JPH08509869A

JPH08509869A - 膵臓および胆管の上皮細胞への遺伝子導入

Info

Publication number: JPH08509869A
Application number: JP6525647A
Authority: JP
Inventors: エム．ウィルソン，ジェームズ
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1993-05-10
Filing date: 1994-05-10
Publication date: 1996-10-22
Also published as: WO1994026915A1; PT698109E; EP0698109A1; EP1211319A2; DK0698109T3; AU6829994A; ES2180579T3; US20050048043A1; EP0698109B1; DE69431106D1; DE69431106T2; ATE221575T1; CA2162602A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者の膵臓あるいは胆管の上皮細胞への選択的体細胞遺伝子導入のための方法に関する。本発明の方法は、適切な導入媒体に会合された導入されるべき遺伝子を、膵臓あるいは肝臓のいずれかの導管系に導入することを包含する。さらに詳細には、本発明は、それらの上皮細胞内の遺伝子欠損により特徴づけられる遺伝子疾患（嚢胞性線維症など）を処置するために、これらの技術を使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】膵臓および胆管の上皮細胞への遺伝子導入発明の技術分野本発明は、患者の膵臓あるいは胆管の上皮細胞への選択的な体細胞遺伝子導入の方法に関する。本発明の方法は、適切な導入媒体（transfer vehicle）と会合された導入されるべき遺伝子の、膵臓あるいは肝臓のいずれかの導管系へ導入することを包含する。さらに詳細には、本発明は、上皮細胞の遺伝子欠損により特徴づけられる、嚢胞性線維症のような遺伝子疾患を処置するためのこれらの技術を使用することに関する。発明の背景肝臓および膵臓の導管（内分泌および外分泌の両方）内部を覆う上皮細胞は、これらの器官の適切な機能化および全般的なホメオスターシスを維持するのに重要である多くのタンパク質の合成に係わる。これらのタンパク質をコードする遺伝子に欠損を引き起こす疾患は、重大な、ときには致命的な影響を及ぼし得る。例えば、嚢胞性線維症（CF）は、細胞内外への水および電解質の輸送の異常によって特徴づけられる疾患である。CFの原因となる遺伝子、すなわち嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンス調節遺伝子（CFTR）は、CF患者の上皮細胞内に欠陥を有することが知られている。その遺伝子の単離および配列は、1989年8月31日に出願された係属出願第401,609号に記載されている。CF患者の主要な損傷部位は肺上皮であるが、膵管および胆管の両方もまた影響を受ける（T．F．Boatら、The Metabo lic Basis of Inherited Disease 第６編、C．R．Scriverら編、McGraw-Hill，N ew York，pp．2649-80（1989））。肝臓および膵臓の上皮細胞内の遺伝子欠損に特徴づけられる他の疾患は、胆石（胆石症）、上行硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、および真性糖尿病である。上記の疾患の処置は非常に重要である。１つの興味深いアプローチは、欠損遺伝子の機能性コピーを冒された細胞へ直接に挿入するための遺伝子置換療法の使用である。遺伝子置換療法の考えは、うまく遺伝子を培養の哺乳動物細胞へ導入することから生まれた。遺伝子導入の最も一般的な方法は、リン酸カルシウムと導入されるべき核酸との共沈殿物で哺乳動物細胞を処理することにより達成される。哺乳動物細胞は、この沈澱物をエンドサイトーシスを介して取り込み、次いで、これらの細胞のいくつかは、核酸配列によりコードされるポリペプチドを発現する。残念なことに、この技術は、インビトロの細胞培養物に限定され、そして患者をインビボで処置する場合にはあまり有用性はない。これは、核酸の不溶特性と、体内の細胞がこれらの沈澱物を取り込む効率が低いこととに原因する。標的細胞に核酸を運ぶためのウイルスあるいはリポソームの使用のような他の技術は、インビボにおいてより適用可能性を有する［C．Nicolauら、Meth．Enzy mo1. ，149，pp．157-76（1987）］。しかし、これらの方法にも短所がある。最も重大なのは、これらの技術のどれも、特定の細胞型に対して特異性であるものはなく、標準的な投与経路を介して適切な細胞へ目的の遺伝子を送達するのは困難である。最近、細胞レセプターリガンドと複合体化された核酸を使用する細胞特異的遺伝子導入の方法が記載された（米国特許第5,166,320号）。この方法は、インビボでの遺伝子療法に必要な細胞特異性を提供するが、核酸-リガンド複合体の作製においてさらなる経費および操作を必要とする。 1990年9月18日に出願された、出願人の係属出願第584,275号で、現在では米国特許第5,240,846号は、嚢胞性線維症を処置するために遺伝子療法を利用する方法を記載している。この出願は、多くの異なった遺伝子の送達系および多くの送達方法（特に、吸入、注入、および経口摂取）を記載している。この出願は、特に、肺上皮の処置に関するが、膵臓および胆管の上皮細胞の処置に対しては簡単に言及している。しかし、この出願は、肺上皮を処置するための記載されたどの方法も、膵臓および胆管の上皮に有効あるいは特異的であることを実証していない。従って、肝臓および膵臓の上皮細胞への細胞特異的遺伝子導入を達成する、経費のかからない比較的簡単な方法の必要性がまだ存在する。発明の要旨本発明は、膵臓および胆管の上皮細胞へのインビボでの遺伝子導入のための新規な技術を提供することにより、この必要性を満たす。出願人は、適切な導入媒体に会合された、膵臓あるいは肝臓のいずれかの導管系への導入されるべき遺伝子の投与は、管の内部を覆う上皮細胞により非常に選択的な取り込みを引き起こすことを発見した。遺伝子の投与は、技術を画像化するために、それらの導管に造影染料を注入することに対して現在使用される方法によって達成され得る。本発明の方法は、器官の導管系上皮における遺伝子欠損によって特徴づけられる、肝臓および膵臓の原発性疾患を処置するのに有効である。これらの遺伝子欠損は、細胞が、十分なレベルでポリペプチド発現しないこと、およびポリペプチドを過剰に産生することの両方を包含する。このような疾患は、これらの細胞および肺上皮に影響を及ぼす嚢胞性線維症を包含する。別の実施態様では、本発明は、肝細胞、膵ランゲルハンス島細胞（pancreatic islet cells）、および膵臓腺房細胞内へ遺伝子を導入する方法を提供する。導入されるべき遺伝子に会合される導入媒体の濃度が十分に高い場合、これらのさらなる細胞および導管上皮細胞は遺伝子を取り込み、そしてその遺伝子を発現する。これは、血流中に注入することなく、肝細胞への遺伝子導入を達成する第一の方法を示す。それはまた、膵ランゲルハンス島細胞および膵臓腺房細胞内への遺伝子導入を達成する第一の方法を示す。本発明の方法は、細胞特異的であることにより、そして患者の血流との接触を避けることにより、遺伝子導入に伴うリスクを有利に減少させる。これらの方法はまた、肝臓および膵臓の導管系を用いることにより提供される解剖学上の制限をうまく利用し、これにより、他の器官および他の細胞への不必要な遺伝子導入を避ける。そして、本発明の方法は、過剰の遺伝子物質および会合された導入媒体を十二指腸内に直ちに送達させ、そして糞便中に排泄させる、さらなる利点を提供する。図面の簡単な説明図１は、pAd.CMV-lacZの構造の概要図である。図２は、pAd.CB-CFTRの構造の概要図である。図３は、CF患者の膵臓腺癌由来の、Ad.CB-CFTR感染細胞および模擬感染細胞の両方からのXbaI-消化総細胞DNAへのヒトCFTR特異的DNAプローブのハイブリダイゼーションを示す。図４は、CF患者の膵臓腺癌由来の、Ad.CB-CFTR感染細胞および模擬感染細胞の両方からの総細胞RNAへのヒトCFTR特異的DNAプローブのハイブリダイゼーションを示す。図５のパネルAおよびBは、非反応性抗体（パネルA）あるいはCFTR特異的抗体（パネルB）のいずれかと、第２のFITC標識抗IgG抗体とを使用する蛍光抗体法によって、CF患者の膵臓腺癌由来のAd.CB-CFTR感染細胞中のCFTRの局在化を示す。図６のパネルA〜Eは、X-gal細胞化学法を用いて、低濃度のAd.CB-CFTRあるいはAd.CMV-lacZのいずれかで感染後の種々の時間でのラットの肝臓切片中のβ-ガラクトシダーゼの分布を示す。図７のパネルA〜Dは、標識CFTR特異的プローブへのハイブリダイゼーションによる、低濃度のAd.CB-CFTRあるいはAd.CMV-lacZのいずれかで感染後３日のラットの肝臓切片中の、ヒトあるいはラットのCFTR RNAの存在を示す。図８のパネルA〜Dは、両タンパク質に対して特異的な抗体を用いる二重免疫拡散法による、低濃度のAd.CB-CFTRあるいはAd.CMV-lacZで感染後３日のラットの肝臓切片中の、CFTRおよびサイトケラチン-18の分布を示す。発明の詳細な説明本発明は、患者の膵管あるいは胆管の上皮細胞内へ機能性遺伝子を導入する方法を提供する。本明細書中に使用されているような用語「機能性遺伝子」とは、ポリペプチドをコードし、標的細胞により発現され得る遺伝子のことである。その用語はまた、結合してポリペプチドの発現を阻害し得るアンチセンス核酸を包含する。用語「標的細胞」とは、目的の遺伝子を取り込む細胞あるいは細胞型のことである。本発明の方法は、膵臓あるいは肝臓のいずれかの導管系内に遺伝子を導入する工程を包含する。遺伝子導入を達成するために、導入されるべき遺伝子は、器官の上皮細胞を形質導入し得る担体（carrier）あるいは媒体と会合されなければならない。用語「導入媒体」および「担体」とは、標的細胞に目的の遺伝子を送達し得る任意の型の構成物のことである。多くのこのような担体は当該分野で公知である。例えば、上皮細胞に感染し得る種々のウイルスは、それらの感染性に影響を及ぼすことなく目的の遺伝子を運ぶように組換え操作され得る。本願において使用されているように、用語「感染する」および「感染性」とは、ウイルスが標的細胞へ遺伝子物質を導入する能力のことのみである。それらの用語は、ウイルスが標的細胞中で複製され得ることは意味しない。実際に、このようなウイルスは、標的細胞がウイルス複製の影響を受けないように、複製欠陥性であることが好ましい。より好ましくは、本発明の方法において遺伝子を運ぶために使用されるウイルスは、組換えアデノウイルスである。アデノウイルスは、上皮のような、非分裂細胞あるいはゆっくり分裂する細胞に感染する能力に対して好ましい。最も好ましくは、組換えアデノウイルスはAd5の誘導体であり、これは、欠失されプロモーターで置換されたE1領域にわたり、さらにエンハンサー配列を有するかあるいは有しない配列と、導入されるべき遺伝子とを有する。一旦標的細胞ゲノムに取り込まれた遺伝子の構成的な発現を提供する任意のプロモーターが使用され得る。このようなプロモーターの例は、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、マロニー（Ma loney）ウイルスLTR、標的細胞に対して内因性のプロモーター、およびサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターである。好ましいプロモーターは、β-アクチンプロモーターおよびCMVプロモーターである。これらの組換えアデノウイルスに使用され得る好ましいエンハンサー配列の例としては、CMVゲノム中に見出されるエンハンサー配列、特にゲノムの極初期領域由来のエンハンサー配列、およびα胎児タンパク質エンハンサー配列が挙げられる。本発明の方法において導入媒体として使用され得る他のウイルスは、複製欠陥レトロウイルスである。これらの複製欠陥レトロウイルスが使用される場合、それらのゲノムは、周知の技術に従って、ヘルパーウイルスによりパッケージされ得る。適切なレトロウイルスとしては、PLJ、pZip、pWe、およびpEMが挙げられ、これらの各々は当該分野で周知である。ゲノムをパッケージするための適切なヘルパーウイルスとしては、ΨCrip、ΨCre、Ψ2、ΨAm、およびアデノ関連ウイルスが挙げられる。ウイルス以外の遺伝子送達系もまた本発明の方法において使用され得る。例えば、導入されるべき遺伝子はリポソームにパッケージされ得る。細胞が、DNAをキャプシド化したリポソームとインキュベートされると、それらはDNAを取り込み、そしてそれを発現する。これらのリポソームを形成するために、導入されるべき遺伝子を発現する発現ベクターのDNAは、Hepes緩衝化生理食塩水のような適切な緩衝液中で、脂質、例えば、N-［1-（2,3-ジオレイロキシ）プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムクロライド（N-［1-（2,3-dioleyloxy）propyl］-N,N,N -trimethylammonium chloride）（DOTMA）と混合される。これは、本発明の方法において使用され得る脂質-DNA複合体（リポソーム）の自発的な形成をなす［P ．L．Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，pp．7413-17（1987）］。本発明において使用され得る別の遺伝子送達系は、DNA-タンパク質複合体である。これらの複合体の形成は米国特許第5,166,320号に記載されており、この開示は本明細書中に参考として援用されている。詳細には、これらの複合体は、ポリリジンのような適切なポリマーを介して、肝臓あるいは膵臓の上皮細胞表面のレセプターに対するポリペプチドリガンドに連結された、導入されるべき遺伝子（プロモーター、エンハンサー配列、および標的細胞中での発現に必要な他のDN Aを伴った）を含有する。この複合体は、リガンドが細胞表面レセプターに結合した後に、エンドサイトーシスを介して上皮細胞によって取り込まれる。次いで、DNAは、ポリマーリンカーを切断する細胞内酵素を介して、複合体の残り部分から切断される。一旦、導入されるべき遺伝子が適切な導入媒体と会合されると、それは、肝臓あるいは膵臓のいずれかの導管系に導入されなければならない。肝臓に対しては、投与の好ましい経路は、一般的な胆管を通してである。膵臓に対しては、好ましい経路は、膵管を通してである。いずれの場合にも、遺伝子物質は、腸を通して所望の導管系に送達され得る。２つの器官の１つのみが所望の標的であるならば、他方は、管が腸へ注ぐ場所で結紮して、遮断され得る。これらの器官の導管へ物質を挿入するための医学的に受容される方法が、本発明において使用され得る。好ましくは、使用される技術は、最少限の侵襲性であり、そして導管の逆行性充填（retrograde filling）を使用する。このような好ましい方法の１つは、内視鏡的逆行性胆管造影法（ERCP）である。ERCPは、内視鏡を介して総胆管あるいは膵管にカニューレ挿入して造影染料を注入することにより、胆管および膵管系を視覚化するために、現在使用されている。本発明の方法では、導入されるべき遺伝子および会合されたその導入媒体は、染料と置換される。標的器官へ目的の遺伝子を挿入するための他の方法としては、外科手術による移植、および腹腔鏡を介しての挿入が挙げられる。好ましい実施態様に従って、本発明は、体細胞遺伝子導入の技術を用いて、膵臓あるいは胆管の疾患を処置するための方法を提供する。種々の疾患は、膵臓あるいは胆管の上皮の遺伝子欠損に関連することが知られている。さらに、肝臓あるいは膵臓の種々の疾患のある種の症状群は、それらの器官の上皮細胞により明らかになる。例えは、膵臓あるいは肝臓の炎症は、上皮へのサイトカイン遺伝子導入を用いると、本発明の方法によって阻害され得た。さらに、胆管上皮の増殖を引き起こす肝臓疾患は、それらの細胞への増殖阻害遺伝子を送達するために使用される場合、本発明の遺伝子治療法によって処置され得た。本発明の方法によって処置され得る他のいくつかの疾患の例としては、上行硬化性胆管炎および原発性胆汁性肝硬変が挙げられる。さらに好ましい実施態様に従って、本発明の方法によって処置されるべき疾患はCFである。CFは、肺気道上皮に対して原発性の影響を及ぼす疾患である。しかし、その疾患はまた、膵臓および肝臓の上皮にも影響を及ぼす。CFにかかった肺を処置するための種々の治療法が開発されているので、これらの二次的な疾患部位はより重要になっている。 CFは、肝臓では、胆汁うっ滞、黄疸、そして最後には肝硬変につながり、そして膵臓では、膵炎、および吸収不良につながる。CF関連膵臓障害の現在の処置としては、酵素置換治療法が挙げられる。しかし、患者は、未だに膵炎およびそれに伴う栄養失調に苦しんでいる。現在、CF関連肝臓障害に対する治療法はない。 CFにおける欠損遺伝子は、トランスメンブラン塩素チャンネルと称する、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタス調節因子（CFTR）である。肝臓におけるCFTR発現は、胆管の内部を覆う上皮細胞に局在化されている。膵臓では、外分泌膵管の内部を覆う細胞は、CFTR発現の供給源であるようである。従って、本発明の方法は、CF関連の膵臓および肝臓の障害を処置するのに良く適している。 CFTR cDNAは、係属出願第584,274号、およびF．S．Collinsら、Science，235 ，pp．1046-49（1987）に記載されており、これらの開示は本明細書中に参考として援用されている。そのcDNAは、上記の任意の遺伝子送達系内に組み入れられ、そして本発明の方法において使用され得る。例えば、CFTR cDNAを含有する特定の組換えウイルスベクターの構築は、上記の'274号の出願に記載されている。それらのベクターは本発明の方法において有用である。最も好ましくは、CFTR DNAは、アデノウィルスAd5の誘導体に組み込まれる。この組換えベクター構築は、以下の実施例に記載されている。別の実施態様に従って、本発明は、遺伝子物質を肝細胞に導入する方法を提供する。本発明の前に、インビボで肝細胞をトランスフェクトする方法のみが、適切な媒体中の導入されるべき遺伝子を血流中に入れることを包含した。従って、パッケージされた遺伝子物質は、肝臓血管を通過したときに、血管内皮細胞によって、より効果的には迅速に分裂する肝細胞によって、取り込まれた。この技術に伴う問題は数倍存在した。第一に、遺伝子物質を血液に曝すことは、目的の遺伝子を運ぶ媒体に対する抗体の形成を潜在的に誘発し得た。第二に、血液系は、肝細胞をトランスフェクトするのに非常に非特異的な導管である。血液系への遺伝子の導入は、他の多くの型の細胞の望ましくないトランスフェクションを引き起こすようである。さらに、血液系の使用は、非常に非効果的であり、これにより、患者へ導入されるべき遺伝子物質をより多く必要とする。そして最後に、血液系に送達された過剰の物質の排出速度は遅く、これにより、遺伝子および担体に患者を曝すのが長引くので、潜在的に有害な影響を及ぼす。出願人は、胆管に導入される所望の遺伝子物質を運ぶ媒体の濃度が増加すると、本発明の方法が肝細胞および胆管上皮細胞への遺伝子物質の導入を起こすことを発見した。肝細胞および胆管上皮細胞を形質導入するために、ウイルス担体を使用する場合には、ウイルスの濃度は、約0.1〜100ml/kg体重の間の投与で、約1 0¹¹〜10¹⁴ pfu/mlの範囲であるべきである。より好ましくは、ウイルスの濃度は、約0.5〜20ml/kg体重の間の投与で、約10¹¹〜10¹² pfu/mlの範囲であるべきである。本発明の方法が肝細胞に対して遺伝子を標的づけるために使用される場合、導入媒体は、本出願中に記載されている組換えレトロウイルスあるいは組換えアデノウイルスのいずれかであることが好ましい。本発明の方法を用いて肝細胞に遺伝子を導入する能力は、これらの細胞の遺伝子疾患の処置およびありうる治療を可能にする。このような疾患としては、家族性高コレステロール血症および他の脂質障害、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、フェニルケトン尿症、およびα-1抗トリプシン欠損症が挙げられる。本明細書中に記載される発明がより十分に理解され得るために、以下の実施例が述べられる。これらの実施例は例示するためのみであり、いかなる方法によっても本発明を限定するようには解釈され得ないことは理解されるべきである。実施例１組換えアデノウイルスの構築 I．pAd.CMV-lacZ A．CMVプロモーター-lacZミニ遺伝子の調製プラスミドpUC19［C．Yanisch-Perronら、Gene，33，pp．103-19（1985）］をSma Iで消化し、次いで8ヌクレオチドのNotIリンカーを末端上にクローニングした。これは、SmaI部位を壊すが、一方リンカーの両側に２つのSacII部位を造る。次に、SV40のポリアデニル化シグナルを含有する196塩基対のフラグメント（S V40ヌクレオチド2533〜2729位）を、SV40含有ベクターから精製した［G．MacGre gorら、Somat．Cell Mol.Gen.，13，pp．253-65（1987）］。BamHIリンカーをそのフラグメントに付加し、次いで改変されたpUC19ベクターの単一のBamHI部位にクローニングした。NotI部位から上流のプロモーターで開始し、その制限部位を通った転写が、SV40後期遺伝子ポリアデニル化シグナルに出会うように、ポリアデニル化部位を配向させた。SV40初期遺伝子ポリアデニル化シグナルは、反対方向に存在する。次に、SV40後期ウイルスタンパク質遺伝子16s/19sスプライスドナーおよびアクセプトシグナルを含有するプラスミドpL1［H.Okayamaら、Mol．Cell Biol.，3 ，pp．280-89（1983）］由来の180塩基対XhoI-PstIフラグメントを、上記ベクター内にクローニングし、適切なシグナルを提供した。pCM5029［M.Boshartら、Ce ll ，41，pp．521-30（1985）］由来の619塩基対ThaIフラグメントとして得られた、ヒトサイトメガロウイルス極初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーを、pUC18のHincII部位にクローニングし、続いてBamHI/HindIIIフラグメントの部分としてそのベクターから回収した。次いで、そのフラグメントをT4ポリメラーゼで処理し、そして平滑末端を上記の改変pUC19ベクターに連結した。 E. coli β-ガラクトシダーゼ遺伝子を、EcoRIおよびXbaIにより、pC4AUG［G ．R．McGregorら、Somat．Cell Mol．Genet.，13，pp．253-65（1987）］から35 30塩基対フラグメントとして切り出した。次いで、NotIリンカーをそのフラグメントに付加し、そして得られた構築物を上記の改変pUC19ベクターのNotI部位にクローニングした。次に、CMVプロモーター／エンハンサー、lacZ遺伝子、およびSV40ポリアデニル化シグナルを含有する完全ミニ遺伝子を、SphIによりpUC19ベクターから切り出した。このフラグメントをクレノウフラグメントで処理し、そしてBclIリンカーで連結した。 B．pAdBglIIの調製およびミニ遺伝子のそのプラスミドへの連結マップユニット0から16.1にわたるAd5由来の配列を含有するプラスミドpEHX-L 3［E．Falck-Pedersenら、J．Virol. 63，pp．532-42（1989）］をEcoRIおよびB gl IIで消化して、マップユニット9.2から16.1のアデノウイルス配列およびプラスミド骨格を含有する5.2キロベースのフラグメントを取り出した。0から1マップユニットにわたり、5'逆方向反復、複製起点、およびキャプシド化シグナルを含有するアデノウイルス配列を、PCRを用いて、元のpEHX-L3ベクターから増幅させ、そしてEcoRI部位のすぐ下流の5'末端にNheI部位を、そして3'末端にBglII部位を与えた。次に、PCR増幅フラグメントをEcoRI/BglIIフラグメントに連結してプラスミドpAdBglIIを生成した。次に、上記のパートAで調製されたlacZ含有ミニ遺伝子を、BglIIで消化してウシ腸ホスファターゼで処理されたpAdBglIIベクターに順行配向にクローニングした。pAd.CMV-lacZの概要図を図１に示す。 II．pAd.CB-CFTR プラスミドpAd.CB-CFTRはpAd.CMV-lacZ由来である。それは、CMVプロモーターおよびlacZ遺伝子の場所に、ニワトリβ-アクチンプロモーター、ヒトCFTR cDNA 、およびMo-MLVレトロウイルス配列の小部分を含有する。 A．pCMV-BA-CFTRの構築ベクターpBA-CFTRは、Mo-MLVの完全な5'LTR、および、5'L TRとヌクレチド146から624位にわたる内部プロモーターと間のさらなるMo-MLVウイルス配列を含有する。このプラスミドはまた、ヌクレオチド7674位のClaI部位（これは、その後に合成リンカーでBamHI部位に変換された）から3'LTRの末端までの野生型Mo-MLV配列を含有する。ヌクレオチド7933位のPvuII部位からヌクレオチド8111位のXbaI部位までの3'LTRのウイルスエンハンサー要素を含有する配列を欠失させた。上記の配列に加えて、このベクターはまた、隣接のマウスゲノムDNA、およびHindIII部位からEcoRI部位にわたるpBR322配列を含有する。このベクター中のβ-アクチンプロモーターは、ヌクレオチド−266から＋1位にわたるニワトリβ-アクチン遺伝子のXhoI-MboIフラグメント由来であった［T ．A．Kostら、Nuc1．Acids Res.，11，pp．8287-301（1983）］。その後、MboI 部位をBamHI部位に変換し、そして改変プロモーターフラグメントを上記のベクター内にクローニングした。ヒトCFTRコード配列は、CFTR cDNAの4.6 kb SacIフラグメント［J．R．Riordanら、Science，245，pp．1066-73（1989）］由来であり、そして完全CFTRコード領域に加えて、少量の5'および3'非翻訳領域を含有した。SacI部位をBclI部位に変換し、そしてβ-アクチンプロモーターのすぐ後ろに、改変フラグメントを上記ベクターのBamHI部位にクローニングした。 CDM［B．Seedら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，pp．3365-69（1987）］をSpeIおよびPstIで消化し、エンハンサー配列含有フラグメントを精製し、pUC19内にクローニングすることにより、ヒトC MVの極初期遺伝子由来のエンハンサー配列を得た。次に、エンハンサー配列の部分を、そのベクターからXhoIおよびNcoIで切り出した。精製後に、合成リンカーのメントを、上記ベクターのβ-アクチンプロモーターに対して5'側に位置する特有のXhoI部位にクローニングした。得られたベクターをpCMV-BA-CFTRと名付けた。 B．CFTRミニ遺伝子によるpAD.CMV-lacZ中の1acZミニ遺伝子の置換ベクターpCMV-BA-CFTRをXhoIおよびNheIで消化して、β-アクチンプロモーター、CFTR遺伝子、および少量のレトロウイルス特異的配列を含有するフラグメントを切り離し、次いで平滑末端化した。プラスミドpAd.CMV-lacZをSnaBIおよびN ot Iで切断して、CMVプロモーターおよびlacZ構造遺伝子を切り出した。CMVエンハンサーおよびSV40ポリアデニル化シグナルを保持するプラスミドの残りの部分を平滑末端化し、そしてpCMV-BA-CFTR由来の平滑末端化フラグメントと連結して、プラスミドpAd.CB-CFTRを形成した。pAd.CB-CFTRの概要図を図２に示す。上記の方法で調製されたプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（12301 Parklawn Drive，Rockville Maryland 20852，USA）に、1993年5月 10日付で寄託され、かつ以下の受託番号：ATCC 75468 - pAd.CB-CFTRにより同定される組換えDNA分子によって例証される。 III．組換えAd.CB-CFTRウイルスの産生ベクターpAd.CB-CFTRをNheIで線状にし、そしてXbaIで消化されたdl7001ウイルスゲノムと混合した。dl7001ウイルスは、78.4から86マップユニットにわたる E3配列中に欠失を有するAd5/Ad2組換えウイルスである。そのウイルスは、0〜76 マップユニットにわたるAd5のEcoRIフラグメント、76〜83にわたるAd2のEcoRIフラグメント、および83-100マップユニットにわたるAd5のEcoRIフラグメントから作られるAd5-Ad2-Ad5組換えウイルス由来であった。次に、このAd5-Ad2-Ad5組換えウイルスのマップユニット78.4から86にわたる配列を切り出してdl7001を形成した［ClaearasおよびWold，Virol.，140，pp．23-43（1985）］。 293細胞［F．L．Grahamら、Methods in Molecular Biology，Vol，7，E．J．M urray編、The Humana Press，Clifton，NJ，pp．109-28（1991）］を、10%胎児ウシ血清、100 U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン（「1% pe n-strep」）を補充したDMEMを入れた150mmプレート中で、80%の集密度に達するまで増殖させた。次いで、これらの細胞を、線状にされたAd.CB-CFTRおよびXbaI で消化されたdl7001によって、共トランスフェクトした。これらの細胞をプラークが形成されるまで増殖させた。次いで、個々のプラークを単離し、そして293 細胞中で増幅させた。次いで、ウイルスDNAを個々のプラークから単離し、そして制限酵素開裂およびサザンブロット分析法によって、ヒトCFTR DNAの存在について分析した。次に、CFTR陽性プラークの１つを、二回目のプラーク精製をし、そしてそこに存在するウイルスをAd.CB-CFTRと名付けた。そのウイルスを以下のように293細胞中で増殖させた。293細胞の30個の150mmプレートを、80〜90%の集密度に達するまで上記のように増殖させた。培地を除去し、次いで細胞を2時間、10 m.o.i. にて、Ad.CB-CFTR（10ml DMEM／1% pen strepに含有された）で感染させた。次に、20mlのDMEM／15%胎児ウシ血清／1% pen-strepを加え、そしてインキュベーションを続けた。感染後約36〜40時間で、遠心分離により細胞を集め、そして10 mM Tris-HCl（pH 8.1）18ml中にそれらの細胞を再懸濁させた。それらの細胞を、凍結／解凍を３回行うことにより破壊して開かせた。次いで、細胞破片を、15 00×g、20分間の遠心分離によりペレット化した。上清を取り出し、そしてペレットを10mM Tris-HCl（pH 8.1）で１回洗浄した。上清を合わせ、そして20mlのC sCl段階勾配（10mM Tris-HCl（pH 8.1）中の1.20g/mlおよび1.45g/ml）にかけて層状にし、そして100,000×gで２時間遠心分離した。次いで、ウイルス粒子のバンドを取り出し、１容量のTris緩衝液中に希釈し、そして２回目の８ml勾配のCs Clバンド化にかけた。100,000×gで18時間の遠心分離後に、ウイルス粒子を回収し、そして５容量の10mM Tris-HCl（pH 8.1）、100mM NaCl、0.1% BSA、50%グリセロール中に保存した。使用する前に、Ham s培地中でSephadex G50に通してゲル濾過することによって、ウイルス調製物を脱塩した。ウイルスの最終濃度を、260nmの吸光度を測定することにより決定した。ウイルス力価を、293細胞を用いるプラークアッセイによって算定した。さらに、HeL a細胞を10moiで感染させ、次いで細胞を30日間継代することにより、複製能力を有するウイルスの存在について調べた。複製能力を有するウイルスの存在は、感染HeLa細胞における細胞変性効果を観察することにより確認される。以下の手法に使用されるどのウイルスも複製能力を有しなかった。実施例２ Ad.CB-CFTRがCF細胞を形質転換する能力最初に、Ad.CB-CFTRが、CF患者の膵臓腺癌由来のCFTR遺伝子を細胞系CFPACに導入する能力を試験した［M．L．Drummら、Cell，62，pp．1227（1990）］。これらの細胞を、10cm²のプレートにおいて、10%胎児ウシ血清および1% pen-strep を補充したIscoveの改変Delbecco培地（Gibco Laboratories，Grand Island，NY ）中で、37℃にて集密状態になるまで増殖させた。次いで、それらの細胞を１m. o.i.でAd.CB-CFTRにより感染させた。感染の48時間後に、それらの細胞を、CFTR の遺伝子導入および発現について分析した。分析は、細胞DNAおよびRNAについて行い、そして全細胞を分析するために免疫細胞化学を用いた。放射標識ハイブリダイゼーションプローブを、 M．A．Fielderら、Am．J．Physiol.，262，p．L779（1992）に記載されている（この開示は、本明細書に参考として援用されている）ラットCFTR cDNA（ヌクレオチド1770〜2475位）由来のPCR鋳型から、Promegaインビトロ転写システム（Pr omega Corporation，Pittsburgh，PA）を用いて、製造者の指示に従って、合成した。プローブをサザンブロットおよびノーザンブロット分析法、およびインサイチュハイブリダイゼーション研究に使用した。模擬感染細胞およびAd.CB-CFTR感染細胞の両細胞由来の総細胞DNA（10μg）を単離し、そしてXbaIで消化した。感染細胞由来のDNAのサザンブロットは、高レベルの遺伝子導入を実証した（図３）。模擬感染細胞およびAd.CB-CFTR感染細胞の両細胞由来の全RNAを単離し、ホルムアルデヒド／アガロースゲル中で電気泳動し、そしてナイロン膜に移行させた。ノーザンブロットは、豊富なレベルのCF TR転写物を実証した（図４）。免疫細胞化学法はまた、CFTRタンパク質を検出するために細胞に対して実施された。細胞を、−20℃で10分間メタノール中で固定し、そしてリン酸塩緩衝化生理食塩水中の20%正常ヤギ血清（「GS/PBS」）と30分間インキュベートした。次いで、それらの細胞を、ヒトおよびラットCFTR中に保存されているC-末端ペプチド（アミノ酸1468-1480位）［J．A．Cohnら、Biochem．Biophys．Res．Commun. ，181，p.36（1991）；C．R．Marinoら、J．Clin．Invest.，88，p.712（1991）；J．A．Coh nら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89，p．2340（1992）］に対して誘起されたウサギポリクローナル抗休５μg/mlと、2%GS/PBS中で50分間インキュベートした。コントロールは、非反応性抗体とのインキュベーション、および、細胞とのインキュベーションの前に、4℃で一晩、2% GS/PBS中で、抗CFTRペプチド抗体と0. 5mg/mlのCFTRペプチドとのプレインキュベーションを包含する。抗体とのインキュベーションの後に、細胞を2% GS/PBSで５分間、３回洗浄した。抗体は、細胞をFITCに結合されたヤギ抗ウサギIgGとインキュベーションすることにより、視覚化した。この実験の結果は、ウイルスに曝されたほぼ全細胞が、検出可能なレベルのCFTRを発現したことを実証した（図５）。さらに、細胞を、cAMP調節陰イオンコンダクタンスを行う能力（機能性CFTRタンパク質を発現する特性）について、アッセイした。詳細には、コラーゲン被覆されたガラスカバースリップ上で、上記の条件下に細胞を集密状態になるまで増殖させた。次いで、培地を除去し、そしてそれを水中NaI緩衝液の低張性1:1希釈液（130mM NaI、４mM KNO₃、１mM Ca(NO₃)₂、１mM Mg(NO₃)₂、１mM Na₂HPO₄、10 mM グルコース、20mM HEPES、pH 7.4）で置き替えた。そして、10mM（最終濃度）のハロゲン化合物に感受性の蛍光物質、すなわち6-メトキシ-N-（3-スルホプロピル）キノリニウム（「SPQ」）を加え、そして37℃で12分間インキュベートした。SPQ含有緩衝液を除去し、希釈していない等張性NaI緩衝液とそれを置き替え、そして細胞をさらに５分間インキュベートした。次いで、カバースリップを顕微鏡ステージに移し、370nm励起フイルターを通した光の下で、40X オイルエマージョンレンズ（oil emersion lens）（Nikon CF蛍光レンズ）を用いて映像化した。細胞からの発蛍光を、ビデオカメラに接続された高解像増感機（Video Scope，I nc，Washington，D.C.）によって集めた。カメラからのシグナル出力を、IMAGE 1/FLソフトウエアー（Universal Imaging，Media，PA）によって制御されたデジタル画像処理板に接続した。ウイルスに曝されたほぼ全部の細胞は、cAMP調節陰イオンコンダクタンスを行う能力を回復した。この実験は、Ad.CB-CFTRウイルスが、細胞への遺伝子導入を行い得、そしてCFTR遺伝子中の欠損を治療し得ることを実証した。実施例３ラット胆管上皮細胞のインビボでのトランスフェクション実施例１に記載されているAd.CMV-lacZウイルスを、ラットの胆管上皮細胞をインビボで標的にするための技術を開発するために使用した。雄Sprague Dawleyラット（約200g）をイソフルランで麻酔し、そして正中切開して内臓を曝した。総胆管を見つけ、そしてそれに27ゲージ針でカニューレ挿入した。種々の濃度のウイルス（1×10¹¹〜2×10¹² pfu/ml）を、0.3mlのリン酸塩緩衝化生理食塩水中に懸濁させ、そして１つの0.3mlアリコートを各ラット内にゆっくりと逆行注入した。注入が完了したときに、針を取り出し、そして胆管の穿刺部位の上に優しく圧力をかけた。次いで、皮膚および筋膜を断続した縫合糸で１つの層に閉じ、そしてその動物を回復させた。コントロールとして、逆行注入に対して実施例２において記載される、Ad.CB- CFTRウイルス（1×10¹¹ pfu/ml）を使用した。３日後に、動物を屠殺した。次いで、肝臓組織を、Xgal免疫化学法を用いて、 lacZ発現について評価した。新鮮な凍結切片（6μm）をスライドガラスに載せ、その後0.5%グルタルアルデヒド／PBS中で10分間固定し、１mM MgCl₂/PBSで２回洗浄し、そしてXgal溶液（1.6mg/ml K₃Fe(CN)₆、2.1mg/ml K₄Fe(CN)₆・3H₂O、40 mg/ml Xgal）中で４時間インキュベートした。最大量のウイルス（2×10¹² pfu/ ml）で注入された動物は、全ての胆管上皮細胞および80%を超える肝細胞でlacZ 発現を示した。低投与量のウイルス（1×10¹¹ pfu/ml）では、1%未満の肝細胞が lacZを発現したという点で、遺伝子導入はより選択的であったが、一方、ほぼ全ての肝臓内胆管上皮細胞はlacZを発現し続けた（図６のパネルBおよびC）。Ad.C B-CFTRで注入された動物は、lacZ発現を示さなかった（図６のパネルA）。この導入された遺伝子の発現の安定性を評価するために、より選択的な投与量を受けたラットを、感染後の７日目および21日目に屠殺した。７日目までに、肝細胞および大胆管上皮における発現が顕著に減少された（図６のパネルD）。しかし、小胆管上皮におけるlacZ発現は、21日間通して一貫したままであった（図６のパネルE）。同じ型の実験を、ラットあるいはヒトCFTR特異的プローブを用いてCFTR RNAについてのアッセイを繰り返した。ラットを感染させるために、1×10¹¹ pfu/mlの Ad.CB-CFTRあるいはAd.CMV-lacZのウイルスのいずれかを0.3ml使用した。感染ラットから取り出した一連の肝臓切片を、ラットあるいはヒトCFTRのいずれかに特異的なプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションを用いて、CFTR RNA の存在について分析した。Ad.CMV-lacZ感染ラットの胆管上皮細胞は、ラットCFT Rプローブにハイブリダイズした（図７のパネルＡ）が、ヒトプローブとはハイブリダイズしなかった（図７のパネルＢ）。このことは、ヒトプローブの特異性を示した。Ad.CB-CFTRウイルスで感染された動物は、大小の肝臓内胆管の胆管上皮細胞全体にわたって、ヒトCFTR RNAの拡散分布を示した（図７のパネルC）。その分布は、内因性ラットCFTR RNAの分布に類似していた（図７のパネルD）。さらに、ヒトCFTR転写物は、少数の肝細胞中に検出された。さらに、ラット肝臓切片を、CFTRに対しておよび胆管上皮細胞内で高レベルに発現されるマーカーであるサイトケラチン-18に対して特異的な抗体を用いて、二重免疫拡散法により分析した。Ad.CB-CFTRで処理された動物は、ほとんどの胆管上皮細胞の先端表面へのCFTR抗体の結合を示した（図８のパネルA）。この結合は、Ad.CMV-lacZ感染動物中の内因性CFTRタンパク質に対してはるかに過剰な抗体結合であった（図８のパネルC）。Ad.CB-CFTR感染動物内に検出されるCFTR特異的抗体結合は、サイトケラチン-18に対する抗体と同じ細胞に局在し（Ad.CMV-lacZ感染動物に対しても示された）、このことは、組換えCFT Rが適切な細胞型内で発現されることを確認する（図８のパネルBおよびD）。実施例４ヒト患者の胆管および膵管の上皮へのCFTR遺伝子導入 Ad.CB-CFTRは、CFの肝胆管側および膵臓側を処置するために使用される。CF患者に内視鏡を使用して十二指腸を視覚化し、そして総胆管の場所を捜し出す。一旦捜し出されると、総胆管はカニューレ挿入される。50〜150ml PBS中の適切な濃度のウイルス（約1×10¹¹ pfu/ml）を、内視鏡的逆行性胆管造影法によって総胆管中に挿入する。その手順の後に、患者は胆管上皮細胞中でCFTRを発現し始める。 CFの膵臓側の処置のための、同様のプロトコールは以下の通りである。肝臓と膵管との間に結紮を設ける。次いで、針を腸内に挿入して、ウイルスを膵管内に注入する。他の遺伝子あるいはそれらのcDNAコピーを運ぶ同様の組換えアデノウイルスを、これらの上皮細胞の他の遺伝子欠損を治療するための同じ手法に使用した。肝細胞、膵臓腺房細胞、および膵ランゲルハンス島細胞の遺伝子欠損はまた、ウイルスを高濃度で胆管および膵管中に投与すると、このような組換えウイルスを使用して治療され得る。本発明の多くの実施態様を本明細書中先に示したが、基本的な構成は、本発明の方法を使用する他の実施態様を提供するために変更され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例によって本明細書中先に示されていた特定の実施態様ではなく、むしろ後に添付されている請求の範囲によって限定されるべきであることが、理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．膵臓の小葉間導管を介して患者の膵管上皮細胞に機能性遺伝子を導入するために、該膵管上皮細胞に該遺伝子を導入し得る担体と会合された機能性遺伝子の使用。２．前記使用が、前記患者の原発性膵臓疾患を処置するためである、請求項１に記載の使用。３．前記疾患が、嚢胞性線維症である、請求項２に記載の使用。４．前記機能性遺伝子がCFTRである、請求項３に記載の使用。５．前記担体が組換えアデノウイルスであり、そして前記機能性遺伝子が該アデノウイルスのゲノム中に存在する、請求項１に記載の使用。６．前記担体がAd.CB-CFTRである、請求項４に記載の使用。７．前記遺伝子が、膵臓の小葉間導管へ、該導管の逆行性充填を介して導入される、請求項１から６のいずれかに記載の使用。８．前記逆行性充填が、内視鏡的逆行性胆管造影法により達成される、請求項７に記載の使用。９．総胆管を介して患者の胆管上皮細胞に機能性遺伝子を導入するために、該胆管上皮細胞に該遺伝子を導入し得る担体と会合された機能性遺伝子の使用。１０．前記使用が、患者の原発性肝臓疾患を処置するためである、請求項９に記載の使用。１１．前記疾患が、嚢胞性線維症である、請求項１０に記載の使用。１２．前記遺伝子がCFTRである、請求項１１に記載の使用。１３．前記担体が組換えアデノウイルスであり、そして前記遺伝子が該アデノウイルスのゲノム中に存在する、請求項９に記載の使用。１４．前記担体がAd.CB-CFTRである、請求項１２に記載の使用。１５．前記遺伝子が、逆行性充填を介して胆管に導入される、請求項９から１４のいずれかに記載の使用。１６．前記逆行性充填が、内視鏡的逆行性胆管造影法により達成される、請求項１５に記載の使用。１７．前記遺伝子が、さらに膵臓腺房細胞および膵ランゲルハンス島細胞に導入される、請求項１に記載の使用。１８．前記遺伝子がまた、さらに肝細胞に導入される、請求項９に記載の使用。