KR101324065B1 - 핵산 송달용 캐리어 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 siRNA 등의 핵산을 동물 유래 세포 또는 생물에 투여한 경우에 핵산을 분해로부터 보호하여 효율적으로 세포 내로 송달시킬 수 있고, 저독성인 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 해당 캐리어 조성물과 핵산을 함유하는 핵산 송달용 조성물을 제공하는 것이다.
(A) 스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질 및, (B) 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질을 조합하여 배합해서 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제한다. 또 해당 핵산 송달용 캐리어 조성물과 핵산을 혼합하여 핵산 송달용 조성물을 조제한다.
Figure R1020087011745
핵산, 동물 유래 세포, 생물, 저독성, 조성물

Description

핵산 송달용 캐리어 조성물{CARRIER COMPOSITION FOR NUCLEIC ACID TRANSPORT}
본 발명은 핵산을 동물 유래 세포 또는 생물에 투여한 경우에 핵산을 분해로부터 보호하고, 효율적으로 세포 내로 송달시킬 수 있는 저독성이고 안전성이 높은 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물에 관한 것이다.
근래의 바이오테크놀로지의 발전에 의해 세포 내에서 생리 활성 기능을 발휘하는 핵산이 여러 가지로 명백해지고 있다. 예를 들면 siRNA(small interfering RNA)는 세포에 존재하는 표적 유전자의 mRNA의 분해를 야기하고, 표적 유전자의 발현을 저해하는 것(RNA interference, RNA간섭)이 알려져 있다. 이 RNA간섭에 의한 표적 유전자의 발현 저해 기능은 특정한 유전자 또는 유전자군의 이상한 발현이 원인으로 되어 발생하는 질환 증상을 경감 내지 치료하는 데 유용하여 siRNA는 치료약으로서의 개발이 기대되고 있다. 그러나 siRNA를 비롯한 핵산을 치료약 등으로서 이용하기 위해서는, 표적 세포 내에서 siRNA의 기능을 발휘하는 것이 중요하며, 이를 위해서는 핵산을 표적 세포 내에 효율적으로 송달시키는 기술을 확립하는 것 이 필요 불가결하다.
외래성 핵산 분자 또는 유전자를 세포 내에 송달하는 기술로서, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스 등을 포함하는 다수의 바이러스가 인간에 있어서의 난치성 질환 치료를 위해 이용되고 있다. 그러나 감염성, 면역 반응성, 생산성 등의 문제에 의해 치료에는 곤란함이 동반되고 있었다. 이 때문에 바이러스 유래의 문제점을 극복하고, 또한 핵산 분자를 세포 내에 송달하기 위한 비바이러스성 캐리어의 개발이 실시되어 왔다.
지금까지 siRNA 등의 핵산의 세포 내로의 송달을 촉진하는 비바이러스성 핵산 송달용 캐리어로서, 예를 들면 특허 문헌 1에는 특정 구조의 카티온성 지질이 보고되어 있다. 그러나 특허 문헌 1에서 보고되어 있는 카티온성 지질에서는 배양 세포 또는 생체에 투여한 경우에는 독성을 나타낸다는 결점이 있었다. 또 특허 문헌 2에는 비교적 독성이 낮고 siRNA를 세포 내에 송달 가능한 캐리어 조성물로서, 양친매성 화합물 및 폴리카티온을 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 그러나 특허 문헌 2에 보고되어 있는 조성물에서도 충분한 양의 siRNA를 세포 내에 도입하는 경우에는 세포에 미치는 독성의 점에서 여전히 문제가 있었다.
이와 같은 종래 기술을 배경으로 하여 저독성이고, siRNA를 비롯한 핵산을 효율적으로 세포 내로 송달시킬 수 있는 핵산 송달용 캐리어 조성물의 개발이 절실히 요망되고 있었다.
특허 문헌 1: 일본국 특표2002-529439호 공보
특허 문헌 2: 일본국 특표2005-508394호 공보
그래서 본 발명은 상기 종래 기술의 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는, 본 발명의 목적은 siRNA 등의 핵산을 동물 유래 세포 또는 생물에 투여한 경우에 핵산을 분해로부터 보호하여 효율적으로 세포 내로 송달시킬 수 있고, 저독성이고 높은 안전성을 나타내는 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 해당 캐리어 조성물과 핵산을 함유하는 핵산 송달용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 바, (A)스테로이드 핵을 갖는 카티온성 지질 및, (B)제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질을 조합하여 함유하는 조성물은 독성이 낮고, 또한 핵산을 분해로부터 보호하여 효율적으로 세포 내로 송달시킬 수 있어서 핵산 송달용 캐리어로서 유용한 것을 발견해냈다. 본 발명은 이들의 지견에 기초하여 더욱 검토를 거듭함으로써 완성된 것이다.
즉 본 발명은 하기에 게재하는 형태의 발명을 제공한다:
항 1. (A) 스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질 및, (B) 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 2. 항 1에 있어서, (C) 유성 기재를 더 함유하는 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 3. 항 1에 있어서, (A)성분이 3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤 및/또는 3β―[N’, N’, N’―트리메틸아미노에탄]요오드화 콜레스테롤인 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 4. 항 1에 있어서, (B)성분이 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염, 디올레오일트리메틸암모늄프로판 및 N―(1―(2, 3―비스(올레오일옥시)프로필)―N, N, N―트리메틸암모늄염산염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류인 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 5. 항 1에 있어서, (A)성분 100중량부에 대하여 (B)성분이 10∼200중량부의 비율로 포함되는 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 6. 항 1에 있어서, siRNA송달용 캐리어인 핵산 송달용 캐리어 조성물.
항 7. 핵산 및 항 1에서 5 중 어느 한 항에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물을 함유하는 핵산 송달용 조성물.
항 8. 항 7에 있어서, 핵산이 siRNA인 핵산 송달용 조성물.
항 9. 항 7에 기재된 핵산 송달용 조성물을 세포에 접촉시킴으로써 핵산을 세포 내에 도입시키는 것을 특징으로 하는 핵산 도입 방법.
항 10. (A)스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질 및 (B) 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질의 핵산 송달용 캐리어 조성물의 제조를 위한 사용.
발명의 효과
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물에 따르면, 하기의 우수한 효과가 얻어진다.
(1) 세포 내에 효율적으로 핵산을 송달하여 세포 내에서 핵산의 기능을 유효하게 발휘시킬 수 있다.
(2) 생체 내나 배양액 중에서 핵산의 분해를 억제할 수 있다.
(3) 독성이 낮고, 안전성이 높다.
따라서 상기 핵산 송달용 캐리어 조성물 및 핵산 송달용 조성물은 핵산의 도입에 의한 각종 질환의 치료, 특히 저분자 화합물 등으로는 치료하기 어려운 난치성 질환 치료에 유용하다.
또 본 발명의 핵산 송달용 조성물은 동결 건조 처리가 가능하기 때문에 동결 건조 상태로 보존할 수 있다는 잇점도 있다.
도 1은 시험예 1에 있어서, 각종 피검 시료를 이용하여 세포를 처리한 후에 세포의 핵산 유래의 형광상을 형광 현미경에 의해 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 시험예 2에 있어서, 각종 피검 시료를 이용하여 세포를 처리한 후에 세포의 루시페라아제 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 시험예 3에 있어서, 쥐의 폐에 있어서의 neprilysin(NEP) 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 시험예 4에 있어서, 각종 피검 시료로 처리한 후의 생세포수의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 시험예 5에 있어서, 쥐의 폐조직 절편을 헤마톡실린―에오신으로 염색한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 헤마톡실린이 핵ㆍ리보솜 등을 청람색으로 염색하고 있으며, 에오신이 세포질ㆍ섬유ㆍ적혈구를 적색으로 염색하고 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
핵산 송달용 캐리어
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 (A) 스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질 및 (B) 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 핵산을 세포 내에 송달(도입)하기 위한 핵산의 캐리어로서 사용된다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물이 적용되는 핵산은 세포 내로의 송달이 필요하게 되어 있는 것이면, 그 종류나 구조에 대해서는 특별히 제한되지 않는다. 해당 핵산의 구체예로서, siRNA, mRNA, tRNA, rRNA, cDNA, miRNA(마이크로RNA), 리보자임, 안티센스 올리고, 디코이 올리고뉴클레오티드, 플라스미드DNA, 펩티드 핵산, 3중 사슬 형성성 올리고뉴클레오티드(Triplex Forming Oligonucleotide, TFO), 유전자 등이 예시된다. 그 중에서도 특히 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 siRNA의 세포 내로의 송달용으로서 유용하다. 본 발명의 핵산 송달용 캐리어가 적용되는 핵산은 인간, 동물, 식물, 세균, 바이러스 등에 유래하는 것이어도 좋고, 또 화학 합성에 의해 제조된 것이어도 좋다. 또한 이들의 핵산은 1개 사슬, 2개 사슬, 3개 사슬의 어느 쪽이어도 좋고, 또한 그 분자량에 대해서도 특별히 제한되지 않는다. 또 본 발명에 있어서, 핵산은 화학, 효소, 또는 펩티드로 수식된 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서, 핵산은 1종류의 것을 단독으로 사용해도 좋고, 또 2종류 이상의 것을 적절히 조합하여 사용해도 좋다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 사용되는 스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질(이하, “(A)성분”으로 표기하는 일도 있다)이란, 스테로이드핵(퍼히드로시클로펜타페난트렌환; C17H28)을 갖고, 카티온성을 나타내는 지질이다. 본 발명에 사용되는 스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질로서는, 약리학적으로 허용되는 것을 한도로 하여 특별히 제한되지 않지만, 구체예로서는, 3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤(DC―Chol), 3β―[N’, N’, N’―트리메틸아미노에탄]요오드화 콜레스테롤(TC-Chol), 비스(구아니디늄)―트렌―콜레스테로스(BGTC), N―콜레스테릴옥시카르보닐―3, 7―디아자노난―1, 9―디아민, β―알라닌―디에탄올아민―콜레스테롤, N4―스펠민콜레스테릴카르바메이트(GL―67; N4―spermine cholesteryl carbamate), N[N4―3―아미노프로필스펠미딘]콜레스테릴카르바메이트(GL-78; N[N4―3―aminopropylspermidine]cholesteryl carbamate), N4―스펠민콜레스테릴카르복시아미드(GL-90; N4-spermine cholesteryl carboxamide), N1, N8―비스(아르기닉카르복시아미드)―N4―스페르미딘콜레스테릴카르바메이트(GL-95; N1, N8-Bis(arginic carboxamide)―N4―spermidine cholestery carbamate), N―[N1, N4, N8―트리스(3―아미노프로필)스페르미딘]콜레스테릴카르바메이트(GL-96; N ―[N1, N4, N8-Tris(3-aminopropyl)spermidine]cholesteryl carbamate) 등의 콜레스테롤 유도체(콜레스테롤 골격을 갖는 카티온성 지질); 스쿠알라민(Squalamine), 3a, 7a, 12a―트리스(3―아미노프로폭시)―5β―콜란―24―(N, N―비스(3―아미노프로필)아민(3a, 7a, 12a―Tris(3―aminopropoxy)―5β―cholan―24―(N, N―bis(3―aminopropyl)amine), 3a, 7a, 12a―트리스(3―아미노프로폭시)―5β―콜란―24―(N―(N―(3―아미노프로필))―3―아미노프로필)―아민(3a, 7a, 12a―Tris(3―aminopropoxy)―5b―cholan―24―(N―(N―(3―aminopropyl))―3―aminopropyl)―amine), 3a, 7a, 12a―트리스(3―아지도프로폭시)―5β―콜란―24―(N, N―비스(2―시아노에틸)아민)(3a, 7a, 12a―Tris(3―azidopropoxy)―5b―cholan―24―(N,N―bis(2―cyanoethyl)amine)), 3a, 7a, 12a―트리스(3―아지도프로폭시)―5β―콜란―24―(N―(벤질옥시카르보닐)―N―(히드록시프로필)―아민)(3a, 7a, 12a―Tris(3―azidopropoxy)―5b―cholan―24―(N―(benzyloxycarbonyl)―N―(3―hydroxypropyl)―amine)) 등의 스테로이드가 결합되어 있는 카티온성 지질; 엄브랠러―스페르민 복합체(Umbrella-spermine conjugates) 등의 콜산이 결합되어 있는 카티온성 지질; 스테롤 글리콕시드가 결합되어 있는 카티온성 지질; 스테로이드 사포닌이 결합되어 있는 카티온성 지질 등이 예시된다. 이들의 스테로이드핵을 갖는 카티온성 단순 지질은 1종류 단독으로 사용해도 좋고, 또 2종류 이상을 임의로 조합하여 사용해도 좋다.
스테로이드 핵을 갖는 카티온성 지질로서, 바람직하게는 콜레스테롤 유도체 (콜레스테롤 골격을 갖는 카티온성 지질)를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤 및 3β―[N’, N’, N’―트리메틸아미노에탄]요오드화 콜레스테롤(TC-Chol)을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 사용되는 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질(이하 「(B)성분」으로 표기하는 일도 있다)로서는, 약리학적으로 허용되는 것을 한도로 하여 특별히 제한되지 않는다. 그 구체예로서는, 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염(DDAB), 1, 2―디미리스토일―3―트리메틸암모늄프로판, 1, 2―디올레오일―3―트리메틸암모늄프로판(DOTAP), 1, 2―디올레오일―3―트리메틸암모늄프로판메틸황산염, 1, 2―디팔미토일―3―트리메틸암모늄프로판, 1, 2―디스테아로일―3―트리메틸암모늄프로판, N―(1―(2, 3―비스(올레오일옥시)프로필)―N, N, N―트리메틸암모늄염산염(DOTMA), 디미리스토일옥시프로필디메틸히드록시에틸암모늄브로마이드염(DMRIE), 디올레오일옥시프로필디메틸히드록시에틸암모늄브로마이드(DORIE), 디메틸디도데실암모늄브로마이드, N―(a―트리메틸암모니오아세틸)―디도데실―D―글루타민염산염, N―(a―트리메틸암모니오아세틸)―O, O’―비스―(1H, 1H, 2H, 2H―퍼플루오로데실)―L―글루타민염산염, O, O’―디도데카노일―N―(a―트리메틸암모니오아세틸)디에탄올아민염산염, 메틸알릴디도데실암모늄브로마이드, N―{p―(w―트리메틸암모니오부틸옥시)―벤조일}―디도데실―L―글루타민염산염, 9―(w―트리메틸암모니오부틸)―3, 6―비스(도데카노일)카르바졸브로마이드, 디메틸디옥타데실암모늄염산염, N―w―트리메틸암모니오데카노일―디헥사데실―D―글루타민브로마이드, N―{p―(w―트리메틸암모니오헥실옥시)―벤조일}―디테트라데실―L ―글루타민브로마이드, p―(w―트리메틸암모니오데실옥시)―p’―옥틸옥시아조벤젠브로마이드염(MC―1―0810), p―{w―(b―히드록시에틸)디메틸―암모니오―데실옥시}―p’―옥틸옥시아조벤젠브로마이드염(MC―3―0810), O, O’, O’’―트리도데카노일―N―(w―트리메틸―암모니오데카노일)―트리스(히드록시메틸)아미노메탄브로마이드염(TC―1―12), 1, 2―디라우릴―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1, 2―디미리스토일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1, 2―디팔미토일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1, 2―디스테아로일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1, 2―디올레오일―글리세로―3―에틸포스포콜린, 1―팔미토일―2―올레오일―글리세로―3―에틸포스포콜린 등이 예시된다. 이들의 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질은 1종류 단독으로 사용해도 좋고, 또 2종류 이상을 임의로 조합하여 사용해도 좋다.
이들의 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질 중에서 바람직하게는 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염(DDAB), 디올레오일트리메틸암모늄프로판(DOTAP), N―(1―(2, 3―비스(올레오일옥시)프로필)―N, N, N―트리메틸암모늄염산염(DOTMA), O, O’―디도데카노일―N―(a―트리메틸암모니오아세틸)디에탄올아민염산염(DC―6―12, n＝12; 및 DC―6―14, n＝14), p―{w―(b―히드록시에틸)디메틸―암모니오―데실옥시}―p’―옥틸옥시아조벤젠브로마이드염(MC―3―0810) 및 O, O’, O’’―트리도데카노일―N―(w―트리메틸―암모니오데카노일)―트리스(히드록시메틸)아미노메탄브로마이드염(TC―1―12)을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염(DDAB), 디올레오일트리메틸암모늄프로판(DOTAP), N―(1―(2, 3―비스(올레오일옥시)프로필)―N, N, N―트리메틸암모늄염산염(DOTMA)을 들 수 있 다.
또 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 있어서, (A)성분과 (B)성분의 배합 비율에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 핵산을 세포 내에 보다 효율적으로 송달한다는 관점에서는 (A)성분 100중량부에 대하여, (B)성분이 10∼200중량부, 바람직하게는 30∼150중량부, 더욱 바람직하게는 75∼125중량부가 예시된다. 또 본 발명의 핵산 송달용 캐리어의 총량에 대한 (A)성분과 (B)성분의 합계량으로서는, 예를 들면 10∼100중량％, 바람직하게는 20∼80중량％, 더욱 바람직하게는 40∼70중량％를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 상기 (A) 및 (B)성분에 추가하여 유성 기제(이하 (C)성분이라 하는 일도 있다)를 더 포함하고 있어도 좋다. 유성 기제를 배합하고, 그 특성을 이용함으로써 핵산 송달용 캐리어 조성물에 의한 핵산의 도입 효율의 제어가 가능해진다. 예를 들면 유성 기제를 배합하여 핵산 송달용 캐리어 조성물의 비중을 조정함으로써 세포와 핵산 송달용 캐리어 조성물의 접촉성을 제어하고, in vitro에서의 도입 효율을 개선하는 것이 가능해진다. 또 예를 들면 유성 기제로서, 온도 감수성 기능을 갖는 것을 배합함으로써 소정의 온도 조건 하에서 핵산 캐리어의 코어를 붕괴시켜서 세포 표면에서의 흔들림을 유인하여 핵산의 도입 효율을 향상시키는 것이 가능해진다. 또한 예를 들면 유성 기제로서 외부 자극 붕괴성을 갖는 것을 배합함으로써 외부 자극에 의해 핵산 캐리어 조성물의 코어를 붕괴시켜서 세포 표면에서의 흔들림을 유인하여 핵산의 도입 효율을 향상시키는 것이 가능해진다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 배합되는 유성 기제로서는, 예를 들면 퍼플루오로카본, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로옥틸브로마이드, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로트리부틸아민, 대두유, 정제 대두유, 수소 첨가 경화유, 대두유불검화(unsaponified)물, 스쿠알렌, 피마자유, 정향유, 트리올레인산 소르비탄, 테레빈유, 잇꽃유, 잇꽃유지방산, 올레인산, 야자유, 평지씨유, 퓨젤유, 올리브유, 아마인유, 참깨유, 엽록소유, 파두유, 베르가모트유, 시더유, 오렌지유, 회향유, 유칼리유, 옥수수유, 라벤더유, 마요라나유, 레몬유, 면실유, 야자유, 난황유, 장미유, 파인유, 편도유, 낙화생유, 동백유, 장뇌유, 카밀레유, 계피유, 박하유, 에스테르화 옥수수유, 생강유, 로마카밀레유, 뱀유, 스피어민트유, 해바라기유, 카카오기름, 밀배아유, 산화아연유, 경화유, 수소 첨가 식물유, 경질 유동 파라핀, 유동 파라핀, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 밍크유, 광귤유, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유10, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유100, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유20, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유40, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유5, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유50, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유60, 폴리옥실35 피마자유, 프로세스유 등을 들 수 있다. 이들의 유성 기제 중 퍼플루오로펜탄에는 온도 감수성이 있고, 29. 5℃에서 비등에 의해 가스화하는 특성이 있다. 또 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로옥틸브로마이드 및 퍼플루오로트리부틸아민에는 외부 자극 붕괴성이 있고, 초음파 조사에 의한 자극 등의 외부로부터의 자극에 의해 캐리어 조성물의 코어에 캐비테이션을 발생시켜서 붕괴시킨다는 특성이 있다.
해당 유성 기제를 함유하는 경우 해당 유성 기제의 비율로서는, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 특별히 제한되지 않지만, 상기 (A)성분 및 (B)성분의 총량 100중량부에 대하여 해당 유성 기재가 0.1∼50중량부, 바람직하게는 1∼30중량부, 더욱 바람직하게는 5∼20중량부로 되는 비율이 예시된다.
또한 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에는 필요에 따라서 막 융합성 지질(헬퍼 지질)을 포함하고 있어도 좋다. 이러한 막 융합성 지질을 함유함으로써 세포 내로의 핵산의 송달 효율을 한층 향상시키는 것이 가능하게 된다. 이와 같은 막 융합성 지질로서는, 예를 들면 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜콜린, 트랜스포스파치딜포스파티딜에탄올아민, 1, 2―비스(10, 12―트리콕사디노일)―포스포에탄올아민, 1, 2―디엘라이도일포스포에탄올아민, 1, 2―디헥사데실포스포에탄올아민, 1, 2―디헥사노일포스포에탄올아민, 1, 2―디라우로일포스포에탄올아민, 1, 2―디리놀레오일포스포에탄올아민, 1, 2―디미리스토일포스포에탄올아민, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민, 1, 2―디팔미토올레오일포스포에탄올아민, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민, 1, 2―디피타노일포스포에탄올아민, 1, 2―디스테아로일포스포에탄올아민, 1―팔미토일―2―올레오일포스포에탄올아민, 1―팔미토일―2―(10, 12―트리콕사디노일)포스포에탄올아민, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―카프로일아민, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―카프로일아민, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N, N―디메틸, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N, N―디메틸, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―도데카노일, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―도데카노일, 1, 2―디올레오일포스포에탄올 아민―N―도데카닐아민, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―도데카닐아민, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―글루타릴, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―글루타릴, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―락토오스, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―[4(p-말레이미드메틸)사이클로헥산―카르복실산염, 디팔미토일포스포에탄올아민―N―[4(p-말레이미드메틸)사이클로헥산―카르복실산염, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―[4(p―말레이미드페닐)부티라미드, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―[4(p―말레이미드페닐)낙산염], 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―메틸, 디팔미토일포스포에탄올아민―N―메틸, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―[3―(2―피리딜디티오)프로피온산염, 1, 2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―[3―(2―피리딜디티오)프로피온산염, 1, 2―디올레오일포스포에탄올아민―N―석시닐), 1,2―디팔미토일포스포에탄올아민―N―(석시닐)등을 들 수 있다. 그 중에서도 디올레오일포스파티딜에탄올아민은 본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물에 있어서 가장 적합하게 사용된다.
해당 막 융합성 지질을 함유하는 경우 해당 막 융합성 지질의 비율로서는, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 제한되지 않지만, 상기 (A)성분 및 (B)성분의 총량 100중량부에 대하여 해당 막 융합성 지질이 1∼500중량부, 바람직하게는 10∼250중량부, 더욱 바람직하게는 25∼100중량부로 되는 비율이 예시된다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 사용 형태에 따라서 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정화제, 완충제, 보존제 등의 여러 가지 첨가제를 함유 할 수 있다. 이들 첨가제의 배합량은 핵산 송달용 캐리어의 사용 형태에 따라서 적절 히 설정할 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 상기 (A)성분, (B)성분 및 필요에 따라서 타성분을 혼합함으로써 제조된다.
핵산 송달용 조성물
본 발명의 핵산 송달용 조성물은 상기의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 핵산을 함유하는 것으로, 해당 핵산 송달용 조성물 중에서 핵산은 핵산 송달용 캐리어 조성물의 배합 성분과 이온 결합 또는 소수 결합에 의해 복합체를 형성하고 있으며, 핵산의 세포 내로의 송달률이 향상되고 있다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물은 상기의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 핵산을 혼합하거나, 또는 핵산 및 상기의 핵산 송달용 캐리어 조성물의 배합 성분을 임의의 순서로 혼합함으로써 제조된다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물에 있어서, 핵산과 핵산 송달용 캐리어 조성물의 배합 비율로서는, 사용하는 핵산이나 핵산 송달용 캐리어의 종류나 핵산의 송달 대상으로 되는 세포의 종류 등에 따라서 다르지만, 예를 들면 핵산 송달용 캐리어 조성물에 포함되는 (A) 및 (B)성분의 총량 100중량부에 대하여 핵산이 0. 1∼300중량부, 바람직하게는 1∼100중량부, 더욱 바람직하게는 2. 5∼50중량부로 되는 비율을 들 수 있다.
또 핵산 송달용 조성물에 포함되는 (A) 및 (B)성분의 합계량으로서는, 해당 조성물의 총량에 대하여 예를 들면 10∼90중량％、 바람직하게는 30∼80중량％、더 욱 바람직하게는 50∼70중량％를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물은 사용 형태에 따라서 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정화제, 완충제, 보존제 등의 여러 가지 첨가제를 함유할 수 있다. 이들 첨가제의 배합량은 핵산 송달용 조성물의 사용 형태에 따라서 적절히 설정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산이 송달되는 세포로서는, 배양 세포, 생체로부터 추출한 세포[표준화된(established) 세포를 포함한다], 생체 내에 존재하는 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 송달용 조성물의 사용 형태로서는, 해당 핵산 송달용 조성물이 핵산 도입 대상으로 되는 세포에 접촉하도록 적용되는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 생체 내의 세포에 핵산을 송달하는 경우이면, 조직으로의 직접 주입; 정맥, 피하, 근육, 복강, 눈 안(eye), 소화 기관 내, 이 안(tooth) 등으로의 주사; 비강, 구강, 폐 등으로의 흡입 투여; 경구 투여; 피부를 통한 경피 투여; 및 구강 점막, 질 점막, 안 점막, 직장 점막, 자궁 점막을 통한 경점막 투여 등이 예시된다. 또 배양 세포나 생체로부터 추출한 세포에 핵산을 송달하는 경우이면, 배양 시에 미리 핵산 송달용 조성물을 존재시킨 상태에서 세포를 배양하는 방법이 예시된다. 또한 배양 세포나 생체로부터 추출한 세포에 핵산을 송달하는 경우 혈청의 존재 하에서도 핵산의 세포 내로의 송달이 가능하다.
(실시예)
이하 실시예 등에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
하기 조성의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제했다.
디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염 0. 9㎍
3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤 0. 9㎍
디올레오일포스파티딜에탄올아민 0. 9㎍
글리세롤 40. 5㎍
정제수 2㎕
OPTI ― MEM 배지( Invitrongen 사제) 적량
총량 50㎕
실시예 2
우선 하기 조성의 핵산 함유액을 조제했다.
siRNA 2 pmol
OPTI ― MEM 배지( Invitrongen 사제) 적량
총량 50㎕
이어서 상기에서 얻어진 핵산 송달용 캐리어 조성물 50㎕과 핵산 함유액 50 ㎕을 혼합하고, 20분간 실온에서 인큐베이트함으로써 siRNA송달용 조성물을 조제했다.
실시예 3
하기 조성의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제했다.
디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염 0. 5㎎
3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤 0. 5㎎
디올레오일포스파티딜에탄올아민 0. 5mg
스쿠로오스 88. 9㎎
정제수 적량
총량 1. 0㎖
실시예 4
하기 조성의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 조제했다.
디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염 0. 5㎎
3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤 0. 5㎎
디올레오일포스파티딜에탄올아민 0. 5㎎
정제수 적량
총량 1. 0㎖
시험예 1
실시예 2의 siRNA송달용 조성물의 세포 내로의 siRNA의 송달성을 평가하기 위해 A549세포(인간 폐암 유래의 세포주; 다이닛폰 제약사제)를 모델 세포로 하여 이하의 시험을 실시했다. 또한 본 시험에 있어서, siRNA는 형광 표식한 GL3―siRNA(개똥벌레 루시페라아제에 대한 siRNA; Dharmacon사, Boulder, CO, USA; sense: 5’―CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT, antisense: 5’―UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)를 이용했다.
우선 DMEM배지(Dulbecco-Minimum Essential Medium)를 이용하여 1. 2×105개/㎖의 농도로 조정한 A549세포를 24―웰 플레이트에 1웰당 6. 0×104개의 세포가 들어 가도록 세포를 시드했다. 이어서 표 1에 나타내는 피검 시료 500㎕을 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5％CO2 조건 하에서 24시간 인큐베이트했다. 그 후 세포의 핵산 유래의 형광상을 형광 현미경(Olympus IX 71 fluorescence microscope; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하고, 세포 내로의 siRNA의 송달성을 평가했다.
[표1]
시험 시료
 조성
No 도 1 중의 표시
1 핵산 송달용 캐리어 조성물＋siRNA 실시예 2의 핵산 송달용 조성물
2 LFA2000＋siRNA LFA2000(Lipofectamine2000; Invitrogen사제)(1. 0㎎/mL) 및 siRNA(20pmol/㎖)를 함유하는 OPTI-MEM배지
3 NeoPhectin＋siRNA NeoPhectin(NeoPharm사제)(1. 0㎎/mL), siRNA(20pmol/㎖)를 함유하는 OPTI-MEM배지
4 siRNA siRNA(20pmol/㎖)를 함유하는 OPTI-MEM 배지
얻어진 결과를 도 1에 나타낸다. 단순히 siRNA만을 첨가한 경우에는 세포 내에 형광이 관찰되지 않았다. 한편 실시예 2의 핵산 송달용 조성물을 사용한 경우, 또는 공지의 세포 송달용 캐리어(LFA2000이나 NeoPhectin)와 함께 siRNA를 첨가한 경우에는 세포 내에서 형광이 관찰되었다. 특히 실시예 2의 핵산 송달용 조성물을 이용한 경우에는 강한 형광이 세포 내에서 관찰되었다. 이것으로부터 본 발명의 핵산 송달용 조성물은 우수한 핵산 송달능을 갖고 있는 것이 확인되었다.
시험예 2
표적 유전자의 단백질 레벨에서의 억제를 평가하기 위해 루시페라아제 유전자를 코드하는 플라스미드를 세포에 일과적으로 도입하고, 그 후 상기 실시예 2의 핵산 송달용 조성물을 첨가하여 루시페라아제의 발현량을 평가했다. 또한 본 시험에 있어서, siRNA는 GL3―siRNA(개똥벌레 루시페라아제에 대한 siRNA; Dharmacon사, Boulder, CO, USA; sense: 5’―CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT, antisense: 5’―UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)를 이용했다.
구체적으로는, 10㎎의 pGL3루시페라아제 및 레닐라루시페라아제(Promega, Madison, WI, USA)를 5×106개의 A549세포(인간 폐암 유래의 세포주; 다이닛폰 제약사제)에 첨가하고, 뉴클레오펙타(Amaxa Inc., Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 일렉트로포레이션을 실시했다. pGL3루시페라아제 및 레닐라루시페라아제를 도입한 세포를 10용량％의 우태아 혈청 함유 또는 무혈청의 DMEM 배지(Dulbecco-Minimum Essential Medium)를 이용하여 1. 2×105개/㎖로 되도록 조정한 후 24―웰 플레이트에 1웰당 6. 0×104개의 세포가 들어가도록 시드했다. 이어서 표 2에 나타내는 피검 시료 500㎕을 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 24시간 인큐베이트했다. 그 후 정법에 따라서 웰 중의 세포를 용해시켜서 세포 용해액을 얻고, 해당 세포 용해액의 루시페라아제의 활성을 Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 평가를 실시했다. 루시페라아제의 활성은 레닐라루시페라아제에 대한 개똥벌레 루시페라아제의 활성의 비율(상대 활성： ％）을 산출함으로써 실시했다.
[표2]
피검 시료
조성
No 도 2 중의 표시
1 핵산 송달용 캐리어 조성물＋siRNA 실시예 2의 핵산 송달용 조성물
2 LFA2000＋siRNA LFA2000(Lipofectamine2000; Invitrogen사제)(1. 0㎎/mL) 및 siRNA(20pmol/㎖)를 함유하는 OPTI-MEM배지
3 NeoPhectin＋siRNA NeoPhectin(NeoPharm사제)(1. 0㎎/mL) 및 siRNA(20pmol/㎖)를 함유하는 OPTI-MEM배지
4 siRNA siRNA(20pmol/㎖)를 함유하는 OPTI-MEM배지
5 LFA2000 LFA2000(Lipofectamine2000; Invitrogen사제)(1. 0㎎/mL)을 함유하는 OPTI-MEM배지
6 NeoPhectin NeoPhectin(NeoPharm사제)(1. 0㎎/mL)을 함유하는 OPTI-MEM배지
7 핵산 송달용 캐리어 조성물 실시예 1에서 얻어진 핵산 송달용 캐리어(50용량％)를 함유하는 OPTI-MEM배지
8 Control OPTI-MEM배지
얻어진 결과를 도 2에 나타낸다. 이 결과로부터 실시예 2의 핵산 송달용 조성물을 사용함으로써 배지 중의 혈청의 유무에 불구하고 고효율로 세포 내로의 siRNA의 송달 및 세포 내에서의 해당 siRNA의 기능 발현이 가능해지는 것이 확인되었다.
시험예 3
본 시험에서는 siRNA로서, Rat Neprilysin(Rat Neprilysin(NM_012608)에 대한 siRNA; RNA-TEC NV사, Belgium; Sense: 5’―GCUCCAAAGCCGAAGAAGAdTdT, Antisense: 5’―UCUUCUUCGGCUUUGGAGCdTdT)을 이용하여 실시예 3의 핵산 송달용 캐리어 조성물의 폐조직 세포 내에 있어서의 siRNA의 기능성 및 송달성에 대해서 평가를 실시했다.
실시예 3의 핵산 송달용 캐리어 조성물과 siRNA를 1:1의 중량비로 혼합함으로써 핵산 송달용 조성물을 조제했다. 이어서 해당 핵산 송달용 조성물을 적당한 캐리어(8. 89w/v％의 스쿠로오스수용액)에 희석한 시험액 0. 4mL을 체중 250―320g의 웅성 SD쥐(SLC, Tokyo, Japan)에 IA-1B inhalation디바이스(PENNCENTURY, Philadelphia, PA, USA)를 이용하여 흡입 마취제 이소플루란(다이닛폰 제약 주식회사 제)에 의한 마취 하에서 경폐 투여했다. 또한 상기 시험액은 siRNA의 투여량이 0. 04∼0. 12㎎/㎏(쥐)로 되도록 핵산 송달용 조성물을 적절히 희석하여 조제했다. 경폐 투여 24시간 후에 에테르 마취하여 쥐를 배위(supine position)에 고정했다. 정중앙선을 따라 쥐를 개복하고, 복부하 대정맥으로부터 출혈사시켰다. 이어서 쥐로부터 폐를 적출하고, 빙랭한 생리 식염수로 세정했다. 적출한 폐를 이용하여 모델 표적 유전자NEP(neutral endopeptidase)의 mRNA발현량 및 하우스키핑 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA발현량을 측정했다. 또한 적출한 폐에 있어서의 Rat neprilysin(NEP)활성을 측정했다. 이들의 구체적 측정 방법 및 결과는 이하와 같다. 또한 컨트롤로서, 캐리어만을 동일 조건으로 투여한 경우에 대해서도 마찬가지로 시험을 실시했다. 또 비교를 위해 Rat Neprilysin 대신에 EGFP(enhanced green fluorescent protein)에 대한 siRNA(Takara, Japan; Sense: 5’―GAACGGCAUCAAGGUGAACTT, Antisense: 5’―GUUCACCUUGAUGCCGUUCTT)를 이용하여 마찬가지로 시험을 실시했다.
＜NEP mRNA 및 GAPDH mRNA의 정량 방법 및 결과＞
적출한 폐의 일부로부터 총 RNA의 격리ㆍ정제를 RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 실시했다. mRNA로부터 cDNA로의 합성은 SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen, California, USA)을 이용하여 실시했다. 조제한 cDNA를 이용하여 리얼타임PCR법에 의해 모델 표적 유전자NEP(neutral endopeptidase)의 mRNA량을 정량했다. 또 하우스키핑 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA량에 대해서도 마찬가지로 측정을 실시했다. Neprilysin mRNA 발현 억제의 평가는 GAPDH mRNA에 대한 NEP mRNA의 비율을 산출하고, 비교함으로써 실시했다.
이 결과로부터 0. 08㎎/㎏의 투여량의 Neprilysin-siRNA에 의해서도 폐에 있어서의 Neprilysin mRNA발현은 현저하게 억제되어 있는 것이 확인되었다. 이 복용량은 in vivo RNAi효과로서 종래 보고되어 있는 복용량에 비교하여 저복용량인 것 에서, 실시예 3에서 얻어진 핵산 송달용 캐리어 조성물을 사용함으로써 효율적으로 siRNA를 폐조직의 세포 내에 송달할 수 있는 것이 명백해졌다.
＜Rat neprilysin(NEP)활성의 측정 방법 및 결과＞
적출한 폐의 일부를 균질화하고, 균질화 중에 있어서의 Rat neprilysin의 활성을 측정했다. Rat neprilysin(NEP)활성의 측정은 NEP에 특이적인 저해제인 phosphoramidon(SIGMA)의 존재 또는 비존재 하에서 NEP의 기질인 DAGNPG(N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly: SIGMA)가 일정 시간에 어느 정도 가수 분해되는지를 측정하고, 저해제 존재 시와 비존재 시에서의 분해물 생성량의 차이로부터 NEP활성을 산출했다. 이 때 이용하는 쥐 폐 균질화량은 50mL, 기질 DAGPNG의 농도는 1mM, 저해제 존재의 경우에는 10mM phosphoramidon을 추가하여 전량 100mL로 반응을 실시했다. 반응은 37℃에서 10분간으로 하고, 90℃에서 10분간 인큐베이트함으로써 반응을 정지시키고, 이 때 발생하고 있는 분해물DAG (Dansyl-D-Ala-Gly)의 양을 측정하여 NEP활성을 산출했다. 또한 분해물DAG의 생성량은, 이 분해물의 형광을 측정함으로써 구하고, 형광의 측정은 360㎚에서 여기시켜서 535㎚의 발광으로 측정했다.
얻어진 결과를 도 3에 나타낸다. 이 결과로부터 0. 4㎎/㎏의 투여량의 NF-siRNA에 의해서도 폐에 있어서의 NEP활성은 현저하게 억제되어 있는 것을 알 수 있었다. 따라서 이 결과로부터도 실시예 3에서 얻어진 핵산 송달용 캐리어 조성물을 사용함으로써 효율적으로 siRNA를 폐조직의 세포 내에 송달할 수 있는 것이 확인되 었다.
시험예 4
실시예 1에서 얻어진 핵산 송달용 캐리어 조성물의 세포 독성에 대하여 Premix WST-1 cell proliferation assay system(Takara, Siga, Japan)을 이용하여 평가를 실시했다. 구체적으로는, A549세포(인간 폐암 유래의 세포주; 다이닛폰 제약사제)를 DMEM배지(Dulbecco-Minimum Essential Medium)를 이용하여 96―웰 플레이트에 (1×105)개/㎖의 농도로 조정하고, 각 웰당의 세포수가 104개로 되도록 시드했다. 이어서 피검 시료[실시예 1의 핵산 송달 캐리어, LFA2000(Lipofectamine2000; Invitrogen사제) 및 NeoPhectin(NeoPharm사제)]를 각 웰에 2∼20㎍/㎖의 농도로 되도록 첨가했다. 그 후 Premix WST―1용액 10㎕을 각 웰에 첨가하여 1시간, 37℃에서 인큐베이트한 후, 각 웰의 450㎚에 있어서의 흡광도를 마이크로플레이트리더(Tecan, Maennedorf, Switzerland)를 이용하여 측정했다. 또한 컨트롤로서, 피검 시료 대신에 배지를 첨가한 웰에 대해서도 마찬가지로 측정을 실시했다. A450의 흡광도는 WST―1이 환원 효소에 의해 형성되는 포르마잔색소 유래의 흡광도를 의미한다. 해당 흡광도와 생세포에는 직선적인 관계가 있기 때문에 파종한 생세포수와 흡광도의 검량선을 작성했다. 얻어진 검량선을 토대로 피검 시료의 세포수를 구했다.
얻어진 결과를 도 4에 나타낸다. 이 결과로부터 실시예 1의 핵산 송달용 캐 리어 조성물을 첨가해도 세포수가 거의 저감되지 않고 있는 것이 확인되고, 해당 핵산 송달용 캐리어 조성물은 독성이 낮고, 높은 안전성을 구비하는 것이 확인되었다.
시험예 5
체중 250―320g의 웅성 SD쥐(SLC, Tokyo, Japan)에 Penncentury사의 1A―IC디바이스를 이용하고, 실시예 4의 핵산 송달용 캐리어 조성물 500㎍을 정제수를 이용하여 0. 4mL에 희석함으로써 조제한 시험액을 쥐에 경폐 투여했다. 투여 후의 쥐는 케이지로 되돌려서 통상의 사육 조건에 따라서 사육했다. 경폐 투여 24시간 후에 펜토바르비탈(넴뷰탈, 다이닛폰 제약 주식회사) 50㎎/㎏(1mL/㎏)을 쥐의 복강 내에 투여하여 마취시키고, 쥐를 배위에 고정했다. 정중앙선을 따라서 쥐를 개복하고, 복부하 대정맥으로부터 출혈사시켰다. 이어서 쥐로부터 폐를 적출하고, 빙랭한 생리 식염수로 세정했다. 적출한 폐의 조직 절편을 작성하고, 이것을 헤마톡실린―에오신을 이용하여 염색해서 현미경 관찰함으로써 핵산 송달용 캐리어 조성물이 폐조직에 미치는 독성에 대하여 평가를 실시했다. 또 비교를 위해 실시예 4의 핵산 송달용 캐리어 조성물 대신에 LFA2000(Lipofectamine2000; Invitrogen사제), 또는 NeoPhectin(NeoPharm사제)을 사용하여 상기와 동일 조건의 시험을 실시했다. 다만 LFA2000을 500㎍ 투여하면 쥐가 치사했기 때문에 LFA2000의 투여량은 250㎍으로 변경하여 시험을 실시했다.
얻어진 결과를 도 5에 나타낸다. LFA2000 또는 NeoPhectin을 폐국소에 투여 하면 염증이 야기되어 일부에 부종이 관찰된 것에 대하여, 실시예 4의 핵산 송달용 캐리어 조성물을 투여한 경우에는, 이 염증 증상이 저감되어 있는 것이 확인되었다. 이 결과로부터 실시예 4의 핵산 송달용 캐리어 조성물은 폐국소 투여 후에 있어서도 저독성이며, 안전성이 높은 것이 확인되었다.

Claims (11)

  1. (A) 스테로이드 핵을 갖는 카티온성 지질 및, (B) 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는
    핵산 송달용 캐리어 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (C) 유성 기재를 더 함유하는
    핵산 송달용 캐리어 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    (A)성분이 3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤, 3β―[N’, N’, N’―트리메틸아미노에탄]요오드화 콜레스테롤, 또는 3β―[N―(N’, N’―디메틸아미노에탄)―카르바모일]콜레스테롤 및 3β―[N’, N’, N’―트리메틸아미노에탄]요오드화 콜레스테롤인
    핵산 송달용 캐리어 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    (B)성분이 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드염, 디올레오일트리메틸암모늄 프로판 및 N―(1―(2, 3―비스(올레오일옥시)프로필)―N, N, N―트리메틸암모늄염산염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류인
    핵산 송달용 캐리어 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    (A)성분 100중량부에 대하여 (B)성분이 10∼200중량부의 비율로 포함되는
    핵산 송달용 캐리어 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    siRNA송달용 캐리어인
    핵산 송달용 캐리어 조성물.
  7. 핵산 및 청구항 1에서 5 중 어느 한 항에 기재된 핵산 송달용 캐리어 조성물을 함유하는
    핵산 송달용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    핵산이 siRNA인
    핵산 송달용 조성물.
  9. 청구항 7에 기재된 핵산 송달용 조성물을 세포에 접촉시킴으로써 핵산을 세포 내에 도입시키는 것을 특징으로 하는
    핵산 도입의 시험관내 방법(in vitro method).
  10. 청구항 7에 기재된 핵산 송달용 조성물을 세포에 접촉시킴으로써 핵산을 세포 내에 도입시키는 것을 특징으로 하며, 단 인간을 제외한 포유동물에 적용되는
    핵산 도입 방법.
  11. (A) 스테로이드핵을 갖는 카티온성 지질 및 (B) 제 4급 암모늄염형의 카티온성 지질을 혼합하는 것을 포함하는
    핵산 송달용 캐리어 조성물의 제조방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200800235A (en) * 2005-10-18 2008-01-01 Otsuka Pharma Co Ltd Carrier composition for nucleic acid transport
EP3721943A1 (en) 2009-12-23 2020-10-14 Novartis AG Lipids, lipid compositions and methods of using them
WO2011114678A1 (ja) * 2010-03-15 2011-09-22 国立大学法人山口大学 哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤
CA2871477A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 The Ohio State University Lipid nanoparticle compositions for antisense oligonucleotides delivery
US9833416B2 (en) * 2014-04-04 2017-12-05 Ohio State Innovation Foundation Oligonucleotide lipid nanoparticle compositions, methods of making and methods of using the same
WO2017017461A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Arcis Biotechnology Holdings Limited Method and composition

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999031132A1 (en) 1997-12-12 1999-06-24 The University Of Queensland NOVEL SURFACE PROTEIN OF $i(NEISSERIA MENINGITIDIS)
WO2000027795A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Invitrogen Corporation Transfection reagents
WO2004004758A1 (en) 2002-07-05 2004-01-15 Lipoxen Technologies Limited Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination
WO2004033620A2 (en) 2001-11-02 2004-04-22 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of rna interference

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030092180A1 (en) 2001-08-27 2003-05-15 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
US5965542A (en) * 1997-03-18 1999-10-12 Inex Pharmaceuticals Corp. Use of temperature to control the size of cationic liposome/plasmid DNA complexes
DE60126801T2 (de) * 2000-10-25 2007-12-06 The University Of British Columbia, Vancouver Lipidformulierungen zur zielgerichteten abgabe
WO2002060412A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Board Of Regents Stabilised polymeric aerosols for pulmonary gene delivery
US20030096414A1 (en) * 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
US7713942B2 (en) * 2001-04-04 2010-05-11 Nordic Vaccine Technology A/S Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides
AU2004257373B2 (en) * 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
AU2005310131A1 (en) 2004-11-17 2006-06-08 University Of Maryland, Baltimore Highly branched HK peptides as effective carriers of siRNA
US20070087045A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Industrial Technology Research Institute Lipid carrier and method of preparing the same
TW200800235A (en) * 2005-10-18 2008-01-01 Otsuka Pharma Co Ltd Carrier composition for nucleic acid transport

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999031132A1 (en) 1997-12-12 1999-06-24 The University Of Queensland NOVEL SURFACE PROTEIN OF $i(NEISSERIA MENINGITIDIS)
WO2000027795A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Invitrogen Corporation Transfection reagents
WO2004033620A2 (en) 2001-11-02 2004-04-22 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of rna interference
WO2004004758A1 (en) 2002-07-05 2004-01-15 Lipoxen Technologies Limited Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination

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