CN114349846A - 一种人精子膜蛋白or1d2特异性多肽与抗体的制备方法 - Google Patents
一种人精子膜蛋白or1d2特异性多肽与抗体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽与抗体的制备方法。特异性多肽氨基酸序列为：LMTRVTFCGSRKIHYI。抗人精子膜蛋白OR1D2抗体按以下方法制备：(1)特异性胞外抗原表位分析与设计；(2)特异性人工多肽合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔多克隆抗体；(5)收集、分离、纯化获得抗体。本发明制备的特异性抗人精子膜蛋白SPACA3抗体效价高、亲和力强、特异性好，可在体内和体外与具有天然活性的人精子膜蛋白SPACA3抗原表位发生特异性结合，可用于荧光免疫和酶联免疫吸附实验。该抗体不仅对研究人精子膜蛋白OR1D2蛋白特性、功能、表达谱和相关疾病提供一个重要工具，还在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽及其抗体的制备方法，该抗体是用于人精子膜蛋白OR1D2蛋白的基础研究的重要工具，还可在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。
背景技术
精子趋化性是化学诱导剂浓度差所引起的精子行为反应，这一机制已经在人、兔、小鼠、牛和猪等动物身上得到了证明，哺乳动物精子趋化性不同于其他精子导向机制的研究，它是基于精子在雌性生殖道中到达受精部位的一种趋向性竞争机制，能够帮助获能的精子到达卵子并完成正常的受精活动。有研究显示，嗅觉受体(olfaetory receptor，OR)在嗅神经和精子细胞表面均有分布，OR1D2受体在精子及睾丸组织有特异性表达，嗅觉受体的特异性抗原位点与抗精子抗体(anti-sperm antibody,AsAb)结合可能引起精子趋化性的改变，而精子趋化性异常导致精子运动方向改变和精卵融合失败继发不孕不育。因此，揭示与趋化性相关的精子表面膜蛋白的特异性抗原位点在两性生殖过程中的作用机制，构建特异性免疫不孕不育靶向治疗方法等一系列的科学问题，是促进健康生育、构筑人口安全的重大需求。
(1)OR1D2的功能：OR1D2属于嗅觉受体，G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptor GPcR)家族，基因位于17p13.3 DNA反义链，长度为939bp，有1个外显子，具有一个保守结构域7tm_1，具有7个长度为19-26个膜外环状结构形成氨基酸疏水区，即7次α-螺旋跨膜蛋白(TM)形成的结构域，总长度约为300-350个氨基酸。氨基酸链的N端在膜外侧，C端在膜内侧，OR1D2基因的TM区域由3个胞内环(IC)和3个胞外环(EC)组成，其中尤以EC2长度最长。该基因的mRNA有一种亚型：NM_002548.2。OR1D2蛋白质产物312个氨基酸，分子量35，240Da，是多次跨膜蛋白，主要位于精子顶部、中段和尾部的细胞膜。
(2)OR1D2抗体产品的信息：经检索,市场上有OR1D2蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位不同仅能进行实验室检测。
(3)OR1D2与疾病：OR1D2属于嗅觉受体家族1亚家族的一个蛋白编码基因，可能涉及的信号通路包括肽受体配体结合和GPCR信号转导。在生殖活动中，可引起细胞内Ca2+浓度的增加，这是精子获能和顶体反应的先决条件，并通过激活依赖Ca2+的Clˉ通道导致精子超极化，增加精子、前列腺和睾丸的能动性来强化精子趋化和受精过程的作用。OR1D2是参与精子趋化性的气味受体，对叔丁基苯丙醛是精子的体外强化学诱导物，有研究证实OR1D2在鼻子和精子中的重要作用，不明原因不育的男性较健康男性的嗅觉阈值、精子对化学诱导感知能力均有明显下降，OR1D2基因单核苷酸多态性(SNPs)可能是引起男性特发性不育症的原因。这也说明影响精子趋向性/运动性的化学吸引对精卵受精过程具有重要作用。
发明内容
本发明目的针对可用于免疫不育机制研究的OR1D2抗体制备方法的不足，提供一种人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽与抗体的制备方法。不同于体外实验检测抗体，用此多肽制备的抗OR1D2抗体一方面可以通过免疫荧光和酶联免疫吸附实验特异识别组织或细胞中的天然人OR1D2蛋白，另一方面可以借助OR1D2的特异性表面抗原位点进行抗精子抗体介导的免疫不育作用机制的研究，还可以开展靶向示踪、生物制药和精准治疗等方面的研究。
本发明的技术方案
一种人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽，所述多肽的抗原结合位点广泛分布于整个精子尾部和顶体赤道段区，有少量分布在精子顶体前部，多肽的氨基酸序列为：LMTRVTFCGSRKIHYI。
所述抗人精子膜蛋白OR1D2的抗体制备方法，包括：
第1步、人精子膜蛋白OR1D2特异性抗原表位的分析与设计
利用生物信息软件对蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析,主要评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数。
第1.1步、使用TMHMM在线预测膜蛋白的跨膜区域
登录TMHMM主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式OR1D2蛋白序列或将序列粘贴在“OR by pasting sequence(s)in FASTAformat:”下方的文本框；out format有三个选项，分别是图形输出(Extensive,with gaphics)；文字输出(Extensive，no graphics)；蛋白逐行显示(One line protein)，默认选项图形化显示；调整完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果，OR1D2受体有七个跨膜螺旋区，其跨膜螺旋区预测的位置分别在蛋白第26-48位、61-83位、98-120位、140-162位、199-221位、241-263位、273-292位，其中1-25、84-97、163-198和264-272位分别处于细胞膜外侧。
第1.2步、使用SignalP 4.1Server对膜蛋白进行信号肽的预测分析
登录SignalP 4.1Server主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式蛋白序列或将序列粘贴在下方的文本框；参数设置Organism group：选择Eukaryotes；D-cutoffvalues：选择Default(optimized for correlation)；Graphics output：选择PNG(inline)；Output format：Standard；Method选择Input sequences may include TMregions。参数设置完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果，OR1D2序列中未发现信号肽。
第1.3步、使用ExPASY-ProtScale对膜蛋白进行疏水性的预测分析
登录ExPASY-ProtScale主界面，在“Enter a UniProtKB/Swiss-Prot orUniProtKB/TrEMBL accession number(AC)”文本框内输入蛋白序列ID number；或将FASTA格式蛋白序列粘贴在“Or you can paste your own sequence in the box below:”的文本框；参数设置选择默认设置，设置完毕后按“Submit”提交并查看预测分析结果，OR1D2存在4个明显的的疏水区，第219位的氨基酸(Val,缬氨酸)疏水性最强。8个比较明显的亲水区，第23位的氨基酸(Gln，谷氨酰胺)亲水性最强。
登录NCBI和UniProtKB蛋白数据库，分别以“OR1D2”“olfactory receptor 1D2”为关键词，种属选定“Homo sapiens”，通过蛋白质数据库查询结果，并下载膜蛋白的FASTA格式的系列文件进行后续分析。利用生物信息软件对人精子膜蛋白OR1D2的氨基酸序列进行抗原表位分析,，评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数,再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定人精子膜蛋白OR1D2抗原表位在氨基酸序列第162位到第177位氨基酸的肽段，确定合成多肽氨基酸序列为LMTRVTFCGSRKIHYI(图1)
第2步、人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽抗原合成与载体蛋白KLH偶联及纯化第2.1步、OR1D2人工多肽的合成
采用多肽自动合成仪合成纯化，并采用质谱分析和高效液相色谱分析法进行纯度鉴定，纯度大于为95％。
第2.2步、利用EDC偶联合成多肽-KLH
将KLH配制成10mg/ml的溶液，将合成多肽溶解在2.5ml的Imject@EDCConjugation Bufjfer中，浓度为0.4mg/ml，将多肽溶液滴加入载体蛋白溶液中，用超纯水配制10mg/ml的EDC溶液，立即加250ul此溶液到mcKLH肽溶液，在室温下反应2小时后除去EDC的残留物。
第2.3步、纯化合成多肽-KLH复合物
在Purification Buffer Salts瓶中添加经超声波震荡除气的超纯水60ml以溶解内容物，每0.5ml样品使用一个脱盐柱过滤，将0.5ml的合成多肽-KLH复合物轻轻滴加入25ml的Purification Buffer Salts洗脱柱子中，静置2分钟，取5ml纯化缓冲液对柱子进行洗脱，收集洗脱液利用紫外可见吸收光谱测定280nm处检测吸光度，根据吸收峰计算多肽-KLH复合物的含量。如果免疫原需要储存较长时间，可使用0.22um过滤器过滤免疫原，-20℃保存。
第3步、制备人工免疫原免疫动物——制备抗体
第3.1步、购入2.0KG重的SPF级的新西兰大白兔4只。分为OR1D2实验组和对照组，正常血清在免疫实验前从动物耳缘静脉抽血0.5ml制备；
第3.2步、利用佐剂包裹抗原：在每次免疫之前，将多肽-KLH的复合物400-600ug吸入一支2.5ml无菌注射器中，以另一只2.5ml注射器吸入等量的完全弗氏佐剂或弗式不完全佐剂，两支注射器以无菌塑料软管连接并反复对抽，直到完全乳化后(滴一滴到冷水中不再扩散，即为达到油包水的完全乳化程度)，即可用于免疫。
第3.3步、动物致敏：400mg多肽-KLH的复合物与完全弗氏佐剂按体积比1：1混合行第2步操作，充分混匀后进行动物致敏，为了增加致敏效果在动物躯干部、颈部和背部采用多点法(每点约200ul)注射于皮下；
第3.4步以相同抗原剂量并以弗氏非完全佐剂和弗氏完全佐剂交叉乳化抗原每周加强免疫一次，乳化方法同前。分别在兔子的背部皮下、腹部皮下、腹股沟、腘沟、脚掌等部位注射。注射时，用兔盒固定兔子，先用左手提起皮肤，右手持注射器，将针头和皮肤之间角度调整为15度左右，将针头注入皮肤1-2cm后向上挑起以防刺入肌肉，每点注射200ul左右。
第3.5步、具体免疫方案如下所示，共免疫10周。每只兔子均在第7周和第9周由耳缘静脉加强免疫两次。分别在第4、8、9和10周进行Elsia实验检测抗体效价和特异性。
第4步、收集抗体血清
第4.1步、将兔子仰卧位用绳子固定四肢，其中双上肢交叉置于头部后面固定，用细绳拴住兔上颌门牙后向后拉，顺势将兔头固定于双上肢上。
第4.2步、暴露颈部，消毒后将颈部毛发剪去，沿颈部正中自胸骨上窝至下颌剪开颈部皮肤约15cm，找到气管后沿气管仔细分离皮下组织，远心端至喉部，近心端至胸锁乳突肌。
第4.3步、在气管下方即可见搏动的劲动脉，仔细分离两侧颈动脉，并充分游离。
第4.4步、将两根黑丝线套入一侧动脉并分开(一根在远心端，一根在近心端)，用丝线将动脉远心端结扎，然后将动脉近心端用动脉夹夹住，用眼科剪在丝线与动脉夹中间的动脉壁上剪开一个小口，迅速插入预先制作好的细塑料软管，并迅速用近心端丝线固定软管与动脉，以防软管脱出和漏血。
第4.5步、轻轻松开动脉夹，用50ml离心管倾斜放置接住从放血管里射出来的动脉血，直至无血液滴出，可同法处理另一侧颈动脉增加放血量，并可于放血流量缓慢时挤压心脏以增加血液排出量。
第4.6步、兔抗血清的分离和保存将兔血清于4℃冰箱放置过夜。第一次吸取血清后，4摄氏度下12000转/分钟，离心15min，第二次吸取血清。最终得到OR1D2抗体血清约75ml，用15ml离心管分装后分别加入0.01％体积的NaN3，置入-20℃冰箱内保存。
第5步、饱和硫酸铵法分离纯化抗人精子膜蛋白OR1D2IgG抗体
第5.1步、取兔抗血清3ml移入15ml离心管中，4℃下逐渐加入3ml的0.01MPH7.4PBS，缓慢震荡下逐滴加入6ml的PH7.0的饱和硫酸铵溶液。
第5.2步、硫酸铵溶液达到50％饱和度时，将上述溶液置于4℃下过夜。
第5.3步、将上述溶液置于4℃下经10000转/分钟离心20min，弃去上清液，得到球蛋白沉淀。
第5.4步、4℃下，用3ml的0.01M PH7.4 PBS溶解沉淀后，逐滴加入1.5ml的饱和硫酸铵溶液(使硫酸铵溶液达到33％饱和度)，沉淀30min。重复两次。
第5.5步、4℃下，10000转/分钟离心10min，弃去上清液，得到抗体IgG沉淀。
第5.6步、弃去上清液，加入3ml的0.01M PH7.4 PBS溶解抗体IgG沉淀，并装入透析袋中。
第5.7步、4℃下，将透析袋放入0.01M PH7.4 PBS溶液中进行透析。期间换液若干次，至透析外液无黄色变化为止。
第5.8步、取透析袋内样品真空干燥，取少许做适当倍数稀释后，测定蛋白含量。
第6步、酶联免疫吸附实验鉴定血清抗体天然人OR1D2蛋白结合效价
第6.1步、人源精子膜蛋白可溶性抗原的制备
第6.1.1步、健康男性禁欲3-5d后，手淫方法取精。精子37℃水浴液化后，行精液常规分析，收集精子成活率>60％，精子活力a级>25％，或a+b级>50％的精液待用；取15ml离心管依次加入90％和45％Percoll液各5ml，形成二层Percoll密度梯度分离柱；取4ml待用精液小心加入至离心管中，可见清晰的分界面。3000转/分钟，离心15分钟，小心吸出精子层，加入至2mlPBS液，4℃下3000/分钟离心10分钟，得到精子细胞沉淀，用4℃无菌PBS充分混匀后按上述条件离心，重复三次。得到清洁的精子细胞沉淀，用约3-5mlPBS充分混匀后移入15ml无菌离心管中得到精子细胞悬液。
第6.1.2步、利用超声波细胞破碎仪打碎精子细胞膜,膜蛋白充分暴露抗原位点。方法：将3-5ml含精子细胞的15ml离心管置入碎冰中，顶帽打开，将超声波细胞破碎仪探头放入溶液中，强度调整为70％，破碎时间6min(破碎5s，暂停5s以防温度过抗原变性以及产生泡沫)。
第6.1.3步、将上述溶液离心(4℃，12000转/分)，弃去沉淀，取上清液(精子可溶性膜蛋白抗原)，4℃下保存。反复上述步骤，将分次取得的可溶性抗原收集并-80度冰箱保存。
第6.2步、包被:将人源精子膜蛋白抗原稀释为50ug/ml滴加到96孔板的若干小孔中，100μL/孔,于4℃过夜。
第6.3步、封闭：弃去孔中的可溶性抗原,加入5％脱脂奶粉(封闭液)150μL/孔,37℃下孵育40min。
第6.4步、洗涤:加洗涤液(PBST)200ul/孔，洗涤三次,每次放置3min。
第6.5步、加入一抗:充分甩弃孔中洗液,并依次加入不同稀释度的待测血清抗体100μL/孔，37℃下，放置40min。
第6.6步、洗涤:小孔中加入PBST，200ul/孔，静置3min,弃去孔中洗涤液，重复三次，最后充分甩弃孔中洗涤液。
第6.7步、加入酶标抗体(二抗):将HRP标羊抗兔二抗1:10000稀释，加入100μL/孔，并于37℃下放置40min。
第6.8步、洗涤:用PBST洗涤三次,每次3min。
第6.9步、显色:加入TMB显色液100μL/孔，常温下避光放置15min。
第6.10步、终止液:加1M的H2SO4，50μL/孔。
第6.11步、测量:利用酶标仪测定OD 490nm值。。本次实验经过十次免疫，最终OR1D2抗体第四周、第八周、第九周和第十周的效价分别为1:1600、1:3200、1:6400和1:6400，第十周抗体OD值最高；(图5)。
第7步、细胞免疫荧光染色定位精子表面OR1D2蛋白分布
第7.1步、人源精子和中性粒细胞收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min,离心10min收集精子细胞，用0.01MPH7.4 PBS洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01MPH7.4 PBS稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2×106个/ml；
第7.2步、精子涂片：将0.5ml含5×106个精子的PBS溶液，均匀滴加于多聚赖氨酸包被的玻片上，室温自然风干，形成精子涂片；
第7.3步、0.01MPH7.4 PBS洗涤3次，每次5分钟；
第7.4步、室温覆盖以4％的多聚甲醛固定15分钟，避光；
第7.5步、0.01MPH7.4 PB PBS缓冲液洗洗涤3次，每次5分钟；
第7.6步、0.25％Triton X-100(通透液)覆盖细胞5-7分钟，(注：不加通透液可省略此步骤)；
第7.7步、0.01MPH7.4PBS洗涤三遍，每次5分钟；
第7.8步、山羊封闭血清室温封闭40分钟；
第7.9步、配制一抗，OR1D2抗体稀释为100ug/ml加入，湿盒内4℃避光过夜；
第7.10步、PBS洗涤三次，每次5分钟；
第7.11步、配制荧光标记二抗(Ab150079)Goat anti-rabbit IgG(H&L)，用PBS按1:100稀释，避光保存；。
第7.12步、加入二抗，室温孵育1小时(避光)；
第7.13步、4℃PBS洗涤三次，每次15分钟(避光)；
第7.14步、DAPI染核，完全覆盖住细胞即可(避光)；
第7.15步、使用共聚焦显微镜观察染色结果，出现高强度红色荧光(发射光波长为647nm)的细胞作为观察视野，进行观察拍照。人源精子和中性粒细胞涂片的免疫荧光染色显示，IgG抗体在人源精子未见着色(图6)；OR1D2蛋白分布范围很大，包括整个尾部和精子顶体赤道段区，有少量分布到精子顶体前部，中性粒细胞可见少量着色(图7)。
第8步、人源正常成熟精子与OR1D2抗体共孵育实验
第8.1步、人源正常成熟精子和中性粒细胞的收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min,离心10min收集精子细胞，用0.01MPH7.4 PBS洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01MPH7.4 PBS稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2×106个/ml；
第8.2步、抗体和精子共孵育：将0.5ml精子溶液或中性粒细胞溶液分别与2mg/ml的OR1D2抗体0.5ml溶液均匀混合，37℃共孵育30分钟，用0.01MPH7.4 PBS洗涤离心3次，定容10ml；随后操作步骤同上第7.2步-第7.15步；
本发明的优点和有益效果：
本发明制备的抗OR1D2抗体不仅可以与固定变性的OR1D2蛋白有稳定的特异性结合能力，还可以与生理状态下保持细胞完整性的精子膜OR1D2蛋白特异性结合，获得很好的抗体定向效果。该抗体可根据具体应用情况，通过Fc端链接复杂的多组分、多功能的生物集团构建复合靶向系统来满足不同的需求。由于OR1D2蛋白在精子膜上有非常广泛的分布，本发明制备的抗体在精子的靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1人源OR1D2氨基酸序列和特异性OR1D2抗原表位的氨基酸序列。
图2 TMHMM2.0预测OR1D2受体有七个跨膜螺旋区，其跨膜螺旋区预测的位置分别在蛋白第26-48位、61-83位、98-120位、140-162位、199-221位、241-263位、273-292位，其中1-25、84-97、163-198和264-272位分别处于细胞膜外侧。
图3 SignalP 4.1显示OR1D2序列中未发现信号肽。
图4 ExPASY-ProtScale预测OR1D2存在4个明显的的疏水区，第219位的氨基酸(Val,缬氨酸)疏水性最强。8个比较明显的亲水区，第23位的氨基酸(Gln，谷氨酰胺)亲水性最强。
图5 ELSIA测定OR1D2抗体效价，(A)第四周抗体效价为1:1600；(B)第八周抗体效价为1：3200；(C)第九周抗体效价为1：6400；(D)第十周的效价别为1:6400，第十周抗体OD值最高。
图6作为阴性对照，抗人IgG抗体在人源精子未见着色。
图7OR1D2蛋白分布范围很大，包括整个尾部和精子顶体赤道段区，有少量分布到精子顶体前部，中性粒细胞可见少量着色。
图8抗人精子膜OR1D2抗体与精子共孵育的免疫荧光结果显示OR1D2蛋白在精子活体状态下，位于精子细胞膜外侧的抗原决定簇可以与抗体直接结合。
具体实施方式
实施例1：
一种作用于人精子表面特异性膜蛋白OR1D2的抗体的制备方法，包括如下步骤：
第1步、人精子膜蛋白OR1D2特异性抗原表位的分析与设计
利用生物信息软件对OR1D2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析,主要评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数,再结合过去制备抗体的实际经验,最终确定OR1D2蛋白162-177aa16个氨基酸，合成多肽氨基酸序列为LMTRVTFCGSRKIHYI(图1)。
第1.1步、使用TMHMM在线预测人源精子膜蛋白OR1D2的跨膜区域
登录TMHMM主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式OR1D2蛋白序列或将序列粘贴在“OR by pasting sequence(s)in FASTAformat:”下方的文本框；out format有三个选项，分别是图形输出(Extensive,with gaphics)；文字输出(Extensive，no graphics)；蛋白逐行显示(One line protein)，默认选项图形化显示；调整完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果，OR1D2受体有七个跨膜螺旋区，其跨膜螺旋区预测的位置分别在26-48位、61-83位、98-120位、140-162位、199-221位、241-263位、273-292位，其中1-25、84-97、163-198和264-272位分别处于细胞膜外侧(图2)。
第1.2步、使用SignalP 4.1Server对人源精子膜蛋白OR1D2进行信号肽的预测分析
登录SignalP 4.1Server主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式蛋白序列或将序列粘贴在下方的文本框；参数设置Organism group：选择Eukaryotes；D-cutoffvalues：选择Default(optimized for correlation)；Graphics output：选择PNG(inline)；Output format：Standard；Method选择Input sequences may include TMregions。参数设置完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果，OR1D2蛋白蛋白序列在本次预测未发现信号肽(图3)。
第1.3步、使用ExPASY-ProtScale对人源精子膜蛋白OR1D2进行疏水性的预测分析
登录ExPASY-ProtScale主界面，在“Enter a UniProtKB/Swiss-Prot orUniProtKB/TrEMBL accession number(AC)”文本框内输入蛋白序列ID number；或将FASTA格式蛋白序列粘贴在“Or you can paste your own sequence in the box below:”的文本框；参数设置选择默认设置，设置完毕后按“Submit”提交并查看预测分析结果，OR1D2存在4个明显的的疏水区，第219位的氨基酸(Val,缬氨酸)疏水性最强。8个比较明显的亲水区，第23位的氨基酸(Gln，谷氨酰胺)亲水性最强(图4)。
第2步、人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽抗原合成与载体蛋白KLH偶联及纯化
第2.1步、OR1D2人工多肽的合成
上海华大基因公司采用多肽自动合成仪合成纯化OR1D2(16肽)10mg，并采用质谱分析和高效液相色谱分析法进行纯度鉴定，纯度大于为95％。
第2.2步、利用EDC偶联合成多肽-KLH
将KLH配制成10mg/ml的溶液，将OR1D2(16肽)合成多肽溶解在2.5ml的Imject@EDCConjugation Bufjfer中，浓度为0.4mg/ml，将多肽溶液滴加入载体蛋白溶液中，用超纯水配制10mg/ml的EDC溶液，立即加250ul此溶液到mcKLH肽溶液，在室温下反应2小时后除去EDC的残留物。
第2.3步、纯化合成多肽-KLH复合物
在Purification Buffer Salts瓶中添加经超声波震荡除气的超纯水60ml以溶解内容物，每0.5ml样品使用一个脱盐柱过滤，将0.5ml的合成多肽-KLH复合物轻轻滴加入25ml的Purification Buffer Salts洗脱柱子中，静置2分钟，取5ml纯化缓冲液对柱子进行洗脱，收集洗脱液利用紫外可见吸收光谱测定280nm处检测吸光度，根据吸收峰计算多肽-KLH复合物的含量。如果免疫原需要储存较长时间，可使用0.22um过滤器过滤免疫原，-20℃保存。
第3步、制备人工免疫原免疫动物(制备抗体)
第3.1步、购入2.0KG重的SPF级的新西兰大白兔4只。分为OR1D2组和对照组，正常血清在免疫实验前从动物耳缘静脉抽血0.5ml制备；
第3.2步、利用佐剂包裹抗原：在每次免疫之前，将OR1D2多肽-KLH的复合物400-600ug吸入一支2.5ml无菌注射器中，以另一只2.5ml注射器吸入等量的完全弗氏佐剂或弗式不完全佐剂，两支注射器以无菌塑料软管连接并反复对抽，直到完全乳化后(滴一滴到冷水中不再扩散，即为达到油包水的完全乳化程度)，即可用于免疫。
第3.3步、动物致敏：400mg多肽-KLH的复合物与完全弗氏佐剂按体积比1：1混合行第2步操作，充分混匀后进行动物致敏，为了增加致敏效果在动物躯干部、颈部和背部采用多点法(每点约200ul)注射于皮下；
第3.4步以相同抗原剂量并以弗氏非完全佐剂和弗氏完全佐剂交叉乳化抗原每周加强免疫一次，乳化方法同前。分别在兔子的背部皮下、腹部皮下、腹股沟、腘沟、脚掌等部位注射。注射时，用兔盒固定兔子，先用左手提起皮肤，右手持注射器，将针头和皮肤之间角度调整为15度左右，将针头注入皮肤1-2cm后向上挑起以防刺入肌肉，每点注射200ul左右。每次免疫后从兔耳缘静脉取血5-10ml作为免疫血清收集；
第3.5步、具体免疫方案如下所示，共免疫10周。每只兔子均在第7周和第9周由耳缘静脉加强免疫两次。分别在第4、8、9和10周进行Elsia实验检测抗体效价和特异性。
第4步、抗体血清的制备
第4.1步、将兔子仰卧位用绳子固定四肢，其中双上肢交叉置于头部后面固定，用细绳拴住兔上颌门牙后向后拉，顺势将兔头固定于双上肢上。
第4.2步、暴露颈部，消毒后将颈部毛发剪去，沿颈部正中自胸骨上窝至下颌剪开颈部皮肤约15cm，找到气管后沿气管仔细分离皮下组织，远心端至喉部，近心端至胸锁乳突肌。
第4.3步、在气管下方即可见搏动的劲动脉，仔细分离两侧颈动脉，并充分游离。
第4.4步、将两根黑丝线套入一侧动脉并分开(一根在远心端，一根在近心端)，用丝线将动脉远心端结扎，然后将动脉近心端用动脉夹夹住，用眼科剪在丝线与动脉夹中间的动脉壁上剪开一个小口，迅速插入预先制作好的细塑料软管，并迅速用近心端丝线固定软管与动脉，以防软管脱出和漏血。
第4.5步、轻轻松开动脉夹，用50ml离心管倾斜放置接住从放血管里射出来的动脉血，直至无血液滴出，可同法处理另一侧颈动脉增加放血量，并可于放血流量缓慢时挤压心脏以增加血液排出量。用此方法得到OR1D2兔血75ml。
第4.6步、兔抗血清的分离和保存将兔血清于4℃冰箱放置过夜。第一次吸取血清后，4摄氏度下12000转/分钟，离心15min，第二次吸取血清。最终得到OR1D2抗体血清约50ml，用15ml离心管分装后分别加入0.01％体积的NaN3，置入-20℃冰箱内保存。
第5步、饱和硫酸铵法分离纯化抗人精子膜蛋白OR1D2IgG抗体
第5.1步、取兔抗血清3ml移入15ml离心管中，4℃下逐渐加入3ml的0.01MPH7.4PBS，缓慢震荡下逐滴加入6ml的PH7.0的饱和硫酸铵溶液。
第5.2步、硫酸铵溶液达到50％饱和度时，将上述溶液置于4℃下过夜。
第5.3步、将上述溶液置于4℃下经10000转/分钟离心20min，弃去上清液，得到球蛋白沉淀。
第5.4步、4℃下，用3ml的0.01M PH7.4 PBS溶解沉淀后，逐滴加入1.5ml的饱和硫酸铵溶液(使硫酸铵溶液达到33％饱和度)，沉淀30min。重复两次。
第5.5步、4℃下，10000转/分钟离心10min，弃去上清液，得到抗体IgG沉淀。
第5.6步、弃去上清液，加入3ml的0.01M PH7.4 PBS溶解抗体IgG沉淀，并装入透析袋中。
第5.7步、4℃下，将透析袋放入0.01M PH7.4 PBS溶液中进行透析。期间换液若干次，至透析外液无黄色变化为止。
第5.8步、取透析袋内样品真空干燥，取少许做适当倍数稀释后，测定蛋白含量。
第6步、酶联免疫吸附实验鉴定血清OR1D2抗体与非变性人OR1D2蛋白结合效价
第6.1步、人源精子膜蛋白可溶性抗原的制备
第6.1.1步、健康男性禁欲3-5d后，手淫方法取精。精子37℃水浴液化后，行精液常规分析，收集精子成活率>60％，精子活力a级>25％，或a+b级>50％的精液待用；取15ml离心管依次加入90％和45％Percoll液各5ml，形成二层Percoll密度梯度分离柱；取4ml待用精液小心加入至离心管中，可见清晰的分界面。3000转/分钟，离心15分钟，小心吸出精子层，加入至2mlPBS液，4℃下3000/分钟离心10分钟，得到精子细胞沉淀，用4℃无菌PBS充分混匀后按上述条件离心，重复三次。得到清洁的精子细胞沉淀，用约3-5mlPBS充分混匀后移入15ml无菌离心管中得到精子细胞悬液。
第6.1.2步、利用超声波细胞破碎仪打碎精子细胞膜,膜蛋白充分暴露抗原位点。方法：将3-5ml含精子细胞的15ml离心管置入碎冰中，顶帽打开，将超声波细胞破碎仪探头放入溶液中，强度调整为70％，破碎时间6min(破碎5s，暂停5s以防温度过抗原变性以及产生泡沫)。
第6.1.3步、将上述溶液离心(4℃，12000转/分)，弃去沉淀，取上清液(精子可溶性膜蛋白抗原)，4℃下保存。反复上述步骤，将分次取得的可溶性抗原收集并-80度冰箱保存。
第6.2步、包被:将人源精子膜蛋白抗原稀释为50ug/ml滴加到96孔板的若干小孔中，100μL/孔,于4℃过夜。
第6.3步、封闭：弃去孔中的可溶性抗原,加入5％脱脂奶粉(封闭液)150μL/孔,37℃下孵育40min。
第6.4步、洗涤:加洗涤液(PBST)200ul/孔，洗涤三次,每次放置3min。
第6.5步、加入一抗:充分甩弃孔中洗液,并依次加入不同稀释度的待测血清抗体100μL/孔，37℃下，放置40min。
第6.6步、洗涤:小孔中加入PBST，200ul/孔，静置3min,弃去孔中洗涤液，重复三次，最后充分甩弃孔中洗涤液。
第6.7步、加入酶标抗体(二抗):将HRP标羊抗兔二抗1:10000稀释，加入100μL/孔，并于37℃下放置40min。
第6.8步、洗涤:用PBST洗涤三次,每次3min。
第6.9步、显色:加入TMB显色液100μL/孔，常温下避光放置15min。
第6.10步、终止液:加1M的H2SO4，50μL/孔。
第6.11步、测量:利用酶标仪测定OD 490nm值。本次实验经过十次免疫，最终OR1D2第四周、第八周、第九周和第十周的效价分别为1:1600、1:3200、1:6400和1:6400，第九周抗体OD值最高(图5)。
第7步、细胞免疫荧光染色定位精子表面OR1D2蛋白分布
第7.1步、人源精子和中性粒细胞收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min,离心10min收集精子细胞，用0.01MPH7.4 PBS洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01MPH7.4 PBS稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2×106个/ml；
第7.2步、精子涂片：将0.5ml含5×106个精子的PBS溶液，均匀滴加于多聚赖氨酸包被的玻片上，室温自然风干，形成精子涂片；
第7.3步、0.01MPH7.4 PBS洗涤3次，每次5分钟；
第7.4步、室温覆盖以4％的多聚甲醛固定15分钟，避光；
第7.5步、0.01MPH7.4 PB PBS缓冲液洗洗涤3次，每次5分钟；
第7.6步、0.25％Triton X-100(通透液)覆盖细胞5-7分钟，(注：不加通透液可省略此步骤)；
第7.7步、0.01MPH7.4PBS洗涤三遍，每次5分钟；
第7.8步、山羊封闭血清室温封闭40分钟；
第7.9步、配制一抗，OR1D2抗体稀释为100ug/加入，湿盒内4℃避光过夜；
第7.10步、PBS洗涤三次，每次5分钟；
第7.11步、配制荧光标记二抗(Ab150079)Goat anti-rabbit IgG(H&L)，用PBS按1:100稀释，避光保存；。
第7.12步、加入二抗，室温孵育1小时(避光)；
第7.13步、4℃PBS洗涤三次，每次15分钟(避光)；
第7.14步、DAPI染核，完全覆盖住细胞即可(避光)；
第7.15步、使用共聚焦显微镜观察染色结果，出现高强度红色荧光(发射光波长为647nm)的细胞作为观察视野，进行观察拍照。人源精子和中性粒细胞涂片的免疫荧光染色显示，IgG抗体在人源精子未见着色(图6)；OR1D2蛋白分布范围很大，包括整个尾部和精子顶体赤道段区，有少量分布到精子顶体前部，中性粒细胞可见少量着色(图7)；
第8步、人源正常成熟精子与OR1D2抗体共孵育实验
第8.1步、人源正常成熟精子和中性粒细胞的收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min,离心10min收集精子细胞，用0.01MPH7.4 PBS洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01MPH7.4 PBS稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2×106个/ml；
第8.2步、抗体和精子共孵育：将0.5ml精子溶液或中性粒细胞溶液分别与2mg/ml的OR1D2抗体0.5ml溶液均匀混合，37℃共孵育30分钟，用0.01MPH7.4 PBS洗涤离心3次，定容10ml；随后操作步骤同上第7.2步-第7.15步；OR1D2抗体与精子共孵育实验可观察抗体结合运动精子OR1D2蛋白的表达情况，本次共孵育实验显示，抗体在精子相应部位出现荧光，说明OR1D2蛋白在细胞活体状态下，抗原决定簇位于精子细胞膜外侧可以与抗体直接结合(图8)。
Claims (8)
1.一种人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽，其特征在于所述多肽的抗原结合位点广泛分布于整个精子尾部和顶体赤道段区，有少量分布在精子顶体前部，多肽的氨基酸序列为：LMTRVTFCGSRKIHYI。
2.一种抗人精子膜蛋白OR1D2的抗体制备方法，其特征在于包括：
1)、人精子膜蛋白OR1D2特异性抗原表位的分析与设计；
2)、人精子膜蛋白OR1D2特异性多肽抗原合成与载体蛋白偶联纯化；
3)、制备人工免疫原免疫动物；
4)、收集抗体血清；
5)、饱和硫酸铵法分离纯化抗人精子膜蛋白OR1D2IgG抗体；
6)、酶联免疫吸附实验鉴定血清抗体与天然人OR1D2蛋白结合效价；
7)、细胞免疫荧光染色定位精子表面OR1D2蛋白分布。
3.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于所述OR1D2特异性抗原表位的分析与设计所确定的胞外特异性抗原表位序列为人精子膜蛋白OR1D2氨基酸序列中部第162位到第177位氨基酸的肽段。
4.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)。
5.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于所述人工免疫原为KLH-多肽与完全或不完全弗氏佐剂的混合物。
6.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于所述载体蛋白偶联纯化为合成抗原多肽通过交联剂将多肽氨基酸疏基与载体蛋白氨基共价交联，经层析柱提纯。
7.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于所述免疫动物为在实验动物背部通过多点皮下注射，并经二次以上加强免疫，与人精子膜蛋白提取物反应血清效价大于1：6400。
8.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于所述分离纯化抗人精子膜蛋白OR1D2IgG抗体是经过硫酸铵沉淀、蛋白亲和纯化能够从抗体血清中获得高纯度的IgG抗体。
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