JP2001524812A

JP2001524812A - アポトーシス誘導タンパク質に対するｒｂの比率の減少による悪性細胞におけるアポトーシス細胞死の誘導方法

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Publication number: JP2001524812A
Application number: JP53617498A
Authority: JP
Inventors: ストラウス，ミカエル; サンディッグ，ヴォルカー; バーテック，ジリ; ルーカス，ジリ
Original assignee: ヘパヴェックアクチエンゲゼルシャフトフールジェンセラピー
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2001-12-04
Also published as: WO1998037190A1; ES2150891T1; EP1007662A1; AU5983198A; CN1248290A; DE1007662T1; AU732794B2; CA2283090A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、悪性疾患の治療用の組成物の製造のための、遺伝物質を含有するベクターの使用であって、該ベクターが、悪性疾患に罹患した被験者に投与されると、pRbタンパク質のリン酸化の阻害を悪性細胞において誘導することにより悪性細胞の増殖停止をまず達成した後、pRbのレベルを減少させアポトーシス誘導タンパク質のレベルを増加させることにより、悪性細胞内のアポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率を減少させることにより、悪性細胞においてアポトーシスを誘導することを特徴とする使用に関する。本発明はさらに、効率的導入のための特異的ベクターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】アポトーシス誘導タンパク質に対するRBの比率の減少による悪性細胞におけるアポトーシス細胞死の誘導方法発明の分野本発明は、ヒトなどの哺乳動物中の悪性細胞において細胞死（例えば、アポトーシス）を誘導する方法に関する。本発明はさらに、悪性細胞における増殖停止およびそれに続くアポトーシスの誘導を達成する目的で遺伝物質を導入するためのベクターの使用に関する。本発明はまた、アポトーシスによる細胞死を誘導する目的で悪性細胞内に遺伝物質を導入するためのベクターに関する。一般的背景現在のところ、ある程度の有望さを前臨床モデルにおいて示す癌遺伝子治療のための基本的戦略は、限られた数しか存在しない。主な２つの戦略は、サイトカイン遺伝子に補助される腫瘍ワクチン療法および選択的プロドラッグ活性化である。その第１の戦略は、比較的少数の遺伝的に修飾された細胞傷害性Ｔ細胞または腫瘍細胞の強力な免疫刺激効果によるものであり、第２の戦略は、酵素をコードする遺伝子により無毒性プロドラッグを毒性産物へ変換することに基づくものであり、この場合、その毒性効果は、いわゆるバイスタンダー効果により、導入されていない分裂する腫瘍細胞上においても発揮される。別法として、癌遺伝子を不活性化したり又は不活性化癌抑制遺伝子を回復させることにより、細胞の悪性表現型を逆転させる戦略が考えられる。どちらの場合も、腫瘍内の細胞への非常に効率的な遺伝子導入が要求される。遺伝子導入の高い効率は、in vitroにおいて、また、状況によってはin vivoにおいても得ることができるが、腫瘍細胞における主な癌遺伝子変化を逆転させることによる悪性表現型の矯正により、正常細胞が得られるとは考えられない。したがって、腫瘍細胞死の選択的誘導が好ましく、そのような誘導を可能にする方法の開発は非常に重要であろう。正常細胞が悪性に転じる前に、種々の癌遺伝子または癌抑制遺伝子におけるいくつかの遺伝的変化が生じているはずである。癌遺伝子または癌抑制遺伝子のほとんどは、ある割合の腫瘍に関与しているが、それらはいずれも、すべての腫瘍の発生に関与しているわけではない。細胞周期の制御などの細胞の運命についての中心的な決定には非常に限られた数の調節経路だけが関与しているという見解に関する証拠が、現在集まりつつある。多段階発癌の一般的な特徴は、各経路の成分の少なくとも１つの阻害にある。劣性癌遺伝子または癌抑制因子が存在するという見解は、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（Rb1)の単離により初めて確認された。この発見は、癌抑制因子の探索を著しく刺激した。それ以来、いくつかの他の癌抑制遺伝子が単離された。Rbl遺伝子産物pRbの機能は、細胞分裂の調節に強く関連している[GoodrichおよびLee( 1993)，Weinberg(1995)，Bartekら(1996)，HerwigおよびStrauss(1997)]。それは、初期G₁期ではリン酸化されない。非リン酸化pRbは転写因子E2Fと複合体を形成し、そのE2Fは後期G₁におけるリン酸化によりこの複合体から遊離される。このことは、その増殖抑制機能が、G0/G₁におけるE2F依存性遺伝子の活性リプレッサーの形成または正常に活性化するE2Fの隔離（sequestration）を引き起こしうるE2Fの結合に基づくことを示唆している。現在の見解は、両方の択一的メカニズムが、種々の遺伝子により又はさらには１つの同一遺伝子により機能しうるというものである。ある遺伝子の連続的な活性化は、静止状態(G_O)からG₁を経てDNA複製期(Ｓ)へ、ついで第２間期（G₂）を経て有糸分裂期（Ｍ）への進行を促進することを必要とする[Pardee(1989)]。細胞周期の各時期が、一定時間だけ活性な一定の遺伝子セットの活性を必要とすることは、明らかと考えられる。この秩序だった事象カスケードを保証するための１つのメカニズムは、転写調節体の時期特異的リン酸化および脱リン酸化である。これらの時期特異的リン酸化は、サイクリン依存性キナーゼ（cdk）と称される酵素により引き起こされる。これらのcdk触媒サブユニットは、サイクリンと称される調節サブユニットと複合体を形成する[Sherr(1 993)]。該サイクリンは、ある標的タンパク質に対する特異的結合によりcdkを活性化酵素に変換し、該キナーゼの基質特異性を決定する。該サイクリンは短寿命タンパク質であり、そのmRNAおよび／またはタンパク質レベルは細胞周期の或る時期に蓄積する。最近、サイクリン依存性キナーゼの阻害因子（CKI）である新規クラスの増殖調節体が同定された[SherrおよびRoberts(1996)]。CKIの１つのグループ、すなわちp21^KIP、p27^KIPおよびp57^KIPを含むキナーゼ阻害タンパク質（KIP）は、いくつかのcdkを阻害しうるが、p15^INK4、p16^INK4、p18^INK4およびp19^INK4を含む第２のグループ（INK4タンパク質）のメンバーはcdk4/cdk6に特異的である[Sher rおよびRoberts(1996)]。該キナーゼの正の調節体（サイクリン）および負の調節体（CKI）は、cdkに対する結合に関して化学量論的に競合するらしく、これは、cdk4/cdk6とＤサイクリンまたはp16^INK4のいずれかとのG₁特異的複合体には少なくとも当てはまる[Parryら．(1995)]。このことは、細胞環境中の増殖因子の平衡が、サイクリンＤまたはp16^INK4のいずれかと複合体を形成しているcdk4/cd k6のおよその比率を決定し、それによりpRbのリン酸化の度合を決定することを示唆している。もう１つの癌抑制因子であるp53は、p21^INK4の誘導を介してpRb のリン酸化を阻害することにより、その機能の少なくとも１つを発揮するらしい [el Deiryら.(1993),Harperら(1993),Dulicら(1994)]。十分に特徴づけられた、 DNA損傷物質に対するこの応答は、後期G₁におけるいわゆるチェックポイントに特徴的である。したがって、p53に媒介される増殖停止の主要標的は、pRbに支配される増殖制御機構であるらしい。pRbは、G₁期進行の主要な公知リプレッサーとして機能する[Pardee(1989),Sherr(1993),SherrおよびRoberts(1996)] p16^INK4をコードする遺伝子は、ある種の腫瘍においては高い割合で失われており腫瘍由来細胞系においてはより一層頻繁に失われている癌抑制因子であることが示されている[Kambら．(1994)，Noboriら(1994)]。p16^INK4機能の喪失は、点突然変異、欠失などの種々のメカニズムにより、また、過メチル化を介した抑制により生じうる[Merloら.(1995)]。最近のほとんどの研究は、Rbおよびp16^INK ⁴ の喪失が相互排他的に生じ、それらの２つの癌抑制遺伝子の機能が、ほとんどのすべての腫瘍細胞系で失われていることを示している[Ottersonら(1994),Okam otoら．(1994)，Tamら.(1994),Lukasら.(1995)]。ほとんどの分化組識は、ある割合のそれらの細胞と共に絶えず再生している。固形組識内の細胞数を一定に維持するためには、同時に細胞死が生じる必要がある。このプログラムされた細胞死またはアポトーシスは、肝臓で最初に検出され、ついでリンパ系細胞において広範に研究された。アポトーシスの誘導または予防に関与する多数の遺伝子が同定されている[White(1996)]。これに関して最も広範に研究された遺伝子産物の１つは、癌抑制因子p53である。このタンパク質は最初は、SV40 T抗原（これもまたpRbに結合する）と複合体を形成しているパートナーとして同定された。SV40および他のDNA腫瘍ウイルスによるpRbおよびp5 3の同時不活性化は、ウイルスにより誘導される悪性トランスフォーメーションの唯一の原因になると示唆されている[HindsおよびWeinberg(1994)]。p53の発現は、照射および他のDNA損傷処理により強く誘導される。同様に、p53は、サイクリン依存性キナーゼの一般的な阻害因子であることが示されているp21^KIP[el De iryら.(1993)]などの他の多数の遺伝子の発現を誘導する。したがって、p53は、 cdk4活性のp21^KIP媒介阻止を介してpRbのリン酸化を阻害することによりG₁期に細胞周期の阻害を引き起こすらしい。しかしながら、p53はまた、後期G1においてアポトーシスを誘導することが示されており、これはおそらく、DNA損傷が適切に修復できない場合に生じるのであろう。一方、p53の不存在下でのアポトーシスが示されており、このことは、p53が、アポトーシスの誘導因子であるが、アポトーシスには要求されず、したがってアポトーシス機構の一部ではない可能性があることを示唆している[White(1996)]。p53のアポトーシス的役割は、腫瘍細胞の増殖の抑制に対するその最も重要な寄与である可能性がある。p53に対する正常細胞の応答は細胞周期停止であると考えられるが、悪性細胞はおそらく、 p53により誘導されるアポトーシスに対して、より感受性であろう。したがって、p53陽性腫瘍細胞は、照射または化学療法により誘導されるアポトーシスに一般に感受性である可能性がある。 Rb欠損細胞では、p53機能を喪失する傾向が強い。公知腫瘍細胞系およびおそらく腫瘍細胞（網膜芽細胞腫以外）のなかには、Rb欠損性であり依然としてp53 陽性であるものは存在しない。G₁期制御の喪失は、数ラウンドの細胞増殖を可能にするものの、おそらく著しい調節解除（deregulation）としてp53に認識されるのであろう。また、それは、突然変異の蓄積により生じる可能性があり、アポトーシスにつながるであろう。サイクリンＤの過剰発現またはp16^INK4の喪失の場合のRb経路の調節解除は、Rbの喪失の場合ほど顕著ではないため、p53の不活性化は明らかに、最初の２つの状況に必須ではない。野生型p53遺伝子の異所性発現は、p53を完全に欠くか又は突然変異p53を発現するヒト腫瘍細胞系のin vitroでの増殖を抑制することが示された[Bakerら.(19 90),Chengら.(1992),Takahashiら.(1992)]。p53遺伝子が導入された腫瘍細胞は、ヌードマウスにおいて、より低い腫瘍形成性を有していた。p53遺伝子を保持するレトロウイルスベクターの気管内点滴は、ヌードマウスにおける正位ヒト肺癌細胞の増殖を妨げた[Caiら.(1993)]。球形腫瘍モデルにおける同様のレトロウイルスベクターの使用は、該ベクターが、内部腫瘍塊中に侵入し、また、肺癌細胞において有意なアポトーシス腫瘍細胞死を誘導しうることを示した[Fujiwara ら.(1993)]。肺癌、そしてまた食道上皮の悪性病変は、頻繁に突然変異したp53 を有しており、このことは、これらの悪性疾患が、適当なベクターの点滴による p53遺伝子導入の主要標的となりうることを示唆している。レトロウイルスベクターは、in vivoでの遺伝子運搬におけるいくつかの固有の問題を有するため、p 53遺伝子を有するアデノウイルスベクターが作製された[Zhangら.(1993)]。CMV プロモーターの制御下にp53遺伝子を有する第１世代のE1欠損ベクターが、p53を欠損したヒト非小細胞肺癌細胞内に導入された[Zhangら.(1994)]。ほぼ100％の遺伝子導入が、50pfu/細胞の感染多重度（m.o.i）で達成され、高レベルのp53タンパク質発現が検出された。p53欠損腫瘍細胞の増殖は有意に抑制されたが、p53 遺伝子に欠損を有さない細胞における影響はほとんど見出されなかった。p53ベクターの腫瘍抑制効果は、種々の動物モデルで示されている[Willsら(1994),Liu ら(1994)]。最近、p53遺伝子導入の適用のための最初の臨床治験が公開された[R othら.(1996)]。この研究では、末期患者（該患者は、治療後数週間以内に全員死亡した）の肺癌内にp53遺伝子を運搬するためにレトロウイルスベクターが使用された。数人の患者においては、アポトーシス細胞死と相関する腫瘍退縮の明らかな徴候が検出可能であった。しかしながら、この研究から腫瘍細胞死および腫瘍塊退縮の程度を評価することは困難である。肺癌細胞は、p53を頻繁に欠損しているばかりでなく、過剰発現されたp53によるアポトーシスの誘導に感受性でもあるため、この腫瘍は、p53による遺伝子治療に特に適したものとなる。 p16^INK4（MTS1）は、正真正銘の癌抑制因子である。p16^INK4遺伝子の機能は、全腫瘍の約60％にのぼる種々の腫瘍型において失われ、膵臓癌および黒色腫においては機能の80〜90％の喪失に達する[Kambら(1994)，Noboriら(1994),Merloら( 1995),Ottersonら(1994),Okamotoら(1994),Tamら(1994),HannonおよびBeach(199 4)，Marx(1994)，Zhangら(1994)，Jenら(1994),Washimiら(1995),Hussussianら( 1994)]。前記のとおり、p16^INK4遺伝子産物は、cdkを特異的に阻害し、それによりpRbのリン酸化を阻害する[Serranoら(1993)，Serranoら(1995)]。したがって、それはpRbの直ぐ上流で機能する[Lukasら(1995),Kohら(1995)]。したがって、 pRbの喪失およびp16^INK4の喪失は、択一的な事象である。Rb欠損腫瘍は、一般には、p16^INK4に関して陽性であり、p16^INK4欠損腫瘍は、正常なRbを有する[Strau ssら(1995),Whiteら(1996)]。したがって、腫瘍細胞におけるp16^INK4機能の回復は、正常な増殖制御を回復させると考えられるが[Lukasら(1995)]、腫瘍増殖の抑制には必ずしもつながらないであろう。p16^INK4を有するアデノウイルスベクターの、ヌードマウスにおける最近の応用は、腫瘍増殖の或る程度の遅延を示している。この結果は、p16^INK4の癌抑制機能を証明しているが、この癌抑制因子により腫瘍の有意な退縮を得ることができないことも示している。発明の概要本発明は、細胞増殖の抑制のための及びプログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導のための癌抑制因子の併用に基づく癌の遺伝子治療を目的とする。先行技術は、種々の癌抑制因子が、腫瘍細胞に対する特異性を伴わずに細胞一般の増殖を抑制しうることを示している。アポトーシスは、正常細胞においては種々の因子により誘導されうるが、腫瘍細胞において誘導することは、より困難である。アポトーシスの誘導因子に応答する能力は主として、正常なp53遺伝子の存在に大きく左右される。この遺伝子の産物は、アポトーシスの主要内因性誘導因子である。p53遺伝子は、大部分の癌において機能的に不活性化される。腫瘍増殖の速度は、主として、細胞増殖の増加とアポトーシスとの間の平衡によって決まる。p53が失われると、自発的アポトーシスが発生せず、化学療法により誘導されるアポトーシスの効率は非常に低い。腫瘍治療の主な目的は、腫瘍増殖の抑制だけではなく、腫瘍細胞死の誘導にもあるため、それらの２つの原則を組合せることが特に重要であろう。機能的Rbの存在は、アポトーシスの妨害に関連している[Haas-Koganら(1995),HerwigおよびStrauss(1997)]。したがって、細胞周期の制御およびアポトーシスの調節は、pRbおよびp53により厳重に調整されるらしい。両方の機能の喪失は、おそらく、アポトーシスによる細胞死を伴わない無制限な増殖を保証するであろう。癌抑制因子の一方または他方の再構成が増殖制御および／またはアポトーシスの再構成をもたらしうるか否かという疑問が生じる。本発明は、p16^INK4遺伝子の産物（MTS-1=CDKI4=CD-KN2とも称される）［Hanno nら(1994)］が、機能的Rb1遺伝子を依然として有する（これは、全腫瘍の約85％に当てはまる）すべての細胞において細胞増殖を抑制するという初めての知見に基づく。種々の型の腫瘍細胞内へ種々の手段によりp16^INK4遺伝子を導入すると、該導入遺伝子からp16^INK4タンパク質が合成される限り続くRbタンパク質のリン酸化の抑制により、細胞増殖の抑制が生じる。ついで、細胞は阻止から回復し、分裂を再開することが可能である。したがって、細胞分裂の一過性の抑制は、腫瘍増殖の効率的な阻止および腫瘍退縮には十分ではないであろう。p16^INK4遺伝子の異所性発現に関して、p53陽性である腫瘍細胞における或る程度の自発的アポトーシスが、選ばれたアデノウイルスベクターを使用してp16^INK4遺伝子を高度に過剰発現させた場合に認められた(実施例2)。p53欠損腫瘍細胞および正常細胞においては、アポトーシスは認められなかった。p16^INK4（Ad-p16-9）(ECAC C受託番号V97021335)とp53との組合せ過剰発現は、p53陽性または陰性である腫瘍細胞においては、前例のない高度（100％に達する）のアポトーシスを引き起こすが、驚くべきことに、正常細胞においては引き起こさない（実施例3)。過剰発現したp16^INK4の腫瘍細胞特異的アポトーシス効果の、この驚くべき知見を、さらに詳細に研究した。p16^INK4が過剰発現した場合には、Rbタンパク質(pRb)のレベルが３日間にわたり相当に減少することが認められた(実施例4)。この効果は、おそらく、Rb1遺伝子を、その非リン酸化産物pRb が自己抑制することによるものであろう。したがって、p16^INK4の過剰発現は、細胞分裂を阻止するばかりでなく、ついでpRbレベルの減少をも引き起こし、それが今度は、p53陽性腫瘍細胞がアポトーシスを受ける能力の増強につながる。後者は、p53の同時発現により劇的に増強されうる。本発明の非常に重要な観点は、pRbおよびアポトーシス誘導タンパク質（例えば、p53）の絶対的レベルだけでなく、それらの２つのタンパク質の比率が、アポトーシスの誘導に重要であるということである（実施例5)。種々の細胞型間で異なるpRb/アポトーシス誘導タンパク質の比率（アポトーシス誘導タンパク質が p53である場合には、1：1から１:20である）は、細胞周期停止後に２通りの方法で減少させなければならない。第１に、pRbのレベルは、少なくとも５倍(最初のレベルの20％未満)、好ましくは、少なくとも10倍(10％未満)、または一層好ましくは20倍（5％未満）減少させなければならない。同時に、p53のレベルは、好ましくは、最初のレベルの２倍以上にまで増加させるべきである。悪性細胞の80 〜100％における効率的なアポトーシスのためには、pRbのレベルを減少させることなくp53のレベルを増加させるだけでは十分ではない。pRbおよびp53のレベルの変化の定量は、診断された腫瘍から組識を、また、本発明に従う治療の後に同じ領域から組識を摘出し、pRbおよびアポトーシス誘導タンパク質に特異的な抗体を使用する免疫ブロット法、ELISAその他の標準的な免疫学的技術により該組識サンプル中のpRbおよびアポトーシス誘導タンパク質のレベルを比較することにより行なうことができる。一般には、リン酸化pRbおよび非リン酸化pRbを含む pRbの全量を測定することになる。本発明の概念に従いpRbの全量を減少させる場合には、減少するのは非リン酸化pRbである。なぜなら、もはやリン酸化pRbがほとんど存在しない場合にのみ、減少が生じるからである。治療は、典型的には、アポトーシス誘導遺伝子と所望により組合された好ましい形態のp16^INK4遺伝子を含有するベクターを腫瘍状組識にトランスフェクトすることを含み、pRbおよびアポトーシス誘導タンパク質の定量のための組識は、典型的には、治療開始の１週間後または２週間後に摘出することになろう。したがって、本発明は、悪性疾患の治療用の組成物の製造のための、遺伝物質を含有するベクターの使用であって、該ベクターが、悪性疾患に罹患した被験者に投与されると、pRbタンパク質のリン酸化の阻害を悪性細胞において誘導することにより悪性細胞の増殖停止をまず達成した後、pRbのレベルを減少させアポトーシス誘導タンパク質のレベルを増加させることにより、悪性細胞内のアポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率を減少させることにより、悪性細胞においてアポトーシスを誘導することを特徴とする使用に関する。本発明は、遺伝物質の導入のためのベクターに関する。発明の詳細な開示本発明は、一般には数時間または数日間にわたり連続的に生じるいくつかの事象を提供するものであり、該事象は、細胞分裂の阻止およびそれに続くpRbレベルの減少を引き起こす遺伝子（それに関しては、p16^INK4遺伝子が典型例である）の過剰発現により開始し、ついでp53などのアポトーシス誘導タンパク質の過剰発現によりアポトーシスを誘導する。後者は、十分に検出可能なレベルの野生型p53を発現する腫瘍においては省略することができる。pRb/アポトーシス誘導タンパク質の比率の減少が、決定的に重要な点である。過剰発現は、好ましくは、ウイルスベクター（好ましくは、アデノウイルスベクター）の使用により行なう。高発現体（正常レベルの５倍以上）の選択に関しては、注意しなければならない。最も好ましいのは、両遺伝子を同時に発現するベクターである。したがって、本発明の好ましい手段は、p16^INK4またはその関連体の１つとp53 またはその下流エフェクターの１つとの同時発現を可能にするアデノウイルス（または他のウイルス）ベクターである。pRbおよびp53は、ある経路のマスター調節遺伝子であるため、p16^INK4およびp53には、いくつかの可能な置換が存在する。p16^INK4遺伝子は、p15^INK4、p18^INK4またはp19^INK4、あるいはp21^KIP、p27^KIP またはp57^KIPと成功裡に置換することが可能である。p53遺伝子は、p53の代わりに治療用ベクターの一部として使用することが可能なbax、bak、bcl-Xなどの多数のプロアポトーシス（pro-apoptotic）遺伝子を誘導する。「アポトーシス誘導タンパク質」なる語を用いる場合、それは、そのような遺伝子のタンパク質産物を意味する。ヌードマウスにおいて導入前細胞からの腫瘍発生の抑制を引き起こすために( 実施例6)、また、既に存在する腫瘍内へのin vivo遺伝子導入により腫瘍増殖の抑制を引き起こすために(実施例7)、本発明の方法を用いた。p16^INK4またはp53 の単独投与は、ほとんど又は全く効果を与えないが、それらの２つの遺伝子の組合せ効果は非常に強力であることを、データは明らかに示している。腫瘍増殖は、ほとんどの動物において該組合せ治療により抑制され、さらに、他のいくつかは、該腫瘍の完全な退縮を示す。したがって、本発明の方法のin vivo適用の結果は、腫瘍組識へのベクターの適切な運搬に大きく左右される。本発明においては、p16^INK4による増殖抑制とp53によるアポトーシスの誘導との組合せ効果に基づく腫瘍遺伝子治療のための新規戦略を用いる。p16^INK4の過剰発現が、アポトーシス刺激に対する腫瘍細胞の感受性の増加につながるpRbタンパク質合成のダウンモジュレーションを誘導することが、初めて示された。したがって、アポトーシス細胞死が大部分の腫瘍細胞において誘導されうる限り、腫瘍細胞におけるサイクリンD/cdk-pRb経路の効率的な遮断が、増殖停止および腫瘍の退縮（アポトーシス細胞死によるもの）のための決定的な段階である。本発明は、生きた生物中の大部分の悪性細胞においてアポトーシスを誘導する方法を初めて教示するものである。したがって、本発明は、効果的な抗腫瘍治療に関して長く渇望されていた課題（ロング・フェルト・ニード）の解決手段を提供するものである。 WO 96/27008は、腫瘍および他の過形成の治療のために、アデノウイルスベクター内に含有されたp16^INK4をコードする遺伝物質を細胞内に導入することを開示している。この文献は、p16^INK4の或るレベルの細胞発現が必要であるか又は好ましいことを開示も検討もしていない。これに対し、本発明は、p53タンパク質の存在下で使用するp16^INK4タンパク質の有意な過剰発現だけが、効率的かつ広範囲に及ぶ細胞死を引き起こすことを開示する。 WO 95/11301は、p53タンパク質の細胞レベルを増加させることにより又はp53 の活性を増加させることにより、増殖中の哺乳類細胞（例えば、癌細胞）の生存能を減少させるための方法に関するものである。癌抑制に関する他の細胞タンパク質の役割については、検討も言及もされていない。p53の単独使用は、本発明に関して用いるアプローチとは全く対照的なものであり、本発明は、アポトーシスにより細胞死を誘導するためには悪性細胞内でp53を発現または過剰発現させることだけでは十分でないことを示している(実施例３を参照されたい)。 WO 96/20207は、種々の病態生理学的細胞増殖疾患を治療するために治療的に使用されるpRbおよびp53タンパク質の突然変異体を開示している。前記の２つのタンパク質をコードする核酸で同時または連続的に、癌細胞を処置する。しかしながら、細胞死を達成するために必要な発現のレベルに関しては何ら言及されていない。それらの２つのタンパク質の細胞比率の重要性は検討されていない。さらに、p53またはpRbのいずれかを欠損した細胞系内で治療の正の効果が生じることが示されているにすぎない。これは、WO 96/20207の方法が、癌の治療に概して適していることを示唆するものではない。 WO 96/27008からは、種々の腫瘍細胞系におけるp16^INK4の異所性発現が、これらの細胞の増殖を抑制し得ることが公知である。しかしながら、本発明は、増殖停止につながるp16^INK4の有意レベルの過剰発現が、p53タンパク質に対するpRb タンパク質の比率（pRb/p53）の低下につながるpRbレベルのダウンレギュレーションおよびそれに伴うp53レベルの増加を介して、p53を発現する腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導に決定的に重要であることを示している。さらに、pRbおよびp53のそれぞれのレベルの変化の実際の規模は、本発明に関しては数種類の細胞について決定されている。本発明は、悪性疾患の治療用の組成物の製造のための、遺伝物質を含有するベクターの使用であって、該ベクターが、悪性疾患に罹患した被験者に投与されると、pRbタンパク質のリン酸化の阻害を悪性細胞において誘導することにより悪性細胞の増殖停止をまず達成した後、pRbのレベルを減少させアポトーシス誘導タンパク質のレベルを増加させることにより、悪性細胞内のアポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率を減少させることにより、悪性細胞においてアポトーシスを誘導することを特徴とする使用に関する。この場合、「増殖停止」なる語は、細胞分裂の実質的な阻止を意昧し、これは、ほぼ完全な（典型的には、少なくとも90％の）阻止と理解される。本発明の好ましい実施形態では、pRbのレベルを少なくとも５倍(最初のレベルの20％未満まで)、少なくとも10倍(最初のレベルの10％未満まで)、または少なくとも20倍（最初のレベルの5％未満まで）減少させ、好ましくは、p53などのアポトーシス誘導タンパク質のレベルを少なくとも２倍増加させることにより、アポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率を悪性細胞において減少させる。種々の型の悪性細胞におけるpRb/アポトーシス誘導タンパク質の比率が、増殖停止をまず達成した後にアポトーシスによる細胞死を誘導する可能性を決定することが、本発明者らにより初めて示された。その実際の比率は、問題の細胞の型によって異なることが認められている。本発明の方法を使用することにより、本発明者らは、腫瘍中の悪性細胞の少なくとも90％においてアポトーシスを誘導することができている。この殺細胞率は、前例がなく高いものであり、したがって癌の治療における有意な改良をもたらす。本発明では、アポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率（例えば、pRb/p53）は、好ましくは、特異的抗体を使用する同一ゲル上におけるアポトーシス誘導タンパク質（例えば、p53）およびpRbタンパク質の免疫ブロット法を用いることにより定量する。例えば一般的な二次抗体およびストレプトアビジン−POD反応により測定される検出可能な一次抗体の量は、おおよそ、それぞれの標的タンパク質の量（分子）に対応する。したがって、該比率は、非常に厳密なモル比率を与えるものではなく、検出される免疫複合体の相対的な測定値を与える。したがって、pRbレベルの減少およびアポトーシス誘導タンパク質レベルの増加の測定は、それらの２つのタンパク質のモル比率の測定より高い再現性および信頼性を有する。 pRbおよびアポトーシス誘導タンパク質のレベルの変化の定量は、好ましくは、診断された腫瘍から組識を、また、本発明の治療後に同じ領域から組識を摘出し、pRbおよびアポトーシス誘導タンパク質に特異的な抗体を使用する免疫ブロット法、ELISAその他の標準的な免疫学的技術により、これらの組識サンプル中のpRbおよびアポトーシス誘導タンパク質のレベルを比較することにより行なう。また、それぞれpRbおよびアポトーシス誘導タンパク質に関して免疫学的に染色された腫瘍からの組識切片を、本発明の治療後の同じ領域からの組識切片との比較のために使用することが好ましい。好ましくは、本発明による治療は、p53遺伝子またはp53プロアポトーシス下流遺伝子と所望により組合された好ましい形態のp16^INK4遺伝子を含有するベクターの有効量を腫瘍状組識にトランスフェクトすることを含む。pRbおよびアポトーシス誘導タンパク質のレベルの定量のための組識または組識切片は、好ましくは、治療の開始の少なくとも１週間後、好ましくは少なくとも２週間後にそれぞれ摘出または切断する。pRb/アポトーシス誘導タンパク質のレベルの比率が十分に減少しない場合には、該治療を繰返すことができる。本発明の１つの実施形態においては、悪性細胞はp53陽性である。「p53陽性」なる語は、免疫組織化学または免疫ブロット法などの標準的な技術により正常( 野生型)タンパク質が発現され検出されうることを意味する。本発明のもう１つの実施形態においては、悪性細胞はp53欠損である。「p53欠損」は、該遺伝子の著しい再編成または欠失による発現の欠如を意味する。本発明の好ましい実施形態においては、悪性細胞内のpRbタンパク質のレベルを減少させる。本発明の背後の中心的概念によれば、pRb/アポトーシス誘導タンパク質の比率（例えば、pRb/p53）は、悪性細胞におけるアポトーシスの誘導に決定的に重要である。さらに、本発明者らは、比率の減少のための出発点として正常な野生型のレベルのpRbの存在が必要であることを示している。同様に、p53の存在が必要である。したがって、本発明では、pRbのレベルおよびp53のレベルを操作することにより、p53陽性である悪性細胞のアポトーシスを誘導することが可能である。細胞がp53欠損である場合には、本発明に従いそれをp53陽性にすることが必要である。本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該細胞内への遺伝物質の導入によりpRbのレベルを減少させアポトーシス誘導タンパク質（例えば、p53）のレベルを増加させることにより、アポトーシス誘導タンパク質のレベルに対する pRbのレベルの比率（例えば、pRb/p53）を悪性細胞において減少させる。「遺伝物質」なる語は、核酸の配列を意味する。本発明の特に好ましい実施形態においては、遺伝物質は、p16^INK4、p15^INK4、 p18^INK4、p19^INK4、p21^KIP、p27^KIP、p57^KIPおよびp53よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子である。また、p16^INK4遺伝子の修飾体が好ましい。特に、p16^IN ^K4 タンパク質のcdk結合ドメインまたはこのドメインの突然変異体だけをコードするp16^INK4遺伝子の修飾体が好ましい。「修飾体」なる語は、遺伝子配列の特定の核酸の欠失、付加または置換により元の遺伝子から誘導された遺伝物質を意味する。本発明において増殖停止効果を引き起こすのは、p16^INK4とcdk4との相互作用であり、したがって可能な限り強力かつ効率的な相互作用を得るのが望ましい。これは、正常なp16^INK4より強力に内因性ckd4タンパク質と相互作用するp16^INK4 タンパク質種を細胞内導入後に生成するp16^INK4遺伝子の修飾体を構築することにより行なうことが可能である。実施例４に示すとおり、悪性細胞内にp16^INK4遺伝子を遺伝子導入し、ついで該悪性細胞内で該遺伝子を異所性細胞発現させると、pRbの細胞レベルの減少が生じる。この減少は、本発明においてアポトーシスの誘導のための必要条件である該悪性細胞の増殖停止を引き起こす。本発明によれば、悪性細胞内でp16^INK4 を発現する効果を模擬する任意の手段により、増殖停止およびそれに続くアポトーシスを達成することが可能である。p15^INK4、p18^INK4、p19^INK4、p21^KIP、p27^KIP 、p57^KIPの遺伝子にコードされるタンパク質は、p16^INK4の類縁体であり、細胞内で或る程度p16^INK4効果を模擬しうる。したがって、本発明では、増殖停止およびそれに続くアポトーシスの誘導を達成するために、これらのタンパク質をコードする遺伝子を悪性細胞内に導入することができる。修飾されているが依然として機能的であるp16^INK4遺伝子の形態にも、同じことが言える。この場合、「p16^INK4の類縁体」なる語は、p15^INK4、p18^INK4及びp19^INK4などのINK4遺伝子ファミリーにより認識されるその遺伝子を意味する。本発明の特に好ましい実施形態では、導入する遺伝物質は、p53遺伝子と組合されたp16^INK4遺伝子である。また、p53プロアポトーシス下流遺伝子と組合されたp16^INK4遺伝子の修飾体の遺伝子導入も好ましい。「p53プロアポトーシス下流遺伝子」なる語は、調節カスケード(例えば、pRb) の先頭に位置するp53の下流で作用する遺伝子を意味する。p53は、転写調節体として、多数の遺伝子を活性化及び抑制し、これらのすべての遺伝子は、下流遺伝子と称される。これらの遺伝子のなかには、細胞周期阻害因子(例えば、p21^KIP) もあれば、プロアポトーシス的（pro-apoptotic）なものもある。p53プロアポトーシス下流遺伝子としては、例えば、bax、bakおよびbcl-X遺伝子が挙げられる。 p16^INK4とp53との組合せ導入は、p53陽性およびp53欠損の両方の細胞における悪性細胞内での増殖停止およびそれに続くアポトーシスの誘導の所望の効果を達成することを可能にする。実施例３は、それらの２つの遺伝子の同時導入の相乗効果が存在することを示す。同様に、p53下流遺伝子と組合されたp16^INK4遺伝子の修飾体を使用することが可能である。本発明のもう１つの好ましい実施形態では、遺伝物質をベクター内で導入する。該ベクターは、非ウイルスまたはウイルスベクターであり得る。該ベクターがウイルスである場合には、本発明では、該ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびハイブリッドベクターよりなる群から選ばれることが好ましい。ウイルスベクターはAd-p16-9ベクター（ECACC受託番号V97021335）であるのが特に好ましい。本発明の特に好ましい実施形態では、導入する遺伝物質の高レベルの過剰発現を達成させる。好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは６倍以上、より一層好ましくは８倍以上、最も好ましくは10倍以上の過剰発現を達成させる。この場合、「過剰発現」なる語は、正常細胞内に存在するレベルを超えるレベルでの発現を意味する。本発明者らは、本発明における増殖停止およびアポトーシスの誘導を達成するためには、p16^INK4遺伝子の細胞過剰発現が決定的に重要であることを示す。効果を得るためにはp16^INK4自体の異所性発現で十分であることは、本発明の開示前には公知でなかった。したがって、本発明は、過剰発現、好ましくは高レベルの過剰発現が必要であることを開示することにより、大多数の悪性細胞におけるアポトーシスの誘導の原理を初めて提供するものである。本発明の特に好ましい実施形態では、p53欠損細胞をp53陽性にする。特に好ましいp53欠損細胞は、p53遺伝子の導入によりp53陽性になる。本発明の好ましい実施形態は、悪性疾患の治療のための、本発明の使用である。好ましくは、該悪性疾患は固形腫瘍である。より好ましくは、該悪性疾患は、結腸直腸癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、頭頚部癌、腎臓癌および黒色腫よりなる群から選ばれる。本発明の重要な態様は、悪性疾患の治療用の組成物の製造のための、遺伝物質を含有するベクターの使用であって、該ベクターが、悪性疾患に罹患した被験者に投与されると、pRbタンパク質のリン酸化の阻害を悪性細胞において誘導することにより悪性細胞の増殖停止をまず達成した後、pRbのレベルを減少させアポトーシス誘導タンパク質のレベルを増加させることにより、悪性細胞内のアポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率を減少させることにより、悪性細胞においてアポトーシスなどの細胞死を誘導することを特徴とする使用である。本発明の好ましい実施形態は、該ベクターが非ウイルスベクターである、本発明の使用である。また、ウイルスベクター、特に、アデノウイルスベクターの使用が好ましい。本発明の特に好ましい実施形態は、該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびハイブリッドベクターよりなる群から選ばれる、本発明の使用である。ベクターAd-p16-9（ ECACC受託番号V97021335）の、本発明の使用が特に好ましい。この場合、「ハイブリッドベクター」なる語は、異なるベクターからの部分の組合せにより作製されたベクターを意昧する。２以上のウイルスの異なる部分を組合せることが可能であるが、ウイルスの一部と非ウイルス成分とを組合せることも可能である。実施例１において、本発明者らは、ベクターAd-p16-9（ECACC受託番号V970213 35）の使用が、該ベクターにより細胞内に導入された遺伝子の非常に高レベルの細胞過剰発現を可能にすることを示す。本発明では、そのようなレベルの過剰発現が好ましいため、開示するアデノウイルスベクターは、それが導入する遺伝子の有意な過剰発現を媒介することが公知でない従来開示されているベクターより優れた重要な利点を示す。本発明の好ましい実施形態は、該遺伝物質が、p16^INK4、p15^INK4、p18^INK4、p 19^INK4、p21^KIP、p27^KIP、p57^KIPおよびp53よりなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、本発明の使用である。特に好ましいのは、p16^INK4遺伝子の修飾体またはその多数の誘導体の使用である。より好ましいのは、p16^INK4タンパク質のcdk結合ドメインだけをコードするp16^INK4遺伝子の修飾体の使用である。より一層好ましいのは、p53遺伝子と組合されたp16^INK4遺伝子の使用である。最も好ましいのは、p53プロアポトーシス下流遺伝子と組合されたp16^INK4遺伝子の修飾体の使用である。本発明の好ましい実施形態は、導入した遺伝物質の高レベルの過剰発現を達成させる、本発明の使用である。選択した遺伝子の、２倍以上のレベルの過剰発現を達成させるのが好ましい。選択した遺伝子の、４倍以上のレベルの過剰発現を達成させるのがより好ましい。選択した遺伝子の、６倍以上のレベルの過剰発現を達成させるのがさらに好ましい。選択した遺伝子の、８倍以上のレベルの過剰発現を達成させるのがより一層好ましい。選択した遺伝子の、10倍以上のレベルの過剰発現を達成させるのが最も好ましい。本発明の特に好ましい実施形態は、pRbのレベルを少なくとも５倍(最初のレベルの20％未満まで)、好ましくは少なくとも10倍(最初のレベルの10％未満まで) 、または一層好ましくは少なくとも20倍（最初のレベルの5％未満まで）減少させることにより(同時に、p53レベルを、最初のレベルの少なくとも２倍増加させるべきである)、該比率（pRb/アポトーシス誘導タンパク質）を減少させる、本発明の使用である。悪性細胞の80〜100％における効率的なアポトーシスのためには、pRbのレベルを減少させることなくアポトーシス誘導タンパク質（例えば、p53）のレベルを増加させるだけでは十分でない。一方、アポトーシス誘導タンパク質のレベルを改変することなくpRbのレベルを減少させるだけで十分であり得る。したがって、本発明の範囲内には、pRbを減少させアポトーシス誘導タンパク質（例えば、p53）を同じレベルに維持する使用が含まれる。本発明の重要な態様は、p16^INK4タンパク質またはその機能的等価体をコードする核酸配列を含み、さらに、該ベクターに固有の遺伝要素と組合された、p53タンパク質またはその機能的等価体をコードする核酸配列を所望により含むベクターであって、該固有要素が該遺伝子配列の有意な過剰発現を引き起こすことを特徴とするベクターに関する。 D-13122 Berlin，Germanyにより受託番号V97021335としてEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）のコレクションに1997年２月13日付けで寄託されている特異的アデノウイルスベクターAd-p16-9に関する。該寄託は、ブダペスト条約の規定に従い行なわれた。図面の説明図１は、ベクターAd-p16-9で遺伝子導入した後のIMR-90細胞におけるp16^INK4 の過剰発現を示す。50のm.o.i.の感染を１時間行なった。細胞を洗浄し、抽出し (48時間後)、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレン上にブロッティングした。p16^INK4の検出は、モノクローナル抗p16^INK4抗体（DCS50）を使用して行なった。右レーン中の上側のバンドは、ウイルス感染細胞内でアップレギュレーションされた内因性p16^INK4に対応する。下側のバンドは、該コード配列の短いＮ末端切断を有する遺伝子に由来する異所性過剰発現したp16^INK4を表す。図２は、細胞周期調節に対するAd-p16^INK4遺伝子導入の効果を示す。内因性p1 6^INK4発現を欠く２つの細胞系(HuH7、LOVO)、および対照として採用する２つのR b陰性細胞系（BT549、C33A）を、PBSで処理する（上パネル）か又はそれぞれ50 、30、50および50のm.o.i.でAd-bg(中パネル)もしくはAd-p16^INK4アデノウイルスで感染させる。感染の48時間後、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を細胞培養培地に加えた。30分後、細胞をトリプシン処理し、固定し、ヨウ化プロピジウム染色によりDNA含量に関して、また、フローサイトメトリーを用いてBrdUの取込みによりDNA合成に関して分析した。Ad-p16^INK4で処理したHuH7およびLOVO細胞においては、増殖している細胞の画分はほとんどなく、一方、このウイルスは、BT549およびC33A細胞には何ら影響を及ぼさない。Ad-p1 6^INK4で処理したHuH7細胞においては、G1細胞のDNA含量より少ないDNA含量を有する細胞の画分（G1ピークの肩部分）が見出される(この肩部分の存在は、両方の腫瘍細胞系での個々の実験によって様々である)。図３は、p16^INK4およびp53遺伝子の同時導入によるアポトーシスの刺激を示す。HuH7、LOVOおよびIMR-90細胞のDNA含量を、ヨウ化プロピジウム染色後にフローサイトメトリーにより分析した。細胞を、PBS（-）で処理するか或いはAd-p53 またはAd-p16^INK4アデノウイルスでm.o.i.25（HuH7）または15（LOVO）で96時間感染させ、ついで分析した。Adβgalウイルスを、m.o.i.25（HuH7）および15（L OVO）で加えた。Ad-p53およびAd-p16^INK4の両方による二重感染を、各ウイルスについてm.o.i.25（HuH7）または15（LOVO）で行なった。Ad-p53で処理した細胞では、わずかなＳ期減少だけが見出され、正常な細胞周期曲線が維持されるが、 Ad-p16^INK4に感染した細胞では、G1およびG2ピークが広がる(典型的な実験)。二重感染させたHuH7およびLOVO細胞のほとんどは、DNA含量の劇的な減少を示す。G 1およびG2ピークは存在しない。IMR-90細胞においては、sub-G1（アポトーシス）DNAピークが全く認められない。図４は、HuH7細胞にAd-p16^INK4ウイルスを感染させた後のpRbの発現およびリン酸化の時間経過を示す。感染は50のm.o.i.で行ない、示されている時点で抽出物を調製する。「方法」に記載のとおり、抽出物をSDS-PAA電気泳動、ウエスタンブロット法およびpRbの免疫検出に供した。図５は、p16^INK4およびp53の過剰発現後における導入後の、減少したpRbレベルおよび増加したp53レベルの検出を示す。この図は、Ad-p16（15m.o.i.）およびAd-p53（15m.o.i.）でのHuH7細胞のアデノウイルス感染を示し、これは、1mM MgCl₂の存在下のリン酸緩衝食塩水（PBS）中で１時間行なった。細胞を37℃で３日間インキュベートし、洗浄し、溶解バッファー中で抽出した。タンパク質（50 μg）を10％ポリアクリルアミド-SDSゲル上で分離し、セミドライブロッティングによりニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、免疫検出を行なった。一次抗体は、pRbに対するG3245(Pharmingen)、およびp53に対するAb-2（Oncogene Sciences）であった。特異的免疫複合体の検出は、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体およびストレプトアビジン-PODコンジュゲート（ECL sy stem，Amersham）を使用して行なった。Ｘ線フィルムにさらすことにより、化学発光を検出した。図６は、経時的な腫瘍サイズを、p53およびp16^INK4での処理の相関因子として示す。3×10⁶個のHuH7細胞を、ヌードマウスの左鼠径領域内に注射した。肉眼で認められるまでに腫瘍が増殖した15日後に、アデノウイルスベクター(6×10⁹個、150μl)を該腫瘍内に注射した(1日目)。４日後に、注射を繰返した。「方法」に記載のとおりに、腫瘍サイズを測定した。材料および方法組換えアデノウイルスの構築および調製 p16^INK4cDNA[Lukasら(1995)]を、CMVポリアデニル化シグナルと融合し、CMV前初期プロモーターの下流にクローニングした。完全な発現単位をアデノウイルスシャトルベクターPdE1sp1A［Bettら(1994)］内に挿入した。Ca-PO₄沈殿技術の変法［Lieberら(1995)］を用いて該シャトルプラスミドとpJM17［McGroryら(1988) ］とを後期継代（late passage）293細胞のサブコンフルエント培養にコトランスフェクトすることにより、組換えウイルスを作製した。該ウイルスを１回、プラーク精製し、制限分析により分析した。該プラークの１つがAd-p16-9を与えた。CMVプロモーターにより駆動されるp53遺伝子を含有するアデノウイルスは、We i-Wei Zang（Houston）から快く贈呈されたものであり、RSVプロモーターの制御下でβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を保持するアデノウイルスは、Michel Perricau det（Paris）により快く提供されたものである。大きな精製ウイルスストックの調製のためには、293細胞にm.o.i.５で感染させ、肉眼でCPEが認められるようになった後（48時間）で収穫した。0.2％ NP40を含有するPBS中で細胞を溶解した。細胞の破片を除去した後、該ウイルス懸濁液を２ラウンドのCsCl段階勾配遠心分離［Kanegaeら(1994)］に付した。Sephadex G25カラム（PD25,Pharmacia）に通すゲル濾過によりCsClを除去し、150mMNaCl、3mM KCl、1mM MgCl₂、10mM Tris pH7.4および10％グリセロールを含有する保存バッファー中でウイルスアリコートを−70℃で保存した。293細胞上でのプラークアッセイにより力価を測定した。細胞培養およびウイルス感染 HuH7(ヒト肝細胞癌)、BT549、MCF7(ヒト乳癌)、IMR-90（正常なヒト繊維芽細胞）および293細胞（ヒト初代胚腎）を、10％FCSおよび2mMグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)）中、5％CO₂にて培養した。C33A（ヒト子宮頚癌）およびLOVO細胞（結腸癌）を、 10％FCSを含有するRPMI中で維持した。１日前にプレーティングした8×10⁵細胞/ 10cmディッシユに、PBS+1mM MgCl₂中、50(HuH7、BT549、C33A)、30(LOVO)、100 （IMR-90）および300（MCF7）のm.o.i.でアデノウイルスを60分間感染させた。 β-ガラクトシダーゼを発現するウイルスを種々の用量で細胞に感染させ、ついでXgalで染色することにより、肉眼で認められる毒性効果を伴うことなく該細胞の100％において発現を引き起こすウイルスの最適濃度を測定した。細胞周期分析増殖中の細胞のパルス標識のために、ブロモデオキシウリジンを10mMの最終濃度で細胞培養培地に適用し、細胞を37℃で30分間インキュベートした。細胞をPB Sで２回洗浄し、トリプシン処理し、70％エタノール中で固定した。2MHCl/0.5％ Triton X100中で30分間のインキュベーションにより、DNAを変性させ、RNAを分解した。0.1M Na₂B₄O₇中での中和の後、細胞をマウスモノクローナル抗BrdU抗体 (Becton Dickinson)、ついでFITCコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体にさらした。DNA含量の検出のために、PBSで洗浄された細胞にヨウ化プロピジウムを5μg/m lの最終濃度になるまで加え、EPICS XL-MCLフローサイトメーター(Coulter)を使用してフローサイトメトリー分析を行なった。実施例１ベクターAd-p16-9（ECACC受託番号V97021335）によるp16^INK4遺伝子の過剰発現正常なヒト繊維芽細胞（IMR-90、ATCC CCL186）を、Ad-p16-9（ECACC受託番号 V97021335）と共に１時間インキュベートし、ついで37℃で２日間インキュベートした。感染細胞および未処理対照細胞を収穫し、洗浄し、溶解バッファー中で抽出した。全タンパク質（50μg）を15％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で移動させ、ニトロセルロース膜上にブロッティングした。該ブロットを、抗p16^INK4 抗体と共に、ついで二次抗体と共にインキュベートした。結果を図１に示す。該ブロットをスキャンして、タンパク質の相対量を定量した。該実験では、p16^INK ⁴ の量の、全体で43倍の増加が生じた。下側のバンドは、末端切断型導入遺伝子にコードされるタンパク質に対応し、上側のバンドは、内因性p16^INK4遺伝子も該遺伝子導入法により活性化されることを示している。下側のバンドの強度から算出した過剰発現の程度は、38倍であった。実施例２ p16^INK4の過剰発現は増殖抑制およびアポトーシスを招く末端切断型であるが機能的であるp16^INK4遺伝子をCMVプロモーターの制御下に保持するアデノウイルスベクターを作製し、それを使用して、種々の組織由来の種々の癌細胞系に感染させた。ついで、細胞周期に対するp16^INK4の過剰発現の効果を、「材料および方法」に記載の通りにフローサイトメトリー分析により測定した。lacZ遺伝子を保持する対照ベクター（Ad-bg）での全細胞系の感染は、２日目には細胞周期に有意な効果を与えなかったが、HuH7およびLOVO（ATCCCCL229 ）の２つのRb陽性癌細胞系においてはＳ期への移行が完全に阻止された(図3)。興味深いことに、感染の２日後のHuH7細胞からのDNAプロフィールにおけるG1ピークの左に肩部分が認められた。２日後、この肩部分は、同じ実験においては一層顕著になったが、他のいくつかの実験においてはそうではなかった(示されていない)。それはアポトーシス細胞のわずかな部分を反映していると疑われた。この仮定を証明するために、少数のアポトーシス細胞を検出するTUNELアッセイを行なった(示されていない)。10日間にわたり完全な増殖停止が認められたが、アポトーシス細胞死は、試験した腫瘍細胞において時々検出されたにすぎず、正常な二倍体繊維芽細胞（IMR-90）においては検出されなかった(示されていない)。実施例３アポトーシスに対するp16^INK4およびp53の相乗効果 p16^INK4の過剰発現は、細胞周期停止を誘導しうるばかりでなく、どういうわけかRb陽性癌細胞をアポトーシス刺激に対して感受性にもするらしいため、p53 遺伝子の過剰発現がp16^INK4発現細胞においてアポトーシスの効率的な誘導を引き起こすか否かを明らかにすることは興味深いことであった。HuH7およびLOVO腫瘍細胞ならびに正常IMR-90細胞に、比較しうる限られた多重度でAd-p16^INK4およびAd-p53を別々に又は一緒に感染させ、３日後にフローサイトメトリーによりDN Aプロフィールを分析した。結果を図３に示す。Ad-p53単独では、全３種の細胞型において細胞周期に対する有意な効果を示さなかったが、Ad-p16^INK4は、これらの条件下ですべての細胞系においてG1停止を誘導した。両方のウイルスの組合せは、２つの腫瘍細胞系においてsub-G1位へのDNAプロフィールの完全な移行を引き起こし、このことは、ほとんどすべての細胞が、この時点でアポトーシスに進入したことを示唆している。IMR-90細胞における効果は、全く検出されなかった(図3)。ウイルス感染の３日後のTUNELアッセイによるHuH7細胞におけるアポトーシスの分析は、いくつかの細胞においてはp53がアポトーシスを誘導することが可能であり、p16^INK4過剰発現が、アポトーシス細胞の時折の出現につながり、両遺伝子の組合せが大部分の細胞においてアポトーシスを誘導することを示した。LOVO細胞に関して、同様の結果が得られたが、Ad-p53は単独で、Rb欠損BT54 9癌細胞において効率的なアポトーシスを誘導することが可能であった(示されていない)。実施例４ p16^INK4過剰発現のpRbに対する経時的効果驚くべきことに、３日間にわたるp16^INK4の過剰発現は、pRbのリン酸化形態の消失を引き起こしたばかりでなく、全Rbタンパク質の量の相当な減少をも引き起こした(これは、肝細胞癌系HuH7において最も顕著であった)。経時的実験は、 pRbレベルが５日間にわたり徐々に減少することを示した(図4)。免疫ブロット法細胞をPBSで２回洗浄し、プレートから擦り取り、細胞溶解バッファー中で溶解した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード・アッセイにより測定した。50μ gのタンパク質を、8％(pRbの場合)、10％（p53）または15％（p16^INK4およびp21 ）ポリアクリルアミド-SDSゲル上で電気泳動的に分離した。タンパク質を、セミドライブロッティングによりニトロセルロースに写し、増強化学発光系ECLを用いて免疫検出を行なった。p16^INK4、Rb(G3245,Pharmingen)、p53(Ab-2,Oncogene Sciences)およびp21（DCS60）に対するマウスモノクローナル抗体を一次抗体として使用し、二次検出にはビオチン化ヤギ抗マウス抗体およびストレプトアビジン-PODコンジュゲート（Amersham）を使用した。 pRbのダウンモジュレーションおよびアポトーシス結果は、癌抑制遺伝子産物p16^INK4の過剰発現が、G1において細胞周期を阻止するばかりでなく、ついでpRb合成の抑制をも誘導しうることも示している。これが今度は、腫瘍細胞をアポトーシス刺激に対して感受性にするらしい。そのような刺激はおそらく、培養中の持続的な増殖停止の条件下においても生じるのであろう。p16^INK4は正常細胞においても細胞周期停止を誘導するが、それに続くアポトーシスを引き起こさないため[Lukasら,(1995)およびこの実施例]、該データは、持続的な増殖停止に対するアポトーシス応答が、腫瘍細胞に特異的であることを示唆している。したがって、アポトーシス制御機構はおそらく、腫瘍細胞の発生中に生じた他の変化を認識するのであろう。アポトーシスの誘導には、機能的なp53の存在が必ずしも要求されないことが公知であり[Whiteら(1996),Bate sら(1996)]、この見解は、ある程度は、突然変異p53を保持するHuH7細胞での実験により裏付けられる。しかしながら、Ad-p16^INK4を導入したp53陽性腫瘍細胞（LOVO、データは示されていない）において、低度のアポトーシスが、より一貫して認められた。それにもかかわらず、過剰発現したp16^INK4によりRb 経路が遮断された細胞内での野生型p53の過剰発現により、アポトーシスが劇的に促進された。アポトーシス制御経路に関する現在の知見は、観察されたこの相乗作用を完全に説明するには不十分であるが、pRbレベルの徐々の減少により、１つの可能な筋書きが示唆される(図2)。p16^INK4による持続的なG1阻止のこの予想外の効果はおそらく、非リン酸化pRbの蓄積に応答したRB-1遺伝子発現の自己抑制［Gillら(1994)］および／またはそのタンパク質分解［AnおよびDou(1996) ］により引き起こされるのであろう。pRbレベルが十分に減少すると、アポトーシスに対するRbの防御的役割をもはや維持することができない。これは今度は、ある状況下でアポトーシスを誘導することが示されている転写因子E2F［Weinber g(1995),Nevins(1992)］の遊離による可能性がある[Qinら(1994),ShanおよびLee (1994),WuおよびLevine(1994)]。遮断されたRb経路（およびそれに続くpRbレベルの減少）が、例えば下流エフェクターの誘導に対して相乗的に作用することによりp53と協同するというメカニズムにより、p53の促進機能は最もよく説明されるであろう。bax遺伝子産物［Oltvaiら(1993)］は、このエフェクターの優れた候補である。なぜなら、それはp53により誘導されることが示されており[Oltvai ら(1993)]、また、E2Fがそのアップレギュレーションに関与している可能性があるからである。いくつかの腫瘍、特に、p53およびpRbを欠損している腫瘍は、明らかに、p53のみの過剰発現によるアポトーシス細胞死に感受性である[Yangら(1 995)，Rothら(1996)]。この実施例で試験した両方のRb陽性腫瘍細胞系（HuH7、L OVO）は、p53の過剰発現によりG1において強く停止されることもなければ、アポトーシスにより応答することもなかった。少なくともこれらのRb陽性腫瘍細胞系においては、Rb経路の阻止および／またはそれに続くpRbレベルのダウンレギュレーションを介したG1停止は、p53の過剰発現により促進されるアポトーシスのための前提条件である、と結論づけることができるであろう。したがって、アポトーシスのためには、低いpRb/p53比率が要求され、G1停止だけでは十分でないと考えられる。G1停止を引き起こすのに十分な正常レベルに近いp16^INK4の発現は、p53依存性アポトーシスを支持しない[Lukasら(1995)および未公開の結果]。正常なIMR-90細胞においてはアポトーシスに対するこの協同効果が認められなかったことを強調することが、重要である(図4)。したがって、過剰発現した野生型p53の存在下での pRbレベルのp16^INK4依存性ダウンモジュレーションは、腫瘍細胞においてのみアポトーシスを引き起こし、一方、正常細胞は、G1において停止したままである。 p53の存在下でのpRbダウンレギュレーションのこの腫瘍細胞特異的効果の分子的基礎は明らかでないが、それは十中八九、Rb経路の阻害に加えて、腫瘍の発生において生じた原癌遺伝子または癌抑制遺伝子中の突然変異によるものであろう。正常細胞においては、G1停止後のpRbのダウンレギュレーションは、おそらく異常ではなく、分化促進事象として機能している可能性がある。実施例５ p16^INK4およびp53の共発現はpRb/p53の比率を減少させアポトーシスを招く感染の前日に、HuH7細胞(8×10⁵細胞/10cmディッシュ）を播いた。Ad-p16^INK4 （15m.o.l.）およびAd-p53(15m.o.i.)でのアデノウイルス感染を、1mM MgCl₂の存在下、リン酸緩衝食塩水（PBS）中で１時間行なった。該ウイルス懸濁液を、新鮮な細胞培養培地と交換し、該細胞を37℃で３日間インキュベートした。この期間の後、細胞をPBSで２回洗浄し、溶解バッファー中で抽出した。タンパク質濃度を測定し、１レーン当たり50μgのタンパク質を10％ポリアクリルアミド-SD Sゲル上で分離した。タンパク質を、セミドライブロッティングによりニトロセルロース膜に写し、免疫検出を行なった。一次抗体は、pRbに対するG3245(Pharm ingen)、およびp53に対するAb-2（Oncogene Sciences)であった。特異的免疫複合体の検出は、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体およびストレプトアビジン-PODコンジュゲート（ECL系、Amersham）を使用して行なった。図５に示す通り、Ｘ線フィルムに露光することにより、化学発光を検出した。該イメージの線形性を保証するために種々の露光の比重（densitometric）スキャニングにより、バンドの強度を記録した。図５のpRb特異的およびp53特異的バンドのスキャンされた相対強度を、表１に記載する。表１このように、pRbレベルの５倍以上の減少およびそれに伴うp53レベルの４倍の増加の結果、p53に対するpRbの比率は、この処理により20倍以上減少した。細胞を、実施例２に記載の通り、細胞周期プロフィールに関して分析したところ、フローサイトメトリースキャンにおけるsub-G1ピークにより示される通り、その時点で該細胞の約50％がアポトーシスに進入していることが判明した(示されていない)。より一層低いpRb/p53比率（0.25）およびほぼ100％のアポトーシス誘導につながる、より多量のAd-p16^INK4およびAd-p53（25m.o.i.の各ウイルス）で、該実験を繰返した。実施例６ p16^INK4およびp53による腫瘍発生の抑制癌細胞へのin vitroでのアデノウイルスの導入がヌードマウスにおいて腫瘍増殖を妨げるか否かについて研究した。この目的のために、Ad-p16^INK4もしくはAd -p53、対照Adtkウイルス(m.o.i.100)、またはAd-p16^INK4およびAd-p53(それぞれ m.o.i.50)の混合物のいずれかをHuH7細胞に感染させ、該細胞をヌードマウスに皮下注射した。第２の実験では、半分の量のAd-p16^INK4およびAd-p53を使用し、合計で100のm.o.i.となるまでAd-βgalを加えた。６週間後、腫瘍サイズを測定した。結果を表２に要約する。すべての対照動物が腫瘍を形成し、一方、Ad-p16^INK4 に感染した細胞または二重感染細胞を注射した２群の10匹の動物のうちの２匹だけが、腫瘍を形成した。これらの腫瘍は、力価には無関係に、対照腫瘍のサイズの10％未満であった。p53を導入した細胞で得られた結果は、力価に大きく左右された。高い力価は、ある程度の増殖抑制効果を有していたが、それは、p1 6^INK4ウイルスのものほど顕著ではなかった。ヌードマウスでの実験 HuH7細胞を培養フラスコに播き、80％コンフルエントになるまで増殖させた。以下の表２に示すアデノウイルスを、100のm.o.i.でアプライした。PBS中での感染の1.5時間後、培地をアプライした。さらに７時間後、細胞を収穫し、3×10⁶ 細胞/動物（実験#1では、雌CD1-nu/nu、Charles River(Sulzfeld,Germany)、実験#2では、MDC,Berlinにおいて飼育した雌NMRI-I-nu/nu）でヌードマウスの左鼡径領域内に皮下注射した。６週間後、次式:V=axb²/2[Carlssonら(1983)]により腫瘍容積を求めた。表２：p16^INK4およびp53遺伝子の導入による腫瘍増殖の抑制示されている遺伝子を含有するアデノウイルスをヒト肝細胞癌細胞（HuH7）に導入し、ついで該細胞をヌードマウスに皮下注射した。６週間後に、腫瘍体積を測定した。数字は、各群において処理した５匹の動物のうちの、腫瘍を発生した動物の数である。該腫瘍の平均サイズおよび標準偏差が示されている。実験#1では、Adtk、Ad-p16^INK4またはAd-p53を、単独で投与する場合にはそれぞれ100のm .o.i.で、あるいは一緒に投与する場合には50のm.o.i.で与えた。実験#2では、A d-p16^INK4またはAd-p53は、単独で与える場合にはそれぞれ50のm.o.i.で投与し、Adβgalを使用して、全ウイルスm.o.i.を100に調整した。実施例７ p16^INK4およびp53による腫瘍増殖の抑制腫瘍細胞に該ウイルスベクターを予め導入することは強力な増殖抑制効果を有することが予想されたため、HuH7肝細胞癌細胞から発生した腫瘍内に該ウイルスベクターを直接注射する、予め樹立した腫瘍でのin vivo実験を行なった。この実験の結果を図６に示す。該データは、組合せアプローチの効果を示している。 Ad-p16^INK4は或る程度の効果を有し、Ad-p53は最低限の増殖遅延効果を有するにすぎなかったが、それらの２つの遺伝子の組合せは、少なくとも12日間のほとんど完全な腫瘍増殖阻止につながった。その時点で、１つの腫瘍が完全に消散した。ヌードマウスでの実験 in vivo遺伝子導入実験のために、3×10⁶個のHuH7細胞をヌードマウスの左鼡径領域内に皮下注射した。肉眼で認められる腫瘍にまで増殖したら、皮膚を切開し、腫瘍を露出させ、それにアデノウイルスベクターを150μl/動物の容量で注射した。この手順を４日後に繰返した。腫瘍体積の増加を18日間にわたリモニターした。 p16^INK4およびp53は腫瘍増殖抑制において協同するこの実施例は、アデノウイルスベクターによるp16^INK4およびp53遺伝子の組合せ導入が、正常または突然変異p53を発現するRb陽性腫瘍細胞においてp53単独では達成できないと考えられるアポトーシスの効率的な誘導を引き起こすことを示す。肝細胞癌細胞（HuH7）および結腸癌細胞（LOVO）へのそれらの２つの遺伝子の導入は、ヌードマウスにおける皮下腫瘍の発生を完全に妨げた。これらの条件下では、p16^INK4単独でも、腫瘍増殖の抑制を引き起こすのに十分であった(表１ )。in vivoにおける腫瘍内へのアデノウイルスベクターの注射は、異なる結果を与えた。p16^INK4では或る程度の増殖遅延が認められ、p53では効果がほとんど認められなかったが、それらの２つの遺伝子の組合せでは腫瘍増殖の強力な抑制が認められた(図6)。Adβgal対照感染による検査では、それらの腫瘍の多重注射でさえ、100％の感染を引き起こさなかった。18日後の腫瘍サイズのゆるやかな増加はおそらく、非感染細胞の成長（outgrowth）を反映するものであろう。癌の遺伝子治療のための効率的なベクターおよび生物学的原理の両方が確立されつつあるが、強固な腫瘍組織内に該ベクターを分布させる一層優れた方法を開発する必要がある。これに関しては、表面電極による電気パルスの適用が有用かもしれない(Rols,M.P.ら，1998)。また、効率的分布の要件は、古典的な化学療法および自殺遺伝子療法においても共に要求され、この場合、内部腫瘍塊への到達性が、そうでなければ該治療に応答する腫瘍における主な問題となる。しかしながら、示されている遺伝子治療の戦略は、腫瘍細胞に選択的であるという利点を有し、さらに、ヒトの悪性疾患の大部分に適用可能であろう。また、本明細書に示すデータは、ある特定の腫瘍のアポトーシス誘導経路（例えば、p53）とRb 経路のメンバーとの両方の状態の詳細な知見が、適当な治療の選択の際に重要であることを指摘している。診断および将来的な治療は共に、細胞周期制御［Wein berg(1995),Straussら(1995),SherrおよびRoberts(1995)］およびアポトーシス［White(1996)］の基本的メカニズムの現在の知見から利益を得るはずである。両方のメカニズムの統合された知見は、腫瘍細胞の選択的排除のための戦略のさらなる改良の助けとなるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月１９日（１９９９．４．１９）【補正内容】請求の範囲１．悪性細胞においてアポトーシスを誘導するための組成物の製造のための、 p53遺伝子を含有するベクターと組合されたp16INK4遺伝子を含有するベクターの使用であって、該アポトーシスが、pRbタンパク質のリン酸化の阻害を悪性細胞において誘導することにより該悪性細胞の増殖停止をまず達成した後、pRbのレベルを減少させp53タンパク質のレベルを増加させ、それにより悪性細胞内に存在するp53タンパク質の量に対するpRbタンパク質の比率を減少させることにより誘導されることを特徴とする使用。２．該ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の使用。３．該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびハイブリッドベクターよりなる群から選ばれる、請求項２に記載の使用。４．p16INK4遺伝子を含有するベクターがECACC受託番号V97021335である、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。５．該p16INK4遺伝子が、p16INK4タンパク質のcdk結合ドメインだけをコードする、請求項４に記載の使用。６．pRbとp53タンパク質との比率を0.49未満に減少させる、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。７．pRbのレベルを5.5倍まで減少させp53タンパク質のレベルを４倍まで増加させることにより、pRbとp53タンパク質との比率を減少させる、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。８．該悪性細胞が固形腫瘍の細胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。９．該固形腫瘍が、結腸直腸癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、頭頚部癌、腎臓癌および黒色腫よりなる群から選ばれる、請求項８に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バーテック，ジリデンマーク国ディーケー―2650 グレーヴェ，ストランドライストアリー 14 (72)発明者ルーカス，ジリデンマーク国ディーケー―2650 グレーヴェ，ラエルケモセン 10

Claims

【特許請求の範囲】１．悪性疾患の治療用の組成物の製造のための、遺伝物質を含有するベクターの使用であって、該ベクターが、悪性疾患に罹患した被験者に投与されると、pR bタンパク質のリン酸化の阻害を悪性細胞において誘導することにより悪性細胞の増殖停止をまず達成した後、pRbのレベルを減少させアポトーシス誘導タンパク質のレベルを増加させることにより、悪性細胞内のアポトーシス誘導タンパク質のレベルに対するpRbタンパク質のレベルの比率を減少させることにより、悪性細胞においてアポトーシスを誘導することを特徴とする使用。２．該ベクターが非ウイルスベクターである、請求項１に記載の使用。３．該ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の使用。４．該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびハイブリッドベクターよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の使用。５．該ベクターがECACC受託番号V97021335である、請求項１に記載の使用。６．該遺伝物質が、p16^INK4、p15^INK4、p18^INK4、p19^INK4、p21^KIP、p27^KIP、 p57^KIP、p53、bax、bakおよびbcl-Xよりなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、請求項１に記載の使用。７．該悪性細胞が、p53などのアポトーシス誘導タンパク質に関して陽性である、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。８．該遺伝物質がp16^INK4遺伝子の修飾体である、請求項７に記載の使用。９．該遺伝物質が、p16^INK4タンパク質のcdk結合ドメインだけをコードするp1 6^INK4遺伝子の修飾体である、請求項７に記載の使用。 10．アポトーシス誘導タンパク質を欠損した悪性細胞を、p53、bax、bakおよびbcl-Xよりなる群から選ばれる１以上の遺伝子の導入によりアポトーシス誘導タンパク質に関して陽性にする、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。 11．該遺伝物質が、アポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子と組合されたp16^INK4遺伝子である、請求項10に記載の使用。 12．該遺伝物質が、アポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子と組合された、p16^INK4タンパク質のcdk結合ドメインだけをコードするp16^INK4遺伝子の修飾体である、請求項10に記載の使用。 13．該導入遺伝物質の高レベルの過剰発現を達成させる、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。 14．選択した遺伝子の、２倍以上のレベルの過剰発現を達成させる、請求項13 に記載の使用。 15．選択した遺伝子の、４倍以上のレベルの過剰発現を達成させる、請求項13 に記載の使用。 16．選択した遺伝子の、６倍以上のレベルの過剰発現を達成させる、請求項13 に記載の使用。 17．選択した遺伝子の、８倍以上のレベルの過剰発現を達成させる、請求項13 に記載の使用。 18．選択した遺伝子の、10倍以上のレベルの過剰発現を達成させる、請求項13 に記載の使用。 19．該比率（pRb/アポトーシス誘導タンパク質）を0.4未満に減少させる、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。 20．pRbのレベルを少なくとも５倍減少させ該アポトーシス誘導タンパク質のレベルを少なくとも２倍増加させることにより、該比率（pRb/アポトーシス誘導タンパク質）を減少させる、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。 21．pRbのレベルを少なくとも10倍減少させ該アポトーシス誘導タンパク質のレベルを少なくとも２倍増加させることにより、該比率（pRb/アポトーシス誘導タンパク質）を減少させる、請求項20に記載の使用。 22．pRbのレベルを少なくとも20倍減少させ該アポトーシス誘導タンパク質のレベルを少なくとも２倍増加させることにより、該比率（pRb/アポトーシス誘導タンパク質）を減少させる、請求項20に記載の使用。 23．該悪性疾患が固形腫瘍である、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。 24．該悪性疾患が、結腸直腸癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、頭頚部癌、腎臓癌および黒色腫よりなる群から選ばれる、請求項23に記載の使用。 25．p16タンパク質またはその機能的等価体をコードする核酸配列を含み、さらに、該ベクターに固有の遺伝要素と組合された、アポトーシス誘導タンパク質をコードする核酸配列を所望により含むベクターであって、該固有要素が該遺伝子配列の有意な過剰発現を引き起こすことを特徴とするベクター。 26．ベクターAd-p16-9(ECACC受託番号V97021335)。