WO2005037325A1

WO2005037325A1 - リポソーム含有ｘ線造影剤およびその製造方法

Info

Publication number: WO2005037325A1
Application number: PCT/JP2004/005261
Authority: WO
Inventors: Eiichi Ueda; Satoshi Kawakatsu; Akihisa Nakajima; Chiaki Nagaike
Original assignee: Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
Priority date: 2003-10-21
Filing date: 2004-04-13
Publication date: 2005-04-28
Also published as: EP1679084A1; CN1929868B; US20050084453A1; JP2005170923A; NO20062248L; CN1929868A

Abstract

本発明のX線造影剤は、狭い粒径範囲に揃えたリポソームの脂質膜中にポリアルキレンオキシド基を有する化合物および/またはステロール類を含有し、該膜内の水相中には水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を内包させているリポソームを含む。好ましくはリポソームの膜内部の水相とそのリポソームが分散されている水性媒体との両方に、少なくともヨウド系化合物および製剤助剤を含有し、該膜内外でそれぞれの濃度が実質的に同一である。さらに該ヨウド系化合物を脂質膜重量に対して1～10の重量比で含有している。本発明の造影剤は、超臨界二酸化炭素法により作製されるためクロル系溶剤などの有毒な溶剤を実質的に含まない。

Description

明細書リポソーム含有 X線造影剤おょぴその製造方法技術分野

本発明は、 X線造影剤おょぴその製造方法に関し、詳しくは内部に造影物質を内包したリボソームを含有する X線造影剤およびその製造方法に関する。背景技術

X線単純撮影や C T撮影法（コンピュータ断層撮影法）は、今日の画像診断の中核を占めている。骨、歯などのいわゆる硬組織は X線を良好に吸収するために容易に高コントラスト像を得ることができる。これに対し、軟組織間では X線吸収の差が小さいため高いコントラスト像を得ることは困難である。このような場合、コントラストの高い像を得るために造影剤を使用することが一般に行なわれている。

現在実用化されている X線造影剤の大部分は、トリョードフヱニル基を含有し水溶性化した化合物を造影物質とするものである。これらの造影剤は、血管、尿管、輸卵管などの管腔部位に投与され、管腔の形状、狭窄などの診断に使用されている。しかしながら、これらのィ匕合物は組織や疾患部位とは相互作用をすることなく管腔部位から速やかに排出されてしまうために、組織や疾患部位、特に癌組織をより詳細に診断する目的には役立たない。このため目標とする組織もしくは疾患部位に選択的に集積し、その周囲またはその他の部位と明瞭なコントラストで区別できる画像を提供する X線造影剤が望まれている。そのような X線検査用造影剤であれば、微細な癌組織であっても精度良く検出することが可能となる。腫瘍発見のために開発された検査方法としては、 X線撮影法だけでなく測定原理を異にする他の方法もある。そのうち MR I (磁気共鳴造影法）では、癌組織、特に微小な癌組織を精度よく撮像するには感度の面から限界があり、 P E T (陽電子放射断層撮影法）では、被爆と稼動コストの点で一般的でなく、いずれも大規模な設備と高額な装置を必要としており、今のところ一般的に広く利用される検查法ではない。

国際公開 WO 98/46275,同 WO 95/31181、同 WO 94/19025、同 WO 96/28414、同 WO 96/00089、米国特許 4873075号、同 4567034号などには、疎水性ヨウド化合物を界面活性剤や油脂の存在下で水中に分散させ、 S重瘍、肝臓、脾像、副腎皮質、動脈硬化巣、血管プール、リンパ系などを造影する方法が開示されている。これらの方法では、造影剤を微粒子化することにより体内での滞留時間を長くして疾患部位を選^的に造影しょうとするものである。しかしながら、その目的のために提案された製剤方法は、造影の効率および選択性とも充分でない。さらに使用するョゥド化合物が疎水性であるために、造影後に体外へ排出する速度が遅く、患者への負担が大きいという問題点もある。

一方、造影剤を微粒子状にする方法として、生体膜類似の脂質から構成され、低い抗原性ゆえに安全性が高いとされているリポソ一ムに造影性化合物を内包させる手法も検討されている。たとえば国際公開 WO 88/09165、同 WO 89/00988、同 WO 90/07491、特開平 07- 316079、特開 2003- 5596では、イオン性または非ィオン性の造影剤を含有するリボソームが提案されている。特許第 2619037号（特許文献 1 ) では、水溶性のョウド化合物をリボソーム内に封入し、リボソーム内のョウド化合物量が脂質の量に対し、 1. 5〜6 g / gと高くすることによって臓器選択性を持たせようとしている。しかしながら、腫瘍に対する選択性は低かった。これは、リボソームの粒径が実質 0. 5〜： L O mと大きめの粒子であったためと推定される。腫瘍組織への蓄積には lOOnm前後の大きさの粒子が好ましいとされる力上記特許内容の製造方法では小粒径化が難しく、また小粒径にするとョウド化合物の脂質量に対する比率が小さくなる。これらの方法では、素材としての安全性が高く、生体内で適度な分解性を有するリポソームを用いるにもかかわらず、製造過程においてリボソーム膜を構成するリン脂質の溶剤として、有機溶媒、特にクロ口ホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤を使用する。したがって、どうしても残存する溶剤の毒性があるという理由で実用化に至っていない（たとえば、特許文献 2参照）。

他方、脂質可溶性の薬剤は容易にリボソーム中に封入されるが、その封入量は他の要因にも左右されることから必ずしもそれほど多くはない。また水溶性電解質である薬剤は、その薬剤の電荷と荷電した脂質の電荷との相互作用を通じてリポソーム内部の水相に封入できるが、薬剤が水溶性の非電解質である場合には、そうした手段を採ることはできない。 X線造影剤についても、一般にイオン性造影化合物よりも、実質的に毒性の低い非イオン性ョゥド化合物をリポソーム内に封入することが望まれるが、上記の理由から容易ではない。さらに形成されるリポソームは多重層になりやすく、ヨウド化合物の内包率も低いために効率が悪くなる。このような水溶性の非電解質を効率的にリボソーム中に封入する手段として、逆相蒸発法、エーテル注入法が挙げられるが、有機溶剤を使用するためにやはり安全性の問題が残る。

特開 2003- 119120では、リボソームを含有する化粧料、皮膚外用剤を、超臨界二酸化炭素を用いて製造する方法が開示されており、親水性薬効成分や親油性薬効成分をリボソームに内包する皮膚外用剤の製造例が示されている。しかし、親水性薬効成分として、水溶性電解質の例は示されているが、同法により水溶性非電解質をリボソームに効率よく内包できるか不明であった。

首尾良く造影物質をリボソーム内部に内包させても、時間経過とともに外部へ漏出する問題、あるいはリボソームそのものが不安定となる事態も考慮されねばならない。さらにリボソームを生体内へ投与しても、その多くが月刊蔵、 J3卑臓などの網内系組織で捕捉されるため、所期の効果が得られないことも指摘されている (Cancer Res. , 43, 5328 (1983) ) 。発明の開示

本発明は、造影物質をリポソームに封入することによりその送達効率および選択性が高い X線造影剤を提供することを目的とする。より具体的には毒性のある有機溶媒を使用することなくリポソーム内に水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を封入し、微小な癌組織の検出も可能な腫瘍描出性に優れる X線造影剤ならぴにその製造方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決する本発明は、以下の構成を有する。

本発明の X線造影剤は、水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を含有するリポソームを含み、しかも実質的にクロル系溶剤を含まないことを特徴としている。前記リポソームは、リン脂質を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素に混合させ、水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を該リン脂質に接触させることにより形成されたリボソームであることを特徴としている。

前記リボソームは、実質的に一枚膜リボソームであることが好ましい。

前記ョゥド系化合物は、 2，4，6—トリョードフエ二ル基を少なくとも 1個有することが好ましい。

前記リボソームの平均粒径は、 0. 05〜0. 5 /ζ πιであることを特徴としている。前記リボソームの平均粒径が、 0. 05〜0· 2 /χ ηιであることが好ましい。

前記リポソームの平均粒径が、 0. 11〜0. 13 μ mであることがより好ましい。前記リボソームは、ォキシエチレン単位が 10〜3500の PEGを、該リボソームを構成する脂質に対して 0. 1〜30質量⁰ /₀含んでなる PEG化リボソームであってもよい。

前記リボソームは、望ましくは 0. 1〜0. 4 / mの孔径を有する濾過膜を通されていることが好ましい。

前記リボソームは、前記ヨウド系化合物を膜脂質重量に対して、 1〜： 10の重量比で含有していることが好ましい。

前記リボソームが、前記ヨウド系化合物をリボソーム膜脂質に対して、 3〜8 の重量比で含有していることが好ましい。

前記リボソームが、前記ヨウド系化合物をリボソーム膜脂質に対して、 5〜8 の重量比で含有していることがより好ましい。

前記リボソーム内に封入されたョウド系化合物は、全ョウド系化合物の 5〜 3 0質量。 /₀であることを特徴としている。

前記リボソームは、その脂質膜にポリアルキレンォキシド塞を有する化合物ステロール類から少なくとも 1種選ばれる化合物を含有し、力つその脂質膜内の水相に前記ヨウド系化合物を含有することが好ましい。

前記リボソームが、好ましくはその脂質膜にポリアルキレンォキシド修飾リン脂質を含有し、かつその脂質膜内の水相に前記ヨウド系化合物を含有している。前記リボソームが、その脂質膜にポリヱチレンォキシドとポリプロピレンォキシドとのプロック共重合物を含有し、かつその脂質膜内の水相に前記ヨウド系化合物を含有してもよい。

前記リボソームは、その脂質膜内の水相と前記リボソームが分散されている水性媒体との両方にヨウド系化合物および製剤助剤を含有し、リポソーム膜内外でそれぞれの濃度が実質的に同一であることが好ましい。

前記製剤助剤が、水溶性ァミン系緩衝剤、キレート化剤から少なくとも 1種選ばれる化合物であることが好ましい。

より好ましくは前記水溶性ァミン系緩衝剤が、トロメタモールである。

さらに前記キレート化剤が、好ましくは EDTANa₂— Caである。

本発明の製造方法は、リボソームを形成するリン脂質を超臨界二酸ィヒ炭素もしくは亜臨界二酸ィヒ炭素に混合させ、水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物をリン脂質に接触させることにより形成されたリボソームを有する X線造影剤の製造方法である。

上記の製造方法は、リポソームを形成するリン脂質を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸ィ匕炭素に混合させ、水溶性かつ非ィオン性のョゥド系化合物の水溶液を導入し、次いで二酸ィ匕炭素を排出してリボソームを形成することが好ましい。前記二酸化炭素の圧力が、 50〜500 kg/cm²であることが望ましい。

また、前記二酸化炭素の温度が好ましくは、 25〜200°Cである。

上記製造方法は、リボソーム膜成分として、リン脂質とともにポリアルキレンォキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンォキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類から少なくとも 1種選ばれる化合物を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸ィヒ炭素に混合させた後、ョゥド系化合物の水溶液を導入し、二酸化炭素を排出して、ヨウド系化合物を内部に含有するフリポソームを形成し、さらに該リボソームを 0. l〜0. 4/z mの孔径を有する濾過膜を通すことが好ましい。

さらに、好ましくは上記製造方法は、リボソーム膜成分として、リン脂質とともにポリアルキレンォキシド修飾リン脂質、ステロール類から選ばれる少なくとも 1種の化合物を超臨界もしくは亜臨界二酸ィヒ炭素に混合させた後、少なくともヨウド系化合物および製剤助剤を含む水溶液を導入し、二酸化炭素を排出して、さらに形成されたリボソームを 0.：！〜 0. 4μ ηιの孔径を有する濾過膜を通し、最終的にヨウド系化合物および製剤助剤が該膜内外でそれぞれ実質的に同一濃度で含有されるリポソームを形成することを特徴としている。

以下、本発明を造影化合物、リボソーム、 X線造影剤の順に詳細に説明する。造影化合物

本発明における水溶性ヨウド系化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず特に規定されない。一般的に非イオン性ョウド系化合物の方が、ィォン性ョウド系化合物よりも浸透圧が低くより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物として、特にヨウ化フエニルを含み、たとえば 2, 4， 6—トリヨードフェニル基を少なくとも 1個有する非イオン性ョゥド系化合物が好適である。

そのような非イオン性ョウド系化合物として、具体的にはィォへキソール、ィォペントー^^、ィォジキサノー Λ^、ィォプロミド、ィオト Πラン、ィオメプロ一ル、 Ν, Ν —ビス〔2—ヒドロキシー 1一（ヒドロキシメチル）ーェチル〕一 5 - [ C ( 2—ヒドロキシ一 1ーォキソプピル）一ァミノ〕一 2，4，6—トリョード — 1，3—ベンゼン一ジカルボキシアミド（ィォパミドール）；メトリザミドなどが挙げられる。

その他のヨウド系化合物として、ジァトリゾィン酸；ジァトリゾエートナトリゥム；メグルミンジァトリゾエート；ァセトリゾィン酸およびその可溶性塩；ジプロトリゾ酸；ョーダミド、ョージパミドナトリゥム、メグルミンョージパミド、ョード馬尿酸おょぴその可溶性塩；ョードメタム酸；ョードピラセットヨ一ドー 2—ピリドン一 N—酢酸、 3，5—ジョード一 4一ピリドン一 N—酢酸（ョードピラセット）；前記酸のジェチルアンモニゥム塩；ィオタラム酸；メトリゾイン酸およびその塩；ィォパノ酸、ィォセファム酸、ィオフエノ酸おょぴそれらの可溶性塩；チロパノエ一トナトリゥム、ィォポダートナトリゥムおよび他の同様なョゥ素化された化合物などを拳げることができる。

これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは 2種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。なお本明細書において、ィ匕合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。

本発明の X線造影剤に好適なヨウド系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないィオメプロール、ィォパミドール、ィォトロラン、ィォジキサノールなどが挙げられる。特にィオトラン、ィォジキサノールといった二量体非イオン性ョゥド系化合物では、同一ョゥド濃度の造影剤を調製しても全伴のモル数が低いために浸透圧をさらに低下させる利点がある。

本発明の造影剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった諸要因に基づき任意に設定することができる。リボソーム内に封入されたョウド系化合物の量は、典型的には X線造影剤における全ョゥド化合物の 5〜95質量％、好ましくは 5〜90質量⁰ /₀、より好ましくは 5〜70質量％である。特にヨウド系化合物をカプセルィ匕したリボソームの経時的な不安定化を充分に防止するには、リボソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、全ョゥド化合物の 5〜30質量％、好ましくは 5〜25 質量％、より好ましくは 5〜20質量％であることが望ましい。 X線造影剤において、リボソーム内に封入されたョウド系化合物の割合が全体の 5〜30質量％ (好ましくは 5〜25質量⁰ /₀)であれば、残り 70〜95質量％ (好ましくは 75〜95質量％) が存在するリポソーム外の水性分散液へ流出する量については、実質的に無視できる。したがって、ヨウド系化合物をカプセル化しリボソームの浸透圧効果による不安定化を十分に防止でき、リポソームにおける造影物質の保持安定性は向上する。

リボソーム

本発明の X線造影剤は、上記造影化合物を目標とする臓器、組織などの標的部位へ選択的に効率よく送達するためにマイクロキヤリヤーとしてのリポソーム内に封入した形態で使用される。本発明の造影剤は、血中安定性が改善されたリポソームを用いることにより血中滞留性を向上させて、効率的な薬物送達ならぴにターグティングの実現を図っている。特に優れた腫瘍描出性を獲得するために有劾とされる E P R (Enhanced permeability and retention, 透過性の充進および滞留）効果を生じさせるためには、リボソーム構造の安定化おょぴ封入物質の保持安定性という、キヤリヤーとしての担持の効率を改善させた上で、血中安定性、血中滞留性といった特性を有することが求められる。

本発明の X線造影剤は、造影化合物を内包するリボソームの粒径（粒子径）およびその二分子膜を適切に設計することによりターグティング機能を実現することができる。受動的ターグティングおよび能動的ターグティングいずれも考慮される。前者は、リボソームの粒径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リポソーム粒径を狭い範囲に揃える調整は、後述する方法に基づき容易に行われる。リボソーム膜表面の設計は、リン脂質の種類と組成、共存物質を変えることにより所望の特性を付与することができる。造影剤のより高度な集積性と選択性を可能とする能動的ターグティングの採用もまた検討されるべきである。一例として、リボソーム表面にポリアルキレンォキシド高分子鎖またはポリエチレングリコール（P E G) を導入することは、標的部位までの誘導過程を制御し得るため、極めて有益である。本発明の X線造影剤に好適なリボソームとは、その表面にポリアルキレンォキシドまたは P E G を付加する修飾を施す結果、その血中滞留性が一層高められ、肝臓などの細網内皮系細胞に貪食されにくいリボソームである。癌組織、疾患部位などに到達しな力た X線造影剤は、正常部位に集積することなく、副作用が発現する前にリポソームが分解されて体外に排泄される。このことはリボソームを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能である。造影物質は、水溶性ヨウド系化合物を使用するため、腎臓を経由して速やかに尿中に排泄される。したがって徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。

本発明における造影化合物のキヤリヤーとして使用されるリボソームの設計、製造方法について、以下に詳述する。

リボソームは、通常、脂質二重膜から形成されている。その脂質膜の成分として、一般にリン脂質および Zまたは糖脂質が好ましく使用される。

本発明のリボソームにおける好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよびノまたはこれらの水素添加物、水酸ィ匕物の誘導体を挙げることができる。

その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来する力、または半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールァミン、スフインゴミエリン、合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC) 、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC) 、ジォレイルホスファチジルコリン（D0PC) 、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG) 、ジステア口ィルホスファチジルセリン（DSPS) 、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSP G) 、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI) 、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI) 、ジパルミトイルホスファチジン酸 (DPPA)、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA)などを挙げることができる。これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、 2種以上併用してもよい。ただし 2種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、重量比として通常、 2 0 0 : 1〜3 ： 1、好ましくは 1 0 0 ： 1〜4 ： 1、より好ましくは 4 0 ： 1〜5 ： 1 である。

糖脂質としては、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラタトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラタトシルセラミド、ガンダリオシド G7、ガンダリオシド G6、ガングリオシド G4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。

リポソ一ムの膜構成成分として、上記脂質の他に必要に応じ他の物質を加えることもできる。たとえば、膜安定化剤として作用するステロール類、たとえばコレステロ一ノレ、ジヒドロコレステロ一ノレ、コレステロ一ノレエステノレ、フイトステローノレ、シトステロ一ノレ、スチグマステロ一ノレ、カンペステローノレ、コレスタノール、ラノステロールまたは 2 , 4—ジヒドロラノステロールなどが挙げられる。また 1—O—ステロールダルコシド， 1一 O—ステロールマルトシドまたは 1― 〇ーステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリボソームの安定化に効果があることが示されている（特開平 5-245357号公報）これらのうち、コレステロールが特に好ましい。

ステロール類の使用量として、リン脂質 1重量部に対して 0. 05〜1. 5重量部、好ましくは 0. 2〜1重量部、より好ましくは 0. 3〜0. 8重量部の割合が望ましい。 0. 05重量部より少ないと混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が発揮されず、 2重量部より多すぎるとリポソームの形成が阻害される力 \ 形成されても不安定となる。

リポソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンォキシド導入用のアンカ一にもなり得る。具体的にはリボソーム膜構成成分として膜中に含めるコレステロールには、必要に応じリンカ一を介してその先にポリアルキレンォキシド基を結合させてもよい。リンカ一には、短鎖のアルキレン基、ォキシアルキレン基などを用いる。特開平 09— 3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、リポソームの形成成分として利用することができる新規なコレステロール驟導体が開示されている。

他に添加できる化合物として、負荷電物質であるジセチルホスフエ一トといつたリン酸ジアルキルエステルなど、正電荷を与える化合物としてステアリルアミンなどの脂肪族ァミンが例示される。

本発明では、ポリアルキレンォキシド（P AO) 基または類似の基を有するリン脂質または化合物を X線造影剤の意図する目的に応じてリボソーム膜の一成分として使用してもよい。これまでも細網内皮系細胞で捕捉されてしまう問題ならぴに崩壌、凝集などといったリボソーム自体の不安定性に関する問題を解決する方法として、リポソームの表面に高分子鎖であるポリエチレンダリコール ( P E G) 鎖、すなわち一（C H ₂ C H ₂0) _n— Hを導入することが試みられている（たとえば、特開平 1—249717号公報、 FEBS letters, 268, 235 (1990) ) 。ポリアルキレンォキシド鎖（ポリオキシアルキレン鎖）または P E G鎖をリポソーム表面に付けることにより、新たな機能をリポソームに付与することができる。たとえば、 P E G化リボソームには免疫系から認識されにくくなる（いわゆる「ステルス化」された状態である）効果が期待できる。あるいはリボソームが親水的傾向を有することにより血中安定性を増して、長時間にわたり血液中の濃度を維持できることが明らかになつている（Biochim. Biophys. Acta.， 1066， 29-36 (1991) ) 。また、リボソームの血中滞留性を向上させるために、ポリアルキレンォキシド修飾リン脂質をリボソーム脂質膜に含有させる手法が開示された（特開 2002- 37833号公報）。そのようなリボソームでは経時安定性も改善されていることが示されている。

これらの性質を利用して X線造影剤に臓器特異性を与えることもできる。具体的には脂質成分は肝臓に貯まりやすいことから肝臓の選択的な造影を目的とする場合には、 P E Gを使用しないか、あるいは P E G含有量の少ないリボソームを用いるのが望ましい。また粒径を 200nm以上に大きくすると、肝臓 Kupffer細胞の食作用により速やかに取り込まれる可能性が高くなり、肝臓の該部位に集積する。肝臓癌の撮像においては、その癌組織には正常組織に比べて Kupffer細胞が少ないために、造影剤リボソームの取込み量は、相対的に少なくなりコントラストが鮮明となる。脾臓においても同様である。反対に他臓器の造影の場合、 PEGを導入すればリポソームをステルス化して肝臓などに集まりにくくすることができるため、 P E Gィ匕リポソームの使用が推奨される。 PEGの導入により水和層が形成されるため、リボソームは安定化し、血中滞留性も向上する。 PEGのォキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。 PEGとして、ォキシエチレン単位が 10〜3500 のポリエチレングリコールが好適である。また PEG を使用する場合の使用量は、該リボソームを構成する脂質に対して 0.1〜30質量⁰ /₀、好ましくは 1〜15質量％程度含むのがよい。

リボソームの PEG化は、公知の技術を利用することができる。； PEGが結合するアンカー（たとえばコレステロールなど）を膜構成成分であるリン脂質と混ぜてリボソームを作製し、そのアンカーに活性ィ匕 PEGを結合させてもよい。なお、リボソーム表面に導入されたポリエチレングリコール基は、後記「機能性物質」と反応しないため、そうしたリボソーム表面上に「機能性物質」を固定化することは困難である。代わりに、 PEG先端に何らかの修飾をさらに施した PE Gをリン脂質に結合させ、これをリボソーム構成成分として含めてリボソームを作製することもできる。

上記 PEGに代わり、公知の各種ポリアルキレンォキシド基、一（AO) _n- Yをリボソーム表面に導入してもよい。ここで AOは炭素数 2〜4のォキシアルキレン基を表し、 nはォキシアルキレン基の平均付加モル数である。また、 Yは、水素原子、アルキル基または機能性官能基を表す。

炭素数 2~4のォキシアルキレン基（AOで表される）として、たとえばォキシエチレン基、ォキシプロピレン基、ォキシトリメチレン基、ォキシテトラメチレン基、ォキシ一 1一ェチルエチレン基、ォキシ一 1， 2—ジメチルエチレン基などが挙げられる。これらのォキシアルキレン基は、エチレンォキシド、プロピレンォキシド、ォキセタン、 1—プテンォキシド、 2—プテンォキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンォキシドを付加重合させた基である。

nは 1~2000、好ましくは 10〜500、さらに好ましくは 20〜200の正数である。 nが 2以上の場合、ォキシアルキレン基の種類は、同一のものでも異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、プロック状に付加していてもよい。ポリアルキレンォキシド鎖に親水性を付与する場合、 AOとしてはェチレンォキシドが単独で付加したものが好ましく、この場合、 nが 1 0以上のものが好ましい。また種類の異なるアルキレンォキシドを付加する場合、エチレンォキシドが 2 0モル⁰ /₀以上、好ましくは 5 0モル％以上付カ卩しているのが望ましい。ポリアルキレンォキシド鎖に親油性を付与する場合はエチレンォキシド以外の付加モル数を多くする。たとえばポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドとのプロック共重合物を含有するリボソームは、本発明の好ましい態様である。

Yは、水素原子、アルキル基または機能性官能基である。アルキル基として、炭素数 1〜5の、分岐していてもよい脂肪族炭化水素基が挙げられる。機能性官能基は、ポリアルキレンォキシド鎖の先端に糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」を付するためのもので、たとえばアミノ基、ォキシカルボ二ルイミダゾール基、 N-ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む官能基が挙げられる。

先端に「機能性物質」を結合しているポリアルキレンォキシド鎖が固定ィ匕されたリボソームは、ポリアルキレンォキシド鎖導入の効果に加えて、ポリアルキレンォキシド鎖に邪魔されることなく「機能性物質」の機能、たとえば「認識素子」として特定臓器指向性、癌組織指向性などの作用が充分に発揮される。

ポリアルキレンォキシド基を有するリン脂質または化合物は、一種類を単独で使用することができ、あるいは二種以上のものを組み合わせて使用することもできる。その含有量は、リポソーム膜形成成分の合計量に対し、 0. 001〜50モル％、好ましくは 0. 01〜25モル⁰ /₀、より好ましくは 0. 1〜10モル⁰ /₀である。 0. 001モル⁰ /₀ 未満では期待される効果が小さくなる。

リポソーム膜へのポリアルキレンォキシド鎖の導入は、公知の技術を利用することができる。たとえばポリアルキレンォキシドが結合するアンカー（コレステロールなど）を膜構成成分であるリン脂質と混ぜてリボソームを作製し、そのァンカーに活性化ポリアルキレンォキシドを結合させてもよい。なお、このような方法では、リポソーム調製後にリポソーム膜表面上で多段階の化学反応を行う必要があり、このため目的とする前記「機能性物質」の導入量が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混入し、リボソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点もある。別の製造方法として、原料のリン脂質類の中に、予めリン脂質ポリアルキレンォキシド（P E O) 誘導体などを含めてリボソームを作成してもよい。その方法に好適な、下式で示される修飾リン脂質が提案された（特開平 7 - 165770号公報）。

OM (式中、 R R ²は炭素数 2〜29のアルキル基、 Mは水素原子またはナトリウムもしくはカリウムなどのアルカリ金属であり、 A O、 nおよび Yは上記のとおり。）

具体例として、ホスファチジルエタノールァミンなどのポリエチレンォキシド ( P E O) 誘導体、たとえばジステアロイルホスファチルジルエタノールァミンポリエチレンォキシド（D S P E— P E O) などが挙げられる。さらに特開 2002 一 37883号公報には、血中滞留性を高めた水溶性高分子修飾リボソームを作製するための高純度ポリアルキレンォキシド修飾リン脂質が開示されている。そうしたリボソームを作製する際にモノァシル体含量が低!/、ポリアルキレンォキシド修飾リン脂質を使用すると、リボソーム分散液の経時安定性が良好であったことが記載されている。

リボソームを作製する方法として、これまで種々の方法が提案されている。作製方法が異なると、最終的に出来上がったリボソームの形態およぴ特性もまた著しく異なることが多い（特開平 6-80560号公報）。そのため所望するリボソームの形態、特性に応じて製造方法を適宜選択することが行なわれている。一般にリポソームは、リン脂質、ステロール、レシチンといった脂質成分を、ほとんど例外なくまず有機溶媒、たとえばク口口ホルム、ジクロロメタン、ェチルエーテル、四塩化炭素、酢酸ェチル、ジォキサン、 THFなどとともに容器中で溶解、混合することにより調製されている。特にクロル系溶媒が良く用いられている。このようなリボソームの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。残存するこれらの有機溶媒を除去するために、多段階の工程おょぴ長時間の処理を要しているのが現状である。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒については、生体に及ぼす悪影響、たとえば副作用が懸念される。本発明に使用するリボソームを調製するには、有機溶媒、特にクロル系有機溶媒を使用しないため上記の問題点を回避できる超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリボソーム調製法を利用する。二酸化炭素の臨界温度が 31. 1°C、臨界圧力が 75. 3 k^cm²と比較的扱いやすく、不活性なガスゆえ残存しても人体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどといった理由により好適である。さらにこの方法により作製されたリボソームは、後記するように X線造影剤のヨウド系化合物を内包するのに種々の好ましい特性おょぴ利点を有している。

超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用してリポソームを作製する場合、上記脂質膜成分を、超臨界状態（亜臨界状態を含む）にある二酸ィヒ炭素に溶解、分散または混合することが必要となる。その際、低級アルコール、グリコール、ダリコールエーテルなどのアルコールを溶解助剤として 1種または 2種以上併用することは、上記脂質膜成分の溶解性が一層向上するために望ましい。たとえばアルコール類を超臨界二酸化炭素の 0. 1〜10質量％、好ましくは、 1〜8質量％の割合で助溶媒として使用するのがよい。このうち、より好ましい溶解助剤は、安全性の観点からエタノールである。

本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、通常 25〜200°C、好ましくは 31〜100° (：、さらに好ましくは 35〜80°Cである。好適な圧力は、通常 50〜500 kgん m²、好ましくは 100〜400 kgん m²、特に好ましくは 90〜： 150 kg/cm²の範囲である。

本発明の X線造影剤に使用するリボソームの好適な調製方法は、具体的には以下のように行なわれる。圧力容器に液体二酸化炭素を加え、上記の好適な圧力および温度のもとにある超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素にリポソーム膜成分としてリン脂質および脂質膜安定化物質を溶解または分散する。膜脂質成分として上記リン脂質を、好ましくは力チオン性リン脂質、ポリアルキレンォキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンォキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類、ダリコール類から少なくとも 1種選ばれた化合物とともに混合して溶解する。あるいは予めこれらの化合物を加えた圧力容器に液体二酸化炭素を加え、次いで温度、圧力を調整して超臨界状態にして混合する。弓 Iき続き生成したリン脂質および脂質膜安定化物質を含有する超臨界二酸化炭素中に、非イオン系ョウド化合物、必要に応じて後述の製剤助剤を含む水溶液を添加する。なお、添加する側と加えられる側を逆にしてもよい。系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出すると、ヨウド系化合物を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。この場合、該リボソームの内部以外の水相にヨウド系化合物が含まれていてもよい。リポソーム内部にも上記水溶液が封入されているため、ヨウド系化合物はリポソ一ムの外部水相のほか、主としてリボソーム内部の水相に存在し、いわゆる「内包」の状態にある。さらに該リポソームを 0. 1〜0· 4μ ηιの孔径を有する濾過膜を通す。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明の X線造影剤が調製される。

超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比ベてリボソームの生成率、封入する物質の内包率、封入物質のリボソーム内の保持率が高いことが示されている（上記特許文献 3参照）。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、実質的に有機溶剤を使用せずに非ィオン性かつ水溶性の物質を効率よくリボソームに封入することができる本法は、本発明の X線造影剤の製造には有用な方法である。なお、実質的にとは、造影剤中の濃度の上限値が 10 μ g/ Lであることを意味する。

本発明の X線造影剤に含有されるリボソームは、好ましくは実質的に 1枚膜リポソーム、すなわちリン脂質二重層が 1 つの層としてなる膜（unilamellar vesicle) で構成されるリボソームである。ここで「実質的に」とは、以下の凍結かつ断（Freeze fracture ) レプリカ法による透過型電子顕微鏡 (T EM) 観察において、レプリ力が概ね 1つの層として認められるリン脂質二重層によりリポソームが構成されていることをいう。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを一枚膜と判定し、 2つ以上の段差が認められるものを「多層膜」と判定される。本発明の X線造影剤において、このような 1枚膜リボソームを、造影剤中に含まれる全リボソーム量のうち、少なくとも 8 0 %、好ましくは 9 0 %以上含むものである。

このような一枚膜リボソームは、脂質類の溶媒として上記の超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用し、水による相分離方法により効率よく作製できる。これに対し、従来のリボソーム作製方法では、様々なサイズ、形態の多重層膜 (multilamellar vesicles ; ML V) からなるリボソームがかなりの割合で存在することが多い。そのため、一枚膜リボソームの比率を高めるためには、超音波を照射する力一定孔サイズのフィルターに何度も通すなどの操作をさらに必要としていた。 1枚膜リボソームは、 ML Vと比較して、リボソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点もある。

一枚膜リボソーム、特に大きい一枚膜リボソームである L U V (Large unilamellar veislcles) は、多重層リボソームに比べて、大きい封入容量を提供するという利点がある。本努明の造影剤に使用するリボソームは、粒径が 200 〜1000nmの L U Vと、粒径が 50nm未満の小さ、一枚膜リボソームである S U V (Small unilamellar vesicles) との中間に位置する。このため、保持容積も S U Vより大きくなり、水溶性ヨウド系化合物のトラップ効率、換言すると内包効率も、後述するように格段に優れたものとなる。また、 M L V、 L UVと違い、細網内皮系細胞に取り込まれて急速に血流から消失することもない。

しかしながらヨウド系化合物の内包効率が良好な 1枚膜リボソームでも、内包するヨウド系化合物の重量が相対的に多過ぎるとリポソームの安定性は低下する。特にイオン強度の急激な変化には弱い傾向が観察されていた。本発明の造影剤のリボソームは、比較的小さい粒径に調整し、リボソーム膜にポリアルキレンォキシド基を有する化合物（たとえばリン脂質）およぴまたはステロール類を含有させて、脂質膜の安定化を図っている。その結果、そうしたリボソームは、塩ショックに対しても安定的であることが判明した。

リボソーム粒子のサイズとその分布は、本発明の X線造影剤が目指す、高い血中滞留性、ターグティング性、送達効率と密接に関わっている。粒径（粒子径）はョゥド系化合物を内包するリポソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕 T EM法）により測定することができる。ここで「平均粒径」とは、観察された造影剤粒子 2 0個の径の単純平均を指している。粒径の調整は、処方またばプロセス条件で行なうことができる。たとえば、上記の超臨界の圧力を大きくすると形成されるリボソーム粒径は小さくなる。作製するリボソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリカーボネート膜、セルロース系の膜などで濾過してもよい。この場合、濾過膜として 0. 1〜0. 4μ ιηの孔径のフィルターを装着したエタストルーダーに通すことにより、 1枚膜の平均粒径として 0. 5// m以下である最適寸法のリポソームを効率よく調製することができる。押出しろ過法については、たとえば Biochim. Biophys. Acta 557卷， 9ページ（1979)に記載されている。このような「押出し」操作を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム外に存在するョウド系化合物の濃度の調整、リボソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去も併せて可能になるという利点もある。

上記のように受動的ターグティング能力をリボソームに持たせるには、その粒径のサイジングが重要である。特許 2619037号公報には、粒径 3000nm以上のリポソームを排除することにより、肺の毛細血管における不都合な保持が回避されると記載されている。し力し、 150〜3000nmの粒径範囲のリボソームは、必ずしも向腫瘍性とはならない。

本努明の造影剤におけるリポソームの平均粒径は、通常 0. 05〜0. δ ίζ η 好ましくは 0. 05~0. 3 m、より好ましくは 0. 05〜0· 2 ί ΐη、特に好ましくは 0· 05〜0. 13 である。 X線撮像の目的に応じて、平均粒径を適切に設定してもよい。たとえば腫瘍部分の選択的撮像目的の場合には、特に 110〜130nmが好ましい。リポソームの平均粒径を ₀· ΐ〜0. 2 μ πι、より好ましくは 0. 11〜0. 13 mの範囲に揃えることにより癌組織へ選択的に X線造影剤を集中させることが可能となる。これは「E P R効果」として知られている。固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓' (fenestra) の孔サイズ、 30〜80nm未満に比べて異常に大きく、約 lOOnm〜約 200nmの大きさの分子でも血管壁から漏れ出る。すなわち E P R効果は、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものである。

血管壁の孔から漏れ出た造影剤は、痛細胞の周辺にはリンパ管が充分に発達していないため、血管に再ぴ戻らずその場に長く留まる。 E P R効果は、血流を利用する受動的な輸送であることから、それが有効に発現するための要件として、血中滞留性の向上が図られねばならない。つまり造影剤粒子（ョゥド系化合物を内包するリボソーム粒子）が、血中に長くとどまって、癌細胞近くの血管を何度も通過することが求められる。本発明の X線造影剤は、特に大きい粒子でもないため、細網系内皮細胞による捕獲の対象になりにくい。またリボソームがいわば赤血球類似の姿と挙動をしていて腎臓を経由して速やかに排出されることはなく、さらにステルス（隠蔽）化されている場合には細網系内皮細胞に貪食されることもなく、血流中に比較的長くとどまる。 E P R効果により、必然的に標的の臓器、組織への造影化合物の移行性が高まり、造影剤の癌組織への選択的集中と蓄積が達成される。造影化合物の腫瘍細胞/正常細胞集積比の上昇は、 X線造影剤のコントラスト性能を高める。このような腫瘍描出性の改善は、これまで検出困難であった微小転移性癌の発見すらも可能とする。

X線造影剤

本発明の X線造影剤において、リボソームによる造影物質の保持の効率は、リポソーム構造の安定ィ匕ならぴに造影物質の内包安定化を通じて改善されている。本発明の造影剤は、好ましくは上記リボソームの膜内部の水相とそのリポソ一ムが分散されている水性媒体との両方に、少なくともヨウド系化合物および製剤助剤を含有し、該膜内外でそれぞれの濃度が実質的に同一である。ここで「実質的に」とは、通常の場合、ほとんど濃度が同一であることをいう。

「製剤助剤」とは、製剤化に際し、造影物質とともに添加されるものであり、これまでの造影剤製造技術に基づいて各種の物質が使用される。具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、 E D TA Na₂— Ca、 E D T A Na₂などのキレートィ匕剤、さらに必要に応じて、浸透圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤として α - トコフエロール、ァスコルビン酸、粘度調節剤などが挙げられる。好ましくは、水溶性ァミン系緩衝剤おょぴキレート化剤をともに含める。 p H緩衝剤としては、ァミン系緩衝剤および炭酸塩系緩衝剤が好ましく用いられるが、さらに好ましくはアミン系緩衝剤であり、中でもトロメタモールが望ましい。キレート化剤は好ましくは、 E D T A Na₂— Caである。

また、水性媒体とは、ヨウド系化合物、製剤助剤などを溶解する水をベースとする溶媒である。

リボソームの膜内部の水相（封入された水溶液）以外の水溶液（すなわち該リポソームが分散されている水性媒体）にも少なくともヨウド系化合物の他に、製剤助剤（たとえば水溶性アミン系緩衝剤、キレート化剤など）が含まれている。したがって、該膜内外で著しい浸透圧差が生じることはなく、これによりリポソ一ムの構造安定性が維持される。

X線造影の良好なコントラスト性能を可能とする標的臓器へのヨウ素の必要な送達量は、明らかにされている（たとえば特許 2619037号公報）。本発明のようにヨウド系化合物をリボソームというマイクロキヤリヤーに封入する場合には、造影物質の送達効率おょぴ保持安定性に加えてリボソームの膜脂質の重量も考慮されねばならない。リポソ一ムの膜脂質の重量が多くなると造影剤の粘度が大きくなる。リボソーム内へのヨウド系化合物の封入量として、リボソーム内に封入された水溶液中に、ヨウド系化合物がリボソーム膜脂質重量に対して、 1〜 10、好ましくは 3〜8、より好ましくは 5〜8の重量比で含有されていることが望ましい。

リポソ一ム水相にカプセル化されたヨウド系化合物の重量比が 1未満であると、比較的多量の脂質を注入することが必要となり、結果的に造影物質の送達効率が悪くなる。特許 2619037号公報の記載によると、当該比が 1でも当時の技術水準からは高い値とされていた。 X線造影剤の粘度は、リボソームの脂質量にも左右されるため、保持容積および内包効率に優れる一枚膜リボソームの優位性は明らかである。反対に、リボソーム膜脂質重量に対するヨウド系化合物の封入重量比が 10 を超えると、リボソームが構造的にも不安定となり、リボソーム膜外へのヨウド系化合物の拡散、漏出は貯蔵中または生体内に注入された後でも避けられない。またリボソーム懸濁薬剤が製造され、分離した直後は 100%の封入が達成されても、浸透圧効果による不安定化に基づき、早くも短時間に封入成分が減少していくことが記載されている（特表平 9一 505821号公報）。

本発明の方法により製造される X線造影剤は、ョウド含有量として、通常、想定される 10〜300mlの製剤溶液の投与量では、 30〜500mgl/mlであり、好ましくは 100〜500mgl/ml、より好ましくは、 150〜300mgl ml の範囲である。また本発明の製剤溶液の粘度（ォスヮルド法で測定した場合）は、 3 7 °Cで、 20 mPa · s以下、好ましくは 18 m P a - s以下、より好ましくは 15 mPa · s以下である。以上より、特に腫瘍描出性おょぴリポソ一ムの造影物質保持性が改善されたより望ましい実施態様の一例は、

脂質膜を有するリボソームを含み、該リボソームはその脂質膜にポリアルキレンォキシド基を有する化合物（たとえばポリアルキレンォキシド修飾リン脂質）および Zまたはステロール類を含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有している。さらに該リボソームは平均粒径が 0. 05〜0. 2 ζ ιηである 1枚膜リボソームであり、ヨウド系化合物を脂質膜重量に対して 3〜8 の重量比で含有し、かつ、リポソーム内に封入されたョゥド化合物が全ョゥド化合物の 5〜25 質量％であることを特徴としている X線造影剤である。

本発明の X線造影剤は、投与後も含有していたリボソームが体内で必要な時間、安定的に維持されるように、体内の浸透圧に対し、等張の溶液または懸濁液の形で調製することが望ましい。そうした溶液もしくは懸濁液の媒質として、水、緩衝液、たとえばトリスー塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、クェン酸緩衝液などを使用することができる。

上記溶液もしくは懸濁液の好ましい p H範囲は、室温で 6. 5〜8. 5、さらに好ましくは 6. 8〜7. 8 である。 X線造影物質が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場合、好ましい緩衝液は、米国特許第 4278654号に記載されているような負の温度係数を有する緩衝液である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、特に好ましくは.トリス（TRIS) である。このタイプの緩衝液は、オートクレープ温度で低い p Hを有し、このことがオートクレープ中の X線造影剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容される p Hに戻る。したがって、注射用無菌造影剤を製造するために、リボソーム調製物をォートクレープ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。しかしォートクレープ滅菌を適用できないリポソームには、ろ過滅菌を行なうのがよい。

等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提供する濃度で、造影剤を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。たとえば造影化合物の溶解性が低いために造影化合物だけでは等張液を提供できない場合、等張の溶液もしくは懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、たとえば塩ィ匕ナトリウムのごとき塩類、マン二トール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添加してもよい。

本発明の X線造影剤は、注射剤または点滴注入剤として、非経口的に、具体的には血管内投与、好ましくは静脈内投与により被験者に投与され X線照射により撮像される。その用量は、従来のヨウド系造影剤に準じる。リボソーム内のヨウド総量、またはそれとリポソーム外のヨウド総量の和が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。

本発明の X線造影剤は、リボソームの膜内部の水相とそのリボソームが分散されている水性媒体との両方に、少なくともヨウド系化合物および製剤助剤を含有しており、該膜内外ではそれぞれの濃度が実質的に同一である。このことは、同

—ョウド系化合物が、同一 X線造影剤中で、異なる存在形態で共存していることを意味する。このような造影物質の態様は、診断的検査において次のような有利な場合があることを指摘できる。すなわち、本発明の X線造影剤を用いることにより、カプセルィヒされていない造影物質とリポソーム内にカプセル化された造影物質との体内拡散時間の違いが、経時的に分布挙動の異なった画像を与えて診断上の有益な情報を提供することがある。

実際の診断的検査においては、本発明の X線造影剤を、コンピュータ断層撮影装置（CT) と組み合わせた X線撮影装置に使用することにより、その造影剤性能をさらに有効に発揮することも期待される。たとえば肝臓腫瘍をコンピュータ断層撮影（C T) 診断する場合、投与直後にリボソーム内にカプセル化されていない造影物質は、肝臓類洞の間隙を自由に通過して肝臓実質細胞に到達し、まず健康な肝臓組織の画像濃度が上昇するが、これは急速に低下する。この濃度低下は弓 Iき続いて同時に起こるリボソーム造影剤からの補強により補償されて長時間にわたり造影物質の高濃度が維持される。この遊離した非カプセル化造影物質が分布挙動に差異を示すことから、組織状態についての詳細な分析が可能となる。本発明に係る X線造影剤は、中心粒径を揃えた 1枚膜リボソームを含み、好ましくはその脂質膜中にポリアルキレンォキシド基を有する化合物および Zまたはステロ一ル類を含んで!/、る。さらにリポソ一ムの膜内部の水相とそのリポソ一ムが分散されている水性媒体との两方に、少なくともヨウド系化合物および製剤助剤を含有し、好ましくは該膜内外でそれぞれの濃度が実質的に同一である。これらに基づいてリボソーム構造の安定性おょぴ封入物質の保持安定性が改善されている。

本発明造影剤の造影物質は血中滞留性が良好であり、 E P R効果が発揮され、その結果、目的とする疾患部位または組織、とりわけ癌組織に選択的に集中し蓄積する。造影後は、該ョウド系化合物が水溶性であるため、いずれ体外へ排泄される。さらにカプセル化されていない造影物質とリポソーム内にカプセル化された造影物質との体内拡散時間の違いが、経時的に分布挙動の異なった画像を与えて診断上の有益な情報を提供する。

上記リボソームの製造は、リン脂質などを超臨界二酸化炭素に溶解して作製する方法を採用するため、有毒な溶媒、特に毒性の高いクロル系溶媒を使用する必要がない。

本発明に係る X線造影剤は、従来の X線造影剤に比べて使用量が少量で済み、毒性、副作用がはるかに軽減されている。したがって、その投与を受ける患者の負担は少ない。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。

〔試験〕

リポソームの形態およぴ粒径調製した造影剤中のリボソームの粒径およぴ構造を凍結破碎法により透過型電子顕微鏡 (T EM) で調べた。すなわち、リボソーム分散液を液体窒素にて急速に凍結し、凍結状態で破碎してリボソームの内部構造を露出させる。破碎面をカーボン蒸着し、形成されたカーボン膜を透過型電子顕微鏡で観察した。

平均粒径（粒子径）は、観察された造影剤粒子 2 0個の径の単純平均とした。リポソーム粒子の構造は、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを「一枚膜」と判定し、 2つ以上の段差が認められるものを「多層膜」と判定した。 2 0個の粒子を観察し、一枚膜構造のものが 8割以上であるものを実質的に一枚膜リボソームと判定した。

ョウド化合物のョウドの定量

リボソーム分散液を等張の食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添カロしてリボソームを破壌して、吸光度の測定によりリボソーム内のヨウド化合物量を求めた。

【実施例 1】

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) と二酸化炭素とをステンレス製オートクレープにエタノールとともに仕込み、オートクレープ内を 60°C、 300kg/cm²にして撹拌して、超臨界二酸化炭素中に DPPCを溶解させた。この超臨界二酸化炭素溶液を撹拌しながら、ィオメプロール溶液（ィオメプロール 816. 5mg を注射用水にて加温溶解し、これに 20 となるようにァスコルビン酸を加えて溶解し、さらにトロメタモールを lmg加えて溶解した。希塩酸にて p Hを生理的 p Hに調整した。最後に注射用水を加えて 1. 0mlに仕上げた溶液）を定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸ィヒ炭素を排出し、ィオメプロ一ルを含有するリボソームの分散液を得た。さらに得られた分散液をガラスパイアル中に入れ、 121 °C、 20分間オートタレープ滅菌し造影剤とした。

得られた造影剤中のリボソームの粒径を凍結破碎 T EM法により測定した。造影剤中のリボソームの平均粒径は 0. 13 u mであった。また同法による形態観察によると、出来上がったリボソームは、一枚膜のリボソームであった。

【実施例 2】

実施例 1で得られた造影剤を等張グルコース液で希釈して、 50mg ヨウ素/ ml の濃度とした。この液をラットに静脈内注射したところ、特に肝臓に集中して分布することが X線画像で観察された。また時間経過とともに肝臓中の造影レベルは、その他すベての器官造影レベルと並行して減少し、ィオメプロールの大部分は尿中に排泄されたことが認められた。

【実施例 3】

実施例 1で得られた造影剤を等張グルコース液で希釈して、 50mg ヨウ素 Zml の濃度とした。この液を多数の肝癌転移を有するラットに静脈注射した。腫瘍転移部分は造影レベルが高く、直径約 5膽の腫瘍が観察された。さらに腫瘍部分造影レベルの低下は、時間経過とともにその他の器官の造影レベルより遅かった。【実施例 4】

圧力および温度をコントロールして、平均粒径が 0. 07 t m、 0. 18 m, 0. 22 m のリボソームを作製した以外は実施例 1と同様にして造影剤を作製した。

【実施例 5】

ォキシエチレン単位が 2000の PEGを 40g添加した以外は実施例 1と同様にして造影剤を作製した。その平均粒径は 0. 12 であった。

【実施例 6】実施例 4およぴ実施例 5で作製した造影剤を実施例 2と同様にして評価した。実施例 4で作製した造影剤は、粒子径にかかわらず注射後、特に肝臓に集中して分布することが X線画像で観察された。実施例 5で作製した造影剤は、実施例 4 で作製した造影剤と比べて肝臓への集中が少なかつた。

【実施例 7】

実施例 4および 5で作製した造影剤を実施例 3と同様にして評価した。

平均粒径 0. のリポソームを含む造影剤は、腫瘍部分造影レベルが実施例 3の造影剤と比較して造影レベルの低下速度が速かつた。

平均粒径 0. 18 mのリポソームを含む造影剤は、腫瘍部分造影レベルが実施例 3の造影剤と比較して低下したものの、造影レベルの低下速度が遅くなつた。平均粒径 0. 22 μ mのリボソームを含む造影剤は、腫瘍部分造影レベルが実施例 3の造影剤と比較して造影レベルが著しく低下した。

実施例 5で作製した造影剤は、腫瘍部分造影レベルが実施例 3の造影剤と比較して高く、造影レベルの低下速度が遅かった。

【比較例 1】

従来のリボソーム作製方法において、リン脂質などを超臨界二酸化炭素の代わりに有機溶媒に溶解して、リボソームを含む分散液を作製し、 X線造影剤を調製した。出来上がったリボソームは一枚膜のリボソームではなかった。実施例 3と同様にして評価した結果、腫瘍部分造影レベルが実施例 3の造影剤と比較して著しく低下していた。

この結果から明らかなように、リン脂質などを超臨界二酸化炭素に溶解して作製した X線造影剤は、従来の、有機溶媒に溶解して作製した X線造影剤と比較して、癌造影性が良い。【実施例 8】

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 0. 04g と、アデカネ土製「プル口ユック F- 88 (ポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドのプロック共重合体）（F- 88) 1. 2mg、エタノール 0· 9gの混合物をステンレス製オートクレープに仕込み、オートクレープ内を 60°Cに加熱し、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gを加えた。ォートクレープ内の圧力を 50kg/cm²から 200kg/cm²にまで加圧し、オートクレープ内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中に DPPC を溶解させた。この超臨界二酸ィ匕炭素溶液を撹拌しながら、ィォへキソール溶液 647mg/mL (ョゥド含有率 300mg/mL)、トロメタモールを 1. 21mg/mL、ェデト酸カルシウム 2ナトリゥム 0. lmg/mLを含有し、適量の塩酸およぴ水酸化ナトリウムで p Hを 7前後に調整した溶液 5 gを定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、ィォへキソールを含有するリボソームの分散液を得た。同じ作業を数回繰り返して得られた分散液を 60°Cまで加熱し、了ドパンテック社製のセルロース系フィルター、 0. 1 / mで加圧濾過した。 0. l /z mのフィルターで加圧濾過して得られるリポソ一ムの粒径は 0. 15 / m以下である。得られた造影剤を試料 1とした。

上記造影剤中のリポソームの平均粒径は 0. 12 mであり、実質的に一枚膜のリポソームであった。上記試料の脂質重量に対するリポソーム内に内包されているョゥド系化合物のヨウド量の比は、 5. 6であった。

【実施例 9】

圧力を高圧側に調整すること、減圧速度を調整すること、使用リン脂質量を変更した以外は、実施例 8と同様にして、アドパンテック社製のセルロース系フィルター、 0, で加圧濾過して、リボソームの分散液を得て、これを試料 2とした。試料 2中のリボソームは、凍結破砕法による T E M観察で、実質的に一枚膜リボソームであった。粒径などの結果を表 1に示す。

【実施例 10】

圧力を高圧側に調整すること、減圧速度を調整すること、使用リン脂質量を変更した以外は、実施例 8と同様にして、アドバンテック社製のセルロース系フィルター、 Ο. ΐ μ πιで加圧濾過して、リボソームの分散液を得て、これを試料 3とした。試料 3中のリボソームは、凍結破砕法による Τ ΕΜ観察で、実質的に一枚膜リポソームであった。粒径などの結果を表 1に示す。

【実施例 11】

圧力を高圧側に調整すること、減圧速度を調整すること、使用リン脂質量を変更した以外は、実施例 8と同様にして、アドパンテック社製のセルロース系フィルター、 0. l mで加圧濾過して、リボソームの分散液を得て、これを試料 4とした。試料 4中のリボソームは、凍結破砕法による T EM観察で、実質的に一枚膜リボソームであった。粒径などの結果を表 1に示す。

【実施例 12】

圧力を高圧側に調整すること、減圧速度を調整すること、使用リン脂質量を変更した以外は、実施例 8と同様にして、アドパンテック社製のセルロース系フィルター、で加圧濾過して、リボソームの分散液を得て、これを試料 5とした。試料 5中のリボソームは、凍結破碎法による T EM観察で、実質的に一枚膜リボソームであった。粒径などの結果を表 1に示す。

【比較例 2】

従来のリボソーム作製方法において、リン脂質などを超臨界二酸化炭素の代わりに有機溶媒に溶解し、使用リン脂質量を変更することによりリボソームを含む分散液を作製した。これにより 2種の X線造影剤（試料 6および 7 )を調製した。出来上がったリボソームは一枚膜のリボソームではなかった。粒径などの結果を表 1に示す。

【実施例 13】

家兎の皮下に V X 2カルシノーマの細胞浮遊液を移植した。移植 2週間後に、実施例 8で得た造影剤を静脈注射し、注射後に X線画像で観察した。時間経過とともに造影レベルは減少する力移植部分については造影レベルの減少は遅かつた。

同様に実施例 9〜； 12 で作製した造影剤試料 2〜 5およぴ比較例 2で作製した造影剤試料 6、 7ならびに、特許第 2619037号明細書の実施例 2の試料 2 Bを再現して作製した試料（試料 8、比較例 3 ) についても同様の評価を行った。その結果を表 1に示す。

癌造影性に関する評価として、表 1では次のように表示する。

◎ 移植部分の造影レベルの減少は、他の部分と比べ、明らかに遅い

〇移植部分の造影レベルの減少は、他の部分と比べ、多少遅い。

Δ 移植部分の造影レベルの減少は、他の部分と比べ、変化が無い。

X 移植部分の造影レベルの上昇が、小さい。

表 1

表 1から明らかなように、リボソームの粒径が 0. 5 t m より大きい試料 8の癌造影性は、他の試料と比較して著しく低下した。

また、リン脂質などを超臨界二酸化炭素に溶解して作製した試料 1〜 5は、従来の、有機溶媒に溶解して作製した試料 6〜 8と比較して、癌造影性が良い。【実施例 14】

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 0. 04g と、アデカネ土製プルロニック F-88 (ポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドのプロック共重合体） 1. 2mg、エタノール 0. 9g の混合物をステンレス製オートクレープに仕込み、オートクレープ内を 60°Cに加熱し、次いで液体二酸化炭素 13gを加えた。ォートクレープ内の圧力を 50kg/cm²から 200kg/cm²にまで加圧し、ォートクレーブ内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中に DPPC を溶解させた。この超臨界二酸化炭素溶液を撹拌しながら、ィォへキソール溶液 647mg/mL (ョウド含有率 300mg/mL) 、トロメタモールを 1. 21mg/mL、ェデト酸カルシウム 2ナトリウム（E D T A Na₂ -Ca) 0. Img/mLを含有し、適量の塩酸おょぴ水酸化ナトリウムで p Hを 7前後に調整した溶液 5 gを定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸化炭素を排出し、ィォへキソールを含有するリボソームの分散液を得た。得られた分散液を 60°Cまで加熱し、アドパンテック社製のセルロース系フィルター、 0. 1 πιで加圧濾過した。得られた造影剤を試料 9とした。

試料 9中のリボソームについて上記試験を行った結果、その平均粒径は 0. 12 mであり、実質的に一枚膜のリボソームであった。上記試料 9の脂質重量に対するリボソーム内に内包されているヨウド系化合物のョウド量の比は、 5. 6であつた _D

圧力を高圧側に調整すること、減圧速度を調整すること、セルロース系フィルター、 Ο. Ι /^ πκ 0. 2 t mおよび 0. 4/_ί Πΐを使用したこと、使用リン脂質量を変更した以外は、上記と同様にすることによりリボソームの分散液を得て、これらを試料 10~15とした。

さらにオートクレープにジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 0. 04g と、コレステロール 0. 01 gおよびアデカネ土製プル口ニック F- 88 (ポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドのプロック共重合体） 1. 2mg、ェタノール 0. 9g の混合物をステンレス製ォートクレープに仕込んだ以外は、上記の試料 9の場合と同様にすることにより、試料 16を作製した。また、プル口ニック F- 88を用いない他は、試料 16の場合と同様にして試料 17を得た。

さらにプル口ニック F- 88 を用いない以外は、試料 9の場合と同様にして、試料 18を作製した。試料 9〜18のすべてが、一枚膜のリボソームであった。

各試料中のリボソームについて、粒径などの測定結果を表 2に示す。表 2

【実施例 15】

実施例 14で得られた試料 9〜18を生理食塩水中に添加し、密閉後に 42°Cに加温して 3日間放置した。得られたサンプルおよび加熱前の試料を光学顕微鏡で観察した。

加熱前の試料はすべて光学顕微鏡で微粒子が観察されなかったが、加熱後は、試料 18については、リボソーム粒子の合一と見られる数 μ πιの微粒子が観察された。また試料 17 はリボソーム粒子の合一と思われる微粒子がわずかに観察された。さらに 4日間加温を行うと、試料 9〜： 15もリボソーム粒子の合一と見られる微粒子がわずかに観察された。しかし、試料 16 については変化が認められなかつた ₀

この結果から明らかなように、ポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドのプロック共重合体またはコレステロールを使用するリボソームを含有する造影剤を用いることにより、安定性の向上を可能とする。

【実施例 16】

実施例 14で得られた試料 9〜18を等張グルコース液で希釈して、 50mgョゥ素 Znilの濃度とした。この液をラットに静脈内注射したところ、試料 17および 18 は、特に肝臓に集中して分布することが X線画像で観察された。

この結果から明らかなように、ポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドのプロック共重合体を使用しないリボソームを含有する造影剤を用いることにより、肝臓の選択的な造影を可能とする。

【実施例 17】

家兎の皮下に V X 2カルシノーマの細胞浮遊液を移植した。移植 2週間後に、実施例 14で得た試料 9〜： 18を家兎に静脈注射し、注射後に X線画像で観察した。試料 9、 10、 11、 12、 14、 16を用いた場合には、試料 13、 15、 17、 18と比較して家兎の移植部分の造影レベルの減少は遅かった。

【実施例 18】

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 0. 032g、コレステロール 0. 008g およびアデカネ土製プル口ニック F- 88 (ポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドのプロック共重合体） 1. 2mg、エタノール 0. 9gの混合物をステンレス製ォ一トクレープに仕込み、オートクレープ内を 60°Cに加熱し、次いで液体二酸化炭素 13gを加えた。オートクレーブ内の圧力を 50kg/cm²から 200kg/cm²にまで加圧し、オートクレープ内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中に DPPC を溶解させた。この超臨界二酸ィ匕炭素溶液を撹拌しながら、ィォへキソール溶液 647mg/mL (ヨウド含有率 300mg/mL) 、トロメタモールを 1. 21mg/mL、ェデト酸カルシウム 2ナトリゥム（E D T A Na₂-Ca) 0. lmg/mLを含有し、適量の塩酸おょぴ水酸化ナトリゥムで p Hを 7前後に調整した溶液 5 gを定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、ィォへキソールを含有するリボソームの分散液を得た。得られた分散液を 60°Cまで加熱し、ァドバンテック社製のセル口ース系フィルター、 0. l /x mで加圧濾過した。得られた造影剤を試料 19とした。上記方法により求めた試料 19中のリボソームの平均粒径は 0. 12 mであり、実質的に一枚膜のリポソームであった。上記試料の脂質重量に対するリポソーム内に内包されているョウド化合物のョウド量の比は、 3. 7であり、全ョウド化合物のうち、リボソーム内のヨウド化合物の比率は、 23質量％であった。

圧力を高圧側に調整すること、減圧速度を調整すること、セルロース系フィルター、 0. 1 μ πι、 0. 2 i mおよび 0. 4μ ηιを使用し、使用リン脂質量を変更した以外は、試料 19 の場合と同様にすることによりリボソームの分散液を得て、これらを試料 20〜25とした。試料 20〜25中のリボソームは、実質的に一枚膜のリポソームであった。これらの試料のリボソーム粒径、脂質重量に対するリボソーム内に内包されているョウド化合物のョウド量の比、全ョウド化合物に対するリポソーム内のヨウド化合物の比率を表 3に示す。

さらにジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 0. 024gおよぴコレステロール 0. 006gを用いて、圧力および減圧速度を調整した以外は、試料 19の場合と同様にすることにより、試料 26を作製した。

また、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 0. 048gおよぴコレステロール 0. 012 gを用いて、圧力および減圧速度を調整した以外は、試料 19 の場合と同様にすることにより、試料 27を作製した。

試料 26および 27中のリボソームは実質的に一枚膜のリボソームであった。これらの試料のリボソーム粒径、脂質重量に対するリボソーム内に内包されているョゥド化合物のヨウド量の比、全ョゥド化合物に対するリポソーム内のヨウド化合物の比率を表 3に示す。

ェデト酸カルシウム 2ナトリウム（E D T A Na₂— Ca) を使用しないこと以外は、試料 19〜27の場合と同様にして試料 29〜37を作製した。試料 29〜37中のリポソームは実質的に一枚膜のリポソームであった。これらの試料のリポソーム粒径、脂質重量に対するリボソーム内に内包されているョウド化合物のヨウド量の比、全ョゥド化合物に対するリポソーム内のヨウド化合物の比率を表 3に示す。これによると、ェデト酸カルシウム 2ナトリウムを使用した場合とほぼ同一であつた o

トロメタモールを使用しない以外は、試料 19〜27の場合と同様にして試料 39 〜47を作製した。試料 39〜47中のリポソームは実質的に一枚膜のリボソームであった。これらの試料のリボソーム粒径、脂質重量に対するリボソーム内に内包されているヨウド化合物のョウド量の比、全ョウド化合物に対するリボソーム内のョウド化合物の比率を表 3に示す。これによると、トロメタモールを使用した場合とほぼ同一であった。

試料 19〜27、 29〜37、 39〜47 について、得られたリボソーム分散液を等張の食塩水で透析し、リボソームが分散されている水性媒体のヨウド化合物と製剤助剤の濃度を、リボソーム膜内の水相の濃度より下げた比較試料 119〜127、 129〜 137、 139〜147を作製した。これらの試料のリボソーム平均粒径、脂質重量に対するリボソーム内に内包されているョウド化合物のヨウド量の比、全ヨウド化合物に対するリポソーム内のヨウド化合物の比率を表 3に示す。

【実施例 19】

安定性評価

実施例 18で得た試料を生理食塩水中に添加し、密閉後、 42°Cに加温して 14日間放置した。得られたサンプルおよぴ加熱前の試料を光学顕微鏡で観察した。加熱前の試料はすべて光学顕微鏡で微粒子が観察されなかったが、加熱後は、一部の試料については、リボソーム粒子の合一と見られる数 /z mの微粒子が観察された。安定性を次の基準で評価した。すなわち、

5 ：合一粒子なし

4 ：合一粒子がごく僅かにある。

3 ：合一粒子が明らかに観察される。

2 ：合一粒子が多い。

1 ：合一粒子が極めて多い。

結果を表 3に示す。

【実施例 20]

表 3力、ら明らかなように、リポソーム内外の水溶性成分に差があるとリポソ一ムの安定性は低下する。また 0. 1〜0. 4 mの孔径を有する濾過膜を通した試料は、同じ中心粒径でも安定性が向上する。

反対に、リボソーム内外の水溶性成分に差がない場合、水溶性アミン系緩衝剤ゃキレート化剤が存在するとさらに安定性が向上する。

表 3

封入ヨウド系化封入ヨウド系化合物リポソ .4 平均安試料一 0.1〜0

合物のリポソ

ム内外濃孔径濾粒径一の X線造影剤におけ No. 定ム膜脂質に対する全ョウド化合物に過膜処理 (ium) 性対する質量％

19 なしなし 0.12 3.7 23 4

20 なしあり 0.07 3.4 21 5

21 なしあり 0.095 3.2 20 5

22 なしあり 0.12 3.8 24 5

23 なしあり 0.15 3.7 23 5

24 なしあり 0.18 4.0 25 5

25 なしあり 0.21 3.9 24 5

26 なしあり 0.12 6 28 5

27 なしあり 0.12 2.5 23 5

29 なしなし 0.12 3.7 23 4

30 なしあり 0.07 3.4 21 4

31 なしあり 0.095 3.2 20 4

32 なしあり 0.12 3.8 24 4

33 なしあり 0.15 3.7 23 4

34 なしあり 0.18 4.0 25 4

35 なしあり 0.21 3.9 24 4

36 なしあり 0.12 6 28 4

37 なしあり 0.12 2.5 23 4

39 なしなし 0.12 3.7 23 4

40 なしあり 0.07 3.4 21 4

41 なしあり 0.095 3.2 20 4

42 なしあり 0.12 3.8 24 4

43 なしあり 0.15 3.7 23 4

44 なしあり 0.18 4.0 25 4

45 なしあり 0.21 3.9 24 4

46 なしあり 0.12 6 28 4

47 なしあり 0.12 2.5 23 4

119 ありなし 0.12 3.7 23 2

120 ありあり 0.07 3.4 21 3

121 ありあり 0.095 3.2 20 3

122 ありあり 0.12 3.8 24 3

123 ありあり 0.15 3.7 23 3

124 ありあり 0.18 4.0 25 3

125 ありあり 0.21 3.9 24 2 表 3 (続き)

一封入ヨウド系化封入ヨウド系化合物リポソ 0.1〜0.4 平均安合物のリポソ一の X線造影剤におけム内外濃 β孔径濾粒径定 No. ム膜脂質に対する全ヨウド化合物に度差過膜処理 (^m) 性対する質量％

126 ありあり 0.12 6 28 2

127 ありあり 0.12 2.5 23 3

129 ありなし 0.12 3.7 23 2

130 ありあり 0.07 3.4 21 3

131 ありあり 0.095 3.2 20 3

132 ありあり 0.12 3.8 24 3

133 ありあり 0.15 3.7 23 3

134 ありあり 0.18 4.0 25 2

135 ありあり 0.21 3.9 24 2

136 ありあり 0.12 6 28 2

137 ありあり 0.12 2.5 23 3

139 ありなし 0.12 3.7 23 2

140 ありあり 0.07 3.4 21 2

141 ありあり 0.095 3.2 20 2

142 ありあり 0.12 3.8 24 2

143 ありあり 0.15 3.7 23 2

144 ありあり 0.18 4.0 25 2

145 ありあり 0.21 3.9 24 2

146 ありあり 0.12 6 28 2

147 ありあり 0.12 2.5 23 2

Claims

請求の範囲

1. 水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を含有するリポソームを含み、しかも実質的にクロル系溶剤を含まないことを特徴とする X線造影剤。

2. 前記リボソームが、リン脂質を超臨界二酸ィ匕炭素もしくは亜臨界二酸ィ匕炭素に混合させ、水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を該リン脂質に接触させることにより形成されたリボソームであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

3. 前記リボソームが、実質的に一枚膜リボソームであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

4. 前記ヨウド系化合物が、 2， 4， 6—トリョードフエ二ル基を少なくとも 1個有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

5. 前記リポソームの平均粒径力 0. 05〜0. 5// mであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

6. 前記リボソームの平均粒径力 S、0. 05~0. 2 u mであることを特徴とする請求の範囲第 5項に記載の X線造影剤。

7. 前記リボソームの平均粒径が、 0. 11〜0. 13 mであることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の X線造影剤。

8. 前記リポソームは、ォキシエチレン単位が 10〜3500の PEGを、該リポソ一ムを構成する脂質に対して 0. 1〜30質量⁰ /₀含んでなる PEG化リボソームであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

9. 前記リボソームが、 0. 1〜0. 4 111の孔径を有する濾過膜を通されていることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

10. 前記リボソームが、前記ヨウド系化合物をリボソーム膜脂質に対して、 1 〜； 10 の重量比で含有していることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

11. 前記リボソームが、前記ヨウド系化合物をリボソーム膜脂質に対して、 3 〜 8の重量比で含有していることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の X 線造影剤。

12. 前記リボソームが、前記ヨウド系化合物をリボソーム膜脂質に対して、 5 〜 8の重量比で含有していることを特徴とする請求の範囲第 1 1項に記載の X 線造影剤。

13. 前記リボソーム内に封入されたヨウド系化合物が、全ョゥド系化合物の 5 〜3 0質量％であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の X線造影剤。

14. 前記リボソームが、その脂質膜にポリアルキレンォキシド基を有する化合物、ステロール類から少なくとも 1種選ばれる化合物を含有し、かつその脂質膜内の水相に前記ョゥド系化合物を含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

15. 前記リボソームが、その脂質膜にポリアルキレンォキシド修飾リン脂質を含有し、かつその脂質膜内の水相に前記ヨウド系化合物を含有していることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

16. 前記リボソームが、その脂質膜にポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドとのブロック共重合物を含有し、かつその脂質膜内の水相に前記ヨウド系化合物を含有していることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

17. 前記リボソームが、その脂質膜内の水相と前記リボソームが分散されている水性媒体との両方に前記ヨウド系化合物および製剤助剤を含有し、リボソーム膜内外でそれぞれの濃度が実質的に同一であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の X線造影剤。

18. 前記製剤助剤が、水溶性アミン系緩衝剤、キレート化剤から少なくとも 1 種選ばれる化合物であることを特徴とする請求の範囲第 1 7項に記載の X線造影剤。

19. 前記水溶性アミン系緩衝剤が、トロメタモールであることを特徴とする請求の範囲第 1 8項に記載の X線造影剤。

20. 前記キレート化剤が、 E D T A Na₂— Caであることを特徴とする請求の範囲第 1 8項に記載の X線造影剤。

21. リポソームを形成するリン脂質を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素に混合させ、 7溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物をリン脂質に接触させることにより形成されたリボソームを含有する X線造影剤の製造方法。

22. リポソームを形成するリン脂質を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素に混合させ、水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物の水溶液を導入し、次いで二酸化炭素を排出してリボソームを形成することを特徴とする請求の範囲第 2 1項に記載の製造方法。

23. 前記二酸化炭素の圧力が、 50〜500 kgん m²であることを特徴とする請求の範囲第 2 1項に記載の製造方法。

24. 前記二酸化炭素の温度が、 25〜200°Cであることを特徴とする請求の範囲第 2 1項に記載の製造方法。

25. リボソーム膜成分として、リン脂質とともにポリアルキレンォキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンォキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類から少なくとも 1種選ばれる化合物を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸ィ匕炭素に混合させた後、ョゥド系化合物の水溶液を導入し、二酸化炭素を排出して、ヨウド系化合物を内部に含有するリボソームを形成し、さらに該リポソームを 0. 1〜0· Α μ mの孔径を有する濾過膜を通すことを特徴とする請求の範囲第 2 2項に記載の製造方法。

26. リボソーム膜成分として、リン脂質とともにポリアルキレンォキシド修飾リン脂質、ステロール類から少なくとも 1種選ばれる化合物を超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素に混合させた後、ョゥド系化合物および製剤助剤を含む水溶液を導入し、二酸化炭素を排出して、さらに形成されたリボソームを 0. 1 〜0· 4 ί Πΐの孔径を有する濾過膜を通し、最終的にヨウド系化合物およぴ製剤助剤が該膜内外でそれぞれ実質的に同一濃度で含有されるリポソームを形成することを特徴とする請求の範囲第 2 2項に記載の製造方法。