PT1678194E - Modulação da síntese e degradação de hialuronano no tratamento de doença - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "MODULAÇÃO DA SÍNTESE E DEGRADAÇÃO DE HIALURONANO NO TRATAMENTO DE DOENÇA"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral à modulação da síntese e degradação de hialuronano (HA) . Mais particularmente, são divulgados composições e métodos para modular a expressão de material genético que codifica a HA sintase (HAS) e outras enzimas ou recetores envolvidos principalmente no metabolismo de hialuronano ou para modular as proteínas que sintetizam ou degradam o hialuronano incluindo a função ou atividade da HAS. As composições incluem ou compreendem moléculas de ácido nucleico e moléculas interativas tais como anticorpos e inibidores de molécula pequena e análogos de substratos de HAS. A presente invenção considera ainda a modulação da proliferação celular, útil na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios inflamatórios incluindo condições hiperproliferativas tais como, mas não se limitando a, cancro e psoríase.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

Os detalhes bibliográficos das publicações referidas nesta especificação estão também coligidos no final da descrição. A referência a qualquer técnica anterior nesta especificação não é, e não deve ser considerada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão que esta 2 técnica anterior faz parte do conhecimento geral em qualquer pais.

As condições inflamatórias representam um fator subjacente importante num grande número de distúrbios clinicamente significativos. A inflamação pode resultar de uma gama de estímulos de fora ou dentro do corpo. No entanto, estes estímulos desencadeiam células e processos fisiológicos num ambiente hospedeiro. Embora tenha sido realizada uma quantidade considerável de investigação para pesquisar a natureza celular e de citocinas dos processos inflamatórios, sabe-se menos sobre outros possíveis participantes na inflamação.

Uma tal classe de participantes é as proteínas transmembranares. As proteínas transmembranares estão envolvidas numa gama de atividades de sinalização e muitas têm atividade enzimática. 0 metabolismo do hialuronano (HA) é um equilíbrio intrincado entre a velocidade de síntese e de degradação do HA onde, dependendo do papel fisiológico a ser desempenhado pelo HA, a síntese e degradação simultâneas é cuidadosamente controlada. 0 hialuronano é sintetizado por uma família de proteínas transmembranares distintas, mas mesmo assim relacionadas, designadas por isoformas de hialuronano-sintase (HAS) , HAS1, 2 e 3, as quais se podem distinguir umas das outras em relação à expressão temporal e diferencial durante a embriogénese do rato e em tecidos maduros, respetivamente, e também no peso molecular do HA produzido. 0 polissacárido da matriz extracelular HA ou a sua forma ácida, ácido hialurónico, é um polímero linear de alto peso molecular constituído por unidades dissacadarídicas repetidas de (β1 — 3) D-glucuronato-(βΊ-4)N-acetil-D-glucosamina (Weissman & Meyer, J. Am. Chem. Soc. 3 76: 1753, 1954). 0 hialuronano é degradado por uma família de enzimas conhecidas como hialuronidases que são presentemente designadas HIAL1, HIAL2, HIAL3 e PH-20, onde, como as enzimas que produzem HA, também se distinguem umas das outras em relação à expressão temporal e diferencial durante processos fisiológicos e estados patológicos diferentes.

No trabalho que conduziu até a presente invenção, observou-se que as HAS e HIAL estão expressadas de forma diferenciada em várias condições fisiológicas. Em particular, elas estavam reguladas positivamente durante condições patológicas tais como uma condição inflamatória ou cancro. A HAS, e em particular, HAS1, 2 e/ou 3 e a HIAL1, 2 e/ou 3 representam alvos farmacológicos úteis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Ao longo da especificação, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra "compreendem", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros especificados, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.

As sequências de nucleótidos e aminoácidos são referidas por um número identificador de sequência (SEQ ID NO:) . Os SEQ ID NOs: correspondem numericamente aos identificadores de sequência <400>1 (SEQ ID N0:1), <400>2 (SEQ ID N0:2), etc. Um sumário dos números identificadores de sequências é proporcionado no Quadro 1. Uma listagem de sequências é proporcionada depois das reivindicações. 4 A presente invenção é dirigida a compostos que são anticorpos ou formas recombinantes ou quiméricas ou derivadas dos mesmos, os quais antagonizam a função ou atividade de HAS como descrito nas reivindicações.

Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais. São também proporcionadas composições farmacêuticas e outras que compreendem os compostos da presente invenção. São também aqui definidos os compostos da invenção a serem utilizados no tratamento de um animal, particularmente um humano, suspeito de ter o que está suscetível a uma doença ou condição associada aos níveis de HA ou à expressão do gene de HAS e do gene de HIAL. Tais métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais dos compostos ou composições da presente invenção ao indivíduo necessitado de tratamento ou suspeito de necessitar de tratamento profilático.

Por conseguinte, um aspeto da presente invenção é dirigido a um composto isolado como descrito nas reivindicações capaz de reduzir o nível de atividade da hialuronano-sintase (HAS)1. QUADRO 1

Sumário de identificadores de sequências SEQUÊNCIA ID NO: DESCRIÇÃO 1 Iniciador mensageiro para HAS2 humana 2 Iniciador antimensageiro para HAS2 humana 3 Iniciador para PCINeo 4 Iniciador mensageiro para GSP2 5 Iniciador mensageiro para GSP4 6 Iniciador mensageiro para HAS 1 7 Iniciador antimensageiro para HAS1 5

Sumário de identificadores de sequências SEQUÊNCIA ID NO: DESCRIÇÃO 8 Iniciador mensageiro para HAS2 9 Iniciador mensageiro para HAS2 10 Iniciador antimensageiro para HAS2 11 Iniciador mensageiro para HAS2 12 Iniciador mensageiro para HAS3 13 Iniciador antimensageiro para HAS3 14 Iniciador mensageiro para HAS3 15 Iniciador mensageiro para GAPDH 16 Iniciador antimensageiro para GAPDH 17 Iniciador mensageiro para GAPDH 18 Iniciador mensageiro para HIAL1 19 Iniciador antimensageiro para HIAL1 20 Iniciador mensageiro HIAL2 21 Iniciador antimensageiro HIAL2 22 Iniciador mensageiro HIAL3 23 Iniciador antimensageiro HIAL3 24 Péptido de imunização HAS418 25 Péptido de imunização HAS419 26 Péptido de imunização HAS421 27 Iniciador mensageiro para HAS1 28 Iniciador mensageiro para HAS2 29 Iniciador mensageiro para HAS3 30 Iniciador mensageiro para GAPDH 31 Iniciador mensageiro para HIAL 1 32 Iniciador mensageiro para HIAL2 33 Iniciador mensageiro para HIAL3 34 Iniciador antimensageiro para HAS 1 35 Iniciador antimensageiro para HAS2 36 Iniciador antimensageiro para HAS3 37 Iniciador antimensageiro para GAPDH 38 Iniciador antimensageiro para HIAL1 39 Iniciador antimensageiro para HIAL2 40 Iniciador antimensageiro para HIAL3 41 Sonda de hibridização para HAS 1 42 Sonda de hibridização para HAS2 6

6 Sumário de identificadores de sequências SEQUÊNCIA ID NO: DESCRIÇÃO 43 Sonda de hibridização para HAS3 44 Sonda de hibridização para GAPDH 45 Iniciador mensageiro para HAS2 46 Iniciador antimensageiro para HAS2 47 Iniciador para pCL-neo 48 Iniciador mensageiro para GSP2 49 Iniciador mensageiro para GSP4 50 Iniciador mensageiro para Alu 51 Iniciador antimensageiro para Alu BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS nas

Figura 1 é uma representação gráfica e fotográfica da quantificação por RT-PCR de Tempo real da expressão do ARNm da família HAS e imunodeteção de HAS2 em MDA-MB 231 parental e transfetantes antimensageiros. A: Expressão e quantificação de ARNm para HAS2 em MDA-MB 231 parental, simulado (apenas o vetor pCIneo) e clones estáveis de MDA MB-231 que expressam ARNm antimensageiro para HAS2 (ASHAS2) . B: Expressão e quantificação de HAS1 e HAS3 em transfetantes parental, simulado e ASHAS2. C: Imunodeteção da proteína HAS2 em MDA-MB 231 parental e, D: em clones estáveis que expressam ARNm antimensageiro para HAS2. Fotografias de transfetantes parental e ASHAS2 a uma ampliação de 400x. Nas células parentais observe que o contorno exterior da célula revela positivamente para o epítopo de HAS2 (setas) que está ausente na transfetada com antimensageiro, Painel D, E e F: Imunorreatividade de MDA MB231 parental para CD44 (painel E) e MDA-MB 231 transfetada com antimensageiro (Painel F). Observe a total ausência de revelação nas células transfetadas com antimensageiro. 7

Figura 2 é uma representação gráfica da caracterização do peso molecular de HA sintetizado e expressão diferencial dos genes da hialuronidase por MDA-MB 231 parental, simulada e transfetada com antimensageiro para HAS2. A: As células foram aplicadas a 7,5xl05 células em balões de cultura de 75cm2 e cultivadas durante 24h em meio completo suplementado com 5pCi de cloridrato de D-[6-3H]-glucosamina. Para determinar o PM do 3H-HA no meio, amostras foram submetidas a cromatografia de exclusão molecular sobre um Sephacryl S-1000 SF eluido em NaCl 0, 15M/fosfato pH 7,25 a 13,6 mL/h. Esta figura mostra as diferenças no peso molecular sintetizado por MDA-MD 231 parental e pelos seus homólogos transfetados que abrigam o ARNm antimensageiro para HAS2. B: 0 ARN total extraido de MDA-MD 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 foi analisado por RT-PCR para detetar os niveis dos genes de hialuronidase, de forma assinalável HIAL-1, 2 e 3. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etidio. Os geles revelados foram em seguida submetidos a análise densitométrica para permitir comparar os niveis de cada gene de HIAL entre as células parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. Assinale-se que tanto as células MDA-MD 231 parentais como as transfetadas de forma simulada expressam niveis comparáveis de HIAL-1 e 2 mas não expressam HIAL-2. Em contraste, nas células transfetadas com ASHAS2, a HIAL-2 não é expressada enquanto a HIAL-3 foi detetada e a HIAL-1 teve uma expressão moderadamente aumentada.

Figura 3 é uma representação gráfica da quantificação e comparação de HAS em MDA-MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. As células foram aplicadas a 2,5xlOs/células em balões de cultura de 25 cm2 e incubadas a 37°C durante 24h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144h. Em cada um dos pontos no tempo, as células foram tripsinizadas e contadas utilizando um contador de Coulter automático. A concentração de HA no meio de cultura colhido foi determinada utilizando um ensaio com proteina de ligação de ácido hialurónico (HAPB), com os padrões e tampão de reação proporcionados por Corgenix Inc (Colorado, EUA). A síntese de HA por MDA-MB 231 parentais e transfetadas de forma simulada foi comparável ao longo da duração da experiência. Em contraste, a síntese de HA estava significativamente aumentada em transfetantes ASHAS2, onde foi libertado aproximadamente 2 a 7 vezes mais HA para o meio de cultura.

Figura 4 é uma representação gráfica que mostra a caracterização da proliferação celular em MDA MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. Os parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 foram colhidos a aproximadamente 80% de confluência e aplicados em placas de 24 poços a uma densidade celular de 5xl03 células/poço. A taxa de crescimento de células foi então seguida durante 24, 48, 72 e 96 horas após aplicação. Todas as contagens de células foram determinadas utilizando um contador de Coulter automático. Enquanto tanto as MDA-MB 231 parentais e transfetadas de forma simulada exibiram crescimento celular exponencial até às 72 horas onde as células se tornaram confluentes, as células transfetadas com ASHAS2 cresceram a uma velocidade muito menor com um período de 'atraso' aproximado na duplicação de células de 24 horas.

Figura 5 é um representação gráfica do efeito da inibição antimensageira de HAS2 no ciclo celular. As células transfetadas e de controlo foram aplicadas a 2xl05 células/balão de 25 cm2 na presença de timidina 2mM e cultivadas até 50% confluentes. As células foram lavadas, em seguida novamente colocadas em meio de cultura normal e 9 colhidas, por tripsinização, aos seguintes pontos no tempo; Oh, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h, 28h, 32h e 36h, em seguida fixadas em etanol a 95% p/v durante 2h a 4°C. As células foram pré-tratadas com 100yg/mL de RNAase (Sigma) e 50yg/mL de iodeto de propídio (Sigma) durante 30 minutos a 37°C, antes de determinar a fase do ciclo celular num instrumento analítico FACS-Calibur (Marca Comercial) (Becton Dickinson, San Jose, CA). Painel A: população de células em Go/Gl; Painel B: na fase S, e PAINEL C: na fase G2/M. Observe o atraso de 24 horas de entrada na FASE S nos transfetantes de MDA MB 231 com ASHAS2.

Figura 6 é a representação gráfica do efeito de inibição da HAS2 no comportamento migratório da linha de células MDA MD 231 altamente metastática. A velocidade de migração de células parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro foi examinada utilizando o ensaio de quimioinvasão em câmara de Boyden como descrito em materiais e métodos. Enquanto os transfetantes parentais e simulados exibiram 100% de migração, as células que albergam o antimensageiro para a HAS2 tiveram uma inibição da migração de 93%.

Figura 7 é a representação gráfica do efeito da inibição da HAS2 por antimensageiro na tumorigenicidade e metástase de MDA MB 231. A: Parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 foram inoculados na almofada de gordura mamária de ratos glabros. O crescimento do tumor primário foi seguido ao longo de um período de 12 semanas depois da implantação, após o que foi detetada a extensão da metástase para outros órgãos utilizando PCR de Alu. Os ratos inoculados com MDA MB 231 parentais ou transfetadas de forma simulada estabeleceram rapidamente tumores primários que foram comparáveis em termos de crescimento ao longo da duração da 10 experiência de 12 semanas. Os ratos inoculados com MDA MB 231 parentais ou transfetadas de forma simulada estabeleceram rapidamente tumores primários que foram comparáveis em termos de crescimento ao longo da duração da experiência de 12 semanas. No entanto, em contraste, os ratos inoculados com transfetantes ASHAS2 não estabeleceram tumores primários. B: Metástase em órgão mole em ratos inoculados com MDA MD 231 parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro. Como avaliado por PCR de Alu, a metástase foi muito prevalecente no cérebro e pulmão mas foi também detetada nos rins e no figado em amostras preparadas a partir de ratos injetados com células MDA-MD 231 parentais ou transfetantes simuladas. Não puderam ser encontradas quaisquer metástases nos órgãos supramencionados em ratos que foram injetados com transfetantes ASHAS2.

Figura 8 é uma representação esquemática que demonstra que as HAS 2 e HAS3 libertam um HA de alto peso molecular que é rapidamente despolimerizado. As células MDA-MB 231 foram aplicadas a 7,5xl05 células/balão de cultura de 75cm2 e foram cultivadas durante 24h em meio de crescimento contendo ± 400yg/mL de DS e 250yCi de D- [ 6-3H] glucosamina. No final da incubação, o HA no meio e associado à célula foi removido e submetido a diálise (exclusão de Mr de 5 kDa) . Após a comprovação de que a Dpm não dialisável era HA (como determinado por digestão com hialuronidase de Streptomyces), este foi submetido a cromatografia de exclusão molecular num gel de Sephacryl S-1000 eluido em NaCl 0,15M/tampão de fosfato, pH 7,25 a 13,6mL/h. As diferenças nos Mr dos HA libertados (Figuras IA, C, E & G) e associados a célula (Figuras 1B, D, F & G) foram determinadas nas seguintes linhas de células: (Fig IA, B) linha de células MDA-MB 453, (Fig 1C, D) MDA-MB 231, (Fig 11 1Ε, F) ΒΤ-549 e (Fig 1G, H) Hs578T. Para determinar a qualidade do HA produzido pelas linhas de células, as culturas foram tratadas com 400pg/mL de sulfato de dextrano (·-·) e para a identificação de produtos de degradação de HA as culturas não continham sulfato de dextrano (o-o).

Figura 9 é um representação esquemática que demonstra a comparação do potencial invasivo de linhas de células de cancro da mama humano e HA recetores. 0 potencial invasivo das linhas de células de mama (·-·) foi examinado utilizando o ensaio de quimioinvasão em câmara de Boyden como descrito em Materiais e Métodos. As células que atravessaram o matrigel e proliferaram na superficie inferior do filtro foram expressadas como uma percentagem da contagem de células determinada para a linha de células Hs578T. Os dados apresentados representam a média ± DP da média de experiências em triplicado realizadas em dois dias separados. Nota: variância da percentagem entre determinações em triplicado < 2%. A quantificação dos recetores de HA (A) CD44 e (B) RHAMM foi determinada por imunotransferência, onde as Bandas imunorreativas foram quantificadas através de análise por densitometria utilizando o equipamento de imagem ProXpress [marca comercial] e os dados analisados utilizando o software Phoretix 1D.

Figura 10 são representações gráficas e fotográficas da expressão de ARNm da familia da hialuronano-sintase e da imunodeteção de HAS2 em MDA-MB 231 parentais e transfetantes antimensageiros, respetivamente. A: O ARN total foi extraido de culturas em divisão exponencial de MDA-MB 231 parentais, transfetantes simulados e clones estáveis que expressam o ARNm de ASHAS2. O nivel de ARNm para a HAS2 foi quantificado por RT-PCR de tempo real. B: 12

Imunodeteção da proteína HAS2 em clones estáveis que expressam ARNm antimensageiro para HAS2 de MDA-MB 231 parentais e, C: na linha de células MDA-MB 231 parentais. (Barra de escala 20ym).

Figura 11 é um representação gráfica que compara a expressão do gene da hialuronidase em MDA-MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro para HAS2. 0 ARN total extraído de MDA-MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 foi analisado por RT-PCR para detetar a presença dos genes de hialuronidase, HIAL-1, 2 e 3. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio. 0 volume da banda em geles revelados foi então submetido a análise densitométrica para permitir comparar os níveis para a expressão de cada gene de HIAL entre células parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. Barra a cheio: HIAL1; barra em branco: HIAL2; barra tracejada na diagonal: HIAL3. Nota: variância da percentagem entre determinações em triplicado < 2%.

Figura 12 é uma representação fotográfica que mostra a reatividade imuno-histoquímica de MDA-MB 231 parentais e transfetantes antimensageiros para CD44. Transfetantes estáveis subconfluentes de MDA-MB 231 que expressam ARNm antimensageiro para HAS2 (A) e (B) MDA-MB 231 parentais foram feitos reagir com um anti-CD44 humano. (Barra de escala 20ym).

Figura 13 é uma representação gráfica da quantificação e comparação da síntese de hialuronano em MDA-MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. As células foram aplicadas a 2,5x105/células em balões de cultura de 25cm2 e incubadas a 37°C durante 24, 48, 72, 96, 120 e 13 144h. Em cada ponto no tempo, as células foram tripsinizadas e quantificadas utilizando um contador de Coulter automático. A concentração de HA no meio de cultura colhido foi determinada utilizando um ensaio de proteína de ligação de ácido hialurónico (HAPB). A síntese de HA pelas MDA-MB 231 parentais e transfetadas de forma simulada foi expressada como HA sintetizado (pg/célula) . Os dados representam a média de determinações em triplicado em cada ponto no tempo ± DP. Δ-Δ: MDA-MB 231 parentais; o—o: transfetantes simulados; transfetantes ASHAS2.

Figura 14 é um representação gráfica da caracterização do peso molecular do HA sintetizado por MDA-MB 231 parentais e transfetantes estáveis que abrigam ASHAS2. As células foram aplicadas a 7,5xl05 células em balões de cultura de 75cm2 e cultivadas durante 24h em meio completo suplementado com 250yCi de cloridrato de D-[6 — 3H] -glucosamina. Para determinar o PM do 3H-HA no meio, as amostras foram submetidas a cromatografia de exclusão molecular sobre um Sephacryl S-1000 SF eluído em NaCl 0,15M/fosfato pH 7,25 a 13,6mL/h. Esta figura mostra as diferenças nos pesos moleculares sintetizados pelas MDA-MB 231 parentais e seus homólogos transfetados que albergam o ARNm antimensageiro para HAS2. As frações eluídas foram comprovadas ser de HA como determinado por digestão com hialuronídase de Streptomyces. (·-·: linha de células parental; o-o: transfetantes estáveis de MDA-MB 231 com ASHAS2)

Figura 15 é uma representação gráfica que mostra o efeito da inibição antimensageira de HAS2 na proliferação celular e ciclo celular em MDA-MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. A: Parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 foram colhidos a aproximadamente 80% de confluência e aplicados em placas de 24 poços a uma 14 densidade celular de 5x103 células/poço (2,5cm2). A taxa de crescimento celular foi então seguida durante 24, 48, 72 e 96h após aplicação. Todas as contagens de células foram determinadas utilizando um contador de Coulter automático. Os dados representam a média de determinações em triplicado em cada ponto no tempo ± DP. : transfetantes estáveis com ASHAS2; A: linha de células parental; o: transfetantes simulados. Nota: variância da percentagem entre determinações em triplicado < 2%. B: As células transfetadas e de controlo foram aplicadas a 2xl05 células/balão de 25cm2 na presença de timidina 2mM e cultivadas até 50% confluentes. As células foram colhidas e a proporção de células numa fase particular do ciclo celular foi então determinada num instrumento analitico FACS-Calibur™. B: população de células em G0/G1; C: na fase S, e D: na fase G2/M. Observe o atraso em 24 horas de entrada na fase S nos transf etantes de MDA-MB 231 com ASHAS2. : transfetantes estáveis com ASHAS2; A: linha de células parental; ·: transfetantes simulados.

Figura 16 é uma representação gráfica que mostra a inibição da capacidade de invasão in vitro de MDA-MB 231 que expressam ARNm antimensageiro para HAS2. 0 potencial invasivo de MDA-MB 231 parentais, simuladas (apenas vetor) e células transfetadas com antimensageiro para HAS2 foi examinado utilizando o ensaio de quimioinvasão em câmara de Boyden. As células que atravessaram o matrigel e se propagaram na superfície inferior do filtro foram expressadas como um percentagem da contagem de células determinada para a linha de células MDA-MB 231 parental. Os dados apresentados representam a média de experiências em triplicado realizadas em dois dias separados ± DP. Nota: variância da percentagem entre determinações em triplicado < 2%. 15

Figura 17 é uma representação gráfica que mostra o efeito da inibição de antimensageiro da HAS2 na tumorigenicidade e metástase em MDA-MB 231. A: Parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 foram inoculados na almofada de gordura mamária de ratos glabros. 0 crescimento do tumor primário foi seguido ao longo de um periodo de 12 semanas com a progressão do tumor registada duas vezes por semana. Os resultados apresentados no gráfico representam o volume tumoral médio (mm3) ± EPM, em que n = 9-13. B: A PCR de Alu foi utilizada para determinar a extensão de metástases de órgão mole do cérebro, rim, fígado e pulmão. Os resultados são exprimidos como a percentagem de ADN de tumor humano nos órgãos moles de rato, n = 8 por grupo.

Figura 18 é uma representação gráfica que mostra o efeito da inibição de antimensageiro da HAS2 na metástase e na sobrevivência do animal. A: A PCR de Alu foi utilizada para determinar a extensão de metástase em órgãos moles após inoculação intracardíaca de ratos glabros a partir de cérebro, rim, fígado, pulmão e osso. Os resultados são exprimidos como a percentagem de ADN de tumor humano nos órgãos moles de rato, n = 9 por grupo. Não pôde ser detetada qualquer metástase para estes órgãos quando os animais foram inoculados com células MDA-MB 231 transfetadas com ASHAS2. B: A taxa de sobrevivência dos ratos parentais, simulados e transfetantes ASHAS2 foi representada graficamente utilizando o programa Prism stats (Sobrevivência de Kaplan-Meier) contra os dias decorridos após as inoculações intracardíacas. Não houve qualquer diferença na taxa de sobrevivência animal (P=0,0840) entre os ratos parentais e transfetados de forma simulada. A curva de sobrevivência para ASHAS2 foi significativamente diferente (P<0,0001) de ambos os grupos de controlo. Transfetantes MDA-MB 231 com ASHAS2 (sólido); linha de 16 células parental (tracejado curto); transfetantes simulados (tracejado longo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS São aqui divulgados compostos, preferencialmente nucleótidos e espécies semelhantes para serem utilizados na modulação da função da HAS ou da expressão de moléculas de ácido nucleico que codificam a HAS e, em particular, HAS1, HAS2 e/ou HAS3 ou uma molécula de ácido nucleico necessária ou que facilita a expressão do material genético da HAS (por exemplo uma região promotora). Como aqui utilizada, a referência a HAS inclui qualquer molécula com a mesma função. Num aspeto preferido, a referência a "HAS", inclui referência às isoformas HAS1, HAS2 ou HAS3. Em particular, a HAS é HAS 2 ou HAS3. São também divulgados compostos, preferencialmente nucleótidos e espécies semelhantes para serem utilizados na modulação da função da HIAL ou da expressão de moléculas de ácido nucleico que codificam a HIAL e, numa forma de realização particular, HIAL1, HIAL2, HIAL3 e/ou PH-20, ou uma molécula de ácido nucleico necessária ou que facilita a expressão de material genético da HIAL (por exemplo uma região promotora) . Como aqui utilizada, a referência a HIAL inclui qualquer molécula com a mesma função. Preferencialmente, a referência a "HIAL", inclui referência às isoformas HIAL1, HIAL2, HIAL3 e/ou PH-20. Em particular a HIAL é HIAL1, HIAL2 ou HIAL3.

Os compostos aqui descritos podem ser utilizados para regular negativamente a expressão de material genético de HAS e HIAL. Isto é conseguido proporcionando oligonucleótidos que hibridizam, ou interagem de outra forma, especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a HAS e/ou a HIAL ou uma molécula de ácido nucleico necessária ou que facilita a expressão do 17 gene da HAS e/ou HIAL. Como aqui utilizados, os termos "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico que codifica a HAS ou HIAL" foram utilizados por conveniência para abranger o ADN que codifica a HAS, ARN (incluindo pré-ARNm e ARNm ou porções dos mesmos) transcrito a partir desse ADN e também ADNc derivado desse ARN. A hibridização ou interação de um composto aqui descrito com um ácido nucleico alvo pode abranger direcionamento antimensageiro ou mensageiro. 0 último é aqui referido como supressão por mensageiro. Consequentemente, isto proporciona inibição por antimensageiro ou mensageiro. Esta inibição por antimensageiro ou mensageiro baseia-se tipicamente na hibridização com base em ligações de hidrogénio de cadeias ou segmentos de oligonucleótidos de tal forma que pelo menos uma cadeia ou segmento é dissociado, degradado ou tornado inoperável de qualquer outra forma. Alternativamente, o silenciamento de gene pós-transcrição (PTGS) pode ser conseguido utilizando supressão por mensageiro (formalmente conhecida como co-supressão). Ainda noutra alternativa podem ser utilizados complexos compreendendo moléculas de ácido nucleico e proteínas (por exemplo ribonucleases) tais como ARNi, ribozimas e ADNzimas.

As moléculas de ácido nucleico alvo incluem as sequências de codificação de HAS e HIAL, uma região promotora, uma região reguladora 3' ou uma sequência de nucleótidos, cuja expressão facilita ou inibe a expressão do gene da HAS ou HIAL (por exemplo um gene regulador, gene ativador ou gene repórter).

As funções da molécula de ácido nucleico a serem reguladas negativamente incluem replicação, transcrição e/ou tradução. Nos casos em que a molécula de ácido nucleico é ARN, os compostos podem visar a translocação do ARN para um 18 sítio de tradução para proteína, a translocação do ARN para sítios dentro da célula que são distantes do sítio de síntese do ARN, tradução da proteína a partir do ARN, excisão-união do ARN para produzir uma ou mais espécies de ARN, e atividade catalítica ou formação de complexos envolvendo o ARN, os quais podem estar envolvidos ou ser facilitados pelo ARN. Um resultado preferido dessa interferência com a função do ácido nucleico alvo é a redução do nível de expressão do material genético da HAS e/ou HIAL e, desse modo, dos níveis de HAS e/ou HIAL. A inibição é a forma de modulação preferida da expressão e o ARNm é o ácido nucleico alvo preferido.

Como aqui referido, "hibridização" significa o emparelhamento de cadeias complementares de ácidos nucleicos. 0 mecanismo de emparelhamento preferido envolve ligações de hidrogénio, as quais podem ser ligações de hidrogénio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertidas, entre nucleósidos ou bases de nucleótido (nucleótidos) complementares das cadeias de compostos oligoméricos. Por exemplo, a adenina e a timina são nucleótidos complementares que emparelham através da formação de ligações de hidrogénio. A hibridização pode ocorrer em várias circunstâncias.

Um composto antimensageiro ou mensageiro é especificamente hibridizável quando a ligação do composto ao ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico alvo para originar uma perda de atividade e existe um grau de complementaridade suficiente para evitar a ligação não específica do composto antimensageiro ou mensageiro a sequências de ácido nucleico não alvo sob condições nas quais é desejada ligação especifica, isto é, sob condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tratamento 19 terapêutico, e sob condições nas quais são realizados os ensaios no caso de ensaios in vitro.

Um composto mensageiro inclui ARNi ou outro complexo, o qual inclui o PTGS.

Como aqui referida, a frase "condições de hibridização estringentes" ou "condições estringentes" refere-se a condições sob as quais um composto aqui divulgado hibridizará com a sua sequência alvo, mas com um número minimo de outras sequências. As condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias e as "condições estringentes" sob as quais os compostos oligoméricos hibridizam com uma sequência alvo são determinadas pela natureza e composição dos compostos oligoméricos e os ensaios nos quais estão a ser investigados. para grau "Complementar," como aqui utilizado, refere-se à capacidade para emparelhamento exato entre dois nucleótidos de um composto oligomérico. Por exemplo, se um nucleótido numa certa posição de um oligonucleótido (um composto oligomérico) é capaz de se ligar por pontes de hidrogénio com um nucleótido numa certa posição de um ácido nucleico alvo, sendo o referido ácido nucleico alvo um ADN, ARN ou molécula oligonucleotidica, então a posição de ligação de hidrogénio entre o oligonucleótido e o ácido nucleico alvo é considerada ser uma posição complementar. 0 oligonucleótido e o ADN, ARN ou molécula oligonucleotidica adicional são complementares um do outro quando um número suficiente de posições complementares em cada molécula são ocupadas por nucleótidos que se podem ligar por pontes de hidrogénio um com o outro. Assim, "especificamente hibridizável" e "complementar" são termos que são utilizados para indicar um grau suficiente de 20 emparelhamento exato ou complementaridade ao longo de um suficiente número de nucleótidos de tal forma que ocorre uma ligação estável e específica entre o oligonucleótido e um ácido nucleico alvo.

Entende-se na técnica que a sequência de um composto antimensageiro ou mensageiro não tem de ser 100% complementar à do seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Além do mais, um oligonucleótido podem hibridizar ao longo de um ou mais segmentos de tal forma que segmentos intermédios ou adjacentes não estão envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura em ansa ou estrutura em grampo). É preferido que os compostos antimensageiros ou mensageiros aqui descritos compreendam pelo menos 70% de complementaridade de sequência com uma região alvo dentro do ácido nucleico alvo; tal como 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de complementaridade com a sequência de ácido nucleico à qual aqueles se dirigem. Por exemplo, um composto antimensageiro ou mensageiro em que 18 dos 20 nucleótidos do composto antimensageiro ou mensageiro são complementares com uma região alvo, e portanto hibridizariam especificamente, representaria 90 por cento de complementaridade. Neste exemplo, os nucleótidos não complementares remanescentes podem estar em conjunto ou separados por nucleótidos complementares e não precisam de ser contíguos uns com os outros ou com nucleótidos complementares. Assim sendo, um composto antimensageiro ou mensageiro que tem 18 nucleótidos de comprimento com 4 (quatro) nucleótidos não complementares que são flanqueados por duas regiões de complementaridade total com o ácido nucleico alvo teriam 77,8% de complementaridade global com o ácido nucleico alvo. 21 A percentagem de complementaridade de um composto antimensageiro ou mensageiro com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente utilizando os programas BLAST (ferramentas básicas de pesquisa de alinhamento local) e os programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410, 1990; Zhang e Madden, Genoma Res. 7: 649-656, 1997).

Os compostos para as utilizações aqui descritas incluem ácidos nucleicos antimensageiros ou mensageiros, compostos oligoméricos antimensageiros ou mensageiros, oligonucleótidos antimensageiros ou mensageiros, ribozimas, oligonucleótidos mensageiros, moléculas mensageiras inteiras, oligonucleótidos de sequência de orientação externa (EGS), elementos de excisão-união alternados, iniciadores, sondas e outros compostos oligoméricos que hibridizam com pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. Assim sendo, estes compostos podem ser introduzidos na forma de compostos oligoméricos de cadeia simples, cadeia dupla, circulares ou em grampo e podem conter elementos estruturais tais como convexidades ou ansas internas ou terminais. Uma vez introduzidos num sistema, os compostos podem desencadear a ação de uma ou mais enzimas ou proteínas estruturais para efetuar a modificação do ácido nucleico alvo.

Como aqui utilizada, uma molécula "antimensageira" ou "mensageira" inclui uma molécula de ARN a qual, ao ligar-se a uma sequência complementar em ARN ou ADN, inibe a função e/ou conclusão da síntese da última molécula. Está envolvida em vários sistemas reguladores in vivo. ARNs antimensageiros ou mensageiros artificiais têm sido utilizados para inibir a tradução de moléculas de ARNm 22 específicas tanto em células vivas (eucarióticas e bacterianas) como em sistemas isentos de células.

Um exemplo não limitativo de uma enzima desse tipo é ARNse H, uma endonuclease celular que dissocia a cadeia de ARN de uma hélice dupla de ARNrADN. Sabe-se na técnica que os compostos antimensaqeiros ou mensageiros de cadeia simples que são "semelhantes a ADN" desencadeiam a ARNse H. Por conseguinte, a ativação da RNase H resulta na dissociação do ARN alvo, melhorando muito desse modo a eficiência da inibição da expressão do gene mediada por oligonucleótido. Papéis semelhantes têm sido postulados para outras ribonucleases tais como aquelas na família de enzimas de RNase III e ribonuclease L.

Embora a forma preferida dos compostos antimensageiros ou mensageiros sejam os oligonucleótidos de cadeia simples, em muitas espécies podem ser utilizadas estruturas de cadeia dupla, tais como moléculas de ARN de cadeia dupla (ARNds), ARNmi, moléculas de ARN de pequena interferência (ARNsi) e ARNds inteiros.

Os ARN de pequena interferência (ARNsi) têm um papel integral no fenómeno de ARN de interferência (ARNi). No ARNi, os ARNds introduzidos em certos organismos ou células são degradados em aproximadamente fragmentos de 22 nucleótidos. Estas moléculas de ARNsi de 22 nucleótidos ligam-se em seguida à porção complementar do seu ARNm alvo e marca-o para degradação;

Uma segunda classe de ARNs reguladores pequenos são referidos como ARNs temporais pequenos. Os ARNs lin-4 e let-7 de aproximadamente 22 nucleótidos são exemplos deste grupo. Estas moléculas de ARN têm um papel na regulação temporal do desenvolvimento de C. elegans. Estas são 23 inicialmente processadas a partir de um transcrito de ARNss com aproximadamente 70 nucleótidos dobrado numa estrutura em ansa de eixo. Após processamento, julga-se que estes ARNst impedem a tradução dos seus ARNm alvo ligando-se às regiões não traduzidas 3' (UTRs) complementares do alvo. Dicer, a enzima RNAase processa ambos os tipos de ARNs (Grishok et al. Science 287(562):2494-2497, 2000).

Como aqui utilizado, o termo "composto oligomérico" refere-se a um polimero ou oligómero compreendendo uma multiplicidade de unidades monoméricas. Como aqui utilizado, o termo "oligonucleótido" refere-se a um oligómero ou polimero de ácido ribonucleico (ARN) ou ácido desoxirribonucleico (ADN) ou miméticos, quimeras, análogos e homólogos do mesmo. Este termo inclui oligonucleótidos constituídos por nucleótidos naturais, açúcares e ligações covalentes internucleósido (estrutura central) bem como oligonucleótidos possuindo porções não naturais que funcionam de forma análoga. Tais oligonucleótidos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos relativamente às formas nativas devido às propriedades desejáveis tais como, por exemplo, captação celular melhorada, afinidade melhorada para um ácido nucleico alvo e maior estabilidade na presença de nucleases.

Embora os oligonucleótidos possam ser utilizados nos métodos aqui descritos, também podem ser utilizadas outras famílias de compostos, incluindo mas não se limitando a análogos e miméticos de oligonucleótidos tais como aqueles aqui descritos.

Os compostos descritos acima compreendem preferencialmente desde cerca de 10 até cerca de 2000 nucleótidos (isto é, desde cerca de 10 até cerca de 2000 nucleósidos ligados) , por exemplo compostos com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 24 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, O LO cn 00 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 , 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 , 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510 , 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630 , 640, 650, 660, 670, 680,690, 700, 710, 720, ' 730, 740, 750 , 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870 , 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950 , 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1080 , 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180 , 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280 , 1290, 1300, 1310, 1320, 1330, 1340, 1350, 1360, 1370, 1380 , 1390, 1400, 1410, 1420, 1430, 1440, 1450, 1460, 1470, 1480 , 1490, 1500, 1510, 1520, 1530, 1540, 1550, 1560, 1570, 1580 , 1590, 1600, 1610, 1620, 1630, 1640, 1650, 1660, 1670 , 1680,1690, 1700, 1710, 1720, 1730, 1740, 1750, 1760, 1770, 1780 , 1790, 1800, 1810, 1820, 1830, 1840, 1850, 1860, 1870, 1880 , 1890, 1900, 1910, 1920, 1930, 1940, 1950, 196C ), 1970, 1980, 1990 ou 2000 nucleótidos de comprimento.

Os compostos antimensageiros ou mensageiros com 10-2000 nucleótidos de comprimento compreendendo um segmento com pelo menos dez (10) tal como 10, 11, 12 , 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleótidos consecutivos selecionados de entre os compostos antimensageiros ou mensageiros ilustrativos são também considerados serem compostos antimensageiros ou mensageiros adequados.

Os compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos ilustrativos incluem sequências oligonucleotidicas que 25 compreendem pelo menos os 10 nucleótidos consecutivos da extremidade 5' de um dos compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos ilustrativos (sendo os restantes nucleótidos um fragmento consecutivo do mesmo oligonucleótido que começa imediatamente a montante da extremidade 5' do composto antimensageiro ou mensageiro que é especificamente hibridizável com o ácido nucleico alvo e prosseguindo até o oligonucleótido conter cerca de 10 até cerca de 2000 nucleótidos). Analogamente, os compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos são representados por sequências oligonucleotidicas que compreendem pelo menos os 10 nucleótidos consecutivos da extremidade 3' de um dos compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos ilustrativos (sendo os restantes nucleótidos um fragmento consecutivo do mesmo oligonucleótido que começa imediatamente a montante da extremidade 3' do composto antimensageiro ou mensageiro que é especificamente hibridizável com o ácido nucleico alvo e prosseguindo até o oligonucleótido conter cerca de 10 até cerca de 2000 nucleótidos). Um especialista na técnica munido dos compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos aqui ilustrados será capaz, sem experimentação excessiva, de identificar outros compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos.

Os compostos candidatos são também aqui referidos como compostos "lideres". Na presente divulgação, o ácido nucleico alvo codifica a HAS ou HIAL ou é um gene necessário para a expressão do gene da HAS ou HIAL. Como indicado acima, o termo "HAS" inclui as isoformas HAS1, HAS2 e HAS3. As HAS2 e HAS3 são particularmente preferidas. Como indicado acima, o termo "HIAL" inclui as isoformas HIAL1, HIAL2, HIAL3 e PH-20. As HIAL1, HIAL2 e HIAL3 são particularmente preferidas. 26 0 processo de direcionamento inclui também geralmente a determinação de pelo menos uma região, segmento ou sitio alvo dentro do ácido nucleico alvo para ocorrer a interação antimensageira ou mensageira de tal forma que resultará o efeito desejado, por exemplo, redução da expressão. Como aqui referido, o termo "região" é definido como uma porção do ácido nucleico alvo possuindo pelo menos uma estrutura, função ou caracteristica identificável. Dentro das regiões de ácidos nucleicos alvo encontram-se segmentos. Os "segmentos" são definidos como regiões mais pequenas ou sub-porções de regiões dentro de um ácido nucleico alvo. Os "sítios," como aqui utilizados, são definidos como posições dentro de um ácido nucleico alvo.

Uma vez que, como é conhecido na técnica, o codão de início da tradução é tipicamente 5'-AUG (em moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG na molécula de ADN correspondente), o codão de início da tradução também é referido como o "codão AUG," o "codão de início" ou o "codão de início AUG". Uma minoria de genes tem um codão de início da tradução que tem a sequência de ARN 5'-GUG, 5'-UUG ou 5'-CUG, e foi mostrado que as 5'-AUA, 5'-ACG e 5'-CUG funcionam in vivo. Assim, os termos "codão de início da tradução" e "codão de início" podem abranger muitas sequências de codão, ainda que o aminoácido iniciador em cada caso seja tipicamente a metionina (nos eucariotas). É também conhecido na técnica que os genes eucarióticos podem ter dois ou mais codões de início alternativos; qualquer um dos quais pode ser preferencialmente utilizado para o início da tradução num tipo particular de células ou tecido, ou sob um conjunto particular de condições. Como aqui utilizado, "codão de início" e "codão de início da tradução" referem-se ao codão ou codões que são utilizados in vivo para iniciar a tradução de um ARNm transcrito a partir de um gene que codifica a HAS, independentemente da(s) sequência(s) desses 27 codões. É também conhecido na técnica que um codão de terminação da tradução (ou "codão de paragem") de um gene pode ter uma de três sequências, isto é, 5' -UAA, 5' -UAG e 5'-UGA (as sequências de ADN correspondentes são 5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA, respetivamente).

Os termos "região do codão de inicio" e "região do codão de início da tradução" referem-se a uma porção de um tal ARNm ou gene que abrange desde cerca de 25 até cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer uma das direções (isto é, 5' ou 3') a partir de um codão de início da tradução. Analogamente, os termos "região do codão de paragem" e "região do codão de terminação da tradução" referem-se a uma porção de um tal ARNm ou gene que abrange desde cerca de 25 até cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer uma das direções (isto é, 5' ou 3') a partir de um codão de terminação da tradução. Consequentemente, a "região do codão de início" (ou "região do codão de início da tradução") e a "região do codão de paragem" (ou "região do codão de terminação da tradução") são todas regiões que podem ser visadas eficazmente com os compostos antimensageiros ou mensageiros aqui descritos. A grelha de leitura aberta (ORF) ou "região de codificação," a qual é conhecida na técnica como referindo-se à região entre o codão de início da tradução e o codão de terminação da tradução, é também uma região que pode ser visada eficazmente.

Uma região preferida é a região intragénica que abrange o codão de início ou terminação da tradução da grelha de leitura aberta (ORF) de um gene.

Outras regiões alvo incluem a região não traduzida 5' (5'UTR), conhecida na técnica como referindo-se à porção de 28 um ARNm na direção 5' a partir do codão de inicio da tradução, e incluindo desse modo os nucleótidos entre o sitio cap 5' e o codão de inicio da tradução de um ARNm (ou nucleótidos correspondentes no gene), e a região não traduzida 3' (3'UTR), conhecida na técnica como referindo-se à porção de um ARNm na direção 3' a partir do codão de terminação da tradução, e incluindo desse modo os nucleótidos entre o codão de terminação da tradução e a extremidade 3' de um ARNm (ou nucleótidos correspondentes no gene) . 0 sitio cap 5' de um ARNm compreende um residuo de guanosina metilado em N7 ligado ao residuo mais 5' do ARNm através de uma ligação trifosfato 5'-5'. Considera-se que a região cap 5' de um ARNm inclui a própria estrutura cap 5' bem como os primeiros 50 nucleótidos adjacentes ao sitio cap. É também preferido visar a região cap 5'.

Embora alguns transcritos de ARNm eucarióticos sejam diretamente traduzidos, muitos contêm uma ou mais regiões, conhecidas como "intrões," as quais são excisadas de um transcrito antes de este ser traduzido. As restantes regiões (e por conseguinte traduzidas) são conhecidas como "exões" e são unidas em conjunto para formar um sequência de ARNm continua. O direcionamento para sitios de excisão-união, isto é, junções intrão-exão ou junções exão-intrão, pode ser também particularmente útil em situações em que está implicada excisão-união aberrante na doença, ou em que está implicada uma produção excessiva de um produto de excisão-união particular na doença. As junções de fusão aberrantes devido a rearranjos ou supressões são também sitios alvo preferidos. Os transcritos de ARNm produzidos através do processo de excisão-união de dois (ou mais) ARNm de diferentes fontes genéticas são conhecidos como "transcritos de fusão". Sabe-se também que os intrões podem ser visados eficazmente utilizando compostos 29 antimensageiros ou mensageiros direcionados para, por exemplo, ADN ou pré-ARNm. É também conhecido na técnica que podem ser produzidos transcritos de ARN alternativos a partir da mesma região genómica de ADN. Estes transcritos alternativos são geralmente conhecidos como "variantes". Mais especificamente, as "variantes de pré-ARNm" são transcritos produzidos a partir do mesmo ADN genómico que diferem de outros transcritos produzidos a partir do mesmo ADN genómico na sua posição de inicio ou paragem e contêm sequências intrónicas e exónicas.

Após excisão de uma ou mais regiões de exão ou intrão, ou porções das mesmas durante a excisão-união, as variantes de pré-ARNm produzem "variantes de ARNm" mais pequenas. Consequentemente, as variantes de ARNm são variantes de pré-ARNm processadas e cada variante de pré-ARNm única tem de produzir sempre uma variante de ARNm única em consequência da excisão-união. Estas variantes de ARNm são também conhecidas como "variantes de excisão-união alternativas". Se não ocorrer qualquer excisão-união da variante de pré-ARNm, então a variante de pré-ARNm é idêntica à variante de ARNm. É também conhecido na técnica que as variantes podem ser produzidas através da utilização de sinais alternativos para iniciar ou para a transcrição e que os pré-ARNm e ARNm pode possuir mais do que um codão de início ou codão de paragem. As variantes que têm origem a partir de um pré-ARNm ou ARNm que utiliza codões de início alternativos são conhecidas como "variantes de início alternativo" desse pré-ARNm ou ARNm. Aqueles transcritos que utilizam um codão de paragem alternativo são conhecidos como "variantes de paragem alternativa" desse pré-ARNm ou ARNm. Um tipo 30 específico de variante de paragem alternativa é a "variante poliA" em que os múltiplos transcritos produzidos resultam da seleção alternativa de um dos "sinais de paragem de poliA" pela maquinaria da transcrição, produzindo desse modo transcritos que terminam em sítios polia únicos.

Os tipos de variantes aqui descritos são também ácidos nucleicos alvos preferidos.

As localizações no ácido nucleico alvo com as quais os compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos hibridizam são a seguir referidas como "segmentos alvos preferidos." Como aqui utilizado o termo "segmento alvo preferido" é definido como uma porção de pelo menos 10 nucleótidos de uma região alvo para a qual é direcionado um composto antimensageiro ou mensageiro ativo. Embora não se pretenda ficar limitado pela teoria, atualmente acredita-se que estes segmentos alvos representam porções do ácido nucleico alvo que estão acessíveis para hibridização.

Embora sejam aqui definidas as sequências específicas de certos segmentos alvos preferidos, um especialista na técnica reconhecerá que estes servem para ilustrar e descrever formas de realização particulares. Outros segmentos alvos preferidos podem ser identificados por um técnico médio.

Os segmentos alvos com 10-2000 nucleótidos de comprimento compreendendo um segmento com pelo menos dez (10) nucleótidos consecutivos selecionados de entre os segmentos alvos preferidos ilustrativos são também considerados como sendo adequados para serem visados.

Os segmentos alvos podem incluir sequências de ADN ou ARN que compreendem pelo menos os 8 nucleótidos consecutivos da 31 extremidade 5' de um dos segmentos alvos preferidos ilustrativos (sendo os restantes nucleótidos um segmento consecutivo do mesmo ADN ou ARN que começa imediatamente a montante da extremidade 5' do segmento alvo e que continua até o ADN ou ARN conter cerca de 10 até cerca de 2000 nucleótidos). Analogamente, os segmentos alvos preferidos são representados por sequências de ADN ou ARN que compreendem pelo menos os 10 nucleótidos consecutivos da extremidade 3' de um dos segmentos alvos preferidos ilustrativos (sendo os restantes nucleótidos um segmento consecutivo do mesmo ADN ou ARN que começa imediatamente a jusante da extremidade 3' do segmento alvo e que continua até o ADN ou ARN conter cerca de 10 até cerca de 2000 nucleótidos). Um especialista na técnica munido com os segmentos alvos preferidos aqui ilustrados será capaz, sem experimentação excessiva, de identificar outros segmentos alvos preferidos.

Uma vez identificados uma ou mais regiões, segmentos ou sitios alvos, são escolhidos compostos antimensageiros ou mensageiros que são suficientemente complementares com o alvo, isto é, hibridizam suficientemente bem e com especificidade suficiente, para dar o efeito desejado, isto é, para reduzir a expressão do gene de HAS e/ou HIAL ou os niveis de HAS e/ou HIAL.

Os "segmentos alvos preferidos" aqui identificados podem ser utilizados num rastreio para compostos adicionais que modulam a expressão do Gene de HAS e/ou HIAL. Os "moduladores" são aqueles compostos que diminuem ou aumentam a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a HAS e/ou HIAL e que compreendem pelo menos uma porção de 10 nucleótidos que é complementar a um segmento alvo preferido. O método de rastreio compreende os passos de pôr em contacto um segmento alvo preferido de uma 32 molécula de ácido nucleico que codifica a HAS e/ou HIAL com um ou mais moduladores candidatos e selecionar um ou mais moduladores candidatos que diminuem ou aumentam a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a HAS e/ou HIAL. Uma vez demonstrado que o modulador ou moduladores candidatos são capazes de modular (por exemplo diminuir ou aumentar) a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a HAS e/ou HIAL o modulador pode ser depois utilizado em mais estudos de investigação da função da HAS e/ou HIAL, ou ser utilizado como um agente de investigação, diagnóstico ou terapêutico.

Os segmentos alvos preferidos podem ser também combinados com os respetivos compostos antimensageiros ou mensageiros complementares como aqui descritos para formar oligonucleótidos de cadeia dupla (em hélice dupla) estabilizados.

Foi demonstrado na técnica que essas unidades de oligonucleótidos de cadeia dupla modulam a expressão do alvo e regulam a tradução bem como o processamento de ARN através de um mecanismo antimensageiro ou mensageiro. Além do mais, as unidades de cadeia dupla podem ser sujeitas a modificações quimicas (Fire et al., Nature 391: 806, 811, 1998; Timmons e Fire, Nature 395: 854, 1998; Timmons et al., Gene 263: 103-112, 2001; Tabara et al., Science 282: 430-431, 1998; Montgomery et al., 1998, supra; Tuschl et al., Genes Dev. 13: 3191-3197, 1999; Elbashir et al., Nature, 411: 494-498, 2001, Elbashir et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001) . Por exemplo, foi demonstrado que tais unidades de cadeia dupla inibem o alvo pela hibridização clássica da cadeia antimensageira ou mensageira da hélice dupla com o alvo, desencadeando desse modo a degradação enzimática do alvo (Tijsterman et al., 2002, supra). 33

Como indicado acima, são aqui divulgadas moléculas interativas especificas para uma HAS, incluindo uma ou mais de HAS1, 2 e/ou 3 e as quais modificam a função ou atividade da HAS. São ainda divulgadas moléculas interativas especifica para uma HIAL, incluindo uma ou mais de HIAL1, HIAL2, HIAL3 e/ou PH-20 e as quais modificam a função ou atividade da HIAL. São aqui divulgados antagonistas da função ou atividade da HAS e/ou HIAL. Tais antagonistas são úteis na redução dos efeitos da HAS e/ou HIAL e, assim, na redução ou aumento dos niveis de HA. 0 termo "antagonista" inclui uma molécula de HAS e/ou HIAL modificada ou substrato de HAS e/ou HIAL bem como os seus homólogos ou equivalentes químicos ou análogos. Preferencialmente, ele abrange moléculas interativas tais como anticorpos e inibidores de molécula pequena.

As moléculas interativas tais como, mas não se limitando a, anticorpos e outras imunoglobulinas incluem fragmentos, derivados, porções de ligação a antigénio, formas recombinantes, formas quiméricas bem como desimunizadas incluindo formas humanizadas dos mesmos dirigidas para os moduladores objeto e inibidores de molécula pequena.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se a anticorpos que ligam, interagem ou associam de outro modo com a HAS e/ou HIAL e que reduzem a função ou atividade da HAS e/ou HIAL.

Em particular, a presente invenção proporciona um composto isolado que reduz o nível de atividade da hialuronano-sintase (HAS)1 em que o referido composto é um anticorpo 34 específico para uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 25 ou 26. monoclonais ou os anticorpos estão na forma ou parcialmente

Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais, embora sejam preferidos monoclonais. Em geral, os anticorpos isolada, homogénea ou completamente purificada.

Os anticorpos também podem ser humanizados ou quiméricos ou são anticorpos humanos adequados para administração em humanos. Estes incluem anticorpos humanizados preparados, por exemplo, a partir de anticorpos monoclonais de murídeos e anticorpos monoclonais humanos que podem ser preparados, por exemplo, utilizando ratos transgénicos como descrito abaixo, ou por apresentação em fago. Um anticorpo "humanizado" inclui um anticorpo desimunizado.

Os anticorpos são gerados contra uma HAS tal como HAS1, 2 ou 3 ou partes imunogénicas da mesma ou moléculas imunologicamente homólogas e são específicos para um aminoácido selecionado de SEQ ID NOs: 25 ou 26. A referência a um "anticorpo" ou "anticorpos" inclui uma referência a todas as várias formas de anticorpos, incluindo mas não se limitando a: anticorpos inteiros (por exemplo possuindo uma região Fc intacta), incluindo, por exemplo, anticorpos monoclonais; fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio, incluindo, por exemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2; anticorpos humanizados; anticorpos humanos (por exemplo, produzidos em animais transgénicos ou através de apresentação em fago); e polipéptidos derivados de imunoglobulina produziu através de técnicas de engenharia genética. Salvo especificação em contrário, os termos "anticorpo" ou "anticorpos" e como aqui utilizados 35 abrangem tanto os anticorpos inteiros como os fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos.

Salvo indicação em contrário, a especificidade no que se refere a um anticorpo da presente invenção pretende significar que o anticorpo se liga substancialmente apenas ao seu antigénio alvo sem qualquer ligação apreciável a proteínas não relacionadas. No entanto, é possivel que um anticorpo seja concebido ou selecionado para se ligar a duas ou mais proteínas relacionadas. Uma proteína relacionada inclui diferentes variantes de excisão-união ou fragmentos da mesma proteína ou proteínas homólogas de espécie diferentes. Tais anticorpos continuam a ser considerados como tendo especificidade para aquelas proteínas e estão abrangidos pela presente invenção. Neste contexto, o termo "substancialmente" significa que não há qualquer ligação detetável a um antigénio não alvo acima dos níveis basais, isto é, não específica.

Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados por procedimentos bem conhecidos. Ver, por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysers, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); e Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Um método para produzir um anticorpo da presente invenção compreende imunizar um animal não humano, tal como um rato ou um rato transgénico, com HAS ou partes imunogénicas da mesma, de acordo com o que são gerados anticorpos dirigidos contra a molécula de HAS ou partes imunogénicas no referido animal. Os vários meios para aumentar a antigenicidade de um imunogénio particular, tal como a administração de adjuvantes ou antigénios conjugados, compreendendo o 36 antigénio contra o qual é desejada uma resposta de anticorpos e outro componente, são bem conhecidos daqueles na técnica e podem ser utilizados. As imunizações envolvem tipicamente uma imunização inicial seguida de uma série de imunizações de reforço. Os animais podem ser sangrados e o soro analisado quanto ao titulo de anticorpo: Os animais podem receber reforços até o titulo atingir um patamar. Os conjugados podem ser preparados em cultura de células recombinantes como proteina fusões. Além disso, os agentes de agregação tais como alúmen são adequadamente utilizados para melhorar a resposta imunológica.

Através deste método podem ser produzidos anticorpos policlonais e monoclonais. Os métodos para obter ambos os tipos de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os anticorpos policlonais são menos preferidos, mas são preparados de forma relativamente mais fácil por injeção de um animal de laboratório adequado com uma quantidade eficaz de uma molécula de HAS, ou partes imunogénicas da mesma, colheita do soro a partir do animal e isolamento dos anticorpos específicos para a molécula de HAS por qualquer uma das técnicas imunoadsorventes conhecidas. Os anticorpos produzidos por esta técnica são geralmente menos escolhidos, devido ao potencial de heterogeneidade do produto A utilização de anticorpos monoclonais é particularmente preferida devido à capacidade de produzi-los em grandes quantidades e à homogeneidade do produto. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por procedimentos convencionais. 0 termo "anticorpo monoclonal" como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, isto é, os 37 anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto no que se refere a possiveis mutações naturais que possam estar presentes em quantidades mais pequenas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sitio antigénico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo (policlonal) convencionais, as quais incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. 0 modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (ver, por exemplo, Pat.U.S. n° 4,816,567). Os "anticorpos monoclonais" podem ser também isolados a partir de bibliotecas de anticorpo em fago utilizando, por exemplo, as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991 e Marks et al. , J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991.

É também aqui descrito um método para produzir uma linha de células de hibridoma, a qual compreende imunizar um animal não humano, tal como um rato ou um rato transgénico, com uma HAS ou partes imunogénicas da mesma; colher as células do baço do animal imunizado; fundir as células de baço colhidas com uma linha de células de mieloma para gerar células de hibridoma; e identificar uma linha de células de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga a uma HAS 38

Os anticorpos monoclonais contra HAS produzidos por aquelas que são especificos para uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 25 ou 26 são abrangidos pela presente invenção. Os anticorpos monoclonais segregados pela linha de células de hibridoma são purificados por técnicas convencionais. Os hibridomas ou os anticorpos monoclonais produzidos pelos mesmos podem ser ainda rastreados para identificar anticorpos monoclonais com propriedades particularmente desejáveis. A molécula de HAS ou parte imunogénica da mesma que pode ser utilizada para imunizar os animais nas fases iniciais da produção dos anticorpos da presente invenção pode ser de qualquer fonte de mamífero.

Os fragmentos de ligação a antigénio dos anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por técnicas convencionais. Os exemplos de tais fragmentos incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, incluindo, fragmentos Fv de cadeia simples (designados sFv ou scFv). Os fragmentos e derivados de anticorpo produzidos por técnicas de engenharia genética, tais como os fragmentos Fv estabilizados com dissulfureto (dsFv), as moléculas (Abs) do domínio da região variável de cadeia simples, os minicorpos e diacorpos também são considerados para serem utilizados de acordo com a presente invenção.

Tais fragmentos e derivados de "anticorpos monoclonais dirigidos contra moléculas de HAS podem ser preparados e rastreado em relação a propriedades desejadas, por técnicas conhecidas, incluindo os ensaios aqui descritos. Algumas das técnicas envolvem o isolamento do ADN que codifica uma cadeia polipeptídica (ou uma porção da mesma) de um mAb de interesse e manipulação do ADN através da tecnologia de ADN recombinante. 0 ADN pode ser fundido com outro ADN de 39 interesse, ou alterado (por exemplo, por mutagénese ou outras técnicas convencionais), por exemplo, para adicionar, suprimir ou substituir um ou mais resíduos de aminoácido. 0 ADN que codifica os polipéptidos de anticorpo (por exemplo, cadeia pesada ou leve, região variável apenas ou inteira) pode ser isolado a partir de células B de ratos que foram imunizados com moléculas de HAS. 0 ADN pode ser isolado utilizando procedimentos convencionais. A apresentação em fago é outro exemplo de uma técnica conhecida pela qual podem ser preparados derivados de anticorpos. Numa abordagem, os polipéptidos que são componentes de um anticorpo de interesse são expressados em qualquer sistema de expressão recombinante adequado e os polipéptidos expressados são deixados reunir-se para formar moléculas de anticorpo.

Os anticorpos de cadeia simples podem ser preparados ligando os fragmentos da região variável da cadeia pesada e leve (região Fv) através de uma ponte de aminoácidos (unidade de ligação peptídica curta), resultando numa única cadeia polipeptídica. Tais Fvs de cadeia simples (scFvs) têm sido preparados fundindo o ADN que codifica uma unidade de ligação peptídica entre os ADN que codificam os dois polipéptidos da região variável (VL e VH). Os fragmentos de anticorpo resultantes podem formar dímeros ou trimeros, dependendo do comprimento de uma unidade de ligação flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt et al., Protein Engineering 10: 423, 1997). As técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos de cadeia simples incluem aquelas descritas na Patente U.S. n° 4, 946, 778; Bird (Science 242: 423, 1988), Huston et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85: 5879, 1988) e Ward et al. (Nature 334: 544, 1989). Os anticorpos de cadeia simples 40 derivados de anticorpos aqui proporcionados são abrangidos pela presente invenção.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona fragmentos de anticorpo ou formas quiméricas, recombinantes ou sintéticas dos anticorpos da presente invenção que se ligam a uma HAS tal como HAS1, 2 e/ou 3, em que o anticorpo é especifico para uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 25 ou 26. São conhecidas técnicas para obter um anticorpo de uma subclasse ou isotipo diferente a partir de um anticorpo de interesse, isto é, troca de subclasse. Assim, por exemplo, os anticorpos monoclonais de IgGl ou IgG4 podem ser obtidos a partir de um anticorpo monoclonal de IgM, e vice versa. Tais técnicas permitem a preparação de novos anticorpos que possuem as propriedades de ligação a antigénio de um dado anticorpo (o anticorpo parental), mas exibem também propriedades biológicas associadas a um isotipo ou subclasse de anticorpo diferente a partir daquele do anticorpo parental. Podem ser utilizadas técnicas de ADN recombinante. Nesses procedimentos pode ser utilizado ADN clonado que codifica polipéptidos de anticorpo particulares, por exemplo ADN que codifica a região constante de um anticorpo do isotipo desejado. O processo de produção do monoclonal descrito acima pode ser utilizado em animais, por exemplo ratos, para produzir anticorpos monoclonais. Os anticorpos convencionais obtidos a partir desses animais, por exemplo anticorpos murideos, são conhecidos como sendo geralmente inadequados para administração em humanos, já que podem provocar uma resposta imunológica. Por conseguinte, tais anticorpos podem necessitar ser modificados a fim de proporcionar anticorpos adequados para administração em humanos. Os 41 processos para preparar anticorpos quiméricos e/ou humanizados são bem conhecidos na técnica e são descritos em mais pormenor abaixo.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos "quiméricos" em que o domínio variável da cadeia pesada e/ou leve é idêntico ou homóloqo às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie não humana (por exemplo, murídeo) , enquanto o resto da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de humanos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Pat. U.S. n° 4,816,567; e Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81:6851-6855, 1984).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murídeos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima proveniente da imunoglobulina não humana. Na maioria dos casos, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) em que as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do recetor são substituídas pelas CDRs correspondentes de uma espécie não humana (anticorpo dador) tais como rato, ratazana, coelho ou primata não humano, possuindo as propriedades desejadas, por exemplo especificidade e afinidade. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não estão presentes no anticorpo recetor ou no anticorpo dador.

Estas modificações são feitas para aperfeiçoar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos 42 um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões determinantes de complementaridade correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os residuos da região estrutural são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321:522,525, 1986; Reichmann et al., Nature 332:323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; Liu et al., Proc. Natl. Acad Sei. EUA 84; 3439, 1987; Larrick et al., Bio/Technology 7 934, 1989; e Winter e Harris, TIPS 14: 139, 1993.

As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um dado anticorpo podem ser facilmente identificadas, por exemplo utilizando o sistema descrito por Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicação NIH n° 91-3242, 1991).

Foram desenvolvidos procedimentos para gerar anticorpos humanos em animais não humanos e são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, ratos transgénicos em que foi introduzido material genético que codifica uma ou mais cadeias de imunoglobulina humana podem ser utilizados para produzir os anticorpos da presente invenção. Os anticorpos produzidos nos animais incorporam cadeias polipeptídicas de imunoglobulina humana codificadas pelo material genético humano introduzido no animal. Exemplos de técnicas para a produção e utilização de tais animais transgénicos são descritos nas Patentes US. n° 5,814,318, 5,569,825 e 5,545,806. 43

Outro método para gerar anticorpos humanos é a apresentação em fago. As técnicas de apresentação em fago para gerar anticorpos humanos são bem conhecidas dos especialistas na técnica e incluem os métodos utilizados por empresas tais como Cambridge Antibody Technology and MorphoSys, e os quais são descritos nas Publicações Internacionais de Patente n° WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213 e WO 93/11236.

Os compostos aqui descritos também podem ser aplicados nas áreas de descoberta de fármacos e validação de alvos. Os compostos e segmentos alvos preferidos aqui identificados podem ser utilizados em trabalhos de pesquisa de fármacos para elucidar relações que existem entre HA, HAS ou HA/HAS e HA, HIAL ou interação HA/HIAL e um estado patológico, fenótipo ou condição. Estes métodos incluem a deteção ou modulação de HAS e/ou HIAL compreendendo pôr em contacto uma amostra, tecido, célula ou organismo com os compostos aqui descritos, medir o nivel de ácido nucleico ou proteina de HAS e/ou HIAL e/ou de um critério fenotipico ou químico relacionado nalguma altura após tratamento e, opcionalmente, comparar o valor medido com uma amostra não tratada ou amostra tratada com um outro composto aqui descrito. Estes métodos podem ser também realizados em paralelo ou em combinação com outras experiências para determinar em seguida a função de genes desconhecidos para o processo de validação de alvo ou para determinar a validade de um produto de gene particular como um alvo para o tratamento ou prevenção de uma doença, condição ou fenótipo particular.

Os compostos aqui descritos podem ser utilizados como agentes terapêuticos para tratar indivíduos que sofrem de doenças e distúrbios associados a HA. Em particular a presente invenção proporciona um composto da invenção para 44 ser utilizado na redução do nivel e/ou atividade de HAS num individuo. Os indivíduos tratados utilizando as composições e compostos da presente invenção incluem qualquer animal que possa beneficiar desse tratamento. Estes incluem, sem limitação, humanos, saguis, orangotangos e gorilas, animais de criação (por exemplo vacas, ovelhas, porcos, cavalos, burros), animais de ensaio laboratorial (por exemplo ratos, ratazanas, porquinhos-da-índia, hamsters, coelhos), animais de companhia (por exemplo gatos, cães) e animais selvagens capturados (por exemplo roedores, raposas, veados, cangurus). Um hospedeiro particularmente preferido é um humano, primata ou animal de criação.

Os compostos aqui descritos podem ser utilizados para diagnóstico, terapêutica, profilaxia e como reagentes e kits de investigação. Além disso, os oligonucleótidos antimensageiros ou mensageiros ou anticorpos contra a HAS e/ou HIAL que são capazes de inibir a expressão de genes ou a atividade da HAS e/ou HIAL com especificidade atraente, são frequentemente utilizados pelos técnicos médios para elucidar a função de genes ou produtos de genes particulares ou para distinguir entre funções de vários membros de uma via biológica.

Para ser utilizado em kits e diagnóstico, os compostos aqui descritos, quer sozinhos ou em associação com outros compostos ou terapêuticas, podem ser utilizados como ferramentas em análises diferenciais e/ou combinatórias para elucidar padrões de expressão de uma porção ou o complemento total de genes expressados nas células e tecidos.

Como um exemplo não limitativo, os padrões de expressão nas células ou tecidos tratados com um ou mais compostos antimensageiros ou mensageiros são comparados com células 45 ou tecidos de controlo não tratados com compostos antimensageiros ou mensageiros e os padrões produzidos são analisados quanto aos niveis diferenciais de expressão de gene conforme eles pertencem, por exemplo, a associação de doença, via de sinalização, localização celular, nível de expressão, tamanho, estrutura ou função dos genes examinados. Noutro exemplo são realizadas experiências semelhantes com anticorpos contra a HAS. Estas análises podem ser realizadas em células estimuladas ou não estimuladas e na presença ou ausência de outros compostos que afetam os padrões de expressão.

Os exemplos de métodos de análise da expressão de genes conhecidos na técnica incluem matrizes ou micro matrizes de ADN (Brazma e Vilo, FEBS Lett, 480: 17-24, 2000; Celis et al., FEBS Lett. 480: 2-16, 2000), SAGE (análise em série da expressão de genes) (Madden et al., Drug Discov. Today 5: 415-425, 2000), READS (amplificação por enzima de restrição de ADNc digeridos) (Prashar e Weissman, Methods Enzymol. 303: 258-272, 1999), TOGA (análise da expressão total de genes) (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad Sei. EUA 97: 1976-1981, 2000), matrizes de proteína e proteómica (Celis et al. 2000, supra; Jungblut et al., Electrophoresis 20: 2100-2110, 1999), sequenciação por etiqueta de sequência expressada (EST) (Celis et al., 2000, supra; Larsson et al., J. Biotechnol. 80: 143-157, 2000), impressão digital de ARN subtrativo (SuRF) (Fuchs et al., Anal. Biochem. 286: 91-98, 2000; Larson et al., Cytometry 41: 203-208, 2000), clonagem subtrativa, apresentação diferencial (DD) (Jurecic e Belmont, Curr. Opin. Micrabiol. 3: 316-321, 2000), hibridização genómica comparativa (Carulli et al., J. Cell Biochem. Supl. 31: 286-296, 1998), técnicas FISH (hibridização in situ fluorescente) (Going e Gusterson, Eur. J. Câncer, 35: 1895-1904, 1999) e métodos de 46 espetrometria de massa (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 3: 235-241, 2000).

Os compostos aqui descritos são úteis para investigação e diagnóstico, porque estes compostos hibridizam com ácidos nucleicos que codificam a HAS ou HIAL ou ligam-se à própria HAS ou HIAL. Por exemplo, os oligonucleótidos que se demonstra que hibridizam com uma eficiência tal e sob condições tais como aqui divulgadas como sendo inibidores eficazes da HAS ou HIAL ou da expressão do gene da HAS ou HIAL serão também iniciadores ou sondas eficazes em condições que favorecem a amplificação ou deteção do gene, respetivamente. Estes iniciadores e sondas são úteis em métodos que requerem a deteção especifica de moléculas de ácido nucleico que codificam a HAS ou HIAL e na amplificação das referidas moléculas de ácido nucleico para deteção ou para serem utilizadas em outros estudos de HAS ou do seu gene. A hibridização dos oligonucleótidos antimensageiros ou mensageiros, particularmente os iniciadores e sondas, aqui descritos com um ácido nucleico que codifica a HAS ou HIAL pode ser detetada por meios conhecidos na técnica. Tais meios podem incluir conjugação de uma enzima com o oligonucleótido, radiomarcação do oligonucleótido ou qualquer outro meio de deteção adequado. Analogamente, os anticorpos podem ser marcados com moléculas repórter incluindo enzimas e etiquetas radioativas para fins de visualização, fins de diagnóstico ou fins quantitativos. Podem ser também preparados kits utilizando tais meios de deteção para detetar o nivel de HAS ou HIAL numa amostra. A especificidade e sensibilidade de compostos antimensageiros ou mensageiros ou anticorpos também são aproveitadas pelos especialistas na técnica para utilizações terapêuticas. Tais compostos têm sido 47 utilizados como unidades terapêuticas no tratamento de estados patológicos em animais, incluindo humanos.

Para terapêutica, um animal, preferencialmente um humano, suspeito de possuir uma doença ou distúrbio que pode ser tratado modulando a expressão do gene da HAS e/ou HIAL é tratado administrando os compostos antimensageiros ou mensageiros aqui descritos. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para inibir a atividade da HAS e/ou HIAL. Por exemplo, os métodos compreendem o passo de administrar, ao animal necessitado de tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da expressão do gene da HAS e/ou HIAL. Os inibidores expressão do gene da HAS ou HIAL inibem eficazmente atividade da proteína HAS e/ou HIAL ou inibem a expressão do gene de HAS e/ou HIAL. Numa forma de realização, a atividade ou expressão da HAS ou do seu gene num animal é inibida em cerca de 10%. Preferencialmente, a atividade ou expressão da HAS e/ou HIAL ou do seu gene num animal é inibida em cerca de 30%. Mais preferencialmente, a atividade ou expressão da HAS e/ou HIAL ou do seu gene num animal é inibida em 50% ou mais.

For exemplo, a redução da expressão do gene da HAS e/ou HIAL pode ser medida no soro, tecido adiposo, células cutâneas, fígado ou qualquer outro fluido corporal, tecido ou órgão do animal. Preferencialmente, as células contidas nos referidos fluidos, tecidos ou órgãos a serem analisados contêm uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína HAS e/ou HIAL.

São também proporcionados métodos de rastreio de compostos compreendendo, por exemplo, pôr em contacto um composto candidato com material genético que codifica a HAS e/ou HIAL incluindo ARNm ou a própria HAS ou HIAL. O 48 procedimento de rastreio inclui analisar (i) quanto à presença de um complexo entre o fármaco e HAS e/ou HIAL ou material genético que codifica a mesma ou (ii) quanto a uma alteração nos niveis de expressão das moléculas de ácido nucleico que codificam a HAS e/ou HIAL. As células inteiras podem ser também rastreadas quanto à interação entre a célula e o fármaco.

Uma forma de ensaio envolve ensaios de ligação competitiva. Nesses ensaios de ligação competitiva, o composto candidato ou HAS e/ou HIAL é tipicamente marcado. A HAS e/ou HIAL livre é separada de qualquer complexo putativo e a quantidade de etiqueta livre (isto é, não complexada) é uma medida da ligação do agente a ser testado à molécula alvo. Pode-se também medir a quantidade de ligado, em vez da HAS e/ou HIAL livre. Pode-se também marcar o composto em vez da HAS ou HIAL e medir a quantidade de composto que se liga a HAS ou HIAL na presença e na ausência do composto a ser ensaiado. Tais compostos podem inibir a HAS e/ou HIAL, o que é útil, por exemplo, na pesquisa de inibidores da expressão de gene, ou, alternativamente, podem potenciar a inibição de HAS e/ou HIAL.

Outro técnica para o rastreio de fármacos proporciona um rastreio de alto débito para compostos que têm afinidade de ligação adequada a um alvo e é descrita em pormenor em Geysen (Publicação Internacional de Patente n° WO 84/03564). Especificando resumidamente, um grande número de compostos peptidicos pequenos de ensaio diferentes é sintetizado num substrato sólido, tais como pinos plásticos ou alguma outra superfície. Os compostos peptidicos de ensaio são feitos reagir com HAS e/ou HIAL e lavados. As moléculas de HAS e/ou HIAL ligadas são em seguida detetadas por métodos bem conhecidos na técnica. Este método pode ser adaptado para a seleção de entidades químicas não 49 peptídicas. Isto alarga-se a abordagens combinatórias para a seleção de antagonistas ou agonistas de HAS e/ou HIAL. A HAS e/ou HIAL purificada pode ser revestida diretamente sobre placas para ser utilizada na técnica de rastreio de fármacos supramencionada. No entanto, também podem ser utilizados anticorpos não neutralizantes para o alvo para imobilizar o alvo na fase sólida.

Outro grupo útil de compostos é um mimético. Um mimético neste contexto refere-se a uma substância que tem alguma semelhança quimica com o substrato da HAS e/ou HIAL mas que antagoniza a atividade da HAS e/ou HIAL. Um mimético pode ser um hidrato de carbono ou péptido ou molécula quimica que mimetiza elementos da estrutura secundária (Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman e Hall, New York, 1993) . A fundamentação lógica subjacente por detrás da utilização de miméticos é que a estrutura central do substrato da HAS e/ou HIAL existe principalmente para orientar o substrato de forma a facilitar as interações moleculares com a HAS e HIAL. Um mimético é concebido para permitir interações moleculares semelhantes à molécula natural. Os miméticos peptidicos ou não peptidicos podem ser úteis, por exemplo, para inibir a atividade da HAS e/ou HIAL. A conceção de miméticos para um composto farmaceuticamente ativo é uma abordagem conhecida para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos com base num composto "líder". Isto pode ser desejável quando o composto ativo é difícil ou dispendioso de sintetizar ou quando é impróprio para um método de administração particular. A conceção, síntese e ensaio de miméticos são geralmente utilizados para evitar o rastreio aleatório de um grande número de moléculas em relação a uma propriedade desejada. 50

Existem vários passos que são geralmente dados na conceção de um mimético a partir de um composto que tem uma dada propriedade desejada. Em primeiro lugar são determinadas as partes particulares do composto que são criticas e/ou importantes na determinação da propriedade desejada. No caso de um péptido, isto pode ser feito variando sistematicamente os residuos de aminoácido no péptido, por exemplo substituindo um residuo de cada vez. Os varrimentos de alanina de péptidos são geralmente utilizados para aperfeiçoar tais motivos peptidicos. Estas partes ou residuos que constituem a região ativa do composto são conhecidos como o seu "farmacóforo".

Uma vez encontrado o farmacóforo, a sua estrutura é modelada de acordo com as suas propriedades fisicas, por exemplo estereoquimica, ligação, tamanho e/ou carga, utilizando dados a partir de uma gama de fontes, por exemplo técnicas espetroscópicas, dados de difração de raios X e RMN. A análise computacional, mapeamento de semelhança (que modela a carga e/ou volume de um farmacóforo, em vez da ligação entre átomos) e outras técnicas podem ser utilizadas neste processo de modelação.

Numa variante desta abordagem são modeladas a estrutura tridimensional do ligando e do seu parceiro de ligação. Isto pode ser especialmente útil quando o ligando e/ou parceiro de ligação alteram a conformação na ligação, permitindo que o modelo tenha isto em consideração na conceção do mimético. A modelação pode ser utilizada para gerar inibidores que interagem com a sequência linear ou uma configuração tridimensional.

Uma molécula molde é em seguida selecionada na qual podem ser enxertados grupos quimicos que mimetizam o farmacóforo. A molécula molde e os grupos quimicos enxertados na mesma 51 podem ser convenientemente selecionados de modo que o mimético é fácil de sintetizar, tem probabilidade de ser farmacologicamente aceitável e não se degrada in vivo, enquanto retém a atividade biológica do composto lider. Alternativamente, quando o mimético se baseia num péptido, pode ser conseguida estabilidade adicional ciclizando o péptido, aumentando a sua rigidez. 0 mimético ou miméticos encontrados por esta abordagem podem ser depois rastreados para ver de têm a propriedade alvo ou em que medida eles a exibem. Pode ser depois realizada otimização ou modificação adicional para chegar a um ou mais miméticos finais para avaliação in vivo ou clinica. 0 objetivo da conceção racional de fármacos é para produzir análogos estruturais de polipéptidos biologicamente ativos de interesse ou de moléculas pequenas com as quais eles interagem (por exemplo agonistas, antagonistas, inibidores ou intensificadores) a fim de modelar fármacos que são, por exemplo, formas mais ativas ou estáveis do polipéptido, ou que, por exemplo melhoram ou interferem com a função de um polipéptido in vivo. Ver, por exemplo Hodgson (Bio/Technology 9: 19-21, 1991). Numa abordagem, a estrutura tridimensional da HAS e/ou HIAL de interesse é determinada por cristalografia de raios X, por modelação computacional ou muito tipicamente, por uma combinação de abordagens. Informação útil relativamente à estrutura de um polipéptido pode ser também obtida por modelação com base na estrutura de proteínas homólogas. Um exemplo da conceção racional de fármacos é o desenvolvimento de inibidores da protease de HIV (Erickson et al., Science 249: 527-533, 1990) . Além disso, as moléculas alvo podem ser analisadas por um varrimento de alanina (Wells, Methods Enzymol. 202: 2699-2705, 1991). Nesta técnica, um resíduo de aminoácido é substituído por Ala e determinado o seu efeito na atividade 52 do péptido. Cada um dos resíduos de aminoácido do péptido é analisado deste modo para determinar as regiões importantes do péptido.

Pode-se também isolar um anticorpo específico contra HAS e/ou HIAL, selecionado por um ensaio funcional e em seguida resolver a sua estrutura cristalina. Em principio, esta abordagem produz um farmacóforo sobre o qual se pode basear uma conceção de fármacos subsequente. É possível contornar completamente a cristalografia de proteínas gerando anticorpos anti-idiotípicos (anti-ids) para um anticorpo funcional, farmacologicamente ativo. Como uma imagem no espelho de uma imagem no espelho, esperar-se-ia que o sítio de ligação do anti-ids seria um análogo do recetor original. 0 anti-id poderia ser depois utilizado para identificar e isolar péptidos a partir de bancos de péptidos produzidos química ou biologicamente. Os péptidos selecionados atuariam então como o farmacóforo. 0 rastreio de duplo híbrido é também útil na identificação de outros membros de uma via bioquímica ou genética associada a um alvo. 0 rastreio de duplo híbrido utiliza convenientemente Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pombe. As interações alvo e os rastreios para inibidores podem ser realizados utilizando o sistema de duplo híbrido de levedura, o qual tira partido de fatores transcricionais que são constituídos por dois domínios funcionais, fisicamente separáveis. 0 mais geralmente utilizado é o ativador transcricional GAL4 de levedura que consiste de um domínio de ligação de ADN e um domínio de ativação transcricional. São utilizados dois vetores de clonagem diferentes para gerar fusões separadas dos domínios GAL4 com os genes que codificam potenciais proteínas de ligação. As proteínas de fusão são co-expressadas, direcionadas para o núcleo e se ocorrerem interações, a ativação de um gene 53 repórter (por exemplo lacZ) produz um fenótipo detetável. No presente caso, por exemplo, a S. cerevisiae é co-transformada com uma biblioteca ou vetor que expressa uma fusão do dominio de ativação do ADNc de GAL4 e um vetor que expressa um gene alvo tal como, por exemplo, o gene da HAS ou HIAL fundido com GAL4. Se o lacZ for utilizado como o gene repórter, a co-expressão das proteínas de fusão produzirá uma cor azul. As moléculas pequenas ou outros compostos candidatos que interagem com um alvo resultarão na perda de cor das células. Pode ser feita referência aos sistemas de duplo hibrido de levedura como divulgados por Munder et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 52(3): 311-320, 1999) e Young et al., Nat. Biotechnol. 16(10): 946-950, 1998). As moléculas assim identificadas por este sistema são depois novamente testadas em células animais.

Como indicado acima, são aqui divulgados inibidores de molécula pequena identificados como descrito acima e que se ligam e inibem a atividade da HAS e/ou HIAL. É para ser entendido que, salvo indicação em contrário, a invenção objeto não se limita a formulações especificas de componentes, métodos de fabrico, regímenes de dosagem, protocolos de tratamento ou semelhantes, já que estes podem variar. É também para ser entendido que a terminologia aqui utilizada é apenas com a finalidade de descrever formas de realização particulares e não pretende ser limitativa.

Deve referir-se que, como utilizadas na presente especificação, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os aspetos plurais, a menos que o contexto determine claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "um composto" inclui um único composto, bem como dois ou mais compostos; a referência a "um anticorpo" 54 inclui um único anticorpo, bem como dois ou mais anticorpos; e assim por diante.

Os termos "composto", "agente ativo", "agente farmacologicamente ativo", "medicamento", "ativo" e "fármaco" são aqui utilizados indistintamente para referir um antagonista da função ou atividade da HAS e/ou HIAL ou da expressão do material genético que codifica a mesma, o qual induz um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado tal como, mas não se limitando a, controlo da inflamação e redução do crescimento de cancro. Os termos abrangem também um ingrediente farmaceuticamente aceitável e farmacologicamente ativo daqueles agentes ativos especificamente aqui mencionados incluindo, mas não se limitando a, sais, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos ativos, análogos e semelhantes. Quando os termos "composto", "agente ativo", "agente farmacologicamente ativo", "medicamento", "ativo" e "fármaco" são utilizados, então é para ser entendido que isto inclui o agente ativo per se bem como os sais, ésteres, amidas, profármacos, metabolitos, análogos farmaceuticamente aceitáveis, farmacologicamente ativos, etc. 0 termo "composto" não é para ser interpretado como um composto quimico apenas mas alarga-se ao ARN e ADN que codifica uma molécula LIF modificada.

Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" do composto como aqui utilizados significam uma quantidade suficiente do agente para proporcionar o efeito terapêutico ou fisiológico desejado tal como inibição da inflamação ou redução do crescimento ou propagação de células cancerosas. Por vezes efeitos indesejáveis, por exemplo efeitos secundários, manifestam-se juntamente com o efeito terapêutico desejado; assim, um praticante pondera os benefícios potenciais contra os 55 riscos potenciais para determinar o que é uma "quantidade eficaz" apropriada. A quantidade exata necessária variará de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade e estado geral do indivíduo, modo de administração e semelhantes. Assim, pode não ser possível especificar uma "quantidade eficaz" exata. No entanto, em qualquer caso particular pode ser determinada uma "quantidade eficaz" apropriada por um técnico médio na matéria utilizando apenas experimentação de rotina. As utilizações aqui divulgadas alargam-se a métodos de tratamento ou profilaxia.

Por transportador, excipiente ou diluente "farmaceuticamente aceitável" pretende-se referir um veículo farmacêutico constituído por um material que não é biologicamente, ou de outra forma, indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo juntamente com o agente ativo selecionado sem originar qualquer reação desfavorável ou uma reação desfavorável substancial. Os transportadores podem incluir excipientes e outros aditivos tais como diluentes, detergentes, corantes, humectantes ou emulsionantes, agentes tampão de pH, conservantes e semelhantes.

Analogamente, um sal, éster, amida, profármaco ou derivado "farmacologicamente aceitável" de um composto como aqui proporcionado é um sal, éster, amida, profármaco ou derivado que não é biologicamente, ou de outra forma, indesej ável.

Os termos "tratar" e "tratamento" como aqui utilizados referem-se à redução da gravidade e/ou frequência de sintomas de doenças ou distúrbios ou condições fisiológicas, eliminação de sintomas e/ou causa subjacente, prevenção da ocorrência de sintomas de doença e/ou sua 56 causa subjacente e melhoria ou remediação de condições associadas à atividade de citocinas. "Tratar" um doente pode envolver a prevenção do distúrbio ou condição patológica ou evento fisiológica num indivíduo suscetível bem como o tratamento de um indivíduo clinicamente sintomático inibindo uma doença ou distúrbio.

Por conseguinte, é também aqui divulgado uma composição terapêutica ou profilática compreendendo um composto capaz de reduzir os níveis ou atividade de HAS e/ou HIAL e, desse modo, reduzir os níveis de HA.

As composições e compostos da presente invenção podem ser utilizados no tratamento ou prevenção de doenças associadas a HA. A presente invenção considera o tratamento de doenças e distúrbios tais como A-Beta-Lipoproteinemia, A-V, Amiloidose A Beta-2 Microglobulina, A-T, A1AD, A1AT, síndrome de Aagenaes, síndrome de Aarskog, Síndrome de Aarskog-Scott, síndrome de Aase-smith, Síndrome de Aase, AAT, Síndrome de Abderhalden-Kaufmann-Lignac, Síndrome da Deficiência Muscular Abdominal, Defeito da Parede Abdominal, Epilepsia Abdominal, Enxaqueca Abdominal, Disfonia Espasmódica do Abdutor, Disfonia Espástica do Abdutor, Síndrome de Abercrombie, Síndrome de Ablepharon-Macrostomia, ABS, Ausência de HPRT, Ausência de Corpo Caloso de Tipo Schinzel, Defeito de Ausência de Membros, Couro Cabeludo e Crânio, Ausência de Preparação de Menstruação, Ausência de HGPRT, Hiperoxalúria Entérica Absortiva, Doença de Abt-Letterer-Siwe, ACADL, Deficiência de ACADM, ACADM, ACADS, Acantocitose-Distúrbio Neurológico, Acantocitose, Acantólise Bolhosa, Acantose Nigricans, Acantose Bolhosa, Acantose Nigricans Com Resistência à Insulina de Tipo A, Acantose Nigricans Com Resistência à Insulina de Tipo B, Nevo Acantótico, Acatalasemia, 57

Acatalasia, ACC, Vias Auriculoventriculares Acessórias, Vias Auriculoventriculares Acessórias, Acefalia, ACF com Defeitos Cardíacos, Acalásia, Síndrome de Achard-Thiers, ACHARD (variante de Marfan) , síndrome de Achard, Icterícia Acolúrica, Acondrogénese, Acondrogénese de Tipo IV, Acondrogénese de Tipo III, Acondroplasia, Acondroplasia Tarda, Nanismo Acondroplásico, Síndrome de Achoo, Acromatismo, Acromatose, Acromatópico, Acromatopsia, Nevos Acrómicos, Deficiência de Ceramidase Ácida, Deficiência de Maltase Ácida, Deficiência de Maltase Ácida, Deficiência de Beta-glucosidase Ácida, Acidemia Metilmalónica, Acidemia Propiónica, Acidemia com Ataxia Episódica e Fraqueza, Acidose, Aclasia Tarsoepifisária, ACM, Neurilemoma Acústico, Neuroma Acústico, ACPS com Hipoplasia da Perna, ACPS II, ACPS IV, ACPS III, Afasia Adquirida com Distúrbio Convulsivo, Síndrome de Brown Adquirida, Afasia Epiléptica Adquirida, Deficiência de Fator XIII Adquirida, Forma de ACC Adquirida (provocada por infeção enquanto ainda estava no ventre), Hiperoxalúria Adquirida, Hipogamaglobulinemia Adquirida, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), Excesso de Ferro Adquirido, Lipodistrofia Adquirida, Lipodistrofia Parcial Adquirida, Baço Flutuante Adquirido, ACR, Disostose Acral com Anormalidades Faciais e Genitais, Síndrome Acro-Renal, Síndrome Acrocalosal de Tipo Schinzel,

Acrocefalossindactilia, Acrocefalossindactilia Tipo I, Acrocefalossindactilia Tipo I Subtipo I, Acrocefalopolissindactilia Tipo II, Acrocefalopolissindactilia Tipo III,

Acrocefalopolissindactilia Tipo IV, Acrocefalossindactilia V (ACS5 ou ACS V) Subtipo I, Assimetria de Crânio Acrocefálica e Sindactilia Ligeira, Acrocefalia, Acrocondro-hiperplasia, Acrodermatite Enteropática, Acrodisostose, Neuropatia Acrodistrófica, Neuropatia Acrodistrófica, Disostose Acrofacial de Tipo Nager, Disostose Acrofacial de Tipo Nager, Disostose Acrofacial de 58

Tipo Pós-axial, Disostose Acrofacial de Tipo Genee-Wiedep, Acrogeria Familiar, Acromegalia, Acromelalgia Hereditária, Displasia Acromesomélica, Nanismo Acromesomélico, Displasia Esquelética Acromicrica, Displasia Acromicrica, Acro-osteólise com Osteoporose e Alterações no Crânio e Maxilar Inferior, Acro-osteólise, Acroparestesia, ACS I, ACS Tipo II, ACS Tipo III, ACS, ACS3, Deficiência de ACTH, Mioclonia de Ação, Sindrome de Nevrite Braquial Aguda, Sindrome de Radiculite Braquial Aguda, Doença Cerebral de Gaucher Aguda, Colangite Aguda, Encefalomielorradiculopatia Disseminada Aguda, Histiocitose-X Disseminada Aguda, Polioencefalite Hemorrágica Aguda, Polinevrite Idiopática Aguda, Polinevrite de Imunomediação Aguda, Esclerose Cerebral de Pelizaeus-Merzbacher Infantil Aguda, Porfiria Intermitente Aguda, Porfirias Agudas, Sarcoidose Aguda,

Nevrite Aguda no Ombro, Epidermólise Tóxica Aguda, Deficiência da Cadeia Longa da Acil-CoA Desidrogenase, Deficiência da Cadeia Curta da Acil-CoA Desidrogenase,

Acil-CoA Di-hidroxiacetona Aciltransferase, Deficiência de Acil-coenzima A Oxidase, ADA, Deficiência de ADA, Complexo de Adão, Sindrome de Adamantiades-Behcet, Adamantinoma, Sindrome de Adams Oliver, Colite da Adaptação, ADD de tipo combinado, ADD, Doença de Addison com Esclerose Cerebral, Anemia de Addison, Anemia de Addison, doença de Addison, doença de Addison, doença de Addison, Anemia de Addison-Biermer, Anemia de Addison-Biermer, Doença de Addison-Schilder, Anemia Perniciosa Addisoniana, Anemia Perniciosa Addisoniana, Polegares Aduzidos-Atraso Mental, Disfonia Espasmódica Aduzida, Disfonia Espástica Aduzida, Virilismo Associado a Adenoma de Mulheres Idosas, Adenomatose do Cólon e Recto, Polipose Adenomatosa do Cólon, Polipose Adenomatosa Familiar, Deficiência de Adenosina Desaminase, Deficiência de Adenosina Desaminase, Deficiência de Adenilossuccinase, ADHD predominantemente de tipo hiperativa-impulsiva, ADHD predominantemente de tipo 59 desatenta, ADHD, Aracnoidite Adsesiva, Síndrome de Adie, Síndrome de Adie, Pupila Tónica de Adie, Pupila de Adie, Polidactilia Retinite Pigmentosa Adipogenital, Síndrome Adipogenital-Retinite Pigmentosa, Adiposia Dolorosa, Adipose Dolorosa, Distrofia Adiposogenital, Cistinose Adolescente, ADPKD, Adenoma do Córtex Supra-renal, Doença Supra-renal, Hiperfunção Supra-renal resultante de Excesso de ACTH Pituitária, Hipoplasia Supra-renal, Insuficiência Supra-renal, Neoplasma Supra-renal, Virilismo Supra-renal, Virilismo Supra-renal, Síndrome de Adreno-Retinite Pigmentosa-Polidactilia, Insuficiência Adrenocortical, Hipofunção Adrenocortical, Deficiência Isolada de Hormona Adrenocorticotrópica, Síndrome Síndrome Adrenogenital, Adrenogenital, Adrenoleucodistrofia, Adrenomieloneuropatia, Síndrome de Adreno-Retinite Pigmeritosa-Polidactilia, Cistinose do Adulto, Dermatomiosite do Adulto, Hipofosfatasia do Adulto, Degenerescência da Mácula Lutea da Retina do Adulto, ALD de Início no Adulto, Coroidose de Início no Adulto, Doença Medular Quística de Início no Adulto, Anemia Perniciosa de Início no Adulto, Anemia Perniciosa de Início no Adulto, Doença de Schindler de Início no Adulto, Encefalomielopatia Necrosante Subaguda de Início no Adulto, Anemia Perniciosa de Início no Adulto, Doença Renal Poliquística do Adulto, Doença Medular Quística de Início no Adulto, Deficiência de Adenilossuccinato Liase, AE, Síndrome de AEC, AFD, AFD, Afibrinogenemia, Siderose Africana, AGA, Megacólon Agangliónico, Degenerescência Macular Relacionada com a Idade, Agenesia da Comissura Cerebral Magna, Agenesia do Corpo Caloso, Agenesia do Corpo Caloso-Espasmos Infantis-Anomalias Oculares, Agenesia do Corpo Caloso e Anormalidade Coriorretiniana, Agenesia do Corpo Caloso-Anormalidade Coriorretinite, Mastocitose Agressiva, Agnosia Primária, Tríade AGR, AGU, Agiria, Espetro da banda Agiria-paquigiria, AHC, AHD, AHDS, Deficiência de AHF, Deficiência 60 de AHG, AHO, Síndrome de Ahumada Del Castillo, Síndrome de Aicardi, Síndrome de Aicardi, AIED, AIMP, AIP, AIS, AIS, Ataque Apopléctico Acinético, Porfiria de ALA-D, Alactasia, Alactasia, Síndrome de Alagille, Doença Ocular da Ilha de Aland (Relacionado com X), Alaninuria, Doença de Albers-Schonberg, Albinismo, Albinismo, Albinismo, Albinoidismo, Osteodistrofia Hereditária de Albright, Alcaptonuria, Alcaptonuria, Defeitos do Parto Relacionados com Álcool, Embriopatia Alcoólica, Aid, ALD, ALD, Aldosterona, Aldosteronismo Com Tensão Arterial Normal, Síndrome de Aldrich, Doença de Alexander, Doença de Alexander, Algodistrofia, Algoneurodistrofia, Alcaptonuria, Ocronose Alcaptonúrica, Deficiência de Alquil DHAP sintase, Síndrome de Allan-Herndon-Dudley, Síndrome de Allan-Herndon, Atraso Mental de Allan-Herndon-Dudley, Artrite Granulomatosa Alérgica, Angeíte Granulomatosa Alérgica de Cronkhite-Canada, Holoprosencefalia Alobar, Alopecia Areata, Alopecia Areata, Alopecia Celsi, Alopecia Cicatrisata, Alopecia Circunscrita, Alopecia-Poliose-Uveíte-Vitiligo-Surdez-Cutâneo-Úveo-O, Alopecia Semiuniversalis, Alopecia Totalis, Alopecia Universalis, Doença de Alpers, Doença de Alpers, Degenerescência Difusa de Alpers da Matéria Cerebral Cinzenta com Cirrose Hepática, Poliodistrofia Infantil Progressiva de Alpers, Deficiência de Alfa-l-Antitripsina, Deficiência de Alfa-1 4 Glucosidase, Deficiência de Alfa-1 4 Glucosidase, Deficiência de Alfa-Galactosidase A, Deficiência de Alfa-Galactosidase B, Deficiência de Alfa-1 4 Glucosidase, Deficiência de Lipoproteína Alfa de Alta Densidade, Deficiência de Alfa-L-Fucosidase Fucosidose de Tipo 3, Deficiência de Alfa-GalNAc de Tipo Schindler, Deficiência de Alfa-1 4 Glucosidase, Deficiência de Alfa-L-Fucosidase Fucosidose de Tipo 3, Alfalipoproteinemia, Alfa Manosidose, Deficiência de Alfa-N-Acetilgalactosaminidase de Tipo Schindler, Deficiência de Alfa-NAGA de Tipo Schindler, Deficiência de Alfa-Neuraminidase, Síndrome de 61

Alfa-Talassemia/atraso mental de tipo não supressivo, Alfalipoproteinemia, Sindrome de Alport, ALS, Sindrome de Alstroem, Alstroem, Sindrome de Alstrom, Sindrome de Hemiplegia Alterna, Hemiplegia Alterna da Infância, Doença de Alzheimer, Idiotia Amaurótica Familiar, Idiotia Amaurótica Familiar, Idiotia Amaurótica Familiar do Adulto, Idiotia Amaurótica Familiar Infantil, Idiotia Amaurótica Familiar Juvenil, Genitais Ambíguos, AMC, AMD, Ameloblastoma, Amelogénese Imperfeita, Amenorreia-Galactorreia Não Puerperal, Sindrome de Amenorreia-Galactorreia-Diminuição de FSH, Amenorreia, Distúrbios de Aminoácidos, Sindrome de Aminoaciduria-Osteomalacia-Hiperfosfaturia, AMN, AMN, Amniocentese, Amniocentese, Bandas Amnióticas, Sindrome da Banda Amniótica, Complexo de Rutura da Banda Amniótica, Sequência de Banda Amniótica, Sequência de Rutura Amniótica, Amputação Congénita, AMS, Sindrome de Lange do Anão de Amesterdão, Deficiência de Amilo-1 6-Glucosidase, Artropatia Amiloide de Hemodiálise Crónica, Distrofia Amiloide da Córnea, Polineuropatia Amiloide, Amiloidose, Amiloidose da Febre Mediterrânica Familiar, Amilopectinose, Amioplasia Congénita, Esclerose Lateral Amiotrófica, Esclerose Lateral Amiotrófica, Esclerose Lateral Amiotrófica-Corpos de Poliglucosano, AN, AN 1, AN 2, Atresia Anal, Membrana Anal, Malformações Anais Retais, Malformações Ano-Retais, Estenose Anal, Amiloidose Analina 60, Analfalipoproteinemia, Anorretal, Anorretal, Anorretal, Astrocitoma Anaplástico, Doença de Andersen, Doença de Anderson-Fabry, Glicogenose de Andersen, Sindrome de Anderson-Warburg, Sindrome de Andre, Sindrome de Andre de Tipo II, Insensibilidade a Androgénios, Sindrome da Insensibilidade Parcial a Androgénios, Sindrome da Insensibilidade a Androgénios, Sindrome da Insensibilidade Parcial a Androgénios, Esteróides Androgénicos, Anemia Auto-imune Hemolítica, Anemia de Blackfan-Diamond, Anemia, Congénita, Sindrome do Polegar Trifalangeano, Anemia 62

Hemolitica de Anticorpo Frio, Anemia Hemolitica de Anticorpo Frio, Anemia Hemolitica com Deficiência de PGK, Anemia Perniciosa, Anencefalia, Sindrome de Angelman, Sindrome de Ângio-Ósteo-hipertrofia, Hiperplasia do Gânglio Linfático Angiofolicular, Angio-hemofilia, Angioqueratoma de Corpo, Angioqueratoma de Corpo Difuso, Angioqueratoma Difuso, Angiotomatose da Retina, Linfoide Angiomatoso, Edema Angioneurótico Hereditário, Displasia Ectodérmica Anidrótica, Displasias Ectodérmicas Relacionadas com X Anidróticas, Aniridia, Aniridia-Genitais Ambiguos-Atraso Mental, Aniridia Associada a Atraso Mental, Aniridia-Ataxia Cerebelosa-Deficiência Mental, Aniridia Parcial-Ataxia Cerebelosa-Atraso Mental, Aniridia Parcial-Ataxia Cerebelosa-Oligofrenia, Aniridia de Tipo I, Aniridia de Tipo II, Associação de Aniridia-Tumor de Wilms, Aniridia-Tumor de Wilms-Gonadoblastoma, Ancilobléfaro-Defeitos Ectodérmicos-Lábio Leporino/Fenda Palatina, Espondilite Anquilosante, Espondilite Anquilosante, Ranhuras anulares, Anodontia, Anodontia, Anodontia Vera, Tricromassia Anómala, Displasia Anómala da Dentina, Displasia da Dentina Frontal, Afasia Anómica, Anoftalmia, Anorretal, Malformações Anorretais, Anosmia, Inclinação Anterior das Pernas com Nanismo, Distrofia da Membrana Cornenana Anterior, Sindrome Anti-Convulsivante, Deficiência de Anticorpo Anti-Antigénio Nuclear do Vírus de Epstein-Barr (EBNA), Deficiência de Anticorpo, Deficiência de Anticorpo com Imunoglobulinas quase normais, Deficiência do Fator Anti-hemofílico, Deficiência de Globulina Anti-hemofílica, Sindrome Antifosfolípido, Sindrome Antifosfolípido, Sindrome do Anticorpo Antifosfolípido, Deficiência de Antitrombina III, Deficiência Clássica de Antitrombina III (Tipo I), Deficiência de Antitripsina, Sindrome de Antley-Bixler, Paralisia de Antoni, Anxietas Tibiais, Sindrome do Arco da Aorta, Atresia Aórtica e Mitral com Sindrome de Coração Esquerdo Hipoplásico, Estenose Aórtica, Estenose Aórtica, 63

Aparosquise, APC, Síndrome de APECED, Síndrome de Apert, Aperts, Afasia, Aplasia Axial Extracortical Congénita, Aplasia Congénita da Derme, Aplasia Congénita da Derme com Defeitos do Membro Transverso Terminal, Anemia Aplástica, Anemia Aplástica com Anomalias Congénitas, APLS, Apneia, Amiloidose de Tipo Appalachiana, Sindrome da Casca de Maçã, Apraxia, Apraxia, Apraxia Bucofacial, Apraxia Construcional, Apraxia Ideacional, Apraxia Ideocinética, Apraxia Ideomotriz, Apraxia Motriz, Apraxia Oculomotriz, APS, Aracnoidite, Aracnodactilia Contratural de Tipo Beals, Aracnodactilia, Quistos Aracnóides, Aracnoidite Ossificans, Aracnoidite, Aran-Duchenne, Atrofia Muscular de Aran-Duchenne, Anemia Aregenerativa, Deficiência de Arginase, Argininamia, Deficiência de Arginino Succinase, Deficiência de Argininossuccinase, Deficiência Argininossuccinato Liase, Liase de Ácido Argininossuccinico-ASL, Deficiência de Ácido Argininossuccinico Sintetase, Aciduria Argininossuccinica, Sindrome de Argonz-Del Castillo, Holoprosencefalia, Sindrome Armeniana, Malformação de Arnold-Chiari, Sindrome de Arnold-Chiari, ARPKD, Mioclonia Arritmica, Displasia Ventricular Direita Arritmogénica, Displasia Artgerial Hepática, Malformação Arteriovenosa, Malformação Arteriovenosa, Malformação Arteriovenosa do Cérebro, Arterite de Células Gigantes, Artrite, Artrite Uretritica, Artro-Dento-Osteodisplasia, Artro-Oftalmopatia, Sindrome de Ehlers-Danlos, Artrogripose Multiplex Congénita, Artrogripose Multiplex Congénita, Distai, Tipo IIA, ARVD, Deficiência de Arilsulfatase-B, AS, AS, AS, AS, Deficiência de ASA; Paralisia Ascendente, ASD, Defeitos Auriculo-septais, ASH, Sindrome de Ashermans, Amiloidose de Tipo Ashkenazi, Deficiência de ASL, Aspartilglucosaminuria, Aspartilglicosaminuria, Sindrome de Asperger, Autismo de Tipo Asperger, Displasia Torácica Asfixiante, Sindrome de Asplenia, Deficiência de ASS, Asma, Astrocitoma de Grau I (Benigna), Astrocitoma de Grau II (Benigna), Fácies de 64

Choro Assimétricas com Defeitos Cardíacos, Hipertrofia septal assimétrica, Agenesia Calosa Assintomática, AT, Deficiência de AT III, AT III Variante IA, AT III Variante Ib, AT 3, Ataxia, Telangiectasia Atáxica, Telangiectasia Atáxica, Ataxia com Acidose Láctica de Tipo II, Paralisia Cerebral Atáxica, Ataxia Dinâmica, Ataxiofenia, ATD, Paralisia Cerebral Atetoide, Eczema Atópico, Atresia do Esófago com ou sem Fistula Traqueoesofágica, Defeitos do Septo Auricular, Defeito do Septo Primum Auricular, Defeito Auricular e Septal e Septal Ventricular Pequeno, Flutuação Auricular, Fibrilação Auricular, Displasia auriculoidigital, Defeitos Auriculo-septais, Bloqueio Auriculoventricular, Defeito do Canal Auriculoventricular, Defeito do Septo Auriculoventricular, Defeito do Septo Auriculoventricular, Sindrome de Norrie, Beriberi Atrófica, Atrofia Olivopontocerebelosa, Distúrbio de Défice de Atenção, Distúrbio de Hiperatividade com Défice de Atenção, Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada, Amiloidose Atípica, Hiperfenilalaninamia Atípica, Atípica Hiperfenilalaninamia, Atresia do Canal Auditivo, Sindrome Auriculotemporal, Autismo, Autismo Tipo Asperger, Ataxia da Demência de Autismo e Perda de Utilização Intencional da Mão, Autismo, Autismo Infantil, Doença Auto-imune de Addison, Anemia Hemolítica Auto-imune, Anemia Hemolítica Auto-imune, Anemia Hemolítica auto-imune, Anemia Hemolítica auto-imune, Hepatite Auto-imune, Auto-imune-Poliendocrinopatia-Candidiase, Doença Poliglandular Auto-imune de Tipo I, Albinismo Autossómico Dominante, Sindrome de Acesso Helio-oftálmico Irresistível Autossómico Dominante, Miopatia Distai da Desmina Autossómica Dominante de Início Tardio, EDS Autossómica Dominante, Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss Autossómica Dominante, Ceratocone Autossómico Dominante, Esclerose Cerebral de Pelizaeus-Merzbacher Autossómica Dominante, Doença Renal Poliquística Autossómica Dominante, Degenerescência Espinocerebelosa 65

Autossómica Dominante, Agamaglobulinemia Autossómica Recessiva, Miopatia Centronuclear Autossómica Recessiva, Sindrome de Conradi-Hunermann Autossómica Recessiva, EDS Autossómica Recessiva, Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss Autossómica Recessiva, Formas Autossómicas Recessivas de Albinismo Ocular, Património Genético Autossómico Recessivo, Agenesia do Corpo Caloso, Ceratocone Autossómico Recessivo, Doença Renal Poliquistica Autossómica Recessiva, Imunodeficiência Autossómica Recessiva Combinada Grave, AV, AV, AVM, AVSD, AWTA, Abcesso da Axila, Neuropatia Gigante Axónica, Doença Neurológica Açoreana, Sindrome de B-K Mole, Sindrome de Babinski-Froelich, BADS, Sindrome de Baillarger, Doença de Balcan, Sindrome de Baller-Gerold, Prolapso da Válvula Mitral, Doença de Balo, Esclerose Concêntrica, Epilepsia Mioclónica Báltica, sindrome de Bannayan-Zonana (BZS), sindrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba, Doença de Banti, Sindrome de Bardet-Biedl, Sindrome de Linfócitos Nus, sindrome de Barlow, Doença de Barraquer-Simons, Esófago de Barrett, Úlcera de Barrett, Sindrome de Barth, sindrome de Barth, sindrome de Bartter, Sindrome do Nevo Basocelular, Doença de Basedow, Sindrome de Bassen-Kornzweig, Doença de Batten, Sindrome de Batten-Mayou, Doença de Batten-Spielmeyer-Vogt, Sindrome de Batten Turner, Miopatia de Batten Turner de Tipo Congénita, Sindrome de Batten-Vogt, Sindrome BBB, Sindrome BBB (Opitz), Sindrome BBB, Sindrome BBBG, Deficiência de BCKD, BD, BDLS, BE, Sindrome de Beals, Sindrome de Beals, Sindrome de Beals-Hecht, Sindrome de Bean, BEB, BEB, Sindrome de Bechterew, Doença de Becker, Distrofia Muscular de Becker, Distrofia Muscular de Becker, Nevo de Becker, Sindrome de Beckwith Wiedemann, Sindrome de Beckwith, Sindrome de Begnez-Cesar, sindrome de Behcet, doença de Behcet, doença de Behcet, Behr 1, Behr 2, Paralisia de Bell, Acantose Nigricans Benigna, Astrocitoma Benigno, Tumores Benignos do Nervo Craniano, Cistinose Benigna, 66

Blefarospasmo Essencial Benigno, Tremor Essencial Benigno, Hematúria Familiar Benigna, Amiotrofia Focal Benigna, Amiotrofia Focal Benigna de ALS, Hidrocéfalo Benigno, Sindrome de Hipermobilidade Benigna, Queratose Nigricans Benigna, Peritonite Paroxistica Benigna, Hematúria Recorrente Benigna, Colestase Intra-hepática Recorrente Benigna, Atrofia Muscular Espinhal Benigna com Hipertrofia de Calves, Lipomatose Simétrica Benigna, Tumores Benignos do Sistema Nervoso Central, Sindrome de Berardinelli-Seip, Doença de Berger, Beriberi, Sindrome de Berman, Sindrome de Bernard-Horner, Sindrome de Bernard-Soulier, Prurigo de Besnier, Doença de Best, Beta-Alanina-Piruvato Aminotransferase, Sindrome de Morquio de Deficiência de Beta-Galactosidase, Deficiência de Beta-Glucuronidase, Defeitos de Beta Oxidação, Defeitos de Beta-oxidação, Beta Talassemia Principal, Beta Talassemia Secundária, Deficiência de Betalipoproteína, Miopatia de Bethlem, Sindrome de Beuren, Deficiência de BH4, Deficiência de BH4, Distrofia Cornenana de Biber-Haab-Dimmer, Válvula Aórtica Bicúspide, Válvula Aórtica Bicúspide, Biedl-Bardet, Crânio Bífido, Deficiência de Enzima Bifuncional, Neurofibromatose Acústica Bilateral, Neuroma Acústico Bilateral, Sequência de Unilateralidade Direira Bilateral, Agenesia Renal Bilateral, Distúrbio Bilateral do Lobo Temporal, Ataques Biliosos, Deficiência de Bilirrubina Glucuronosiltransferase de Tipo I, Sindrome Aglutinante, Doença de Binswanger, Encefalopatia de Binswanger, Deficiência de Biotinidase, Nanismo de Cabeça de Pássaro de Tipo Seckel, Defeitos de Nascimento, Sinal de Nascença, Sindrome das Marcas Bitemporais de Fórceps, Fibrose Biventricular, Sindrome de Bjornstad, Sindrome de B-K Mole, Black Locks-Albinismo-Surdez de Tipo Neurossensorial (BADS), Anemia de Blackfan-Diamond, Artrite Idiopática Blenorrágica, Blefarofimose, Ptose, Sindrome de Epicanto Inverso, Blefarospasmo, Blefarospasmo, Blefarospasmo 67

Essencial Benigno, Distonia Oromandibular de Blefarospasmo, Quistos de Blessig, BLFS, Cegueira, Incontinência de Bloch-Siemens, Melanoblastose Pigmentar Linear da Derme, Sindrome de Bloch-Siemens-Sulzberger, Sindrome de Bloch-Sulzberger, Tipos de Sangue, Sangue tipo A, Sangue tipo B, Sangue tipo AB, Sangue tipo 0, Sindrome de Bloom, Sindrome de Bloom-Torre-Mackacek, Nevo de Borbulha de Borracha Azul, Bebé Azul, Sindrome Azul da Fralda, BMD, BOD, BOFS, Tumor Ósseo-Polipose Quistica Epidermoide, Sindrome de Bonnet-Dechaume-Blanc, Sindrome de Bonnevie-Ulrich, Sindrome de Book, Sindrome de BOR, BORJ, Sindrome de Borjeson, Sindrome de Borjeson-Forssman-Lehmann, Sindrome de Bowen, Sindrome de Bowen-Conradi, Huterite de Bowen-Conradi, Sindrome de Bowen-Conradi Tipo Huterite, Camada de Bowman, ΒΡΕΙ, BPES, Nevrite Braquial, Sindrome da Nevrite Braquial, Nevrite do Plexo braquial, Neuropatia Braquial-Plexo, Isquemia Braquicefálica, Sindrome de Brachmann-de Lange, Braquicefalia, Braquicefalia, Braquimorfo de Tipo Congénito, Bradicardia, Tumores Cerebrais, Tumores Cerebrais Benignos, Tumores Cerebrais Malignos, Deficiência de Alfa-Cetoácido Desidrogenase da Cadeia Ramificada, Cetonúria I da Cadeia Ramificada, Deficiência de Brancher, Sindrome Brânquio-Óculo-Facial, Displasia Brânquio-Oto-Renal, Sindrome Brânquio-Oto-Renal, Sindrome Brânquio-Óculo-Facial, Sindrome Branquiótica, Sindrome de Brandt, Dentinogénese Imperfeita tipo Brandywine, Dentinogénese Imperfeita tipo Brandywine, Cancro da Mama, Sindrome de BRIC, Doença dos Ossos Frágeis, Doença Beta Larga, Sindrome do Polegar Extenso, Fácies Caracteristicas de Polegares Extensos e Dedos dos Pés Grandes e Atraso Mental, Polegar Extenso-Hallux, Afasia de Broca, Doença de Brocq-Duhring, Diabetes de Bronze, Doença de Bronze Schilder, Albinismo de Brown, Esmalte Hereditário de Brown, Sindrome de Brown-Sequard, Sindrome de Brown, BRRS, Sindrome de Brueghel, Agamaglobulinemia Comum de Bruton, BS, BSS, Sindrome de 68

Buchanan, Síndrome de Budd, Síndrome de Budd-Chiari, Síndrome de Buerger-Gruetz, Atrofia Muscular Bulboespinal Relacionada com X, Síndrome de Bulldog, Bolhosa Hereditária, CIE Bolhosa, CIE Bolhosa, Eritroderma Ictiosiforme Congénito Bolhoso, Ictiose Bolhosa, Penfigoide Bolhoso, Linfoma de Burkitt, Linfoma de Burkitt de Tipo Africano, Linfoma de Burkitt de Tipo não africano, BWS, Doença de Biler, Síndrome C, Angioedema de Tipo II da Disfunção do Inibidor da Esterase Cl, Cl-INH, Angioedema de Tipo I da Disfunção do Inibidor da Esterase Cl, C1NH, Doença de Cacchi-Ricci, CAD, CADASIL, CAH, CAH, Valgo Calcâneo, Calcaneovalgo, Depósitos de Pirofosfato de cálcio Di-hidratado, Agenesia Calosa e Anormalidades Oculares, Hipertrofia de Calves de Atrofia Muscular Espinhal, Displasia Campomélica, Nanismo Campomélico, Síndrome Campomélica, Camptodactilia-Fenda Palatina-Pé Torto, Camptodactilia-Saída Limitada do Maxilar Inferior, Nanismo Camptomélico, Síndrome Camptomélica, Síndrome Camptomélica do Tipo Membro Comprido, Doença de Camurati-Engelmann, Doença de Camurati-Engelmann, Doença de Canada-Cronkhite, Doença de Canavan, Doença de Canavan Inclusa, Leucodistrofia de Canavan, Cancro, Síndrome de Cancro Familiar de Tipo Lynch, Síndrome de Cantrell, Síndrome de Cantrell-Haller-Ravich, Pentalogia de Cantrell, Deficiência de Carbamilo Fosfato Sintetase, Síndrome Glicoproteína Deficiente em Hidratos de Carbono, Síndrome Glicoproteína Deficiente em Hidratos de Carbono de Tipo Ia, Hiperlipemia Induzida por Hidratos de carbono, Intolerância a Hidratos de carbono da Glucose Galactose, Acidose de Dióxido de Carbono, Deficiência Múltipla de Carboxilase, Síndrome de Membro Cardíaco, Síndrome Cardio-auditiva, Síndrome Cardioauditiva de Jervell e Lange-Nielsen, Síndrome Cardiocutânea, Síndrome Cardio-facial-cutâneo, Síndrome Cardiofacial de Tipo Cailer, Cardiomegalia Glicogénica Difusa, Cardiomegalia Glicogénica Difusa, Lentiginose 69

Cardiomiopática, Cardiomiopatia, Cardiomiopatia, Cardiomiopatia Associada a Miopatia de Acumulação da Desmina, Cardiomiopatia Devido a Defeito de Desmina, Sindrome de Cardiomiopatia-Neutropenia, Sindrome de Cardiomiopatia-Neutropenia, Sindrome de Cardiomiopatia-Neutropenia Cardiomiopatia Infantil Letal, Amiloidose Cardiopática, Cardioespasmo, Sindrome Cardocardiaca, Deficiência de Carnitina-Acilcarnitina Translocase, Deficiência e Distúrbios de Carnitina, Deficiência Primária de Carnitina, Deficiência Secundária de Carnitina, Deficiência Secundária de Carnitina a Deficiência de MCAD, Sindrome de Deficiência de Carnitina, Carnitina Palmitoilo Transferase I & II (CPT I & II), Deficiência de Carnitina Palmitoiltransferase, Deficiência de Carnitina Palmitoiltransferase de Tipo 1, forma muscular clássica benigna da Deficiência de Carnitina Palmitoiltransferase de Tipo 2 incluido a forma infantil grave incluido, Defeito do Transporte de Carnitina (Deficiência Primária de Carnitina), Deficiência de Carnosinase, Carnosinemia, Doença de Caroli, sindrome de Carpenter, Carpenter, Hipoplasia da Cartilagem-Cabelo, Hipoplasia da Cartilagem-Cabelo, Doença de Castleman, Doença de Castleman do Tipo

Hialina Vascular, Doença de Castleman do Tipo Plasma de Células, Tumor de Castleman, Sindrome do Olho de Gato, Sindrome do Choro de Gato, deficiência de Catalaise,

Sindrome Catarata-Dentária, Catarata Relacionada com X com Dentes Hutchinsonianos, Hormonas de Catecolamina, Sindrome de Catel-Manzke, Sindrome Palatodigital de Tipo Catel-Manzke, Displasia Caudal, Sequência de Displasia Caudal, Sindrome de Regressão Caudal, Sindrome de Causalgia Principal, Cavernomas, Angioma Cavernoso, Hemangioma Cavernoso, Linfangioma Cavernoso, Malformações Cavernosas, Sindrome de Cailer, Vitiligo de Cazenave, CBGD, CBGD, CBPS, CBPS, CCA, CCD, CCD, CCHS, Sindrome de CCM, CCMS, CCO, CD, CDGla, CDG1A, CDGS Tipo Ia, CDGS Tipo Ia, CDGS, CDI, CdLS, 70

Doença Celíaca, Psilose Celíaca, Psilose Celíaca-Dermatite, Imunodeficiência Celular com Deficiência de Fosforilase de Nucleósidos de Purina, Vitiligo de Celsus, Apneia Central, Doença do Núcleo Central, Doença do Núcleo Central, Diabetes Insípida Central, Neurofibromatose de Forma Central, Hipoventilação Central, Apneia do Sono Central, Lipodistrofia Centrífuga, Miopatia Centronuclear, CEP, Cefalocele, Lipodistrofia Cefalotorácica, Deficiência de Ceramida Tri-hexosidase, Agenesia Cerebelosa, Cerebelosa Aplasia, Hemiagenesia Cerebelosa, Hipoplasia Cerebelosa, Aplasia do Vérmis Cerebeloso, Agenesia do Vérmis Cerebeloso-Hiperneia-Movimentos Episódicos do Olho-Ataxia-Atraso, Síndrome Cerebelosa, Distúrbio Cerebelosoparenquimal IV, Síndrome de Malformação Cerebelomedular, Síndrome de Malformação Cerebelomedular, Telangiectasia Cerebelo-Óculo-cutânea, Distúrbio Cerebeloparenquimal IV Familiar, Tumor do Ângulo Cerebelar, Aracnoidite Cerebral, Arteriopatia Cerebral Autossómica Dominante com Enfartes Subcorticais e Leucodistrofia, Beriberi Cerebral, Diplegia Cerebral, Gigantismo Cerebral, Malformações Vasculares Cerebrais, Paralisia Cerebral, Distrofia Cerebro-Óculo-Renal, Síndrome Cerebro-Óculo-Facio-Esquelético, Síndrome Cerebrocostomandibular, Síndrome Cerebro-hepato-renal, Degenerescência Cerebromacular, Degenerescência Cerebromacular, Distrofia Cerebromuscular de Tipo Fukuyama, Disgenesia Cerebroocular, Síndrome de Displasia Cerebroocular-Distrofia Muscular, Síndrome Cerebrooculofacioesquelética, Aneurisma Arteriovenoso Cerebroretiniano, Lipidose Cerebrósida, Cerebrosidose, Xantomatose Cerebrotendínea, Ferrocalcinose Cerebrovascular, Forma adulta da Lipofuscinose Ceroide, Distonia Cervical, Distonia Cervical, Síndrome Cervico-Óculo-Acústico, Estenose Cervical Espinhal, Fusão Vertebral Cervical, CES, CF, síndrome de CFC, CFIDS, CFND, CGD, CGF, CGF, Calasodermia Generalizada, Doença de Chanarin Dorfman, 71 Síndrome de Chanarin Dorfman, Síndrome da Ictiose de Chanarin Dorfman, Síndrome de Chandler, Doença de Charcot, Charcot-Marie-Tooth, Doença de Charcot-Marie-Tooth, Doença de Charcot-Marie-Tooth Variante, Doença de Charcot-Marie-Tooth-Roussy-Levy, Associação de CHARGE, Síndrome de Charge, Síndrome de CHARGE, Displasias Ectodérmicas de Chaund, Síndrome de Chediak-Higashi, Síndrome de Chediak-Higashi, Síndrome de Chediak-Steinbrinck-Higashi, Queilite Granulomatosa, Queilosquise, Síndrome de Chemke, Síndrome de Cheney, Síndrome das Manchas de Vermelho Cereja e Mioclonia, CHF, CHH, CHH, Doença de Chiari, Malformação de Chiari I, Malformação de Chiari, Chiari Tipo I (Malformação de Chiari I), Chiari Tipo II (Malformação de Chiari II), Síndrome de Chiari I, Síndrome de Chiari-Budd, Síndrome de Chiari-Frommel, Malformação de Chiari II, Síndrome de CHILD, Síndrome da Ictiose de CHILD, Síndrome da Ictiose de CHILD, Adrenoleucodistrofia da Infância, Dermatomiosite da Infância, Distonia de Início na Infância, Vomição Cíclica da Infância, Neuropatia Axónica Gigante da Infância, Hipofasfatasia da Infância, Distrofia Muscular da Infância, CHN, Colestase, Colestase Hereditária de Tipo Norueguês, Colestase Intra-hepática, Colestase Neonatal, Colestase de Utilizadores de Contraceptivos orais, Colestase com Estenose Pulmonar Periférica, Colestase da Gravidez, Deficiência de Colesterol Desmolase, Deficiência de Colesterol Desmolase, Condrodisplasia Puntuada, Condrodistrofia Calcificans Congénita, Condrodistrofia Fetalis, Miotonia Condrodistrofica, Condrodistrofia, Condrodistrofia com Pés Tortos, Condrodistrofia Epifisária, Forma Hiperplásica de Condrodistrofia, Displasias Condroectodérmicas, Condrogénese Imperfeita, Condrodistrofia, Condroosteodistrofia, Coreoacantocitose, Biópsia de Vilos Coriónicos, Anomalias Coriorretinianas, Anomalias Coriorretinianas com ACC, Síndrome Coriorretiniana de Coloboma-Joubert, Esclerose Coroidal, 72

Coroidermia, Síndrome de Chotzen, Síndrome de Chotzen, Síndrome de Christ-Siemens-Touraine, Síndrome de Christ-Siemans-Touraine; Doença de Natal, Síndrome da Árvore de Natal, Supressão do Cromossoma 3 do 3p Distai, Cromossoma 3 Distai 3p Monossomia, Cromossoma 3-Distal 3q2 Duplication, Cromossoma 3-Distal 3q2 Trisomy, Monossomia 3p2 do Cromossoma 3, Síndrome de Duplicação Parcial do Cromossoma 3q, Cromossoma 3q, Síndrome de Trissomia Parcial, Cromossoma 3-Trissomia 3q2, Síndrome de Supressão de 4q31-qter do Cromossoma 4, Síndrome de Supressão de 4q32-qter do Cromossoma 4, Síndrome de Supressão de 4q33-qter do Cromossoma 4, Supressão do Braço Longo do Cromossoma 4, Supressão do Braço Longo do Cromossoma 4, Monossomia 4q do Cromossoma 4, Cromossoma 4-Monossomia 4q, Monossomia Distai 4q do Cromossoma 4, Supressão Parcial de 4p do Cromossoma 4, Cromossoma 4, Supressão Parcial do Braço Curto, Monossomia Parcial de 4q Distai do Cromossoma 4, Monossomia Parcial 4p do Cromossoma 4, Trissomia Parcial 4 (q25-qter) do Cromossoma 4, Trissomia Parcial 4 (q26 ou q27-qter) do Cromossoma 4, Cromossoma 4 Trissomia Parcial 4 (q31 ou 32-qter), Trissomia Parcial 4p do Cromossoma 4, Trissomias Parciais 4q2 e 4q3 do Cromossoma 4, Trissomia Parcial Distai 4 do Cromossoma 4, Anel do Cromossoma 4, Síndrome da Supressão Terminal 4q do Cromossoma 4, Síndrome do Cromossoma 4q, Síndrome do Cromossoma 4q, Trissomia 4 do Cromossoma 4, Trissomia 4p do Cromossoma 4, Cromossoma 4 XY/47 XXY (Mosaico), Monossomia 5p do Cromossoma 5, Cromossoma 5, Síndrome de Supressão Parcial do Braço Curto, Trissomia 5p do Cromossoma 5, Trissomia 5p Completa (5pll-pter) do Cromossoma 5, Trissomia 5p Parcial (5pl3 ou 14-pter) do Cromossoma 5, Síndrome do Cromossoma 5p, Trissomia Parcial 6q do Cromossoma 6, Anel do Cromossoma 6, Trissomia 6q2 do Cromossoma 6, Monossomia 7p2 do Cromossoma 7, Supressão Parcial do Braço Curto (7p2-) do Cromossoma 7, Supressão Terminal 7p [de (7) (p21-p22) ] do Cromossoma 7, 73

Monossomia 8p2 do Cromossoma 8, Monossomia 8p21-pter do Cromossoma 8, Supressão Parcial (braço curto) do Cromossoma 8, Monossomia Parcial 8p2 do Cromossoma 8, Trissomia Completa 9P do Cromossoma 9, Supressão Parcial do Braço Curto do Cromossoma 9, Monossomia Parcial 9p do Cromossoma 9, Monossomia Parcial 9p22 do Cromossoma 9, Monossomia Parcial 9p22-pter do Cromossoma 9, Trissomia Parcial 9P Inclusa do Cromossoma 9, Anel do Cromossoma 9, Tetrassomia 9p do Cromossoma 9, Tetrassomia 9p Mosaicismo do Cromossoma 9, Trissomia 9p (Variantes Múltiplas) do Cromossoma 9, Trissomia 9 (pter-p21 a q32) Inclusa do Cromossoma 9, Trissomia de Mosaico do Cromossoma 9, Trissomia de Mosaico do Cromossoma 9, Trissomia Distai lOq do Cromossoma 10, Monossomia do Cromossoma 10, Monossomia lOp do Cromossoma 10, Cromossoma 10, Supressão Parcial (braço curto), Cromossoma 10, 10p-Parcial, Trissomia Parcial 10q24-qter do Cromossoma 10, Trissomia 10q2 do Cromossoma 10, Monossomia Parcial do Braço Longo do Cromossoma 11, Monossomia Parcial llq do Cromossoma 11, Trissomia Parcial do Cromossoma 11, Trissomia Parcial llql3-qter do Cromossoma 11, Trissomia Parcial llq21-qter do Cromossoma 11, Trissomia Parcial llq23-qter do Cromossoma 11, Cromossoma llq, Trissomia Parcial, Mosaico de Isocromossoma 12p do Cromossoma 12, Monossomia Parcial 13q do Cromossoma 13, Cromossoma 13, Monossomia Parcial do Braço Longo, Anel do Cromossoma 14, Trissomia do Cromossoma 14, Trissomia Distai 15q do Cromossoma 15, Cromossoma rl5, Anel do Cromossoma 15, Trissomia 15q2 do Cromossoma 15, Cromossoma 15q, Sindrome de Duplicação Parcial, Supressão Intersticial 17p do Cromossoma 17, Sindrome da Supressão do Braço Longo do Cromossoma 18, Monossomia 18p do Cromossoma 18, Monossomia 18Q do Cromossoma 18, Anel do Cromossoma 18, Tetrassomia 18p do Cromossoma 18, Sindrome do Cromossoma 18q, Sindrome de Mosaico 21 do Cromossoma 21, Anel do Cromossoma 21, Sindrome de Translocação 21 do Cromossoma 21, Duplicação 74

Invertida do Cromossoma 22 (22pter-22qll) , Trissomia Parcial (22pter-22qll) do Cromossoma 22, Anel do Cromossoma 22, Trissomia de Mosaico do Cromossoma 22, XXYY do Cromossoma 48, XXXY do Cromossoma 48, Cromossoma rl5, Triplicação Cromossómica, Triplicação do Cromossoma, Sindrome de Triploidia de Cromossoma, Cromossoma X, Cromossoma XXY, Icterícia Acolúrica Crónica, Aracnoidite Adesiva Crónica, Insuficiência Adrenocortical Crónica, Cavernosite Crónica, Anemia Arregenerativa Congénita Crónica, Disfagocitose Crónica, Granulomatose Familiar Crónica, Icterícia Familiar Crónica, Sindrome de Disfunção Imune de Fadiga Crónica (CFIDS), Doença Granulomatosa Crónica, sindrome de Guillain-Barre Crónica, Icterícia Idiopática Crónica, Polinevrite Idiopática Crónica (CIP), Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crónica, Polieradiculoneuropatia Desmielinizante Inflamatória Crónica, Tique Motor Crónico, Candidiase Mucocutânea Crónica, Tiques Múltiplos Crónicos, Colite Ulcerosa Não Especifica Crónica, Colite Ulcerosa Não Especifica Crónica, Colangite Obliterante Crónica, Sindrome de Úlcera Péptica e Esofagite Crónicas, Coreia Progressiva Crónica, Sindrome de Oftalmoplegia Externa Progressiva Crónica, Oftalmoplegia e Miopatia Externa Progressiva Crónica, Oftalmoplegia Externa Progressiva Crónica, com Fibras Vermelhas Irregulares, Polineuropatia Recidivante Crónica, Sarcoidose Crónica, Disfonia Espasmódica Crónica, Vomição Crónica na Infância, CHS, Sindrome de Churg-Strauss, Penfigoide Cicatricial, CIP, Cirrose Congénita Pigmentar, Cirrose, Cistinuria, Citrulinemia, CJD, Doença de Schindler Clássica, Sindrome de Tipo Pfeiffer Clássica, Leucinose Clássica, Hemofilia Clássica, Forma Clássica da Sindrome de Cockayne de Tipo I (Tipo A) , Doença de Leigh Clássica, Fenilcetonúria Clássica, Esclerose Cerebral de Pelizaeus-Merzbacher Relacionada com X Clássica, CLE, Quistos da Mucosas do Lábio Leporino/Fenda Palatina Anomalias PP Digital e 75

Genital do Lábio Inferior, Lagoftalmo e Hipertelorismo Blefarofimose do Lábio Leporino-Fenda Palatina, Lábio Leporino/Fenda Palatina com Polegares Anormais e Microcefalia, Fenda Palatina-contracturas das articulações-Malformações de Dandy Walker, Fenda Palatina e Lábio Leporino, Displasia Cleidocraniana com Micrognatia, Polegares Ausentes & Afalangia Distai, Disostose Cleidocraniana, Displasia Cleidocraniana, Sindrome de Murmúrio de Clique, CLN1, Espasmódica Clónica, Sindrome de Cloustons, Pés Tortos, CMDI, CMM, CMT, CMTC, CMTX, Sindrome COA, Coarctação da aorta, Coarctação da aorta, Doença de Coats, Displasia de Cobblestone, Distúrbio de Cochin Jewish, Sindrome de Cockayne, Sindrome de COD-MD, COD, Sindrome de Coffin-Lowry, Sindrome de Coffin, Sindrome de Coffin Siris, Sindrome de COFS, Distrofia Cornenana de Cogan, Sindrome de Cogan Reese, Sindrome de Cohen, Doença de Aglutinina Fria, Doença de Anticorpo Frio, Doença de Anticorpo Frio, Anemia Hemolitica de Anticorpo Frio, Doença de Aglutinina Fria, Doença de Aglutinina Fria, Colite Ulcerosa, Colite Grave, Colite Grave, Colite Ulcerosa Colite Ulcerosa Não Especifica Crónica, Bebé Colódio, Coloboma Defeitos Cardíacos Atresia das Coanas Atraso do Crescimento e Desenvolvimento Genital e Anomalias Urinárias e Anomalias das orelhas, Coloboma, Coloboma, Neurose Colónica, Daltonismo, Daltonismo, Daltonismo, Daltonismo, Colpocefalia, Esófago de tipo colunar, Degenerescência Cone-Bastonete Combinada, Imunodeficiência Combinada com Imunoglobulinas, Displasia Mesoectodérmica Combinada, Hipogamaglobulinemia Variável Comum, Imunodeficiência Variável Comum, Ventrículo Comum, Hidrocéfalo Comunicante, Ausência Completa de Hipoxantina-Guanina Fosforibosiltranferase, Defeito do Septo Auriculoventricular Completo, Deficiência de Inibidor da Componente 1 do Complemento, Deficiência do Componente Regulador da Componente Cl do Complemento, Bloqueio 76

Completo do Coração, Intolerância a Hidratos de Carbono Complexos, Síndrome de Dor Regional Complexa, Deficiência de ATP Sintase do Complexo V, Complexo I, deficiência de NADH desidrogenase do Complexo I, Complexo II, Deficiência de succinato desidrogenase do Complexo II, Complexo III, deficiência de Ubiquinona-citocromo c oxidoredutase do Complexo III, Complexo IV, deficiência de Citocromo c oxidase do Complexo IV, Deficiência de Complexo IV, Complexo V, Degenerescência de Cone-Bastonete, Degenerescência Progressiva de Cone-Bastonete, Distrofia de Cone, Distrofia de Cone-Bastonete, Papilomatose Reticular Confluente, Cinética Congénita com PK baixo, Ausência Congénita de Músculos Abdominais, Ausência Congénita do Timo e Paratireoides, Acromia Congénita, Doença Congénita de Addison, Hiperplasia Supra-renal Congénita, Hiperplasia Supra-renal Congénita, Afibrinogenemia Congénita, Hipoventilação Alveolar Congénita, Anemia Congénita de Recém-nascidos, Síndrome Persilviana Bilateral Congénita, Síndrome de Brown Congénita, Defeitos Cardiovasculares Congénitos, Síndrome de Hipoventilação Central Congénita, Paralisia Cerebral Congénita, Sinostose Cervical Congénita, Polegar Unido Congénito com Atraso Mental, Aracnodactilia Contratural Congénita, Contracturas Múltiplas Congénitas com Aracnodactilia, Cianose Congénita, Defeito Congénito do Crânio e Couro Cabeludo, Dilatação Congénita da Via Biliar Intra-hepática, Neuropatia Dismielinizante Congénita, Disfagocitose Congénita, Angiectasia Displásica Congénita, Porfiria Eritropoiética Congénita, Porfiria Eritropoiética Congénita, Deficiência Congénita de Fator XIII, Insuficiência Congénita do Controlo Autónomo da Respiração, Icterícia Não Hemolítica Familiar Congénita de Tipo I, Diarreia Familiar Prolongada Congénita, Forma Congénita da Síndrome de Cockayne de Tipo II (Tipo B) , Fibromatose Generalizada Congénita, Rubéola Congénita, Neuropatia Axónica Gigante Congénita, Bloqueio Congénito do Coração, 77

Defeitos Cardíacos Congénitos, Hemidisplasia Congénita com Ictiose Eritrodérmica e Defeitos dos Membros, Icterícia Hemolítica Congénita, Anemia Hemolítica Congénita, Fibrose Hepática Congénita, Distrofia Cornenana Hereditária Congénita, Linfedema Hereditário Congénito, Hipercondroplasia Congénita, Polineuropatia Hipomielinizante Congénita, Neuropatia de Hipomielinização Congénita, Hipomielinização Congénita, Neuropatia de Hipomielinização Congénita, Polineuropatia de Hipomielinização Congénita (Bolbo de Cebola), Eritroderma Ictiosiforme Congénito, Ceratocone Congénito, Acidose Láctica Congénita, Intolerância à Lactose Congénita, Lipodistrofia Congénita, Cirrose Hepática Congénita, Enfisema Lobar Congénito, Enfisema Localizado Congénito, Macroglossia Congénita, Estenose Medular Congénita, Megacólon Congénito, Nevo Melanocítico Congénito, Dismorfodistrofia Mesodérmica Congénita, Distrofia Mesodérmica Congénita, Atrofia Congénita de Microvilos, Artrogripose Múltipla Congénita, Distrofia Miotónica Congénita, Neuropatia Congénita provocada por Hipomielinização, Pancitopenia Congénita, Anemia Perniciosa Congénita, Anemia Perniciosa Congénita devido a Defeito de Fator Intrínseco, Anemia Perniciosa Congénita devido a Defeito de Fator Intrínseco, Cirrose Pigmentar Congénita, Porfiria Congénita, Miopatia Proximal Congénita Associada a Miopatia de Acumulação da Desmina, Enfisema Pulmonar Congénito, Anemia Congénita Pura dos Glóbulos Vermelhos, Aplasia Congénita Pura dos Glóbulos Vermelhos, Cegueira Retiniana Congénita, Quisto Retiniano Congénito, Retinite Pigmentosa Congénita, Retinosquise Congénita, Doença de Bastonete Congénita, Síndrome de Rubéola Congénita, Defeitos Congénitos do Couro Cabeludo com Anomalias de Redução de Membro Distai, Neuropatia Sensorial Congénita, SMA Congénita com Artrogripose, Anemia Esferocítica Congénita, Displasia Espondiloepifisária Congénita, 78

Síndrome Congénita da Medula Espinal Cervical Presas, Tirossinose Congénita, Sindrome da Varicela Congénita, Malformações Vasculares Cavernosas Congénitas, Véus Vasculares Congénitos na Retina, Alexia Congénita, Baço Flutuante (Pediátrico) Congénito, Cardiomiopatia Congestiva, Córnea Cónica, Hiperbilirrubinemia Conjugada, Conjuntivite, Conjuntivite Lenhosa, Sindrome Conjuntivo-Uretro-Sinovial, Sindrome de Conn, Doença do Tecido Conjuntivo, Doença de Conradi, Sindrome de Conradi Hunermann, Anemia Aplástica Constitucional, Hipoplasia Eritroide Constitucional, Eczema Constitucional, Disfunção Hepática Constitucional, Trombopatia Constitutional, Bandas de Constrição Congénitas, Pericardite Constritiva com Nanismo, Sindrome de Atividade Continua da Fibra Muscular, Aracnodactilia Contratural, Aracnodactilia Contratural, Contracturas de Atrofia Muscular dos Pés e Apraxia Oculomotora, Convulsões, Anemia de Cooley, Doença de Transporte de Cobre, Coproporfiria Porfiria Hepática, Coração Triauricular, Coração Triauricular Esquerdo, Coração Triventricular Biauricular, Coração biventricular, Doença de Cori, Distrofia da Córnea, Amiloidose Cornenana, Opacificação da córnea-Dermatolisia-Atraso Mental, Distrofia Cornenana, Sindrome de Cornelia de Lange, Displasia da Dentina Coronal, Doença Coronária, Doença Coronária, Agenesia do Corpo Caloso, Degenerescência Gangliónico Cortico-Basal, Deformaris Cortical, Degenerescência Gangliónica Cortico-Basal (CBGD) , Degenerescência corticobasal, Deficiência de Corticosterona Metiloxidase de Tipo I, Deficiência de Corticosterona Metiloxidase de Tipo II, Cortisol, Sindrome de Costello, Morte Súbita do Recém-nascido, Sindrome de COVESDEM, COX, Deficiência de COX, Deficiência de COX de Tipo Francês-Canadiano, Deficiência de COX Tipo Miopatia Mitocondrial Infantil de Toni-Fanconi-Debre Incluso, Deficiência de COX Tipo Miopatia Mitocondrial Infantil Benigna, CP, CPEO, CPEO 79 com miopatia, CPEO com Fibras Vermelhas Irregulares, Forma Familiar de CPPD, Deficiência de CPT, CPTD, Arterite Craniana, Meningoencefalocele Craniana, Sindrome Crânio-Oro-Digital, Distrofia Craniocarpotarsal, Craniocele, Sindrome Craniodigital-Atraso Mental de Tipo Scott, Disostose Craniofacial, Disostose Craniofacial-Canal Arterial PD-Hipertricose-Hipoplasia dos Lábios, Displasia Craniofrontonasal, Displasia Craniometafisária, Sindrome Cranioorodigital, Sindrome Cranioorodigital de Tipo II, Cranioestenose de Tipo Crouzon, Cranioestenose, Cranioestenose, Craniossinostose-Atresia Coanal-Sinostose Humeral Radial, Craniossinostose-Hipertricose-Facial e Outras Anomalias, Craniossinostose Hipoplasia do Terço Médio da Face e Anormalidades do Pé, Craniossinostose Primária, Sindrome de Craniossinostose-Aplasia Radial, Craniossinostose com Defeitos Radiais, Crânio Bifidum, Sindrome de CREST, Sindrome de CREST, Doença de Creutzfeldt Jakob, Sindrome Cri du Chat, Morte Súbita do Recém-nascido, Sindrome de Crigler Najjar de Tipo I, Doença de Crohn, Doença de Crohn, Sindrome de Cronkhite-Canada, Sindrome de Cross, Sindrome de Cross, Sindrome de Cross-McKusick-Breen, Crouzon, Sindrome de Crouzon, Disostose Craniofacial de Crouzon, Crioglobulinemia Essencial Mista, Sindrome de Criptofalmo-Sindactilia, Criptorquidia-Nanismo-Mentalidade Subnormal, Distrofia Cornenana Cristalina de Schnyder, CS, CSD, CSID, CSO, Sindrome de CST, Displasia de Cabelo Encaracolado-Ancilobléfaro-Unhas, Sindrome de Curschmann-Batten-Steinert, Ictiose Histrica de Tipo Curth Macklin, Tipo Curth-Macklin, Cushing, Sindrome de Cushing, Cushing III, Melanoma Maligno Cutâneo Hereditário, Porfirias Cutâneas, Dermatolisia, Dermatolisia, Sindrome de Dermatolisia-Deficiência do Crescimento, Cútis Marmórea Telangiectatica Congénita, CVI, CVID, CVS, CVS, Sindrome de Vomição Cíclica, Doença Quística da Medula Renal, Doença Quistica da Medula Renal, Higroma Quistico, Fibrose 80

Quistica, Linfangioma Quístico, Cistina-Lisina-Arginina-Ornitinúria, Doença de Acumulação de Cistina, Cistinose, Cistinúria, Cistinúria com Aminoaciduria Dibásica, Cistinúria Tipo I, Cistinúria Tipo II, Cistinúria Tipo III, Quistos Congénitos da Medula Renal, Quistos Congénitos da Medula Renal, Deficiência de Oxidase do Citocromo C, D.C., Dacriosialoadenopatia, Dacriosialoadenopatia, Dalpro, Dalton, Daltonismo, Sindrome de Danbolt-Cross, Sindrome de Olhos Dançantes-Pés Dançantes, Sindrome de Dandy-Walker, Quisto de Dandy-Walker, Deformidade de Dandy-Walker, Malformação de Dandy Walker, Amiloidose Cardiaca de tipo dinamarquês (Tipo III), Doença de Darier, Doença de Davidson, Doença de Davies, DBA, DBS, DC, DD, Sindrome de De Barsy, Sindrome de De Barsy-Moens-Diercks, Sindrome de Lange, Sindrome de De Morsier, Sindrome de De Santis Cacchione, Sindrome de Toni-Fanconi, Surdez Congénita e Doença Cardiaca Funcional, Surdez-Nanismo-Atrofia Retiniana, Surdez-Doença Cardiaca Funcional, Surdez Onicodistrofia Osteodistrofia e Atraso mental, Surdez e Pili Torti de Tipo Bjornstad, Surdez Neurossensorial com Ânus não Perfurado e Polegares Hipoplásticos, Deficiência de Debrancher, Pele Caduca, Defeito do Recetor do Fator Intrínseco de Enterócitos, Defeito do Recetor do Fator Intrínseco de Enterócitos, Defeito em Linfócitos Assassinos Naturais, Defeito de Reabsorção Renal de Carnitina, Deficiência de Glicoproteina Neuraminidase, Deficiência de Complexo IV da Cadeia Respiratória Mitocondrial, Deficiência de Glicoproteina Ib das Plaquetas, Deficiência do Recetor do Fator de Von Willebrand, Deficiência da Desidrogenase da Cadeiua Curta de Acil-CoA (ACADS, Deformidade com Nanismo Mesomélico, Coreia Degenerativa, Estenose Espinhal Lombar Degenerativa, Doença de Degos, Doença de Degos-Kohlmeier, Sindrome de Degos, DEH, Sindrome de Dejerine-Roussy, Doença de Dejerine Sottas, Sindrome Parcial de Supressão de 9p, Sindrome Parcial de Supressão 81 de llq, Síndrome Parcial de Supressão de 13q, Síndrome de Delleman-Oorthuys, Síndrome de Delleman, Demência com Atrofia Lobar e Inclusões Neuronais Citoplasmáticas, Doença Desmielinizante, Síndrome de DeMyer, Displasia da Dentina Coronal, Displasia da Dentina Radicular, Displasia da Dentina de Tipo I, Displasia da Dentina de Tipo II, Dentinogénese Imperfeita de Tipo Brandywine, Dentinogénese Imperfeita de Tipo Shields, Dentinogénese Imperfeita de Tipo Shields, Dentinogénese Imperfeita Tipo III, Dentinogénese Imperfeita Tipo III, Displasia Óculo-Dento-Óssea, Displasia Óculo-Dento-Óssea, Síndrome Óculo-Dento-Cutânea, Síndrome de Denys-Drash, Depacene, exposição a DepaceneTM, Depakote, Depakote Sprinkle, Despigmentação-Fibromatose Gengival-Microftalmia, Doença de Dercum, Doença de Dercum, Dermatite Atópica, Dermatite Exfoliativa, Dermatite Herpetiforme, Dermatite Multiforme, Dermatocálase Generalizada, Dermatolisia Generalizada, Dermatomegalia, Dermatomiosite sem miosite, Dermatomiosite, Dermatosparaxia, Dermatoestomatite de Tipo Stevens Johnson, Síndrome de Desbuquois, Miopatia de Acumulação de Desmina, Descamação de Recém-nascidos, Deuteranomalia, Deuteranomalia, Distúrbio de Leitura do Desenvolvimento, Síndrome de Gerstmann do Desenvolvimento, Doença de Devergie, Doença de Devic, Síndrome de Devic, Dextrocardia-Bronquectasia e Sinusite, Dextrocardia com Sítio Inverso, DGS, Síndrome DGSX de Golabi-Rosen Incluso, DH, DHAP deficiência de alquil transferase, Deficiência de DHBS, Deficiência de DHBS, DHOF, Deficiência de DHPR, Deficiência de DHPR, Diabetes Insípida, Diabetes Insípida Diabetes Mellitus Atrofia Óptica e Surdez, Diabetes insípida Neuro-hipofisária, Diabetes Insulino-dependente, Diabetes Mellitus, Diabetes Mellitus doença de Addison Mixedema, Acidose Diabética, Síndrome da Mulher Diabética com Barba, Anemia de Diamond-Blackfan, Apneia Diafragmática, Aclasia Diafisária, Nanismo Diastrófico, Displasia Diastrófica, 82 Síndrome de Nanismo Diastrófico, Aminoaciduria Dicarboxílica, Aciduria Dicarboxílica Provocada por Defeito na Beta-Oxidação de Ácidos Gordos, Aciduria Dicarboxilica devido a Defeito na Beta-Oxidação de Ácidos Gordos, Aciduria Dicarboxilica devido a Deficiência de MCADH, Dicromatopsia, Dicker-Opitz, DIDMOAD, Sindrome Diencefálica, Sindrome Diencefálica da Infância, Sindrome Diencefálica da Emaciação, Deficiência de Dienoil-CoA Redutase, Degenerescência Cerebral Difusa na Infância, Doença Cerebral Degenerativa Difusa, Hiperostose Esguelética Idiopática Difusa, Glicopeptiduria Difusa, Sindrome de DiGeorge, Sindrome de DiGeorge, Sindrome Digital-Oro-Craniana, Sindrome Digito-Oto-Palatina, Sindrome Digito-Oto-Palatina de Tipo I, Sindrome Digito-Oto-Palatina de Tipo II, Deficiência de Di-hidrobiopterina Sintetase, Deficiência de Di-hidrobiopterina Sintetase, Deficiência de Di-hidropteridina Redutase, Deficiência de Di-hidropteridina Redutase, Di-hidroxiacetonafosfato sintase, Cardiomiopatia Dilatada (Congestiva), Doença de Dimitri, Diplegia de Paralisia Cerebral, Sindrome de Diplo-Y, Deficiência de Dissacaridase, Intolerância a Dissacáridos I, Lúpus Discoide, Lúpus Eritematoso Discoide, DISH, Distúrbio de Cornificação, Distúrbio de Cornificação Tipo I, Distúrbio de Cornificação 4, Distúrbio de Cornificação 6, Distúrbio de Cornificação 8, Distúrbio de Cornificação 9 de Tipo Netherton, Distúrbio de Cornificação 11 de Tipo Ácido Fitânico, Distúrbio de Cornificação 12 (Tipo Acumulação de Lipidos Neutros), Distúrbio de Cornificação 13, Distúrbio de Cornificação 14, Distúrbio de Cornificação 14 de Tipo Tricotiodistrofia, Distúrbio de Cornificação 15 (Tipo Surdez de Queratite), Distúrbio de Cornificação 16, Distúrbio de Cornificação 18 de Tipo Eritroqueratodermia Variável, Distúrbio de Cornificação 19, Distúrbio de Cornificação 20, Distúrbio de Cornificação 24, Baço Deslocado, Lúpus Eritematoso Disseminado, Neurodermite 83

Disseminada, Esclerose Disseminada, Monossomia llq Distai, Sindrome llq Distai, Artrogripose Distai Múltipla Congénita de Tipo IIA, Distai Artrogripose Distai Múltipla Congénita de Tipo IIA, Artrogripose Distai de Tipo IIA, Artrogripose Distai de Tipo 2A, Duplicação Distai 6q, Duplicação Distai lOq, Sindrome Dup(lOq), Duplicação Distai 15q, Monossomia Distai 9p, Trissomia Distai 6q, Sindrome de Trissomia Distai lOq, Trissomia Distai llq, Divalproato, DJS, DKC, DLE, DLPIII, DM, Sindrome de DMC, Doença de DMC, DMD, DNS Hereditária, DOC I, DOC 2, DOC 4, DOC 6 (Tipo Arlequim), DOC 8 Tipo Curth-Macklin, DOC 11 Tipo Ácido Fitânico, DOC 12 (Tipo Acumulação de Lípidos neutros), DOC 13, DOC 14, DOC 14 Tipo Tricotiodistrof ia, DOC 15 (Tipo Surdez de Queratite), DOC 16, DOC 16 Tipo Hemidisplasia Unilateral, DOC 18, DOC 19, DOC 20, DOC 24, Mielopatia dos Corpos de Dohle, Displasia Dolicospondilica, Dolicostenomelia, Sindrome de Dolicostenomelia, Sindrome de Kenny-Caffe de Tipo Dominante, Miotonia Congénita de Tipo Dominante, Sindrome de Donahue, Anemia Hemolitica de Donath-Landsteiner, Sindrome de Donath-Landsteiner, Sindrome de DOOR, Sindrome de DOORS, Distonia Reativa a Dopa (DRD), Sindrome de Dorfman Chanarin, Sindrome de Dowling-Meara, sindrome de Down, Sindrome de DR, Sindrome de Drash, DRD, Distrofia Muscular de Tipo Dreifuss-Emery com Contracturas, Sindrome de Dressler, Baço Flutuante, Acantose Nigricans de Origem Medicamentosa, Lúpus Eritematoso de Origem Medicamentosa, Insuficiência Supra-renal de Origem Medicamentosa, Sindrome de Drummond, Beriberi Seco, Olho Seco, DTD, Sindrome de Retracção de Duane, Sindrome de Duane, Sindrome de Duane de Tipo ΙΑ, 1B e 1C, Sindrome de Duane de Tipo 2A, 2B e 2C, Sindrome de Duane de Tipo 3A, 3B e 3C, Sindrome de Dubin Johnson, Sindrome de Dubowitz, Duchenne, Distrofia Muscular de Duchenne, Paralisia de Duchenne, Doença de Duhring, Doença de Duncan, Doença de Duncan, Atresia Duodenal, Estenose Duodenal, Duodenite, 84 84 ECPSG, EBVS, ECD, Síndrome de Duplicação de 4p, Duplicação Parcial de 6q, Síndrome de Dupuy, Contractura de Dupuytren, Síndrome de Dutch-Kennedy, Nanismo, Nanismo Campomélico, Nanismo Espessamento Cortical dos Ossos Tubulares & Hipocalcemia Transitória, Nanismo de Tipo Levi, Nanismo Metatrópico, Nanismo-Onicodisplasia, Nanismo-Pericardite, Nanismo com Atrofia Renal e Surdez, Nanismo com Raquitismo, DWM, Síndrome de Dyggve Melchior Clausen, Disautonomia Familiar, Disbetalipoproteinemia Familiar, Discondrodisplasia com Hemangiomas, Discondrosteose, Discromatose Universal Hereditária, Disencefalia Esplecnocística, Disqueratose Congénita, Disqueratose Congénita Autossómica Recessiva, Disqueratose Congénita de Tipo Scoggins, Síndrome de Disqueratose Congénita, Disqueratose Folicular Vegetante, Dislexia, Leucodistrofia Desmielogénica, Leucodistrofia-Megalobar Desmielogénica, Disfonia Espástica, Displasia Epifisária Puntuada, Displasia Epifisária Hemimélica, Displasia das Unhas Com Hipodontia, Displasia Cleidocraniana, Displasia Fibrosa, Displasia do Gigantismo Relacionada com a Síndrome X, Displasia Osteodental, Síndrome do Nevo Displásico, Síndrome do Nevo Displásico, Tipo Nevo Displásico, Dissinergia Cerebelosa Mioclónica, Dissinergia Esofágica, Distonia, Distonia, Distopia Canthorum, Distopia Canthorum, Distrofia Adipogenital, Distrofia Endotelial da Córnea, Distrofia Mesodermal, Epidermólise Bolhosa Distrófica, Epidermólise Bolhosa Distrófica, Distrofia, Túrax Asfixiante, Distrofia Miotónica, Síndrome E-D, Síndrome de Eagle-Barrett, Retinopatia de Eales, Doença de Eales, Anomalias nas Orelhas-Contracturas-Displasia Óssea com Cifoescoliose, Síndrome de Estatura Baixa da Rótula do Ouvido, Defeitos de Restrições Iniciais, Síndrome de Hipercalcemia Precoce com Fácies de Anão, Distonia de Início Precoce, Síndrome de Eaton Lambert, EB, Anomalia de Ebstein, EBV (EBVS) , Suscetibilidade de EBVS, ECD, ECPSG, Displasias 85

Ectodérmicas, Displasia Anidrótica Ectodérmica com Lábio Leporino e Fenda Palatina, Displasia Ectodérmica-Insuficiência Pancreática Exócrina, Displasia Ectodérmica de Tipo Rapp-Hodgkin, Displasia Ectodérmica e Mesodérmica Congénita, Displasia Ectodérmica e Mesodérmica com Envolvimento Ósseo, Ectodermose Erosiva Pluriorificial, Ectopia do Cristalino, Ectopia Vesicae, Sindrome ACTH Ectópica, Sindrome Ectópica da Hormona adrenocorticotrópica, ânus Ectópico, Ectrodactilia da Mão, Ectrodactilia, Ectrodactilia-Displasia Ectodérmica-Sindrome de Fissuração, Ectrodactilia Displasias Ectodérmicas Sindrome de Fissuração, Ectrodactilia Displasia Ectodérmica Lábio Leporino/Fenda Palatina, Eczema, Eczema-Trombocitopenia-Síndrome de Imunodeficiência, EDA, EDMD, EDS, EDS Arterial de Tipo Equimótico, Artrocalasia de EDS, Forma Grave Clássica de EDS, EDS Desfibronectinémica, EDS de Tipo Grave, EDS de Hipermobilidade, EDS Cifoescolótico, EDS Cifoescoliose, EDS de Tipo Mitis, EDS Ocular-Escolótico, EDS Progeroide, EDS Periodontose, EDS Vascular, Sindrome de EEC, EFE, EHBA, EHK, Sindrome de Ehlers Danlos, sindrome de Ehlers-Danlos, Ehlers Danlos IX, Complexo de Eisenmenger, complexo de Eisenmenger, Doença de Eisenmenger, Reação de Eisenmenger, Sindrome de Eisenmenger, Sindrome de Eisenmenger, Sindrome de Ekbom, Doença de Ekman-Lobstein, Ectrodactilia da Mão, Ectrodactilia da Mão, EKV, Distúrbios da Fibra de Elastina, Elastorrexia Generalizada, Sindrome de Elastose Distrófica, Mutismo Eletivo (obsoleto) , Mutismo Eletivo, Electrocardiograma (ECG ou EKG), Flavoproteína de Transferência de Eletrão (ETF) Deficiência de Desidrogenase: (GAII & MADD), Estudo Electrofisiológico (EPS), Unhas de Elefante do Nascimento, Elefantíase Congénita Angiomatosa, Hipertrofia Hemangietática, Fácies de Nanismo com Hipercalcemia, Sindrome de Ellis-van Creveld, Sindrome de Ellis Van Creveld, Rim Embrionário, 86

Adenomiossarcoma Renal Embrionário, Carcinossarcoma Renal Embrionário, Tumor Renal Misto Embrionário, EMC, Distrofia Muscular de Emery Dreyfus, Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss, Síndrome de Emery-Dreifuss, EMF, Síndrome de EMG, Síndrome de Sela Vazia, Encefalite Periaxial Difusa, Encefalite Periaxial Concêntrica, Encefalocele, Angiotomatose Encefalofacial, Encefalopatia, Angiotomatose Encefalotrigeminal, Encondromatose com Múltiplos Hemangiomas Cavernosos, Polinevrite Endémica, Defeito da Almofada Endocardiaca, Defeito da Almofada Endocardíaca, Defeitos da Almofada Endocardiaca, Displasia Endocardíaca, Fibroelastose Endocardíaca (EFE), Hipertrigliceridemia Endógena, Hidropisia Endolinfática, Crescimentos Endométricos, Endometriose, Fibrose Endomiocárdica, Distrofia Endotelial Cornenana Congénita, Distrofia Epitelial Endotelial Cornenana, Endotélio, Doença de Engelmann, Língua Alargada, Enterocolite, Malabsorção Enterócita de Cobalamina, Síndrome Eosinofílica, Celulite Eosinofílica, Fasciíte Eosinofílica, Granuloma Eosinofílico, Síndrome Eosinofílica, Síndrome de Nevo Epidérmico, Epidermólise Bolhosa, Epidermólise Bolhosa, Epidermólise Bolhosa Adquirida, Epidermólise Bolhosa Hereditária, Epidermólise Bolhosa Letalis, Epidermólise Hereditária Tarda, Hiperqueratose Epidermolítica, Hiperqueratose Epidermolítica (CIE Bolhosa), Epilepsia Progressiva, Epilepsia, Epinefrina, Alterações Epifisárias e Miopia Alta, Osteocondroma Epifisário Benigno, Displasia Epifisária Hemimélica, Movimento Ocular Episódico-Anormal, Distrofia Cornenana da Membrana da Base Epitelial, Distrofia Cornenana Epitelial de Meesmann Juvenil, Epiteliomatose Múltipla com Nevo, Epitélio, Epival, EPS, Doença Linfoproliferativa induzida pelo vírus Epstein-Barr em Machos, síndrome de Erb-Goldflam, Doença de Erdheim Chester, Eritema Multiforme Exsudativo, Eritema Polimorfo de Tipo Stevens Johnson, Eritroblastoftisia, Eritroblastose 87

Fetal, Eritroblastose Neonatal, Anemia Eritroblastótica da Infância, Deficiência de Fosfoglicerato Cinase de Eritrócitos, Eritrogénese Imperfeita, Eritroqueratodermia Progressiva Simétrica, Ictiose Eritroqueratodermia Progressiva Simétrica, Eritroqueratodermia Variável, Eritroqueratodermia Variável, Eritroqueratodermia de Tipo Variável, Eritroqueratólise Invernal, Eritroqueratólise Invernal, Eritroqueratólise Invernal, Porfirias Eritropoiéticos, Porfiria Eritropoiético, Sindrome de Escobar, Atresia Esofágica, Esofágico Aperistaltismo, Esofagite-Úlcera Péptica, Atresia do Esófago e/ou Fístula Traqueoesofágica, Hiperlipemia Familiar Essencial, Frutosúria Essencial, Hematúria Essencial, Trombocitémia Hemorrágica Essencial, Trombocitémia Hemorrágica Essencial, Crioglobulinemia Mista Essencial, Doença de Moschowitz Essencial, Trombocitémia Essencial, Trombocitémia Essencial, Trombocitopenia Essencial, Trombocitose Essencial, Trombocitose Essencial, Tremor Essencial, Deficiência de Inibidor de Esterase, Variante de Estren-Dameshek da Anemia de Fanconi, Colestase relacionado com Estrogénio, ET, ET, ETF, Aciduria Etilmalónica Adípica, Doença de Eulenburg, pc, EVCS, Reação de Sobressalto Exagerada, Exencefalia, Hipertrigliceridemia Exógena, Sindrome de Onfalocele-Macroglossia-Gigantismo, Bócio Exoftálmico, Sindrome de Rubéola Expandida, Extrofia da Bexiga, EXT, Sindrome de Condromatose Externa, Atresia Biliar Extra-Hepática, Plasmocitoma Extramedular, Retinite Exsudativa, Sindrome de Retracção do Olho, FA1, FAA, doença de Fabry, FAC, FACB, FACD, FACE, FACF, FACG, FACH, Paralisia do Nervo Facial, Paralisia Facial, Displasias Ectodérmicas Faciais, Displasia Ectodérmica Facial, Distrofia Facio-Escápulo-Humeral, Espetro Facio-Auriculo-Vertebral, Sindrome Facio-cardio-cutânea, Displasia Facio-Fronto-Nasal, Sindrome Faciocutaneoesquelético, Sindrome Faciodigitogenital, Displasia Faciogenital, Sindrome 88

Faciogenitopopliteal, Sindrome Facio-palato-óssea, Síndrome Facio-palato-óssea de Tipo II, Distrofia Muscular Facio-Escápulo-Humeral, Hipoglicemia Factícia, Deficiência de Fator VIII, Deficiência de Fator IX, Fator IX, Deficiência de Fator XI, Deficiência de Fator XII, Deficiência de Fator XIII, Doença de Fahr, Doença de Fahr, Insuficiência de Secreção Gástrica de Fator Intrínseco, Doença de Fairbank, Tetralogia de Fallot, Acrogeria Familiar, Acrogeria Familiar, Acromicria Familiar, Acromicria Familiar, Polipose Adenomatosa Familiar do Cólon, Polipose Adenomatosa Familiar com Manifestações Extraintestinais, Holoprosencefalia Alobar Familiar, Deficiência de Alfa-Lipoproteína Familiar, Coreia Amiotrófica Familiar com Acantocitose, Mioclonia Arrítmica Familiar, Condrocalcinose Articular Familiar, Síndrome Familiar Atípica de Melanoma Mole Maligno, Doença Beta Larga Familiar, Gota Cálcica Familiar, Artropatia de Pirofosfato de Cálcio Familiar, Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica Familiar, Descamação Contínua da Pele Familiar, Amiloidose Cutânea Familiar, Disproteinemia Familiar, Enfisema Familiar, Microvilosidade Enteropática Familiar, Retinosquise Foveal Familiar, Síndrome de Hibernação Familiar, Colesterol Alto Familiar, Hemocromatose Familiar, Colesterol Alto no Sangue Familiar, Deficiência de Lipoproteína de Alta Densidade Familiar, Colesterol Alto no Soro Familiar, Hiperlipidemia Familiar, Hipoproteinemia Familiar com Enteropatia Linfangiectásica, Icterícia Familiar, Anomalia Ocular Associada a Nefronoftise Juvenil Familiar, Líquen Amiloidose Familiar (Tipo IX) , Estenose Lombar Familiar, Linfedema Precoce Familiar, Febre Mediterrânica Familiar, Familiar Polipose Múltipla Familiar, Bolha Nucal Familiar, Poliserosite Paroxística Familiar, Polipose Cólica Familiar, Hipertensão Pulmonar Primária Familiar, Glicosúria Renal Familiar, Anemia Esplénica Familiar, Doença de Soressalto Familiar, Amiloidose Visceral Familiar (Tipo VIII), FAMMM, FANCA, 89 FANCB, FANCC, FANCD, FANCE, Panmielopatia de Fanconi, Pancitopenia de Fanconi, Fanconi II, Anemia de Fanconi, Anemia de Fanconi de Tipo I, Grupo de Complementação da Anemia de Fanconi, Grupo A de Complementação da Anemia de Fanconi, Grupo B de Complementação da Anemia de Fanconi, Grupo C de Complementação da Anemia de Fanconi, Grupo D de

Complementação da Anemia de Fanconi , Grupo E de Complementação da Anemia de Fanconi , Grupo G de Complementação da Anemia de Fanconi , Grupo H de Complementação da Anemia de Fanconi, Anemia de Fanconi Variante de Estren- -Dameshek, FANF, FANG, FANH, FAP , FAPG,

Doença de Farber, Lipogranulomatose de Farber, FAS, Hipoglicemia em Jejum, Hiperlipemia induzida por Gordura, Doença Granulomatosa Fatal da Infância, Distúrbios da Oxidação Gorda, Figado Gordo com Encefalopatia, FAV, FCH, FCMD, Sindrome de FCS, FD, FDH, Sindrome Mucocutâneo Febril de Tipo Stevens Johnson, Dermatose Neutrofilica Febril Aguda, Ataques Apoplécticos Febris, Sindrome de Feinberg, Sindrome de Feissinger-Leroy-Reiter, Sindrome Pseudo-Turner Feminina, Disgenesia Femoral Bilateral-Anomalia de Robin, Disgenesia Femoral Bilateral, Sindrome Femoral Facial, Sindrome de Hipoplasia Femoral-Fácies Raros, Sindrome de Álcool Fetal, Sindrome Anti-Convulsivante Fetal, Higroma Quistico Fetal, Efeitos Fetais do Álcool, Efeitos Fetais da Varicela, Efeitos Fetais da Talidomida, Efeitos Fetais do Virus Zoster da Varicela, Fibrose Endomiocárdica Fetal, Sindrome do Rosto Fetal, Sindrome Fetal da Irite, Sindrome Fetal da Transfusão, Sindrome Fetal do Valproato, Sindrome da Exposição Fetal ao Ácido Valpróico, Infeção Fetal por Varicela, Sindrome Fetal de Varicela Zoster, FFDD Tipo II,

Sindrome de FG, FGDY, FHS, Deficiência de Fator Estabilizante de Fibrina, Deficiência de Fibrinase,

Degenerescência Fibrinoide de Astrócitos, Leucodistrofia Fibrinoide, Deficiência de Fibrinoligase, Fibroblastoma Perineural, Doença Fibroquística do Pâncreas, 90

Fibrodisplasia Ossificans Progressiva, Endocardite Fibroelástica, Fibromialgia, Fibromialgia-Fibromiosite, Fibromiosite, Colangite Fibrosante, Fibrosite, Anquilose Fibrosa de Múltiplas Articulações, Cavernosite Fibrosa, Displasia Fibrosa, Placas Fibrosas do Pénis, Esclerose Fibrosa do Pénis, Tipo Fickler-Winkler, Doença de Fiedler, Sindrome do Quinto Dedo, Sindrome de Filippi, Amiloidose Tipo finlandês (Tipo V) , Bloqueio Congénito do Coração de Primeiro GRau, Sindrome do Primeiro e Segundo Arcos Branquiais, Sindrome de Fischer, Sindrome do Odor a Peixe, Lingua Fissurada, Sindrome de Adenoma Plano, Doença de Flatau-Schilder, Monooxigenase 2 Contendo Flavina, Doença Beta Flutuante, Sindrome do Porto Flutuante, Baço Flutuante, Sindrome do Bebé Mole, Sindrome da Válvula Preguiçosa, Afasia Fluente, FMD, FMF, Forma no Figado de Adulto da FMO, FM02, FND, Sindrome de Displasia Dérmica Focal, Hipoplasia Dérmica Focal, Displasia Dermato-Falângica Focal, Distonia Focal, Epilepsia Focal, Displasia Dérmica Facial Focal de Tipo II, Neuromiotonia Focal, FODH, Sindrome de Folling, Doença de Fong, FOP, Doença de Forbes, Sindrome de Forbes-Albright, Doença de Forestier, Sindrome de Forsius-Eriksson (Relacionada com X), Doença de Fothergill, Sindrome de Fountain, Distrofia Foveal Progressiva, Sindrome FPO de Tipo II, FPO, Acondrogénese de Tipo Fraccaro (Tipo IB) , Sindrome X Frágil, Sindrome de Franceschetti-Zwalen-Klein, Sindrome da Discefalia de Francois, Distrofia Manchada de Francois-Neetens, Distrofia Cornenana Manchada, Sindrome de Fraser, FRAXA, FRDA, Hiperlipoproteinemia de Fredrickson de Tipo I, Sindrome de Freeman-Sheldon, Sindrome de Freire-Maia, Sindrome de Frey, Ataxia de Friedreich, Ataxia de Friedreich, Doença de Friedreich, Tabes de Friedreich, FRNS, Sindrome de Froelich, Sindrome de Frommel-Chiari, Sindrome de Frommel-Chiari Atrofia do Útero na Lactação, Sindrome Frontodigital, Disostose Frontofacionasal, Displasia 91

Frontofacionasal, Displasia Frontonasal, Displasia Frontonasal com Craniossinostose Coronal, Deficiência de Frutose-l-Fosfato Aldolase, Frutosemia, Frutosúria, Sindrome de Fryns, FSH, FSHD, FSS, Distrofia de Fuchs, Fucosidose de Tipo 1, Fucosidose de Tipo 2, Fucosidose de Tipo 3, Sindrome de Fukuhara, Doença de Fukuyama, Distrofia Muscular de Tipo Fukuyama, Distrofia Muscular de Tipo Fukuyama, Deficiência de Fumarilacetoacetase, Lingua Estriada, Sindrome G, Deficiência de G6PD, G6PD, GA I, GA IIB, GA IIA, GA II, GAII & MADD, Sindrome de Galactorreia-Amenorreia Não puerperal, Galactorreia-Amenorreia sem Gravidez, Deficiência de Galactosamina-6-Sulfatase, Deficiência de Galactose-l-Fosfato Uridil Transferase, Galactosemia, Deficiência de GALB, Sindrome de Galloway-Mowat, Sindrome de Galloway, Deficiência de GALT, Deficiência de Gamaglobulina, GAN, Deficiência de Gangliósido Neuraminidase, Deficiência de Gangliósido Sialidase, Gangliosidose GM1 de Tipo 1, Gangliosidose GM2 de Tipo 2, Deficiência de Gangliosidose Beta Hexosaminidase B, Sindrome de Gardner, Sindrome de Gardner, Gargoilismo, Sindrome de Garies-Mason, Sindrome de Gasser, Insuficiência de Secreção Gástrica do Fator Intrínseco, Cobalamina Enterócita, Gastrinoma, Gastrite, Laceração-Hemorragia Gastroesofágica, Polipose Gastrointestinal e Alterações Ectodérmicas, Laparosquise, Doença de Gaucher, Gaucher-Schlagenhaufer, Sindrome de Gayet-Wernicke, GBS, GCA, Sindrome de GCM, GCPS, Doença de Gee-Herter, Doença de Gee-Thaysen, Doença de Gehrig's, Sindrome de Gelineau's, Sindrome de Genee-Wiedemann, Distonia Generalizada, Neuromiotonia Familiar Generalizada, Fibromatose Generalizada, Epilepsia de Flexão Generalizada, Glicogenose Generalizada, Glicogenose Generalizada, Hiperidrose Generalizada, Lipofuscinose Generalizada, Miastenia Grave Generalizada, Miotonia Generalizada, Neuromitonia Esporádica Generalizada, Distúrbios Genéticos, Defeitos dos 92

Genitais, Defeitos dos Genitais e Aparelho Urinário, Defeitos dos Genitais e Aparelho Urinário, Sindrome de Gerstmann, Tétrada de Gerstmann, GHPB, GHD, GHR, Doença Axónica Gigante, Neuropatia Axónica Gigante, Linfoma Benigno Gigante, Glioblastoma Astrocitoma de Células Gigantes, Arterite de Células Gigantes, Doença Hepática de Células Gigantes, Hepatite de Células Gigantes, Cirrose de Células Gigantes em Recém-nascidos, Quisto Gigante da Retina, Hiperplasia de Gânglio Linfático Gigante, Sindrome de Plaqueta Hereditária Gigante, Lingua Gigante, Distrofia Macular, Doença de Gilbert, Sindrome de Gilbert, Sindrome de Gilbert-Dreyfus, Sindrome de Gilbert-Dreyfus, Sindrome de Gilbert-Lereboullet, Sindrome de Gilford, Sindrome de Gilles de la Tourette, Sindrome de Gillespie, Fibromatose Gengival-Dedos Unhas Nariz Orelha Anormais Esplenomegalia, Deficiência de GLA, GLA, GLB1, Glioma da Retina, Afasia Global, Leucodistrofia Globoide, Glossoptose Micrognatia e Fenda Palatina, Deficiência de Glucocerebrosidase, Glucocerebrosidose, Deficiência de Glucose-6-Fosfato Desidrogenase, Defeito do Transporte de Glucose-6-Fosfato, Deficiência de Glucose-6-Fosfato Translocase, Deficiência de Glucose-G-Fosfatase, Malabsorção de Glucose-Galactose, Malabsorção de Glucose-Galactose, Lipidose de Glucosil Ceramida, Aciduria Glutárica I, Acidemia Glutárica I, Acidemia Glutárica II, Aciduria Glutárica II, Aciduria Glutárica Tipo II, Aciduria Glutárica Tipo III, Acidemia Glutárica I, Acidemia Glutárica II, Aciduria Glutárica I, Glutáricoaciduria II, Aciduria Glutárica Tipo IIA, Aciduria Glutárica Tipo IIB, Deficiência de Glutaril-CoA Desidrogenase, Defeito do Transporte de Glutarato-Aspartato, Enteropatia Sensível a Glúten, Doença do Glicogénio do Músculo de Tipo VII, Doença de Acumulação de Glicogénio I, Doença de Acumulação de Glicogénio III, Doença de Acumulação de Glicogénio IV, Doença de Acumulação de Glicogénio Tipo V, Doença de Acumulação de Glicogénio 93 VI, Doença de Acumulação de Glicogénio VII, Doença de Acumulação de Glicogénio VIII, Doença de Acumulação de Glicogénio Tipo II, Doença de Acumulação de Glicogénio-Tipo II, Glicogenose, Glicogenose Tipo I, Glicogenose Tipo IA, Glicogenose Tipo IB, Glicogenose Tipo II, Glicogenose Tipo II, Glicogenose Tipo III, Glicogenose Tipo IV, Glicogenose Tipo V, Glicogenose Tipo VI, Glicogenose Tipo VII, Glicogenose Tipo VIII, Aciduria Glicólica, Aciduria Glicólica, Lipidose de Glicolípidos, Gangliosidose GM2 de Tipo 1, Gangliosidose GM2 de Tipo 1, GNPTA, Tiroidite Auto-imune Bociosa, Sindrome de Goldenhar, Sindrome de Goldenhar-Gorlin, Doença de Goldscheider, Sindrome de Goltz, Sindrome de Goltz-Gorlin, Disgenesia Gonadal 45 X, Disgenesia Gonadal XO, Goniodisgenesia-Hipodontia, Sindrome de Goodman, Goodman, Sindrome de Goodpasture, Sindrome de Gordon, Sindrome de Gorlin, Sindrome de Gorlin-Chaudhry-Moss, Eritroqueratodermia Congénita Progressiva Simétrica de Gottron, Sindrome de Gottron, Sindrome de Gougerot-Carteaud, Epilepsia Tipo Grand Mal, Distrofia Cornenana de Tipo Granular, Arterite Granulomatosa, Colite Granulomatosa, Dermatite Granulomatosa com Eosinofilia, Ileíte Granulomatosa, Doença de Graves, Hipertireoidismo de Graves, Doença de Graves, Sindrome de Cefalopolisindactilia de Greig, Distrofia Cornenana de Groenouw de Tipo I, Distrofia Cornenana de Groenouw de Tipo II, Sindrome de Gronblad-Strandberg, Sindrome de Grotton, Deficiência de Recetor da Hormona do Crescimento, Deficiência de Proteína de Ligação à Hormona do Crescimento, Deficiência de Hormona do Crescimento, Sindrome de Insuficiência de Crescimento-Mental de Myhre, Atraso do Crescimento-Anomalia de Rieger, GRS, Sindrome de Gruber, GS, GSD6, GSD8, GTS, Deficiência de Guanosina Trifosfato-Ciclo-hidrolase, Deficiência de Guanosina Trifosfato-Ciclo-hidrolase, Porfiria de Guenther, Sindrome de Guerin-Stem, Guillain-Barré, Sindrome de Guillain-Barre, Doença de Gunther, Doença H, Sindrome de H. 94

Gottron, Síndrome de H. Gottron, Espasmos do Hábito, HAE, Deficiência do Fator de Hageman, Fator de Hageman, Sindrome de Haim-Munk, Sindrome de Hajdu-Cheney, Hajdu Cheney, Deficiência de HAL, Sindrome de Hall-Pallister, Sindrome de Hallermann-Streiff-Francois, Sindrome de Hallermann-Streiff, Doença de Hallervorden-Spatz, Sindrome de Hallervorden-Spatz, Doença de Hallopeau-Siemens, Polidactilia Pós-axial de Duplicação de Hallux e Ausência de Corpo Caloso, Sindrome de Halushi-Behcet, Hamartoma dos Tecidos Linfáticos, Sindrome de Hand-Schueller-Christian, HANE, Sindrome de Hanhart, Sindrome da Boneca Alegre, Sindrome de Harada, Sindrome de HARD +/-E, Sindrome de HARD, Lábio Leporino, Feto de Arlequim, DOC 6 de Tipo Arlequim, Ictiose de Tipo Arlequim, Ictiose de Tipo Arlequim, Sindrome de Harley, Sindrome de Harrington, Sindrome de Hart, Doença de Hartnup, Distúrbio de Hartnup, Sindrome de Hartnup, Doença de Hashimoto, Sindrome de Hashimoto-Pritzker, Sindrome de Hashimoto, Tiroidite de Hashimoto, Tiroidite de Hashimoto, Sindrome de Hashimoto-Pritzker, Sindrome de Hay Well, Sindrome de Hay-Well da Displasia Ectodérmica, HCMM, HCP, HCTD, HD, Sindrome Coração-Mão (Tipo Holt-Oram) , Doença Cardíaca, Síndrome de Hecht, HED, Síndromes de Heerferdt-Waldenstrom e Lofgren, Doença de Hegglin, Síndrome de Heinrichsbauer, Hemangiomas, Hemangioma Familiar, Síndrome de Hemangioma-Trombocitopenia, Hemangiomatose Condrodistrófica, Síndrome Hemangiomatosa de Fendas Branquiais-Pseudofendas do Lábio, Microsomia Hemifacial, Hemimegalencefalia, Hemiparesia de Paralisia Cerebral, Hemiplegia de Paralisia Cerebral, Hemissecção da Medula espinal, Hemocromatose, Síndrome de Hemocromatose, Amiloidose relacionada com Hemodiálise, Síndromes de Hemoglobina Lepore, Anemia Hemolítica de Recém-nascidos, Anemia Hemolítica de Anticorpo Frio, Doença Hemolítica de Recém-nascidos, Síndrome Hemolítica-Urémica, Síndrome Hemolítica-Urémica, Hemofilia, Hemofilia A, 95

Hemofilia B, Hemofilia B Fator IX, Hemofilia C, Trombocitopenia Distrófica Hemorrágica, Aleucemia Hemorrágica, Hemosiderose, Deficiência de Frutocinase Hepática, Deficiência de Fosforilase Cinase Hepática, Porfiria Hepática, Porfirias Hepáticas, Porfirias Hepáticas, Doença Veno-Oclusiva Hepática, Sindrome Hepato-Renal, Degenerescência Hepatolenticular, Deficiência de Hepatofosforilase, Glicogenose Hepatorrenal, Sindrome Hepatorrenal, Tirosinamia Hepatorrenal, Acromelalgia Hereditária, Alcaptonúria Hereditária, Amiloidose Hereditária, Angioedema Hereditário, Distasia Arrefléxica Hereditária, Heredopatia Polinauritiforme Atactica Ataxia Hereditária, Ataxia Hereditária, Ataxia Hereditária de Tipo Friedrich, Acantose Nigricans Benigna Hereditária, Ataxia Cerebelosa Hereditária, Coreia Hereditária, Coreia Progressiva Crónica Hereditária, Distúrbios Hereditários do Tecido Conjuntivo, Coproporfiria Hereditária, Coproporfiria Porfiria Hereditária, Melanoma Cutâneo Maligno Hereditário, Surdez-Retinite Pigmentosa Hereditária, Distúrbio de Deficiência de Zinco Hereditário, DNS Hereditária, Lipidose Distrófica Hereditária, Enfisema Hereditário, Intolerância Hereditária à Frutose, Telangiectasia Hemorrágica Hereditária, Telangiectasia Hemorrágica Hereditária de Tipo I, Telangiectasia Hemorrágica Hereditária de Tipo II, Telangiectasia Hemorrágica Hereditária de Tipo III, Hiperuricemia Hereditária e Sindrome de Coreoatetose, Leptocitose Principal Hereditária, Leptocitose Secundária Hereditária, Linfedema Hereditário, Linfedema Tarda Hereditário, Linfedema Tipo I Hereditário, Linfedema Tipo II Hereditário, Neuropatia Sensorial Motora Hereditária, Neuropatia Sensorial Motora Hereditária I, Neuropatia Sensorial Motora Hereditária Tipo III, Nefrite Hereditária, Nefrite Hereditária e Surdez Nervosa, Amiloidose Nefropática Hereditária, Nefropatia e Surdez Hereditária, Cancro Colorretal não Polipose Hereditário, Carcinoma 96

Colorretal não Polipose Hereditário, Anemia Hemolitica não Esferocitica Hereditária, Onicoosteodisplasia Hereditária, Neurorretinopatia Óptica Hereditária, Polipose Hereditária,

Neuropatia Sensorial e Autónoma Hereditária Tipo I, Neuropatia Sensorial e Autónoma Hereditária Tipo II, Neuropatia Sensorial e Autónoma Hereditária Tipo III, Neuropatia Sensorial Motora Hereditária, Neuropatia Sensorial Hereditária tipo I, Neuropatia Sensorial

Hereditária Tipo I, Neuropatia Sensorial Hereditária Tipo II, Neuropatia Sensorial Hereditária Tipo III, Neuropatia Sensorial Radicular Hereditária Tipo I, Neuropatia Sensorial Radicular Hereditária Tipo I, Neuropatia Sensorial Radicular Hereditária Tipo II, Cancro de Sitio Especifico Hereditário, Anemia Hemolitica Esferocitica Hereditária, Esferocitose Hereditária, Tirosinamia Hereditária Tipo 1, Distúrbios Hereditários do Tecido Conjuntivo, Sindrome de Herlitz, Facomatose de Hermans-Herzberg, Sindrome de Hermansky-Pudlak, Sindrome de Hermansky-Pudlak, Hermafroditismo, Herpes Zoster, Herpes íris Tipo Stevens-Johnson, Doença de Hers, Talassemia Beta Heterozigótica, Deficiência de Subunidade Alfa de Hexoaminidase (Variante B), Deficiência de Subunidade Alfa de Hexoaminidase (Variante B) , HFA, HFM, HGPS, HH, HHHO, HHRH, HHT, Hérnia de Hiato-Microcefalia-Nefrose de Tipo Galloway, Hidradenite Supurativa, Hidrosadenite Axilar, Hidrosadenite Supurativa, Displasias Ectodérmicas Hidróticas, Sindrome de HIE, Ânus Não Perfurado Alto, Potássio Alto, Omoplata Alto, HIM, Doença de Hirschsprung, Doença de Hirschsprung Adquirida, Doença de Hirschsprung Polidactilia de Ulnar & Dedo do Pé Grande e VSD, Doença de Hirschsprung com Braquidactilia de Tipo D, Hirsutismo, Deficiência de HIS, Deficiência de Histidina Amónia-Liase (HAL), Deficiência de Histidase, Histidinamia, Histidinamia, Histiocitose, Histiocitose X, HLHS, HLP Tipo II, HMG, HMI, HMSN I, HNHA, HOCM, Doença de Hodgkin, doença 97 de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin, Doença de Hollaender-Simons, Síndrome de Holmes-Adie, Deficiência de Holocarboxilase Sintetase, Holoprosencefalia, Complexo de Malformação de Holoprosencefalia, Sequência de Holoprosencefalia, Sindrome de Holt-Oram, Sindrome Coração-Mão de Tipo Holt-Oram, Homocistinemia, Homocistinúria, Homocistinúria, Deficiência de Ácido Homogentisico Oxidase, Acidura Homogentisica, Deficiência de Alfa-l-Antitripsina Homozigótica, HOOD, Sindrome de Homer, doença de Horton, HOS, H0S1, Acrondrogénese de Tipo Houston-Harris (Tipo IA), HPS, HRS, HS, HS, HS, HS, HS, HSAN Tipo I, HSAN Tipo II, HSAN-III, HSMN, HSMN Tipo III, HSN I, HSN-III, Doença de Huebner-Herter, Adesivo de Hunner, Úlcera de Hunner, Sindrome de Hunter, Sindrome de Hunter, Displasia Acromesomélica Tipo Hunter-Thompson, Coreia de Huntington, doença de Huntington, Doença de Hurler, Doença de Hurler, Sindrome de Hurler, Sindrome de Hurler-Scheie, HUS, HUS, Sindrome de Hutchinson-Gilford Progeria, Sindrome de Hutchinson-Gilford, Sindrome de Hutchinson-Weber-Peutz, Sindrome de Hutchinson-Weber-Peutz, Sindrome de Huterite de Tipo Bowen-Conradi, Panneuropatia Hialina, Hidranencefalia, Hidrocéfalo, Hidrocéfalo Agiria e Displasia Retiniana, Hidrocéfalo Interno de Tipo Dandy-Walker, Hidrocéfalo não Comunicante de Tipo Dandy-Walker, Hidrocefalia, Hidronefrose Com Expressão Facial Peculiar, Deficiência de Hidroxilase, Higroma Colli, Sindrome de Hiper-IgE, Sindrome de Hiper-IgM, Sindrome de Hiper-IgM, Hiperaldosteronismo, Hiperaldosteronismo Com Alcalose Hipocalémica, Hiperaldosteronismo Sem Hipertensão, Hiperamonemia, Hiperamonemia Devido a Deficiência de Carbamilfosfato Sintetase, Hiperamonemia Devido a Deficiência de Ornitina Transcarbamilase, Hiperamonemia Tipo II, Carnosinemia Hiper-Beta, Hiperbilirrubinemia I, Hiperbilirrubinemia II, Hipercalcemia Familiar com Nefrocalcinose e Indicanuria, Hipercalcemia-Estenose Aórtica Supravalvar, Raquitismo 98

Hipercalciúrico, Acidose Hipercnápica, Enteropatia Hipercatabólica com Perda de Proteína, Acidose Hiperclorémica, Hipercolesterolemia, Hipercolesterolemia Tipo IV, Hipercilomicronemia, Hipercistinuria, Hipereplexia, Articulações Hiperextensíveis, Púrpura Hiperglobulinémica, Hiperglicinamia com Cetoacidose e Acidose Láctica de Tipo Propiónica, Hiperglicinamia não Cetótica, Hipogonadismo Hipergonadotrófico, Síndrome de Hiperimunoglobulina E, Síndrome de Hiperimunoglobulina E-Infeção Recorrente, Hiperimunoglobulinemia E-Estafilocócica, Hipercalemia, Síndrome Hipercinética, Retinite Hiperlipidémica, Hiperlipidemia I, Hiperlipidemia IV, Hiperlipoproteinemia Tipo I, Hiperlipoproteinemia Tipo III, Hiperlipoproteinemia Tipo IV, Hiperoxalúria, Hiperfalangia-Clinodactilia do Dedo Indicador com Síndrome de Pierre Robin, Hiperfenilalanemia, Epidermólise Bolhosa Hiperplásica, Hiperpneia, Hiperpotassemia, Hiperpré-beta-Lipoproteinemia, Hiperprolinamia Tipo I, Hiperprolinamia Tipo II, Hiperesplenismo, Hipertelorismo com Anormalidades Esofágicas e Hipospadia, Síndrome de Hipertelorismo-Hipospadia, Cardiomiopatia Hipertrófica, Neuropatia Intersticial Hipertrófica, Nevrite Intersticial Hipertrófica, Radiculoneuropatia Intersticial Hipertrófica, Neuropatia Hipertrófico de Refsum, Cardiomiopatia Obstrutiva Hipertrófica, Síndrome de Hiperuricemia Coreoatetose Auto-mutilação, Hiperuricemia-Oligofrenia, Hipervalinemia, Tipo Hipocalcifiçado (Hipomineralizado), Hipocondrogénese, Hipocrondroplasia, Hipogamaglobulinemia, Hipogamaglobulinemia Transitória da Infânia, Distrofia Hipogenital com Tendência Diabética, Síndrome de Hipoglossia-Hipodactilia, Hipoglicemia, Hipoglicemia, Hipoglicemia Exógena, Hipoglicemia com Macroglossia, Síndrome de Hipoglicosilação Tipo la, Síndrome de Hipoglicosilação de Tipo la, Hipogonadismo com Anosmia, Hipogonadismo Hipogonadotrófico e Anosmia, Displasia 99

Ectodérmica Hipoidrótica, Displasia Ectodérmica Hipoidrótica Autossómica de tipo Dominante, Displasias Ectodérmicas Hipoidróticas Autorrecessivas, Hipocalemia, Alcalose Hipocalémica com Hipercalciúria, Sindrome Hipocalémica, Hipolactasia, Tipo Hipomaturação (Dentes Cobertos de Neve), Hipomelanose de Ito, Sindrome de Hipomelia-Hipotricose-Hemangioma Facial, Neuropatia de Hipomielinização, Hipoparatireoidismo, Hipofosfatasia, Raquitismo Hipofosfatémico com Hipercalcemia, Hipopigmentação, Hipopigmentação, Lesão Macular Hipopigmentada, Hipoplasia do Depressor do Ângulo do Músculo Oris com Defeitos Cardíacos, Anemia Hipoplástica, Anemia Congénita Hipoplástica, Condrodistrofia Hipoplástica, Esmalte Hipoplástico-Onicolise-Hipoidrose, Tipo Hipoplástico (Hipoplástico-Explástico), Sindrome do Coração Esquerdo Hipoplástico, Sindrome do Coração Esquerdo Hipoplástico, Polegares Trifalângicos Hipoplásticos, Sindrome de Hipopotassemia, Sindrome de Hipospadia-Disfagia, Hiposmia, Hamartoblastoma Hipotalâmico Hipopituitarismo Ânus não Perfurado Polidactilia, Infantilismo Hipotalâmico-Obesidade, Hipotiroidismo, Sindrome de Hipotonia-Hipomentia-Hipogonadismo-Obesidade, Defeito de Hipoxantina-Guanina Fosforibosiltranferase (Ausência Completa de) , Doença da Célula I, Hipoglicemia Iatrogénica, IBGC, Sindrome de IBIDS, IBM, IBS, IC, Doença da Célula I, ICD, Sindrome de ICE de Tipo Cogan-Reese, Amiloidose de Tipo islandesa (Tipo VI), Doença da Célula I, Envolvimento de Eritroderma Cornenano Ictiosiforme e Surdez, Eritroderma Ictiosiforme Anormalidade de Crescimento de Cabelo e Homens, Eritroderma Ictiosiforme com Vacuolização de Leucócitos, Ictiose, Ictiose Congénita, Ictiose Congénita com Tricotiodistrofia, Ictiose Histrix, Ictiose Histrix Gravior, Ictiose Linear Circunflexa, Ictiose Simplex, Sindrome de Ictiose Tay, Ictiose Vulgar, Ictiose Vulgar, Doença de Acumulação Ictiotípica de Lípidos 100 neutros, Leptospirose Ictérica, Leptospirose Ictero-hemorrágica, Icterícia (Crónica Familiar), Icterícia Grave do Recém-nascido, Icterícia Intermitente Juvenil,

Hipoventilação Alveolar Idiopática, Amiloidose Idiopática, Arterite Idiopática de Takayasu, Calcificação Idiopática dos Gânglios Basais (IBGC), Neuropatia Idiopática do Plexo Braquial, Distonia Cervical Idiopática, Dilatação

Idiopática da Artéria Pulmonar, Dilatação Idiopática da

Artéria Pulmonar, Paralisia Facial Idiopática, Hiperlipemia Idiopática Familiar, Estenose Subaórtica Hipertrófica

Idiopática, Hipoproteinemia Idiopática, Deficiência Idiopática de Imunoglobulina, Hepatite Neonatal Idiopática, Colite Ulcerosa Não específica Idiopática, Colite Ulcerosa Idiopática Não Específica, Periflebite Periférica

Idiopática, Fibrose Pulmonar Idiopática, Anemia Sideroblástica Refractária Idiopática, Anemia

Sideroblástica Refractária Idiopática, Hematúria Renal Idiopática, Estearreia Idiopática, Trombocitémia

Idiopática, Trombocitémia Idiopática, Trombocitopénica

Idiopática Púrpura, Trombocitopenia Idiopática Púrpura (ITP), IDPA, IDPA, Nefropatia de IgA, Nefropatia de IgA, IHSS, Ileíte, Ileocolite, Amiloidose de Tipo Illinois, ILS, IM, IMD2, IMD5, IMD5, Defeito Imune Devido a Ausência de

Timo, Anemia Imunodeficiência Imunodeficiência Imunoglobulina, Classificável, Imunodeficiência

Hemolítica Paroxística Imune Fria, com Ataxia Telangiectasia,

Celular com Síntese Anormal de Imunodeficiência Comum Variável Não

Imunodeficiência com Hiper-IgM, com Leucopenia, Imunodeficiência-2, Imunodeficiência-5 (IMD5), Deficiência de Imunoglobulina, Ânus não Perfurado, Ânus não Perfurado com Anomalias da Mão Pé e Orelha, Canal Nasolacrimal não Perfurado e Síndrome do Envelhecimento Prematuro, Síndrome Neutrófila Impotente, Incapacidade para Abrir Completamente a Boca e Dedo-Flexor Curto, INAD, INAD, Erro Inato de Síntese de Ureia de Tipo 101

Arginase, Erro inato de Síntese de Ureia de Tipo Arginino Succínico, Erros inatos de Síntese de Ureia de Tipo Carbamil Fosfato, Erro inato de Síntese de Ureia de Tipo Citrulinemia, Erros inatos Síntese de Ureia de Tipo Glutamato Sintetase, INCL, Miosite de Corpo de Inclusão, Defeito do Septo Auriculoventricular Incompleto; Feminização Testicular Incompleta, Feminização Testicular Incompleta, Incontinência Pigmentar, Incontinência Pigmentar, Incontinência Pigmentar Acromiante, Anomalia do Dedo Indicador com Síndrome de Pierre Robin, Amiloidose de Tipo Indiana (Tipo II) , Mastocitose Sistémica Indolente, Afasia Infantil Adquirida, Doença Renal Poliquística Autossómica Recessiva Infantil, Beriberi Infantil, Gangliósido Cerebral Infantil, Gangliósido Cerebral Infantil, Paralisia Cerebral Infantil, Cistinose Infantil, Epilepsia Infantil, Síndrome de Fanconi com Cistinose Infantil, Ceroidolipofuscinose Neuronial Infantil de Tipo finlandês, Doença de Gaucher Infantil, Hipoglicemia Infantil, Hipofasfatasia Infantil, Enfisema Lobar Infantil, Encefalopatia Mioclónica Infantil, Encefalopatia Mioclónica e Polimioclonia Infantil, Miofibromatose Infantil, Encefalopatia Necrosante Infantil, Ceroidolipofuscinose Neuronial Infantil, Distrofia Neuroaxonal Infantil, Doença de Schindler de Início na Infância, Doença Infantil de Acumulação de Ácido Fitânico, Doença de Refsum Infantil (IRD), Gangliosideose GM-2 Sipoidose Infantil (Tipo S) , Gangliosideose GM-2 Sipoidose Infantil (Tipo S, Apneia do sono Infantil, Espasmos Infantis, Atrofia Muscular Espinhal Infantil (de todos os tipos), Atrofia Muscular Espinhal Infantil ALS, Atrofia Muscular Espinhal Infantil Tipo I, Ceroidolipofuscinose Neuronial de Tipo Infantil, Icterícia Infecciosa, Cancro da Mama Inflamatório, Sindrome Inflamatória de Nevo Linear Sebáceo; Iniencefalia, Acantose Nigricans Resistente a Insulina, Lipodistrofia de Insulina, Diabetes Insulino-dependente, Mioclonia, Cistinose 102

Intermediária, Leucinose Intermediária, Ataxia Intermitente com Deficiência de Piruvato Desidrogenase, Ataxia Intermitente com Deficiência de Piruvato Desidrogenase, Leucinose Intermitente, Hidrocéfalo Interno, Cistite Intersticial, Supressão Intersticial de 4q Incluso, Supressão Intersticial de 4q- Incluso, Lipodistrofia Intestinal, Granulomatose Lipofágica Intestinal, Linfangiectasia Intestinal, Polipose Intestinal I, Polipose Intestinal II, Polipose Intestinal II, Polipose Intestinal III, Sindrome de Polipose Intestinal-Pigmentação Cutânea, Sindrome de Polipose Intestinal-Pigmentação Cutânea, Pseudoobstrução Intestinal com Oftalmoplegia Externa, Neoplasma Intracraniano, Tumores Intracranianos, Malformações Vasculares Intracranianas, Nanismo Intrauterino, Sinéquias Intrauterinas, Sorriso Invertido e Bexiga Neuropática Oculta, Amiloidose de Tipo Iowa (Tipo IV) , IP, IPA, Sindrome Endotelial Iridocorneana, Sindrome Endotelial Iridocorneana (ICE) de Tipo Cogan-Resse, Iridogoniodisgenesia Com Anomalias Somáticas, Atrofia da íris com Edema e Glaucoma Cornenano, Sindrome do Nevo da íris, Anemia de Excesso de Ferro, Anemia de Excesso de Ferro, Doença de Excesso de Ferro, Sindrome do Intestino Irritável, Sindrome do Cólon Irritável, Sindrome de Isaacs, Sindrome de Isaacs-Merten, Cardiomiopatia Isquémica, Sequência de Lissencefalia Isolada, Amiloidose de Isoleucina 33, Deficiência de Ácido Isovalérico CoA Desidrogenase, Acidemia Isovalérica, Acidemia Isovalérica, Deficiência de Isovaleril CoA Carboxilase, Hipomelanose de ITO, ITO, ITP, ITP, IVA, Sindrome de Ivemark, Quistos de Iwanoff, Convulsão de Jackknife, Craniossinostose de Jackson-Weiss, Sindrome de Jackson-Weiss, Epilepsia Jacksoniana, Sindrome de Jacobsen, Sindrome de Jadassohn-Lewandowsky, Doença de Jaffe-Lichenstein, Doença de Jakob, Doença de Jakob-Creutzfeldt, Janeway I, Disgamaglobulinemia de Janeway, Disostose Metafisária de Jansen, 103

Condrodisplasia Metafisária de Tipo Jansen, Síndrome de Jarcho-Levin, Maxilar Tremente, JBS, JBS, JDMS, Sindrome de Jegher, Sindrome de Jegher, Atresia Jejunal, Jejunite, Jejunoileite, Sindrome de Jervell e Lange-Nielsen, Sindrome de Jeune, JMS, Sindrome de Job, Sindrome de Job-Buckley, Sindrome de Johanson-Blizzard, John Dalton, Doença de Johnson-Stevens, Alopecia de Jonston, Doença de Joseph, Doença de Joseph Tipo I, Doença de Joseph Tipo II, Doença de Joseph Tipo III, Sindrome de Joubert, Sindrome de Joubert-Bolthauser, JRA, JRA, Sindrome de Juberg Hayward, Sindrome de Juberg-Marsidi, Sindrome de Atraso Mental de Juberg-Marsidi, Francês Saltador, Francês Saltador de Maine, Artrite Juvenil, Artrite Juvenil, Doença Renal Poliquistica Autossómica Recessiva Juvenil, Cistinose Juvenil, Dermatomiosite Juvenil (Infância) (JDMS) , Diabetes Juvenil, Doença de Gaucher Juvenil, Sindrome de Gota Juvenil Coreoatetose e Atraso Mental, Má Absorção Intestinal Juvenil de Vit B12, Má Absorção Intestinal Juvenil de Vitamina B12, Degenerescência Macular Juvenil, Anemia Perniciosa Juvenil, Retinosquise Juvenil, Artrite Reumatoide Juvenil, Artrite Reumatoide Juvenil, Atrofia Muscular Espinhal Inclusa Juvenil, Atrofia Muscular Espinhal ALS Inclusa Juvenil, Atrofia Muscular Espinhal de Tipo III Juvenil, Adipose Dolorosa Justa-Articular, Adipose Dolorosa Justa-Articular, Hiperplasia Justaglomerular, Sindrome de Maquiagem de Kabuki, Doença de Kahler, Sindrome de Kallmann, Sindrome de Kanner, Doença de Kanzaki, Doença de Kaposi (não Sarcoma de Kaposi), Deficiência de Cadeia Leve kappa, Sindrome de Karsch-Neugebauer, Sindrome de Karsch-Neugebauer, Sindrome de Kartagener-Doença Sinobronquial Crónica e Dextrocardia, Triade de Kartagener, Sindrome de Kasabach-Merritt, Sindrome de Kast, Doença de Kawasaki, Sindrome de Kawasaki, Sindrome de KBG, KD, Doença de Kearns-Sayre, Sindrome de Kearns-Sayre, Síndrome de Kearns-Sayre, Doença de Kennedy, Síndrome de Kennedy, 104

Atrofia Muscular Espinal e Bulbar de Tipo Kennedy, Doença de Kennedy-Stefanis, Doença de Kenny, Sindrome de Kenny, Estenose Tubular de Tipo Kenny, Sindrome de Kenny-Caffe, Kera. Palmoplant. Con. Pes Planus Ony. Periodon. Arach., Sindrome de Queratite Ictiose Surdez, Ceratocone, Ceratocone, Ceratocone Posticus Circunscrito, Ceratólise, Ceratólise Exfoliativa Congénita, Eritema Queratolitico de Inverno, Ceratomalacia, Queratose Folicular, Queratose Folicular Espinulosa Decalvante, Queratose Folicular Espinulosa Decalvante Ictiose, Queratose Nigricans, Queratose Palmoplantar com Periodontopatia e Onicogripose, Queratose Palmoplantar Congénita Pes Planus Onicogripose Periodontose Aracnodactilia, Queratose Palmoplantar Congénita, Pes Planus, Onicogripose, Periodontose, Aracnodactilia, Acro-osteólise, Queratose Rubra Figurada, Queratose Seborreica, Deficiência de Cetoácido Descarboxilase, Cetoaciduria, Glicinamia Cetótica, Glicinamia Cetótica, KFS, Sindrome de KID, Agenesia Renal, Sindrome de Joubert de Rins Quísticos-Aplasia Retiniana, Sindrome de Killian, Sindrome de Killian/Teschler-Nicola, sindrome de Kiloh-Nevin III, Doença dos Cabelos Crespos, Sindrome de Kinsboume, Deformidade de Kleeblattschadel, Sindrome de Kleine-Levin, Sindrome de Hibernação de Kleine-Levin, Klinefelter, Sindrome de Klippel-Feil, Sindrome Klippel-Feil de Tipo I, Sindrome de Klippel-Feil de Tipo II, Sindrome de Klippel-Feil de Tipo III, Sindrome de Klippel Trenaunay, Sindrome de Klippel-Trenaunay-Weber, Sindrome de Kluver-Bucy, KMS, Displasia de Kniest, Sindrome de Kniest, Doença de Kobner, Sindrome de Koebberling-Dunnigan, Doença de Kohlmeier-Degos, Doença de Kok, Psicose de Korsakoff, Sindrome de Korsakoff, Doença de Krabbe Inclusa, Leucodistrofia de Krabbe, Sindrome de Kramer, KSS, KSS, KTS, Sindrome de KTW, Doença de Kufs, Doença de Kugelberg-Welander, Doença de Kugelberg-Welander, Sindrome de Kugelberg-Welander, Sindrome de Kugelberg-Welander, 105 Síndrome de Kugelberg-Welander, Paralisia de Kussmaul-Landry, KWS, Deficiência de L-3-Hidroxi-Acil-CoA Desidrogenase (LCHAD), Sindrome de Laband, Sindrome de Labhart-Willi, Sindrome Labirintica, Hidropisia Labirintica, Sindrome Lacrimo-Auriculo-Dento-Digital, Intolerância Isolada à Lactase, Deficiência de Lactase, Atrofia do Útero na Lactação, Acidose Láctica Neuropatia Óptica Hereditária de Leber, Acidemia Láctica e Piruvato com Sensibilidade a Hidratos de Carbono, Acidemia Láctica e Piruvato com Ataxia Episódica e Fraqueza, Acidemia Láctica e Piruvato com Sensibilidade a Hidratos de Carbono, Láctico e Piruvato, Acidose Láctica, Intolerância à Lactose da Idade Adulta, Intolerância à Lactose, Intolerância à Lactose na Infância, Intolerância à Lactose, Sindrome de LADD, LADD, Doença de Lafora Inclusa, Doença do Corpo de Lafora, Deficiência de Fator de Laki-Lorand, LAM, Ictiose Tipo Lambert, Sindrome de Lambert-Eaton, Sindrome Miasténica de Lambert-Eaton, Ictiose Lamelar Recessiva, Ictiose Lamelar Recessiva, Ictiose Lamelar, Ictiose Lamelar Recessiva, Espiroquetose de Lancereaux-Mathieu-Weil, Sindrome de Landau-Kleffner, Distrofia Muscular de Landouzy Dejerine, Paralisia Ascendente de Landry, Acondrogénese de Tipo Langer-Salidino (Tipo II), Sindrome de Langer Giedion, Granulomatose das Células de Langerhans, Histiocitose das Células de Langerhans (LCH), Grande Defeito Auricular e Ventricular, Nanismo de Laron, Nanismo Pituitário de Tipo Laron, Sindrome de Larsen, Distonia Laringea, Latah (Observado na Malásia), Distrofia Neuroaxonal Infantil Tardia, Distrofia Neuroaxonal Infantil Tardia, Sindrome de Cockayne de Tipo III de Inicio Tardio (Tipo C), Distonia de Inicio Tardio, Deficiência de Imunoglobulina de Inicio Tardio, Deficiência de Imunoglobulina de Inicio Tardio, Esclerose Cerebral de Pelizaeus-Merzbacher de Inicio Tardio, Distrofia Cornenana de Malha, Distrofia de Malha, Launois-Bensaude, Sindrome de Launois-Cleret, Sindrome de 106

Laurence, Síndrome de Laurence-Moon, Laurence-Moon/Bardet-Biedl, Síndrome de Lawrence-Seip, LCA, Deficiência de LCAD, LCAD, LCAD, LCAD, Deficiência de LCADH, LCH, LCHAD, LCHAD, LCPD, Síndrome de Le Jeune, Síndrome de Leband, Amaurose de Leber, Amaurose Congénita de Leber, Ausência Congénita de Bastonetes e Cones, Degenerescência Tapetorretinal Congénita de Leber, Displasia Tapetorretinal Congénita de Leber, Doença de Leber, Atrofia Óptica de Leber, Neuropatia Óptica de Leber, Fibrose Ventricular Esquerda, Úlcera na Perna, Doença de Legg-Calve-Perthes, Doença de Leigh, Doença de Leigh, Síndrome de Leigh, Síndrome de Leigh (Encefalomielopatia Necrosante Subaguda), Encefalopatia Necrosante de Leigh, Síndrome de Lennox-Gastaut, Lentigio-Polipose-Síndrome Digestiva, Lentigio-Polipose-Síndrome Digestiva, Síndrome Dismorfogénica de Lenz, Displasia de Lenz, Síndrome de Microftalmia de Lenz, Síndrome de Lenz, Síndrome de LEOPARD, Leprechaunismo, Leprechaunismo, Angiotomatose Leptomeníngea, Icterícia Leptospiral, Doença de Leri-Weill, Discondrosteose de Leri-Weil, Síndrome de Leri-Weil, Síndrome de Lermoyez, Doença de Leroy, Síndrome de Lesch Nyhan, Cardiomiopatia Letal Infantil, Nanismo Neonatal Letal, Osteocondrodisplasia Letal, Doença de Letterer-Siwe, Anomalia Leucocitária do Albinismo, Inclusões Leucocitárias com Anormalidade de Plaquetas, Leucodistrofia, Leucodistrofia com Fibras de Rosenthal, Leucoencefalite Periaxial Concêntrica, Síndrome de Levine-Critchley, Levulosuria, Síndrome de Levy-Hollister, LGMD, LGS, LHON, LHON, LIC, Líquen Rubro Acuminatus, Líquen Acuminatus, Amiloidose de Líquen, Líquen plano, Psoríase de Líquen, Síndrome de Lignac-Debre-Fanconi, Síndrome de Lignac-Fanconi, Conjuntivite Lenhosa, Distrofia Muscular da Cintura, Distrofia Muscular da Cintura, Síndrome de Malformações de Membro-Dento-Digital, Dextrinose Limite,

Hipermelanose Nevoide Linear, Síndrome de Nevo Sebáceo Linear, Esclerodermia Linear, Sequência de Nevo Sebáceo 107

Linear, Síndrome de Nevo Sebáceo Linear, Lingua Fissurada, Lingua Sulcada, Lingua Scrotalis, Discinesia Linguofacial, Sindrome de Pseudofenda do Lábio- Quisto Branquial hemangiomatoso, Granulomatose Lipidica, Histiocitose Lipidica, Tipo Cerasina de Lipido, Doença de Acumulação de Lipidos, Miopatia de Acumulação de Lipidos Associada a Deficiência de SCAD, Lipidose Gangliósida Infantil, Lipidose Gangliósida Infantil, Diabetes Mellitus Lipoatrófica, Lipodistrofia, Distrofia Cornenana Lipoide, Hiperplasia Lipoide-Pseudo-hermafroditismo Masculino, Hiperplasia Lipoide-Pseudo-hermafroditismo Masculino, Lipomatose Congénita do Pâncreas, Lipomucopolissacaridose Tipo I, Lipomielomeningocele, Deficiência de Lipoproteína Lipase Familiar, LIS, LIS1, Lissencefalia 1, Lissencefalia Tipo I, V deariantes Lissencefalia com agenesia do corpo caloso hipoplasia cerebelosa ou outras anomalias, Doença de Little, Deficiência Hepática de Fosforilase, LKS, Sindrome de LM, Atrofia Lobar, Atrofia Lobar do Cérebro, Holoprosencefalia Lobar, Enfisema de Tensão Lobar na Infância, Doença de Lobstein (Tipo I), Deformidade de Lobster Claw, Deformidade de Lobster Claw, Epidermólise Bolhosa Localizada, Lipodistrofia Localizada, Nevrite de Cintura Escapular Localizada, Doença de Loeffler, Fibrose Endomiocárdica de Loeffler com Eosinofilia, Endocardite Parietal Fibroplástica de Loeffler, Síndrome de Loken, Síndrome de Loken-Senior, Desidrogenase da Cadeia Longa de 3-hidroxiacil-CoA (LCHAD), Deficiência de Desidrogenase da Cadeia Longa de Acil CoA, Desidrogenase da Cadeia Longa de Acil-CoA (ACADL), Deficiência de Desidrogenase da Cadeia Longa de Acil-CoA, Síndrome de QT Longo sem Surdez, Doença de Lou Gehrig, Doença de Lou Gehrig Inclusa, Síndrome de Louis-Bar, Açúcar Baixo no Sangue, Deficiência de Beta Lipoproteína de Baixa Densidade, Ânus Baixo não Perfurado, Síndrome de Potássio Baixo, síndrome de Lowe, Síndrome de Lowe, Síndrome de Lowe-Bickel, Síndrome de Lowe-Terry- 108

MacLachlan, LS, LS, LTD, Síndrome de Lubs, Síndrome de Lubs, Doença de Luft, Estenose do Canal Lombar, Estenose Espinhal Lombar, Estenose Espinhal Lombossagrada, Doença de Lundborg-Unverricht, Doença de Lundborg-Unverricht Inclusa, Lúpus, Lúpus, Lúpus Eritematoso, Atresia de Foramina de Luschka-Magendie, Sindrome de Lyell, Sindrome de Lyelles, Bócio Linfadenoide, Enteropatia Linfangiectásica com Perda de Proteina, Linfangioleiomatose, Linfangioleimiomatose, Linfangiomas, Malformações Linfáticas, Sindromes de Lynch, Sindrome de Lynch I, Sindrome de Lynch II, Deficiência de Alfa-N-Acetilgalactosaminidase Lisossómica de Tipo Schindler, Doença de Acumulação Lisossómica de Glicoaminoácido-Angioqueratoma de Corpo Difuso, Deficiência de Glucosidase Lisossómica, Deficiência de Glucosidase Lisossómica, MAA, Doença de Machado, Doença de Machado-Joseph, Macrencefalia, Macrocefalia, Macrocefalia Hemi-hipertrofia, Macrocefalia com Múltiplos Lipomas e Hemangiomata, Macrocefalia com Pseudopapiledema e Múltiplos Hemangiomatas, Macroglobulinemia, Macroglossia, Síndrome de Macroglossia-Onfalocele-Visceromegalia, Síndrome de Macrostomia Ablefaria, Macrotrombocitopenia Familiar de Tipo Bernard-Soulier, Degenerescência da Mácula Lútea, Amiloidose Macular, Degenerescência Macular, Degenerescência Macular Disciforme, Degenerescência Macular Senil, Distrofia Macular, Distrofia Cornenana de Tipo Macular, MAD, MAD, Doença de Madelung, Síndrome de Maffucci, Epilepsia Maior, Malabsorção, Malabsorção-Displasia Ectodérmica- Hipoplasia Nasal Alar, Maladie de Roger, Maladie de Tics, Malformação dos Membros e Rins Masculinos, Síndrome de Turner Masculina, Acantose Maligna, Acantose Nigricans Maligna, Astrocitoma Maligno, Papulose Atrófica Maligna, Febre Maligna, Hiperfenilalaninamia Maligna, Hiperfenilalaninamia Maligna, Hiperpirexia Maligna, Hipertermia Maligna, Melanoma Maligno, Tumores Malignos do Sistema Nervoso Central, Laceração de Mallory- 109

Weiss, Rutura de Mallory-Weiss, Sindrome de Mallory-Weiss, Doença Mamária de Paget, Ameloblastoma Mandibular, Disostose Mandibulofacial, Manosidose, Distrofia Cornenana de Tipo Mapa-Ponto-Impressão Digital, Leucinose, Leucinose, Doença Marmórea dos Ossos, Sindrome de Marchiafava-Micheli, Sindrome de Marcus Gunn Maxilar Tremente, Fenómeno de Marcus Gunn, Ptose de Marcus Gunn com Maxilar Tremente, Sindrome de Marcus Gunn, Sindrome de Marcus Gunn (Maxilar Tremente), Ptose de Marcus Gunn (com maxilar tremente), Sindrome de Marden-Walker, Distúrbio do Tecido Conjuntivo de Tipo Marden-Walker, Abiotrofia de Marfan, Sindrome de Marfan-Achard, Sindrome de Marfan, Sindrome de Marfan, Sindrome de Marfan I, Variante de Marfan, sindrome de Marfan-Achard, Sindrome de Hipermobilidade Marfanoide, Distrofia Cornenana Marginal, Ataxia de Marie, Ataxia de Marie, Doença de Marie, Doença de Marie-Sainton, Doença de Marie Strumpell, Espondilite de Marie-Strumpell, Sindrome de Marinesco-Sjogren, Sindrome de Marinesco-Sjogren-Gorland, Sindrome X Marcadora, Sindrome de Maroteaux Lamy, Displasia Acromesomélica de Tipo Maroteaux, Displasias Ectodérmicas de Marshall Com Defeitos Oculares e Auditivos, Sindrome de Marshall-Smith, Sindrome de Marshall, Surdez-Miopia-Catarata-Nariz Côncavo de Tipo Marshall, Sindrome de Martin-Albright, Sindrome de Martin-Bell, Sindrome de Martorell, Sindrome de MASA, Mioclonia Massiva, Leucemia de Mastócitos, Mastocitose, Mastocitose Com um Distúrbio Hematológico Associado, Distrofia Cornenana de Maumenee, Ameloblastoma Maxilar, Disostose Maxilofacial, Displasia Maxilonasal, Displasia Maxilonasal de Tipo Aglutinante, Sincinesia Maxilopalpebral, Anomalia de May-Hegglin, Deficiência de MCAD, MCAD, MCAD, MCAD, Doença de McArdle, McCune-Albright, MCD, Condrodisplasia Metafisária de Tipo McKusick, Condrodisplasia Metafisária de Tipo McKusick, MCR, MCTD, Sindrome de Meckel, Sindrome de Meckel-Gruber, Sindrome do Rosto com Fissura Mediana, Anemia 110

Mediterrânica, Desidrogenase da Cadeia Média da Acil-CoA (ACADM), Deficiência de Desidrogenase da Cadeia Média da Acil-CoA (MCAD), Deficiência de Desidrogenase da Cadeia Média da Acil-CoA, Deficiência de Desidrogenase da Cadeia Média da Acilo CoA, Doença Quistica Medular, Doença Quistica Medular, Rim Tipo Esponja Medular, MEF, Megaesófago, Megalocefalia, Megalocefalia com Inclusão Hialina, Doença de Alexander, Anemia Megaloblástica, Anemia Megaloblástica da Gravidez, Sindrome da Megalocórnea-Atraso Mental, Sindrome de Meier-Gorlin, Linfedema de Meige, Sindrome de Meige, Leucodistrofia Melanodérmica, Melanoplacia-Polipose Intestinal, Melanoplacia-Polipose Intestinal, Sindrome de MELAS, MELAS, Sindrome de Melkersson, Sindrome de Melnick-Fraser, Osteodisplastia de Melnick-Needles, Sindrome de Melnick-Needles, Lipodistrofia Membranosa, Sindrome de Mendes da Costa, Doença de Meniere, Doença de Ménière, Angiotomatose Capilar Meningea, Doença de Menkes, Sindrome de Menke I, Atraso Mental Afasia Braquibasia Polegares Aduzidos (MASA), Atraso Mental-Surdez-Anormalidades Esqueléticas-Rosto Grosseiro com Lábios Carnudos, Atraso Mental com Unhas dos Dedos das Mãos e Unhas dos Dedos dos Pés Hipoplásticas, Atraso Mental com Anormalidades Osteocartilaginosas, Atraso Mental-Atraso de Crescimento Relacionado com X-Surdez-Microgenitalismo, OPCA de Tipo Menzel, Sindrome da Sereia, MERRF, Sindrome de MERRF, MERRF, Sindrome de Merten-Singletoon, MES, Nefropatia IGA Mesangial, Lipodistrofia Mesentérica, Sindrome de Mesiodens-Catarata, Dismorfodistrofia Mesodérmica, Nanismo Mesomélico-Deformidade de Madelung, Acidose Metabólica, Leucodistrofia Metacromática, Metatarso Varo, Sindrome de Nanismo Metatrópico, Displasia Metatrópica, Displasia Metatrópica I, Displasia Metatrópica II, Acidemia Metilmalónica, Aciduria Metilmalónica, Doença de Meulengracht, MFD1, MG, MH, MHA, Microencefalia, Nanismo Primordial Microcefálico I, Microcefalia, Microcefalia- 111 Hérnia de Hiato-Nefrose de Tipo Galloway, Microcefalia-Hérnia de Hiato-Síndrome Nefrótica, Distrofia Cornenana Microcistica, Microcitemia, Microlissencefalia, Microftalmia, Microftalmia, Microftalmia ou Anoftalmos com Anomalias Associadas, Micropoligiria Com Distrofia Muscular, Sindrome Micrognatia da Patela com Microtia Ausente, Doença de Inclusão de Microvilosidade, MID, sindrome do Sopro Mesossistólico-clique-Sistólico Tardio, Sindrome de Miescher de Tipo I, Sindrome de Mikulicz, Sindrome de Mikulicz-Radecki, Sindrome de Mikulicz-Sjogren, Recessiva Autossómica Ligeira, Leucinose Intermediária Ligeira, Leucinose Ligeira, Sindrome de Miller, Sindrome de Miller-Dieker, Sindrome de Miller-Fisher, Doença de Milroy, Sindrome de Minkowski-Chauffard, Epilepsia Menor, Doença de Minot-Von Willebrand, Dextrocardia de Imagem no Espelho, Distúrbios da Beta-Oxidação Mitocondrial, Mitocondrial e Citosólica, Citopatia Mitocondrial, Citopatia Mitocondrial, Tipo Kearn-Sayre, Encefalopatia Mitocondrial, Encefalomiopatia Mitocondrial Acidose Láctica e Episódios Semelhantes a Ataque Cardíaco, Miopatia Mitocondrial, Miopatia Mitocondrial Encefalopatia Acidose Láctica Episódio Semelhante a Ataque Cardíaco, Deficiência de PEPCK Mitocondrial, Prolapso da válvula Mitral, Apneia Mista, Doença Mista do Tecido Conjuntivo, Doença Mista do Tecido Conjuntivo, Porfiria Hepática Mista, Afasia não Fluente Mista, Apneia do Sono Mista, Torcicolo Tónico e Clónico Misto, MJD, MKS, ML I, ML II, ML II, ML III, ML IV, Distúrbio ML de Tipo I, Distúrbio ML de Tipo II, Distúrbio ML de Tipo III, Distúrbio ML de Tipo IV, MLNS, Sindrome MMR, MND, MNGIE, MNS, Mobitz I; Mobitz II, Sindrome de Mobius, Sindrome de Moebius, Sindrome de Moersch-Woltmann, Sindrome de Mohr, Aplasia Moniliforme, Amnésia Visual Monomodal, Mononevrite Multiplex, Mononevrite Periférica, Mononeuropatia Periférica, Monossomia 3p2, Monossomia 9p Parcial, Monossomia llq Parcial, Monossomia 13q Parcial, 112 112 Anormalidades

Sindrome de Monossomia 18q, Monossomia X, Displasia Fibrosa Monostótica, Sindrome de Morgagni-Turner-Albright, Morféia, Doença de Morquio, Sindrome de Morquio, Sindrome de Morquio A, Sindrome de Morquio B, Sindrome de Morquio-Brailsford, Doença de Morvan, Tetrassomia de Mosaico 9p, Doença do Neurónio Motor, Doença do Neurónio Motor, Sindrome do Neurónio Motor, Doença do Neurónio Motor, Doença do Motoneurónio, Doença do Motoneurónio, Doença do Sistema Motor (Focal e Lenta), Doença de Moya-moya, Doença de Moyamoya, MPS, MPS I, MPS I H, Sindrome de MPS 1 H/S Hurler/Scheie, Sindrome de MPS I S Scheie, MPS II, MPS IIA, MPS IIB, MPS II-AR Sindrome Autossómica Recessiva de Hunter, MPS II-XR, MPS II-XR Recessiva Autossómica de Grave, MPS III, MPS III A B C e D Sanfiloppo A, MPS IV, MPS IV A e B Morquio A, MPS V, MPS VI, MPS VI Grave Maroteaux-Lamy Intermediário Ligeiro, MPS VII, Sindrome de MPS VII Sly, MPS VIII, Distúrbio de MPS, Distúrbio de MPS I, Distúrbio de MPS II, Distúrbio de MPS III, Distúrbio de MPS VI, Distúrbio de MPS Tipo VII, MRS, MS, MSA, MSD, MSL, MSS, MSUD, MSUD, MSUD Tipo Ib, MSUD Tipo II, Sindrome do Gânglio Linfático Mucocutâneo, Mucolipidose I, Mucolipidose II, Mucolipidose II, Mucolipidose III, Mucolipidose IV, Mucopolissacaridose, Mucopolissacaridose I-H, Mucopolissacaridose I-S, Mucopolissacaridose II, Mucopolissacaridose III, Mucopolissacaridose IV, Mucopolissacaridose VI, Mucopolissacaridose VII, Mucopolissacaridose Tipo I, Mucopolissacaridose Tipo II, Mucopolissacaridose Tipo III, Mucopolissacaridose Tipo VII, Mucosis, Mucossulfatidose, Colite Mucosa, Mucoviscidose, Nanismo de Mulibrey, Sindrome de Nanismo de Mulibrey, Aplasia do Dueto Mulleriano-Aplasia Renal-Displasia do Somito Cervicotorácico, Defeitos de Dueto Mulleriano-Renal-Cervicotorácico-Membro Superior, Agenesia do Dueto Mulleriano e Renal com Anomalias de Membro Superior e Costela, Anormalidades Mulleriano-Renal-Somito 113

Cervicotorácico, Demência por Enfarte Múltiplo de Tipo Binswanger, Doença Multicêntrica de Castleman, Granuloma Eosinofilico Multifocal, Deficiência Múltipla de Acil-CoA

Desidrogenase, Deficiência Múltipla de Acil-CoA Desidrogenase, Deficiência Múltipla de Acil-CoA Desidrogenase / Aciduria Glutárica Tipo II, Angiomas Múltiplos e Endocondromas, Deficiência Múltipla de Carboxilase, Encondromatose Cartilaginosa Múltipla,

Exostoses Cartilaginosas Múltiplas, Encondromatose Múltipla, Sindrome de Deficiência Endócrina Múltipla de Tipo II, Displasia Epifisária Múltipla, Exostoses Múltiplas, Sindrome de Exostoses Múltiplas, Polipose Familiar Múltipla, Sindrome de Lentigines Múltipla, Mieloma Múltiplo, Nevrite Múltipla da Cintura Escapular, Osteocondromatose Múltipla, Nevrite Periférica Múltipla, Polipose Múltipla do Cólon, Sindrome Múltipla do Pterigio, Esclerose Múltipla, Esclerose Múltipla, Deficiência Múltipla de Sulfatase, Lipomatose Simétrica Múltipla, Atrofia de Múltiplos Sistemas, Osteodisgenése Multissinostótica, Osteodisgenése Multissinostótica com Fraturas Ósseas Logas, Sindrome de Mulvihill-Smith, Associação de MURCS, Condrodisplasia Metafisária de Tipo Murk Jansen, Deficiência de Carnitina Muscular, Doença do Núcleo Muscular, Deficiência de Fosfofrutocinase Muscular, Doença do Núcleo Central Muscular, Distrofia Muscular, Distrofia Muscular Clássica Recessiva Relacionada com X, Distrofia Muscular Congénita Com Envolvimento do Sistema Nervoso Central, Distrofia Muscular Congénita Progressiva com Atraso Mental, Distrofia Muscular Facio-escapulo-humeral, Reumatismo Muscular, Rigidez Muscular-Espasmo Progressivo, Sindrome da Dor Musculoesquelética, Acropatia Mutilante, Acropatia Mutilante, Mutismo, mvp, MVP, PMS, Miastenia Grave, Miastenia Grave, Miastenia Grave Pseudoparalitica, Sindrome Miasténica de Lambert-Eaton, Esclerose Mielinoclástica Difusa, Mielomatose, Sindrome de 114

Myhre, Epilepsia Petit Mal Astática Mioclónica, Distonia Mioclónica, Encefalopatia Mioclónica de Bebés, Epilepsia Mioclónica, Epilepsia Mioclónica de Tipo Hartung, Epilepsia Mioclónica Associada a Fibras Vermelhas Irregulares, Epilepsia Mioclónica e Doença de Fibras Vermelhas Irregulares, Epilepsia Mioclónica Progressiva Familiar, Epilepsia Mioclónica Progressiva Familiar, Ataque Apopléctico Mioclónico, Mioclonia, Epilepsia Mioclónica, Doença de Mioencefalopatia com Fibras Vermelhas Irregulares, Miofibromatose, Miofibromatose Congénita, Sindrome Facio-Escapulo-Peroneal Miogénica, Distúrbio Mioneurogastrointestinal e Encefalopatia, Artrogripose Miopática Multiplex Congénita, Deficiência Miopática de Carnitina, Miopatia Central Fibrilar, Miopatia Congénita não Progressiva, Miopatia Congénita não Progressiva com Eixo Central, Miopatia com Deficiência de Carnitina Palmitoil transferase, Miopatia-Síndrome de Marinesco-Sjogren, Miopatia-Deficiência Metabólica de Carnitina Palmitoil transderase, Miopatia Mitocondrial-Encefalopatia-Láctico Acidose-Acidente Vascular Cerebral, Miopatia com Corpos Sarcoplásmicos e Filamentos Intermediários, Deficiência de Miofosforilase, Miosite Ossificans Progressiva, Miotonia Atrófica, Miotonia Congénita, Miotonia Congénita Intermitente, Distrofia Miotónica, Miopatia Miotónica Nanismo Condrodistrofia Ocular e Anomalias Faciais, Miopatia Miotubular, Miopatia Miotubular Relacionada com X, Ácido Mipróico, Myriachit (Observada na Sibéria), Mixedema, Deficiência de N-Acetilglucosamina-1-Fosfotransferase, Deficiência de N-Acetil Glutamato Sintetase, Deficiência de NADH-CoQ redutase, Displasias Ectodérmicas tipo Naegeli, Sindrome de Nager, Sindrome de Disostose Acrofacial de Nager, Sindrome de Disostose Acrofacial de Nager, Sindrome de Nager, Deficiência de NAGS, Sindrome de Distrofia das Unhas-Surdez, Disgenesia das Unhas e Hipodontia, Sindrome de Unhas-Patela, Sindrome 115 de Nance-Horan, Nanismo Nanocefálico, Nanocefalia, Nanoftalmia, Narcolepsia, Síndrome Narcoléptica, NARP, Displasia Nasal-fronto-facial, Hipoplasia Alar Nasal Hipotiroidismo Aquilia Pancreática Surdez Congénita, Hipoplasia Nasomaxilar, Lipodistrofia Nasal, NBIA1, ND, NDI, NDP, Encefalomielopatia Necrosante de Leigh's, Granulomatose Respiratória Necrosante, Síndrome de Neill-Dingwall, Síndrome de Nelson, Miopatia Nemalina, Adrenoleucodistrofia Neonatal, Adrenoleucodistrofia Neonatal (NALD), Adrenoleucodistrofia Neonatal (ALD), Doença Renal Poliquística Autossómica Recessiva Neonatal, Nanismo Neonatal, Hepatite Neonatal, Hipoglicemia Neonatal, Intolerância à Lactose Neonatal, Linfedema Neonatal devido a Enteropatia Exsudativa, Síndrome Progeroide Neonatal, Síndrome Progeroide Pseudo-Hidrocefálica Neonatal de Wiedemann-Rautenstrauch, Aracnoidite Neoplásica, Nefroblastoma, Diabetes Insípida Nefrogénica, Nefronoftise Familiar Juvenil, Nefronoftise Familiar Juvenil, Cistinose Nefropática, Nefropatia-Pseudo-hermafroditismo-Tumor de Wilms, Síndrome de Nefrose-Microcefalia, Síndrome de Nefrose-Dismigração Neuronal, Síndrome Nefrótica-Glicossúrica-Nanismo-Raquitismo-Hipofosfatómica, Doença de Netherton, Síndrome de Netherton, Ictiose do Síndrome de Netherton, Síndrome de Nettleship Falis (Relacionado com X), Síndrome de Neu-Laxova, Síndrome de Neuhauser, Defeitos dos tubos Nervosos, Amiotrofia Nevrálgica, Amiotrofia Nevrálgica, Deficiência de Neuraminidase, Melanose Neurocutânea, Neurinoma do Nervo Acústico, Neurinoma, Neuroacantocitose, Distrofia Neuroaxonal de Tipo Schindler, Neurodegenerescência com Acumulação Cerebral de Ferro tipo 1 (NBIA1), Neurofibroma do Nervo Acústico, Artrogripose Neurogénica Multiplex Congénita, Neuromielite óptica, Neuromiotonia, Neuromiotonia Focal, Neuromiotonia Generalizada, Neuromitonia Familiar, Generalizada, Esporádica, Distrofia Neuronal Axónica de Tipo Schindler, 116

Ceroidolipofuscinose Neuronial de Tipo Adulto, Ceroidolipofuscinose Neuronial de Tipo Juvenil, Ceroidolipofuscinose Neuronial Tipo 1, Doença Neuronopática Aguda de Gaucher, Amiloidose Neuropática, Beriberi

Neuropático, Ataxia Neuropática e Retinite Pigmentosa, Síndrome de Neuropatia do Plexo Braquial, Neuropatia Sensorial Hereditária Tipo I, Neuropatia Sensorial Hereditária Tipo II, Doença da Acumulação de Lipidos Neutros, Nevos, Sindrome do Carcinoma Nevoide Basocelular, Nevo, Nevo Cavernoso, Nevo Comedónico, Nevo Despigmentoso, Nevo Sebáceo de Jadassohn, Sindrome de Nezelof, Aplasia Tímica de Nezelof, Imunodeficiência Grave Combinada de Tipo Nezelof, NF, NF1, NF2, NF-1, NF-2, NHS, Doença de Niemann Pick, doença de Nieman Pick Tipo A (aguda neuronopathic forma), doença de Nieman Pick Tipo B, Doença de Nieman Pick Tipo C (forma neuropática crónica), doença de Nieman Pick Tipo D (variante da Nova Escócia) , doença de Nieman Pick Tipo E, doença de Nieman Pick Tipo F (doença de histiocite de azul mar), Cegueira Noturna, Degenerescência Nigroespinodental, Sindrome de Niikawakuroki, NLS, NM, Sindrome de Noack Tipo I, Mioclonia Noturna Hereditária, Mioclonia Essencial, Degenerescência Nodular da Córnea, CIE Não Bolhosa, Eritroderma Ictiosiforme Não Bolhoso Congénito, Hidrocéfalo Não Comunicante, sindrome de Alfa-Talassemia de Tipo não Supressivo / Atraso Mental, Hiperglicinamia não Cetónica de Tipo I (NKHI), Hiperglicinamia não Cetótica, Reticuloendoteliose não Lipídica, Doença de Gaucher não Neuropática Crónica do Adulto, Epidermólise Bolhosa não Cicatrizante, Calcificações Cerebris não Arterioscleróticas, Reumatismo não Articular, Doença de Gaucher não Cerebral Juvenil, Glicosúria não Diabética, Cardiomiopatia não Isquémica, Hipoglicemia não Cetótica e Deficiência de Carnitina devido a Deficiência de MCAD, Hipoglicemia não Cetótica Provocada por Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase, Glicinamia não 117 117 Polidistrofia

Cetótica, Sindrome de Nonne, Síndrome de Nonne-Milroy-Meige, Dentina Opalescente não Opalescente, Galactorreia-Amenorreia não Puerperal, Mieloma não Secretor, Anemia Hemolitica não Esferocitica, Doença Celiaca, Síndrome de Noonan, Norepinefrina, Hidrocéfalo de Pressão Normal, Síndrome de Norman-Roberts, Doença de Norrbottnian Gaucher, Doença de Norrie, Colestase Hereditária de Tipo norueguês, NPD, NPS, NS, NSA, Síndrome de Demência de Distonia Nucal, Neuropatia Nutritiva, Síndrome de Nyhan, Espetro OAV, Apneia Obstrutiva, Hidrocéfalo Obstrutivo, Apneia Obstrutiva do Sono, Síndrome de OCC, Tromboaortopatia Oclusiva, OCCS, Malformações Vasculares Intracranianas Ocultas, Sequência de Disrafismo Espinhal Oculta, Síndrome de Ochoa, Ocronose, Artrite Ocronótica, OCR, OCRL, Otocefalia, Albinismo Ocular, Herpes Ocular, Miastenia Ocular Grave, Displasia Oculo-Auriculo-Vertebral, Espetro Oculo-Auriculo-Vertebral, Síndrome Oculo-Buco-Genital, Síndrome Oculocerebral com Hipopigmentação, Síndrome Oculocerebrocutânea, Oculo-Cerebro-Renal, Distrofia Oculocerebrorenal, Síndrome Oculocerebrorenal, Síndrome Oculocraniosomática (obsoleta) , Albinismo Oculocutâneo, Albinismo Oculocutâneo Tipo Chediak-Higashi, Displasia Oculo-Dento-Digital, Displasia Oculo-Dento-Digital, Síndrome Oculodentodigital, Displasia Oculo-Dento-Óssea, Displasia Oculo-Dento-Óssea, Distrofia Muscular Oculo Gastrointestinal, Distrofia Muscular Oculo-Gastrointestinal, Distrofia Muscular Oculogastrointestinal, Oculomandibulodiscefalia com hipotricose, Sindrome Oculomandibulofacial, Oculomotor com Contracturas Congénitas e Atrofia Muscular, Paralisia Oculossimpática, Síndrome ODD, Síndrome de ODD, ODOD, Tumor Odontogénico, Síndrome Odontotricomélica, OFD, Síndrome de OFD, Amiloidose Tipo Ohio (Tipo VII), 01, 01 Congénita, 01 Tardia, Síndrome de Oldfield, Sequência de Oligoidrâmnio, Microftalmos Oligofrenia, Polidistrofia Oligodrénica, 118

Atrofia Olivopontocerebelosa, Atrofia Olivopontocerebelosa, Atrofia Olivopontocerebelosa com Demência e Sinais Extrapiramidais, Atrofia Olivopontocerebelosa com Degenerescência Retiniana, Atrofia Olivopontocerebelosa I, Atrofia Olivopontocerebelosa II, Atrofia Olivopontocerebelosa III, Atrofia Olivopontocerebelosa IV, Atrofia Olivopontocerebelosa V, Doença de Ollier, Osteocondromatose de Ollier, Sindrome de Onfalocele-Visceromegalia-Macroglossia, Praga de Ondine, Neuropatia Bolbo de Cebola, Polineuropatia Bolbo de Cebola, Onicosteodisplasia, Onicotricodisplasia com Neutropenia, OPCA, OPCA I, OPCA II, OPCA III, OPCA IV, OPCA V, Sindrome OPD, Sindrome OPD Tipo I, Sindrome OPD Tipo II, Sindrome OPD I, Sindrome OPD II, Oftalmoartropatia, Oftalmoplegia-Pseudoobstrução Intestinal, Oftalmoplegia, Degenerescência Pigmentar da Retina e Cardiomiopatia, Sindrome de Oftalmoplegia Plus, Sindrome de Oftalmoplegia, Sindrome de Opitz BBB, Opitz Sindrome Composta BBB/G, Sindrome de Opitz BBBG, Sindrome de Opitz-Colds, Sindrome de Opitz G, Sindrome de Opitz G/BBB, Sindrome de Hipertelorismo de Opitz-Hipospadia, Sindrome de Opitz-Kaveggia, Sindrome Oculogenitolaríngea de Opitz, Sindrome Trigonocefalia de Opitz, Sindrome de Opitz, Opsoclonia, Opsoclonia-Mioclonia, Oftalmoneuromielite, Atrofia Óptica Polineuropatia e Surdez, Neuroencefalomielopatia Óptica, Neuromielite Óptica, Opticomielite, Aracnoidite Optoquiasmática, Fissuras Oro-Faciais, Discinesia Oro-facial, Distonia Oral Facial, Sindrome Oral-Facial-Digital, Sindrome Oral-Facial-Digital de Tipo I, Sindrome Oral-Facial-Digital I, Sindrome Oral-Facial-Digital II, Sindrome Oral-Facial-Digital III, Sindrome Oral-Facial-Digital IV, Quisto Orbital com Malformações Cerebrais e Dérmicas Focais, Deficiência de Ornitina Carbamil Transferase, Deficiência de Ornitina Transcarbamilase, Sindrome Orocraniodigital, Sindrome Orofaciodigital, Distonia Oromandibular, Hipotensão 119

Ortostática, doença de Osler-Weber-Rendu, Displasia Osso-Oculo-Dental, Displasia Osso-Oculo-Dentária, Osteite Deformante, Osteocondrodistrofia Deformante, Osteocondroplasia, Osteodisplastia de Melnick e Needles, Osteogénese Imperfeita, Osteogénese Imperfeita, Osteogénese Imperfeita Congénita, Osteogénese Imperfeita Tardia, Nevo Flammeus Osteo-hipertrófico, Osteopatia Hiperostótica Escloreticante Multiplex Infantal, Osteopatia Hiperostótica Escloreticante Multiplex Infantal, Osteopatiarose, Osteopetrose, Osteopetrose Autossómica Dominante de Tipo Adulto, Osteopetrose Autossómica Recessiva Maligna de Tipo Infantil, Osteopetrose Autossómica Recessiva Ligeira de Tipo Intermediário, Osteosclerose Frágil Generalizada, Mieloma Osteosclerótico; Defeito Ostium Primum (Defeitos da Almofada Endocardiaca inclusos), Defeito Ostium Secundum, Deficiência de OTC, Sindrome Oto Palato Digital, Sindrome Oto-Palato-Digital de Tipo I, Sindrome Oto-Palatal-Digital de Tipo II, Displasia Otodental, Sindrome Otopalatodigital, Sindrome Otopalataldigital de Tipo II, Pele de Oudtshoorn, Nanismo Ovariano de Tipo Turner, Aplasia Ovariana de Tipo Turner, OWR, Oxalose, Deficiência de Oxidase, Oxicefalia, Oxicefalia, Oxicefalia -Acrocefalia, P-V, PA, PAC, Paquioniquia Istiosiforme, Paquioniquia Congénita com Dente Natal, Paquioniquia Congénita, Paquioniquia Congénita Queratose Disseminada Circunscrita (folicular), Paquioniquia Congénita de Tipo Jadassohn-Lewandowsky, PAF com MSA, Doença de Paget, Doença de Paget do Osso, Doença de Paget da Mama, Doença de Paget do Mamilo, Doença de Paget do Mamilo e Aréola, Sindrome de Pagon, Oftalmoplegia Dolorosa, PAIS, Mioclonia Palatal, Sindrome Palato-Oto-Digital, Sindrome Palatal-Oto-Digital de Tipo I, Sindrome Palatal-Oto-Digital de Tipo II, Sindrome de Pallister, Sindrome de Pallister-Hall, Sindrome do Mosaico de Pallister-Killian, Aneuploidia do Mosaico de Pallister, Sindrome do Mosaico de Pallister, Sindrome do Mosaico de 120

Pallister Tetrassomia 12p, Síndrome de Pallister-W, Hiperqueratose Palmoplantar e Alopecia, Paralisia, Fibrose Pancreática, Insuficiência Pancreática e Disfunção da Medula Óssea, Sindrome de Tumor Ulcerogénico Pancreático, Panmieloftise, Panmielopatia, Neurodegenerescência Associada a Pantotenato cinase (PKAN), Sindrome de Papillon-Lefevre, Psuedotabes Papilotónicos, Paralisia Periódica Paramiotónica, Beriberi Paralítica, Nevrite Braquial Paralítica, Sindrome de Fendas Paramedianas do Lábio Inferior-Pterigio Popliteo, Sindrome Diencefálica Paramediana, Paramieloidose, Paramioclonia Múltipla, Paramiotonia Congénita, Paramiotonia Congénita de Von Eulenburg, Doença de Parkinson, Taquicardia Auricular Paroxistica, Hemoglobinuria Fria Paroxistica, Distonia Paroxistica, Distonia Coreoatetose Paroxistica, Distonia Cinesigénica Paroxistica, Hemoglobinuria Noturna Paroxistica, Hemoglobinuria Normal Paroxistica, Sono Paroxistico, Sindrome de Parrot, Doença de Parry, Sindrome de Parry-Romberg, Sindrome de Parsonage-Turner, Sindrome de Insensibilidade Parcial a Androgénios, Supressão Parcial do Braço Curto do Cromossoma 4, Supressão Parcial do Braço Curto do Cromossoma 5, Supressão Parcial do Braço Curto do Cromossoma 9, Sindrome de Duplicação Parcial de 3q, Sindrome de Duplicação Parcial de 15q, Paralisia Facial Parcial Com Anormalidades Urinárias, Gigantismo Parcial das Mãos e Pés-Nevos-Hemi-Hipertrofia-Macrocefalia, Lipodistrofia Parcial, Monossomia Parcial do Braço Longo do

Cromossoma 11, Monossomia Parcial do Braço Longo do Cromossoma 13, Sindrome Sensorial Espinhal Parcial,

Trissomia Parcial llq, Sindrome de Partington, PAT, Dueto Patente do Canal Arterial, Mioclonia Patológica, Artrite de Inicio Pauciarticular Juvenil, Artrite de Inicio Pauciarticular juvenil, Paulite, PBC, PBS, Deficiência de PC, Deficiência de PC Grupo A, Deficiência de PC Grupo B, PC, Doença de Eulenburg, Deficiência de PCC, PCH, PCLD, 121 PCT, PD, PDA, Deficiência de PDH, Deficiência de PDH, Sindrome de Pearson, Deficiência de Piruvato Carboxilase, Apneia Obstrutiva do Sono Pediátrica, Sindrome de Descamação Cutânea, Doença de Pelizaeus-Merzbacher, Esclerose Cerebral de Pelizaeus-Merzbacher, Esclerose Cerebral de Pelizaeus-Merzbacher, Sindrome de Pelagra-Ataxia Cerebelosa-Aminoaciduria Renal, Sindrome da Dor pélvica, Pênfigo Vulgar, Sindrome de Pena Shokeir II, Sindrome de Pena Shokeir de Tipo II, Fibromatose Peniana, Fibrose Peniana, Endurecimento Peniano, Sindrome Penta X, Pentalogia de Cantrell, Sindrome de Pentalogia, Pentassomia X, Deficiência de PEPCK, Sindrome da Pimenta, Sindrome de Per-heentupa, Fibrosite Periarticular, Constrição Pericárdica com Insuficiência de Crescimento, Amiloidose Pericolagénica, Doenças Renais Poliquisticas Perinatais, Ânus Perineal, Sindrome Amiloide Periódica, Sindrome de Peritonite Periódica, Sonolência Periódica e Apetite Mórbido, Sindrome Periódica, Degenerescência Cistoide Periférica da Retina, Disostose Periférica- Hipoplasia Nasal-Atraso Mental, Nevrite Periférica, Neuropatia Periférica, Hérnia Diafragmática Peritoneopericardiaca, Anemia Perniciosa, Anemia Perniciosa, Anemia Perniciosa, Peromelia com Micrognatia, Atrofia Muscular Peroneal, Paralisia do Nervo Peroneal, Espirro de Peroutka, Acil-CoA Oxidase Peroxissómica, Distúrbios de Beta-Oxidação Peroxissómica, Enzima Bifuncional Peroxissómica, Tiolase Peroxissómica, Deficiência de Tiolase Peroxissómica, Tronco Arterial Persistente, Doença de Perthes, Epilepsia Petit Mal, Variante Petit Mal, Sindrome de Peutz-Jeghers, Sindrome de Peutz-Jeghers, Sindrome de Peutz-Touraine, Sindrome de Peutz-Touraine, Doença de Peyronie, Pfeiffer, Sindrome de Pfeiffer Tipo I, PGA I, PGA II, PGA II, PGA III, PGK, PH Tipo I, PH Tipo I, Sindrome da Bolsas Faringea, Deficiência de PHD Desidrogenase da Cadeia Curta de Acil-CoA, Deficiência Fenilalanina Hidroxilase, 122

Fenilalaninamia, Fenilcetonúria, Fenilcetonúria, Oligofrenia Fenilpirúvica, Focomelia, Síndrome de Focomelia, Deficiência de Fosfoenolpiruvato Carboxicinase, Deficiência de Fosfofrutocinase, Deficiência de Fosfoglicerato Cinase, Fosfoglicerocinase, Deficiência de Fosforilase 6 Cinase, Doença de Acumulação de Glicogénio por Deficiência de Fosforilase, Deficiência de Fosforilase Cinase Hepática, Reflexo de Espirro Fótico, Espirro Fótico, Queratetomia Fototerapêutica, PHS, Fisicista John Dalton, Doença de Acumulação de Ácido Fitânico, Pi Fenótipo ZZ, PI, Doença Cerebral de Pick, Doença de Pick, Doença de Pick, Sindrome Pickwickiana, Anomalia de Pierre Robin, Complexo de Pierre Robin, Sequência de Pierre Robin, Sindrome de Pierre Robin, Sindrome de Pierre Robin com Hiperfalangia e Clinodactilia, Doença de Pierre-Marie, Degenerescência Pigmentar do Núcleo Vermelho da Matéria Cinzenta do Globo Pálido, Pili Torti e Surdez Nervosa, Pili Torti-Perda de Audição Neurossensorial, Nanismo Pituitário II, Adrenalectomia após Tumor Pituitário, Pitiriase Pilosa, Pitiriase rubra pilar, PJS, PJS, PKAN, PKD, PKD, PKD1, PKD2, PKD3, PKU, PKU, PKU1, Plagiocefalia, Plagiocefalia, Plagiocefalia, Mieloma das Células Plasmáticas, Leucemia das Células Plasmáticas, Deficiência da Componente de Tromboplastina no Plasma, Deficiência de Transglutaminase no Plasma, Endurecimento plásico de Corpos Cavernosos, Endurecimento plásico do Pénis, PLD, Lingua Pregueada, PLS, PMD, Sindrome Pneumorrenal, PNH, PNM, Deficiência de PNP, POD, POH, Poiquilodermia Atrofiante e Catarata, Poiquilodermia Congénita, Anomalia de Poland, Sequência de Poland, Sindactilia de Poland, Sindrome de Poland, Poliodistrofia Cerebral Progressiva, Poliartrite Entérica, Poliarterite Nodosa, Artrite de Inicio Poliarticular juvenil de Tipo I, Artrite de Inicio Poliarticular juvenil de Tipo II, Artrite de Inicio Poliarticular juvenil de Tipos I e II, Policondrite, Doença Renal Poliquistica, 123

Doença Renal Poliquística de Tipo Medular, Doença Renal Poliquística de Tipo Medular, Doença hepática Poliquística, Doença do Ovário Poliquístico, Doenças Renais Poliquísticas, Polidactilia-Síndrome de Joubert, Epidermólise Bolhosa Polidisplásica, Oligofrenia Polidistrófica, Nanismo Polidistrófico, Síndrome Auto-imune Poliglandular de Tipo III, Síndrome Auto-imune Poliglandular de Tipo II, Síndrome Auto-imune Poliglandular de Tipo I, Síndrome Auto-imune Poliglandular de Tipo II, Síndrome de Deficiência Poliglandular de Tipo II, Síndromes Poliglandulares, Degenerescência Polimórfica da Mácula Lútea, Degenerescência Macular Polimórfica, Polimorfismo da Plaqueta Glicoproteica Ib, Distrofia Cornenana Polimórfica Hereditária, Polimialgia Reumática, Polimialgia Reumática, Polimiosite e Dermatomiosite, Agamaglobulinemia Primária, Polinevrite Periférica, Polineuropatia-Surdez-Atrofia Óptica, Polineuropatia Periférica, Polineuropatia e Poliradiculoneuropatia, Displasia Fibrosa Poliostótica, Histiocitose Esclerosante Poliostótica, Polipose Familiar, Polipose de Tipo Gardner, Polipose Intestinal Hamartomatosa, Polipose Hamartomatosa Intestinal, Síndrome de Polipose-Osteomatose-Quisto Epidermoide, Polipose Pigmentação da Pele Alopecia e Alterações das Unhas, Síndrome dos Pólipos e Manchas, Síndrome de Pólipos e Manchas, Poliserosite Recorrente, Polissomia Y, Polisindactilia com Forma de Crânio Peculiar, Polisindactilia-Craniofácies Dismórficas de Tipo Greig, Doença de Pompe, Doença de Pompe, Síndrome de Pterígio Poplíteo, Homem Porco-Espinho, Porencefalia, Porencefalia, Porfobilinogénio deaminase (PBG-D), Porfiria, Porfiria Aguda Intermitente, Porfiria Aguda Intermitente, Porfiria ALA-D, Porfiria Cutânea Tardia, Porfiria Cutânea Tardia, Porfiria Cutânea Tardia Hereditária, Porfiria Cutânea Tardia Sintomática, Porfiria Hepática Variegata, Porfiria de Tipo Suíço, Porfiria Variegata, Porfiria Aguda 124

Intermitente, Porfirinas, Porrigo Decalvante, Manchas do Vinho do Porto, Amiloidose de Tipo Português, Polinevrite Pós-Infecciosa, Mioclonia de Intenção Pós-axónica, Disostose Acrofacial Pós-axial, Polidactilia Pós-axial, Mioclonia de Intenção Pós-encefalitica, Distrofia Cornenana Posterior Hereditária, Sindrome Talâmica Posterior, Aracnoidite Pós-mielográfica, Paralisia Cerebral Pós-natal, Colestase Pós-operatória, Sindrome de Galactorreia-Amenorreia Pós-parto, Hipopituitarismo Pós-parto, Sindrome Panipopituitária Pós-parto, Panipopituitarismo Pós-parto, Necrose Pituitária Pós-parto, Hipotensão Postural, Nefrite de Perda de Potássio, Sindrome de Perda de Potássio, Doenças Renais Poliquisticas Infantis de Potter de Tipo I, Doença Renal Poliquistica de Potter de Tipo III, PPH, PPS, Sindrome de Prader-Willi, Sindrome Fancone de Prader-Labhart-Willi, Amiloidose Tyr-77 Pré-albumina, Sindrome da Pré-excitação, Sindrome da Pré-excitação, Deficiência de Pregnenolona, Contracções Auriculares Prematuras, Sindrome da Senilidade Prematura, Contracções Supraventriculares Prematuras, Complexos Ventriculares Prematuros, Distrofia Neuroaxonal Pré-natal ou Peri-natal, Demência Pré-senil, Degenerescência Pré-senil da Mácula Lútea da Retina, Insuficiência Supra-renal Primária, Agamaglobulinemias Primárias, Aldosteronismo Primário, Hipoventilação Alveolar Primária, Amiloidose Primária, Anemia Primária, Anemia Primária, Beriberi Primária, Biliar Primária, Cirrose Biliar Primária, Sindrome de Brown Primária, Deficiência Primária de Carnitina, Sindrome Primária de Hipoventilação Central, Discinesia Primária Ciliar de Tipo Kartagener, Amiloidose Cutânea Primária, Distonia Primária, Insuficiência Adrenocortical Primária, Hipoplasia Familiar Primária do Maxilar, Hemocromatose Primária, Hiperidrose Primária, Hiperoxalúria Primária [Tipo I], Hiperoxalúria Primária Tipo 1 (PH1), Hiperoxalúria Primária Tipo 1, Hiperoxalúria Primária Tipo II, Hiperoxalúria Primária Tipo 125 III, Hipogonadismo Primário, Linfangiectasia Intestinal Primária, Esclerose Lateral Primária, Amiloidose não Hereditária Primária, Doença Vascular Pulmonar Obliterante Primária, Esclerose Múltipla Progressiva Primária, Hipertensão Pulmonar Primária, Incapacidade de Leitura Primária, Glicosúria Renal Primária, Colangite Esclerosante Primária, Trombocitémia Primária, Trombocitémia Primária, Tumores Primários do Sistema Nervoso Central, Agnosia Visual Primária, Proctocolite Idiopática, Proctocolite Idiopática, Progeria da Idade Adulta, Progeria da Infância, Nanismo Progeroide, Estatura Baixa Progeroide com Nevos Pigmentados, Sindrome Progeroide de De Barsy, Insuficiência Autónoma Progressiva com Atrofia de Múltiplos Sistemas, Paralisia Bulbar Progressiva, Paralisia Bulbar Progressiva Inclusa, Lentiginose Cardiomiopática Progressiva, Ataxia Cerebelosa Familiar Progressiva, Poliodistrofia Cerebral Progressiva, Atrofia Coroidal Progressiva, Displasia Diafisária Progressiva, Displasia Diafisária Progressiva, Hemiatrofia Facial Progressiva, Epilepsia Mioclónica Familiar Progressiva, Atrofia Hemifacial Progressiva, Hipoeritemia Progressiva, Poliodistrofia Infantil Progressiva, Degenerescência Lenticular Progressiva, Lipodistrofia Progressiva, Distrofia Muscular da Infância Progressiva, Epilepsia Mioclónica Progressiva, Heteroplasia Óssea Progressiva, Sindrome de Degenerescência Pálida Progressiva, Sindrome de Degenerescência Pálida Progressiva, Atrofia Muscular Espinobulbar Progressiva, Paralisia Supranuclear Progressiva, Esclerose Sistémica Progressiva, Distrofia Tapetocoroidal Progressiva, Deficiência de Prolina Oxidase, Acidemia Propiónica, Acidemia Propiónica, Acidemia Propiónica Tipo I (Deficiência de PCCA), Acidemia Propiónica Tipo II (Deficiência de PCCB), Deficiência de Propionil CoA Carboxilase, Deficiência de Propionilo CoA Carboxilase, Protanomalia, Protanopia, Enteropatia Secundária com Perda 126 de Proteína a Insuficiência Cardíaca Congestiva, Síndrome de Proteus, Supressão Proximal de 4q Inclusa, Supressão Proximal de 4q Inclusa, PRP, PRS, Síndrome da Barriga Seca, PS, Polidistrofia Pseudo-Hurler, Pseudo-Polidistrofia, Pseudoacantose Nigricans, Pseudoacondroplasia, Deficiência de Pseudocolinasterase, Pseudogota Familiar, Pseudo-hemofilia, Pseudo-hermafroditismo, Pseudo-hermafroditismo, Pseudo-hermafroditismo-Distúrbio Nefrónico-Tumor de Wilm, Distrofia Muscular Pseudo-hipertrófica, Pseudo-hipoparatireoidismo, Pseudo-hipoparatireoidismo, Pseudo-hipofosfafasia, Pseudopolidistrofia, Síndrome de Pseudotalidomida, Pseudoxantoma Elástico, Pseudoxantoma Elástico, Psoríase, Psorospermose Folicular, PSP, PSS, Convulsão Psicomotora, Epilepsia Psicomotora, Epilepsia Psicomotora Equivalente, Deficiência de PTC, Pterígio, Síndrome de Pterígio Colli, Pterígio Universal, Pterigolinfangiectasia, Atresia Pulmonar, Linfangiomiomatose Pulmonar, Estenose Pulmonar, Estenose Pulmonar-Defeito do Septo Ventricular, Cálculos Pulpares, Displasia Pulpar, Síndrome de Martorell, Alinfocitose Pura, Histiocitose Cutânea Pura, Deficiência de Nucleósidos de Purina-fosforilase, Púrpura Hemorrágica, Síndrome de Purtilo, PXE, PXE de Tipo Dominante, PXE de Tipo Recessivo, Picnodisostose, Picnodisostose, Picnoepilepsia, Aciduria Piroglutâmica, Aciduria Piroglutâmica, Deficiência de Pirrolina Carboxilato Desidrogenase, Deficiência de Piruvato Carboxilase, Deficiência de Piruvato Carboxilase de Grupo A, Deficiência de Piruvato Carboxilase de Grupo B, Deficiência de Piruvato Desidrogenase, Deficiência de Piruvato-Desidrogenase, Deficiência de Piruvato Desidrogenase, Deficiência de Piruvato Cinase, q25-qter, q26 ou q27-qter, q31 ou 32-qter, Polongamento de QT com Hipohipocalcinomia Extracelular, Polongamento de QT sem Surdez Congénita, QT Prolongado com Surdez Congénita, Quadriparesia da Paralisia Cerebral, Quadriplegia da 127

Paralisia Cerebral, Dissipação Quântica, Dissipação Quântica, r4, r6, rl4, r 18, r21, r22, Raquisquise Posterior, Aplasia Radial-Trombocitopenia Amegacariocítica, Aplasia Radial-Sindrome da Trombocitopenia, Paralisia do Nervo Radial, Neuropatia Sensorial Radicular, Neuropatia Sensorial Radicular, Neuropatia Sensorial Radicular Recessiva, Displasia Radicular da Dentina, Distonia-parkinsonismo de Inicio Rápido, Sindrome de Rapp-Hodgkin, Sindrome de Displasia Ectodérmica de Rapp-Hodgkin (hipoidrótica), Displasias Ectodérmicas Hipoidróticas de Rapp-Hodgkin, Ataxia Hereditária Rara com alterações polinevriticas e surdez provocada por um defeito na enzima hidroxilase do ácido fitânico, Sindrome de Rautenstrauch-Wiedemann, Progeria de Rautenstrauch-Wiedemann Tipo Neonatal, Fenómeno de Raynaud, RDP, Hipoglicemia Funcional Reativa, Hipoglicemia Secundária Reativa a Diabetes Ligeira, Sindrome de Kenny-Caffe de Tipo Recessivo, Miotonia Congénita de Recklin de Tipo Recessivo, Doença de Recklinghausen; Fistula Rectoperineal, Vomição Recorrente, Distrofia Neurovascular Reflexa, Sindrome da Distrofia Simpática Reflexa, Erros Refrativos, Anemia Refractária, Paralisia da Refrigeração, Doença de Refsum, Doença de Refsum, Enterite Regional, Sindrome de Reid-Barlow, Sindrome de Reifenstein, Sindrome de Reifenstein, Anomalia de Reiger-Atraso de Crescimento, Sindrome de Reiger, Doença Periódica de Reimann, Sindrome de Reimann, Distrofia Cornenana de Reis-Bucklers, Sindrome de Reiter, Sindrome de Reiter, Sindrome de Guillain-Barre Recidivante, Esclerose Múltipla Recidivante-Remitente, Agenesia Renal, Displasia Renal-Cegueira Hereditária, Displasia Renal-Aplasia Retiniana de Tipo Loken-Senior, Glicosúria Renal, Glicosúria Renal de Tipo A, Glicosúria Renal de Tipo B, Glicosúria Renal de Tipo 0, Oculocerebrodistrofia Renal, Displasia Renal-Retiniana com Doença Medular Quistica, Displasia Renal-Retiniana com Doença Medular Quistica, 128

Distrofia Renal-Retiniana Familiar, Sindrome Renal-Retiniana, Sindrome de Rendu-Osler-Weber, Acidose Respiratória, Distúrbios da Cadeia Respiratória, Mioclonia Respiratório, Sindrome das Pernas Irrequitas, Cardiomiopatia Restritiva, Hiperlipemia de Retenção, Sindrome de Rethore (obsoleto), Disgenesia Reticular, Sindrome Aplástica-Quística Retiniana de Rins-Joubert, Degenerescência do Cone Retiniano, Distrofia do Cone Retiniano, Distrofia do Cone-Bastonete Retiniano, Retinite Pigmentosa, Retinite Pigmentosa e Surdez Congénita, Retinoblastoma, Deficiência de Retinol, Retinosquise, Retinosquise Juvenil, Sindrome de Retracção, Neuropatia Retrobulbar, Sindrome Retrolenticular, Sindrome de Rett, Coarctação Inversa, Sindrome de Reye, Sindrome de Reye, RGS, Fatores Sanguíneos Rh, Doença de Rh, Incompatibilidade de Fator Rh, Incompatibilidade de Rh, Incompatibilidade de Rhesus, Febre Reumática, Artrite Reumatoide, Miosite Reumatoide, Aracnoidite Cerebral Rinosinusogénica, Condrodisplasia Puntuada Rizumélica (RCDP), Acatalasemia, Doença de Refsum Clássica, RHS, Mioclonia Rítmica, Defeitos de Lacuna das Costelas com Micrognatia, Doença de Ribbing (obsoleto), Doença de Ribbing, Sindrome de Richner-Hanhart, Sindrome de Rieger, Sindrome de Rieter, Fibrose Ventricular Direita, Sindrome de Riley-Day, Sindrome de Riley-Smith, Anel de Cromossoma 14, Anel de Cromossoma 18, Anel 4, Anel 4 do Cromossoma, Anel 6, Anel 6 do Cromossoma, Anel 9, Anel 9 Cromossoma R9, Anel 14, Anel 15, Anel 15 do Cromossoma (padrão de mosaico), Anel 18, Anel do Cromossoma 18, Anel 21, Anel 21 do Cromossoma, Anel 22, Anel 22 do Cromossoma, Doença de Ritter, Sindrome de Ritter-Lyell, RLS, RMSS, Sindrome de Roberts SC-Focomelia, Sindrome de Roberts, Sindrome Tetrafocomelia de Roberts, Displasias Ectodérmicas de Robertson, Anomalia de Robin, Sequência de Robin, Sindrome de Robin, Nanismo de Robinow, Sindrome de Robinow, Sindrome de Robinow Forma Dominante, Sindrome de Robinow 129

Forma Recessiva, Miopatia de Bastonete, Doença de Roger, Doença de Rokitansky, Sindrome de Romano-Ward, Sindrome de Romberg, Dentes sem Raiz, Sindrome de Rosenberg-Chutorian, Sindrome de Rosewater, Sindrome de Rosewater, Sindrome de Rosselli-Gulienatti, Sindrome de Rothmund-Thomson, Sindrome de Roussy-Levy, RP, RS Relacionado com X, RS, RS, RSDS, Sindrome RSH, RSS, RSTS, RTS, RTS, RTS, Rubéola Congénita, Sindrome de Rubinstein, Sindrome de Rubinstein-Taybi, Sindrome de Rubinstein Taybi Polegar Grande-Hallux, Albinismo Castanho-Avermelhado, Sindrome de Ruhr, Caquexia Diencefálica de Russell, Sindrome de Russell, Sindrome de Russell, Nanismo de Russell-Silver, Sindrome de Russell-Silver, Sindrome de Russell-Silver Relacionada com X, Sindrome de Ruvalcaba-Myhre-Smith (RMSS), Sindrome de Ruvalcaba, Displasia de Tipo Ósseo de Ruvalcaba com Atraso Mental, Regressão Sacral, Agenesia Sacral Congénita, SAE, Sindrome de Saethre-Chotzen, Sakati, Sindrome de Sakati, Sindrome de Sakati-Nyhan, Espasmos de Salaam, Sindrome Salivosudoriparosa, Distrofia Cornenana Modular de Salzman, Doença de Sandhoff, Sindrome de Sanfilippo, Sanfilippo Tipo A, Sanfilippo Tipo B, Doença de Santavuori, Doença de Santavuori-Haltia; Sarcoide de Boeck, Sarcoidose, Sarcoidose, Sathre-chotzen, Paralisia do Sábado à Noite, SBMA, Sindrome SC Focomelia, Sindrome SC, SCA 3, Deficiência de SCAD, Deficiência de SCAD Localizada com Inicio na Idade Adulta, Deficiência de SCAD Congénita Generalizada, SCAD, SCAD, SCAD, Deficiência de SCADH, Sindrome da Pele Escaldada, Defeito Congénito do Couro Cabeludo, Escafocefalia, Escafocefalia, Escafocefalia, Omoplata Elevado, Miopatia Escapuloperoneal, Distrofia Muscular Escapuloperoneal, Sindrome Escapuloperoneal de Tipo Miopático, Cicatrização Bolhosa, Cicatriz Bolhosa, SCHAD, Doença de Schaumann, Sindrome de Scheie, Sindrome de Schereshevkii-Turner, Doença de Schilder, Encefalite de Schilder, Doença de Schilder, Doença de Schindler Tipo I 130 (Início Infantil), Doença de Schindler de Início Infantil, Doença de Schindler, Doença de Schindler Tipo II (Início no Adulto), Síndrome de Schinzel, Síndrome de Schinzel-Giedion, Síndrome Acrocalosal de Schinzel, Síndrome de Retracção do Terço Médio da Face de Schinzel-Giedion, Esquizenfalia, Condrodisplasia Metafisária de Tipo Schmid, Disostose Metafisária de Schmid, Síndrome de Schmid-Fraccaro, Síndrome de Schmidt, Síndrome de Schopf-Schultz-Passarge, Doença de Schueller-Christian, Tipo Schut-Haymaker, Síndrome de Schwartz-Jampel-Aberfeld, Síndrome de Schwartz-Jampel Tipos IA e 1B, Síndrome de Schwartz-Jampel, Síndrome de Schwart z-Jampel Tipo 2, SCI, D SCID, Esclerodermia, Esclerodermia, Esclerose Familiar Progressiva Sistémica, Esclerose Cerebral Difusa Familiar, Síndrome Craniodigital de Scott Com Atraso Mental, Língua Escrotal, SCS, SCS, DP, SDS, SDYS, Conjuntivite Sazonal, Síndrome do Nevo Sebáceo, Nevo Sebáceo, Queratose Seborreica, Verrugas Seborreicas, Síndrome de Seckel, Nanismo de Tipo Seckel, Bloqueio Congénito do Coração de Segundo Grau, Amiloidose Secundária, Blefarospasmo Secundário, Doença celíaca Secundária, Síndrome de Brown Secundária, Beriberi Secundária, Amiloidose Generalizada Secundária, Distonia Secundária, Deficiência de Componente Secretora, Deficiência de IgA Secretora, SED Tardia, SED Congénita, SEDC, Nevo acrómico linear segmentado, Distonia Segmentar, Mioclonia Segmentar, Síndrome de Seip, Doença de Seitelberger, Doença de Seitelberger, Ataques Apoplécticos, Deficiência Seletiva de Subclasses de IgG, Mutismo Seletivo, Deficiência Seletiva de Subclasse de IgG, Deficiência Seletiva de IgM, Mutismo Seletivo, Deficiência Seletiva de IgA, Histiocitose de Auto-Cicatrização, Holoprosencefalia Semilobar, Disgenesia Tubular Seminífera, Retinosquise Senil, Verrugas Senis, Síndrome de Senior-Loken, Neuropatia Sensorial Hereditária de Tipo I, Neuropatia Sensorial Hereditária de Tipo II, Neuropatia 131

Sensorial Hereditária de Tipo I, Neuropatia Sensorial Radicular, Neuropatia Sensorial Radicular, Neuropatia Sensorial Radicular Recessiva, Granulomatose Séptica Progressiva, Displasia Septo-óptica, Meningite Serosa Circunscrita, Deficiência de Inibidor de Protease no Soro, Deficiência de Carnosinase no Soro, Sindrome de Setleis, Imunodeficiência Combinada Grave, Imunodeficiência Combinada Grave com Deficiência de Adenosina Deaminase, Imunodeficiência Combinada Grave (SCID), Inversão de Sexo, Infantilismo Sexual, Sindrome de SGB, Sindrome de Sheehan, Dentinogénese Imperfeita de Tipo Shields, Zona, virus varicella-zoster, Beriberi de embarcação, Sindrome de SHORT, Sindrome de Supressão do Braço Curto 18, Deficiência da Cadeia Curta de Acilo CoA Desidrogenase, Deficiência da Cadeia Curta de Acil-CoA Desidrogenase (SCAD), Estatura Pequena e Telangiectasia Facial, Estatura Pequena Anomalias Faciais/Esqueléticas-Atraso-Macrodontia, Estatura Pequena-Hiperextensibilidade-Anomalia de Rieger-Atraso da Dentição, Estatura Pequena-Onicodisplasia, Estatura Pequena Eritema Telangiectático da Face, Sindrome de SHORT, Beriberi de Shoshin, Sindrome Cintura Escapular, Sindrome de Shprintzen-Goldberg, Sindrome de Shulman, Sindrome de Shwachman-Bodian, Sindrome de Shwachman-Diamond, Sindrome de Shwachman, Sindrome de Shwachman-Diamond-Oski, Sindrome de Shwachmann, Sindrome de Shy Drager, Sindrome de Shy-Magee, Deficiência de SI, Deficiência de Sialidase, Sialidose Tipo I Juvenil, Sialidose Tipo II Infantil, Sialidose, Sialolipidose, Sindrome do Seio Doente, Anemia Falciforme, Doença de Células Falciformes, Doença de Células Falciformes-Hemoglobina C, Doença de Células Falciformes-Hemoglobina D, Doença de Células Falciformes-Talassemia, Marca de Células Falciformes, Anemias Sideroblásticas, Anemia Sideroblástica, Sideroblastose, Sideroblastose, SIDS, Sindrome de Siegel-Cattan-Mamou, Dermatose Pigmentada de Tipo Siemens-Bloch, Sindrome de 132

Siemens, Doença de Siewerling-Creutzfeldt, Síndrome de Siewert, Síndrome de Silver, Nanismo de Silver-Russell, Síndrome de Silver-Russell, Doença de Simmond, Síndrome de Simony, Epidermólise Bolhosa Simplex, Síndrome Dismórfica de Simpson, Síndrome de Simpson-Golabi-Behmel, Doença de Sinding-Larsen-Johansson, Síndrome de Singletoon-Merten, Arritmia Sinusal, Seio Venoso, Taquicardia sinusal, Sequência de Sirenomelia, Sirenomelus, Bronquectasia e Sinusite de Sítio Inverso, Síndrome de SJA, Ictiose da Síndrome de Sjogren Larsson, Síndrome de Sjogren, Ictiose da Síndrome de Sjogren Larsson, Síndrome de Sjogren, SJS, Displasia Esquelética, Displasia Esquelética de Tipo Weismann Netter Stuhl, Síndrome de Descamação da Pele, Neoplasmas Cutâneos, Assimetria Craniana e Atraso Ligeiro, Assimetria Craniana e Sindactilia Ligeira, SLE, Epilepsia do Sono, Apneia do Sono, SLO, Síndrome de Sly, SMA, Forma Infantil Aguda de SMA, SMA I, SMA III, SMA tipo I, SMA tipo II, SMA tipo III, SMA3, SMAX1, SMCR, Síndrome de Smith Lemli Opitz, Síndrome de Smith Magenis, Região Cromossómica de Smith-Magenis, Nanismo de Smith-McCort, Síndrome de Smith-Opitz-Inborn, Doença de Smith, Mieloma Latente, SMS, SMS, SNE, Espirro de Exposição à Luz, Valproato de sódio, Plasmocitoma Ósseo Solitário, Doença de Sorsby, Síndrome de Sotos, Síndrome de Souques-Charcot, Porfiria Genética Sul Africana, Disfonia Espasmódica, Torcicolo Espasmódico, Torcicolo Espasmódico, Torcicolo Espasmódico, Paralisia Cerebral Espástica, Cólon Espástico, Disfonia Espástica, Paraplegia Espástica, Calcinose SPD, Deficiência de Anticorpo Específico com Imunoglobulinas Normais, Incapacidade de Leitura Específica, SPH2, Anemia Esferocítica, Esferocitose, Síndrome de Esferofaquia-Braquimorfia, Lipidose Esfingomielina, Deficiência de Esfingomielinase, Dedos de Aranha, Doença de Spielmeyer-Vogt, Síndrome de Spielmeyer-Vogt-Batten, Espinha Bífida, Espinha Bífida, Espinha Bífida Aberta, Aracnoidite 133

Espinhal, Malformação Arteriovenosa Espinhal, Ataxia Espinhal Familiar Hereditária, Atrofia Muscular Espinhal e bulbar, Hiperostose Esquelética Idiopática Espinhal Difusa, DISH Espinhal, Atrofia Muscular Espinhal, Atrofia Muscular Espinhal, Atrofia Muscular Espinhal de todos os Tipos, Atrofia Muscular Espinhal de Tipo ALS, Atrofia Muscular Espinhal-Hipertrofia de Calves, Atrofia Muscular Espinhal de Tipo I, Atrofia Muscular Espinhal de Tipo III, Atrofia Muscular Espinhal de tipo 3, Atrofia Muscular Espinhal-Hipertrofia do Calves, Aracnoidite Ossificante Espinhal, Estenose Espinhal, Ataxia Cerebelosa Espinhal, Atrofia Espinhocerebelosa de Tipo I, Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo I (SCA1), Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo II (SCAII), Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo III (SCAIII), Ataxia

Espinhocerebelosa de Tipo III (SCA 3), Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo IV (SCAIV), Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo V (SCAV), Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo VI (SCAVI), Ataxia Espinhocerebelosa de Tipo VII (SCAVII), Icterícia

Espiroquetal, Sindrome de Agenesia Esplénica, Ptose Esplénica, Esplenoptose, Deformidade da Mão Dividida-Disostose Mandibulofacial, Deformidade da Mão Dividida-Disostose Mandibulofacial, Deformidade da Mão Dividida, Deformidade da Mão Dividida, Espondiloartrite, Displasia Epondilocostal - Tipo I, Displasia Espondiloepifisária Tardia, Displasia Espondilotorácica, Radiculopatia Caudal Espondilótica, Espongiose Renal, Espongioblastoma Multiforme, Hipoglicemia Espontânea, Deformidade de Sprengel, Oftalmia da Primavera, SRS, ST, Sindrome de Peixe Velho, Sindrome Estafilocócica da Pele Escaldada, Doença de Stargardt, Doença de Startle, Estado Epiléptico, Sindrome de Steele-Richardson-Olszewski, Doença do Cabelo Rigido, Sindrome de Stein-Leventhal, Doença de Steinert, Sindrome de Stengel, Doença de Stengel-Batten-Mayou-Spielmeyer-Vogt-Stock, Colangite Estenosante, Estenose do Canal Vertebral 134

Lombar, Estenose, Deficiência de Esteroide Sulfatase, Displasias Ectodérmicas de Stevanovic, Sindrome de Stevens Johnson, Sindrome de Stevens-Johnson, STGD, Sindrome de Stickler, Sindrome de Stickler, Sindrome do Homem Rigido, Sindrome do Homem Rigido, Sindrome da Pessoa Rígida, Doença de Still, Sindrome de Stilling-Turk-Duane, Doença de Stillis, Mioclonia Sensível a Estímulos, Sindrome do Homem Pedra, Homem Pedra, Anomalia de Streeter, Degenerescência EStriatonigral Autossómica de Tipo Dominante, Calcinose Estriopalidodentata, Estroma, Membrana de Descemet, Distrofia Cornenana do Estroma, Bócio Linfomatoso, Sindrome de Sturge-Kalischer-Weber, Sindrome de Sturge Weber, Facomatose de Sturge-Weber, Encefalomielopatia Necrosante Subaguda, Encefalomielopatia Necrosante Subaguda, Encefalopatia Espongiforme Subaguda, Encefalopatia Necrosante Subaguda, Sarcoidose Subaguda, Estenose Neuronopática, Subaórtica Subaguda, Encefalopatia Arteriosclerótica Subcortical, Esclerose Subendocardial, Sensibilidade à Succinilcolina, Deficiência Congénita de Sucrase-Isomaltase, Malabsorção Congénita de Sacarose-Isomaltose, Intolerância Congénita à Sacarose, Leucodistrofia Sudanofílica ADL, Leucodistrofia Sudanofílica de Tipo Pelizaeus-Merzbacher, Leucodistrofia Sudanofílica Inclusa, Sindrome da Morte Súbita do Bebé, Atrofia de Sudeck, Sindrome de Sugio-Kajii, Sindrome de Summerskill, Acrocefalossindactilia de Summit, Acrocefalossindactilia de Summitt, Sindrome de Summitt, Sindrome da Bainha do Tendão Oblíquo Superior, Glândulas Supra-renais, Estenose Aórtica Supravalvular, Taquicardia Supraventricular, Sindrome Surdicardíaca, Sindrome Surdocardíaca, SVT, Abcesso de Glândula Sudorípara, Sindrome da Sudação Gostativa, Sindrome dos Doces, Sindrome de Cartilagem do Queijo Suíço, Enfermidade de Apert, Sindactilia Tipo I com Microcefalia e Atraso Mental, Hipoplasia Ductular Hepática Sindromática, Siringomielia, 135

Reticuloendoteliose Aleucémica Sistémica, Amiloidose Sistémica, Deficiência Sistémica de Carnitina, Elastorrexia Sistémica, Lúpus Eritematoso Disseminado, Doença Sistémica dos Mastócitos, Mastocitose Sistémica, Artrite Juvenil de Início Sistémico, Artrite Juvenil de Início Sistémico, Esclerose Sistémica, Baço Sistópico, Deficiência de Linfócitos T, Hipoglicemia de Taquialimentação, Taquicardia, Síndrome de Takahara, Doença de Takayasu, Arterite de Takayasu, Arterite de Takayasu, Talipo Calcâneo, Talipo Equinovaro, Talipo Equino, Talipo Varo, Talipo Valgo, Estenose Espinhal Tandem, Doença de Tânger, Degenerescência Tapetoretinal, Síndrome de TAR, Distonia Tardia, Distrofia Muscular Tardia, Discinesia Tardia, Discinesia Oral Tardia, Discinesia Tardia, Distonia Tardia, Paralisia Ulnar Tardia, Anemia de Células Alvo, Tarsomegalia, Doença de Tarui, Defeitos Medianos TAS Inclusos, Defeito Mediano TAS, Doença de Tay Sachs, Esfingolipidose de Tay Sachs, Doença de Tay Sachs, Ictiose da Síndrome de Tay, Esfingolipidose de Tay Sachs, Ictiose da Síndrome de Tay, Síndrome de Taybi Tipo I, Síndrome de Taybi, TCD, TC0F1, TCS, TD, Síndrome TDO, TDO-I, TDO-II, TDO-III, Telangiectasia, Telecanto com Anormalidades Associadas, Telecanto Com Anormalidades Associadas, Síndrome de Telecanto-Hipospadia, Epilepsia do Lobo Temporal, Arterite Temporal/Arterite de Células Gigantes, Arterite Temporal, TEN, Aderência da Bainha do Tendão Oblíquo Superior, Mialgia de Tensão, Supressão Terminal de 4q Inclusa, Supressão Terminal de 4q Inclusa, Distrofia Cornenana Terriana, Síndrome de Teschler-Nicola/Killian, Síndrome da Medula Espinhal Presa, Sequência de Malformação da Medula Presa, Síndrome da Medula Presa, Síndrome da Medula Espinhal Cervical Presa, Deficiências de Tetra-hidrobiopterina, Deficiências de Tetra-hidrobiopterina, Tetralogia de Fallot, Tetralogia de Fallot, Síndrome de Tetrafocomelia-Trombocitopenia, Tetrassomia do Braço Curto 136 do Cromossoma 9, Tetrassomia 9p, Tetrassomia do Braço Curto do Cromossoma 18, Síndrome Talâmica, Síndrome de Dor Talâmica, Anestesia hiperestética Talâmica, Talassemia Intermédia, Talassemia Menor, Talassemia Maior, Deficiência de Tiamina, Leucinose Reativa a Tiamina, Nefropatia de Membrana Basal Fina, Deficiência de Tiolase, RCDP, Acil-CoA di-hidroxiacetonafosfato aciltransferase, Sindrome da Terceira e Quarta Bolsas Faringeas, Bloqueio Congénito (Completo) do Coração de Terceiro Grau, Doença de Thomsen, Distrofia Torácico-Pélvica-Falângica, Canal Espinhal Torácico, Sindrome Toracoabdominal, Sindrome de Ectopia Cordis Toracoabdominal, Sindrome Três M, Nanismo Três-M com massa Óssea Insuficiente, Trombastenia de Glanzmann e Naegeli, Trombocitémia Essencial, Sindrome de Trombocitopenia-Rádio Ausente, Sindrome de Trombocitopenia-Hemangioma, Sindrome de Trombocitopenia-Rádios Ausentes, Trombofilia Hereditária Devido a AT III, Púrpura Trombocitopénica Trombótica, Colite Tromboulcerativa, Colite Tromboulcerativa, Displasia Timica com Imunoglobulinas Normais, Agenesia Timica, Aplasia Timica de Tipo DiGeorge, Hipoplasia Timica Agamaglobulinemias Primárias Inclusas, Hipoplasia Timica de Tipo DiGeorge, Aplasia Congénita do Timo, Tique Doloroso, Tiques, Sindrome de Tinel, Sindrome de Tolosa Hunt, Torcicolo Espasmódico Tónico, Sindrome da Pupila Tónica, Sindrome do Dente e Unha, Sindrome do Dente e Unha, Infeção de TORCH, Sindrome de TORCH, Distonia de Torsão, Torcicolo, Torcicolo, Lipodistrofia Total, Conexão Venosa Pulmonar Anómala Total, Aftose de Touraine, Sindrome de Tourette, Distúrbio de Tourette, Sindrome de Townes-Brocks, Sindrome de Townes, Anemia Paralítica Tóxica, Necrólise Epidérmica Tóxica, Toxopaquiosteose Diafisária Tibio-Peroneira, Toxopaquiosteose, Toxoplasmose Outros Agentes Rubéola Citomegalovirus Herpes Simplex, Fistula Traqueoesofágica com ou sem Atresia Esofágica, Fistula Traqueoesofágica, 137

Miastenia Grave Neonatal Transitório, Defeito Transitório do Septo Auriculoventricular, Transposição das Grandes Artérias, Acompanhamento Transtelefónico, Amiloidose de Transtiretina Metionina-30 (Tipo I), Síndrome da Trapezoidocefalia-Sinostose Múltipla, Sindrome de Treacher Collins, Síndrome de Treacher Collins-Franceschetti 1, Doença de Trevor, Coração Triauricular, Síndrome Trico-Dento-Óssea, Síndrome Tricodento-Óssea, Tricopoliodistrofia, Síndrome Tricorinofalangeária, Síndrome Tricorinofalangeária, Atresia Tricúspide, Deficiência de Proteína Trifuncional, Nevralgia do Trigémeo, Doença de Acumulação de Triglicéridos com Oxidação Debilitada dos Ácidos Gordos de Cadeia Longa, Trigonite, Trigonocefalia, Trigonocefalia, Trigonocefalia, Síndrome de Trigonocefalia, Síndrome de Trigonocefalia "C", Trimetilaminuria, Polegares trifalângicos-Falanges Distais Hipoplásticas-Onicodistrofia, Síndrome do Polegar Trifalangeano, Sintoma Triplo Complexo de Behcet, Síndrome do Triplo X, Síndrome do Triplo X, Síndrome Triploide, Triploidia, Síndrome de Triploidia, Síndrome de Trismo-Pseudocamptodactilia, Trissomia, Síndrome de Trissomia G, Trissomia X, Trissomia Parcial 6q, Síndrome de Trissomia Parcial 6q, Mosaico de Trissomia 9, Síndrome de Trissomia 9P (Parcial) Inclusa, Trissomia Parcial llq, Mosaico de Trissomia 14, Síndrome do Mosaico de Trissomia 14, Síndrome de Trissomia 21, Mosaico de Trissomia 22, Síndrome de Mosaico de Trissomia 22, TRPS, TRPS1, TRPS2, TRPS3, Hermafroditismo Verdadeiro, Hermafroditismo Verdadeiro, Tronco do Canal Arterial, Malabsorção de Triptofano, Deficiência de Triptofano Pirrolase, TS, TTP, TTTS, Esclerose Tuberosa, Ectasia Tubular, Síndrome de Turcot, Síndrome de Turner, Síndrome de Turner-Kieser, Fenótipo de Turner com Cromossomas Normais (Cariótipo), Síndrome de Turner-varny, Turricefalia, Síndrome de Transfusão Gémeo-Gémeo, Síndrome de Transfusão de Gémeo para Gémeo, Tipo A, 138

Tipo B, Tipo AB, Tipo 0, Diabetes de Tipo I, Tipo I Familiar Incompleto Masculino, Pseudo-hermafroditismo Masculino Incompleto Familiar de Tipo I, Doença de Gaucher de Tipo I, Tipo I (Deficiência de PCCA) , Tirosinamia de Tipo I, Doença de Gaucher de Tipo II, Histiocitose de Tipo II, Tipo II (Deficiência de PCCB) , Tirosinamia de Tipo II, Artrogripose Multiplex Congénita Distai de Tipo IIA, Doença de Gaucher de Tipo III, Tirosinamia de Tipo III, Dentinogénese Imperfeita de Tipo III, Retinosquise Tipica, Albinismo com Tirosinase Negativa (Tipo I), Albinismo com Tirosinase Positiva (Tipo II), Forma Aguda de Tirosinamia de Tipo 1, Forma Crónica da Tirosinamia de Tipo 1, Tirosinose, UCE, Colite Ulcerosa, Colite Ulcerosa Crónica não Especifica, Sindrome Ulnar-Mamária, Sindrome Ulnar-Mamária de Pallister, Paralisia do Nervo Ulnar, UMS, FODs não Classificadas, Bilirrubinemia Benigna não Conjugada, Subatividade da Paratireoide, Eritroderma Ictiosiforme Unilateral com Malformações Ipsilaterais de Membro, Condromatose Unilateral, Defeito Unilateral do Músculo Peitoral e Sindactilia da Mão, Hemidisplasia de Tipo Unilateral, Megalocefalia Unilateral, Lipodistrofia Parcial Unilateral, Agenesia Renal Unilateral, Cólon Instável, Doença de Unverricht, Doença de Unverricht-Lundborg, Doença de Unverricht-Lundborg-Laf, Sindrome de Unverricht, Sindrome de Membro Superior - Cardiovascular (Holt-Oram), Doença do Neurónio Motor Superior, Apneia das Vias Aéreas Superiores, Apneia das Vias Aéreas Superiores, Defeitos ou Distúrbios do Ciclo da Ureia, Distúrbio do Ciclo da Ureia de Tipo Arginase, Distúrbio do Ciclo da Ureia de Tipo Arginino Succinase, Distúrbios do Ciclo da Ureia de Tipo Carbamil Fosfato Sintetase, Distúrbio do Ciclo da Ureia de Tipo Citrulinemia, Distúrbios do Ciclo da Ureia de Tipo N-Acril Glutamato Sintetase, Distúrbio do Ciclo da Ureia de Tipo OTC, Sindrome Uretral, Sindrome Uretro-Oculo-Articular, Defeciência Grave de Uridina Difosfato 139

Glucuronosil transferase de Tipo I, Defeitos do Aparelho Urinário, Sindrome Urofacial, Utoporfirinogénio III cosintase, Urticária Pigmentosa, Sindrome de Usher, Usher Tipo I, Usher Tipo II, Usher Tipo III, Usher Tipo IV, Sinéquias Uterinas, Uoporfirinogénio I-sintase, Uveite, Sindrome de Uveomeningite, V-CJD, Associação de VACTEL, Associação de VACTERL, Sindrome de VACTERL, Valgo Calcâneo, Deficiência de Valina Transaminase, Valinemia, Ácido valpróico, Exposição a Valproato Ácido, Exposição a Ácido valpróico, Ácido valpróico, Doença de Van Buren's, Sindrome de Van der Hoeve-Habertsma-Waardenburg-Gauldi, Disgamaglobulinemia com Deficiência de Imunoglobulina de Início Variável, Doença de Creutzfeldt-Jakob Variante (V-CJD), Embriopatia da Varicela, Porfiria Variegata, Porfiria Variegata, Porfiria Variegata, Marcas Vasculares de Nascimento, Demência Vascular de Tipo Binswanger, Tumor Eréctil Vascular, Hemofilia Vascular, Malformações Vasculares, Malformações Vasculares do Cérebro, Vasculite, Ataxia Vasomotora, Diabetes Insípida Resistente a Vasopressina, Diabetes Insípida Sensível a Vasopressina, Associação de VATER, sindrome Vcf, Vcfs, Sindrome Velocardiofacial, Sindrome VeloCardioFacial, Artrite Venérea, Malformações Venosas, Fibrilação Ventricular, Defeitos do Septo Ventricular, Defeitos Ventriculares Congénitos, Defeito do Septo Ventricular, Taquicardia Ventricular, Malformações Venuais, VEOHD, Aplasia do Vérmis, Agenesia Cerebelosa do Vérmis, Queratoconjuntivite Vernal, Verruga, Vertebral Anal Traqueoesofágica Esofágica Radial, Hiperostose Anquilosante Vertebral, Doença de Huntington de Início Muito Precoce, Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Muito Longa (VLCAD), Schwannoma Vestibular, Neurofibromatose de Schwannoma Vestibular, Vestibulocerebelosa, Oxicefalia de Virchow, Xantogranulomatose Visceral, Xanto-Granulomatose Visceral, Miopatia Visceral-Oftalmoplegia Externa, Sindrome de 140

Visceromegalia-Hérnia Umbilical-Macroglossia, Amnésia Visual, Deficiência de Vitamina A, Deficiência de Vitamina B-l, Distrofia Macular Vitelina, Vitiligo, Vitiligo, Vitiligo Capitis, Distrofia Vitreoretinal, VKC, Sindrome VKH, VLCAD, VLCAD, Sindrome de Vogt, Cefalosindactilia de Vogt, Sindrome de Vogt Koyanagi Harada, Sindrome de Vogt Koyanagi Harada, Sindrome de Vogt Koyanagi Harada, Sindrome de Von Bechterew-Strumpell, Paramiotonia Congénita de Von Eulenburg, Sindrome de Von Frey, Doença de Von Gierke, Sindrome de Von Hippel-Lindau, Sindrome de Von Mikulicz, Doença de Von Recklinghausen, Doença de Von Willebrandt, VP, Doença de Vrolik (Tipo II), VSD, VSD, Distúrbio de Cornificação de Tipo Vulgar, Ictiose de Tipo Vulgar, Sindrome W, Sindrome de Waardenburg, Sindrome de Waardenburg-Klein, Sindrome de Waardenburg de Tipo I (WSl), Sindrome de Waardenburg de Tipo II (WS2) , Sindrome de Waardenburg de Tipo IIA (WS2A), Sindrome de Waardenburg de Tipo IIB (WS2B), Sindrome de Waardenburg de Tipo III (WS3), Sindrome de Waardenburg de Tipo IV (WS4), Sindrome de Waelsch, Complexo de WAGR, Sindrome de WAGR, Sindrome de WAGR, Macroglobulinemia de Waldenstroem, Púrpura de Waldenstrom, Sindrome de Waldenstrom, Doença de Waldmann, Sindrome de Walker-Warburg, Baço Flutuante, Sindrome de Warburg, Anemia Hemolitica de Anticorpo Quente, Doença de Anticorpo de Reação Quente, Sindrome de Wartenberg, WAS, Água no Cérebro, Sindrome de Watson, Sindrome de Watson-Alagille, Sindrome de Waterhouse-Friderichsen, Doença Cerosa, WBS, Sindrome de Weaver, Sindrome de Weaver-Smith, Doença de Weber-Cockayne, Granulomatose de Wegener, Granulomatose de Wegener, Doença de Weil, Sindrome de Weil, Weill-Marchesani, Sindrome de Weill-Marchesani, Sindrome de Weill-Reyes, Sindrome de Weismann-Netter-Stuhl, Sindrome de Weissenbacher-Zweymuller, Sindrome de Wells, Wenckebach, Doença de Werdnig-Hoffman, Doença de Werdnig-Hoffmann, doença de Werdnig-Hoffmann, Doença de Werdnig-Hoffman, 141

Paralisia de Werdnig-Hoffman, Doença de Werlhof, Síndrome de Werner, Sindrome de Wernicke (C) I, Afasia de Wernicke, Sindrome de Wernicke-Korsakoff, Sindrome de West, Beriberi Húmida, WHCR, Doença de Whipple, Doença de Whipple, sindrome do rosto sibilante, Sindrome do Rosto Sibilante-Mão em Pá Giratória, Doença de White-Darier, Sindrome de Whitnall-Norman, hipermelanose nevoide em espiral, WHS, Sindrome de Wieacker, Sindrome de Wieacher, Sindrome de Wieacker-Wolff, Sindrome de Wiedmann-Beckwith, Sindrome de Wiedemann-Rautenstrauch, Sindrome de Wildervanck, Doença de Willebrand-Juergens, Sindrome de Willi-Prader, Sindrome de Williams, Sindrome de Williams, Sindrome de Williams-Beuren, Tumor de Wilms, Sindrome de Tumor de Wilms-Aniridia-Gonadoblastoma-Atraso Mental, Tumor de Wilms Aniridia Gonadoblastoma Atraso Mental, Sindrome de Tumor de Wilms-Aniridia-Anomalias Urogenitais-Atraso Mental, Tumor de Wilms-Pseudo-hermafroditismo-Nefropatia, Tumor de Wilms e Pseudo-hermafroditismo, Tumor de Wilms-Pseuodo-hermafroditismo-Glomerulopatia, doença de Wilson, Sindrome de Winchester, Sindrome de Winchester-Grossman, Sindrome de Wiskott-Aldrich, Imunodeficiência de Tipo Wiskott-Aldrich, Displasias Ectodérmicas de Witkop, Síndrome Dente-Unha de Witkop, Síndrome de Wittmaack-Ekbom, Síndrome de WM, WMS, WMS, WNS, Doença de Wohlfart, Doença de Wohlfart-Kugelberg-Welander, Síndrome de Wolf, Região Cromossómica de Wolf-Hirschhorn (WHCR), Síndrome de Wolf-Hirschhorn, Síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome de Wolff-Parkinson-White, Síndrome de Wolff Parkinson White, Síndrome de Wolfram, Doença de Wolman (Deficiência de Lipase Ácida Lisossomal), Doença Lenhosa de Guthrie, Síndrome WPW, síndrome WPW, Cãibra do Escritor, WS, WS, WS, WSS, WWS, Síndrome de Wyburn-Mason, Síndrome de Wyburn-Mason, Doença de Addison Relacionada com X, Adrenoleucodistrofia Relacionada com X (X-ALD), Atrofia Muscular Espinobulbar Relacionada com X de Início no Adulto, Atrofia Muscular Espinhal Relacionada com 142 X do Adulto, Agamaglobulinemia com Deficiência de Hormona do Crescimento Relacionada com X, Agamaglobulinemia Relacionada com X, Sindrome Linfoproliferativa Relacionada com X, Cardiomiopatia e Neutropenia Relacionadas com X, Miopatia Centronuclear Relacionada com X, Deficiência de Cobre Relacionada com X, Malabsorção de Cobre Relacionada com X, Sindrome de Conradi-Hunermann Dominante Relacionada com X, Agenesia Hereditária Dominate do Corpo Caloso Relacionada com X, Distonia-parkinsonismo Relacionado com X, Ictiose Relacionada com X, Ictiose Associada a X, Agamaglobulinemia Infantil Relacionada com X, Encefalopatia Necrosante Infantil Relacionada com X, Retinosquise Juvenil Relacionada com X, Lissencefalia Relacionada com X, Sindrome Linfoproliferativa Relacionada com X, Sindrome de Atraso Mental-Polegar Unido Relacionada com X, Atraso Mental com Hipotonia Relacionado com X, Atraso Mental e Macroorquidismo Relacionado com X, Imunodeficiência Variável Combinada Progressiva Relacionada com X, Sindrome de Conradi-Hunermann Recessiva Relacionada com X, Imunodeficiência Combinada Grave Recessiva Relacionada com X, Imunodeficiência Combinada Grave Recessiva Relacionada com X, Retinosquise Relacionada com X, Displasia Espondiloepifisária Relacionada com X, Deficiência de Xantina Oxidase (Deficiência de Xantinuria, Hereditária), Deficiência de Xantinuria, Hereditária (Deficiência de Xantina Oxidase), Xantogranulomatose Generalizada, Xantoma Tuberoso, Xeroderma Pigmentoso, Xeroderma Pigmentoso de Tipo Dominante, Xeroderma Pigmentoso de Tipo A I XPA Forma Clássica, Xeroderma Pigmentoso de Tipo B II XPB, Xeroderma Pigmentoso de Tipo E V XPE, Xeroderma Pigmentoso de Tipo C III XPC, Xeroderma Pigmentoso de Tipo D IV XPD, Xeroderma Pigmentoso de Tipo F VI XPF, Xeroderma Pigmentoso de Tipo G VII XPG, Xeroderma Pigmentoso Variante de Tipo XP-V, Xeroderma-Talipo-Defeito do Esmalte, Idiotia Xerodérmica, Xeroftalmia, Queratite Cerótica, XLP, Sindrome XO, XP, 143 Síndrome XX Masculina, Inversão de Sexo, Síndrome XXXXX, Síndrome XXY, Síndrome XYY, Cromossoma Padrão XYY, Albinismo Mutante Amarelo, Síndrome da Unha Amarela, YKL, Arterite do Ser Feminino Jovem, Síndrome de Yunis-Varon, Síndrome YY, Síndrome Z-E, Deficiência de Inibidor de Z- e - Protease, Síndrome de Zellweger, síndrome de Zellweger, síndrome cerebro-hepato-renal de Zellweger, ZES, Doença de Ziehen-Oppenheim (Distonia de Torsão), Síndrome de Zimmermann-Laband, Deficiência Congénita de Zinco, Sindrome de Zinsser-Cole-Engman, ZLS, síndrome de Zollinger-Ellison.

Como aqui utilizado um "cancro" refere-se a um grupo de doenças e distúrbios que são caracterizados por crescimento celular não controlado (por exemplo formação de tumor) sem qualquer diferenciação daquelas células em células especializadas e diferentes. Os cancros que podem ser tratados utilizando os métodos da presente invenção incluem, sem se estar limitado a, protooncogene ABL1, Cancros Relacionados com a SIDA, Neuroma Acústico, Leucemia Linfocítica Aguda, Leucemia Mieloide Aguda, Carcinoma Adenocístico, Cancro Adrenocortical, Metaplasia Mieloide Angiogénica, Alopecia, Sarcoma Alveolar das Partes Moles, Cancro Anal, Angiossarcoma, Anemia Aplástica, Astrocitoma, Ataxia-telangiectasia, Carcinoma Basocelular (Pele), Cancro da Bexiga, Cancros dos Ossos, Cancro do Intestino, Glioma do Tronco Cerebral, Tumores do Cérebro e SNC, Cancro da Mama, tumores do SNC, Tumores Carcinóides, Cancro Cervical, Tumores Cerebrais da Infância, Cancro da Infância, Leucemia da Infância, Sarcoma dos Tecidos Moles da Infância, Condrossarcoma, Coriocarcinoma, Leucemia Linfocítica Crónica, Leucemia Mieloide Crónica, Cancros Colorretais, Linfoma Cutâneo de Células T, Dermatofibrossarcoma-protuberante, Tumor Desmoplástico de Células Circulares Pequenas, Carcinoma Ductal, Cancros Endócrinos, Cancro do Endométrio, Ependimoma, Cancro Esofágico, sarcoma de Ewing, 144

Cancro da Via Biliar Extra-Hepática, Cancro do Olho, Melanoma do Olho, Retinoblastoma, Cancro da Trompa de Falópio, Anemia de Fanconi, Fibrossarcoma, Cancro da Vesicula Biliar, Cancro Gástrico, Cancros Gastrointestinais, Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Cancros Urogenitais, Tumores das Células Germinativas, Doença Trofoblástica Gestacional, Glioma, Cancros Ginecológicos, Malignidades Hematológicas, Leucemia de Tricoleucitos, Cancro da Cabeça e Pescoço, Cancro Hepatocelular, Cancro da Mama Hereditário, Histiocitose, Doença de Hodgkin, Papilomavirus Humano, Hidatidiforme Mole, Hipercalcemia, Cancro da Hipofaringe, Melanoma Intra-ocular, Cancro das Células Ilhéus, Sarcoma de Kaposi, Cancro do Rim, Histiocitose das Células de Langerhan, Cancro Laringeo, Leiomiossarcoma, Leucemia, Sindrome de Li-Fraumeni, Cancro do Lábio, Lipossarcoma, Cancro do Figado, Cancro do Pulmão, Linfedema, Linfoma, Linfoma de Hodgkin, Linfoma não-Hodgkin, Cancro da Mama Masculino, Tumor Rabdoide Maligno do Rim, Meduloblastoma, Melanoma, Cancro das Células de Merkel, Mesotelioma, Cancro Metastático, Cancro da Boca, Neoplasia Endócrina Múltipla, Micose Fungoides, Sindrome Mielodisplásicas, Mieloma, Distúrbios Mieloproliferativos, Cancro Nasal, Cancro Nasofaringeo, Nefroblastoma, Neuroblastoma, Neurofibromatose, Sindrome da Fratura de Nijmegen, Cancro da Pele Não-melanoma, Cancro das Células não Pequenas do Pulmão (NSCLC), Cancros Oculares, Cancro Esofágico, Cancro da Cavidade Oral, Cancro Orofaringeo, Osteossarcoma, Ostomia Cancro do Ovário, Cancro Pancreático, Cancro Paranasal, Cancro da Paratireoide, Cancro Glândula Parótida, Cancro Peniano, Tumores Neuroectodérmicos Periféricos, Cancro Pituitário, Policitemia Vera, Cancro da Próstata, Cancros Raros e Distúrbios Associados, Carcinoma das Células Renais, Retinoblastoma, Rabdomiossarcoma, Sindrome de Rothmund-Thomson, Cancro das Glândulas Salivares, Sarcoma, 145

Schwannoma, Síndrome de Sezary, Cancro da Pele, Cancro das Células Pequenas do Pulmão (SCLC), Cancro do Intestino Delgado, Sarcoma de Tecidos Moles, Tumores da Medula Espinhal, Carcinoma de Células Escamosas (pele), Cancro do Estômago, Sarcoma Sinovial, Cancro Testicular, Cancro do Timo, Cancro da Tireoide, Cancro das Células Transitórias (bexiga), Cancro das Células Transitórias (renal-pélvis-/-ureter), Cancro Trofoblástico, Cancro Uretral, Cancro do Sistema Urinário, Uroplaquinas, Sarcoma Uterino, Cancro do Útero, Cancro Vaginal, Cancro da Vulva, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Tumor de Wilms.

Os compostos da invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas adicionando uma quantidade eficaz de um composto a um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável adequado. A utilização dos compostos e métodos aqui descritos também pode ser útil profilaticamente.

Como é conhecido na técnica, um nucleósido é uma associação base-açúcar. A porção de base do nucleósido é normalmente uma base heterociclica. As duas classes mais comuns dessas bases heterociclicas são as purinas e as pirimidinas. Os nucleótidos são nucleósidos que incluem ainda um grupo fosfato ligado covalentemente à parte de açúcar do nucleósido. Para aqueles nucleósidos que incluem um açúcar pentofuranosilo, o grupo fosfato pode estar ligado na unidade hidroxilo 2', 3' ou 5' do açúcar. Ao formar os oligonucleótidos, os grupos fosfato ligam covalentemente nucleósidos adjacentes uns dos outros para formar um composto polimérico linear. Por sua vez, as respetivas extremidades deste composto polimérico linear podem ser ainda ligadas para formar um composto circular, contudo, são geralmente preferidos compostos lineares. Além disso, os compostos lineares podem ter complementaridade interna 146 de nucleótidos e podem, por conseguinte, dobrar-se de modo a produzir um composto completa ou parcialmente de cadeia dupla. Nos oligonucleótidos, os grupos fosfato são geralmente referidos como formando o esqueleto internucleósido do oligonucleótido. A ligação normal ou esqueleto de ARN e ADN é uma ligação fosfodiéster de 3' para 5'.

Os exemplos específicos de compostos antimensageiros ou mensageiros preferidos úteis nos métodos aqui descritos incluem oligonucleótidos contendo esqueletos modificados ou ligações internucleósido não naturais. Como definido nesta especificação, os oligonucleótidos possuindo esqueletos modificados incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo no esqueleto e aqueles que não têm um átomo de fósforo no esqueleto. Para os fins desta especificação, e como por vezes referido na técnica, os oligonucleótidos modificados que não têm um átomo de fósforo no seu esqueleto internucleósido também podem ser considerados como sendo oligonucleósidos.

Os esqueletos oligonucleotídicos modificados preferidos contendo um átomo de fósforo no mesmo incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros alquil fosfonatos incluindo 3'-alquileno fosfonatos, 5'-alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos possuindo ligações 3'-5' normais, análogos ligados 2'-5' destes e aqueles possuindo polaridade invertida em que uma ou mais ligações internucleotidicas é uma ligação 3' para 3', 5' para 5' ou 2' para 2'. Os oligonucleótidos possuindo polaridade 147 invertida preferidos compreendem uma única ligação 3' para 3' na ligação internucleotidica mais a 3', isto é, um único resíduo de nucleósido invertido que pode ser não básico (o nucleótido está ausente ou tem um grupo hidroxilo no seu lugar). Estão também incluídos vários sais, sais mistos e formas de ácido livre.

As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Números 4,469,863; 5,264,423; 5,399, 676; 5,476,925; 5,563,253; 4,476,301; 5,276, 019; 5,405,939; 5,519, 126; 5,571,799; 5,023,243; 5,278,302; 5,453,496; 5,536,821; 5,587,361; 5, 177, 196; 5,286,717; 5,455,233; 5,541,306; 5,194,599; 3,687,808; 5,188,897; 5,321,131; 5,466,677; 5,550,111; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 e 5,625,050.

Os esqueletos oligonucleotídicos modificados preferidos que não incluem um átomo de fósforo nos mesmos, têm esqueletos que são formados por ligações internucleósido alquilo ou cicloalquilo de cadeia curta, ligações internucleósido mistas de heteroátomos e alquilo ou cicloalquilo, ou uma ou mais ligações internucleósido heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estes incluem aqueles que têm ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção de açúcar de um nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfureto, sulfóxido e sulfona; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo; esqueletos de metileno formacetilo e tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos contendo alceno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino e metileno-hidrazino; esqueletos de sulfonato e sulfonamida; esqueletos de amida; e outros possuindo partes componentes mistas com N, O, S e CH2. 148 148 limitam às Patentes U.S. Números 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,405,938; 5,541,307; 5,602,240; 5,663,312;

As patentes dos Estados Unidos representativas a preparação dos oligonucleósidos acima incluem, 5,264,564; 5,489,677; 5,610,289; 5,623,070; 5,434,257; 5,561,225; 5,608,046; 5,633,360; 5,034,506; 5,235,033; 5,466,677; 5,596, 086; 5,610,289; 5,677,437; que ensinam mas não se 5,166,315; 5,264,562; 5,470,967; 5,602,240; 5,618,704; 5,792,608; 5,646,269 e 5,677,439

Noutros miméticos de oligonucleótido preferidos, tanto o açúcar como a ligação internucleósido (isto é, o esqueleto) , as unidades de nucleótido são substituídas por grupos novos. As unidades de nucleótido são mantidas durante a hibridização com um ácido nucleico alvo apropriado. Um tal composto, um mimético de oligonucleótido que demonstrou ter excelentes propriedades de hibridização, é referido como um péptido ácido nucleico (PNA). Nos compostos PNA, o açúcar-esqueleto de um oligonucleótido está substituído por um esqueleto contendo amida, em particular um esqueleto de aminoetilglicina. Os nucleótidos são retidos e estão ligados direta ou indiretamente a átomos de azoto aza da porção amida do esqueleto. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Números: 5,539,082; 5,714,331; e 5,719,262. Outros ensinamentos sobre compostos PNA podem ser encontrados em Nielsen et ai., Science 254: 1497-1500, 1991. São preferidos os oligonucleótidos com esqueletos de fosforotioato e esqueletos de oligonucleósidos com heteroátomos e, em particular, -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3) -0-CH2- [conhecido como um metileno (metilimino) ou esqueleto MMI], -CH2-0-N (CH3) -CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- e 149 -0-N(CH3) -CH2-CH2- [em que o esqueleto fosfodiéster nativo é representado como -0-P-0-CH2-] da Patente U.S. Número: 5,489,677 acima referenciada, e os esqueletos de amida da Patente U.S. Número: 5,602,240 acima referenciada. São também preferidos os oligonucleótidos possuindo as estruturas de esqueleto de morfolino da Patente U.S. Número: 5,034,506 acima referenciada.

Os oligonucleótidos modificados podem conter também uma ou mais unidades açúcar substituidas. Os oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2' : OH; F; O-, S- ou N-alquilo; O-, S- ou N-alcenilo; O-, S- ou N-alcinilo; ou O-alquil-O-alquilo, em que o alquilo, alcenilo e alcinilo podem ser substituídos ou não substituídos alquilo Ci a Cio ou alcenilo e alcinilo C2 a Cio. São particularmente preferidos os O [ (CH2) nO] mCH3, 0(CH2)n0CH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 e O (CH2) nON [ (CH2) nCH3] 2, em que nem são desde 1 até cerca de 10. Outros oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': alquilo inferior Ci a Ci0, alquilo inferior substituído, alcenilo, alcinilo, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo ou O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl; Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo substituído, um grupo de dissociação de ARN, um grupo repórter, um grupo de intercalação, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleótido, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleótido e outros substituintes possuindo propriedades semelhantes. Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietoxilo (2'-0-CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietilo) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 78: 486-504, 1995) isto é, um grupo alcoxialcoxilo. Uma outra modificação preferida inclui 2'-dimetilaminooxietoxilo, 150 isto é, um grupo 0 (0¾) 2ON (CH3) 2, também conhecido como 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietoxilo (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo ou 2'-DMAEOE), isto é, 2'-0-CH2-0-CH2-N (CH3) 2, também descrito nos exemplos abaixo.

Outras modificações preferidas incluem 2'-metoxilo (2'-0-CH3) , 2 '-aminopropoxilo (2 '-OCH2CH2CH2NH2) , 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2' -0-alilo (2'-0-CH2-CH=CH2) e 2'-fluoro (2'-F). A modificação 2' pode ser na posição arabino (em acima) ou posição ribo (em baixo). Uma modificação 2'-arabino preferida é 2'-F. Podem ser também feitas modificações semelhantes noutras posições do oligonucleótido, particularmente na posição 3' do açúcar do nucleótido da extremidade 3' ou nos oligonucleótidos ligados 2'-5' e na posição 5' do nucleótido da extremidade 5'. Os oligonucleótidos também podem ter miméticos de açúcar tais como unidades ciclobutilo em vez do açúcar pentofuranosilo. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação dessas estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não se limitam a, Patentes U.S. Números: 4,981,957; 5,446,137; 5,576,427; 5,639,873; 5,700, 920 . 5,118,800; 5,466, 786; 5,591,722; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5, 646, 265; 5, 658,873; 5, 670, 633; 5, 792,747;

Uma outra modificação de açúcar preferida inclui Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNAs) em que o grupo 2'-hidroxilo está ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel de açúcar, formando desse modo uma unidade de açúcar biciclica. A ligação é preferencialmente um grupo metileno (-CH2-)n que liga em ponte o átomo de oxigénio 2' e o átomo de carbono 4' em que n é 1 ou 2. Os LNAs e a sua preparação são descritos em WO 98/39352 e WO 99/14226. 151

Os oligonucleótidos também podem incluir modificações ou substituições de nucleótidos (frequentemente referidos na técnica simplesmente por "base"). Como aqui utilizado, nucleótidos "não modificados" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) , e as bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) e uracilo (U) . Os nucleótidos modificados incluem outros nucleótidos sintéticos e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados de alquilo de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados de alquilo de adenina e guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracilo e citosina, 5-propinil (-C=c-CH3) uracilo e citosina e outros derivados de alcinilo das bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo e outras adeninas e guaninas substituídas na posição 8, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo e outros uracilos e citosinas substituídos na posição 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desazaadenina e 3-desazaguanina e 3-desazaadenina. Outros nucleótidos modificados incluem pirimidinas triciclicas tais como fenoxazina citidina(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (lH-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), grampos de G tais como uma fenoxazina citidina substituída (por exemplo 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazole citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona) , piridoindole citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Os nucleótidos modificados podem incluir também aqueles nos quais a base de purina ou pirimidina está substituída com outros heterociclos, por exemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Outros 152 nucleótidos incluem aqueles divulgados na Patente dos Estados Unidos n° 3,687,808, aqueles divulgados em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aqueles divulgados por Englisch et ai., Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, 1991, e aqueles divulgados por Sanghvi, Y.S., Capitulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. e Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Certos destes nucleótidos são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos aqui descritos. Estes incluem pirimidinas 5-substituidas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina. Foi demonstrado que as substituições de 5-metilcitosina aumenta a estabilidade da hélice dupla do ácido nucleico em 0,6-1,2 °C e são presentemente substituições de bases preferidas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietilo.

As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de alguns dos nucleótidos modificados referidos acima bem como outros nucleótidos modificados incluem, mas não se limitam à Patente U.S. Número: 3,687,808 assinalada acima, bem como as Patentes U.S. Números: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,459,255; 5,587,469; 5,830,653; 5,484,908; 5,594,121, 5,763,588; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5, 596, 091; 5,614,617; 5, 645, 985; 6, 005, 096; e 5, 681, 941.

Outra modificação dos oligonucleótidos aqui descritos envolve ligar quimicamente ao oligonucleótido uma ou mais unidades ou conjugados que melhoram a atividade, distribuição celular ou captação celular do 153 oligonucleótido. Estas unidades ou conjugados podem incluir grupos conjugados ligados covalentemente a grupos funcionais tais como grupos hidroxilo primários ou secundários. Tais grupos conjugados incluem grupos de intercalação, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietileno glicóis, poliéteres, grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas de oligómeros e grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas de oligómeros. Os grupos conjugados tipicos incluem colesteróis, lipidos, fosfolipidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, cumarinas e corantes. Os grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas incluem grupos que melhoram a captação, melhoram a resistência à degradação e/ou fortalecem a hibridização especifica da sequência com o ácido nucleico alvo. Os grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas, incluem grupos que melhoram a captação, distribuição, metabolismo ou excreção dos compostos aqui descritos. Grupos conjugados representativos são divulgados no Pedido Internacional de Patente PCT/US92/09196, apresentado em 23 de Outubro de 1992, e a Patente U.S. Número: 6,287,860.

As unidades conjugadas incluem mas não estão limitados a unidades lipídicas tais como uma unidade de colesterol, ácido eólico, um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, por exemplo, residuos dodecanodiol ou undecilo, um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamónio, uma cadeia de poliamina ou polietileno glicol, ou ácido adamantano acético, uma unidade palmitilo, ou uma unidade octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Os oligonucleótidos também podem ser conjugados a substâncias farmacológicas ativas, por exemplo, aspirina, varfarina, 154 fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (5) -( + )-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácido flufenâmico, ácido folinico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina, indometicina, um barbiturato, uma cefalosporina, um fármaco sulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico.

As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de oligonucleótidos incluem, ] mas não se limitam às Patentes U. S. Números: 4,828,979; 4, 948,882; 5,218, 105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5, 552,538; 5,578, 717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5, 109, 124; 5,118, 802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5, 512,439; 5,578, 718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4, 667,025; 4,762, 779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904, 582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082, 830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258, 506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371, 241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512, 6 67; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585, 481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 e 5,688,941, algumas das quais são de propriedade comum com o presente pedido. Não é necessário que todas as posições de um dado composto estejam modificadas de forma uniforme e, de facto, podem ser incorporadas mais do que uma das modificações supramencionadas num único composto ou até mesmo num único nucleósido dentro de um oligonucleótido.

Os compostos antimensageiros ou mensageiros podem ser compostos quiméricos. Os compostos antimensageiros "quiméricos" ou "quimeras", como aqui referidos, são compostos antimensageiros ou mensageiros, particularmente 155 oligonucleótidos, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma delas constituída por menos uma unidade de monómero, isto é, um nucleótido no caso de um composto oligonucleótido. Estes oligonucleótidos contêm tipicamente pelo menos uma região em que o oligonucleótido é modificado de forma a conferir ao oligonucleótido maior resistência à degradação pelas nucleases, maior captação celular, maior estabilidade e/ou maior afinidade de ligação ao ácido nucleico alvo. Uma região adicional do oligonucleótido pode servir como um substrato para enzimas capazes de dissociar híbridos de ARN:ADN ou ARN:ARN. A título de exemplo, ARNse H é um endonuclease celular que dissocia a cadeia de ARN de uma hélice dupla de ARN:ADN. Por conseguinte, a ativação da RNase H resulta na dissociação do ARN alvo, melhorando desse modo muito a eficiência da inibição mediada pelo oligonucleótido da expressão do gene. De uma maneira semelhante, a dissociação de híbridos de ARN:ARN pode ser realizada através da ação de endoribonucleases, tais como a ARNseL que dissocia o ARN celular e virai. A dissociação do ARN alvo pode ser detetada rotineiramente por eletroforese em gel e, se for necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas conhecidas na técnica.

Os compostos antimensageiros ou mensageiros quiméricos aqui divulgados podem ser preparados como estruturas compósitas de dois ou mais oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos e/ou miméticos de oligonucleótidos como descrito acima. Tais compostos foram também referidos na técnica como híbridos ou gapmeros. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais estruturas híbridas incluem, mas não se limitam às Patentes U.S. Números: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; e 5,700,922. 156

Os compostos aqui descritos podem ser também misturados, encapsulados, conjugados ou associados de outro modo a outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, como por exemplo, moléculas direcionadas para recetores de lipossomas, formulações orais, retais, tópicas ou outras, para auxiliar na captação, distribuição e/ou absorção. As patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais formulações auxiliares de captação, distribuição e/ou absorção incluem, mas não se limitam às Patentes U.S. Números: 5,108,921; 5,354,844; 5,543,158; 4,534,899; 5,264,221; 5,462,854; 5,543,152; 5,547,932; 5,013,556; 5,356,633; 5,469,854; 5,556,948; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,583,020; 5,108,921; 5,395,619; 5,512,295; 5,591,721; 5,213,804; 5,416,016; 5,527,528; 4,426,330; 5,227,170; 5,417,978; 5,534,259; 5,580,575; e 5,595,756.

Os compostos antimensageiros ou mensageiros aqui descritos abrangem quaisquer sais, ésteres ou sais desses ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administração a um animal, incluindo um humano, é capaz de proporcionar (direta ou indiretamente) o metabolito biologicamente ativo ou resíduo do mesmo. Por conseguinte, por exemplo, a divulgação também é orientada para profármacos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui divulgados, sais farmaceuticamente aceitáveis desses profármacos e outros bioequivalentes. O termo "profármaco" indica um agente terapêutico que é preparado numa forma inativa que é convertida numa forma ativa (isto é, fármaco) no corpo ou células do mesmo pela ação de enzimas endógenas ou outras substâncias químicas e/ou condições. Em particular, as versões profármaco dos oligonucleótidos aqui descritos são preparadas como derivados SATE [ (S-acetil-2-tioetil)fosfato] de acordo com 157 os métodos divulgados na WO 93/24510 de Gosselin et al., publicada em 9 de dezembro de 1993 ou nas WO 94/26764 e Patente U.S. Número: 5,770,713 de Imbach et al. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui descritos: isto é, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto parental e não conferem efeitos toxicológicos indesejados ao mesmo. Para os oligonucleótidos, os exemplos preferidos de sais farmaceuticamente aceitáveis e suas utilizações são descritos em mais pormenor na Patente U.S. Número: 6,287,860. A presente invenção inclui também composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos interativos da presente invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em qualquer número de vias dependendo de se é desejado tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e a membranas mucosas incluindo administração vaginal e retal), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossoles, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), oral ou parentérica. A administração parentérica inclui injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular ou infusão; ou administração intracraniana, por exemplo, intratecal ou intraventricular, . Os compostos podem ser modificados para administração oral. Por exemplo, os oligonucleótidos com pelo menos uma modificação 2'-O-metoxietilo são úteis para administração oral.

As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, 158 pomadas, loções, cremes, geles, gotas, supositórios, formulações para pulverização, liquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis transportadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes. Podem também ser úteis preservativos, luvas revestidas e semelhantes.

As formulações farmacêuticas da presente invenção, as quais podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem o passo de pôr em associação os ingredientes ativos com o(s) transportador(es) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando em associação uniforme e intima os ingredientes ativos com transportadores liquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida, se for necessário, moldando o produto.

As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis tais como, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, geles moles, supositórios e enemas. As composições da presente invenção podem ser também formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode conter também estabilizantes.

As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não se limitam a, soluções, emulsões, espumas e formulações contendo lipossomas. As composições e formulações farmacêuticas da presente invenção podem 159 compreender um ou mais intensificadores da penetração, transportadores, excipientes ou outros ingredientes ativos ou inativos.

As emulsões são tipicamente sistemas heterogéneos de um liquido dispersado noutro na forma de goticulas que geralmente excedem 0,1 ym de diâmetro. As emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução na fase aquosa, na fase oleosa ou estar ele mesmo como uma fase separada.

As microemulsões estão incluídas como uma forma de realização da presente invenção. As emulsões e suas utilizações são bem conhecidas na técnica e são descritas em pormenor na Patente U.S. Número: 6,287,860.

As formulações da presente invenção incluem formulações de lipossomas. Como utilizado na presente invenção, o termo "lipossoma" significa uma vesícula constituída por lípidos anfifílicos preparados numa bicamada ou bicamadas esféricas. Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana preparada a partir de um material lipófilo e um interior aquoso que contém a composição a ser administrada. Os lipossomas catiónicos são lipossomas carregados positivamente que se julga que interagem com moléculas de ADN carregadas negativamente para formar um complexo estável. Julga-se que os lipossomas que são sensíveis a pH ou carregados negativamente aprisionam o ADN em vez de complexar com o mesmo. Os lipossomas catiónicos e não catiónicos têm sido ambos utilizados para administrar ADN em células.

Os lipossomas incluem também lipossomas "estericamente estabilizados", um termo que, como aqui utilizado, refere- 160 se a lipossomas compreendendo um ou mais lípidos especializados que, quando incorporados em lipossomas, resulta em melhores tempos de vida de circulação em relação aos lipossomas que não têm esses lipidos especializados. Os exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da porção de liquido que forma a vesicula do lipossoma compreende um ou mais glicolipidos ou está derivatizado com um ou mais polímeros hidrófilos, tais como uma unidade de polietileno glicol (PEG). Os lipossomas e suas utilizações são descritos em mais detalhe na Patente U.S. Número: 6, 287,860, a qual é aqui incorporada na sua totalidade.

As formulações e composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir também tensioativos. A utilização de tensioativos em produtos farmacológicos, formulações e em emulsões é bem conhecida na técnica. Os tensioativos e suas utilizações são descritos em mais detalhe na Patente U.S. Número: 6,287,860.

Podem ser utilizados vários intensificadores de penetração para efetuar a administração eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Além de auxiliar a difusão de fármacos não lipófilos através das membranas celulares, os intensificadores de penetração melhoram também a permeabilidade de fármacos lipófilos. Os intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco grandes categorias, isto é, tensioativos, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensioativos não quelantes. Os intensificadores de penetração e suas utilizações são descritos em mais detalhe na Patente U.S. Número: 6,287,860. 161

Um especialista na técnica reconhecerá que as formulações são rotineiramente concebidas de acordo com a sua utilização, isto é, via de administração pretendida.

As formulações preferidas para administração tópica incluem aquelas em que os oligonucleótidos aqui descritos são misturados com um agente de administração tópica tal como lipidos, lipossomas, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, esteróides, agentes quelantes e tensioativos. Os lipidos e lipossomas preferidos incluem neutros (por exemplo dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, distearoilfosfatidil colina) negativos (por exemplo dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiónicos (por exemplo dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA).

Para administração tópica ou outra, os oligonucleótidos aqui descritos podem ser encapsulados em lipossomas ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomas catiónicos. Alternativamente, os oligonucleótidos ou moléculas interativas (por exemplo anticorpos) pode ser complexados com lipidos, em particular com lipidos catiónicos. Os ácidos gordos e ésteres preferidos, seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e suas utilizações são descrito em mais detalhe na Patente U.S. Número: 6,287,860.

As composições e formulações para administração oral incluem pós ou granulados, microparticulas, nanoparticulas, suspensões ou soluções em meios aquosos ou não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou minicomprimidos. Podem ser desejados espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes. As formulações orais preferidas 162 são aquelas em que os oligonucleótidos aqui descritos são administrados em conjunto com um ou mais intensificadores de penetração, tensioativos e quelantes. Os tensioativos preferidos incluem ácidos gordos e/ou seus ésteres ou sais, ácidos biliares e/ou seus sais.

Os ácidos/sais biliares e ácidos gordos preferidos e suas utilizações são descritos em mais detalhe na Patente U.S. Número: 6,287,860. São também preferidas associações de intensificadores de penetração, por exemplo, ácidos gordos/sais em associação com ácidos/sais biliares. Uma associação particularmente preferida é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros intensificadores de penetração incluem éter polioxietileno-9-laurílico, éter polioxietileno-20-cetilico. Os oligonucleótidos ou anticorpos ou outras moléculas interativas aqui descritos podem ser administrados por via oral, na forma granular incluindo partículas secas por pulverização ou complexados para formar micro ou nanopartícuias. Os agentes de complexação de oligonucleótidos e suas utilizações são descritos em mais pormenor na Patente U.S. Número: 6,287,860.

As composições e formulações para administração parentérica, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que podem conter também tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não se limitando a, intensificadores de penetração, compostos transportadores e outros transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Certas formas de realização da presente invenção proporcionam composições farmacêuticas contendo um ou mais compostos oligoméricos e um ou mais de outros agentes quimioterapêuticos. Os exemplos de tais agentes 163 quimioterapêuticos incluem mas não se limitam a fármacos quimioterapêuticos contra o cancro tais como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósida, bis-cloroetilnitrosureia, bussulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucil, metilciclo-hexilnitrosureia, mostardas de azoto, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiureia, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR) , metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gencitabina, teniposido, cisplatina e dietilestilbestrol (DES). Quando utilizado com os compostos da invenção, tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados individualmente (por exemplo, 5-FU e oligonucleótido) , sequencialmente (por exemplo, 5-FU e oligonucleótido durante um intervalo de tempo seguidos de MTX e oligonucleótido) ou em associação com um ou mais desses agentes quimioterapêuticos (por exemplo, 5-FU, MTX e oligonucleótido, ou 5-FU, radioterapia e oligonucleótido). Os fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não se limitando a fármacos anti-inf lamatórios não esteróides e corticosteróides, e os fármacos antivirais, incluindo mas não se limitando a ribivirina, vidarabina, aciclovir e ganciclovir, também podem ser combinados nas composições da invenção. São também divulgadas associações de compostos antimensageiros ou mensageiros e outros fármacos não antimensageiros. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente. 164

As composições aqui descritas podem conter um ou mais compostos antimensageiros ou mensageiros, ou uma ou mais moléculas interativas tais como anticorpos direcionados para um primeiro ácido nucleico ou proteina alvo e um ou mais compostos adicionais direcionados para um segundo ácido nucleico ou proteina alvo. Alternativamente, as composições aqui descritas podem conter dois ou mais compostos antimensageiros ou mensageiros ou dois ou mais compostos interativos direcionados para regiões diferente do mesmo ácido nucleico ou proteina alvo. A formulação de composições terapêuticas e sua administração (dosagem) subsequente está dentro da perícia dos técnicos na matéria. A dosagem depende da gravidade e sensibilidade do estado patológico a ser tratado, com o decurso do tratamento a durar de vários dias até vários meses, ou até ser efetuada a cura ou ser conseguida uma diminuição do estado patológico. Os planos de administração ótimos podem ser calculadas a partir de medições da acumulação de fármaco no corpo do doente. Os técnicos médios podem determinar facilmente as dosagens ótimas, as metodologias de administração e as taxas de repetição. As dosagens ótimas podem variar dependendo da potência relativa dos compostos individuais e podem ser geralmente estimadas com base nas EC50S determinadas como sendo eficazes in vitro e em modelos animais in vivo. Em geral, a dosagem é desde 0,01 ug até 100 g por kg de peso corporal, e pode ser dada uma vez ou mais diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou até mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Os técnicos médios na matéria podem estimar facilmente as taxas de repetição para administração com base nos tempos de residência e concentrações de fármaco medidos em fluidos ou tecidos do corpo. Após tratamento bem sucedido, pode ser desejável manter o doente sob uma terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado 165 patológico, em que o composto é administrado em doses de manutenção, que vão desde 0,01 yg até 100 g por kg de peso corporal, uma vez ou mais diariamente até uma vez a cada 20 anos. Os exemplos de quantidades eficazes incluem 0,01, 0,02, 0 ,03, 0, 04, 0,05 , o, 06, 0,07 , o, 08, 0,09 , o, .1, 0,2, 0,3 , o, 4, 0 ,5, 0, 6 , o, 7, 0 ,8, 0, 9, 1,0 , 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 1 0, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e lOOg/kg de peso corporal. A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1

Linha de células A linha de células MDA-MB 231 de cancro da mama humano foi obtida de American Tissue Culture Collection (Rockville, EUA) e cultivadas a 37°C em 100% (v/v) ar, e mantidas em

Meio de Leibovitz L-15 (Sigma, St Louis, Mo., EUA), suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (CSL, Melbourne, Austrália) e reagentes antibióticos/ antimicóticos (Sigma, St Louis, Mo., EUA). EXEMPLO 2

Isolamento do ADNc para a HAS2 humana e construção de um vetor de expressão antimensageiro 166 0 ADNc para a HAS2 humana foi gerada concebendo iniciadores especificos para o gene a partir da sequência de Watanabe e Yamaguchi publicada (1996; N° de Acesso Genbank U54804) e consistiu nos seguintes iniciadores: mensageiro 5'>GAGCTGAACAAGATGCATTGTGAGAGC (SEQ ID NO:1) e antimensageiro 5'GACATGGTGCTT-GATGTATGATCTTCCAT (SEQ ID N0:2). 0 ARN total colhido a partir dos fibroblastos dérmicos humanos em divisão exponencial foi utilizado como cadeia molde para RT-PCR para gerar um fragmento de ADNc de HAS2 com l,7kb, o qual foi clonado diretamente no vetor pGEM-T (Promega Corporation, Madisom, EUA) . 0 ADNc para a HAS2 foi subsequentemente subclonada no vetor de expressão pCI-Neo (Promega Corporation, Madisom, EUA) e os clones isolados contendo a inserção na orientação antimensageira foram identificados por mapeamento com endonuclease de restrição e sequenciação automática. EXEMPLO 3

Transfeção de ASHAS2 humano e simulado em células MDA-MB 231 de cancro da mama humano A construção ASHAS2-pCl-Neo e o vetor pCl-neo foram transfetados em células da mama MDA-MB 231 humanas utilizando o reagente Lipofectamina mais (Gibco life Technologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Antes de começas os estudos, as células transfetadas foram selecionadas durante pelo menos um mês na presença de 500yg/mL de antibiótico G418. As células transfetadas foram selecionadas durante pelo menos um mês na presença de 500yg/mL de antibiótico G418. As colónias resistentes foram em seguida colhidas e estabelecidas como linhas de células estáveis. 167 EXEMPLO 4

Deteção da incorporação da transfeção estável no genoma A PCR em ADN genómico purificado isolado de transfetantes ASHAS2-pCINeo foi realizada para confirmar a incorporação da construção antimensageira no genoma. Em resumo, utilizou-se um iniciador específico para o gene para a pCINeo: 5 '-GCACAGATGCGTAAGGAG-3' (SEQ ID NO : 3) em associação com dois iniciadores específicos de HAS 2 da seguinte sequência: GSP2 mensageiro 5'- GCTGTGTACATGACCTCGCGCTTGCCGCC-3' (SEQ ID NO:4) e GSP4 mensageiro, 5'-GGCGGGAAGTAAACTCGAC-3' (SEQ ID N0:5). Quando utilizados na combinação seguinte foram amplificados os produtos de tamanho esperado para pCIneo/GSP2 e pCIneo/GSP4 de 1443 e 2223pb, respetivamente. EXEMPLO 5

Quantificação de ARNm para HAS1, 2 e 3

Utilizou-se PCR em tempo real para quantificar os niveis relativos de ARNm de HAS1, HAS2 e HAS3 nas células parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 utilizando iniciadores específicos dos genes e uma sonda oligonucleotídica interna. Em resumo, o ARN total foi purificado de células experimentais utilizando Rneasy (Qaigen, Melbourne, Austrália), o qual foi então utilizado para gerar ADNc de cadeia simples incubando 2yg de ARN com 0,5yg/yL de iniciadores aleatórios e trancriptase inversa. Para PCR em tempo real quantitativa foram utilizados iniciadores específicos dos genes para cada isoforma de HAS e uma sonda oligonucleotídica interna. Em resumo, os iniciadores consistiram dos seguintes: HAS1, mensageiro, 5' 168

CCTGCATCAGCGGTCCTCTA 3' (SEQ ID N0:6); HAS1 antimensageiro, 5' GCCGGTCA-TCCCCAAAAG 3' (SEQ ID NO: 7) ; sonda para HAS1, 5' AACCTCTTGCAGCAGTTTCTTGAGGCC 3' (SEQ ID NO:8); HAS2 mensageiro, 5' CAGTCCTGGCTTCGAGCAG 3' (SEQ ID NO:9), HAS2 antimensageiro, 5' TTGGGAGAAAAGTCTTTGGCT 3' (SEQ ID NO:10); sonda para HAS2, 5' CCATTGAACCAG-AGACTTGAAACAGCCC 3' (SEQ ID NO:11); HAS3 mensageiro, 5' TTGCACTGTGGTCGTCAACTT 3' (SEQ ID NO:12), HAS3 antimensageiro, 5' GTCGAGGTCAAACGTTGTGAG 3' (SEQ ID NO:13), sonda para HAS3, 5' T CAAAT CAAAAACAGGCAGGTACAGGTAGTGG 3' (SEQ ID NO:14); GAPDH mensageiro, 5' AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3' (SEQ ID NO:15), GAPDH antimensageiro, 5' GAGTTAAAA-GCAGCCCTGGTG 3' (SEQ ID NO:16), sonda para GAPDH, 5' TTTGGTCGTATTGGGCGCCTGG3' (SEQ ID NO:17). Para as sondas interna para HAS o corante repórter 6-carboxilfluoresceina (6-FAM) e desativador 6-carboxitetrametil rodamina (TAMRA) foram marcados em 5' e 3' respetivamente. Para as sondas internas para GAPDH o repórter 6-FAM foi substituído por VIC™ (Applied Biosystems Califórnia, EUA). A reação de PCR foi realizada num volume final de 30yL e consistiu de mistura reacional Taqman 1*, 6μΜ de iniciador direto e inverso para HAS, 1,5μΜ de sonda, ΙμΜ de cada iniciador para GAPDH e 500nM de sonda para GAPDH. A amplificação por PCR foi por desnaturação durante 10 minutos a 95°C, seguida de emparelhamento durante 2 minutos a 50°C seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. A execução dos ciclos térmicos e medição de fluorescência foram realizadas num sistema de deteção de sequência ABI Prism 7700 (Applyed Biosystems, Califórnia, EUA). Para permitir a comparação entre amostras, os sinais relativos da hialuronano-sintase foram normalizados com medições de controlo de GAPDH interna. EXEMPLO 6 169

Caracterização da expressão do gene da hialuronidase A fim de determinar o estado da expressão do gene da hialuronidase para a HIAL1, 2 e 3, foi realizada RT-PCR em ARN total extraido de células experimentais colhidas a 80 e 100% de confluência. Os conjuntos de iniciadores específicos para os genes foram concebidos a partir de sequências recuperadas do GenBank e consistiram de: HIAL1 (N° de Acesso Genbank NM007312) mensageiro, 5'-GCACAGGGAAGTCACAGATGTATGTGC-3' (SEQ ID NO:18); HIALl antimensageiro, 5'-CCACTGGTCACGTTCAGGATGAAG-3 (SEQ ID NO:19); HIAL2 (N° de Acesso Genbank NM003773) mensageiro 5'-GATGTGTATCGCC-GGTTATCACGCC-3' (SEQ ID NO:20); HIAL2 antimensageiro 5' -CGTAGACTGGGAG-TGCATGGTTGGC-3' (SEQ ID NO:21); HIAL3 (N° de Acesso Genbank NM003549) mensageiro, 5'-GCACTGATGGAGGATACGCTGCG-3' (SEQ ID NO:22); HIAL3 antimensageiro, 5'-GCTGGTGACTG-CAGGCCATCGCTGC-3' (SEQ ID NO:23). As sequências amplificadas foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etidio e a identidade confirmada por sequenciação de ADN automática. EXEMPLO 7

Ensaio de proliferação celular Células parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 foram colhidas a aproximadamente 80% de confluência e aplicadas em placas de 24 poços a densidades celulares diferentes, que iam desde 5xl03 células até 9xl04células/poço. O taxa de crescimento de células foi então seguida durante 24, 48, 72 e 96 horas após aplicação. Todas as contagens de células foram determinadas utilizando um contador de Coulter automático. 170 EXEMPLO 8

Imuno-histoquímica

Para permitir a imunodeteção e comparação entre células MDA-MB-231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2-pCNeo foram amavelmente oferecidos anticorpos específicos para HAS2 e Hyal2 pelo Dr Paraskevi Heldin e Dr Robert Stem, respetivamente. O Clone DF1485 anti-CD44 humano foi adquirido de DAKO (Dinamarca) e utilizado de acordo com as instruções do fabricante. As células foram aplicadas em lamelas de câmara com 8 poços a uma densidade de 2xl04 células/poço e cultivadas durante mais 24 horas a 37°C. As células foram fixadas em Histochoice durante 15 minutos antes de bloquear as proteínas heterófilas por incubação em PBS contendo 10%FCS. Os anticorpos primários foram diluídos (para indicar concentração NÃO diluição) em diluente de anticorpo (PBS contendo 1% de soro humano e 1% de FCS), em seguida incubados nas lamelas durante 60 min à temperatura ambiente. A atividade peroxídase endógena foi bloqueado por imersão das lamelas em H2O2 a 0,3% em metanol durante 20 min antes da incubação com um antissoro secundário anti-ovelha de coelho conjugado com peroxídase durante 60min à TA. Os imunocomplexos foram visualizados aplicando substrato 3,3'-Diaminobenzideno (Sigma Fast DAB) durante 5-10 minutos, em seguida submetidos a revelação de contraste com hematoxilina, desidratados e montados. EXEMPLO 9

Análise do ciclo celular por citometria de fluxo

As células transfetadas e de controlo foram aplicadas a 2xl05 células/balão de 25cm2 na presença de timidina 2mM e 171 cultivadas até 50% confluentes. As células foram lavadas, em seguidas recolocadas no meio de cultura normal e colhidas por tripsinização, aos seguintes pontos no tempo; Oh, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h, 28h, 32h e 36h, em seguida fixadas em etanol a 95% durante 2h a 4°C. As células foram pré-tratadas com 100pg/mL de RNAase (Sigma) e 50pg/mL de iodeto de propidio (Sigma) durante 30 minutos a 37°C antes de determinar a fase do ciclo celular num instrumento analítico FACS-Calibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA). EXEMPLO 10

Ensaio de migração

O ensaio de quimioinvasão em câmara de Boyden foi realizado como anteriormente descrito (Thompson et al., 1992). O

Matrigel (50pg) foi seco sobre filtros de policarbonato (12ym de poro, isentos de PVP, Nucleopore, Pleasanton, CA) e em seguida reconstituídos a 37°C. O meio de crescimento normal (L-15 meio) contendo 0,1% de albumina de soro bovino (Miles Biochemicals, Kankakee, IL) foi utilizado como o quimiotático. As células foram colhidas na fase de crescimento logarítmico por tripsinização, lavadas duas vezes com meio L-15 isento de soro contendo 0,1% de albumina de soro bovino, em seguida aplicadas a 300 000 células/câmara de lmL e 70 000 células/câmara de 0,2mL. Cada experiência foi realizada em triplicado. As câmaras foram incubadas numa incubadora humidificada a 37°C durante 6 horas. Para determinar a população de células que atravessou o matrigel, os filtros foram revelados com Diff-Quik (American Scientific Products, McGaw PK., IL) , em seguida contados. EXEMPLO 11 172

Ensaio de exclusão de partículas e morfologia da célula A matriz pericelular dependente de HA foi visualizada em torno das células do cancro da mama a partir de culturas de controlo e transfetadas pela exclusão de eritrócitos humanos fixos descrita por Clarris & Fraser (1968). As diferenças morfológicas bem como o ensaio de exclusão de partículas nas células MDA-MB 231 de controlo e transfetadas foram fotografadas num microscópio de contraste de fase invertida Nikon Optiflot (Nikon Company, Japão) 24h e 60h após aplicação. EXEMPLO 12

Efeito da produção de HA

As células foram aplicadas a 2,5xl05/células em balões de cultura de 25cm2 e incubadas a 37°C durante 24h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144h. Em cada ponto no tempo, as células foram tripsinizadas e contadas utilizando um contador de Coulter automático. A concentração de HA no meio de cultura colhido foi determinada utilizando um ensaio de proteína de ligação de ácido hialurónico (HAPB), com os padrões e tampão de reação proporcionados por Corgenix Inc (Colorado, EUA). EXEMPLO 13

Cromatografia de exclusão molecular para determinar o PM do HA sintetizado

As células foram aplicadas a 7,5xl05 células em balões de cultura de 75cm2 e cultivadas durante 24h em meio completo suplementado com 5yCi de cloridrato de D-[6-3H]-Glucosamina. a. Para determinar o PM do 3H-HA no meio, as 173 amostras foram submetidas a cromatografia de exclusão molecular sobre um Sephacryl S-1000 SF. Em resumo, a coluna de gel (l,6m x 90m) foi empacotada de acordo com as instruções do fabricante, equilibrada e eluida com tampão de fosfato contendo 0,2% (v/v) de TX-100. O peso molecular do HA no meio de cultura foi calculado utilizando regressão linear de Kav versus HA de pesos moleculares conhecidos que vão desde >1, 67xl07, Kav=0 a 4,4xl03, Kav=l. Gama de fração de coluna S-1000 7xl04 -l,7xl07Da. EXEMPLO 14

Inoculação de células MDA-MB 231 na almofada de gordura mamária Células parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 foram colhidas na fase de crescimento logarítmico por raspagem. As células foram ressuspensas a uma densidade final de 2xl06 células em meio L-15 suplementado com 0,1% de glucose +/- Matrigel (v/v QUAL É A PERCENTAGEM?), em seguida imediatamente injetadas na almofada de gordura mamária de ratos glabros CBA fêmeas com 5 semanas de idade (n=ll, assim cada grupo de tratamento consistem em 11) . O crescimento do tumor foi registado duas vezes por semana medindo três diâmetros perpendiculares (dl,d2,d3). O volume do tumor foi então calculado utilizando a fórmula: (1/6)π (dld2d3). No dia 84, os ratos foram mortos humanamente e o fígado, rins, cérebro e pulmões removidos na autópsia e conservados a -20°C. Para avaliação histológica, metade do tumor primária foi fixado em formaldeído a 4% e embutido em parafina, em seguida secções de 5ym deste tecido foram examinadas por revelação com H&E. A porção remanescente do tumor foi congelada a -20°C até análise posterior. 174 EXEMPLO 15

Extração de ADN a partir dos órgãos moles e quantificação das metástases de MDA-MD 231

Foi utilizada PCR de Alu quantitativa para detetar a metástase de MDA-MD 231 a partir do tumor primário para outros órgãos recolhidos na autópsia. Em resumo, o ADN foi extraído triturando as amostras sob azoto líquido e ressuspendendo num tampão de lise de ADN. 0 ADN foi então purificado utilizando metodologia corrente de fenol-clorofórmio, seguida de precipitação com etanol e reconstituição em tampão TE. 0 ADN purificado foi ajustado a uma concentração final de lOng/yL em tampão TE pH7,2, recolhidas alíquotas e conservado a -20°C até análise. Para remover a contaminação com ADN humano exógeno, a mistura reacional foi tratada com 17U/mL de nuclease S7 (Roche) na presença de CaCl2 lmM a 37°C durante 24 horas antes da PCR. A PCR de Alu quantitativa foi então realizada em amostras de ADN genómico purificado (lOng) num Sistema de deteção de sequência GeneAmp 5700 (Applyed Biosystems, Austrália). Em resumo, cada amostra foi testada em duplicado num volume reacional final de 25yL consistindo de 0,625U Taq ADN polimerase (Roche; Mannheim, Alemanha), Tris-HCl lOmM, pH 8,3, MgCl2 1,5mM, KC1 50mM, dNTPs 200μΜ, 8% de DMSO, lyg/mL de 6-carboxi-X-rodamina (Molecular Probes; Eugene, Oregon EUA) , diluição a 1 para 40000 de SYBR Green I (Molecular Probes) e lOOnM de cada iniciador para Alu. Após uma incubação de desnaturação inicial a 95°C durante 2 minutos, a amplificação ocorreu ao longo de 40 ciclos, os quais consistiram em desnaturação a 95°C durante 5 segundos, emparelhamento a 65°C durante 60 segundos e prolongamento a 75°C durante 15 segundos, durante o que foi medida a intensidade de fluorescência. Foi então gerada uma curva de 175 dissociação desde 60°C a 95°C. Em cada placa reacional de 96 poços foi preparada um curva de calibração diluindo sucessivamente humano ADN em ADN de rato, o que permitiu a quantificação da carga tecidular de células de tumor humano nos órgãos do rato removidos na autópsia. EXEMPLO 16

Transfeção de HAS2 antimensageiro em células MDA-MB 231 transfetadas A incorporação da construção HAS2-pCINeo antimensageira no genoma de MDA-MB 231 foi confirmada através de análise por PCR em ADN altamente purificado extraído a partir das células transfetadas. Quando utilizado na seguinte combinação; os produtos de pCIneo/GSP2 e pCIneo/GSP4 de tamanho esperado 1443 e 2223pb foram amplificados de forma reprodutível a partir de clones estáveis que têm a construção antimensageira para HAS2. 0 ADN genómico isolado a partir de células parentais e transfetadas de forma simulada deram um teste negativo. EXEMPLO 17

Transfeção com antimensageiro para HAS2 altera os perfis de expressão de HAS e dos genes de hialuronidase em MDA-MB 231

Os níveis endógenos de ARNm para HAS2 em células parentais foram quantificados utilizando PCR em tempo real e comparados com os valores obtidos a partir de células simuladas e transfetadas com antimensageiro para HAS2. Simultaneamente com estas experiências foram também quantificados os níveis de ARNm de HAS1 e HAS3 utilizando PCR em tempo real com a expressão de HIAL1, 2 e 3 176 caracterizada por metodologia TA-PCR corrente. Para permitir a comparação da expressão de HAS em real tempo entre células transfetadas e parentais o nivel de cada ARNm quantificado foi normalizado aos respetivos controlos de GAPDH internos. 0 nivel endógeno de expressão de ARNm de HAS2 em células parentais é mostrado na Figura la, o qual era ligeiramente menor nos transfetantes simulados. Em contraste, a expressão de ARNm em células transfetadas com ASHAS2 estava aumentada 3 a 4 vezes e 8 a 9 vezes quando comparado com as células parentais e transfetantes simuladas células (Figura la). Foi também detetada a expressão moderada de HAS3 e foi comparável em células parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro Figura lb. A expressão de HAS I em transfetantes antimensageiros foi coerente ao longo deste estudo, o que não pôde ser detetado em células parentais e transfetantes simulados (Figura lb).

As culturas de controlo de células parentais e transfetadas de forma simulada revelaram positivamente para o recetor de HA CD44 e Hial-2. A revelação de CD44 em ambos os controlos foi muito evidente na membrana do plasma com áreas de revelação intensa focal da membrana (Figura 1 painel E). No epitopo CD44 pôde ser detetada reatividade nos transfetantes ASHAS2 (Figura 1 painel F). Observações semelhantes foram registadas para a reatividade com anticorpo contra Hial-2, onde as culturas de controlo revelaram positivamente, que se localizou na membrana do plasma e também surgiu como vesículas citoplasmáticas enquanto que não podia ser detetada qualquer reatividade nos transfetantes ASHAS2. Estes resultados indicam que a perturbação do CD44 e Hyal2 funcionais, como observada nos transfetantes ASHAS2, alteram o catabolismo do HA culminando num aumento significativo da quantidade de HA no meio de cultura. 177 EXEMPLO 18

Características das células MDA MB 231 de cancro da mama num modelo de xenoenxerto de tumor

Curiosamente, a inibição antimensageira de HAS2 alterou profundamente a expressão de Hial-1, 2 e 3 em MDA-MD 231. A Hial-3 não pôde ser detetada tanto em parentais como transfetantes simulados, os quais expressam ambos niveis comparáveis de ARNm para Hial-1 e numa extensão muito maior Hial-2, a qual foi também comparável entre estes dois controlos (Figura 2).

Em contraste, a inibição da expressão de HAS2 resultou na regulação negativa do ARNm de Hial-2 até ao ponto em que não era detetável mesmo após 35 ciclos de PCR. A expressão de Hial-1 em transfetantes antimensageiros foi moderadamente aumentada quando comparada com os controlos parental e simulado e a Hial-3 foi também detetada nos transfetantes antimensageiros. Assim, ao impedir a produção de uma proteína HAS2 funcional na linha de células MDA-MD 231, a expressão do gene de Hial-2 foi regulada negativamente simultaneamente com a regulação positiva de HAS 1 e Hyal3, genes que não são normalmente expressados nesta linha de células.

Foi utilizada imuno-histoquímica com um anticorpo específico para HAS2 para determinar a extensão da reatividade da superfície celular. Enquanto que as células parentais e transfetadas de forma simulada revelaram positivamente para a proteína HAS2 (Figura 1, painel B) , que se localizaram principalmente na membrana do plasma, o bloqueio eficiente da tradução nos transfetantes antimensageiros para HAS2 foi evidenciado pela ausência de 178 imunorreatividade com o anticorpo contra HAS2 (Figura 1 painel C). A massa molecular do HA sintetizado pelas células parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro foi determinada por cromatografia de exclusão molecular sobre Sephacyl S-1000. A linha de células parental sintetizou três pesos moleculares distintos de HA que se estimou serem de 3000 kDa, 40 000 e 100 000 Da respetivamente, o que reflete os produtos das isoformas de HAS expressadas na linha de células parentais, especialmente HAS2 e 3. Os transfetantes antimensageiros para HAS2 sintetizaram HA que foi eluido no volume morto que corresponde a um peso molecular >1,67 x 107. Foi também detetada outra fração correspondente a um PM de 100 OOODa no meio dos transfetantes antimensageiros mas a percentagem de incorporação de precursor radioativo foi muito inferior à observada na linha de células parental (Figura 2). Foi demonstrado que estes perfis de eluição eram 100% suscetíveis a digestão com hialuronídase de Streptomyces. A inibição antimensageira de HAS2 resulta num metabolismo de hialuronano alterado. Devido à expressão alterada do gene de HAS e HIAL em transfetantes de MDA-MB 231 com ASHAS2 a quantidade de hialuronano no meio de cultura em contacto com as células foi quantificado utilizando um ensaio de proteína ligada a enzima específica para HA. A produção de HA foi quantificada a partir de amostras recolhidas em triplicado nos mesmos pontos no tempo estabelecidos no ensaio de proliferação. Os dados recolhidos foram representados graficamente como HA sintetizado (picograma por célula: pg/célula/dia). O meio de contacto com as células de transfetantes de MDA-MB 231 com antimensageiro para HAS2 continha uma quantidade 179 significativamente maior de hialuronano quando comparado com as células parentais ou transfetantes simulados (Figura 3). Em médias as culturas de ASHAS2 sintetizaram 6,79pg de HA/célula/dia ao longo da duração da experiência com uma exceção assinalável às 48 horas, onde a síntese aumentou até 12pg/célula/dia. Em contraste, as células parentais e transfetantes simulados sintetizaram aproximadamente 1,1 e l,4pg de HA/célula/dia respetivamente ao longo da duração da experiência. A exclusão de eritrócitos fixos foi utilizada para visualizar indiretamente a matriz pericelular de HA nos transfetantes ASHAS2, a qual foi então comparada com a observada nas células parentais ou transfetantes simulados. Nestas experiências não houve qualquer evidência para sugerir qualquer diferença flagrante na espessura da matriz pericelular, a qual era comparável à observada nas culturas de controlo (Figura 3b) .

Ao longo das experiências, a morfologia das células transfetadas com antimensageiro foi comparada com as células de controlo. Os transfetantes ASHAS2 eram facilmente distinguíveis pela sua morfologia, a qual era semelhante a células que sofrem mitose e/ou migração, isto é, células arredondadas pequenas que estavam ligeiramente aderidas à superfície de crescimento. Coerente ao longo destas observações foi a diminuição do número de células de transfetantes ASHAS2 quando comparado com as culturas de controlo. EXEMPLO 19

Inibição de HAS2 diminui a proliferação e migração in vitro das células de cancro da mama 180

Para comparar o efeito da inibição antimensageira de HAS2 durante o crescimento ativo de células, células parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 foram aplicadas a densidades subconfluentes idênticas e foram colhidas em tempos definidos e a contagem total de células estimada utilizando um contador de Coulter. Em ambas as culturas de controlo foi observada uma duplicação do número de células a cada 24 horas até ao ponto de amostragem de 72 horas onde as culturas atingiram a confluência (Figura 4). Em contraste, nos transfetantes estáveis que abrigam ASHAS2, o crescimento de células foi profundamente afetado pela ausência de uma proteína HAS2 funcional. Especificamente, os transfetantes ASHAS2 exibiram um período de atraso de aproximadamente 24 horas para atingir densidades semelhantes às observadas nas culturas de controlo em todos os pontos no tempo subsequentes em que foi determinado s número de células (Figura 4) . A confluência em culturas ASHAS2 ocorreu aproximadamente às 96 a 120 horas de crescimento de células após aplicação, em comparação com 72 horas em ambas as culturas de controlo. Por conseguinte, estas observações realçam a importância da expressão coordenada de uma HAS2 funcional na proliferação celular.

Simultaneamente com estas observações foi também realizada análise citométrica de fluxo em células parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 para determinar o teor relativo de ADN em pontos definidos no tempo após aplicação a densidades subconfluentes (Figura 5) . A percentagem de células transfetadas com ASHAS2 nas fases do ciclo celular Go/Gi, S e G2/M 28 horas após aplicação foram 80%, 0% e 9% respetivamente (Figura 5) . Em contraste, as figuras correspondentes das células parentais, as fases do ciclo celular G0/Gi, S e G2/M foram 4%, 75% e 15% respetivamente (Figura 5). Estes resultados são coerentes com a observação do período de 'atraso' de 24 horas no ensaio de 181 proliferação, onde a inibição antimensageira induziu um atraso transitório de entrada na fase S de aproximadamente 24 horas (Figura 5), reforçando desse modo a importância da expressão de HAS2 durante a proliferação celular em culturas de MBA-MD-231. A aptidão das células cancerosas para migrar é uma caracteristica fundamental em células cancerosas altamente metastáticas. Para caracterizar as caracteristicas altamente invasivas de MDA MB-231 foi utilizado o ensaio de quimioinvasão utilizando a câmara de Boyden. As taxas de migração foram em seguida comparadas entre MDA MB-231 parentais, simuladas e transfetadas ASHAS2. As células parentais e transfetantes simulados exibiram comportamento migratório tipico com 100% da população de células a invadir o matrigel no filtro subjacente (Figura 6) . Em contraste, os transfetantes estáveis que abrigam antimensageiro HAS2 resultaram em 93% inibição da migração quando comparados com quaisquer dos controlos testados (Figura 6). EXEMPLO 20 A inibição de HAS2 inibe totalmente o crescimento e progressão do cancro da mama primário e secundário A fim de examinar os efeitos da inibição antimensageira de HAS2 no crescimento do tumor, células parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 foram inoculados na almofada de gordura mamária de ratos glabros. O crescimento do tumor primário foi seguido ao longo de um periodo de 12 semanas após implantação, após o que a extensão de metástase para outros órgãos foi detetada utilizando PCR de Alu. Os ratos inoculados com MDA MB 231 parentais ou transfetadas de 182 forma simulada estabeleceram facilmente tumores primários que eram comparáveis em crescimento ao longo da duração da experiência de 12 semanas (Figura 7) . No entanto, em contraste, os ratos inoculados com transfetantes ASHAS2 não estabeleceram tumores primários (Figura 7). Noutras experiências foi também incluído Matrigel no meio de inoculação utilizado para assegurar a viabilidade dos transfetantes ASHAS2 injetados. Mais uma vez, não pôde ser detetado qualquer tumor primário ao longo da duração da experiência de 12 semanas (dados não apresentados). Como avaliado por PCR de Alu, a metástase foi muito prevalecente no cérebro, e pulmão mas foi também detetada nos rins e no fígado de amostras preparadas a partir de ratos injetados com células MDA-MD 231 parentais ou transfetantes simuladas (Figura 7b) . Apesar da sensibilidade descrita para este ensaio, o qual é capaz de detetar 1 célula humano/1 x 106 células de rato, não puderam ser encontradas quaisquer metástases nos órgãos supramencionados de ratos que foram injetados com transfetantes ASHAS2 (Figura 7) foram determinadas quaisquer metástases para mole órgãos, contudo, não foram detetadas metástases com o antimensageiro para HAS2 e foram encontrados níveis significativamente altos de metástase no cérebro e pulmão em comparação com o rim e fígado nos grupos de ratos parentais (Figura 7b). EXEMPLO 21 A sobreexpressão de HAS2, HIAL2 e CD44 correlaciona com a capacidade de invasão do cancro da mama

Cultura de células de cancro da mama humano 183

Linhas de células de adenocarcinoma da mama humano aneuplóides, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDA-MB-453, MDA-MB-361, T47D, MCF-7A, BT-549, ZR-75-1 e Hs578T foram obtidas de American Tissue Culture Collection, Rockville, EUA. Todos os reagentes de propagação de cultura de células foram obtidos de Sigma, St Louis, Mo, EUA. As linhas de células, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDA-MB-453 e MDA-MB-361 foram rotineiramente cultivadas e subcultivadas como uma monocamada em balões de cultura de 175 cm2 em meio de Leibovitz L-15 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) a 37°C em 100% (v/v) ar. A linha de células ZR-75-1 foi cultivada em Meio RPMI suplementado com 10% de FCS, L-glutamina 2mM, l,5g/L de bicarbonato de sódio, 4,5g/L de glucose, HEPES lOmM, piruvato de sódio lmM a 37 °C numa incubadora de humidade controlada em 5% (v/v) de CC>2. A linha de células T47D foi mantida numa incubadora humidificada a 37 °C em 5% de CO2 em RPMI suplementado com 10% de FCS, 4,5g/L de glucose, HEPES lOmM, piruvato de sódio lmM, 7,lyg/mL de insulina. A linha de células BT-549 foi mantida numa incubadora humidificada a 37°C em 5% de CO2 em RPMI suplementado com 10% de FCS e 0,8yg/mL de insulina. A linha de células Hs578T foi cultivada numa incubadora humidificada a 37 °C em 5% de C02 em DMEM suplementado com 10% FCS e lOyg/mL de insulina. A linha de células MCF-7 foi cultivada numa incubadora humidificada a 37 °C em 5% de C02 em MEM suplementado com 10% de FCS, piruvato de sódio lmM e lOyg/mL de insulina. Todas as culturas de células foram rotineiramente mantidas em meios contendo reagentes antibióticos/antimicóticos.

Quantificação de ARNm para HAS1, 2 e 3

Foram utilizadas PCR de tempo real e de transcriptase inversa comparativa, respetivamente, para quantificar os níveis relativos de ARNm das HA sintases (HAS1-3) nas dez 184 linhas de células de cancro da mama humano utilizando iniciadores específicos dos genes e uma sonda oligonucleotídica interna (Quadro 2). 0 ARN foi extraído a partir de culturas of células em triplicado cultivadas até à fase exponencial e em patamar utilizando Kits RNeasy Mini (QIAGEN, Basel, Suíça). Em resumo, o ARN total foi purificado de células em crescimento exponencial utilizando reagente TRI (Sigma) que foi utilizado para gerar ADNc de cadeia simples incubando 2yg de ARN com 0,5yg/yL de iniciadores aleatórios e trancriptase inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) . Para PCR em tempo real quantitativa foram utilizados iniciadores específicos dos genes para cada isoforma de HAS e uma sonda oligonucleotídica interna. Para sondas internas para HAS o corante repórter 6-carboxilfluoresceína (6-FAM) e desativador 6-carboxitetrametil rodamina (TAMRA) foram ligados em 5' e 3', respetivamente. Para sondas internas para GAPDH, o repórter 6-FAM foi substituído por VIC™ (Applyed Biosystems, Foster City, CA, EUA). A reação de PCR foi realizada num volume final de 30pL e consistiu em mistura reacional Taqman 1 x, 6μΜ de iniciador direto e inverso para HAS, 1,5μΜ de sonda, ΙμΜ de cada iniciador para GAPDH e 500nM de sonda para GAPDH. A amplificação por PCR foi realizada por desnaturação durante 10 min a 95°C, seguida de emparelhamento durante 2 min a 50 °C, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 min a 60°C. A execução dos ciclos térmicos e medição de fluorescência foram realizadas num sistema de deteção de sequência ABI Prism 7700 (Applyed Biosystems). A quantificação relativa foi realizada normalizando os valores limiares de ciclo (Ct) de cada amostra de gene com os valores de Ct da GAPDH. ACt corresponde à diferença entre o Ct dos genes de HAS de interesse e o Ct da GAPDH. Os dados são apresentados como a diferença do número de vezes da alteração relativamente aos 185 parentais (arbitrariamente fixados em 100) calculada de acordo com a fórmula que descreve a quantificação relativa por PCR 2“(actHAS'actGAPDH)

Caracterização of expressão do gene da hialuronidase

Para determinar a expressão do gene da hialuronidase para HIAL-1, 2 e 3 foi realizada TA-PCR em ARN total extraido de células nas fases de crescimento exponencial e de paragem de crescimento. Os conjuntos de iniciadores especificos para os genes foram concebidos a partir de sequências recuperadas do GenBank (ver Quadro 2). As sequências amplificadas foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etidio e a sua identidade confirmada por sequenciação de ADN automática. A fim de quantificar a abundância relativa de cada produto de PCR, os geles de agarose revelados com brometo de etidio contendo fragmentos amplificados foram submetidos a análise densitométrica utilizando o Instrumento de Imagem ProXpress™ (Perkin Elmer, Boston, MA, EUA) e os dados analisados utilizando o software Phoretix 1D (Phoretic International, Newcastle, UK) .

Quantificação da sintese e catabolismo de hialuronano libertado e associado às células

Culturas em triplicado de linhas de células de cancro da mama humano foram aplicadas a 7,5xl05 células/balão de cultura de 75cm2 e foram cultivadas com 400yg/mL de sulfato de dextrano (Mr 500 kDa e substituído com 17% de enxofre; Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) como um meio para inibir a atividade endógena da hialuronidase e permitir a caracterização dos produtos de digestão da hialuronidase (Udabage et al, 2004). As culturas foram 186 cultivadas durante 24h no decurso das quais as culturas de células atingiram 85% de confluência e, em seguida, durante mais 24h até ter sido observada paragem. No final do periodo de incubação, as células foram colhidas por tripsinização e contadas utilizando um contador de Coulter. 0 meio foi utilizado para quantificar o HA libertado. 0 HA extracelular associado às células foi obtido por centrifugação da fração de células/tripsina a 400gav numa centrifugadora Beckman TJ-6, onde o sobrenadante foi quantificado em relação ao HA. A concentração intracelular de HA foi determinada tratando o sedimento de células como se segue: o sedimento de células foi sujeito a lise sob condições hipotónicas por ressuspensão em HEPES lOmM pH 7,2, seguida de rutura num homogeneizador de Dounce utilizando 20 pancadas a cada 15 min. A lise celular foi confirmada por revelação com Giemsa e análise por microscopia ótica. A fim de dissociar o HA das proteínas de ligação, o lisado celular foi aquecido até 37°C com 0,5%v/v de Triton X-114 em tampão HEPES lOmM, pH 7,2 (Prehm, 1990). As micelas de HA/detergente foram centrifugadas a 1500gav durante 5 min e a fase aquosa superior foi analisada em relação ao HA. As análises individuais das frações intra e extracelular de HA não estavam dentro dos limites de deteção da ELISA de HA (>50ng/mL), por conseguinte as frações extracelular e intracelular foram combinadas e caracterizadas quanto às concentrações de HA. A produção de Hialuronano foi quantificada utilizando um ensaio de proteína de ligação a HA ligado a enzima (Corgenix Inc, Colorado, EUA). O ensaio foi realizado como orientado pelas instruções do fabricante. Em resumo, a partir de 100pL de amostras em duplicado e de padrões de HA (Ong/mL, 50ng/mL, lOOng/mL, 200ng/mL, 500ng/mL e 800ng/mL) foram retiradas alíquotas para uma placa de 96 poços revestidos com proteína de ligação a HA (HAPB), incubadas 187 durante 60 minutos à temperatura ambiente (TA) seguida de quatro lavagens com PBS. Foram adicionados 100 pL de HAPB conjugado com peroxídase de rábano silvestre e incubados durante 30 minutos à TA. Após mais lavagens com PBS, a reação foi visualizada com lOOpL de 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) após uma incubação de 30 min à TA. A reação foi parada com lOOpL de ácido sulfúrico 0,36N e lida a 450nm (referência 650nm) num leitor de microplacas BioRad 350. O meio de crescimento que não tinha sido exposto às células foi utilizado para determinar o fundo de HA endógeno, este número foi subtraído de todos os resultados.

Visualização da glicocálix de hialuronano A matriz pericelular dependente de HA foi visualizada em torno das células do cancro da mama pela adição de eritrócitos humanos fixos como descrito por Clarris & Fraser (1968). Em resumo, eritrócitos humanos foram fixados de um dia para o outro em l,5%v/v de formaldeído em PBS à TA e foram em seguida lavados exaustivamente em PBS. Na última lavagem foi adicionada azida de sódio a uma concentração final de 0,l%v/v e as células conservadas a 4°C. A monocamadas de cancro da mama foram lavadas duas vezes em PBS, 37°C e, em seguida, incubadas com 5mL de PBS ao qual foram adicionados 50pL de eritrócitos fixos (~108células/mL). As partículas foram deixadas depositar durante 15-30 min após o que a matriz pericelular dependente de HA foi registada por fotografia num microscópio de contraste de fase invertida Nikon Optiflot. A especificidade deste método foi demonstrada por incubação das culturas de cancro da mama com hialuronidase de Streptomyces, onde as células foram cobertas com lOunidades/mL de hialuronidase, seguida de incubação a 37°C durante 15-30 min. As monocamadas foram lavadas duas vezes em PBS, 37 °C e cobertas com 5mL de suspensão de eritrócitos fixos como anteriormente descrito. As particulas foram deixadas depositar durante 15-30 min, observadas e fotografadas como descrito acima.

Caracterização do peso molecular do hialuronano produzido pelas células de cancro da mama humano

As células foram aplicadas a 7,5xl05 células/balão de cultura de 75cm2 e foram cultivadas durante 24h em meio de crescimento contendo 400yg/mL de DS e 250yCi de cloridrato de D- [ 6-3H]glucosamina (Perkin Elmer, Boston, MA, EUA). No final do período de 24h de incubação, o meio foi removido e submetido exaustivamente a diálise (exclusão de Mr de 6 kDa) contra Tris-HCl lOmM/cloreto de sódio 0,15M/0,02% de azida de sódio pH 7,4 a 4°C. O dialisado e líquido de diálise foram analisados cromatograficamente para a identificação de [3H]HA e seus produtos de degradação. O [3H]HA >5kD foi submetido a cromatografia de exclusão molecular num gel de Sephacryl S-1000 eluído em NaCl 0, 15M/fosfato pH 7,25, o qual continha NaH2PC>4 19mM, Na2HP02 38mM e NaCl 94mM a 13,6mL/h. O líquido de diálise (moléculas <5kD) foi submetido a cromatografia de exclusão molecular num gel de Superose 12 gel eluído no tampão supramencionado a um caudal de eluição de 20mL/h. Os pesos moleculares estimados foram calculados utilizando dados de calibração para o HA em Sephacryl S-1000 e dados de

Superose 12 gerados a partir de frações de HA de alta

monodispersão que vão desde lOk até 5000 kDa adquiridas comercialmente (CPN, República Checa e Pharmacia). Para determinar a percentagem de incorporação de cloridrato de D-[ 6-3H] glucosamina nas macromoléculas de Ha, o dpm não dialisável (moléculas >5 kDa) foi submetido a digestão por 10 TRU de hialuronidase de Streptomyces a pH 6, 37 °C 189 durante 24h. 0 material digerido foi submetido a cromatografia em Sephacryl S-1000 e Superose 12, onde os perfis foram comparados com amostra não digerida equivalente. Qualquer material [3H] não digerido pela hialuronidase foi excluído dos perfis de cromatografia. Para o cálculo das recuperações da coluna, as contagens em cada fração foram tomadas como significativas quando >3 D.P. acima das dpm médias do fundo, com o fundo determinado tomando um número igual de pontos de amostragem antes e após V0 e Vt, em que o número médio tirado foi 20.

Avaliação da capacidade de invasão da linha de células de cancro da mama: ensaio de migração em câmara de Boyden

Os ensaios de invasão foram realizadas utilizando câmaras de Boyden modificadas com membrana de policarbonato Nucleopore (Corning, Corning, NY, EUA). Os filtros pré-revestidos (6,5 mm de diâmetro, 12 ym de tamanho de poro, Matrigel 100yg/cm2) foram re-hidratados com 100 yL de meio de Leibovitz L-15 suplementado com 0,1% p/v de BSA (Sigma). As células em crescimento exponencial foram colhidas com tripsina/EDTA (Sigma), lavadas duas vezes com meio de crescimento isento de soro contendo 0,1% p/v de BSA, em seguida adicionadas à câmara superior (3xl05 células/ câmara de lmL) . Foi utilizado meio de crescimento normal contendo 10% v/v de FCS como o quimiotático. Após incubação durante 6h a 37°C, as células não invadidas na superfície do filtro superior foram limpas com uma zaragatoa de algodão e as células que emigraram na superfície inferior do filtro foram fixadas e reveladas com kit Diff-Quick. A capacidade de invasão foi determinada contando as células em cinco campos microscópicos por poço e a extensão de invasão foi exprimida como um número médio de células por campo microscópico. Cada experiência foi realizada em 190 triplicado em dois dias diferentes em que os dados são representados como % de células migrantes em comparação com a linha de células parental.

Quantificação dos recetores de hialuronano, RHAMM e CD44

Os extratos celulares foram obtidos por lise hipotónica de células em crescimento exponencial em HEPES lOmM pH 7,2, seguida de rutura num homogeneizador de Dounce utilizando 20 pancadas a cada 15 minutos. A lise celular foi confirmada por revelação com Giemsa do lisado celular e observação por microscopia ótica. As preparações de lisado celular foram desnaturadas a 65°C durante 5 min e transferidas (15-30 yg de proteina por faixa) para um gel de poliacrilamida a 10%. A eletroforese foi realizada num aparelho minigel da Bio-Rad. As proteinas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e bloqueadas durante 1 h com soro fisiológico tamponado com Tris contendo 5% de leite seco desnatado e 0,1% de Tween-20. As membranas foram em seguida lavadas e testadas com o anticorpo apropriado diluido em soro fisiológico tamponado com Tris contendo 5% de albumina de soro bovino (para anticorpos policlonais) ou 5% de leite seco desnatado (para anticorpos monoclonais). Os anticorpos utilizados para deteção foram 50yg de anticorpo monoclonal contra CD44 (Hibridoma Bank, EUA) ou 25yg de RHAMM (amavelmente doado por R. Savani, University of Pennsilvania School of Medicine, EUA) . Os anticorpos secundários utilizados foram IgG anti-coelho (New England Bio-labs) e IgG anti-ratazana de coelho (Bio-Rad), os quais foram conjugados com peroxidase de rábano silvestre. As bandas imunorreativas foram detetadas por quimioluminescência melhorada e os tamanhos das proteinas foram estimados utilizando padrões de peso molecular pré-revelados. As bandas imunorreativas foram quantificadas por análise de densitometria utilizando 191 o instrumento de imagem ProXpress™ (Perkin Elmer, Boston, MA, EUA) e os dados analisados utilizando o software Phoretix 1D (Phoretic International, Newcastle, UK).

As células de cancro da mama altamente invasivas expressam preferencialmente HAS2

Os niveis endógenos de ARNm para as várias isoformas de HA-sintase foram quantificados em 10 linhas de células de cancro da mama humano diferentes utilizando PCR em tempo real e TA-PCR comparativa (ver Quadro 3) . O ARNm de HAS 1 não foi detetado em qualquer uma das dez linhas de células de cancro da mama. 0 ARNm de HAS2 foi detetado em todas as linhas de células de cancro da mama, as quais demonstraram uma capacidade de invasão >80% em que as linhas de células BT-549 e Hs578T altamente invasivas expressaram até 205 vezes mais ARNm de HAS2 do que as linha de células MDA-MB 453 não invasivas. Foram observadas diferenças insignificantes no ARNm de HAS2 entre células em crescimento exponencial e em paragem de crescimento. Todas as linhas de células expressaram niveis baixos de ARNm de HAS3, mas foi interessante observar que nas células com um baixo potencial invasivo (<26%) não foi detetado qualquer ARNm de HAS3 em células com paragem de crescimento, enquanto nas linhas de células altamente invasivas a transcrição deste gene prosseguiu. A expressão de HAS3 em todas as linhas de células de cancro da mama, mais particularmente nas linhas de células menos invasivas sugere que esta isoforma de HAS é principalmente responsável pela sintese dos niveis basal de produção de HA necessários para função celular normal e a HAS2 é necessária para a sintese rápida de grandes quantidades de HA necessárias para a invasão por cancro. 192 A glicocálix em células de cancro da mama em crescimento exponencial é gerada pela HAS2

Utilizando o ensaio de quantificação de HA e exclusão de partículas foi possível demonstrar de modo único que quando as células de cancro da mama estão na fase de crescimento exponencial qualquer HA associado à célula é apenas detetado nas células que expressam HAS2 (Quadro 3) . No fenótipo de cancro da mama menos invasivo, em crescimento exponencial que expressou preferencialmente HAS3, nenhum do HA sintetizado estava retido como parte da glicocálix, a retenção do HA na matriz pericelular ocorreu apenas depois de as células terem atingido a paragem de crescimento. Esta observação é contrária a estudos noutros tipos de células em que foi sugerido que a expressão de HAS3 resultava na retenção de uma matriz pericelular (Itano et al, 1999a; Liu et al, 1996) . Durante a senescência, em geral, a quantidade de HA libertado para o meio por linhas de células que expressam HAS3 diminui significativamente, nalguns casos foi observada inibição total da libertação de HA, seguida de retenção do HA na fração associada a células. Durante a senescência, as linhas de células altamente invasivas libertaram 40-60% menos HA para o ambiente extracelular, mas retiveram 2-22 vezes mais de HA na matriz pericelular. A quantificação da HA associado às células foi comprovada pelo ensaio de exclusão de células vermelhas, o que apenas demonstrou a presença de um revestimento pericelular nas linhas de células MDA-MB 231, BT-549 e Hs578T em crescimento exponencial. HAS 2 e HAS3 libertam hialuronano de alto peso molecular que é rapidamente despolimerizado 193 A caracterização cromatográfica do HA libertado (idigestão com hialuronidase de Streptomyces) a partir de células que tinham sofrido proliferação exponencial e paragem de crescimento demonstrou que 80-98% da [3H] glucosamina estava incorporada na [3H]HA, com a restante [3H] dpm identificada como uma macromolécula de aproximadamente 50kDa que podia ser digerida pela pronase (ver Quadro 4) . Todos os gráficos representados nas Figuras 8A-H tiveram quaisquer picos associados a material resistente à hialuronidase de Streptomyces retirados do perfil. A linha de células menos invasiva, MDA-MB 453 que apenas expressou HAS3 libertou HA monodisperso de lOOOOkDa, enquanto a amostra equivalente de células cultivadas sem inibição da hialuronidase endógena (cultura DxS) exibiu despolimerização de 22% do HA libertado a 60kDa até 6000kDa com 78% degradado a 30kDa (Fig. 8A) . As linhas de células mais invasivas, BT-549 e Hs578T as quais expressaram ambas principalmente HAS2 e uma expressão muito baixa de HAS3, libertaram ambas grandes quantidades de HA de 10 OOOkDa que na presença de hialuronidases ativa foi rapidamente degradado em fragmentos de HA de 10, 20 e 40kDa (Fig.8E & G) . A MDA MB-231 que expressava niveis moderados de HAS2 e niveis muito baixos de HAS3, produziu um HA polidisperso que tinha vários picos com o Mr modal de 600 a 10 OOOkDa e frações mais pequenas a 60 e 200kDa, enquanto após exposição a processos de degradação endógenos estas macromoléculas foram degradadas em 20, 40 e 500kDa (Fig. 8B) . A análise de HA associado às células demonstrou que quando os processos normais de degradação de HA foram inibidos por sulfato de dextrano podia ser detetado um HA de Mr muito alto, bem como oligómeros de Mr intermédio, que vai desde 20 a 200kDa. Quando as hialuronidase e outros processos degradativos potenciais foram inibidos pelo sulfato de 194 dextrano apenas fragmentos de HA pequenos que variam desde 10 a 70kDa foram encontrados associados à fração celular (Quadro 5). A expressão aumentada de Hial-1 e Hial-2 induz capacidade de invasão em linhas de células de cancro da mama humano

Utilizando a reação em cadeia da polimerase de transcrição inversa competitiva (TA-PCR) foram detetadas Hial-1, 2 e 3 em quantidades variáveis em todas as linhas de células, enquanto não foi detetada PH-20 utilizando estas condições de amplificação. Quando se compara a expressão de Hial-1 e expressão de Hial-2 nas linhas de células menos invasivas (<30% de uma população de células exibe migração) os ARNm para ambas enzimas tiveram uma expressão aproximadamente igual. À medida que as células se tornavam mais invasivas a expressão do ARNm de Hial-1 e Hial-2 aumentava, sendo a Hial-2 frequentemente expressada a niveis 5-7 vezes superiores ao ARNm de Hial-1. Nas linhas de células menos invasivas a transcrição de Hial-1 e 2 era inibida durante a senescência, enquanto nas linhas de células altamente invasivas o nivel de expressão de ARNm era mantido ou ligeiramente aumentado durante a paragem do crescimento. A renovação celular de hlaluronano diminui com invasão celular aumentada

Como se observa no Quadro 4, à medida que aumentava o potencial invasivo das células de cancro da mama a taxa de renovação do HA libertado diminuia, indicando que células altamente invasivas podem exigir um ambiente extracelular rico em HA ou que as vias degradativas das células atingiram uma capacidade de funcionamento máxima. Este estudo identificou unicamente a expressão de Hial-3 no 195 cancro da mama em que existe uma relação inversa entre capacidade de invasão da célula e expressão de Hial-3. A identificação de Hial-3 em células de cancro da mama foi inesperada já que este gene foi descrito em testiculo e medula óssea de mamiferos (Csoka et al, 2001), mas ainda tem de ser demonstrada atividade em ensaios de hialuronidase correntes (Stem, 2003).

Niveis altos do epítopo CD44 correlaciona com maior capacidade de invasão das células, expressão elevada de HAS2, Hial-1 e Hial-2 A quantificação do recetor de RHAMM não apresentou uma forte correlação com qualquer isoforma particular de HAS ou prevalência de expressão da hialuronidase ou capacidade de invasão das células, contudo parece existir uma relação inversa entre a expressão de CD44 e RHAMM (Figs. 9A & B). À exceção da linha de células moderadamente invasiva, MDA-MB 468, houve uma relação proporcional entre HAS2, Hial-1 Hial-2, CD44 e capacidade de invasão das células de cancro da mama (Quadros 3 & 4) . Quando se examina o potencial catabólico de uma célula de cancro da mama; quanto maior a expressão de CD44 e Hial-2, maior a capacidade das células para degradar grandes quantidades de HA (Quadro 4). 1%

Quadro 2 Gene Iniciador Mensageiro Iniciador Inverso Sonda de Hibridização HASl 5 'CCTGCAICAGCGGTCCTCTA 3' (SEQ ID NO:27) 5’ GCCGGTCA-TCCCCAAAAG3' (SEQ ID NO::34) 5 'AACCTCTTGCAGCAGTTTCTTGAGGCC 3’ (SEQ ID NO:41) HAS2 5' CAGTCCTGGCTTCGAGCAG 3' (SEQ ID NO:28) 5' TTGGGAGAAAAGTCTTTGGCT 3' (SEQ ID NO:35) 5 'CCATTGAACCAGAGACTTGARACAGCCC 3' (SEQ ID NO:42) HAS3 5' TTGCACIGTGGTCGTCAACTT 3' (SEQ ID NO:29) 5' GICGAGGTCAAACGITGTGAG 3' (SEQ ID NO:36) 5' ICAAATCAAAAACAGGCAGGTACAGGTAGTGG 3 (SEQ ID NO:43) GAPDH 5' AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3' (SEQ ID NO:30) 5' GAGTTAAAA-GCAGCCCTGGTG 3' (SEQ ID NO:37) 5' TTTGGTCGTATTGGGCGCCTGG3' (SEQ ID NO:44) Hial-1 51GCACAGGGAAGTCACAGATGTATGTGC 3' (SEQ ID NO:31) 51CCACTGGTCACGTTCAGGATGAAG-31 (SEQ ID NO:38) Hial-2 5' GATGTGTATCGCC-GGTTATCACGCC 3’ (SEQ ID NO:32) 5'CGTAGACTGGGAGTGCATGGTTGGC 3'; (SEQ ID NO:39) Bial-3 5' GCAC1GAIGGAGGAIACGC1GCG 3' 5' GC1GGTGACTGCAGGCCAICGC1GC 3’ (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:40) w

Quadro 3

Expressão de Hialuronano-sintase* Produção de Hialuronano (fg/célula/24h) Linha de Potencial Invasivo Expressão de CD44 HAS2 HAS3 Libertado Associado a Células de (1 de células (unidades de células Cancro da migratórias) densitometria/pg de Mama proteína) Fase Fase Fase Fase Fase Fase Fase Fase EXP. PLAT. EXP. PLAT. EXP. PLAT. EXP. PLAT. MDA-MB-453 1 0 0 0 1 0 594 139 0 64 MDA-MB-361 2 0 0 0 1 0 255 46 0 80 MDA-MB-468 23 1,9 0 0 3 0 616 0 0 38 ZRL-75-1 26 0 0 0 0,5 0 637 627 0 26 T47D 26 0,1 0 0 2 0 1523 0 0 71 MCF-7A 31 0,1 0 0 1 1 1623 313 0 64 MDA-MB-435 48 0,9 0 0 0,5 0,5 376 92 0 44 MDA-MB-231 80 1,1 14 16 1 1 6450 1137 250 351 BT-549 92 1,5 92 91 8 8 13087 5278 125 2793 Hs578T 100 3,6 208 205 0,2 0,2 12711 4567 52 102 * Expressão de HAS como determinada por TA-PCR de tempo real em que os números são expressados como a diferença em número de vezes da percentagem da linha de células menos invasiva MDA-MB 453 0 indica onde não foi detetado gene ou 198

Quadro i

Expressão do Gene da Hialuronidase* Renovação de Hialuronano (fg/célula/24h) Linha de Potencial Expressão CD44 flial-l Hial-2 Hial-3 Libertado Associado a Células de Invasivo (Ide (unidades de células Cancro da células densitometra /pg Mama migratórias) proteína) Fase Fase Fase Fase Fase Fase Fase EXP. Fase PLAT. Fase Fase EXP. PLAT. EXP. PLAT. EXP. PLAT. EXP. PLAT. MDA-MB-453 1 0 1 0 1 0 1 1 594(100¾) 139(100¾) 0 6 m mda-mb-361 2 0 1 0 1 0 5 2 255 (100¾) 46 (100¾) 0 44 (55¾) MDA-MB-468 23 M 5 0 5 0 10 10 616(100¾) 0 0 6 (16¾) ZRL-75-1 26 0 10 0 11 0 14 0 594 (93¾) 367 (59¾) 0 0,8 (3¾) T47D 26 0,1 16 0 17 0 5 30 1308(66¾) 0 0 17 (24¾) MCF-7A 31 0,1 5 0 5 0 25 5 1623(100¾) 313 (100¾) 0 35 (30¾) MDA-MB-435 48 0,3 14 16 103 105 75 76 376(100¾) 92(100¾) 0 19 (43¾) MDA-MB-231 80 U 30 30 155 158 35 0 2020(31¾) 880(77¾) 0 46 (13¾) BT-549 92 1,5 28 30 180 192 5 0 1476(11¾) 914 (17¾) 61(49¾) 1405 (50¾) Hs578T 100 3,6 29 35 201 205 0 0 2330(24¾) 1756(381) 34(65¾) 41(40¾) * Expressão de Hial como determinada por TA-PCR e digitalização das bandas onde está a diferença em vezes na expressão quando comparada com a linha de células menos invasiva MDA-MB 463 indica onde não é detetado gene ou hialuronano Números entre parêntesis representam a % de HA que é degradada/célula/24h 199

Quadro 5

Linha de Células de Cancro da Mama Potencial Invasivo (¾ de células migratórias) Expressão do Gene de HAS1 Expressão do Gene de Hialh Caracterização do HA libertado Caracterização do HA associado à célula HAS2 J0S3 Híãl- Hial- Hial- Mr 0. 0 Mr dos produtos 0. 0 Mr 0. 0 Mr dos produtos 0. 0 1 2 3 Modal de de degradação de Modal de de degradação de (kDa) HA de HA (kDa) HA (kDa) HA de HA (kDa) HA MDA-MB-453 1 0 1 1 1 1 10000 100 25 67 60 23 10 2? L L 70 11 100 24 20 78 800 3 10000 53 3000 7 6000 12 MDA-MB 231 80 14 1 30 155 35 60 36 20 37 200 39 20 23 200 36 40 41 500 38 40 33 600 a 28 500 99 660 23 70 44 10000 ET-549 92 92 8 28 180 5 10000 100 10 66 20 21 10 9 20 11 60 41 20 26 40 10000 38 40 46 60 8 Hs578T 100 208 0,2 29 201 0 10 000 100 10 9 10000 100 10 27 20 28 20 36 40 41 a Expressão de HAS como determinada por TA-PCR c e tempo real onde os números são expressados como a diferença em número de vezes da percentagem da linha de células menos invasiva MDA-MB 453 b Expressão de Hial como determinada por TA-PCR e digitalização das bandas onde está a diferença em vezes na expressão quando comparada com a linha de células menos invasiva MDA-MB 453 200 EXEMPLO 22 A supressão medicada por antimensageiro de hialuronano-sintase 2 inibe a génese tumoral e a progressão de mama

Cultura de células. A linha de células de adenocarcinoma da mama humano aneuploide MDA-MB 231 (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, EUA) foi selecionada com base na expressão de HAS2. As células foram propagadas em cultura em monocamada em meio de Leibovitz L-15 (Sigma, St Louis, MO, EUA) , suplementado com 10% de FCS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.

Construção do vetor de expressão antimensageiro. 0 ADNc da grelha de leitura aberta para a HAS2 humana foi gerado concebendo iniciadores específicos dos genes a partir da sequência de Watanabe e Yamaguchi publicada e consistiu nos seguintes iniciadores: mensageiro, 5'-GAGCTGAACAAGATGCATTGTGAGAGC-3' (SEQ ID NO:45) e antimensageiro, 5'-GACATGGTGCTTGATGTATGATCTTCCAT-3' (SEQ ID NO:46). O ARN total colhido de fibroblastos dérmicos humanos em divisão exponencial foi utilizado como a cadeia molde para TA-PCR, gerando um fragmento ADNc de HAS2 com l,7kb, o qual foi clonado diretamente no vetor pGEM-T (Promega, Madison, EUA). O ADNc para HAS2 foi subsequentemente subclonado no vetor de expressão pCl-neo (Promega) e os clones isolados contendo a inserção na orientação antimensageira (construção ASHAS2) foram identificados por mapeamento com endonuclease de restrição e sequenciação automática. 201

Transfeção e validação de células de cancro da mama humano MDA-MB 231 com ASHAS2 e construções simuladas.

A construção ASHAS2-pCl-Neo e controlo simulado (vetor pCl-neo sem inserção) foram transfetados em células de cancro da mama MDA-MB 231 humanas utilizando o reagente Lipofectamina mais (Gibco Life Technologies, Melbourne, Victoria, Austrália) de acordo com as instruções do fabricante. Durante pelo menos um mês, antes do inicio dos estudos, as células transfetadas foram selecionadas na presença de 500yg/mL de antibiótico G418 (Promega). As linhas de células estáveis foram estabelecidas colhendo e combinando colónias resistentes a antibiótico. A confirmação da incorporação estável da construção antimensageira para HAS2 no genoma foi realizada utilizando PCR em ADN genómico purificado. Em resumo, um iniciador especifico de gene para pCl-neo: 5'-GCACAGATGCGTAAGGAG-3' (SEQ ID NO:47) foi utilizado em associação com dois iniciadores específicos para HAS2 da seguinte sequência: GSP2 mensageiro 5'-GCTGTGTACATGACCTCGCGCTTGCCGCC-3' (SEQ ID NO:48) e GSP4 mensageiro, 5'-GGCGGGAAGTAAACTCGAC-3' (SEQ ID NO:49). Quando utilizado na seguinte associação; os produtos de pCl-neo/GSP2 e pCl-neo/GSP4 de tamanho esperado de 1443pb e 2223pb foram amplificados, respetivamente. Os produtos de PCR foram identificados por mapeamento com endonuclease de restrição e sequenciação automática.

Quantificação do ARNm para HAS1, 2 e 3. A PCR em tempo real utilizando iniciadores específicos dos genes e uma sonda oligonucleotídica interna foi utilizada para quantificar os níveis relativos de ARNm de HAS1, HAS2, e HAS3 em células parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 (Quadro 2). Em resumo, o ARN total foi purificado a 202 partir de células em crescimento exponencial utilizando o reagente TRI (Sigma). O ARN total foi utilizado para gerar ADNc de cadeia simples incubando 2yg de ARN com 0,5pg/pL de iniciadores aleatórios e trancriptase inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) . Para PCR em tempo real quantitativa foram utilizados iniciadores específicos dos genes para cada isoforma de HAS e uma sonda oligonucleotídica interna. Para sondas internas para HAS o corante repórter 6- carboxilfluoresceína (6-FAM) e o desativador 6- carboxitetrametil rodamina (TAMRA) foram marcados em 5' e 3', respetivamente. Paras as sondas internas para GAPDH o repórter 6-FAM foi substituído por VIC™ (Applyed Biosystems, Foster City, CA, EUA) . A reação de PCR foi realizada num volume final de 30yL e consistiu de mistura reacional Taqman lx, 6μΜ de iniciador direto e inverso para HAS, 1,5μΜ de sonda, ΙμΜ de cada iniciador para GAPDH e 500nM de sonda para GAPDH. A amplificação por PCR foi realizada por desnaturação durante 10 min a 95°C, seguida de emparelhamento durante 2 min a 50°C, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 min a 60°C. A execução dos ciclos térmicos e medição de fluorescência foram realizadas num sistema de deteção de sequência ABI Prism 7700 (Applyed Biosystems). A quantificação relativa foi realizada normalizando os valores limiares de ciclo (Ct) de cada amostra de gene com os valores de Ct do GAPDH. O ACt corresponde à diferença entre o Ct dos genes de HAS de

interesse e o Ct de GAPDH. Os dados são apresentados como a alteração em vezes da diferença relativa com as parentais (arbitrariamente fixados em 100) calculada de acordo com a fórmula que descreve a quantificação relativa por PCR 2~ (ACtHAS-ACtGAPDH)

Caracterização da expressão do gene da hialuronidase. 203

Para determinar a expressão do gene da hialuronidase para as HIAL1, 2 e 3, a TA-PCR foi realizada em ARN total extraido a partir de células nas fases de crescimento exponencial e paragem de crescimento. Os conjuntos de iniciadores específicos para os genes foram concebidos a partir de sequências recuperadas a partir do GenBank (ver Quadro 2). As sequências amplificadas foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etidio e a sua identidade confirmada por sequenciação de ADN automática. Para quantificar a abundância relativa de cada produto de PCR, os geles de agarose revelados com brometo de etidio contendo fragmentos amplificados foram submetidos a análise densitométrica utilizando o instrumento de imagem ProXpress™ (Perkin Elmer, Boston, MA, EUA) e os dados analisados utilizando o software Phoretix 1D (Phoretic International, Newcastle, UK).

Ensaio de proliferação celular. Células parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 em crescimento exponencial foram aplicados em placas de 24 poços (2,5cm2/poço) a densidades celulares, que variavam desde 5xl03 a 9xl04células/poço. O efeito de inibição da HAS2 na proliferação celular foi estudado durante 24, 48, 72, 96, 120 e 144h. Depois do período de crescimento definido, as células foram desprendidas utilizando 0,25% p/v de tripsina e o número de células determinado utilizando um contador de Coulter (Beckman, Coulter, Austrália). 204

Identificação imuno-histoquímica de hialuronano-sintase, hialuronidases e CD44 0 efeito comparativo da inibição de HAS2 na expressão da HA sintase, hialuronidase e recetores de HA foi realizado em células MDA-MB 231 parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2. Lamelas de câmara com oito poços foram aplicadas com uma densidade de 2xl04 células/poço e as células foram ligadas durante 24h. As células foram fixas em Histochoice (Sigma) durante 15 min, em seguida lavadas 3x5 min em PBS. As proteinas heterófilas foram bloqueadas por incubação com 10% de FCS durante 10 min, seguida de uma lavagem com PBS. Os antissoros ou anticorpos contra CD44H (DAKO, Copenhagen, Dinamarca) HIAL1, HIAL2, (amavelmente doadas por R. Stem, University of San Francisco, EUA), HAS2 (amavelmente doada por P. Heldin, Ludwig Institute for Câncer Research, Uppsala, Suécia) foram diluidos em PBS contendo 1% de soro humano/1% de FCS, onde os anticorpos de deteção foram aplicados durante 60 min a 25°C. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada por imersão em H2O2 a 0,3% em metanol durante 20 min. Após uma lavagem adicional com PBS, o antissoro secundário anti-coelho de suino ou anti-rato de ratazana conjugado com peroxidase (DAKO) foi aplicado durante 60 min à TA, seguido de lavagens 3x5 min em PBS. 0 epitopo foi visualizado com Sigma Fast DAB (3,3'-diaminobenzidina, Sigma) após aplicação durante 5-10 min à TA. As lamelas foram lavadas em água corrente para 10 min, submetidas a revelação de contraste com hematoxilina, desidratadas e montadas.

Análise do ciclo celular por citometria de fluxo.

As células transfetadas e de controlo foram aplicadas a 2xl05 células/25cm2 e cultivadas com timidina 2mM até 50% 205 confluentes. Depois de atingir 50% de confluência, as células foram cultivadas em meio de cultura isento de timidina. As células foram colhidas, por tripsinização as 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 e 36h seguida de fixação em etanol a 95% durante 2h a 4°C. As células foram pré-tratadas com RNAase (100yg/mL) (Sigma) e 50yg/mL de iodeto de propidio (Sigma) durante 30min a 37°C antes de determinar a fase do ciclo celular utilizando um instrumento analítico FACS-Calibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA).

Ensaio de migração celular.

Os ensaios de invasão foram realizados utilizando câmaras de Boyden modificadas com membranas de policarbonato Nucleopore (Corning, Corning, NY, EUA). Os filtros pré-revestidos (6,5 mm de diâmetro, 12 ym de tamanho de poro, Matrigel 100yg/cm2) foram re-hidratados com 100 yL de meio de Leibovitz L-15 suplementado com 0,1% p/v de BSA (Sigma). As células em crescimento exponencial foram colhidas com tripsina/EDTA (Sigma). Antes da adição à câmara superior do aparelho de Boyden, 3xl05 células/câmara de lmL foram lavadas duas vezes com meio de crescimento isento de soro contendo 0,1% p/v de BSA. Foi utilizado meio de crescimento normal contendo 10% v/v de FCS como o quimiotático. Após incubação durante 6h a 37°C, as células não invadidas na superfície superior do filtro foram limpas com uma zaragatoa de algodão e as células que migraram para a superfície inferior do filtro foram fixas e reveladas com o kit Diff-Quick. A capacidade de invasão foi determinada contando as células em cinco campos microscópicos por poço, e a extensão de invasão foi expressada como um número médio de células por campo microscópico. Cada experiência foi realizada em triplicado em dois dias separados, onde os 206 dados são representados como % de células migrantes em comparação com a linha de células parental.

Ensaio de exclusão de partículas e morfologia da célula. A matriz pericelular dependente de HA foi visualizada em torno das células de cancro da mama de culturas de controlo e transfetadas pela exclusão de eritrócitos humanos fixos como anteriormente descrito por Clarris e Fraser. As diferenças morfológicas bem como o ensaio de exclusão de partículas nas células MDA-MB 231 de controlo e transfetadas foram fotografadas num microscópio de contraste de fase invertida Nikon Optiflot (Nikon) 24 e 60h após aplicação.

Quantificação de HA libertado.

Culturas triplicadas de células de cancro da mama MDA-MB 231 humanas parentais, simuladas e transfetadas com ASHAS2 foram aplicadas a 2,5xl05 células/25cm2 e incubadas durante 24, 48, 72, 96, 120 e 144h. No final do periodo de incubação, as células foram colhidas por tripsinização e contadas utilizando um contador de Coulter. O meio foi utilizado para quantificar o HA libertado. O HA libertado foi quantificado utilizando um ensaio de proteina de ligação a HA ligado a enzima (HAPB) (Corgenix Inc, Westminster, CO, EUA). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, a partir de 100yL de amostras em duplicado e de padrões de HA (0, 50, 100, 200, 500 e 800ng/mL) foram retiradas aliquotas para uma placa de 96 poços revestidos com HAPB e incubadas à temperatura ambiente (TA) durante 60 min. As amostras foram lavadas quatro vezes com PBS. Foram adicionados 100 yL de HAPB conjugado com peroxidase de rábano silvestre e 207 incubadas à TA durante 30 min. Após lavagens adicionais com PBS, a reação foi visualizada com 100yL de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) após uma incubação de 30 min à TA. A reação foi parada com 100yL de ácido sulfúrico 0,36N e lida a 450nm (referência 650nm) num leitor de microplacas BioRad 350. Meio de crescimento que não tinha sido exposto a células foi utilizado para determinar os niveis de HA endógeno. Os niveis de HA endógeno foram subtraidos de todos os resultados de estimativa de HA.

Caracterização do peso molecular do hialuronano utilizando cromatografia de exclusão molecular.

As células foram aplicadas a 7,5xl05 células/balão de cultura de 75cm2 e foram cultivadas durante 24h em meio de crescimento contendo 250yCi de cloridrato de D-[6-3H]glucosamina (Perkin Elmer). No final do periodo de incubação de 24h, o meio foi retirado e submetido exaustivamente a diálise (exclusão de Mr de 6 kDa) contra Tris-HCl lOmM/cloreto de sódio 0,15M/0,02% de azida de sódio pH 7,4 a 4°C. O dialisado e liquido de diálise foram analisados cromatograficamente para a identificação de [3H] HA e seus produtos de degradação. O [3H]HA >5 kD foi submetido a cromatografia de exclusão molecular num gel de Sephacryl S-1000 eluido em NaCl 0,15M/fosfato pH 7,25 que continha NaH2PC>4 19mM, Na2HPC>4 38mM e NaCl 94mM a 13, 6mL/h. O liquido de diálise (moléculas <5 kDa) foi submetido a cromatografia de exclusão molecular num gel de Superose 12 eluido no tampão supramencionado a um caudal de eluição de 20mL/h. As estimativas de peso molecular foram calculadas utilizando dados de calibração para HA em Sephacryl S-1000 e Superose 12, em que os dados foram gerados variando o PM de HA desde 800 Da a 10 000 kDa (CPN, República Checa e Pharmacia). Para assegurar que o cloridrato de D-[6- 2 208 H]glucosamina foi utilizado como um único precursor para a produção de HA, a Dpm não dialisável (moléculas >5 kDa) foi submetida a digestão com 10 TRU de hialuronídase de Streptomyces (Calbiochem, Alemanha) a pH 6, 37 °C durante 24h. O material digerido foi submetido a cromatografia em Sephacryl S-1000 e Superose 12, onde os perfis foram comparados com amostras equivalente não digeridas.

Geração de tumores subcutâneos em gordura mamária.

Os estudos animais foram realizados com aprovação ética completa do comité de ética institucional relevante e de acordo com as diretrizes do Australian National Health and Medicai Research Councils para o tratamento e utilização de animais de laboratório. Ratos glabros CBA com cinco semanas de idade (Walter and Eliza Hall, Melbourne, Victoria, Austrália) foram divididos aleatoriamente em três grupos (n=ll/grupo) para a geração de tumores parentais, simulados e ASHAS2. As células foram colhidas na fase de crescimento logarítmico por raspagem, ressuspensas a uma densidade final de 2xl06cells em meio L-15 suplementado com 0,1% de glucose ± 5mg/mL de Matrigel seguidas de injeção imediata na gordura mamária. O crescimento do tumor foi registado duas vezes por semana medindo três diâmetros perpendiculares (dl, d2, d3) . O volume do tumor foi então calculado utilizando a fórmula: (1/6)π(dld2d3). No dia 84 após o inicio dos tumores, os ratos foram mortos humanamente. O figado, rins, cérebro e pulmões foram retirados na autópsia e conservados a -20°C até análise por PCR de Alu. Para avaliação patológica, metade do tumor primário foi fixo em formaldeido a 4% e embutido em parafina, secções de 5pm foram examinadas após revelação com hematoxilina e eosina. 209

Inoculação intracardiaca de células de cancro da mama.

Antes da inoculação intracardiaca do tumor, os ratos foram anestesiados com um mistura intraperitoneal de cetamina (50mg/kg) e xilazina (5mg/kg). As células MDA-MB 231 foram preparadas como anteriormente descrito e ressuspensas a lxl05células/0,lmL. A suspensão celular foi retirada para uma seringa de lmL munida com uma agulha de calibre 25 e 0,1 mL injetados no ventrículo esquerdo. Os ratos foram deitados numa almofada aquecida para recuperar antes de regressarem às gaiolas. Periodicamente foi realizada análise radiográfica para avaliar a osteólise do osso. Para isso, os ratos foram anestesiados (como anteriormente descrito) e sujeitos a raios X numa posição em decúbito abdominal contra uma película X-Omat (Eastsman Kodak Co., Rochester, NY, EUA) e expostos com raios X de 35kV durante 30 s utilizando um sistema de raios X Cabinet-Faxitron Series, Hewlett-Packard Co. (Modelo MX20 com uma fonte focal de 20pm; Faxitron X-ray Corp., Illinois, EUA). Foi observada a saúde do animal e a taxa de sobrevivência até à sua eutanásia devido a uma das seguintes razões médicas; perda de peso grave, hiperventilação, paralisia ou fratura óssea. Órgãos recolhidos: o fígado, rins, cérebro e pulmões foram retirados e conservados a -20°C até ser realizada análise por PCR de Alu. Para determinar o tempo de sobrevivência mediano foi representada graficamente uma curva de sobrevivência utilizando o programa Prism stats (Sobrevivência de Kaplan-Meier) com os dias decorridos após as inoculações intracardíacas. Foi calculado o valor de P para comparação das curvas de sobrevivência. 210

Quantificação de metástase por Alu PCR.

Foi utilizado PCR de Alu quantitativa para detetar a metástase de MDA-MB 231 a partir do tumor primário para órgãos secundários. Em resumo, o ADN foi extraído triturando as amostras sob azoto líquido e ressuspensão num tampão de lise de ADN (NaCl lOOmM, Tris-HCl 20mM , pH 8,0, EDTA 20mM, pH 8,0, 0,4% (v/v) de SDS). O ADN foi purificado utilizando a metodologia de fenol-clorofórmio, seguida de precipitação com etanol e reconstituição em tampão TE. O ADN purificado foi ajustado a uma concentração final de lOng/yL em tampão TE pH7,2, recolhidas alíquotas e conservadas a -20°C até análise. Para remover contaminação com ADN humano exógeno, a mistura reacional, antes da adição de iniciadores, foi tratada com 17U/mL de nuclease S7 (Roche Diagnostics, Alemanha) na presença de CaCl2 lmM a 37 °C durante 24h antes da PCR. A Nuclease S7 foi então inativada a 90°C durante 30 min, após a adição de EGTA 4mM. A PCR de Alu quantitativa foi então realizada em amostras de ADN purificado genómico (lOng) num Sistema de deteção de sequência GeneAmp 5700 (Applyed Biosystems). Cada amostra foi testada em duplicado num volume reacional final de 25pL consistindo de 0,625U de Taq ADN polimerase (Roche; Mannheim, Alemanha), Tris-HCl lOmM pH 8,3, MgCl2 l,5mM, KC1 50mM, dNTPs 200μΜ, 8% de DMSO, lyg/mL de 6-carboxi-X- rodamina (Molecular Probes; Eugene, Oregon EUA), diluição a 1 para 40000 de SYBR Green I (Molecular Probes) e lOOnM de cada iniciador para Alu (Alu mensageiro 5'- GTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAA-3' (SEQ ID NO:50); Alu antimensageiro 5'-GCGATCTCGGCTCACTGCAA-3' (SEQ ID NO:51). Após incubação de desnaturação inicial a 95°C durante 2min, a amplificação ocorreu ao longo de 40 ciclos, os quais consistiram em desnaturação a 95°C durante 5 segundos, emparelhamento a 65°C durante 60 segundos, e prolongamento a 75°C durante 15 segundos, durante o que foi 211 medida a intensidade de fluorescência. Foi então gerada uma curva de dissociação desde 60°C a 95°C. Em cada placa reacional de 96 poços foi preparada um curva de calibração diluindo sucessivamente ADN humano em ADN de rato que permitiu a quantificação da carga tecidular de células de tumor humano nos órgãos do rato retirados na autópsia.

Confirmação da transfeção estável de antimensageiro para HAS2 em células MDA-MB 231 A incorporação da construção antimensageira HAS2-pCl-neo no genoma de MDA-MB 231 foi confirmada através de análise por PCR de ADN genómico altamente purificado extraído a partir de células transfetadas. Quando utilizada na seguinte combinação; os produtos de pCl-neo/GSP2 e pCl-neo/GSP4 de tamanho esperado de 1443pb e 2223pb foram amplificados de forma reprodutível a partir de clones estáveis que têm a construção antimensageira para HAS2. 0 ADN genómico isolado a partir de células parentais e transfetadas de forma simulada deu um teste negativo. A transfeção de células de cancro da mama MDA-MB 231 com antimensageiro para HAS2 reduz o ARNm de HAS e inibe completamente a expressão da proteina HAS2

Os níveis endógenos de ARNm para HAS2 em células parentais foram quantificados utilizando TA-PCR de tempo real e comparados com os valores obtidos a partir de transfetantes simulados e antimensageiros para HAS2. Simultaneamente com estas experiências, os níveis de ARNm de HAS1 e HAS3 foram também quantificados utilizando PCR em tempo real com expressão de HIAL1, 2 e 3 caracterizada por metodologia TA-PCR corrente. Para permitir a comparação da expressão de HAS em real tempo entre células transfetadas e parentais o 212 nível de cada ARNm quantificado foi normalizado com respeito aos seus controlos de GAPDH internos. Quando se compararam os níveis endógenos da expressão de ARNm de HAS2 em células parentais e transfetantes, não foram observadas diferenças entre as linhas de células parentais e transfetadas de forma simulada. Em contraste, a expressão de ARNm em células transfetadas ASHAS2 estáveis diminuiu em 50% quando comparada com parentais e transfetantes simulados respetivamente (p=0, 008) (Fig. 10A) . Foi também detetada expressão moderada de HAS3 e foi comparável em células parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro, enquanto a HAS1 não pôde ser detetada em quaisquer dos grupos de tratamento (dados não apresentados). A deteção imuno-histoquímica de HAS2 com anticorpo monoclonal específico para a isoforma demonstrou que a transfeção estável com ASHAS2 resultou no bloqueio eficaz da tradução da proteína HAS2 (Fig. 10B) . Enquanto tanto as células parentais como as transfetadas de forma simulada exibiram um grau alto de expressão de HAS2 como indicado por revelação de epítopo positiva (Fig. 10C). A inibição de HAS2 altera a expressão de hialuronidase A inibição antimensageira de HAS2 alterou significativamente a expressão de HIAL1, 2 e 3 (Fig. 11). A HIAL3 não pôde ser detetada em células parentais ou transfetantes simulados, mas a inibição de HAS2 resultou na expressão de HIAL3 (Fig. 11) . No entanto, a inibição da expressão de HAS2 resultou na regulação negativa da expressão do gene para o ARNm de HIAL2 ao ponto em que este não era detetável mesmo após 35 ciclos de PCR. Esta observação é reforçada pela ausência de imunorreatividade de transfetantes estáveis de MDA-MB 231 com ASHAS2 com o anticorpo contra HIAL2 onde a revelação localizou-se na 213 membrana do plasma e surgiu também como vesículas citoplasmáticas. A expressão de HIAL1 em transfetantes antimensageiros foi moderadamente regulado de forma positiva quando comparada com os controlos parental e simulado. Estas observações foram coerentes em ARN total extraído de culturas subconfluentes ou confluentes. O CD44 foi regulado negativamente pela inibição de HAS2 A expressão do recetor de HA, CD44 foi regulado negativamente nas células ASHAS2 (Fig. 12A) quando comparada com transfetantes parentais e simulados (Fig. 12B) . A revelação para o CD44 em ambos os controlos foi muito evidente na membrana do plasma com áreas de revelação focal intensa na membrana. A inibição antimensageira de HAS2 altera o metabolismo de hialuronano

Devido à expressão alterada de HAS e HIAL em transfetantes de MDA-MB 231 ASHAS2 foi quantificada a quantidade de HA libertado. Os transfetantes de MDA-MB 231 ASHAS2 libertaram quantidades significativamente maiores de HA quando comparados com a linha de células parental ou transfetantes simulados (Fig. 13). Ao longo da duração da experiência, as culturas de ASHAS2 sintetizaram uma média de 6,94pg de HA/célula/dia com uma exceção assinalável às 24h após aplicação, onde a síntese aumentou até aproximadamente 15,4pg/célula/dia, em contraste com os transfetantes parentais e simulados que sintetizaram aproximadamente 2 e 1,6pgHA/célula/dia, respetivamente. 214 A inibição antimensageira de HAS2 não afetou o hialuronano associado a células A exclusão de eritrócitos fixos foi utilizada para visualizar indiretamente a matriz pericelular de HA. Quando comparados com parentais e transfetantes simulados, a inibição de HAS2 não resultou em qualquer diferença flagrante na espessura da matriz pericelular de HA e o HA associado a células subsequente.

A modulação da expressão de HAS2 altera o peso molecular do hialuronano produziu por células de cancro da mama MDA-MB 231 0 meio retirado dos transfetantes de MDA-MB 231 ASHAS2 era altamente viscoso quando comparado com as linhas de células de controlo. A digestão do meio com hialuronídase de Streptomyces demonstrou que >98% da [3H] glucosamina tinha sido incorporada em [3H] HA, com os restantes 2% de [3H] dpm associados a macromoléculas de ~50 kDa que podem ser digeridas por Pronase. Todos os números representam dados onde esta reatividade foi removido. 0 PM do HA sintetizado por células parentais, simuladas e transfetadas com antimensageiro foi determinado por cromatografia de exclusão molecular sobre Sephacryl S-1000. A linha de células parental sintetizou três PM distintos de HA que foram estimados ser de 100, 400 e 3000 kDa refletindo potencialmente os produtos sintéticos das isoformas de HAS expressadas de forma prevalente, HAS2 e 3 respetivamente (Fig. 14) . Em contraste, os transfetantes antimensageiros para HAS2 sintetizaram HA correspondente a um PM de >10 000 kDa onde foi também detetada uma fração mais pequena (5,2%) correspondente a um peso molecular de 100 kDa. 215 A inibição de HAS2 diminui a proliferação das células de cancro da mama e para o ciclo celular em Go/Gi A comparação do efeito da inibição antimensageira de HAS2 na proliferação celular e na progressão do ciclo celular durante periodos de crescimento ativo de células demonstrou que nas células parentais e transfetadas de forma simulada ocorria uma duplicação do número de células a cada 24h, onde foi atingida uma fase de crescimento em plataforma às 72h (Fig. 15A). Nos transfetantes ASHAS2 estáveis a ausência de uma HAS2 funcional alterou a proliferação celular exibindo um periodo de atraso de aproximadamente 24h, atingindo a paragem de crescimento às 96 a 120h (Fig. 15A) . Simultaneamente com estas observações foi também realizada uma análise citométrica de fluxo em células parentais, simuladas e transfetantes ASHAS2 para determinar o teor relativo de ADN em pontos no tempo definidos após aplicação a densidades subconfluentes. A percentagem de células transfetadas ASHAS2 nas fases do ciclo celular Go/Gi, S e G2/M 20h após aplicação foram 79%, 4% e 5% como se observa nas Figs. 15B, C e D, respetivamente. Em contraste, as figuras correspondentes da linha de células parental para as fases do ciclo celular, Go/Gi, S e G2/M foram aproximadamente 10%, 84% e 13%, respetivamente (Fig. 15B, C e D). Os transfetantes simulados foram comparáveis à linha de células parental. Em contraste, a inibição antimensageira de HAS2 originou um atraso transitório (aproximadamente 24h) da entrada na fase S (Fig. 15C) . Estes resultados são coerentes com a observação do periodo de atraso de 24h na taxa de crescimento observada no ensaio de proliferação. 216 A supressão de HAS2 reduz a migração do cancro da mama humano A migração das células de cancro da mama foi melhorada pela inibição de HAS2 como indicado pelo incapacidade dos transfetantes ASHAS2 para migrar através de uma membrana de Matrigel (Fig. 16) . A comparação das taxas de migração celular demonstrou que as células parentais e transfetantes simulados exibiam fenótipos invasivos típicos com 100% das populações de células a permear o Matrigel, em contraste, apenas 7% dos transfetantes HAS2 estáveis mantinham a capacidade para invadir a membrana de Matrigel. A inibição de HAS2 inibe completamente o inicio e progressão do cancro da mama primário in vivo

Os ratos inoculados por via intradérmica com MDA-MB 231 parentais ou transfetadas de forma simulada estabeleceram prontamente tumores primários que eram comparáveis em crescimento ao longo da duração da experiência de 12 semanas (Fig. 17A) . No entanto, em contraste, os ratos inoculados com transfetantes ASHAS2 não estabeleceram tumores primários (Fig. 17A). Para assegurar que a ausência de crescimento de tumor não resultou de uma má viabilidade celular do inoculo de células, num conjunto de experiências foi também incluído Matrigel no meio de inoculação. Mais uma vez, não pôde ser detetado qualquer tumor primário ao longo da duração da experiência de 12 semanas. Quando se quantificou a disseminação do cancro primário, o ensaio de PCR de Alu altamente sensível demonstrou que a metástase em animais inoculados com parentais e transfetadas de forma simulada foi muito prevalecente no cérebro e pulmão, mas foi também detetada nos rins e fígado transfetantes. Os 217 ratos injetados com MDA-MB 231 ASHAS2 não apresentaram metástase em quaisquer órgãos (Fig. 17B). A modulação de HAS2 inibiu a formação de tumores secundária e aumentou a sobrevivência animal

Quando se comparou a metástase do cancro da mama após inoculação intracardiaca, os animais inoculados com parentais e transfetadas de forma simulada demonstraram disseminação prevalecente do cancro para o cérebro, figado, rins, pulmão e osso, enquanto os ratos injetados com MDA-MB 231 ASHAS2 não exibiram metástases para quaisquer órgãos (Fig. 18A). Foram observadas lesões ósseas em vários ratos dos grupos de controlo, enquanto os ratos inoculados com ASHAS2 não apresentaram quaisquer lesões ósseas. Os ratos inoculados com células MDA-MB 231 parentais ou transfetadas de forma simulada demonstraram um periodo de sobrevivência significativamente mais curto, 72 dias e 77 dias quando comparados com os animais ASHAS2 que tinham um tempo de sobrevivência médio de 124 dias (p=0, 0001) (Fig. 18B) . EXEMPLO 23

Produção de antissoro contra HAS

Com base na sequência de aminoácidos prevista para a hHASl foram concebidos três péptidos antigénicos curtos e sintetizados por sintese de aminoácidos em fase sólida e purificados por cromatografia de alta pressão de fase inversa. Determinou-se que os péptidos eram 99,9% puros como demonstrado por espetrometria de massa. A produção, purificação, conjugação com toxoide de difteria (DT) e avaliação da pureza dos péptidos foram realizadas por 218

Chiron Mimitopes (Melbourne, Austrália). A sequência de cada péptido de imunização é mostrada no Quadro 7.

Quadro 7

Características do péptidos de imunização utilizados para gerar anticorpos policlonais contra a HA sintase. Péptido de imunização Sequência de aminoácidos Reatividade cruzada hipotética da espécie rato humano HAS418 AARGPLDAATCRALLYPRARV (SEQ ID NO:24) 49-58 'Cys' 94-103 -ve +ve HAS419 GGLVRSVAHEA (SEQ ID NO: 25) 480-490 -ve +ve HAS421 GAYREVEAEDPGRLAVE (SEQ ID NO:26) 146-162 +ve +ve

Os péptidos de imunização para HAS 418 e 419 foram selecionados em áreas de heterogeneidade entre espécies indicando que eles seriam específicos para humanos, enquanto o HAS421 foi homólogo para ratos e humanos.

Ovelhas cruzadas Border Leicester Merino foram injetadas por via intramuscular em dois sítios com os péptidos (0,2-0,5mg) dissolvidos em adjuvante completo de Freund e novamente duas semanas depois em adjuvante de Freud incompleto. No dia 35, as ovelhas foram sangradas e o soro separado por centrifugação, e conservado a -20°C. Todo o soro recolhido foi testado com um ensaio de imunoabsorção enzimática quando à presença de anticorpos específicos para o péptido e proteína transportadora. O péptido de imunização foi acoplado a gel de tiopropil-Sepharose 6B (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) por ativação com brometo de cianogénio e os anticorpos específicos foram extraídos a partir do antissoro policlonal de ovelhas contra HAS por cromatografia de afinidade. Em resumo, 5mL de soro foi misturado com 3mL de PBS e misturado com resina 219 de afinidade/ligação durante 1 hora à temperatura ambiente, seguida de três lavagens com 5mL de PBS. Os anticorpos foram eluidos em glicina 0,1M, pH2,8 e foram imediatamente neutralizados a pH7,2 pela adição de NaOH 0,1M.

Os anticorpos policlonais contra HAS foram em seguida concentrados num concentrador de células Amicon munido com um filtro YM30 Diaflo. A concentração de proteina de cada anticorpo purificado por afinidade foi determinada pelo ensaio de BCA (Pierce, EUA). A esterilidade dos anticorpos utilizados na imuno-histoquímica ou imunotransferência foi assegurada pela adição de 0,l%p/v de azida de sódio, antes da conservação a -20°C em aliquotas. Os anticorpos destinados a serem adicionados a culturas de células foram conservados a 20°C sem azida.

Os especialistas na técnica aperceber-se-ão que a invenção aqui descrita é suscetível a variações e modificações além daquelas especificamente descritas. É para ser entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações na medida em que estejam abrangidas pelas reivindicações. A invenção também inclui todos os passos, características, composições e compostos referidos ou indicados nesta especificação individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as associações de quaisquer dois ou mais passos ou características na medida em que sejam abrangidos pelas reivindicações.

BIBLIOGRAFIA

Altschul et al., J. Mol. Biol. : 215,430-410, 1990

Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988) 220

Banerji et al., J. Cell Biol.: 144, 789-801, 1999 Bird, Science 242: 423, 1988

Bourguignon et al., Biol. Chem.: 272, 27913-27918, 1997 Brazma e Vilo, FEBS Lett.: 480, 17-24, 2000 Camenisch et al., J. Clin. Invest.: 106, 349-360, 2000 Caulli et al., J. Cell Biochem. Suppl.: 31, 286-296, 1998 Celis et al., FEBS Lett.: 480, 2-16, 2000 Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991

Clarris et al., On the pericellular zone of some mammalian cells in vitro. Exp Cell Res 49:181-193, 1968

Csoka et al., The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol 20: 499-508, 2001

Culty et al., J. Cell Physiol.: 160, 275-286, 1994

Elbashir et al., Nature: 411, 494-498, 2001

Elbashire et al., Genes Dev.: 15, 188-120, 2001

Entwistle et al., J Cell. Biochem.: 61, 569-577, 1996

Erickson et al., Science 249: 527-533, 1990

Fire et al., Nature: 391, 806-811, 1998 221

Fries et al., Virchows. Archiv.: 424: 7-12, 1994

Fuchs et al., Anal. Biochem.: 286, 91-98, 2000

Going and Gusterson, Eur. J. Câncer.: 35, 1895-1904, 1999 Gunthert et al., Cell.: 65, pp. 13-24, 1991

Guo e Kempheus, Cell: 81,611-620, 1995

Hodgson (Bio/Technology 9: 19-21, 1991)

Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879, 1988

Itano et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. : 222, 816-821, 1996

Itano et al., Three isoforms of mainmalian hyaluronan synthases have distinct enzymatic properties. J Biol Chem 274: 25085-25092, 1999

Itano et al., Câncer Res.: 59, 2499-2504, 1999

Itano et al., Proc. Natl. Acad. Sei.: 99, 3609-3614, 2002 Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in Biotechnology and Pharmacy

Jones et al., Nature 321:522-525, 1986

Jungblut et al., Electrophoresis: 20, 2100-2110, 1999

Jurecic e Belmont, Curr. Opin. Microbiol.: 3, 316-321, 2000

Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91 -3242, 1991 222

Kennet et al. (eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A

New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.),

Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Knudson e Knudson, FASEB. 7: pp. 1233-1241, 1993

Knudson e Knudson, The hyaluronan recetor, CD44, 1999

Knudson et al., The role and regulation of tumor-associated hyaluronan. In: The Biology of Hyaluronan. (Editors: Evered, D. & Whelan, J) Ciba foundation symposium 143. J Wiley and Sons, Chichester: pp. 150-169, 1989

Kohler et al., Nature 256:495 (1975)

Kojima et al., Câncer Res.: 35, 542-547,1975

Kortt et al., Protein Engineering 10: 423, 1997

Kosaki et al., Câncer Res.: 59, 1141-1145, 1999

Larrick et al., BiolTechnology 7: 934, 1989

Larson et al., Cytometry: 41, 203-208, 2000

Larsson et al., J Biotechnol.: 80, 143-157, 2000 - Laurent and Fraser, Hyal. FASEB J.: 6, 2397-2404, 1992

Laurent e Killander, J. Chromatogr.: 14, pp. 317-330, 1964

Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 3439, 1987 223

Liu et al., Câncer Res. 61, 5207-5214, 2001

Madden et al., Drug Disc. Today: 5, 415-423, 2000 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991

Mathew e Dorfman, Physiol. Rev.: 35, 381-402, 1955

McKee, et al., J. Biol. Chem.: 272; 8013-8018, 1997

Montgomery et al. , Proc. Natl. Acad. Sei, USA: 95, 15502-15507, 1998

Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855, 1984

Munder et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 52(3): 311-320, 1999

Ng e Schwartz, J. Biol. Chem.: 264, 11776-11783, 1989

Oksala et al., J. Histochem. Cytochem.: 43, 125-135, 1995

Pauli e Knudson, Human Path.: 19, 628-639, 1988

Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993

Philipson and Schwartz, J. Biol. Chem.: 259, pp. 5017-5023, 1984

Philipson et al., Biochem.: 24, 7899-7906, 1985

Prashar e Weissman, Meth-Enzymol.: 303, 258-272, 1999

Prehm, P and Mausolf, Biochem. J.: 235, 887-889, 1986 Prehm, P, Biochem. J.: 220, pp. 597-600, 1984 224

Prehm P, Release of hyaluronate from eukaryotic cells. Biochem J 267: 185-189, 1990

Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992

Reichmann et al., Nature 332:323-329, 1988

Rilla et al., J. cell Sei.: 115, 3633-3643, 2002

Shyjan et al., J. Biol. Chem.: 271, pp. 23395-23399, 1996

Simpson et al., American J. Path.: 161, pp. 849-857, 2002

Spicer e McDonald, J. Biol. Chem.: 273, 1923-1932, 1998

Spicer e Nguyen, Biochem. Soc. Trans.: 27, 109-115, 1999

Spicer et al., Genomics.: 41, 493-497, 1997

Spicer et al., J. Biol. Chem.: 272, 8957-8961, 1997

Stem R, Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? Glycobiology 13:105R-115R, 2003

Sutcliffe et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA.: 97, 1976- 1981, 2000

Sy et al., J. Exp. Med.: 174, pp. 859-866, 1991 Tabara et al., Sei.: 282, 430-431, 1998 Tester et al., Clin. & Exp. Metast.: 0, 1-7, 2002 Thompson et al., J. Cell Physiol.: 150, 534-544, 1992

Tijsterman et al., Science: 295, 694-697, 2002 225

Timmons e Fire, Nature: 395, 854, 1998 Tiinmons et al., Gene: 263, 103-112, 2001

Tool, B., Glycosaminoglcans in morphogenesis. In: Cell Biology of the extracellular matrix. (Editor. Hay, E.D.) Plenum Press, New York.: pp. 259-294, 1981

Toole, B.P., Current Opin. in Cell Biol.: 2, 839-844, 1990

Toole, B.P., J. Inter. Med.: 242, 35-40, 1997

Turley e Torrance, Exp. Cell. Res.: 161, 17-28, 1985

Tuschl et al., Genes Dev. : 13, 3191-3197, 1999

Patente U.S. n° 4,816,567

Patente U.S. n° 4,946,778

Udabage et al., Inhibition of hyaluronan degradation by dextran sulphate facilitates characterisation of hyaluronan synthesis: an in vitro and in vivo study Glycoconjugate J (in Press), 2004

Victor et al., J Câncer: 82, 77-83, 1999 Ward et al., Nature 334: 544, 1989

Watanabe e Yamaguchi, J. Biol. Chem.: 271, 22945-22948, 1996

Weissmann e Meyer, J. Am. Chem. Soc.: 76, pp. 1753, 1954

Wells, Methods Enzymol. 202: 2699-2705, 1991 226

Winter e Harris, TIPS 14: 139, 1993

Young et al., Nat. Biotechnol. 16(10): 946-950, 1998 Xing et al., Oral Diseases: 4, 241-247, 1998

Zhang and Madden, Genome Res.: 7,649-656, 1997 Zhang et al., Câncer Res.: 55, 428-433, 1995

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Meditech Research Limited Brownlee (Apenas EUA), Gary Russell Brown (Apenas US), Tracey Jean

<120> A MODULAÇÃO DA SÍNTESE E DEGRADAÇÃO DE HIALURONANO NO TRATAMENTO DE DOENÇA <130> 12 5 0 990 0/EJH/HPM <150> AU 2003905551 <151> 2003-10-10 <150> AU 2003906658 <151> 2003-12-01 <160> 51 <17 0> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> humano <4 0 0> 1 227 gagctgaaca agatgcattg tgagagc 27 <210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> humano <400> 2 gacatggtgc ttgatgtatg atcttccat 29 <2 Λ o \—1 3 <2 11> 18 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 3 gcacagatgc gtaaggag 18 <2 Λ o \—1 4 <2 11> 29 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 4 gctgtgtaca tgacctcgcg cttgccgcc 29 <2 Λ o \—1 5 <2 11> 19 <2 12> ADN <2 13> humano <4 A o o 5 ggcgggaagt aaactcgac 19 <210> 6 <211> 20 228 <212> ADN <213> humano <400> 6 cctgcatcag cggtcctcta 20 <2 Λ o \—1 7 <2 11> 18 <2 12> ADN <2 13> humano <4 O o V 7 gccggtcatc cccaaaag 18 <2 Λ o \—1 8 <2 11> 27 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 8 aacctcttgc agcagtttct tgaggcc 27 <210> 9 <211> 19 <212> ADN <213> humano <400> 9 cagtcctggc ttcgagcag 19

<210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> humano 229 <4 0 0> 10 ttgggagaaa agtctttggc t 21 <210> 11 <211> 28 <212> ADN <213> humano <4 0 0> 11 ccattgaacc agagacttga aacagccc <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> humano <4 0 0> 12 ttgca< otgtg gtcgtcaact t 21 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> humano <4 0 0> 13 gtcgaggtca-aacgttgtga g 21 <210> 14 <211> 32 <212> ADN <213> humano <4 0 0> 14 32 tcaaatcaaa aacaggcagg tacaggtagt gg 230 <2 Λ o \—1 15 <2 11> 21 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 15 aaggtgaagg tcggagtcaa c 21 <2 A o \—1 16 <2 11> 21 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 16 gagttaaaag cagccctggt g 21 <2 Λ o \—1 17 <2 11> 22 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 17 tttggtcgta ttgggcgcct gg 22 <2 Λ o \—1 18 <2 11> 27 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 18 gcacagggaa gtcacagatg tatgtgc 27

<210> 19 <211> 24 <212> ADN 231 <213> humano <4 0 0> 19 ccactggtca cgttcaggat gaag 24 <2 Λ o \—1 20 <2 11> 25 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 20 gatgtgtatc gccggttatc acgcc 25 <2 Λ o \—1 21 <2 11> 25 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 21 cgtagactgg gagtgcatgg ttggc 25 <2 Λ o \—1 22 <2 11> 23 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 22 gcactgatgg aggatacgct gcg 23 <2 Λ o \—1 23 <2 11> 25 <2 12> ADN <2 13> humano <4 Λ o o 23 25 gctggtgact gcaggccatc gctgc 232 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> humana <4Ο0> 24

Ala Ala Arg.Gly Pro Leu Asp Ala Ala Thr Cys Arg Ala Leu Leu Tyr 1 5 10 15

Pro Arg Ala Arg Vai 20 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> humana <400> 25

Gly Gly Leu Vai Arg Ser Vai Ala His Glu Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> humana <400> 26

Gly Ala Tyr Arg Glu Vai Glu Ala Glu Asp Pro Gly Arg Leu Ala Vai 15 10 15

Glu <210> 27 <211> 20 233 <212> PRT <213> humana <4Ο0> 27

Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys 15 10 15

Thr Cys Thr Ala 20 <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> humana <400> 28

Cys Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly 15 10 15

Cys Ala Gly <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> humana <400> 29

Thr Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys 15 10 15

Ala Ala Cys Thr Thr 20 234 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> humana <400> 30

Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Gly Ala Gly 15 10 15

Thr Cys Ala Ala Cys 20 <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> humana <400> 31

Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala 15 10 15

Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Gly Thr Gly Cys 20 25 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> humana <400> 32 235

Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala 1 5 10 15

Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Gly Thr Gly Cys 20 25 <210> 33 <211> 27 <212> PRT <213> humana <400> 33

Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala 15 10 15

Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Gly Thr Gly Cys 20 25 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> humana <400> 34

Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala 15 10 15

Ala Gly

<210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> humana 236 <4Ο0> 35

Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr 15 10 15

Thr Gly Gly Cys Thr 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> humana <400> 36

Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr 1 5 10 15

Gly Thr Gly Ala Gly 20 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> humana <400> 37

Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys 15 10 15

Thr Gly Gly Thr Gly 20 <210> 38 <211> 24 237 <212> PRT <213> humana <400> 38

Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Gly Thr Thr Cys Ala 15 10 15

Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly 20 <210> 39 <211> 25 <212> PRT <213> humana <400> 39

Cys Gly Thr Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys 1 5 10 15

Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Cys 20 25 <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> humana <400> 40

Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys 15 10 15

Cys Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys 20 25 238 <210> 41 <211> 27 <212> PRT <213> humana <4Ο0> 41

Ala Ala Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr 15 10 15

Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Gly Cys Cys 20 25 <210> 42 <211> 28 <212> PRT <213> humana <400> 42

Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys 15 10 15

Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys 20 25 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> humana <400> 43 239

Thr Cys Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly 15 10 15

Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly 20 25 30 <210> 44 <211> 22 <212> PRT <213> humana <400> 44

Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Ala Thr Thr Gly Gly Gly Cys 1 5 10 15

Gly Cys Cys Thr Gly Gly 20 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> humana <400> 45

Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys 15 10 15

Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys 20 25

<210> 46 <211> 29 <212> PRT 240 <213> humana <400> 4 6

Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Thr GXy Ala Thr Gly 15 io 15

Thr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Thr 20 25 <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> humana <400> 47

Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly Cys Gly Thr Ala Ala Gly Gly 15 10 15

Ala Gly <210> 48 <211> 29 <212> PRT <213> humana <400> 48

Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr 15 10 15

Cys Gly Cys Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys 25 20 <210> 49 <211> 19 241 <212> PRT <213> humana <4 Ο Ο > 49

Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Cys 15 10 15

Gly Ala Cys <210> 50 <211> 30 <212> PRT <213> humana <400> 50

Gly Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr 15 10 15

Ala Cys Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala 20 25 30 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> humana <400> 51 242

Gly Cys Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr 15 10 15

Gly Cys Ala Ala 20

Lisboa, 24 de Setembro de 2013

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto isolado que reduz o nível de atividade da hialuronano-sintase (HAS)l em que o referido composto é um anticorpo específico para uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 25 ou 26.

2. Composto isolado da reivindicação 1 em que o anticorpo é selecionado de um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal e um fragmento de ligação a antigénio do mesmo, um anticorpo humanizado e um anticorpo desimunizado.

3. Composto isolado da reivindicação 1 ou 2 para ser utilizado em terapia.

4. Composição farmacêutica compreendendo um composto da reivindicação 1 ou 2 e um ou mais transportadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

5. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 no fabrico de um medicamento para administração a um indivíduo numa quantidade eficaz para reduzir o nível e/ou atividade de HAS.

6. Utilização de reivindicação 5 em que o indivíduo é um humano.

7. Utilização de reivindicação 5 ou 6 para o tratamento de cancro.

8. Composto para ser utilizado na redução do nível e/ou atividade de HAS num indivíduo, em que o referido composto é como definido na reivindicação 1 ou 2. 2

9. Composto da reivindicação 8, em que o indivíduo é um humano.

10. Composto da reivindicação 8 ou 9 para ser utilizado no tratamento de cancro. Lisboa, 24 de Setembro de 2013