TWI736514B - 酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子２包含 - Google Patents

酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子２包含 Download PDF

Info

Publication number
TWI736514B
TWI736514B TW103130887A TW103130887A TWI736514B TW I736514 B TWI736514 B TW I736514B TW 103130887 A TW103130887 A TW 103130887A TW 103130887 A TW103130887 A TW 103130887A TW I736514 B TWI736514 B TW I736514B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
hydrogen
alkyl
gaa
oligomer
Prior art date
Application number
TW103130887A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201605881A (zh
Inventor
史帝芬 杜諾德 威爾頓
蘇 費契爾
剛納爾 詹姆斯 漢森
理查 凱西 貝斯特威克
Original Assignee
美商薩羅塔治療公司
澳洲梅鐸大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商薩羅塔治療公司, 澳洲梅鐸大學 filed Critical 美商薩羅塔治療公司
Publication of TW201605881A publication Critical patent/TW201605881A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI736514B publication Critical patent/TWI736514B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本揭示內容係關於反義寡聚物及誘導外顯子包含之相關組合物以及方法，其用於治療II型肝糖貯積病(GSD-II)(亦稱為龐貝病(Pompe disease)、肝糖病II、酸性麥芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α-葡萄糖苷酶缺乏及溶酶體α-葡萄糖苷酶缺乏)，且更特別關於誘導外顯子2包含且由此恢復GAA基因編碼之酶活性酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)蛋白之含量。

Description

酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子2包含 相關申請案之交叉參考
本申請案在35 U.S.C.§ 119(e)下主張2013年9月5日提出申請之美國申請案第61/874,261號及2014年1月27日提出申請之美國申請案第61/932,195號之優先權；每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
關於序列表之聲明
與本申請案有關之序列表係以文件模式而非紙印式來提供，且由此以引用方式併入說明書中。含有序列表之文件檔案之名稱為SATH_001_02TW_ST25.txt。文件檔案約為62KB且於2014年9月4日產生。
本揭示內容係關於反義股寡聚物及誘導外顯子包含之相關組合物以及方法，其用於治療II型肝糖貯積病(GSD-II)(亦稱為龐貝病(Pompe disease)、肝糖病II、酸性麥芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α-葡萄糖苷酶缺乏及溶酶體α-葡萄糖苷酶缺乏)，且更具體而言係關於誘導外顯子2包含且由此恢復由GAA基因編碼之酶活性酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)蛋白之含量。
替代剪接藉由自單一基因產生多種蛋白質來增加人類基因組之編碼可能。不適當剪接亦與增加數量之人類疾病有關。
GSD-II係由稱為酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)之酶之缺陷所引起之遺傳常染色體隱性溶酶體貯積病。GAA在身體內之作用係分解肝糖。減小或缺乏之GAA活性程度使得肝糖累積於受影響組織(包含心臟、骨骼肌(包含彼等涉及呼吸者)、肝及神經系統)中。據信，此肝糖累積會在患有GSD-II之個體中引起進展性肌無力及呼吸功能不全。GSD-II可發生於嬰兒、幼兒或成人中，且預後根據發作時間及症狀嚴重程度而有所變化。在臨床上，GSD-II可展現自嚴重(嬰兒)至較輕遲發成人形式之較寬連續範圍之嚴重程度。患者最終死於呼吸功能不全。疾病嚴重程度與殘餘酸性α-葡萄糖苷酶活性之間具有良好關聯，10-20%正常值之活性存於晚期疾病發作中且小於2%存於早期疾病發作形式中。據估計，GSD-II在全世界影響大約5,000至10,000人。
與疾病成人發作形式有關之最常見突變係IVS1-13T>G。在超過三分之二之成人發作GSD-II患者中發現，此突變可賦予雜合個體選擇性優點或係極老突變。具有此突變之成人發作GSD-II個體之廣泛的族群差異推翻了共同創始者之可能性。
GAA基因由20個跨越約20kb之外顯子組成。3.4kb mRNA編碼分子量大約為105kD之蛋白質。IVS1-13T>G突變導致含有起始AUG密碼子之外顯子2(578個鹼基)的缺失。
GSD-II治療涉及藥物治療策略、飲食控制及並無顯著成功之骨髓移植。近年來，酶代替療法(ERT)為GSD-II患者提供新的希望。舉例而言，在2006年於美國及歐洲，Myozyme®(重組GAA蛋白藥物)已接受用於患有GSD-II疾病之患者。Myozyme®依賴於GAA蛋白表面上之6-磷酸甘露糖(M6P)以遞送至溶酶體。
主要用於RNA下調之反義股技術最近已適用於剪接過程。許多基因之主要基因轉錄物(前體mRNA)之處理涉及去除內含子及精確剪接外顯子(其中供體剪接位點連接至受體剪接位點)。剪接精確過程， 其涉及協調識別供體與受體剪接位點及分支點(位於受體剪接位點上游)且正性外顯子剪接增強子(主要位於外顯子內)及負性剪接基序(剪接沉默子主要位於內含子中)相平衡。
可改變GAA前體mRNA之剪接之有效藥劑可在治療上用於改良GSD-II之治療。
本揭示內容之實施例係關於反義股寡聚物及相關組合物以及增加細胞中含有外顯子2且編碼GAA之mRNA之含量之方法，該等方法包括使細胞與具有足夠長度及互補性之反義股寡聚物接觸以與GAA基因之前體mRNA內之區域特異性雜交，其中反義股寡聚物與區域之結合增加了細胞中含有外顯子2且編碼GAA之mRNA之含量。
因此，在一些實施例中，本揭示內容係關於具有10至40個核苷酸或核苷酸類似物之反義股寡聚物，其包括具有足夠長度及互補性之靶向序列以與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)、外顯子2(SEQ ID NO：2)或內含子2(SEQ ID NO：3)內的區域特異性雜交。
在某些實施例中，本揭示內容係關於反義股寡聚物化合物，其包括：非天然化學骨架，其選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環-DNA寡聚物、三環-硫代磷酸酯寡聚物、2’O-Me修飾之寡聚物或前述物質之任一組合；及靶向序列，其與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID.NO.1)、內含子2(SEQ ID.NO.2)或外顯子2(SEQ ID.NO.3)內之區域互補。
在一些實施例中，反義股寡聚物特異性與表1中所陳述之內含子 1、外顯子2及/或內含子2GAA序列內之區域雜交。在一些實施例中，反義股寡聚物特異性與內含子剪接沉默子元件或外顯子剪接沉默子元件雜交。在某些實施例中，反義股寡聚物包括表2中所陳述之靶向序列、表2中之靶向序列之至少10個鄰接核苷酸之片段或與表2中之靶向序列具有至少80%序列一致性之變體。在具體實施例中，反義股寡聚物由表2中所陳述之靶向序列組成或基本上由其組成。
在某些實施例中，反義股寡聚物係胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)、PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環-DNA寡聚物、三環-硫代磷酸酯寡聚物、2’O-Me修飾之寡聚物或任一前述物質之組合。
在一些實施例中，反義股寡聚物含有約、至少約或不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個陽離子型核苷間鏈接。在某些實施例中，反義股寡聚物含有約或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之陽離子型核苷間鏈接。在某些實施例中，反義股寡聚物含有約、至少約或不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個展現介於約4.5與約12之間之pKa之核苷間鏈接。在一些實施例中，反義股寡聚物含有約或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%展現介於約4.5與約12之間之pKa之核苷間鏈接。在一些實施例中，反義股寡聚物具有含有鹼性氮及烷基、芳基或芳烷基之核苷間鏈接。在一些實施例中，反義股寡聚物包括嗎啉基。
在某些實施例中，本揭示內容之反義股寡聚物係式(I)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0007-1
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係8至38之整數；每一Y獨立地選自O或-NRa，其中Ra係選自由以下組成之群：氫、-T1-NRcRdRe及-[(C(O)CHR'NH)m]R"，其中：R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈，R"係選自氫或醯基，m係1至60之整數，Rc係選自由氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2組成之群，Rd係選自由氫、芳烷基及C1-C6烷基組成之群，或在Rc及Rd各自獨立地係C1-C6烷基或芳烷基時Rc及Rd與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環視情況經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，且Re係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；每一L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，S係選自1至8之整數； n係0至3之整數；每一R1獨立地選自由以下組成之群：-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、式(II)部分：
Figure 103130887-A0305-02-0008-2
其中R8係選自由氫、甲基、-C(=NH)NH2、-Z-T2-NHC(=NH)NH2及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中Z係羰基或直接鍵，R9係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群，且每一R10獨立地選自氫或甲基；且式(III)部分：
Figure 103130887-A0305-02-0008-3
其中q係0至2之整數，R11係選自由氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2組成之群，R12係選自由氫、芳烷基及C1-C6烷基組成之群，或R11及R12與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環視情況經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，且R13係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；R2係選自由氫、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，或R2不存在；R3係選自由氫、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、-C(=NH)NH2、三苯甲基、-C(=O)ORg、醯基、-C(O)(CH2)mC(O)及T4- (4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)六氫吡嗪-1-基組成之群，其中Rg係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，T4係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R係-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；R4係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及醯基，且每一R5獨立地選自氫或甲基；每一R6及每一R7獨立地選自氫或-T3-NRcRdRe；且T1、T2及T3中之每一者獨立地係長度至多為18個原子之可選連接體，包括烷基、烷氧基或烷基胺基或其組合，其中靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID.NO.1)、內含子2(SEQ ID.NO.2)或外顯子2(SEQ ID.NO.3)內之區域互補。
在某些實施例中，本揭示內容之反義股寡聚物係式(IV)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0010-4
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係15至25之整數；每一Y係O；每一R1獨立地選自由以下組成之群：
Figure 103130887-A0305-02-0010-5
 其中至少一個R1係-N(CH3)2，且其中靶向序列係選自SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在某些實施例中，反義股寡聚物進一步包括增強細胞攝取之肽部分。
亦包含於本揭示內容之範圍內者係如下反義股寡聚物：其包括具有足夠長度及互補性以與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)、外顯子2(SEQ ID NO：2)或內含子2(SEQ ID NO：3)內之區域特異性雜交之靶向序列，如表2中所陳述。在一些實施例中，靶向序列包括選自SEQ ID.NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118之靶向序列之至少10個鄰接核苷酸，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。在某些實施例中，靶向序列包括與選自SEQ ID.NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118之靶向序列80%之序列一致性，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在特定實施例中，反義股寡聚物係胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)、PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環-DNA寡聚物、三環-硫代磷酸酯寡聚物、2'O-Me修飾之寡聚物或任一前述物質之組合。
亦包含醫藥組合物，其包括生理上可接受之載劑及本文所闡述之反義股寡聚物。
某些實施例亦包含增加細胞中含有外顯子2之酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)mRNA之含量之方法，其包括使細胞與具有足夠長度及互補性之反義股寡聚物接觸以與GAA基因之前體mRNA內之區域特異性雜交，其中反義股寡聚物與該區域之結合增加了細胞中含有外顯子2之GAA mRNA之含量。
在一些實施例中，細胞中含有外顯子2之GAA mRNA之含量相對於對照增加至少約10%。在某些實施例中，細胞中功能GAA蛋白之含量相對於對照增加至少約10%。在某些實施例中，細胞在其基因組之一或多個等位基因中具有IVS1-13T>G突變，其(在不存在反義股處理 下)導致含有外顯子2之GAA mRNA之表現有所減小。
在一些實施例中，細胞係有需要之個體中之細胞，且該方法包括向個體投與反義股寡聚物。在一些實施例中，個體患有II型肝糖貯積病(GSD-II)或處於患有II型肝糖貯積病(GSD-II)之風險下。本揭示內容之一些實施例係關於治療有需要之個體之II型肝糖貯積病(GSD-II；龐貝病)之方法，其包括向個體投與有效量之本揭示內容之反義股寡聚物。某些實施例係關於用以製備用於治療II型肝糖貯積病(GSD-II；龐貝病)之藥劑之反義股寡聚物。
在某些實施例中，個體患有嬰兒GSD-II或處於患有嬰兒GSD-II之風險下。在特定實施例中，個體患有晚期發作GSD-II或處於患有晚期發作GSD-II之風險下。在某些實施例中，該方法包括將個體之一或多個組織中之肝糖含量相對於對照減小至少約10%。
此外，本揭示內容亦包含檢測人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因mRNA中之外顯子2包含之方法，該方法包括：使用至少一種包括選自由SEQ ID NO：121、122或123組成之群之鹼基序列之聚合酶鏈式反應引子擴增GAA mRNA。
參照下列實施方式及附圖將明瞭本揭示內容之該等及其他態樣。本文所揭示之所有參考文獻之全部內容以引用方式併入本文中，如同每一者個別地併入一般。
圖1圖解說明空間阻斷反義股寡聚物可相對於缺失外顯子之GAA mRNA增強含有外顯子2之GAA mRNA之含量的一種機制。
圖2展示使用針對外顯子1(正向)及外顯子3(反向)之引子之含有外顯子2之來自野生型GAA基因的約1177個鹼基PCR擴增產物(參見實例2)。
圖3A-3C展示來自實例2之表E1之2'-O-甲基修飾之反義股寡聚物 之結果。圖3A展示寡聚物9(GAA-IVS1(-74-55))及12(GAA-IVS1(-158-140))誘導攜載IVS1-13G>T突變之人類細胞中之外顯子2包含，如藉由約600鹼基擴增子之減小之擴增(相對於全長約1177鹼基擴增子)所證實。圖3B展示寡聚物14(GAA-IVS2(-53-72))誘導外顯子-2包含，且圖3C展示寡聚物20(GAA-IVS2(-173-192))及22(GAA-IVS2(-338-364))同樣誘導一定程度之外顯子-2包含。
圖4A-4C展示表4A之PMO反義股寡聚物之RT-PCR結果。
I.定義
除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與彼等熟習本揭示內容所屬領域技術者通常所理解相同之含義。儘管任一類似或等效於彼等本文所闡述方法及材料之方法及材料皆可用於本揭示內容之標的物之實踐或測試中，但闡述較佳方法及材料。出於本揭示內容之目的，下列術語定義於下文中。
本文所用之冠詞「一個(a及an)」係指該冠詞之文法受詞之一個或一個以上(亦即係指至少一個)。舉例而言，「一個元件」意指一個元件或一個以上元件。
「約」意指數量、程度、數值、數字、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度相對於參考數量、程度、數值、數字、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化至多30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
「編碼序列」意指任何有助於編碼基因之多肽產物之核酸序列。相反，術語「非編碼序列」係指任何並不直接促進編碼基因之多肽產物之核酸序列。
在整個本揭示內容中，除非上下文另有需要，否則詞語「包括(comprise、comprises及comprising)」應理解為表示包含所述步驟或要 素或步驟或要素群，但不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素群。
「由......組成」意指包含且受限於片語「由......組成」後之任何要素。因此，片語「由......組成」指示所列示要素係需要的或必需的，且不可存在其他要素。「基本上由......組成」意指包含該片語後所列示之任何要素，且受限於不干擾或有助於本揭示內容中針對所列示要素指定之活性或作用之其他要素。因此，片語「基本上由......組成」表示所列示要素係需要的或必需的，但其他要素係可選的且可存在或不存在，此取決於該等其他要素是否顯著影響所列示要素之活性或作用。
如本文中所使用，術語「接觸細胞」、「引入」或「遞送」包含藉由業內之常規方法(例如轉染(例如脂質體、磷酸鈣、聚乙烯亞胺)、電穿孔(例如核轉染)、顯微注射))將本揭示內容之寡聚物遞送至細胞中。
如本文中所使用，術語「烷基」意欲包含直鏈(亦即無支鏈或非環)、具支鏈、環狀或多環非芳族烴基團，其視情況經一或多個官能基取代。除非另外規定，否則「烷基」含有一至八個及較佳地一至六個碳原子。C1-C6烷基意欲包含C1、C2、C3、C4、C5及C6烷基。低碳烷基係指含有1至6個碳原子之烷基。烷基之實例包含但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、環丁基、戊基、異戊基、第三戊基、環戊基、己基、異己基、環己基等。烷基可經取代或未經取代。闡釋性經取代烷基包含但不限於氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基、羥甲基、2-羥乙基、3-羥丙基、苄基、經取代苄基、苯乙基、經取代苯乙基等。
如本文中所使用，術語「烷氧基」意指如上文所定義具有指示碳數之烷基經由氧橋連接之烷基子組。舉例而言，「烷氧基」係指基團-O-烷基，其中烷基含有1至8個直鏈、具支鏈、環狀構形之碳原 子。「烷氧基」之實例包含但不限於甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、第三丁氧基、正丁氧基、第二戊氧基及諸如此類。
如本文中所使用，術語「芳基」(單獨使用或用作較大部分之一部分(如在「芳烷基」、「芳烷氧基」或「芳基氧基-烷基」))係指具有6至14個環原子之芳族環基團，例如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基及2-蒽基。「芳基」環可含有一或多個取代基。術語「芳基」可與術語「芳環」互換使用。「芳基」亦包含稠合多環芳族環系統，其中芳族環稠合至一或多個環。有用芳環基團之非限制性實例包含苯基、羥基苯基、鹵代苯基、烷氧基苯基、二烷氧基苯基、三烷氧基苯基、伸烷基二氧基苯基、萘基、菲基、蒽基、菲并及諸如此類以及1-萘基、2-萘基、1-蒽基及2-蒽基。亦包含於術語「芳基」(如本文中所使用)範圍內者係芳族環稠合至一或多個非芳族環(例如二氫茚基、菲啶基或四氫萘基)之基團，其中連接基團或連接點位於芳族環上。
術語「醯基」意指C(O)R基團(其中R表示H、如上文所定義之烷基或芳基)。醯基之實例包含甲醯基、乙醯基、苯甲醯基、苯基乙醯基及類似基團。
本文所用之術語「同系物」意指因連續增加相同化學基團而具有規則差異之化合物。舉例而言，化合物同系物可因增加一或多個-CH2-基團、胺基酸殘基、核苷酸或核苷酸類似物而有所不同。
術語「細胞穿透肽」(CPP)或「增強細胞攝取之部分」可互換使用且係指陽離子型細胞穿透肽，亦稱為「轉運肽」、「載體肽」或「肽轉導結構域」。本文所展示之肽能夠在給定細胞培養群之30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之細胞內誘導細胞穿透，且在全身性投與後使得活體內多種組織可進行大分子易位。在一些實施例中，CPP具有式-[(C(O)CHR'NH)m]R"，其中R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈，R"係選自氫或醯基，且m係最高50之整 數。其他CPP在業內已眾所周知且揭示於(例如)美國申請案第2010/0016215號(其全部內容以引用方式併入本文中)中。在其他實施例中，m係選自1至50之整數，其中在m為1時，該部分係單一胺基酸或其衍生物。
如本文中所使用，「胺基酸」係指由連接一級胺基、羧酸基團、側鏈及氫原子之碳原子組成之化合物。舉例而言，術語「胺基酸」包含但不限於甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸及精胺酸。另外，如本文中所使用，「胺基酸」亦包含胺基酸之衍生物，例如酯及醯胺及鹽以及其他衍生物(包含在代謝成活性形式後具有藥物性質之衍生物)。因此，術語「胺基酸」應理解為包含天然胺基酸及非天然胺基酸。
「電子對」係指並不與其他原子鍵結或共有之電子價對。
「同源性」係指相同或構成保守性取代之胺基酸之百分比數。可使用諸如GAP(Deveraux等人，1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)等序列對比程式來測定同源性。以此方式，可藉由將缺口插入比對序列中來比較與本文所闡述序列長度類似或顯著不同之序列，該等缺口係藉由(例如)GAP所用之對比算法來測定。
「經分離」意指材料實質上或基本上不含通常在其天然狀態下與其相伴之組份。舉例而言，本文所用之「經分離多核苷酸」、「經分離寡核苷酸」或「經分離寡聚物」可係指已自天然狀態下位於兩側之序列純化或取出之多核苷酸，例如已自毗鄰基因組中之片段之序列取出之DNA片段。術語「分離」(如涉及細胞)係指自源個體(例如患有多核苷酸重複疾病之個體)純化細胞(例如纖維母細胞、淋巴母細胞)。在mRNA或蛋白質之背景下，「分離」係指自源(例如細胞)回收mRNA或蛋白質。
術語「調變」包含視情況將一或多個可量化參數「增加」或 「降低」界定量及/或統計學顯著量。「增加(increase或increasing)」、「增強(enhance或enhancing)」或「刺激(stimulate或stimulating)」通常係指一或多種反義股或組合物相對於無反義股化合物時或由對照化合物引起之反應能夠在細胞或個體中產生或引起較大生理學反應(亦即下游效應)。相關生理學或細胞反應(活體內或活體外)為熟習此項技術者所明瞭，且可包含增加編碼GAA之前體mRNA中之外顯子2包含，或增加細胞、組織或有需要之個體中功能GAA酶之表現。「增加」或「增強」之量通常係「統計學顯著」之量，且可包含等於無反義股化合物時(不存在藥劑)或由對照化合物所產生量之1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍(例如500倍、1000倍)(包含該等數字之間且大於1之所有整數及小數，例如1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍等)之增加。術語「減少」或「抑制」通常可係關於如根據診斷領域常規技術所量測，一或多種反義股化合物或組合物能夠「降低」相關生理學或細胞反應(例如本文所闡述疾病或病狀之症狀)。相關生理學或細胞反應(活體內或活體外)為熟習此項技術者所明瞭，且可包含減少肝糖貯積病(例如龐貝病)之症狀或病況，例如降低一或多種組織中之肝糖累積。反應之「降低」與無反義股化合物時或由對照組合物產生之反應相比可為「統計學顯著」的，且可包含降低1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包含該等數字之間之所有整數)。
如本文中所使用，「反義股寡核苷酸」、「反義股寡聚物」或「寡核苷酸」係指核苷酸或核苷酸類似物之直鏈序列，其容許核鹼基與RNA中之靶序列藉由沃森-克裡克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)進行雜交以在靶序列內形成寡聚物：RNA異源雙鏈體。術語「反義股寡核苷酸」、「反義股寡聚物」、「寡聚物」及「化合物」可互換使用以係指寡聚物。該等環狀亞單元可基於核糖或另一戊糖；或在某些實施例中，其基於嗎啉基(參見下文關於嗎啉基寡聚物之說明)。較業內已知之其他反義股藥劑，亦尤其涵蓋肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、三環-DNA寡聚物、三環-硫代磷酸酯寡聚物及2'-O-甲基寡聚物。
包含非天然寡聚物或「寡核苷酸類似物」，其包含具有以下之寡聚物：(i)經修飾之骨架結構，例如除在天然寡核苷酸及多核苷酸中發現之標準磷酸二酯鏈接外之骨架，及/或(ii)經修飾之糖部分，例如嗎啉基部分而非核糖或去氧核糖部分。寡聚物類似物支持能夠藉由沃森-克裡克鹼基配對與標準多核苷酸鹼基氫鍵結之鹼基，其中類似物骨架呈現鹼基之方式允許該氫鍵結以序列特異性方式存於寡聚物類似物分子與標準多核苷酸(例如單鏈RNA或單鏈DNA)中之鹼基之間。較佳類似物係彼等具有實質上不帶電之含磷骨架者。
「抗核酸酶」寡聚物係指骨架可以非雜交或雜交形式實質上抵抗身體內常見細胞外及細胞內核酸酶(例如外切核酸酶(例如3'-外切核酸酶)、內切核酸酶、RNase H)之核酸酶裂解之寡聚物；亦即在該寡聚物所暴露之機體內於正常核酸酶條件下該寡聚物展示極少或無核酸酶裂解。「抗核酸酶異源雙鏈體」係指藉由使反義股寡聚物與其互補靶結合形成之異源雙鏈體，從而使得該異源雙鏈體實質上抵抗細胞內及細胞外核酸酶(其能夠切斷雙鏈RNA/RNA或RNA/DNA複合體)之活體內降解。「異源雙鏈體」係指反義股寡聚物與靶RNA之互補部分之間之雙鏈體。
如本文中所使用，「核鹼基」(Nu)、「配對部分」或「鹼基」可互換使用以係指天然DNA或RNA中發現之嘌呤或嘧啶鹼基(尿嘧 啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤)以及賦予改良性質(例如至寡聚物之結合親和力)之天然嘌呤及嘧啶之類似物。實例性類似物包含次黃嘌呤(核苷肌苷之鹼基組份)、2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基修飾之嘧啶、9-(胺基乙氧基)吩噁嗪(G形夾)及諸如此類。
鹼基配對部分之其他實例包含但不限於尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及次黃嘌呤(其各別胺基由醯基保護基團保護)、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、氮雜胞嘧啶、嘧啶類似物(例如假異胞嘧啶及假尿嘧啶)及其他經修飾之核鹼基(例如8-取代嘌呤、黃嘌呤或次黃嘌呤(後兩者係天然降解產物))。亦涵蓋揭示於Chiu及Rana,RNA,2003,9,1034-1048；Limbach等人，Nucleic Acids Research,1994,22,2183-2196及Revankar及Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry，第7卷，313中之經修飾之核鹼基。
鹼基配對部分之其他實例包含但不限於增加一或多個苯環之展開大小之核鹼基。闡述於Glen Research目錄(www.glenresearch.com)；Krueger AT等人，Acc.Chem.Res.,2007,40,141-150；Kool,ET,Acc.Chem.Res.,2002,35,936-943；Benner S.A.等人，Nat.Rev.Genet.,2005,6,553-543；Romesberg,F.E.等人，Curr.Opin.Chem.Biol.,2003,7,723-733；Hirao,I.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2006,10,622-627中之核鹼基代替預計可用於合成本文所闡述之寡聚物。展開大小之核鹼基之實例展示於下文中：
Figure 103130887-A0305-02-0020-6
以共價方式連接至核糖、糖類似物或嗎啉基之核鹼基包括核苷。「核苷酸」由核苷以及一個磷酸酯基團構成。磷酸酯基團以共價方式使毗鄰核苷酸彼此連接以形成寡聚物。
若寡聚物與在生理學條件下與靶雜交，則寡聚物與靶多核苷酸「特異性雜交」，其中Tm實質上大於40℃或45℃、較佳地至少50℃及通常60℃-80℃或更高。該雜交較佳地對應於嚴格之雜交條件。在給定離子強度及pH下，Tm係50%之靶序列與互補多核苷酸雜交之溫度。該雜交可在反義股寡聚物與靶序列之「近似」或「實質」互補性以及精確互補性下進行。
如本文中所使用，「足夠長度」係指反義股寡聚物與GAA內含子1、外顯子2或內含子2之區域或跨越任一前述部分之區域中之至少8、更通常8-40個鄰接核鹼基互補。具有足夠長度之反義股寡聚物具有至少最小數量之核苷酸以能夠與突變體RNA中GAA前體mRNA重複之區域特異性雜交。較佳地，具有足夠長度之寡聚物之長度為8至30個核苷酸。更佳地，具有足夠長度之寡聚物之長度為9至27個核苷酸。
本文所用之術語「序列一致性」(或例如包含「序列50%一致」) 係指序列基於各核苷酸或基於各胺基酸在對比窗中之一致性程度。因此，「序列一致性百分比」可藉由以下方式來計算：在對比窗中比較兩個最佳比對之序列，測定兩個序列中出現相同核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)之位置數以產生匹配位置數，用匹配位置數除以對比窗中之總位置數(亦即窗大小)，並將結果乘以100以產生序列一致性百分比。用於比對對比窗之序列最佳比對可藉由電腦化實施算法(Wisconsin Genetics Software Package 7.0版中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,Wis.,USA)或藉由檢查使用所選各種方法中之任一種生成之最佳比對(亦即在對比窗中得到最高同源性百分比)來實施。亦可參照BLAST程式系列，如例如由Altschul等人，Nucl.Acids Res.25：3389,1997所揭示。
「個體」或「有需要之個體」包含哺乳動物個體，例如人類個體。實例性哺乳動物個體患有GSD-II(或龐貝病)或處於患有GSD-II(或龐貝病)之風險下。如本文中所使用，術語「GSD-II」係指II型肝糖貯積病(GSD-II或龐貝病)，其係特徵通常在於GAA蛋白在受影響個體中表現不足之人類常染色體隱性疾病。在某些實施例中，個體之一或多個組織(例如心臟、骨骼肌、肝及神經系統組織)中GAA蛋白之表現及/或活性有所減小。在一些實施例中，個體之一或多個組織(例如心臟、骨骼肌、肝及神經系統組織)中之肝糖累積有所增加。在具體實施例中，個體具有IVS1-13T>G突變或其他突變以使得功能GAA蛋白之表現有所減小(例如參見Zampieri等人，European J.Human Genetics.19：422-431,2011)。
如本文中所使用，術語「靶」係指RNA區域，且具體而言係指 由GAA基因鑑別之區域。在一特定實施例中，靶係編碼GAA之前體mRNA之內含子1或內含子2內之區域，其負責阻抑促進外顯子2包含之信號。在另一實施例中，靶區域係GAA外顯子2之mRNA之區域。
術語「靶序列」係指寡聚物類似物所針對之靶RNA之一部分，亦即寡聚物類似物將藉由互補序列之沃森-克裡克鹼基配對來雜交之序列。
術語「靶向序列」係指寡聚物或寡聚物類似物中與RNA基因組中之「靶序列」互補(此外，意指實質上互補)之序列。反義股寡聚物之整個序列或僅一部分可與靶序列互補。舉例而言，在具有20-30個鹼基之寡聚物中，約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個鹼基可為與靶區域互補之靶向序列。通常，靶向序列由寡聚物中之鄰接鹼基形成，但可替代地由非鄰接序列形成，該等非鄰接序列在(例如)自寡聚物之相對末端置於一起時組成跨越靶序列之序列。
「靶向序列」可與靶序列具有「近似」或「實質」互補性且仍用於本揭示內容之目的，亦即其仍「互補」。較佳地，本揭示內容中所採用之寡聚物類似物化合物與靶序列每10個核苷酸具有至多一處錯配，且較佳地每20個核苷酸具有至多一處錯配。另一選擇為，所採用反義股寡聚物與如本文所指定實例性靶向序列具有至少90%之序列同源性及較佳地至少95%之序列同源性。
如本文中所使用，術語「量化(quantifying、quantification)」或其他相關詞語係指測定單位體積中核酸、多核苷酸、寡聚物、肽、多肽或蛋白質之量、質量或濃度。
如本文中所使用，「治療」個體(例如哺乳動物，例如人類)或「處理」細胞係用於試圖改變個體或細胞中之天然過程之任一類幹預。治療包含但不限於投與醫藥組合物，且可以預防性方式實施，或 在病理性事件開始後實施；或與病原體接觸。亦包含「預防性」治療，其可涉及減小所治療疾病或病狀之進展速率，延遲該疾病或病狀之發作，或減小其發作之嚴重程度。「治療」或「預防」並不一定指示完全根除、治癒或預防疾病或病狀或其相關症狀。
II.用於剪接調變GAA之序列
某些實施例係關於相對於細胞中缺失外顯子-2之GAA mRNA提高含有外顯子2且編碼GAA之mRNA之含量的方法，其包括使細胞與具有足夠長度及互補性之反義股寡聚物接觸以與GAA基因內之區域特異性雜交，從而相對於細胞中缺失外顯子-2之GAA mRNA提高含有外顯子2之GAA mRNA之含量。在一些實施例中，細胞存於個體中，且該方法包括向個體投與反義股寡聚物。
反義股寡聚物可設計為阻斷或抑制或調變mRNA之轉譯或抑制或調變前體mRNA剪接處理，或誘導靶向mRNA降解，且可稱為「針對」或「靶向」與其雜交之靶序列。在某些實施例中，靶序列包含含有預處理mRNA之3'或5'剪接位點、分支點或涉及剪接調控之其他序列之區域。靶序列可位於外顯子內或位於內內含子或跨越內含子/外顯子接點。
在某些實施例中，反義股寡聚物與靶RNA(亦即調變剪接位點選擇之RNA)具有足夠序列互補性以使用有效方式阻斷靶RNA(例如前體mRNA)之區域。在實例性實施例中，GAA前體mRNA之該阻斷用於藉由遮蔽用於原本調變剪接之天然蛋白質之結合位點及/或藉由改變靶向RNA的結構來調變剪接。在一些實施例中，靶RNA係靶前體mRNA(例如GAA基因前體mRNA)。
與靶RNA序列具有足夠序列互補性以調變靶RNA之剪接之反義股寡聚物意指，反義股藥劑具有足以觸發遮蔽用於原本調變剪接之天然蛋白質之結合位點及/或改變靶向RNA之三維結構的序列。同樣， 與靶RNA序列具有足夠序列互補性以調變靶RNA之剪接之寡聚物試劑意指，反義股試劑具有足以觸發遮蔽用於原本調變剪接之天然蛋白質之結合位點及/或改變靶向RNA之三維結構的序列。
在某些實施例中，反義股寡聚物具有足夠長度且與人類GAA前體mRNA之內含子1、人類GAA前體mRNA之外顯子2或人類GAA前體mRNA之內含子2中的序列具有足夠互補性。亦包含與跨越人類GAA前體mRNA之內含子1/外顯子2之區域或跨越人類GAA前體mRNA之外顯子2/內含子2之區域互補之反義股寡聚物。人類GAA基因之內含子1(SEQ ID NO：1)、外顯子2(SEQ ID NO：2)及內含子2(SEQ ID NO：3)序列展示於下表1中(SEQ ID NO：1中靠近3'端之突出顯示之T/G係上述IVS1-13T>G突變；此位置處之核苷酸係T或G)。
Figure 103130887-A0305-02-0024-273
Figure 103130887-A0305-02-0025-8
在某些實施例中，反義股靶向序列設計為與表1中所列示一或多個靶序列中之區域雜交。可使所選反義股靶向序列更短(例如約12個鹼基)或更長(例如約40個鹼基)，且其包含少量錯配，只要序列充分互補以在與靶序列雜交後實現剪接調變且視情況與RNA形成Tm為45℃或更高之異源雙鏈體即可。
在某些實施例中，靶序列與反義股靶向序列之間之互補性程度足以形成穩定雙鏈體。反義股寡聚物與靶RNA序列之互補性區域可短至8-11個鹼基，但可為12-15個鹼基或更長，例如10-40個鹼基、12-30個鹼基、12-25個鹼基、15-25個鹼基、12-20個鹼基或15-20個鹼基(包含該等範圍之間之所有整數)。具有約14-15個鹼基之反義股寡聚物一般長至足以具有獨特互補序列。在某些實施例中，可能需要互補鹼基具有最小長度以達成必需結合Tm，如本文中所論述。
在某些實施例中，長至40個鹼基之寡聚物可為適宜的，其中至少最小數量之鹼基(例如10-12個鹼基)與靶序列互補。在一些實施例中，細胞中之協助或主動攝取在小於約30個鹼基之寡聚物長度下優化。對於PMO寡聚物而言，如下文進一步所闡述，結合穩定性與攝取之最佳平衡一般出現在18-25個鹼基之長度下。本揭示內容包含由約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個鹼基組成之反義股寡聚物(例如PMO、PMO-X、PNA、LNA、2'-OMe)，其中至少約6、8、9、10、11、12、13、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個鄰接或非鄰接鹼基與表1之靶序列(例如SEQ ID NO：1-3、跨越SEQ ID NO：1/2或SEQ ID NO：2/3之序列)互補。
反義寡聚物通常包括與人類GAA基因之前體mRNA序列之內含子 1、外顯子2或內含子2內或與其毗鄰之序列或區域充分互補的鹼基序列。理想地，反義寡聚物能夠有效調變GAA前體mRNA之異常剪接，且由此增加活性GAA蛋白之表現。當該寡聚物化合物能夠由哺乳動物細胞主動吸收且一但吸收可與靶mRNA形成視情況Tm大於約40℃或45℃之穩定雙鏈體(或異源雙鏈體)時，則視情況滿足此需求。
在某些實施例中，反義寡聚物可與靶序列100%互補，或可包含錯配以例如適應變體，只要該寡聚物與靶序列之間形成之異源雙鏈體足夠穩定以耐受細胞核酸酶之作用及活體內可能發生的其他降解模式。因此，某些寡聚物可具有實質互補性，此意指該寡聚物與靶序列之間具有約或至少約70%序列互補性，例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列互補性。本文論述對核酸酶裂解較不易感之寡聚物骨架。若錯配存在，則其通常在雜合雙鏈體末端區域之失穩小於中間區域。根據熟知雙鏈體穩定性原則，所容許之錯配數量取決於寡聚物長度、G：C鹼基對在雙鏈體中之百分比及錯配在雙鏈體中之位置。儘管此反義寡聚物不一定與靶序列100%互補，但其可有效地與靶序列穩定且特異性地結合，從而調變靶前體RNA之剪接。
寡聚物與靶序列之間形成之雙鏈體之穩定性隨結合Tm及雙鏈體對細胞酶裂解之易感性而變化。寡聚物相對於互補序列RNA之Tm可藉由習用方法，例如Hames等人，Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,1985，第107-108頁中所述或如Miyada C.G.及Wallace R.B.,1987,Oligomer Hybridization Techniques,Methods Enzymol.，第154卷第94-107頁中所述方法測量。在某些實施例中，反義寡聚物相對於互補序列RNA之結合Tm可高於體溫且較佳地高於約45℃或50℃。亦包 含在60-80℃範圍內或較高之Tm。根據熟知原則，可藉由提高C：G鹼基對在雙鏈體中之比率及/或藉由延長異源雙鏈體之長度(以鹼基對計)來提高寡聚物相對於基於互補RNA雜合體之Tm。同時，為優化細胞攝取之目的，可有利地限制寡聚物之大小。為此，在25個鹼基或更短長度展示高Tm(45-50℃或更高)之化合物通常優於需要多於25個鹼基以獲得高Tm值者。
下表2展示與人類GAA基因之內含子1、外顯子2或內含子2前體mRNA序列完全互補之實例性靶向序列(以5'-至-3'定向)。
Figure 103130887-A0305-02-0028-274
Figure 103130887-A0305-02-0029-10
Figure 103130887-A0305-02-0030-11
Figure 103130887-A0305-02-0031-12
Figure 103130887-A0305-02-0032-13
某些反義股寡聚物由此包括表1中之序列(例如SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118)或其變體或鄰接或非鄰接部分、由其組成或基本上由其組成。舉例而言，某些反義股寡聚物包括SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118中之任一者之約或至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個鄰接或非鄰接核苷酸。對於非鄰接部分而言，插入核苷酸可缺失或經不同核苷酸取代，或可增加插入核苷酸。變體之其他實例包含在SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118中之任一者之整個長度內具有約或至少約70%序列一致性或同源性(例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性或同源性)的寡聚物。
可根據業內常規技術來分析反義股寡聚物及其變體之活性。舉例而言，可藉由用於檢測經轉錄核酸或蛋白質之剪接形式及/或表現之各種熟知方法中之任一者來評價所觀察RNA及蛋白質的剪接形式及 表現程度。該等方法之非限制性實例包含RNA剪接形式之RT-PCR及隨後PCR產物之大小分離、核酸雜交方法(例如北方印跡(Northern blot)及/或使用核酸陣列)、核酸擴增方法、檢測蛋白質之免疫學方法、蛋白質純化方法及蛋白質功能或活性分析。
可藉由以下方式來評價RNA表現程度：自細胞、組織或有機體製備mRNA/cDNA(亦即經轉錄多核苷酸)，及使mRNA/cDNA與參考多核苷酸(其係所分析核酸之補體或其片段)雜交。在與互補多核苷酸雜交之前，可視情況使用各種聚合酶鏈式反應或活體外轉錄方法中之任一者擴增cDNA；較佳地，其並不擴增。亦可使用定量PCR檢測一或多種轉錄物之表現以評價轉錄物表現程度。
III.反義股寡聚物之化學性質 A.一般特性
本揭示內容之某些反義股寡聚物與內含子剪接沉默子元件或外顯子剪接沉默子元件特異性雜交。一些反義股寡聚物包括表2中所陳述之靶向序列、表2中靶向序列之至少10個鄰接核苷酸之片段或與表2中之靶向序列具有至少80%之序列一致性之變體。具體反義股寡聚物由表2中所陳述之靶向序列組成或基本上由其組成。在一些實施例中，寡聚物具有核酸酶抗性。
在某些實施例中，反義股寡聚物包括選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環-DNA寡聚物、三環-硫代磷酸酯寡聚物、2’O-Me修飾之寡聚物或任一前述物質之組合之非天然化學骨架；及與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID.NO：1)、內含子2(SEQ ID.NO：2)或外顯子2(SEQ ID.NO：3)內之區域互補的靶向序列。舉例而言，在一些實施例中，靶向序列係選自SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧 啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
本揭示內容之反義股寡聚物通常包括複數個核苷酸亞單元，其各自具有一起形成或包括(例如)如上文所論述之靶向序列之核鹼基。因此，在一些實施例中，反義股寡聚物之長度介於約10至約40個亞單元之間，更佳地為約10至30個亞單元，且通常為15-25個亞單元。舉例而言，本揭示內容之反義股化合物之長度可為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個亞單元，或其範圍為10個亞單元至40個亞單元、10個亞單元至30個亞單元、14個亞單元至25個亞單元、15個亞單元至30個亞單元、17個亞單元至30個亞單元、17個亞單元至27個亞單元、10個亞單元至27個亞單元、10個亞單元至25個亞單元及10個亞單元至20個亞單元。在某些實施例中，反義股寡聚物之長度為約10至約40或約5至約30個核苷酸。在一些實施例中，反義股寡聚物之長度為約14至約25或約17至約27個核苷酸。
在一些實施例中，反義股寡聚物之骨架實質上不帶電，且視情況識別為穿過細胞膜主動或協助轉運之受質。在一些實施例中，所有核苷間鏈接皆不帶電。寡聚物與靶RNA形成穩定雙鏈體之能力亦可涉及骨架之其他特徵，包含反義股寡聚物與靶互補之長度及程度、G：C與A：T鹼基匹配之比率及任一錯配鹼基之位置。反義股寡聚物抵抗細胞核酸酶之能力可促進存活及最終將藥劑遞送至細胞質中。實例性反義股寡聚物靶向序列列示於表2中(見上文)。
在某些實施例中，反義股寡聚物具有至少一個在生理學pH下帶正電荷或為陽離子型之核苷間鏈接。在一些實施例中，反義股寡聚物具有至少一個展現介於約5.5與約12之間之pKa之核苷間鏈接。視情況，反義股寡聚物具有至少一個具有鹼性氮及烷基、芳基或芳烷基之核苷間鏈接。在特定實施例中，一或多個陽離子型核苷間鏈接包括4- 胺基六氫吡啶-1-基(APN)或其衍生物。儘管不受限於任一理論，但據信，在寡聚物中存在一或多個陽離子型鏈接(例如APN基團或APN衍生物)會促進與靶核苷酸中帶負電荷之磷酸酯之結合。因此，在突變體RNA與含有陽離子型鏈接之寡聚物之間所形成之異源雙鏈體可藉由離子吸引力及沃森-克裡克鹼基配對保持在一起。
在一些實施例中，陽離子型鏈接之數量為至少2且不超過全部核苷間鏈接之約二分之一，例如約或不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個陽離子型鏈接。然而，在一些實施例中，至多所有核苷間鏈接皆係陽離子型鏈接，舉例而言，全部核苷間鏈接之約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個係陽離子型鏈接。在具體實施例中，具有約19-20個亞單元之寡聚物可具有2-10(例如4-8)個陽離子型鏈接，且剩餘部分係不帶電鏈接。在其他具體實施例中，具有14-15個亞單元之寡聚物可具有2-7(例如2、3、4、5、6或7)個陽離子型鏈接且剩餘部分係不帶電鏈接。寡聚物中陽離子型鏈接之總數可由此自約1至10至15至20至30或更高有所變化(包含之間之所有整數)，且可散佈於整個寡聚物中。
在一些實施例中，反義股寡聚物可具有約或至多約1個陽離子型鏈接/2-5或2、3、4或5個不帶電鏈接，例如約4-5或4或5個陽離子型鏈接/10個不帶電鏈接。
某些實施例包含含有約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之陽離子型鏈接之反義股寡聚物。在某些實施例中，若約25%之骨架鏈接係陽離子型，則可看到反義股活性之最佳改 良。在某些實施例中，在含有少量(例如10-20%)陽離子型鏈接或陽離子型鏈接之數量在50-80%範圍內(例如約60%)之情形下，可看到增強。
在一些實施例中，陽離子型鏈接沿骨架散佈。該等寡聚物視情況含有至少兩個連續之不帶電鏈接；亦即該寡聚物視情況不具有沿其整個長度之嚴格交替模式。在具體情況下，每一或兩個陽離子型鏈接沿骨架相隔至少1、2、3、4或5個不帶電鏈接。
亦包含具有陽離子型鏈接阻斷及不帶電鏈接阻斷之寡聚物。舉例而言，不帶電鏈接之中心阻斷可側接有陽離子型鏈接阻斷，或反之亦然。在一些實施例中，寡聚物之5',3'及中心區域具有大致相等之長度，且陽離子型鏈接在中心區域中之百分比大於陽離子型鏈接總數之約50%、60%、70%或80%。
在某些反義股寡聚物中，大部分陽離子型鏈接(例如70%、75%、80%、90%之陽離子型鏈接)靠近「中心區域」骨架鏈接(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個最中心鏈接)分佈。舉例而言，16、17、18、19、20、21、22、23或24聚體寡聚物中至少50%、60%、70%或80%之總陽離子型鏈接可侷限於8、9、10、11或12最中心鏈接處。
B.骨架化學特徵
反義股寡聚物可採用各種反義股化學物質。寡聚物化學物質之實例包含但不限於肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、2'O-Me修飾之寡聚物、嗎啉基、PMO、PPMO、PMOplus及PMO-X化學物質，包含任一前述物質之組合。一般而言，PNA及LNA化學物質可利用較短靶向序列，此乃因其靶結合強度相對於PMO及2’O-Me寡聚物相對較高。硫代磷酸酯及2'O-Me修飾之化學物質通常組合生成2'O-Me-硫代磷酸酯骨架。例如參見PCT公開案第WO/2013/112053號及第 WO/2009/008725號，其全部內容以引用方式併入本文中。
在一些情況下，反義股寡聚物(例如PMO)可偶聯至細胞穿透肽(CPP)以促進細胞內遞送。肽偶聯PMO稱為PPMO且某些實施例包含彼等闡述於PCT公開案第WO/2012/150960號(其全部內容以引用方式併入本文中)中者。
1.肽核酸(PNA)
肽核酸(PNA)係DNA類似物，其中骨架在結構上與去氧核糖骨架同形，其由連接有嘧啶或嘌呤鹼基之N-(2-胺基乙基)甘胺酸單元組成。含有天然嘧啶及嘌呤鹼基之PNA按照沃森-克裡克鹼基配對規律與互補寡聚物雜交，且在鹼基對識別方面模擬DNA(Egholm、Buchardt等人，1993)。PNA骨架係由肽鍵而非磷酸二酯鍵形成，從而使其非常適用於反義股應用(參見下文結構)。該骨架不帶電，從而使得PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈體展現高於正常之熱穩定性。核酸酶或蛋白酶不識別PNA。PNA之非限制性實例繪示於下文中：
Figure 103130887-A0305-02-0037-14
儘管相對於天然結構發生顯著結構變化，但PNA能夠以螺旋形式序列特異性結合DNA或RNA。PNA之特性包含與互補DNA或RNA之高結合親和性、由單鹼基錯配所致之失穩效應、對核酸酶及蛋白酶之抵抗、與DNA或RNA之雜交獨立於鹽濃度及與同型嘌呤DNA形成三鏈體。PANAGENE.TM.已研發出其專利性Bts PNA單體(Bts；苯并噻唑-2-磺醯基)及專利性寡聚製程。使用Bts PNA單體之PNA寡聚係由去 保護、偶合及加帽之重複性循環構成。可以合成方式使用業內已知之任一技術產生PNA。例如參見美國專利第6,969,766號、第7,211,668號、第7,022,851號、第7,125,994號、第7,145,006號及第7,179,896號。亦參見美國專利第5,539,082號、第5,714,331號及第5,719,262號以用於製備PNA。PNA化合物之其他教示內容可參見Nielsen等人，Science,254：1497-1500,1991。前述文獻之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
2.鎖核酸(LNA)
反義股寡聚物化合物亦可含有「鎖核酸」亞單元(LNA)。「LNA」係稱為橋接核酸(BNA)之修飾種類之成員。BNA之特徵在於鎖定C30-內(北方)糖褶中核糖環之構象之共價鏈接。對於LNA而言，橋由2'-O與4'-C位置之間之亞甲基構成。LNA增強骨架預組織及鹼基堆積以增加雜交及熱穩定性。
LNA之結構可參見(例如)Wengel，等人，Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54：3607及Accounts of Chem.Research(1999)32：301)；Obika等人，Tetrahedron Letters(1997)38：8735；(1998)39：5401及Bioorganic Medicinal Chemistry(2008)16：9230。LNA之非限制性實例繪示於下文中：
Figure 103130887-A0305-02-0038-16
本揭示內容之化合物可納入一或多種LNA；在一些情形下，化合物可完全由LNA構成。個別LNA核苷亞單元之合成方法及將其納入寡 聚物中之方法已闡述於(例如)美國專利第7,572,582號、第7,569,575號、第7,084,125號、第7,060,809號、第7,053,207號、第7,034,133號、第6,794,499號及第6,670,461號中，每一專利之全部內容以引用方式併入本文中。典型亞單元間連接體包含磷酸二酯部分及硫代磷酸酯部分；另一選擇為，可採用不含磷連接體。一實施例係含LNA化合物，其中各LNA亞單元由DNA亞單元來分隔。某些化合物由交替之LNA及DNA亞單元構成，其中亞單元間連接體係硫代磷酸酯。
3.硫代磷酸酯
「硫代磷酸酯」(或S-寡聚物)係一個非橋接氧由硫代替之正常DNA之變體。硫代磷酸酯之非限制性實例繪示於下文中；
Figure 103130887-A0305-02-0039-18
核苷間酸鍵之硫化減小了內核酸酶及外核酸酶(包含5'至3'及3'至5' DNA POL 1外核酸酶、核酸酶S1及P1、RNase、血清核酸酶及蛇毒磷酸二酯酶)之作用。硫代磷酸酯係藉由以下兩種主要途徑製得：藉由存於二硫化碳中之元素硫之溶液對膦酸氫酯之作用，或藉由使用二硫化四乙基秋蘭姆(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亞磷酸三酯之方法(例如參見Iyer等人，J.Org.Chem.55,4693-4699,1990)。後一方法避免了元素硫在大部分有機溶劑中之不溶性及二硫化碳之毒性之問題。TETD及BDTD方法亦得到較高純度之硫代磷酸酯。
4.三環-DNA及三環-硫代磷酸酯核苷酸
三環-DNA(tc-DNA)係一類受約束DNA類似物，其中藉由引入環丙烷環來修飾每一核苷酸以限制骨架之構象撓性並優化扭轉角γ之骨 架幾何結構。含有同型鹼基腺嘌呤及胸腺嘧啶之tc-DNA與互補RNA形成格外穩定之A-T鹼基對。三環-DNA及其合成闡述於國際專利申請案公開案第WO 2010/115993號中。本揭示內容之化合物可納入一或多種三環-DNA核苷酸；在一些情形下，化合物可完全由三環-DNA核苷酸構成。
三環-硫代磷酸酯核苷酸係具有硫代磷酸酯亞單元間鏈接之三環-DNA核苷酸。三環-硫代磷酸酯核苷酸及其合成闡述於國際專利申請案公開案第WO 2013/053928號中。本揭示內容之化合物可納入一或多種三環-DNA核苷酸；在一些情形下，化合物可完全由三環-DNA核苷酸構成。三環-DNA/三環-硫代磷酸酯核苷酸之非限制性實例繪示於下文中：
Figure 103130887-A0305-02-0040-19
5. 2' O-甲基寡聚物
「2’O-Me寡聚物」分子在核糖分子之2'-OH殘基處攜載甲基。2'-O-Me-RNA與DNA展示相同(或類似)行為，但抵抗核酸酶降解。2'-O-Me-RNA亦可與硫代磷酸酯寡聚物(PTO)組合以進一步穩定化。可根據業內常規技術合成2'O-Me寡聚物(磷酸二酯或硫代磷酸酯)(例如參見Yoo等人，Nucleic Acids Res.32：2008-16,2004)。2' O-Me寡聚物之非限制性實例繪示於下文中：
Figure 103130887-A0305-02-0041-20
2' O-Me寡聚物亦可包括硫代磷酸酯鏈接(2' O-Me硫代磷酸酯寡聚物)。
6.嗎啉基寡聚物
「嗎啉基寡聚物」或「PMO」係指具有支持能夠氫鍵結至典型多核苷酸之核鹼基之骨架之寡聚物，其中聚合物缺乏戊糖糖骨架部分，而代之以含有嗎啉基環。因此，在PMO中，嗎啉基環結構支持鹼基配對部分以形成鹼基配對部分之序列，其通常經設計以與細胞中或所治療個體中之所選反義股靶雜交。實例性「嗎啉基」寡聚物包括藉由胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯鏈接(將一個亞單元之嗎啉基氮連接至毗鄰亞單元之4'環外碳)連接至一起之嗎啉基亞單元結構，每一亞單元包括藉由鹼基特異性氫鍵結有效結合至多核苷酸中之鹼基之嘌呤或嘧啶核鹼基。嗎啉基寡聚物(包含反義股寡聚物)詳述於(例如)美國專利第5,698,685號、第5,217,866號、第5,142,047號、第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,521,063號、第5,506,337號及待決美國專利申請案12/271,036、12/271,040及PCT公開案第WO/2009/064471號及第WO/2012/043730號，所有案件之全部內容以引用方式併入本文中。
在寡聚物結構內，通常認為磷酸酯基團形成寡聚物之「核苷間鏈接」。RNA及DNA之天然核苷間鏈接係3’至5’磷酸二酯鏈接。「胺基磷酸酯」基團包括具有三個連接氧原子及一個連接氮原子之磷，而「二胺基磷酸酯」基團包括具有兩個連接氧原子及兩個連接氮原子之 磷。在本文所闡述PMO及/或PMO-X寡聚物之不帶電或陽離子型亞單元間鏈接中，一個氮總是懸垂於骨架鏈上。二胺基磷酸酯鏈接中之第二氮通常係嗎啉基環結構中之環氮。
「PMO-X」係指具有磷原子之二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)，其具有：(i)至嗎啉基環之氮原子之共價鍵，及(ii)至4-胺基六氫吡啶-1-基(亦即APN)或4-胺基六氫吡啶-1-基之衍生物之環氮之第二共價鍵。實例性PMO-X寡聚物揭示於PCT申請案第PCT/US2011/38459號及PCT公開案第WO/2013/074834號中，每一案件之其全部內容以引用方式併入本文中。「PMO-apn」或「APN」係指包括至少一種核苷間鏈接之PMO-X寡聚物，其中磷原子連接至嗎啉基及4-胺基六氫吡啶-1-基(亦即APN)之環氮。在具體實施例中，包括如表2中所陳述靶向序列之反義股寡聚物包括至少一種含有APN之鏈接或含有APN衍生物之鏈接。具體實施例包含具有約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之含有APN/APN衍生物之鏈接之PMO，其中剩餘鏈接(若小於100%)係不帶電鏈接，舉例而言，總核苷間鏈接中之約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個係含有APN/APN衍生物之鏈接。
在一些實施例中，反義股寡聚物係式(I)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0043-21
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係8至38之整數；每一Y獨立地選自O或-NRa，其中Ra係選自由以下組成之群：氫、-T1-NRcRdRe及-[(C(O)CHR'NH)m]R"，其中：R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈，R"係選自氫或醯基，m係1至60之整數，Rc係選自由氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2組成之群，Rd係選自由氫、芳烷基及C1-C6烷基組成之群，或在Rc及Rd各自獨立地係C1-C6烷基或芳烷基時Rc及Rd與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環視情況經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，且Re係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；每一L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，S係選自1至8之整數； n係0至3之整數；每一R1獨立地選自由以下組成之群：-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、式(II)部分：
Figure 103130887-A0305-02-0044-22
其中R8係選自由氫、甲基、-C(=NH)NH2、-Z-T2-NHC(=NH)NH2及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中Z係羰基或直接鍵，R9係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群，且每一R10獨立地選自氫或甲基；且式(III)部分：
Figure 103130887-A0305-02-0044-23
其中q係0至2之整數，R11係選自由氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2組成之群，R12係選自由氫、芳烷基及C1-C6烷基組成之群，或R11及R12與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環視情況經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，且R13係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；R2係選自由氫、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，或R2不存在；R3係選自由氫、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、-C(=NH)NH2、三苯甲基、-C(=O)ORg、醯基、-C(O)(CH2)mC(O)及T4- (4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)六氫吡嗪-1-基組成之群，其中Rg係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，T4係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R係-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；R4係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及醯基，且每一R5獨立地選自氫或甲基；每一R6及每一R7獨立地選自氫或-T3-NRcRdRe；且T1、T2及T3中之每一者獨立地係長度至多為18個原子之可選連接體，包括烷基、烷氧基或烷基胺基或其組合，其中靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID.NO.1)、內含子2(SEQ ID.NO.2)或外顯子2(SEQ ID.NO.3)內之區域互補。
在一些實施例中，R3係部分T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)六氫吡嗪-1-基，其中T4係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R係-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2。該等部分另外闡述於美國專利第7,935,816號中，該專利之全部內容以引用方式併入本文中。
在某些實施例中，R3可包括繪示於下文中之部分：
Figure 103130887-A0305-02-0045-24
在某些實施例中，每一R1係-N(CH3)2。在一些實施例中，約50-90%之R1基團係二甲基胺基(亦即-N(CH3)2)。在某些實施例中，約66%之R1基團係二甲基胺基。
在一些實施例中，靶向序列係選自SEQ.ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶 (T)。在一些實施例中，每一R1係-N(CH3)2且靶向序列係選自SEQ.ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在本揭示內容之一些實施例中，R1可選自由以下組成之群：
Figure 103130887-A0305-02-0046-25
在一些實施例中，至少一個R1係：
Figure 103130887-A0305-02-0046-27
在某些實施例中，n為2，R2及L一起具有下式：
Figure 103130887-A0305-02-0047-28
 且Y在每次出現時係O。
在其他實施例中，反義股寡聚物係式(IV)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0047-29
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係8至38之整數；每一L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，S係選自1至8之整數；R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈，R"係選自氫或醯基，m係1至60之整數； n係0至3之整數；R2係選自由氫、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，或R2不存在；R3係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、-C(=NH)NH2及醯基；且R4係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及醯基，其中靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID.NO：1)、內含子2(SEQ ID.NO：2)或外顯子2(SEQ ID.NO：3)內之區域互補。
在一些實施例中，n為2，R2及L一起具有下式：
Figure 103130887-A0305-02-0048-30
 R3係氫；且R4係電子對。
在一些實施例中，反義股寡聚物係式(V)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0049-31
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係8至38之整數；每一L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，S係選自1至8之整數；R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈，R"係選自氫或醯基，且m係1至60之整數；n係0至3之整數；且R2係選自由氫、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，或R2不存在，其中靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA 之內含子1(SEQ ID.NO：1)、內含子2(SEQ ID.NO：2)或外顯子2(SEQ ID.NO：3)內之區域互補。
在一些實施例中，n為2；且R2及L一起具有下式：
Figure 103130887-A0305-02-0050-34
在某些實施例中，本揭示內容之反義股寡聚物係式(VI)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0050-33
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係15至25之整數；每一Y係O；每一R1獨立地選自由以下組成之群：
Figure 103130887-A0305-02-0051-35
 其中至少一個R1係-N(CH3)2，且其中靶向序列係選自SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。在一些實施例中，每一R1係-N(CH3)2。
在一些實施例中，本揭示內容之反義股寡聚物(包含式(I)、(IV)、(V)及(VI)之化合物)之每一Nu獨立地選自由以下組成之群：腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黃嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基修飾之嘧啶及9-(胺基乙氧基)吩噁嗪。在一些實施例中，本揭示內容之反義股寡聚物(包含式(I)、(IV)、(V)及(VI)之化合物)之靶向序列係選自SEQ.ID NO：412、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在某些實施例中，反義股寡聚物係式(VII)化合物：
Figure 103130887-A0305-02-0052-36
或其醫藥上可接受之鹽，其中：每一Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；且x係8至38之整數；其中靶向序列係選自SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
可用於本揭示內容中之其他反義股寡聚物/化學物質包含彼等闡述於下列專利及專利公開案(其內容以引用方式併入本文中)中者：PCT公開案第WO/2007/002390號、第WO/2010/120820號及第WO/2010/148249號、美國專利第7,838,657號及美國申請案第2011/0269820號。
C.具有鹼性氮核苷間連接體之PMO-X之製備
可如(例如)美國專利第5,185,444號及第7,943,762號(其全部內容以引用方式併入本文中)中所闡述來製備嗎啉基亞單元、經修飾之亞單元間鏈接及包括其之寡聚物。可根據下列一般反應圖I來製備嗎啉基亞單元。
Figure 103130887-A0305-02-0053-37
參照反應圖1，其中B代表鹼基配對部分且PG代表保護基團，可自如所展示之相應核糖核苷(1)製備嗎啉基亞單元。可視情況藉由與適宜保護基團前體(例如三苯甲基氯)進行反應來保護嗎啉基亞單元(2)。通常在固態寡聚物合成期間去除3'保護基團，如下文更詳細所闡述。可適宜地保護鹼基配對部分以用於固相寡聚物合成。適宜保護基團包含苯甲醯基(用於腺嘌呤及胞嘧啶)、苯基乙醯基(用於鳥嘌呤)及三甲基乙醯基氧基甲基(用於次黃嘌呤(I))。可將三甲基乙醯基氧基甲基引入次黃嘌呤雜環鹼基之N1位置處。儘管可採用未保護次黃嘌呤亞單元，但在鹼基受保護時活化反應中之產率極佳。其他適宜保護基團包含彼等揭示於共同待決之美國申請案第12/271,040號(其全部內容以引用方式併入本文中)中者。
3與經活化磷化合物4之反應得到具有期望鏈接部分之嗎啉基亞單元5。可使用彼等熟習此項技術者已知之任一方法來製備結構4之化合物。舉例而言，可藉由相應胺及磷醯氯之反應來製備該等化合物。就此而言，可使用業內已知之任一方法(例如彼等闡述於實例及美國專利第7,943,762號中之方法)來製備胺起始材料。
結構5之化合物可用於固相自動寡聚物合成中以製備包括亞單元間鏈接之寡聚物。業內已熟知該等方法。簡言之，結構5之化合物可在5'端經修飾以含有連接至固體載體之連接體。舉例而言，化合物5可藉由包括L11及L15之連接體連接至固體載體。實例性方法顯示於圖1及2中。一旦受載，去除保護基團(例如三苯甲基)，且使自由胺與結構5之第二化合物之經活化磷部分反應。重複此序列直至獲得期望長度之寡聚物為止。末端5'端之保護基團可去除或保留(若期望5'-修飾)。可使用任何方法自固體載體去除寡聚物，例如用DTT、然後用氫氧化銨處理，如圖3及4中所示。
經修飾之嗎啉基亞單元及嗎啉基寡聚物之製備更詳細闡述於實例中。可使用本文所闡述之方法、業內已知方法及/或以引用方式闡述於本文中之方法來製備含有任何數量經修飾之鏈接之嗎啉基寡聚物。實例中亦闡述如前文所述製得之嗎啉基寡聚物之整體修飾(參見例如PCT公開案WO2008036127)。
術語「保護基團」係指阻斷化合物之一些或所有反應性部分且防止該等部分參與化學反應直至該保護基團去除為止之化學部分，例如列示且闡述於T.W.Greene,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons(1999)中之部分。若採用不同保護基團，各(不同)保護基團藉由不同方式去除可較為有利。在完全不同反應條件下裂解之保護基團允許差別地去除該等保護基團。舉例而言，可藉由酸、鹼及氫解去除保護基團。諸如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、縮醛及第三丁基二甲基矽烷基之基團係酸不穩定且可在經Cbz基團(其可藉由氫解去除)及Fmoc基團(其係鹼不穩定)保護之胺基存在下用於保護羧基及羥基反應性部分。羧酸部分可使用鹼不穩定基團(例如，但不限於，甲基或乙基)阻斷，且羥基反應性部分可使用鹼不穩定基團(例如乙醯基)在經酸不穩定基團(例如胺基甲酸第 三丁基酯)或胺基甲酸酯(其係酸及鹼穩定但可以水解去除)阻斷之胺存在下阻斷。
羧酸及羥基反應性部分亦可經水解可去除性保護基團(例如苄基)阻斷，而胺基團可經鹼不穩定基團(例如Fmoc)阻斷。用於合成式(I)化合物之尤其有用之胺保護基團係三氟乙醯胺。羧酸反應性部分可經氧化可去除性保護基團(例如2,4-二甲氧基苄基)阻斷，而共存之胺基可經氟化物不穩定之胺基甲酸矽烷基酯阻斷。
烯丙基阻斷基團可用於酸及鹼保護基團存在下，此乃因形成劑較為穩定且可隨後藉由金屬或π酸觸媒去除。舉例而言，可使用鈀(0)催化反應在酸不穩定胺基甲酸第三丁基酯或鹼不穩定乙酸酯胺保護基團存在下對烯丙基阻斷之羧酸實施去保護。保護基團之又一形式係樹脂，其可連接有化合物或中間體。只要殘基連接至樹脂，官能基即受阻斷且不能反應。在自樹脂釋放後，官能基可用於反應。
典型阻斷/保護基團為業內已知且包含但不限於下列部分：
Figure 103130887-A0305-02-0055-38
除非另有所述，否則所有化學物質皆自Sigma-Aldrich-Fluka獲得。苯甲醯基腺苷、苯甲醯基胞苷及苯基乙醯基鳥苷係自Carbosynth Limited,UK獲得。
使用業內已知之方法來合成含有如本文所闡述之其他鏈接修飾之PMO、PMO+、PPMO及PMO-X且闡述於待決美國申請案第 12/271,036號及第12/271,040號及PCT公開案第WO/2009/064471號(其全部內容以引用方式併入本文中)中。
基本上如PCT公開案第WO/2009/064471號中所闡述來合成具有3'三苯甲基修飾之PMO，只是刪除去三苯甲基化步驟。
Ⅳ 調配物
本揭示內容之化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物混合物(例如脂質體、靶向受體之分子、經口、直腸、局部或其他調配物)混合、囊封、偶聯或以其他方式締合以有助於攝取、分佈及/或吸收。教示該等有助於攝取、分佈及/或吸收之調配物之製備的代表性美國專利包含但不限於美國專利第5,108,921號、第5,354,844號、第5,416,016號、第5,459,127號、第5,521,291號、第5,543,158號、第5,547,932號、第5,583,020號、第5,591,721號、第4,426,330號、第4,534,899號、第5,013,556號、第5,108,921號、第5,213,804號、第5,227,170號、第5,264,221號、第5,356,633號、第5,395,619號、第5,416,016號、第5,417,978號、第5,462,854號、第5,469,854號、第5,512,295號、第5,527,528號、第5,534,259號、第5,543,152號、第5,556,948號、第5,580,575號及第5,595,756號，每一者皆以引用方式併入本文中。
本揭示內容之反義股化合物涵蓋任一醫藥上可接受之鹽、酯或該等酯之鹽或在投與動物(包含人類)後能夠提供(直接或間接)生物活性代謝物或其殘基的任一其他化合物。因此，舉例而言，本揭示內容亦係關於本揭示內容之化合物之前藥及醫藥上可接受之鹽、該等前藥之醫藥上可接受之鹽及其他生物等效物。
術語「前藥」指示以非活性形式製備之治療劑，其在機體內或其細胞內藉由內源性酶或其他化學物質及/或條件轉化為活性形式(亦即藥物)。特定而言，根據揭示於WO 93/24510(頒予Gosselin等人， 公開於1993年12月9日)或WO 94/26764及美國專利第5,770,713號(頒予Imbach等人)中之方法將本揭示內容之寡聚物之前藥形式製備為SATE[(S-乙醯基-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物。
術語「醫藥上可接受之鹽」係指本揭示內容之化合物之生理上及醫藥上可接受之鹽：亦即保留母體化合物之期望生物活性且並不賦予其不期望毒理學效應之鹽。對於寡聚物而言，醫藥上可接受之鹽及其應用之實例進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。
本揭示內容亦包含含有本揭示內容之反義股化合物之醫藥組合物及調配物。端視期望局部抑或全身性治療及擬治療區域，本揭示內容之醫藥組合物可以諸多方式投與。投與可為局部(包含眼部投與及投與黏膜，包含陰道及直腸遞送)、肺部(例如藉由吸入或噴射粉末或氣溶膠，包含藉由霧化器)、氣管內、鼻內、表皮及經皮、經口或非經腸投與。非經腸投與包含靜脈內、動脈內、皮下、腹膜腔內或肌內注射或輸注或顱內(例如鞘內或心室內)投與。據信，具有至少一個2'-O-甲氧基乙基修飾之寡聚物尤其可用於經口投與。用於局部投與之醫藥組合物及調配物可包含經皮貼劑、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。可能需要或期望習用醫藥載劑、水性、粉末或油性基質、增稠劑及諸如此類。亦可使用包覆避孕套、手套及諸如此類。
可便利地以單位劑型呈現之本揭示內容之醫藥調配物可根據醫藥工業中熟知之習用技術製得。該等技術包含使活性成份與醫藥載劑或賦形劑結合之步驟。一般而言，調配物可藉由使活性成份與液體載劑或微細固體載劑或二者均勻且充分結合且然後(若需要)使該產物成型來製備。
可將本揭示內容之組合物調配成許多可能劑型中之任一者，例 如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟質凝膠、栓劑及灌腸劑。本揭示內容之組合物亦可調配成存於水性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液之黏度之物質，其包含(例如)羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或右旋糖酐。懸浮液亦可含有穩定劑。
本揭示內容之醫藥組合物包含但不限於溶液、乳液、發泡體及含有脂質體之調配物。本揭示內容之醫藥組合物及調配物可包括一或多種滲透增強劑、載劑、賦形劑或其他活性或惰性成份。
乳液通常係一種液體分散於另一液滴形式液體(直徑經常超過0.1μm)的異質系統。乳液除分散相外亦可含有其他組份及可呈現為存於水相、油相中之溶液形式或自身作為分離相的活性藥物。本揭示內容之一實施例包含微乳液。乳液及其應用在業內已眾所周知且進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文中。
本揭示內容之調配物包含脂質體調配物。如本揭示內容中所使用，術語「脂質體」意指由配置於一或多個球形雙層中之兩親性脂質構成的囊泡。脂質體係單層或多層囊泡，其具有自親脂性材料形成之膜及含有擬遞送組合物之水性內部結構。陽離子型脂質體係帶正電之脂質體，據信其與帶負電之DNA分子相互作用以形成穩定複合物。對pH敏感或帶負電之脂質體據信會捕獲DNA而非與其複合。陽離子型及非陽離子型脂質體皆可用於向細胞遞送DNA。
脂質體亦包含「空間穩定」脂質體，本文所用之該術語係指包括一或多個特定脂質之脂質體，該等特定脂質在納入質體中時會相對於缺乏該等特定脂質之脂質體增強循環壽命。空間穩定脂質體之實例係彼等脂質體中形成囊泡之脂質部分之一部分包括一或多種糖脂或衍生自一或多種親水性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)部分)者。脂質體及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文 中。
本揭示內容之醫藥調配物及組合物亦可包含表面活性劑。表面活性劑在藥物產物、調配物及乳液中之應用在業內已眾所周知。表面活性劑及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文中。
在一些實施例中，本揭示內容採用各種滲透增強劑來實現核酸、尤其寡聚物之有效遞送。除有助於非親脂性藥物在細胞膜中之擴散外，滲透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透性。滲透增強劑可歸類為屬5大類中之一者：亦即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合性非表面活性劑。滲透增強劑及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文中。
熟習此項技術者應認識到，調配物通常根據其預期應用(亦即投與途徑)來進行設計。
用於局部投與之調配物包含彼等本揭示內容之寡聚物與局部遞送劑混合者，該局部遞送劑係(例如)脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及表面活性劑。脂質及脂質體包含中性脂質及脂質體(例如二油醯基磷脂醯基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼DMPC、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼)、負脂質及脂質體(例如二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油DMPG)及陽離子型脂質及脂質體(例如二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂醯基乙醇胺DOTMA)。
對於局部或其他投與而言，本揭示內容之寡聚物可囊封於脂質體內或可與其形成複合物(尤其陽離子型脂質體)。另一選擇為，寡聚物可與脂質、尤其陽離子型脂質複合。脂肪酸及酯、其醫藥上可接受之鹽及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文中。局部調配物詳細闡述於1999年5月20日提出申請之美國專利申請案第09/315,298號中，其全部內容以引用方式併入本文中。
用於經口投與之組合物及調配物包含粉末或粒子、微顆粒、奈米顆粒、存於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微錠劑。可能期望使用增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。口服調配物係彼等本揭示內容之寡聚物與一或多種滲透增強劑、表面活性劑及螯合劑聯合投與者。表面活性劑包含脂肪酸及/或其酯或鹽、膽汁酸及/或其鹽。膽汁酸/鹽及脂肪酸及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文中。在一些實施例中，本揭示內容提供滲透增強劑之組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合。實例性組合係月桂酸之鈉鹽、癸酸及UDCA。其他滲透增強劑包含聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本揭示內容之寡聚物可以粒子形式(包含噴霧乾燥顆粒或經複合以形成微顆粒或奈米顆粒)經口遞送。寡聚物複合劑及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號中，其全部內容併入本文中。寡聚物之口服調配物及其製備詳細闡述於美國申請案第09/108,673號(1998年7月1日提出申請)、第09/315,298號(1999年5月20日提出申請)及第10/071,822號(2002年2月8日提出申請)，每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
用於非經腸、鞘內或心室內投與之組合物及調配物可包含亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜添加劑之無菌水溶液，該等其他適宜添加劑係(例如但不限於)滲透增強劑、載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
本揭示內容之某些實施例提供含有一或多種寡聚化合物及一或多種藉由非反義股機制發揮作用之其他化學治療劑之醫藥組合物。該等化學治療劑之實例包含但不限於癌症化學治療藥物，例如柔紅黴素(daunorubicin)、道諾黴素(daunomycin)、更生黴素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、 依索比星(esorubicin)、博來黴素(bleomycin)、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)、亞硝脲氮芥(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安(busulfan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、放線菌素D(actinomycin D)、光輝黴素(mithramycin)、潑尼松(prednisone)、羥孕酮(hydroxyprogesterone)、睪酮(testosterone)、他莫昔芬(tamoxifen)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、五甲三聚氰胺(pentamethylmelamine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環己亞硝脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥(nitrogen mustard)、美法侖(melphalan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、羥基脲(hydroxyurea)、噴司他丁(deoxyco-formycin)、4-羥基過氧環磷醯胺(4-hydroxyperoxycyclophosphoramide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)(5-FUdR)、胺甲蝶呤(methotrexate)(MTX)、秋水仙鹼(colchicine)、紫杉醇(taxol)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊甙(etoposide)(VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate)、伊立替康(irinotecan)、托泊替坎(topotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、替尼泊甙(teniposide)、順鉑(cisplatin)及己烯雌酚(diethylstilbestrol)(DES)。在與本揭示內容之化合物一起使用時，該等化學治療劑可個別地(例如5-FU及寡聚物)、依序(例如5-FU及寡聚物，隨後在一定時間之後係MTX及寡聚物)或與一或多種其他該等化學治療劑組合(例如5-FU、MTX及寡聚物，或5-FU、放射療法及寡聚物)使用。抗炎藥(包含但不限於非類固醇抗炎藥及皮質類固醇)以及抗病毒藥(包含但不限於利巴韋林(ribivirin)、阿糖 腺苷(vidarabine)、阿昔洛韋(acyclovir)及更昔洛韋(ganciclovir))亦可組合於本揭示內容之組合物中。反義股化合物及其他非反義股藥物之組合亦屬本發明範圍內。兩種或更多種組合之化合物可一起或依序使用。
在另一相關實施例中，本揭示內容之組合物可含有一或多種靶向第一核酸之反義股化合物(尤其寡聚物)及一或多種靶向第二核酸靶之額外反義股化合物。另一選擇為，本揭示內容之組合物可含有兩種或更多種靶向同一核酸靶之不同區域的反義股化合物。反義股化合物之諸多實例為業內已知。兩種或更多種組合之化合物可一起或依序使用。
V.使用方法
某些實施例係關於使用本揭示內容之反義股寡聚物增加含有外顯子2之GAA mRNA及/或蛋白質之表現以用於治療性目的(例如治療患有GSD-II之個體)的方法。因此，在一些實施例中，本揭示內容提供治療患有GSD-II或處於發生GSD-II之風險下之個體之方法，其包括向個體投與有效量之本揭示內容之反義股寡聚物。在一些實施例中，反義股寡聚物包括具有足夠長度及互補性以與酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA內之區域特異性雜交之核苷酸序列，其中反義股寡聚物與該區域之結合增加了個體之細胞及/或組織中含有外顯子2之GAA mRNA之含量。實例性反義股靶向序列展示於表2中。
亦包含用以製備用於治療II型肝糖貯積病(GSD-II；龐貝病)之藥劑之反義股寡聚物，其包括具有足夠長度及互補性以與酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA內之區域特異性雜交之核苷酸序列，其中反義股寡聚物與該區域之結合增加了含有外顯子2之GAA mRNA之含量。
在治療GSD-II之方法或用於治療GSD-II之藥劑之一些實施例 中，反義股寡聚物化合物包括：非天然化學骨架，其選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環-DNA寡聚物、三環-硫代磷酸酯寡聚物、2’O-Me修飾之寡聚物或前述物質之任一組合；及靶向序列，其與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID.NO：1)、內含子2(SEQ ID.NO：2)或外顯子2(SEQ ID.NO：3)內之區域互補。
如上所述，「GSD-II」係指II型肝糖貯積病(GSD-II或龐貝病)，其係特徵通常在於GAA蛋白在受影響個體中表現不足之人類常染色體隱性疾病。包含患有嬰兒GSD-II之個體及彼等患有晚期發作形式之疾病者。
在某些實施例中，個體之一或多個組織(包含心臟、骨骼肌、肝及神經系統組織)中GAA蛋白之表現及/或活性有所減小(例如相對於健康個體或較早時間點)。在一些實施例中，個體之一或多個組織(包含心臟、骨骼肌、肝及神經系統組織)中之肝糖累積有所增加(例如相對於健康個體或較早時間點)。在具體實施例中，個體至少一種IVS1-13T>G突變(亦稱為c.336-13T>G)(可能)與減小功能GAA蛋白之表現之其他突變之組合。用於GSD-II之分子基因測試之匯總展示於下表3中。
Figure 103130887-A0305-02-0063-275
Figure 103130887-A0305-02-0064-40
某些實施例係關於增加如本文所闡述之細胞、組織及/或個體中含有外顯子2之GAA mRNA或蛋白質之表現的方法。在一些情況下，相對於對照(例如對照細胞/個體、不含反義股寡聚物之對照組合物、不存在治療及/或較早時間點)，含有外顯子-2之GAA mRNA或蛋白質增加約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。亦包含相對於健康對照之表現程度維持含有外顯子2之GAA mRNA或蛋白質之表現的方法。
一些實施例係關於增加如本文所闡述之細胞、組織及/或個體之功能/活性GAA蛋白之表現的方法。在某些情況下，相對於對照(例如對照細胞/個體、不含反義股寡聚物之對照組合物、不存在治療及/或較早時間點)，功能/活性GAA蛋白之含量增加約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。亦包含相對於健康對照之表現程度維持功能/活性GAA蛋白之表現之方法。
特定實施例係關於減小如本文所闡述之一或多種細胞、組織及/ 或個體中之肝糖累積之方法。在某些情況下，相對於對照(例如對照細胞/個體、不含反義股寡聚物之對照組合物、不存在治療及/或較早時間點)，肝糖累積減小約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%o、85%、90%、95%或100%。亦包含維持細胞、組織及/或個體中之正常或另外健康肝糖含量(例如非症狀性含量或與減少之GSD-II症狀有關之含量)之方法。
亦包含減少有需要之個體中一或多種GSD-II症狀之方法。特定實例包含嬰兒GSD-II之症狀，例如心臟擴大、張力過低、心肌病、左心室流出道阻塞、呼吸窘迫、運動延遲/肌無力及進食困難/長勢不能。其他實例包含晚期發作GSD-II之症狀，例如肌無力(例如骨骼肌無力，包含進展性肌無力)、咳嗽受損、復發性胸腔感染、張力過低、運動指標延遲、難以吞嚥或咀嚼及肺活量減小或呼吸功能不全。
可向個體投與本揭示內容之反義股寡聚物以治療(預防性或治療性)GSD-II。結合該治療，可考慮藥物基因組學(亦即研究個體基因型與該個體對外來化合物或藥物之反應之間之關係)。治療劑代謝之差異可藉由改變藥理學活性藥物之劑量與血液濃度之間的關係來引起嚴重毒性或治療失敗。
因此，醫師或臨床醫師可考慮應用在相關藥物基因組學研究中所獲得之知識以確定是否投與治療劑以及調節治療劑治療之劑量及/或治療方案。
反義股寡聚物至靶核酸之有效遞送係一種治療態樣。反義股寡聚物之遞送途徑包含但不限於各種全身性途徑，包含經口及非經腸途徑，例如靜脈內、皮下、腹膜腔內及肌內以及吸入、經皮及局部遞送。熟習此項技術者可根據所治療個體之情況來確定適宜途徑。血管 或血管外循環、血液或淋巴系統及腦脊髓液係可引入RNA之一些非限制性位點。可採用直接CNS遞送，舉例而言，可使用腦室內或鞘內投與作為投與途徑。
在特定實施例中，藉由肌內注射(IM)將反義股寡聚物投與個體，亦即將其肌內投與或遞送。肌內注射位點之非限制性實例包含手臂三角肌、腿部股外側肌及臀部腹腔間區肌肉及背臀區肌肉。在具體實施例中，藉由IM投與PMO、PMO-X或PPMO。
在某些實施例中，有需要之個體在中樞神經系統組織中具有肝糖累積。實例包含中樞神經系統病況有助於GSD-II中之呼吸缺陷之情況(例如參見DeRuisseau等人，PNAS USA.106：9419-24,2009)。因此，可藉由任一業內認可方法將本文所闡述之反義股寡聚物遞送至個體之神經系統中，舉例而言，其中個體患有涉及CNS之GSD-II。舉例而言，可使用本揭示內容之反義股寡聚物之外周血注射經由擴散及/或主動方式來將該等試劑遞送至周邊神經元中。另一選擇為，可修飾反義股寡聚物以促進穿過血液-腦障壁(BBB)，從而達成將該等試劑遞送至中樞神經系統(CNS)之神經元細胞中。反義股寡聚物技術及遞送策略之最新特定進步拓寬了用於神經元病症之反義股寡聚物之範圍(例如參見Forte,A.等人2005.Curr.Drug Targets 6：21-29；Jaeger,L.B.及W.A.Banks.2005.Methods Mol.Med.106：237-251；Vinogradov,S.V.等人，2004.Bioconjug.Chem.5：50-60；前述文獻之全部內容以引用方式併入本文中)。舉例而言，可以肽核酸(PNA)化合物形式生成本揭示內容之反義股寡聚物。PNA試劑各自經鑑別以穿過BBB(Jaeger,L.B.及W.A.Banks.2005.Methods Mol.Med.106：237-251)。亦闡述使用(例如)血管活性藥劑治療個體以促進轉運穿過BBB(Id)。亦可使用將本揭示內容之反義股寡聚物連接至主動轉運穿過BBB之藥劑作為遞送機制。投與反義股藥劑以及造影劑(例如碘海醇)(例如單獨、同時、 以同一調配物)亦可促進遞送穿過BBB，如PCT公開案第WO/2013/086207號中所闡述，其全部內容以引用方式併入本文中。
在某些實施例中，可藉由經皮方法遞送本揭示內容之反義股寡聚物(例如，經由將反義股寡聚物納入(例如)乳液在，其中該等反義股寡聚物視情況包裝至脂質體中)。業內闡述該等經皮及乳液/脂質體調介之遞送方法以用於遞送反義股寡聚物，例如闡述於美國專利第6,965,025號中，其全部內容之內容以引用方式併入本文中。
亦可經由可植入裝置遞送本文所闡述之反義股寡聚物。此一裝置之設計係業內認可製程，例如闡述於(例如)美國專利第6,969,400號中之合成植入體設計，其全部內容之內容以引用方式併入本文中。
可使用業內認可技術(例如轉染、電穿孔、融合、脂質體、膠質聚合顆粒及病毒與非病毒載體以及業內已知之其他方式)將反義股寡聚物引入細胞中。所選遞送方法至少取決於寡聚物化學性質、擬處理細胞及細胞位置且為熟習此項技術者所明瞭。舉例而言，可藉由在表面上具有指向脂質體之特定標記物之脂質體、直接注射至含有靶細胞之組織中、特定受體調介之攝取或諸如此類來達成局部化。
如業內已知，可使用(例如)涉及脂質體調介之攝取、脂質偶聯物、多離胺酸調介之攝取、奈米顆粒調介之攝取及受體調介之胞吞作用以及其他非胞吞遞送模式(例如顯微注射、滲透化(例如鏈球菌溶血素-O滲透化、非離子型肽滲透化)、電穿孔及業內已知之各種非侵襲性非胞吞遞送方法(參照Dokka及Rojanasakul,Advanced Drug Delivery Reviews 44,35-49，其全部內容以引用方式併入本文中))之方法遞送反義股寡聚物。
反義股寡聚物可以存於生理上及/或醫藥上可接受之任一便利媒劑或載劑中之形式來投與。此一組合物可包含彼等熟習此項技術者所採用各種醫藥上可接受之標準載劑中之任一者。實例包含但不限於鹽 水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、水、乙醇水溶液、乳液(例如油/水乳液或甘油三酯乳液)、錠劑及膠囊。生理上可接受之適宜載劑之選擇可隨所選投與模式而變。「醫藥上可接受之載劑」意欲包含任何及所有與醫藥投與相容之溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用為業內所熟知。除任何與活性化合物不相容之習用介質或藥劑外，本發明涵蓋其於組合物中之用途。組合物中亦可納入補充性活性化合物。
本揭示內容之化合物(例如反義股寡聚物)通常可以游離酸或游離鹼形式利用。另一選擇為，本揭示內容之化合物可以酸式或鹼式加成鹽之形式使用。本揭示內容之游離胺基化合物之酸式加成鹽可藉由業內熟知之方法製得，且可自有機酸及無機酸形成。適宜有機酸包含馬來酸、富馬酸、苯甲酸、抗壞血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡糖酸、乳酸、苦杏仁酸、肉桂酸、天門冬胺酸、硬脂酸、棕櫚酸、乙醇酸、麩胺酸及苯磺酸。
適宜無機酸包含鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸及硝酸。鹼式加成鹽包含彼等使用羧酸鹽陰離子形成之鹽且包含使用有機及無機陽離子(例如彼等選自鹼金屬及鹼土金屬(例如鋰、鈉、鉀、鎂、鋇及鈣)者以及銨離子及其取代衍生物(例如二苄基銨、苄基銨、2-羥乙基銨及諸如此類))形成之鹽。因此，術語「醫藥上可接受之鹽」意欲涵蓋任一及所有可接受鹽形式。
此外，前藥亦包含於本揭示內容之背景內。前藥係任一共價鍵結之載劑，在將該前藥投與患者時其在活體內釋放化合物。通常藉由修飾官能基來製備前藥，其中藉由常規操作或在活體內裂解修飾基團以得到母體化合物。前藥包含(例如)羥基、胺或硫氫基鍵結至任一在 投與患者時裂解以形成羥基、胺或硫氫基之基團之本揭示內容之化合物。因此，前藥之代表性實例包含(但不限於)本揭示內容之反義股寡聚物之醇及胺官能基的乙酸酯、甲酸酯及苯甲酸酯衍生物。此外，在羧酸(-COOH)之情形下，可採用酯，例如甲酯、乙酯及諸如此類。
在一些情況下，可採用脂質體來促進細胞攝取反義股寡聚物(例如參見Williams,S.A.,Leukemia.10(12)：1980-1989,1996；Lappalainen等人，Antiviral Res.23：119,1994；Uhlmann等人，antisense oligomers：a new therapeutic principle,Chemical Reviews，第90卷第4、25期，第544-584頁，1990；Gregoriadis,G.，第14章，Liposomes,Drug Carriers in Biology and Medicine，第287-341頁，Academic Press,1979)。亦可使用水凝膠作為投與反義股寡聚物之媒劑，例如如WO 93/01286中所闡述。另一選擇為，寡聚物可以存於微球體或微粒中之形式來投與。(例如參見Wu,G.Y.及Wu,C.H.,J.Biol.Chem.262：4429-4432,30 1987)。另一選擇為，使用與反義股寡聚物複合之充氣式微氣泡可增強向靶組織之遞送，如美國專利第6,245,747號中所闡述。亦可使用持續釋放之組合物。該等組合物可包含呈諸如薄膜或微膠囊等成型物件形式之半滲透性聚合基質。
在一實施例中，以適宜醫藥載劑將反義股寡聚物投與展現溶酶體貯積病症狀之哺乳動物個體(例如人類或家畜)。在該方法之一態樣中，個體係人類個體，例如診斷為患有GSD-II(龐貝病)之患者。在一較佳實施例中，反義股寡聚物含於醫藥上可接受之載劑中，且經口遞送。在另一較佳實施例中，寡聚物含於醫藥上可接受之載劑中，且經靜脈內(i.v.)遞送。
在一實施例中，以有效產生至少200-400nM反義股寡聚物之峰值血液濃度之量及方式來投與反義股化合物。通常，經約一至兩週之時段通常以規律性間隔投與一或多個劑量之反義股寡聚物。經口投與之 較佳劑量係每70kg約1-1000mg寡聚物。在一些情形下，可能需要大於1000mg寡聚物/患者之劑量。對於靜脈內投與而言，較佳劑量係每70kg約0.5mg至1000mg寡聚物。反義股寡聚物經較短時間段以規律性間隔來投與，例如經兩週或更短時間每日投與。然而，在一些情形下，寡聚物係經較長時間段間歇性投與。可在投與後或在投與的同時投與抗生素或其他治療性治療劑。可視指示基於對所治療個體之免疫分析、其他生化測試及生理檢查之結果來調節治療方案(劑量、頻率、途徑等)。
使用本揭示內容之反義股寡聚物之有效活體內治療方案可根據投與之持續時間、劑量、頻率及途徑以及所治療個體之狀況來改變(亦即預防性投與對因應局部或全身性感染來投與)。因此，該活體內療法經常需要藉由適於所治療特定病症類型之測試進行監測並對劑量或治療方案作出相應調節以獲得最佳治療結果。
可(例如)藉由業內已知疾病之一般指示劑來監測治療。可自獲取自個體生物之試樣(組織、血液、尿液等)在投與反義股寡聚物之前、期間及之後來測定本揭示內容之活體內投與反義股寡聚物之效能。該等試樣之分析包含：(1)使用彼等熟習此項技術者已知之程序(例如電泳凝膠遷移率分析)監測與靶及非靶序列形成之異源雙鏈體之存在或不存在；(2)監測突變體mRNA相對於參考正常mRNA或蛋白質之量，如藉由標準技術(例如RT-PCR、北方印跡、ELISA或西方印跡(Western blotting))所測定。
在一些實施例中，反義股寡聚物由哺乳動物細胞主動吸收。在其他實施例中，反義股寡聚物可偶聯至如本文所闡述之轉運部分(例如轉運肽或CPP)以促進該攝取。
VI.投藥
據信，彼等熟習此項技術者應瞭解治療性組合物之調配及其隨 後之投與(投藥)。投藥取決於擬治療疾病狀態之嚴重程度及反應性，其中治療過程持續數天至數月，或直至實現治癒或減輕疾病狀態為止。可藉由量測患者體內之藥物累積來計算最佳投藥時間表。熟習此項技術者可容易地確定最佳劑量、投藥方法及重複速率。最佳劑量可端視個別寡聚物之相對效力而有所變化，且通常可基於發現在活體外及活體內動物模型中有效之EC50進行估計。一般而言，劑量為0.01μg/kg體重至100g/kg體重，且可每日、每週、每月或每年給予一次或更多次，或甚至每2至20年給予一次。熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中藥物之所量測滯留時間及濃度來估計投藥的重複速率。在成功治療後，可期望使患者維持該療法以預防疾病狀態復發，其中以介於0.01μg/kg體重至100g/kg體重之間之維持劑量投與寡聚物，且每日投與一次或更多次至每20年投與一次。
儘管根據某些實施例具體闡述本揭示內容，但列實例僅用於闡釋本揭示內容且並不意欲加以限制。本申請案中所列舉參考文獻、專利、專利申請案、基因庫登錄號及諸如此類中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
VII.實例 實例1 反義股靶向序列之設計
設計反義股寡聚物靶向序列以用於與人類GAA基因中之IVS1-13T>G突變相關之治療性剪接切換應用。此處，預計剪接切換寡聚物將阻抑內含子及外顯子剪接沉默子元件(分別係ISS及ESS元件)且由此促進成熟GAA mRNA中之外顯子2滯留。恢復正常或近正常GAA表現然後使得合成功能酶，由此向GSD-II患者提供臨床益處。
由此設計某些反義股靶向序列以遮蔽GAA基因之外顯子2內或其側接內含子內之剪接沉默子元件。潛在沉默子元件靶之非限制性實例 包含hnRNPAl基序(TAGGGA)、Tra2-β基序及9G8基序。亦採用內含子1及2(分別係IVS1及IVS2)mRNA之電腦上二級結構分析(mFold)來鑑別可提供適宜反義股靶序列之長距離相互作用。源自此分析之反義股靶向序列展示於表2中(亦參見SEQ ID NO：4-12、14-103、105-108、110-113及115-118)。
包括如表2中所陳述之靶向序列之實例性寡聚物在此實例中製成具有硫代磷酸酯骨架之2'-O-甲基修飾之反義股寡聚物形式。使該等反義股寡聚物與陽離子型遞送藥劑(Lipofectamine 2000、Lipofectin或類似物)複合且轉染至攜載IVS1-13T>G突變之GSD-II患者源纖維母細胞及/或淋巴球中，如下文實例2中所闡述。
在其他實驗中，將包括如表2中所陳述之靶向序列之其他實例性寡聚物製成PMO形式。使用核轉染方案將該等反義股寡聚物引入患者源纖維母細胞及/或淋巴球中，如亦在下文實例2中所闡述。
實例2 反義股寡聚物誘導GSD-II患者源纖維母細胞中之外顯子2包含
實施實驗以測試反義股寡聚物誘導源自患有GSD-II之個體中纖維母細胞及/或淋巴球中之外顯子2包含之能力。在一組實驗中，根據標準方案製備2'-O-甲基修飾之反義股寡聚物且轉染至攜載IVS1-13G>T突變之GSD-II患者源纖維母細胞及/或淋巴球中。在另一組實驗中，根據標準方案製備PMO且藉由核轉染引入該等相同細胞中。然後藉由RT-PCR量測含有外顯子2之mRNA之含量。
GSD-II細胞. 根據標準方案在含有10% FBS之伊格爾MEM(Eagle's MEM)中培養來自患有GSD-II之個體之患者源纖維母細胞或淋巴球(卡瑞爾細胞系(Coriell cell line)GM00443、GM11661、GM14463及/或GM14484)。在實驗之前使細胞傳代約3-5天且在轉染或核轉染時大約80%鋪滿。
GM00443纖維母細胞係來自30歲男性。成人形式；在30歲時發作；正常大小及量之GAA mRNA，藉由抗體檢測GAA蛋白，但僅9%至26%之正常酸-α-1,4葡萄糖苷酶活性；CCR處之親代3；供體個體係具有一個在GAA基因之內含子1中受體位點之位置-13處攜載T>G顛換之等位基因的雜合體，從而得到缺失第一編碼外顯子[外顯子2(IVS1-13T>G)]之替代剪接之轉錄物。
GM11661纖維母細胞係來自38歲男性。異常肝功能測試；在體力活動期間腿部具有不時性抽筋；早晨頭痛；油膩性食物耐受不良；腹部囊腫；缺失纖維母細胞及WBC酸-α-1,4葡萄糖苷酶活性；供體個體係化合物雜合體：等位基因1在GAA基因之內含子1中受體位點之位置-13處攜載T>G顛換(IVS1-13T>G)；所得替代剪接轉錄物具有含有起始密碼子之外顯子2之框架缺失；等位基因2攜載外顯子18之缺失。
GM14463淋巴球係來自26歲女性。在臨床上受影響；成人發作；嚴重全身肌無力及消瘦；嚴重呼吸功能不全；肌肉生檢展示酸性麥芽糖酶缺乏；供體個體係化合物雜合體：一個等位基因在GAA基因之內含子1中受體位點之位置-13處具有T>G顛換(IVS1-13T>G)，從而得到具有第一編碼外顯子缺失之替代剪接轉錄物，外顯子2；第二等位基因在外顯子2中之核苷酸366處具有1 bp缺失(c.366delT)，從而得到框移及蛋白質截短[Glnl24SerfsX18)。
GM14484淋巴球係來自61歲男性。在臨床上受影響；成人發作)；供體個體係化合物雜合體：一個等位基因在GAA基因之內含子1中受體位點之位置-13處具有T>G顛換(IVS1-13T>G)，從而得到具有第一編碼外顯子缺失之替代剪接轉錄物，外顯子2；第二等位基因在外顯子2中之核苷酸172處具有C>T轉變(c.172C>T)，從而止於密碼子58處[Gln58Ter(Q58X)]。
在獲得後，將GSD-II患者細胞擴展且冷凍等分試樣以用於長期 儲存。然後繁殖細胞且對自細胞提取之全部RNA實施RT-PCR以證實外顯子2自成熟GAA編碼轉錄物缺失。
轉染方案. 簡言之，將2'-0-甲基修飾之反義股寡聚物與陽離子型脂質體製劑(例如Lipofectamine 2000)混合且在0、2.5、5、10、25、50、100及200nM之濃度範圍內添加至所培養細胞中。在轉染之後5小時，更換培養基且將細胞在37℃下於5% CO2中培育24至72小時。包含假轉染及未處理細胞作為陰性對照。自細胞製劑提取全部RNA且用作RT-PCR分析中之模板來監測GAA表現之變化，尤其用於觀察成熟GAA轉錄物中外顯子2之增加之包含/滯留。經轉染2'-O-甲基修飾之反義股寡聚物展示於下表E1中。對於此實例而言，SEQ ID NO：24及25之每一X係尿嘧啶(U)。
Figure 103130887-A0305-02-0074-276
Figure 103130887-A0305-02-0075-42
核轉染方案. 將反義股PMO製成存於無核酸酶水(未使用DEPC處理)中之1-2mM儲備液且自其製備適當稀釋液以用於核轉染。對GSD-II細胞實施胰蛋白酶化，計數，以90g離心10分鐘，且將1-5×105個細胞/孔再懸浮於核轉染溶液P2(Lonza)中。然後將反義股PMO溶液及細胞添加至Nucleocuvette 16孔板條之每一孔中，且使用程式EN-100實施脈衝。將細胞在室溫下培育10分鐘且一式兩份轉移至12孔板中。在48小時之後，使用GE Illustra 96 Spin套組遵循製造商推薦方案自經處理細胞分離全部RNA。在分析之前，將所回收RNA儲存於-80℃下。
GAA RT-PCR. 對於含有外顯子2之mRNA之PCR檢測而言，引子序列係選自外顯子1(正向)至外顯子3(反向)。穿過外顯子1-3之RT-PCR將生成具有約1177個鹼基之全長擴增子(關於來自正常人類細胞之全長擴增子而言，參見圖2)。完整擴增子(約1177個鹼基)與缺失外顯子2(外顯子2係約578個鹼基)之約600個鹼基轉錄物之間之大小差異意味著，較短產物具有實質性優先擴增。此將設定分析反義股寡聚物之效能之高基準以誘導全長轉錄物或含有外顯子2之轉錄物之剪接。
實施逆轉錄酶PCR以使用Superscript III一步式RT-PCR系統(Invitrogen)擴增GAA等位基因。逆轉錄自經核轉染細胞分離之400ng全部RNA且使用基因特異性引子擴增。
一步式套組中所提供之擴增溶液補充有Cy5-標記dCTP(GE)以使得能夠藉由螢光觀察帶。在pre-cast 10%丙烯醯胺/TBE凝膠(Invitrogen)上對經消化試樣實施試驗且在Typhoon Trio(GE)上使用633nm激發雷射及在台板表面上具有焦平面之670nm BP 30濾波器觀察。使用ImageQuant(GE)分析凝膠以測定帶強度。將來自含有外顯子2之所有帶之強度加和至一起以代表包含分析中之全外顯子2轉錄物含量。
另一選擇為，在Caliper生物分析儀或Agilent 2200 Tape Station上分析PCR擴增產物用於測定外顯子包含%。
表E1之2'-O-甲基修飾之反義股寡聚物之結果展示於圖3A-3C中。圖3A展示，寡聚物9(GAA-IVS1(-74-55))及12 GAA-IVS1(-158-140))誘導攜載IVS1-13G>T突變之人類細胞中之外顯子2包含，如藉由約600個鹼基擴增子之減小之擴增所證實(相對於全長約1177個鹼基擴增子)。圖3B展示寡聚物14(GAA-IVS2(-53-72))誘導外顯子-2包含，且圖3C展示寡聚物20(GAA-IVS2(-173-192))及22(GAA-IVS2(-338-364))同樣誘導一定程度之外顯子-2包含。
實例3 反義股寡聚物誘導GSD-II患者源纖維母細胞中酸性α葡萄糖苷酶之升高含量
使用本揭示內容之反義股寡聚物(如上文所闡述)處理之GSD-II患者細胞展示具有升高之功能/活性GAA含量，此乃因含有外顯子2之GAA mRNA之表現有所增加。製備經處理細胞且使用標準方案提取蛋白質。測定蛋白質濃度且量測界定量之所提取蛋白質之GAA酶活 性。誘導較高GAA含量之反義股寡聚物係本揭示內容之較佳實施例。
實例4 GSD-II患者源纖維母細胞中之反義股PMO誘導之劑量依賴性外顯子2包含
使用上述核轉染程序處理GM00443纖維母細胞且基於上文在實例2中所闡述之初始GAA外顯子2包含結果將反義股序列製成PMO形式。如前文所闡述對20uM PMO(根據上式(VII)且具有下表4A中所鑑別之靶向序列)實施核轉染，且將細胞在37℃、5% CO2下培育24小時，然後分離全部RNA。使用Caliper LabChip分析具有表4B之引子FWD124(SEQ ID NO：121)、FWD645(SEQ ID NO：122)及REV780(SEQ ID NO：123)之RNA之RT-PCR擴增以測定外顯子2包含百分比，其結果展示於圖4A(內含子1靶向PMO)、4B(外顯子2靶向PMO)及4C(內含子2靶向PMO)中。
Figure 103130887-A0305-02-0077-43
Figure 103130887-A0305-02-0078-44
Figure 103130887-A0305-02-0079-45
Figure 103130887-A0305-02-0080-46
因此，本揭示內容亦包含檢測人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因mRNA中之外顯子2包含之方法，該方法包括：使用至少一種包括選自由SEQ ID NO：121、122或123組成之群之鹼基序列之聚合酶鏈式反應引子擴增GAA mRNA。
<110> 美商薩羅塔治療公司(SAREPTA THERAPEUTICS,INC.) 澳洲梅鐸大學(MURDOCH UNIVERSITY)
<120> 酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子2包含
<140> TW 103130887
<141> 2014-09-05
<150> US 61/874,261
<151> 2013-09-05
<150> US 61/932,195
<151> 2014-01-27
<160> 188
<170> notepad
<210> 1
<211> 2664
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (2652)..(2652)
<223> x係t或G
<400> 1
Figure 103130887-A0305-02-0081-47
Figure 103130887-A0305-02-0082-48
<210> 2
<211> 578
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
Figure 103130887-A0305-02-0082-49
<210> 3
<211> 616
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
Figure 103130887-A0305-02-0083-52
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-39-20)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 4
Figure 103130887-A0305-02-0083-51
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-74-55)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 5
Figure 103130887-A0305-02-0083-50
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-99-75)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 6
Figure 103130887-A0305-02-0084-53
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-139-115)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 7
Figure 103130887-A0305-02-0084-54
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-158-140)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> x係t或u
<400> 8
Figure 103130887-A0305-02-0084-55
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-179-160)
<400> 9
Figure 103130887-A0305-02-0085-58
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-4-20)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> x係t或u
<400> 10
Figure 103130887-A0305-02-0085-57
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-14-30)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> x係t或u
<400> 11
Figure 103130887-A0305-02-0085-56
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-33-52)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 12
Figure 103130887-A0305-02-0086-59
<210> 13
<400> 13 000
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-73-92)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 14
Figure 103130887-A0305-02-0086-60
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-93-112)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 15
Figure 103130887-A0305-02-0086-61
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-113-132)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 16
Figure 103130887-A0305-02-0087-64
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-133-150)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> x係t或u
<400> 17
Figure 103130887-A0305-02-0087-63
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-153-172)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 18
Figure 103130887-A0305-02-0087-62
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-173-192)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 19
Figure 103130887-A0305-02-0088-65
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-193-212)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 20
Figure 103130887-A0305-02-0088-66
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-213-237)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 21
Figure 103130887-A0305-02-0088-67
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-234-258)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 22
Figure 103130887-A0305-02-0088-68
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-338-364)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> x係t或u
<400> 23
Figure 103130887-A0305-02-0089-71
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAAEx2A(+202+226)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 24
Figure 103130887-A0305-02-0089-70
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAAEx2A(+367+391)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 25
Figure 103130887-A0305-02-0089-69
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.4.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 26
Figure 103130887-A0305-02-0090-72
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.6.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 27
Figure 103130887-A0305-02-0090-73
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.8.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 28
Figure 103130887-A0305-02-0090-74
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.10.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 29
Figure 103130887-A0305-02-0091-75
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.12.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 30
Figure 103130887-A0305-02-0091-77
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.14.20
<400> 31
Figure 103130887-A0305-02-0091-78
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.15.20
<400> 32
Figure 103130887-A0305-02-0091-79
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.17.20
<400> 33
Figure 103130887-A0305-02-0092-80
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.21.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 34
Figure 103130887-A0305-02-0092-81
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.24.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 35
Figure 103130887-A0305-02-0092-82
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.26.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 36
Figure 103130887-A0305-02-0093-83
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.28.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 37
Figure 103130887-A0305-02-0093-84
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.30.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 38
Figure 103130887-A0305-02-0093-85
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.32.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 39
Figure 103130887-A0305-02-0094-86
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2013.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 40
Figure 103130887-A0305-02-0094-87
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2015.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 41
Figure 103130887-A0305-02-0094-88
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2017.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 42
Figure 103130887-A0305-02-0095-89
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2019.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 43
Figure 103130887-A0305-02-0095-90
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2022.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 44
Figure 103130887-A0305-02-0095-91
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2024.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 45
Figure 103130887-A0305-02-0096-92
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2037.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 46
Figure 103130887-A0305-02-0096-93
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2041.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 47
Figure 103130887-A0305-02-0096-95
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2043.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 48
Figure 103130887-A0305-02-0097-96
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2045.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 49
Figure 103130887-A0305-02-0097-97
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2048.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 50
Figure 103130887-A0305-02-0097-98
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2069.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 51
Figure 103130887-A0305-02-0097-99
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2071.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 52
Figure 103130887-A0305-02-0098-101
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2073.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 53
Figure 103130887-A0305-02-0098-102
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2075.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 54
Figure 103130887-A0305-02-0098-103
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2077.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 55
Figure 103130887-A0305-02-0099-104
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2079.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 56
Figure 103130887-A0305-02-0099-105
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2081.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 57
Figure 103130887-A0305-02-0099-106
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2088.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 58
Figure 103130887-A0305-02-0100-107
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2115.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 59
Figure 103130887-A0305-02-0100-272
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2132.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 60
Figure 103130887-A0305-02-0100-109
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2135.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 61
Figure 103130887-A0305-02-0101-110
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2140.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 62
Figure 103130887-A0305-02-0101-112
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2143.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 63
Figure 103130887-A0305-02-0101-113
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2152.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 64
Figure 103130887-A0305-02-0102-114
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2156.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 65
Figure 103130887-A0305-02-0102-115
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2163.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 66
Figure 103130887-A0305-02-0102-116
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2165.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 67
Figure 103130887-A0305-02-0103-117
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2178.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 68
Figure 103130887-A0305-02-0103-118
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2183.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 69
Figure 103130887-A0305-02-0103-119
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2185.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 70
Figure 103130887-A0305-02-0104-120
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2188.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 71
Figure 103130887-A0305-02-0104-121
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2190.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 72
Figure 103130887-A0305-02-0104-122
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2195.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 73
Figure 103130887-A0305-02-0105-123
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2200.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 74
Figure 103130887-A0305-02-0105-124
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2202.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 75
Figure 103130887-A0305-02-0105-125
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2204.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 76
Figure 103130887-A0305-02-0105-126
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2206.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 77
Figure 103130887-A0305-02-0106-127
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2208.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 78
Figure 103130887-A0305-02-0106-128
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2210.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 79
Figure 103130887-A0305-02-0106-129
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.1.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 80
Figure 103130887-A0305-02-0107-130
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.6.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 81
Figure 103130887-A0305-02-0107-131
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.9.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 82
Figure 103130887-A0305-02-0107-132
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.12.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 83
Figure 103130887-A0305-02-0108-133
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.18.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 84
Figure 103130887-A0305-02-0108-134
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.24.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 85
Figure 103130887-A0305-02-0108-135
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.27.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 86
Figure 103130887-A0305-02-0109-136
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.40.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 87
Figure 103130887-A0305-02-0109-137
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.45.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 88
Figure 103130887-A0305-02-0109-138
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.48.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 89
Figure 103130887-A0305-02-0110-139
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.54.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 90
Figure 103130887-A0305-02-0110-140
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.67.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 91
Figure 103130887-A0305-02-0110-141
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.72.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 92
Figure 103130887-A0305-02-0111-143
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.431.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 93
Figure 103130887-A0305-02-0111-144
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.446.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 94
Figure 103130887-A0305-02-0111-145
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.448.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 95
Figure 103130887-A0305-02-0112-146
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.450.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 96
Figure 103130887-A0305-02-0112-147
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.451.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 97
Figure 103130887-A0305-02-0112-149
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.452.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 98
Figure 103130887-A0305-02-0113-150
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.453.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 99
Figure 103130887-A0305-02-0113-151
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.454.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 100
Figure 103130887-A0305-02-0113-152
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.455.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 101
Figure 103130887-A0305-02-0113-153
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.456.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 102
Figure 103130887-A0305-02-0114-154
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.457.20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 103
Figure 103130887-A0305-02-0114-155
<210> 104
<400> 104 000
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-79-55)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 105
Figure 103130887-A0305-02-0115-156
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-74-50)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 106
Figure 103130887-A0305-02-0115-157
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-79-60)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 107
Figure 103130887-A0305-02-0115-158
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-69-55)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 108
Figure 103130887-A0305-02-0115-159
<210> 109
<400> 109 000
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-163-140)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> x係t或u
<400> 110
Figure 103130887-A0305-02-0116-160
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-158-135)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> x係t或u
<400> 111
Figure 103130887-A0305-02-0116-161
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-163-145)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> x係t或u
<400> 112
Figure 103130887-A0305-02-0117-162
<210> 113
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-153-135)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> x係t或u
<400> 113
Figure 103130887-A0305-02-0117-163
<210> 114
<400> 114 000
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-168-192)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 115
Figure 103130887-A0305-02-0117-164
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-173-197)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> x係t或u
<400> 116
Figure 103130887-A0305-02-0118-166
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-168-187)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 117
Figure 103130887-A0305-02-0118-167
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-178-197)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> x係t或u
<400> 118
Figure 103130887-A0305-02-0118-168
<210> 119
<400> 119 000
<210> 120
<400> 120 000
<210> 121
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子-FWD124
<400> 121
Figure 103130887-A0305-02-0119-169
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子-FWD645
<400> 122
Figure 103130887-A0305-02-0119-170
<210> 123
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子-REV780
<400> 123
Figure 103130887-A0305-02-0119-171
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-39-20)
<400> 124
Figure 103130887-A0305-02-0119-172
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-74-55)
<400> 125
Figure 103130887-A0305-02-0120-173
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-99-75)
<400> 126
Figure 103130887-A0305-02-0120-174
<210> 127
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-139-115)
<400> 127
Figure 103130887-A0305-02-0120-175
<210> 128
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1(-158-140)
<400> 128
Figure 103130887-A0305-02-0120-177
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.6.20
<400> 129
Figure 103130887-A0305-02-0120-178
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.10.20
<400> 130
Figure 103130887-A0305-02-0121-179
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.24.20
<400> 131
Figure 103130887-A0305-02-0121-180
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.28.20
<400> 132
Figure 103130887-A0305-02-0121-181
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.32.20
<400> 133
Figure 103130887-A0305-02-0121-182
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2015.20
<400> 134
Figure 103130887-A0305-02-0122-183
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2019.20
<400> 135
Figure 103130887-A0305-02-0122-184
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2024.20
<400> 136
Figure 103130887-A0305-02-0122-185
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2037.20
<400> 137
Figure 103130887-A0305-02-0122-186
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2043.20
<400> 138
Figure 103130887-A0305-02-0122-187
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2048.20
<400> 139
Figure 103130887-A0305-02-0123-188
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2071.20
<400> 140
Figure 103130887-A0305-02-0123-189
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2075.20
<400> 141
Figure 103130887-A0305-02-0123-190
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2079.20
<400> 142
Figure 103130887-A0305-02-0123-191
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2088.20
<400> 143
Figure 103130887-A0305-02-0124-192
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2115.20
<400> 144
Figure 103130887-A0305-02-0124-193
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2132.20
<400> 145
Figure 103130887-A0305-02-0124-194
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2135.20
<400> 146
Figure 103130887-A0305-02-0124-195
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2140.20
<400> 147
Figure 103130887-A0305-02-0124-196
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2152.20
<400> 148
Figure 103130887-A0305-02-0125-197
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2156.20
<400> 149
Figure 103130887-A0305-02-0125-198
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2165.20
<400> 150
Figure 103130887-A0305-02-0125-199
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2178.20
<400> 151
Figure 103130887-A0305-02-0125-200
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2185.20
<400> 152
Figure 103130887-A0305-02-0125-201
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2190.20
<400> 153
Figure 103130887-A0305-02-0126-202
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2195.20
<400> 154
Figure 103130887-A0305-02-0126-203
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2202.20
<400> 155
Figure 103130887-A0305-02-0126-204
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2206.20
<400> 156
Figure 103130887-A0305-02-0126-205
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS1.2210.20
<400> 157
Figure 103130887-A0305-02-0127-207
<210> 158
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAAEx2A(+202+226)
<400> 158
Figure 103130887-A0305-02-0127-209
<210> 159
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAAEx2A(+367+391)
<400> 159
Figure 103130887-A0305-02-0127-210
<210> 160
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-4-20)
<400> 160
Figure 103130887-A0305-02-0127-211
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-14-30)
<400> 161
Figure 103130887-A0305-02-0127-212
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-33-52)
<400> 162
Figure 103130887-A0305-02-0128-213
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-53-72)
<400> 163
Figure 103130887-A0305-02-0128-214
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-73-92)
<400> 164
Figure 103130887-A0305-02-0128-215
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-93-112)
<400> 165
Figure 103130887-A0305-02-0128-216
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-113-132)
<400> 166
Figure 103130887-A0305-02-0129-217
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-133-150)
<400> 167
Figure 103130887-A0305-02-0129-218
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-153-172)
<400> 168
Figure 103130887-A0305-02-0129-219
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-173-192)
<400> 169
Figure 103130887-A0305-02-0129-220
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-193-212)
<400> 170
Figure 103130887-A0305-02-0129-221
<210> 171
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-213-237)
<400> 171
Figure 103130887-A0305-02-0130-224
<210> 172
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-234-258)
<400> 172
Figure 103130887-A0305-02-0130-223
<210> 173
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2(-338-364)
<400> 173
Figure 103130887-A0305-02-0130-225
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.6.20
<400> 174
Figure 103130887-A0305-02-0130-226
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.9.20
<400> 175
Figure 103130887-A0305-02-0131-227
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.12.20
<400> 176
Figure 103130887-A0305-02-0131-228
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.18.20
<400> 177
Figure 103130887-A0305-02-0131-229
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.24.20
<400> 178
Figure 103130887-A0305-02-0131-230
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.27.20
<400> 179
Figure 103130887-A0305-02-0131-231
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.40.20
<400> 180
Figure 103130887-A0305-02-0132-232
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.48.20
<400> 181
Figure 103130887-A0305-02-0132-234
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.67.20
<400> 182
Figure 103130887-A0305-02-0132-236
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.72.20
<400> 183
Figure 103130887-A0305-02-0132-237
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.431.20
<400> 184
Figure 103130887-A0305-02-0133-239
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.446.20
<400> 185
Figure 103130887-A0305-02-0133-240
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.451.20
<400> 186
Figure 103130887-A0305-02-0133-241
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.454.20
<400> 187
Figure 103130887-A0305-02-0133-242
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義股寡聚物-GAA-IVS2.457.20
<400> 188
Figure 103130887-A0305-02-0133-244
Figure 103130887-A0202-11-0002-1

Claims (18)

  1. 一種具有至少18個核苷酸或核苷酸類似物之反義寡聚物化合物，其包括：選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)之非天然化學骨架；及靶向序列，其與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域互補，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  2. 一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽，
    Figure 103130887-A0305-02-0134-246
     其中：各Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係16至38之整數； 各Y獨立地選自O或-NRa，其中Ra係選自由以下組成之群：氫、-T1-NRcRdRe及細胞穿透肽，其中：Rc係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2，Rd係選自由以下組成之群：氫、芳烷基及C1-C6烷基，或當Rc及Rd各獨立地係C1-C6烷基或芳烷基時，Rc及Rd與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環未經取代或經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，及Re係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基；各L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，及S係選自1至8之整數；n係0至3之整數；各R1獨立地選自由以下組成之群：-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、式(II)部分：
    Figure 103130887-A0305-02-0135-247
     其中：R8係選自由氫、甲基、-C(=NH)NH2、-Z-T2-NHC(=NH)NH2及細胞穿透肽組成之群，其中Z係羰基或直接鍵，R9係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；各R10獨立地選自氫或甲基；及 式(III)部分：
    Figure 103130887-A0305-02-0136-248
     其中：q係0至2之整數，R11係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2，R12係選自由以下組成之群：氫、芳烷基及C1-C6烷基，或R11及R12與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環未經取代或經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，及R13係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基；R2係選自由氫、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C6烷基，或R2不存在；R3係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、-C(=NH)NH2、三苯甲基、-C(=O)ORg、醯基、-C(O)(CH2)mC(O)及T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)六氫吡嗪-1-基，其中Rg係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，T4係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，及R係-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2； R4係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及醯基組成之群，及各R5獨立地選自氫或甲基；各R6及各R7獨立地選自氫或-T3-NRcRdRe；各T1、T2及T3獨立地係長度多至18個原子之可選連接體，包括烷基、烷氧基或烷基胺基或其組合；R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈；R"係選自氫或醯基；以及m係1至60之整數；其中該靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域互補，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  3. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中各Nu獨立地選自由以下組成之群：腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黃嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基修飾之嘧啶及9-(胺基乙氧基)吩噁嗪(phenoxazine)。
  4. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中各R1係-N(CH3)2。
  5. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中至少一個R1係選自由以下組成之群：
    Figure 103130887-A0305-02-0138-249
  6. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中50%至90%之該等R1基團係-N(CH2)3。
  7. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中66%之該等R1基團係-N(CH2)3。
  8. 如請求項2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中：n為2；R2及L一起為下式：
    Figure 103130887-A0305-02-0138-250
     Y在每次出現時係O。
  9. 一種式(IV)化合物或其醫藥上可接受之鹽，
    Figure 103130887-A0305-02-0139-251
     其中：各Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係16至25之整數；各Y係O；各R1獨立地選自由以下組成之群：
    Figure 103130887-A0305-02-0139-253
     其中至少一個R1係-N(CH3)2，及其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73 及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  10. 一種醫藥組合物，其包括具有18至40個核苷酸或核苷酸類似物之反義寡聚物化合物及醫藥上可接受之載劑，該化合物包括：選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)之非天然化學骨架；及靶向序列，其與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域互補，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  11. 一種醫藥組合物，其包括式(I)化合物：
    Figure 103130887-A0305-02-0140-254
     或其醫藥上可接受之鹽，其中：各Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係16至38之整數；各Y獨立地選自O或-NRa，其中Ra係選自由以下組成之群： 氫、-T1-NRcRdRe及細胞穿透肽，其中：Rc係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2，Rd係選自由以下組成之群：氫、芳烷基及C1-C6烷基，或當Rc及Rd各獨立地係C1-C6烷基或芳烷基時，Rc及Rd與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環未經取代或經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，及Re係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基；各L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，S係選自1至8之整數；n係0至3之整數；各R1獨立地選自由以下組成之群：-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、式(II)部分：
    Figure 103130887-A0305-02-0141-255
     其中：R8係選自由氫、甲基、-C(=NH)NH2、-Z-T2-NHC(=NH)NH2及細胞穿透肽組成之群，其中Z係羰基或直接鍵，及R9係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；各R10獨立地選自氫或甲基；及 式(III)部分：
    Figure 103130887-A0305-02-0142-257
     其中：q係0至2之整數；R11係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2，R12係選自由以下組成之群：氫、芳烷基及C1-C6烷基，或R11及R12與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環未經取代或經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代；及R13係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基；R2係選自由氫、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C6烷基，或R2不存在；R3係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、-C(=NH)NH2、三苯甲基、-C(=O)ORg、醯基、-C(O)(CH2)mC(O)及T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)六氫吡嗪-1-基，其中Rg係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基；T4係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-；及R係-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2； R4係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及醯基組成之群，及各R5獨立地選自氫或甲基；各R6及各R7獨立地選自氫或-T3-NRcRdRe；各T1、T2及T3獨立地係長度多至18個原子之可選連接體，包括烷基、烷氧基或烷基胺基或其組合；R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈；R"係選自氫或醯基；以及m係1至60之整數；其中該靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域互補，及醫藥上可接受之載劑，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其中各R1係-N(CH3)2。
  13. 如請求項11之醫藥組合物，其中：n為2；R2及L一起為下式：
    Figure 103130887-A0305-02-0143-258
     Y在每次出現時係O。
  14. 一種反義寡聚物化合物之用途，其係用於製備治療II型肝糖貯積病之藥物，其中該反義寡聚物化合物具有18至40個核苷酸或核苷酸類似物，該化合物包括： 選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)之非天然化學骨架；及靶向序列，其與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域互補，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  15. 一種反義寡聚物化合物之用途，其係用於製備治療II型肝糖貯積病之藥物，其中該反義寡聚物化合物具式(I)：
    Figure 103130887-A0305-02-0144-259
     或其醫藥上可接受之鹽，其中：各Nu係核鹼基，一起形成靶向序列；x係16至38之整數；各Y獨立地選自O或-NRa，其中Ra係選自由以下組成之群：氫、-T1-NRcRdRe及細胞穿透肽，其中：Rc係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、芳烷基及- C(=NH)NH2，Rd係選自由以下組成之群：氫、芳烷基及C1-C6烷基，或當Rc及Rd各獨立地係C1-C6烷基或芳烷基時，Rc及Rd與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環未經取代或經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代，及Re係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基；各L獨立地選自由-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、六氫吡嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w-及-[(C(O)CHR'NH)m]R"組成之群，其中w係選自3至20之整數，且s係選自1至8之整數；n係0至3之整數；各R1獨立地選自由以下組成之群：-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、式(II)部分：
    Figure 103130887-A0305-02-0145-260
     其中：R8係選自由氫、甲基、-C(=NH)NH2、-Z-T2-NHC(=NH)NH2及細胞穿透肽組成之群，其中Z係羰基或直接鍵，及R9係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基組成之群；各R10獨立地選自氫或甲基；及式(III)部分：
    Figure 103130887-A0305-02-0146-261
     其中：q係0至2之整數；R11係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、芳烷基及-C(=NH)NH2，R12係選自由以下組成之群：氫、芳烷基及C1-C6烷基，或R11及R12與其所連接之氮原子一起形成5至7員環，其中該環未經取代或經選自由C1-C6烷基、苯基、鹵素及芳烷基組成之群之取代基取代；及R13係選自由以下組成之群：電子對、氫、C1-C6烷基及芳烷基；R2係選自由氫、OH、寡聚物、-(CH2)mC(O)NRfRg(其中Rf及Rg獨立地選自H、醯基、C1-C6烷基及-[(C(O)CHR'NH)m]R")、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(=O)ORf及醯基組成之群，其中w係選自3至20之整數，S係選自1至4之整數，且Rf係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，或R2不存在；R3係選自由以下組成之群：氫、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR'NH)m]R"、-C(=NH)NH2、三苯甲基、-C(=O)ORg、醯基、-C(O)(CH2)mC(O)及T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)六氫吡嗪-1-基，其中Rg係包括一或多個氧或羥基部分或其組合之C1-C30烷基，T4係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，及R係-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2； R4係選自由電子對、氫、C1-C6烷基及醯基組成之群，及各R5係獨立地選自氫或甲基；各R6及R7係獨立地選自氫或-T3-NRcRdRe；各T1、T2及T3獨立地係長度多至18個原子之可選連接體，包括烷基、烷氧基或烷基胺基或其組合；R'係天然胺基酸或其一碳或兩碳同系物之側鏈；R"係選自氫或醯基；以及m係1至60之整數；其中該靶向序列與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域互補，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  16. 如請求項15之用途，其中各R1係-N(CH3)2。
  17. 如請求項15之用途，其中：n為2；R2及L一起為下式：
    Figure 103130887-A0305-02-0147-262
     Y在每次出現時係O。
  18. 一種反義寡聚物，其包括選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)之非天然化學骨架；以及具有足夠長度及互補性以與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前體mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內之區域特異性雜交的靶向序列，其中該靶向序 列與選自SEQ ID NO：5、6、9、50、54、72、73及77之靶向序列具有至少90%之序列同源性，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
TW103130887A 2013-09-05 2014-09-05 酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子２包含 TWI736514B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361874261P 2013-09-05 2013-09-05
US61/874,261 2013-09-05
US201461932195P 2014-01-27 2014-01-27
US61/932,195 2014-01-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201605881A TW201605881A (zh) 2016-02-16
TWI736514B true TWI736514B (zh) 2021-08-21

Family

ID=51541398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103130887A TWI736514B (zh) 2013-09-05 2014-09-05 酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子２包含

Country Status (11)

Country Link
US (3) US20150197534A1 (zh)
EP (1) EP3041935A1 (zh)
JP (3) JP6618910B2 (zh)
KR (2) KR20210088009A (zh)
CN (2) CN111235149B (zh)
AU (2) AU2014317961B2 (zh)
CA (1) CA2922838A1 (zh)
IL (3) IL282239B2 (zh)
MX (1) MX2016002934A (zh)
TW (1) TWI736514B (zh)
WO (1) WO2015035231A1 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2596506C (en) 2005-02-09 2021-04-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
US20150197534A1 (en) 2013-09-05 2015-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
US10059947B2 (en) * 2013-09-11 2018-08-28 Synthena Ag Nucleic acids and methods for the treatment of Pompe disease
WO2015190922A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
US9976143B2 (en) 2014-10-03 2018-05-22 Cold Spring Harbor Laboratory Targeted augmentation of nuclear gene output
MA41759A (fr) * 2015-02-27 2018-01-03 Univ Murdoch Inclusion de l'exon 2, induite par antisens, dans une alpha-glucosidase acide
MA41795A (fr) * 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
JP2018530560A (ja) * 2015-10-09 2018-10-18 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび関連障害の処置のための組成物および方法
EP3359685A1 (en) 2015-10-09 2018-08-15 University Of Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
WO2017099579A1 (en) * 2015-12-07 2017-06-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for pompe disease
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
WO2017106377A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant mental retardation-5 and dravet syndrome
KR102522059B1 (ko) * 2016-04-18 2023-04-14 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 안티센스 올리고머, 및 산성 알파-글루코시다제 유전자와 연관된 질환을 치료하기 위한 이의 사용 방법
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
NL2017295B1 (en) * 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Antisense oligomeric compound for Pompe disease
BR112019012647A2 (pt) * 2016-12-19 2019-11-19 Sarepta Therapeutics Inc conjugados de oligômero de salto de éxon para distrofia muscular
CN111278991B (zh) 2017-08-25 2022-04-01 斯托克制药公司 用于治疗病况和疾病的反义寡聚体
NL2019517B1 (en) * 2017-09-08 2019-03-19 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam New therapy for Pompe disease
EP3672601B1 (en) * 2017-09-25 2023-09-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers via fast-flow synthesis
CA3173647A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Isabel AZNAREZ Opa1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
KR20210151593A (ko) * 2020-06-05 2021-12-14 넥스올리고(주) 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082551A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Induced exon inclusion in spinal muscle atrophy

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
EP0215942B1 (en) 1985-03-15 1995-07-12 Antivirals Inc. Polynucleotide assay reagent and method
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
JPH07501204A (ja) 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
FR2692265B1 (fr) 1992-05-25 1996-11-08 Centre Nat Rech Scient Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters.
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
JP4193917B2 (ja) 1995-12-18 2008-12-10 アンジオデバイス インターナショナル ゲーエムベーハー 架橋ポリマー組成物およびその使用方法
US6245747B1 (en) 1996-03-12 2001-06-12 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Targeted site specific antisense oligodeoxynucleotide delivery method
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
KR100782896B1 (ko) 1999-05-04 2007-12-06 엑시콘 에이/에스 Ｌ-리보-ｌｎａ 유사체
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
KR20020097241A (ko) * 2000-05-04 2002-12-31 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드 스플라이스-영역 안티센스 조성물 및 방법
KR100408844B1 (ko) * 2000-07-29 2003-12-06 한국산업기술평가원 동물세포 발현벡터
US20040049022A1 (en) * 2001-04-24 2004-03-11 Nyce Jonathan W. Composition & methods for treatment and screening
WO2002085309A2 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. Composition, formulations & kits for treatment of respiratory & lung disease with anti-sense oligonucleotides & a bronchodilating agent
EP1446412B1 (en) 2001-09-04 2012-03-07 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
JP2006507841A (ja) * 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
WO2005084712A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-15 Antisense Pharma Gmbh Use of an oligonucleotide or its active derivative for the preparation of a pharmaceutical composition for inhibiting the formation of metastases in cancer treatment
US7838657B2 (en) 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
US8097597B2 (en) * 2005-05-05 2012-01-17 Antisense Pharma Gmbh Use of low doses of oligonucleotides antisense to TGF-β genes in the treatment of brain tumors
DE202005008426U1 (de) 2005-05-31 2005-09-15 Ricon Sieb Und Foerdertechnik Fördervorrichtung mit Fördertuch
PL2548560T3 (pl) 2005-06-23 2015-11-30 Biogen Ma Inc Kompozycje i sposoby modulowania splicingu SMN2
WO2007022470A2 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating neurological disease
JP2010505741A (ja) 2006-05-10 2010-02-25 エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド カチオン性のサブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドアナログ
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
JP2010533170A (ja) 2007-07-12 2010-10-21 プロセンサ テクノロジーズ ビー．ブイ． 化合物を種々の選択された臓器、組織又は腫瘍細胞に標的化するための分子
US7935816B2 (en) 2007-10-25 2011-05-03 Gene Tools, Llc Molecular transporter compositions comprising dendrimeric oligoguanidine with a triazine core that facilitate delivery into cells in vivo
WO2009064471A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
ES2532634T5 (es) * 2008-10-27 2018-04-30 Biomarin Technologies B.V. Procedimientos y medios para el salto eficiente del exón 45 en el pre-ARNm de la distrofia muscular de Duchenne
JP2012523225A (ja) 2009-04-10 2012-10-04 アソシアシオン・アンスティテュ・ドゥ・ミオロジー 疾患の処置のためのトリシクロ−ｄｎａアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物及び方法
US20120149757A1 (en) 2009-04-13 2012-06-14 Krainer Adrian R Compositions and methods for modulation of smn2 splicing
NZ597071A (en) 2009-06-17 2014-05-30 Isis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulation of smn2 splicing in a subject
WO2011028941A2 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Disabling autophagy as a treatment for lysosomal storage diseases
WO2011090740A2 (en) * 2009-12-29 2011-07-28 Opko Curna, Llc Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
FR2957090A1 (fr) * 2010-03-05 2011-09-09 Immunosearch Methode d'evaluation du potentiel irritant d'un compose test
US8802642B2 (en) 2010-04-28 2014-08-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. Spinal muscular atrophy treatment via targeting SMN2 catalytic core
AU2011257980B2 (en) 2010-05-28 2016-06-30 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogues having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
US8962560B2 (en) * 2010-06-01 2015-02-24 Atyr Pharma Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Lysyl-tRNA synthetases
DK2623507T3 (da) 2010-09-30 2017-01-02 Nippon Shinyaku Co Ltd Morpholinonukleinsyrederivat
WO2012092645A1 (en) * 2011-01-04 2012-07-12 Co-Operative Research Centre For Asthma And Airways Novel antisense oligonucleotides
KR102339196B1 (ko) * 2011-05-05 2021-12-15 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 접합체
DK2581448T3 (en) 2011-10-13 2015-04-27 Ass Inst De Myologie Tricyclo-DNA phosphorothioate
KR102271212B1 (ko) 2011-11-18 2021-07-01 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 기능적으로-변형된 올리고뉴클레오티드 및 이의 서브유니트
AU2012347765B2 (en) 2011-12-06 2017-05-04 Research Institute At Nationwide Childrens's Hospital Non-ionic, low osmolar contrast agents for delivery of antisense oligonucleotides and treatment of disease
HUE038369T2 (hu) * 2011-12-08 2018-10-29 Sarepta Therapeutics Inc Humán LMNA-t célzó oligonukleotid-analógok
CN104203289B (zh) 2012-01-27 2020-11-03 比奥马林技术公司 用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸
WO2013173637A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
JP2015518711A (ja) * 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂｄｎｆ発現を調節するための組成物及び方法
HUE051612T2 (hu) 2012-07-11 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére
US20150197534A1 (en) 2013-09-05 2015-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
AU2015272127A1 (en) 2014-06-10 2017-01-19 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for characterizing alternatively or aberrantly spliced mRNA isoforms
MA41759A (fr) 2015-02-27 2018-01-03 Univ Murdoch Inclusion de l'exon 2, induite par antisens, dans une alpha-glucosidase acide
US10867398B2 (en) 2017-11-21 2020-12-15 Reliance Core Consulting LLC Methods, systems, apparatuses and devices for facilitating motion analysis in an environment

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082551A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Induced exon inclusion in spinal muscle atrophy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Boerkoel C F et al., "Leaky splicing mutation in the acid maltase gene is associated with delayed onset of glycogenosis type II. American journal of human genetics", 56:887-897, 1995
Pastores GM, "Therapeutic approaches for lysosomal storage diseases", Therapeutic advances in endocrinology and metabolism, 1(4):177-188, 2010
Pastores GM, "Therapeutic approaches for lysosomal storage diseases", Therapeutic advances in endocrinology and metabolism, 1(4):177-188, 2010 Boerkoel C F et al., "Leaky splicing mutation in the acid maltase gene is associated with delayed onset of glycogenosis type II. American journal of human genetics", 56:887-897, 1995 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111235149B (zh) 2024-04-16
CN105793422A (zh) 2016-07-20
JP6865871B2 (ja) 2021-04-28
IL244334B (en) 2021-04-29
KR20160082972A (ko) 2016-07-11
AU2020204409B2 (en) 2023-05-25
JP2016533761A (ja) 2016-11-04
IL282239B2 (en) 2023-10-01
EP3041935A1 (en) 2016-07-13
TW201605881A (zh) 2016-02-16
US20150197534A1 (en) 2015-07-16
KR20210088009A (ko) 2021-07-13
JP6618910B2 (ja) 2019-12-11
WO2015035231A1 (en) 2015-03-12
US20160208264A1 (en) 2016-07-21
US11236338B2 (en) 2022-02-01
AU2014317961A1 (en) 2016-03-17
CN111235149A (zh) 2020-06-05
CA2922838A1 (en) 2015-03-12
AU2014317961B2 (en) 2020-07-30
IL282239B1 (en) 2023-06-01
JP2020089392A (ja) 2020-06-11
IL244334A0 (en) 2016-04-21
IL282239A (en) 2021-05-31
KR102275504B1 (ko) 2021-07-09
US20220170024A1 (en) 2022-06-02
JP2019050828A (ja) 2019-04-04
MX2016002934A (es) 2016-12-20
CN105793422B (zh) 2020-03-03
AU2020204409A1 (en) 2020-07-23
IL300444A (en) 2023-04-01
JP6671449B2 (ja) 2020-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI736514B (zh) 酸性α葡萄糖苷酶之反義股誘導之外顯子２包含
JP2023129494A (ja) 酸性アルファ－グルコシダーゼにおけるアンチセンスに誘導されるエクソン２の組入れ
JP7342169B2 (ja) 酸性アルファ－グルコシダーゼ遺伝子に関連する疾患を処置するためのアンチセンスオリゴマーおよびそれを用いる方法
CA2996164A1 (en) Modified antisense oligomers for exon inclusion in spinal muscular atrophy
EA042313B1 (ru) Антисмысловые олигомеры и способы их применения для лечения заболеваний, связанных с геном кислой альфа-глюкозидазы
NZ787366A (en) Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated
BR112016005062B1 (pt) Compostos de oligômero antissenso, composição farmacêutica compreendendo os ditos compostos e usos dos mesmos para tratar uma doença de armazenamento de glicogênio tipo ii