耳%。
本發明的脂質奈米粒子的構成脂質之中，作為本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質以外的脂質，能夠使用一般性地形成脂質體時所用的脂質。作為這樣的脂質，可列舉例如：磷脂質、固醇或固醇衍生物、醣脂質、或飽和或不飽和脂肪酸等。該等能夠使用1種或2種以上的組合。
作為磷脂質能夠列舉：磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、心磷脂、縮醛磷脂、神經醯胺磷脂醯甘油磷酸、磷脂酸等甘油磷脂質；鞘磷脂、神經醯胺磷酸甘油、神經醯胺磷酸乙醇胺等鞘磷脂質等。又，也能夠使用蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂等源自天然物質的磷脂質。甘油磷脂質及鞘磷脂質中的脂肪酸殘基，並無特別限定，能夠列舉例如碳數12～24的飽和或不飽和脂肪酸殘基，較佳是碳數14～20的飽和或不飽和脂肪酸殘基。具體而言，能夠列舉源自脂肪酸的醯基，該脂肪酸是十二酸、十四酸、十六酸、十六烯酸、十八酸、十八烯酸、十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、二十酸、二十碳四烯酸、二十二酸、二十四酸等。當該等甘油脂質及鞘脂質具有2個以上的脂肪酸殘基時，全部的脂肪酸殘基可以是相同的基團，也可以是互為不同的基團。
作為固醇或固醇衍生物，可列舉例如：膽固醇、膽固醇琥珀酸、羊毛固醇、二氫羊毛固醇、脫氫固醇(desmosterol)、二氫膽固醇等動物來源的固醇；豆固醇、穀固醇、β-穀固醇、菜油固醇、菜子固醇等植物來源的固醇(植物固醇)；酵母固醇、麥角固醇等微生物來源的固醇。作為醣脂質，可列舉例如：硫氧核糖甘油酯、二糖基甘油二酯、二半乳糖甘油二酯、半乳糖甘油二酯、糖基甘油二酯等甘油醣脂質；半乳糖腦苷脂、乳糖腦苷脂、神經節苷脂等醣神經鞘醣脂質等。作為飽和或不飽和脂肪酸，可列舉例如：十六酸、十八烯酸、十八酸、二十碳四烯酸、十四酸等碳數12～20的飽和或不飽和脂肪酸。
作為本發明的脂質奈米粒子的構成脂質，除了本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質以外，較佳是包含中性脂質，更佳是包含磷脂質或固醇，進一步較佳是包含固醇，進一步更加是包含膽固醇。
本發明的脂質奈米粒子，作為脂質成分較佳是含有聚烷二醇修飾脂質。聚烷二醇是親水性聚合物，藉由將聚烷二醇修飾脂質作為脂質膜構成脂質使用來建構脂質奈米粒子，能夠利用聚烷二醇來修飾脂質奈米粒子的表面。藉由利用聚烷二醇進行表面修飾，有時能夠提高脂質奈米粒子的血中滯留性等穩定性。
作為聚烷二醇，能夠使用例如：聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚己二醇等。聚烷二醇的分子量例如是300～10000左右，較佳是500～10000左右，更佳是1000～5000左右。
例如，針對脂質的藉由聚烷二醇的修飾，能夠使用硬脂化聚乙二醇(例如硬脂酸PEG45(STR-PEG45)等)。除此之外，也能夠使用聚乙二醇衍生物等，但是聚二醇化脂質不限定於此，該聚乙二醇衍生物是：N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、正[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2二(十四醯基)-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)等。
相對於構成本發明的脂質奈米粒子的總脂質量，聚烷二醇修飾脂質的比例，只要是不會損及本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質所產生的肝臟選擇性或脾臟選擇性的量，具體而言為不損及當使用本發明的脂質奈米粒子作為基因載子時的肝臟特異性基因表現活性或脾臟特異性基因表現活性的量，則無特別限定。例如，聚烷二醇修飾脂質相對於構成脂質奈米粒子的總脂質量的比例，較佳是設為0.5～3莫耳%。
針對本發明的脂質奈米粒子，能夠依據需要實行適當的表面修飾等。 本發明的脂質奈米粒子藉由利用親水性聚合物等對表面進行修飾，能夠提高血中滯留性。有時也能夠將利用該等修飾基所修飾而成的脂質作為脂質奈米粒子的構成脂質來使用，藉此來實行表面修飾。
當製造本發明的脂質奈米粒子時，作為用以提高血中滯留性的脂質衍生物，能夠利用例如：醣蛋白、神經節苷脂GM1、磷脂醯肌醇、神經節苷脂GM3、葡萄醣醛酸衍生物、穀胺酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物等。又，作為用以提高血中滯留性的親水性聚合物，除了聚烷二醇以外，也能夠在表面修飾中使用葡聚醣、支鏈澱粉、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-馬來酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐交替共聚物、直鏈澱粉、支鏈澱粉、幾丁質、甘露聚醣、環糊精、果膠、鹿角菜膠等。
又，為了促進本發明的脂質奈米粒子的核內運輸(nuclear translocation)，例如也能夠利用3糖以上的寡糖化合物對脂質奈米粒子進行表面修飾。3糖以上的寡糖化合物的種類並無特別限定，例如能夠使用3～10個左右的糖單元鍵結而成之寡糖化合物，較佳是使用3～6個左右的糖單元鍵結而成之寡糖化合物。其中，較佳能夠使用葡萄糖的三聚物～六聚物之寡糖化合物，進一步較佳能夠使用葡萄糖的三聚物或四聚物之寡糖化合物。更具體而言，能夠適用異麥芽三糖、異葡糖基麥芽糖(isopanose)、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽六糖等，該等之中，進一步較佳是葡萄糖經α1-4鍵結而成的麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽六糖。特佳是麥芽三糖或麥芽四糖，最佳是麥芽三糖。藉由寡糖化合物的脂質奈米粒子的表面修飾量並無特別限定，例如相對於總脂質量為1～30莫耳%左右，較佳是2～20莫耳%左右，更佳是5～10莫耳%左右。
利用寡糖化合物對脂質奈米粒子進行表面修飾的方法並無特別限定，已知例如利用半乳糖和甘露糖等單糖對脂質奈米粒子的表面進行修飾的脂質體(國際公開第2007/102481號)，所以能夠採用該刊物所記載的表面修飾方法。上述刊物的全部揭示內容可藉由參照而包含於本案說明書的揭示內容。
又，能夠對本發明的脂質奈米粒子賦予例如溫度變化應答性功能、膜通透性功能、基因表現功能及酸鹼應答性功能等之中的任意1種或2種以上的功能。藉由適當地附加該等功能，能夠使脂質奈米粒子在血液中的滯留性提升，在目標細胞的胞吞作用後可使脂質奈米粒子有效地自胞內體脫離，並且使所封裝的核酸更有效地在肝臟細胞內或肝臟細胞內表現。
本發明的脂質奈米粒子，可包含選自由抗氧化劑、帶電物質及膜多肽等所組成之群組中的1種或2種以上的物質，該抗氧化劑是生育酚、沒食子酸丙酯、抗壞血酸棕櫚酸酯或丁基化羥基甲苯等。作為可賦予正電的帶電物質，能夠列舉例如硬脂胺、油胺等飽和或不飽和的脂肪族胺等，作為可賦予負電的帶電物質，能夠列舉例如磷酸二辛酯、半胱胺酸膽固醇酯、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸等。作為膜多肽可列舉例如膜外多肽或膜內多肽等。該等物質的調配量並無特別限定，能夠依據目的而適當選擇。
從容易獲得生物體內的肝臟細胞或脾臟細胞的高輸送效率這點來看，本發明的脂質奈米粒子的大小較佳是平均粒徑為400nm以下，更佳是平均粒徑為300nm以下，進一步較佳是平均粒徑為200nm以下，進一步更佳為150nm以下。再者，所謂脂質奈米粒子的平均粒徑，意指藉由動態光散射法(Dynamic light scattering，DLS)所測得的個數平均粒徑。藉由動態光散射法的測定，能夠使用市售的DLS裝置等並藉由一般的方法來實行。
本發明的脂質奈米粒子的多分散指數(PDI，polydispersity index)為0.01～0.7左右，較佳是0.01～0.6左右，更佳是0.03～0.3左右。pH7.4時的仄他電位(Zeta potential)能夠設定在-50mV～5mV的範圍，較佳是-45mV～5mV的範圍。
本發明的脂質奈米粒子的形態並無特別限定，能夠列舉例如：作成分散於水系溶媒的形態的單層脂質體、多層脂質體、球形微胞或不規則形的層狀結構物等。作為本發明的脂質奈米粒子，較佳是單層脂質體、多層脂質體。
本發明的脂質奈米粒子，較佳是將要輸送至目標細胞內的目標成分包裹於由脂質膜所包覆而成的粒子內部中。作為本發明的脂質奈米粒子包裹於粒子內部的成分，只要是能夠包裹的尺寸即可，並無特別限制。本發明的脂質奈米粒子中，能夠封裝核酸、醣類、胜肽類、低分子化合物、金屬化合物等任意物質。
作為被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的成分，較佳是核酸。作為核酸，可以是DNA，可以是RNA，也可以是該等的類似物質或衍生物(例如：肽核酸(PNA)或硫代磷酸鹽DNA等)。作為被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的核酸，可以是單股核酸，也可以是雙股核酸，並且可以是線狀，也可以是環狀。 本發明的一態樣中，本發明的脂質奈米粒子包含本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物及核酸。
作為被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的核酸，較佳是包含用以在目標細胞內表現的外來基因，更佳是發揮用以藉由胞吞至細胞內來使外來基因在細胞內表現這樣的功能的核酸。該外來基因，可以是目標細胞(較佳是肝臟細胞及脾臟細胞)的基因組DNA中本就包含的基因，也可以是基因組DNA中未包含的基因。作為這樣的核酸，可列舉包含核酸之基因表現載體(vector)，該核酸由編碼有所欲表現的目標基因之鹼基序列所構成。該基因表現載體，在所導入的細胞中可以作為染色體外基因存在，也可以藉由同源重組被納入基因組DNA中。
作為被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的基因表現載體，並無特別限定，能夠使用一般用於基因治療等的載體。作為被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的基因表現載體，較佳是質體載體等核酸載體。質體載體可以維持環狀，也可以以預先切割為線狀的狀態封裝於本發明的脂質奈米粒子中。基因表現載體，基於所欲表現的對象基因的鹼基序列資訊，能夠利用一般用於分子生物學上的工具並藉由一般方法來設計，並且能夠利用習知的各種方法來製造。
被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的核酸，較佳是也可控制存在於目標細胞內的目標基因的表現的功能性核酸。作為該功能性核酸，可列舉：反義寡核苷酸、反義DNA、反義RNA、siRNA、microRNA、mRNA、適體、質體DNA等。又，可以是作成使siRNA在細胞內表現的siRNA表現載體之質體DNA(pDNA)。作為siRNA表現載體，能夠由市售的siRNA表現載體來調製，也可以將市售的siRNA表現載子進行適當的變化。作為被包裹於本發明的脂質奈米粒子中的核酸，尤其從對肝臟或脾臟的選擇性為良好的這點來看，較佳是mRNA或pDNA。 本發明的一態樣中，本發明的脂質奈米粒子包含本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物及核酸，在此處，前述核酸為mRNA或質體DNA。
本發明的脂質奈米粒子的製造方法並無特別限定，能夠採用本發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠利用的任意方法。若要舉例，能夠以下述方式來製造：將全部的脂質成分溶解於三氯甲烷等有機溶媒中，藉由蒸發器實行減壓乾固或藉由噴霧乾燥機實行噴霧乾燥，藉此形成脂質膜後，將包含所欲封裝進該脂質奈米粒子的成分、例如核酸等之水系溶媒添加至經乾燥所獲得的上述混合物中，並進一步藉由均質機等乳化機、超音波乳化機或高壓噴射乳化機等來進行乳化。又，作為製造脂質體的方法，也能夠藉由廣為人知的方法，例如逆相蒸發法等來製造。當為了要控制脂質奈米粒子的大小時，只要使用孔徑一致的膜過濾器等，在高壓下實行擠製法(擠壓過濾)即可。
水系溶媒(分散介質)的組成並無特別限定，能夠列舉例如：磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽液等緩衝液；生理食鹽水；細胞培養用的培養基等。該等水系溶媒(分散介質)能夠使脂質奈米粒子穩定地分散，但是也可進一步添加糖(水溶液)和多元醇(水溶液)等，該糖是：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等單醣類；乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等雙醣類；棉子糖、松三糖等三醣類；環糊精等多醣類；赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇和麥芽糖醇等糖醇等；該多元醇是甘油、雙甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇單烷基醚、二乙二醇單烷基醚、1,3-丁二醇等。為了將分散於該水系溶媒中的脂質奈米粒子穩定地長期保存，從抑制凝集等物理穩定性的層面來看，期望是盡量去除水系溶媒中的電解質。又，從脂質的化學穩定性的層面來看，期望是將水系溶媒的pH值設定在弱酸性至中性附近(pH3.0～8.0左右)及/或藉由氮氣通氣(bubbling)等來去除溶存氧氣。
本發明的脂質奈米粒子，也能夠藉由使用流道的乙醇稀釋法來製造。該方法是自不同的流道導入使脂質成分溶解於乙醇溶媒而成的溶液、與使所欲包含在脂質奈米粒子中的水溶性成分溶解於水系溶媒而成的溶液，並藉由使該等溶液合流，來製造脂質奈米粒子的方法。使用內藏能夠達成將2種液體瞬間混合的三維微混合器之微流道，藉此能夠再現性良好地製造直徑30nm左右的脂質奈米粒子(非專利文獻11)。作為用於製造的流道，從能夠形成粒徑控制性高的奈米尺寸的脂質粒子形成系統這點來看，較佳是使用如專利文獻2所記載的單純的二維性結構之流道結構體，其是在原料溶液流動的微尺寸的流道中，以兩側面互為不同的方式對於流道寬度配置固定寬度的擋板(折流板，baffle plate)而成。作為於乙醇稀釋法中所用的水系溶媒，能夠使用前述水系溶媒。
當將所獲得的脂質奈米粒子的水性分散物進行冷凍乾燥或噴霧乾燥時，若使用糖(水溶液)，有時能夠改善穩定性，該糖是：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等單醣類；乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等雙醣類；棉子糖、松三糖等三醣類；環糊精等多醣類；赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇和麥芽糖醇等糖醇等。又，當將上述水性分散物進行冷凍時，若使用前述糖類和多元醇(水溶液)，有時能夠改善穩定性，該多元醇是甘油、雙甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇單烷基醚、二乙二醇單烷基醚、1,3-丁二醇等。 本發明的一態樣中，本發明的脂質奈米粒子進行冷凍乾燥。
本發明的另一實施形態，關於一種脂質奈米粒子製劑，其包含本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物。本發明的另一實施形態關於一種脂質奈米粒子製劑，其包含：(i)固醇或固醇衍生物；(ii)聚烷二醇修飾脂質；(iii)核酸；(iv)緩衝劑；(v)雙醣；及，(vi)本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物。 作為固醇或固醇衍生物，可列舉例如膽固醇、穀固醇等，較佳是膽固醇。 作為聚烷二醇修飾脂質，可列舉例如聚乙二醇修飾脂質、聚丙二醇修飾脂質等，較佳是聚乙二醇修飾脂質。 作為核酸，可列舉例如siRNA、pDNA、mRNA、引導RNA(gRNA)、適體、質體等，較佳是mRNA。 作為緩衝劑，可列舉例如HEPES緩衝劑、磷酸緩衝劑、TRIS緩衝劑(托立斯緩衝劑)等。 作為雙醣，可列舉例如乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等，較佳是蔗糖。脂質奈米粒子製劑中的雙醣的濃度，例如是1重量%～20重量%，較佳是5重量%～15重量%。 固醇或固醇衍生物與酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物的莫耳比，例如是68.5：20～28.5：60。
本發明中，脂質奈米粒子製劑可藉由使脂質奈米粒子懸浮於水溶液中來調製。 本發明的脂質奈米粒子製劑的pH值，在25℃時，例如是5.5～8.5，較佳是6.8～8.0。 本發明在一實施形態中關於一種再懸浮製劑，其是藉由水或水溶液的添加使脂質奈米粒子製劑進行再懸浮而成。
本發明的脂質奈米粒子在穩定性方面優異。本發明的脂質奈米粒子，例如在-80℃中保管1週或1週以上仍為穩定，及/或在5℃中保管1週、2週、3週、4週、5週或5週以上仍為穩定，及/或在25℃中保管1週、2週、3週、4週、5週或5週以上仍為穩定，及/或在40℃中保管3天、1週、2週、3週、4週、5週或5週以上仍為穩定。 針對脂質奈米粒子的品質，例如可以將脂質奈米粒子靜置於特定的溫度並保管特定的期間後，將此時的平均粒徑、PDI及核酸封裝率與作成後即刻的數值進行比較，將滿足下述全部3種條件的脂質奈米粒子定義為品質良好地維持的脂質奈米粒子，該條件是：平均粒徑維持在以脂質奈米粒子調製日為基準的±20nm以內；PDI保持在0.2以下的高均勻性；核酸封裝率也維持在80%以上。 例如，可以依據以下的基準來進行評價。 良好：粒徑為作成即刻的粒徑±20nm以內、PDI為0.2以下且封裝率為80%以上。 不為良好：粒徑超過作成即刻的粒徑±20nm或封裝率小於80%。 例如，可以將下述脂質奈米粒子評價為在穩定性方面優異的脂質奈米粒子：在5℃中靜置1週以上時品質仍良好地保持的脂質奈米粒子、和在40℃中靜置1週以上時品質仍良好地保持的脂質奈米粒子。
若對動物個體投予封裝有基因表現載體之本發明的脂質奈米粒子，比起其他臟器，被封裝在該脂質奈米粒子的基因表現載體會選擇性地表現於肝臟或脾臟中。同理，若對動物個體投予封裝有siRNA表現載體之本發明的脂質奈米粒子，比起其他臟器，被封裝在該脂質奈米粒子的siRNA表現載體會選擇性地表現於肝臟或脾臟中，而抑制被該表現載體設為目標的基因的表現。例如，若對受試動物投予封裝有以在肝臟細胞內或脾臟細胞內表現為目的的外來基因之本發明的脂質奈米粒子，能夠使該外來基因表現於該受試動物的肝臟或脾臟內。
藉由這樣對於肝臟或脾臟的高選擇性的基因表現活性，本發明的脂質奈米粒子可作成以肝臟或脾臟為目標的基因表現載子來發揮作用。本發明的脂質奈米粒子中，藉由將以在肝臟細胞內或脾臟細胞內表現為目的的外來基因封裝，並且對受試動物進行投予，該外來基因可在該受試動物的肝臟內或脾臟內表現。因此，本發明的脂質奈米粒子，有助於作成用於基因治療的醫藥用組成物的有效成分，尤其有助於作成用於以肝臟或脾臟為目標臟器的基因治療的醫藥用組成物的有效成分。 本發明在一實施形態中，關於一種肝臟輸送用的醫藥組成物，其含有本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物。 本發明在其他實施形態中，關於一種脾臟輸送用的醫藥組成物，其含有本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物。
本發明的脂質奈米粒子所投予的動物，並無特別限定，可以是人類，也可以是人類以外的動物。作為非人動物，可列舉：牛、豬、馬、綿羊、山羊、猴、犬、貓、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等哺乳動物；及，雞、鵪鶉、鴨等鳥類等。
本發明在一實施形態中，關於一種用於輸送至癌症之醫藥組成物。在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物包含本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質。 在本發明中，酸鹼應答性陽離子性脂質例如是CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 10-5、CL15F6、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F 13-3、CL15F 13-11、CL15F 14-2、CL15F 14-12、CL15F 16-1等，但是不限定於該等。
在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物除了包含本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質之外，還包含固醇或固醇衍生物、聚烷二醇修飾脂質、及緩衝劑。 在本發明中，固醇或固醇衍生物例如是膽固醇、穀固醇等，但不限定於該等；較佳是膽固醇。
在本發明中，聚烷二醇修飾脂質例如是聚乙二醇修飾脂質、聚丙二醇修飾脂質等，但不限定於該等，較佳是聚乙二醇修飾脂質。 在本發明中，聚乙二醇修飾脂質例如是1,2-二硬脂醯基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG)，較佳是1,2-二硬脂醯基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG)，但不限定於該等。 若DSG-PEG的聚乙二醇的分子量為500～10000，則該脂質奈米粒子在癌組織中的累積優異，若為1000～3000，則該脂質粒子在癌組織中的累積更優異，若為2000，則在癌組織中的累積又更優異。
在本發明中，緩衝劑例如是HEPES緩衝劑、磷酸緩衝劑、TRIS緩衝劑等，但不限定於該等。 在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物進一步包含核酸。 在本發明中，核酸例如是siRNA、mRNA、引導RNA(gRNA)、適體及質體DNA等，但不限定於該等。 在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物是脂質奈米粒子的懸浮液。 在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物在25℃中為pH6.8～pH8.0。
在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物包含二糖。在本發明中，二糖是乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等，但不限定於該等，較佳是蔗糖。在本發明中，二糖的濃度例如是1重量%～20重量%，較佳是5重量%～15重量%。
在本發明的一態樣中，用於輸送至癌症之醫藥組成物是脂質奈米粒子的冷凍乾燥製劑。 本發明在一實施形態中，關於一種癌症治療用醫藥組成物，其用以治療具有癌症之個體。在本發明的一態樣中，癌症治療用醫藥組成物包含本發明的用於輸送至癌症之醫藥組成物。
在本發明中，癌症例如是從皮膚和胃、腸的黏膜等上皮細胞所產生的惡性腫瘤、從肌肉、纖維、骨、脂肪、血管、神經等非上皮細胞所產生的惡性腫瘤、從造血器官所產生的白血病和惡性淋巴瘤等，但不限定於該等。 本發明的癌症治療用醫藥組成物所投予的個體並無特別限定，可以是人類，也可以是非人動物。作為非人動物，可列舉：牛、豬、馬、綿羊、山羊、猴、犬、貓、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等哺乳動物；及，雞、鵪鶉、鴨等鳥類等。
在本發明中，癌症治療用醫藥組成物可進一步包含藥學上容許的載體。在本發明中，載體例如是賦形劑、填充劑、增量劑、黏結劑、賦溼劑、崩解劑、界面活性劑、著色料、香味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、潤滑劑、流動性促進劑等，但不限定於該等。 本發明在其他實施形態中，關於一種治療癌症的方法，其包含：對需要該方法之個體投予本發明的癌症治療用醫藥組成物。 本發明在其他實施形態中，關於一種本發明的脂質奈米粒子用於製造癌症治療用醫藥組成物之用途。
本發明在在一實施形態中，關於一種免疫賦活用組成物。 在本發明中「免疫賦活用組成物」意指對於個體產生免疫賦活作用之組成物。
在本發明的一態樣中，免疫賦活用組成物包含本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質。在本發明中，酸鹼應答性陽離子性脂質例如是CL4F 6-4、CL4F 7-3、CL4F7-4、CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 8-5、CL4F 8-6、CL4F 9-3、CL4F 9-4、CL4F 9-5、CL4F 9-6、CL4F 9-7、CL4F 10-2、CL4F 10-4、CL4F6、CL4F 10-8、CL4F 11-5、CL4F 12-4、CL4F 12-6、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CLF 10-5、CL15F6、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F 13-3、CL15F 14-2等，但不限定於該等。
在本發明的一態樣中，免疫賦活用組成物進一步包含核酸。在本發明中，核酸例如是siRNA、mRNA、引導RNA(gRNA)、適體及質體DNA等，但不限定於該等。 在本發明的一態樣中，免疫賦活用組成物是脂質奈米粒子的懸浮液。 在本發明的一態樣中，免疫賦活用組成物在25℃中為pH6.8～pH8.0。
本發明的免疫賦活用組成物所投予的個體並無特別限定，可以是人類，也可以是非人動物。作為非人動物，可列舉：牛、豬、馬、綿羊、山羊、猴、犬、貓、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等哺乳動物；及，雞、鵪鶉、鴨等鳥類等。
在本發明中，免疫賦活用組成物可進一步包含藥學上容許的載體。在本發明中，載體例如是賦形劑、填充劑、增量劑、黏結劑、賦溼劑、崩解劑、界面活性劑、著色料、香味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、潤滑劑、流動性促進劑等，但不限定於該等。 在本發明的一態樣中，免疫賦活用組成物包含二糖。在本發明中，二糖是乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等，但不限定於該等，較佳是蔗糖。在本發明中，二糖的濃度例如是1重量%～20重量%，較佳是5重量%～15重量%。 在本發明的一態樣中，免疫賦活用組成物是脂質奈米粒子的冷凍乾燥製劑。
本發明在其他實施形態中，關於一種對個體進行免疫賦活的方法，其包含：對個體投予本發明的免疫賦活用組成物。 本發明在其他實施形態中，關於一種本發明的脂質奈米粒子用於製造免疫賦活用組成物之用途。
本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物，例如可藉由將其基本骨架與支鏈脂肪酸進行縮合來合成，該基本骨架是7-(4-(二丙基胺基)丁基)十三烷基-1,7,13-三醇或5,11-二羥基-5-(6-羥基己基)十一烷-1-甲基哌啶-4-羧酸酯。 本發明在一實施形態中，關於一種酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物的製造方法。在本發明的一態樣中，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的製造方法至少包含下述步驟：在有機鋰、二甲基丙烯脲(DMPU)及四氫呋喃(THF)的存在下，使烷基羧酸與鹵化烷基進行反應來獲得支鏈脂肪酸(步驟A)。 該方法中，烷基羧酸例如是辛酸、癸酸、十三酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸。 該方法中，鹵化烷基例如是1-碘己烷、1-碘丁烷、2-碘己烷、1-溴己烷、碘甲烷、碘乙烷、1-碘丙烷、1-碘丁烷、1-碘戊烷、1-碘己烷、1-碘庚烷、1-碘辛烷、1-碘壬烷、1-碘癸烷、1-碘十一烷、1-碘十二烷、1-碘十三烷、1-碘十四烷、1-碘十五烷、1-碘十六烷。 該方法中，有機鋰例如是二異丙基胺基鋰(LDA)、三級丁基鋰、正丁基鋰。
在本發明的一態樣中，本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的製造方法至少包含下述步驟：將反應液進行水解處理及加熱處理來獲得支鏈脂肪酸(步驟B)，該反應液是在鹼的存在下使丙二酸酯與鹵化烷基進行反應而獲得。 該方法中，丙二酸酯例如是丙二酸二甲酯、丙二酸二乙酯、丙二酸二異丙酯，較佳是丙二酸二甲酯。 該方法中，鹵化烷基例如是碘化烷基，碘化烷基例如是1-碘己烷、1-碘丙烷、2-碘己烷。 該方法中，鹼例如是氫化鈉、氫化鈣、乙醇鈉及雙(三甲基甲矽烷基)胺鋰，較佳是氫化鈉。 該方法中，水解處理例如可使用氫氧化鈉、氫氧化鈣及氫氧化鋰中的任一種來實行。 該方法中，加熱處理在與水解處理同時及/或在水解處理之後實行，較佳是在120℃～170℃中實行，更佳是在150℃～170℃中實行。 該方法可進一步包含藉由逆相層析術來精製支鏈脂肪酸的步驟。
在用於以下化合物的合成的支鏈脂肪酸中，比起步驟B，藉由步驟A實行者可獲得產率較佳的支鏈脂肪酸。
在用於以下化合物的合成的支鏈脂肪酸中，比起步驟A，藉由步驟B實行者可獲得產率較佳的支鏈脂肪酸。
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在本發明的一態樣中，用於本發明的酸鹼應答性陽離子性脂質的合成中的支鏈脂肪酸，例如能夠以日本專利第2756756號所記載的方法來獲得。 [實施例]
以下示出本實施例來進一步詳細地說明本發明，但是本發明並不限於以下實施例。
I. CL4F6、CL4G6、CL15F6及CL15G6的合成 [合成例1] CL4F6的合成 將由專利文獻1所記載的方法所合成出的7-(4-(二丙基胺基)丁基)十三烷基-1,7,13-三醇(1.0mmol)溶解於5mL的二氯甲烷，繼而，添加2-己基癸酸(2.20 mmol)、DMAP(N，N-二甲基-4-胺基吡啶，0.20 mmol)及EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺，3.0 mmol)，在室溫中反應一晚。使用旋轉蒸發儀餾除溶媒後，利用乙酸乙酯進行懸浮，並藉由過濾去除雜質。利用0.5N氧化鈉水溶液及飽和食鹽水將濾液進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒，獲得粗製品。藉由將粗製品供給至矽膠層析儀[溶析溶媒為二氯甲烷：甲醇(連續梯度)]來進行精製，而獲得7-(4-(二丙基胺基)丁基)-7-羥基十三烷-1,13-二基-雙(2-己基癸酸酯)(CL4F6)。
[合成例2]CL4G6的合成 除了使用2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸取代2-己基癸酸以外，與合成例1同樣地操作，而獲得7-(4-(二丙基胺基)丁基)-7-羥基十三烷-1,13-二基-雙(2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸酯)(CL4G6)。
[合成例3]CL15F6的合成 將由專利文獻1所記載的方法所合成出的5,11-二羥基-5-(6-羥基己基)十一烷-1-甲基哌啶-4-羧酸酯(1.0mmol)溶解於10mL的二氯甲烷。繼而，添加2-己基癸酸(2.20 mmol)、DMAP(0.20 mmol)及EDCI(3.0 mmol)，在室溫中反應一晚。使用旋轉蒸發儀餾除溶媒後，利用乙酸乙酯進行懸浮，並藉由過濾去除雜質。利用0.5N氧化鈉水溶液及飽和食鹽水將濾液進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒，獲得粗製品。藉由將粗製品供給至矽膠層析儀[溶析溶媒為二氯甲烷：甲醇(連續梯度)]來進行精製，而獲得7-羥基-7-(4-((1-甲基哌啶)-4-羰基)氧基)丁基]十三烷-1,13-二基-雙(2-己基癸酸酯)(CL15F6)。
[合成例2]CL15G6的合成 除了使用2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸取代2-己基癸酸以外，與合成例3同樣地操作，而獲得7-羥基-7-(4-((1-甲基哌啶)-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基-雙(2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛酸酯(CL15G6)。
II. 使用了CL4F6、CL4G6、CL15F6及CL15G6之脂質奈米粒子的製作及評價 〈脂質奈米粒子的調製〉 在以下的實驗中，只要沒有特別記載，脂質奈米粒子即是藉由使用流道的乙醇稀釋法所調製。作為流道，使用混合器內藏之微流體裝置「iLiNP」(Lilac pharma Inc.製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及siRNA濃度已調整為71.1μg/mL的乙酸緩衝液(25mM，pH4.0)各自以0.375mL/分鐘及1.125mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液倒入透析膜(MWCO 12000～14000)，將外水相設為20mM MES緩衝液(pH6.0)並以4℃、2小時以上的條件進行透析。之後，將外水相置換為PBS(-)(pH7.4)，並進一步以4℃、2小時以上的條件進行透析後，自透析膜回收脂質奈米粒子。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 CL4F6、CL4G6、CL15F6及CL15G6，使用由合成例1～4所合成者。 7-(4-(二丙基胺基)丁基)-7-羥基十三烷-1,13-二基-二油酸(CL4H6)及7-羥基-7-(4-((1-甲基哌啶)-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基-二油酸(CL15H6)使用以專利文獻1所記載的方法所合成者。
進一步，作為中性脂質，使用膽固醇(chol)及聚乙二醇2000修飾二月桂基甘油(PEG-DMG)。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI(多分散指數)及仄他電位的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZS ZEN3600」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子在PBS(-)中的平均粒徑(個數平均值)及PDI與在10mM HEPES緩衝液(pH7.4)中的仄他電位。
〈脂質奈米粒子的pKa的測定〉 脂質奈米粒子的pKa，使用對甲苯胺基-2-萘磺酸(TNS)來測定。首先，將TNS(最終濃度：0.75μm)與脂質奈米粒子(最終濃度：30mM)在各經調整pH值的緩衝液中進行混合。利用微量盤分析儀來測定所調製成的混合液的螢光強度。測定值中，將最高值及最低值各自設為100%及0%的帶電率，並計算表示50%帶電率的pH值來作為pKa。 〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 使用Ribogreen(life technologies公司製造)來測定脂質奈米粒子的siRNA、mRNA及pDNA的封裝率。
[實施例1] 以莫耳比計為50：50：1的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、膽固醇及PEG-DMG，藉由乙醇稀釋法來製作搭載有針對F7的siRNA之脂質奈米粒子(F7 siRNA搭載脂質奈米粒子)。作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6或CL15H6。將使用以下酸鹼應答性陽離子性脂質X所製成的脂質奈米粒子稱為X-LNP。例如，將使用酸鹼應答性陽離子性脂質CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6或CL15H6所製成的脂質奈米粒子，各自稱為CL4F-LNP、CL4G6-LNP、CL4H6-LNP、CL15F-LNP、CL15G6-LNP或CL15H6-LNP。又，將針對F7的siRNA的鹼基序列表示於表1。 表中，大寫文字表示天然型RNA(僅有T為天然型DNA)，小寫文字表示2’-氟基修飾物，*表示硫代磷酸酯鍵。
[表1]
所調製成的各脂質奈米粒子的平均粒徑為80～120nm，siRNA封裝率為90%以上。將測定各脂質奈米粒子的pKa的結果表示於第1圖(A)及第1圖(B)。如第1圖所示，比起支架結構使用直鏈型的CL4H6或CL15H6所製成的脂質奈米粒子，支架結構使用支鏈型的CL4F6、CL4G6、CL15F6或CL15G6所製成的脂質奈米粒子顯示了較低的pKa。
繼而，對ICR小鼠(4週齡，雌性)投予所調製的各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子，調查in vivo(體內)F7基因減量活性。具體而言，將各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子以0.003～0.1mg siRNA/kg的條件對ICR小鼠進行靜脈投予，並測定24小時後的血漿中F7酵素活性。將未經處理的小鼠的血漿中F7酵素活性設為100%，來計算經投予各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的相對血漿中F7酵素活性(%)。將結果表示於第2圖(A)及第2圖(B)。第2圖(B)是將各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子以0.1mg siRNA/kg的條件進行靜脈投予的結果。如第2圖所示，比起支架結構使用直鏈型的CL4H6或CL15H6所製成的脂質奈米粒子，支架結構使用支鏈型的CL4F6、CL4G6、CL15F6或CL15G6所製成的脂質奈米粒子顯示相同程度的in vivo F7基因減量活性。從該等結果可知，將CL4F6、CL4G6、CL15F6及CL15G6設為構成脂質之脂質奈米粒子，有助於作為siRNA輸送載子。
[實施例2] 調製搭載以mRNA取代siRNA的脂質奈米粒子，並調查in vivo基因表現活性。mRNA使用藉由對編碼有NanoLuc(註冊商標)螢光酵素(Nluc)(Promega Corp.公司製造)之pDNA實行in vitro轉錄反應所調製成者(Nluc mRNA)。
首先，以莫耳比計為60：10：40：1的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、膽固醇及PEG-DMG，藉由乙醇稀釋法來製作搭載有Nluc mRNA之脂質奈米粒子(Nluc mRNA搭載脂質奈米粒子)。作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6或CL15H6。
[表2]
調查所調製成的脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、仄他電位及mRNA封裝率。將測定結果表示於表2。表2中，「CL」意指陽離子性脂質。藉由動態光散射法所計算出的平均粒徑皆為70～130nm(表2)。調製成的脂質奈米粒子之中，僅CL15H6-LNP形成PDI大且均勻性低的粒子(表2)。有關mRNAz封裝率，CL4H6-LNP低於80%，相對於此，包含其他陽離子性脂質之LNP皆顯示為90%以上。
繼而，對ICR小鼠(4週齡，雌性)投予所調製的各Nluc mRNA搭載脂質奈米粒子，調查in vivo基因表現活性。具體而言，將各Nluc mRNA搭載脂質奈米粒子以0.04mg mRNA/kg的條件對ICR小鼠進行靜脈投予，並測定24小時後在肝臟及脾臟中的Nluc活性。Nluc活性藉由光度計測定(RLU)，並基於BCA(蛋白質定量)法以經定量的蛋白質量進行校正。
將經投予各Nluc mRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的肝臟與脾臟中的Nluc活性(RLU/mg protein)的測定結果表示於第3圖。第3圖(A)是肝臟中的Nluc活性的測定結果，第3圖(B)是脾臟中的Nluc活性的測定結果。進一步，以脾臟中的基因表現活性除以肝臟中的基因表現活性，藉此計算基因表現的肝臟選擇性。第3圖(C)是顯示經投予各Nluc mRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的[肝臟中的Nluc活性]/[胰臟中的Nluc活性]的計算結果的圖。如第3圖(A)所示，在肝臟中，經投予CL4F6-LNP、CL15F6-LNP及CL15G6-LNP的小鼠顯示了與經投予CL4H6-LNP的小鼠相同程度的Nluc活性。又，如第3圖(C)所示，比起經投予CL4H6-LNP的小鼠，經投予CL4F6-LNP及CL4G6-LNP的小鼠顯示了較高的肝臟選擇性。同樣地，比起經投予CL15H6-LNP的小鼠，經投予CL15F6-LNP及CL15G6-LNP的小鼠顯示了較高的肝臟選擇性。從該等結果可知，在封裝了mRNA的情況下，比起支架結構包含直鏈型的酸鹼應答性陽離子性脂質之脂質奈米粒子，支架結構包含支鏈型的酸鹼應答性陽離子性脂質之脂質奈米粒子對肝臟的選擇性高，而有助於作成可特異性地輸送至肝臟的輸送載子。
[實施例3] 調製搭載以pDNA取代siRNA的脂質奈米粒子，調查in vivo基因表現活性。pDNA使用在CMV啟動子下表現螢火蟲螢光素酶(Fluc)的質體(pFluc)。
〈in vitro基因表現活性〉 首先，以莫耳比計為50：10：40：1.5的組成使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC、膽固醇及PEG-DMG，藉由乙醇稀釋法來製作搭載有pFluc之脂質奈米粒子(pFluc搭載脂質奈米粒子)。作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL4F6、CL4G6、CL4H6、CL15F6、CL15G6或CL15H6。又，將微流道中的N/P比設為9。
[表3]
調查所調製成的脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、仄他電位及mRNA封裝率。將測定結果表示於表3。表3中，「CL」意指陽離子性脂質。藉由動態光散射法所計算出的平均粒徑皆為90～150nm(表3)。針對pDNA封裝率，CL4H6-LNP及CL15H6-LNP分別為70%及82%。另一方面，包含其他陽離子性脂質之脂質奈米粒子，pDNA封裝率顯示90%以上的良好數值。
對培養細胞導入pFluc搭載脂質奈米粒子來調查in vitro(體外)基因表現活性。具體而言，將pFluc搭載脂質奈米粒子以0.0625μg pDNA/孔的條件對培養在96孔盤的HeLa-GFP細胞進行轉染，並測定24小時後的Fluc活性。作為正控制組使用導入試劑「Lipofectamine 3000」(賽默飛世爾科技股份有限公司製造)對HeLa-GFP細胞導入pFluc。Fluc活性藉由光度計測定(RLU)，並基於BCA(蛋白質定量)法以經定量的蛋白質量進行校正。
將導入有各pFluc搭載脂質奈米粒子之HeLa-GFP細胞的Fluc活性的測定結果表示於第4圖。第4圖中，「Lipo3K」意指使用Lipofectamine 3000導入基因的正控制組。如第4圖所示，比起導入有CL4H6-LNP、CL15H6-LNP及正控制組之細胞，導入有CL15F6-LNP之細胞顯示了較高的活性。
〈in vitro基因表現活性〉 除了將微流道中的N/P比設為6以外，與前述同樣地操作，而調製成pFluc搭載脂質奈米粒子。
[表4]
調查所調製成的脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、仄他電位及mRNA封裝率。將測定結果表示於表4。表4中，「CL」意指陽離子性脂質。藉由動態光散射法所計算出的平均粒徑皆為70～125nm(表4)。針對pDNA封裝率，CL4F6-LNP、CL4G6-LNP、CL15F6-LNP及CL15G6-LNP皆顯示90%以上的良好數值。
繼而，對ICR小鼠(4週齡，雌性)投予所調製的各pFluc搭載脂質奈米粒子，調查in vivo基因表現活性。具體而言，將各pFluc搭載脂質奈米粒子以0.5mg mRNA/kg的條件對ICR小鼠進行靜脈投予，並測定6小時後在肝臟及脾臟中的Fluc活性。Fluc活性藉由光度計測定(RLU)，並基於BCA(蛋白質定量)法以經定量的蛋白質量進行校正。
將經投予各pFluc搭載脂質奈米粒子的小鼠的肝臟與脾臟中的Fluc活性(RLU/mg protein)的測定結果表示於第5圖。第5圖(A)是肝臟中的Fluc活性的測定結果，第5圖(B)是脾臟中的Fluc活性的測定結果。進一步，以脾臟中的基因表現活性除以肝臟中的基因表現活性，藉此計算基因表現的肝臟選擇性。第5圖(C)是顯示經投予各pFluc搭載脂質奈米粒子的小鼠的[肝臟中的Fluc活性]/[胰臟中的Fluc活性]的計算結果的圖。如第5圖(A)所示，在肝臟中的Fluc活性，比起經投予CL4H6-LNP及CL15H6-LNP之小鼠，經投予CL4F6-LNP及CL15F6-LNP之小鼠較優異。又，如第5圖(C)所示，比起經投予CL4H6-LNP的小鼠，經投予CL4F6-LNP及CL4G6-LNP的小鼠顯示了較高的肝臟選擇性。同樣地，比起經投予CL15H6-LNP的小鼠，經投予CL15F6-LNP及CL15G6-LNP的小鼠顯示了較高的肝臟選擇性。從該等結果可知，若在具有相同的親水性部位之脂質之間比較，即便在封裝了pDNA的情況下，比起包含支架結構為直鏈型的酸鹼應答性陽離子性脂質之脂質奈米粒子，包含支架結構為支鏈型的酸鹼應答性陽離子性脂質之脂質奈米粒子對肝臟的選擇性較高，而有助於作成可特異性地輸送至肝臟的輸送載子。
III. CL4F6衍生物及CL15F6衍生物的合成 〈CL4F6及CL4F6衍生物的合成〉 依照以下的操作來實行CL4F6及CL4F6衍生物的合成，該CL4F6及CL4F6衍生物即CL4F 6-2、CL4F 6-4、CL4F 7-3、CL4F 7-4、CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 8-5、CL4F 8-6、CL4F 9-3、CL4F 9-4、CL4F 9-5、CL4F 9-6、CL4F 9-7、CL4F 10-2、CL4F 10-4、CL4F 10-5、CL4F 10-7、CL4F 10-8、CL4F 11-5、CL4F 11-6、CL4F 11-7、CL4F 11-9、CL4F 12-4、CL4F 12-6、CL4F 12-10、CL4F 13-3、CL4F 14-2、CL4F 16-0及CL4F 16-1。 將由專利文獻1所記載的方法所合成出的7-(4-(二丙基胺基)丁基)十三烷基-1,7,13-三醇(1.0mmol)溶解於5mL的二氯甲烷，繼而，添加支鏈脂肪酸(2.40mmol)、DMAP(N，N-二甲基-4-胺基吡啶，0.10 mmol)及EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺，3.0 mmol)，在室溫中反應一晚。使用旋轉蒸發儀餾除溶媒後，利用乙酸乙酯進行懸浮，之後，利用0.5N氫氧化鈉水溶液及飽和食鹽水將濾液進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒，獲得粗製品。藉由將粗製品供給至ODS化矽膠層析儀[溶析溶媒為乙腈/異丙醇(50：50)：水(0.1% TFA)(連續梯度)]與矽膠層析儀[溶析溶媒為二氯甲烷：甲醇(連續梯度)]來進行精製，而獲得CL4F6或CL4F6衍生物。
〈CL15F6及CL15F6衍生物的合成〉 依照以下的操作來實行CL15F6及CL15F6衍生物的合成，該CL15F6及CL15F6衍生物即CL15F 6-2、CL15F 6-4、CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 10-5、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F 12-10、CL15F 13-11、CL15F 13-3、CL15F 14-2、CL15F 14-12、CL15F 16-0及CL15F 16-1。 將由專利文獻1所記載的方法所合成出的5,11-二羥基-5-(6-羥基己基)十一烷-1-甲基哌啶-4-羧酸酯(1.0mmol)溶解於10mL的二氯甲烷。繼而，添加2-己基癸酸酯(2.40 mmol)、DMAP(0.10 mmol)及EDCI(3.0 mmol)，在室溫中反應一晚。使用旋轉蒸發儀餾除溶媒後，利用乙酸乙酯進行懸浮，之後，利用0.5N氫氧化鈉水溶液及飽和食鹽水將濾液進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒，獲得粗製品。藉由將粗製品供給至ODS化矽膠層析儀[溶析溶媒為乙腈/異丙醇(50：50)：水(0.1% TFA)(連續梯度)]與矽膠層析儀[溶析溶媒為二氯甲烷：甲醇(連續梯度)]來進行精製，而獲得CL15F6或CL15F6衍生物。
上述的支鏈脂肪酸是以直鏈脂肪酸或丙二酸二甲酯為原料並依照以下的操作來合成。 〈以直鏈脂肪酸為原料之支鏈脂肪酸的合成〉 將直鏈脂肪酸(10.28mmol)溶解於36mL的THF中，繼而在-20℃以下滴下二異丙基胺基鋰(24mmol)，在0℃中攪拌30分鐘。繼而，添加DMPU(18mL)，在0℃中攪拌60分鐘。繼而，添加碘烷(23.2mmol)，在10℃中反應一晚。以2N鹽酸進行淬滅(quenching)之後，以二乙基醚稀釋，並利用飽和食鹽水進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒，獲得粗製品。藉由將粗製品供給至ODS化矽膠層析儀[溶析溶媒為乙腈/異丙醇(50：50)：水(10mM乙酸銨)(連續梯度)]來進行精製，而獲得支鏈脂肪酸。
〈以丙二酸二甲酯為原料之支鏈脂肪酸的合成〉 將NaH(7.56mmol)溶解於18mL的THF中，在0℃中攪拌10分鐘。繼而，添加丙二酸二甲酯(7.56mmol)，在0℃中攪拌10分鐘。繼而，添加任意的碘烷(7.56mmol)，在室溫中反應一晚。添加NaH(11.34mmol)，在0℃中攪拌10分鐘。繼而，添加任意的碘烷(11.34mmol)，在室溫中反應一晚。以乙酸進行淬滅之後，以乙酸乙酯稀釋，並利用飽和食鹽水進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒。以16mL的乙醇溶解去除溶媒的成分，並添加5mL的8N氫氧化鈉水溶液，在60℃中反應一晚。利用6N鹽酸進行中和後，以乙酸乙酯稀釋，並利用飽和食鹽水進行分液洗滌。在有機層中添加無水硫酸鈉進行脫水。將前述溶液進行過濾後，使用旋轉蒸發儀餾除溶媒後，在160℃中加熱2小時，而獲得粗製品。藉由將粗製品供給至ODS化矽膠層析儀[溶析溶媒為乙腈/異丙醇(50：50)：水(10mM乙酸銨)(連續梯度)]來進行精製，而獲得支鏈脂肪酸。
在用於CL4F 7-4、CL4F 8-5、CL4F 9-6及CL4F 10-7的合成的支鏈脂肪酸中，比起在原料中使用丙二酸二甲酯的方法，在原料中使用直鏈脂肪酸的方法可產率較佳地獲得支鏈脂肪酸。 在用於下述化合物的合成中的支鏈脂肪酸中，比起在原料中使用直鏈脂肪酸的方法，使用丙二酸二甲酯的方法可產率較佳地獲得支鏈脂肪酸，該等化合物是：CL4F 6-2、CL4F 6-4、CL4F 7-3、CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 8-6、CL4F 9-3、CL4F 9-4、CL4F 9-5、CL4F 9-7、CL4F 10-2、CL4F 10-4、CL4F 10-5、CL4F6、CL4F 10-8、CL4F 11-5、CL4F 11-6、CL4F 11-7、CL4F 11-9、CL4F 12-4、CL4F 12-6、CL4F 12-10、CL4F 13-3、CL4F 14-2、、CL4F 16-1、CL15F 6-2、CL15F 6-4、CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 10-5、CL15F6、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F 12-10、CL15F 13-3、CL15F 13-11、CL15F 14-2、CL15F 14-12及CL15F 16-1。
IV.使用CL4F6衍生物及CL15F6衍生物之脂質奈米粒子的調製及評價 1.mRNA搭載脂質奈米粒子的調製及評價 〈mRNA搭載脂質奈米粒子(mRNA-LNP)的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用混合器內藏之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及mRNA濃度已調整為46.1μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元(Ultrafiltration unit)進行濃縮，來回收脂質奈米粒子溶液。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：38.5：1.5的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)及DMG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)，藉由乙醇稀釋法來製作搭載有Fluc mRNA之脂質奈米粒子(Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子)。Fluc mRNA使用TriLink Biotechnologies公司製造的CleanCap(註冊商標)Fluc mRNA(5moU)。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子在PBS(-)中的平均粒徑(ζ-平均值(Average))及PDI。
〈脂質奈米粒子的pKa的測定〉 脂質奈米粒子的pKa，使用對甲苯胺基-2-萘磺酸(TNS)來測定。首先，將TNS(最終濃度：0.75μM)與脂質奈米粒子(最終濃度：60μM)在各經調整pH值的緩衝液中進行混合。利用微量盤分析儀來測定所調製成的混合液的螢光強度。激發波長的測定值中，將在pH3.5中的測定值設為100%帶電率，將在pH9.5中的測定值設為0%帶電率，並計算表示50%帶電率的pH值來作為pKa。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 使用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的siRNA及mRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司(康寧公司 Inc.)製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈結果〉 調查所調製成的脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI及mRNA封裝率、pKa。將CL4F6衍生物奈米粒子的測定結果表示於表5及表6，並將CL15F6衍生物奈米粒子的測定結果表示於表7。作為對照，使用具有以下結構之D-Lin-MC3-DMA(MC3，MedChemExpress公司製造)。 藉由動態光散射法所計算出的表5中的CL4F6衍生物奈米粒子的平均粒徑皆為60～220nm，除了CL4F 16-0-LNP以外，形成為PDI小且均勻性高的粒子。mRNA封裝率方面，CL4F 6-2-LNP與CL4F 16-1-LNP低於80%，相對於此，包含其他陽離子性脂質之LNP皆顯示為80%以上。 表7的CL15F6衍生物奈米粒子的平均粒徑，雖然CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP超過300nm，但是包含其他陽離子性脂質之LNP皆為90～200nm。PDI除了CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP、CL15F 16-0-LNP、CL15H6-LNP以外，形成為PDI小且均勻性高的粒子。mRNA封裝率方面，CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP低於80%，相對於此，包含其他陽離子性脂質之LNP皆顯示為80%以上。
繼而，對Balb/c小鼠(日本查爾斯河實驗室公司(Charles River Laboratories Japan, Inc.)，7週齡，雌性)投予所調製成的各Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子，調查in vivo基因表現活性。具體而言，以各Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子0.1mg mRNA/kg的條件對Balb/c小鼠進行靜脈投予，然後測定6小時後的肝臟及脾臟中的Fluc活性。Fluc活性，是以每隻小鼠為1.5mg的方式從尾靜脈投予以PBS溶解為15mg/mL而成的VivoGlo Luciferin、 In Vivo Grade(Promega公司製造，P1041)，之後，藉由活體成像系統(in vivo imaging system，Perkin Elmer公司製造，IVIS200)進行測定。Fluc活性的單位，是最大發光波長約560nm時的每單位面積的發光強度(Avg Radiance(平均發光強度)[p/s/cm 2/sr])。
將經投予各Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的肝臟與脾臟中的Fluc活性(Avg Radiance [p/s/cm 2/sr])的測定結果表示於表5～表7。 表5及表6中的CL4F6衍生物奈米粒子在肝臟中的Fluc活性，比起經投予含CL4F6之Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠，在經投予含CL4F 8-6、CL4F 9-7或CL4F 11-6之Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠中顯示了更高的Fluc活性。另一方面，脾臟中的CL4F6衍生物奈米粒子的Fluc活性，比起經投予含CL4F6之Fluc mRNA脂質奈米粒子的小鼠，經投予含CL4F 7-5、CL4F 8-4、CL4F 9-3、CL4F 10-2、CL4F 8-6、CL4F 10-4、CL4F 10-5、CL4F 12-4、CL4F 13-3、CL4F 14-2、CL4F 7-4、CL4F 8-5、CL4F 9-4或CL4F 9-5之Fluc mRNA脂質奈米粒子的小鼠顯示了更高的Fluc活性。 表7中的CL15F6衍生物奈米粒子在肝臟中的Fluc活性，比起經投予含CL15F6之Fluc mRNA脂質奈米粒子的小鼠，經投予含CL15F 9-7、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 10-8、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-10或CL15F 14-2之Fluc mRNA脂質奈米粒子的小鼠顯示了較高的Fluc活性。表7中的CL15F6在脾臟中的Fluc活性，比起經投予含CL15F6之Fluc mRNA脂質奈米粒子的小鼠，經投予含CL15F 6-4、CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 10-5、CL15F 13-3、CL15F 11-6、CL15F 10-8、CL15F 11-7、CL15F 11-9或CL15F 14-2之Fluc mRNA脂質奈米粒子的小鼠顯示了較高的Fluc活性。
[表5]
[表6]
[表7]
2. siRNA搭載脂質奈米粒子的調製及評價 〈siRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 調製搭載有以siRNA取代mRNA之脂質奈米粒子，並調查in vivo F7基因減量活性。siRNA搭載脂質奈米粒子，除了在微流道中的N/P比設為6以外，以與前述進行相同的操作來調製。將針對F7的siRNA的鹼基序列表示於表8。表中，大寫文字表示天然型RNA(僅有T為天然型DNA)，小寫文字表示2’-氟基修飾物，*表示硫代磷酸酯鍵。 [表8]
首先，以莫耳比計為50：10：38.5：1.5的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、膽固醇及PEG-DMG，藉由乙醇稀釋法來製作搭載有針對F7的siRNA之脂質奈米粒子(F7 siRNA搭載脂質奈米粒子)。
〈結果〉 調查所調製成的脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、siRNA封裝率及pKa。將CL4F6衍生物奈米粒子的測定結果表示於表9及表10，並將CL15F6衍生物奈米粒子的測定結果表示於表11。CL4F6衍生物奈米粒子的平均粒徑為60～280nm，siRNA封裝率方面，CL4F 6-2-LNP低於90%，相對於此，包含其他陽離子性脂質之LNP皆顯示為90%以上。除了CL4F 16-2-LNP以外，形成為PDI小且均勻性高的粒子。 CL15F6衍生物奈米粒子的平均粒徑，雖然CL15F 6-2-LNP超過300nm，但是包含其他陽離子性脂質之LNP皆為85～290nm。siRNA封裝率，在全部的LNP中皆顯示90%以上。除了CL15F 6-2-LNP、CL15F 6-4-LNP、CL15F 7-3-LNP、CL15F 16-0-LNP以外，形成為PDI小且均勻性高的粒子。 繼而，對Balb/c小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，5週齡，雌性)投予所調製成的各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子，調查in vivo F7基因減量活性。具體而言，以含有表9所記載的脂質之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子 0.025mg為siRNA/kg、含有表10及11所記載的脂質之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子為0.025mg siRNA/kg的條件，對Balb/c小鼠進行靜脈投予，然後使用BIOPHEN FVII(Biophen公司製造，A221304)測定24小時後的血漿中F7酵素活性。將未處理群小鼠的血漿中F7酵素活性設為100%，來計算經投予各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的相對血漿中F7酵素活性(%)。進一步，將經投予含MC3之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的相對血漿中F7酵素活性設為1，來計算比率。將CL4F6衍生物奈米粒子的測定結果表示於表9及表10，並將CL15F6衍生物奈米粒子的測定結果表示於表11。 比起含MC3之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子，在表9及表10的含CL4F 10-4、CL4F 8-5、CL4F 9-5或CL4F 12-6之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子中顯示了較高的基因減量活性。 比起含MC3之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子，在表11的含CL15F 9-7、CL15F 11-5、CL15F 12-4、CL15F 11-6、CL15F 10-8、CL15F 11-7、CL15F 11-9或CL15F 12-10之F7 siRNA搭載脂質奈米粒子中顯示了較高的基因減量活性。
[表9]
[表10]
[表11]
3. pDNA搭載脂質奈米粒子的調製及評價 〈pDNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 調製搭載以編碼有eGFP之pDNA取代mRNA之脂質奈米粒子，並調查in vitro(體外)的eGFP的發光。編碼有eGFP之pDNA，是藉由對pCMV-LacI from LacSwitch II Mammalian Expression System(Agilent公司製造)插入編碼有eGFP之基因所製成。 pDNA搭載脂質奈米粒子，以與mRNA搭載脂質奈米粒子同樣地操作來調製。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：38.5：1.5的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)及DMG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定，以與mRNA-LNP的平均粒徑的測定相同的方法來實行。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 使用Picogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMdsDNA Assay Kit，廣效(broad range)，賽默飛世爾科技公司製造)來測定脂質奈米粒子的pDNA的封裝率。pDNA的封裝率測定，除了將奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度設為1.6μg/mL，將總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度設為24ng/mL，使用於校準曲線的核酸濃度設為0～0.5μg/mL，並使用Picogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMdsDNA Assay Kit，廣效，賽默飛世爾科技公司製造)作為測定試劑以外，藉由與siRNA及mRNA的封裝率測定方法相同的方法來實行。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈結果〉 將結果表示於下表。將調製成的脂質奈米粒子靜置於40℃中，在經過各期間的保管後，依據以下的基準來評價品質是否仍良好地維持： 良好(〇)：粒徑為作成即刻的粒徑±20nm以內、PDI為0.2以下且封裝率80%以上。 不為良好(×)：粒徑超過作成即刻的粒徑±20nm且封裝率小於80%。 在40℃中靜置1週以上品質仍良好地維持的脂質奈米粒子能夠評價為穩定性優異。 [表12]
4.脂質奈米粒子的保存穩定性評價 〈脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏有混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及mRNA濃度已調整為46.1μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收脂質奈米粒子溶液。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：38.5：1.5的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇及PEG-DMG，藉由乙醇稀釋法來製作搭載有Fluc mRNA之脂質奈米粒子(Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子)。Fluc mRNA使用TriLink Biotechnologies公司製造的CleanCap(註冊商標)Fluc mRNA(5moU)。 〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子在PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average(平均值))及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 使用Ribogreen試劑(life technologies公司製造)來測定脂質奈米粒子的mRNA的封裝率。 〈保存穩定性評價〉 將脂質奈米粒子靜置在-80℃、5℃、25℃、40℃各溫度中，在保管各期間後，測定平均粒徑、PDI及核酸封裝率。滿足下述全部3種條件的脂質奈米粒子判斷為品質仍良好地維持：平均粒徑以LNP調製日為基準仍維持在±20nm以內、PDI為0.2以下而保持高均勻性、核酸封裝率仍維持在80%以上。
〈結果〉 表13及表14中表示測定平均粒徑、PDI及核酸封裝率的結果和脂質奈米粒子的品質判斷為仍良好地維持的期間，該平均粒徑、PDI及核酸封裝率是將各Fluc mRNA搭載脂質奈米粒子分別靜置在-80℃、5℃、25℃、40℃中並保管各期間後所測得者。在5℃中靜置1週以上而品質仍良好地維持的脂質奈米粒子能夠評價為穩定性優異。
[表13]
脂質名稱 括號內為最大保存期間 -80℃ (1週) 5℃ (5週) 25℃ (5週) 40℃ (5週)
CL4F 6-2 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL4F 6-4 0週 5週 5週 3天
CL4F 7-3 0週 5週 5週 0天
CL4F 7-4 0週 5週 5週 1週
CL4F 7-5 1週 2週 5週 1週
CL4F 8-4 1週 5週 5週 1週
CL4F 8-5 1週 5週 5週 5週
CL4F 8-6 1週 5週 5週 1週
CL4F 9-3 1週 5週 5週 0天
CL4F 9-4 1週 5週 5週 1週
CL4F 9-5 1週 5週 5週 5週
CL4F 9-6 1週 5週 5週 5週
CL4F 9-7 1週 5週 5週 5週
CL4F 10-2 0週 5週 1週 0天
CL4F 10-4 1週 5週 5週 0天
CL4F 10-5 1週 5週 5週 5週
CL4F 10-7 1週 5週 5週 5週
CL4F 10-8 1週 5週 5週 5週
CL4F 11-5 1週 5週 5週 1週
CL4F 11-6 1週 5週 5週 5週
CL4F 11-7 1週 5週 5週 5週
CL4F 11-9 1週 5週 5週 5週
CL4F 12-4 1週 5週 5週 1週
CL4F 12-6 1週 5週 5週 5週
CL4F 12-10 1週 5週 5週 5週
CL4F 13-3 0週 0週 0週 0天
CL4F 14-2 0週 0週 0週 0天
CL4F 16-0 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL4F 16-1 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL4F6 1週 5週 5週 5週
CL4G6 1週 5週 5週 5週
CL4H6 0週 0週 1週 0天
[表14]
脂質名稱 -80℃ 5℃ 25℃ 40℃
括號內為最大保存期間 (1週) (5週) (5週) (5週)
CL15F 6-2 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL15F 6-4 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL15F 7-3 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL15F 7-5 0週 5週 5週 5週
CL15F 8-6 1週 5週 5週 5週
CL15F 9-3 0週 5週 5週 5週
CL15F 9-5 1週 5週 5週 5週
CL15F 9-7 1週 5週 5週 5週
CL15F 10-4 1週 5週 5週 5週
CL15F 10-5 1週 5週 5週 5週
CL15F 10-8 1週 5週 5週 5週
CL15F 11-5 1週 5週 5週 5週
CL15F 11-6 1週 5週 5週 5週
CL15F 11-7 1週 5週 5週 5週
CL15F 11-9 1週 5週 5週 5週
CL15F 12-4 1週 5週 5週 5週
CL15F 12-10 1週 5週 5週 5週
CL15F 13-3 0週 5週 5週 5週
CL15F 14-2 1週 5週 5週 5週
CL15F 16-0 在作成階段即不滿足「良好」的基準
CL15F 16-1 0週 0週 0週 0週
CL15F6 1週 5週 5週 5週
CL15G 1週 5週 5週 5週
CL15H 在作成階段即不滿足「良好」的基準
MC3 0週 0週 1週 0週
5.具有各式各樣組成之脂質奈米粒子的製作及評價 〈脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及核酸濃度已調整為46.1μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收脂質奈米粒子溶液。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以表15～18中記載的組成來調製脂質。作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL4F 10-5、CL4F 9-7、CL4F 8-4、CL4F6、CL15 10-5及CL15F6。作為其他脂質，使用：膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)、β-穀固醇(22,23-二氫豆固醇(22,23-Dihydrostigmasterol)、β-穀固醇(beta-Sitosterol)、5-豆固烷-3β-醇(5-Stigmasten-3β-ol)、α-二氫海藻固醇(α-Dihydrofucosterol)、24α-乙基膽固醇(24α-Ethylcholesterol，以上為西格瑪奧瑞奇公司製造)；DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，COATSOME MC-8080，油化產業股份有限公司製造)、DMG-PEG2K(1,2-二-十四醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯醚，SUNBRIGHT GM-020，油化產業股份有限公司製造)、DOPC(1,2-二-十八醯基-sn-甘油酸-3-磷酸膽鹼，COATSOME MC-8181，油化產業股份有限公司製造)、DOPE(1,2-二-十八醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，COATSOME ME-8181，油化產業股份有限公司製造)、DPPC(1,2-二棕櫚醯基-sn甘油-3-磷酸膽鹼，COATSOME MC-6060，油化產業股份有限公司製造)。作為mRNA使用Fluc表現mRNA(CleanCap Fluc mRNA (5moU)，TriLink Biotechnologies公司製造)、mCherry表現mRNA(CleanCap mCherry mRNA (5moU)，TriLink Biotechnologies公司製造)。
〈保存穩定性評價〉 將調製成的脂質奈米粒子靜置在40℃中，在保管各期間後，測定平均粒徑、PDI及核酸封裝率。依據以下的基準，來評價品質是否仍良好地維持。 良好(〇)：粒徑為作成即刻的粒徑±20nm以內、PDI為0.2以下且封裝率80%以上。 不為良好(×)：粒徑超過作成即刻的粒徑±20nm且封裝率小於80%。 在40℃中靜置1週以上品質仍良好地維持的脂質奈米粒子能夠評價為穩定性優異。
〈in vitro中的螢光素酶表現活性的測定〉 作為細胞培養用培養基，在E-MEM培養基中(L-麩醯胺酸、酚紅、丙酮酸鈉、非必需胺基酸、含1500mg/L碳酸氫鈉)(製品編碼055-08975，和光純藥股份有限公司製造)添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum Charachterized，康寧公司製造)及1%抗生素(Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL)，賽默飛世爾科技公司製造)而成者。將人類胎兒腎臟細胞293(HEK293細胞)以2.0×10 4cells/well(孔)的條件添加至96孔白色微量盤(西格瑪奧瑞奇公司製造)，在37℃且5%CO 2環境下培養一晚後，以mRNA含量換算計為100ng/well的條件添加脂質奈米粒子。以相同條件培養24小時後，以100μg/well的量添加300μg/mL的螢光素溶液(Beetle luciferin，Promega公司製造)，利用多功能讀盤儀(EnSight multimode plate reader，Perkin Elmer公司製造)測定發光強度。此時，對於僅添加培養基的槽(well)及未添加脂質奈米粒子的細胞槽中添加前述螢光素溶液，並同樣地實行測定，然後採用扣除以培養基槽的發光強度作為背景值所得的數值。再者，未添加脂質奈米粒子的細胞槽的發光強度為背景值以下。
〈in vitro中的mCherry表現活性的測定〉 作為細胞培養用培養基，在E-MEM培養基中(L-麩醯胺酸、酚紅、丙酮酸鈉、非必需胺基酸、含1500mg/L碳酸氫鈉)(製品編碼055-08975，和光純藥股份有限公司製造)添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum Charachterized，康寧公司製造)及1%抗生素(Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL)，賽默飛世爾科技公司製造)而成者。將人類胎兒腎臟細胞293(HEK293細胞)以2.0×10 4cells/well的條件添加至96孔黑色微量盤(西格瑪奧瑞奇公司製造)，在37℃且5%CO 2環境下培養一晚後，以mRNA含量換算計為1000ng/well的條件添加脂質奈米粒子。以相同條件培養24小時後，利用多功能讀盤儀(EnSight multimode plate reader，Perkin Elmer公司製造)測定發光強度(激發波長587nm/螢光波長610nm)。此時，亦準備僅添加培養基的槽(well)及未添加脂質奈米粒子的細胞槽中添加前述螢光素溶液，並同樣地實行測定，然後採用扣除以培養基槽的發光強度作為背景值所得的數值。再者，未添加脂質奈米粒子的細胞槽的螢光強度為背景值以下。
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
〈結果〉 將結果表示於下述表19～23。 [表19]
[表20]
[表21]
[表22]
[表23]
6.腫瘤中的siRNA或mRNA搭載脂質奈米粒子的活性評價 (1)藉由hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子進行的OS-RC-2細胞腫瘤中的基因減量試驗 對經利用OS-RC-2細胞來形成皮下腫瘤後的小鼠投予hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子，調查腫瘤中的in vivo基因減量活性。 〈siRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及siRNA濃度已調整為151μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子溶液。 將hPLK-1siRNA搭載脂質的鹼基序列表示於表24。表中，小寫文字表示RNA鹼基，*表示2’-OMe修飾。 [表24]
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：37：3的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)及DSG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-9、CL15F 13-3、CL15F 10-5、CL15F 11-5、CL15F 11-6、CL15F 11-7、CL15F 12-4、CL15F 13-11、CL15F 14-12及CL15F6。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子的PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average)及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 利用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的siRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈腫瘤中的in vivo基因減量試驗〉 將懸浮於100μL的RPMI1640(R5886-500mL，Sigma-Aldrich公司製造)中的2×10 6cells的OS-RC-2細胞(人類腎臟癌細胞株，RCB0735，RIKEN公司製造)移植到BALB/c-nu/nu小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，7週齡，雌性)的右側腹皮下。形成皮下腫瘤後，根據腫瘤體積來將小鼠分組。腫瘤體積的群組平均為127～143mm 3。對分組後的小鼠靜脈投予所調製的各hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子2mg siRNA/kg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)。投予24小時後，在異氟醚麻醉下從後大靜脈進行放血，將安樂死後的小鼠的皮下腫瘤摘除。將所摘除的腫瘤浸泡於Allprotect Tissue Reagent(商品名，QIAGEN公司製造)中，在4℃靜置一晩後，實行RNA萃取(RNeasy Plus Universal Mini Kit，QIAGEN公司製造)。使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(商品名，Invitrogen公司製造)來使所獲得的總RNA進行反轉錄反應。然後，藉由使用了Power SYBR TMGreen PCR Master Mix(商品名，Thermo公司製造)之qPCR法來測定hPLK-1的mRNA量。內源控制基因設為人類甘油醛-3-磷酸脫氫酶(hGAPDH)。將所使用的引子表示於表25及表26。 腫瘤中hPLK-1mRNA量(%)是將經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠的腫瘤中的hPLK-1的mRNA量設為100%，來計算投予各hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中hPLK-1mRNA量(%)。
[表25] [表26]
〈結果〉 將所調製的hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、siRNA封裝率、及腫瘤中hPLK-1 mRNA量(%)表示於表27～29。 hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為74.5～177.2nm，siRNA封裝率皆顯示95%以上。又，形成了PDI較小且均勻性較高之粒子。 投予hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中的hPLK-1的表現量皆為經以HEPES緩衝液進行處理後的小鼠的腫瘤的20.8～66.9%。
[表27] [表28] [表29]
(2)藉由hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子進行的OS-RC-2細胞腫瘤中的基因減量試驗 對經利用OS-RC-2細胞來形成皮下腫瘤後的小鼠投予hGSPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子，調查腫瘤中的in vivo基因減量活性。 〈siRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為16mM的乙醇溶液及siRNA濃度已調整為151μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子溶液。 hGAPDHsiRNA的鹼基序列表示於表30。表中，大寫文字表示DNA鹼基，小寫文字表示RNA鹼基。 [表30]
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：37：3的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)及DSG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL15F 11-9及CL15F6。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子的PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average)及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 利用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的siRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈腫瘤中的in vivo基因減量試驗〉 將懸浮於100μL的RPMI1640(R5886-500mL，Sigma-Aldrich公司製造)中的2×10 6cells的OS-RC-2細胞(人類腎臟癌細胞株，RCB0735，RIKEN公司製造)移植到BALB/c-nu/nu小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，7週齡，雌性)的右側腹皮下。形成皮下腫瘤後，根據腫瘤體積來將小鼠分組。腫瘤體積的群組平均為135～138mm 3。對分組後的小鼠靜脈投予所調製的各hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子2mg siRNA/kg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)。投予24小時後，在異氟醚麻醉下從後大靜脈進行放血，將安樂死後的小鼠的皮下腫瘤摘除。所摘除的腫瘤浸泡於Allprotect Tissue Reagent(商品名，QIAGEN公司製造)中，在4℃靜置一晩後，實行RNA萃取(Rneasy Plus Universal Mini Kit，QIAGEN公司製造)。使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)來使所獲得的總RNA進行反轉錄反應。然後，藉由使用了Power SYBR TMGreen PCR Master Mix(商品名，Thermo公司製造)之qPCR法來測定hGAPDH的mRNA量。內源控制基因設為人類β-肌動蛋白(hβ-actin)。將所使用的引子表示於表31及表32。 腫瘤中hGAPDHmRNA量(%)是將經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠的腫瘤中的hGAPDH的mRNA量設為100%，來計算投予各hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中hGAPDHmRNA量(%)。
[表31] [表32]
〈結果〉 將所調製的hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、siRNA封裝率、及腫瘤中hGAPDHmRNA量(%)表示於表33。 hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為95.9～110.9nm，siRNA封裝率皆顯示95%以上。又，形成了PDI較小且均勻性較高之粒子。 投予hGAPDHsiRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中的hGAPDH的表現量皆為經以HEPES緩衝液進行處理後的小鼠的腫瘤的45.4～58.3%。
[表33]
(3)藉由hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子進行的BT-474細胞腫瘤中的基因減量試驗 對經利用BT-474細胞來形成皮下腫瘤後的小鼠投予hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子，調查腫瘤中的in vivo基因減量活性。 〈siRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及siRNA濃度已調整為151μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子溶液。 將hPLK-1siRNA搭載脂質的鹼基序列表示於表34。表中，小寫文字表示RNA鹼基，*表示2’-OMe修飾。 [表34]
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：37：3的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)、及DMG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL15F 9-5、CL15F 11-9及CL15F6。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子的PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average)及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 利用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的siRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈腫瘤中的in vivo基因減量試驗〉 將癌細胞移植到BALB/c-nu/nu小鼠的皮下。形成皮下腫瘤後，投予所調製的各PLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子，調查腫瘤中的in vivo hPLK-1(human PLK-1)基因減量活性。 將懸浮於100μL溶液中的5×10 6cells的BT-474細胞(人類乳癌細胞株，美國典型培養物保藏中心製造，HTB-20)移植到BALB/c-nu/nu小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，5週齡，雌性)的右側腹皮下，該溶液是將含Hybri-Care培養基(美國典型培養物保藏中心(ATCC)製造，46-X)之1.5g/L碳酸氫鈉(Sigma-Aldrich公司製造，S5761-500G)溶液與Matrigel(康寧公司製造，354234)以1：1的體積比加以混合而獲得。形成皮下腫瘤後，根據腫瘤體積來將小鼠分組。腫瘤體積的群組平均為141～143mm 3。對分組後的小鼠靜脈投予所調製的各hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子4mg siRNA/kg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)。投予24小時後，在異氟醚麻醉下從後大靜脈進行放血，將安樂死後的小鼠的皮下腫瘤摘除。所摘除的腫瘤浸泡於Allprotect Tissue Reagent (QIAGEN公司製造)中，在4℃靜置一晩後，實行RNA萃取(Rneasy Plus Universal Mini Kit，QIAGEN公司製造)。使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(商品名，Invitrogen公司製造)來使所獲得的總RNA進行反轉錄反應。然後，藉由使用了Power SYBR TMGreen PCR Master Mix(商品名，Thermo公司製造)之qPCR法來測定hPLK-1的mRNA量。內源控制基因設為人類GAPDH(hGAPDH)。將所使用的引子表示於表35及表36。 腫瘤中hPLK-1mRNA量(%)是將經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠的腫瘤中的hPLK-1的mRNA量設為100%，來計算投予各hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中hPLK-1mRNA量(%)。 [表35] [表36]
〈結果〉 將所調製的hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、siRNA封裝率及腫瘤中hPLK-1mRNA量(%)表示於表37。 hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為102.4～154.1nm，siRNA封裝率皆顯示95%以上。又，形成了PDI較小且均勻性較高之粒子。 投予hPLK-1siRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中的hPLK-1的表現量皆為經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠的腫瘤中的49.6～68.6%。 [表37]
(4)FLucmRNA搭載脂質奈米粒子在OS-RC-2細胞腫瘤中的in vivo基因表現活性 對經利用OS-RC-2細胞來形成皮下腫瘤後的小鼠投予FLucmRNA搭載脂質奈米粒子，調查腫瘤中的in vivo基因表現活性。 〈mRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及mRNA濃度已調整為46μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收脂質奈米粒子溶液。 mRNA使用TriLink Biotechnologies公司製造的CleanCap(註冊商標)Fluc mRNA(5moU)，來調製FLuc mRNA搭載脂質奈米粒子。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：37：3的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)及DSG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL15F 7-3、CL15F 7-5、CL15F 8-6、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 10-4、CL15F 13-3、CL15F 16-1、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F6、CL15F 9-3、CL15F 10-5、CL15F 11-6、CL15F 12-4及CL15F 14-2。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子的PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average)及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 利用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的mRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈腫瘤中的Fluc活性的測定〉 將懸浮於100μL的RPMI1640(Sigma-Aldrich製造，R5886-500mL)中的2×10 6cells的OS-RC-2細胞(人類腎臟癌細胞株，RIKEN公司製造，RCB0735)移植到BALB/c-nu/nu小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，7週齡，雌性)的右側腹皮下。形成皮下腫瘤後，根據腫瘤體積來將小鼠分組。腫瘤體積的群組平均為125～140mm 3。對分組後的小鼠靜脈投予各FlucmRNA搭載脂質奈米粒子0.1mg mRNA/kg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)，測定24小時後的腫瘤中的Fluc活性。Fluc活性，是以每隻小鼠為1.5mg的方式從尾靜脈投予以1×PBS(pH7.4，Gibco公司製造)溶解為15mg/mL而成的VivoGlo Luciferin、 In Vivo Grade(Promega公司製造，P1041)，之後，藉由活體成像系統(in vivo imaging system，Perkin Elmer公司製造，IVIS200)進行測定。Fluc活性的單位，是最大發光波長約560nm時的每單位面積的發光強度(Avg Radiance(平均發光強度)[p/s/cm 2/sr])。
〈結果〉 將所調製的FlucmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、mRNA封裝率、及腫瘤中Fluc活性表示於表38及表39。 FlucmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為84.1～303.0nm。mRNA封裝率皆顯示75%以上。又，形成了任一粒子的PDI皆較小且均勻性較高之粒子。 比起經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠，投予FlucmRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中的Fluc活性皆顯示了較高的Fluc活性。 [表38] [表39] (5)FLucmRNA搭載脂質奈米粒子在BT-474細胞腫瘤中的in vivo基因表現活性 對經利用BT-474細胞來形成皮下腫瘤後的小鼠投予FLucmRNA搭載脂質奈米粒子，調查腫瘤中的in vivo基因表現活性。 〈mRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及mRNA濃度已調整為46μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收脂質奈米粒子溶液。 mRNA使用TriLink Biotechnologies公司製造的CleanCap(註冊商標)Fluc mRNA(5moU)，來調製FLuc mRNA搭載脂質奈米粒子。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：37：3的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)及DSG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL15F 11-5、CL15F 8-6及CL15F6。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子的PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average)及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 利用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的mRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈腫瘤中的Fluc活性的測定〉 將懸浮於100μL溶液中的5×10 6cells的BT-474細胞(人類乳癌細胞株，美國典型培養物保藏中心製造，HTB-20)移植到BALB/c-nu/nu小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，5週齡，雌性)的右側腹皮下，該溶液是將含Hybri-Care培養基(美國典型培養物保藏中心製造，46-X)之1.5g/L碳酸氫鈉(Sigma-Aldrich公司製造，S5761-500G)溶液與Matrigel(康寧公司製造，354234)以1：1的體積比加以混合而獲得。形成皮下腫瘤後，根據腫瘤體積來將小鼠分組。腫瘤體積的群組平均為131～134mm 3。對分組後的小鼠靜脈投予各Fluc　mRNA搭載脂質奈米粒子0.5mg mRNA/kg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)，測定24小時後的腫瘤中的Fluc活性。Fluc活性，是以每隻小鼠為1.5mg的方式從尾靜脈投予以1×PBS(pH7.4，Gibco公司製造)溶解為15mg/mL而成的VivoGlo Luciferin、 In Vivo Grade(Promega公司製造，P1041)，之後，藉由活體成像系統(in vivo imaging system，Perkin Elmer公司製造，IVIS Spectrum CT)進行測定。Fluc活性的單位，是最大發光波長約560nm時的每單位面積的發光強度(Avg Radiance(平均發光強度)[p/s/cm 2/sr])。
〈結果〉 將所調製的FlucmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、mRNA封裝率、及腫瘤中Fluc活性表示於表40。 FlucmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為105.2～124.9nm，mRNA封裝率皆顯示95%以上。又，形成了PDI較小且均勻性較高之粒子。 比起經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠，投予FlucmRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠的腫瘤中的Fluc活性皆顯示了較高的Fluc活性。 [表40]
7.藉由mRNA搭載脂質奈米粒子進行的免疫誘導試驗 (1)藉由OVAmRNA搭載脂質奈米粒子進行的細胞性免疫誘導試驗 對小鼠投予OVAmRNA搭載脂質奈米粒子，調查OVA特異性的細胞性免疫反應。 〈mRNA搭載脂質奈米粒子的調製〉 脂質奈米粒子是藉由使用流道的乙醇稀釋法來調製。作為流道，使用內藏混合器之微流體裝置「NanoAssemblr」(Precision NanoSystems公司製造)。 具體而言，首先將脂質濃度已調整為8mM的乙醇溶液及mRNA濃度已調整為46μg/mL的檸檬酸緩衝液(50mM，pH3.5)各自以3mL/分鐘及9mL/分鐘的流速輸液至微流道中，並回收自流道所排出的脂質奈米粒子溶液。將該脂質奈米粒子溶液以20mM HEPES緩衝液(9%蔗糖，pH7.45)稀釋10倍之後，以超濾單元進行濃縮，並回收脂質奈米粒子溶液。 作為mRNA，使用CleanCap OVA mRNA(5moU，TriLink公司製造，L-7210-5)，來調製OVAmRNA搭載脂質奈米粒子。
〈脂質奈米粒子的構成脂質〉 以莫耳比計為50：10：38.5：1.5的組成，使用酸鹼應答性陽離子性脂質、DSPC(1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，油化產業股份有限公司製造)、膽固醇(Nacalai Tesque Inc.製造)、及DMG-PEG2K(油化產業股份有限公司製造)。 作為酸鹼應答性陽離子性脂質，使用CL15F 7-5、CL15F 9-3、CL15F 9-5、CL15F 9-7、CL15F 14-2、CL15F 11-7、CL15F 11-9、CL15F 12-4、CL15F6、CL15F 8-6、CL15F 10-4、CL15F 10-5、CL15F 10-8、CL15F 11-5、CL15F 11-6、及CL15F 13-3、以及CL4F 7-3、CL4F 7-5、CL4F 8-6、CL4F 9-4、CL4F 10-2、CL4F 10-8、CL4F 12-4、CL4F 12-6、CL4F6、CL4F 6-4、CL4F 7-4、CL4F 8-4、CL4F 8-5、CL4F 9-3、CL4F 9-5、CL4F 9-6、CL4F 9-7、CL4F 10-4及CL4F 11-5。
〈脂質奈米粒子的平均粒徑及PDI的測定〉 使用利用動態光散射法的分析裝置「Zetasizer Nano ZSP」(Malvern Panalytical Ltd.製造)來測定脂質奈米粒子的PBS(-)中的平均粒徑(ζ-Average)及PDI。
〈脂質奈米粒子的核酸封裝率〉 利用Ribogreen試劑來測定脂質奈米粒子的mRNA的封裝率。作成並準備奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液，其是利用TE緩衝液以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度8μg/mL的方式稀釋而成。又，以將脂質奈米粒子的濃度作成核酸濃度1.2μg/mL並以X-triton100成為1%(w/w)的方式進行添加來準備總核酸濃度測定用溶液。在96孔微量多孔盤(黑色，聚苯乙烯製，平底，康寧公司製造)的孔內對於各別的100μL的溶液添加100μL的Ribogreen(註冊商標)試劑(Quant-iT TMRiboGreen TMRNA Reagent，賽默飛世爾科技公司製造)並混合均勻，利用微量盤檢測儀測定激發波長485nm、測定波長528nm時的螢光強度。核酸濃度的計算，是基於校準曲線計算，該校準曲線是藉由以與前述同樣的條件對含1% X-triton100之核酸溶液(核酸濃度0～2.5μg/mL)測定螢光強度所作成。藉由以下的算式，計算各脂質奈米粒子的核酸封裝率。 封裝率%＝(總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)－脂質奈米粒子表面核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL))÷總核酸濃度測定用溶液的核酸濃度(μg/mL)×100
〈細胞性免疫誘導試驗〉 對小鼠投予所調製的各OVAmRNA搭載脂質奈米粒子，使用Mouse IFN-γ ELISPOT Kit(R&D systems公司製造，XEL485)來調查OVA特異性的細胞性免疫反應。 具體而言，對C57BL6小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，9週齡，雌性)以3週的間隔在左大腿部肌內投予2次所調製的各OVAmRNA搭載脂質奈米粒子1μg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)。從第2次投予起算1週後，從經利用頸椎脫臼進行安樂死後的小鼠回收脾臟，並放入裝有3mL的RPMI1640(Sigma-Aldrich製造，R5886-500mL)之C tube(Miltenyi Biotec公司製造，130-093-237)中，利用gentleMACS TMOcto Dissociator with Heaters(Miltenyi Biotec公司製造)加以分離。使分離後的脾臟細胞通過40μm 細胞過濾器(cell strainer)，以RPMI1640加以洗滌後，以300×g、7分鐘、4℃的條件進行離心。去除上清液後，使用ACK裂解緩衝液(ACK Lysing buffer，Gibco公司製造，A10492-01)以2分鐘、室溫的條件使紅血球溶解。藉由加入10mL的RPMI164011來使反應停止，以300×g、7分鐘、4℃的條件進行離心，並將上清液完全去除。去除上清液後，利用包含10%FBS(Gibco公司製造，10270-160)和1%左旋麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素溶液(Sigma-Aldrich公司製造，G1146-100mL)之RPMI1640 (RPMI1640+FBS+L-G/PS)使脾臟細胞懸浮，並測量細胞數。
繼而，藉由在ELISpot孔盤中添加RPMI1640+FBS+L-G/PS，並靜置20分鐘以上來使濾膜膨脹。繼而，在ELISpot孔盤的各孔(well)中添加各50μL的RPMI1640+FBS+L-G/PS或包含20μM的OVA第一型胜肽(OVA class I pepetide，Sigma公司製造，序列：SIINFEKL)之RPMI1640+FBS+L-G/PS。添加有RPMI1640+FBS+L-G/PS的孔設為背景值檢測用，添加有包含OVA第一型胜肽之RPMI1640+FBS+L-G/PS的孔設為OVA特異性IFN-γ檢測用。繼而，將測量細胞數後的脾臟細胞調整成7.5×10 5cells/mL，並接種於ELISpot孔盤的各孔中各50μL。接種脾臟細胞後的孔盤在5%CO 2、37℃中進行培養20小時。培養後，依據Mouse IFN-γELISpot Kit的步驟準則來實行IFN-γ的檢測。使孔盤乾燥後，使用ELISpot Reader(C.T.L.公司製造，ImmunoSpot S6 Analyzer)來測量斑點數。 各小鼠的OVA特異性IFN-γ產生細胞的斑點數設為由OVA特異性IFN-γ檢測用的孔減去背景值檢測用孔而得的數。
〈結果〉 將含有CL15F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、siRNA封裝率、及OVA特異性IFN-γ產生細胞的斑點數表示於表41及表42，將含有CL4F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、mRNA封裝率、及OVA特異性IFN-γ產生細胞的斑點數表示於表43及表44。 含有CL15F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為99.5～197.3nm，mRNA封裝率皆顯示90%以上。又，形成了PDI較小且均勻性較高之粒子。 含有CL4F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑為80.9～175.4nm，mRNA封裝率皆顯示75%以上。又，形成了PDI較小且均勻性較高之粒子。 相較於經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠，投予含有CL15F6衍生物或CL4F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠中檢測到較多的OVA特異性IFN-γ產生細胞的斑點數。
[表41]
[表42]
[表43]
[表44] (2)藉由OVAmRNA搭載脂質奈米粒子進行的體液免疫誘導試驗 對小鼠投予OVAmRNA搭載脂質奈米粒子，調查OVA特異性的體液免疫反應。OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的調製是使用細胞性免疫誘導試驗中製作的OVAmRNA搭載脂質奈米粒子。 〈體液免疫誘導試驗〉 對小鼠投予所調製的各OVAmRNA搭載脂質奈米粒子，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來調查OVA特異性的體液免疫反應。 具體而言，對C57BL6小鼠(日本查爾斯河實驗室公司，9週齡，雌性)以3週的間隔在左大腿部肌內投予2次所調製的各OVAmRNA搭載脂質奈米粒子1μg或pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)。從第2次投予起算3週後，在異氟醚麻醉下從心臟實行採血。所回收的血液加入MiniCollect(註冊商標)貓血清(Greiner公司製造，450533)中，進行8～10次倒轉混合後，靜置30分鐘～90分鐘。靜置後，以3000×g、10分鐘、室溫的條件進行離心，並回收血清。 繼而，將各100μL的溶解於碳酸緩衝溶液而成的100μg/mL的卵白蛋白(A2512-250MG)溶液加入Nunc Immuno Plate(Thermo公司製造，439454)的各孔中，在4℃培養一晩。利用包含0.05% Tween20之pH7.4、1×PBS(0.05%　Tween20-PBS)來清洗經以卵白蛋白被覆後的孔盤3次，將200μL的溶解於10g/L而成的Block Ace(雪印公司製造，UKB80)溶液加入各well中，再次在4℃培養一晩。繼而，利用0.05% Tween20-PBS來對孔盤進行3次洗滌後，將各50μL的經以4g/L的Block Ace進行1/2連續稀釋後的血清加入各孔中，在室溫培養90分鐘。然後，再次利用0.05% Tween20-PBS進行3次洗滌，將各100μL的經以4g/L的Block Ace進行調整後的Anti-IgG(Fc), Mouse, Goat-Poly, HRP(BETHYL公司製造，A90-131P)添加至各孔中，然後在室溫培養1小時。繼而，利用0.05% Tween20-PBS進行3次洗滌，加入100μL 的TMB solution(05298-80，Nacalai Tesque Inc.製造)，在室溫培養30分鐘。培養後，將100μL的1M硫酸添加至各孔後，利用EnSight(Perkin Elmer公司製造)測定450nm的吸光度。OVA特異性IgG是將最小吸光度設為0.3，計算各組的平均值。當Log2力價(titer)超過28時將28設為測定值。
〈結果〉 將含有CL15F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、mRNA封裝率、及OVA特異性IgG(log2力價)表示於表45及表46，將含有CL4F6衍生物之OVAmRNA搭載脂質奈米粒子的平均粒徑、PDI、mRNA封裝率、及OVA特異性IgG(log2力價)表示於表47及表48。 相較於經以pH7.45、20mM HEPES緩衝液(9重量%蔗糖)進行處理後的小鼠，投予OVAmRNA搭載脂質奈米粒子後的小鼠中的OVA特異性IgG皆較高。
[表45]
[表46]
[表47]
[表48]
無
第1圖是顯示針對實施例1測定各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子的pKa的結果的圖。第1圖(A)是使用CL4F6、CL4G6或CL4H6調製成的脂質奈米粒子的結果，第1圖(B)是使用CL15F6、CL15G6或CL15H6調製成的脂質奈米粒子的結果。 第2圖是顯示針對實施例1計算出經投予各F7 siRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠的相對血漿中的F7酵素活性(%)的結果的圖。第2圖(A)是經投予使用CL4F6、CL4G6或CL4H6調製成的脂質奈米粒子的小鼠的結果，第2圖(B)是經投予使用CL15F6、CL15G6或CL15H6調製成的脂質奈米粒子的小鼠的結果。 第3圖是顯示針對實施例2測定經投予各Nluc mRNA搭載脂質奈米粒子的小鼠肝臟與脾臟中的Nluc活性(RLU/mg 蛋白質)的結果的圖。 第4圖是顯示針對實施例3測定經導入各pFluc搭載脂質奈米粒子的HeLa-GFP細胞的Fluc活性的結果的圖。 第5圖是顯示針對實施例3測定經投予各pFluc搭載脂質奈米粒子的小鼠肝臟與脾臟中的Fluc活性(RLU/mg 蛋白質)的結果的圖。
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Claims (18)

  1. 一種用於輸送至癌症之醫藥組成物，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。
  2. 如請求項1所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其包含： (i)固醇或固醇衍生物； (ii)聚烷二醇修飾脂質；及， (iii)緩衝劑。
  3. 如請求項2所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其中，前述聚烷二醇修飾脂質包含1,2-二硬脂醯基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG)。
  4. 如請求項1～3中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示： 。
  5. 如請求項1～4中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其進一步包含核酸。
  6. 如請求項5所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其中，前述核酸是選自由siRNA、mRNA、適體及質體DNA所組成之群組中的至少1種。
  7. 如請求項1～6中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其是脂質奈米粒子的懸浮液。
  8. 如請求項7所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其在25℃中為pH6.8～pH8.0。
  9. 如請求項7或8所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其包含1重量%～20重量%的二糖。
  10. 如請求項1～6中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物，其是脂質奈米粒子的冷凍乾燥製劑。
  11. 一種癌症治療用醫藥組成物，用以治療具有癌症之個體，該癌症治療用醫藥組成物包含請求項1～10中任一項所述之用於輸送至癌症之醫藥組成物。
  12. 一種免疫賦活用組成物，其含有由下述式(I)表示的酸鹼應答性陽離子性脂質、其立體異構物或立體異構物之混合物： 式(I)中，a表示3～5的整數，b表示0或1，R 1及R 2各自獨立地表示由下述通式(A)表示的基團，X表示由下述通式(B)表示的基團或5～7員非芳香族雜環基，其中，該基團藉由碳原子鍵結在(O－CO) b－上，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基， 式(A)中，R 11及R 12各自獨立地表示直鏈狀或支鏈狀的C 1-15烷基，c表示0或1，v表示4～12的整數， 式(B)中，d表示0～3的整數，R 3及R 4各自獨立地表示C 1-4烷基或C 2-4烯基，該C 1-4烷基或C 2-4烯基的1個或2個氫原子可被取代為苯基，R 3及R 4可互相鍵結而形成5～7員非芳香族雜環，該環的1個或2個氫原子可被取代為C 1-4烷基或C 2-4烯基。
  13. 如請求項12所述之免疫賦活用組成物，其中，前述酸鹼應答性陽離子性脂質由下述式表示： 。
  14. 如請求項12或13所述之免疫賦活用組成物，其包含選自由siRNA、mRNA、適體及質體DNA所組成之群組中的核酸。
  15. 如請求項12～14中任一項所述之免疫賦活用組成物，其是脂質奈米粒子的懸浮液。
  16. 如請求項15所述之免疫賦活用組成物，其在25℃中為pH6.8～pH8.0。
  17. 如請求項15或16所述之免疫賦活用組成物，其包含1重量%～20重量%的二糖。
  18. 如請求項12～14中任一項所述之免疫賦活用組成物，其是脂質奈米粒子的冷凍乾燥製劑。
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