EP0815239A1 - Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisation en therapie genique - Google Patents

Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisation en therapie genique

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EP0815239A1
EP0815239A1 EP96906816A EP96906816A EP0815239A1 EP 0815239 A1 EP0815239 A1 EP 0815239A1 EP 96906816 A EP96906816 A EP 96906816A EP 96906816 A EP96906816 A EP 96906816A EP 0815239 A1 EP0815239 A1 EP 0815239A1
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EP
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lcat
virus
adenovirus
cholesterol
virus according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96906816A
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German (de)
English (en)
Inventor
Patrice Denefle
Nicolas Duverger
Martine Latta-Mahieu
Sandrine Seguret
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Definitions

  • the present invention relates to new recombinant viruses, their preparation and their use in gene therapy, for the transfer and expression in vivo of desired genes. More specifically, it relates to new recombinant viruses comprising an inserted gene coding for all or part of lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) or a variant thereof.
  • LCAT lecithin cholesterol acyltransferase
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising said recombinant viruses. More particularly, the present invention relates to defective recombinant viruses and their use for the prevention or treatment of pathologies linked to dyslipoproteinemias, which are known for their serious consequences at the cardiovascular and neurological level.
  • Dyslipoproteinemias are disorders of the metabolism of lipoproteins responsible for the transport in the blood and peripheral fluids of lipids such as cholesterol and triglycerides. They lead to significant pathologies, respectively linked to hypercholesterolemia or hyperttriglyceridérnie, such as in particular atherosclerosis.
  • Atherosclerosis is a complex, polygenic disease. which is defined histologically by deposits (lipid or fibro-lipid plaques) of lipids and other blood derivatives in the wall of the large arteries (aorta, coronary arteries, carotid). These plaques, more or less calcified depending on the progress of the process, can be combined with lesions and are linked to the accumulation in the arteries of fatty deposits consisting essentially of cholesterol esters.
  • plaques are accompanied by a thickening of the arterial wall, with enlargement of the smooth muscle, appearance of foam cells and accumulation of fibrous tissue.
  • the atherosclerotic plaque is very clearly in relief on the wall, which gives it a stenosing character responsible for vascular occlusions by atheroma, thrombosis or embolism which occur in the most affected patients.
  • Hypercholesterolaemia can therefore lead to cardio- very serious vascular events such as infarction, sudden death, cardiac decompensation, stroke, etc.
  • LDL low density lipoproteins
  • HDL high density lipoproteins
  • dyslipidaemia and in particular hypercholesterolaemia are mainly treated by means of compounds acting either on the biosynthesis of cholesterol (hydroxymethylglutaryl-coenzymeA reductase inhibitors, statins), or on the uptake and elimination of bile cholesterol (sequestrants or resins), or again on lipolysis by a mode of action which remains to be elucidated on the molecular level (fibrates). Consequently, all the major classes of drugs, which have been used in this indication (sequestrants, fibrates or statins), are intended only for the preventive aspect of the formation of atheroma plaque and not in fact for the treatment of the atheroma.
  • the current treatments for atheroma, post coronary accident are only palliative since they do not intervene on the homeostasis of cholesterol and they are surgical acts (coronary bypass, angioplasty).
  • a first approach for the treatment of these pathologies by gene therapy has been described in application WO94 / 25073.
  • This approach is based in particular on the direct transfer of genes coding for apolipoproteins.
  • the present invention constitutes a new therapeutic approach for the treatment of pathologies linked to dyslipoproteinemias. It is based more particularly on the transfer of genes coding for enzymes involved in the catabolism of cholesterol.
  • the transfer and expression in vivo of the LCAT according to the invention advantageously makes it possible to act not only on the level of circulating HDL, but also on their enzymatic activity linked to the reverse transport of cholesterol. This approach therefore has a double stimulating effect aimed at bringing cholesterol back to the liver.
  • the present invention also relies on the use of viruses which make it possible to transfer and express genes coding for enzymes of cholesterol metabolism in the liver, and to secrete said enzymes in the circulatory system where they exercise their activity with a great efficiency.
  • viruses which make it possible to transfer and express genes coding for enzymes of cholesterol metabolism in the liver, and to secrete said enzymes in the circulatory system where they exercise their activity with a great efficiency.
  • the examples presented below indicate in particular that the adenoviruses are capable, depending on the mode of administration, of transferring and expressing efficiently, for a significant period and without cytopathological effect, the gene coding for lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT).
  • LCAT lecithin cholesterol acyltransferase
  • a first object of the invention therefore resides in a defective recombinant virus containing at least one inserted gene coding for all or part of lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) or a variant thereof.
  • LCAT lecithin cholesterol acyltransferase
  • the invention also relates to the use of such a defective recombinant virus for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment or prevention of pathologies linked to dyslipoproteinemias.
  • LCAT Human lecithi-cholesterol acyltransferase
  • LCAT is an enzyme that catalyzes the esterification of free cholesterol by transfer of an acyl group of phosphatidyleholine to a hydroxyl residue of cholesterol, with the formation of cholesterol ester and lysophosphatidyleholine.
  • LCAT high density lipoproteins
  • the inserted gene can be a fragment of complementary DNA (cDNA), of genomic DNA (gDNA), or a hybrid construct consisting, for example, of a cDNA into which one or more introns would be inserted. They can also be synthetic or semi-synthetic sequences. As indicated above, it may be a gene encoding all or part of the LCAT or a variant thereof. Within the meaning of the present invention, the term variant denotes any mutant, fragment or peptide having at least one biological property of LCAT, as well as all natural variants of LCAT.
  • fragments and variants can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by genetic and / or chemical and / or enzymatic modifications, or even by cloning by expression, allowing the selection of variants according to their biological activity. . Genetic modifications include deletions, deletions, mutations, etc.
  • the gene inserted within the meaning of the invention is preferably the gene coding for all or part of the human LCAT. It is more preferably a cDNA or a gDNA.
  • the inserted gene also includes sequences allowing its expression in the infected cell. These may be sequences which are naturally responsible for the expression of said gene when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be sequences of eukaryotic or viral genes or derived sequences, stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not and in an inducible way or not.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect, or from the genome of a virus, and in particular, the promoters of the El A, MLP genes of adenovirus, CMV promoter, LTR-RSV, etc.
  • eukaryotic promoters include ubiquitous promoters (HPRT, vimentin, -actin, tubulin, etc.), promoters of intermediate filaments (desmin, neurofilaments, keratin, GFAP, etc.) promoters of therapeutic genes (MDR type, CFTR, factor VTII, etc.) tissue-specific promoters (pyruvate kinase, villin, promoter of the intestinal fatty acid binding protein, promoter of smooth muscle cell actin, specific promoters for the liver; Apo AI, Apo AU, human albumin etc) or the promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.).
  • these expression sequences can be modified by adding activation sequences, regulation, etc.
  • the inserted gene does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.
  • the inserted gene generally comprises, upstream of the coding sequence, a signal sequence directing the polypeptide synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural LCAT signal sequence, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the viruses according to the present invention are defective, that is to say incapable of replicating autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the inserted gene.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • the virus according to the invention can be derived from an adenovirus, an adeno-associated virus (AAV) or a retrovirus. According to a preferred embodiment, it is an adenovirus.
  • serotypes of adenoviruses there are different serotypes of adenoviruses, the structure and properties of which vary somewhat. Among these serotypes, it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR- 800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the encapsidation and the nucleic acid of interest.
  • the E1 region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the regions E1 and E4. According to another preferred embodiment, it comprises a deletion in region E1 at the level of which the region E4 and the sequence coding for LCAT are inserted (Cf FR94 13355).
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to a person skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 0 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917) .
  • they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequence of interest. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used should preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome 0 Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the El and E4 as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the nucleic sequence of interest bordered by two inverted repeat regions (ITR) from AAV, and a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) from AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • ITR inverted repeat regions
  • the recombinant AAVs produced are then purified by conventional techniques.
  • the invention therefore also relates to a recombinant virus derived from AAVs, the genome of which comprises a LCAT coding sequence bordered by AAV ITRs.
  • the invention also relates to a plasmid comprising a sequence coding for LCAT bordered by two ITRs of an AAV.
  • a plasmid can be used as such to transfer the LCAT sequence, optionally incorporated into a liposomal vector (pseudovirus).
  • retroviruses are integrative viruses, infecting dividing cells.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus”), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV ("spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • MoMuLV murine moloney leukemia virus
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV human moloney sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • Friend virus Friend virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs
  • the packaging sequence and said coding sequence is generally constructed, then used to transfect a cell line called packaging, capable to bring in trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant viruses as described above.
  • Such compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, etc. administration.
  • the composition according to the invention contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation can be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be administered according to different modes, and in particular by intravenous injection. Preferably, they are injected at the portal vein.
  • retroviruses it may be advantageous to use infected cells ex vivo for their reimplantation in vivo, possibly in the form of neo-organs (WO94 / 24298).
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned or the duration of the treatment sought.
  • the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml.
  • doses of 10 6 to 10 10 pfu / ml can also be used.
  • pfu plaque forming unit
  • compositions of the invention may also contain one or more defective recombinant adenoviruses containing an inserted gene coding for an apolipoprotein.
  • the association of these two types of genes exerts a synergistic effect on the activity of HDL and thus on the reverse transport of cholesterol.
  • the construction of adenovirus containing an inserted gene coding for an apolipoprotein was described in application WO94 / 25073.
  • a preferred combination comprises an adenovirus according to the invention and an adenovirus containing a gene coding for apolipoprotein AI or apolipoprotein AIV.
  • the present invention provides a new, very effective means for the treatment or prevention of pathologies linked to dyslipoproteinemias, in particular in the field of cardiovascular affections such as myocardial infarction, angina, sudden death, cardiac decompensation, accidents. cerebrovascular, atherosclerosis or restenosis. More generally, this approach offers a very promising therapeutic intervention for each case where a genetic or metabolic deficit of the LCAT can be corrected.
  • this treatment can concern both humans and any animal such as sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.
  • Figure 1 Representation of the plasmid pXL2639.
  • FIG. 2 Representation of the plasmid pXL2640.
  • Flgure3 Transfection of Hep3B cells with an adeno AdCMV hLCAT.
  • the Hep3B cells were infected with an adeno AdCMV hLCAT (empty squares) or adeno AdCMV ⁇ gal (filled squares) at multiplicities of infection of 10, 25, 50, 100, 250 and 500.
  • the LCAT activity was measured in the supernatant at 72 h. The determinations were made in duplicate and each value represents the mean ⁇ standard deviation.
  • FIG. 4 Analysis of TARN by Northern blot, isolated from the liver of infected or non-infected mice.
  • the total RNA comes from the livers of control mice (1), infected with the adeno AdCMV ⁇ gal (2) and the adeno AdCMV hLCAT (3). 10 ⁇ g of RNA were separated by formaldehyde-1.2% agarose electrophoresis, transferred to a nylon membrane and hybridized with various human LCAT and mouse apoE probes
  • FIGS 5A and 5B Effect of the transfer of the human LCAT gene on plasma concentrations of total cholesterol and HDL cholesterol.
  • Plasma concentrations of total cholesterol and HDL-cholesterol mean ⁇ standard deviation
  • control mice empty squares
  • 1 x 10 9 pfu of adeno AdCMV hLCAT empty circles
  • 1 x 10 9 pfu d adeno AdCMV ⁇ gal filled squares
  • transgenic mice expressing human apolipoprotein AI.
  • FIG. 6 Effect of human LCAT gene transfer on plasma concentrations of human apoA-I.
  • Plasma concentrations of human apoA-I mean ⁇ standard deviation
  • control mice empty squares
  • 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV hLCAT empty circles
  • 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV ⁇ gal filled squares
  • transgenic mice expressing human apolipoprotein AI.
  • Figure 8 Effect of the transfer of the human LCAT gene on the sizes of HDL particles.
  • the plasma comes from the mice, 5 days after the injection of 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV hLCAT (solid line) and controls (broken line).
  • the plasma was separated on a polyacrylamide gel (gradient 4-20%) and transferred by Western blot and human apoA-I is then revealed by specific antibodies against human apoA-I. The blot is then scanned by densitometry.
  • Figure 9 Effect of the transfer of the human LCAT gene on the mobility of particles containing apoA-I.
  • the plasma comes from the mice, 5 days after the injection of 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV ⁇ gal (1), 5 ⁇ 10 8 pfu of adeno AdCMV hLCAT (2) or 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV hLCAT (3).
  • 2 ⁇ l of plasma are used to separate the HDLs by electrophoresis on agarose gel followed by staining of the lipids with black Sudan.
  • Figure 10 Effect of the transfer of the human LCAT gene on the ability of the serum to promote efflux of cholesterol.
  • the plasma comes from mice, 5 days after the injection of 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV hLCAT (open circles), 1 ⁇ 10 9 pfu of adeno AdCMV ⁇ gal (solid squares) or control mice (open squares).
  • the cholesterol efflux is calculated by measuring the radioactivity in the medium and in the cells after the incubation of the serum diluted to 2.5% with Fu5Ah cells preloaded with radioactive cholesterol.
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of DNA.
  • phage T4 ligase Biolabs
  • the filling of the prominent 5 ′ ends can be carried out by the lenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • PCR Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki RK et al., Science 230 (1985) 1350- 1354; Mullis KB and Faloona FA, Meth. Enzym. 1 __ ⁇ (1987) 335-350]
  • PCR Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki RK et al., Science 230 (1985) 1350- 1354; Mullis KB and Faloona FA, Meth. Enzym. 1 __ ⁇ (1987) 335-350
  • DNA thermal cycler Perkin El er Cetus
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5477] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Construction of a defective recombinant adenovirus containing the human lecithin cholesterol acyltransferase (hLCAT) gene:
  • the defective recombinant adenoviruses were prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying, inter alia, the gene which it is desired to insert, after co-transfection into an appropriate cell line.
  • Plasmid pXL2616 contains the cDNA encoding human lecithin cholesterol acyltransferase.
  • the DNA fragment corresponding to the LCAT cDNA was isolated by the RT-PCR technique from the total RNA of HepG2 cells (First-Strand cDNA synthesis Kit, Pharmacia).
  • the cDNAs were produced by reverse transcription of the polyadenylated RNAs using hexanucleotide primers.
  • a PCR reaction was then carried out on these cDNAs with the oligonucleotides Sq5209: CCC TCG AGG CCA TCG ATG AGG CCT GAC TTT TTC AAT AAA (SEQ ID n ° 1) and Sq5287: GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (SEQ ID No.
  • Plasmids pXL2639 and pXL2640 contain the human LCAT cDNA, under the control of the CMV early promoter and the RSV virus LTR promoter, respectively.
  • the DNA was introduced via a calcium phosphate-DNA complex according to the method of Wilger et al., Cell, 11 (1977) 223.
  • LCAT activity was measured on cell supernatants 60 hours after transfection, according to the method of Chen and Albers, JLR, 23 (1982) 680.
  • the measurement is based on the use of proteoliposomes as exogenous substrate, prepared by incubation of 30 minutes of apoA-I, 14C cholesterol, phosphatidylcholine at a molar ratio of 0.8: 12.5: 250 at 37 ° C.
  • the activity is determined by measuring the conversion of 14C-cholesterol into 14C-cholesterol ester after incubation of the substrate with 4 ⁇ l of plasma or culture supernatant for 2 hours at 37 ° C.
  • the esters formed are separated by thin layer chromatography on silica plates using a petroleum ether-diethyl ether-acetic acid 76: 20: 1 mixture and the radioactivity is determined by liquid scintillation spectrometry.
  • the plasmids prepared in A were then linearized and cotransfected for recombination with the deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions encoded by the El (El A and E1B) o adenovirus regions.
  • the Ad.CMVLCAT adenovirus was obtained by homologous in vivo recombination between the Ad.RSV ⁇ gal adenovirus (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) and the plasmid pXL2639 according to the following protocol: plasmid pXL2639 linearized by the enzyme Xmnl and the adenovirus Ad.RSV ⁇ gal linearized by Clal are co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus generated are selected by plaque purification.
  • the recombinant adenovirus is amplified in cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 10 0 pfu / ml.
  • the viral particles are purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • the Ad.CMVLCAT adenovirus is stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • the expression and the functionality of the enzyme were tested after infection of Hep3B cells (cell line of human hepatocytes) by the recombinant adenovirus AdCMV-hLCAT at MOIs of 10, 25, 50, 100, 250 and 500.
  • the recombinant adenovirus AdCMV ⁇ gal was used as a control.
  • LCAT activity total amount of cholesterol esters produced in 1 hour in 100 ⁇ l of culture medium was measured on cell supernatants 72 hours after infection, according to the method of Chen and Albers, JLR, 23 ( 1982) 680.
  • the results (FIG. 3) show that the human LCAT secreted into the culture medium is functional and that the level of expression of the enzyme is dependent on the viral concentration in the cells.
  • mice transgenic for human apoA-I were infected by injection into the tail vein of recombinant adenovirus AdCMV-hLCAT (5 x 10 8 or 1 x 10 9 pfu), AdCMV- ⁇ Gal (1 x 10 9 pfu) or non-viral solution.
  • Very high levels of LCAT activity were detected in the plasma of mice infected with AdCMV-hLCAT (from 3266 ⁇ 292 to 9068 ⁇ 812 nmol / ml / h) 5 days after injection, while the levels observed in mice not infected or infected with AdCMV- ⁇ Gal correspond to the basal LCAT activity of mouse plasma.
  • mice infected with 1 x 10 9 pfu of AdCMV-hLCAT have plasma HDL-cholesterol and total cholesterol (CT) levels 7 and 6 times higher, respectively, than levels obtained in control mice ( Figure 5a and 5b) . These variations are associated with an increase in both esterified cholesterol (EC) and free cholesterol (CL), 8 and 2.5 times respectively compared to the levels obtained in the control mice.
  • the increase in plasma CE leads to an increase in the CE / CT ratio in the HDL fraction.
  • Mice infected with 1 ⁇ 10 9 pfu of AdCMV-hLCAT show a 2.5-fold increase in the concentration of human apoA-I compared with the control mice (FIG. 6).
  • mice Infected mice Infected mice Control infected mice with AdCMV ⁇ gal by AdCMV- by AdCMV-
  • esters of 68 ⁇ 8 71 ⁇ 10 319 ⁇ 22 ° 587 ⁇ 41 a cholesterol (CE)
  • VLDL + LDL 15 ⁇ 3 20 ⁇ 6 33 ⁇ 12 d 30 ⁇ 3 c - e -TC
  • the distribution of cholesterol in the lipoproteic fractions was carried out from pools of mouse plasmas by analytical chromatography by gel filtration (fig. 7). The concentrations of CT and human apoA-I were determined in the eluted fractions. These analyzes reveal a significant accumulation of cholesterol in the HDL fraction as well as an increase in size of HDL for the mice infected with 1 ⁇ 10 9 pfu of AdCMV-hLCAT compared to the control mice. Human apoA-I is found associated with particles the size of HDL.
  • apoA-I containing lipoproteins in transgenic mice for human apoA-I has been shown to be bimodal, with peak sizes of 9.4 nm and llnm. While in control mice, this same distribution is conserved, it is altered in mice infected with AdCMV-hLCAT. For the mice having received 1 ⁇ 10 9 pfu of AdCMV-hLCAT, the smaller peak disappears in favor of two larger peaks of 13.3 and 14.2 nm (FIG. 8).
  • Plasma lipoproteins were separated by electrophoresis in a non-denaturing agarose gel, followed by lipid detection. As shown in Figure 9, HDLs with pre-alpha mobility appear in the plasmas of mice infected with AdCMV-hLCAT, revealing that not only the size of HDL is affected but also the charges on the surface of HDL.
  • Example 6 Effects of Expression of Human LCAT on the Efflux of Cellular Cholesterol
  • the efflux of cell cholesterol was determined after incubation of the Fu5AH rat hepatoma cells with pools of plasma from infected or uninfected mice.
  • FIG. 10 shows that a 65% increase in efflux is obtained with the plasma of mice infected with AdCMV-hLCAT compared to the plasma of mice infected with AdCMV ⁇ gal. It appears that this increase is related to the higher concentrations of human apoA-I and HDL-cholesterol in mice infected with AdCMV-hLCAT. These results are in favor of greater efficiency of reverse transport of cholesterol resulting from the high expression of human LCAT.
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.

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Abstract

La présente invention concerne des virus recombinants défectifs contenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci, les compositions pharmaceutiques comprenant ces virus, et leur utilisation pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

Description

VIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT LA LECITHINE CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIOUE
La présente invention concerne de nouveaux virus recombinants, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique, pour le transfert et l'expression in vivo de gènes désirés. Plus précisément, elle concerne de nouveaux virus recombinants comprenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci. La présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits virus recombinants. Plus particulièrement, la présente invention concerne des virus recombinants défectifs et leur utilisation pour la prévention ou le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, qui sont connues pour leurs conséquences graves au niveau cardiovasculaire et neurologique.
Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l'hypercholestérolémie ou rhypertriglycéridérnie, telles que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique. qui est définie sur le plan histologique par des dépôts (plaques lipidiques ou fibro- lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio- vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro- vasculaires, etc.
Il est donc particulièrement important de pouvoir disposer de traitements permettant de diminuer dans certaines situations pathologiques les taux de cholestérol plasmatique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol) au niveau des tissus périphériques afin de décharger les cellules ayant accumulé du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipoprotéines dont les lipoprotéines de faible densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et/ou dégradé.
Actuellement, les dyslipidémies et en particulier les hypercholestérolémies sont traitées essentiellement au moyen de composés agissant soit sur la biosynthèse du cholestérol (inhibiteurs de hydroxyméthylglutaryl-coenzymeA reductase, les statines), soit sur la captation et l'élimination du cholestérol biliaire (les séquestrants ou résines), soit encore sur la lipolyse par un mode d'action qui reste à élucider sur le plan moléculaire (les fibrates). Par conséquent, toutes les grandes classes de médicaments, qui ont été utilisées dans cette indication (séquestrants, fibrates ou statines), s'adressent seulement à l'aspect préventif de la formation de la plaque d'athérome et non en fait au traitement de l'athérome. Les traitements actuels de l'athérome, post accident coronarien, ne sont que palliatifs puisqu'ils n'interviennent pas sur l'homéostase du cholestérol et qu'ils sont des actes chirurgicaux (by-pass coronarien, angioplastie).
Une première approche pour le traitement de ces pathologies par la thérapie génique a été décrite dans la demande WO94/25073. Cette approche repose en particulier sur le transfert direct de gènes codant pour des apolipoprotéines. La présente invention constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. Elle repose plus particulièrement sur le transfert de gènes codant pour des enzymes impliquées dans le catabolisme du cholestérol. En particulier, le transfert et l'expression in vivo de la LCAT selon l'invention permet de manière avantageuse d'agir non seulement sur le taux de HDL circulants, mais également sur leur activité enzymatique liée au transport inverse du cholestérol. Cette approche a donc un double effet stimulant visant à ramener le cholestérol vers le foie. La présente invention repose également sur l'utilisation de virus qui permettent de transférer et d'exprimer des gènes codant pour des enzymes du métabolisme du cholestérol au niveau du foie, et de sécréter lesdites enzymes dans le système circulatoire où elles exercent leur activité avec une grande efficacité. Les exemples présentés plus loin indiquent notamment que les adénovirus sont capables, selon le mode d'administration, de transférer et d'exprimer efficacement, pour une durée importante et sans effet cytopathologique, le gène codant pour la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT).
Un premier objet de l'invention réside donc dans un virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
La lécithi ne-cholestérol acyltransférase (LCAT) humaine est une protéine de
416 acides aminés, glycosylée et ayant une masse moléculaire relative de 65 à 69 kD. Le gène, ainsi que l'ADNc, codant pour la LCAT, longs respectivement de 4200 et 1744 pb, ont été clones et séquences (Me Lean et coll., Proc.Natl.Acad S /.83 (1986) 2335 et Me Lean et coll., Nucleic Acids Res. 14(23) (1986) 9397). La LCAT est une enzyme qui catalyse l'estérification du cholestérol libre par transfert d'un groupement acyl de la phosphatidyleholine sur un résidu hydroxyle du cholestérol, avec formation d'ester de cholestérol et de lysophosphatidyleholine. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et elle est libérée dans le plasma (6μg/ml), où elle est associée au lipoprotéines de haute densité (HDL), dites lipoprotéines antiathérogènes. Ces particules possèdent la capacité d'accepter le cholestérol se trouvant en excès dans les cellules, qui est alors estérifié par la LCAT. Les HDL riches en esters de cholestérol sont captées par le foie pour y être ensuite éliminées. Ce mécanisme, qui permet l'épuration du cholestérol excédentaire de l'organisme, est appelé transport inverse du cholestérol et est clairement impliqué dans la prévention de l'athérogénèse (Ana Jonas BBA 1084 (1991) 273 et Johnson et coll. BBA 1085 (1991)205). La LCAT, en créant un gradient de cholestérol libre entre les membranes plasmiques et les lipoprotéines circulantes, joue très vraisemblablement un rôle majeur dans ce processus.
Les conséquences physiologiques d'une absence partielle ou totale d'activité de l'enzyme LCAT dans le plasma sont illustrées par les changements pathologiques observés dans le syndrome de "l'oeil de poisson" (Fish Eye Disease, FES) et de la déficience classique en LCAT. Les symptômes cliniques de la FES sont l'opacité de la cornée ainsi qu'une atteinte rénale et une anémie. Ces deux syndromes sont associés à une hypoalphalipoprotéinémie et une élévation des triglycérides plasmatiques. Ds peuvent être distingués par le dosage biochimique de l'activité LCAT dans le plasma. Aucune activité d'estérification plasmatique du cholestérol n'est décelable chez un patient atteint de la déficience classique en LCAT alors que chez un patient ayant un profil de FES, une activité résiduelle en LCAT est observée. Le transfert du gène de la LCAT selon l'invention constitue une nouvelle approche pour le traitement des pathologies cardiovasculaires. La capacité de transférer ce gène et de surexprimer la LCAT in vivo permet selon l'invention d'exercer une double activité de stimulation sur l'efflux du cholestérol, liée d'une part à l'augmentation du taux de HDL circulants et d'autre part à l'augmentation de l'activité enzymatique de ces HDL.
Dans les virus de l'invention, le gène inséré peut être un fragment d'ADN complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la LCAT ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique de la LCAT, ainsi que tous variants naturels de la LCAT. Ces fragments et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par clonage par expression, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques incluent les suppressions, délétions, mutations, etc.
Le gène inséré au sens de l'invention est préférentiellement le gène codant pour tout ou partie de la LCAT humaine. Il s'agit plus préférentiellement d'un ADNc ou d'un ADNg.
Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes El A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, -actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VTII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie ; Apo AI, Apo AU, Albumine humaine etc) ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc.). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, le gène inséré comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la LCAT, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Le virus selon l'invention peut être dérivé d'un adénovirus, d'un virus adéno- associé (AAV) ou d'un rétrovirus.Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
II existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt. Encore 5 plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de
1 o l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon i 5 l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour la LCAT (Cf FR94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 0 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par 5 lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un 0 adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions dencapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence nucléique d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc également un virus recombinant dérivé des AAV dont le génome comprend une séquence codant pour la LCAT bordée des ITR de l'AAV. L'invention concerne également un plasmide comprenant une séquence codant pour la LCAT bordée de deux ITR d'un AAV. Un tel plasmide peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de la LCAT, éventuellement incorporé dans un vecteur liposomal (pseudo- virus).
Concernant les les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment EP 453242, EPI 78220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la LCAT selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4.861.719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De telles compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc.
Préférentiellement, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection intraveineuse. Préférentiellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. S'agissant des rétrovirus, ils peut être avantageux d'utiliser des cellules infectées ex vivo en vue de leur réimplantation in vivo, éventuellement sous forme de néo-organes (WO94/24298).
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 1010 pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Par ailleurs, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également contenir un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs contenant un gène inséré codant pour une apolipoprotéine. L'association de ces deux types de gènes permet d'exercer un effet synergique sur l'activité des HDL et ainsi sur le transport inverse du cholestérol. La construction d' adénovirus contenant un gène inséré codant pour une apolipoprotéine a été décrite dans la demande WO94/25073. Une association préférée comprend un adénovirus selon l'invention et un adénovirus contenant un gène codant pour l'apolipoprotéine AI ou l'apolipoprotéine AIV.
La présente invention offre un nouveau moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro- vasculaires, l'athérosclérose ou la resténose. Plus généralement, cette approche offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de la LCAT peut être corrigé.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Représentation du plasmide pXL2639.
Figure 2 : Représentation du plasmide pXL2640. Flgure3 : Transfection des cellules Hep3B par un adéno AdCMV hLCAT. Les cellules Hep3B ont été infectées par un adéno AdCMV hLCAT (Carrés vides) ou adéno AdCMV βgal (carrés pleins) à des multiplicités d'infection de 10, 25, 50, 100, 250 and 500. L'activité LCAT a été mesurée dans le surnageant à 72 h. Les déterminations ont été faites en double et chaque valeur représente la moyenne ± écart-type.
Figure 4 : Analyse de TARN par Northern blot, isolé de foie de souris infectées ou non infectées. L'ARN total provient des foies des souris témoins (1), infectées par l'adéno AdCMV βgal (2) et l'adéno AdCMV hLCAT (3). 10 μg d'ARN ont été séparés par électrophorèse en formaldehyde-1,2% agarose, transférés sur une membrane de Nylon et hybrides avec différentes sondes LCAT humaine et apoE de souris
Figures 5A et 5B ; Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les concentrations plasmatiques de cholestérol total et cholestérol-HDL. Concentrations plasmatiques de cholestérol total et cholestérol-HDL (moyenne ± écart-type) chez les souris témoins (carrés vides) ou après injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds vides) ou bien 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV βgal (carrés pleins) dans des souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-I humaine.
*: différent des souris infectées avec l'adéno AdCMV βgal, P < 0.0001.
Figure 6 : Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les concentrations plasmatiques d'apoA-I humaine. Concentrations plasmatiques d'apoA-I humaine (moyenne ± écart-type) chez les souris témoins (carrés vides) ou après injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds vides) ou bien 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV βgal (carrés pleins) dans des souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-I humaine.
*: différent des souris infectées avec l'adéno AdCMV βgal, P < 0.0001. Figure 7 ; Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la distribution lipoprotéique du cholestérol. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 5 10° pfu d'adéno AdCMV hLCAT (carrés pleins), 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ronds solides) ou témoins (carrés ouverts), le plasma est séparé sur une colonne Superose-6 par chromatographie de gel-filtration, et le cholestérol mesuré dans chaque fractions éluées.
Figure 8 : Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur les tailles des particules HDL. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (ligne pleine) et témoins (ligne discontinue). Les plasma ont été séparés sur un gel de polyacrylamide (gradient 4-20%) et transférés par Western blot et l'apoA-I humaine est alors révélée par des anticorps spécifiques anti-apoA-I humaine. Le blot est ensuite scanné par densitomètrie.
Figure 9: Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la mobilité des particules contenant l'apoA-I. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV βgal (1 ), 5 x 108 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (2) ou 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (3). 2 μl de plasma sont utilisés pour séparer les HDL par électrophorèse sur gel d'agarose suivit d'une coloration des lipides au noir Soudan.
Figure 10 : Effet du transfert du gène de la LCAT humaine sur la capacité du sérum à promouvoir des efflux de cholestérol. Les plasma proviennent des souris, 5 jours après l'injection de 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV hLCAT (cercles ouverts), 1 x 109 pfu d'adéno AdCMV βgal (carrés solides) ou souris témoins (carrés ouverts). L'efflux de cholestérol est calculé en mesurant la radioactivité dans le milieu et dans les cellules après l'incubation du sérum dilué à 2.5% avec des cellules Fu5Ah préchargées en cholestérol radioactif.
*: différent des souris témoins, P < 0.01. **: différent des souris témoins ou souris infectées avec l'adéno AdCMV βgal, P _ 0.0005. TECHNIQUES GÉNÉRALES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de lenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350- 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 1__\ (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin El er Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction d'un adénovirus recombinant défectif contenant le gène de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine (hLCAT) :
Comme indiqué avant, les adénovirus recombinants défectifs ont été préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène que l'on désire insérer, après co-transfection dans une lignée cellulaire appropriée.
A. Préparation des plasmides portant le gène de la LCAT humaine :
1. Construction du plasmide pXL2616
Le plasmide pXL2616 contient l'ADNc codant pour la lécithine cholestérol acyltransférase humaine.
Il a été construit de la manière suivante :
Le fragment d'ADN correspondant à l'ADNc de la LCAT a été isolé par la technique de RT-PCR à partir des ARN totaux des cellules HepG2 (First-Strand cDNA synthesis Kit, Pharmacia). Les cDNA ont été produits par transcription inverse des ARN polyadénylés à l'aide d'amorces hexanucléotidiques. Une réaction de PCR a alors été réalisée sur ces ADNc avec les oligonucléotides Sq5209 : CCC TCG AGG CCA TCG ATG AGG CCT GAC TTT TTC AAT AAA (SEQ ID n° 1) et Sq5287 : GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (SEQ ID n° 2) spécifiques de la séquence de la LCAT humaine (Mac Lean et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 1986) et qui permettent l'ajout d'un site Clal en 5' de la séquence de la LCAT et d'un site Sali en 3'. Le fragment de 1750 pb obtenu a été clone dans le plasmide pCR-ϋ (TA cloning Kit, Invitrogen) et sa séquence vérifiée. Le plasmide résultant a été appelé pXL2616.
2. Construction des plasmides pXL2639 (fig 1) et pXL2640 (fi g 2)
Les plasmides pXL2639 et pXL2640 contiennent l'ADNc de la LCAT humaine, sous le contrôle respectivement du promoteur précoce du CMV et du promoteur LTR du virus RSV.
Ils ont été construits de la manière suivante :
- digestion des plasmides pXL2375 (promoteur CMV) et pXL2376
(promoteur RSV-LTR), décrits dans la demande WO94/25073, par Clal et Sali, ce qui aboutit à l'excision de l'ADNc de l'apoA-I, puis,
- insertion du fragment Clal-Sall du plasmide pXL2616, contenant l'ADNc de la LCAT humaine, dans les plasmides préalablement digérés décrits ci-dessus.
B. Expression de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine in vitro
L'expression et la fonctionnalité de l'enzyme ont été testées après transfection transitoire de cellules 293 par les vecteurs ainsi construits (pXL2639 et pXL 2640).
L'ADN a été introduit par l'intermédiaire d'un complexe phosphate de calcium-ADN selon la méthode de Wilger et coll., Cell, 11 (1977) 223.
L'activité LCAT a été mesurée sur les surnageants cellulaires 60 heures après la transfection, selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. La mesure repose sur l'utilisation de protéoliposomes comme substrat exogène, préparés par incubation de 30 minutes d'apoA-I, de 14C cholestérol, de phosphatidylcholine à un ratio molaire de 0,8:12,5:250 à 37°C. L'activité est déterminée en mesurant la conversion de 14C- cholestérol en 14C-ester de cholestérol après incubation du substrat avec 4μl de plasma ou de surnageant de culture pendant 2 heures à 37°C. Les esters formés sont séparés par chromatographie sur couche mince sur plaques de silice à l'aide d'un mélange éther de pétrole-diéthyl éther-acide acétique 76:20:1 et la radioactivité est déterminée par spectrométrie à scintillation liquide.
Les résultats obtenus montrent que la LCAT humaine sécrétée par les cellules 5 293 transf ectées est fonctionnelle.
C. Préparation des adénovirus recombinants
Les plasmides préparés en A ont ensuite été linéarisés et cotransfectés pour la recombinaison avec le vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (El A et E1B) o d'adénovirus.
L'adénovirus Ad.CMVLCAT a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSVβgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le plasmide pXL2639 selon le protocole suivant : le plasmide pXL2639 linéarisé par l'enzyme Xmnl et l'adénovirus Ad.RSVβgal linéarisé par Clal sont co- 5 transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 0 pfu/ml.
Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad.CMVLCAT est conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
Le même protocole a été reproduit avec le plasmide pXL2640 conduisant à l'adénovirus recombinant Ad.RSVLCAT. Exemple 2 : Expression in vitro du gène de la LCAT humaine médiée par un adénovirus recombinant défectif
L'expression et la fonctionnalité de l'enzyme ont été testées après infection de cellules Hep3B (lignée cellulaire d'hépatocytes humains) par l'adénovirus recombinant AdCMV-hLCAT à des MOI de 10, 25, 50, 100, 250 et 500. L'adénovirus recombinant AdCMVβgal a été utilisé comme contrôle. L'activité LCAT (quantité totale d'esters de cholestérol produits en 1 heure dans 100 μl de milieu de culture) a été mesurée sur les surnageants cellulaires 72 heures après l'infection, selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. Les résultats (fig. 3) montrent que la LCAT humaine sécrétée dans le milieu de culture est fonctionnelle et que le niveau d'expression de l'enzyme est dépendant de la concentration virale dans les cellules.
Exemple 3 : Expression in vivo du gène de la LCAT humaine médiée par un adénovirus recombinant défectif
Des souris C57B1/6 transgéniques pour l'apoA-I humaine ont été infectées par injection dans la veine de la queue d' adénovirus recombinant AdCMV-hLCAT (5 x 108 ou 1 x 109 pfu), AdCMV-βGal (1 x 109 pfu) ou de solution non virale. Des niveaux très élevés d'activité LCAT ont été détectés dans le plasma des souris infectées par l' AdCMV-hLCAT (de 3266±292 à 9068±812 nmol/ml/h) 5 jours après l'injection, tandis que les niveaux observés chez les souris non infectées ou infectées par l'AdCMV-βGal correspondent à l'activité LCAT basale du plasma de souris.
Un Northern blot, réalisé avec les ARN de foie de souris infectées par l'AdCMV- hLCAT, a permis de révéler l'expression d'une seule espèce d'ARN messager s'hybridant avec une sonde correspondant à l'ADNc complet de la LCAT humaine, tandis qu'un Northern blotting, réalisé avec les ARN de foie des souris contrôles n'a mis en évidence aucune hybridation (fig.4). Exemple 4 : Effets de l'expression de la LCAT humaine sur les niveaux plasmatiques des lipoprotéines et apolipoprotéines.
L'expression transitoire de la LCAT humaine a entraîné un changement significatif des concentrations en lipides circulants et en apolipoprotéine A-I humaine (hapoA-I). Les variations les plus importantes ont été observées 5 jours après l'injection et sont résumées dans la Table I.
Les souris infectées par 1 x 109 pfu d' AdCMV- hLCAT ont des niveaux de HDL- cholestérol et de cholestérol total (CT) plasmatiques 7 et 6 fois supérieurs, respectivement, aux niveaux obtenus chez les souris contrôles (figure 5a et 5b). Ces variations sont associées à une augmentation à la fois du cholestérol estérifié (CE) et du cholestérol libre (CL), respectivement de 8 et 2,5 fois par rapport aux niveaux obtenus chez les souris contrôles. L'augmentation du CE plasmatique conduit à une augmentation du rapport CE/CT dans la fraction HDL. Les souris infectées par 1 x 109 pfu d' AdCMV-hLCAT présentent un accroissement de 2,5 fois de la concentration en apoA-I humaine par rapport aux souris contrôles (figure 6).
Table I. Paramètres lipidiques et apolipoprotéiques dans le plasma des souris transgéniques apoA-I humaines témoins et infectées par des adénovirus.
Souris Souris infectées Souris infectées Souris infectées témoins par AdCMV βgal parAdCMV- parAdCMV-
(n=5) (n=5) LCAT (n=2) LCAT (n=5)
1 x 109 pfu/miœ 5x10° pfu/miα 1 x lθ" pfu/miœ
Cholestérol 132 ±14 139± 18 462 ± 116e 827 ± 49a total (CT)
Esters de 68 ±8 71 ±10 319 ±22° 587±41a cholestérol (CE)
Cholestérol libre (FC) 63 ± 11 68 ±9 143 ± 37C 239 ±62°
CECT 0,52 ± 0,06 0,51 ± 0,07 0,69 ± 0,04e 0,71 ± 0,04e
(VLDL+LDL) 15±3 20 ±6 33 ± 12d 30 ± 3c-e -TC
Triglycérides 49 ±3 50 ±7 90±5e 140 ± 7b
Phospholipides 313 ±40 309 ± 20 773 ± 53e 954 ± 65b h apoA-I 247 ±14 246 ± 30 542 ± 32e 616±17a
Activité LCAT 45 ±2 45 ±3 3266 ± 292a 9068±812a (nmol/ml/h)
Vitesse d'esterification 149 ± 11 161 ± 17 ND 340 ± 5e endogène (nmol/ml/h)
HDL-TC 117±12 119± 14 429 ± 127e 797 ± 48a
HDL-CE 66 ±8 67 ±10 317±llb 570 ± 20a
HDL-FC 51 ± 11 52 ±12 112±26c 227 ± 53b
CE/CT dans 0,56 ± 0,05 0,57 ±0,05 0,74 ± 0,03e 0,72 ± 0,03e les HDL
Toutes les valeurs de lipides et lipoprotéines sont exprimées en mg/dl. ap<0.0001, Dp<0.0004, cp<0.01, dp=NS. Différent des souris témoins et des souris infectées par l'adéno AdCMV βgal-infected. ^≈NS Différent des souris infectées par l'adéno AdCMV βgal-infected Exemple 5 : Effets de l'expression de la LCAT humaine sur la répartition du cholestérol dans les lipoprotéines, la taille et la mobilité électrophorétique des HDL
La répartition du cholestérol dans les fractions lipoproteiques a été réalisée à partir de pools de plasmas de souris par chromatographie analytique par filtration sur gel (fig.7). Les concentrations de CT et d'apoA-I humaine ont été déterminées dans les fractions éluées. Ces analyses révèlent une accumulation importante de cholestérol dans la fraction HDL ainsi qu'une augmentation de taille des HDL pour les souris infectées par 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT par rapport aux souris contrôles. L'apoA-I humaine est retrouvée associée aux particules de la taille des HDL.
Il a été montré que la distribution en taille des lipoprotéines contenant de l'apoA-I chez les souris transgéniques pour l'apoA-I humaine était bimodale, avec des tailles de pics de 9,4 nm et llnm. Alors que chez les souris contrôles, cette même distribution est conservée, elle est altérée chez les souris infectées par l 'AdCMV-hLCAT. Pour les souris ayant reçu 1 x 109 pfu d'AdCMV-hLCAT, le pic le plus petit disparaît au profit de deux pics plus grands de 13,3 et 14,2 nm (fig.8).
Les lipoprotéines plasmatiques ont été séparées par électrophorèse dans un gel d'agarose non dénaturante, suivie par une détection des lipides. Comme le montre la figure 9, des HDL possédant une mobilité pré-alpha apparaissent dans les plasmas des souris infectées par l' AdCMV-hLCAT, révélant que non seulement la taille des HDL est affectée mais également les charges à la surface des HDL.
En résumé, l'expression forte et transitoire de la LCAT humaine chez les souris transgéniques pour l'apoA-I humaine conduit à la formation d'un profil lipoprotéique moins athérogène, grâce à l'augmentation des concentrations en HDL-cholestérol et en apoA-I humaine, ainsi que l'augmentation de taille et de charge des HDL.
Exemple 6 : Effets de l'expression de la LCAT humaine sur l'efflux de cholestérol cellulaire L'efflux du cholestérol cellulaire a été déterminée après incubation des cellules d'hépatome de rat Fu5AH avec des pools de plasmas de souris infectées ou non. La figure 10 montre qu'une augmentation de 65% de l'efflux est obtenu avec le plasma des souris infectées par l' AdCMV-hLCAT par rapport au plasma des souris infectées par l' AdCMV βgal. 11 s'avère que cette augmentation est en relation avec les concentrations plus élevées d'apoA-I humaine et de HDL-cholestérol chez les souris infectées par l'AdCMV-hLCAT. Ces résultats sont en faveur d'une plus grande efficacité du transport inverse du cholestérol résultant de la forte expression de LCAT humaine.
LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L' INVENTION:VIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT LA LECITHINE CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1
CCCTCGAGGC CATCGATGAG GCCTGACTTT TTCAATAAA 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GCGTCGACAG CTCAGTCCCA GGCCTCAGAC GAG 33

Claims

REVENDICATIONS
1. Virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
2. Virus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée.
3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2.
4. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine.
5. Virus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène inséré code pour tout ou partie de la LCAT humaine ou d'un variant de celle-ci.
6. Virus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène inséré code pour la LCAT humaine.
7. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNc.
8. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNg.
9. Virus selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le gène inséré comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée.
10. Virus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le gène inséré comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
11. Adénovirus selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion de tout ou partie de la région El.
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion de tout ou partie de la région E4.
13. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un virus adéno-associé (AAV).
14. Virus selon la revendication 13 caractérisée en ce que son génome comprend le gène codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci bordé de 2 ITR.
15. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un rétrovirus.
16. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
17. Utilisation selon la revendication 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'athérosclérose et/ou de la resténose.
18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable et en ce qu'elle comprend de 10^ à 10^4 pfu/ml d'adénovirus.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'elle contient également un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs codant pour une apolipoprotéine.
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