CN101291678B - 核酸转运用载体组合物 - Google Patents
核酸转运用载体组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101291678B CN101291678B CN2006800389545A CN200680038954A CN101291678B CN 101291678 B CN101291678 B CN 101291678B CN 2006800389545 A CN2006800389545 A CN 2006800389545A CN 200680038954 A CN200680038954 A CN 200680038954A CN 101291678 B CN101291678 B CN 101291678B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- composition
- nucleic acid
- carrier
- weight portions
- acid transport
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明的目的在于提供一种在将siRNA等核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸免于分解并使其高效地转运至细胞内的、低毒性的核酸转运用载体组合物,及含有该载体组合物和核酸的核酸转运用组合物。本发明通过组合(A)具有甾核的阳离子性脂质及(B)季铵盐型的阳离子性脂质,将其配合,制备核酸转运用载体组合物。另外,混合该核酸转运用载体组合物和核酸来制备核酸转运用组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种在将核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸不被分解并将其高效率地转运至细胞内的、低毒性且安全性高的核酸转运用载体组合物、及核酸转运用组合物。
背景技术
近年,随着生物技术的发展,已经发现了多种在细胞内发挥生理活性功能的核酸。例如,已知siRNA(small interfering RNA:小干扰RNA)可引起存在于细胞内的靶基因的mRNA分解,阻碍靶基因表达(RNA interference:RNA干涉)。由此RNA干涉产生的阻碍靶基因表达的功能导致特定基因或基因组的异常表达,在减轻所患疾病症状乃至治疗方面是有用的,故人们期待将siRNA开发用作治疗药。但是,为了将以siRNA为首的核酸用作治疗药等,重要的是使siRNA在靶细胞内发挥功能,因此,确立使核酸有效地转运至靶细胞内的技术必不可少。
作为将外来性核酸分子或基因转运至细胞内的技术,包括逆转录病毒、腺病毒及疱疹病毒等在内的多种病毒被用于人难治性疾病的治疗。但是,由于存在感染性、免疫反应性、生产率等问题,在治疗中有难度。因此,人们正在开发一种能克服来自病毒的问题、且可用于将核酸分子转运至细胞内的非病毒性载体。
目前为止,作为促进siRNA等核酸向细胞内转运的非病毒性核酸转运用载体,例如,专利文献1中公开了特定结构的阳离子性脂质。但是,专利文献1中公开的阳离子性脂质,具有在给予培养细胞或生物体时呈现毒性的缺点。另外,专利文献2中,作为毒性较低、可将siRNA转运至细胞内的载体组合物,公开了含有两亲性化合物及聚阳 离子的组合物。但是,即使是专利文献2中公开的组合物,在将充分量的siRNA导入细胞内时,其对细胞的毒性方面依然存在问题。
以上述现有技术为背景,人们期待开发出低毒性、能够使以siRNA为代表的核酸高效率地转运到细胞内的核酸转运用载体组合物。
专利文献1:特表2002-529439号公报
专利文献2:特表2005-508394号公报
发明内容
因此,本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题。具体而言,本发明的目的在于提供一种在将siRNA等核酸给予来自动物的细胞或生物时能够保护核酸不被分解并将其高效率地转运至细胞内的、低毒性且高安全性的核酸转运用载体组合物、及含有该载体组合物和核酸的核酸转运用组合物。
本发明人等为了解决上述问题进行了潜心研究,发现组合含有(A)具有甾核的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质的组合物,毒性低且能够保护核酸不被分解并使其高效率地转运至细胞内,作为核酸转运用载体是有用的。本发明是基于上述发现,通过进一步反复研究而完成的。
即,本发明提供下述方案的发明:
项1.一种核酸转运用载体组合物,其特征在于,含有(A)具有甾核的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质。
项2.如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中还含有(C)油性基材。
项3.如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,(A)成分为3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、及/或3β-[N’,N’,N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇。
项4.如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,(B)成分为选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、及N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐 中的至少1种。
项5.如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,相对于100重量份(A)成分,以10~200重量份的比例含有(B)成分。
项6.如项1所述的核酸转运用载体组合物,其中,所述组合物为siRNA转运用载体。
项7.一种核酸转运用组合物,其中含有核酸及项1至5中任一项所述的核酸转运用载体组合物。
项8.如项7所述的核酸转运用组合物,其中,核酸为siRNA。
项9.一种核酸导入方法,其特征在于,通过使项7所述的核酸转运用组合物与细胞接触,使核酸导入到细胞内。
项10.(A)具有甾核的阳离子性脂质及(B)季铵盐型的阳离子性脂质的组合在制造核酸转运用载体组合物中的用途。
根据本发明的核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物,可以得到下述优异的效果。
(1)能够有效率地将核酸转运至细胞内,使核酸在细胞内有效地发挥功能。
(2)能够抑制核酸在生物体内或培养液中分解。
(3)毒性低、安全性高。
所以,上述核酸转运用载体组合物及核酸转运用组合物可以用于通过导入核酸进行的各种疾病的治疗,特别是对用低分子化合物等难于治疗的难治性疾病的治疗有效。
另外,本发明的核酸转运用组合物可以进行冻干处理,因此,也具有可在冻干状态下保存的优点。
附图说明
[图1]是表示在试验例1中使用各种受试试样处理细胞后,通过荧光显微镜观察来自细胞中的核酸的荧光像的结果的图。
[图2]是表示在试验例2中使用各种受试试样处理细胞后,测定细胞的荧光素酶活性的结果的图。
[图3]是表示在试验例3中测定大鼠的肺中脑啡肽酶(NEP)活性的结果的图。
[图4]是表示在试验例4中使用各种受试试样处理后的活细胞数的测定结果的图。
[图5]是表示在试验例5中将大鼠的肺组织切片用苏木精-伊红染色的结果的图。图中,苏木精将核·核糖体等染成蓝绿色,伊红将细胞质·纤维·红细胞染成红色。
具体实施方式
以下,详细地说明本发明。
核酸转运用载体
本发明的核酸转运用载体组合物的特征在于,含有(A)具有甾核的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质。
本发明的核酸转运用载体组合物可以作为用于将核酸转运(导入)至细胞内的核酸载体使用。
本发明的核酸转运用载体组合物适用的核酸,只要是必需转运至细胞内的核酸即可,对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例,可以举出siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成性寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide,TFO)、基因等。其中,本发明的核酸转运用载体组合物在将siRNA向细胞内转运方面特别有用。本发明的核酸转运用载体适用的核酸,可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸,另外,也可以是通过化学合成制造的核酸。进而,上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种,并且对其分子量也没有特殊的限定。另外,本发明中,核酸可以为被化学、酶或肽修饰的核酸。本发明中,核酸可以单独使用1种,也可以2种以上适当地组合使用。
本发明的核酸转运用载体组合物中使用的具有甾核的阳离子性脂质(以下,有时也表示为“(A)成分”),是指具有甾核(环戊 烷多氢菲环;C17H28)、显示阳离子性的脂质。作为本发明中使用的具有甾核的阳离子性脂质,只要是药理学上允许的脂质即可,没有特殊的限制,作为具体例,可以举出3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、3β-[N’,N’,N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)、(N’,N-双胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-胆固醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterol)(BGTC)、N-胆甾烯基氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺、β-丙氨酸-二乙醇胺-胆固醇、N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67;N4-spermine cholesteryl carbamate)、N[N4-3-氨基丙基亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-78;N[N4-3-aminopropylspermidine]cholesteryl carbamate)、N4-精胺胆固醇甲酰胺(GL-90;N4-spermine cholesteryl carboxamide)、N1,N8-双(精氨酸甲酰胺)-N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-95;N1,N8-Bis(argininccarboxamide)-N4-spermidine cholesteryl carbamate)、N-[N1,N4,N8-三(3-氨基丙基)亚精胺]胆固醇氨基甲酸酯(GL-96;N-[N1,N4,N8-Tris(3-aminopropyl)spermidine]cholesterylcarbamate)等胆固醇衍生物(具有胆固醇骨架的阳离子性脂质);角鲨胺(Squalamine)、3a,7a,12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N,N-双(3-氨基丙基)胺(3a,7a,12a-Tris(3-aminopropoxy)-5β-cholan-24-(N,N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a,7a,12a-三(3-氨基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(N-(3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a,7a,12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine)、3a,7a,12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N,N-双(2-氰基乙基)胺)(3a,7a,12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N,N-bis(2-cyanoethyl)amine))、3a,7a,12a-三(3-叠氮基丙氧基)-5β-胆烷-24-(N-(苄基氧基羰基)-N-(羟基丙基)-胺)(3a,7a,12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24- (N-(benzyloxycarbonyl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等甾族化合物结合的阳离子性脂质;伞状精胺复合体(Umbrella-spermine conjugates)等胆酸结合的阳离子性脂质;甾醇糖苷结合的阳离子性脂质;甾类皂苷结合的阳离子性脂质等。上述具有甾核的阳离子性单纯脂质可以单独使用1种,或任意组合2种以上使用。
作为具有甾核的阳离子性脂质,优选举出胆固醇衍生物(具有胆固醇骨架的阳离子性脂质),更优选举出3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、及3β-[N’,N’,N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇(TC-Chol)。
作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的季铵盐型阳离子性脂质(以下,有时也表示为“(B)成分”),只要在药理学上允许即可,没有特殊限制。作为其具体例,可以举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O,O’-双-(1H,1H,2H,2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3,6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)- p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O,O’,O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12)、1,2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等。上述季铵盐型阳离子性脂质可以单独使用1种,也可以任意组合2种以上使用。
上述季铵盐型阳离子性脂质中,优选举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐(DC-6-12,n=12;及DC-6-14,n=14)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-081O)、及O,O’,O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐(TC-1-12),更优选举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐(DOTMA)。
另外,本发明的核酸转运用载体组合物中,对(A)成分和(B)成分的配合比率没有特殊的限制,从将核酸有效地转运至细胞内的观点考虑,相对于100重量份(A)成分,(B)成分为10~200重量份,优选为30~150重量份,更优选为75~125重量份。另外,相对于本发明的核酸转运用载体的总量,(A)成分和(B)成分的总量例如可以为10~100重量%,优选为20~80重量%,更优选为40~70重量%。
本发明的核酸转运用载体组合物,除上述(A)及(B)成分之外,还可以含有油性基剂(以下,有时也称为(C)成分)。配合油性基 剂,利用其特性,由此能够控制核酸转运用载体组合物的核酸导入效率。例如通过配合油性基剂调整核酸转运用载体组合物的比重,可以控制细胞和核酸转运用载体组合物的接触性,改善体外的导入效率。另外,例如通过配合具有温度感受性功能的油剂作为油性基剂,能够在规定的温度条件下使核酸载体的芯破碎,诱发细胞表面的波动,提高核酸的导入效率。进而,例如通过配合具有外部刺激破碎性的油剂作为油性基剂,可以通过外部刺激使核酸载体组合物的芯破碎,诱发细胞表面的波动,提高核酸的导入效率。
作为本发明的核酸转运用载体组合物中配合的油性基材,例如可以举出,全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氢化大豆油、大豆油非皂化物、角鲨烯、蓖麻油、丁香油、三油酸脱水山梨糖醇酯、松节油、红花油、红花油脂肪酸、油酸、棕榈油、菜子油、杂醇油、橄榄油、亚麻仁油、芝麻油、叶绿素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉树油、玉米油、熏衣草油、马郁兰油、柠檬油、棉籽油、椰子油、蛋黄油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黄菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、罗马春黄菊油、蛇油、留兰香油(spearmint oil)、向日葵油、可可脂、小麦胚芽油、氧化锌油、氢化油、氢化植物油、轻质液体石蜡、液体石蜡、中链脂肪酸三甘油酯、貂油(mink oil)、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油100、聚氧乙烯氢化蓖麻油20、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油5、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧基35蓖麻油、操作油等。上述油性基剂中,全氟戊烷具有温度感受性,具有在29.5℃下通过沸腾气化的特性。另外,全氟己烷、溴代全氟辛烷、及全氟三丁基胺具有下述特性,即具有外部刺激破碎性,在由超声波照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下,使载体组合物的芯产生空腔,使其破碎。
含有该油性基剂时,作为该油性基剂的比例,只要不妨碍本发明的效果即可,没有特殊的限制,例如可以为下述比例,即相对于100 重量份上述(A)成分及(B)成分的总量,该油性基材为0.1~50重量份,优选为1~30重量份,更优选为5~20重量份。
进而,本发明的核酸转运用载体组合物中根据需要也可以含有膜融合性脂质(辅助脂质)。通过含有上述膜融合性脂质,能够进一步提高核酸向细胞内的转运效率。作为上述膜融合性脂质,例如可以举出,二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基磷脂酰基乙醇胺、1,2-双(10,12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1,2-二反油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1,2-二己酰基磷酸乙醇胺、1,2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1,2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(10,12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N,N-二甲基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N,N-二甲基-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、二棕榈酰磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、N-(琥珀酰)-1,2-二油 酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中,在本发明的核酸转运用载体组合物中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。
含有该膜融合性脂质时,作为该膜融合性脂质的比例,只要不妨碍本发明的效果即可,没有特殊的限制,可以举出下述比例,即相对于100重量份上述(A)成分及(B)成分的总量,该膜融合性脂质为1~500重量份,优选为10~250重量份,更优选为25~100重量份。
根据使用形态,本发明的核酸转运用载体组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂。上述添加剂的配合量,可以根据核酸转运用载体的使用形态适当地设定。
本发明的核酸转运用载体组合物通过混合上述(A)成分、(B)成分、及根据需要混合其他成分而制造。
核酸转运用组合物
本发明的核酸转运用组合物是含有上述核酸转运用载体组合物和核酸的组合物,在该核酸转运用组合物中,核酸与核酸转运用载体组合物的配合成分通过离子键或疏水键形成复合体,提高核酸向细胞内的转运率。
本发明的核酸转运用组合物通过混合上述核酸转运用载体组合物和核酸,或以任意顺序混合核酸及上述核酸转运用载体组合物的配合成分而进行制造。
本发明的核酸转运用组合物中,作为核酸和核酸转运用载体组合物的配合比率,根据使用的核酸或核酸转运用载体的种类或为核酸转运对象的细胞的种类等而不同,例如,可以举出以下比例,即相对于100重量份核酸转运用载体组合物中所含的(A)及(B)成分的总量,核酸为0.1~300重量份,优选为1~100重量份,更优选为2.5~50重量份。
另外,作为核酸转运用组合物中所含的(A)及(B)成分的总量,相对于该组合物的总量,例如可以举出10~90重量%,优选为30~80 重量%,更优选为50~70重量%。
根据使用形态,本发明的核酸转运用组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等多种添加剂。上述添加剂的配合量可以根据核酸转运用组合物的使用形态适当地设定。
本发明中,作为核酸被转运的细胞,可以举出培养细胞、从生物体中提取的细胞(包含株化的细胞)、生物体内存在的细胞等。
作为本发明的核酸转运用组合物的使用状态,只要能使该核酸转运用组合物与作为核酸导入对象的细胞接触即可,没有特殊限制。例如,向生物体内的细胞中转运核酸时,例如可以举出向组织中直接注入;向静脉、皮下、肌肉、腹腔、眼内、消化器官内、牙内等注射;从鼻腔、口腔、肺等吸入给予;口服给予;通过皮肤的透皮给予;及通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜、子宫粘膜的经粘膜给予等。另外,在向培养细胞或从生物体提取的细胞中转运核酸的情况下,可以举出将核酸转运用组合物预先添加到培养基中,在该状态下培养细胞的方法。需要说明的是,向培养细胞或从生物体提取的细胞中转运核酸时,即使在血清存在下也可以将核酸转运至细胞内。
实施例
以下,根据实施例等详细地说明本发明,但本发明并不限定于此。
实施例1
制备下述组成的核酸转运用载体组合物。
二甲基二(十八烷基)溴化铵盐 0.9μg
3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇 0.9μg
二油酰基磷脂酰乙醇胺 0.9μg
丙三醇 40.5μg
精制水 2μl
OPTI-MEM培养基(Invitrongen社制) 适量
总量 50μl
实施例2
首先,制备下述组成的含核酸的液体。
siRNA 2pmol
OPTI-MEM培养基(Invitrongen社制) 适量
总量 50μl
然后,将50μl上述所得的核酸转运用载体组合物和50μl含有核酸的液体混合,在室温下培养20分钟,由此制备siRNA转运用组合物。
实施例3
制备下述组成的核酸转运用载体组合物。
二甲基二(十八烷基)溴化铵盐 0.5mg
3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇 0.5mg
二油酰基磷脂酰乙醇胺 0.5mg
蔗糖 88.9mg
精制水 适量
总量 1.0ml
实施例4
制备下述组成的核酸转运用载体组合物。
二甲基二(十八烷基)溴化铵盐 0.5mg
3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇 0.5mg
二油酰基磷脂酰乙醇胺 0.5mg
精制水 适量
总量 1.0ml
试验例1
为了评价实施例2的siRNA转运用组合物向细胞内的siRNA转运性,以A549细胞(来自人肺癌的细胞株;日本制药社制)为模型细胞 进行以下试验。需要说明的是,在本试验中,siRNA使用荧光标记的GL3-siRNA(靶向萤火虫荧光素酶的siRNA;Dharmacon社,Boulder,CO,USA;有意义:5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT,反义:5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)。
首先,使用DMEM培养基(Dulbecco-Minimum EssentialMedium),将A549细胞调整至浓度为1.2×105个/ml,接种上述细胞,使24-孔培养板中每1孔加入6.0×104个细胞。接下来向各孔中添加500μl表1所示的受试试样,在37℃、5%CO2条件下培养24小时。然后使用荧光显微镜(Olympus IX 71 fluorescence microscope;Olympus,Tokyo,日本)观察来自细胞中的核酸的荧光像,评价向细胞内的siRNA转运性。
[表1]
所得结果如图1所示。仅添加siRNA时在细胞内未观察到荧光。另一方面,使用实施例2的核酸转运用组合物时,或与公知的细胞转运用载体(LFA2000或NeoPhectin)一起添加siRNA时,在细胞内观察到荧光。特别是在使用实施例2的核酸转运用组合物时在细胞内观察到较强荧光。由上述结果可以确认,本发明的核酸转运用组合物具有优异的核酸转运能力。
试验例2
为了评价靶基因在蛋白质水平的抑制,向细胞中一过性导入编码荧光素酶基因的质粒,然后添加上述实施例2的核酸转运用组合物,评价荧光素酶的表达量。需要说明的是,本试验中,siRNA使用GL3-siRNA(靶向萤火虫荧光素酶的siRNA;Dhamacon社,Boulder,CO,USA;有意义:5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT,反义:5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)。
具体而言,向5×106个A549细胞(来自人肺癌的细胞株;日本制药社制)中添加10mg的pGL3荧光素酶及Renilla荧光素酶(Promega,Madison,WI,USA),使用Nucleofector(Amaxa Inc.,Gaithersburg,MD,USA),进行电穿孔。使用含有10容量%胎牛血清或不含血清的DMEM培养基(Dulbecco-Minimum Essential Medium),将导入了pGL3荧光素酶及Renilla荧光素酶的细胞调整至1.2×105个/ml,然后,接种到24-孔培养板中,使每1孔加入6.0×104个细胞。接下来,向各孔中添加500μl表2所示的受试试样,在37℃、5%CO2条件下培养24小时。然后,根据规定方法使孔中的细胞溶解得到细胞溶解液,使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega,Madison,WI,USA)评价该细胞溶解液的荧光素酶的活性。计算萤火虫荧光素酶相对于Renilla荧光素酶的活性的比率(相对活性:%),由此评价荧光素酶的活性。
[表2]
所得的结果如图2所示。由上述结果可以确认,通过使用实施例2的核酸转运用组合物,无论培养基中有无血清,均能够以高效率向细胞内转运siRNA、及在细胞内发挥该siRNA的功能。
试验例3
本试验中,作为siRNA,使用大鼠脑啡肽酶(靶向大鼠脑啡肽酶(NM-012608)的siRNA;RNA-TEC NV社,Belgium;有意义:5’-GCUCCAAAGCCGAAGAAGAdTdT,反义:5’-UCUUCUUCGGCUUUGGAGCdTdT),对实施例3的核酸转运用载体组合物在肺组织细胞内的siRNA的功能性及转运性进行评价。
通过以1∶1的重量比混合实施例3的核酸转运用载体组合物和siRNA,制备核酸转运用组合物。然后,用适当的载体(8.89w/v%的蔗糖水溶液)稀释该核酸转运用组合物得到试验液,使用IA-1B吸入(inhalation)装置(PENNCENTURY,Philadelphia,PA,USA), 将体重250-320g的雄性SD大鼠(SLC,Tokyo,日本)用吸入麻醉剂异氟烷(日本制药株式会社制)麻醉,在该麻醉状态下经肺给予此大鼠0.4mL上述所得的试验液。需要说明的是,适当地稀释核酸转运用组合物,制备上述试验液使siRNA的给予量为0.04~0.12mg/kg(大鼠)。经肺给予24小时后,将乙醚麻醉的大鼠背位固定。沿着正中线将大鼠开腹,从腹部下大静脉放血致死。然后,从大鼠中摘出肺,用冰冷的生理盐水洗涤。使用摘出的肺,测定模型靶基因NEP(中性内肽酶)的mRNA表达量及为管家基因的GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)的mRNA表达量。进而,测定摘出的肺中的大鼠脑啡肽酶(NEP)活性。其具体测定方法及结果如下所述。需要说明的是,作为对照,在相同条件下只给予载体,相同地进行试验。另外,为了比较,使用靶向EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的siRNA(Takara,日本;有意义:5’-GAACGGCAUCAAGGUGAACTT,反义:5’-GUUCACCUUGAUGCCGUUCTT)代替大鼠脑啡肽酶,相同地进行试验。
<NEP mRNA及GAPDH mRNA的定量方法及结果>
使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Germany)从摘出的肺的一部分中进行总RNA的分离·精制。使用SuperScript III First-StrandSynthesis System for RT-PCR(Invitrogen,California,USA)由mRNA合成cDNA。使用制备的cDNA,通过实时PCR法定量模型靶基因NEP(中性内肽酶)的mRNA量。另外,相同地测定为管家基因的GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)的mRNA量。计算出NEP mRNA相对于GAPDH mRNA的比率,通过比较,评价脑啡肽酶mRNA表达抑制。
由上述结果可知,给予量为0.08mg/kg的脑啡肽酶-siRNA即可显著地抑制肺中脑啡肽酶mRNA表达。其用量与作为体内RNAi效果的现有报道的用量相比较低,由此可知通过使用实施例3中所得的核酸转运用载体组合物,能够高效率地将siRNA转运至肺组织的细胞内。
<大鼠脑啡肽酶(NEP)活性的测定方法及结果>
将摘出的肺的一部分匀浆,测定匀浆物中大鼠脑啡肽酶的活性。大鼠脑啡肽酶(NEP)活性的测定,是在存在或不存在为NEP特异性 阻碍剂的膦酰二肽(phosphoramidon)(SIGMA)的条件下,测定为NEP基质的DAGNPG(N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly:SIGMA)在一定时间内水解多少,由在阻碍剂存在时和不存在时的分解物生成量的差计算NEP活性。此时使用的大鼠的肺的匀浆量为50mL,基质DAGPNG的浓度为1mM,存在阻碍剂时添加10mM膦酰二肽,总量为100mL,进行反应。反应在37℃下进行10分钟,在90℃下培养10分钟使反应停止,测定此时生成的分解物DAG(Dansyl-D-Ala-Gly)的量,算出NEP活性。需要说明的是,分解物DAG的生成量通过测定此分解物的荧光而求出,荧光的测定是在360nm下激发,测定535nm的发光。
所得结果如图3所示。由上述结果可知,给予量为0.4mg/kg的NF-siRNA即可显著抑制肺中的NEP活性。所以,由上述结果也可以确认,通过使用实施例3中得到的核酸转运用载体组合物,能够高效率地将siRNA转运至肺组织的细胞内。
试验例4
使用Premix WST-1 cell proliferation assay system(Takara,Siga,日本)评价实施例1中得到的核酸转运用载体组合物的细胞毒性。具体而言,使用DMEM培养基(Dulbecco-Minimum Essential Medium),在96-孔培养板上将A549细胞(来自人肺癌的细胞株;日本制药社制)调整至浓度为(1×105)个/ml,进行接种,使各孔的细胞数为104个。接下来,向各孔添加受试试样[实施例1的核酸转运载体、LFA2000(Lipofectamine2000;Invitrogen社制)、及NeoPhectin(NeoPharm社制)]使其浓度为2~20μg/ml。然后,向各孔中添加10μl的PremixWST-1溶液,在37℃下培养1小时后,使用酶标仪(Microplate Reader)(Tecan,Maennedorf,Switzerland)测定各孔在450nm的吸光度。另外,作为对照,相同地测定添加培养基代替受试试样的孔。A450的吸光度是指来自甲 色素的吸光度,该色素是WST-1在还原酶作用下形成的。由于该吸光度和活细胞具有直线关系,所以可制作播种的活 细胞数和吸光度的标准曲线。基于所得的标准曲线求出受试试样的细胞数。
所得的结果如图4所示。由上述结果可知,即使添加实施例1的核酸转运用载体组合物,细胞数也几乎不减少,由此可确认该核酸转运用载体组合物的毒性低、安全性高。
试验例5
使用精制水将500μg实施例4的核酸转运用载体组合物稀释至0.4mL,制备得到试验液,使用Penncentury社的1A-IC装置,将上述试验液经肺给予体重250-320g的雄性SD大鼠(SLC,Tokyo,日本)。将给药后的大鼠放回笼中,按照通常的饲养条件进行饲养。经肺给予24小时后,向大鼠腹腔内给予50mg/kg(1mL/kg)戊巴比妥(Nembutal,日本制药株式会社)进行麻醉,背位固定大鼠。将大鼠沿着正中线开腹,从腹部下大静脉放血致死。接下来,从大鼠中摘出肺,用冰冷的生理盐水洗涤。制作摘出的肺的组织切片,使用苏木精-伊红将其染色,通过显微镜观察,评价核酸转运用载体组合物对肺组织的毒性。另外,为了比较,使用LFA2000(Lipofectamine2000;Invitrogen社制)、或NeoPhectin(NeoPharm社制)代替实施例4的核酸转运用载体组合物,在与上述相同的条件下进行试验。但是,由于给予500μg的LFA2000时使大鼠致死,所以将LFA2000的给予量改为250μg,进行试验。
所得结果如图5所示。由此可知,肺局部给予LFA2000或NeoPhectin时引起炎症,部分观察到浮肿,而在给予实施例4的核酸转运用载体组合物时,此炎症症状减轻。由此结果可知,实施例4的核酸转运用载体组合物即使在肺局部给予后仍为低毒性、且安全性高。
Claims (21)
1.一种核酸转运用载体组合物,其特征在于,含有(A)具有胆固醇骨架的阳离子性脂质、及(B)季铵盐型的阳离子性脂质,其中,相对于100重量份(A)成分,以10~200重量份的比例含有(B)成分,所述季铵盐型的阳离子性脂质为选自下述物质中的至少一种:二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐、及O,O’,O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐。
2.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物,其中还含有(C)油性基材。
3.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物,其中,(A)成分为3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、及/或3β-[N’,N’,N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇。
4.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物,其中,(B)成分为选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、及N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐中的至少1种。
5.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物,其中,还含有(D)膜融合性脂质。
6.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物,其中,相对于100重量份(A)成分,以30~150重量份的比例含有(B)成分。
7.如权利要求2所述的核酸转运用载体组合物,其中,相对于100重量份(A)成分及(B)成分的总量,以0.1~50重量份的比例含有(C)成分。
8.如权利要求5所述的核酸转运用载体组合物,其中,相对于100重量份(A)成分及(B)成分的总量,以1~500重量份的比例含有(D)成分。
9.如权利要求1所述的核酸转运用载体组合物,所述组合物为siRNA转运用载体。
10.一种核酸转运用组合物,含有核酸及权利要求1至9中任一项所述的核酸转运用载体组合物。
11.如权利要求10所述的核酸转运用组合物,其中,核酸为siRNA。
12.一种核酸导入方法,其特征在于,通过使权利要求10所述的核酸转运用组合物与细胞接触,使核酸导入到细胞内,所述细胞为培养细胞或从生物体中提取的细胞。
13.含有(A)具有胆固醇骨架的阳离子性脂质及(B)季铵盐型的阳离子性脂质的组合物在制备核酸转运用载体中的应用,其中,相对于100重量份(A)成分,以10~200重量份的比例含有(B)成分,所述(B)季铵盐型的阳离子性脂质为选自下述物质中的至少一种:二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐、及O,O’,O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷溴化物盐。
14.如权利要求13所述的应用,所述组合物还含有(C)油性基材。
15.如权利要求13所述的应用,其中,(A)成分为3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇、及/或3β-[N’,N’,N’-三甲基氨基乙烷]碘化胆固醇。
16.如权利要求13所述的应用,其中,(B)成分为选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐、二油酰基三甲基铵丙烷、及N-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵盐酸盐中的至少1种。
17.如权利要求13所述的应用,其中,组合物还含有(D)膜融合性脂质。
18.如权利要求13所述的应用,其中,组合物中相对于100重量份(A)成分,以30~150重量份的比例含有(B)成分。
19.如权利要求14所述的应用,其中,组合物中相对于100重量份(A)成分及(B)成分的总量,以0.1~50重量份的比例含有(C)成分。
20.如权利要求17所述的应用,其中,组合物中相对于100重量份(A)成分及(B)成分的总量,以1~500重量份的比例含有(D)成分。
21.如权利要求13所述的应用,所述核酸转运用载体为siRNA转运用载体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005303497 | 2005-10-18 | ||
JP303497/2005 | 2005-10-18 | ||
PCT/JP2006/320617 WO2007046356A1 (ja) | 2005-10-18 | 2006-10-17 | 核酸送達用キャリアー組成物 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110461144.3A Division CN102512689B (zh) | 2005-10-18 | 2006-10-17 | 核酸转运用载体组合物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101291678A CN101291678A (zh) | 2008-10-22 |
CN101291678B true CN101291678B (zh) | 2012-03-28 |
Family
ID=37962449
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2006800389545A Expired - Fee Related CN101291678B (zh) | 2005-10-18 | 2006-10-17 | 核酸转运用载体组合物 |
CN201110461144.3A Expired - Fee Related CN102512689B (zh) | 2005-10-18 | 2006-10-17 | 核酸转运用载体组合物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110461144.3A Expired - Fee Related CN102512689B (zh) | 2005-10-18 | 2006-10-17 | 核酸转运用载体组合物 |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8030075B2 (zh) |
EP (1) | EP1946761B8 (zh) |
JP (1) | JP5046952B2 (zh) |
KR (1) | KR101324065B1 (zh) |
CN (2) | CN101291678B (zh) |
AR (1) | AR057553A1 (zh) |
AU (1) | AU2006305318B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0617449A2 (zh) |
CA (1) | CA2624840A1 (zh) |
CY (1) | CY1114586T1 (zh) |
DK (1) | DK1946761T3 (zh) |
ES (1) | ES2412029T3 (zh) |
HK (2) | HK1119956A1 (zh) |
MY (1) | MY149502A (zh) |
PL (1) | PL1946761T3 (zh) |
PT (1) | PT1946761E (zh) |
RU (1) | RU2421227C2 (zh) |
SI (1) | SI1946761T1 (zh) |
TW (1) | TW200800235A (zh) |
WO (1) | WO2007046356A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102512689A (zh) * | 2005-10-18 | 2012-06-27 | 大塚制药株式会社 | 核酸转运用载体组合物 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201407996PA (en) | 2009-12-23 | 2015-01-29 | Novartis Ag | Lipids, lipid compositions, and methods of using them |
EP2548958B1 (en) * | 2010-03-15 | 2017-11-22 | Yamaguchi University | Agent for improving gene transfer efficiency to mammalian cells |
CN104428005B (zh) * | 2012-05-23 | 2019-05-10 | 俄亥俄州立大学 | 用于反义寡核苷酸递送的脂质纳米颗粒组合物 |
WO2015154002A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-10-08 | Ohio State Innovation Foundation | Oligonucleotide lipid nanoparticle compositions, methods of making and methods of using the same |
EP3329011B1 (en) * | 2015-07-30 | 2019-12-18 | Arcis Biotechnology Holdings Limited | Method and composition |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030092180A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-05-15 | David Lewis | Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo |
US5965542A (en) * | 1997-03-18 | 1999-10-12 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Use of temperature to control the size of cationic liposome/plasmid DNA complexes |
GB9726398D0 (en) | 1997-12-12 | 1998-02-11 | Isis Innovation | Polypeptide and coding sequences |
EP1829856A3 (en) * | 1998-11-12 | 2009-02-25 | Invitrogen Corporation | Transfection reagents |
WO2002034236A2 (en) * | 2000-10-25 | 2002-05-02 | The University Of British Columbia | Lipid formulations for target delivery |
CA2437555A1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Yiyu Zou | Stabilised polymeric aerosols for pulmonary gene delivery |
US20030096414A1 (en) * | 2001-03-27 | 2003-05-22 | Invitrogen Corporation | Culture medium for cell growth and transfection |
US7713942B2 (en) * | 2001-04-04 | 2010-05-11 | Nordic Vaccine Technology A/S | Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides |
IL161733A0 (en) * | 2001-11-02 | 2005-11-20 | Insert Therapeutics Inc | Methods and compositions for therapeutic use of rna interference |
AU2003244855A1 (en) | 2002-07-05 | 2004-01-23 | Lipoxen Technologies Limited | Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination |
NZ544637A (en) * | 2003-07-16 | 2010-04-30 | Protiva Biotherapeutics Inc | Lipid encapsulated interfering RNA |
AU2005310131A1 (en) * | 2004-11-17 | 2006-06-08 | University Of Maryland, Baltimore | Highly branched HK peptides as effective carriers of siRNA |
US20070087045A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Industrial Technology Research Institute | Lipid carrier and method of preparing the same |
TW200800235A (en) * | 2005-10-18 | 2008-01-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | Carrier composition for nucleic acid transport |
-
2006
- 2006-10-16 TW TW095138027A patent/TW200800235A/zh not_active IP Right Cessation
- 2006-10-17 JP JP2007540975A patent/JP5046952B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-17 RU RU2008119498/15A patent/RU2421227C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-10-17 BR BRPI0617449-3A patent/BRPI0617449A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-10-17 EP EP06811872.8A patent/EP1946761B8/en active Active
- 2006-10-17 MY MYPI20081086A patent/MY149502A/en unknown
- 2006-10-17 PL PL06811872T patent/PL1946761T3/pl unknown
- 2006-10-17 KR KR1020087011745A patent/KR101324065B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-10-17 PT PT68118728T patent/PT1946761E/pt unknown
- 2006-10-17 CN CN2006800389545A patent/CN101291678B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-17 US US12/083,727 patent/US8030075B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-17 AU AU2006305318A patent/AU2006305318B2/en not_active Ceased
- 2006-10-17 WO PCT/JP2006/320617 patent/WO2007046356A1/ja active Application Filing
- 2006-10-17 CA CA002624840A patent/CA2624840A1/en not_active Abandoned
- 2006-10-17 SI SI200631574T patent/SI1946761T1/sl unknown
- 2006-10-17 DK DK06811872.8T patent/DK1946761T3/da active
- 2006-10-17 ES ES06811872T patent/ES2412029T3/es active Active
- 2006-10-17 AR ARP060104512A patent/AR057553A1/es unknown
- 2006-10-17 CN CN201110461144.3A patent/CN102512689B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-12-31 HK HK08114132.2A patent/HK1119956A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-12-06 HK HK12112608.5A patent/HK1171689A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-06-11 CY CY20131100464T patent/CY1114586T1/el unknown
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
Hassan Farhood et al.The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationicliposome mediated gene transfer.Biochimica et Biophysica Acta1235 2.1995,1235(2),289-295. |
Hassan Farhood et al.The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationicliposome mediated gene transfer.Biochimica et Biophysica Acta1235 2.1995,1235(2),289-295. * |
Technology Today1 5.1998,1(5),206-213. * |
Wen-Chi Tseng et al.Liposome-based gene therapy.Pharmaceutical Science & Technology Today1 5.1998,1(5),206-213. |
Wen-Chi Tseng et al.Liposome-based gene therapy.Pharmaceutical Science & * |
付爱玲等.膜穿透肽介导的核酸转运.生命的化学23 5.2003,23(5),329-332. |
付爱玲等.膜穿透肽介导的核酸转运.生命的化学23 5.2003,23(5),329-332. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102512689A (zh) * | 2005-10-18 | 2012-06-27 | 大塚制药株式会社 | 核酸转运用载体组合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BRPI0617449A2 (pt) | 2011-07-26 |
KR101324065B1 (ko) | 2013-10-31 |
EP1946761A1 (en) | 2008-07-23 |
CY1114586T1 (el) | 2016-10-05 |
CN102512689A (zh) | 2012-06-27 |
US20090258923A1 (en) | 2009-10-15 |
PL1946761T3 (pl) | 2013-08-30 |
HK1119956A1 (en) | 2009-03-20 |
CN102512689B (zh) | 2014-08-20 |
TW200800235A (en) | 2008-01-01 |
JP5046952B2 (ja) | 2012-10-10 |
CN101291678A (zh) | 2008-10-22 |
EP1946761B1 (en) | 2013-04-03 |
RU2008119498A (ru) | 2009-11-27 |
AR057553A1 (es) | 2007-12-05 |
SI1946761T1 (sl) | 2013-06-28 |
CA2624840A1 (en) | 2007-04-26 |
TWI376225B (zh) | 2012-11-11 |
DK1946761T3 (da) | 2013-04-15 |
AU2006305318B2 (en) | 2011-08-25 |
JPWO2007046356A1 (ja) | 2009-04-23 |
MY149502A (en) | 2013-09-13 |
RU2421227C2 (ru) | 2011-06-20 |
HK1171689A1 (zh) | 2013-04-05 |
KR20080059648A (ko) | 2008-06-30 |
EP1946761B8 (en) | 2013-05-22 |
ES2412029T3 (es) | 2013-07-09 |
AU2006305318A1 (en) | 2007-04-26 |
EP1946761A4 (en) | 2012-01-25 |
WO2007046356A1 (ja) | 2007-04-26 |
US8030075B2 (en) | 2011-10-04 |
PT1946761E (pt) | 2013-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101291678B (zh) | 核酸转运用载体组合物 | |
Yu et al. | Insight into mechanisms of cellular uptake of lipid nanoparticles and intracellular release of small RNAs | |
US9730893B2 (en) | Lipid assemblies comprising anionic lysolipids and use thereof | |
CN101646443B (zh) | 速效型核酸转运用载体组合物 | |
CN101854918B (zh) | 核酸复合体及核酸转运用组合物 | |
CN102369282B (zh) | 核酸复合体及核酸转运用组合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1119956 Country of ref document: HK |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1119956 Country of ref document: HK |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120328 Termination date: 20161017 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |