FR2731710A1 - Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique - Google Patents

Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne des virus recombinants défectifs contenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci, les compositions pharmaceutiques comprenant ces virus, et leur utilisation pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

Description

VIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT LA LECITHINE CHOLESTEROL
ACYLTRANSFERASE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIOUE
La présente invention concerne de nouveaux virus recombinants, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique, pour le transfert et l'expression in vivo de gènes désirés. Plus précisément, elle concerne de nouveaux virus recombinants comprenant un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci. La présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits virus recombinants.
Plus particulièrement, la présente invention concerne des virus recombinants défectifs et leur utilisation pour la prévention ou le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, qui sont connues pour leurs conséquences graves au niveau cardiovasculaire et neurologique.
Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l'hypercholestérolémie ou l'hypertriglycéridémie, telles que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépôts (plaques lipidiques ou fibrolipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol.Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, etc.
Il est donc particulièrement important de pouvoir disposer de traitements permettant de diminuer dans certaines situations pathologiques les taux de cholestérol plasmatique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol) au niveau des tissus périphériques afin de décharger les cellules ayant accumulé du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipoprotéines dont les lipoprotéines de faible densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et/ou dégradé.
Actuellement, les dyslipidémies et en particulier les hypercholestérolémies sont traitées essentiellement au moyen de composés agissant soit sur la biosynthèse du cholestérol (inhibiteurs de l'hydroxyméthylglutaryl-coenzymeA reductase, les statines), soit sur la captation et l'élimination du cholestérol biliaire (les séquestrants ou résines), soit encore sur la lipolyse par un mode d'action qui reste à élucider sur le plan moléculaire (les fibrates). Par conséquent, toutes les grandes classes de médicaments, qui ont été utilisées dans cette indication (séquestrants, fibrates ou statines), s'adressent seulement à l'aspect préventif de la formation de la plaque d'athérome et non en fait au traitement de l'athérome.Les traitements actuels de l'athérome, post accident coronarien, ne sont que palliatifs puisqu'ils n'interviennent pas sur l'homéostase du cholestérol et qu'ils sont des actes chirurgicaux (by-pass coronarien, angioplastie).
Une première approche pour le traitement de ces pathologies par la thérapie génique a été décrite dans la demande W094/25073. Cette approche repose en particulier sur le transfert direct de gènes codant pour des apolipoprotéines. La présente invention constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. Elle repose plus particulièrement sur le transfert de gènes codant pour des enzymes impliquées dans le catabolisme du cholestérol. En particulier, le transfert et l'expression in vivo de la LCAT selon l'invention permet de manière avantageuse d'agir non seulement sur le taux de HDL circulants, mais également sur leur activité enzymatique liée au transport inverse du cholestérol. Cette approche a donc un double effet stimulant visant à ramener le cholestérol vers le foie.La présente invention repose également sur l'utilisation de virus qui permettent de transférer et d'exprimer des gènes codant pour des enzymes du métabolisme du cholestérol au niveau du foie, et de sécréter lesdites enzymes dans le système circulatoire où elles exercent leur activité avec une grande efficacité.
Les exemples présentés plus loin indiquent notamment que les adénovirus sont capables, selon le mode d'administration, de transférer et d'exprimer efficacement, pour une durée importante et sans effet cytopathologique, le gène codant pour la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT).
Un premier objet de l'invention réside donc dans un virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
La lécithine-cholestérol acyltransférase (LCAT) humaine est une protéine de 416 acides aminés, glycosylée et ayant une masse moléculaire relative de 65 à 69 kD.
Le gène, ainsi que l'ADNc, codant pour la LCAT, longs respectivement de 4200 et 1744 pb, ont été clonés et séquencés (Mc Lean et coll., Proc.Natl.Acad Sci.83 (1986) 2335 et Mc Lean et coll., Nucleic Acids Res. 14(23) (1986) 9397). La LCAT est une enzyme qui catalyse l'estérification du cholestérol libre par transfert d'un groupement acyl de la phosphatidylcholine sur un résidu hydroxyle du cholestérol, avec formation d'ester de cholestérol et de lysophosphatidylcholine. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et elle est libérée dans le plasma (6 > g/ml), où elle est associée au lipoprotéines de haute densité (HDL), dites lipoprotéines antiathérogènes.
Ces particules possèdent la capacité d'accepter le cholestérol se trouvant en excès dans les cellules, qui est alors estérifié par la LCAT. Les HDL riches en esters de cholestérol sont captées par le foie pour y être ensuite éliminées. Ce mécanisme, qui permet l'épuration du cholestérol excédentaire de l'organisme, est appelé transport inverse du cholestérol et est clairement impliqué dans la prévention de l'athérogénêse (Ana Jonas BBA 1084 (1991) 273 et Johnson et coll. BBA 1085 (1991)205). La
LCAT, en créant un gradient de cholestérol libre entre les membranes plasmiques et les lipoprotéines circulantes, joue très vraisemblablement un rôle majeur dans ce processus.
Les conséquences physiologiques d'une absence partielle ou totale d'activité de l'enzyme LCAT dans le plasma sont illustrées par les changements pathologiques observés dans le syndrome de "l'oeil de poisson" (Fish Eye Disease, FES) et de la déficience classique en LCAT. Les symptomes cliniques de la FES sont l'opacité de la cornée ainsi qu'une atteinte rénale et une anémie. Ces deux syndromes sont associés à une hypoalphalipoprotéinémie et une élévation des triglycérides plasmatiques. Ils peuvent être distingués par le dosage biochimique de l'activité LCAT dans le plasma.
Aucune activité d'estérification plasmatique du cholestérol n'est décelable chez un patient atteint de la déficience classique en LCAT alors que chez un patient ayant un profil de FES, une activité résiduelle en LCAT est observée. Le transfert du gène de la
LCAT selon l'invention constitue une nouvelle approche pour le traitement des pathologies cardiovasculaires. La capacité de transférer ce gène et de surexprimer la
LCAT in vivo permet selon l'invention d'exercer une double activité de stimulation sur l'efflux du cholestérol, liée d'une part à l'augmentation du taux de HDL circulants et d'autre part à l'augmentation de l'activité enzymatique de ces HDL.
Dans les virus de l'invention, le gène inséré peut être un fragment d'ADN complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques.
Comme indiqué ci-avant, il peut s'agir d'un gène codant pour tout ou partie de la
LCAT ou d'un variant de celle-ci. Au sens de la présente invention, le terme variant désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique de la LCAT, ainsi que tous variants naturels de la LCAT. Ces fragments et variants peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par modifications génétique et/ou chimique et/ou enzymatique, ou encore par clonage par expression, permettant la sélection de variants en fonction de leur activité biologique. Les modifications génétiques incluent les suppressions, délétions, mutations, etc.
Le gène inséré au sens de l'invention est préférentiellement le gène codant pour tout ou partie de la LCAT humaine. Il s'agit plus préférentiellement d'un ADNc ou d'un ADNg.
Généralement, le gène inséré comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule infectée. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non.A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes El A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, a-actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments intermédiaires (desmine, neurofilaments, kératine, GFAP, etc) les promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, facteur VIII, etc) les promoteurs spécifiques de tissus (pyruvate kinase, villine, promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, promoteur de l'actine a des cellules du muscle lisse, promoteurs spécifiques pour le foie , Apo AI, Apo AII, Albumine humaine etc) ou encore les promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc,). En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence.
Par ailleurs, le gêne inséré comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la LCAT, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré.
Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Le virus selon l'invention peut être dérivé d'un adénovirus, d'un virus adénoassocié (AAV) ou d'un rétrovirus.Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les
ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour la LCAT (Cf FR94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectifs, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et
E4 telles que décrites notamment dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus.Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence nucléique d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV.Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. L'invention concerne donc également un virus recombinant dérivé des AAV dont le génome comprend une séquence codant pour la LCAT bordée des ITR de l'AAV. L'invention concerne également un plasmide comprenant une séquence codant pour la LCAT bordée de deux ITR d'un AAV. Un tel plasmide peut être utilisé tel quel pour transférer la séquence de la LCAT, éventuellement incorporé dans un vecteur liposomal (pseudovirus).
Concernant les les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature voir notamment EP 453242, EP178220,
Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt.Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la LCAT selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.
Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm- 12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment.De telles compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc.
Préférentiellement, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection intraveineuse.
Préférentiellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. S'agissant des rétrovirus, ils peut être avantageux d'utiliser des cellules infectées ex vivo en vue de leur réimplantation in vivo, éventuellement sous forme de néo-organes (W094/24298).
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 1010 pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfù ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées.Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Par ailleurs, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également contenir un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs contenant un gène inséré codant pour une apolipoprotéine. L'association de ces deux types de gènes permet d'exercer un effet synergique sur l'activité des HDL et ainsi sur le transport inverse du cholestérol. La construction d'adénovirus contenant un gène inséré codant pour une apolipoprotéine a été décrite dans la demande W094/25073. Une association préférée comprend un adénovirus selon l'invention et un adénovirus contenant un gène codant pour l'apolipoprotéine AI ou l'apolipoprotéine AIV.
La présente invention offre un nouveau moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, I'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires,
I'athérosclérose ou la resténose. Plus généralement, cette approche offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de la LCAT peut être corrigé.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1: Représentation du plasmide pXL2639.
Figure 2 : Représentation du plasmide pXL2640.
TECHNIQUES CFNFRAI FS DE BIOLOGIE MCI.ECULAIRE
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis
T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoUchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed chais Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 13501354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 54635467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
ExEMPLFS
Exemple 1 : Construction d'un adénovirus recombinant défectif contenant le gène de la lécithine cholestérol acvltransférase humaine (hLCAT
Comme indiqué avant, les adénovirus recombinants défectifs ont été préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène que l'on désire insérer, après co-transfection dans une lignée cellulaire appropriée.
A. Préparation des plasmides portant le gène de la LCAT humaine.
1. Construction du plasmide pXL2616
Le plasmide pXL2616 contient l'ADNc codant pour la lécithine cholestérol acyltransférase humaine.
Il a été construit de la manière suivante
Le fragment d'ADN correspondant à l'ADNc de la LCAT a été isolé par la technique de RT-PCR à partir des ARN totaux des cellules HepG2 (First-Strand cDNA synthesis Kit, Pharmacia). Les cDNA ont été produits par transcription inverse des ARN polyadénylés à l'aide d'amorces hexanucléotidiques. Une réaction de PCR a alors été réalisée sur ces ADNc avec les oligonucléotides Sq5209 : CCC TCG AGG
CCA TCG ATG AGG CCT GAC TTT TTC AAT AAA (SEQ ID n" 1) et Sq5287:
GCG TCG ACA GCT CAG TCC CAG GCC TCA GAC GAG (SEQ ID n" 2) spécifiques de la séquence de la LCAT humaine (Mac Lean et coll., Proc. Natl. Acad.
Sci., 83, 1986) et qui permettent l'ajout d'un site ClaI en 5' de la séquence de la LCAT et d'un site SalI en 3'. Le fragment de 1750 pb obtenu a été cloné dans le plasmide pCR-II (TA cloning Kit, Invitrogen) et sa séquence vérifiée. Le plasmide résultant a été appelé pXL2616.
2. Construction des plasmides pXL2639 et pXL2640
Les plasmides pXL2639 et pXL2640 contiennent l'ADNc de la LCAT humaine, sous le contrôle respectivement du promoteur précoce du CMV et du promoteur LTR du virus RSV (cf figures).
Ils ont été construits de la manière suivante
- digestion des plasmides pXL2375 (promoteur CMV) et pXL2376 (promoteur
RSV-LTR), décrits dans la demande W094/25073, par ClaI et SalI, ce qui aboutit à l'excision de l'ADNc de l'apoA-I, puis,
- insertion du fragment ClaI-SalI du plasmide pXL2616, contenant l'ADNc de la LCAT humaine, dans les plasmides préalablement digérés décrits ci-dessus.
B. Expression de la lécithine cholestérol acyltransférase humaine in vitro
L'expression et la fonctionnalité de l'enzyme ont été testées après transfection transitoire de cellules 293 par les vecteurs ainsi construits (pXL2639 et pXL 2640).
L'ADN a été introduit par l'intermédiaire d'un complexe phosphate de calcium-ADN selon la méthode de Wilger et coll., Cell, 11 (1977) 223.
L'activité LCAT a été mesurée sur les surnageants cellulaires 60 heures après la transfection, selon la méthode de Chen et Albers, JLR, 23 (1982) 680. La mesure repose sur l'utilisation de protéoliposomes comme substrat exogène, préparés par incubation de 30 minutes d'apoA-I, de 14C cholestérol, de phosphatidylcholine à un ratio molaire de 0,8:12,5:250 à 37"C. L'activité est déterminée en mesurant la conversion de 14C- cholestérol en 14C-ester de cholestérol après incubation du substrat avec 4ll1 de plasma ou de surnageant de culture pendant 2 heures à 37"C. Les esters formés sont séparés par chromatographie sur couche mince sur plaques de silice à l'aide d'un mélange éther de pétrole-diéthyl éther-acide acétique 76:20::1 et la radioactivité est déterminée par spectrométrie à scintillation liquide.
Les résultats obtenus montrent que la LCAT humaine sécrétée par les cellules 293 transfectées est fonctionnelle.
C. Préparation des adénovirus recombinants
Les plasmides préparés en A ont ensuite été linéarisés et cotransfectés pour la recombinaison avec le vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (ElA et ElB) d'adénovirus.
L'adénovirus Ad.CMVLCAT a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad.RSVssgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) et le plasmide pXL2639 selon le protocole suivant : le plasmide pXL2639 linéarisé par l'enzyme XmnI et l'adénovirus Ad.RSVBgal linéarisé par ClaI sont cotransfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad.CMVLCAT est conservé à -80 C dans 20 % de glycérol.
Le même protocole a été reproduit avec le plasmide pXL2640 conduisant à l'adénovirus recombinant Ad.RSVLCAT.
Exemple B: Transfert et expression in vivo du gène de la LCAT humaine
Le stock de virus que l'on produit ainsi est ensuite utilisé pour l'infection in vivo.
Dans un premier temps, les virus sont utilisés pour l'infection in vivo des hépatocytes chez la souris. Pour cela, les particules virales sont injectées par exemple par la voie portale, par la veine de la queue ou le sinus rétro-orbital chez des souris
C57Bl6 (une technique d'injection utilisable a été décrite par Jaffe et al., Nature
Genetics, vol. (1992) 372). Le niveau d'expression plasmatique de LCAT humaine est testé par ELISA à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine humaine, et la spécificité de l'expression du gène recombinant est vérifiée à l'aide de sondes oligonucléotidiques humaines spécifiques dans différents tissus (northern blotting et
RT-PCR).

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Virus recombinant défectif contenant au moins un gène inséré codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci.
2. Virus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule infectée.
3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un adénovirus, de préférence de type Ad 5 ou Ad 2.
4. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus d'origine animale, de préférence canine.
5. Virus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le gène inséré code pour tout ou partie de la LCAT humaine ou d'un variant de celle-ci.
6. Virus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène inséré code pour la LCAT humaine.
7. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNc.
8. Virus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le gène inséré est un ADNg.
9. Virus selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le gène inséré comprend des séquences permettant son expression dans la cellule infectée.
10. Virus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce que le gène inséré comprend une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
11. Adénovirus selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend une délétion de tout ou partie de la région El
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une délétion de tout ou partie de la région E4.
13. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un virus adéno-associé (AAV).
14. Virus selon la revendication 13 caractérisée en ce que son génome comprend le gène codant pour tout ou partie de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) ou d'un variant de celle-ci bordé de 2 ITR.
15. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'il sagit d'un rétrovirus.
16. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.
17. Utilisation selon la revendication 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'athérosclérose et/ou de la resténose.
18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme injectable et en ce qu'elle comprend de 104 à 1014 pfu/ml d'adénovirus.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'elle contient également un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs codant pour une apolipoprotéine.
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