CN102369282B

CN102369282B - 核酸复合体及核酸转运用组合物

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Publication number: CN102369282B
Application number: CN201080010437.3A
Authority: CN
Inventors: 竹内洋文; 户塚裕一; 村田光隆; 丰福秀一
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2030-03-04
Also published as: JP5808246B2; EP2405001B1; CN102369282A; EP2405001A1; KR20110128325A; JPWO2010101226A1; EP2405001A4; US9090912B1; WO2010101226A1; CA2753703A1; ES2542874T3

Abstract

本发明的目的在于提供一种低毒性且高安全性的、可以在细胞内保持siRNA等能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子核酸复合体，并且提供一种能够有效地将该核酸复合体转运至细胞内的核酸转运用组合物。使用导入细胞内的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子和大环糊精形成复合体，由此可以得到低毒性且高安全性的、并且能够在细胞内保持该核酸分子的核酸复合体。进而，作为用于将该核酸复合体导入细胞内的核酸转运用载体，使用含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、以及(C)脂肪族伯胺的载体，由此能够进一步提高安全性、细胞内转运的有效性、及细胞内的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的持续保持能力。

Description

核酸复合体及核酸转运用组合物

技术领域

本发明涉及一种核酸复合体，所述核酸复合体的向细胞内转运能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的转运能力优异，低毒性且安全性高，并涉及一种能够有效地将该核酸复合体转运至细胞内的核酸转运用组合物。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，已经发现了多种在细胞内发挥RNA干扰功能的核酸分子。例如，已知siRNA(small interfering RNA：小干涉RNA)引起细胞中存在的靶基因的mRNA分解，阻碍靶基因表达(RNA interference：RNA干扰)。由该RNA干扰产生的阻碍靶基因表达的功能在减轻或治疗由特定基因或基因组的异常表达而引起的疾病症状方面是有用的，故人们期待开发siRNA用作治疗药物。但是，在包括siRNA的基因治疗中，由于核酸分子是具有负电荷的水溶性高分子，所以其向细胞内的基因转运效率非常低，导致无法得到有效的治疗效果的问题。

一直以来，为了将基因有效地转运到细胞内，已知有利用载体(运载体)。运载体分为病毒性运载体和非病毒性运载体。病毒性运载体显示出高核酸导入效率，但在病原性、免疫原性、细胞毒性等安全性方面存在很多不清楚的地方，因此临床应用中期望使用非病毒性运载体。

作为非病毒性运载体，已经市售有Lipofectamine^TM2000，进而，报道了一种含有特定结构的阳离子性脂质(参见专利文献1)；一种含有两亲性化合物及聚阳离子的组合物(参见专利文献2)等。使用非病毒性运载体将核酸分子转运至细胞内时如下进行：通过将应转运的核酸分子和非病毒性运载体混合进行复合化，然后将其与靶细胞接触。非病毒性运载体可以形成脂质体时，在将核酸分子封入脂质体内的状态下，导入细胞内，由此将核酸分子转运至细胞内。

但是，siRNA等能够进行RNA干扰的核酸分子由于具有稳定性低、显示强负电性这些特有性质，所以与作为非病毒性运载体的阳离子性运载体混合时，因电荷中和导致稳定性降低，存在无法持续地将核酸分子导入细胞内的问题。至此，虽然已知通过将siRNA和阳离子性聚合物制成复合体而将核酸封入脂质体的例子(参见非专利文献1)，但是从阳离子性聚合物的细胞毒性的观点考虑，还未确认到实用性上有效。进而，即使现有的非病毒性运载体能够与核酸分子形成稳定的复合体，也存在向细胞内的转运能力低、或者即使转运至细胞内复合体的滞留时间也短的问题。因此，现有的非病毒性运载体存在下述缺陷：无法在细胞内持续地保持核酸分子，也无法持续发挥基于核酸分子的期望的有用效果。

鉴于上述现有技术，迫切期望开发出下述技术，所述技术低毒性且安全性高，并且用于有效地将以siRNA为代表的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内，且持续地保持核酸分子。

专利文献1：日本特表2002-529439号公报

专利文献2：日本特表2005-508394号公报

非专利文献1：Kintaro Kogure et al.，Development of a non-viral multifunctional envelope-type nano device by a novel lipid film hydration method，J，Control，Release，98(2004)317-323

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术中的问题。具体而言，本发明的目的在于提供一种低毒性且高安全性的、可以将siRNA等能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内的核酸复合体，并提供一种能够有效地将该核酸复合体转运至细胞内的核酸转运用组合物。另外，本发明的目的在于提供一种含有核酸转运用组合物的药物组合物、及通过使核酸转运用组合物与细胞接触将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内的方法。

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过使用作为向细胞内导入的对象的核酸分子(能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子)和大环糊精(cycloamylose)化合物形成复合体，能够得到低毒性且高安全性的、并且可以将该核酸分子转运至细胞内的核酸复合体。进而，发现作为用于将该核酸复合体导入细胞内的核酸转运用载体，使用含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、以及(C)脂肪族伯胺的载体，由此能够更进一步提高安全性、及细胞内转运的有效性。本发明是基于上述发现并且进行了反复研究而完成的。

即，本发明提供下述列举的方案的发明：

项1.一种核酸复合体，其特征在于，含有选自由大环糊精及其衍生物组成的组中的至少一种大环糊精化合物、以及能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子。

项2.如项1所述的核酸复合体，其中，相对于1重量份能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子，大环糊精化合物为1～4000重量份。

项3.如项1所述的核酸复合体，其中，大环糊精化合物的聚合度为10～500。

项4.如项1所述的核酸复合体，其中，能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子为siRNA。

项5.如项1所述的核酸复合体，是通过将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子、和大环糊精化合物在水溶液中混合而得到的凝集体。

项6.一种核酸转运用组合物，含有项1至5中任一项所述的核酸复合体、及核酸转运用载体。

项7.如项6所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体为含有选自(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自由胆固醇及其衍生物组成的组中的至少一种、及(C)脂肪族伯胺的组合物。

项8.如项7所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中含有的(A)成分为酰基部分的碳原子数4～23的二酰基磷脂酰胆碱。

项9.如项7所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中含有的(B)成分为胆固醇。

项10.如项7所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中含有的(C)成分为碳原子数10～20的烷基胺。

项11.如项7所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中(A)成分∶(B)成分∶(C)成分的摩尔比为5～9∶1～5∶1。

项12.如项7所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体为由(A)～(C)成分形成脂质体膜的脂质体制剂。

项13.一种药物组合物，含有项6至12中任一项所述的核酸转运用组合物。

项14.大环糊精化合物、以及能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子在制造核酸复合体中的应用，所述大环糊精化合物是选自由大环糊精及其衍生物组成的组中的至少一种。

项15.项1至5中任一项所述的核酸复合体、及核酸转运用载体在制造核酸转运用组合物中的应用。

项16.项1至5中任一项所述的核酸复合体在制造用于将可以能够RNA干扰的核酸分子转运至细胞内的药物中的应用。

项17.一种将能够进行RNA干扰的核酸分子转运至细胞内的方法，包括使含有选自由大环糊精及其衍生物组成的组中的至少一种大环糊精化合物、以及能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的核酸复合体与细胞接触的步骤。

项18.如项17所述的转运方法，使项6至12中任一项所述的核酸转运用组合物与细胞接触。

本发明的核酸复合体是使用大环糊精化合物将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子复合化而得到的，由此安全性高，也可以被转运至细胞内，并且可以在细胞内发挥基于该核酸分子的RNA干扰效果。另外，本发明的核酸复合体容易与核酸转运用载体进行复合化，并且封入即使为脂质体形态的核酸转运用载体，也易于被封入其中，因此，从核酸转运用组合物的制备容易性的观点考虑，本发明的核酸复合体也优异。进而，本发明的核酸转运用组合物可以将上述核酸复合体导入细胞内。

另外，为了将本发明的核酸复合体转运至细胞内，作为细胞转运用载体，使用含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、以及(C)脂肪族伯胺的载体，由此能够提高将核酸复合体转运至细胞内的效率，并且还能够进一步提高细胞内转运的持续性及安全性。

如上所述，本发明的核酸复合体及核酸转运用组合物能够有效地发挥基于该核酸分子的RNA干扰效果，并且具有高安全性，所以作为基因治疗中使用的药物特别有用。因此，本发明的药物组合物、或将可以能够RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内的方法可以更有效地将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内。

附图说明

[图1]图1为表示试验例3的结果、即评价实施例2的核酸转运用组合物(脂质体化法(liposomalization)及脂质复合法(lipoplexmethod))的细胞安全性的结果的图。图中，“对照组”表示未添加实施例2的核酸转运用组合物的情况，“脂质体化法”表示添加了由脂质体化法制备的实施例2的核酸转运用组合物的情况，“脂质复合法”表示添加了由脂质复合法制备的实施例2的核酸转运用组合物的情况。

[图2]图2为表示评价在试验例4中实施例2的核酸转运用组合物(脂质体化法)中得到siRNA向细胞内的导入量的结果的图。图2的纵轴表示每1个细胞的荧光强度的平均值。图中，“脂质体化法” 表示由脂质体化法制备的实施例2的核酸转运用组合物。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

(1)核酸复合体

本发明的核酸复合体的特征在于，含有可以能够RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子及大环糊精化合物。

本发明的核酸复合体中使用的核酸分子只要能够在细胞内进行RNA干扰或者翻译抑制、且必须转运至细胞内才可以显示其效果即可，对其种类或结构没有特别限定。能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的碱基数只要在具有RNA干扰能力或者翻译抑制能力的范围内即可，例如可以举出30～80个碱基、优选为38～64个碱基、更优选为38～54个碱基。此处列举的核酸分子的碱基数，在核酸分子形成二聚物或其以上的多聚物时，表示构成二聚物或其以上的多聚物的全部碱基数。

作为能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子，包括该技术领域公知的核酸分子，例如可以举出siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA等RNA分子。其中，优选siRNA、shRNA、miRNA等低分子RNA，特别优选siRNA。siRNA具有在与现有非病毒性运载体共存下具有稳定性降低的缺陷，但通过制成本发明的核酸复合体的形态，能够兼备优异的稳定性和向细胞内转运的转运性。siRNA的有义链及反义链的碱基长只要具有siRNA干扰能力即可，没有特别限定，可以举出10～50个碱基、优选15～30个碱基、更优选19～23个碱基、特别优选21个碱基。siRNA可以具有下述结构使得有义链与反义链杂交，两末端的一方或双方可以形成突出部(悬端)，另外也可以形成平滑末端(平端)。另外，siRNA中两末端中的一方或双方形成突出部时，该突出部可以由脱氧核糖核酸(DNA)构成。

另外，关于能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的靶基因、即通过RNA干扰使得表达被抑制的、或翻译被抑制的基因，可以根据本发明的核酸复合体的使用目的等适当设定。从医学角度考虑，已知例如转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)等基因与特定的疾病具有相关性，抑制上述基因的表达对改善该特定疾病有效，举出以上述基因为靶基因的抑制RNA干扰或者翻译的核酸分子作为优选例之一。

需要说明的是，关于可以进行RNA干扰的核酸分子的碱基序列，可以根据靶基因的种类适当设计，可以使用该技术领域中公知的该碱基序列的设计方法。

本发明的核酸复合体中使用的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸分子，另外也可以通过化学合成制造得到的核酸分子。进而，上述核酸分子可以为单链、双链、三链均可，并且对其分子量也没有特别限定。另外，本发明中，能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子可以被化学、酶或肽修饰。进而，本发明中，能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子可以单独使用一种，或者也可以适当组合使用两种以上。

本发明的核酸复合体中使用的大环糊精化合物为选自由大环糊精及其衍生物组成的组中的至少一种。

大环糊精为葡萄糖经α1，4键键合的环状α-1，4-葡聚糖，在螺旋结构内侧具备具有一定深度的立体空洞部分。作为本发明中使用的大环糊精中的葡萄糖的聚合度，没有特别限定，例如可以举出10～500、优选10～100、更优选22～50。大环糊精可以利用麦芽糖转葡糖基酶等酶由葡萄糖制备。另外，大环糊精已被市售，本发明也可以使用市售品。

另外，作为本发明中使用的大环糊精的衍生物，只要为药学上允许的物质即可，没有特别限定，例如可以举出键合有甲基、乙基、丙基等烷基(碳原子数1～18)的衍生物；键合有羟基甲基、羟基丙基、羟基丙基等羟基烷基(碳原子数1～4)的衍生物；键合有单糖、寡糖、氨基糖等糖类的衍生物等。

本发明中，大环糊精及其衍生物可以单独使用一种，或者也可以组合使用两种以上。大环糊精及其衍生物中，可优选举出大环糊精。

本发明的核酸复合体中，关于上述核酸分子与上述大环糊精化合物的比率，没有特别限定，通常可以举出相对于1重量份核酸，大环糊精化合物为1～4000重量份，优选为10～1000重量份，更优选为100～400重量份。另外，从摩尔比的观点考虑，作为该比率，例如可以举出相对于1摩尔核酸分子，大环糊精化合物为0.1～1000摩尔，优选为1～100摩尔，更优选为10～20摩尔。通过满足上述比率，能够更进一步实现利用核酸转运用载体的上述核酸分子向细胞内的核酸转运性、以及安全性。

作为本发明的核酸复合体的平均粒径，通常可以举出6～60nm、优选8～40nm。核酸复合体的平均粒径使用动态激光散射法作为体积平均粒径进行测定。

本发明的核酸复合体是通过将上述核酸分子和上述大环糊精化合物凝集而形成的复合体。本发明的核酸复合体通过在可以稳定地分散上述核酸分子和上述大环糊精化合物的溶液中，将两者混合进行制造。作为上述可以稳定地分散核酸分子和上述大环糊精化合物的溶液，具体而言，可以举出Tris等缓冲液。上述缓冲液中可以含有乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂。另外，作为上述核酸分子与上述大环糊精化合物的混合条件，可以举出在上述溶液中，例如在0.1μM～100μM左右、优选1μM～10μM左右的核酸分子、与1μM～1000μM左右、优选10μM～100μM左右的大环糊精化合物共存下，在室温下混合1～100分钟左右、优选5～10分钟左右。这样制造的本发明的核酸复合体以分散于溶液中的状态存在，可以直接将其用于与核酸转运用载体混合，也可以根据需要进行稀释或浓缩后用于与核酸转运用载体混合。

(2)核酸转运用组合物

上述核酸复合体通过与核酸转运用载体混合，而进入核酸转运用载体中，使得能够将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内。即，本发明还提供含有上述核酸复合体、和核酸转运用载体的核酸转运用组合物。

此处，所谓核酸转运用载体是为了将核酸分子转运(导入)至细胞内，而用作核酸分子的载体的非病毒运载体。另外，所谓核酸转运用组合物是指为了将该组合物内含有的核酸分子导入用作转运对象的细胞内，而与用作转运对象的细胞接触的组合物。

核酸转运用载体的组成

作为本发明的核酸转运用组合物中使用的核酸转运用载体，只要可以将核酸复合体导入细胞内即可，没有特别限定。作为该核酸转运用载体，例如，可以使用Lipofectamine^TM 2000等现有公知的载体。

从进一步提高上述核酸复合体中含有的核酸分子向细胞内的转运性、并且更进一步提高向细胞内的转运效率及安全性的观点考虑，优选举出含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、以及(C)脂肪族伯胺的载体(以下记作“载体-1”)。

作为上述载体-1中使用的二酰基磷脂酰胆碱(以下有时也记作“(A)成分”)，只要是药学上允许的物质即可，没有特别限定，例如可以举出酰基部分的碳原子数4～23的物质。需要说明的是，构成该二酰基磷脂酰胆碱的2个酰基的碳原子数可以相同或不同。

作为二酰基磷脂酰胆碱的具体例，可以举出二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱、二丁酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二庚酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二苯二甲酰磷脂酰胆碱、二月桂基磷脂酰胆碱、二花生酰磷脂酰胆碱、二(二十一烷酰基)磷脂酰胆碱、二芥酰磷脂酰胆碱、二花生四烯酰磷脂酰胆碱、双(二十三烷二酰基)磷脂酰胆碱(bis(tricosadinoyl)phosphatidylcholine)等。其中，优选举出酰基部分的碳原子数为12～18的二酰基磷脂酰胆碱；更优选举出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、及棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱等酰基部分的碳原子数为13～17的二酰基磷脂酰胆碱；特别优选举出二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、及二硬脂酰磷脂酰胆碱；最优选举出二硬脂酰磷脂酰胆碱。上述二酰基磷脂酰胆碱可以单独使用一种，或者也可以组合使用两种以上。

作为上述载体-1中使用的胆固醇及/或其衍生物(以下有时也记作“(B)成分”)，只要为药学上允许的物质即可，没有特别限定。所谓胆固醇的衍生物是具有胆固醇骨架的阳离子性脂质，具体而言，可以举出3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、3β-[N’，N’，N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)、(N’，N-双胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-胆固醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterol)(BGTC)、N-胆甾烯基氧基羰基-3，7-二氮杂壬烷-1，9-二胺、β-丙氨酸-二乙醇胺-胆固醇、N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67；N4-spermine cholesterylcarbamate)、N[N4-3-氨基丙基亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-78；N[N4-3-aminopropylspermidine]cholesteryl carbamate)、N4-精胺胆固醇甲酰胺(GL-90；N4-spermine cholesteryl carboxamide)、N1，N8-双(精氨酸甲酰胺)-N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-95；N1，N8-Bis(argininc carboxamide)-N4-spermidine cholestery carbamate)、N-[N1，N4，N8-三(3-氨基丙基)亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-96；N-[N1，N4，N8-Tris(3-aminopropyl)spermidine]cholesteryl carbamate)。作为优选(B)成分，可以举出胆固醇。上述载体-1中，作为(B)成分，可以单独使用胆固醇及其衍生物中的一种，或者也可以组合物使用其中的两种以上。

作为上述载体-1中使用的脂肪族伯胺(以下有时也记作“(C)成分”)，只要为药学上允许的物质即可，没有特别限定，例如可以举出烷基部分的碳原子数为10～20的烷基胺。

作为脂肪族伯胺的具体例，可以举出月桂胺、肉豆蔻胺、棕榈胺、硬脂胺、油胺、癸酰胺、苯二甲酰胺等。其中，优选举出烷基部分的碳原子数为12～18的烷基胺；更优选举出硬脂胺、油胺、及棕榈酰胺；特别优选举出硬脂胺。上述脂肪族伯胺可以单独使用一种，或者也可以组合使用两种以上。

上述载体-1只要组合含有上述(A)～(C)成分即可，通过采用下述组合方案，能够更进一步提高核酸分子向细胞内的转运效率、并降低毒性，从这一观点考虑，优选以下举出的组合；

(A)酰基部分的碳原子数为4～23的二酰基磷脂酰胆碱、(B)胆固醇及/或其衍生物、及(C)碳原子数为10～20的烷基胺的组合；更优选(A)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、及/或二硬脂酰磷脂酰胆碱、(B)胆固醇、及(C)硬脂胺的组合。

另外，上述载体-1中，关于(A)～(C)成分的配合比率，没有特别限定，例如，可以举出(A)成分∶(B)成分∶(C)成分的摩尔比为5～9∶1～5∶1、优选6～9∶1～4∶1、更优选7～8∶2～3∶1。通过满足上述比率，能够更进一步提高核酸分子向细胞内的转运效率、并降低毒性。

另外，作为相对于上述载体-1总量的(A)～(C)成分的合计量，可以举出例如1～100重量％、优选20～90重量％、更优选30～70重量％。

上述载体-1中除上述(A)～(C)成分之外，还可以含有其他阳离子性脂质。作为上述阳离子性脂质，具体而言可以举出角鲨胺(Squalamine)、3a，7a，12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N，N-双(3-氨基丙基)胺(3a，7a，12a-Tris(3-aminopropoxy)-5β-cholan-24-(N，N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a，7a，12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(N-(3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a，7a，12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b- cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine)、3a，7a，12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N，N-双(2-氰基乙基)胺)(3a，7a，12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N，N-bis(2-cyanoethyl)amine))、3a，7a，12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(苄氧基羰基)-N-(羟基丙基)-胺)(3a，7a，12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbonyl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等甾族化合物结合的阳离子性脂质；伞状精胺复合体(Umbrella-spermine conjugates)等胆酸结合的阳离子性脂质；甾醇糖苷结合的阳离子性脂质；甾类皂苷结合的阳离子性脂质；二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2，3-双(油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基(二)十二烷基溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-(二)十二烷基-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O，O’-双-(1H，1H，2H，2H-全氟癸基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O，O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(ω-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、9-(ω-三甲基铵基丁基)-3，6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-ω-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴、N-{p-(ω-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(ω-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)、p-{ω-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O，O’，O”-三(十二烷酰基) -N-(ω-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等季铵盐型阳离子性脂质等。

载体-1中，含有除(A)～(C)成分之外的其他阳离子性脂质时，作为该阳离子性脂质的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，可以举出下述比例，即，相对于上述(A)～(C)成分的总量100重量份，该阳离子性脂质为1～10重量份，优选为2～8重量份，更优选为4～6重量份。

进而，上述载体-1中根据需要可以含有油性基剂。通过配合油性基剂、利用其特性，可以控制载体-1的核酸分子导入效率。例如，通过配合油性基剂调整载体-1的比重，可以控制细胞与载体-1的接触性，改善体外导入效率。另外，例如，通过配合具有温度敏感性功能的物质作为油性基剂，可以在规定的温度条件下使核酸载体的芯破碎，从而诱发细胞表面的波动(fluctuations)，提高核酸分子的导入效率。进而，例如，通过配合具有外部刺激破碎性的物质作为油性基剂，可以通过外部刺激使载体-1的芯破碎，从而诱导细胞表面的波动，提高核酸分子的导入效率。

作为上述载体-1中配合的油性基剂，例如可以举出全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氢化大豆油、大豆油非皂化物、角鲨烯、蓖麻油、丁香油、失水山梨醇三油酸酯、松节油、红花油、红花油脂肪酸、油酸、棕榈油、菜子油、杂醇油、橄榄油、亚麻仁油、芝麻油、叶绿素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉树油、玉米油、薰衣草油、香马郁兰油、柠檬油、棉籽油、椰子油、蛋黄油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黄菊油、肉桂油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、罗马春黄菊油、蛇油、留兰香油(spearmint oil)、向日葵油、可可脂、小麦胚芽油、氧化锌油、氢化油、氢化植物油、轻质液体石蜡、液体石蜡、中链脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油100、聚氧乙烯氢化蓖麻油20、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油5、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蓖麻油聚烃氧酯35、操作油等。上述油性基剂内，全氟戊烷具有温度敏感性，具有在29.5℃下沸腾而气化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷、及全氟三丁基胺具有下述特性，即，具有外部刺激破碎性，在由超声波照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下，使载体-1芯产生空腔，使其破碎。

含有该油性基剂时，作为该油性基剂的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，例如可以举出下述比例，即，相对于上述(A)～(C)成分的总量100重量份，该油性基材为0.1～50重量份、优选为1～30重量份、更优选为5～20重量份。

进而，上述载体-1中根据需要可以含有膜融合性脂质(辅助脂质)。通过含有上述膜融合性脂质，可以进一步提高向细胞内转运核酸分子的效率。作为上述膜融合性脂质，例如可以举出二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基磷脂酰基乙醇胺、1，2-双(10，12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1，2-二反油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1，2-二己酰基磷酸乙醇胺、1，2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二植烷酰基磷酸乙醇胺、1，2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(10，12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N，N-二甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N，N-二甲基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1，2-二油酰磷酸乙醇胺-N-[4(对马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(对马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(对马来酰亚胺苯基)丁酰胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(对马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐、N-(琥珀酰)-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中，在上述载体-1中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。

含有该膜融合性脂质时，作为该膜融合性脂质的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，可以举出下述比例，即，相对于上述(A)～(C)成分的总量100重量份，该膜融合性脂质为1～500重量份，优选为10～250重量份，更优选为25～100重量份。

上述载体-1根据使用形态，可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂；精制水、糖水溶液、缓冲液、生理盐水、高分子水溶液、不含RNase的水等水性载体。上述添加剂及水性载体的配合量可以根据核酸转运用载体的使用形态适当地设定。

核酸转运用载体的形态

上述核酸转运用载体只要能够包含用作向细胞内转运的对象的核酸复合体即可，对于其形态没有特别限定，优选为脂质体的形态。例如，将上述载体-1制成脂质体形态时，上述(A)～(C)成分及根据需要添加的其他脂质形成脂质体膜。

将上述核酸转运用载体制成脂质体形态时，可以为小单层脂质体(small unilamellar vesicles：SUV)、大单层脂质体(large unilamellar vesicles：LUV)、及多层脂质体(multilamellar vesicles：MLV)均可。另外，关于其粒径，只要根据转运对象细胞的种类等适当设定即可，可以举出例如为SUV时粒径为20～100nm、为LUV时粒径为200～1000nm、为MLV时粒径为400～3500nm左右。脂质体的粒径使用动态激光散射法进行测定。

脂质体的制造及其粒径的调节根据本技术领域公知的方法进行。例如，为上述载体-1时，可以使用含有上述(A)～(C)成分的油相和水相(水性载体)，采用薄膜法、逆相蒸发法、醚注入法、表面活性剂法、加热法等形成脂质体。另外，可以采用挤出法、French press法、均质化法等调节粒径。

核酸转运用组合物的形态、组成、使用方法

核酸转运用载体为脂质体形态时，上述核酸复合体在本发明的核酸转运用组合物中，可以以被封入脂质体的内水相中的状态而存在，另外上述核酸复合体也可以通过离子键或者疏水键键合于脂质体膜的内侧或外侧而存在。优选为前者的形态。另外，如果核酸转运用载体为除脂质体之外的形态时，在本发明的核酸转运用组合物中，只要上述核酸复合体与核酸转运用载体的成分通过离子键或者疏水键进行复合化形成复合体即可。

本发明的核酸转运用组合物如下制造：混合上述核酸复合体和核酸转运用载体制备成所期望的形态；或者以任意的顺序混合将上述核酸复合体及上述核酸转运用载体组合物的配合成分，制备成所期望的形态。

在本发明的核酸转运用组合物中，作为上述核酸复合体与核酸转运用载体的配合比率，根据上述核酸复合体的种类、核酸转运用载体的种类、用作核酸转运对象的细胞的种类等而不同，例如可以举出下述比率，即，相对于核酸转运用载体的总量100重量份，上述核酸复合体为1～100重量份、优选为10～100重量份、更优选为20～100重量份。更具体而言，如果使用上述载体-1作为核酸转运用载体时，可以举出下述比例，即，相对于上述载体-1中含有的(A)～(C)成分的总量100重量份，上述核酸复合体为1～100重量份、优选为10～100重量份、更优选为20～100重量份。

另外，本发明的核酸转运用组合物中，关于上述核酸复合体的配合量也没有特别限定，可以举出相对于核酸转运用组合物的总量，上述核酸复合体在1～50重量％、优选10～50重量％、更优选15～50重量％的范围内。

另外，作为核酸转运用载体使用上述载体-1时，作为该载体-1中含有的(A)～(C)成分的合计量，可以举出相对于核酸转运用组合物总量，例如为10～90重量％、优选为30～80重量％、更优选为40～60重量％。

本发明的核酸转运用组合物根据使用形态可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂；精制水、葡萄糖水溶液、缓冲液、生理盐水等水性载体等添加剂及载体。上述添加剂及载体的配合量可以根据核酸转运用组合物的使用形态适当设定。

另外，本发明的核酸转运用组合物其本身可以用作基因治疗中使用的药物，即可以作为用于将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内的药物，以药物组合物的形态使用。将本发明的核酸转运用组合物作为药物组合物使用时，上述核酸转运用载体、添加剂、载体等可以从药学上允许的物质中选择。将本发明的核酸转运用组合物作为药物组合物使用时，可以制成各种剂型。作为药物组合物的剂型，可以举出例如溶液剂(包括糖浆剂等)、滴剂、注射剂等液体制剂；片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)等固体制剂。药物组合物为液体制剂时，也可以进行冷冻保存，另外也可通过冷冻干燥等除去水分进行保存。冷冻干燥制剂及干糖浆剂等在使用时加入注射用蒸馏水、灭菌水等，再次溶解使用。另外，本发明的药物组合物为固体制剂时，也可以在使用时加入注射用蒸馏水、灭菌水等，再次溶解使用。

本发明中，转运能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的细胞、即本发明的核酸转运用组合物所使用的细胞，只要是需要针对靶基因的RNA干扰或者翻译抑制的细胞、或需要针对靶基因的RNA干扰或者翻译抑制的组织中的细胞即可，例如可以举出培养细胞、从机体中分离的细胞(包括株化的细胞)、机体内存在的细胞等。上述细胞可以为来自人的细胞，另外也可以为来自人之外的动物的细胞。另外，本发明的核酸转运用组合物可以适用于体外，也可以适用于体内或离体。

另外，例如，在由特定基因表达引起的疾病组织中，该特定基因的表达抑制对该疾病的治疗及改善有效时，可以向该疾病组织中的细胞中导入能够对该特定基因进行RNA干扰的核酸分子。

本发明中，能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子向细胞内的转运可以经历将本发明的核酸转运用组合物与细胞接触的步骤进行。本发明的核酸转运用组合物与细胞的接触方法只要适用于将适量的该核酸转运用组合物与用作核酸分子导入对象的细胞接触即可，没有特别限定。例如，使用本发明的核酸转运用组合物作为药物组合物时，关于其使用方法，可以与现有的基因治疗方法同样地进行，关于给与量也同样，均可适当设定。通过如上所述将本发明的核酸转运用组合物适用于细胞，可以将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子容易地转运至细胞内，并且可以在细胞内稳定地保持被转运的核酸分子。

例如，将本发明的核酸转运用组合物和细胞在体外接触时，可以举出在培养该细胞时预先存在适量核酸转运用组合物的状态下培养细胞的方法。另外，欲将本发明的核酸转运用组合物与培养细胞或从机体提取的细胞在体外接触时，可以在血清存在下使其接触。另外，欲将本发明的核酸转运用组合物与细胞在体内接触时，可以举出将本发明的核酸转运用组合物直接注入组织；向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、齿内等注射；向鼻腔、口腔、肺等吸入给与；口服给与；经皮肤的经皮给与；及经口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给与等。

另外，将本发明的核酸转运用组合物用于细胞时，只要使用其有效量即可，例如，相对于每1个细胞，使用.001pMol～10pMol、优选0.01pMol～1pMol、更优选0.01pMol～0.1pMol量的该核酸转运用组合物中含有的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子。

利用本发明的核酸转运用组合物，可以将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内。即，本发明的核酸转运用组合物对于通过将该核酸转运用组合物与细胞接触，将该核酸转运用组合物中存在的、形成上述核酸复合体的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内来说是有效的。

(3)将核酸分子转运至细胞内的方法

本发明另外提供将可以进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子转运至细胞内的方法。将本发明的核酸分子转运至细胞内的方法包括将上述核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞接触的步骤。对于上述核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞的接触，只要将适量核酸复合体或核酸转运用组合物与用作核酸分子导入对象的细胞接触即可，没有特别限定。

通过如上所述将核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞接触，可以将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子稳定保持在细胞内。该核酸复合体可以自身与细胞接触，并且也可以与上述添加剂及载体组合并与细胞接触。从更有效地将核酸分子转运至细胞内的观点考虑，优选将上述核酸转运用组合物与细胞接触。

本发明中，如上所述作为转运能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子的细胞没有特别限定，只要为需要针对靶基因的RNA干扰或者翻译抑制的细胞、或需要针对靶基因的RNA干扰或者翻译抑制的组织中的细胞即可，例如，可以举出培养细胞、从机体中分离的细胞(包括株化的细胞)、机体内存在的细胞等。另外，该细胞可以来自人，也可以来自除人之外的动物。另外，上述核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞的接触可以在体外进行，也可以在体内或离体进行。

另外，例如，在由特定基因的表达引起的疾病组织中，该特定基因的表达抑制对该疾病的治疗及改善有效时，可以向该疾病组织中的细胞中导入针对该特定基因的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子。

例如，将上述核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞在体外接触时，可以举出在该细胞培养时预先存在适量上述核酸复合体或核酸转运用组合物的状态下培养细胞的方法。另外，将上述核酸复合体或核酸转运用组合物与培养细胞及从机体中分离的细胞在体外接触时，也可以在血清存在下接触。另外，将上述核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞在体内接触时，可以举出将上述核酸复合体或核酸转运用组合物直接注入组织；向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、齿内等内注射；向鼻腔、口腔、肺等内吸入给与；口服给与；经皮肤的经皮给与；及经口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给与等。

另外，在将本发明的核酸分子转运至细胞内的方法中，将能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子导入细胞内时，可以将有效量的核酸复合体或核酸转运用组合物与细胞接触。具体而言，作为其适用量，可以举出相对于每1个细胞，换算为该核酸转运用组合物中含有的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子时，给与0.001pMol～10pMol、优选0.01pMol～1pMol、更优选0.01pMol～0.1pMol的能够进行RNA干扰或者翻译抑制的核酸分子。

另外，本发明的转运方法中，也可以通过将上述核酸转运用组合物与细胞接触而进行。

实施例

以下，基于实施例等详细说明本发明，本发明不限于此。另外，在以下实施例及试验例中，作为siRNA，使用GL3-siRNA(针对萤火虫荧光素酶的siRNA；Dharmacon公司，Boulder，CO，USA；有意：5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT(序列号1)、反意：5’- UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT(序列号2))。另外，作为大环糊精，使用和光纯药株式会社销售的大环糊精(聚合度22～50(重均分子量6000～8000)的混合物)。

实施例1含有siRNA与大环糊精的复合体的制备

使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)，制备以2μM浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。另外，另行使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)制备以25μM浓度含有大环糊精的溶液(大环糊精溶液)。于室温下，通过将等量的上述物质混合1分钟制备siRNA复合体。

比较例1-4含有siRNA与环糊精的复合体的制备

使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)，制备以2μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。另外，另行使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)，制备以2μM的浓度含有α-环糊精的溶液(α-环糊精溶液)。室温下，通过将等量的上述物质混合1分钟制备siRNA复合体(比较例1)。

另外，除使用以20μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)之外，采用与上述比较例1相同的条件制备siRNA复合体(比较例2)。

另外，使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)，制备以2μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。另外，另行使用Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)，制备以2μM的浓度含有γ-环糊精的溶液(γ-环糊精溶液)。于室温下，通过将等量的上述物质混合1分钟制备siRNA复合体(比较例3)。

另外，除使用以20μM的浓度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)之外，在与上述比较例3相同的条件下制备siRNA复合体(比较例4)。

试验例1siRNA复合体的粒径、及Zeta电位的测定

测定实施例1及比较例1-2中得到的siRNA复合体的粒径、及含有该siRNA复合体的溶液的Zeta电位。粒径表示使用ZETASIZER 3000HSA(MALVERN INSTRUMENT)(使用激光衍射法测定体积平均粒径)测定的平均粒径(nm)。Zeta电位同样使用ZETASIZER 3000HSA(MALVERN INSTRUMENT)测定。

[表1]

	粒径(nm)	Zeta电位(mV)
			实施例1	33.0	-12.8
比较例1	未检测到	未检测到
			比较例2	400.0	-25.2
比较例3	未检测到	未检测到
			比较例4	631.4	-32.0

需要说明的是，比较例1-4的siRNA复合体中确认到凝集。

该结果表明，与使用α-环糊精或γ-环糊精将siRNA复合体化的情况相比，通过使用大环糊精将siRNA复合体化，能够形成粒径小的siRNA复合体。由于siRNA复合体的粒径越小越容易将其导入细胞内，所以确认到使用了大环糊精的siRNA复合体适于向细胞内导入。

实施例2 含有siRNA复合体的核酸转运用组合物的制备

称量二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、硬脂胺，使其以摩尔比为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)∶胆固醇∶硬脂胺＝7∶3∶1，将它们在茄型瓶中溶解于氯仿中。通过旋转蒸发仪使其减压干燥，形成脂质薄膜。接着，向所得的脂质薄膜中添加实施例1中得到的含有0.014mg/ml的siRNA复合体的溶液，使得溶液中DSPC浓度为30mg/mL，混合后，使用挤出机使溶液通过孔径800nm及200nm的膜进行整粒，制备阳离子性脂质体形态的siRNA转运用组合物(实施例2：脂质体化法)。

另外，向上述形成的脂质薄膜中添加Tris-EDTA(TE)缓冲液(Fluka公司制)使溶液中DSPC浓度为63.2mg/mL，混合后，使用挤出机使溶液通过孔径800nm及200nm的膜进行整粒，制备阳离子性脂质体。将如上所述得到的阳离子性脂质体(DSPC量为63.2mg)与含有实施例1中得到的siRNA复合体的溶液(siRNA复合体量为 0.028mg)混合，制备siRNA转运用组合物(实施例2：脂质复合法)。

所得的siRNA转运用组合物(实施例2)的物性示于表2。形成阳离子性脂质体时添加了siRNA复合体溶液所得的组合物(脂质体化法)的粒径约为300nm，Zeta电位约为20mV，为粒度均匀的粒子的脂质体形态。另一方面，形成阳离子性脂质体后添加siRNA复合体溶液制备的组合物(脂质复合法)的粒径约为800nm、Zeta电位约为20mV。粒径表示通过ZETASIZER 3000HSA(MALVERN INSTRUMENT)(使用激光衍射法测定体积平均粒径)测定的平均粒径(nm)。Zeta电位同样使用ZETASIZER 3000HSA(MALVERN INSTRUMENT)测定。

表2

需要说明的是，使用比较例1及3的siRNA复合体、在与上述实施例2相同的条件下制备核酸转运用组合物时，siRNA复合体还附着于脂质体表面，无法将siRNA复合体充分封入脂质体内。

试验例2 siRNA的封入率(inclusion efficiency)的评价

本试验中，使用预先用FITC标记的siRNA，采用与上述实施例1相同的方法，制备FITC标记的siRNA复合体。使用该FITC标记的siRNA复合体，在与上述实施例2相同的条件下制备核酸转运用组合物。制备后立即通过离心处理(75,000rpm、1小时)使siRNA转运用组合物沉淀，通过测定其上清液中存在的FITC标记的siRNA的荧光强度，计算siRNA的封入率(被封入脂质体内的siRNA相对于全部siRNA的比例：％)。

结果，siRNA的封入率如表3所示，在采用脂质体化法制备的核酸转运用组合物中封入率为95.9％，在采用脂质复合法制备的核酸转运用组合物中封入率为91.5％，为非常高的值。由此表明本发明的核酸复合体具有被有效地导入脂质体状核酸转运用载体中的特性。推测这是由于大环糊精与siRNA形成紧密的复合体，但不作限制性解释。

[表3]

试验例3细胞安全性的评价试验

采用MTS试验法进行评价。MTS试验使用Promega公司制“CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay”进行。具体而言，在96孔板中，将A594细胞(ATCC，USA)以3.16×10⁴细胞/孔接种到200μL含有10容量％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium，DMEM)中，在37℃下培养24小时。用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)清洗3次后，将培养基改为不含FBS的DMEM，向每1孔中分别添加20μL上述实施例2的核酸转运用组合物(脂质体化法及脂质复合法)，在37℃、5％CO₂条件下培养4小时。接着，将孔中的培养上清液改为含有10容量％FBS的DMEM，再次在37℃、5％CO₂条件下培养20小时。接着，向各孔中加入20μL MTS试剂及100μL含有FBS10容量％的DMEM培养基，培养2小时后，测定492nm处的吸光度，计算细胞存活率。需要说明的是，细胞存活率是以不添加核酸转运用组合物在上述条件下培养时测定的492nm处的吸光度为100％计算得到的。

所得的结果示于图1。如图1所示，表明采用脂质体化法及脂质复合法的实施例2的核酸转运用组合物均具有低细胞毒性，安全性高。特别是确认到采用实施例2的脂质体化法制备的核酸转运用组合物的安全性明显较高。

试验例4 siRNA向细胞内的转运效率的评价试验

使用流式细胞术测定用FITC标记的siRNA的荧光强度，由此评价向细胞内导入siRNA的效率。需要说明的是，本试验中，利用使用预先标记了FITC的siRNA制备的核酸转运用组合物。具体而言，在24孔板中按照5×10⁵细胞/孔将A594细胞(ATCC，USA)接种到500μL含有10容量％FBS的DMEM中，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。用HBSS清洗3次后，向各孔中加入0.45mL不含FBS的DMEM，进而向每1孔添加0.05mL上述实施例2的核酸转运用组合物(脂质体化法)(含有的DSPC的浓度：30mg/mL)，在37℃、5％CO₂条件下培养4小时。接着，将孔中的培养上清液改为含有10容量％FBS的DMEM，再次在37℃、5％CO₂条件下培养20小时。用HBSS将各孔清洗1次后，添加0.2mL Cell Scrub Buffer(Gene Therapy Systems，Inc.制)在37℃、5％CO₂条件下培养15分钟。进而，用HBSS清洗2次后，使用胰蛋白酶剥取附着在孔底部的细胞，通过离心分离回收细胞，将所得的细胞悬浮于HBSS中。使该悬浮液通过孔径41μm的膜。添加核酸转运用组合物4小时后使用流式细胞术测定细胞的荧光强度。另外，作为比较对照，使用下述比较用核酸转运用组合物，与上述相同地测定细胞的荧光强度，所述比较用核酸转运用组合物如下制备：以容量比1∶1混合用OptiMEM培养基将市售的常用作基因运载体的Lipofectamine2000^TM(Invitrogen公司制)稀释至0.1mg/mL的溶液、与用TE缓冲液以2μM的浓度稀释siRNA所得的siRNA溶液。

所得结果示于图2。由该结果确认到对于实施例2制备的核酸转运用组合物(脂质体化法)来说，siRNA被明显地导入细胞内。

Claims

1.一种核酸复合体，其特征在于，含有大环糊精及siRNA，其中，

所述大环糊精的聚合度为22～50，

相对于1摩尔siRNA，含有10～20摩尔大环糊精。

2.如权利要求1所述的核酸复合体，是通过将siRNA和大环糊精在水溶液中混合而得到的凝集体。

3.一种核酸转运用组合物，含有权利要求1或2所述的核酸复合体及核酸转运用载体，其中，所述核酸转运用载体为含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自由胆固醇及其衍生物组成的组中的至少一种、及(C)脂肪族伯胺的组合物。

4.如权利要求3所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中含有的(A)成分为酰基部分的碳原子数4～23的二酰基磷脂酰胆碱。

5.如权利要求3所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中含有的(B)成分为胆固醇。

6.如权利要求3所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中含有的(C)成分为碳原子数10～20的烷基胺。

7.如权利要求3所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体中(A)成分：(B)成分：(C)成分的摩尔比为5～9：1～5：1。

8.如权利要求3所述的核酸转运用组合物，核酸转运用载体为由(A)～(C)成分形成脂质体膜的脂质体制剂。

9.一种药物组合物，含有权利要求3至8中任一项所述的核酸转运用组合物。

10.大环糊精及siRNA在制造核酸复合体中的应用，所述大环糊精的聚合度为22～50。

11.权利要求1或2所述的核酸复合体及核酸转运用载体在制造核酸转运用组合物中的应用，其中，所述核酸转运用载体为含有(A)二酰基磷脂酰胆碱、(B)选自由胆固醇及其衍生物组成的组中的至少一种、及(C)脂肪族伯胺的组合物。

12.权利要求1或2所述的核酸复合体在制造用于将siRNA转运至细胞内的药物中的应用。

13.一种将siRNA转运至体外细胞内的方法，包括使权利要求1或2所述的核酸复合体与体外细胞接触的步骤。

14.一种将siRNA转运至体外细胞内的方法，包括使权利要求3至8中任一项所述的核酸转运用组合物与体外细胞接触的步骤。