DE69636907T2

DE69636907T2 - Verwendung von lezithin-cholesterin-azetyltransferase für die behandlung von atherosklerose

Info

Publication number: DE69636907T2
Application number: DE69636907T
Authority: DE
Inventors: Silvia Potomac SANTAMARINA-FOJO; M. Jeffrey Potomac HOEG; Bryan H. Rockville BREWER
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-11-09
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2016-11-09
Also published as: CA2236982C; WO1997017434A2; ATE353957T1; AU728257B2; ES2283007T3; EP0871713B1; DE69636907D1; US6635614B1; EP0871713A2; AU7729396A; CA2236982A1; WO1997017434A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Atherosklerose sowie Erkrankungen im Zusammenhang mit einem Mangel an Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität.
Atherosklerose ist ein pathologischer Zustand von Säugetieren, der durch die Anreicherung von Cholesterin in den Arterien charakterisiert ist. Cholesterin reichert sich in den Schaumzellen der Arterienwand an und verengt dadurch das Lumen. Dies führt zu einem verminderten Blutfluss. Die klinischen Spätschäden von Atherosklerose schließen Herzkrankheit und Herzanfall, Schlaganfall und periphere Gefäßerkrankung ein. Zusammen genommen sind diese Erkrankungen für mehr krankheitsbezogene Todesfälle in den industrialisierten Ländern verantwortlich als jede beliebige andere Ursache.
Die Entwicklung von humaner Atherosklerose steht in umgekehrter Beziehung zu der Konzentration von High Density-Lipoproteinen bzw. Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) im Serum. D.J. Gordon und B.M. Rifkind (1989) N. Engl. J. Med. 321:1311. Hohe HDL-Konzentrationen scheinen vor der Entwicklung von vorzeitiger Atherosklerose zu schützen, während niedrige HDL-Cholesterin-Konzentrationen mit einem erhöhten Risiko einer Herzkreislauferkrankung assoziiert sind. D.J. Gordon et al. (1986) Circulation 74:1217. Es ist vorgeschlagen worden, dass ein 1%-iger Anstieg der HDL-Konzentration zu einer 3%-igen Abnahme des Risikos der Entwicklung klinischer Atherosklerose beim Menschen führen würde. Gordon und Rifkind, oben.
Das Plasmaproteinenzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) katalysiert den Transfer von Fettsäure von der sn-2-Position von Lecithin zu der freien Hydroxylgruppe von Cholesterin. J.A. Glomset et al. (1966) J. Lipid Res. 7:638. J. McLean et al. (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83:2335-2339 beschrieben die Klonierung und die Sequenz einer humanen LCAT-cDNA. J. McLean et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:9397-9406 beschrieben eine vollständige Gensequenz für humane LCAT.
Zuerst wurde vor beinahe 30 Jahren vorgeschlagen, dass der Veresterungsprozess mithilfe dieses Enzyms der Schlüsselschritt bei dem Cholesterintransfer aus den Körpergeweben zur Leber sein könnte. Es wurde vorgeschlagen, dass dieser Vorgang, "reverser Cholesterintransport" genannt (J.A. Glomset (1968) J. Lipid Res. 9:155), die Entfernung von Cholesterin aus dem Körper begünstigt. Allerdings war von Erhöhungen von LCAT nicht bekannt, dass sie das Atheroskleroserisiko vermindern.
Verschiedene Mutationen des LCAT-Gens sind bekannt. Individuen, die homozygot hinsichtlich einer nicht-funktionellen LCAT-Mutante sind, haben die klassische LCAT-Mangelerkrankung, charakterisiert durch Eintrübung der Hornhaut, normochrome Anämie und Glomerulosklerose. Mutationen im LCAT-Gen, die in einer gewissen LCAT-Restaktivität resultieren, führen zur Fischaugen-Erkrankung, charakterisiert durch Undurchsichtigkeit der Hornhaut und Hypo-Alphaliproteinämie. H.-G. Klein et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:499-506.
Es besteht somit ein Bedarf an Zusammensetzungen und Verfahren zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Atherosklerose und mit LCAT-Mangel assoziierten Zuständen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf, indem Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung des Serumniveaus von LCAT-Aktivität zur Verfügung gestellt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist festgestellt worden, dass ein Anstieg des Niveaus von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität in einem Kaninchen (welches ein akzeptiertes Modell der Entwicklung von Atherosklerose in Menschen ist; D.J. Gordon und B.M. Rifkind (1989) N. Engl. J. Med. 321:1311) eine Verminderung der Anreicherung von Cholesterin in den Arterien verursacht. Diese Feststellung ist eine Überraschung, weil keine früheren Ergebnisse darauf hingewiesen haben, dass eine Erhöhung des LCAT-Aktivitätsniveaus eine solche Wirkung haben würde. In dem Kaninchenmodell führte ein Anstieg der Gewichtsmenge von humaner LCAT in dem Serum um das etwa Fünffache über das normale Human-Niveau ebenfalls zu signifikanten Abnahmen bei den Gesamt-Triglyceriden, mindestens fünffachen Zunahmen bei der Menge der Lipoproteine hoher Dichte und einer etwa siebenfachen Abnahme bei dem Verhältnis von Gesamtcholesterin zu Lipoproteinen hoher Dichte in Tieren, die mit einer an Cholesterin reichen Diät gefüttert worden waren. Deswegen ist das Anheben der LCAT-Aktivität im Serum von Menschen, Kaninchen und anderen Säugetieren mit ähnlichen Arten des Lipoproteinstoffwechsels eine wirksame Behandlung gegen Atherosklerose.
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Anreicherung von Cholesterin in einem Subjekt, das keinen LCAT-Mangel aufweist, vor. Die Erfindung beinhaltet gleich falls die Verwendung von LCAT zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Atherosklerose in einem Subjekt, das keinen LCAT-Mangel hat.
Es wird ein Verfahren beschrieben, das die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine pharmazeutisch wirksame Menge von LCAT umfasst, an ein Subjekt einbezieht. Die Zusammensetzung wird intravenös verabreicht. Es werden ebenfalls pharmazeutische Dosierungsformen beschrieben, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine pharmazeutisch wirksame Menge von LCAT umfassen.
Es wird ebenfalls die Transfektion von Zellen mit einer Nukleinsäure beschrieben, die eine für die LCAT-Expression codierende Nukleotidsequenz umfasst, wodurch die transfizierten Zellen LCAT exprimieren und in das Serum ausreichend LCAT sekretieren, um LCAT auf ein für die Verminderung der Cholesterinanreicherung wirksames Niveau anzuheben. Das Verfahren bezieht die Transfektion von Zellen in vivo ein. Als Alternative bedingt das Verfahren die Transfektion von Zellen ex vivo und die Verabreichung transfizierter Zellen, die LCAT exprimieren und sekretieren, an das Subjekt in einer Menge, die ausreicht, um die LCAT-Aktivität auf ein für die Verminderung der Cholesterinanreicherung wirksames Niveau anzuheben.
Es werden ebenfalls Verfahren beschrieben, welche die Verabreichung eines Arzneimittels einbeziehen, das die endogene LCAT-Erzeugung in dem Subjekt hochreguliert.
Es wird ebenfalls ein Verfahren beschrieben, welches das Anheben sowohl der LCAT-Aktivität im Serum wie auch des Niveaus von Apo A-I im Serum auf einen für die Verminderung der Cholesterinanreicherung wirksamen Betrag einbezieht. Es werden ebenfalls Vektoren beschrieben, umfassend eine Nukleinsäure, die Expressionskontrollsequenzen umfasst, die in operativer Weise mit einer Sequenz verbunden sind, die für die Expression von LCAT codiert, und Expressionskontrollsequenzen, die in operativer Weise mit einer Sequenz verbunden sind, die für die Expression von Apo A-I codiert.
Es werden ebenfalls Verfahren zur Behandlung eines LCAT-Mangelzustands in einem Säugetier-Subjekt beschrieben, die das Anheben der LCAT-Aktivität im Serum des Subjekts auf ein therapeutisch wirksames Niveau umfassen. Der Zustand kann das Fischaugen-Syndrom oder das klassische LCAT-Mangelsyndrom sein.
Es werden ebenfalls nicht-humane, hinsichtlich LCAT transgene Säugetiere, die eine absolute LCAT-Serumaktivität von mindestens 1000 nmol/ml/h aufweisen, beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 stellt einen Vergleich der Atherosklerose in Kontroll-Kaninchen und transgenen Kaninchen, die humane LCAT überexprimieren, mittels quantitativer Planimetrie bzw. Flächenvermessung dar. Die Aorten von männlichen, hinsichtlich LCAT transgenen Kaninchen (n = 12) (oben) und Kontrollkaninchen (n = 10) (unten), die mit einer 0,3%-igen Cholesterin-Futter-Nahrung während 17 Wochen gefüttert worden waren, wurden gewonnen und mit Sudan IV angefärbt. Der Prozentanteil des Oberflächenbereichs, der sich anfärbte, wurde durch Flächenvermessung des digitalisierten Bildes ermittelt. J.F. Cornhill et al. (1985) Arteriosclerosis 5:415. Die Zusammenstellungen der Bilder aus den Studiengruppen sind für die transgenen Kaninchen und die Kontroll-Kaninchen zusammengefasst, und zwar mit im unteren Bereich gezeigten abgestuften Schattierungen der Verteilungswahrscheinlichkeiten.
Die 2 (linke und rechte Fotographien) zeigt Aortaquerschnitte aus Kontrollkaninchen und transgenen Kaninchen, die mit an Cholesterin reichen Diät gefüttert worden waren. Ein 1mm-Schnitt wurde aus der absteigenden Thorax-Aorta, bei jeder Aorta an derselben Position, entnommen, mit PAS angefärbt, und das Ausmaß an Schaumzellanreicherung in der Intima der Kontrollen (links) wurde mit dem Fehlen von Schaumzellbildung in der Intima oder der Veränderung der Intimadicke in den transgenen Aorten (rechts) verglichen.
Die 3 (linke und rechte Graphiken) zeigt das Ausmaß der Intimazellenproliferation, wie in der 2 gezeigt, wobei unter Verwendung eines Verhältnisses der Intima zur Media quantifiziert wurde. A.V. Chobanian et al. (1989) Hypertension 14:203. Die quantitative Bewertung sowohl des Intima/Media-Verhältnisses (p < 0,003) als auch des Prozentanteils des Oberflächenbereichs (p < 0,009) war in den transgenen LCAT-Kaninchen signifikant niedriger als in den Kontrollen.
Die 4 (A-H) zeigt die signifikanten (p < 0,05) bivarianten Pearson-Korrelationen von Variablen nach der Diät mit der Aorta-Atherosklerose in Kontrollkaninchen und transgenen Kaninchen. Das Intima/Media-Verhältnis korrelierte gut mit der Planimetrie-Auswertung hinsichtlich Atherosklerose sowohl in der Kontrollgruppe (A) als auch in der gesamten Studiengruppe (E). Das Intima/Media-Verhältnis war umgekehrt mit der Schwere der Atherosklerose korreliert (B, F) und positiv mit dem nicht-HDL-Cholesterin (C, G) und Gesamt-Cholesterin/HDL-Cholesterin (TC/HDL) (D, H) korreliert.
Die 5 (A-B) stellt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines genomischen, eine humane LCAT codierenden Klons dar (SEQ ID NR:1).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Da der Prozess der Anreicherung von Cholesterin in den Arterien zur Atherosklerose und deren klinischen Spätschäden führt, beispielsweise ischämische Herzerkrankung und Herzanfall, Schlaganfall und periphere Gefäßerkrankung, ist eine Verlangsamung oder Umkehrung des Vorgangs der Cholesterinanreicherung bei der Vorbeugung oder Behandlung der Atherosklerose wirksam. Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Verminderung (d. h., Verlangsamung oder Umkehrung) der Cholesterinanreicherung in den Arterien eines Säugetier-Subjekts durch Anheben des Niveaus von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase("LCAT")-Aktivität im Serum des Subjekts beschrieben. Es werden ebenfalls Verfahren zur Aufrechterhaltung des Verhältnisses von Gesamt-Serumcholesterin zu den Serum-Lipoproteinen hoher Dichte in einem Säugetier bei weniger als fünf:eins, von dem angenommen wird, dass es ein Profil eines durchschnittlichen Herzerkrankungsrisikos darstellt, beschrieben. (W.P. Castelli et al. (1986) JAMA 256:2835). Ebenfalls beschrieben werden Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Atherosklerose in einem Säugetier-Subjekt, insbesondere einem menschlichen Subjekt, durch Anheben der LCAT-Aktivität in dem Serum des Subjekts auf einen Betrag, der wirksam ist, um die Cholesterinanreicherung des Subjekts, insbesondere in den Arterien des Subjekts, zu verringern. Es werden ebenfalls Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit LCAT-Mangelerscheinungen einhergehen, wie das Fischaugen-Syndrom und die klassische LCAT-Mangelerkrankung, beschrieben. Es werden ebenfalls Verfahren beschrieben, die das Anheben der LCAT-Aktivität in dem Serum auf ein ausreichendes Niveau, um den Zustand zu verbessern, und vorzugsweise das Anheben auf mindestens Normalniveaus einbeziehen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase" oder "LCAT" ein Glykoprotein-Enzym, das natürlicherweise im Blutserum von Säugetieren, einschließlich Menschen, gefunden werden kann, das die Synthese von Cholesterinestern und Lysolecithin aus Phosphatidylcholin und unverestertem, in Plasmalipoproteinen vorliegendem Cholesterin katalysiert. Das Enzym wird natürlicherweise primär durch die Leber hergestellt. Eine genomische DNA, die eine humane LCAT von 416 Aminosäuren codiert, ist isoliert worden. Ihre Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz werden in 5 (SEQ ID NR:1) zur Verfügung gestellt. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz einer LCAT aus der Maus ist in C.H. Warden et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:21573-81 beschrieben. Jede beliebige Säugetier-LCAT oder enzymatisch aktive Allelvariation davon ist in der vorliegenden Erfindung brauchbar, ebenso wie es andere Varianten, einschließlich Fragmente des Enzyms, sind, welche die oben beschriebene enzymatische Aktivität besitzen. Eine "Allelvariation" im Zusammenhang mit einem Polynukleotid oder einem Gen ist eine alternative Form (Allel) eines Gens, das in mehr als einer Form in der Population existiert. Auf dem Polypeptidniveau unterscheiden sich "Allelvarianten" im Allgemeinen voneinander lediglich durch eine, oder allenfalls einige wenige Aminosäuresubstitution(en). Eine "Speziesvariation" eines Polynukleotids oder eines Polypeptids ist eine, bei der die Variation natürlicherweise innerhalb verschiedener Spezies eines Organismus auftritt. Ein Polypeptid- "Fragment" oder "-Segment" ist eine Strecke von Aminosäureresten von mindestens etwa 6 benachbarten Aminosäuren aus einer bestimmten Sequenz, typischer von mindestens etwa 12 Aminosäuren.
Die Menge bzw. der Betrag von LCAT oder LCAT-Aktivität in Serum kann auf verschiedenen Wegen ermittelt werden. Die Gewichtsmenge von LCAT kann mittels eines kompetitiven Doppelantikörper-Radioimmunassays bestimmt werden. Es sind ebenfalls Routineverfahren zur Messung der absoluten LCAT-Aktivität im Serum und zur Messung der informativeren Cholesterinveresterungsgeschwindigkeit bekannt; siehe, z. B., J.J. Albers et al. Methods in Enzymol. 129:763-783 (1986) sowie M.P.T. Gillet und J.S. Owens, Kapitel 7b, Seiten 187-201, in Lipoprotein Analysis – A Practical Approach, C.A. Converse und E.R. Skinner, Hrsg. Die LCAT-Aktivität kann durch Messung der Umwandlung von radiomarkiertem Cholesterin zu Cholesterylester nach Inkubation des Enzyms und radiomarkierten, Apo A-I enthaltenden Lecithin-Cholesterin-Liposomensubstraten bestimmt werden. Die Veresterungsgeschwindigkeit des endogenen Cholesterins kann durch Messung der Geschwindigkeit der Umwandlung von markiertem Cholesterin zu Cholesterylester nach Inkubation von frischem Plasma, das mit einer Spurenmenge radioaktiven Cholesterins markiert ist, durch Äquilibrierung mit einer [¹⁴C]-Cholesterin-Albumin-Mischung bei 4°C, ermittelt werden. Eine ausführlichere Vorschrift wird in den Beispielen zur Verfügung gestellt. Die Veresterungsgeschwindigkeit des endogenen Cholesterins ist ein besserer Maßstab für die therapeutische LCAT-Aktivität, weil sie nicht nur den Betrag der im Serum vorliegenden LCAT-Aktivität widerspiegelt, sondern auch die Art und Menge von Substrat und Cofaktoren im Plasma. Die Veresterungsgeschwindigkeit von Cholesterin ist daher weder zur Gewichtsmenge von LCAT, noch zur absoluten LCAT-Aktivität notwendigerweise proportional.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Säugetier-Subjekt" ein Individuum von jeder beliebigen Spezies, einschließlich des Menschen, das Anzeichen von Atherosklerose entwickelt. Diese Anzeichen oder Indikatoren schließen beispielsweise die Entwicklung von Cholesterin-Plaques in den Arterien und Verkalkung, deren Ausmaß mittels Sudan IV-Anfärbung bestimmt werden kann, oder die Entwicklung von Schaumzellen in einer Arterie ein. Atherosklerose ist auch durch eine Verengung der Arterien, die beispielsweise durch Koronar-Angioplastie, Ultraschall und ultraschnelle CT nachgewiesen wird, charakterisiert. Bevorzugte Säugetier-Subjekte für die LCAT-Behandlung von Atherosklerose schließen jene ein, deren Art des Lipoproteinstoffwechsels ähnlich wie bei Menschen und Kaninchen ist, wie nicht-humane Primaten.
Prophylaktische und therapeutische Behandlungen
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Behandlung" sowohl eine prophylaktische als auch eine therapeutische Behandlung. Zum Beispiel kann eine prophylaktische Behandlung an diejenigen Subjekte mit dem Risiko einer Atherosklerose-Entwicklung verabreicht werden. Ein Risikofaktor ist ein atherogenes Lipoproteinprofil. Beispielsweise zeigt ein Verhältnis von Serumcholesterin zu den Lipoproteinen hoher Dichte von oberhalb 5:1 ein über dem Durchschnitt liegendes Risiko der Atherosklerose-Entwicklung an. Andere Faktoren, die auf ein erhöhtes Risiko für Atherosklerose hinweisen, schließen ein Serumcholesterin-Niveau von oberhalb etwa 240 mg/dl; ein Niveau der Lipoproteine hoher Dichte von unterhalb etwa 35 mg/dl; und ein Niveau der Lipoproteine niedriger Dichte von oberhalb etwa 190 mg/dl ein. Therapeutisch kann die beschriebene Behandlung an Individuen verabreicht werden, die schon an Atherosklerose oder einer damit assoziierten Erkrankung leiden.
Das Niveau einer für die Verminderung der Cholesterinanreicherung wirksamen Serum-LCAT-Aktivität hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Spezies, der Art und Weise der Verabreichung, der allgemeinen Gesundheit des Subjekts, des gewünschten Resultats (z. B. Prophylaxe oder therapeutische Behandlung) und der Beurteilung des behandelnden Arztes. Der praktische Arzt kann zum Beispiel darüber entscheiden, welche Risikostufen für eine Herzerkrankung auf eine prophylaktische Behandlung hinweisen, und welches Zielniveau von LCAT für die Behandlung einer Person, die bereits an Atherosklerose leidet, indiziert ist. LCAT-Niveaus, die ausreichen, die Anreicherungsgeschwindigkeit von Cholesterin messbar zu verringern, liegen bei mindestens etwa dem Eineinhalb-fachen der normalen Cholesterinveresterungs-Geschwindigkeit für die Säugetierspezies und stärker bevorzugt bei mindestens etwa dem Zweifachen, mindestens etwa dem Fünffachen, mindestens etwa dem Zehnfachen, mindestens etwa dem Fünfzehnfachen oder mindestens etwa dem Zwanzigfachen.
Beim Menschen reicht die normale Cholesterinveresterungs-Geschwindigkeit von etwa 60 nmol/ml/h bis etwa 130 nmol/ml/h. Die wirksame Behandlung von Atherosklerose in Menschen kann es einbeziehen, das Niveau der Serum-LCAT-Aktivität anzuheben, um eine Cholesterinveresterungs-Geschwindigkeit von mindestens 200 nmol/ml/h, mindestens 250 nmol/ml/h, mindestens 500 nmol/ml/h, mindestens 1000 nmol/ml/h oder mindestens 2000 nmol/ml/h zu erreichen. Das Anheben der LCAT-Gewichtsmenge im Serum führt zu einem Anstieg der Cholesterinveresterungs-Geschwindigkeiten. Normalerweise haben Menschen etwa 5 μg LCAT pro ml Serum. Daher kann das Anheben der LCAT auf mindestens 10 μg/ml Serum die Cholesterinveresterungs-Geschwindigkeit auf anti-Atherosklerotische Niveaus erhöhen. Das Anheben der LCAT auf mindestens 15 μg/ml Serum, mindestens 25 μg/ml Serum, mindestens 50 μg/ml Serum oder mindestens 100 μg/ml Serum kann diese Ziele ebenfalls erreichen.
Verfahren zum Anheben der LCAT-Serumniveaus
Das LCAT-Serumniveau kann durch jede beliebigen verfügbaren Mittel angehoben werden. Ohne Eingrenzungen schließt dies die direkte Verabreichung des LCAT-Enzyms, die Expression von LCAT durch Gentherapie und die Aufwärtsregulation endogener LCAT durch die Verabreichung von Arzneimitteln ein.
1. Verabreichung von LCAT-Enzym
Das LCAT-Aktivitätsniveau in einem Subjekt kann durch die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine pharmazeutisch wirksame LCAT-Menge, an das Subjekt erhöht werden. Eine pharmazeutisch wirksame LCAT-Menge ist eine Menge, die bei der Verringerung der Anreicherungsgeschwindigkeit von Cholesterin in einem Subjekt wirksam ist. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "pharmazeutische Zusammensetzung" eine Zusammensetzung, die für eine pharmazeutische Anwendung in einem Säugetier geeignet ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen sind somit vergleichsweise untoxisch für das Tier, dem die Zusammensetzung verabreicht wird.
"Pharmazeutisch annehmbarer Träger" umspannt jeden beliebigen bzw. jedes beliebige der standardmäßigen pharmazeutischen Träger, Puffer und Exzipientien, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser und Emulsionen. Geeignete pharmazeutische Träger und ihre Formulierungen sind beschrieben in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgabe (Mack Publishing Co., Easton 1995). Flüssigkeiten sind die bevorzugten pharmazeutischen Träger für die Zubereitung der pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für alle gut bekannten Formen der Verabreichung vorgesehen und insbesondere für die parenterale Verabreichung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung. Eine lokale Verabreichung, wie transdermal, wird ebenfalls in Betracht gezogen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Dosierungseinheitsformen, abhängig vom Verfahren der Verabreichung, verabreicht werden. Beispielsweise beinhalten Dosierungseinheitsformen zur parenteralen Verabreichung Dosierungseinheiten von injizierbaren Lösungen.
LCAT kann durch jede beliebigen, im Fachgebiet zur Abgabe von Proteinen bekannten Hilfsmittel verabreicht werden. Allerdings ist die systemische Verabreichung durch Injektion bevorzugt. Dies beinhaltet die intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale und subkutane Injektion. Die Injektion kann beispielsweise durch eine programmierbare Pumpe automatisiert werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung bereit, die eine Lösung von LCAT, gelöst oder suspendiert in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, umfassen. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%-ige Kochsalzlösung und dergleichen. Zum Beispiel ist phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) besonders für die Verabreichung von LCAT-Protein geeignet. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert werden, oder sie können steril filtriert werden. Additive können ebenfalls zusätzliche aktive Bestandteile einschließen, wie bakterizide Mittel oder Stabilisatoren. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung, wie sie sind, verpackt werden, oder lyophilisiert, wobei die lyophilisierte Zubereitung mit einer sterilen wässrigen Lösung vor der Verabreichung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich sind, um physiologische Bedingungen anzunähern, wie pH-Wert-Einstell- und Puffermittel, die Tonizität einstellende Mittel, Benetzungsmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc.
LCAT kann auch transmucosal oder transdermal systemisch verabreicht werden. Zur transmucosalen oder transdermalen Verabreichung werden Penetrationsmittel, geeignet für die zu durchdringende Barriere, in der Formulierung verwendet. Derartige Penetrationen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und beinhalten beispielsweise zur transmucosalen Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate. Darüber hinaus können Detergentien zur Erleichterung der Durchdringung verwendet werden. Die transmucosale Verabreichung kann zum Beispiel mittels Nasensprays oder unter Verwendung von Zäpfchen erfolgen.
Die Form, Mengen und Terminierung der Verabeichung sind generell eine Angelegenheit zur Festlegung durch den praktizierenden Arzt. In einer Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung als Dosierungseinheitsform abgegeben. Schätzungsweise reichen etwa 40 mg LCAT aus, um die Serum-LCAT-Menge in einem Menschen etwa zu verdoppeln. Dementsprechend kann eine Dosierungseinheitsform etwa 10 mg bis etwa 1000 mg oder etwa 40 mg bis etwa 200 mg enthalten. In bestimmten Ausführungsformen weist die Dosierungsform etwa 100 mg oder etwa 500 mg LCAT auf. Abhängig von dem Zielniveau an LCAT, das aufrechterhalten werden soll, und der Terminierung der Abgabe können niedrige Dosierungen häufig verabreicht werden, oder hohe Dosierungen können weniger häufig verabreicht werden.
Die Erfindung zieht verschiedene Quellen von LCAT zur Einbringung in pharmazeutische Zusammensetzungen in Erwägung. LCAT kann aus Plasma isoliert werden. Ein Verfahren für die Isolierung von LCAT aus Humanserum ist in den Beispielen beschrieben.
Als Alternative kann LCAT rekombinante LCAT sein, und zwar, genauer gesagt, rekombinante humane LCAT. J. McLean et al. (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83:2335-2339 beschreibt die Klonierung und die Sequenz einer humanen LCAT-cDNA. J. McLean et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:9397-9406 beschreibt eine vollständige Gensequenz für human-LCAT. (Siehe 5). J.S. Hill et al. (1993) J. Lipid Res., 34:1245-1251 beschreibt die Expression rekombinanter LCAT. Verfahren zur Präparation von Expressionsvektoren werden in weiteren Einzelheiten unten beschrieben. Diese Vektoren können zur Expression rekombinanter LCAT in einer Vielzahl von Expressionssystemen, einschließlich Säuger-, Insekten- und Bakteriensystemen, verwendet werden. Die einzelligen Wirte können prokaryot oder eukaryot sein und schließen beispielsweise E. coli, Hefe, Insektenzellen, COS-Zellen oder Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters ("CHO") ein. Ein Verfahren zur Expression von LCAT in COS-7-Zellen ist in J. McLean (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 83:2335-2339 beschrieben. Expressionskontrollsequenzen können, wie geeignet, ausgewählt werden. Rekombinante LCAT kann anschließend z. B. mittels des in den Beispielen beschriebenen Verfahrens gereinigt werden.
Der Begriff "Expressionsvektor" bezeichnet einen Vektor, der ein rekombinantes Polynukleotid umfasst, umfassend Expressionskontrollsequenzen, die in operativer Weise mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz verbunden sind. Ein Expressionsvektor umfasst genügend ciseinwirkende Elemente für eine Expression; andere Elemente zur Expression können von der Wirtszelle oder einem in vitro-Expressionssystem geliefert werden. Die Expressionsvektoren schließen alle diejenigen ein, die im Fachgebiet bekannt sind, wie Cosmide, Plasmide (z. B. nackte oder in Liposomen enthaltene) und Viren, die das rekombinante Polynukleotid aufnehmen. Die Konstruktion von Expressionsvektoren und die Expression von Genen in transfizierten Zellen bezieht die Verwendung von Techniken der Molekularen Klonierung ein, die im Fachgebiet ebenfalls gut bekannt sind. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) und Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., (Current Protocols, ein Gemeinschaftsunternehmen bzw. Joint Venture von Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc.).
2. Gentherapie
Es wird ebenfalls beschrieben, dass das Niveau von LCAT-Aktivität mithilfe der Anwendung von Gentherapie angehoben wird. Wie hierin verwendet, bezeichnet "Gentherapie" den Transfer und vorzugsweise die stabile Integration neuer genetischer Information in Zellen eines Subjekts. Verfahren zur Anhebung von LCAT-Aktivitätsniveaus mittels Gentherapie beziehen das Transfizieren von Zellen mit einer Nukleinsäure ein, die eine für die Expression von LCAT codierende Nukleinsäuresequenz einschließt. Die transfizierten Zellen exprimieren LCAT und sekretieren diese in das Serum des Subjekts. Die Zellen werden in ausreichender Anzahl transfiziert oder im Hinblick auf eine derart hohe LCAT-Expression, dass sie die LCAT-Menge auf ein Niveau anheben, das für die Verringerung der Cholesterinanreicherung wirksam ist. LCAT codierende Gene werden auf einem von zwei Wegen in das Subjekt eingeführt. Es wird ebenfalls beschrieben, dass die Gene in Zellen des Individuums in vivo mithilfe von Expressionsvektoren eingeführt werden, oder die Gene werden in Zellen ex vivo eingeführt, und transfizierte Zellen, die LCAT exprimieren und sekretieren, werden dem Subjekt verabreicht.
Bei in vivo-Vorgehensweisen sind Leberzellen brauchbare Ziele für die Transfektion. Leberzellen stellen LCAT her, so dass sie die Prozessierungsmaschinerie für eine rekombinante Erzeugung des Enzyms besitzen. Darüber hinaus wandern in den Blutstrom injizierte Vektoren rasch durch die Leber, so dass Leberzellen den Vektoren rasch ausgesetzt werden. Hämatopoetische Stammzellen sind ebenfalls brauchbare Ziele für eine Gentherapie, da sie sich rasch vermehren, wodurch mehr zur Herstellung von LCAT befähigte Zellen erzeugt werden.
Ex vivo-Vorgehensweisen sind auch attraktiv, weil sie eine stärkere Kontrolle über den Transfektionsprozess zulassen. Beispielsweise können transfizierte Zellen getestet werden, und diejenigen, die LCAT in den höchsten Mengen exprimieren, können selektiert werden. Hämatopoetische Stammzellen können dem Subjekt entnommen, ex vivo transfiziert und dem Subjekt wieder zugeführt werden. Es wird daher auch beschrieben, dass die Zellen Zellen aus dem Subjekt sind. Während Allotransplantate brauchbar sein können, sind syngene Transplantate am nützlichsten, weil sie mit der geringsten Wahrscheinlichkeit eine Host-versus-Graft-Reaktion auslösen.
Verfahren zur Transfektion von Genen in Säugerzellen, sowohl in vivo als auch ex vivo, und zum Erzielen ihrer Expression sind im Fachgebiet gut bekannt. Diese beinhalten zum Beispiel die Transfektion von Zellen mit der Nukleinsäure mithilfe von Nukleinsäurevektoren, wie virale Vektoren (einschließlich z. B. retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, adeno-assoziierte virale Vektoren, Hepatitisvirus-Vektoren, Vacciniavirus-Vektoren und Herpesvirus-Vektoren), Plasmidvektoren, Cosmidvektoren, mikroverkapselte Vektoren (z. B. kationische oder ungeladene liposomale Mikrosphären); Mikroinjektion; Elektroporation; Chromosomentransfer; Calciumpräzipitation; oder biolistische Injektion (z. B. DNA-Anheftung an ein Partikel, wie ein Goldkügelchen, und sein Hineintreiben in eine Zelle). Siehe auch z. B. Methods in Enzymology, Band 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel, Hrsg.) (1990) oder M. Kriegler, Gene Transfer and Expression – A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, (1990).
Virale Vektoren sind besonders nützlich für die Gentherapie. Verfahren zur Konstruktion und Verwendung viraler Vektoren sind im Fachgebiet bekannt und werden beispielsweise in Miller und Rosman (1992) Biotechniques, 7:980-990, besprochen. Die Target- bzw. Ziel-Spezifität viraler Vektoren kann genutzt werden, um auf im Voraus festgelegte Zelltypen abzuzielen und ein Nukleinsäuremolekül in die Zelle einzuführen. Der ausgewählte virale Vektor wird somit zum Teil von dem Zelltyp abhängen, auf den abgezielt werden soll. Hepatozyten zum Beispiel, die normalerweise LCAT herstellen, sind ein attraktives Ziel für eine Transfektion. Darüber hinaus kann ein viraler Vektor durch den Einbau eines gewebespezifischen Promotors oder Enhancers in den Vektor gewebespezifisch ausgestaltet werden.
Adenoviren sind nützliche Vektoren für den Transfer von Genen in Zellen. Leberzellen haben einen Adenovirus-Rezeptor. Im Anschluss an eine intravenöse Injektion eines rekombinanten Adenovirus werden daher etwa 95% der Viren selektiv Leberzellen infizieren. Replikationsdefekte adenovirale Vektoren können durch Deletion von Sequenzen, die E1A, E1B und einen Teil der E3-Region umspannen, präpariert werden, wodurch die Fähigkeit dieses Virus zur Replikation oder Transformation nicht-permissiver Zellen vermindert wird. Siehe z. B. Hurwitz et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:163-167. Der Early-Enhancer/Promotor des Cytomegalovirus kann verwendet werden, um die Transkription eines insertierten LCAT-Gens mit einer SV40-Polyadenylierungssequenz, stromabwärts von diesem Reporter kloniert, voranzutreiben. Hochtitriger rekombinanter Adenovirus kann durch Amplifikation in LE293-Zellen unter Verwendung etablierter Verfahren präpariert werden. Der Virus kann aus Zelllysaten mittels Cäsiumchlorid-Gradienten-Ultrazentrifugation, gefolgt von Entsalzen auf einer Sephadex G-50(Sigma Biochemicals, St. Louis, MO)-Säule in PBS gereinigt werden. Der gereinigte Virus kann anschließend für die Injektion in das Subjekt verwendet werden. Adenovirale Vektoren, in denen die E4-Region deletiert worden ist, sind ebenfalls attraktiv als adenovirale Vektoren der Zweiten Generation, die eine verlängerte Expression und eine geringe mögliche Immunogenität aufweisen.
Der Adenassoziierte Virus (AAV) ist einzelsträngiger DNA-Parvovirus. AAV-Vektoren haben mehrere Vorteile, die sie zu wünschenswerten Genabgabesystemen machen. Sie haben keinen bekannten Pathogeneseweg und 80% der Bevölkerung der Vereinigten Staaten sind gegenwärtig im Hinblick auf AAV seropositiv. Ostrove et al. (1981) Virology 113:521; Cukor et al. in The Parvoviruses (Hrsg. Berns, Plenum, NY, 1984). AAV-Virionen sind widerstandsfähig gegenüber physikalischen Behandlungen, wie Beschallung und Hitzeinaktivierung, die von anderen Viren während der Reinigung nicht toleriert werden. Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828. Anders als bei Retroviren ist eine Infektion und/oder Transduktion von nicht-teilenden Zellen möglich. Wie Retroviren integriert AAV bei Infektion in das Wirtszellgenom. Kotin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2211-2215; Samulski et al. (1991) EMBO J. 10:3941-3950. Anders als Retroviren jedoch integriert AAV vorzugsweise an einer spezifischen chromosomalen Stelle (19q13.3). An dieser Stelle verursacht AAV keinerlei Veränderung der Wachstumseigenschaften oder der morphologischen Charakteristika von menschlichen Zellen. Darüber hinaus kann die Integration von AAV in das zelluläre Genom in nicht proliferierenden Zellen stattfinden. Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996. Der AAV besitzt auch eine angemessen große Klonierungskapazität, geringfügig oberhalb der Hälfte von derjenigen von retroviralen Vektoren. Rekombinante AAV-Vektoren enthalten keine endogene Promotor-Aktivität, was es ermöglicht, spezifische Promotorselektionen zu treffen, und zwar abhängig vom Zielzelltyp, ohne Rücksicht auf Komplikationen, die aus endogenen viralen Promotoren herrühren. Anders als retrovirale Vektoren können verpackte AAV-Vektoren konzentriert werden, so dass Infektions-Multiplizitäten bzw. -Vielfache, die 1,0 übertreffen, in Transduktionsexperimenten verwendet werden können. Dies bedeutet, dass nahezu 100% der Ziele in einer Kultur transduziert werden können, wodurch der Bedarf für einen Selektionsschritt entfällt.
Der AAV ist ein defekter Virus, der nur in Zellen wächst, in denen bestimmte Funktionen von einem co-infizierenden Helfervirus, wie Adenoviren und Herpesviren, zur Verfügung gestellt werden. Eine Infektion von Zellen mit AAV in der Abwesenheit von Helferfunktionen führt zur Integration von AAV in das Wirtszellgenom ohne Replikation. Das AAV-Genom weist zwei Kopien eines 145 Nukleotide langen ITR (inverted terminal repeat) auf, eine an jedem Ende. Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45:555-564. Die ITR-Sequenzen stellen einen Replikationsursprung zur Verfügung und vermitteln auch die Integration und Exzision des AAV-Genoms aus dem Zellgenom.
Die Sequenz zwischen den ITRs von etwa 4470 Nukleotiden enthält zwei offene Leserahmen für rep- und cap-Gene. Hermonat et al. (1984) Virology 51:329-339. Das cap-Gen codiert Capsid-Proteine. Das rep-Gen codiert Proteine, die bekanntermaßen für die Replikation benötigt werden. Rep^–-Vektoren können eine verminderte Präferenz für eine ortsspezifische Integration in das Chromosom 19 zeigen. Allerdings ist die Integrationsfrequenz von Rep^–-Vektoren insgesamt eine etwa 80-fach höhere Integrationsfrequenz als von vergleichbaren Rep⁺-Vektoren, wodurch nahe gelegt wird, dass rep eine Integration eher inhibiert als erleichtert. McLaughlin et al. (1988) J. Virol. 62:1963-1973.
In rekombinantem AAV können alle Proteincodierungssequenzen (wie cap, lip und rep) durch die LCAT-Codierungssequenz ersetzt werden. Der rekombinante AAV wird repliziert, indem eine Zelle, die den AAV-Vektor, der das Gen von Interesse aufweist, trägt, zusammen mit einem Helfer-AAV-Plasmid, das alle der essentiellen AAV-Gene exprimiert, in Adenovirus- oder Herpes-infizierte Zellen, die zusätzliche, für die AAV-Replikation und die Herstellung neuer Viruspartikel erforderliche Funktionen zur Verfügung stellen, ko-transfiziert wird.
Es ist ein weiteres Verfahren vorgeschlagen worden, bei dem ein rekombinanter Vektor, der AAV-ITR-Sequenzen enthält, dem aber alle anderen AAV-Sequenzen fehlen, von kationischen Lipiden umgeben ist und mittels Lipofektion in eine Zelle eingeführt wird. Phillip et al., WO 95/07995.
Im Falle von nicht-infektiösen viralen Vektoren wird das Helfervirusgenom üblicherweise mutiert, um das Virusverpackungssignal, das zur Verkapselung der Nukleinsäure in Viruspartikel benötigt wird, zu zerstören. Der Helfervirus behält jedoch Strukturgene, die für die Verpackung eines gleichzeitig eingeführten rekombinanten Virus, der ein Gen von Interesse enthält, erforderlich sind. Ohne ein Verpackungssignal werden Viruspartikel kein Genom enthalten und können somit nicht durch aufeinander folgende Infektionszyklen voranschreiten.
Retrovirale Vektoren können für in vivo- oder ex vivo-Zielfindungs- und -Therapie-Prozeduren verwendet werden. Retrovirale Vektoren können entweder für die Funktion als infektiöse Partikel oder für das Durchlaufen von nur einem einzigen anfänglichen Infektionszyklus konstruiert werden. Im erstgenannten Fall wird das Virusgenom so modifiziert, dass es die notwendigen Gene, regulatorische Sequenzen und Verpackungssignale beibehält, um neue Virusproteine und -RNA zu synthetisieren. Allerdings werden die das onkogene Potential dieser Viren vermittelnden Gene zerstört. Nachdem die Virusproteine synthetisiert worden sind, verpackt die Wirtszelle die RNA in neue Viruspartikel, die weitere Infektionszyklen durchlaufen können. Das Virusgenom wird auch gentechnisch hergestellt, um das gewünschte rekombinante Protein zu codieren und zu exprimieren. Verbesserte Verfahren zur Transfektion von peripheren Blutlymphozyten durch retrovirale Vektoren sind in Yang et al. (1995) Nature Medicine 1(9):890-893 und Bunnell et al. (1995) Proc. Acad. Nat'l Sci. USA 92:7739-7743 beschrieben.
Eine retrovirale Verpackungszelllinie, wie PA317 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD, Zugangsnummer CRL 9078), kann zur Erzeugung infektiöser amphotropher retroviraler Vektoren verwendet werden. Das retrovirale Plasmid pLNCX (D. Miller und G. Rosman (1989) Biotechniques 7:980) kann die Expressionskontrollsequenz, die in operativer Weise mit der bei "X" zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden ist, enthalten. Das Plasmid enthält einen LTR-Promotor/Enhancer (L) des Maloney-Mausleukämie-Virus; ein Neomycinresistenzgen, das Neomycin-Phosphotransferase (N) codiert; ein bzw. einen LTR/Enhancer (C) von humanem Cytomegalovirus und das zu exprimierende codierende Gen (X). Das LCAT-Gen wird mittels Standardtechniken an einer schon vorher bestehenden Klonierungsstelle durch Ersetzen des Phosphotransferase-Gens für Neomycinresistenz durch eines, das eine Phosphotransferase für Hygromycinresistenz codiert, insertiert.
Retroviren sind das bevorzugte Vehikel für eine Genabgabe in menschliche hämatopoetische Stammzellen gewesen, und zwar wegen ihrer hohen Effizienz des Gentransfers und der co-linearen und stabilen Integration der übertragenen Gene in chromosomale DNA. Allerdings können Gene aus Retroviren in das Wirtszellchromosom nur dann integrieren, wenn die Zelle sich aktiv teilt.
Nukleinsäuren, die verwendet werden, um Zellen mit dem LCAT-Gen zu transfizieren, werden im Allgemeinen in der Form eines Expressionsvektors, einschließlich einer Expressionskontrollsequenz, die in operativer Weise mit einer für die Expression von LCAT codierenden Nukleotidsequenz verbunden ist, vorliegen. Der Begriff" Expressionskontrollsequenz" bezeichnet eine Nukleotidsequenz in einem Polynukleotid, welche die Expression (Transkription und/oder Translation) einer Nukleotidsequenz reguliert, die damit in operativer Weise verbunden ist. Der Begriff "in operativer Weise verbunden" bezeichnet eine funktionelle Beziehung zwischen zwei Teilen, bei denen die Aktivität des einen Teils (z. B. die Fähigkeit zur Regulation der Transkription) zu einer Aktion an dem anderen Teil (z. B. die Transkription der Sequenz) führt. Expressionskontrollsequenzen können beispielsweise, und ohne Beschränkung, Sequenzen von Promotoren (z. B. induzierbare oder konstitutive), Enhancern, Transkriptionsterminatoren, einem Startcodon (z. B. ATG), Spleiss-Signalen für Introns und Stoppcodons einschließen.
Geeignete Expressionskontrollsequenzen für Säugerzellen beinhalten zum Beispiel den SV40-Promotor, den RSV(Rous-Sarkom-Virus)-Promotor, den CMV(Cytomegalovirus)-Promotor und den Metallothionin-Promotor. Der CMV-Promotor wird für transiente Expressionssysteme bevorzugt. Der Metallothionin-Promotor wird für stabile Expressionssysteme bevorzugt. Promotoren können konstitutiv oder für den Zielzelltyp gewebespezifisch, z. B. spezifisch für Hepatozyten, sein. Expressionskontrollsequenzen, die für hohe Expressionsniveaus sorgen, sind für die Herstellung von LCAT in Mengen, die ausreichen, um eine Verminderung der Cholesterinanreicherung hervorzurufen, zu bevorzugen.
Wie verwendet, bezeichnet der Begriff" für die Expression von LCAT codierend" Sequenzen, die infolge der Transkription und Translation von mRNA, Polypeptidsequenzen des LCAT-Enzyms erzeugen. Beispielsweise codieren somit cDNA, genomische DNA, bei der Introns infolge der Transkription und Prozessierung zu mRNA entfernt werden, und degenerierte Sequenzen, die LCAT codieren, alle die Expression von LCAT. DNA-Sequenzen, welche für die Expression von LCAT codieren, können durch jede beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahren erhalten werden. Beispielsweise können codierende Sequenzen durch chemische Synthese präpariert werden. Es können auch Primer unter Verwendung der hierin zur Verfügung gestellten LCAT-Sequenzen entworfen werden, und cDNA oder genomische DNA kann mittels Amplifikation isoliert werden.
Die folgenden Polynukleotide sind als Primer brauchbar, um Sonden für die Isolierung einer cDNA oder eines genomischen Klons, der eine humane LCAT codiert, aus einer Bibliothek, herzustellen.

1. Sonde I: eine 340 bp 5'LCAT Exon-1-Sonde Sense-Oligo: 5'GGC TCC CTG AGG CTG TGC CCC TTT 3' (SEQ ID NR.:2) Antisense-Oligo: 5' TGG CGT GGT GCA TCA GGG GCC TGG 3' (SEQ ID NR.:3)
2. Sonde II: eine 380 bp 3' LCAT-Sonde Sense-Oligo: 5' CTG GTG TGG AAG TAT ACT GCT TTT 3' (SEQ ID NR.:4) Antisense-Oligo: 5' CTT CAA CCT GAA ACA TAG CCA TCA 3' (SEQ ID NR.:5)

Die Technik der „Polymerase-Ketten-Reaktion", oder "PCR", wie hier verwendet, bezieht sich im Allgemeinen auf eine Arbeitsweise, bei der winzige Mengen von einem spezifischen Teil der Nukleinsäure, RNA und/oder DNA, amplifiziert werden, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4 683 195, veröffentlicht am 28. Juli 1987, beschrieben. Im Allgemeinen muß die Sequenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus verfügbar sein, so dass Oligonukleotidprimer entworfen werden können; diese Primer werden identisch oder ähnlich in der Sequenze zu gegenüberliegenden Strängen auf der zu amplifizierenden Matritze sein. Die 5'-terminalen Nukleotide der zwei Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials zusammenfallen. Die PCR kann verwendet werden, um spezifische RNA-Sequenzen, spezifische DNA-Sequenzen von einer vollständigen Genom-DNA, und cDNA, die von einer vollständigen zellulären RNA, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen, usw. transkribiert wurde, zu amplifizieren; siehe, allgemein, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, Hrsg., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Wie hier verwendet wird die PCR als ein, aber nicht als das einzige Beispiel für ein Nukleinsäure-Polymerase-Reaktionsverfahren zur Amplifizierung einer Nukleinsäuretestprobe, die die Verwendung einer bekannten Nukleinsäure (DNA oder RNA) als ein Primer umfasst, betrachtet.
Ein „isoliertes Polynukleotid" ist ein Polynukleotid, z. B. eine RNA, DNA, oder ein gemischtes Polymer, welches im Wesentlichen von anderen DNA-Sequenzen getrennt ist, welche natürlicherweise mit einer nativen humanen Sequenz, z. B. Ribosomen, Polymerasen und vielen anderen humanen Genomsequenzen, einhergehen. Der Begriff umfasst eine Polynukleotidsequenz, welche aus ihrer natürlich vorkommenden Umgebung entfernt wurde, und schließt rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoge oder Analoge, die biologisch duch heterologe Systeme synthetisiert wurden, ein. Ein im Wesentlichen reines Molekül schließt isolierte Formen des Moleküls ein. Ein „isoliertes Polypeptid" oder Protein trägt eine ähnliche Bedeutung, wobei das Polypeptid oder Protein im Wesentlichen von jedwegen zellulären Kontaminanten und Komponenten, welche natürlicherweise mit dem Protein in vivo assoziiert sind, getrennt wurde, so dass es die vorherrschende makromolekulare Spezies in der Zusammensetzung ist.
Einige der Nachteile, die von der Verwendung viraler Vektoren herrühren, werden durch nicht-biologisches Transfizieren eines DNA-Fragmentes in Zellen, zum Beispiel durch Lipofektion, chemische Transformation, Elektroporation oder biolistische Injektion vermieden. Bei diesen Herangehensweisen können ausreichende Mengen an reiner DNA für die Transfektionen hergestellt werden, und es können viel größere Fragmente aufgenommen werden. Solche Herangehensweisen werden bei Zellen bevorzugt, die zeitweise aus dem Körper entfernt werden können.
Der Begriff „rekombinant" oder „rekombinantes DNA-Molekül" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die natürlicherweise nicht vorkommt oder die durch die künstliche Kombination von zwei anderweitig getrennten Segmenten der Sequenz hergestellt wird. Mit „rekombinant hergestellt" ist eine künstliche Kombination gemeint, die oft entweder duch chemische Synthesemittel oder durch die künstliche Manipulation von isolierten Segmenten der Nukleinsäuren, z. B. durch gentechnische Manipulationstechniken, ausgeführt wird. Dies wird gewöhnlicherweise gemacht, um ein Kodon gegen ein redundantes Kodon auszutauschen, welches dieselbe oder eine konservative Aminosäure codiert, indem typischerweise eine Sequenzerkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ wird ein Zusammenführen von Nukleinsäuresegmenten der gewünschten Funktionen durchgeführt, um eine einzelne genetische Funktionseinheit, die eine gewünschte Kombination der Funktionen, die in den üblichen natürlichen Formen nicht gefunden werden, umfasst. Restriktionsenzymerkennungsstellen sind oft das Ziel solcher künstlichen Manipulationen, aber andere stellenspezifische Ziele, z. B. Promotoren, DNA-Replikationsstellen, Regulationssequenzen, Kontrollsequenzen oder andere brauchbare Merkmale können durch Design bzw. Gestaltung eingebracht werden. „Rekombinante DNA-Moleküle" schließen Klonierungs- und Expressionsvektoren ein. Ein „Fragment" eines Polynukleotides ist eine Strecke von mindestens etwa 18 Nukleotiden, typischer mindestens etwa 40 Nukleotide.
3. Hoch-Regulation von endogener LCAT
Ein weiteres Verfahren, um den Serumspiegel der LCAT-Aktivität anzuheben, ist durch die Verabreichung von Arzneistoffen, die die endogene Herstellung von LCAT in dem Subjekt hochregulieren. Androgene sind bereits dafür bekannt, die Expression von LCAT nach unten zu regulieren. J.J. Albers et al. Biochim. Biophys. Acta 795:293-296 (1984). Auch sind die LCAT-Spiegel in Frauen höher als in Männern. J.J. Albers et al. Atherosclerosis 43:369-379 (1983). Es wird angenommen, dass Östrogene und Östrogenanaloge die Expression von LCAT hoch zu regulieren. Die Mengen solcher zu verabreichenden Arzneistoffe können durch den Praktiker empirisch bestimmt werden.
Kandidatenarzneistoffe können durch das Screenen von Verbindungen für die Fähigkeit, die LCAT-Expression in Tiermodellen oder in in vitro-Modellen zu erhöhen, identifiziert werden. In Tiermodellen kann der Kandidatenarzneistoff einem Tier verabreicht werden, um den Effekt auf die LCAT-Aktivität in dem Tier zu bestimmen. Altrnativ kann das Tier nach der Verabreichung untersucht werden, um den Effekt des Arzneistoffes auf die Entwicklung von Atherosklerose zu bestimmen.
Kandidatenarzneistoffe können durch das Screenen von Verbindugen für die Fähigkeit, die LCAT-Aktivität in vitro zu erhöhen, identifiziert werden. Bei einem Verfahren wird die Verbindung auf ihren Effekt auf die Fähigkeit von LCAT getestet, Veresterung von Cholesterin zu Cholesterylester in einem LCAT-Aktivitätsassay, wie oben beschrieben, zu verursachen.
Weiter Behandlungsverfahren
Der Metabolismus von Cholesterin schließt sowohl das Beladen des Cholesterins auf HDL-Partikel durch die Veresterung durch LCAT als auch den Transport des Cholesterins in die Leber durch HDL ein. Es ist bekannt, dass die Erhöhung von Apo A-I das Risiko einer Herzkrankheit senkt. A.C. Liu et al. (1994) J. Lipid Res. 35:2263-2267 und C. Paszty et al. (1994) J. Clin. Invest. 94:899-903. Bestimmte Versionen von Apo A-I wie Apo A-I Milano sind besonders schützend. C.R. Sirtori et al. (1995) Atherosclerosis X S. 50-55, Elsevier Science, NY und S. Ameli et al. (1994) Circulation 90:1935-41. Darüber hinaus ist Apo A-I ein Cofaktor der LCAT-Aktivität. C.J. Fielding et al. (1972) Bioch Biophys. Acta 270:513-518. Dementsprechend bewirkt eine Erhöhung der LCAT-Aktivität in dem Serum des Subjektes, kombiniert mit einer Erhöhung des Cholesterintransportes in die Leber durch eine Erhöhung des Serum-HDL oder durch das Bereitstellen von HDL mit besseren Cholesterin-ladenden Charakteristika, einen synergistischen Effekt für das Verringerung der Cholesterinanreicherung in den Arterien eines Subjektes. Es wird auch eine Erhöhung sowohl von LCAT als auch vom Apo A-I-Spiegel im Serum von einem Subjektes auf einen Betrag, der wirksam ist die Anreicherung von Cholersterin zu verringern, beschrieben. Die Menge an Apo A-I im Serum eines Menschen beträgt normalerweise etwa 130 mg/dl. Es ist auch beschrieben, dass Apo A-I-Spiegel auf mindestens 150 mg/dl oder auf mindestens 300 mg/dl erhöht werden können. Es ist auch beschrieben, dass sowohl die Spiegel von Apo A-I als auch von Apo A-I-Milano erhöht sind. Apo A-I-Milano ist auch auf mindestens 150 mg/dl oder auf mindestens 300 mg/dl erhöht. Verfahren, um die Menge an Apo A-I anzuheben, schließen jedes bereits für die Erhöhung der LCAT-Spiegel beschriebene ein. Verfahren für die Herstellung von Apo A-I sind in dem U.S.-Patent 4 943 527 (Protter et al.) beschrieben.
Auch sind Expressionsvektoren beschrieben, die eine Nukleinsäure umfassen, welche Expressionskontrollsequenzen einschließt, die in operativer Weise mit einer Sequenz verbunden sind, die für die Expression von LCAT codiert. Es sind auch Expressionsvektoren beschrieben, die eine Nukleinsäure umfasst, welche Expressionskontrollsequenzen, die in operativer Weise mit einer Sequenz verbunden sind, die für die Expression von LCAT codiert und Expressionskontrollse quenzen einschließt, die in operativer Weise mit einer Sequenz in Verbindung stehen, die für die Expression von einem Apo A-I-Protein, einschließlich z. B. Apo A-I-Milano, codiert.
Behandlung von Zuständen, die LCAT-Mangel betreffen
Es sind Verfahren für die Behandlung von Zuständen beschrieben, die von einem Mangel der LCAT-Aktivität herrühren, wie das klassische LCAT-Mangel-Syndrom, bei dem LCAT fehlt und das Fischaugen-Syndrom, bei dem das Individuum nur partielle Rest-LCAT-Aktivitätsspiegel besitzt. Die Verfahren umfassen ein Anheben der Serum-LCAT-Aktivitätsspiegel in solchen Individuen auf ein therapeutisch effektives Niveau. Ein Anheben der LCAT-Serumspiegel auf etwa normale Spiegel d. h. um eine Veresterungsgeschwindigkeit des Cholesterins auf mindestens 60 nmol/ml/h oder auf mindestens 130 nmol/ml/h zu erreichen, sind therapeutisch effektiv. Die LCAT kann auch angehoben werden, um eine Veresterungsgeschwindigkeit des Cholesterins über normale Spiegel zu erreichen, z. B. Geschwindigkeiten von etwa 200 nmol/ml/h, 300 nmol/ml/h, 500 nmol/ml/h oder 1000 nmol/ml/h. Eine Anhebung der LCAT-Menge in dem Serum auf etwa 5 μg/ml oder höher, z. B. auf etwa 10 μg/ml, etwa 20 μg/ml, etwa 50 μg/ml oder etwa 100 μg/ml erzielt auch diese Ergebnisse. Die LCAT-Spiegel können durch jedes der oben beschriebenen Verfahren erhöht werden.
Transgene nicht-humane Säugetiere
Es werden auch nicht-humane Säugetiere, die für LCAT transgen sind beschrieben, deren Serum eine Veresterungsgeschwindigkeit des Cholesterins von mindestens dem 1,5fachen oder mindestens dem zweifachen des normalen Spiegels bzw. Niveuas oder eine absolute LCAT-Serumaktivität von mindestens 1000 nmol/ml/h und vorzugsweise mindestens 1500 nmol/ml/h besitzt. Diese Tiere sind brauchbar für die Gewinnung von gesünderen Viehbeständen, für die Studie von Atherosklerose und als Screens für Verbindungen, die die Anreicherung von Cholesterin erhöhen oder verringern. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Säugetier transgen für LCAT" auf ein Säugetier, dessen Keimzellen (d. h. Oozyten oder Spermien) mindestens ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfasst, welches Expressionskontrollsequenzen umfasst, die in operativer Weise mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden sind, die für die Expression von LCAT codiert. Die Expressionskontrollsequenzen werden natürlicherweise nicht in operativer Weise mit LCAT verbunden gefunden. Vorzugsweise umfasst die rekombinante Nukleinsäure eine nicht-native LCAT-Codiersequenz d. h. eine LCAT-Sequenz, die die Spezies in der Natur nicht herstellen. Auch wird die Verwendung von LCAT, welches humanes LCAT ist, offenbart. Besonders brauchbare transgene Säuger schließen Kaninchen und Nagetiere wie Mäuse ein. Transgene nicht-humane Säugetiere können, wie oben in den Beispielen beschrieben, hergestellt werden.
Beispiele
Bestimmung der Veresterungsgeschwindigkeit des endogenen Cholesterins
J. J. Albers et al. (1986) Methods in Enzymology 129: 763-783, beschreiben das folgende Verfahren zur Bestimmung der Veresterungsgeschwindigkeit des endogenen Cholesterins. Alle 25 Assays wird das enzymatische Farbreagenz täglich frisch hergestellt durch Mischen von 0,1 ml von 1 mg Cholesterinoxidase/ml Lösung, 1 ml von 2 mg Peroxidase/ml Lösung, 1 ml von 20 mg 4-Aminoantipyrin/ml Lösung, 1 ml von 50 mg 2,4-Dibromphenol/ml Lösung, 3,75 ml 2%ige Natriumcholat-Lösung und 30,65 ml Assaypuffer. Vierzig μl frisches Plasma wird in Glasröhrchen pipettiert, in siebenfacher Ausfertigung sowohl für Kontroll- als auch Testproben. Zum Zeitpunkt Null werden 20 μl 150 mM Iodacetat-Lösung zu jeder Kontrollprobe zugegeben, um die LCAT-Reaktion zu inhibieren, wohingegen 20 μl Inkubationspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) zu jeder Testprobe zugesetzt werden. Alle Proben werden bei 37° während 40 min inkubiert. Am Ende dieser Inkubation werden 20 μl 150 mM Iodacetatlösung zu jeder Testprobe zugegeben und 20 μl Inkubationspuffer werden zu jeder Kontrollprobe zugegeben. Dann werden 1,5 ml jedes Farbreagenzes zu allen Proben zugesetzt, und die Mischungen werden 10 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion der Assaymischungen wird 10 min lang bei 37° inkubiert. Die Extinktion der Assaymischungen wird spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 500 nm gemessen. Nicht-verestertes Cholesterin in jeder Probe wird durch Vergleich gegen die Farbe von 1 bis 100 μg nicht-verestertes Cholesterin enthaltender Cholesterin-Standardlösung bestimmt, in welcher die Farbe auf die gleiche Weise wie in der Probenlösung entwickelt wird. Die Geschwindigkeit der Cholesterinveresterung wird durch Subtraktion der Menge von Cholesterin in den Testproben von derjenigen in den Kontrollproben erhalten. Die Geschwindigkeit kann sowohl als fraktionelle Cholesterinveresterungsgeschwindigkeit (Prozentsatz der Verringerung von nicht-verestertem Cholesterin/h) als auch als molare Cholesterinveresterungsgeschwindigkeit (nmol Verringerung von nicht-verestertem Cholesterin/ml Plasma/h) ausgedrückt werden.
Isolierung von LCAT
J. J. Albers et al., Methods in Enzymol., 129: 763-783 (1986), beschreibt das folgende Verfahren zum Isolieren von LCAT. Plasma wird mit Dextransulfat-Mg²⁺ (500 mM MgCl₂) präzipitiert, und das Plasma wird aufgesammelt. Die Mischung wird auf eine Phenyl-Sepharose-Chromatographie-Säule gegeben und zu 10 mM Tris, 140 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 7,4 äquilibriert. LCAT wird eluiert durch Waschen der Säule mit destilliertem Wasser. LCAT-haltige Fraktionen werden gegen 20 mM Natriumphosphat, pH 7,1, dialysiert und durch eine Affi-Gel-Blue-Säule mit diesem Puffer hindurchgeleitet. LCAT enthaltende Fraktionen werden isoliert. Diese Fraktionen werden zu 1 mM Tris, 5 mM EDTA und 25 mM NaCl, pH 7,4, äqui libriert. Die Mischung wird einer DEAE-Sepharose-Chromatographie unterzogen, und LCAT wird eluiert mit einem linearen NaCl-Tris-Gradienten (25 mM NaCl, 1 mM Tris, zu 200 mM NaCl, 10 mM Tris), welcher 5 mM EDTA enthält. LCAT enthaltende Fraktionen werden dann einer Hydroxylapatit-Chromatographie unterworfen. LCAT wird eluiert mit einem linearen Phosphatgradienten (15 mM zu 60 mM), pH 6,9, 150 mM NaCl. Die LCAT enthaltenden Fraktionen werden einer Sephacryl S-200-Gelfiltration unterzogen und mit 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, eluiert.
Herstellen von transgenen Tieren
Verfahren zur Herstellung von transgenen Säugetieren werden z. B. in C. P. Landel (1991) GATA 8: 83-94, beschrieben. Eine Superovulation wird induziert, z. B. durch die Verabreichung zu Beginn von Serum aus schwangeren Stuten, gefolgt von der Verabreichung von exogenem Gonadotrophin zweiundvierzig bis achtundvierzig Stunden später. Dann lässt man die Tiere sich paaren. Befruchtete Eier zur Mikroinjektion werden dann aus superovulierten Spenderweibchen aufgefangen. Die Weibchen werden getötet, und die Eileiter werden entfernt. Die Eier werden aus dem Eileiter entnommen und in M2-Puffer, welcher nachstehend in der Tabelle 1 beschrieben wird, gewaschen. Die Eier werden kultiviert und von Cumulus-Zellen in Puffer M16, welcher untenstehend beschrieben ist, getrennt. Die Eier erhalten eine Mikroinjektion mit gereinigten DNA-Fragmenten, welche für die Expression von LCAT codieren. Intakte, mikroinjizierte Eier werden in die Eileiter von Leihmüttern implantiert, welche durch Paarung mit sterilen Männchen pseudoschwanger gemacht worden sind. Transgene nicht-menschliche Tiere werden unter der Nachkommenschaft, welche von den Leihmüttern zur Welt gebracht wird, identifiziert.
Der Effekt von erhöhtem LCAT auf Atherosklerose in transgenen Tieren
Der Effekt von erhöhten Spiegeln an humanem LCAT auf die Atherosklerose im Kaninchen wurde untersucht. Das Kaninchen ist über mehr als 80 Jahre hinweg die hauptsächliche Tierspezies gewesen, die man zur Untersuchung der Entwicklung von durch Nahrungs-Cholesterin verursachter Atherosklerose verwendete (N. Anitschkow und S. Chalatow (1913) Zentralbl. Allg. Path. Anat. 24: 1-9). Diese Empfindlichkeit gegenüber Cholesterin in der Nahrung führt zu Atherosklerose im Kaninchen, welche menschlichen atherosklerotischen Plaques ähnelt (M. L. Querturf und D. S. Loose-Mitchell (1992) Curr. Opin. Lipidol. 3: 179-185). "Very low density"-Lipoproteine bzw. Lipoproteine sehr niedriger Dichte aus Kaninchen sind hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung, des Apolipoprotein-Gehalts und der elektrophoretischen Mobilität bei Agarosegelelektrophorese ähnlich zu menschlichen Lipoproteinen sehr niedriger Dichte; M. J. Chapman (1980) J. Lipid Res. 21: 789-853. Darüber hinaus ist Apolipoprotein B, ein bei der Atherogenese beteiligtes Apolipoprotein, in Lipoproteinen intermediärer Dichte und Lipoproteinen niedriger Dichte aus Kaninchen offensichtlich, welche denjenigen, die beim Men schen beobachtet werden, sehr ähnlich sind; ebenda. Wie Menschen, exprimiert das Kaninchen Cholesterinestertransferprotein, welches nicht nur den Transfer von aus Lipoprotein hoher Dichte abgeleitetem Cholesterinester zu Apolipoprotein B enthaltenden Lipoproteinteilchen erlaubt, sondern wahrscheinlich auch eine Rolle in der nahrungsinduzierten Atherosklerose spielt, welche Kaninchen ausprägen (A. R. Tall (1993) J. Lipid. Res. 34: 1255-1274). Deshalb gewährt das Kaninchenmodellsystem eine ausgezeichnete Methode zum Detektieren und Quantifizieren der Wirkung von potenziellen Therapien zur Behandlung und Prävention von Atherosklerose in Menschen.
Ein Konstrukt, welches das humane genomische Volllängen-LCAT-Gen enthält, wurde verwendet, um transgene Tiere zu erzeugen; B. L. Vaisman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 12269. Dieses Konstrukt enthielt alle Introns und 851 bp der 5'- und 1134 bp der 3'-untranslatierten Regionen des humanen LCAT-Gens. Eine aus humaner genomischer DNA von weißen Blutkörperchen hergestellte Cosmidbibliothek wurde mit einer humanen Volllängen-LCAT-cDNA-Sonde gescreent, wie beschrieben; J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und B. L. Vaisman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 122269-12275. DNA aus identifizierten Klonen wurde durch Alkalische-Lyse-Minipräp-DNA-Isolierung (J. Sambrook et al., siehe oben) präpariert und mit dem Restriktionsenzym Sma I (New England Biolabs, Beverly, MA) verdaut. Das 6,2 kb große Sma I-Fragment wurde aus Agarosegel durch "Gen-Reinigung" isoliert (Gene Clean Bio101 Inc., La Jolla, CA), gefolgt von Subklonierung in Bluescript IIKS- (Stratagene, La Jolla, CA), um ein 9,16 kb großes Plasmid zu erzeugen. Nach der Amplifikation in E. coli wurde Plasmid-DNA durch Doppel-CsCl-Bandierung isoliert (S. S. Fojo (1984), Biochem. Biophys. Res. Commun., 124: 308-313), gefolgt von gründlicher Dialyse und Verdau mit Sma I. Das 6,2 kb große Fragment Sma I-Fragment wurde dann aus Agarosegelen reisoliert, und "gen-gereinigt" (Gene Clean Bio 101 Inc., La Jolla, CA). Das "gen-gereinigte" Fragment wurde durch CsCl-Bandierung bzw. -Bandenisolation, gefolgt von gründlicher Dialyse gegen Injektionspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), vor der Mikroinjektion erneut gereinigt.
Die Erzeugung von transgenen Kaninchen wurde vom "Animal Care and Use Committee of the National Heart, Lung, and Blood Institute" genehmigt. Transgene Tiere wurden im Wesentlichen, wie obenstehend beschrieben, produziert durch Transfizieren mit dem Sma I-Fragment, welches für die Expression von LCAT codiert, siehe oben.
Bei der Untersuchung des Ausmaßes der Atherosklerose wurden Tiere durch intramuskuläre Vor-Medikation mit Xylazin (3 mg/Pfund), Ketamin (15 mg/Pfund) und Robinul (0,25 ml/10 Pfund) getötet, entweder vor einer Isofluran-Inhalationsbetäubung oder Euthanasie durch intravenöses Natriumpentobarbital.
Ein hoher Spiegel der Expression von humanem LCAT führte zu erhöhten Spiegeln von HDL-Cholesterin-Konzentrationen im Kaninchen. J. M. Hoeg et al. (1994) Atherosclerosis 109: 11, Abstract. Diese T-1-Gründerlinie wurde für diese Untersuchungen vermehrt. Insgesamt 10 LCAT-transgene und 9 Kontroll-Männchen mit einem Alter von 5-6 Monaten wurden untersucht. Die Masse des humanen LCAT im transgenen Plasma belief sich auf 27,25 ± 6,27 μg/ml (Mittelwert ± Standardabweichung), was mehr als das 5-Fache der mittleren LCAT-Masse von 5,56 +/0,91 μg/ml war, welche in Menschen berichtet worden ist; J. J. Albers et al. (1982) Atherosclerosis 43: 369. Die Expression von humanem LCAT führte dazu, dass die LCAT-Aktivität bei der Basislinie in den transgenen Kaninchen das 15-Fache von derjenigen von Kontrollen war (Tabelle 2). Verglichen mit Kontrollen wiesen LCAT-transgene Kaninchen eine bemerkenswerte Erhöhung in den gesamten (617 %; p < 0,001) und HDL-Cholesterin-Konzentrationen (671 %; p < 0,001) auf.
Diesen Kaninchen wurde dann eine 0,3%ige Cholesterin-Nahrung (Produktnummer 4109000, Ziegler Brothers, Inc., Gardners, PA) als Futter gegeben. Die an Cholesterin reiche Nahrung führte in den Kontrollkaninchen zu Erhöhungen von sowohl Gesamt- (19-fach) als auch speziell Nicht-HDL-Cholesterin-Konzentrationen (127-fach) (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu stieg die Plasmakonzentration in den LCAT-transgenen Kaninchen nur 2-fach bzw. 11-fach an. Die LCAT-Aktivität in den transgenen Kaninchen mit der Cholesterin-Diät blieb mehr als das 3-Fache von derjenigen der Kontrolle und führte zu einer Erhöhung von HDL-Cholesterin-Konzentrationen auf das mehr als 5-Fache von derjenigen von Kontrollkaninchen. Das Gesamt-Cholesterin/HDL-Cholesterin-Verhältnis, ein empfindlicher Indikator von klinisch nachweisbarer humaner Atherosklerose (W. Castelli und A. Leaf (1985) Cardiology Clinics 3: 171) stieg in der Kontrollgruppe um mehr als das 12-Fache an. Im Gegensatz dazu stieg das bei LCAT-transgenen Kaninchen vorhandene Gesamt/HDL-Verhältnis um weniger als das 2-Fache (Tabelle 2) und blieb unterhalb des Verhältnisses von 5, welches ein durchschnittliches Risiko für Atherosklerose beim Menschen angibt; W.P. Castelli et al. (1986) JAMA 256: 2835.
Diese Unterschiede hinsichtlich der Plasma-Lipoprotein-Konzentrationen zwischen Kontroll- und LCAT-Transgenen-Kaninchen reflektierten Unterschiede in der Entwicklung von Atherosklerose. Nach 17 Wochen bei der 0,3%-Cholesterin-Diät wurden die Aorten aus diesen Tieren geerntet, und zwei Verfahren wurden angewandt, um die Schwere von Diät-induzierter Atherosklerose in diesen Kaninchen zu quantifizieren. Eine Sudan-IV-Färbung der Lipidtröpfchen gestattet die Quantifizierung des Prozentsatzes des Oberflächenbereichs, welcher Läsionen entwickelt; J. F. Cornhill et al. (1985) Arteriosclerosis 5: 415. Die Wahrscheinlichkeits-Karte für Aorta-Läsionsentwicklung in den transgenen Kaninchen (1) zeigt nur zerstreute Foci von Öl-Sudan-IV-Färbematerial, wohingegen die Kontroll-Aorten eine wesentliche Färbung in der Mehrzahl der Tiere aufwiesen. Bei der Aorta der Kontrollgruppe waren 35 ± 7 % der Oberfläche mit Plaque bedeckt. In ausgesprochenem Gegensatz dazu waren hingegen nur 5 ± 1 % der Aor taoberfläche in den LCAT-transgenen Kaninchen von Plaque bedeckt (p < 0,009, 1 und 3, rechts).
Diese wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Atherosklerose in Aorten zwischen diesen zwei Gruppen waren auch mikroskopisch offensichtlich (2). Die Intima der Kontrollkaninchen zeigte eine Schaumzellenbildung, zelluläre Proliferation und eine Erhöhung im Verhältnis der Intima/Media auf 0,40 ± 0,11 (3, links). Es gab praktisch keine Schaumzellenbildung oder zelluläre Proliferation in den transgenen Kaninchen, welche humanes LCAT exprimierten (2). Das Intima/Media-Verhältnis von 0,03 ± 0,01 war signifikant niedriger als die Kontrolle (p < 0,009; 3, links). Diese Daten belegen, dass die Erhöhung in der LCAT-Aktivität zu einer 85-90%igen Reduktion der Atherosklerose führte.
Der Effekt der Überexpression von humanem LCAT auf die Atherogenese war signifikant mit den Änderungen hinsichtlich der Plasma-Lipoproteine korreliert. Der Metabolismus der atherogenen Apolipoprotine B (apoB)-Lipoproteinteilchen steht mit demjenigen der nicht-apoB-assoziierten Hochdichte-Lipoproteine in Zusammenhang. Patienten mit sehr hohen Konzentrationen von entweder Triglycerid-reichen apoB-Teilchen (E. A. Brinton et al. (1991) J. Clin. Invest. 87: 536) oder mit Cholesterin-angereicherten LDL-Teilchen (J. R. Schaefer et al. (1992) Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 843) weisen eine verstärkte Entfernung von HDL-Teilchen auf. Die wechselseitige Beziehung des Metabolismus dieser Teilchen wird zumindest teilweise von der Veresterung des in HDL vorhandenen Cholesterins durch LCAT und den anschließenden Transfer des Cholesterinesters aus HDL zu den apoB enthaltenden Teilchen durch das Cholesterinester-Transferprotein (CETP) vermittelt; A.R. Tall (1993) J. Lipid Res. 34: 125. Kaninchen exprimieren nicht nur mehr CETP als Nagetiere und Menschen, sondern sie erhöhen des Weiteren die Expression dieses Proteins bei Cholesterin-Fütterung; E.M. Quinet et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 357. Somit stand die Überexpression von LCAT in diesen Kaninchen im Zusammenhang mit einer reichlichen CETP-Aktivität, welche die Cholesterinkonzentrationen von sowohl HDL- als auch den Nicht-HDL-Teilchen beeinflusste.
Um die Beziehungen zwischen den für Lipoproteine und Atherogenese relevanten Variablen weiter zu erforschen, wurde eine Serie von bivariaten Pearson-Korrelationen ausgefürt. Die zwei Atherosklerose-Endpunkte, welche in dieser Untersuchung verwendet wurden, waren in hohem Maße korreliert sowohl für die Kontrollkaninchen als auch für die gesamte Untersuchungsgruppe (4, Tafeln A und E). Die Schwere der Atherosklerose sowohl in der Kontrollgruppe (r = –0,64, p < 0,006; 2, Tafel B) als auch der gesamten Untersuchungsgruppe (r = –0,55, p = 0,019; 4, Tafel F) war zu der Basislinien-LCAT-Aktivität invers korreliert. Diese inversen Korrelationen mit LCAT-Aktivität wurden durch die signifikanten direkten Korrelationen von sowohl dem Nicht-HDL- (4, Tafeln C und G) als auch dem Gesamt-Cholesterin/HDL-Cholesterin-Verhältnis (4, Tafeln D und H) komplementiert. Diese Dosis- Antwort-Beziehungen untermauern die Assoziation zwischen Atherogenese und dem Spiegel der LCAT-Expression in der Kontrolle sowie in den LCAT-transgenen Kaninchen.
Es gibt mehrere Ursachen für erhöhte Konzentrationen von HDL-Cholesterin (Hyperalphalipoproteinämie) und gesenkte Konzentrationen von HDL-Cholesterin (Hypoalphalipoproteinämie). Die zugrunde liegende Ätiologie, welche zu diesen verschiedenen Phänotypen führt, kann unterschiedliche Effekte auf Atherogenese aufweisen. Obwohl HDL-Cholesterin-Konzentrationen hauptsächlich durch die Clearance von HDL aus dem Kreislauf bestimmt werden (E.A. Brinton et al. (1994) Arterioscler. Thromb. 14: 707; D.J. Radar et al., in High Density Lipoproteins: Physiopathology and Clinical Relevance, A.L. Catapano, F. Bemini und A. Corsini, Hrsg. (Raven Press., Ltd., New York, 1993), S. 43), kann die Überproduktion von apoA-I zu Hyperalphalipoproteinämie führen (D.J. Rader et al. (1993) Metabolism 42: 1429) und gegen die Entwicklung von Atherosklerose schützen (E.M. Rubin et al. (1991) Nature 353: 265). Darüber hinaus repräsentieren HDLs eine Anordnung bzw. Gruppierung heterogener Teilchen. Es ist vorgeschlagen worden, dass in Menschen das HDL enthaltende apoA-I (LpA-I) effektiver beim reversen Cholesterintransport ist als Teilchen, welche sowohl apoA-I als auch apoA-II enthalten; R. Barbaras et al. (1988) Adv. Exp. Med. Biol., 243: 271; J.C. Fruchart und G. Ailhaud (1992) Clinical Chemistry 38: 793; H.B. Brewer, Jr. et al., in Disorders of HDL, L.A. Carlson, Hrsg. (Smith-Gordon, 1990), S. 51. ApoA-I ist ein potenter Cofaktor, welcher LCAT-Aktivität verstärkt, und die Modulation von LpA-I-Größe ist empfindlich gegenüber dem Vorhandensein von apoB enthaltenden Teilchen und LCAT-Aktivität; M.C. Cheung und A.C. Wolf (1989) J. Lipid Res. 30: 499. Kaninchen exprimieren kein apoA-II (A.L. Borresen (1976) J. Immunogenet. 3: 73; A.L. Borresen (1976) J. Immunogenet. 3: 83; A.L. Borresen (1976) J. Immunogenet. 3: 91), und diese transgenen Kaninchen besitzen nur LpA-I-Teilchen. Eine Überexpression von LCAT in diesen Tieren kann zur Erzeugung einer anti-atherogenen HDL-Subspezies geführt haben.
Transgene Mäuse, welches humanes LCAT exprimieren
Anders als das Kaninchen, ist die Maus kein ideales Modellsystem für humane Atherosklerose. Ein Grund hierfür besteht darin, dass der Lipoprotein-Metabolismus in der Maus signifikant unterschiedlich von demjenigen von Kaninchen, Menschen und anderen nicht-humanen Primaten ist. Ein metabolischer Kernunterschied zwischen Kaninchen und Mäusen ist das Vorhandensein von Cholesterylester-Transferprotein ("CETP") in Kaninchen, aber nicht in Mäusen. CETP vermittelt den Transfer von Cholesterylestern aus HDL zu apo-B enthaltenden Lipoproteinen in Kaninchen, aber nicht in Mäusen. CETP vermittelt den Transfer von Cholesterylestern aus HDL zu apo-B enthaltenden Proteinen, was die Abgabe von Cholesterin an die Leber erleichtert.
Der Effekt der Expression von humanem LCAT auf Mäuse, welche mit einer Hochcholesterin-Diät gefüttert wurden, wurde getestet. Die LCAT-Expression wurde durch Herstellen von trans genen Mäusen bewirkt. Transgene Mäuse wurden hergestellt durch Mikroinjektion eines 6,2 kb großen genomischen Fragments des gesamten humanen LCAT-Gens in befruchtete Eier; siehe Vaisman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 12269.
Transgene Mäuse, welche mit einer Diät von hohem Cholesterinanteil gefüttert wurden, zeigten erhöhte Konzentrationen im Plasma von Gesamtcholesterin, Cholesterylester und apo-B enthaltendem Nicht-HDL-Lipoprotein, wie es bei Kontrolltieren der Fall war. Im Vergleich zu Kontrollen reflektierten erhöhte Plasma-Gesamtcholesterin- und -Cholesterylester-Spiegel in LCAT-transgenen Mäusen allerdings hauptsächlich höhere Plasma-HDL-Konzentrationen, da sich die pro-atherogenen Plasma-Nicht-HDL-Lipoproteine zwischen den zwei Gruppen nicht bedeutend unterschieden.
Trotz des relativ normalen Ausflusses von membran-zellulärem Cholesterin, sowie dem Anhalten höherer HDL-Plasmakonzentrationen in Antwort auf die atherogene Nahrung, wiesen Mäuse, welche humanes LCAT überexprimieren, eine verstärkte Atherosklerose mit Zuwächsen in der mittleren Aorta-Läsionsgröße im Vergleich zu Kontrollen, und im Gegensatz zu transgenen Kaninchen, einem Modellsystem für humane Atherosklerose, auf.
Erhöhte HDL-Spiegel in Menschen sind mit einem verringerten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankung assoziiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Mechanismus, durch welchen HDL erhöht wird, die anti-atherogenen Eigenschaften des Lipoproteins bestimmt. Deshalb ist das Erhöhen von LCAT-Aktivität wahrscheinlich in Säugetieren, welche einen ähnlichen Lipoprotein-Metabolismus wie Menschen aufweisen (z. B. Kaninchen und nicht-humane Primaten), und in Menschen, deren Lipoprotein-Metabolismus (neben LCAT-Defizienz) relativ normal ist (z. B. ohne Aufweisen von CETP-Defizienz), am effektivsten.
Tabelle 1 M2- und M16-Kulturmedien für Präimplantations-Embryonen (aus Landel, siehe oben)
TABELLE 2: KONTROLL- UND LCAT-AKTIVITÄTEN UND PLASMA-LIPOPROTEINE VOR UND NACH CHOLESTERIN-FÜTTERUNG
Den Kaninchen wurde 5-7 ml Blut nach einem 12-stündigen Fasten vor (Basislinie) und nach Füttern mit einer Nahrung mit 0,3 % Cholesterin-Futter (Cholesterin-gefüttert) entnommen. α-LCAT-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung von 10 μl Plasma in einem Proteoliposom-Assay {{46885}}. EDTA-Plasma wurde hinsichtlich Gesamt-Cholesterin- und -Triglyzerid-Konzentrationen (Sigma, St. Louis, MO) auf einem Hitachi 911 Autoanalyzer (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) analysiert. Die HDL-Cholesterin-Konzentration wurde an Plasma bestimmt, welches mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 1:1 (v/v) verdünnt und dann mit Dextransulfat präzipitiert worden war {{15590}}. Die Gesamt-Plasma-Cholesterin-Konzentration und die Nicht-HDL-Cholesterin-Konzentration wurde durch Subtrahieren der HDL-Cholesterin-Konzentration von der Gesamt-Cholesterin-Konzentration ermittelt.

* Unterscheidet sich von der Basislinie, p < 0,05; ** Unterscheidet sich von Kontrollwerten, p < 0,05

Claims

Verwendung von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) für die Herstellung eines Medikaments, um die Anreicherung von Cholesterin in einem Subjekt, das keinen LCAT-Mangel aufweist, zu verringern.
Die Verwendung von LCAT für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Atherosklerose in einem Subjekt, das keinen LCAT-Mangel aufweist.
Die Verwendung wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei das LCAT enthaltende Medikament einem Säugetier als Subjekt verabreicht wird, um die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT)-Aktivität im Serum des Subjekts auf ein Niveau anzuheben, das wirksam ist, die Anreicherung von Cholesterin im Subjekt zu verringern, wobei die Anreicherung von Cholesterin ein Indikator für Atherosklerose ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament beispielsweise an einen Menschen zu verabreichen ist, wobei das Subjekt gefährdet ist, Atherosklerose zu entwickeln oder wobei das Subjekt an Atherosklerose leidet.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die LCAT eine menschliche LCAT ist, vorzugsweise rekombinante LCAT.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament an ein Subjekt zu verabreichen ist, das ein Verhältnis von Serum-Cholesterin zu Lipoproteinen hoher Dichte von über 5:1 aufweist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament an ein Subjekt zu verabreichen ist, so dass die Veresterungsgeschwindigkeit des endogenen Cholesterins im Subjekt auf mindestens 200 nmol/ml/h, vorzugsweise auf mindestens 300 nmol/ml/h, weiter bevorzugt auf mindestens 500 nmol/ml/h, weiter bevorzugt auf mindestens 1000 nmol/ml/h, noch weiter bevorzugt auf mindestens 2000 nmol/ml/h angehoben wird.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Medikament parenteral, durch Injektion, transmucosal oder transdermal zu verabreichen ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das LCAT enthaltende Medikament außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält und in Form von Dosierungseinheiten vorliegt, wobei die Dosierungseinheit vorzugsweise etwa 10 mg bis etwa 1000 mg, weiter bevorzugt etwa 40 mg bis etwa 200 mg des LCAT-Enzyms enthält.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das LCAT enthaltende Medikament für die Verabreichung über transfizierte Zellen abgestimmt ist, welche eine Nukleinsäure aufweisen, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für die Expression von LCAT codiert, wodurch die transfizierten Zellen LCAT exprimieren und ausreichend LCAT in das Serum eines Individuums sekretieren, dem sie verabreicht worden sind, um die LCAT auf eine Konzentration zu erhöhen, die wirksam ist, die Anreicherung von Cholesterin zu verringern.
Die Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäure Expressionskontrollsequenzen umfasst, die in operativer Weise mit der Nukleinsäuresequenz verbunden sind, die für die Expression von LCAT codiert, wobei die Zellen vorzugsweise mit der Nukleinsäure mittels viraler Vektoren, Plasmidvektoren, Cosmidvektoren, Mikroverkapselungsvektoren, Mikroinjektion, Elektroporation, Chromosomentransfer, Calciumpräzipitation oder biolistischer Injektion transfiziert werden.
Die Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zellen in vivo transfiziert werden, wobei die Zellen wahlweise mit einem viralen Vektor transfiziert werden, der die Nukleinsäure umfasst, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor, ein adenoviraler Vektor, ein adeno-assoziierter viraler Vektor, ein viraler Hepatitis-Vektor, ein viraler Vaccinia-Vektor oder ein viraler Herpes-Vektor ist, wobei der virale Vektor vorzugsweise ein adenoviraler Vektor ist, der einen CMV-Promotor, eine SV40-Exon-Intron-Spleissstelle, eine Sequenz, die für die Expression von LCAT codiert und ein SV40-Polyadenylierungssignal umfasst.
Die Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zellen ex vivo transfiziert werden und die transfizierten Zellen dadurch verabreicht werden, um LCAT zu exprimieren und an das Subjekt in einer ausreichenden Menge zu sekretieren, um die LCAT-Aktivität auf ein Niveau anzuheben, das wirksam ist, die Anreicherung von Cholesterin zu verringern, wobei die Zellen wahlweise hämatopoetische Zellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Medikament an ein Subjekt zu verabreichen ist, um die Konzentration an Apo A-I-Lipoprotein im Serum des Subjekts auf einen Betrag anzuheben, der wirksam ist, die Anreicherung von Cholesterin zu verringern, wobei die Menge an Apo A-I-Lipoprotein im Serum vorzugsweise auf mindestens 150 mg/dl, weiter bevorzugt auf mindestens 300 mg/dl angehoben wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Medikament an ein Subjekt zu verabreichen ist, um die Konzentration von APO A-I-Milano-Lipoprotein im Serum des Subjekts, an den das Medikament verabreicht wird, um einen Betrag anzuheben, der wirksam ist, die Anreicherung von Cholesterin zu verringern, wobei die Menge an APO A-I-Milano-Lipoprotein im Serum vorzugsweise auf mindestens 150 mg/dl angehoben wird.