JP2006014694A - ペプチド、その抗体及びその抗体の製法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記ペプチドは、ヒトヒアルロニダーゼ−2のアミノ酸配列における第38番〜第48番のアミノ酸からなる配列からなる。前記製造方法では、前記ペプチドを動物に免疫することによって抗体を得る。前記抗体は、ヒトヒアルロニダーゼ−2と反応し、ヒトヒアルロニダーゼ−2以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイムと反応しない。
【選択図】なし
Description
例えば、非特許文献6では、マウス実験癌のアストロサイトマにHYAL−2を過剰発現させると脳内での癌の増殖が劇的に促進されることを報告している。すなわち、脳の細胞外マトリックスの主たる成分はヒアルロン酸であり、HYAL−2を多く発現している癌は脳での増殖が早い可能性や脳に転移しやすい可能性を示すもので、例えば、原発摘出癌組織のHYAL−2量を調べることにより、脳への転移性や悪性度を把握することができる可能性が考えられる。
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端及び/若しくはC末端に1若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドにより解決することができる。
また、本発明は、ヒトヒアルロニダーゼ−2と反応し、ヒトヒアルロニダーゼ−2以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイムと反応しないことを特徴とする、抗体又はその断片に関する。
本発明の抗体又はその断片の好ましい態様によれば、ヒトヒアルロニダーゼアイソザイムである、ヒトヒアルロニダーゼ−1、ヒトヒアルロニダーゼ−3、ヒトヒアルロニダーゼ−4、及びヒトヒアルロニダーゼPH−20のいずれとも反応しない。
更に、本発明は、前記ペプチドを動物に免疫することを特徴とする、抗体又はその断片の製造方法に関する。
本発明のペプチドには、
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、並びに
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に1又は数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド(以下、改変ペプチドと称する)
が含まれる。
配列番号2で表されるアミノ酸配列(ヒトHYAL−2のアミノ酸配列における第437番〜第447番のアミノ酸からなる配列;Q-C-Q-W-D-H-R-Q-A-A-G)、配列番号3で表されるアミノ酸配列(ヒトHYAL−2のアミノ酸配列における第161番〜第170番のアミノ酸からなる配列;S-R-H-P-D-W-P-P-D-R)が存在する。
また、付加するアミノ酸の数(N末端及びC末端の両方に付加する場合は、それらの合計数)は、5個以下であることが好ましく、3個以下であることがより好ましく、2個以下であることが更に好ましく、1個であることが特に好ましい。
本発明の抗体は、
(1)ヒトヒアルロニダーゼ−2と反応し、
(2)ヒトヒアルロニダーゼ−2以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイム(例えば、ヒトヒアルロニダーゼ−1、ヒトヒアルロニダーゼ−3、ヒトヒアルロニダーゼ−4、又はヒトヒアルロニダーゼPH−20)と反応しない。
本発明による抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。
本発明によるモノクローナル抗体は、免疫用抗原及びスクリーニング用抗原として、ヒトヒアルロニダーゼ−2のアミノ酸配列に特異的なアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは本発明によるペプチドを用いることを除いて、それ自体公知の手段により得ることができる。
前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、5%CO2濃度且つ37℃の条件下で約3日間で行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約14日間で行なうことができる。
このような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインA結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
ペプチドと担体との結合は、公知の方法、例えば、活性化エステル法(A.E.KARU et al., J.Agric.Food Chem., 42, 301-309, 1994)、又は混合酸無水物法(B.F.Erlanger et al., J.Biol.Chem., 234, 1090-1094, 1954)等によって行うことができる。
ペプチド自動合成装置(アプライド・バイオシステム社製)を用いて固相法により、ヒトHYAL−2のアミノ末端側アミノ酸配列に相当する11個のアミノ酸残基からなる合成ペプチドV-A-W-D-V-P-T-Q-D-C-G(配列番号1)を作製した。ポリマー性の固相支持体へ前記ペプチドのC末端側からそのアミノ酸残基に対応したL−体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合した。そのようにして得られた合成ペプチドはトリフルオロメタンスルホン酸などを用いて固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製した。合成ペプチドの精製純度は約95%で、そのアミノ酸配列はアミノ酸シーケンサー(アプライド・バイオシステム社製)により確認した。
合成ペプチドはハプテンとしてキャリアータンパク質との架橋物にして免疫抗原とした。キャリアータンパク質としてKLHを使用した。その架橋方法は、合成ペプチド内のカルボキシル末端側にあるCys残基を利用した。スルホ−SMCC(スルホサクシニミディル−4−N−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレート)を用いてKLHに−SH基反応性のマレイミド基を導入し、活性化し、次に、その活性化されたマレイミド基とCys−SH基を反応させ架橋した。
実施例2で作成した免疫原である合成ペプチド−KLH架橋物(以下、単に合成ペプチドと称することがある)2mgをPBS(リン酸緩衝液pH7.4)500μLに溶解し、フロイントの完全アジュバンド500μLと充分混合してエマルジョンとした。このエマルジョンをウサギ(日本白色種、メス、体重1.5kg〜2.0kg)の皮下に数箇所投与した。
更に、3週後、新たに前記の半量の合成ペプチド(1mg)をフロイントの不完全アジュバンドと充分混合してエマルジョンとし、皮下に数箇所投与した(2回目投与)。
更に、3週後、新たに前記2回目投与と同量の合成ペプチド(1mg)をフロイントの完全アジュバンドと充分混合してエマルジョンとし、ウサギの腰部筋肉内に2箇所投与した(3回目投与)。
3回目投与の1週後より耳静脈より大量採血を実施して約40mLの血清を得、以後4週間後まで週1回、約40mLを採血した。
採血した血清中に含有された抗体と免疫原として使用した合成ペプチドとの抗原抗体の反応を次に示すELISA(エンザイム・イムノソーベント・アッセイ)で検討した。
まず、96ウエル平底ELISA−プレート(ELISA−plate)の各ウエルに合成ペプチド溶液(1μg/mL、炭酸緩衝液pH9.6)を50μLずつ分注し、4℃で一晩静置した(この処置により合成ペプチドは、各ウエルの接触面に非特異的に吸着する)。
実施例4で使用したELISA−プレート(すなわち、各ウエルに3種類の合成ペプチドを吸着させた後、ウシ血清アルブミンで処理したELISA−プレート)に、一定の濃度に希釈した抗血清(3種類)と3種類の合成ペプチド(実施例1に記載の合成ペプチド及び実施例4に記載した陰性対照用合成ペプチド)をそれぞれ0.13μg/mL〜100μg/mL添加し、4℃で1晩静置した。ウエル内の溶液を除去し、前記洗浄液で洗浄後、以下の二次抗体の添加及び発色反応は、実施例4と同様に実施した。
実施例4の結果同様、本発明の合成ペプチドを免疫原に用いて作成された抗血清は、液相反応においても本発明の合成ペプチドとのみ抗原抗体反応することが判明した。
ヒト線維芽細胞(detroit551株)及びヒト表角化細胞(クラボウ)を75cm2の培養ボトル(住友ベークライト)で培養し、細胞を集めた後、それぞれ0.2mol/L−NaCLを含む50mmol/Lトリス塩酸緩衝液(抽出用緩衝液)で懸濁し、超音波処理で細胞を破砕した。その後遠心し、その上清を細胞抽出液として調整した。
一方、陰性対照用合成ペプチドを免疫原に用いて作成された抗血清は、HYAL−2の分子量と同様の位置にバンドは認められず、非特異的なバンドも多く検出された。
実施例6に記載されたヒト線維芽細胞にHYAL−2アンチセンス及びミスマッチアンチセンスを導入した後、実施例6に記載の方法により、それぞれ培養した後、細胞抽出液を調製した。本発明の合成ペプチドを用いて作成された抗血清を用いて、実施例6に記載のウエスタンブロット法で分析すると、アンチセンス導入ヒト線維芽細胞は、コントロールの何も導入していないヒト線維芽細胞に比較し、顕著なシグナルの減少が認められたが、ミスマッチアンチセンスを導入ヒト線維芽細胞ではシグナルの減少は認められなかった。従って、本発明の合成ペプチドを用いて作成された抗血清より検出されるシグナルはヒトHYAL−2であることが明らかである。その結果を図2に示す。図2において、レーン1はコントロール細胞の結果であり、レーン2はアンチセンス導入ヒト線維芽細胞の結果である。
一方、陰性対照用合成ペプチドを用いて作成された抗血清(2種類)では、アンチセンス導入ヒト線維芽細胞とコントロール細胞との間でシグナルの変化は認められず、これらの抗血清が認識しているバンドは、ヒトHYAL−2でないことが判明した。
実施例3で得られたウサギ抗血清よりIgG画分を精製し、CNBr活性化セファロース(Sepharose)4B(アマシャムバイオサイエンス)を用いて抗体を固定化し、抗体固定担体を作製した。実施例6に記載の角化細胞抽出液0.5mLを抗体固定担体0.2mLと混合し、室温で4時間、ゆっくりと攪拌した。その処理担体を抽出用緩衝液で洗浄後、グリシン/HCL緩衝液(pH2.8)で溶出した。溶出した画分を実施例6の方法により、ウエスタンブロット解析を行ったところ、HYAL−2相当の位置にシグナルが検出された。従って、本発明方法により得られたウサギ抗血清は、HYAL−2を認識し、結合することが判明した(図は示さず)。
Claims (5)
- (1)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端及び/若しくはC末端に1若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。 - ヒトヒアルロニダーゼ−2と反応し、ヒトヒアルロニダーゼ−2以外のヒトヒアルロニダーゼアイソザイムと反応しないことを特徴とする、抗体又はその断片。
- ヒトヒアルロニダーゼアイソザイムである、ヒトヒアルロニダーゼ−1、ヒトヒアルロニダーゼ−3、ヒトヒアルロニダーゼ−4、及びヒトヒアルロニダーゼPH−20のいずれとも反応しない、請求項2に記載の抗体又はその断片。
- 請求項1に記載のペプチドを動物に免疫することによって得られる抗体又はその断片。
- 請求項1に記載のペプチドを動物に免疫することを特徴とする、抗体又はその断片の製造方法。
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