CN117534756A - 一种用于检测小鼠dr5蛋白的抗体及其相关检测产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测小鼠DR5蛋白的抗体及其相关检测产品，所述抗体为抗小鼠DR5单克隆抗体6A11，其具有较强的特异性和亲和力，亲和力为nM级，此外，还具有较高的灵敏度，能够应用到不同类型的试剂盒中实现高灵敏度和高精度的DR5检测，对于DR5的检测具有重要意义。

Description

一种用于检测小鼠DR5蛋白的抗体及其相关检测产品
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测小鼠DR5蛋白的抗体及其相关检测产品，更具体地，本发明涉及一种用于检测小鼠DR5蛋白的抗体6A11及其相关检测产品和用途。
背景技术
近年来，随着生物医学不断地发展，抗体的应用也越来越广泛，不仅在临床和生物实验的检测工作中大显身手，还在疾病的治疗研究中崭露头角。基于单克隆抗体的几种衍生物：双特异性抗体、抗体-药物偶联物研发也正在蓬勃发展。检测方面，在基于抗原-抗体结合机制的常用免疫分析技术(免疫印迹法、酶联免疫吸附测定、免疫荧光、免疫组化、免疫沉淀等)中，抗体选择的合适与否直接影响了结果。治疗方面，相对于多克隆抗体，单克隆抗体表现出更强的特异性及更高的纯度。基于单克隆抗体的高特异性和单克隆抗体人源化技术的进步，越来越多的单克隆抗体在疾病的靶向治疗中发挥了重要的作用。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)作为肿瘤坏死因子超家族中的一员，其可在对正常细胞相对安全的情况下，选择性的诱导肿瘤细胞凋亡。人的TRAIL受体共有5种，其中TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)胞内段均含有死亡结构域，通常被称为死亡受体。在众多TRAIL受体中，DR5是最值得关注的，其高表达于肿瘤细胞，健康细胞表达较低甚至几乎不表达，且大多数临床中使用的化疗药物均可诱导DR5高表达，因此，DR5在TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥主要作用。随着TRAIL/DR5研究的不断深入，越来越多的研究表明TRAIL/DR5通路与缺血/缺氧性疾病的诊断和治疗密切相关。
小鼠和人的TRAIL-TRAIL-R系统不尽相同，小鼠仅表达单一的mTRAIL-R，也称为MK，其胞内段也含有死亡结构域，与人类的DR4胞内死亡结构域有43％的同源性，与DR5胞内死亡结构域有49％的同源性。目前市面上抗体公司所制备的DR5单克隆抗体大多数以死亡结构域中的一段序列所制备的多肽作为免疫原，因物种之间TRAIL-R死亡结构域的高度同源性，许多DR5抗体可同时用在人、大鼠、小鼠的免疫分析检测。以DR5胞外段作为免疫原制备单克隆抗体的例子有一些，但针对小鼠DR5胞外段抗体的应用场景较为局限，这一现象导致了缺乏特异性针对小鼠DR5胞外段的抗体来应用于Western blot等免疫分析实验。
发明内容
为了弥补本领域关于小鼠DR5胞外段相关抗体的技术空白，本发明通过分子克隆技术获得小鼠DR5胞外段基因，进一步通过蛋白表达与纯化获得了纯度较高的小鼠DR5胞外段蛋白(mDR5-His)，以mDR5-His原核表达蛋白作为免疫抗原，通过与弗氏佐剂等比混合免疫Wistar大鼠制备单克隆抗体。三次免疫后用mDR5-His真核表达蛋白及GST-mDR5原核表达蛋白进行效价检测及初步筛选，继而冲击免疫。冲击免疫后取大鼠脾脏分离脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经过筛选、亚克隆获得稳定分泌抗小鼠DR5单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过序列比对的方式初步鉴定单克隆抗体的类型。杂交瘤细胞扩大培养后收集上清，根据亚类结果选择合适的纯化方式从而对抗小鼠DR5单克隆抗体进行纯化。其中，抗小鼠DR5单克隆抗体6A11具有较强的特异性和亲和力，亲和力为nM级，此外，还具有较高的灵敏度，可应用于Western blot、ELISA、免疫荧光检测中。
本发明具体的技术方案如下：
首先，本发明提供了一种抗DR5的抗体。
进一步，所述抗体包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中3个互补决定区HCDR1-3和如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的3个互补决定区LCDR1-3。
进一步，当按照IMGT编号方案对所述抗体CDRs进行定义时，所述抗体包含如下CDRs序列：
(i)重链可变区中3个互补决定区HCDR1-3分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示；
(ii)轻链可变区中的3个互补决定区LCDR1-3分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示。
进一步，当按照Kabat编号方案对所述抗体CDRs进行定义时，所述抗体包含如下CDRs序列：
(i)重链可变区中3个互补决定区HCDR1-3分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6所示；
(ii)轻链可变区中的3个互补决定区LCDR1-3分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。
进一步，所述抗体包含的重链可变区和轻链可变区的序列如下：
(a)所述重链可变区如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少70％序列同一性；
(b)所述轻链可变区如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少70％序列同一性。
在本发明中，对所述抗体的重链可变区和轻链可变区中的CDRs进行定义的编号方案并不局限于IMGT编号方案、Kabat编号方案，所述编号方案包括现有的编号方案和将来可能产生的新的编号方案。在一些实施方式中，所述编号方案包括但不限于：IMGT编号方案、Kabat编号方案、Chothia编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)组合，经上述编号方案或编号方案组合对本发明提供的抗体的重链可变区和轻链可变区中的CDRs进行定义得到的HCDR1-3、LCDR1-3序列均包含在本发明的保护范围内。
其次，本发明提供了一种编码如前所述抗体的多核苷酸；
优选地，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
优选地，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
再次，本发明提供了一种包含如前所述多核苷酸的载体；
优选地，所述载体包括质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒；
更优选地，所述载体含有以下任意一种或多种控制表达的元件：启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件、报告基因、复制起始位点。
再次，本发明提供了一种包含如前所述载体的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞；
更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；
最优选地，所述哺乳动物细胞包括HEK293细胞、CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HeLa细胞、A549细胞、293T细胞、COS细胞、BHK细胞。
再次，本发明提供了一种检测DR5的试剂盒或药物组合物。
进一步，所述试剂盒包含如前所述的抗体；
优选地，所述抗体为标记抗体；
更优选地，所述标记抗体的标记物包括生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂、纳米颗粒类标记物；
最优选地，所述荧光染料包括荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物、ATTOTM系列染料、TYE系列染料、量子点、蛋白类染料及其衍生物；
最优选地，所述催化底物显色的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氧酶；
最优选地，所述放射性同位素包括212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu、18F；
最优选地，所述化学发光试剂包括鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物、过氧草酸盐及其衍生物；
最优选地，所述纳米颗粒类标记物包括纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒、稀土络合物纳米颗粒；
最优选地，所述胶体包括胶体金属、分散型染料、染料标记的微球、染料标记的乳胶；
最优选地，所述胶体金属包括胶体金、胶体银、胶体硒；
优选地，所述药物组合物包含如前所述的抗体。
再次，本发明提供了如前所述的抗体、如前所述的多核苷酸、如前所述的载体和/或如前所述的宿主细胞在非诊断目的地检测DR5蛋白中的应用、在制备用于检测DR5蛋白的产品中的应用或在制备用于治疗DR5相关疾病的药物中的应用。
最后，本发明提供了如下任一种方法：
一种体外检测DR5蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将如前所述的抗体或如前所述的试剂盒与待测样品接触，检测DR5蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。
一种诊断DR5相关疾病的方法，所述方法包括如下步骤：将受试者来源的待测样品与如前所述的抗体或如前所述的试剂盒接触，检测待测样品中DR5蛋白的存在或含量。
进一步，所述待测样品可以是来源于任何生物体的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，所述动物包括人或者非人的其他动物)。更具体地，所述动物样品包括可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液或皮肤或粘膜表面的拭子。
一种治疗DR5相关疾病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明如前所述的药物组合物。
一种制备如前所述的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将如前所述的载体导入到宿主细胞中得到如前所述的宿主细胞。
进一步，所述将载体导入到宿主细胞的操作可采用本领域技术人员已知的方法实现，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
附图说明
图1为小鼠DR5胞外段蛋白亲疏水性及抗原表位分析，其中，(a)小鼠DR5胞外段蛋白亲疏水性分析；(b)小鼠DR5胞外段蛋白抗原表位分析；
图2为mDR5胞外段真核质粒构建，其中，(a)pCAGGS-mDR5-His PCR产物(引物为：F2及R)；(b)pCAGGS-mDR5-His PCR产物(引物为：F1及R)；(c)pCAGGS-mDR5-His菌液PCR；
图3为mDR5胞外段原核质粒构建，其中，(a)pGEX-6p-1-GST-mDR5 PCR产物；(b)pET-32a-mDR5-His PCR产物；(c)pGEX-6p-1及pET-32a载体双酶切；(d)pGEX-6p-1-GST-mDR5及pET-32a-mDR5-His菌液PCR；
图4为mDR5-His真核重组蛋白表达纯化，其中，(a～b)mDR5-His真核重组蛋白亲和层析纯化SDS-PAGE检测结果；(c)mDR5-His真核重组蛋白亲和层析纯化UV 280洗脱峰值及洗脱百分比；
图5为mDR5原核重组蛋白表达纯化，其中，(a～b)GST-mDR5原核重组蛋白亲和层析纯化SDS-PAGE检测结果；(c)GST-mDR5原核重组蛋白亲和层析纯化UV 280洗脱峰值及洗脱百分比；(d～e)mDR5-His原核重组蛋白亲和层析纯化SDS-PAGE检测结果；(f)mDR5-His原核重组蛋白亲和层析纯化UV 280洗脱峰值及洗脱百分比；
图6为免疫后大鼠血清效价检测，其中，P76、P77为免疫大鼠耳标号，mDR5-His为真核表达蛋白，GST-mDR5为原核表达蛋白；
图7为抗小鼠DR5单克隆抗体的纯化，其中，(a)单克隆抗体6A11纯化SDS-PAGE结果；(b)单克隆抗体6A11纯化UV 280洗脱峰值；(c)单克隆抗体1B5纯化SDS-PAGE结果；(d)单克隆抗体1B5纯化UV 280洗脱峰值；(e)单克隆抗体9D1、17B1及12A11纯化SDS-PAGE结果；(f)单克隆抗体9D1纯化UV 280洗脱峰值；(g)单克隆抗体17B1纯化UV 280洗脱峰值；(h)单克隆抗体12A11纯化UV 280洗脱峰值；
图8为单克隆抗体特异性鉴定，其中，(a)间接ELISA检测单克隆抗体的特异性；(b)Western blot检测单克隆抗体识别内源蛋白情况；(c)免疫荧光检测单克隆抗体识别内源蛋白情况；
图9为单克隆抗体亲和力鉴定；
图10为单克隆抗体灵敏度鉴定，其中，(a)间接ELISA检测单克隆抗体的灵敏度；(b～f)Western blot检测单克隆抗体灵敏度(所用抗体依次为：1B5、6A11、9D1、17B1、12A11)。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更容易理解本发明，描述具体实施例之前，首先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：
本文所使用的术语“抗体”，是指能够非共价地、可逆地并以特异性方式结合对应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是一种包括通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的四聚体。每个重链包含重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。其中，重链的三个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的三个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。本文中所使用的“抗体”包含但不限于：单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼科抗体、嵌合抗体等。抗体可以属于任何同种型/种类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
本文所使用的术语“同一性”，同术语“同源性”，两者可互换使用，是指与需要比对的氨基酸序列或核苷酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明提供的氨基酸序列具有70％或更高，或75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。所述70％或70％以上同源性，可为70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的同源性。
通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的；插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。
本文所使用的术语“载体”，可以例如是克隆载体、双元载体或整合型载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。载体的非限制性实例包括但不限于：pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)。适合于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部为Invitrogen)。适合于在爪蟾属(Xenopus)胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。
通常，载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)和一种或多种表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点(IRES)和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，其包括在本发明的核酸分子的下游。进一步的例子包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统的信号序列，其能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基。载体也可含有编码一种或多种蛋白伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。
本文所使用的术语“治疗有效量”，是指可有效地抑制、预防、阻止、延迟或治疗特定的疾病、病症或副作用的症状的本文所述抗体、药物组合物的量。这种疾病、病症和副作用包括但不限于与DR5表达相关的那些病理学状况，其中治疗包括例如通过使细胞、组织或受体与本发明所述抗体、药物组合物接触而抑制其活性。治疗有效量可根据施用途径和剂型、受试对象的年龄和体重和/或被治疗的疾病或状况而变化。
本文所使用的术语“受试者”，包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在某些实施方案中，所述“受试者”优选为人。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1mDR5胞外段重组质粒的构建
1、实验方法
1.1目的基因片段的获得
(1)DR5基因片段的选择
小鼠DR5在NCBI上显示的CDS全长为1146bp(NCBI Reference Sequence:NM_020275.4)，胞外段长度为384bp，本发明希望所制备的抗体可特异性识别小鼠DR5胞外段，因此选择了小鼠DR5胞外段全长片段作为免疫片段并在设计引物之前利用Expasy及BepiPred 2.0对小鼠DR5胞外段的亲疏水性及抗原表位进行初步分析。
(2)PCR扩增目的基因片段
所用引物序列如下，以真核质粒pcDNA3.1-mDR5-Fc为模板，反应体系如下表1所示，在PCR仪上的反应程序如下表2所示。
pCAGGS-DR5-His-F1：CGGAATTCGCCACCATGGACGCCATGAAGCGGGGCCTCTGCTGTGTTCTGCTGCTCTGCGGCGCC；
pCAGGS-DR5-His-F2：TTCTGCTGCTCTGCGGCGCCGTGTTCGTGAGTAACTCGAACCCAGCCCATAATCGTCCAG；
pCAGGS-DR5-His-R：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGCTTATGCCAAGATGCCCAAGCCGTTTTGGAGACACACTTCCG；
pET-32a-DR5-His-F：CGGGATCCAACCCAGCCCATAATCGTCCAGC；
pET-32a-DR5-His-R：CCGCTCGAGCTTATGCCAAGATGCCCAAGCCGTTTTGGAGACACACTTC；
pGEX-6p-1-DR5-F：CGGGATCCAACCCAGCCCATAATCGTCCAGC；
pGEX-6p-1-DR5-R：CCGCTCGAGTCACTTATGCCAAGATGCCCAAGCCGTTTTGGAGACACACTTCC。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应程序
1.2目的基因片段与载体重组
(1)PCR产物核酸胶电泳及胶回收
将上述PCR扩增所得PCR产物加上10μL 6×DNA loading buffer。配制1％琼脂糖凝胶，将PCR产物全部上样，125V电压电泳25min。提前预热金属浴至50℃，在紫外切胶台上按照目的条带大小切胶，将切下的胶放入干净的EP管中。按照0.1g加100μL PN(溶胶buffer)的比例将PN加入EP管内。将EP管放入金属浴中加热，每间隔1min取下EP管温柔的上下翻转，直到胶块完全溶解。平衡DNA回收柱，将完全溶解后的溶液吸出转移至回收柱中，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃去废液。加入600μL漂洗液，静置5min，12000rpm离心1min，弃去废液，重复1次。空离1次后静置5min，完全晾干。换上新的收集管加入DNA洗脱液，静置2min，12000rpm离心2min，从收集管中收集离心所得DNA液体再次加入回收柱，静置2min，12000rpm离心2min。
(2)PCR产物及载体质粒酶切
PCR产物酶切体系如下表3所示，载体酶切体系如下表4所示，按照上述体系混合后，用移液器轻柔吹打混匀，在37℃金属浴上放置酶切3.5h。酶切后再次核酸电泳并按照上述胶回收步骤进行胶回收，根据DNA浓度及片段长度计算连接时片段和载体的用量。
表3 PCR产物酶切体系
表4载体酶切体系
(3)PCR产物及载体质粒的连接
按照下表5所示的体系混合后，用移液器轻柔吹打混匀，室温连接孵育30min。
表5酶连体系
(4)连接产物的转化
从-80℃中取出DH5α感受态细胞放置于冰上。在超净工作台中将连接产物全部加入感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min。加入700μL LB培养基后在37℃，220rpm的摇床中震荡培养1h。1h后取出在超净工作台中吸出200μL菌液均匀的涂抹在带有氨苄抗性的细菌培养皿上，37℃静置培养过夜，第二天观察细菌生长状态。
(5)重组质粒的测序
挑取单克隆菌株，转入含有氨苄抗性的LB培养基中，在37℃，220rpm的条件下震荡培养3h，3h后观察细菌浑浊程度。将已培养浑浊的细菌做菌液PCR验证并核酸电泳，位置正确后送测序。
(6)质粒提取
测序正确的菌液扩大培养，真核表达的质粒应用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取。原核表达的质粒用质粒小提试剂盒提取质粒。
2、实验结果
2.1mDR5胞外段亲疏水性及抗原表位分析
本实施例首先对小鼠DR5胞外段的氨基酸序列进行了亲疏水性(图1a)及抗原表位分析(图1b)。图1a的结果表明小鼠DR5蛋白疏水区域位于蛋白质的中部区域。亲水性区域更有可能位于蛋白质表面，而疏水区域一般包裹在蛋白内部，所以，亲水性部分与蛋白的抗原表位密切相关，但是高亲水性部位不一定是表位，表位也不一定是亲水性部位。图1b的结果表明，理论上小鼠DR5胞外段可诱导免疫应答的产生。
2.2mDR5胞外段的真核重组质粒构建
本实施例对mDR5信号肽进行了替换，经过两次PCR从现有质粒模板中扩增出替换信号肽后的mDR5胞外段基因片段，首次PCR扩增出带有部分信号肽的mDR5片段(图2a)，第二次PCR扩增出完整的替换信号肽后的mDR5胞外段(图2b)。经琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物大小符合mDR5胞外段理论大小，为474bp。该质粒所连接的pCAGGS载体为实验室储存的已经酶切后的载体，酶切位点分别为：EcoRⅠ及NotⅠ。经酶切及酶连成功构建重组质粒并转化至DH5α感受态细胞中，涂板后挑取单克隆菌落扩大培养并进行菌液PCR(图2c)。测序后与目的序列一致，表明pCAGGS-mDR5-His重组质粒构建成功。
2.3mDR5胞外段的原核重组质粒构建
本实施例同时构建了两种不同标签的mDR5重组质粒(原核)。经琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物大小符合mDR5胞外段理论大小，均为387bp左右(图3a～b)。pGEX-6p-1及pET-32a两种载体所用酶切位点均为BamHⅠ和XhoⅠ(图3c)。经酶切及酶连成功构建重组质粒并转化至DH5α感受态细胞中，涂板后挑取单克隆菌落扩大培养并进行菌液PCR(图3d)。测序后与目的序列一致，表明pGEX-6p-1-GST-mDR5和pET-32a-TrxA-mDR5-His重组质粒构建成功。
实施例2mDR5胞外段重组蛋白的表达及纯化
1、实验方法
1.1小鼠DR5真核蛋白的转染
293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平，有利于蛋白的表达。复苏悬浮293T细胞，进行扩大培养。按照实验需求扩大到指定细胞数后，用无内毒素质粒大提试剂盒提取的质粒(pCAGGS-mDR5-His重组质粒)进行瞬转，转染后24h补料，之后每天检测细胞活率，培养6～7天细胞活率开始降低时，离心收集细胞上清。
1.2小鼠DR5原核蛋白的诱导表达
将转化DH5α后扩大培养的大肠杆菌过夜培养后提取质粒，将所得质粒(pGEX-6p-1-GST-mDR5及pET-32a-TrxA-mDR5-His重组质粒)转化至BL21(DE3)中，涂板后挑取单克隆菌株后扩大培养至10mL。将10mL扩大培养后的菌液转入1L氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养至OD 0.6～0.8之间。此时取出1mL菌液作为诱导前对照。然后在培养基中1：1000添加IPTG，诱导过夜。以pET-32a为载体的mDR5诱导条件为16℃，170rpm。以pGEX-6p-1为载体的mDR5诱导条件为25℃，170rpm。诱导过夜后，取出1mL作为诱导后对照。剩下的菌液在超低温离心机中5000rpm，4℃，离心30min。离心后弃上清，用1×PBS重悬菌液。将重悬后的菌液移入100mL小烧杯中，冰上超声。超声条件：变幅杆10，超声6s，停9s，功率37％，超声10min。超声后将菌液移至50mL离心管中，8000rpm，4℃，离心30min。离心后分离上清及沉淀，用SDS-PAGE验证蛋白表达情况。
1.3小鼠DR5重组蛋白的纯化
(1)真核蛋白纯化前处理：收集离心后的细胞上清，用0.45μm的滤器过滤后放置于冰上等待上机。
(2)原核蛋白纯化前处理：将菌液超声并离心后收集上清，用0.45μm的滤器过滤放置于冰上等待上机。
(3)纯化步骤：打开蛋白纯化仪器及电脑软件，用水冲洗纯化仪管路。将流速调整为1mL/min并连接纯化柱，连接完成后继续用水清洗管路及纯化柱5～10个柱体积，流速为5mL/min。用Elution buffer清洗柱子中可能存在的残留蛋白5～10个柱体积，流速为5mL/min。用Binding buffer平衡柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。将上样管路置于待纯化样品中进行上样，流速为5mL/min。上样完成后继续使用Binding buffer平衡柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。用Elution buffer对已挂柱蛋白进行洗脱，当UV升高时开始收集，UV降至基线水平停止收集。继续用Elution buffer清洗管路及柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。用水清洗管路及柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。用20％乙醇清洗管路及柱子5～10个柱体积，并将柱子及管路保存在20％乙醇中。将流速调整为1mL/min，取下纯化柱存放于4℃冰箱。保存纯化结果，并关闭电脑及纯化仪。经SDS-PAGE验证、浓缩置换后用BCA法测定蛋白浓度。
2、实验结果
2.1mDR5-His真核重组蛋白的表达及纯化
本实施例将所构建的mDR5真核表达质粒(pCAGGS-mDR5-His重组质粒)转染293T细胞，待细胞活率下降后收取上清并上机纯化。收集纯化各阶段的样品对mDR5-His真核表达蛋白进行鉴定。mDR5-His真核表达蛋白理论分子量大小为15kDa，但由于该蛋白存在糖基化修饰，其实际大小为25～30kDa左右。SDS-PAGE结果显示该蛋白条带较弥散，符合糖基化蛋白的特点，条带大小在25～35kDa之间与预期相符且纯度大于90％(图4a～c)。每100mL293T细胞上清可获得3.75mg重组蛋白。以上数据表明mDR5-His真核表达蛋白制备成功。
2.2GST-mDR5及mDR5-His原核重组蛋白的诱导表达及纯化
将所构建不同标签的mDR5原核质粒(pGEX-6p-1-GST-mDR5及pET-32a-TrxA-mDR5-His)转化BL-21(DE3)感受态细胞后进行诱导表达。GST-mDR5及mDR5-His诱导表达条件均为：0.1mM IPTG，16℃，170rpm，12～16h。超声碎菌后经SDS-PAGE发现两种不同标签的mDR5蛋白均有可溶性表达和包涵体表达两种形式。收集碎菌后的上清进行纯化并收集纯化各阶段的样品对两种mDR5原核重组蛋白进行鉴定。GST-mDR5原核蛋白理论分子量大小为41kDa，SDS-PAGE结果与理论分子量相符，进行梯度洗脱后在50％及100％洗脱时纯度较高(图5a～c)。mDR5-His原核表达蛋白理论分子量大小为32.9kDa，SDS-PAGE结果与预期相符且纯度大于90％(图5d～f)。每升菌液可纯化出1mg mDR5-His或4mg GST-mDR5。以上数据表明GST-mDR5及mDR5-His原核表达蛋白制备成功，考虑到原核表达更加经济实惠，本发明选择mDR5-His原核表达蛋白作为免疫原进行下一步动物免疫。
实施例3抗小鼠DR5单克隆抗体的制备与类型鉴定
1、实验方法
1.1动物免疫
将免疫用抗原(mDR5-His原核蛋白)稀释至2mg/mL，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫使用弗氏不完全佐剂，共免疫三次，每次200μg/只。免疫三次后腹腔注射不加佐剂的免疫用蛋白200μg/只进行冲击免疫。抗原乳化方式如下：分别将抗原和等量的佐剂吸入两只注射器中并将两只注射剂连接抗原乳化接头。先从抗原侧推向佐剂侧，反复推打，直至注射器阻力变大，难以推动为止。将乳化后的乳状物推打到一只注射器中并连接针头，将乳化后的乳状物滴一滴至水面，乳状物不散为乳化成功。免疫前取动物全血并分离血清作为血清效价检测的阴性对照。
1.2Wistar大鼠血清抗体效价的检测
大鼠血清抗体效价检测从二次免疫后一周开始进行第一次检测，后续每次免疫后一周均进行血清效价检测，对免疫后大鼠眼框取血，将收集的全血室温静置2h后，3000rpm，4℃，离心10min。离心后收集血清备用，血清可-20℃保存。采用间接ELISA的方式进行检测：
(1)抗原包被：用包被液稀释抗原至1μg/mL，每孔100μL，4℃过夜包被。将包被好的板子拿出，甩出包被液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(2)封闭：用封闭液配制5％脱脂牛奶，200μL/孔，37℃孵育2h。2h后甩出封闭液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(3)一抗孵育：将免疫后大鼠的血清按照1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000进行稀释，阴性血清稀释比例为1：1000，每孔100μL，37℃孵育1h。1h后甩出一抗液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(4)二抗孵育：以抗大鼠IgG为二抗，稀释比例1：10000，每孔100μL，37℃孵育1h。1h后甩出二抗液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(5)显色：用TMB单组份显色液显色，每孔100μL，显色10min。
(6)终止：用2M H2SO4作为终止液，每孔50μL，在全波长酶标仪上检测各孔OD450值。其中，OD值判定方法如下：按照P/N≥2.1为阳性。
1.3细胞融合
(1)SP2/0细胞的准备
细胞融合前2周复苏小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，先用8-Ag筛选一周，一周后换成完全培养基扩大培养。具体步骤为：水浴锅37℃预热，从液氮罐中取出冻存的小鼠骨髓瘤细SP2/0，在水浴锅中快速融化，在生物安全柜中打开冻存管，将冻存管中的细胞悬液移入15mL离心管中，500rpm，离心5min。离心后去上清，用带有8-Ag的完全培养基重悬细胞，均匀铺在T25瓶内。在培养瓶上标记清楚复苏日期、细胞名称等信息后，放入37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中，24h后观察细胞状态并换液。用8-Ag筛选一周后更换为完全培养基扩大培养。融合时选择状态较好的骨髓瘤细胞使用，使用移液器去除细胞上清后在培养皿中加入不完全培养基，吹打细胞使细胞悬浮，收集细胞至15mL离心管，500rpm，离心5min，去除细胞上清再用提前预热(37℃)的不完全培养基重悬，重复洗三次，充分去除细胞中的血清成分，最后用适量提前预热的不完全培养基重悬细胞，并对细胞悬液进行计数备用。
(2)饲养层细胞的准备
融合前一天下午或晚上开始制备饲养层细胞，常用的饲养层细胞有腹腔巨噬细胞、脾细胞及胸腺细胞。脾细胞数量较多，一只小鼠脾细胞即可铺5～10块96孔板，较为经济实惠，故本次抗体制备选择脾细胞作为饲养细胞。具体制备步骤如下：将小鼠脱颈致死，脱颈时需要注意减少对小鼠腹部压迫，以防损伤腹腔血管以及肠道，腹腔脏器损伤会增加脾细胞污染风险。将小鼠浸泡在75％酒精中，浸泡5min。取无菌的细胞培养皿，皿中倒入适量的不完全培养基备用。5min后提起小鼠尾部，在75％酒精中重复涮洗，涮洗后置于生物安全柜中。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀在小鼠剑突下剪开皮肤，注意不要损伤腹膜。然后用手捏住缺口两侧将小鼠腹壁充分撕开并暴露腹膜。用新的剪刀及镊子提起腹膜并剪开缺口，然后慢慢向两侧扩大缺口范围，直至充分暴露脾脏。用新的剪刀及镊子提起脾脏并分离脾脏，将脾脏转移至带有不完全培养基的细胞培养皿中。取出一只10mL无菌注射器，用注射器针头在脾脏上反复穿刺。穿刺后用注射器抽芯不断地轻轻研磨脾脏组织碎块，直至皿中的残余组织发白后停止研磨，将培养皿中的细胞悬液用70μm滤网过滤，500g离心5min。加入5mL破红液，冰上破红5min后加入三倍体积的不完全培养基终止，500g离心5min，弃掉上清液，再按照相同的方法用不完全培养基将细胞清洗1～2次，充分去除其中的结缔组织。最后用适量的HAT培养基重悬细胞，并对细胞悬液进行计数，按照实验需要将细胞均匀的铺入96孔板中。
(3)脾细胞的准备
与饲养层细胞制备方式一致。第三次免疫后一周检测血清效价后，如效价达到预期则可进行冲击免疫，腹腔冲击免疫后4天可收取脾细胞进行融合，脾细胞制备时所用溶液均需37℃预热，且最后重悬脾细胞时所用培养基为不完全培养基，重悬后计数备用。
(4)SP2/0与脾细胞的细胞融合
根据计数结果取适量的细胞进行融合，脾细胞与SP2/0之比为10：1。按照上述比例将两种细胞在50mL离心管中混合并补加提前预热的不完全培养基至30mL，将二者充分混匀，1000rpm，离心5min，弃上清并用移液器小心吸出剩余上清。轻弹离心管底部，使细胞松散并均匀的铺在管底。左手握持离心管，将其置于37℃水浴锅中，确保细胞没于液面之下。一手轻柔且匀速的转动离心管，另一手吸取预热后的1mL 50％ PEG，缓慢滴加，边滴加边转动离心管，1min加完，加完后继续转动1min。随即用预热后的不完全培养基终止PEG的作用，共需要加入30mL不完全培养基。具体的添加步骤及时间为：第1min，添加1mL培养基。第2min，添加2mL培养基。第3min，添加3mL培养基。剩下的24mL培养基在2min内加完。边加边轻柔且匀速转动离心管，保持细胞始终没于液面之下。添加培养基终止反应后，800rpm，离心5min，弃去上清后用适量的HAT培养基轻柔的重悬细胞，并轻柔地吹打混匀。按照实验需要将细胞悬液移入大皿中并补加一定量的HAT培养基充分混匀后每孔100μL铺在96孔板中。置于温度为37℃，CO2含量为5％的温箱中进行培养。
1.4杂交瘤细胞的筛选
(1)阳性克隆筛选
融合后前3天不动，3天后首次观察细胞状态并在有杂交瘤细胞生长的孔中补加HAT培养基50μL/孔。第5天、第7天、第9天进行半换液(吸出100μL，加入120μL HAT培养基)，第12天进行全换液，第14天吸出细胞上清ELISA检测(一般情况下，细胞培养基发黄且细胞生长至培养皿底部面积的1/2时，可进行上清检测)，并将培养基换为HT培养基。如果细胞生长速度较快，可尽早进行检测并开始亚克隆，这样可有效防止细胞转阴带来的不良影响。
(2)亚克隆及建株
亚克隆前一天需要提前制备饲养层细胞，间接ELISA挑选阳性母克隆后，选择OD值高且生长状态良好的母克隆进行亚克隆。弃去96板母克隆的上清后，用不完全培养基将细胞吹打悬浮，500rpm，离心5min后弃去上清，用适量的HT培养基重悬细胞并进行细胞计数。根据计数结果，一部分扩大培养用于低温冻存，另一部分有限稀释法亚克隆。在96孔板的前四列接种2个细胞/孔、中间四列接种1个细胞/孔，最后四列接种0.5个细胞/孔。重复亚克隆2～3次，直至OD值均一且阳性率达到100％。母克隆及每次亚克隆的细胞株均应该进行及时冻存，亚克隆完成后对最后一株杂交瘤细胞进行扩大培养一部分低温冻存，另一部分进行抗体生产。
1.5单克隆抗体的类型鉴定
抗体类型鉴定以PCR的方式进行，提取单克隆杂交瘤细胞的总RNA并逆转录为cDNA后，以简并性引物克隆出抗体序列以确定类型。
1.6单克隆抗体的纯化
将所获单克隆杂交瘤细胞株扩大培养并监测细胞活率，待细胞活率开始下降时收集细胞上清，根据亚类结果选择合适的策略，除纯化buffer不同及纯化柱(Protein G)不同外，纯化方式如前所述，浓度测定采用BCA法。
1.7单克隆抗体可变区序列钓取及序列分析
选用PCR的方式进行单克隆抗体重、轻链的序列钓取。将扩大培养的单克隆细胞提取总RNA后逆转录为cDNA。以所获cDNA为模板克隆出单克隆抗体的重、轻链序列并进行测序。测序后将所获5株抗体序列通过Ig Blast、IMGT及ProtParam分析抗体的结构是否完整及V-D-J基因所属家族。
2、实验结果
2.1间接ELISA检测三次免疫后Wistar大鼠的血清效价
本实施例选择mDR5-His原核表达蛋白作为免疫原免疫2只Wistar大鼠(编号分别为P76、P77)，三次免疫后用所制备的mDR5-His真核表达蛋白及GST-mDR5原核表达蛋白包板检测Wistar大鼠血清效价。免疫三次后P76号鼠血清效价为1：64000，P77号鼠血清效价为1：256000，高于P76号鼠(图6)，本实施例选择P77号鼠进行下一步冲击免疫。
2.2细胞融合
在冲击免疫后第3天制备饲养层细胞，第4天进行细胞融合，在PEG-1450的介导下进行SP2/0及免疫后大鼠脾细胞的细胞融合，融合后5天可观察到孔板中出现零散的细胞，表明细胞融合成功。
2.3阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆化
融合后第14天在显微镜下观察长有细胞团的培养孔并计数，用间接ELISA检测杂交瘤细胞上清中是否存在抗小鼠DR5抗体，细胞融合时共计铺板20块，长有细胞团的孔共有299个，分别用mDR5-His真核蛋白及GST-mDR5原核蛋白作为包被抗原来筛选杂交瘤细胞上清，经ELISA检测OD＞1.0的阳性孔共有155个，融合率51.8％。挑选15株OD值较高的杂交瘤细胞母克隆进行亚克隆，亚克隆过程中10株母克隆细胞转阴，剩余5株杂交瘤细胞均经过2～3次亚克隆，最后获得5株单克隆细胞株，分别命名为1B5、9D1、12A11、17B1、6A11。
2.4单克隆抗体的类型鉴定
对5株单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，提取杂交瘤细胞总RNA并进行逆转录，然后采用PCR的方式对5株抗体的类型进行鉴定，经过序列比对初步得知，所获5株抗体均应属于IgG1亚类，轻链均应属于Kappa亚型(表6)。
表6抗小鼠DR5单克隆抗体的类型鉴定
2.5抗小鼠DR5单克隆抗体的纯化
将所获单克隆杂交瘤细胞扩大培养并体外摇瓶生产，收集杂交瘤细胞上清。根据亚型鉴定结果选用Protein G柱纯化并收集纯化各阶段的样品对杂交瘤细胞上清纯化结果进行鉴定，SDS-PAGE检测杂交瘤上清洗脱液中可见清晰的两条带，分别为抗小鼠DR5抗体的重链和轻链，重链大小为50kDa左右，轻链大小为25kDa左右，与理论大鼠抗体分子量相符且纯度大于90％，表明成功纯化出5株纯度较高的单克隆抗体1B5、9D1、12A11、17B1、6A11(图7a～h)。其中，单克隆抗体6A11的序列信息如表7所示。
表7单克隆抗体6A11的序列
实施例4单克隆抗体的特异性鉴定
1、实验方法
1.1蛋白ELISA检测单克隆抗体特异性
ELISA检测方法如前所述，包被抗原分别为真核mDR5-His(1μg/mL)及两种His-Tagprotein(1μg/mL)，所用抗体为如前所述的自制抗小鼠DR5单克隆抗体，所用抗体浓度均为1μg/mL。
1.2Western blot检测单克隆抗体对天然DR5蛋白的识别
选用的细胞系分别为293T、AC16、H9C2及SP2/0细胞，分别为人肾上皮细胞、人心肌细胞、大鼠心肌细胞及小鼠骨髓瘤细胞。
所用天然DR5蛋白采用提取的细胞总蛋白，具体方式如下：将所用细胞从培养箱中取出，弃去细胞上清并用PBS洗两次，Western blot裂解液分别加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂按照50：1的比例进行添加。将配置好的裂解液加入培养皿中，冰上裂解30min。用细胞刮将细胞刮下并用移液枪将细胞悬液吸出放置于2mL EP管中，12000rpm，10min离心。离心后吸出上清放置于新的EP管中，并进行BCA定量。定量后加入适当体积的PBS及5×loadingbuffer并在沸水中煮10min，放入-20℃保存备用。
Western blot检测目的蛋白表达情况：配制12％的SDS-PAGE胶，将所制备的样品取出并重新沸水煮5min。将胶固定在电泳内槽中，倒入适量的1×电泳液并进行上样。上样后将电泳内槽置于电泳外槽中并在外槽中倒入适量的1×电泳液。盖上电泳槽的盖子并将其连接到电泳仪上，80V电泳至蛋白Marker充分散开后，将电压调节至120V继续电泳直至溴酚蓝泳至胶板底部。取出电泳完毕的胶，PVDF膜预先浸泡在甲醇中激活1min，转膜液提前遇冷。将胶和PVDF膜放入转膜夹，转膜夹放入转膜槽，在转膜槽中倒入适量的转膜液并放入冰袋，盖好转膜槽的盖子，保证正负极放置正确，将转膜槽放置于冰上，300mA，转膜100min。转膜结束后将膜取出放入5％脱脂牛奶中进行封闭处理，封闭时间为2h。封闭结束后选择所需的一抗(自制抗小鼠DR5单克隆抗体，所用抗体浓度均为1μg/mL)4℃孵育过夜。TBST洗膜三次，每次10min。选择所需二抗(1：10000稀释)室温孵育2h，TBST洗膜三次，每次10min。最后在全自动化学发光仪中进行扫描。
免疫荧光检测目的蛋白表达情况：常规培养AC16细胞，待细胞生长至80％左右，提前一天接种至已提前放入细胞爬片的12孔板中，待细胞生长至80％左右进行处理。具体步骤如下：弃去孔板中的培养基，用1×PBS洗两次，每次5min。在孔板中加入4％多聚甲醛溶液固定细胞20min，1×PBS洗三次，每次5min。加入0.2％ Triton-X100(PBS配制)，室温透化细胞10min，1×PBS洗三次，每次5min。加入5％ BSA溶液室温封闭1h。然后加入抗小鼠DR5单克隆抗体(5μg/mL)，4℃孵育过夜。第二天取出后弃去孔板中的抗体，1×PBS洗三次，每次5min。加入Aleax Flour594标记的羊抗大鼠IgG(1：500稀释)，室温避光孵育1h，1×PBS洗三次，每次5min。DAPI(1μg/mL)染核，室温避光孵育10min，1×PBS洗三次，每次5min。在盖玻片上滴加抗荧光衰减剂，将细胞爬片正面朝下放置在盖玻片上。用正置荧光显微镜进行阅片。
2、实验结果
采用间接ELISA的方式对单克隆抗体的特异性进行鉴定，分别包被两种不同的His-Tag无关蛋白及mDR5-His真核蛋白，结果显示所获抗体仅与mDR5-His结合，不与其他His-Tag protein结合(图8a)，表明所述5株抗体特异性较高。
采用Western blot的方式检测抗体对内源蛋白识别情况，分别提取了AC16、293T、H9C2及SP2/0细胞的总蛋白检测单克隆抗体对人、大鼠、小鼠三物种DR5的识别情况，12A11可用于Western blot检测内源DR5蛋白，且可同时识别人、小鼠两物种的DR5蛋白(图8b)。采用免疫荧光的方式检测抗体对内源蛋白识别情况，本发明所获5株抗体均可识别AC16细胞表达的DR5(图8c)。表明所述5株单抗特异性强且可用于ELISA、Western blot及免疫荧光。
实施例5单克隆抗体的亲和力鉴定
1、实验方法
用mDR5-His真核蛋白(1μg/mL)包被96孔板，5株抗体均从100nM十倍稀释8个浓度梯度作为一抗，PBS作为对照，抗体所用浓度均为1μg/mL，按照如前所述的ELISA步骤进行操作，检测出OD值后将其输入GraphPad Prism进行绘图并进行非线性拟合，计算所得EC50值作为单克隆抗体亲和力。
2、实验结果
以真核mDR5-His重组蛋白(1μg/mL)包被96孔板，抗小鼠DR5单克隆抗体分别以100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM、0.0001nM、0.00001nM 8个浓度梯度对单克隆抗体亲和力进行检测。横坐标为抗体浓度的对数，纵坐标为OD450值，用Graphpad prism 8.0进行非线性拟合，所得EC50值即为抗体亲和力(图9)。结果显示，5株抗小鼠DR5单克隆抗体与真核mDR5-His重组蛋白结合呈现浓度依赖性且结合活性较高。本发明所获5株单克隆抗体EC50值均为nM级别，表明所述5株抗体亲和力均较高(表8)。
表8ELISA检测抗小鼠DR5单克隆抗体的EC50值统计表
实施例6单克隆抗体的灵敏度鉴定
1、实验方法
1.1蛋白ELISA检测单克隆抗体灵敏度
ELISA检测步骤如前所述，包被抗原(mDR5-His真核表达蛋白)浓度从1μg/mL倍比稀释7个浓度梯度，抗体所用浓度均为1μg/mL。
1.2Western blot检测单克隆抗体灵敏度
Western blot检测步骤如前所述，抗原样品(mDR5-His真核表达蛋白)浓度从1μg倍比稀释9个浓度梯度，抗体所用浓度均为1μg/mL。
2、实验结果
亲和力是反应抗原抗体结合的直接指标，但并不是亲和力越高在实际应用过程中效果就越好。为了进一步测定抗体在实际应用中的灵敏度，本发明用mDR5真核蛋白作为包被抗原或Western blot检测样品，包被浓度从1μg/mL倍比稀释至0.015625μg/mL，分别加入所述5株不同的单克隆抗体检测灵敏度，结果显示，5株抗体在0.015625μg/mL的包被抗原时仍可识别(图10a)。Western blot上样浓度从1μg倍比稀释至0.00390625μg，结果显示，1B5可识别至0.03125μg，6A11可识别至0.125μg，9D1、12A11、17B1可识别至0.0625μg(图10b～f)。以上结果表明本发明制备得到的5株单克隆抗体均有较好的灵敏度。

Claims (10)

1.一种抗DR5的抗体，其特征在于，所述抗体包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中3个互补决定区HCDR1-3和如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的3个互补决定区LCDR1-3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，当按照IMGT编号方案对所述抗体CDRs进行定义时，所述抗体包含如下CDRs序列：
(i)重链可变区中3个互补决定区HCDR1-3分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示；
(ii)轻链可变区中的3个互补决定区LCDR1-3分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11所示。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，当按照Kabat编号方案对所述抗体CDRs进行定义时，所述抗体包含如下CDRs序列：
(i)重链可变区中3个互补决定区HCDR1-3分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6所示；
(ii)轻链可变区中的3个互补决定区LCDR1-3分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14所示。
4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含的重链可变区和轻链可变区的序列如下：
(a)所述重链可变区如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少70％序列同一性；
(b)所述轻链可变区如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少70％序列同一性。
5.一种编码权利要求1-4中任一项所述抗体的多核苷酸；
优选地，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
优选地，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
6.一种包含权利要求5所述多核苷酸的载体；
优选地，所述载体包括质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒；
更优选地，所述载体含有以下任意一种或多种控制表达的元件：启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件、报告基因、复制起始位点。
7.一种包含权利要求6所述载体的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞；
更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；
最优选地，所述哺乳动物细胞包括HEK293细胞、CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HeLa细胞、A549细胞、293T细胞、COS细胞、BHK细胞。
8.一种检测DR5的试剂盒或药物组合物，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4中任一项所述的抗体；
优选地，所述抗体为标记抗体；
更优选地，所述标记抗体的标记物包括生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂、纳米颗粒类标记物；
最优选地，所述荧光染料包括荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物、ATTOTM系列染料、TYE系列染料、量子点、蛋白类染料及其衍生物；
最优选地，所述催化底物显色的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氧酶；
最优选地，所述放射性同位素包括212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu、18F；
最优选地，所述化学发光试剂包括鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物、过氧草酸盐及其衍生物；
最优选地，所述纳米颗粒类标记物包括纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒、稀土络合物纳米颗粒；
最优选地，所述胶体包括胶体金属、分散型染料、染料标记的微球、染料标记的乳胶；
最优选地，所述胶体金属包括胶体金、胶体银、胶体硒；
优选地，所述药物组合物包含权利要求1-4中任一项所述的抗体。
9.权利要求1-4中任一项所述的抗体、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的载体和/或权利要求7所述的宿主细胞在非诊断目的地检测DR5蛋白中的应用、在制备用于检测DR5蛋白的产品中的应用或在制备用于治疗DR5相关疾病的药物中的应用。
10.一种体外检测DR5蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-4中任一项所述的抗体或权利要求8中所述的试剂盒与待测样品接触，检测DR5蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。
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