CN116082179A - 基于内源性二羧酸的可电离脂质及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及基于内源性二羧酸的可电离脂质及其制备方法与应用。其为式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物；
Figure ZY_1
其中，X选自‑CH2‑CH2‑、‑CH2=CH2‑、
Figure ZY_2
、
Figure ZY_3
、
Figure ZY_4
、
Figure ZY_5
；Y选自‑O‑、‑NH‑；R选自C6‑C20的烷基、取代基团取代的C6‑C20的烷基、C6‑C20的烯基、取代基团取代的C6‑C20的烯基、C6‑C20的炔基、取代基团取代的C6‑C20的炔基；n为1~8的整数。本发明提供的内源性二羧酸的可电离脂质用于制备脂质纳米粒进行有效的核酸递送，实现针对性的基因治疗。

Description

基于内源性二羧酸的可电离脂质及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及基于内源性二羧酸的可电离脂质及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
由于核酸药物分子量大且自身的细胞穿透性差，容易受到胞内核酸酶降解，导致核酸药物的体内应用面临巨大的挑战。因此，开发安全有效的核酸递送载体，以提高核酸药物到达靶部位的能力是发挥基因治疗应用潜力的关键。现有技术可通过脂质纳米颗粒将核酸分子RNA等核酸药物传递到靶细胞，尽管现有技术已经报道了一系列可电离脂质化合物，但是仍然需要提供具有高效和稳定递送性能的脂质化合物。因此有必要开发一种效率高、毒性小、靶向性优良的脂质化合物。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供基于内源性二羧酸的可电离脂质及其制备方法与应用，本发明提供的内源性二羧酸的可电离脂质用于制备脂质纳米粒进行有效的核酸递送，实现针对性的基因治疗。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种基于内源性二羧酸的可电离脂质，其为式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物；
其中，X选自-CH2-CH2-、-CH2=CH2-、、、、；Y选自-O-、-NH-；R选自C6-C20的烷基、取代基团取代的C6-C20的烷基、C6-C20的烯基、取代基团取代的C6-C20的烯基、C6-C20的炔基、取代基团取代的C6-C20的炔基；n为1~8的整数。
另一方面，一种上述基于内源性二羧酸的可电离脂质的制备方法，包括以式(II)所示化合物和以式(III)所示化合物通过酯化反应或酰胺化反应获得式(I)所示的化合物的步骤；
其中，Y’为氨基或羟基。
第三方面，一种组合物，包括上述基于内源性二羧酸的可电离脂质、中性脂质、疏水性脂质和PEG-脂质。
第四方面，一种上述组合物在作为基因药物递送载体的应用。
第五方面，一种上述组合物在制备基因药物的应用，所述基因药物包括活性成分和递送载体，所述活性成分为核酸药物，所述递送载体为上述组合物。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的可电离脂质基于生物代谢过程中产生的内源性二羧酸作为基本骨架，且以酯键和酰胺键作为连接键，在体内可以被酶快速水解，具有良好的生物相容性和生物可降解性；该脂质化合物具有多条疏水尾部，能够增强细胞内体逃逸，提高转染效果；在其他辅助脂质的支持下，能够有效包载siRNA、mRNA等核酸药物，形成稳定均一的脂质纳米粒。同时凭借在生理环境下呈电中性，脂质纳米粒具备更优良的体内稳定性，降低了因过多正电荷引起的细胞毒性；因此基于本公开提供的可电离脂质化合物制备的脂质纳米粒可以作为安全、高效的基因递送载体。
（2）相对于传统的可电离脂质，本发明提供的可电离脂质化合物，初始原料常见易得，合成步骤简单，反应条件温和，产物易于分离，具有良好的生物医学应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例14制备的YHS-12-1脂质纳米粒TEM图；
图2为本发明实施例中不同处方脂质纳米粒在Hep3B细胞上转染GFP mRNA的阳性率结果图；
图3为本发明实施例中YHS-12-2脂质纳米粒体外细胞毒性检测结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于目前基因疗法中siRNA、mRNA、ASO等核酸药物对核酸酶敏感且无法渗透细胞等问题，为了解决如上的技术问题，本发明提出了基于内源性二羧酸的可电离脂质及其制备方法与应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种基于内源性二羧酸的可电离脂质，其为式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物；
其中，X选自-CH2-CH2-、-CH2=CH2-、、、、；Y选自-O-、-NH-；R选自C6-C20的烷基、取代基团取代的C6-C20的烷基、C6-C20的烯基、取代基团取代的C6-C20的烯基、C6-C20的炔基、取代基团取代的C6-C20的炔基；n为1~8的整数。
所述取代基团为卤素或氨基。所述烷基为直链烷基或支链烷基，优选支链烷基。所述烯基为直链烯基或支链烯基，优选支链烯基。所述烷基为直链炔基或支链炔基，优选支链炔基。
在一些实施例中，X选自-CH2-CH2-，-CH=CH-，。
在一些实施例中，Y为-NH-。
在一些实施例中，R为C6-C20的烷基。
在一些实施例中，n为1~3的整数。
具体地，包括以下化合物：
（HPS-9）；
（HPS-12）；
（YHS-8）；
（YHS-12）；
（YKS-9）；
（YKS-12）。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述基于内源性二羧酸的可电离脂质的制备方法，包括以式(II)所示化合物和以式(III)所示化合物通过酯化反应或酰胺化反应获得式(I)所示的化合物的步骤；
其中，Y’为氨基或羟基。
在一些实施例中，酯化反应是在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑存在的条件下进行。
在一些实施例中，酰胺化反应在冰浴条件下进行。
在一些实施例中，式(II)所示化合物包括琥珀酸、延胡索酸、衣康酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、L-苹果酸。
本发明的第三种实施方式，提供了一种组合物，包括上述基于内源性二羧酸的可电离脂质、中性脂质、疏水性脂质和PEG-脂质。
在一些实施例中，所述组合物构成脂质纳米粒。具体地，所述脂质纳米粒在pH 4.0条件下带正电，在pH 7.0条件下不带电荷或带负电。脂质纳米粒的制备方法包括脂质体挤出法、薄膜水化法、纳米沉淀法、微流控以及冲击射流式混合法等，优选为纳米沉淀法。
在一种或多种实施例中，脂质纳米粒的粒径为1~1000 nm，优选为100~200 nm。
在一些实施例中，基于内源性二羧酸的可电离脂质、中性脂质、疏水性脂质和PEG-脂质的摩尔比为(2~60)：(5~55)：(10~50)：(0.2~25)；优选为(15~45)：(10~40)：(20~35)：(0.5~5)。
在一些实施例中，所述中性脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、鞘磷脂(SM)。优选为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一些实施例中，疏水性脂质为固醇。所述固醇为胆固醇。
在一些实施例中，PEG-脂质包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG(DSPE-PEG)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG (DPPE-PEG)、二肉豆蔻基甘油-PEG(DMG-PEG)或二甲基丙烯酸酯-PEG(DMA-PEG)。优选为二肉豆蔻基甘油-PEG(DMG-PEG)。
在一些实施例中，包括缓冲试剂。所述缓冲试剂优选为酸性缓冲试剂。所述缓冲试剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸、醋酸钠、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸二氢钾-氢氧化钠、甘氨酸-盐酸、硼酸-硼砂、邻苯二甲酸-盐酸、邻苯二甲酸氢钾和磷酸二氢钠-柠檬酸。所述缓冲试剂优选为柠檬酸。具体地，形成脂质纳米粒时，缓冲试剂的体积分数为40~90％v/v，优选为75％v/v。
在一些实施例中，包括有机试剂。所述有机试剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、氯苯、二氯苯、乙醚、二氯甲烷、环氧丙烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙腈、吡啶、苯酚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚和三乙醇胺中的一种或多种，优选乙醇。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述组合物在作为基因药物递送载体的应用。
本发明的第五种实施方式，提供了一种上述组合物在制备基因药物的应用，所述基因药物包括活性成分和递送载体，所述活性成分为核酸药物，所述递送载体为上述组合物。
在一些实施例中，所述核酸药物为siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、ASO、质粒DNA、microRNA、long non-coding RNA等，优选为mRNA。mRNA包括直链mRNA和环状mRNA。
在一些实施例中，活性成分和递送载体的质量比为1:8~12。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1 1,1-二甲基乙基-N-[2-(二壬基氨基)乙基]氨基甲酸酯的合成：
在装有磁子的250 mL圆底烧瓶中加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺（1.76 g，10mmol）、1-溴壬烷（5.00 g，22 mmol）、碳酸钾（3.03 g，20 mmol）和无水乙腈（30 ml），在反应瓶上加装冷凝管，80℃下加热回流72 h。反应液抽滤，弃去固体，减压旋蒸除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离纯化（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:20），即得到中间产物1,1-二甲基乙基-N-[2-(二壬基氨基)乙基]氨基甲酸酯，收率83%。具体反应式如下：
实施例2 N1,N1-二壬基-1,2-乙二胺的合成：
在装有磁子的100 ml圆底烧瓶中加入1,1-二甲基乙基-N-[2-(二壬基氨基)乙基]氨基甲酸酯（4.00 g，9.7 mmol），用1,4-二氧六环（25 mL）溶解后，加入盐酸1,4-二氧六环溶液（25 mL），室温搅拌8 h。减压旋干反应液，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷（3×30 mL）萃取，有机相用无水硫酸钠干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，即得N1,N1-二壬基-1,2-乙二胺粗产物，无需纯化即可参加下一步反应，具体反应式如下：
实施例3 (2-(双十二烷基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成：
在装有磁子的250 mL圆底烧瓶中加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺（1.8 g，11mmol）、1-溴十二烷（6.0 g，24 mmol）、碳酸钾（3.04 g，22 mmol）和无水乙腈（40 ml），在反应瓶上加装冷凝管，80℃下加热回流72 h。反应液抽滤，弃去固体，减压旋蒸除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离纯化（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:20），即得到中间产物(2-(双十二烷基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，收率78%。具体反应式如下：
实施例4 N1, N1-双十二烷基乙烷-1,2-二胺的合成：
在装有磁子的100 mg圆底烧瓶中加入(2-(双十二烷基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯（4.0 g，8 mmol），用1,4-二氧六环（20 mL）溶解后，加入盐酸1,4-二氧六环溶液（20 mL），室温搅拌6 h。减压旋干反应液，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷（3×30 mL）萃取，有机相用无水硫酸钠干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，即得N1, N1-双十二烷基乙烷-1,2-二胺粗产物，无需纯化即可参加下一步反应，具体反应式如下；
实施例5 1,1-二甲基乙基-N-[2-(二辛基氨基)乙基]氨基甲酸酯的合成：
在装有磁子的250 mL圆底烧瓶中加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺（1.92 g，12mmol）、1-溴辛烷（5.00 g，26 mmol）、碳酸钾（3.32 g，24 mmol）和无水乙腈（30 ml），在反应瓶上加装冷凝管，80℃下加热回流72 h。反应液抽滤，弃去固体，减压旋蒸除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离纯化（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:20），即得到中间产物1,1-二甲基乙基-N-[2-(二辛基氨基)乙基]氨基甲酸酯，收率79%。具体反应式如下；
实施例6 N1,N1-二辛基-1,2-乙二胺的合成：
在装有磁子的100 ml圆底烧瓶中加入1,1-二甲基乙基-N-[2-(二辛基氨基)乙基]氨基甲酸酯（2.00 g，5.2 mmol），用1,4-二氧六环（13 mL）溶解后，加入盐酸1,4-二氧六环溶液（13 mL），室温搅拌6 h。减压旋干反应液，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷（3×30 mL）萃取，有机相用无水硫酸钠干燥并过滤，用旋转蒸发仪除去溶剂，即得N1,N1-二辛基-1,2-乙二胺粗产物，无需纯化即可参加下一步反应，具体反应式如下；
实施例7 衣康酰氯的合成：
在装有磁子的100 ml圆底烧瓶中加入衣康酸（1.00 g，7.7 mmol），三倍量的草酰氯（23.1 mmol，1.97 ml），用二氯甲烷（25 ml）溶解，之后加入3~5滴DMF，室温搅拌6h，注意要连接尾气处理装置并且防止倒吸。减压旋干反应液，即得衣康酰氯粗产物，无需纯化即可参加下一步反应，具体反应式如下；
实施例8 N1,N4-双(2-(二壬基氨基)乙基)-2-亚甲基琥珀酰胺的合成：
取制备的N1,N1-二壬基-1,2-乙二胺（1.0 g，3.20 mmol）于带有磁子的100 mL圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷（10 ml）溶解；另取制备的衣康酰氯（0.24 g，1.45 mmol）用无水二氯甲烷溶解，后将其加入到恒压滴液漏斗中，在冰水浴下将其缓慢滴入N1,N1-二壬基-1,2-乙二胺的二氯甲烷溶液中，控制滴速在1 h内滴加完毕，之后不断搅拌24 h。反应液无需后处理，直接减压蒸干后，残余混合物用硅胶柱层析分离（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:10），得到目标产物76 mg，为黄色油状液体，收率7.31%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d)δ 6.33 (d, J= 2.5 Hz, 1H), 5.60 (d, J= 2.2 Hz, 1H), 3.65 (t, J= 6.8 Hz, 4H),3.29 (s, 2H), 2.63 (t, J= 6.8 Hz, 3H), 2.45-2.37 (m, 8H), 1.25 (s, 56H), 0.88(t, J= 6.7 Hz, 12H)。具体反应式如下：
实施例9 N1,N4-双(2-(双十二烷基氨基)乙基)-2-亚甲基琥珀酰胺的合成：
取制备的N1,N1-双十二烷基乙烷-1,2-乙二胺（1.0 g，2.52 mmol）于带有磁子的100 mL圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷（10 ml）溶解；另取制备的衣康酰氯（0.19 g，1.15mmol）用无水二氯甲烷溶解，后将其加入到恒压滴液漏斗中，在冰水浴下将其缓慢滴入N1,N1-双十二烷基乙烷-1,2-二胺的二氯甲烷溶液中，控制滴速在1 h内滴加完毕，之后不断搅拌24 h。反应液无需后处理，直接减压蒸干后，残余混合物用硅胶柱层析分离（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:10），得到目标产物84 mg，为黄色油状液体，收率10%。1H NMR (400MHz, Chloroform-d) δ 6.25 (d, J= 2.5 Hz, 1H), 5.52 (d, J= 2.2 Hz, 1H), 3.58 (t, J= 6.8 Hz, 4H), 3.23-3.21 (m, 2H), 2.56 (t, J= 6.8 Hz, 3H), 2.40-2.27 (m, 8H),1.18 (s, 80H), 0.82 (d, J= 6.6 Hz, 12H)。具体反应式如下：
实施例10 N1,N4-双（2-（二壬基氨基）乙基）琥珀酰胺的合成：
取制备的N1,N1-二壬基-1,2-乙二胺（1.0 g，3.20 mmol）于带有磁子的100 mL圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷（10 ml）溶解；另取琥珀酰氯（0.22 g，1.45 mmol）用无水二氯甲烷溶解，后将其加入到恒压滴液漏斗中，在冰水浴下将其缓慢滴入N1,N1-二壬基-1,2-乙二胺的二氯甲烷溶液中，控制滴速在1 h内滴加完毕，之后不断搅拌24 h。反应液无需后处理，直接减压蒸干后，残余混合物用硅胶柱层析分离（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:10），得到目标产物53 mg，为黄色油状液体，收率5.13%。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 3.51(t, J= 6.8 Hz, 4H), 2.53 (dd, J= 14.5, 7.6 Hz, 8H), 2.33 (t, J= 7.4 Hz, 8H),1.30-1.18 (m, 56H), 0.82 (d, J= 6.8 Hz, 12H)。具体反应式如下：
实施例11 N1,N4-双(2-(双十二烷基氨基)乙基)琥珀酰胺的合成：
取制备的N1,N1-双十二烷基乙烷-1,2-乙二胺（1.0 g，2.52 mmol）于带有磁子的100 mL圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷（10 ml）溶解；另取琥珀酰氯（0.18 g，1.15 mmol）用无水二氯甲烷溶解，后将其加入到恒压滴液漏斗中，在冰水浴下将其缓慢滴入N1, N1-双十二烷基乙烷-1,2-二胺的二氯甲烷溶液中，控制滴速在1 h内滴加完毕，之后不断搅拌24 h。反应液无需后处理，直接减压蒸干后，残余混合物用硅胶柱层析分离（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:10），得到目标产物64 mg，为黄色油状液体，收率6.4%。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 3.51 (t, J= 6.8 Hz, 4H), 2.61-2.49 (m, 8H), 2.37-2.30 (m, 7H),1.19 (s, 80H), 0.81 (t, J= 6.7 Hz, 12H)。具体反应式如下：
实施例12 N1,N4-双(2-(二辛基氨基)乙基)富马酰胺的合成：
取制备的N1,N1-二辛基-1,2-乙二胺（0.5 g，1.76 mmol）于带有磁子的100 mL圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷（10 ml）溶解；另取富马酰氯（0.12 g，0.84 mmol）用无水二氯甲烷溶解，后将其加入到恒压滴液漏斗中，在冰水浴下将其缓慢滴入N1,N1-二辛基-1,2-乙二胺的二氯甲烷溶液中，控制滴速在1 h内滴加完毕，之后不断搅拌24 h。反应液无需后处理，直接减压蒸干后，残余混合物用硅胶柱层析分离（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:10），得到目标产物30 mg，为白色固体，收率5.45%。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.89 (s,2H), 6.82 (t, J= 5.1 Hz, 2H), 3.31 (q, J= 5.8 Hz, 4H), 2.51 (t, J= 6.1 Hz, 4H),2.39-2.23 (m, 8H), 1.37-1.13 (m, 48H), 0.81 (t, J= 6.7 Hz, 12H)。具体反应式如下：
实施例13 N1,N4-双(2-(双十二烷基氨基)乙基)富马酰胺的合成：
取制备的N1, N1-双十二烷基乙烷-1,2-乙二胺（0.6 g，1.51 mmol）于带有磁子的100 mL圆底烧瓶中，用无水二氯甲烷（10 ml）溶解；另取富马酰氯（0.11 g，0.72 mmol）用无水二氯甲烷溶解，后将其加入到恒压滴液漏斗中，在冰水浴下将其缓慢滴入N1, N1-双十二烷基乙烷-1,2-二胺的二氯甲烷溶液中，控制滴速在1 h内滴加完毕，之后不断搅拌24 h。反应液无需后处理，直接减压蒸干后，残余混合物用硅胶柱层析分离（洗脱剂：甲醇：二氯甲烷体积比=1:10），得到目标产物155 mg，为白色固体，收率24.6%。1H NMR (600 MHz,Chloroform-d) δ 6.83 (s, 2H), 6.65 (s, 2H), 3.32 (q, J= 5.8 Hz, 4H), 2.51 (t, J= 6.0 Hz, 4H), 2.35 (t, J= 7.6 Hz, 8H), 1.37-1.15 (m, 80H), 0.81 (t, J= 7.0 Hz,12H)。具体反应式如下：
实施例14 可电离脂质纳米颗粒的制备与表征：
选取实施例13制备的脂质YHS-12为代表性化合物制备脂质纳米粒。首先将用于制备脂质纳米粒的可电离脂质（YHS-12）、DSPC、胆固醇、DMG-PEG分别设置4个水平，如表1所示，接下来利用正交设计软件来优化设计了16个纳米粒处方，16个处方中不同组分的摩尔比及质量比如表2所示。将YHS-12、DOPE、胆固醇、DMG-PEG分别溶于无水乙醇，均配置成浓度为10mg/ml的储备液。上述材料准备完成后，按照表2中的质量比将四种原料储备液混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，将mRNA（购自载体家的EGFP IVT mRNA，m1Ψ修饰，mRNA与YHS-12的质量比为1：10）溶解于有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50 mM的柠檬酸缓冲剂中，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和水相缓冲液的胰岛素注射器置于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成脂质纳米颗粒，最后将产物在PBS缓冲液中，4℃透析过夜。16个处方均按照上述方法制备脂质纳米粒，命名为YHS-12-1，YHS-12-2，YHS-12-3，YHS-12-4，YHS-12-5，YHS-12-6，YHS-12-7，YHS-12-8，YHS-12-9，YHS-12-10，YHS-12-11，YHS-12-12，YHS-12-13，YHS-12-14，YHS-12-15，YHS-12-16。
表1
表2
使用Malvern Zetasizer Nano ZS，以90°反向散射检测模式，利用动态光散射检测不同处方脂质纳米颗粒的纳米尺寸和多分散系数PDI。使用Quant-iT RiboGreen RNAAssay Kit RNA定量检测试剂盒，测定脂质纳米粒包封率。结果如表3所示，16种脂质纳米粒的粒径均一（PDI<0.3），大小在100~200 nm之间，且不同处方的脂质纳米粒均对mRNA具有较高的包封率。此外，以YHS-12-1为代表性脂质纳米粒，通过透射电镜对其形貌进行考察，结果显示脂质纳米粒呈类球形，如图1所示。
表3
实施例15 YHS-12脂质纳米粒mRNA体外转染实验：
本实验选用GFP-mRNA作为模型mRNA，在Hep3B细胞检测16个处方制剂的mRNA转染效率，具体操作方法如下：将处于对数生长期的Hep3B细胞接种于6孔板上并在细胞培养箱中培养过夜，接下来将16个脂质纳米粒 (mRNA最终量为2μg)分别与Hep3B细胞孵育，培养24小时后采用流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例。以商业化基因转染试剂LipoSmart mRNATransfection Reagent作为阳性对照。由图2结果可知，本公开的YHS-12化合物制备的脂质纳米粒能够转染表达GFP的mRNA至Hep3B细胞，尤其是YSH-12-2、YSH-12-3、YSH-12-5、YSH-12-6、YSH-12-16的转染效率能够达到或高于商品化转染试剂LipoSmart mRNATransfection Reagent，其中YHS-12-2转染效率最佳。
实施例16 脂质纳米粒体外细胞毒性分析：
为了检测脂质纳米粒的细胞毒性，将处于对数生长期的Hep3B细胞接种于96孔板上并在细胞培养箱中培养过夜，接下来分别将含有不同mRNA浓度(250、500、1000、1250、1500 ng/ml)的YSH-12-2与Hep3B细胞孵育，通过CCK-8试剂盒检测细胞活性。结果显示在所有浓度下，Hep3B细胞的活性没有明显变化(图3)，表明本发明提供的YHS-12-2脂质纳米粒细胞毒性较低，具有优良的生物相容性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于内源性二羧酸的可电离脂质，其特征是，其为式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物；
其中，X选自-CH2-CH2-、-CH2=CH2-、、、、；Y选自-O-、-NH-；R选自C6-C20的烷基、取代基团取代的C6-C20的烷基、C6-C20的烯基、取代基团取代的C6-C20的烯基、C6-C20的炔基、取代基团取代的C6-C20的炔基；n为1~8的整数。
2.如权利要求1所述的基于内源性二羧酸的可电离脂质，其特征是，X选自-CH2-CH2-，-CH=CH-，。
3.如权利要求1所述的基于内源性二羧酸的可电离脂质，其特征是，包括以下化合物：
；
；
；
；
；
。
4.一种权利要求1所述的基于内源性二羧酸的可电离脂质的制备方法，其特征是，包括以式(II)所示化合物和以式(III)所示化合物通过酯化反应或酰胺化反应获得式(I)所示的化合物的步骤；
其中，Y’为氨基或羟基，X与权利要求1中的X基团一致。
5.一种组合物，其特征是，包括权利要求1~3任一所述的基于内源性二羧酸的可电离脂质、中性脂质、疏水性脂质和PEG-脂质。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征是，所述组合物构成脂质纳米粒。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征是，基于内源性二羧酸的可电离脂质、中性脂质、疏水性脂质和PEG-脂质的摩尔比为(2~60)：(5~55)：(10~50)：(0.2~25)。
8.一种权利要求5~7任一所述的组合物在作为基因药物递送载体的应用。
9.一种权利要求5~7任一所述的组合物在制备基因药物的应用，其特征是，所述基因药物包括活性成分和递送载体，所述活性成分为核酸药物，所述递送载体为所述组合物。
10.如权利要求9所述的组合物在制备基因药物的应用，其特征是，所述核酸药物为siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、ASO、质粒DNA、microRNA或long non-coding RNA。
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