JP5370153B2 - 造影剤用化合物含有糖修飾リポソーム及び造影剤 - Google Patents

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Description

本発明は、造影剤への利用に好適なリポソームおよび当該リポソームを含有する造影剤(リポソーム製剤)に関する。
肝臓がんの診断においては、超音波診断、ダイナミックCT、および必要であればMRI用造影剤「リゾビスト」(登録商標)を用いる手法を標準化する動きがある。最も利用されているのはダイナミックCTであり、ヨード系造影剤による血流情報や肝細胞への拡散の違いにより病変を検出する。一方、リゾビスト(超常磁性体酸化鉄)は、肝臓の類洞内にあるクッパー細胞(免疫細胞)に異物として認識され、貪食を受けることにより取り込まれるが、このクッパー細胞はがん組織にはないことから、がん部と正常部にコントラストが生まれ、がんが検出される。この造影剤は肝臓特異性造影剤またはクッパー細胞特異性造影剤ともよばれ、通常の造影とは違った、生体の機能を反映した画像である、いわゆる「機能性画像」を評価することができることから注目されている。なお、「フェリデックス」(登録商標)も、リゾビストと同様、MRI用造影剤として利用されているものの一つである。
一方、ダイナミックCT用の肝臓特異性造影剤の検討も、20年以上前から検討されている。たとえば、油溶性造影剤である「リピオドール」(登録商標)を利用したオイルエマルションタイプのEOE−13(粒径2μm程度)はその一つである。しかし、一定程度の造影効果は得られるが、粒径がμmオーダーと大きいことや、油溶性ヨード造影剤を用いていることが原因と推定される副作用が大きいことから、現在では利用されていない。
かかる造影剤の改良発明として、特許文献1には、ダイナミックCT用リポソーム製剤として、リポソーム膜に水素添加ホスファチジルコリン(HEPC)および水素添加ホスファチジルセリン(HEPS)を含み、イオジキサノール(ヨード系X線造影剤)などを内包するリポソーム製剤が開示されている。このリポソーム製剤は分散安定性が良好で、オートクレーブ耐性も高いが、クッパー細胞に集積するにしても特異性が十分ではない、あるいは粘度が高いといった影響があるためか、製品化には至っていない。
なお、特許文献2には、糖脂質を有するリポソームとオリゴヌクレオチドとの複合体を用いて、クッパー細胞に当該オリゴヌクレオチドを送達させることが開示されており、また、特許文献3には、糖鎖がリポソーム膜に結合されている糖鎖修飾リポソームを含む炎症性疾患治療用または診断用医薬組成物の発明が開示されている。しかし、これらのいずれの文献にも、そのようなリポソームに肝臓がんの診断などに用いられる造影剤用化合物を内包させることは具体的に記載されておらず、かかるリポソームを含有する造影剤により特徴的な機能性画像が得られることを示唆する記載も全くない。
特許第3759765号公報(特開平07−316079号公報) 特開2006−193488号公報 国際公開第05/011633号パンフレット
本発明の第一の目的は、特に肝臓がんの診断への利用に好適な造影剤(特に、X線用造影剤やMRI用造影剤)を提供することであり、第二の目的は、診断と同時に治療も行える治療薬兼診断薬として機能する薬剤を提供することである。
本発明者が鋭意検討した結果、造影剤用化合物を内包するリポソームを糖(特にマンノース)で修飾することにより、積極的にクッパー細胞に取り込ませることが可能となり、非修飾リポソームやセリン修飾リポソームに比べて造影性能が高く、診断に十分に使用できるとの知見を得た。さらに驚くべきことに、このようなリポソームを用いた場合、得られる造影画像におけるがん病変の周縁部が、単純撮影や従来の造影剤(セリン修飾リポソーム、フェリデックス、リゾビスト等)を用いた場合には見られない、著しく白く濃染される現象(これを本発明者は「目玉焼き現象」と呼んでいる。)が起こり、かかる新規なタイプの画像は、肝臓がんの診断のために極めて好適であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明のリポソームは、造影剤用化合物を内包し、かつ、表面が糖で修飾されていることを特徴とする。上記「糖」は、マンノースであることが好ましい。また、本発明のリポソームは、後述の一般式(1)で表されるコレステロール誘導体により表面が糖で修飾されていることが好ましいが、特にこれに限定されるものではない。
本発明のリポソームが含有する造影剤用化合物としては、X線造影剤用化合物(特に非イオン性ヨード造影剤)またはMRI造影剤用化合物(特に水溶性Gd錯体)が好ましい。
また、本発明のX線造影剤およびMRI造影剤は、上記のリポソームを含有するものであり、必要に応じてさらに抗がん剤を含有してもよい。
本発明によるリポソームを用いた造影剤(特にX線用またはMRI用造影剤)を用いることにより、従来の造影剤を用いたのでは見られなかった新規な機能性画像が得られるようになり、肝臓がんの病変の検出性を向上させることが可能となる。また、同時に抗がん剤を内包すれば、がん周囲に集積するので、がんの治療と診断を同時に行うことが可能になる。
水準1(マンノース修飾リポソームA、内包ヨード量90mgI/kg)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像。 水準2(マンノース修飾リポソームA、内包ヨード量180mgI/kg)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像。 水準3(マンノース修飾リポソームB)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像。 造影画像における目玉焼き現象のイメージ図。 水準5(セリン修飾リポソームA)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像。 水準7(イオヘキソール240mgI/ml)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像。 水準8(リゾビスト)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像。 水準9(フコース修飾リポソームA)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像 水準10(グルコース修飾リポソームA)の投与前(a)および投与20分後(b)の造影画像
符号の説明
1 肝臓
2 腫瘍部
リポソーム表面の糖での修飾
本発明のリポソームは、表面が糖で修飾されていることを特徴とする。ここで言う表面とは、リポソームを形成する膜の表面を表し、リポソームには内水相と外水相があるが、その外水相側の膜の表面のことを表す。また、表面と言ってはいるが、糖の機能が発揮できる限りは、ある程度、リポソーム膜に入り込んでいてもよい。また、ここで言う修飾とは、化学的な結合、物理的な結合のいずれか、あるいは両方で、リポソームを形成する膜と結合していることであり、しっかりとした化学結合はもちろんのこと、複合的な結合や、ゆるい吸着等もこれに含まれる。
修飾のための手法としては、以下に述べるように、a)通常のリポソームを調製した後に、その表面を糖で修飾する、あるいはb)糖を有する脂質(糖脂質)若しくは糖を有するコレステロール(糖修飾コレステロール)をリポソーム膜の構成成分として使用してリポソームを調製する、といった方法が挙げられる。
上記a)の方法としては、糖で修飾されていない通常のリポソームを調製した後、そのリポソーム膜を構成する脂質分子にリンカー(スペーサー)分子を介して糖が結合するよう反応させる方法が挙げられる。このようにして糖で修飾する方法は公知であり、たとえば、ヒト血清アルブミン等のリンカータンパク質および架橋用2価試薬を介してルイスX型三糖鎖等を結合する方法が開示されている、特開2003−226638号公報などの文献を参照することができる。
また、a)のもう一つの方法としては、コレステロール、長鎖炭化水素等をアンカーとして利用する方法がある。すなわち、糖とこれらアンカーとをあらかじめ結合させておき、通常のリポソームを調製した後にこれを添加して膜上に埋め込むことにより糖で修飾することができる。特に、コレステロールは、糖で修飾するためのアンカーとして好適である。このようにして糖で修飾する方法は公知であり、非特許文献(寺田弘、吉村哲郎編著(1992)、ライフサイエンスにおけるリポソーム実験マニュアル、309−310項、シュプリンガー・フェアラーク東京)にも記載されている。
ここで、本発明のリポソームに導入される「糖」は、各種の単糖のみならず、単糖が2〜600分子程度連結した二糖類ないしオリゴ糖を含むものとして定義される。
このような糖としては、フコース、マンノース、グルコース、アロース、アルトース、ギュロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトース、エリトロース、トレオース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、リポアラビノマンナン、ルイスX型三糖、シアリルルイスX型四糖などが挙げられる。これらのうち、特にマンノースは、クッパー細胞へのターゲティング性に優れるため好適な機能性画像が得られるようになり、本発明で用いるのに好適な糖である。なお、このような糖は、クッパー細胞の表面上に存在する公知のレクチン(糖鎖認識タンパク質)に対して結合活性を有する糖(たとえばマンノース)に限られるものではなく、その他の糖(グルコース等)であっても機能性画像を得ることができる。
一方、上記b)の方法において用いることのできる糖脂質としては、グリセロ糖脂質(ジガラクトシルジグリセリド、ジマンノシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル、ジマンノシルジグリセリド硫酸エステル、ガラクトシルジグリセロール、ジマンノシルグリセロール等)や、スフィンゴ糖脂質(マンノセレブロシド、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4等)などが挙げられる。これらの糖脂質をリポソームの原料に配合することによっても、表面が糖で修飾されたリポソームが得られる。
また、前述のa)の方法において後に添加して用いた糖修飾コレステロールを、b)の方法においてはじめから原料に含めて用いることもできる。この場合の糖修飾コレステロールとしては、マンナンコレステロール、または、特願2006−353771号明細書に記載のコレステロール誘導体、特開2006−193488号公報(前記特許文献2)に記載のマンノースやフコースで修飾されたコレステロール誘導体などが挙げられる。
上記「特願2006−353771号明細書に記載のコレステロール誘導体」とは、具体的には、以下の一般式(1)で表される化合物である。
一般式(1)において、Gはヒドロキシル基と糖が糖のアノマー位でエーテル結合を形成した一価の残基を表し、該糖は単糖、二糖、三糖、多糖の全てのアルドペントース、アルドヘキソースを表すが、好ましくはアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、ギュロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトロース、トレオース、セロビオース、フコース、マルトース、イソマルトース、ラクトースまたはマルトリオロースを表す。〜線は糖のアノマー位の立体が、α体及び/又はβ体であることを表すが、α体、β体それぞれの単独であっても良いし、α体、β体の任意の比率での混合物であってもよい。Jは二価のアルキレン基を表わすが、直鎖でも分岐していても良く、好ましくは直鎖のアルキレン基である。炭素数の合計は2〜12であることが好ましいが、特に好ましくは2〜6である。該アルキレン基は置換基を有していてもよいが、好ましくは無置換である。該置換基として具体的には、アルコキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルファモイル基、スルホンアミド基、エステル基等が挙げられる。
<糖の修飾量>
前述のa)の方法、すなわち通常のリポソームを調製した後にその表面を糖で修飾する場合、たとえば、アンカーである糖修飾コレステロールを、通常のリポソームを調製するために用いた膜構成成分に対して、通常5〜20mol%、好ましくは10〜20mol%の範囲で配合すればよい。
また、前述のb)の方法、すなわち糖脂質または糖修飾コレステロールをリポソーム膜の構成成分として使用してリポソームを調製する場合、糖脂質および糖修飾コレステロールのどちらの場合も、構成成分全量に対して、通常5〜20mol%、好ましくは10〜20mol%の範囲で配合される。
リポソームに内包される化合物
本発明のリポソームは、以下に挙げるような造影剤用化合物(造影物質)を内包するものであり、投与の際に抗がん作用を期待する観点からは、さらに以下に挙げるような抗がん剤を内包することも好ましい。
なお、公知のリポソーム製剤と同様、本発明のリポソームを含有する造影剤についても、下記の造影剤用化合物、抗がん剤、その他の薬剤類は、リポソームに内包されるだけでなく、さらにその外液に含まれていてもよい。
この抗がん剤を含有した造影剤は、造影剤を内包した方法と同様の方法で内包することができる。また、肝がん周囲に集積する目玉焼き現象を生じるため、抗がん剤としての効果が期待できると共に、病変の経過観察にも有用であることが推測される。
<造影剤用化合物>
本発明における造影剤用化合物としては、X線、MRI、光診断、PET、超音波などに用いられる各種の造影剤用化合物が挙げられるが、空間分解能などの面で優れており、良好な機能性画像が得られることから、X線用造影剤用化合物またはMRI用造影剤用化合物とすることが特に好適である。
本発明で用いることのできるX線造影剤用の化合物としては、たとえば、イオメプロール、イオパミドール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオキシラン、イオシミド、イオベンゾール、イオトロラン、イオジキサノール、イオデシモル、イオタスル、メトリザミド、1,3-ビス-(N-3,5-ビス-(2,3-ジヒドロキシプロピルアミノカルボニル)-2,4,6-トリヨードフェニル)-N-ヒドロキシアセチル-アミノ)-プロパンなどの非イオン性ヨード化合物が挙げられる。なかでも、高度に親水性であり、高濃度でも浸透圧が高くならない点から、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールが好適である。
一方、本発明で用いることのできるMRI造影剤用の化合物としては、ガドリニウムとキレート化剤(NTA, EDTA, HEDTA, DTPA, DTPA-BMA, BOPTA, TTHA, NOTA, DOTA, DO3A, HP-DO3A, EOB-DTPA, TETA, HAM, DPDP, ポルフィリン等)とからなる錯体が挙げられる。たとえば、Gd-DOTA(ガドテル酸メグルミン)、Gd-DTPA(ガドペンテト酸メグルミン)、Gd-BOPTAなどは特に好適である。
造影剤用化合物は、造影剤の送達の効率性およびリポソームの安定性の観点から、内包される化合物のリポソームの脂質膜に対する重量比(造影剤用化合物の重量/脂質膜重量)は所定の範囲内にあることが望ましい。たとえば、造影剤化合物として非イオン型ヨード系化合物またはガドリニウム系化合物を使用する場合は、いずれの場合についても、上記重量比は、通常1〜8、好ましくは3〜8程度とされる。
本発明の造影剤について、外液にも造影剤用化合物が含まれている場合、造影剤用化合物のリポソーム中への内包率(造影剤中に含まれている全造影剤用化合物のうち、リポソームに内包されているものの割合(質量%)。詳細は後述の実施例に示す。)は、内包する造影剤用化合物の種類や態様の他、症状あるいは造影検査の種類ごとに適宜選択することができるが、好適な内包率は10〜40%程度である。また、外液に造影剤用化合物が含まれていない場合は、内包率としては100%となるが、造影剤中のリポソームの数を、外液に造影剤用化合物が含まれていて内包率が上記範囲にある場合と同等になるように調整することが好ましい。
<抗がん剤>
本発明で用いることのできる抗がん性物質としては、たとえば、アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、5−フルオロウラシル、イリノテカンが挙げられる。
また、がん細胞の増殖にとって重要な遺伝子の働きを抑制する核酸類(DNAもしくはRNAのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、mRNAなど)、たとえば、抗がん活性を有するsiRNA(small interfering RNA)も、本発明における抗がん剤の一態様として挙げられる。
<その他の薬剤類>
本発明の造影剤には、必要に応じて、その他の薬剤、製薬助剤等を、リポソームに内包させるか、または水溶液に溶解させることにより配合しても良い。
上記薬剤としては、たとえば、リソマイシン、レボフロキサシン、ストレプトマイシン、リファンピシン、アムホテリシンB、ナイスタチン、ミデカマイシンなどの抗菌剤;インターフェロン、エリスロポエチン、インターロイキン、ポルフィルンなどの生体内物質;その他水溶性ビタミン、アスコルビン酸ジパルミタート、ヘスペリジン、ルチン、ナリンジン、ジゴキシンといった水溶性非電解質の薬剤類が挙げられる。
また、上記製薬助剤としては、たとえば、水溶性アミン系緩衝剤(トロメタモール等)、炭酸塩系緩衝剤などのpH緩衝剤;エデト酸系キレート化剤(EDTANa-Ca等)などのキレート化剤;α−トコフェロール、アスコルビン酸などの抗酸化剤;その他、浸透圧調節剤、安定化剤、粘度調節剤、保存剤、無機塩類、あるいは血管拡張剤、凝固抑制剤などの薬理的活性物質が挙げられる。
リポソームの製造
<膜構成成分>
本発明のリポソームを形成する脂質膜は、前述のように糖で修飾されている以外は通常のリポソームと同様であり、リポソーム膜の成分として一般的に用いられているもの、たとえば、リン脂質、ステロール類、グリコール類、脂肪族アミンなど、各種の公知の化合物を原料とすることができ、また、これらの膜構成成分の配合比についても、リポソームの安定性や、リポソーム膜表面の電位(ゼータ電位)などの性状を考慮しながら、公知の適切な範囲内で調節すればよい。
たとえば、リン脂質としては、大豆レシチン、卵黄レシチン、精製品である、大豆ホスファチジルコリン(SPC)、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、水素添加大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、水素添加卵黄ホスファチジルコリン(HEPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジミリストリルホスファチジルコリン(DMPC)、ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)、ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール(DPPI)、ジステアロイルホスファチジルイノシトール(DSPI)、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、ジステアロイルホスファチジン酸(DSPA)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンや、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
また、ステロール類としては、たとえば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、ラノステロールといったステロール誘導体が挙げられる。ステロール類を使用する場合、リポソーム膜の安定性への寄与などの観点から、リン脂質/ステロール類のモル比は、一般的には100/60〜100/90、好ましくは100/70〜100/85の範囲が好ましい。
さらに、必要に応じて、その他の所定の機能性を賦与するための化合物を、リポソーム膜の構成成分として組み合わせて用いてもよい。たとえば、グリコール類を用いることにより、リポソームに内包させる薬剤類の保持効率を向上させることができる。また、膜構成脂質にポリオキシアルキレン基を導入することにより、リポソームの表面が親水性になり、リポソームの安定性が向上(崩壊性・凝集性などが改善)し、体内で異物として認識されなくなるといった効果が得られる。さらに、脂溶性脂質を膜成分に含むリポソームは、経口投与・腸管吸収の経路による取り込みの効率が高くなると考えられる。
<製造方法>
本発明のリポソームは、従来のリポソームと同様の、公知の工程、方法、条件、装置等により製造することができる。
リポソームの製造方法としては、たとえば、「薄膜法(バンガム法)」、「超音波法」、「逆相蒸発法」、「凍結融解法」、「コアセルベーション法」、「マイクロカプセル化法」(特開2001-139460号公報等参照)、「膜乳化法」、「超臨界二酸化炭素法」(特開2005-162678号公報等参照)などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、その他の好適な方法を適宜用いることも可能である。
本発明のリポソームは造影剤用化合物や必要に応じて抗がん剤などを内包するが、そのための方法も特に制限されるものではない。たとえば、水溶性の薬剤を用いる場合、上記のような方法におけるリポソーム膜を形成する工程で、これらの薬剤類が溶解した水性溶媒を用いることで初めから薬剤類を内包するリポソームを調製するようにしてもよく、あるいは、薬剤類を内包しない空のリポソームを調製し、必要に応じて一旦凍結乾燥し、その後、内包させるべき薬剤類の溶解した水性溶媒中で撹拌することにより、その薬剤類を空のリポソームに取り込ませてもよい。また、油溶性の薬剤を用いる場合は、上記のような方法におけるリポソーム膜を形成する工程で、脂質を溶解する溶媒に一緒に溶解した溶液を用いるか、溶媒を用いない場合は、脂質と固体状態(あるいは液体状態)で混合したものを用いてもよい。あるいは、水溶性薬剤の時と同様に、一旦、空のリポソームを形成し、それに油溶性薬剤を添加し、その後、水相を添加する等してもよい。
また、リポソーム分散液は、リポソーム膜の外と内に水相を有しているが、内包する造影剤用化合物が水溶性の場合、その外液に、造影剤用化合物があっても、なくても良い。
また、リポソームを調製した後さらに、リポソームの粒径分布をリポソーム製剤として使用するために好適な範囲内に揃える目的のために、静圧押出装置等を用いる濾過工程を設けることが好ましい。たとえば、リポソームの中心粒径を50〜300nm程度とすれば、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどないと同時に、がん組織近辺の血管にできる間隙を通過できるといった利点を有する。
リポソームの用途
上述のような本発明のリポソームを用いることにより、がん病変の周縁部が著しく白く濃染されるという優れた機能性画像が得られる造影剤を製造することができる。このような現象は、X線用、MRI用、その他の造影剤のいずれについても同様に起こると推定されるが、機能性画像の有用性等の面から、空間分可能の比較的高い診断ツールを用いた方がよく、本発明の造影剤はX線用造影剤およびMRI用造影剤とすることが好ましく、特にX線用造影剤とすることが好ましい。
これらの造影剤の製造や投与に当たっては、本発明のリポソームを用いる以外は従来のリポソーム製剤と同様の態様、方法を適用することができる。
たとえば、注射剤、点滴剤などの非経口投与で用いる造影剤とする場合は、これらの薬剤で一般的に用いられている水性溶媒等に本発明のリポソームを懸濁させるようにすればよい。また、本発明のリポソームは、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口投与で用いる態様の薬剤とすることもできる。
また、X線検査用の造影物質であるヨード系化合物や、MRI検査用の造影物質であるガドリニウム系化合物の至適濃度および必要な造影剤量(造影剤濃度×投与造影剤量)は、化合物の種類や態様の他、症状あるいは造影検査の種類ごとに設定するのが通例であり、当業者によって適切な調整が可能である。一般的には、X線造影剤にあっては、ヨウ素原子として5〜600mgI/kg体重とされ、また、MRI用造影剤にあっては、ガドリニウム原子として7〜32mgGd/kg体重の範囲で投与される。本発明の造影剤は、リポソームの外液に造影剤用化合物を含有するか否かによっても投与量は変動しうるが、外液に造影剤用化合物が含まれている場合、従来の造影剤と同等〜15%程度の投与量で用いることで、優れた機能性画像を撮ることができる。
以下の記載において、特に断らない限り、[ml/kg]の単位は、投与対象の体重1kgあたりの投与量[ml]を表す。
造影剤含有糖修飾リポソームの調製
[実施例1]
(マンノース修飾リポソームAの作製)
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)409mg、コレステロール126mg、下記式で表されるマンノース修飾コレステロール(1)64mgを溶解した12.1mlのエタノール溶液を、マツボー社製超臨界流体式リポソーム製造装置(反応容器の容量:300ml)に仕込み、容器内を60℃に保ちながら二酸化炭素を導入した。容器内の圧力を初期値の5MPaから圧縮装置を用いて13MPaにまで上げた。その後、撹拌機で、600rpmで攪拌しながら、240mgI/mlイオヘキソール水溶液(X線造影剤)35.5mlを0.87ml/minで添加した。添加終了後、この圧力、温度と攪拌条件で1時間接触操作を行った後、系内を減圧して二酸化炭素を排出して、マンノース修飾リポソームAの分散液を得た。
(溶媒除去)
この分散液を、高圧蒸気滅菌器STH307FA(アドバンテック社製)で121℃、30分の条件で処理することにより、エタノールを除去した。
(整粒操作)
エクストルーダ(日本油脂社製)と、0.8μm、0.4μmおよび0.2μmの3種類のポリカーボネートフィルター(アドバンテック社製)を用意した。リポソーム分散液をエクストルーダに入れ、80℃においてN2ガス0.3MPaの圧力で各フィルターについて2回ずつ加圧ろ過を行い、整粒したリポソーム分散液を得た。
(濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整)
この分散液に対して、ウルトラフィルター(アドバンテック社製、分画分子量20,000)を用いて限外濾過することにより濃縮し、所望の内包率(この場合、20%)のマンノース修飾リポソームAの分散液を得た。
この分散液をリン酸緩衝食塩水(PBS)で25倍に希釈し、ナノトラック粒度分布測定装置UPA-EX150(日機装社製)で粒径測定を行ったところ、体積平均粒径は160nmであった。
上記操作を必要なバッチ数行い、実験に必要な量を確保した。
以下の比較例、実施例において、整粒操作、粒径測定については全て上記と同じ方法、条件で行った。また、造影剤用化合物の内包率の測定方法ついては後述の通りとした。
[実施例2]
エタノールに溶解するリポソーム膜形成成分を、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)409mg、コレステロール145mg、マンノース修飾コレステロール(1)32mgに変更した以外は、実施例1と全く同じ処方、条件で製造し、マンノース修飾リポソームBを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は160nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例3]
マンノース修飾コレステロール(1)を下記式で表されるマンノース修飾コレステロール(2)に変更した以外は、実施例1と全く同じ処方、条件で製造し、マンノース修飾リポソームCを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は160nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例4]
マンノース修飾コレステロール(1)を下記式で表されるフコース修飾コレステロール(1)に変更した以外は、実施例1と全く同じ処方、条件で製造し、フコース修飾リポソームAを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は165nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例5]
マンノース修飾コレステロール1を、下記式で表されるグルコース修飾コレステロール(1)に変更した以外は、実施例1と全く同じ処方、条件で製造し、グルコース修飾リポソームAを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は160nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例6]
内包する薬剤をマグネビスト(MRI造影剤)に変更した以外は実施例1と同様にして、マンノース修飾リポソームDを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は170nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例7]
内包する薬剤をマグネビストに変更した以外は実施例3と同様にして、マンノース修飾リポソームEを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は160nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例8]
内包する薬剤をマグネビストに変更した以外は実施例4と同様にして、フコース修飾リポソームBを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は165nm、薬剤内包率は20%であった。
[実施例9]
内包する薬剤をマグネビストに変更した以外は実施例5と同様にして、グルコース修飾リポソームBを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は170nm、薬剤内包率は20%であった。
[比較例1]
エタノールに溶解するリポソーム膜形成成分を、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)409mg、ジパルミトイルホスファチジルセリン41mgに変更した以外は実施例1と全く同じ処方、条件で製造し、セリン修飾リポソームAを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は170nm、薬剤内包率は21%であった。
[比較例2]
エタノールに溶解するリポソーム膜形成成分を、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)409mg、コレステロール164mg(マンノース修飾コレステロール(1)は加えない)に変更した以外は実施例1と全く同じ処方、条件で製造し、未修飾リポソームAを得た。濃縮によるリポソーム分散液の内包率の調整後の平均粒径は180nm、薬剤内包率は19%であった。
(造影剤用化合物の内包率の測定)
造影剤用化合物(ヨード系造影剤またはガドリニウム系造影剤)内包リポソームの分散液50μlを採取し1.8%生理食塩水950μlを加えて遠心分離(6,000rpm、20分)を行った。得られた上清および残渣(リポソーム)を完全に分離した後、各々アルコールを加えて溶解し20mlに仕上げた。ヨード系造影剤については波長約245nm、ガドリニウム系造影剤については波長約280nmにおける吸光度を測定し、内包造影剤用化合物の吸光度と造影剤用化合物の濃度の検量線に基づき、リポソームに内包される造影剤用化合物の質量および系内の全造影剤用化合物の質量を計算して、以下の式で造影剤用化合物の内包率を求めた。ここで、リポソーム内包造影剤用化合物質量は残渣から測定された造影剤用化合物質量、全造影剤用化合物質量は上清と残渣から測定された造影剤用化合物質量の和とする。
造影剤用化合物内包率(%)
=リポソーム内包造影剤用化合物質量/全造影剤用化合物質量×100
造影試験
上述の実施例および比較例で作製したリポソーム分散液を用いて、正常ウサギおよび担癌ウサギを用いた肝臓の造影試験を行った。撮影は、下記の撮影プロトコルに準じて適切な医用X線CT装置を用いて行った。
<撮影プロトコル>
スキャン・モード:Axial 5i x 4
SFOV:Head
管球回転速度:0.4 sec/rot.
管電圧:120 kVp
管電流:500 mA
DFOV:15 cm
再構成アルゴリズム:Standard
スライス厚:5 mm
撮影枚数:20 スライス
〔正常ウサギ造影試験〕
各サンプル(表1記載)を正常ウサギ(2.5〜3.0kg)に所定量(内包率により異なるが、おおよそ2ml/kg程度)注入し、注入後30秒から60分に渡って、肝実質のCTを計測した。注入後のCT値から注入前のCT値を差し引いてΔCT値を求めた。
結果は表1に示すとおりである。本発明の造影剤含有糖修飾リポソームは、比較例に対し、優位に肝臓の実質細胞を濃染することがわかった。
〔担癌ウサギ造影試験〕
次に、表2に記載した各サンプルを担癌ウサギ(2.5〜3.0kg)に所定量(内包率により異なるが、おおよそ2ml/kg程度(下記水準2はその2倍量)。リポソームに内包されたヨードの量が表2の様になるように調節して投与。)注入し、注入後30秒から60分に渡って、肝実質(非腫瘍部)および腫瘍部のCTを計測、撮影した。
また、比較として、リゾビストを用いて、1.5TのMRI装置を用いて、一般的なT2撮像条件(long TE)で撮像した。
水準1〜3の造影画像(図1〜3)に見られるように、X線造影剤含有糖修飾リポソームを用いた場合、腫瘍部の周辺が肝全体よりさらに白く造影される、目玉焼きに似た造影画像を呈することがわかる(図4の模式図参照。これを我々は「目玉焼き現象」と呼んでいる)。なお、撮影画像は掲載していないが、この現象は、水準4でも同様に見られた。
一方、セリン修飾リポソームの造影画像(水準5、図5)には、目玉焼き現象は見られなかった。同様に未修飾リポソーム(水準6)の造影画像にも目玉焼き現象は見られなかった。
また、イオヘキソール240mgI/mlを4ml投与したときの造影画像(水準7、図6)では、腫瘍はぼやけたままで、腫瘍周辺部がより白く濃染される目玉焼き現象は観察されなかった。市販のMRI造影剤であるリゾビストを投与したときの造影画像(水準8、図7)についても、腫瘍は見えるようになってはいるが、目玉焼き現象は見られなかった。
上記の様に、水準5〜8が、がん細胞の周囲が強く濃染される「目玉焼き現象」が観察されないのに対し、水準1〜4の造影剤含有糖鎖修飾リポソームは、がん細胞の周囲に明らかに白く強い濃染が見られる「目玉焼き現象」が確認できる。特に、水準3(図3)と水準8(図7)は、同じウサギを用いて、造影を行った結果の画像(順序としては、まず、リゾビストを投与し、MRI撮影し、その後、本発明のリポソームを投与して、CTを撮影した。)であるが、移植によりできた1.5cm程度のがんについて、リゾビストの画像(水準8(図7))、ぼやっとしてはっきりしないのに対し、本発明による画像(水準3(図3))は、「目玉焼き現象」によって、がんが縁取りされたような画像を呈するので、はっきりと病変を捉えることができ、微小ながんの検出に有利であることは明らかである。これは糖鎖修飾リポソームと造影剤(特にX線造影剤、MRI造影剤)の組み合わせでのみ発現する現象で、これまでにない新規な機能性画像を提供し、新しい価値ある診断を提供することを示唆するものである。

Claims (5)

  1. 非イオン性ヨード造影剤を内包し、かつ、表面がマンノースで修飾されていることを特徴とする肝臓がんCT診断造影剤用リポソーム。
  2. 前記表面がコレステロール誘導体によりマンノースで修飾されていることを特徴とする請求項1記載の肝臓がんCT診断造影剤用リポソーム。
  3. 前記コレステロール誘導体が下記一般式(1)で表されるコレステロール誘導体であることを特徴とする請求項2記載の肝臓がんCT診断造影剤用リポソーム。
    (式中、Gはヒドロキシル基とマンノースがマンノースのアノマー位でエーテル結合を形成した一価の残基を表し、〜線はマンノースのアノマー位の立体が、α体及び/又はβ体であることを表し、Jは二価のアルキレン基を表す。)
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の肝臓がんCT診断造影剤用リポソームを含有する造影剤。
  5. さらに抗がん剤を含む請求項4記載の造影剤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2852413A4 (en) 2012-02-16 2016-04-27 Univ Toledo XENOANTIGEN WITH VACCINES AGAINST CANCER AND MANUFACTURING PROCESS THEREFOR

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003515550A (ja) * 1999-11-30 2003-05-07 ジ・アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・アリゾナ 放射線感受性リポソーム
JP2006069895A (ja) * 2004-08-31 2006-03-16 Fuji Photo Film Co Ltd トリヨードアリール基を有するアルキルアルコールのエステル化合物
JP2006193488A (ja) * 2005-01-14 2006-07-27 Kyoto Univ 免疫担当細胞指向型オリゴヌクレオチド・リポソーム複合体
JP2006298843A (ja) * 2005-04-21 2006-11-02 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソームおよびリポソーム含有製剤の製造方法
JP2006298838A (ja) * 2005-04-21 2006-11-02 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソーム含有x線造影剤
WO2007091661A1 (ja) * 2006-02-08 2007-08-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06122634A (ja) * 1992-01-20 1994-05-06 Nippon Fine Chem Co Ltd リポソームを用いるガン診断薬およびガン治療薬
JP3759765B2 (ja) * 1994-03-28 2006-03-29 第一製薬株式会社 リポソーム
WO2008081686A1 (ja) * 2006-12-28 2008-07-10 Konica Minolta Holdings, Inc. コレステロール誘導体、リポソーム、リポソームの形成方法およびx線用造影剤

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003515550A (ja) * 1999-11-30 2003-05-07 ジ・アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・アリゾナ 放射線感受性リポソーム
JP2006069895A (ja) * 2004-08-31 2006-03-16 Fuji Photo Film Co Ltd トリヨードアリール基を有するアルキルアルコールのエステル化合物
JP2006193488A (ja) * 2005-01-14 2006-07-27 Kyoto Univ 免疫担当細胞指向型オリゴヌクレオチド・リポソーム複合体
JP2006298843A (ja) * 2005-04-21 2006-11-02 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソームおよびリポソーム含有製剤の製造方法
JP2006298838A (ja) * 2005-04-21 2006-11-02 Konica Minolta Medical & Graphic Inc リポソーム含有x線造影剤
WO2007091661A1 (ja) * 2006-02-08 2007-08-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6013003357; Biochimica et Biophysica Acta Vol.1524, 2000, p.258-265 *
JPN6013003359; 薬物動態 Vol.14, Supplement, 1999, p,S116-S117 *
JPN6013003361; 薬物動態 Vol.9, Supplement, 1994, p..S118-S121 *
JPN6013003364; Biochim Biophys Acta Vol.1511, 2001, p.134-145 *
JPN6013003366; Proceedings of the Japan Academy, Series B Vol.76, 2000, p.63-67 *

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