CN117534757A - 一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段和应用 - Google Patents

一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段和应用，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1‑3、SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1‑3，其具有优异的特异性、亲和力和灵敏度，可应用于ELISA检测、Western blot检测、免疫荧光检测、流式检测和IHC检测等多种检测方法。

Description

一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段和应用，所述靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段为17B1。
背景技术
随着TRAIL/DR5(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体/死亡受体5)研究的不断深入，越来越多的研究表明TRAIL/DR5通路与缺血/缺氧性疾病的诊断和治疗密切相关，例如：DR5在心肌缺血再灌注损伤后表达升高，sDR5-Fc融合蛋白竞争性结合TRAIL可阻断TRAIL/DR5所诱导的凋亡途径，减少心梗面积，改善心功能。在烧伤所致的急性肾损伤中，TRAIL和DR5表达上调，腹腔注射可溶性DR5蛋白可显著减少肾脏细胞凋亡，减轻肾功能障碍。在肝细胞系缺复氧处理后，DR5 mRNA表达水平上调。在缺血缺氧脑病中，DR5在脑组织中的表达也呈现上调的趋势。因此，设计并制备TRAIL/DR5通路相关抗体，可在众多疾病相关指标检测及治疗中发挥重大的价值。除激动型DR5抗体外，关于DR5抑制型抗体的相关报道较少，但无论是针对肿瘤的激动型抗体，或者是具有结合活性的检测型抗体，对于推动TRAIL/DR5通路的研究均具有重要的意义。
目前，市面上的DR5抗体大多是以DR5死亡结构域中的一段序列所制备的多肽作为免疫原，因物种间死亡结构域的高同源性，这些抗体通常可同时用于人、大鼠和小鼠的免疫实验中。虽能满足大多数实验需求，但该类抗体无法识别DR5胞外段。少数以人DR5胞外段为免疫原所制备的单克隆抗体只能识别人源DR5蛋白且适用的免疫实验较为局限，本领域尚缺乏能够应用于多种免疫检测方法且能够有效识别DR5胞外段蛋白的单克隆抗体。制备针对DR5胞外段的特异性抗体可满足许多的检测需求，例如：抗体标记活体成像、抗体生物素化后通过双抗夹心ELISA检测血浆中DR5的表达量以及对DR5胞外段蛋白的纯化验证等，其中抗体标记活体成像技术的应用可准确的观察到疾病发生、发展过程中DR5在体内的富集位置，这也是识别DR5胞内段的单抗无法做到的，对TRAIL/DR5通路相关疾病的研究有着重要的意义。
发明内容
针对上述技术问题，本申请通过蛋白表达与纯化获得了纯度较高的小鼠DR5胞外段蛋白，以其作为免疫原免疫大鼠制备得到了特异性抗小鼠DR5单克隆抗体17B1，进一步通过实验验证发现，该抗体能够特异性识别DR5，且表现出优异的特异性、亲和力和灵敏度，可应用于ELISA检测、Western blot检测、免疫荧光检测、流式检测和IHC检测等多种检测方法。因此，本申请至少包括如下目的：
本申请的第一目的是提供一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段，及其相关衍生产品。
本申请的第二目的是提供上述抗体或其抗原结合片段在检测死亡受体5方面的应用，包括定性和定量检测等。
为了实现上述目的，本申请具体采用了以下技术方案：
本申请首先提供了一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3、SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
进一步，所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示或分别如SEQ IDNO:4-6所示；
优选地，所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9-11所示或分别如SEQ IDNO:12-14所示。
进一步，所述重链可变区序列、轻链可变区序列选自如下组：
(a)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性；
(b)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段的功能变体同样包含在本发明的保护范围内，所述“功能性变体”是指与亲本抗体相比具有明显或显著序列同一性或相似性的蛋白，所述功能性变体保留了亲本抗体的生物活性。功能性变体涵盖例如本文中所述抗体(亲本抗体)的以下变体，其与亲本抗体相比在类似程度上、在相同程度上或在更高程度上保留识别靶细胞的能力。参考亲本抗体，功能性变体可例如与亲本抗体在氨基酸序列方面具有至少约30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。
进一步，功能性变体可例如包含具有至少一个保守性氨基酸替换的亲本抗体的氨基酸序列。作为替选或补充，功能性变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸替换的亲本抗体的氨基酸序列。在这种情况下，非保守性氨基酸替换优选不干扰或抑制功能性变体的生物活性。非保守性氨基酸替换可增强功能性变体的生物活性，使得与亲本抗体相比，功能性变体的生物活性提高。
进一步，保守性氨基酸替换是本领域已知的，并且包括其中将一个具有特定物理和/或化学特性的氨基酸交换为另一个具有相同或相似化学或物理特性的氨基酸替换。例如，保守性氨基酸替换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸替换另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸替换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸替换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷氨基酸替换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr等)、具有β支化侧链的氨基酸替换另一个具有β支化侧链的氨基酸(例如，He、Thr和Val)、具有芳香族侧链的氨基酸替换另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如采用定向进化和点突变的方法，对本发明所述抗体或其抗原结合片段对应的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明所述抗体或其抗原结合片段对应的核苷酸序列70％或70％以上同源性的核苷酸，只要编码本发明上述抗体或其抗原结合片段，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列，同样包含在本发明的保护范围内。
在本发明中，采用任何CDR编号方案(现有的CDR编号方案或将来产生的新的CDR编号方案)分别对如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3进行定义、对如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1-3进行定义得到的HCDR1-3、LCDR1-3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。
在具体实施方案中，所述HCDR1-3、LCDR1-3是根据IMGT编号方案、Kabat编号方案、Chothia编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种对如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区进行定义或任意多种(两种或两种以上)组合对如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区进行定义得到的，经上述定义方式定义得到的HCDR1-3、LCDR1-3对应的抗体的序列包含在本发明的保护范围内。
在本申请中所使用的，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在本申请中所使用的，术语“单克隆抗体”是指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，不涉及其制备的方法。单克隆抗体或其免疫活性片段可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术等或其它本领域已知的生产技术来产生。
本发明还提供了上述抗体或其抗原结合片段如下任一应用：
(1)上述抗体或其抗原结合片段在死亡受体5蛋白的检测、鉴定或筛选中的应用；
(2)上述抗体或其抗原结合片段在制备死亡受体5蛋白的检测、鉴定或筛选产品中的应用；
(3)上述抗体或其抗原结合片段在制备死亡受体5相关疾病的诊断产品或伴随诊断产品中的应用；
优选地，所述检测包括定量检测、定性检测；
更优选地，所述检测包括免疫原性检测；
最优选地，所述检测的方式包括ELISA检测、Western blot检测、免疫荧光检测、流式检测、IHC检测。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸。
进一步，所述多核苷酸编码上述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，所述多核苷酸可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸；并且其可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，代替在未经修饰寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，在一些情况下对核酸而言，包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换可以是合适的，因此，这些插入、缺失、倒位和/或替换形成的核酸同样在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种重组载体。
进一步，所述重组载体包含上述多核苷酸；
优选地，所述重组载体还包含调控序列；
更优选地，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子或其任意组合；
优选地，所述重组载体包括表达载体、克隆载体。
在一些实施方案中，可用于本发明的载体的实例包括但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、病毒来源的载体。可选用本领域已知的各种载体，例如选用市售的载体，然后将编码上述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列可操作性地连于表达调控序列上形成表达载体。在一些实施方案中，所述病毒来源的载体包括但不限于：慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体、乳头状瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。
在一些实施方案中，所述表达载体可包含表达调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，所述表达调节序列对需向其中引入载体的宿主细胞的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，这视情况而定并且考虑载体是基于DNA还是基于RNA。重组表达载体可包含限制性位点以利于克隆。
在一些实施方案中，所述表达载体还可包含一个或更多个允许选择转化或转染的宿主细胞的标记基因。标记基因包括杀生物剂抗性(例如针对抗生素、重金属等的抗性)；营养缺陷型宿主中提供原养型的互补等等。用于本发明表达载体的合适的标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
本发明还提供了一种宿主细胞。
进一步，所述宿主细胞包含上述重组载体；
优选地，所述宿主细胞为将上述重组载体引入到宿主细胞中制备得到；
更优选地，所述引入的方式包括物理方法、化学方法、生物方法；
最优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
最优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述生物方法包括DNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞。在一些实施方案中，所述真核细胞包括但不限于：哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。所述原核细胞包括但不限于：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。在一些实施方案中，用于表达本发明所述抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。
本发明还提供了一种检测产品。
进一步，所述检测产品包含上述抗体或其抗原结合片段、上述多核苷酸或上述重组载体中的一种或多种；
优选地，所述检测产品包括试剂盒；
更优选地，所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、流式分选试剂盒、IHC检测试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等，在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于溶解待测样品的裂解介质、检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明还提供了一种非诊断目的地检测死亡受体5蛋白的方法,所述方法包括如下步骤：将上述抗体或其抗原结合片段或上述检测产品与待测样品接触，检测待测样品中死亡受体5蛋白与所述抗体或其抗原结合片段免疫复合物的形成。
本发明还提供了一种诊断死亡受体5相关疾病的方法，所述方法包括将上述抗体或其抗原结合片段和/或上述检测产品对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应检测死亡受体5的存在情况，以诊断受试者是否患有死亡受体5相关疾病或患死亡受体5相关疾病的风险。
本发明还提供了一种治疗死亡受体5相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的上述抗体或其抗原结合片段施用于有需要的受试者。
本发明还提供了如下任一方面应用：
(1)上述宿主细胞在制备上述抗体或其抗原结合片段中的应用；
(2)上述多核苷酸、上述重组载体、上述宿主细胞和/或上述检测产品在制备用于检测死亡受体5蛋白的产品或用于诊断死亡受体5相关疾病的产品中的应用；
(3)上述抗体或其抗原结合片段、上述多核苷酸、上述重组载体和/或上述宿主细胞在制备用于治疗死亡受体5相关疾病的药物组合物中的应用。
附图说明
图1为小鼠DR5胞外段蛋白亲疏水性及抗原表位分析，其中，(a)小鼠DR5胞外段蛋白亲疏水性分析；(b)小鼠DR5胞外段蛋白抗原表位分析；
图2为mDR5胞外段真核质粒构建，其中，(a)pCAGGS-mDR5-His PCR产物(引物为：F2及R)；(b)pCAGGS-mDR5-His PCR产物(引物为：F1及R)；(c)pCAGGS-mDR5-His菌液PCR；
图3为mDR5胞外段原核质粒构建，其中，(a)pGEX-6p-1-GST-mDR5 PCR产物；(b)pET-32a-mDR5-His PCR产物；(c)pGEX-6p-1及pET-32a载体双酶切；(d)pGEX-6p-1-GST-mDR5及pET-32a-mDR5-His菌液PCR；
图4为mDR5-His真核重组蛋白表达纯化，其中，(a～b)mDR5-His真核重组蛋白亲和层析纯化SDS-PAGE检测结果；(c)mDR5-His真核重组蛋白亲和层析纯化UV 280洗脱峰值及洗脱百分比；
图5为mDR5原核重组蛋白表达纯化，其中，(a～b)GST-mDR5原核重组蛋白亲和层析纯化SDS-PAGE检测结果；(c)GST-mDR5原核重组蛋白亲和层析纯化UV 280洗脱峰值及洗脱百分比；(d～e)mDR5-His原核重组蛋白亲和层析纯化SDS-PAGE检测结果；(f)mDR5-His原核重组蛋白亲和层析纯化UV 280洗脱峰值及洗脱百分比；
图6为免疫后大鼠血清效价检测，其中，P76、P77为免疫大鼠耳标号，mDR5-His为真核表达蛋白，GST-mDR5为原核表达蛋白；
图7为抗小鼠DR5单克隆抗体的纯化，其中，(a)单克隆抗体6A11纯化SDS-PAGE结果；(b)单克隆抗体6A11纯化UV 280洗脱峰值；(c)单克隆抗体1B5纯化SDS-PAGE结果；(d)单克隆抗体1B5纯化UV 280洗脱峰值；(e)单克隆抗体9D1、17B1及12A11纯化SDS-PAGE结果；(f)单克隆抗体9D1纯化UV 280洗脱峰值；(g)单克隆抗体17B1纯化UV 280洗脱峰值；(h)单克隆抗体12A11纯化UV 280洗脱峰值；
图8为单克隆抗体特异性鉴定，其中，(a)间接ELISA检测单克隆抗体的特异性；(b)Western blot检测单克隆抗体识别内源蛋白情况；(c)免疫荧光检测单克隆抗体识别内源蛋白情况；
图9为单克隆抗体亲和力鉴定；
图10为单克隆抗体灵敏度鉴定，其中，(a)间接ELISA检测单克隆抗体的灵敏度；(b～f)Western blot检测单克隆抗体灵敏度(所用抗体依次为：1B5、6A11、9D1、17B1、12A11)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1mDR5胞外段重组质粒的构建
1、实验方法
1.1目的基因片段的获得
(1)DR5基因片段的选择
小鼠DR5在NCBI上显示的CDS全长为1146bp(NCBI Reference Sequence:NM_020275.4)，胞外段长度为384bp，本发明希望所制备的抗体可特异性识别小鼠DR5胞外段，因此选择了小鼠DR5胞外段全长片段作为免疫片段并在设计引物之前利用Expasy及BepiPred 2.0对小鼠DR5胞外段的亲疏水性及抗原表位进行初步分析。
(2)PCR扩增目的基因片段
所用引物序列如下，以真核质粒pcDNA3.1-mDR5-Fc为模板，反应体系如下表1所示，在PCR仪上的反应程序如下表2所示。
pCAGGS-DR5-His-F1：CGGAATTCGCCACCATGGACGCCATGAAGCGGGGCCTCTGCTGTGTTCTGCTGCTCTGCGGCGCC；
pCAGGS-DR5-His-F2：TTCTGCTGCTCTGCGGCGCCGTGTTCGTGAGTAACTCGAACCCAGCCCATAATCGTCCAG；
pCAGGS-DR5-His-R：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGC TTATGCCAAGATGCCCAAGCCGTTTTGGAGACACACTTCCG；
pET-32a-DR5-His-F：CGGGATCCAACCCAGCCCATAATCGTCCAGC；
pET-32a-DR5-His-R：CCGCTCGAGCTTATGCCAAGATGCCCAAGCCGTTTTGGAGA CACACTTC；
pGEX-6p-1-DR5-F：CGGGATCCAACCCAGCCCATAATCGTCCAGC；
pGEX-6p-1-DR5-R：CCGCTCGAGTCACTTATGCCAAGATGCCCAAGCCGTTTTGGAGACACACTTCC。
表1PCR反应体系
表2PCR反应程序
1.2目的基因片段与载体重组
(1)PCR产物核酸胶电泳及胶回收
将上述PCR扩增所得PCR产物加上10μL 6×DNA loading buffer。配制1％琼脂糖凝胶，将PCR产物全部上样，125V电压电泳25min。提前预热金属浴至50℃，在紫外切胶台上按照目的条带大小切胶，将切下的胶放入干净的EP管中。按照0.1g加100μL PN(溶胶buffer)的比例将PN加入EP管内。将EP管放入金属浴中加热，每间隔1min取下EP管温柔的上下翻转，直到胶块完全溶解。平衡DNA回收柱，将完全溶解后的溶液吸出转移至回收柱中，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃去废液。加入600μL漂洗液，静置5min，12000rpm离心1min，弃去废液，重复1次。空离1次后静置5min，完全晾干。换上新的收集管加入DNA洗脱液，静置2min，12000rpm离心2min，从收集管中收集离心所得DNA液体再次加入回收柱，静置2min，12000rpm离心2min。
(2)PCR产物及载体质粒酶切
PCR产物酶切体系如下表3所示，载体酶切体系如下表4所示，按照上述体系混合后，用移液器轻柔吹打混匀，在37℃金属浴上放置酶切3.5h。酶切后再次核酸电泳并按照上述胶回收步骤进行胶回收，根据DNA浓度及片段长度计算连接时片段和载体的用量。
表3PCR产物酶切体系
表4载体酶切体系
(3)PCR产物及载体质粒的连接
按照下表5所示的体系混合后，用移液器轻柔吹打混匀，室温连接孵育30min。
表5酶连体系
(4)连接产物的转化
从-80℃中取出DH5α感受态细胞放置于冰上。在超净工作台中将连接产物全部加入感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min。加入700μL LB培养基后在37℃，220rpm的摇床中震荡培养1h。1h后取出在超净工作台中吸出200μL菌液均匀的涂抹在带有氨苄抗性的细菌培养皿上，37℃静置培养过夜，第二天观察细菌生长状态。
(5)重组质粒的测序
挑取单克隆菌株，转入含有氨苄抗性的LB培养基中，在37℃，220rpm的条件下震荡培养3h，3h后观察细菌浑浊程度。将已培养浑浊的细菌做菌液PCR验证并核酸电泳，位置正确后送测序。
(6)质粒提取
测序正确的菌液扩大培养，真核表达的质粒应用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取。原核表达的质粒用质粒小提试剂盒提取质粒。
2、实验结果
2.1mDR5胞外段亲疏水性及抗原表位分析
本实施例首先对小鼠DR5胞外段的氨基酸序列进行了亲疏水性(图1a)及抗原表位分析(图1b)。图1a的结果表明小鼠DR5蛋白疏水区域位于蛋白质的中部区域。亲水性区域更有可能位于蛋白质表面，而疏水区域一般包裹在蛋白内部，所以，亲水性部分与蛋白的抗原表位密切相关，但是高亲水性部位不一定是表位，表位也不一定是亲水性部位。图1b的结果表明，理论上小鼠DR5胞外段可诱导免疫应答的产生。
2.2mDR5胞外段的真核重组质粒构建
本实施例对mDR5信号肽进行了替换，经过两次PCR从现有质粒模板中扩增出替换信号肽后的mDR5胞外段基因片段，首次PCR扩增出带有部分信号肽的mDR5片段(图2a)，第二次PCR扩增出完整的替换信号肽后的mDR5胞外段(图2b)。经琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物大小符合mDR5胞外段理论大小，为474bp。该质粒所连接的pCAGGS载体为实验室储存的已经酶切后的载体，酶切位点分别为：EcoRⅠ及NotⅠ。经酶切及酶连成功构建重组质粒并转化至DH5α感受态细胞中，涂板后挑取单克隆菌落扩大培养并进行菌液PCR(图2c)。测序后与目的序列一致，表明pCAGGS-mDR5-His重组质粒构建成功。
2.3mDR5胞外段的原核重组质粒构建
本实施例同时构建了两种不同标签的mDR5重组质粒(原核)。经琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物大小符合mDR5胞外段理论大小，均为387bp左右(图3a～b)。pGEX-6p-1及pET-32a两种载体所用酶切位点均为BamHⅠ和XhoⅠ(图3c)。经酶切及酶连成功构建重组质粒并转化至DH5α感受态细胞中，涂板后挑取单克隆菌落扩大培养并进行菌液PCR(图3d)。测序后与目的序列一致，表明pGEX-6p-1-GST-mDR5和pET-32a-TrxA-mDR5-His重组质粒构建成功。
实施例2mDR5胞外段重组蛋白的表达及纯化
1、实验方法
1.1小鼠DR5真核蛋白的转染
293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平，有利于蛋白的表达。复苏悬浮293T细胞，进行扩大培养。按照实验需求扩大到指定细胞数后，用无内毒素质粒大提试剂盒提取的质粒(pCAGGS-mDR5-His重组质粒)进行瞬转，转染后24h补料，之后每天检测细胞活率，培养6～7天细胞活率开始降低时，离心收集细胞上清。
1.2小鼠DR5原核蛋白的诱导表达
将转化DH5α后扩大培养的大肠杆菌过夜培养后提取质粒，将所得质粒(pGEX-6p-1-GST-mDR5及pET-32a-TrxA-mDR5-His重组质粒)转化至BL21(DE3)中，涂板后挑取单克隆菌株后扩大培养至10mL。将10mL扩大培养后的菌液转入1L氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养至OD 0.6～0.8之间。此时取出1mL菌液作为诱导前对照。然后在培养基中1：1000添加IPTG，诱导过夜。以pET-32a为载体的mDR5诱导条件为16℃，170rpm。以pGEX-6p-1为载体的mDR5诱导条件为25℃，170rpm。诱导过夜后，取出1mL作为诱导后对照。剩下的菌液在超低温离心机中5000rpm，4℃，离心30min。离心后弃上清，用1×PBS重悬菌液。将重悬后的菌液移入100mL小烧杯中，冰上超声。超声条件：变幅杆10，超声6s，停9s，功率37％，超声10min。超声后将菌液移至50mL离心管中，8000rpm，4℃，离心30min。离心后分离上清及沉淀，用SDS-PAGE验证蛋白表达情况。
1.3小鼠DR5重组蛋白的纯化
(1)真核蛋白纯化前处理：收集离心后的细胞上清，用0.45μm的滤器过滤后放置于冰上等待上机。
(2)原核蛋白纯化前处理：将菌液超声并离心后收集上清，用0.45μm的滤器过滤放置于冰上等待上机。
(3)纯化步骤：打开蛋白纯化仪器及电脑软件，用水冲洗纯化仪管路。将流速调整为1mL/min并连接纯化柱，连接完成后继续用水清洗管路及纯化柱5～10个柱体积，流速为5mL/min。用Elution buffer清洗柱子中可能存在的残留蛋白5～10个柱体积，流速为5mL/min。用Binding buffer平衡柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。将上样管路置于待纯化样品中进行上样，流速为5mL/min。上样完成后继续使用Binding buffer平衡柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。用Elution buffer对已挂柱蛋白进行洗脱，当UV升高时开始收集，UV降至基线水平停止收集。继续用Elution buffer清洗管路及柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。用水清洗管路及柱子5～10个柱体积，流速为5mL/min。用20％乙醇清洗管路及柱子5～10个柱体积，并将柱子及管路保存在20％乙醇中。将流速调整为1mL/min，取下纯化柱存放于4℃冰箱。保存纯化结果，并关闭电脑及纯化仪。经SDS-PAGE验证、浓缩置换后用BCA法测定蛋白浓度。
2、实验结果
2.1mDR5-His真核重组蛋白的表达及纯化
本实施例将所构建的mDR5真核表达质粒(pCAGGS-mDR5-His重组质粒)转染293T细胞，待细胞活率下降后收取上清并上机纯化。收集纯化各阶段的样品对mDR5-His真核表达蛋白进行鉴定。mDR5-His真核表达蛋白理论分子量大小为15kDa，但由于该蛋白存在糖基化修饰，其实际大小为25～30kDa左右。SDS-PAGE结果显示该蛋白条带较弥散，符合糖基化蛋白的特点，条带大小在25～35kDa之间与预期相符且纯度大于90％(图4a～c)。每100mL293T细胞上清可获得3.75mg重组蛋白。以上数据表明mDR5-His真核表达蛋白制备成功。
2.2GST-mDR5及mDR5-His原核重组蛋白的诱导表达及纯化
将所构建不同标签的mDR5原核质粒(pGEX-6p-1-GST-mDR5及pET-32a-TrxA-mDR5-His)转化BL-21(DE3)感受态细胞后进行诱导表达。GST-mDR5及mDR5-His诱导表达条件均为：0.1mM IPTG，16℃，170rpm，12～16h。超声碎菌后经SDS-PAGE发现两种不同标签的mDR5蛋白均有可溶性表达和包涵体表达两种形式。收集碎菌后的上清进行纯化并收集纯化各阶段的样品对两种mDR5原核重组蛋白进行鉴定。GST-mDR5原核蛋白理论分子量大小为41kDa，SDS-PAGE结果与理论分子量相符，进行梯度洗脱后在50％及100％洗脱时纯度较高(图5a～c)。mDR5-His原核表达蛋白理论分子量大小为32.9kDa，SDS-PAGE结果与预期相符且纯度大于90％(图5d～f)。每升菌液可纯化出1mg mDR5-His或4mg GST-mDR5。以上数据表明GST-mDR5及mDR5-His原核表达蛋白制备成功，考虑到原核表达更加经济实惠，本发明选择mDR5-His原核表达蛋白作为免疫原进行下一步动物免疫。
实施例3抗小鼠DR5单克隆抗体的制备与类型鉴定
1、实验方法
1.1动物免疫
将免疫用抗原(mDR5-His原核蛋白)稀释至2mg/mL，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫使用弗氏不完全佐剂，共免疫三次，每次200μg/只。免疫三次后腹腔注射不加佐剂的免疫用蛋白200μg/只进行冲击免疫。抗原乳化方式如下：分别将抗原和等量的佐剂吸入两只注射器中并将两只注射剂连接抗原乳化接头。先从抗原侧推向佐剂侧，反复推打，直至注射器阻力变大，难以推动为止。将乳化后的乳状物推打到一只注射器中并连接针头，将乳化后的乳状物滴一滴至水面，乳状物不散为乳化成功。免疫前取动物全血并分离血清作为血清效价检测的阴性对照。
1.2Wistar大鼠血清抗体效价的检测
大鼠血清抗体效价检测从二次免疫后一周开始进行第一次检测，后续每次免疫后一周均进行血清效价检测，对免疫后大鼠眼框取血，将收集的全血室温静置2h后，3000rpm，4℃，离心10min。离心后收集血清备用，血清可-20℃保存。采用间接ELISA的方式进行检测：
(1)抗原包被：用包被液稀释抗原至1μg/mL，每孔100μL，4℃过夜包被。将包被好的板子拿出，甩出包被液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(2)封闭：用封闭液配制5％脱脂牛奶，200μL/孔，37℃孵育2h。2h后甩出封闭液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(3)一抗孵育：将免疫后大鼠的血清按照1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000进行稀释，阴性血清稀释比例为1：1000，每孔100μL，37℃孵育1h。1h后甩出一抗液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(4)二抗孵育：以抗大鼠IgG为二抗，稀释比例1：10000，每孔100μL，37℃孵育1h。1h后甩出二抗液体并拍干。在全自动洗板机上用PBST洗板三次，每孔300μL/次。
(5)显色：用TMB单组份显色液显色，每孔100μL，显色10min。
(6)终止：用2M H2SO4作为终止液，每孔50μL，在全波长酶标仪上检测各孔OD450值。其中，OD值判定方法如下：按照P/N≥2.1为阳性。
1.3细胞融合
(1)SP2/0细胞的准备
细胞融合前2周复苏小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，先用8-Ag筛选一周，一周后换成完全培养基扩大培养。具体步骤为：水浴锅37℃预热，从液氮罐中取出冻存的小鼠骨髓瘤细SP2/0，在水浴锅中快速融化，在生物安全柜中打开冻存管，将冻存管中的细胞悬液移入15mL离心管中，500rpm，离心5min。离心后去上清，用带有8-Ag的完全培养基重悬细胞，均匀铺在T25瓶内。在培养瓶上标记清楚复苏日期、细胞名称等信息后，放入37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中，24h后观察细胞状态并换液。用8-Ag筛选一周后更换为完全培养基扩大培养。融合时选择状态较好的骨髓瘤细胞使用，使用移液器去除细胞上清后在培养皿中加入不完全培养基，吹打细胞使细胞悬浮，收集细胞至15mL离心管，500rpm，离心5min，去除细胞上清再用提前预热(37℃)的不完全培养基重悬，重复洗三次，充分去除细胞中的血清成分，最后用适量提前预热的不完全培养基重悬细胞，并对细胞悬液进行计数备用。
(2)饲养层细胞的准备
融合前一天下午或晚上开始制备饲养层细胞，常用的饲养层细胞有腹腔巨噬细胞、脾细胞及胸腺细胞。脾细胞数量较多，一只小鼠脾细胞即可铺5～10块96孔板，较为经济实惠，故本次抗体制备选择脾细胞作为饲养细胞。具体制备步骤如下：将小鼠脱颈致死，脱颈时需要注意减少对小鼠腹部压迫，以防损伤腹腔血管以及肠道，腹腔脏器损伤会增加脾细胞污染风险。将小鼠浸泡在75％酒精中，浸泡5min。取无菌的细胞培养皿，皿中倒入适量的不完全培养基备用。5min后提起小鼠尾部，在75％酒精中重复涮洗，涮洗后置于生物安全柜中。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀在小鼠剑突下剪开皮肤，注意不要损伤腹膜。然后用手捏住缺口两侧将小鼠腹壁充分撕开并暴露腹膜。用新的剪刀及镊子提起腹膜并剪开缺口，然后慢慢向两侧扩大缺口范围，直至充分暴露脾脏。用新的剪刀及镊子提起脾脏并分离脾脏，将脾脏转移至带有不完全培养基的细胞培养皿中。取出一只10mL无菌注射器，用注射器针头在脾脏上反复穿刺。穿刺后用注射器抽芯不断地轻轻研磨脾脏组织碎块，直至皿中的残余组织发白后停止研磨，将培养皿中的细胞悬液用70μm滤网过滤，500g离心5min。加入5mL破红液，冰上破红5min后加入三倍体积的不完全培养基终止，500g离心5min，弃掉上清液，再按照相同的方法用不完全培养基将细胞清洗1～2次，充分去除其中的结缔组织。最后用适量的HAT培养基重悬细胞，并对细胞悬液进行计数，按照实验需要将细胞均匀的铺入96孔板中。
(3)脾细胞的准备
与饲养层细胞制备方式一致。第三次免疫后一周检测血清效价后，如效价达到预期则可进行冲击免疫，腹腔冲击免疫后4天可收取脾细胞进行融合，脾细胞制备时所用溶液均需37℃预热，且最后重悬脾细胞时所用培养基为不完全培养基，重悬后计数备用。
(4)SP2/0与脾细胞的细胞融合
根据计数结果取适量的细胞进行融合，脾细胞与SP2/0之比为10：1。按照上述比例将两种细胞在50mL离心管中混合并补加提前预热的不完全培养基至30mL，将二者充分混匀，1000rpm，离心5min，弃上清并用移液器小心吸出剩余上清。轻弹离心管底部，使细胞松散并均匀的铺在管底。左手握持离心管，将其置于37℃水浴锅中，确保细胞没于液面之下。一手轻柔且匀速的转动离心管，另一手吸取预热后的1mL 50％ PEG，缓慢滴加，边滴加边转动离心管，1min加完，加完后继续转动1min。随即用预热后的不完全培养基终止PEG的作用，共需要加入30mL不完全培养基。具体的添加步骤及时间为：第1min，添加1mL培养基。第2min，添加2mL培养基。第3min，添加3mL培养基。剩下的24mL培养基在2min内加完。边加边轻柔且匀速转动离心管，保持细胞始终没于液面之下。添加培养基终止反应后，800rpm，离心5min，弃去上清后用适量的HAT培养基轻柔的重悬细胞，并轻柔地吹打混匀。按照实验需要将细胞悬液移入大皿中并补加一定量的HAT培养基充分混匀后每孔100μL铺在96孔板中。置于温度为37℃，CO2含量为5％的温箱中进行培养。
1.4杂交瘤细胞的筛选
(1)阳性克隆筛选
融合后前3天不动，3天后首次观察细胞状态并在有杂交瘤细胞生长的孔中补加HAT培养基50μL/孔。第5天、第7天、第9天进行半换液(吸出100μL，加入120μL HAT培养基)，第12天进行全换液，第14天吸出细胞上清ELISA检测(一般情况下，细胞培养基发黄且细胞生长至培养皿底部面积的1/2时，可进行上清检测)，并将培养基换为HT培养基。如果细胞生长速度较快，可尽早进行检测并开始亚克隆，这样可有效防止细胞转阴带来的不良影响。
(2)亚克隆及建株
亚克隆前一天需要提前制备饲养层细胞，间接ELISA挑选阳性母克隆后，选择OD值高且生长状态良好的母克隆进行亚克隆。弃去96板母克隆的上清后，用不完全培养基将细胞吹打悬浮，500rpm，离心5min后弃去上清，用适量的HT培养基重悬细胞并进行细胞计数。根据计数结果，一部分扩大培养用于低温冻存，另一部分有限稀释法亚克隆。在96孔板的前四列接种2个细胞/孔、中间四列接种1个细胞/孔，最后四列接种0.5个细胞/孔。重复亚克隆2～3次，直至OD值均一且阳性率达到100％。母克隆及每次亚克隆的细胞株均应该进行及时冻存，亚克隆完成后对最后一株杂交瘤细胞进行扩大培养一部分低温冻存，另一部分进行抗体生产。
1.5单克隆抗体的类型鉴定
抗体类型鉴定以PCR的方式进行，提取单克隆杂交瘤细胞的总RNA并逆转录为cDNA后，以简并性引物克隆出抗体序列以确定类型。
1.6单克隆抗体的纯化
将所获单克隆杂交瘤细胞株扩大培养并监测细胞活率，待细胞活率开始下降时收集细胞上清，根据亚类结果选择合适的策略，除纯化buffer不同及纯化柱(Protein G)不同外，纯化方式如前所述，浓度测定采用BCA法。
1.7单克隆抗体可变区序列钓取及序列分析
选用PCR的方式进行单克隆抗体重、轻链的序列钓取。将扩大培养的单克隆细胞提取总RNA后逆转录为cDNA。以所获cDNA为模板克隆出单克隆抗体的重、轻链序列并进行测序。测序后将所获5株抗体序列通过Ig Blast、IMGT及ProtParam分析抗体的结构是否完整及V-D-J基因所属家族。
2、实验结果
2.1间接ELISA检测三次免疫后Wistar大鼠的血清效价
本实施例选择mDR5-His原核表达蛋白作为免疫原免疫2只Wistar大鼠(编号分别为P76、P77)，三次免疫后用所制备的mDR5-His真核表达蛋白及GST-mDR5原核表达蛋白包板检测Wistar大鼠血清效价。免疫三次后P76号鼠血清效价为1：64000，P77号鼠血清效价为1：256000，高于P76号鼠(图6)，本实施例选择P77号鼠进行下一步冲击免疫。
2.2细胞融合
在冲击免疫后第3天制备饲养层细胞，第4天进行细胞融合，在PEG-1450的介导下进行SP2/0及免疫后大鼠脾细胞的细胞融合，融合后5天可观察到孔板中出现零散的细胞，表明细胞融合成功。
2.3阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆化
融合后第14天在显微镜下观察长有细胞团的培养孔并计数，用间接ELISA检测杂交瘤细胞上清中是否存在抗小鼠DR5抗体，细胞融合时共计铺板20块，长有细胞团的孔共有299个，分别用mDR5-His真核蛋白及GST-mDR5原核蛋白作为包被抗原来筛选杂交瘤细胞上清，经ELISA检测OD＞1.0的阳性孔共有155个，融合率51.8％。挑选15株OD值较高的杂交瘤细胞母克隆进行亚克隆，亚克隆过程中10株母克隆细胞转阴，剩余5株杂交瘤细胞均经过2～3次亚克隆，最后获得5株单克隆细胞株，分别命名为1B5、9D1、12A11、17B1、6A11。
2.4单克隆抗体的类型鉴定
对5株单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，提取杂交瘤细胞总RNA并进行逆转录，然后采用PCR的方式对5株抗体的类型进行鉴定，经过序列比对初步得知，所获5株抗体均应属于IgG1亚类，轻链均应属于Kappa亚型(表6)。
表6抗小鼠DR5单克隆抗体的类型鉴定
2.5抗小鼠DR5单克隆抗体的纯化
将所获单克隆杂交瘤细胞扩大培养并体外摇瓶生产，收集杂交瘤细胞上清。根据亚型鉴定结果选用Protein G柱纯化并收集纯化各阶段的样品对杂交瘤细胞上清纯化结果进行鉴定，SDS-PAGE检测杂交瘤上清洗脱液中可见清晰的两条带，分别为抗小鼠DR5抗体的重链和轻链，重链大小为50kDa左右，轻链大小为25kDa左右，与理论大鼠抗体分子量相符且纯度大于90％，表明成功纯化出5株纯度较高的单克隆抗体1B5、9D1、12A11、17B1、6A11(图7a～h)。其中，单克隆抗体17B1的序列信息如表7所示。
表7单克隆抗体17B1的序列
实施例4单克隆抗体的特异性鉴定
1、实验方法
1.1蛋白ELISA检测单克隆抗体特异性
ELISA检测方法如前所述，包被抗原分别为真核mDR5-His(1μg/mL)及两种His-Tagprotein(1μg/mL)，所用抗体为如前所述的自制抗小鼠DR5单克隆抗体，所用抗体浓度均为1μg/mL。
1.2Western blot检测单克隆抗体对天然DR5蛋白的识别
选用的细胞系分别为293T、AC16、H9C2及SP2/0细胞，分别为人肾上皮细胞、人心肌细胞、大鼠心肌细胞及小鼠骨髓瘤细胞。
所用天然DR5蛋白采用提取的细胞总蛋白，具体方式如下：将所用细胞从培养箱中取出，弃去细胞上清并用PBS洗两次，Western blot裂解液分别加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂按照50：1的比例进行添加。将配置好的裂解液加入培养皿中，冰上裂解30min。用细胞刮将细胞刮下并用移液枪将细胞悬液吸出放置于2mL EP管中，12000rpm，10min离心。离心后吸出上清放置于新的EP管中，并进行BCA定量。定量后加入适当体积的PBS及5×loadingbuffer并在沸水中煮10min，放入-20℃保存备用。
Western blot检测目的蛋白表达情况：配制12％的SDS-PAGE胶，将所制备的样品取出并重新沸水煮5min。将胶固定在电泳内槽中，倒入适量的1×电泳液并进行上样。上样后将电泳内槽置于电泳外槽中并在外槽中倒入适量的1×电泳液。盖上电泳槽的盖子并将其连接到电泳仪上，80V电泳至蛋白Marker充分散开后，将电压调节至120V继续电泳直至溴酚蓝泳至胶板底部。取出电泳完毕的胶，PVDF膜预先浸泡在甲醇中激活1min，转膜液提前遇冷。将胶和PVDF膜放入转膜夹，转膜夹放入转膜槽，在转膜槽中倒入适量的转膜液并放入冰袋，盖好转膜槽的盖子，保证正负极放置正确，将转膜槽放置于冰上，300mA，转膜100min。转膜结束后将膜取出放入5％脱脂牛奶中进行封闭处理，封闭时间为2h。封闭结束后选择所需的一抗(自制抗小鼠DR5单克隆抗体，所用抗体浓度均为1μg/mL)4℃孵育过夜。TBST洗膜三次，每次10min。选择所需二抗(1：10000稀释)室温孵育2h，TBST洗膜三次，每次10min。最后在全自动化学发光仪中进行扫描。
免疫荧光检测目的蛋白表达情况：常规培养AC16细胞，待细胞生长至80％左右，提前一天接种至已提前放入细胞爬片的12孔板中，待细胞生长至80％左右进行处理。具体步骤如下：弃去孔板中的培养基，用1×PBS洗两次，每次5min。在孔板中加入4％多聚甲醛溶液固定细胞20min，1×PBS洗三次，每次5min。加入0.2％ Triton-X100(PBS配制)，室温透化细胞10min，1×PBS洗三次，每次5min。加入5％ BSA溶液室温封闭1h。然后加入抗小鼠DR5单克隆抗体(5μg/mL)，4℃孵育过夜。第二天取出后弃去孔板中的抗体，1×PBS洗三次，每次5min。加入Aleax Flour594标记的羊抗大鼠IgG(1：500稀释)，室温避光孵育1h，1×PBS洗三次，每次5min。DAPI(1μg/mL)染核，室温避光孵育10min，1×PBS洗三次，每次5min。在盖玻片上滴加抗荧光衰减剂，将细胞爬片正面朝下放置在盖玻片上。用正置荧光显微镜进行阅片。
2、实验结果
采用间接ELISA的方式对单克隆抗体的特异性进行鉴定，分别包被两种不同的His-Tag无关蛋白及mDR5-His真核蛋白，结果显示所获抗体仅与mDR5-His结合，不与其他His-Tag protein结合(图8a)，表明所述5株抗体特异性较高。
采用Western blot的方式检测抗体对内源蛋白识别情况，分别提取了AC16、293T、H9C2及SP2/0细胞的总蛋白检测单克隆抗体对人、大鼠、小鼠三物种DR5的识别情况，12A11可用于Western blot检测内源DR5蛋白，且可同时识别人、小鼠两物种的DR5蛋白(图8b)。采用免疫荧光的方式检测抗体对内源蛋白识别情况，本发明所获5株抗体均可识别AC16细胞表达的DR5(图8c)。表明所述5株单抗特异性强且可用于ELISA、Western blot及免疫荧光。
实施例5单克隆抗体的亲和力鉴定
1、实验方法
用mDR5-His真核蛋白(1μg/mL)包被96孔板，5株抗体均从100nM十倍稀释8个浓度梯度作为一抗，PBS作为对照，抗体所用浓度均为1μg/mL，按照如前所述的ELISA步骤进行操作，检测出OD值后将其输入GraphPad Prism进行绘图并进行非线性拟合，计算所得EC50值作为单克隆抗体亲和力。
2、实验结果
以真核mDR5-His重组蛋白(1μg/mL)包被96孔板，抗小鼠DR5单克隆抗体分别以100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM、0.0001nM、0.00001nM 8个浓度梯度对单克隆抗体亲和力进行检测。横坐标为抗体浓度的对数，纵坐标为OD450值，用Graphpad prism 8.0进行非线性拟合，所得EC50值即为抗体亲和力(图9)。结果显示，5株抗小鼠DR5单克隆抗体与真核mDR5-His重组蛋白结合呈现浓度依赖性且结合活性较高。本发明所获5株单克隆抗体EC50值均为nM级别，表明所述5株抗体亲和力均较高(表8)。
表8ELISA检测抗小鼠DR5单克隆抗体的EC50值统计表
实施例6单克隆抗体的灵敏度鉴定
1、实验方法
1.1蛋白ELISA检测单克隆抗体灵敏度
ELISA检测步骤如前所述，包被抗原(mDR5-His真核表达蛋白)浓度从1μg/mL倍比稀释7个浓度梯度，抗体所用浓度均为1μg/mL。
1.2Western blot检测单克隆抗体灵敏度
Western blot检测步骤如前所述，抗原样品(mDR5-His真核表达蛋白)浓度从1μg倍比稀释9个浓度梯度，抗体所用浓度均为1μg/mL。
2、实验结果
亲和力是反应抗原抗体结合的直接指标，但并不是亲和力越高在实际应用过程中效果就越好。为了进一步测定抗体在实际应用中的灵敏度，本发明用mDR5真核蛋白作为包被抗原或Western blot检测样品，包被浓度从1μg/mL倍比稀释至0.015625μg/mL，分别加入所述5株不同的单克隆抗体检测灵敏度，结果显示，5株抗体在0.015625μg/mL的包被抗原时仍可识别(图10a)。Western blot上样浓度从1μg倍比稀释至0.00390625μg，结果显示，1B5可识别至0.03125μg，6A11可识别至0.125μg，9D1、12A11、17B1可识别至0.0625μg(图10b～f)。以上结果表明本发明制备得到的5株单克隆抗体均有较好的灵敏度。

Claims (10)

1.一种靶向死亡受体5的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3、SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示或分别如SEQ ID NO:4-6所示；
优选地，所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9-11所示或分别如SEQ ID NO:12-14所示。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区序列、轻链可变区序列选自如下组：
(a)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性；
(b)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。
4.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的如下任一应用：
(1)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在死亡受体5蛋白的检测、鉴定或筛选中的应用；
(2)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备死亡受体5蛋白的检测、鉴定或筛选产品中的应用；
(3)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备死亡受体5相关疾病的诊断产品或伴随诊断产品中的应用；
优选地，所述检测包括定量检测、定性检测；
更优选地，所述检测包括免疫原性检测；
最优选地，所述检测的方式包括ELISA检测、Westernblot检测、免疫荧光检测、流式检测、IHC检测。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求5所述的多核苷酸；
优选地，所述重组载体还包含调控序列；
更优选地，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子或其任意组合；
优选地，所述重组载体包括表达载体、克隆载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求6所述的重组载体；
优选地，所述宿主细胞为将权利要求6所述的重组载体引入到宿主细胞中制备得到；
更优选地，所述引入的方式包括物理方法、化学方法、生物方法；
最优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
最优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述生物方法包括DNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
8.一种检测产品，其特征在于，所述检测产品包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的多核苷酸或权利要求6所述的重组载体中的一种或多种；
优选地，所述检测产品包括试剂盒；
更优选地，所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、流式分选试剂盒、IHC检测试剂盒。
9.一种非诊断目的地检测死亡受体5蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求8所述的检测产品与待测样品接触，检测待测样品中死亡受体5蛋白与所述抗体或其抗原结合片段免疫复合物的形成。
10.如下任一方面应用：
(1)权利要求7所述的宿主细胞在制备权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段中的应用；
(2)权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的重组载体、权利要求7所述的宿主细胞和/或权利要求8所述的检测产品在制备用于检测死亡受体5蛋白的产品或用于诊断死亡受体5相关疾病的产品中的应用；
(3)权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的重组载体和/或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗死亡受体5相关疾病的药物组合物中的应用。
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