UA75319C2

UA75319C2 - Виділений поліпептид, кодований геном, подібним до гена ліпази (llg), композиції, що його містять, та способи їх використання

Info

Publication number: UA75319C2
Application number: UA99073794A
Authority: UA
Inventors: Майкл К. Джей; Кім-Анх Тхі Доан; Джон А. Кравік; Кевін Дж. Лінч; Діліп В. Амін; Вікторія Дж. Саут
Original assignee: Авентіс Фамасьютікалз Інк.
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-05-12
Publication date: 2006-04-17
Also published as: HU227851B1; HUP0001649A2; HUP0001649A3

Abstract

Описуються виділені поліпептиди, кодовані геном, подібним до гена ліпази (LLG), нуклеїнові кислоти, що кодують вказані поліпептиди, антисмислові послідовності та антитіла проти вказаних поліпептидів. Описуються також способи одержання вказаних поліпептидів в рекомбінантній системі та способи використання вказаних поліпептидів для виявлення агоністів або антагоністів цих поліпептидів. Крім того, описуються способи та композиції для лікування порушень ліпідного метаболізму.

Description

Опис винаходу

Ця заявка претендує на переваги двох одночасно поданих попередніх заявок 60/032254 та 60/032783, 2 поданих 6 грудня 1996р.

Цей винахід належить до поліпептидів сімейства триацилгліцерол-ліпаз, до нуклеїнових кислот, що кодують указані поліпептиди, до антизмістовних послідовностей, похідних указаних нуклеїнових кислот та до антитіл проти указаних поліпептидів. Цей винахід належить також до одержання указаних поліпептидів з використанням рекомбінантних технологій та до використання указаних поліпептидів для скринінгу з метою виявлення агоністів 70 або антагоністів указаних поліпептидів. Цей винахід належить також до способів терапевтичного використання таких поліпептидів та послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують указані поліпептиди, в фармацевтичних композиціях, які включають композиції для генної терапії та композиції для лікування порушень метаболізму ліпідів і ліпопротеїнів.

А) Ліпіди

Ліпіди являють собою нерозчинні в воді органічні біологічні молекули, які є неодмінними учасниками різноманітних біологічних функцій, які включають накопичення, транспорт та метаболізм енергії, а також відіграють важливу роль для структури та плинності мембрани. Ліпіди, що містяться в організмі людини та інших тварин, утворюються з двох джерел: деякі ліпіди поступають з харчовими жирами та маслами, а інші ліпіди біологічно синтезуються організмом людини або тварини. У ссавців, принаймні, 1095 від маси їх тіла складають ліпіди, більшість з яких присутні в формі триацилгліцеринів.

Триацилгліцерини, відомі також як тригліцериди або триацилгліцериди, складаються з трьох жирних кислот, етерифікованих гліцерином. Харчові триацилгліцериди накопичуються в жирових тканинах як джерела енергії або гідролізуються в травному тракті триацилгліцерол-ліпазами, з яких найважливішою є панкреатична ліпаза.

Триацилгліцерини транспортуються між тканинами в формі ліпопротеїнів. с

Ліпопротеїни являють собою міцелоподібні структури, які знаходять в плазмі та які містять варіювальні Ге) співвідношення різних типів ліпідів і білків (які називають апопротеїнами). Є п'ять основних класів ліпопротеїнів плазми, головною функцією яких є транспорт ліпідів. Такими класами є, в порядку зростання густини: хіломікрони, ліпопротеїни дуже низької густини (ЛДНГ), ліпопротеїни проміжної густини (ЛПГ), ліпопротеїни низької густини (ЛНГ) та ліпопротеїни високої густини (ЛВГ). Хоч кожен клас ліпопротеїнів о включає в себе багато типів ліпідів, однак, кожен клас транспортує переважно один тип ліпідів: «- триацилгліцерини, що описані вище, транспортуються в складі хіломікронів, ЛДНГ та ЛПГ; тоді, як фосфоліпіди та складні ефіри холестерину транспортуються в складі ЛВГ та ЛНГ, відповідно. о

Фосфоліпіди являють собою складні ефіри двохосновної жирної кислоти та гліцеринфосфату, які також ою містять полярну групу, що зв'язана з фосфатом. Фосфоліпіди є важливими структурними компонентами клітинних мембран. Фосфоліпіди гідролізуються ферментами, які називаються фосфоліпазами. в

Фосфатидилхолін, типовий фосфоліпід, є головним компонентом мембран більшості еукаріотичних клітин.

Холестерин являє собою метаболічний попередник стероїдних гормонів та жовчних кислот і є також основним компонентом клітинних мембран. У людини та інших тварин, холестерин поступає з їжею, а також « синтезується печінкою та іншими тканинами. Холестерин транспортується між тканинами в формі складних З 50 ефірів холестерину, які входять до складу ЛНГ та інших ліпопротеїнів. с Кожна жива клітина оточена мембранами, які служать бар'єром між внутрішньоклітинними та позаклітинними з» компартментами. Мембрани також оточують ядро еукаріотичної клітини, входять до складу ендоплазматичного ретикулуму та здійснюють спеціальні функції, такі як функції в мієліновій оболонці, що оточує аксони. Типова мембрана містить біля 4095 ліпіду та 6095 білка, але є і істотні варіації. Головними ліпідними компонентами є фосфоліпіди, зокрема, фосфатидилхолін та фосфатидилетаноламін, і холестерин. Фізико-хімічні властивості і мембран, такі як плинність, можуть бути змінені шляхом модифікації або профілів жирних кислот, які входять до 4! складу фосфоліпідів, або вмісту холестерину. Модуляція складу та структури мембранних ліпідів також призводить до модуляції мембрано-асоційованих клітинних функцій, таких як, рецепторна активність, ендоцитоз о та надходження холестерину. -к 70 В) Ферменти

Триацилгліцерол-ліпази являють собою сімейство ферментів, що відіграють декілька ключових ролей в с метаболізмі ліпідів в організмі. Були описані три члени сімейства триацилгліцерол-ліпаз: панкреатична ліпаза, ліпопротеїн-ліпаза та ліпаза печінки (Соідрега, І.9., Ге, М.-А., Сіпзбрего, Н.М., Кгайев, К.М., « І Іпадгеп, ЕТ. (1988)

У. Сіїп. Іпмеві., 81, 561-568; ,, соідрего, 1І.9., І е, М., Раїегпій 9.К., Сіпзбрегао, Н.М., І іпадгеп, ЕТ. 5 Вгом/п, М.М. (1982) 29 у, Сііп. Іпмеві., 70, 1184-1192; Ніде, МУ.А., Спап, І, 5 1, М/.-Н. (1992) 9. Іірій. Кевз. 33, 167-178). Панкреатична

ГФ) ліпаза відповідальна, головним чином, за гідроліз харчових ліпідів. Були описані варіанти панкреатичної ліпази, але їх фізіологічна роль не була визначена |(сШег, Т., Виспм/аїд, Р., Віют-Каеїйп, О., 5 НипгікКег, МУ. (1992) о У. Віої. Спет., 267, 16509-16516). Ліпопротеїн-ліпаза є головним ферментом, відповідальним за розподіл та утилізацію тригліцеридів в організмі. Ліпопротеїн-ліпаза гідролізує тригліцириди як в складі хіломікронів, 60 таків виді ЛДНГ. Ліпаза печінки гідролізує тригліцериди з утворенням ЛПГ та ЛВГ, ії є відповідальною за ремоделювання ліпопротеїнів. Ліпаза печінки також діє як фосфоліпаза та гідролізує фосфоліпіди з утворенням

ЛВ.

Фосфоліпази відіграють важливу роль в катаболізмі та ремодулюванні фосфоліпідного компонента ліпопротеїнів їі фосфоліпідів мембран. Фосфоліпази також відіграють певну роль в вивільненні арахідинової бо кислоти з наступним утворенням простагландинів, лейкотриєнів та інших ліпідів, які беруть участь в ряді запальних процесів.

Поліпептиди ліпази, що кодуються генами ліпази, мають послідовність довжиною приблизно до 450 амінокислот з пептидами лідерної сигнальної послідовності для полегшення секреції. Білки ліпази складаються з двох головних доменів |Му/іпКіег, К., САгсу, А., 5 НиплікКег, МУ. (1990) Майшге, 343, 771-774). Аміно-кінцевий домен містить каталітичний центр, а карбокси-кінцевий домен, очевидно, відповідальний за зв'язування з субстратом, приєднання кофактора та взаємодію з клітинними рецепторами (МУопао, Н., ЮОамів, К.С., Міказгу, 5.,

Зеераг, К.Е., 5 Зспої7, М.С. (1991) Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 88, 11290-11294; мап Тіїреигой, Н., Коизвеї,

А., Іаоцеї, 9У.-М., 5 Сатбрійац, С (1994) 9. Віої. Спет. 269, 4626-4633; МУопд, Н., Оамів, К.С., Тпигеп, Т., 70 боегв, 9О.МУ., Мікагу, 9У., ММайе, М., 5 5спої7, М.С. (1994) 9. Віої. Спет. 269, 10319-10323; СпарреїІ, БА, Іпопше,

І, Егу, Б.Г., Ріадеї, М.МУ., Вожеп, 5.Ї, Імегіив, Р.-Н., І аіоцеї, 9У.-М. 5 5ігіскіапа, О.К. (1994) 3. Віої. Спет., 269, 18001-18006). Загальний рівень амінокислотної гомології між членами цього сімейства складає 22-6595, при цьому, є локальні ділянки високої гомології, що відповідають структурній гомології, яка пов'язана з ферментативною функцією.

Природна ліпопротеїн-ліпаза (І РІ) глікозилована і це глікозилування необхідне для ІРі-ферментативної активності |ЗетепкКомісп, С.Р., Їцо, С.-С, МаКапізпі, М.К., Спеп, 5.-Н., Зтії, Ї.С., «5 Спап, ЇЇ. (1990) 9. Віої.

Спет., 265, 5429-5433). В ліпазі печінки та ліпопротеїн-ліпазі присутні два сайти М-глікозилування, а в панкреатичній ліпазі присутній один сайт М-глікозилування. Крім того, чотири групи цистеїнів утворюють дисульфідні містки, які мають важливе значення в зберіганні структурної цілісності для забезпечення ферментативної активності (Со, ..-У., зт, Г.С. 5 Спеп, СГ. (1995) Віоспет. Віорпуз. Кев. Соттип. 206, 266-271; Вгаду, Ї, Вг2ог2омузКкі, А.М., Оегежшепаа, 2.5., Юодвоп, Е., Юоавзоп, О., ТоМПеу, 5., ТигКеприго, 9.Р.,

СпНгівііапзеп, І, Ниде-депзеп В., МогеКом, І, Тіт, Ї, 5 Мепде, ). (1990) Майшге, 343, 767-770.

Члени сімейства триацилгліцерол-ліпаз мають ряд загальних консервативних структурних особливостей.

Однією з таких особливостей є мотив "ЗХ5ХО", в якому центральний сериновий залишок є одним з трьох сч залишків, що складають "каталітичну тріаду" (М/іпКіег, К., С'Агсу, А., «5 Нипгікег, МУ. (1990) Майшге, 343, 771-774;

ЕайзііпейМйа, Р., Зтій, Ї.С., 5 Спап, І. (1992) Віоспетівігу, 31, 7219-7223). Інші залишки каталітичної тріади (8) складають консервативні аспартатні та гістидинові залишки. Коротка ділянка з 19-23 амінокислот (ділянка "кришки") утворює амфіпатичну спіральну структуру та покриває каталітичний "карман" ферменту |ММіпКіег, К.,

СУАгсу, А., б НипліКег, МУ. (1990) Майте, 343, 771-774). Ця ділянка відрізняється у різних членів цього Ге! зо сімейства, а недавно було встановлено, що ця ділянка передає ферменту субстратну специфічність (Оицаді, К.А., біснек Н.Г., 5 Запіатагіпа-Бо|о, 5. (1995) 9. Віої. Спет., 270, 25396-25401|. Порівняння ліпази печінки та -- ліпопротеїн-ліпази показало, що різниця в активностях триацилгліцерол-ліпази та фосфоліпази опосередкована, с почасти даною ділянкою "кришки" (Оиді, К.А., Оіспек Н.Г., « Запіатагіпа-бо|о, 5. (1995) 9. Віої. Спет., 270, 25396-254011. о

Триацилгліцерол-ліпази мають різні ступені гепарин-зв'язуючої активності. Ліпопротеїн-ліпаза має найвищу ї- спорідненість до гепарину, та, у відповідності до проведеного картування, ця ділянка зв'язуючої активності простягається до позитивно заряджених залишків в аміно-кінцевому домені (Ма, У., Непадегвоп, Н.Е., іш, М.-5., 7папо, Н., Рогзуїйе, 1.9., СіІагке-І ем/ів, І., Наудеп, М.К., « ВгипгеїЇї, 9У.О0., У. Пірій Кев., 35, 2049-2059).

Локалізація ліпопротеїн-ліпази на поверхні ендотеліальної клітини |(Спепо, С.Р., Оовіа, С.М., Вепзадоцп, А., 5 « Козепрего, К.О. (1981) 9. Віої. Спет., 256, 12893-12896), опосередкується, головним чином, через зв'язування з с з поверхневими протеогліканами |Зпітада, К., СОЇ, Р.О., 5ірегі, У.Е., боцйдіаз, МУ.Н.О., 5 Раприго, В.І. (1981) 3.

Й Сіїп. Іпмеві, 68, 995-1002; Бахепа, О., КіІеіп, М.О., 5 Соїідрего, І.9., (1991) У. Віої. Спет., 226, 17516-17521; и? Еівепрего, 5., Зепауек, Е., ОЇїмесгопа, Т., 5 МіодамеКку, І. (1992) 9. Сііп. Іпмеві,, 90, 2013-2021). Саме ця зв'язуюча активність дозволяє ферменту прискорювати поглинання ЛНГ, діючи як місток між ЛНГ та клітинною поверхнею ІМшиїдег, М., Готрвагаї, Р., Чапзеп, Н., мап Вегкеї, Т.9У., Егапів К.К., « НамекКез, І.М. (1992) Віоспет. -І Віорпуз. Кев. Сотют. 185, 582-587; КиШейде, 9У.С., 5 Соідрего, 1.9. (1994) У. Іірій Кев. 35. 1152-1160;

Твиснпіуа, 5., Хатабре, М., Матадисні, Т., Корауавнпі, У., Коппо, Т., «« Тада, К. (1980) Іпі. 93. Сапсег. 26, 171-176). о Відомо, що як ліпопротеїн-ліпаза, так і ліпаза печінки функціонують в поєднанні з білками коактиваторами: 2) аполіпопротеїном СП для ліпопротеїн-ліпази та коліпазою для панкреатичної ліпази.

Генетичні послідовності, що кодують панкреатичну ліпазу, ліпазу печінки та ліпопротеїн-ліпазу людини, - описані в літературі (СепрапК, реєстраційні номери М93285, 903540 і М15856, відповідно). Інформаційні РНК

Ге) ліпази печінки та панкреатичної ліпази людини мають довжину приблизно 1,7 та 1,8 тисяч пар основ, відповідно.

Два мРНК-транскрипти довжиною 3,6 та 3,2 тисяч пар основ транскрибуються з гена ліпопротеїн-ліпазу людини.

Ці два транскрипти використовують альтернативні сигнали поліаденілування та відрізняються за ефективністю своєї трансляції |Капдапаїнап, б., Оп, 9У.М., МикКНї, А., задпігаден, М., Зітзвоїо, К.В., Рацег, А., Кепт, Р.А. (1995) 9. Вісі. Спет., 270, 7149-7155).

Ф) С) Фізіологічні процеси ка Метаболізм ліпідів здійснюється шляхом взаємодії ліпідів, апопротеїнів, ліпопротеїнів та ферментів.

Ліпаза печінки та ліпопротеїн-ліпаза являють собою багатофункціональні білки, які опосередковують бо Зв'язування, утилізацію, катаболізм та ремоделювання ліпопротеїнів і фосфоліпідів. Ліпопротеїн-ліпаза та ліпаза печінки функціонують шляхом зв'язування з люмінальною поверхнею ендотеліальної клітини в периферичних тканинах і в печінці, відповідно. Обидва ці ферменти беруть участь в зворотному транспорті холестерину, який полягає в переносі холестерину з периферичних тканин в печінку або для екскреції з організму, або для повторного метаболічного циклу. Відомо, що генетичні дефекти як ліпази печінки, так і 65 ліпопротеїн-ліпази викликають спадкові порушення метаболізму ліпопротеїну. Дефекти в метаболізмі ліпопротеїнів призводять до серйозних метаболічних розладів, включаючи гіперхолестеринемію, гіперліпідемію та атеросклероз.

Атеросклероз являє собою комплексне полігенне захворювання, яке, з гістологічного погляду, визначається як відкладання (ліпідні або фіброліпідні бляшки) ліпідів та інших похідних крові на стінках кровоносних судин, особливо великих артерій (в аорті, коронарній артерії, сонній артерії). Ці бляшки, що є більш або менш кальцифікованими у відповідності до стадії атеросклеротичного процесу, можуть бути пов'язані з ураженнями та асоціюватися з акумуляцією в кровоносних судинах жирових відкладень, які складаються в основному зі складних ефірів холестерину. Ці бляшки супроводжуються потовщенням стінки кровоносної судини, гіпертрофією гладенької мускулатури, появою "пінистих" клітин (навантажених ліпідом клітин, які утворюються в /о результаті нерегульованого поглинання холестерину "рекрутованими" макрофагами) та акумуляцією фіброзної тканини. Атероматозні бляшки помітно виступають на стінці судини, що надає їм стенозувальних властивостей, які є відповідальними за оклюзію судин унаслідок атероми, тромбозу або емболії, що розвиваються у тих пацієнтів, які найбільш сприйнятливі до цих уражень. Вказані ураження можуть призводити до серйозних серцево-судинних патологій, таких як, інфаркт, раптова смерть, серцева недостатність та інсульт.

Роль триацилгліцерол-ліпаз в судинних патологіях, таких як, атеросклероз, є об'єктом інтенсивного дослідження |див., огляд (С., 5 Оїїмесгопа, с., 5 Оїїмесгтопа, Т. (1995) Сип. Оріп. Гірійа б, 291-305). В основному дія триацилгліцерол-ліпаз є, очевидно, антиатерогенною, оскільки ці ферменти знижують рівень триацилгліцерину в сироватці та стимулюють утворення ЛВГ. Трансгенні тварини, які експресують ліпопротеїн-ліпазу або ліпазу печінки людини, виявляли занижений рівень тригліцеридів в плазмі та підвищений рівень ліпопротеїнів високої густини (ЛВГ) |Зпітада, М., Зпітапо, Н., боюда, Т., Мататоїй, К., Кажматига, М.,

Іпара, Т., Магакі, Т., 5 Матада, М. (1993) 9. Віої. Спет. 268, 17924-17929; іш, М.-5., ЧК, Е.К., І еВоеці,

НК.С., Непаегзоп, Н., Сазіеїапі, І.М., І вів, А. 9., Ма, У., РоггзуїПе, 1.9У., 2папао, Н., Кігк, Е., ВгипгеїЇ, 9У.О., 5 Наудеп,

М.К. (1994) У. Віої. Спет. 269, 11417-11424). Було встановлено, що люди з генетичними дефектами, що призводять до зниження рівня ліпопротеїн-ліпазної активності, схильні до гіпертригліцеридемії, але без сч ов Підвищеного ризику виникнення ішемічної хвороби серця. Повідомлялось, що це зумовлено відсутністю продукування атерогенних ліпопротеїнів проміжних розмірів, які можуть акумулюватися в субендотеліальному і) просторі (імегетії, Ю.В. (1973) Сігс. Кев. 33, 633-638).

Однак, було висловлене припущення, що в локалізованій ділянці атеросклеротичного ураження, підвищений рівень ліпазної активності прискорює атерогенний процес хл/ліїмегетії О.В. (1995) Сіп. Спет. 41, 153-158; Ге! зо 7атроп, А., Тоевз, А., Ві)моеї, 5., Сапде, С, Мооіапі, 5., І иріеп, Р.)., Наудеп М.К., 5 ВгипгеїйІ, 9.0. (1993)

Іапсеї 341, 1119-1121). Це може бути обумовлено збільшенням зв'язування та поглинання ліпопротеїнів -- судинною тканиною, що опосередковане ліпазами (Еізепрего, 5., ЗепауекК, Е., ОїЇїмесгопа, Т., Міодаузку, І. с (1992) 9. Сіїп. Іпмеві. 90, 2013-2021; Тарав, І., (1, І., Вгосіа К.МУ., Хи, 5.МУ., Змепвоп, Т.Ї, ММШіатв, К.). (1993) 9. Віої. Спет. 268, 20419-20432; Могаезідаага, В.О., 5 Міеівеп, А.О. (1994) Сит. Оріп. Іірід. 5, о 252-257; ММШіатве, К.)., 5 Тадаз, І. (1995) Ай. Тиготр. Апа Мазе. Віої. 15, 551-561). Крім того, високий ї- локальний рівень ліпазної активності може призводити до цитотоксичних рівнів жирних кислот та лізофосфатидилхоліну, який продукується в попередниках атеросклеротичних уражень.

Не дивлячись на появу великої кількості відомостей, що до ролі, яку відіграє ліпазна активність в ліпідному гомеостазі, однак, необхідність в ідентифікації додаткових генів, що кодують білки та регулюють « ліпідний метаболізм, залишається актуальною. з с Цей винахід належить до виявлення гена, подібного до гена ліпази (10), до поліпептидних продуктів експресії цього гена, а також до композицій і до способів їх використання. (| З-поліпептид зв'язується з з гепарином, має гомологію з ліпопротеїн-ліпазою та ліпазою печінки людини і включає каталітичний ЗОкДа-домен сімейства триацилгліцерол-ліпаз. В іншому варіанті здійснення винаходу, цей поліпептид має активність фосфоліпази А. -І Цей винахід належить до виділеного поліпептиду, що містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 10.

Крім того, цей винахід належить до виділеного поліпептиду, що містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 8 та має о уявну молекулярну масу біля 55кДа або б8кДа на 1095 ДСН-ПААГ-гелі. 2) Цей винахід належить також до виділеного поліпептиду, що містить послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 6 та має уявну 5р молекулярну масу біля 40кДа на 1095 ДСН-ПААГ-гелі. - Крім того, цей винахід належить до антигенного фрагменту І І с-поліпептиду.

Ге) В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид та має указану вище послідовність.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до вектора, що включає вищевказану нуклеїнову кислоту, що в Кодує указаний поліпептид, та правильно приєднана до регуляторної ділянки, такої як промотор.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до рекомбінантної клітини, яка включає указаний вище (Ф, вектор. ка В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до способу одержання поліпептиду, який передбачає культивування рекомбінантних клітин, що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує указаний поліпептид, в умовах, бо що сприяють експресії указаного поліпептиду.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до антитіла, що здатне специфічно зв'язуватися з поліпептидами цього винаходу та/або нейтралізувати біологічну активність цих поліпептидів. Дійсно, додаткова властивість поліпептиду цього винаходу полягає в тому, що він специфічно зв'язується з антитілом цього винаходу, тобто з антитілом, яке є специфічним відносно І | б-поліпептиду. 65 В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до композиції, яка містить поліпептид, нуклеїнову кислоту, вектор, антизмістовну нуклеїнову кислоту або антитіло цього винаходу та фармацевтично прийнятний носій.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до способу скринінгу з метою виявлення агоністів або антагоністів ферментативної активності, яку мають поліпептиди цього винаходу, де указаний спосіб передбачає контактування потенційних агоністів або антагоністів з указаними поліпептидами та їх субстратом, і вимірювання здатності потенційних агоністів або антагоністів підсилювати або інгібувати цю активність.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до способу ферментативного гідролізу складного ефіру фосфатидилхоліну, який передбачає контактування указаного складного ефіру фосфатидилхоліну з поліпептидом цього винаходу.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до способу лікування людини або тварини з метою 7/0 покращання профілю вмісту ліпідів в сироватці даної людини або тварини, що мають небажаний ліпідний профіль, де указаний спосіб передбачає введення ефективної кількості композиції цього винаходу.

В іншому своєму аспекті, цей винахід належить до способу лікування або попередження атеросклерозу у людини або тварини, що передбачає введення даній людині або тварині ефективної кількості композиції цього винаходу.

Інші аспекти та переваги цього винаходу, крім того, проілюстровані на рисунках та в детальному описі переважних варіантів його здійснення.

На Фіг.1 показані послідовності (ЗЕО ІЮО Мо: 17-31) праймерів, що використані для експериментальних

РСК-ампліфікацій.

На Фіг.2 показана нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ Мо: 1) та виведена амінокислотна послідовність (ЗЕ 10 Мо: 2) продукту КТ-РСК-реакції (що проводиться методом диференційного відображення), що містить КДНК ген, подібний до гена ліпази. Послідовності, які відповідають двом праймерам, що використовуються при ампліфікації, підкреслені. Стоп-кодон та сигнал поліаденілування виділені рамкою. Мотиви СААТТС та фланкуюча послідовність є похідними вектора рек, в який був клонований цей продукт.

На Фіг.3 показана нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ Мо: 3) та виведена амінокислотна послідовність (ЗЕ с

ІЮ Мо: 4) 5КАСЕ-подовження кКДНК для 1/0. Послідовності, які відповідають двом праймерам, що використовуються при ампліфікації, підкреслені. Мотиви СААТТС та фланкуюча послідовність є похідними і) вектора рекІЇ, в який був клонований цей продукт.

На Фіг.4 показана послідовність (ЗЕО ІЮ Мо: 7) кКДНК, що містить повну відкриту рамку зчитування гена, подібного до гена ліпази, ГІ ОХ. Старт-кодон (АТО) та стоп-кодон (ТАС) виділені рамкою. ЮОга1-сайт (Т'ТААА) Ге! зо тазт -сайт (ЗСССОоООС), що використані при конструюванні експресуючих векторів, підкреслені.

На Фіг.5 показана виведена амінокислотна послідовність (ЗЕСО ІО Мо: 8) білка І ОХІ. Передбачувана (87 сигнальна послідовність підкреслена. с

На Фіг.6 показане порівняння первинних послідовностей членів сімейства генів триацилгліцерол-ліпаз (ЗЕО

ІЮ Мо:13-15)3. Заштриховані залишки ідентичні білкові ЇХ! (5ЕО І Мо: 8). Прориви були введені в о послідовності для максимізації порівняння первинних послідовностей з використанням програми СІ ОЗТАЇ. ї-

На Фіг.7 показано Нозерн-аналіз мРНК ІІ С в клітинах ТНР-1. Клітини були стимульовані або РМА, або РМА та окисленим І ОГ (РМА «я окис. І 0). Цифри зліва вказують на положення РНК-стандартів (тисяч пар основ).

На Фіг.8 показано Нозерн-аналіз мРНК з безлічі тканин людини, зондованих з використанням кКДНК ІІ, ліпопротеїнліпази (І РІ) та бета-актину людини. Положення 4,4т.п.о. - РНК-стандарт указане зліва від панелів « 20 5 та ГРІ. в с На Фіг.9 показано Нозерн-аналіз експресії 1/0 та ІРі в культивованих ендотеліальних клітинах та в клітинах ТНР-1 людини. Ці клітини або не стимулювали (не обробляли РМА), або стимулювали РМА. ;» На Фіг.10 показана послідовність імунізуючого пептиду (ЗЕО ІЮО Мо: 16) та його споріднення з послідовністю білка І! ОХІ. Цей пептид показано в заштрихованій рамці. Термінальний цистеїн був введений шляхом приєднання пептиду до білка-носія. -І На Фіг.11 показано Вестерн-аналіз білків, що концентровані на гепарин-сефарозі, з кондиціонованого середовища від культивованих ендотеліальних клітин. Блот зондували з використанням антисироватки проти о Гб. Цифри зліва указують на положення білків-стандартів в кілодальтонах. 2) На Фіг.12 показано Вестерн-аналіз на білки, зв'язані з гепарин-сефарозою, з кондиціонованого середовища 5ор Від клітин СОЗ-7, корткочасно трансфікованих експресуючим вектором, що містить КДНК для ПОМ або || ОХІ, - або не містить ДНК (Контроль). Білки від РМА-стимульованих ендотеліальних клітин (НСАЕС ї- РМА) були

Ге) включені для порівняння розмірів. Цифри зліва позначають уявну молекулярну масу основних імунореактивних білків, визначену шляхом порівняння з білками-стандартами.

На Фіг.13 показана послідовність РСОК-продукту кролячого ГО (КІ, ЗЕБЕО ІЮ Мо: 12) та порівняння ов первинних послідовностей РСК-продукту кролячого ІІ та відповідної послідовності КДНК людини (ІІ 57742А).

Ідентичні нуклеотиди заштиховані.

Ф) На Фіг.14 проілюстрована фосфоліпазна (А) активність ІРІ, ЇМ та ІЇОХІ| з використанням ка фосфатидилхолінового субстрату.

На Фіг.15 проілюстрована фосфоліпазна (А) активність РІ, ОМ та ГІ ОХ. з використанням триолеїнового бор субстрату.

На Фіг.16 показана гібридизація І | (5- та І КІ -зондів для геномних ДНК, які походять від різних видів.

Цей винахід належить до виявлення гена, подібного до гена ліпази (1/0), та до поліпептидних продуктів його експресії. Ці поліпептидні продукти, члени сімейства триацилгліцерол-ліпаз, містять каталітичний домен приблизно ЗО9кДа, характерний для сімейства триацилгліцерол-ліпаз, наприклад, який має послідовність ЗЕО ІЮ 65 Мо: 10. В одному зі своїх варіантів, цей винахід належить до поліпептиду ГОМ, що має 354 амінокислоти. В своєму іншому варіанті, цей винахід належить до поліпептиду ГІ ОХ, що містить 500 амінокислот та має 43905-ну подібність з ліпопротеїн-ліпазою людини і 3795-ну подібність з ліпазою печінки людини. Поліпептид ГІ ОХ. має фосфоліпазну (А) активність.

Авторами цього винаходу була виділена неповна кКДНК з мРНК клітин ТНР-1, які були оброблені форболовим складним ефіром та окисленими ЛНГ. Після 5'КАСЕ-подовження цієї неповної кКДНК, була виділена трохи менша альтернативно сплайсована кДНК. Інша більша кДНК була виділена з кДНК-бібліотеки плаценти людини.

Нозерн-аналіз показав, що ген ГЇЗ експресується в ендотеліальних клітинах. Антисироватка, продукована проти пептиду, передбаченого виходячи з відкритої рамки зчитування кКДНК, дозволила знайти білки очікуваних розмірів для ЇМ та І ОХІ в кондиціонованому середовищі від культивованих ендотеліальних клітин. 70 Оброблення ендотеліальних клітин форболовими складними ефірами призводить до підвищеного продукування

Го як на рівні мРНК, так і на рівні білків. Цей білок є першим членом сімейства триацилгліцерол-ліпаз, який, як було виявлено, експресується ендотеліальними клітинами.

А) Визначення

Нижче наводиться визначення термінів, що використовуються в описі цього винаходу, яке може бути 7/5 Корисним для розуміння суті та застосування цього винаходу. "Поліпептид" являє собою полімерну сполуку, яка складається з ковалентно зв'язаних амінокислотних залишків. Амінокислоти мають, таку загальну структуру:

Н

' к- 35 5 - с2ОоОоНн сч | о «-

Амінокислоти були поділені на сім груп у відповідності до своїх бічних ланцюгів К: (1) аліфатичні бічні с ланцюги, (2) бічні ланцюги, що містять гідроксильну групу (ОН), (3) бічні ланцюги, що містять атоми сірки, (4) бічні ланцюги, що містять кислотні або амідні групи, (5) бічні ланцюги, що містять основні групи, (6) о бічні ланцюги, що містять ароматичне кільце та (7) пролін, амінокислота, в якій бічний ланцюг зв'язаний з ї- аміногрупою. "Білок" являє собою поліпептид, який відіграє певну структурну або функціональну роль в живій клітині.

Поліпептиди та білки цього винаходу можуть бути глікозилованими або неглікозилованими.

Термін "гомологія" означає подібність послідовностей, яка відображає їх загальне еволюційне походження. «

Вважається, що поліпептиди або білки мають гомологію або подібність, коли значна кількість їх амінокислот є з с або (1) ідентичними, або (2) мають хімічно подібний бічний ланцюг К. Вважається, що нуклеїнові кислоти мають гомологію, коли значна кількість їх нуклеотидів є ідентичними. з "Виділений поліпептид" або "виділений білок являє собою поліпептид або білок, який, в основному, не містить тих сполук, які звичайно асоціюються з ними в природних умовах (наприклад, інші білки або поліпептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, ліпіди). Термін "виділений" не означає, що він виключає штучні -І або синтетичні суміші з іншими сполуками, або присутність домішок, які не впливають на біологічну активність та які можуть бути присутніми, наприклад, через неповне очищення, додання стабілізаторів або виготовлення о фармацевтично прийнятних препаратів. 2) Молекула є "антигенною", якщо вона здатна специфічно взаємодіяти з антиген-розпізнаючою молекулою 5ор імунної системи, такою як, імуноглобулін (антитіло) або рецептор для Т-клітинного антигена. Антигенний - поліпетид містить, принаймні, біля 5, а переважно, принаймні, біля 10 амінокислот. Антигенна ділянка молекули

Ге) може бути тією ділянкою, яка є імунодомінантною для антитіла або для розпізнавання Т-клітинного рецептора, або вона може бути ділянкою, що використовується для продукування антитіла до даної молекули шляхом кон'югування антигенної ділянки з молекулою-носієм для імунізації. Молекула, яка є антигеном, необов'язково в повинна бути сама імуногенною, тобто здатною індукувати імунну відповідь в відсутності носія. "Поліпептид ГОМ" та "білок Г.М" позначають поліпептид, що включає послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 6, де (Ф, указаний поліпептид є глікозилованим або неглікозилованим. ка "Поліпептид І ОХІ" та "білок ОХ" позначають поліпептид, що включає послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 8, де указаний поліпептид є глікозилованим або неглікозилованим. во "| б-поліпептид", в основному, належить як до поліпептиду ГІ ОМ, так і до поліпептиду І Г ОХ.

І С-поліпептидом або білком цього винаходу є будь-який аналог, фрагмент, похідна або мутант, що походить від ГІЇ С-поліпептиду і який зберігає, принаймні, одну біологічну властивість ГІ -поліпептиду. В природі існують різноманітні варіанти ГІ «з-поліпептиду. Ці варіанти можуть бути алельними варіантами, які характеризуються відмінностями нуклеотидних послідовностей структурного гена, що кодує даний білок, або 65 Вони можуть відрізнятися за сплайсингом або за пост-трансляційною модифікацією. Кожен фахівець може самостійно одержати варіанти, що мають одну або безліч амінокислотних замін, делецій, додатків або перестановок. Такими варіантами можуть бути, іпіег аїйа, (а) варіанти, в яких один або декілька амінокислотних залишки замінені консервативними або не консервативними амінокислотами, (Б) варіанти, в яких одна або декілька амінокислот додані до ІІ С-поліпептиду, (с) варіанти, в яких одна або декілька амінокислот

Включають замінну групу та (4) варіанти, в яких ГІ бС-поліпептид з'єднаний з іншим поліпептидом, таким як, альбумін сироватки. Іншими ГІ З-поліпептидами цього винаходу є варіанти, в яких амінокислотні залишки, що походять від одного виду, замінені на відповідні амінокислотні залишки від іншого виду або в консервативних, або в неконсервативних положеннях. В іншому варіанті здійснення винаходу, амінокислотні залишки в неконсервативних положеннях замінені консервативними або неконсервативними залишками. Способи /о одержання цих варіантів, включаючи генетичні (супресії, делеції, мутації і т.п.), хімічні та ферментативні способи, відомі кожному середньому фахівцю.

Якщо такі алельні варіанти, аналоги, фрагменти, похідні, мутанти та модифікації, включаючи альтернативні форми мРНК-сплайсингу та альтернативні форми пост-трансляційної модифікації, призводять до продукування похідних ІІ С-поліпептиду, які зберігають будь-які з біологічних властивостей цього І (з-поліпептиду, то всі 7/5 Вони входять в об'єм цього винаходу. "Нуклеїнова кислота" являє собою полімерну сполуку, що складається з ковалентно зв'язаних субодиниць, які називаються нуклеотидами. Нуклеїновими кислотами є полірибонуклеїова кислота (РНК) та полідезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК), обидві з яких можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими.

ДНК може являти собою кДНК, геномнуднК, синтетичну ДНК та напівсинтетичну ДНК. Послідовність нуклеодитів, що кодує білок, називається змістовною послідовністю. "Антизмістовна нуклеїнова кислота" являє собою послідовність нуклеотидів, яка є комплементарною до змістовної послідовності. Антизмістовна послідовність може бути використана для інгібування або блокування експресії поліпептиду, кодованого змістовним ланцюгом.

Термін "виділена нуклеїнова кислота" позначає нуклеїнову кислоту, яка, в основному, не містить сполук, що сч звичайно асоціюються з нею в природних умовах. Термін "виділений" не означає, що він виключає штучні або синтетичні суміші з іншими сполуками, або присутність домішок, які не впливають на біологічну активність та і) які можуть бути присутніми, наприклад, Через неповне очищення, додання стабілізаторів або виготовлення фармацевтично прийнятних препаратів.

Фраза "нуклеїнова кислота, яка гібридизується в умовах високої жорсткості" позначає, що гібридизовані Ге!

Зо Нуклеїнові кислоти здатні витримувати промивання в умовах високої жорсткості. Прикладом промивання в умовах високої жорсткості для гібридів ДНК-ДНК є промивання 0,1 х З55С, 0,595 ДСН при 682С. Фахівцям відомі -- і інші промивання в умовах високої жорсткості. со

Термін "регуляторна ділянка" позначає послідовність нуклеїнової кислоти, яка регулює експресію нуклеїнової кислоти. Регуляторна ділянка може включати послідовності, що по своїй природі є відповідальними юю з5 за експресію конкретної амінокислоти (гомологічна ділянка), або вона може включати послідовності ї- різноманітного походження (відповідальні за експресію різних білків або навіть синтетичних білків). Зокрема, такими послідовностями можуть бути послідовності еукаріотичних генів або вірусних генів, або похідні від них послідовності, що стимулюють або пригнічують транскрипцію гена специфічним або не специфічним способом та індукованим або не індукованим способом. Регуляторні ділянки включають ділянки ініціації реплікації, сайти « сплайсингу РНК, енхансери, послідовності термінації транскрипції, сигнальні послідовності, що направляють шщ с поліпептид секреторним шляхом до клітини-мішені, та промотори. й Регуляторна ділянка з "гетерологічного джерела" являє собою регуляторну ділянку, яка в природних умовах "» не асоціюється з нуклеїновою кислотою, що експресується. До гетерологічних регуляторних ділянок належать регуляторні ділянки особин іншого виду, регуляторні ділянки іншого гена, гібридні регуляторні послідовності та регуляторні послідовності, які не зустрічаються в природі, але які були сконструйовані штучно. -і Термін "вектор" позначає будь-яку послідовність, що призначена для перенесення нуклеїнової кислоти цього винаходу до клітини-хазяїна. Термін "вектор' включає вектори вірусного та не вірусного походження, які іні використовуються для введення нуклеїнової кислоти в прокаріотичну або еукаріотичну клітину іп міїгр, ех мімо

Ге) або іп мімо. Векторами не віросного походження є плазміди, ліпосоми, ліпіди з електричним зарядом (цитофектини), комплекси ДНК-білок та біологічні полімери. Вірусними векторами є ретровіруси, - аденоасоційовані віруси, вектори на основі поксвірусів, бакуловірусів, вірусів коров'ячої віспи, вірусів

Ге) простого герпесу, вірусів Епштейна-Барра та аденовірусів. Окрім нуклеїнової кислоти цього винаходу, вектор може також містити одну або декілька регуляторних ділянок та/або селективні маркери, що використовуються для відбору, вимірювання та моніторингу результатів перенесення нуклеїнової кислоти (перенесення в тканини, тривалості експресії і т.п.). "Рекомбінантна клітина" являє собою клітину, що містить нуклеїнову кислоту, яка в природних умовах не іФ) присутня в цій клітині. Термін "рекомбінантна клітина" включає вищі еукаріотичні клітини, такі як, клітини ко ссавців, нижчі еукаріотичні клітини, такі як, дріжджові клітини, прокаріотичні клітини та архебактеріальні клітини. "Фармацевтично прийнятний носій" включає розріджувачі та наповнювачі, які є фармацевтично прийнятними бо для цього способу введення та стерильними, і можуть являти собою водні або масляні суспензії, виготовлені з використанням придатних диспергуючих або змочувальних агентів та суспендуючих агентів. Вибір конкретного фармацевтично прийнятного носія та відношення вмісту активної сполуки до вмісту цього носія визначається розчинністю та хімічними властивостями композиції, конкретним способом введення та стандартною фармацевтичною практикою. 65 "Ліпаза" являє собою білок, який може ферментативно розщеплювати ліпідний субстрат. "Фосфоліпаза" являє собою білок, який може ферментативно розщеплювати фосфоліпідний субстрат.

"Триацилгліцерол-ліпаза" являє собою бГяок, який може ферментативно розщеплювати триацилгліцеридний субстрат. "Фосфатидилхолін" являє собою гліцерин-вмісний фосфоліпід, що має таку структуру: о . » я-с-о-сн 2 в- 0-5 0-он . | | Ї о ! з о 0но-о-в-о-сни-сни--Мо 2 й М НІ о де К та К' являють собою вуглеводневі бокові ланцюги жирних кислот. Фосфатидилхолін також відомий як лецитин.

Термін "ліпідний профіль" позначає серію концентрацій холестерину, тригліцериду, ліпопротеїнового сч об Холестерину та інших ліпідів в організмі людини або тварини. "Небажаний ліпідний профіль" являє собою стан, при якому концентрації холестерину, тригліцериду або о) ліпопротеїнового холестерину знаходяться поза стандартними межами, які визначені для цього віку та статі.

Звичайно, небажаним ліпідним профілем вважаються концентрації загального холестерину 220Омг/дл, тригліцеридів плазми »20Омг/дл, холестерину ЛНГ »13Омг/дл, холестерину ЛВГ «ЗОмг/дл або відношення б зо Загального холестерину до холестерину ЛВГ 24,0. Небажаний ліпідний профіль асоційований з рядом патологічних станів, включаючи гіперліпідемію, діабетичну гіперхолестеринемію, атеросклероз та інші форми -ї7 ішемічної хвороби серця. со

В) Поліпептиди

Цей винахід належить до поліпептидів, які є членами сімейства тригліцерол-ліпаз та які включають іс) каталітичний ЗОкДа-домен сімейства триацилгліцерол-ліпаз, наприклад, домен, що має послідовність ЗЕО ІЮ Мо: їм 10. Одним з варіантів здійснення цього винаходу є виділений І | б-поліпептид, що містить послідовність ЗЕО ІЮ

Мо: 6 та має уявну молекулярну масу біля 40кДа на 1095 ПААГ-ДСН-гелі. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є виділений ІІ б-поліпептид, що містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо:8 та має уявну молекулярну масу біля 55кДа або б8кДа на 1095 ПААГ-ДСН-гелі. « 20 Поліпептиди та білки цього винаходу можуть бути рекомбінантними поліпептидами, природними 3 с поліпептидами або синтетичними поліпептидами та можуть походити від людини, кролика або від інших тварин.

Ці поліпептиди характеризуються репродукованими однією молекулярною масою та/або безліччю молекулярних :з» мас, хроматографічними реакціями та профілями елюції, амінокислотним складом та амінокислотною послідовністю, а також біологічною активністю.

Поліпептиди цього винаходу можуть бути виділені з природних джерел, таких як, екстракти плаценти, плазма -1 людини або кондиціоновані середовища від культивованих клітин, таких як, макрофаги або ендотеліальні клітини, з використанням процедур очищення, добре відомих фахівцям. 1 Альтернативно, поліпептиди цього винаходу можуть бути одержані з використанням методу рекомбінантних с ДНК, який передбачає вставляння нуклеїнової кислоти, що кодує цей поліпептид, в придатний вектор, введення 5о одержаного вектора в придатну клітину-хазяїн, виділення поліпептиду, продукованого одержаною - клітиною-хазяїном та очищення цього виділеного поліпептиду.

Ге) С) Нуклеїнові кислоти

Цей винахід належить до виділених нуклеїнових кислот, що кодують І І б-поліпептиди.

Цей винахід належить також до антизмістовних нуклеїнових кислот, що можуть бути використані для супресії або блокування експресії І І -поліпептидів іп міїго, ех мімо або іп мімо.

Техніка рекомбінантних ДНК відома кожному фахівцю в цій галузі. Загальні методи клонування та експресії (Ф) рекомбінантних молекул описані в пораднику Мапіаїйз |Моїесшіаг Сіопіпд, Сої4 Зргіпд Нагброг Іарогаїйогієв, ко 19821, та А!йзибеї! (Сигтепі Ргоїосоіїв іп Моїесціаг Віооду, МУПеу апа Зопз, 1987), які вводяться в цей опис шляхом посилання. во Нуклеїнові кислоти цього винаходу можуть бути з'єднані з однією або декількома регуляторними ділянками.

Вибір відповідної регуляторної ділянки або регуляторних ділянок являє собою рутинний метод доступний кожному середньому фахівцю. Регуляторні ділянки включають промотори та можуть включати енхансери, супресори та т.п.

Промоторами, які можуть бути використані в цьому винаході, є конститутивні промотори та регульовані в5 (індуцибельні) промотори. Ці промотори можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними в залежності від хазяїна. Прокаріотичними промоторами (включаючи бактеріофагові промотори), які можуть бути використані в цілях цього винаходу, є ад, Іас/, ТЗ, Т7, лямбда Р ,, РІ та ігр-промотори. Еукаріотичними промоторами (включаючи вірусні промотори), які можуть бути використані в цілях цього винаходу, є конститутивні промотори (наприклад, промотори НРЕТ, віментину, актину, тубуліну); промотори проміжних філаментів (наприклад, промотори десміну, нейрофіламентів, кератину, ОЕАР); промотори терапевтичних генів (наприклад, типу МОК,

СЕТК, фактора МІІ); тканиноспецифічні промотори (наприклад, промотор актину в клітинах гладеньких м'язів або промотори Рїї та РІК, активні в ендотеліальних клітинах); промотори, які, переважно, активуються в клітинах, що діляться; промотори, що є сприйнятливими до стимуляторів (наприклад, рецептор стероїдного гормона, рецептор ретиноєвої кислоти); модулятори транскрипції, що регулюються тетрацикліном; передранні промотори 7/0 Читомегаловіруса; довгі кінцеві повтори (ГТК) ретровірусів; промотори металотіонеїну; промотори ЗМ40; промотори ЕїЇа та промотори МІ Р. Модулятори транскрипції, що регулюються тетрацикліном, та промотори СММ описані в МО 96/01313, в патентах США 5168062 та 5385839, зміст яких вводиться в цей опис шляхом посилання.

Краще, щоб вірусні вектори, які використовуються в генній терапії, були дефектними по реплікації, тобто, /5 краще, щоб вони були нездатні автономно реплікуватися в клітинах-мішенях. В основному, в геномі дефектних по реплікації вірусних векторів, які використовуються в цьому винаході, відсутня, принаймні, одна ділянка, що необхідна для реплікації віруса в інфікованих клітинах. Ці ділянки можуть бути або еліміновані (повністю або частково), або зроблені не функціональними відомими способами. Ці способи передбачають повне вилучення, заміну (іншими послідовностями, зокрема, інсертованою нуклеїновою кислотою), часткову делецію або додання

ОДНІЄЇ або декількох основ до головної (для реплікації) ділянки. Ці способи можуть бути здійснені іп мйго (на виділеній ДНК) або іп зйш, з використанням техніки модифікації генів або шляхом обробляння мутагенними агентами.

При цьому переважно, щоб дефектний по реплікації вірус зберігав послідовності свого геному, необхідні для утворення капсиду вірусних частинок. с

Ретровіруси являють собою віруси, що інтегруються та які інфікують клітини, що діляться. Геном ретровіруса включає два І ТК (довгих кінцевих повтори), послідовність, що відповідає за утворення капсиду, та і) три кодуючих ділянки (дад, ро! та епу). Було описано конструювання рекомбінантних ретровірусних векторів:

Ідив., зокрема, ЕР 453242, ЕР 178220, Вепзіевїп еї аїЇ., Сепеї. Епо. 7 (1985) 235; МсСогтіск, ВіоТесппоіоду З (1985) 689, і т.п. В рекомбінантних ретровірусних векторах, гени дад, роІ та епу, звичайно делетировані, Ге! зо повністю або частково, та замінені потрібною гетерологічною послідовністю нуклеїнової кислоти. Ці вектори можуть бути сконструйовані з ретровірусів різних типів, таких як, МоМи! М ("мишачий вірус лейкозу Молоні"), --

ММ ("мишачий вірус саркоми Молоні"), Назм ("вірус саркоми Харвея"); ММ ("вірус некрозу селезінки"); КЗМ с (вірус саркоми Рауса") та віруса Фрейнда.

В основному, для конструювання рекомбінантних ретровірусів, що містять послідовності, які кодують о

І! О-поліпептид цього винаходу, була сконструйована плазміда, що містить І ТК, послідовність, що відповідає-за ї- утворення капсиду, та кодуючу послідовність. Цю конструкцію використовували для трансфекції упаковувальної клітинної лінії, що здатна забезпечити в транс-положенні ретровірусні функції, які відсутні в плазміді. Таким чином, упаковувальні клітинні лінії в основному, здатні експресувати гени дад, роіЇ та епу. Такі упаковувальні клітинні лінії були описані раніше, а, зокрема, клітинна лінія РАЗІ17 (054861719); клітинна «

Лінія РвіСкІР (УМО 90/02806), і клітинна лінія бРжепуАт-12 (МУО 89/07150). Окрім того, рекомбінантні з с ретровірусні вектори можуть містити модифікації в ГТК для інгібування транскрипційної активності, а також подовженні послідовності, що відповідають за утворення капсиду та які можуть включати частину гена дад ;» ІВепдег еї аїЇ., 9. Мігої, 61 (1987) 1639). Рекомбінантні ретровірусні вектори очищають за допомогою стандартних методик, які добре відомі фахівцям.

Аденоасоційованими вірусами (ААВ) є ДНК-вмісні віруси відносно невеликого розміру, які можуть -І інтегруватися стабільним та сайт-специфічним способом в геном клітин, які вони інфікують. Ці віруси здатні інфікувати широкий спектр клітин без індукування якої-небудь дії на ріст, морфологію або диференціювання 1 клітин, та вони, очевидно, не викликають яких-небудь патологій у людини. Геном ААВ був клонований, 2) секвенований та охарактеризований. Він містить приблизно 4700 основ та містить ділянку інвертованих кінцевих 5р повторів (ІТК) приблизно в 145 основ на кожному кінці, яка є ділянкою ініціації реплікації вірусу. Решта - геному ділиться на дві основні ділянки, що мають функції утворення капсиду: лівосторонню частину геному, яка

Ге) містить ген гер, що приймає участь в реплікації вірусу та експресії вірусних генів; та правосторонню частину геному, яка містить ген сар, який кодує капсидні білки вірусу.

Використання векторів, що походять від ААВ, для переносу генів іп міо і іп мімо, описано в роботах в Ідив. УУО91/18088, УУО93/09239; патенти США 4797368; ЕР 488528). В цих публікаціях описані різноманітні конструкції, які походять від ААВ, та в яких гени гер та/або сар були делеговані та замінені потрібним геном,

Ф) а також використання цих конструкцій для перенесення указаного потрібного гена іп мійго (в культивовані ка клітини) або іп мімо (безпосередньо в організм). Дефектні по реплікації рекомбінантні ААВ цього винаходу можуть бути одержані шляхом контрансфекції плазміди, що містить потрібну послідовність нуклеїнової кислоти, во фланковану двома ділянками інвертованих кінцевих повторів (ІТК) ААВ, та плазміди, що несе гени, відповідальні за утворення капсиду ААВ (гени гер та сар), в клітинну лінію, інфіковану людськім вірусом-помічником (наприклад, аденовірусом). Потім, продуковані рекомбінантні ААВ очищають стандартними методами. Отже, цей винахід належить до похідного від ААВ рекомбінантного вірусу, геном якого охоплює послідовність, що кодує

І О-поліпептид, фланкований ААВ-ІТК. Цей винахід також належить до плазміди, яка включає послідовність, що 65 кодує І О-поліпептид, фланкований двома ІТК від ААВ. Така плазміда також може бути використана для перенесення послідовності ГО, причому, ця плазміда, якщо це необхідно, може бути введена в ліпосомний вектор (псевдовірус).

В переважному варіанті здійснення цього винаходу, таким вектором є аденовірусний вектор.

Аденовіруси являють собою еукаріотичні ДНК-віруси, які можуть бути модифіковані для доставки нуклеїнової

Кислоти цього винаходу в клітини різних типів.

Існують різноманітні серотипи аденовірусів. З цих серотипів, з погляду цього винаходу, краще використовувати аденовіруси людини типу 2 або 5 (Ад2 або Авд5) або аденовіруси, які походять від тварин (див.

МО094/26914). Такими аденовірусами тваринного походження, які можуть бути використані в цьому винаході, є аденовіруси собак, корів, мишей Інаприклад, Мамі, Веага еї аї., Мігоюду 75 (1990) 81), овець, свиней, птахів /о та мавп (наприклад, ЗАМ). Кращими аденовірусами, що походять від тварин, є аденовіруси собак, найкраще аденовірус САМ2 |наприклад, штам Манхетен або штам А26/61, наприклад, АТС МІК-8001.

Переважні дефектні по реплікації аденовірусні вектори цього винаходу містять ІТК, послідовність утворення капсиду та потрібну нуклеїнову кислоту. Ще краще, щоб, принаймні, ділянка Е1 аденовірусного вектора була не функціональною. При цьому, краще щоб делеція на ділянці ЕЇ охоплювала ділянку від нуклеотиду 455 до /5 Нуклеотиду 3329 в послідовності аденовірусу Аа5. Можуть бути також модифіковані інші ділянки, зокрема, ділянка ЕЗ (МИО95/02697), ділянка Е2 (УУО94/28938), ділянка Е4 (М/О94/28152, МО094/12649 та М/О95/02697) або ділянка в будь-якому з пізніх генів І 1-І 5. Дефектні ретровірусні вектори описані в УМО95/02697.

В переважному варіанті здійснення винаходу, аденовірусний вектор має делецію на ділянках Е1 та Е4. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу, аденовірусний вектор має делецію на ділянці ЕТ, в яку були вбудовані ділянка Е4 та послідовність, що кодує ГІ о (див. ЕК94 13355).

Дефектні по реплікації рекомбінантні аденовіруси цього винаходу можуть бути одержані будь-яким способом, що є відомим фахівцям (І емгего еї аіЇ., бСепе 101 (1991) 195, ЕР 185573; Стгапат, ЕМВО .., З (1984) 2917).

Зокрема, вони можуть бути одержані шляхом гомологічної рекомбінації між аденовірусом та плазмідою, яка містить, іпіег аїйа, потрібну ДНК-послідовність. Ця гомологічна рекомбінація здійснюється після котрансфекції сч ов указаного аденовірусу та плазміди у відповідну клітинну лінію. Використовувана клітинна лінія повинна бути, переважно, такою, що (і) трансформується указаними елементами та (ії) містить послідовності, комплементарні і) частини геному дефектного по реплікації аденовірусу, переважно, в інтегрованій формі для усування ризику рекомбінації. Прикладами клітинних ліній, які можуть бути використані, є ниркова клітинна лінія ембріона людини 293 |ОСгапат еї аї., 9). Сеп. Мігої. 36 (1977) 59), яка містить лівосторонню частину генома аденовірусу Ге! зо Ла5 (1290), інтегровану в її геном; та клітинні лінії, здатні до комплементації функцій Е1 та Е4, як описано в заявках У/О094/26914 та УМ/095/02697. Рекомбінантні аденовіруси виділяли та очищали з використанням -- стандартних методів молекулярної біології добре відомих кожному фахівцю. с

Інгібування експресії гена з використанням антизмістовних нуклеїнових кислот може бути досягнене на трансляційному або транскрипційному рівні. Антизмістовні нуклеїнові кислоти цього,иинаходу, переважно, о зв ЯяВЛЯЮТЬ собою фрагменти нуклеїнових кислот, що здатні специфічно гібридизуватися зі всією або з частиною ї- нуклеїнової кислоти, що кодує ГІ с або відповідну інформаційну РНК. Ці антизмістовні нуклеїнові кислоти можуть являти собою синтетичні олігонуклеотиди, необов'язково модифіковані для підвищення їх стабільності та селективності. Вони-можуть також являти собою ДНК-послідовністі, експресія яких в клітині призводить до продукування РНК, комплементарної всій або частині МРНК ІІ 0. Антизмістовні нуклеїнові кислоти можуть бути « одержані шляхом експресії всієї або частини послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ Мо: 2, з с ЗЕО ІЮ Мо: 3, ЗЕО ІЮО Мо: 7 або ЗЕО ІО Мо: 11, і знаходиться в протилежній орієнтації, як описано в ЕР 140308. . Для здійснення цього винаходу придатною є антизмістовна послідовність будь-якої довжини, за умови, що вона и?» здатна інгібувати або блокувати експресію (1/0. Переважно, щоб довжина антизмістовної послідовності складала, принаймні, 20 нуклеотидів. Одержання та використання антизмістовних нуклеїнових кислот, ДНК, що Кодують антизмістовні РНК, та використання оліго- і генних антизмістовних послідовностей описано в заявці -І М/092/15680, зміст якої вводиться в цей опис через посилання.

Ор) Антитіла о Цей винахід належить до антитіл проти ГІ -поліпептиду. Ці антитіла можуть бути моноклональними або 2) поліклональними антитілами. Цей винахід включає химерні, одноланцюгові, "гуманізовані" антитіла, а також 5о Еаб-фрагменти та продукти бібліотеки Рар-фрагментів, що експресуються. - Можуть бути одержані поліклональні антитіла проти антигенного фрагменту І | С-поліпептиду, як описано в

Ге) Прикладі 4А. Можуть бути також продуковані антитіла проти інтактного (ГІ -білка або поліпептиду, або проти фрагменту, похідного або епітопу цього білка, або поліпептиду. Антитіла можуть бути продуковані після введення білка, поліпептиду, фрагменту, похідного або епітопу тварині з використанням техніки та процедур, в Відомих фахівцям.

Моноклональні антитіла можуть бути одержані методом МізпеїІ, В.В., еї аЇ., Зеіесієїй Меїподз іп Сеїйшаг

Ф) Іттипоіоду |МУ.Н. Егеетап, ед., зап Егапсізсо (1980)). Для цього, поліпептид цього винаходу використовують для ка імунізації клітин селезінки мишей ВАЇВ/с. Імунізовані клітини селезінки піддають злиттю з мієломними клітинами. Злиті клітини, що мають властивості клітин селезінки та мієломної клітини, виділяють шляхом бо Культивування в середовищі НАТ, тобто, в середовищі, на якому обидві батьківські клітини гинуть, але продукти злитих клітин виживають і ростуть.

Моноклональні антитіла цього винаходу можуть бути "гуманізовані" для запобігання вироблянню у хазяїна імунної відповіді на ці антитіла. "Гуманізоване антитіло" являє собою антитіло, в якому гіперваріабельні ділянки (які визначають комплементарність ділянки - СОК) та/або інші ділянки каркасних варіабельних доменів 65 легкого та/або важкого ланцюга є похідними імуноглобуліну, відмінного від людського, а інші ділянки молекули походять від одного або декількох імуноглобулінів людини. "Гуманізованими" антитілами також є антитіла, які характеризуються тим, що у них "туманізований" важкий ланцюг асоційований з донорним або акцепторним немодифікованим легким ланцюгом або з химерним легким ланцюгом, або навпаки. "Гуманізування" антитіл може бути здійснене методами, відомими фахівцям |див., наприклад, С.Е. Маг 4 Е.А, Радіап, "Спаріег 4.

Нитапігайоп ої Мопосіопа! Апііїродіев", Те НапдроокК ої Ехрегітепіа! Рпагтасоїоду Мої. 113, Зргіпдег-Мегіад,

Мем Хогк, 1994). Для продукування "гуманізуванних" антитіл можуть бути використані трансгенні тварини.

Для продукування одноланцюгових антитіл проти імуногенних поліпептидів та білків цього винаходу можть бути пристосовані методики, відомі фахівцям та які використовуються для продукування одноланцюгових антитіл. 70 Антитіла проти ГІ б можуть бути використані в аналізах для виявлення або для кількісної оцінки рівнів (І (5.

В одному з варіантів здійснення цього винаходу, ці аналізи дозволять проводити клінічну діагностику та оцінку рівнів ЇЇ с на різних стадіях захворювання та здійснювати моніторинг ефективності лікування.

Е) Методи скринінгу для виявлення агоністів або антагоністів

Цей винахід належить до способів скринінгу бібліотек невеликих молекул або джерел природних продуктів /5 для виявлення агоністів (енхансерів або коактиваторів, включаючи білкові коактиватори) або антагоністів (інгібіторів) ГІ ОХІ -активності. Передбачуваний агоніст або антагоніст піддають контакту з білком ОХ та субстратом ГІ ОХ, і оцінюють здатність передбачуваного агоністаабо антагоніста підсилювати або інгібувати активність ГІ ОХ.

Білок ІІ ОХ, що використовується в цьому способі, може бути продукований рекомбінантним методом в ряді Клітин-хазяїнів, включаючи клітини ссавців (як показано в Прикладі 7), клітини, інфіковані бакуловірусом, дріжджі та бактерії. Експресія | в стабільно трансфікованих клітинах СНО може бути оптимізована шляхом метотрексат-ампліфікації цих клітин. Білок Г/ОХІ може бути також виділений з природних джерел, таких як, плазма людини, плацентарні екстракти або кондиціоноване середовище від культивованих ендотеліальних клітин, клітин ТНР-1 або макрофагів. сч

Оптимізація аналітичних параметрів, включаючи рН, концентрацію іонів, температуру, концентрацію субстрату та умови емульгування, може бути проведена емпірично будь-яким фахівцем. і)

Жирнокислотні замісники субстратів можуть варіюватися по довжині ланцюга, а також за ступенем та положенням ненасиченості. Субстрати можуть бути помічені радісактивною міткою в будь-якому з декількох положень. Фосфоліпідні субстрати, такі як, фосфатидилхолін, можуть бути піддані радіоактивному міченню, Ге! зо наприклад, в положенні жирних кислот Зп-1 або зЗп-2, або в гліцериновій, фосфатній або полярній головній групі (холін у випадку фосфатидилхоліну). --

Як альтернатива до радіоактивних субстратів, в методах скринінгу можуть бути також використані і інші с класи мічених субстратів, такі як, флуоресцентні субстрати або тіовмісні субстрати.

Флуоресцентні субстрати є особливо придатними для використання в аналізах скринінгу, оскільки в цьому о з5 випадку ферментативний каталіз може оцінюватися безперервно шляхом вимірювання інтенсивності ча флуоресценції не вдаючись до фізичного відділення (екдгракції) продуктів від субстратів. Прикладом флуоресцентного фосфатидилхолінового субстрату є

СеМвО-РОІ1-ацил-2-|6-(нітро-2,1,3-бензоксадіазол-4-іл)-аміно|)капроїлфосфатидилхолін).

Тіовмісними субстратами є 1,2-біс(гексаноїл-тіо)-1,2-дидезокси-зп-гліцеро-3-фосфорилхолін |С.9У. Кеупоїдвз, «

М.М. УМазпригп, К.А. ЮОеєетв, 5 Е.А. Юеппів, 1991, Меїйоаз іп Епгутоіоду 197: 3-23; 1. Ми 5 Е.А. Оеппів, 1991, нт») с Меїйподз іп Епгутоіоду 197: 65-75; І.А. М/ЩШепацег, К. ЗпПігаі, К.Ї. дасКвоп 5 9.0. доппзоп, 1984, Віоспет.

Віорпуз. Кез. Соттип. 118:894-9011. ;» Е) Гідроліз складних ефірів фосфатидилхоліну

Цей винахід належить до способу ферментативного гідролізу складних ефірів фосфатидилхоліну, наприклад, для промислової або харчової обробки, або для одержання миючих засобів для прання білизни. Поліпептиди -І цього винаходу можуть бути використані для гідролізу складних ефірів фосфатидилхоліну в розчині або ці ферменти можуть бути зв'язані з твердим носієм, який може бути потім підданий контакту з субстратом. Цей о метод може бути використаний для продукування лізофосфоліпідів та вільних жирних кислот. 2) Об) Композиції

Цей винахід належить до композицій в біологічно сумісному розчині, що включає поліпептиди, нуклеїнові - кислоти, вектори та антитіла цього винаходу. Біологічно сумісний розчин являє собою розчин, в якому

Ге) поліпептид, нуклеїнова кислота, вектор або антитіло цього винаходу підтримуються в активній формі, наприклад, у формі, яка є сприятливою для здійснення біологічної активності. Так, наприклад, поліпептид цього винаходу повинен мати фосфоліпазну активність, нуклеїнова кислота повинна бути здатною до реплікації та до трансляції ов транскрипту або гібридизуватися з комплементарною нуклеїновою кислотою; вектор повинен бути здатен трансфікувати клітину-мішень; а антитіло повинне зв'язуватися з поліпептидом цього винаходу. В основному,

Ф) таким біологічно сумісним розчином є водний буфер, наприклад, Трис, фосфат або буфер НЕРЕ5, що містить ка іони солі. Звичайно концентрація іонів солі аналогічна фізіологічним рівням. В конкретному варіанті здійснення винаходу, біологічно сумісний розчин являє собою фармацевтично прийнятну композицію. Біологічно бо сумісні розчини можуть включати стабілізуючі агенти та консерванти.

Такі композиції можуть бути виготовлені для місцевого, перорального, парентерального, інтраназального, підшкірного та внутрішньоочного введення. Під парентеральним введенням мається на увазі внутрішньовенна ін'єкція, внутрішньом'язова ін'єкція, внутрішньоартеріальна ін'єкція або інфузія. Ця композиція може бути введена парентерально в вигляді готових лікарських форм, що містять стандартні добре відомі нетоксичні 65 фізіологічно прийнятні носії, ад'юванти та наповнювачі, якщо це необхідно.

Переважними стерильними препаратами для ін'єкцій можуть бути розчин або суспензія в нетоксичному парентерально прийнятному розчиннику або розріджувачі. Прикладами фармацевтично прийнятних носіїв є фізіологічний розчин, забуферений фізіологічний розчин, ізотонічний фізіологічний розчин (наприклад, однозамінений фосфат натрію, двозамінений фосфат натрію, хлорид натрію, калію, кальцію або магнію, або суміші цих солей), розчин Рінгера, декстроза, вода, стерильна вода, гліцерин, етанол та їх комбінації.

Звичайно, як розчинники або суспендуючі середовища використовуються 1,3-бутанол та стерильні жирні масла.

З цією метою може бути використане будь-яке м'яке жирне масло, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди.

В препаратах для ін'єкцій можуть бути також використані жирні кислоти, такі як олеїнова кислота.

Середовищем для композицій може бути також гідрогель, який одержують з будь-якого біологічно сумісного 70 або нетоксичного (гомо- або гетеро-) полімеру, такого як, гідрофільний полімер поліакрилової кислоти, який може діяти як губка, що абсорбує лікарський засіб. Такі полімери були описані, наприклад, в заявці

М/093/08845, зміст якої вводиться в цей опис через посилання. Деякі з них, зокрема, такі як, полімери, які одержують з етилену та/або окису пропілену, є комерційно доступними. Гідрогель може бути осаджений безпосередньо на поверхню тканини, що обробляється, наприклад, під час хірургічного втручання.

В іншому переважному варіанті свого здійснення, цей винахід належить до фармацевтичних композицій, що включають дефектний по реплікації рекомбінантний вірус та полоксамер. Конкретніше цей винахід належить до композиції, яка містить дефектний по реплікації рекомбінантний вірус, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує ГІ б-поліпептид, та полоксамер. Переважним полоксамером є Полоксамер 407, який є в продажу (ВАБЗЕ,

Рагвіррапу, МУ), а найкращим є нетоксичний біологічно сумісний багатоатомний спирт. Полоксамер, просочений го рекомбінантним вірусом, може бути осаджений безпосередньо на поверхню тканини, що обробляється, наприклад, під час хірургічного втручання. Полоксамер має, в основному, ті ж переваги, що й гідрогель, але при цьому він має нижчу в'язкість.

Н) Способи лікування

Цей винахід належить до способів лікування, які передбачають введення людині або іншій тварині сч ов ефективної кількості композиції цього винаходу.

Ефективні кількості композиції можуть варіюватися в залежності від віку, типу та важкості стану пацієнта, і) що піддається лікуванню, а також від маси тіла, необхідної тривалості лікування, способу введення та інших параметрів. Ефективної кількості визначаються лікуючим лікарем та іншим кваліфікованим медичним персоналом. б зо Поліпептиди цього винаходу вводять, в основному, в дозах, що складають від біля 0,01мг/кг до біля 10Омг/кг, переважно, від біля 0,1мг/кг до біля 5Омг/кг, а найкраще, від біля 1мг/кг до біля 1Омг/кг маси тіла - на день. со

Рекомбінантні віруси цього винаходу звичайно продукують та вводять в дозах від близько 107 до близько 10146 у,0. У випадку ААВ та аденовірусів, краще використовувати дози від близько 105 до близько 10116.у.0. юю

Термін "б.уо" (бляшкоутворююча одиниця) відповідає інфекційній здатності суспензії вібріонів, яка - визначається інфекцією відповідної клітинної культури та вимірюється кількістю утворених бляшок. Способи визначення титру б.у.о. вірусного розчину добре описані в літературі.

Цей винахід належить до способів лікування атеросклерозу, де указаний атеросклероз є результатом « надлишкової, аномальної або неадекватної експресії І | (з-поліпептидної активності.

Крім того, цей винахід належить до способів лікування людини або іншої тварини, що має небажаний ліпідний - с профіль, де указаний небажаний ліпідний профіль є результатом високої або неадекватної експресії и І ГО-поліпептидної активності. є» Цей винахід також належить до способів лікування цукрового діабету, гіперліпідемії, внутрішньопечінкового холестазу або інших метаболічних порушень, де указані цукровий діабет, гіперліпідемія, внутрішньопечінковий холестаз або інші метаболічні порушення є результатом високої або неадекватної експресії ГІ -поліпептидної -і активності. сл 1) Корекція небажаних ліпідних профілів, асоційованих з підвищеною експресією І | б-поліпептиду.

Способи зниження експресії ГІ З-поліпептиду для корекції указаних станів, де ці стани або порушення (95) асоційовані з небажаним ліпідним профілем, обумовлені ІІ б-поліпептидною активністю, передбачають, але не -л 20 обмежуються, введення композиції, що містить антизмістовну нуклеїнову кислоту; введення композиції, що містить внутрішньоклітинний зв'язуючий білок, такий як, антитіло; введення композиції, що містить іЧе) ГГОМ-поліпептид або інші фрагменти ГЇ, та введення композиції, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує

Г ГОоМ-поліпептид або інший фрагмент / І.

В одному з варіантів здійснення винаходу, композицію, що містить антизмістовну нуклеїнову кислоту, використовують для пригнічення або блокування експресії 10. В одному з варіантів здійснення винаходу, о указана нуклеїнова кислота кодує антизмістовні РНК-молекули. В такому варіанті цього винаходу, нуклеїнову кислоту правильно з'єднують з сигнальними послідовностями, які забезпечують експресію нуклеотидної їмо) послідовності, та вбудовують в клітину, використовуючи, переважно, рекомбінантні векторні конструкції, що здатні експресувати антизмістовну нуклеїнову кислоту після введення цього вектора в клітину. Прикладами бо придатних векторів є плазміди, аденовіруси, аденоасоційовані віруси, ретровіруси та віруси герпесу.

Переважним вектором є аденовірус. Найкращим вектором є дефектний по реплікації аденовірус, що має делецію на ділянках вірусу Е1 та/або ЕЗ.

В іншому переважному варіанті цього винаходу, експресія | (з інгібується або блокується за допомогою експресії послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує внутрішньоклітинний зв'язуючий білок, здатний вибірково 65 взаємодіяти з ГІ 5. В заяках УУО94/29446 та МУ/О94/02610, зміст яких вводиться в цей опис через посилання, описана трансфекція клітин генами, що кодують внутрішньоклітинний зв'язуючий білок. Внутрішньоклітинним зв'язуючим білком є будь-який білок, що здатен вибірково взаємодіяти або зв'язуватися з | | (з в клітині, в якій він експресується, та нейтралізувати функцію зв'язаного ГІЇ. Переважним внутрішньоклітинним зв'язуючим білком є антитіло або фрагмент антитіла. Кращим внутрішньоклітинним зв'язуючим білком є одноланцюгове антитіло.

В УМУО94/02610 описано одержання антитіл та ідентифікація нуклеїнової кислоти, що кодує конкретне антитіло. З використанням ГІ С або його фрагмента, специфічне моноклональне антитіло може бути одержане способами, що відомі фахівцям. Для використання в способі цього винаходу може бути потім одержаний вектор, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує внутрішньоклітинний зв'язуючий білок або його фрагмент, та здатен /о експресувати ся в клітині-хазяїні.

Альтернативно, ГІ С-активність може бути блокована шляхом введення нейтралізуючого антитіла в кровотік.

Це нейтралізуюче антитіло може бути введене безпосередньо в вигляді білка або воно може бути експресоване з вектора (що містить секреторний сигнал).

В іншому варіанті, цього винаходу, ГІ Хі -активність інгібують шляхом введення композиції, що містить 7/5 поліпептид ГОМ або інший фрагмент ІІ 0. Ця композиція може бути введена стандартним способом, таким як, пероральрне, місцеве, внутрішньовенне, внутрішньоочеревенне, внутрішньом'язове, підшкірне, інтраназальне або черезшкірне введення. Ця композиція може бути введена безпосередньо або вона може бути інкапсульована (наприклад, в ліпідній системі, в амінокислотних мікросферах або в глобулярних дендримерах).

В деяких випадках, цей поліпептид може бути приєднаний до іншого полімеру, такого як, альбумін сироватки або полівінілпіролідон.

В іншому варіанті цього винаходу, ГІ Хі -активність інгібують шляхом використання низькомолекулярних сполук, які пригнічують його ферментативні властивості або запобігають його розпізнавання клітинними сайтами зв'язування.

В іншому варіанті цього винаходу, ГІ ХІІ -активність інгібують шляхом використання генної терапії, тобто сч об Шляхом введення сполуки, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує та направляє експресію поліпептиду ГОМ або іншого фрагмента 0. В конкретному варіанті здійснення винаходу, ген ГО цього винаходу також має і) спорідненість до гепарину. ІІ (з-поліпептид, який зв'язується з внутрішньоклітинним гепарином в порожнині кровоносних судин, дозволяє І | (з зв'язуватися та прискорювати поглинання ЛНГ, діючи як місточковий зв'язок між ЛНГ та внутрішньоклітинним гепарином. Передбачається, що на ділянці локалізації атеросклеротичних Ге! зо уражень підвищений рівень ліпазної активності прискорює атерогенний процес |Лімегетії, О.В. (1995) Сііп.

Спет. 41, 153-158; 7атроп, А., Тоггевз, А., Ві)моеї, 5., Садпе, С, Мооіапі, 5., І оріеп, Р.)., Наудеп М.К., 5 -

ВгипгеїЇ, У.О. (1993) І апсеї 341, 1119-1121). Це може бути обумовлене підвищеним рівнем зв'язування та с поглинання ліпопротеїнів тканиною судин, що опосередковане ліпазами (Еізепрего, 5., Зепауек, Е., ОїЇїмесгопа,

Т., МіодаузКу, І. (1992) 9. Сііп. Іпмеві, 90, 2013-2021; Тарав, І., Ії, І., Вгосіа К.МУ., Хи, 5М/., Змепвоп, Щео,

Т.Г, М/Шіатв, К.). (1993) 9. Віої. Спет., 268, 20419-20432; Могаезідаага, В.О., К Міеівеп, А.О. (1994) Сигт. Оріп. ї-

МПріа. 5, 252-257; МУШіатве, К.)., « Таравз, І. (1995) Ап. Тпготр. апа Мазе. ВіоІ. 15, 551-561). Окрім того, високий локальний рівень ліпазної активності може призводити до цитотоксичних рівнів жирних кислот та лізофосфатидилхоліну, що продукується в попередниках атеросклеротичних уражень. Ця конкретна активність

Гб може сприяти розвитку або прогресуванню атеросклерозу, особливо на фоні надлишкових рівнів ліпідів, « обумовлених харчуванням або генетичними факторами. Таким чином, цей винахід дозволяє |інгібувати в с акумуляцію ліпопротеїнів шляхом інгібування експресії ГІЇ З-поліпептиду або зв'язування з ліпопротеїном (наприклад, ЛНГ). ;» 2) Корекція небажаних ліпідних профілів, асоційованих з недостатньою активністю І | б-поліпептиду

Способи підвищення експресії ЇЇ для корекції тих станів, в яких активність ІІ («з-поліпептиду сприяє розвитку хвороб або порушень, асоційованих з небажаним ліпідним профілем, передбачають, але не -І обмежуються, введення композиції, що містить поліпептид ГЇХІ, та введення композиції, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує поліпептид / І ОХ. 1 В одному з варіантів здійснення цього винаходу, ГІ ОХ -активність підвищують шляхом введення композиції, 2) що містить поліпептид ГІ ОХ. Ця композиція може бути введена стандартним способом, таким як, пероральрне,

Місцеве, внутрішньовенне, внутрішньоочеревенне, внутрішньом'язове, підшкірне, інтраназальне або черезшкірне - введення. Ця композиція може бути введена безпосередньо або вона може бути інкапсульована (наприклад, в

Ге) ліпідній системі, в амінокислотних мікросферах або в глобулярних дендримерах). В деяких випадках, цей поліпептид може бути приєднаний до іншого полімеру, такого як, альбумін сироватки або полівінілпіролідон.

В іншому варіанті цього винаходу, І І Хі -активність підвищують шляхом використання низькомолекулярних в сполук, які можуть підсилювати експресію ГІ ОХ. на рівні транскрипції, трансляції або після трансляції.

В іншому варіанті цього винаходу, рівень ЇЇ ОХІ підвищують шляхом введення композиції, що містить

Ф) нуклеїнову кислоту, яка кодує та направляє експресію І | Хі -поліпептиду. ка Внутрішньопечінковий холестаз може бути охарактеризований як збільшення рівнів холестерину та фосфоліпіду в сироватці. Недавно повідомлялось, що модель внутрішньопечінкового холестазу у пацюків, бо індукованого лікарським засобом фалоїдином, продемонструвала значне збільшення рівнів холестерину та фосфоліпіду в сироватці (Ізпігакі, К., Кіпрага, 5., Міуагамжа, М., Такешспі, У., Нігарауазні, М., Казаї, Н., « Агакі,

Т. (1997) ТохісоЇ. ІеЧегз 90, 29-34). Продукти цього винаходу можуть бути використані для лікування внутрішньопечінкового холестазу у пацієнтів з підвищеними рівнями холестерину та/(або фосфоліпіду в сироватці. Крім того, ця модель з використанням пацюків також показала значне зниження швидкості виділення 65 холестерину з жовчю. І О-поліпептид та продукти нуклеїнової кислоти цього винаходу можуть бути використані для лікування пацієнтів з порушенням системи жовчовиділення.

Внутрішньопечінковий холестаз характеризується як порушення виділення жовчі з печінки. Недавно проведене картування показало, що локуси для прогресуючого спадкового внутрішньопечінкового холестазу (ПСВХ або хвороба Байлера) та доброякісний рецидивуючий внутрішньопечінковий холестаз (ДРВХ)

Знаходяться на 18421-д22 ІСагйоп, М.Е.Н., Кпізе|у, А.5., 5 Егеітег, М.В. (1995) Нит. Мої. Сепеї. 4, 1049-1053 5

Ношмжеп, К.Н., Вапйагіоо, 5., ВіапКепеПпір, К., КаеутаекКегв, Р., дУиуп, 9., запакий, СА., б Егеітег, М.В. (1994)

Маїцйге Сепеї. 8, 380-386, відповідно). Оскільки ген ЇЇ був картований на цій хромосомі на ділянці 18421, то ген Ї/0з або продукти цього винаходу можуть бути використані для лікування пацієнтів, які страждають внутрішньопечінковим холестазом, що викликаний мутацією або дефектною експресією гена (генів), 70 відповідального за захворювання ПСВХ/ДРВХ.

В іншому варіанті здійснення цього винаходу, ген ГІ 5 або поліпептидні продукти цього винаходу можуть бути використані для лікування пацієнтів, які страждають внутрішньопечінковим холестазом, що не викликається дефектом гена, відповідального за захворювання ПСВХ/ДРВХ, на ділянці 18421-422. Недавно проведені дослідження дозволили припустити, що інший локус, розташований за межами ділянки 18421-422, може також /5 продукувати пПоВХ-фенотип |ЗігаціпіеКв, 5.5., КадамаїІа, А.Р., Таппег, М.5., Сагаіпег, К.М., « Тпотрзап, К.). (1996) У. Мей. Сепеї. 33, 833-836). Однак, введення ГІ С-поліпептиду або безпосередньо, або за допомогою генної терапії, може полегшити стан, що викликаний цією формою захворювання.

В генній терапії одну або декілька нуклеїнових кислот, що кодують поліпептид, а також регуляторні ділянки, які контролюють її експресію, переносять в клітини-мішені людини або іншої тварини. Це перенесення здійснюється або ех мімо-способом, в якому нуклеїнову кислоту переносять в клітини в лабораторії, а потім модифіковані клітини вводять людині або іншій тварині, або іп мімо-способом, в якому нуклеїнову кислоту вводять безпосередньо в клітини людини або іншої тварини. Перенесення нуклеїнових кислот може бути здійснене з використанням або вірусних, або невірусних векторів, описаних вище.

Невірусні вектори можуть бути перенесені в клітини будь-якими методами, що відомі фахівцям, включаючи сч ов Копреципітацію фосфатом кальцію, ліпофекцію (з використанням синтетичних аніонних та катіонних ліпосом), опосередковану рецептором доставку гена, ін'єкцію "голою" ДНК, електропорацію та доставку методами і) біобалістики або прискорення частинок.

Приклади

Цей винахід проілюстровано наступними прикладами. Ці приклади приводяться лише з ілюстративною Ге! зр Метою та не обмежують об'єм претензій.

Приклад 1 -

Ідентифікація диференціально експресованої к ДНК с

А) Одержання РНК

Моноцитарні клітини ТНР-1 людини |Зтійй Р.К., Кгойп, К.І., Негптапзоп, О.Т., Маїйа, А.К., Сапіпег, Б.М., Щео,

Ргомепгапо, М.О., Рціітою, Е.К., СоеКе, М.М., ОіІвоп, В.)., апа Кіепк, О.С. (1985) Апаї. Віоспет. 150, 76-85) ї- культивували в середовищі КРМІ-1640 (СІВСО), що містить 25мММ НЕРЕЗ, 1095 фетальну бичачу сироватку, 10бодиниць/мл натрій-вмісного пеніціліну б та 1ТОбодиниць/мл сульфату стрептоміцину. Клітини висівали в 1Бсм-чашки для культивування тканини при концентрації 1,5 х10'клітин/учашка та обробляли 4Онг/мл « 12-міристат-13-ацетатом форболу (Зідта) на протязі 48 годин для індукування диференціювання клітин. Людські ліпопротеїни низької, густини (ЛНГ), які поставляються фірмою Саїріоспет, піддавали вичерпному діалізу проти - с РВ5З при 420. Потім ЛНГ розводили до 500мкг/мл та діалізували проти 5мкМ СизоО, в РВЗ5 при 372С на протязі ц 16 годин. Для припинення окислення ЛНГ піддавали вичерпному діалізу проти 150мМ Масі, 0,3ММ ЕОТА, а потім ,» фільтр стерилізували. Концентрацію білка визначали методом ВСА (|ЗепиНй, ., Раїгсіоцдн, с.Р., апа Назспетеуег,

К.Н. (1978) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 75, 3173-3177) (Ріегсе). Ступінь окислення був визначений методом ТВАК5З |Спотсгупзекі, Р. (1993) Віоїесппідцез 15, 532-537| та складав 25-3ЗОнмоль еквівалентів МОА/мг білка. - | Диференційовані клітини ТНР-1 обробляли на протязі 24 годин або БОмкг/мл окисленого ЛНГ, або сл МасіІ-ЕОТА-буфером в середовищі КРМІ, що містить 10956-ну фетальну бичачу сироватку з дефіцитом ліпопротеїну (Зідта). Для збору РНК, чашки промивали 1Омл РВ5З, а потім в кожну чашку додавали 14мл ТКІ2ОЇ. (95) ІШапо, Р. « Рагаєе, А.В. (1992) Зсіепсе 257, 967-971) (СІВСО). Розчин декілька разів піпетували для одержання шу 20 суміші, а потім однакові зразки об'єднували в центрифугальних пробірках, додавали Змл хлороформу на чашку та змішували. Пробірки центрифугували на протязі 15 хвилин при 12000 х д. Після центрифугування, верхній іЧе) шар переносили в нову пробірку, а потім додавали 7,5мл ізопропанолу на чашку та змішували. Пробірки центрифугували при 12000 х д на протязі 20 хвилин. Осад після центрифугування промивали охолодженим на льоду 70906-ним етанолом та сушили при кімнатній температурі. Осади суспендували в 500мкл ТЕ (Трис-ЕОТА) та обробляли 200 одиницями ДНКази 1, яка не містить РНКази, та 200 одиницями РНКази, плацентарного о інгібітора РНКази, (Рготеада) на протязі 30 хвилин при 3720. РНК очищали за допомогою послідовної екстракції фенолом, фенолом/хлороформом/ізоаміловим спиртом (25:24:1) та хлороформом/ізоаміловим спиртом (24:71), а о потім осаджували етанолом.

В) Синтез кКДдНК 60 Синтез КДНК та РСК-ампліфікацію здійснювали у відповідності до інструкцій, що додаються до набору для здійснення методу диференціального відображення |Оійегепіїіаї Оізріау Кії версія 1,0, Оівзріау бувіетзв

Віосїесппоіоду, Іпс.)ї. Ця система заснована на методі вперше описаному Гіапод і Рагдее |Меайд, СА, Реу, М.К.,

Нептзіаді, С, Магсії, К.А., 5 тій, І.М. (1991) Віо/Гесппоїсду 9657-663)Ї. Пари праймерів, які давали кКДНК-фрагмент, що містить першу інформацію про ген ліпазо-подібного поліпептиду, являли собою прямий 65 праймер 7 та зворотний праймер 15. кКДНК для ампліфікації синтезували, як описано нижче, з використання РНК, яка походить від клітин ТНР-1, оброблених РМА та експонованих або буфером, або окисленим ЛНГ: Змкл 25мМкМ прямого праймера 7 та 7,5мкл води, обробленої діетилпірокарбонатом (ОЕРС), додавали до ЗООнг (3З,Омкл) РНК від будь-якого зразка РНК ТНР-1. Цю суміш нагрівали до 702 на протязі 10 хвилин, а потім охолоджували на льоду. В цю пробірку додавали Змкл 5 х РСК-буфера (250мМ Трис-НСЇ, рН 8,3, 375мМ КСІ) (СІВСО), Змкл 25мММ

МосСіІ», Змкл 0,1М ДТТ, 1,2мкл 500мкМ аМтТР, 0,7мкл РНКазину та 5,бмкл ОЕРС-обробленої води. Пробірки інкубували на протязі 2 хвилин при кімнатній температурі, після чого додавали 1,5мкл (300 одиниць)

Зирегзсагірі ІІ РНКази Н-зворотної транскриптази (СІВСО). Пробірки інкубували послідовно на протязі 2 хвилин при кімнатній температурі, 60 хвилин при 372С та 5 хвилин при 9592С, а потім охолоджували на льоду.

РСК-ампліфікацію здійснювали з використанням набору Мазіег Міх, що містить 117мкл 10 х РСК-буфера (500ММ 70 КСІ, 100мММ Трис-НСІ рН 8,3, 15мММ МосСі!» та 0,0195 (мас/об.) желатину), 70,2мкл 25ММ Моасі», 5,9мкл альфа-ЗЗР-аАТР (1ОмКі/мл. ОиРопі МЕМ), 4,7мкл 500мМкМ суміші аМТР, 11мкл ДНК-полімерази Атрії-Тазд (Бодиниць/мкл, Регкіп-ЕІтег), та 493,3мкл ОЕРС-обробленої води. Для кожної реакції 12мкл набору Мавзіег Міх додавали до 2мкл прямого праймера й7, їмкл кКДНК та бмкл зворотнього праймера 2415. Реакційні суміші нагрівали до 942С на протязі 1 хвилини, а потім піддавали 40 термоциклам зі стадією денатурації при 949С на 75 протязі 15 секунд; стадією відпалу при 402С на протязі 1 хвилини та зі стадією подовження при 722С на протязі

ЗО секунд. Після проведення 40 циклів реакційні суміші інкубували при 72 С на протязі 5 хвилин та зберігали при 1020. РСК-реакції здійснювали в термокомірці зепеАтр бузіет 9600 Регкіп-ЕІтег.

Чотири мікролітри реакційної суміші для ампліфікації змішували з рівним об'ємом буфера для завантажування (0,296 бромфенолового синього, 0,295 ксилолціанолу, Л10ММ ЕОТА рН 8,0 та 20965 гліцерину).

Чотири мікролітри цієї суміші піддавали електрофорезу в бо-ному акриламідному секвенуючому гелі, що неденатурує, на протязі З годин при 1200 Вольтах (постійна напруга). Цей гель сушили при 802 на протязі 1,5 годин та експонували з плівкою Кодак ХАК. Був ідентифікований ампліфікований продукт, знайдений лише в реакційній суміші, що містить кКДНК від клітин ТНР-1, оброблених окисленим ЛНГ, а потім цей продукт вирізували з гелю. В мікроцентрифугову пробірку, що містить вирізаний гелевий фрагмент, додавали 10Омкл сч

ОЕРС-обробленої води, а потім інкубували на протязі ЗО хвилин при кімнатній температурі, а потім ще на Го) протязі 15 хвилин при 9590.

Для проведення повторної ампліфікації РСК-продукту, 26,5 мікролітрів елюйованої ДНК використовували в реакції ампліфікації, яка також включала 5мкл 10 х РСОК-буфера, Змкл 25мММ МаосСіІ», 5мкл 500мкМ амтР, мкл Фу 2мМКкМ прямого праймера 7, 7,5мкл зворотного праймера 15 та О,бмкл полімерази Атрійад. Параметри

РСкК-циклів та обладнання були описані вище. Після ампліфікації 2омкл повторно ампліфікованої реакційної «- суміші аналізували на агарозному гелі та 4мкл використали для субклонування РСК-продуктів в векторі рСКІЇ з с використанням системи клонування ТА (Егоптап, М.А., Юиви, М.К. 5 Магпіп, С.К. (1988) Ргос. Май. Асад. Зсі.

ЗА 85, 8998-90021 (Іпийгодеп). Після лігування на протязі ночі при 142С, ліговані продукти використовували для ів) трансформації Е. соїї. Одержані трансформанти збирали та Змл нічних культур використовували для їм приготування плазмідних мініпрепаратів. Розміри вставок визначали з використанням ЕсокКіІ-гідролізу плазмід та клони, які містять вставки, приблизно, розміру вихідного РСК-продукту, секвенували з використанням реагентів-термінаторів та флуоресцентного барвника (Ргізт, Арріїей Віозувіетв), та з використанням

ДНК-секвенатора Арріїеїй Віозузіетв 373. Послідовність РСК-продукту показана на Фіг.2. Послідовність « 20 ампліфікованих праймерів підкреслена. - с С) Реакція УКАСЕ

Подовження кДНК, ідентифікованої за допомогою КТ-РСК, здійснювали з використанням системи 5'КАСЕ :з» (Сойп, Е.М., Еїої, 9У.Е., Сміпа, 5., І апіег/ Ї, «5 Оаміз, М.М. (1989) Зсіепсе 243, 217-219; Біттв, Ю., цап, М., «

Зйагатап, К., (1991) Росиз 1399 (5ІВСО)Ї Один мікрограм РНК ТНР-1 (оброблених окисленим ЛНГ), Використаних спершу в реакціях диференціального відображення, використали в реакції 5'КАСЕ: -1 1мкл (мкг) РНК об'єднували з Змкл (Зпмоль) праймера 2а та 11мкл ОЕРС-обробленої води, та нагрівали до 7090 на протязі 10 хвилин, а потім витримували на протязі 1 хвилини на льоду. Потім додавали 2,5мкл 10 х о буфера для реакції (200мМ Трис-НСЇІ рН 8,4, 500мММ КСІ), Змкл 25ММ МасІі», мкл 10мММ суміші аМТР та 2,5мкл 2) 0,1мМ ДТТ. Цю суміш інкубували на протязі 2 хвилин при 422С, а потім додавали мкл обробленої транскриптази пз Зирегзсегірі ІІ. Реакційну суміш інкубували ще 30 хвилин при 422С, 15 хвилин при 702С та 1 хвилину на льоду.

Потім додавали один мікролітр РНКази Н (2 одиниці) та суміш інкубували при 559С на протязі 10 хвилин. К ДНК іЧе) очищали з використанням колонок СіаззМах |Затбгоок, У. Ргйвзси, Е.Б. б Мапіайвз Т. (1989) МоіІесшаг Сіопіпд:

А Іарогаюгу Мапиа), зесопа еаййіоп, Со ргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, Ріаіїпміему, ММ), включених до набору. Цю кДНК елюювали з колонки в БОмкл анНьоО, ліофілізували та ресуспендували в 21мкл аньо.

Нарощування ланцюга кКДНК здійснювали в такій реакції: 7,5мкл ан 2оО, 2,5мкл буфера для реакції (200мММ о Трис-НСІ рН 8,4, 500мММ КСІ), 1,5мкл 25мММ Масі», 2,5мкл 2мМ астР та 1Омкл кКДНК інкубували при 9492 на протязі З хвилин, а потім на льоду на протязі 1 хвилини. Потім додавали мкл (10 одиниць) кінцевої їмо) дезоксинуклеотидилтрансферази та суміш інкубували на протязі 10 хвилин при 37 С. Фермент піддавали тепловій інактивації шляхом інкубування при 70 С на протязі 10 хвилин, а потім суміш ставили на лід. 60 РСВ-ампліфікацію кКДНК здійснювали на таких стадіях: 5мкл КДНК з нарощеним кінцем була включена в реакційну суміш, яка також містила 5мкл 10 х РСК-буфера (500мМ КСІ, 100мММ Трис-НСЇ рН 8,3, 15ММ МосСіІ» та 0,0195 (мас/об.) желатину), їмкл 1ОмМ суміші аМТР, 2мкл (1Опмоль) якірного праймера, Імкл (20пмоль) праймера За та З5мкл ан2О. Реакційну суміш нагрівали до 952С на протязі 1 хвилини, а потім додавали 0,9мкл (4,5 одиниці) полімерази Атрійад. Реакцію проводили 40 циклів при таких умовах: 9490 - 5 секунд, 5090 - 20 бо секунд та 722 - 30 секунд. Один мікролітр цієї реакційної суміші використовували для "гніздової" повторної ампліфікації з метою підвищення рівнів специфічного продукту для наступного виділення. Для повторної ампліфікації використовували: мкл суміші для первинної ампліфікації, 5мкл 10 х РСК-буфера, мкл 10мМ суміші амМТР, 2мкл (20пмоль) універсального праймера для ампліфікації, 2мкл (2О0пмоль) праймера 4а та 38 мкл аньо.

Реакційну суміш нагрівали до 959С на протязі 1 хвилини, а потім додавали 0,7 мкл (3,5 одиниці) полімерази

Атрійад. Реакцію проводили 40 циклів при таких умовах: 942С - 5 секунд, 5090 - 20 секунд та 7290 - 30 секунд.

Ампліфіковані продукти аналізували шляхом електрофорезу в 0,895 агарозному гелі. Був знайдений переважаючий продукт, що містить близько 1,2т.п.о. Два мікролітри продуктів реакції клонували в вектор рекІЇ з набору для клонування ТА (Іпуйгодеп) та інкубували на протязі ночі при 14 20С. Ці продукти лігування 70 використовували для трансформації Е. соїї. Розміри вставок одержаних трансформантів визначали шляхом

ЕсокіІ-гідролізу. Клони, які містять вставки приблизно розміру вихідного РСК-продукту, секвенузали з використанням реагентів-термінаторів - флуоресцентного барвника (Ргізт, Аррієй Віозузіетв), та з використанням ДНК-секвентатора Арріїеі Віозувіетвз 373. Послідовність КАСЕ-продукту, включаючи

ЕсокКіІ-сайти від вектора ТА, показана на Фіг.3. Послідовності амплімерів (універсальний ампліфікований 75 праймер та праймер, комплементарний 5'КАСЕ-праймеру 4а) підкреслені.

Приклад 2

Кпонування та локалізація гена ГІ ОХ. на хромосомі

А) Скринінг бібліотеки КДНК

Плацентарну бібліотеку кКДНК людини (оліго 4Т та рандомізовано праймовану, кат. Мо5014р, серія 552033) одержували від Сіопіесп (Раїо Ай, СА). Радіоактивно мічений зонд створювали шляхом вирізання вставки плазміди, що містить описаний вище РСК-продукт 5'КАСЕ-реакції. Зонд радіоактивно мітили з використанням техніки рандомізованого праймування: ДНК-фрагмент (50-100Онг) інкубували з 1мкг рандомізованих гексамерів (сірсо) при 9592 на протязі 10 хвилин, а потім на льоду на протязі 1 хвилини. Потім при кімнатній температурі були додані: Змкл 10 х буфера Кленова (100мМ Трис-НСЇ рн 7,5, 50ММ Масі», 57мММ дитіотрейтол; Мем Епдіапаї «М Віоіарв), Змкл 0,5мММ адтР, астрР, аттР), 10ОмкКі о-2растр (ЗО00ОКі/ммоль, Мем Епдіапа Мисіеаг) та мкл о фрагменту Кленова ДНК-полімерази І (5 одиниць, Сірсо). Реакційну суміш інкубували на протязі 2-3 годин при кімнатній температурі, а потім реакцію припиняли шляхом підвищення об'єму до 100мкл з використанням ТЕ, рн 8,0, та шляхом додання ЕЮТА до кінцевої концентрації ММ. Не включені нуклеотиди вилучали шляхом підвищення об'єму реакційної суміші до 10Омкл, та її пропускання через центрифугову колонку 5-50 (Воейгіпдег ФО

Мапппєїт). Одержані зонди мали специфічну активність, яка перевищує 5х108імп/хв/мкг ДНК. «-

Бібліотеку зондували стандартними методами |(ММаїег, Р., Сіітоге, К., « Віоре!, б. (1984) Се 38, 5-8)

Для цього фільтри гібридизували на протязі 24 годин при 65 С в 4,8Х З5РЕ (20Х 55РЕ - 3,6М Масі, 0,02М Ше

МаньРО,Х, 0,02М ЕОТА, рН 7,7), 20мМ Трис-НСІ рН 7,6, 1 х розчину Денхардта (100Х - 295 фікол 400, 2956 полівінілпіролідон, 295 В5БА), 10906 сульфату декстрану, 0,195 ДСН, 10Омкг/мл ДНК сперми лосося та м 1Хх10бімп/хв/мл радіоактивно міченого зонда. Потім фільтри промивали три рази на протязі 15 хвилин при кімнатній температурі в 2 х З5С (1 х 55С - 150мМ Масі, 15мМ цитрат натрію, рН 7,0), 0,196 додецилсульфату натрію (ДСН), а потім промивали три рази на протязі 15 хвилин при 6593 кожен з 0,5 х 55С та 0,196 ДСН. Фаг, що гібридизувався з зондом, виділяли та ампліфікували. ДНК очищали з ампліфікованого фага з використанням « 0 реактиву Гатраазогь (Рготеда) у відповідності до інструкцій виробників. Вставки вирізували з фагової ДНК у с шляхом гідролізу ферментом Есокі. Ці вставки субклонували в ЕсоКіІ-сайт плазмідного вектора (Віпезсгірі ІІ ЗК,

Зігаїадепе). Шляхом описаного вище автоматичного секвенування була визначена послідовність відкритої рамки :з» зчитування, яка знаходиться всередині 2,бт.п.о.-ЕсоКІ-фрагмента кКДНК. Ця послідовність показана на Фіг.4.

Амінокослотна послідовність передбаченого білка, кодованого відкритою рамкою зчитування, показана на Фіг.5, та позначена ІСОХІ Було припущено, що перший метіонін кодується парами нуклеотидів 252-254. -І Передбачений білок має довжину в 500 амінокислот. Перші 18 амінокислот утворюють послідовність, характерну для секреторного сигнального пептиду ІНіддіпе, О.., 5 Зпагр, Р.М. (1988) Сепе 73, 237-244). Передбачений о пропептид має молекулярну масу 56800 Дальтон. Якщо припустити, що розщеплення сигнального пептиду оо проходить в положенні 18, то молекулярна маса немодифікованого зрілого білка складає 54724 Дальтон.

Повна схожість між цим білком та іншими відомими членами сімейства триацилгліцерол-ліпази - проілюстрована на Фіг.б та в Таблиці 1. В порівнянні первинних послідовностей, показаному на Фіг.б6, | 5 являє

Ге собою поліпептид (ЗЕО ІЮО Мо: 6), кодований кКДНК (ЗЕО ІЮО Мо: 5), яка описана в Прикладі 1, і далі позначається

ІГОМ. За своїми аміно-кінцевими 345 залишками, цей білок є ідентичним до білка ГІ ХІІ. 9 унікальних залишків ідуть слідом за стоп-кодоном та продукують поліпептид 39,ЗкДа та зрілий білок 37,З3кДа. Послідовності, які є боб Загальними для СОМ та І ОХІ, являють собою послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮО Мо: 9 та амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 10. (Ф; Цікаво відзначити, що положення, в якому білки ГІ (ЗМ та ГІ ОХ. розрізняються, являє собою ділянку, яка, як ка відомо зі структири іншої ліпази, знаходиться між аміно- та карбокси-доменами цих білків. Тому білок! Її ОМ, очевидно, складається з одного із двох доменів триацилгліцерол-ліпаз. Ця послідовність містить характерний бо Мотив "вхеХхОо" ліпази в положеннях 167-171, а також консервативні залишки каталітичної тріади в бег 169, Авзр 193 та Нів 274. Консервативність цистеїнових залишків (положення 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463 та 483), які приймають участь в дисульфідних зв'язках в інших ліпазах, дає підставу припустити, що білокі! ох. має структурну схожість з іншими ферментами. Є п'ять передбачуваних сайтів М-глікозилування в положеннях амінокислот 80, 136, 393, 469 та 491. Послідовностями білка, які використовуються для порівняння, є 65 ліпопротеїн-ліпаза людини (І РІ; Сепрапк, номер доступу ЯМ15856, ЗЕО ІЮО Мо: 13), ліпаза печінки людини (НІ,

СепрапкК, номер доступу 2ШОЗ540, 5ЕО ІЮО Мо: 14), панкреатична ліпаза людини (РІ, СепрапК, номер доступу

ЯМО93285, 5ЕО ІО Мо: 15), білок-1, споріднений з панкреатичною ліпазою людини (РІ КР-1; СепрапкК, номер доступу ЯМО93283), білок-2, споріднений з панкреатичною ліпазою людини (РІ КР-2; СепрапК, номер доступу

ЯМО3284), о Тавхоляу но ве (віярі рія», плекс вловвояв гав 226 о айс воозав ол 09. ж |з|юв - я го 220.

РО ля 228228 - 852 во

РіяРі 225 (22 мо 652 в

РіяР2 226 209220 622 ві. й й й й

Відсоток схожості оцінювали виходячи з порівняння пар основ первинних структур з використанням алгоритму Сіивіа! (Сатрв», І|., Кеїпа.М., Порега, М., Мідаго, 5., б Оїїмесгопа, Т.(1990) Ат. 9. РНувзіоїЇ. 258,

С673-С6811) програми Меааїїдп в наборі програм І азегдепе Віосотрийіпуд Зоїмаге Зийе (Опавіаг).

В) Локалізація на хромосомі

ДНК від клону РІ |Зіегпрего, М., Кие(ШПег, У. 5 ЮОекКієї, К.Тпе Мем Віоіодівї 2; 151-62, 1990), що містить геномну ДНК 110, мітили ТК (уридинтрифосфатом) дигоксигеніну шляхом "нік'-транслації. Мічений зонд об'єднували з фрагментованою ДНК людини та гібридизували з РНА, що стимульована лімфоцитами периферичної крові, які взяті від донора чоловіка, в розчині, що містить 5095 формаміду, 1095 сульфату декстрану та 2 х 5502. Специфічні сигнали гібридизації детектували шляхом інкубування гібридизованих клітин з сч флуоресцентно поміченими антитілами проти дигоксигеніну з наступним контрастним забарвлюванням ОАРІ.

Цей попередній експеремент призводив до специфічного мічення хромосоми групи Е, яка, виходячи з (о) рАРІ-забарвлювання, є, очевидно, хромосомою 18.

Потім проводили інший експеримент, в якому мічений біотином зонд, специфічний для центромери хромосоми 18, разом гібридизували ГІЇ б-зондом. Цей експеримент призводив до специфічного забарвлення Фо зо Чентромери хромосоми 18 червоним та довгого плеча хромосоми 18 зеленим. Виміри 11-ти специфічно мічених гібридизованих хромосом 18 показали, що ЇЇ має РБіег 0,67 (виміри за Франку 0,38), що відповідає смузі ж 18421. Деякі спадкові захворювання, включаючи внутрішньопечінковий холестаз, колбочко-паличкову дистрофію со (сітківки) та спадковий остеоліз, очевидно, обумовлені дефектами на цій ділянці хромосоми.

Приклад З Іо)

Аналіз РНК о | їч-

А) Експресія РНК І С в клітинах ТРН-1

Аналіз мРНК, з яких одержують кКДНК, здійснювали шляхом Нозерн-аналізу РНК ТНР-1. РНК від цих клітин одержували як описано вище. Цю мРНК виділяли з повної РНК з використанням системи роїу-йТ-магнітних сфер (Роїуангасі зувіет, Рготеда). Три мікрограми роїу(А)-вміснрї мРНК піддавали електрофорезу на 195 агарозному « 20 формальдегідному гелі. Цей гель промивали на протязі 30 хвилин в 48Н2»О. РНК переносили в умовах вакууму на ш-в найлонову мембрану з використанням лужного буфера для перенесення (ЗМ масі, 8мМ Маон, 2мМм саркозил). с Після перенесення, блот нейтралізували шляхом інкубування на протязі 5 хвилин в 200мМ фосфатному буфері, :з» рН 6,68. РНК перехресно зшивали з мембраною з використанням приладу для УФ-зшивання (5ігагадепе).

Зонд одержували шляхом вирізання вставки плазміди, що містить 5'ВДСЕ-продукт РСК-реакції, описаний

Вище. Цей зонд піддавали радіоактивному міченню з використанням техніки рандомізованого праймування, яка - описана в Прикладі 2.

Фільтри попередньо гібридизували в розчині для швидкої гібридизації ОцїЇкНу»ь (Зігаїадепе) на протязі 30 о хвилин при 652С. Радіоактивно мічений зонд (1-2 х 10бімп/хв/мл) та оброблену ультразвуком ДНК сперми лосося 2) (кінцева концентрація 10Омкг/мл) денатурували шляхом нагрівання на протязі 10 хвилин до 95 С та швидко 5р охолоджували льодом, після цього переносили на фільтр в розчин ОцікНуб. Гібридизацію проводили З години - при 6520. Негібридозований зонд вилучали шляхом двократного 15-хвилинного промивання фільтрів 2 х 55С, (Че) 0,195 додецилсульфатом натрію при кімнатній температурі з наступним двократним 15-хвилинним промивання фільтрів 0,1 х З55С, 0,196 ДСН при 622С. Після промивання фільтри швидко осушували, а потім експонували з плівкою Кодак ХАК-2 з підсилюючими екранами при -809С. Результати проілюстровані на Фіг.7, де показані великі МмРНК-молекули, що складають приблизно 4,5 тисяч пар основ. Були присутні також і менші молекули о довжиною 4,3 та 1,6 тисяч пар основ. Очікуваний розмір КДНК ГОМ складав 1,6бт.п.о. Послідовність ГІ ОХ, очевидно, кодується великими молекулами детектованої ме НК. їмо) В) Експресія РНК І. в різноманітних тканинах людини

Комерційно доступний готовий фільтр, що містить Змкг кожної з мРНК від різноманітних тканин людини 60о (серця, головного мозку, плаценти, легень, печінки, скелетного м'яза, нирок тапідшлункової залози), одержували від фірми Сіопейесі (Саїйаіод Я7760-1). Цей фільтр зондували та обробляли, як описано вище. Після зондування радіоактивно міченим фрагментом ГО та радіоавтогрфії, зонд очищали шляхом промивання в киплячому 0,1 х З5С, 0,195 ДСН в інкубаторі при 65923 на протязі 2х15 хвилин. Потім мембрани зондували з використанням ДНК-фрагмента в 1,4т.п.о., що кодує ліпопротеїн-ліпазу людини. Цей фрагмент одержували б5 шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (КТ-РСК) РНК від клітин ТРН-1 (оброблених РМА та окис. ЛНГ) з використанням 5' РІ - та 3 РІ - праймерів, показаних на Фіг.1, та умов КТ-РСК,

описаних вище. Після авторадіографії мембрани знову очищали та знову зондували радіоактивно міченим фрагментом кДНК бета-актину людини для нормалізації вмісту РНК. Результати цих аналізів проілюстровані на

Фіг.8. Найвищі рівні транскрипту ЇЇ (з виявлялися в РНК плаценти, а найнижчі рівні виявлялися в РНК, які

ПОХОДЯТЬ від тканин легень, печінки та нирок. У відповідності до попередніх досліджень інших авторів

Мегтоемеп, А.).М., Чапвзеп, Н. (1994) Віоспет. Віорпуз. Асіа 1211, 121-124), транскрипт ліпопротеїн-ліпази виявлявся в багатьох тканинах, при цьому найбільші рівні виявлялися в тканинах серця та скелетного м'яза.

Результати цих аналізів показали, що розподіл експресії | в тканинах дуже відрізняється від розподілу І РІ.

Характер експресії ЇЇ також відрізняється від характеру експресії ліпази печінки або панкреатичної ліпази, у як повідомлялось іншими дослідниками (МУапо, С.-5., й НагівисК, УА. (1993) Віоспет. Віорпуз. Асіа 1166, 1-19; Бетепкомісп, С.Р., Спеп 5.-МУ., Муітв, М., Їцо С.-С, (і, МУ.-Н., Спап, І. (1989) 9. ІІрій Кев. 30, 423-431;

Адатзвг, М.О., Кепіамаде, А.К., Рівїдв, С, 5 Мепіег, С. (1993) Майте Сепеї. 4, 256-265).

Для визначення характеру експресії в інших тканинах людини, інша комерційно доступна мембрана була зондована з використанням КДНК І ОХ. Цей дот-блот (РНК людини Мазвіег Віої, Сіопіесп Саї. 27770-1) містив 75. 100-500нг мРНК з 50 різноманітних тканин та був нормалізований на еквівалентну експресію генів "домашнього господарства" |Спап, Ї, 5 Могіп, К. (1971) Віоспет. Віорпуз. Асіа 231, 194-1971. 1,бт.п.о. ОгаІ-5ПІ-фрагмент

КДНК ОХ. мітили ЗРаСТР з використанням рандомізованої системи олігонуклеотидного праймування (Ргіте Ії

І, Бігаїадепе) у відповідності до інстукцій виробника. Після З0-хвилинної передгібридизації при 652, зонд додавали до гібридизованого розчину СцікКНув при 1,3х10бімп/хв/мл. Гібридизацію проводили на протязі 2 20 години при 652С. Негібридозований зонд вилучали шляхом двократного промивання фільтрів 2 х З5С на протязі хвилин, а потім 0,195 додецилсульфатом натрію при кімнатній температурі з наступним двократним промивання на протязі 15 хвилин в 0,1 х 5ЗС, 0,195 ДСН при 62 «С. Після промивання фільтри піддавали швидкому сушінню, а потім експонували з плівкою Кодак ХАК-2 з використанням підсилюючих екранів при -802С, в різні періоди часу. Одержані зоброження кількісно оцінювали за допомогою денситометрії. Результати с наведені в Таблиці 2. Відносні рівні експресії в тканинах, визначені за допомогою Нозеран-аналізу безлічі (3 тканин та за допомогою дот-блотів, одержаних з безлічі тканин, були аналогічні, при цьому найвищі рівні спостерігались в плаценті, а найнижчі рівні спостерігались в легенях, печінці та нирках. В фетальній печінці, нирках та легені також експресувалися майже ті ж самі рівні, що й у тканинах дорослих індивідуумів.

Несподівано було знайдено, що зі всіх представлених тканин, тканини щитовидної залози експресували найвищі б рівні, які складали 12290 від рівня, що експресується в тканинах плаценти. Хоча експресія ліпази в плаценті «ч- спостерігалась раніше |КоїпмжеїІ, У.Е., ЕІрпіск, М.С. (1982) 9У. Юем. РпузіоЇї. 4, 153-159; Мегтоемеп, А.).М.,

Сапіпа О., 5 Оапвеп Н. (1994) у. Іірій Кевз. 35, 966-975; Вигоп, В.К., МиейМег, Н. МУ. (1980) Віоспет. і.

Віорпуз. Асіа 618, 449-460), однак експресія якої-небудь ліпази в щитовидній залозі раніше не спостерігалась. ю

Ці результати дають підставу припустити, що експресія З може сприяти збереженню плаценти, де ГІ З може

Зо служити для вивільнення вільних жирних кислот з субстратів, таких як, фосфоліпіди, як джерел енергії. І | 5, що - експресований в щитовидній залозі, може служити попередником для синтезу біологічно активних молекул цією залозою. їх з З с з мозючоє 000004 ідбуоріеядро нзієча 00000009 сожахшка 00006 головний мозок плоду 6. з і.

І; м потилична частина (з товста ишка 8 щотовидна залоза 122 кстовиймозоє 0 тимуєлляду 69, - (шкаралупа на осечовийміхур нзоолинна залоза наз Залендиє 000007 левняпллоду////- 8 с Ці величини являють собою відсотки експресії; при цьому рівні в тканинах плаценти були довільно прийняті за 100905.

Ці величини являють собою середні значення з денситометричних вимірювань, одержаних з двох 22 авторадіографічних експонувань, н.з. - не знаходили. (ФІ С) Експресія РНК І С в культивованих ендотеліальних клітинах

Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (НОМЕС) та ендотеліальні клітини коронарної артерії людини о (НСАЕС) одержували від Сіопейсв. НОМЕС були розмножені в комерційно доступному середовищі для росту ендотеліальних клітин (ЕСМ, Сіопеїйісв), в яке було додано Змг/мл екстракту бичачого головного мозку (Масіад, 60 Т., Сегипдоїю, 9., ІвІеу, 5., КеПеу, Р.К., 5 Рогапа, К. (1979) Ргос. Май. Асад. сі, ОБА, 76, 5674-5678),

Сіопейісв, а НСАЕС були розмножені в середовищі ЕСМ, в яке було додано Змг/мл екстракту бичачого головного мозку та 396 фетальної бичачої сироватки (в кінцевій концентрації 595). Клітини культивували до досягнення конфлюєнтності, після чого це середовище замінювали на середовище ЕСМ, яке не містило екстракту бичачого головного мозку. Культури стимулювали шляхом додання 1ООнг/мл міристату форболу (Зідта). Після бо 24-годинного інкубування, РНК екстрагували з клітин методом з використанням тризолу, описаним вище.

Двадцять мікрограмів повної РНК піддавали електрофорезу та переносили на мембрану для аналізу. Мембрани зондували І О- та І РІ -зондами, як описано вище. Результати проілюстровані на Фіг.9. Двадцять мікрограмів повної РНК з клітин ТНР-1, стимульованих РМА, піддавали блот-аналізу для порівняння. РНК, яка гібридизується

З ГГ О-зондом, знаходили в нестимульованих та РМА-стимульованих клітинах НОМЕС. На противагу цьому, рівні

МРНК І 10, що детектуються, виявлялись лише в культурах НСАЕС після стимуляції РМА. У відповідності до попередніх досліджень інших авторів, якого-небудь рівня мРНК ліпопротеїн-ліпази, що детектується, не було знайдено в жодній з ендотеліальних РНК |Мегпоемеп, А.).М., дапзеп, Н. (1994) Віоспет. Віорпуз. Асіа 1211, 121-124). 70 Приклад 4 Аналіз на білок І І

А) Одежання антитіл

Продукували антисироватку проти пептидів, що мають послідовність відповідну до ділянки, яка, як припускають, кодується відкритою рамкою зчитування кКДНК ІІ 0. Був вибраний саме цей пептид, оскільки він має високий передбачений індекс антигенності Чатезоп В.А. й МУУої, Н. (1988) Сотриї. Арріїс. Іп Ше 7/5 Віовзсіепсев 4, 181-186). Послідовність імунізуючого пептиду не була виявлена ні в одному з білків або в трансльованій ДНК-послідовності, що є в базі даних Сепрапк. Відповідне положення цієї послідовньості в білку (о показане на Фіг.10. Карбокси-кінцевий цистеїн цього пептиду не відповідає залишку в передбачуваному білку І с, але він був введений для полегшення зв'язування з білком-носієм. Цей пептид синтезували на синтезаторі пептидів Арріїей Віозузіетв Моде! 433А. Два міліграми пептиду об'єднували з двома міліграмами 2о активованого малеїмідом гемоціаніну лімфи слимака у відповідності з інструкціями, що додаються до набору

Ітіесії Асіїмаїей Іттиподеп Сопісдайоп Кії (Ріегсе Спетіса!). Після знесолювання половину цього кон'югату емульгували з використанням рівного об'єму повного ад'юванту Фрейда (Ріегсе). Цю емульговану суміш вводили новозеландським білим кроликам. Через чотири тижні після первісної інокуляції, була зроблена бустер-інокуляція, при цьому емульгування проводили так само, як було описано вище, за винятком того, що с ов ВИКОристовували неповний ад'ювант Фрейда (Ріегсе). Через два тижні після бустер-інокуляція брали пробу крові та титри специфічних антитіл визначали за допомогою аналізу ЕПІ5ЗА з використанням імобілізованого пептиду. і)

Наступну бустер-інокуляція проводили через місяць після першої бустер-інокуляції.

В) Вестерн-аналіз середовища від ендотеліальних клітинних культур

Клітини НОМЕ5 та НСЕАС культивували та стимулювали РМА, як описано в Прикладі ЗС, за винятком того, Ге!

Зо що клітини стимулювали РМА на протязі 48 годин. Зразки кондиціонованого середовища (мл) інкубували з

БООмкл 5096-ної суспензії гепарину-сефарози СІ-6В в забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5, (97 150мМ хлорид натрію, 100ММ фосфат натрію, рН 7,2). Для часткового очищення та концентрування білків | | (з с була вибрана саме гепарин-сефароза, оскільки консервативність залишків в послідовності ГЇОХІ була ідентифікована як критична для гепарин-зв'язуючої активності І РІ (Ма, У., Непаеггоп, Н.Е., іш, М.5., 2папад, Щео,

Н., Роггуїне, 1І.9У., СіІагке-І емгів, І., Наудеп, М.К., 5 ВгигеїІї, 9У.О., У. Іірійд Кевз. 35, 2049-2059; та на Фіг.б). ї-

Після вихрового перемішування при 4 2С на протязі 1 години, зразки центрифугували на протязі 5 хвилин при 150 х 9. Потім середовище відсмоктували та сефарозу промивали 1ї4мл РВ5. Після центрифугування та відсмоктування, осаджену гепарин-сефарозу суспендували в 200мкл 2 х ДСН-буфера для завантаження (490

ДСН, 2095 гліцерин, 2905 (З-меркаптоетанол, 0,00295 бромфеноловий синій та 120мМ Трис, рН 6,8). Зразки « нагрівали до 952С на протязі 5 хвилин та 40мкл зразків наносили на 1096-ний Трис-гліциновий гель з ДНС. Після у с електрофорезу при 1408 приблизно на протязі 90 хвилин білки переносили на нітроцелюлозні мембрани за ц допомогою апарата для електроблотингу Момех (2108, 1 година). Мембрани блокували на протязі 30 хвилин в "» блокуючому буфері (595 знежирене сухе молоко, 0,195 Твін-20, 150мМ хлорид натрію, 25мММ Трис, рН 7,2).

Антипептидні антисироватки та нормальну кролячу сироватку розводили 1:5000 в блокуючому буфері та інкубували з мембранами на протязі ночі при 49С при делікатному помішуванні. Потім мембрани 4 рази на -і протязі 15 хвилин промивали ТВ5Т (0,195 Твін-20, 150мМ хлорид натрію, 25мМ Трис, рН 7.2). Козячі антикролячі сл антисироватки, кон'юговані з пероксидазою (Воепгіпдег Мапппеійт) розводили 1:5000 в блокуючому буфері та інкубували, перемішуючи, з мембраною на протязі 1 години. Ці мембрани промивали, як описано вище, а потім (95) піддавали реакції з хемілюмінісцентним реагентом Кепаїіззапсе (ЮиРопі МЕМ) та експонували з плівкою Кодак шу 20 ХАК-2. Результати наведені на Фіг.11. В зразках від нестимульованих клітин НОМЕС та НСАЕС були присутні два види імунореактивних білків. Рівні імунореактивного білка в нестимульованих зразках НСАЕС були набагато іЧе) нижчими, ніж рівні, які відповідають зразку НОМЕС. Після стимуляції РМА три імунореактивних білки були секретовані ендотеліальними клітинними культурами. Обробляння РМА значно підвищило рівень білків (І, продукованих культурами НСАЕС. РМА-індукування білків ГІ (з в культурах НОМЕС не відігравало істотної ролі.

Приклад 5 Продукування рекомбінантного білка! | о

А) ПІ О-експресуючі конструкції о КДНК, що кодує білки ОМ і 11 ОХ, клонували в експресуючий вектор РСОМАЗ ссавця (Іпмйгодеп). Цей ко вектор дозволяє експресувати чужородні гени в багатьох клітинах ссавців завдяки використанню головного пізнього промотора цитомегаловіруса. Цей 5'КАСЕ-продукт ГІ М клонували в ЕсоКІ-сайт РСОМАЗ. кКДНКІЇ ОХ. 60 гідролізували ферментами Ога!Ї та ЗИ з одержанням кДНК розміром 1,55т.п.о. (див. Фіг.4). Одержаний вектор гідролізували рестриктуючим ферментом ЕсокУ, а потім вектор та вставку лігували з використанням ДНК-лігази

Т4 та реагентів з набору для швидкого лігування Каріа І ідайоп Кії (Воейгіпдег МаппПеїт) у відповідності з інструкціями виробників. Ці ліговані продукти були використані для трансформації компетентної Е.соїї.

Одержані колонії скринували шляхом рестрикційного аналізу та секвенували на присутність та орієнтацію 65 вставки в експресуючому векторі.

В) Короткочасна трансфекція ГІ о в клітинах СО5-7

І /С-експресуючі вектори вводили в клітини СО5-7 з використанням катіонного ліпідного реагента ліпофектаміну (СІВСО). За 24 години до трансфекції, клітини СО5-7 висівіли на бОмм-чашки для культивування тканини при густині 2х1ОУклітин/чашка. Ці клітини розмножували в модифікованому за способом Дульбеко середовищі Ігла (ОМЕМ; СІВСО), в яке були додані 1095 фетальна сироватка теляти, 10бод/мл пеніциліну та 10Омкг/мл стрептоміцину. До З0Омкл безсироваточного середовища Оріїтет І (бірсо) додавали один мікрограм плазмідної ДНК. Десять мікролітрів ліпофектамінового реагенту розводили в ЗОО0мкл середовища Оріїтет І! та цей розчин об'єднували з розчином ДНК, і залишали для перемішування при кімнатній температурі на протязі 30 хвилин. Потім середовище вилучали з чашок та клітини промивали 2мл середовища Оріїтет І. Розчин ДНК та 70 ліпофектаміну додавали в чашки разом з 2,7мл середовища Оріїтет, та ці чашки інкубували на протязі 5 годин при 372С. Після інкубування безсироваточне середовище вилучали та заміняли середовищем ОМЕМ, в яке були додані 2906 ЕВ5 та антибіотики. Через 12 годин після трансфекції певну частину культур обробляли або 0,25мММ

Регабіоз 5С (Воепгіпдег Мапппеїіт), або інгібітором протеази, або 1Оод/мл гепарину. За 30 хвилин до збору, оброблені гепарином зразки обробляли ще 40од/мл гепарину. Середовище вилучали з клітин через 60 годин 75 після трансфекції. До їмл середовища додавали гепарин-сефарозу СІ -48 (200мкл 5095 суспензії в РВ5, рН 7,2) та розмішували при 42С на протязі 1 години. Потім сефарозу осаджували шляхом центрифугування при низькій швидкості та три рази промивали мл холодного РВ5. Цю сефарозу осаджували та суспендували в 10Омкл 2 х буфера для завантажування. Зразки нагрівали до 952 на протязі 5 хвилин. 40мкл кожного із зразків наносили на 1095 ДСН-ПААГ-гель. Електофорез та вестерн-аналіз здійснювали з використанням антисироватки проти ГІ 0, як описано вище. Результати наведені на Фіг.12. Білки з кондиціонованого середовища від НСАЕС були включені для порівняння розмірів. (ЇМ мігрує приблизно при 4ОкДа, що відповідає найнижчій смузі в НСАЕС.

Середовище від клітин СО5, трансфікованих кКДНК ІГ ОХ, містить типи білка б8кДа та 40кДа. При оброблянні цих клітин гепарином кількість білків б8кДа та 4ОкДа, виділених з середовища, різко збільшувалась, що вказувало або на вивільнення з клітинної поверхні білка, зв'язаного з протеогліканом, або на стабілізацію цих се білків гепарином. При оброблянні клітин інгібітором протеази Реїаріос кількість білка бвкДа збільшувалась в о порівнянні з білком типу 40кДа. Це дає підставу припустити, що білок з нижчою молекулярною масою, який продукується цими клітинами, являє собою продукт протеолізу більшої бвкДа-форми. Роль мРНК, яка ідентифікована за допомогою диференціального відображення, що кодує коротші види білка 40кДа, до цього часу не відома. Однак повідомлялося, що була одержана, альтернативно сплайсованій, форма ліпази печінки, (о) яка, очевидно, експресується тканиноспецифічним чином та повинна продукувати усічений білок. «-

Приклад 6

Го у тварин різних видів со

А) Клонування кролячого гомолога Г І ю

Комерційно доступну бібліотеку КДНК лямбда, яка походить від тканини легені кролика (Сіопіесй, кат. 1110105), використовували для виділення фрагмента кролячого гомолога гена ІІ 0. П'ять мікролітрів вихідної і - бібліотеки додавали до 45мкл води та нагрівали до 959С на протязі 10 хвилин. Були додані такі матеріали в кінцевому об'ємі 100мкл: 200мкМ амтР, 20мММ Трис-НСЇІ, рН 8,4, 5О0мММ-КСІ, 1,5мММ МасіІ», 100мМмкМ кожного з праймерів ОГІР774 та І | сдепга, і 2,5 одиниці полімерази Тад (СІВСО). Реакцію проводили за 35 термоциклів « при таких умовах: 15 секунд - 942С, 20 секунд - 509С, 30 секунд - 7220. 10 мікролітрів цієї реакційної суміші аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Був знайдений продукт приблизно в 300 пар основ. З с Частину (4мкл) цієї реакційної суміші використовували для клонування продукту за допомогою системи "» клонування ТА. Вставку одержаного клона секвенували (ЗЕО ІЮ Мо: 11). Порівняння первинних виведеної " кролячої амінокислотної послідовності (ЗЕО ІЮ Мо: 12) та відповідної послідовності "ДНК людини також показано на Фіг.14. Для нуклеотидів, які не є частиною будь-якого праймера для ампліфікації, спостерігалася 85,89в-на подібність між кролячою послідовністю та послідовністю ГЇС людини. Передбачений білок, кодований цією

Ш- кролячою кДНК, має 94,695-ну ідентичність з білком людини, при цьому більшість нуклеотидних замін с знаходиться в третьому положенні або в положеннях несуворої відповідності ("гойдалок") кодонів. Слід осрбливо відзначити, що ця ділянка охоплює послідовність "кришки" передбачених білків 1.Ї(з та являє собою о варіабельний домен в сімействі генів ліпази. Очевидно, це забезпечує високий ступінь консервативності цього -ь 20 гена для різноманітних видів.

В) о в інших видах ср Для демонстрації присутності генів ЇЇ в інших видах, геномні ДНК від різних видів гідролізували рестриктуючим ферментом ЕсокКі!І, виділяли шляхом електрофорезу в агарозних гелях та блотували на нітроцелюлозних мембранах.

Мембрани гібридизували на протязі ночі при 65 С з 2,5х10бімп/хв/мл рандомізовано праймованого

ГФ) зонда З2Р-ІІ З або З2рР-І РІ. (ліпопротеїнліпаза) в розчині для гібридизації: 6 х 55С, 10965 сульфат декстрану, 5

ГФ х розчин Денхардта, 195 ДСН та 5мкг/мл ДНК сперми лосося. Ці мембрани промивали 0,1 х З55С, 0,596 ДСН на протязі 10 хвилин при кімнатній температурі, а потім послідовно на протязі 10 хвилин при температурі 40 2С, во 502 та 5590. Авторадіограми блотів показані на Фіг.16.

На Фіг.16 проілюстровано присутність генів ГІ та І РІ у всіх видах, що оцінювались, за винятком того, Що гібридизації з зондом ГІ (з проти ДНК пацюка не спостерігалось. Виняткові дані, одержані для пацюків, можуть представляти артефакт, викликаний генеруванням рестрикційних фрагментів аномального розміру, що містять послідовністі Ії. Такі фрагменти можуть знаходитись поза межами фракціонування агарозного гелю або 65 можуть бути наслідком неефективного блотування. Різні смуги, знайдені за допомогою деох зондів, вказують на те, що І РІ. та Гб являють собою окремі еволюційно консервативні гени.

Приклад 7

Ферментативна активність І І ОХ.

А) Фосфоліпазна активність

Кондиціоновані середовища від клітин СО5-7, які короткочасно експресують ліпопротеїн-лірпазу людини (РУ, СОМ або ІІ ОХ, аналізували на фосліпазну активність. Мінімальне підтримуюче середовище (МЕМ), що містить 1095 ЕВ (МЕМ), використовували як сліпий контроль, а кондиціоноване середовище від клітин СО5-7, трансфікованих антизмістовною І І Хі -плазмідою (А5), використовували як негативний контроль.

Фосфатидилхолінову (РОС) емульсію готували з використанням 1Омкл фосфатидилхоліну (1ОМмМ), 70 4Омкл 14С-фосфатидилхоліну, дипальмітоїлу (2мкКі), міченого в 1 і 2 положеннях, та 100мкл Трис-ТСМВ (100ММ

Трис, 195 Тритон, 5ММ Сасі», 200мМмМ масі, 0,195 ВБА). Одержану емульсію упарювали на протязі 10 хвилин, а потім додавали до кінцевого об'єму їмл в Трис-ТСМВ.

Реакції проводили в дублікаті та вони містили 5Омкл емульсії РС і 950 мкл середовища. Зразки ікубували в водяній бані зі струшуванням на протязі 2-4 годин при 37 С. Реакції закінчували шляхом додання мл Мн НОСІ, а 75 потім екстрагували 4мл 2-пропанолтексан (1:11). Верхній 1,9мл гексановий шар пропускали через колонку з силікагелем та виділені жирні кислоти, що не містять "С і які знаходяться в проточній фракції, кількісно оцінювали в сцинтиляційному лічильнику. Результати цих аналізів показані на Фіг.14.

В) Триацилгліцерол-ліпазна активність

Кондиціоноване середовище від клітин СО5-7, які короткочасно експресують ліпопротеїн-лірпазу людини (ІР3, ОМ або І1ОХІ|, аналізували на тригліцерол-ліпазну активність. МЕМ, що містить 1095 ЕВ5, використовували як сліпий контроль, а кондиціоноване середовище з клітин СО5-7, трансфікованих антизмістовною І | ХІІ -плазмідою (АБ), використовували як негативний контроль.

Концентрований субстрат одержували в вигляді безводної емульсії міченого триолеїну, І9,10- ЗН(М)| та неміченого триолеїну (кінцевий вміст повного триолеїну - 150мг при 6,25Х108імп/хв), яку стабілізували шляхом с 29 додання Омг лецитину в 10095 гліцерину. 0,5бмл ЗН-триолеїну (0,28мКі) змішували з 0,17мл неміченого (3 триолеїну та 9УОмкл лецитину (9мг). Одержану суміш упарювали в потоці азоту. Осушену ліпідну суміш емульгували в 2,5мл 10095 гліцерину шляхом обробляння ультразвуком (30-секундні імпульси на рівні 2 з наступними 2-секундними циклами охолодження на протязі 5 хвилин).

Субстрат для аналізу був одержаний шляхом розведення 1 об'єму концентрованого субстрату чотирма Ф 30 об'ємами 0,2М Трис-НСІ-буфера (рН 8,0), що містить 395 мас/об, альбуміну бичачої сироватки, в якому була -- відсутня жирна кислота. Розведений субстрат інтенсивно перемішували на протязі 5 секунд.

Реакції проводили в дублікаті в повному об'ємі 0,2мл, що містить О,їмл субстрату для аналізу і 0Тмл о указаного кондиціонованого середовища. Реакційні суміші інкубували на протязі 90 хвилин при 372С. Реакції припиняли шляхом додання 3,25мл метанолу-хлороформу-гептану (1,41:1,25:1) (об/об/об), а потім 1,05мл 0,1М м 35 калійкарбонатного/боратного буфера (рН 10,5). Після інтенсивного розмішування на протязі 15 секунд, зразки центрифугували на протязі 5 хвилин при 71000об/хв. 1,0мл-аліквоту верхньої водної фази оцінювали в сцинтиляційному лічильнику. Результати цих аналізів показані на Фіг.15.

Приклад 8 « дю Використання І І о-поліпептиду для скринінгу з метою виявлення агоністів або антагоністів -

Рекомбінантний ІІ з продукували в клітинах комах, інфікованих бакуловірусом. Рекомбінантний ГІ З очищали с з кондиціонованого середовища, яке містить або не містить сироватку, за допомогою хроматографії на :з» гепарин-сефарозі, а потім за допомогою хроматографії на катіонообмінній смолі. Якщо це було необхідно, то при очищенні ЇЇ використовували третю хроматографічну стадію, таку як, гель-фільтрація. Під час очищення антитіла проти пептидів використовували для моніторингу білка ГІ з, а фосфоліпазний аналіз використовували - 395 для визначення І | с-активності.

У флуоресцентному аналізі кінцеві умови аналізу передбачали використання приблизно 10мм Трис-НСЇ (рн 1 7,4), 100мМмМ КСІ, 2ММ Сасі», МКМ сю СеМвО-РОІ1-ацил-2-|6-(нітро-2,1,3-бензоксадіазол-4-ил)|аміно)капроїл-фосфатидилхолін, та білок 1 (прибл. 1-1400нг). Реакційну суміш піддавали флуоресцентному збудженню при 47Онм та здійснювали моніторинг - ферментної активності, що вимірювалась за флуоресцентним випроміненням при 54Онм. Потім сполуки та/або с речовини, що тестуються на стимуляцію та/або інгібування (| С-активності, додавали в вигляді 10-200ММ розчинів в диметилсульфоксиді. Сполуки, які стимуляють або інгібують ІІ С-активність, ідентифікували як сполуки, що викликають підвищення або зниження флуоресцентного випромінення при 54Онм.

В цьому тіо-аналізі кінцеві умови аналізу передбачали використання приблизно 25мММ Трис-НСІ (рН 8,5), 100ММ КСІ, 1омММ сасі», 424ММ Тритон х-100, 0,5ММ

ГФ) 1,2-біс(гексаноїлтіо)-1,2-дидезокси-зп-гліцеро-З3-фосфорилхолін, Б5мМ 4,4"-дитіобіспіридин (з 5ОмММ вихідного

ГФ розчину в етанолі), та 1-10О0нг рекомбінантного ГІЇ. Фосфоліпазну активність визначали шляхом вимірювання збільшення погилинання при 342нм. Сполуки та/або речовини, що тестуються на стимуляцію та/або інгібування во | О-активності, додавали в вигляді 10-200мМ розчинів в диметилсульфоксиді. Сполуки, які стимуляють або інгібують І І б-активність, ідентифікували як сполуки, що викликають підвищення або зниження поглиняння при

З42нм.

Приклад 9

Трансгенні миші, що експресують І | 5 людини

Для подальшого дослідження фізіологічної ролі-- Її були продуковані трансгенні миші, що експресують І 65 людини.

Рестрикційний 1,53т.п.о.-ЮОгаі/ЗпІ-фрагмент, що кодує ГЇОХІ (див. Фіг.4), клонували в плазмідний вектор (рнмМо) нижче промотора для гена редуктази, що конститутивно експресується,

З-гідрокси-3-метилглутарил-конформента А (НМО СоА). Трансгенні миші, в яких експресувались різні рівні

ІГОХі людини, одержували стандартними методами |див., наприклад, О.Ї. Тготр еї аіЇ., Сепе 1565: 199-205, 1995). Цих трансгенних мишей використовували для визначення впливу надекспресії ГІ ОХ. на ліпідний профіль, судинну патологію, швидкість розвитку та тяжкість атеросклерозу, та інших фізіологічних параметрів.

Приклад 10

Експресія ГІ С в атеросклеротичних тканинах 70 Експресію ГІЇ ОХІ при атеросклерозі оцінювали шляхом проведення полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (КТ-РСК) з використенням мРНК, що виділена за допомогою судинної біопсії від чотирьох пацієнтів з атеросклерозом. Зразки тканин брали зі стінки аорти (один зразок), клубової артерії (два зразки) та сонної артерії (один зразок).

Біопсію з атеросклеротичних судин одержували з клініки (Сіоисевіегпіге Коуа! Нозрійа), Епдіапа), після 7/5 чого одержували роїу(АукМРНК та ресуспендували в обробленій діетилпірокарбонатом (ОЕРС) воді при концентрації О,5мкг/мкл мРНК. Реакції зі зворотною транскриптазою здійснювали у відповідності до протоколу бірсо ВКІ, що додається до системи попередньої ампліфікації (З,ирегзсгірі Ргеатрійісабйоп Зувіет) для синтезу першого ланцюга кДНК. Коротко, кКДНК синтезували таким чином: 2мкл кожної з мРНК додавали до 1мкл о ідо(ат)412.1в8-праймера та Умкл ОСЕРС-води. Пробірки інкубували на протязі 10,хвилин при 702С та ставили на 1 хвилину на лід. До кожної пробірки додавали такі компоненти: 2мкл 10 х РОК-буфера, 2мкл 25мМ МосСі», мкл 10мМ амктР-суміші та 2мкл 0,1М ДТТ. Після 5-хвилинного витримування при 422С, додавали 1мкл (200 одиниць) зворотної траскриптази Зирег 5сагірі ІІ. Реакційну суміш злегка розмішували, а потім інкубували 50 хвилин при -4220. Реакції закінчували шляхом інкубування на протязі 15 хвилин при 70 2С, а потім реакційні суміші ставили на лід. МРНК, що залишилася, руйнували шляхом додання в кожну пробірку їмкл РНКази Н, та інкубували на Ге протязі 20 хвилин при 3726. о

РСК-ампліфікацію здійснювали з використанням 2мкл кДНК-реакційної суміші. В кожну з пробірок додавали такі компоненти: мкл 10 х РСК-буфера, 5мкл 2мМ амтР-суміші, їмкл ПіІІд-дзрі-праймера (2Опмоль/мл, див.

Фіг.1), їмкл пІІд-дзр2а-праймера (2Опмоль/мл, див. Фіг.1), 1,5мкл 50ММ Масі», О,5мкл полімерази Таз (5од/мл) та Заімкл води. Після витримування реакційних сумішей на протязі 2 хвилин при 952С, проводили 30 циклів РСК ФУ при таких умовах: 15 секунд при 942С, 20 секунд при 522С та 30 секунд при 7220. Заключні реакції проводили на «- протязі 10 хвилин при 722С, а потім здійснювали аналіз за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, пПІІд-дзр-праймери є специфічними до ГЇ0 та дають очікуваний продукт в З00п.о. В паралельній РСК було і, показано, що реакції синтезу КДНК були успішнми, при цьому використовували праймери, що є специфічними до Му гену "домашнього господарства" та до ОЗРОН (гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази) (1мкл кожного при 3о концентрації 20пмоль/мл). -

О5РОН-праймери (див. Фіг.1) давали очікуваний продукт в 983 п.о. для всіх чотирьох зразків судинної біопсії. Експресія ІЗ виявлялась у трьох з чотирьох зразків, а в зразку, взятому з сонної артерії, цієї експресії не спостерігалось. «

Всі обговорювані роботи вводяться в цей опис через посилання.

Для кожного фахівця очевидно, що цей винахід може бути легко адаптований для здійснення мети винаходу в с та досягнення потрібних результатів і вищезгаданих переваг цього винаходу. Пептиди, полінуклеотиди, способи, "з процедури та техніка, олисані в цій заявці, наведені як переважні варіанти здійснення винаходу та приводяться " з ілюстративною метою, а тому вони не повинні розглядатися як такі, що обмежують об'єм винаходу. В цей винахід можуть бути внесені зміни та інші варіанти його використання, однак, вони не повинні виходити за межі сутності та об'єму винаходу, що зформульовані в формулі винаходу, яка додається.

Ш- Список послідовностей «сл (1) Загальна інформація: (65) (і) Заявник: Чауе, Міснаві! С. - 50 роап, Кіт-Апп Т.

Кгамлес, Ддопп А.

Ме, Гупси, Кеміп .).

Атіп, Оіїїр У. зош, Місіогіа .). о (її Назва винаходу: Поліпептиди ЇЇ сімейства триацилгліцерол-ліпаз, композиції та способи їх використання в ферментативному гідролізі, та терапія з використанням білків та генів ко (ії) Кількість послідовностей: 31 (м) Поштова адреса: бо (А) Адреса: Кпопе-Рошіепс Когег Іпс. (В) Вулиця: 500 Агсоїа Ка. з3с43 (С) Місто: СоПедемШе (0) Штат: РА (Е) Країна: США 65 (Р) Поштовий індекс: 19426 (м) Форма комп'ютерного зчитування:

(А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: РС сумісна з ІВМ (С) Операційна система: РО-ЮОБ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: Раїепіїп Кеїеазе 2 1.0, Мегвіоп Ж 1.30 (мі) Дані цієї заявки: (А) Номер заявки: О5 (В) Дата подання: (С) Класифікація: 70 (мії) Дані про повіреного/агента: (А) Ім'я, прізвище: РейіІпег РА.О., Раці КЕ. (В) Реєстраційний номер: 35135 (С) Номер документа/досьє: А2582-МО (їх) Телекомунікаційні дані: (А) Телефон: (610) 454-3839 (В) Телефакс: (610) 454-3808 (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 1: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 367 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: дволанцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: кКДНК (ЇХ) Відмітна ознака: сч (А) Ім'я/ключ: СО5 (В) Локалізація: 22... 180 і) (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 1: у Риж рує бує йіУу сів бух аа сбеє Су вну Ф - й бе ї 5: 10 - да лас пот ат дат ос. ат БОС ТАС ВАТ спос дя зда АТО Аби БАС 55 о їЩув Аци Акц бСуя аби ває ГУ ЦіЖ тує дян діа: пу пуз мес ви вий ю дао дове Аве ВБС ЛАК АТ ТАС ста ЗаА АОС сов са бос А есУ 00

Був яку днини Ве бує Мах тує Бей був ТО дод вів оду мен р Оце « ш во 35 46 с апа. вот ААС стТт СМ ЯСЄ сте БАС СЕС ТА СБІАВОЮСЮТ ТЛАТАКЕКОС 295. " два Бім Ай аа бій ше: ей бій був ВЕ Є

ТІСТТААТАС САТОСТОСАС АССАБОССАС АТОСТАСССС АССАСААСТО СССАССАСЗА 260 -і Я . сл ТССААТСААА ТССТТЯСАЛА ТСАСАТТАСА СТОТОСАТСТ ССТАССАААС ССААТСТТТА 120 (95) СААААТАААС АСТОТОЗАСС ССТСААЛАААА ААААААААСС СОЛАТТС 3167 - 50 (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 2:

Ме; (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 53 амінокислоти (В) Тип: амінокислотна (0) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: білок о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 2: іме) 60 б5

Ре Пуз Ппув сбіУу К1еє Суз Пец Зех Суз Ах ув Авп о Аку Суз Авпобеї 1 5 10 15 тІ1е сіу Тут Азп Аза Пубз Гуз Мес Ах Азп оПуз АхкЯ Ап обек Пуз Мес 20 28 30 тут преп Буз Тіг Ак Азїа біу Меє Рхо РБе Ага сіу Авп о Пеп біп Бех 70 35 40 І 45

Таж віз Суз хо "7 ; 50 (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 3: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 1382 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: дволанцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: кКДНК (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: СО5 Ге (В) Локалізація: 312... 1370 о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 3: (22) «- со

ІС) ч- « ші с з -І 1 (95) - 50 3е)

Ф) іме) 60 б5 пелена тегАстяетА СТаовОСТОЇ тдсссвосою созвосовоє о ясласолоте спосте сепиютєм сасшлосесь АТС тини А Ото есттахсвст офстсостес свссвіоеста СОСААВТІТТ САТФРТОСАЄ 289 бгІстеТче тцемотесте сквсосето ссплвлААє ФТТТАВОВ о то стосладсяс СлдолОзтос ТТТТООТТТТ ТІйААастс тотттстт: забонтот 300 басоопосяо о іАта АВС АВС тос сте ост сто сте бат т те т о Ск 550

СМес Еш Мп Ббу Чаї Реб ва Бен сСуш РВЄ Тр: Бак орав. ве ов ва су тує Су вча Аля Ін суу пак РІО ТАТ рРсо ВНе Бу ре спі Су тю 75 чо де пеу спи дев ІД Бех нів БУЄ РУЄ УЖ Аа Тих бій ТВ СІ УНй

СЕ о: ве: ше ї -ААА сСА СТ ге вот Аме стесве аро ос два свое ссА см СА 458. сч 25 ще р БЕ маї дтб ВВЕ Ді: МИ Мо ТНК Бах уз йнр ре ШТ НІВ о

ІВВ ! МЕ щ1б «да вих тс пав Ст тес то Б сао АБО САВ Ос та сних АС То її

І сту Сує тує щем Заг Чаї СІ НВ Бех ЕЙ Вей Біжи 15 люд ср Ф 30 Бк | і щи 25 Ше - дай ті айс ЛИ Ксь ПО ака АОС тт їте Кб Ажт ско бій нав яв 8 с ще вва вка НК Же Ат Шу тк Бе Яне тів діє Нів 12 то ТВ г ав хо за о вто аБо БУ ве тт БАХ АВО тТоо сто СМ Адж сте бто тс се СЯ 53.

Жас бег сім Е Ене БІЖх йжа бкз тк ЖШує Шаш ча. ех діва бер:

ЗБ: ЕЕ яво с нів фвт аг -к Буйсйср Аля йвй Хаї Уві ві Чаї Яхво тер бен Бко в: й В ув 2» Й ст бе си свс'стт те сс пит осо сс ки АЖ АОС йо БІ та "а 45 Бечодта Ніж бідо рев бр те ЛЕВ дія Ухї Аво Ява Збх Аде Маї Уаї 185 ї Ав 159 шсх слб дос дит ост Ал вто сто охо топ сто сло: сло МУ сг се "тай біфш ніс Би тре кій Деу Мер Бей де тя Бей рн ст Бук пер пор м 195 чо яке 205 во тут тст сте ОБО ВАК ото Сас тт вто пос отас вошссте сх соб со во с ве важ же сту дяк Уа) Ні пий Ії О0И уж ден Шен бору дтя НЕ роя, ЩЕ: ШО ШЩея - фас вог ть Ес Є хАссрес ФК ВА сах Ас от ВЕ ЕН А ООСБРВ о Чаї Аа зу Тут Кід Сіу дяп'яВе Узі пув бу ти Чаї Ям дою їж

Зб. 5 ві

По) 1 60 б5 тік Сп рев два С веа Аха біУ Вс Ме Ре біз сію Аїа: Ав се нія - Й ша р: В Б; . тує вк пев бек рус йзо йо АіноАвр уве Уві вяю Чаї реа НІЖ ТЕ вве 7 5 ат е тук Тих Ак бат вне біу Бач Ве Ше БУ ї16 ям має шо чаї Му во НИ А КО ТА СОС длАтТ сов от ша тт СА сс щос Тато і76 75 Ніз тре лер Гіє Тух ба ва СІуУ іу ве ЗБ ай РЕ ЗІУ сув' щу 1: 95. Зо 95 тс ие ще ях Фо та КТ сх ТА СА АСА ОВС ОД ОСМ ЯМ Ме

Шен йяподяр Маї пев біу ве ее Аа Тує алу тн ТтТе жВСохта УЮ вв 315 92о

Е ета вка тат рас слт ми сва дес сто сан Тс тт тт бас Р Я О00ОАбЄ укі Ду бух бін нія бін дж Віа Уві, Нізетляо зе Чиї дбр'як: пах ща - ВІ зв: см ат дя сяк дя шує рез Бвх РВЕ ла виш сів сук тТНе АВ де Дей вів З за | 50 к

Зо Шов ТС ЛАКІАЛЯ поз КТ тот сто ВОСтТос сво до КАЄ Сов Бу в зав: - кое вна пн дув шту тліє суа шо БЕ Су йте Був Аяп бо сую ля. шк Ід

ЗУ і Вей 385 зт:

Ас АтТІ ЯБСІТАЄ ДАТ'ОСЕ Аа ва кто вста ДЕ АдсовшО ВА КОС дай, ча аж ІТ Слуттує ян да пу Бу Меє ле дав Пуж Аго АвпоБнию др - ши: 88 С ко тає СТХ Лад нос сво ось пос али оо птиг дод ШО ДАЕ ситі 0 ОБ « й ми Тух Бей щує ТВЕ АБУ МІЖ Сіу Мак Вес Фа Акт Су лив їни СІх З с зво Е «во "з тес бавітвт саасосвми ще в " Як раш піт уює н п ов -І (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 4: (Ї) Характеристики послідовності: 1 (А) Довжина: 353 амінокислоти со (В) Тип: амінокислотна (ОБ) Топологія: лінійна - (ї) Тип молекули: білок

Ге) (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 4: (Ф) о) бо б5

І) Описпослідовност ЗЕ МО Мої ах шо во : в. що ши

Рбе Жта для Чу бак РКО Укі Рує РВе Бім Рхо біш біу Хгу і дих то 78 що ї й дар Пуч пів. Ще пу реє Шу Ата нт БМ Тк до УА. Шує бо Бек

З ! й. г «5 зіаї му тВЖ дов рай Агу Те ек цує дер РНа б)й Од ФО СТУ Су:

Тух Пам оБес у бі нія ях бів рез Мей сі йно буж бах она ана: а ; 70: я що: 7 ТЕ ТМ длА ЩУХ нс рве РБЄ Ї)е Хе Ніж ді тку ти Мих Би обу: 1 В 80 Й СІЙ хе тне стй Аа тромби ніх туз па уиї ШНЖ дія Пай НЕБО ТвУ ЗАТ проб. Бо що см шт пуя дао дол вна Уві Уві Ма) уні дер: ев їн ро бом він дів

ШК лаб В. Й 30 ота фе м пу Уа йяп Авт Зх йшло Маї Уві Бі нія баг ; б о жів йїа йхе Кев рей аву Тер це бі 1 Буз Ар Ав Ре Баш во: ою 35 : ше в. «їу вен Чаї НІВ Пео тів щу тує важ пе ст Атя Нія май дл. пі зи ках ча НК вв ке 470 вк що, « ю Су Ада ЗУ дит Ре Ма). бує ЗКУ Твж Уві бу ко З Тв бу без З

Й пай щяв: ща с Е г» Вшо бив дія Бі бхо Меб рве Сім ЯТу йіа Ар 230 Щі ПуУЄ деу Ви: 95, -об 205 45 і -

В. Шеп бро йвр дер ДІА АБУ РБО Маїс Авр Мах Бей Нів тв Туй тні с о; 2І5 229 о Бай вне БЦ ідеш ит тів бІу тіє біл Мес Ро Маї біу йів Тів-Авр. о Те Тук Рко йзн біуссіи Ар Бе бід Рхо біу Суз біу пев Ява Аж 6 259 258 ' - кі бе Суу пес дів йіа тус Бу тни ту ве бай мат Уві Бує су щі то ЗЕ» ве сто нів ній ійтт ше те нів їв же ув) Авробек же Маф йзпо був: бо ре ж вт 285

Жар ув Ро Бах Ра діа бе бій бує щвн Дер бах Яни ле Рв Ту

А: 95: во бо :

тук йявоАід уз Був НО ккд дя Уж Вхо Аж бек Цує мак тує 1 (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 5: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 1065 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: дволанцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: кКДНК (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: СО5 (В) Локалізація: 1 .. 1065 с (хі) Оційс послідовності ЗЕБЕОЮ Мо: 5: 5)

Меб Бекодян рек Хе РІЄ Ше І був Фе ТЕР Бех Іф. був Тух Суя ав ї 4656 кс : (22) то я СТ сп ец дос сес бта сот тот сот сс баб оз соб сто бах шЕО-

Бве аа Ка ПІЦУ Бер Фо мні вро: Ва б1уУ ВР СИ СІУ зд тей Бій ях зв Ї зт зва за 38 САТ АЛ СТО БАС ВАХ СПО ДАК ост.доА Са АсСтТ пло ото БА ССА т ла м- др. те ев фев: Шо: вт уз ій же вів сі на Фк ов чув Бу ша. Бех що зе 406:

Фтс Аа Тгт АМС. СІЄ ШЕ МЕ сс лаб БАС ШСА Пас пат ад ей те 99

Мах вже вне ва «й яра хек Бех Буз дви ув Бій ні БІ Ту су -

Тут тен Зах Та яву Ніж бвє бід Вже пис бі дже суч Б рЮе дев; с» ЕЙ 85 т «о - і (95) - 50 3е)

Ф) іме) 60 б5

Меп Те Аза бух Тато рве Ре Ліє Те Ні Єїу тТлр таж Матч Бех ОЩу «385 | ча 45 й с зни

Іс ту си и оо сто Сяс лак СУС сто па бос ста са дод жд. за жЖіє Бке біц Ярі Фев Байонів Шує цей Меї ББЖ Ай БИ Не ЧНЕ Ак чо БЕ бо. 465 то ско АдЕ пис сос ДТ ста т? сто стт еАе тов ст спе сто осо ас ЗВ шій дя йо Кіа дна Мах уні чай Ух Ай Тер сей св реа та ВЗя що о ж о, ВЕ шо СТІ Тс Або САФ Осо сто Кат ду? АС дО сто то пол САТ АВС ві пі ей их Тр дер ан Чеу Ані доп увв ОА Май Уав'шїу нка вет. дттссс до Ве сто ОАЄ се сті сло баб кає БАЄ бат тт ст ст їщо;

Щі йів ДЕ Ме Ббй ля ТВ ро пл бе: Уж лем жар РБА: Ба: Бе

Ба ШЕ "вІб

Білу ва Мат НЕ Пе її О1У тут ВЕ рей ПМ; вла нів мах дж Шу см вів 525 нос | о тдт БсА бас ААЄ ОС СТО ВА са АС СТЕ ОО СА ЛІС всСи ост ТТ ВТБ; тут дію ім люй На ні пу Біу тн Мах слу дев ав тн? му дей р - "Ват сст осо бах ССО Кто ттЕ БА соб БоЄ САС АТС бас Акб дов сте бай со

ЕВ СРЕа 1 Сі ржО Ме РН Бін СІ Ашя дер ті ни: бує о два: 1! 559 о ВБЕ ше ви дет сбо САС сАК ССА САТ ттт бТо бат у СС Седе абс їде дев бат 873 век вяо АБ Авр.АІя Анр Ба УКІ АБО Уві пев нів тн ТУЄ ТИЖ ВИ

БЕ к вв 575 й « їхі Й всьо в - с й те То опо то ЖосС жхте бот тт схо те Ост оте пос а ат Ас тай

Бех ВцасО1у їжи Бех Тл ТУ ТТе Єбд Ме вто Чаї СМ; нія ІТ йею :» 88О в5 БО 5 ВИ ТАСОКС АТ БО спт БАЄ ТІ САВ СС. спос ТТ бах СТО ВАЄ бат: Ва - лі тут РЕ Аа БУ бІУ МБО ОРНИе Ба РО БМ суч СТУ де дей яр вав: | 7 во - бо ос Ж і о тс то ФА ТС АТ ОСА ТАТ ВОК ВСА АТС АСА САФ СТЕ СТА АКА ТТ. ще з ю "нь цей сіу Бетг тів АТа Тух біу Твж Іів ТБх буш Маї Узі уж Сув вто Ів: 62о жав (Че) Яощоя ква бат сав СбА СОЄ СТ6 СИС сте тт бтр БАС Тег Сто сто АТ САС век ім жів біз йжо Віва яв нів Пез Би Уаі дар бех інн Уаї Ан я 535 540 щі А МАВ СсО ВОТОТтТт ОСС ТО САЮ Тс СТ шАЄ ТОС дат СБ тт хх ще з фарнув Рош БУ Ве АтТа Бе ШТЯ Сує ТЕ Дар ББЕ А: ян де ув

Б 650 558 бо б5 був Зіу ліє бує Мо Бех Су йхо БУВ Акподжш Сув вип бає Кіш БІ ява | вв. жу 8 й

МТС ОААТ Ос КИ КАК ОЛТЄ АОС АВ ХА АБО АНІ ДО ЛА ВТО ТИФ СТВ. вва

Бук Кай Кіа Мух МУЗ Мав су дви СИ Дер йжа бек уж Ме Тут Шо. 575 | во ав ши! я

ВИжОоВСт сот Сех посол ост тт док ост лис СТ тес б 5 жу Тит Вев Крах піу мес вто Ре ку СК лев бо біз Вер їде бін я 555. | Бе то в й 5 тестове я | с ї чо; (2) Дані послідовності 5ЕО ІО Мо: 6: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 355 амінокислот (В) Тип: амінокислотна (0) Топологія: лінійна (ї) Тит молекули: білок (хі) Опис послідовності зЕО ІО Мо: 6: Що Й | Що й дв Меє бек йзп ех Уві хо ті Мец бут ВШ Тир Янг цеб був тує рух с 38 ке о. 5

Й ів) зв уаї йо Ве Ана Бей йеу тк БЕР щує див Руо ОМ. ная сіяв бує ї- й | 55 Бо тут пе Яеу М біу Ніз Бех бід хо йац ЗМ АВр бух беж Ре АБ « ав В. во 2 с це з» бівт би Віа Бує тв Фе РНЯ ЇТЬ Те НЕ бау тер Ти Мек ех СІу що іє ри сти Ки тив дае Нія ув рен уві бек Аїа пес Ніз Тв Вхе ре: г Й Бекех: БІШЙ "о о яіч бут Вбр Кі йяо ЧЕ а) Мві Чаї вер о тТтю ше Вжб рез ха Же ще і - 55

Ф) іме) 60 б5 аю, 135 460 тав В ав; яко

ЕІ Айва Мі Мія цем їіе Шу Тух бек Тен Ту Віа Яке Чаї діж біу то 0 Абв, Мб те тив аа ру дав іа Бе ЧИ Кув ау тни муаж р ку Ка ТВЕ СВУ бач. зв І85 150 і Й | й Ще Щ . дор вий кій сту го Ме РНа сій сіу вла дерті нє пуя дже пай: 159: ши ен Й о Ба рез дяройзр ія Ар ВМе Маї Яво Маї ав ніж Твх тух тіж джу що 218. о і

Не Вке біу Бещ ет Жів ту Ті біз Має хо Мі біу Нів Іі й» 225 Ї ай 235 2 сч 7 Щ шик шо ШИ о;

Їіе Тух го йяп слу бі Анр Ре Б) Рго біу Сув СТУ Пец два Ар ше 259 роя ; (22) зо Мах Без бі Бек Ме Ма Туж Су ТБжх тів Тве б1о Уах Мах бує Сує - тео бах 279 : | й І со сіє нів БЕ Кука чаї нів цей рНе Чай вас беж па уві йев Ст ю 25, її -в5 і ' й і - дяр туя ро дак Бе ів не бій бує лі яр Бек дей Ах вМо лує ав: 295 во й | « шує Біу іє бух Пен бер Суз душ бує Яви дує Суз йди Як тів ай» а с до : Зі З зга ут йно Аа Був щує Має йх: Або Цув йсш Дві; Бех Шуе Меє Туб Ле; -і і. ! сл шуй тнт Аг ЖІ бу мак РЕ Ре АКу Сту вай пай БІ Би пев сто; зо к 345 359 о ст що ж й су ржа б о 7 ЗБЕ. - с (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 7: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 2565 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота

ГФ) (С) Ланцюговість: дволанцюгова (ОБ) Топологія: лінійна о (ії) Тип молекули: кКДНК (ЇХ) Відмітна ознака: 60 (А) Ім'я/ключ: СОЗ (В) Локалізація: 252... 1754 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 7: б5 падттесссв СсбОстТевАє босБостєво сАсеАсовоя сатоТсвМ Ба сертаксяєст сестсестас сстосстосс шеслАстттт Сто сяє 0020

В сттстстасе оеаетевеє сАВСВСЄВЄ ТотсттасеВ осот 003 ! Й Що сзчак - ет АлАСАС падсаєстТос ТТТТТОТІТІ ТТКАВНСтТІС ТотТТтсттоє бабсооботот 0 що то посапобсйс о ато вос яхо, те тест ота ст пот тс тод во се 80 мех нат дет Бек ну Ре Пе пе сСує МЕ Тер дет сви. ' зо: завя тост татотос т Яст св бо аде сс ста Ст тт ОК 'свв баб осА яв

Суш тут шує РМа Аїа Мій сти дак Руб Мах Ро ВН су вее; дам су о зт й з Щ со сто Сад бат АВ СТ СА ВЛА СОС Ада Ст аб Сас васт бло Єте Зб де цей сти айр' вує а нев ув виб Шу дла тн ші Ме БІ Ма 165 вва Ї о вда: те: Я

ВАВ СОА СТ ОТО дно ТІ ВАС СТ СОС АВС ЯСО АБ БАС ссА спо саб чі

Буч рес Баг МЯІ ку Во АБ ей ле т ває пуб дей вто Пій Вів: с ВДВ. У 5 см чад са тає тає Сто ОС то бе сво дог САС СОС ТТА ша БАС ТО 53 «чта сію сСує тує цеа ех чар біду ні бет сій Ршо рей біновев сує аа 25 ша

Ф

МЕТ тс ВАЄ АТ ВСХ ОСТ ВАХ Є тт ТЕС або АтТІ САС ебх тов ех 535 - вам вне деп Мав ти дів пух ТНК РВЕ РНЕ ТРА тлб ийя ПКУ ТУВ ЗБЕ: ява же а о та Вас ост дес ТТ БАХА АКО то СТО СВО дмА ст сто ТОА С СТ 58 "Жаба паю ЖЩО ЗНа-бІа днт Те; бай із Був Бей кі: шен аа цей - 459 і 55 169 каш ДСА ВС ЛО ЗАД АС ОСС ВАТ ста ст те тт ВО за сво БО Ед. « ще тн ва Бо ух оо дів ве уях чаї Уа Мак йо пев щей РО: З 85 470 йтя «Во с 155 : з -І 5 о - 50 с (Ф) т 60 б5 фа боб сво схіх СТУ ТАЄ Моро САТ Об сте ВАТ КАТ АОС Ме Сто ОТ вт

Жеш за Міє бід бен ух тн йеЮ Аа Ван Ана де дру МЕЖ Мах дБ. ай "- 455 на слс кос оваут сес.вос АТО СТО сабо сте Сас сво каб САС сАТ чай б наш Бест ТІіЄ КІН Аж Ме Бий кер тир еВ ів ЯВИ ЛУ АБО Ар»

Що 500 ОБ: т 810 то ттт тет сте доп ААЖ ШО САС ПТО АТО бОЄ ТАЄ АБ СТ оп ОБ ОСА ля рнНя Беж реа Біу же уні Ніз бем тів: біх Туш бех беш ЗМу йїа Бі

ЕСЕ га | 523 сто пес боса ТАЖ ОСА ОБО ААЄ Є Ота вк ОбА АОС сте БО сБК А Ще чні ща су тук ді СБУ Ап Ре ЕІ пу шіУ ТБк Ча1ссту АВИСЕИВ то с: В ее Ба Й зсь бат та йМо ст бос соб се або тт аб б об ове асо ев: тис сту лей яв рий Вій МІУ рт Мер рРЕЄ 1 пу дів вай дтасня:

У 55 855 - ЖЕД.

Й два вав сто їст есб бас пат оса бат ТТ сте ват С сте са аб 51.

Шин ак ННЯ Бах Ро АяЮ АЕРО АВ РНа май АВ Маї цей НЕШ Тех:

ЗЕ5 в 575 ни » тс асо шет тро тте ос тт Ас дтт сот тт сдся АТе ост сто бос ва о щури ТЕ йрш ау вне бу пай БЕ ЖІ БІ тб бів Мес свка ву Фу

БО 585 89 сис вт ас Кс тає со ват осо дат пдв тт си ос тоб вай жа Ф а тів ер тів бус вно век бі Су ар вяе.: дію; Бий Ці був Шу -

БЩ5 5. щі не ш Гео) «те ВАС САТ ОТО то ОА ЖСА-СТ бСх ТАЖ под ас те вйох см Сто дов ю лляні БИ АБО Маї Шви су Веб Ті Ата Тую ШІУ ТЕ схо брисощи Мах ча що від БІ5 бив

Муйт пу Су БІ: Ні І: Хе Ма Уаі ніш радо ве Чаї яв ве ей « ва тя 835 Щ с З й й с та ат си аа да са Авт ТТ осо с сла тес аст смс то ват ве з» члиї вна Сінозно цук рез Баг ВН Аля РЕ Сіл Св ТВі Бер Беу Ав щи шЕЄ Іс ака Ал боб Дт ОВ С ос Вас СОС АЛО ДАЄ сот тот Кт: ї205; ше вне Шдиз БВ Ту пає Суж Дї чу су кеш їде Аііодту був дев:

Ф ОВ в85 576 о б АБС АР БОС ТАС ВАЄ БОС КАС ЗАХ ЗО АБО БАС АВО ВОЮ ОМАЄ СС КАХ» зач - ек т1е СТО Тут анц Аля пуб Бук Моб-люц Кай Пуш ве Де шаЕ ДИ со вт ко; ВН да ТАЄ Сфія дал всс поз сс дос ля ст тт дех ТИ ТАЄ СВТ ТАТ роя зв меє туш рей тже ня ту ЖМЯ СЛ МЕк ріео-внЕ АБ; ШЬХ Ти МЕЖ у

БО с зо й з ТАБ АТЯ АМА ТВ САТ ОТ ТС АТ ТАС Ал дас АТ боса БАД тт А а бхп Ме пив дів НІЖ Мау ВНе Бнх ус муж зви Мет Пі Сі ІЩЕ БІЙ то5 І ЗІ в: паб бо б5 сБб АОЄ ТР ТАЄ БО йде СТР АФ ОО АС АЖ СА САТ фоє САЄ Ст їззє хо Тік ОРрБе Тут Уаї Хто їм Тут біу То нт Віа Аєровах Бій те: чі таза ча й се Ск ств шк Втх СТ СЮ бо лтЄ Са САС АТ бос ВСс АМо ос ща два РФ Пес бі жів Маї 019 вхо Тке 15 бір Аве Ака тнЕ дено тн "В: т45 т те 16 теще СТ тс ТАЄ дес баб блю смс тт под. Ас СТ тто ВА АТО СВБ; 1450 ве цем Маї Тук же іє сій ав ей СЛ ве Бей цей Був же бе 75 "76о 765 ше тосопає соб осо тот сво ет пов ТАЄ вас сто щоб ААб ба 1538 тв жи Тв Тер дра бІу Жіа Бег біл ва Тгр уж АБИ Пеш ТУЮ Щуж с "в к щ тво

ШТР сор абс ТАС СТЮ СТ Сад СОС Сбо АС Сб БА СОб САС СТО КИТ 58

Ффне Аля бех Тут Мем Бех СІЙ Бхо Дго яр. Рго ФІУ йху ДІВ Пец дну "я: 98 тав "Вб. вт аБа Бе ке боб сто Аха тот бо шах АОС ША ба АЖА СТО ЖСЯ. лоза

Ії сте Ате іа вт Уві Пух вве СМР бів Тр обію Ах Був Бей ТУ: ка (о) ятт ТО АСК СА САС ЦСтТ сла КАС сс Ас АТИ тес сса бод сов СА 000 1бво

Фе бує Тр обітз дар о рте біб Вб ТБл Бех І1е Баг бго Яру вка бра

Шен Тево Ре Мет ув Суд йо йвр ЗБустТсю вт Ме був дедозі Ти со ще 840 ! щі5 я зв дет все дет стол ст бо тах нсАДстТстТ СПАСА Як бек жо ТЕ МиЇ сій Цей Вик З вкй 855

СЕТОСТИТос ЛАССССХТОС ДОСлААЄТИА СТОСТоАссА ссслссскат В дек ши і і ши шо ши дияни З стстаантОЄ аВАССТЄВ СоЛОЗЕсТОС АблосВогАй: СТОСАНАТТТ СТОТТНАВС зо щ сл досто тос стопосссто ТоптоласАС ТОпАТТОстТт ТСТОоЗсттоС торсосаєст 08; з шотттсверо товотолоха стосттостя. етсатотсме Во; ситосеносє стостАжстт остобооссє собстеттев СОС осттесаєт 0 жОБИ

Ф) ю схе т сис зе скати з зн ра не -х вивч і песни до до ЗАТ зі тля кон, - ад. о ТНМК ИРИА ТІНСНДУССс ТЛА ЗАТТАСТсас СстТетосАтТтТ тТОсхВОсссяє Заща б5 дАВБОСАССТ боросстюо оБАсОститА СПАТАТАНОС ДЕСОкНово соробвкнте з5БЕ зи щ 5 сввх (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 8: (Ї) Характеристики послідовності: 70 (А) Довжина: 501 амінокислота (В) Тип: амінокислотна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗБОЮ Мо: 8: | й Й Щ Щ 5 має час одна Бех Маї Ро цен єн бух ріж тер че пев с сув тую су.

Ба т ща 5

Ве Віж Ата біж бах Рто Уаії Уго Яйце біз хо біз біу Аг еп сі. ку ЖЕ З о йвр Був там Ніз Буй РЕ Пуз дів тиж Бі5 ТБ бій ВХ рух ре Важ ї5 0 45

В т с "ах ди рН ди най ку Тих щае БУЄ дар рев: ш-в ба бІу су о "рут цез беж Уві біу Шіа бах бій Вуз бе біс бер Сув бек Ве Ах. Ф з Б то тв 8о -

Мат ти іа Був тк; РНе Ве 116 Ті Няш СОУ тур Те Меб Бо ДУ. со 5 во ве ю

Зо шт вне сій дей тжр їй нев бух це: Уа БеБ Аля баб ніз ТК АБУ - то 95 ій бік уз йшр Аів.лит Маї Уві Уві Мал дев ТУЮ аг роМ пай АЛ із ч "з дує дез Тут Ти йяр Ма Чі взв ана Тих Ас чай Ма бисни є Вед " БО. во жав: - 7. Шке дія Хр Має теч деб Тер тей бів бій Шут дер йвр Ява йах раи ак що; ЖБ5 169 1 о ху ака Уа нНех Са дів Ту тТук ит них СЛУ жа ні Чай о Ата.: сту 3е) - . тут ді бІу Ай РНе чужі БУЖ МИ Те ув бі АК Же ТЯ пою Бай "щав; ше 85 в: - Й ря ке й

Ф Авю фут Аа біу тт Мбс Ре бів біу Ата Азю ія Нія лев Ах ех бо й б5

Бех ркс Авройор Ав АзроРне Уаї Вжв Май Бей Нтя ТВ бухт ле 219 515 2-20

Беж вве білу цей сек ІМ сім тіФ суб ме; вла уві сти нів її5 др 215 250: « ре ай тів Тит Рус Аби біжу П1у Дер ве бід Вго Біу бує сі без Валодях 70 вк й 25 ав;

ЧАЇ сій біу Бег їіе АТй Тук ту тн ІБ Тит бі Чаї мах тує СУБ 260 265 219 то бій ніх сій Веб АТа УЖЬ нія те РНЄ чаї дер: ЕЕ иа Уах каш с яв. 289. 85 вра Руб Баг вне Аїя На сій бує ти вну Ваг дай Деу РНе. ДН: ва з55 зва

Шут сіу тів бив тен ву Сут Ак Був деп ако Сую ден бак ЗівлОу во о: е зі5 За: с щі Тук'днй АБ БУЄ ув МебоАЄЕ но, Був Ах Ав бек йув: Меб Чу Шев; о)

Шув ТЕ Аг дів СІу Ме Рбо РБа Ат. Мах фу Нея Ук сій Ма Був. Ф зо 345. 845» 556 - тла йЯів Майї ВН Явк Тут ув вай має сію єї тів ми ве тет вве. со 55 зво З55 ю з5 "Ву Чаї Твж Кв бук бі Тбг Ява Кіз йкр Бех бін пи Бео Руб тез Як 310. 375 дай ої ІН? Мах олйк Ат ТІо іш ба йяр дія Фах та КБ: Уве» Ше Мк ч 385 з ЗБ ще 2 й "рук тТвт бр бін Аер ней сту дер баз пе туз жів сл та тв тер 7 бі: бу Аїа бех бів Бех ТхроТук йяо без Тр був сій іа гу вх 429 що йо сл ; о Тут бен век бів Кто Ак бла Во бі Лк бів пе Ази їі Арт йвд шу 0 85 ко: й 45

Фо тіж дев Май уз бехоЄШІу ПЕ ТИХ Ота АЖФ пу теш тв Ввж був ЖБх ов бін дяр рхо Шу: аБа оте вах жів дек ро СІМ Атш бли беж БіровВе: о Ба Янв рее Яви в тонні 489

Бест їлун бує пну йвросту тлр Арш Мас бує Алл. Чід ТЛНя чат вхо бо що ай й. Баш оРЕВ

Щі вав я 65 (2) Дані послідовності ЗЕО ІО Мо: 9: (Ї) Характеристики послідовності:

(А) Довжина: 1035 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: дволанцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: кКДНК (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: СО5 (В) Локалізація: 1... 1035 70 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 9:

Меб Бет де вав АХ РЕ лам цей сує: вне тив ат цей су тує бух що 55 0 НІВ ва ати Вів бух бек охо ай Рго Рие біж Ркз бі бі й це Бі; ва БяЗ я 20 йно Мут ем Ва Гуз Рко Був йія Твх- бін Сх біз Уві Буш. РКО? ВЕЖ 535 віб ни с

Зв ати Ріє Аз цем Ату Тех бес Буг йарорхео бій Нв ТИ ху Був сч 25 550 БЕ БО. 565 о тис: сто тос сто ссс са ми сао сос ттв пад Сасстос дст ЛО ДАЄ 248

Жук ен Вер Уа БІ; ев Зах Сід Боб баб Біб й5р бує Ватсон ян «ТИ КАСА СТ АКА МС ТТ ТТ АТО атт са Оса то АС Дт АОС пат вв мес ТЕ АТ був тини зе риа її Же. НІВ Бу Тер шви не: ех У: о 88 ВУ У: о щі "«АфО ТТТ БАЛАНС ТОЇ Сто ОВО йАЖ Сто сте То ос Ст са ЖеХ ех в її ве сій Авц тт» пес нЕк щує ше) ат Баш Аа фей Ніз ТБ Ву

По. Й я ПИ шик акию вашон зд ша ' « ю еАб ад СМ ОСС Ап ОЄтТА УК ЧТО ТТ САС Тбе сте оро Сто сс ся ве З7З с Бий ув яр фккш дБ Мі Майї Уа) БЖ вяв ТУ ей рко Ов) Аа ОнІВ

ЕВ вх НО БЕ5

ЖАБ тт ТАЄ асо бат Осо СТС ЛАТ АФ АОС ЗО ОТО сте бах САС дос 35 із Беж Тук Ту Ачр Вій уні Ави вер Фе дту МИХ ау КУ нія дж: -1 38 ах ща Й о сл ї (95) - 50 3е)

Ф) іме) 60 б5

ТТ БОШ яса Ата СТО БА ТО СТ со Овес Аве ОВС САД ШТ? ст сте. шк яіе ва Аж Мев Тви Ар їтхр Без бі і Буя Ажр др: Ре Бех їви; с: Ж Ве: Кс, «ФІ вжи чЧаь ня рей хія Му Тут. бас їеи біу вта Ні Уві АТа сфу

Й Ен вт: щу ; чує та су джа вени уві Буб сіу Тв Уві біи й Тієстьє біу Бош; й Ба Вт: -к ВО: з джоацт ЩО ОБО бос лтЄ СТЕ сак'воє ОС Сл втс САС ля об сте як вв ща М 200 ТЕ 70 Важ вВуо Хор й» Аів дво тре Уві дяр Уві Цец Ніз Тіш тую ТБ Ахд то па І - чле " 925 тор тт б у абс хтт БІВ А сло ато ост ТО БОС Сас ав ва то сч св Звж ра Фіу рам Яех ха би сіє біб Меє Вже Уві Яру Вів Ме дер. то: тая 748 о дес АС СО АХ бе бот ШИ: тІс Ав сх сос я СЕ сте вас БАТ 0О6В іч Бужк вто Азяп біт біу дез РНе біз йо біУу Суя біх деш йжи дар Ф зо 75 тво 755. м с. Ж Й че

Маї цес біу Бех Іе Кіа Тук ЧІ ТНЕ їбе Я Яща Уві Маі буж Суз те 765 й о

Ас АВ ССО вет ТТ ОСС ТТ СА тТОсоАсСТт БА ТОСОААТ СОС ТІ Ах й 2 с ср Бут РФ бек Яна Мія ке ін Сує ТНК ЕВ дб дл оАте Ве: Шу "» рег та о | 805:

Буша СТу Месбуз Пец дек Сух Вт Дух дж вну сСуж вав заг тра о їм во вия ща о с ТАС ОВКТ БОС АКО ДАК ВЕС ДНО АВЄ АБ Ас ДАЄ ВОС АНА АЖ ТМ: ста. тпо8

Вуз са Ах Бра ау Мас то вна дев. 55 о (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо: 10: о (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 345 амінокислот 60 (В) Тип: амінокислотна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 10: б5 -4о-

ман Бат яп Бех ба фко Цей Шеш був РБе Жжр Бек їн бує тук суз с 8 що" В ? Бе АйіасАЇв б1У бах рЕо УЯі хо не СТУ ко біб біу Яга Пев'сів, 20 28 34 дир Куй тем НЕ; Був веб. Бу хів тн іл твк сів Маї Шуз КО бег

З о. я 48 "лю лкЦ РН Ви І АК ТА Зх Був йжр вто СІ ніш бла Ір Сує рі інв во ж су

ЖЧухт Сем дет Уаі Су лів беє бів рес йти Сім дно буя бах рйе йо в 70. тв о

Мов тнЕ дій пую сни рве Бе їле ті Мія СІ дер ВЕ Мав баг 01у ве - 50 дв тів не бі5 деп бу пав, нія дув теш чаї Баг да Піо НІВ Тв Ак ва чо що сч 25 «ам ув Авр Аза Анпоуаї Уві Уаї Уаі Янр Ткр бе руб цен дів нів т2б ї28 зо сій на Тук Но лавр йїа ЧЕ дви авт бе дме Мі Уві біу Я яв Ф ї3б 5 ви ІЙ а у со щтВ дує Ажу МЕЕ бі Ар ткВ ВНУ сів Фо щуз Аяр. йво Ве. За Ше ю з5 145 155 і55 їі м віт ач Уві Ні Бей іє Сту Ту беж рец сі дій Ні Мах Аїя: БУ п то ІТ: « то «тут Аїа біу Авп ВНе Уві цуз біу тТбр Уа біу Ак Ме Ту Шу баб З с вени ЖН5 ща ;з»

Жер Бко Ага Су ге МаЄ Не ти біу Аїа дев ТЕ НІВ Бу Аку і: - 155 ХО етебся сл ши шко Ашр дяр дій дир ра туаі дав'тйі Бею НЕШОТВЕ ту тах вже

ВИЙ йб ВІ 230 Щ й оз - Бех Рре біу шен бек їіт біх Ме біп Меб бто Узі біу Нів пів дя. со ев 859 ЕЕ: 2550

Ф) іме) 60 б5 -д41-

тіесТуг Бе Ява сіу Біу Абр Рбе біп Ріо Стус сує сіу пе й дир.

Б. 25о й г Й

Маї цей біу бек 116 діа Тут Біу ббх їів Те обі Маі бай бує Сун

ЖІ. " 289. 285 в Мер пув Бко Бех бце Ку РБе Бій Сує ТК вер бег два Яку Бе бує ув ТУ Ізе Сух Цей Яех Сує А пуз Ави Агу пує дей Беж тів Су 305 Зб; я ВЕ з пут ква Ка цу був МОЄ Атс АБИ бує Кто блю бек тує мак тук аб; - х 525 839 зав уз Ти диф Вів сіу має рий Не Кг о (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо: 11: о (Ї) Характеристики послідовності: 3о (А) Довжина: 225 пар основ -- (В) Тип: нуклеїнова кислота со (С) Ланцюговість: дволанцюгова (ОБ) Топологія: лінійна Іо) (ї) Тип молекули: «дик м (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: СО5 (В) Локалізація: 1... 225 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 11: « -то ох гос дос ссо тат опо доб вто осо одо сто сто хлотос со 34 - с Же сту Бад жа Аля Тухкобуу ТБ ть АБа БІ Чай Уч був «у аж кат ас спос осв от сит ста сту ста раю ТС Сто біб ває св до 8 нев: Ану вда уво но реа вва Мав дер яв ем Уаі дар ви ЯМ ав" во Зт5 о ря лив во де; ри да ве із Су ТУ йо ше Азподуе НЯ Муж Був - Й кв яв 896. 3е) з

ФІУ ГІВ суж Бей баг буз Агб Би5 Кяво Ну СУ Ав БІ ТІВ БІУ тує щі з ве: 405 во 00» 5 Й 426 і (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо: 12: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 75 амінокислот бо (В) Тип: амінокислотна

(ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 12: й їм іш Бех Її Ай Ток СІу тн Тїє йтва ші Ме Уа був Сов ст нів іа лиш ати уні ніх пев За лі дир'єак їжи Уві Аед бій йво 70 В: В ш 50. їуз йго Шер Вве йїа БЕ БІВ був Яну во бек й ех Те пув Був я ча 45

Фу тіассув Жвй Бак бує ва: сш; дит Є ; ; -: жен сту втеосщу тує

Бо 5 ва ю пет вія БУ Буш Тіт джу Ази. Пуз Аро: Кай. Тв (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 13: Га (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 472 амінокислоти і) (В) Тип: амінокислотна (С) Ланцюговість: (ОБ) Топологія: лінійна Ге»! (ї) Тип молекули: білок «- со

ІС) ч- « ші с ;» -І 1 (95) - 50 3е)

Ф) іме) 60 б5

Її) Опис послідовності ЗЕДЧО Мо: 15 мае бій шви що вів ред пецоуаї пед тн Пен дія Уа) бкр ев; біл

Шнх ем Тв іх Яех нд бу біх Меї Бін Дія КТ» йо сіл шо Яку 23 й. 89; 70 о

Жир РЕ тла дар Ї15 СТИ ША ую рЕводІй ТЗ др тТме то СІВ вер 35 40 -Я8 18 тн Адв сію АЕр Те був нія Бай тає гго сааусмау хій сто бек Ууйх 5о І 56 -Вїа Жах був нія Ве Аяп ін дек дех бух ТЕ ва має Маї іє іх вв. т 7 во бту тар тт Уві Тр біу Неє тує бін беж Тут Уві Риб пух Бав УВІ в іа Але ой Тут Шут Яку бій Бтосаяр Бак дев Чаї Тів Маї МВ Ав й 400 105 "о о

Ятроіжв Бер ойто бла бів бій Ноя Тут РКО Ма) Зх Аїй пу тух Те Ф зо 115 хо ва: - подув Май СТУ Шів авб жі Кт Кжу ББЖ тіе дев Тер: Меє Зм сів вза со о аз5 й та.

ІС в)

Ше дя Тух Бу Пец яв АВа Май нія пев Бай сту тує Бах пев сту їм жав БО: ЕВ же ків нів дів Кі Шіу 116 Ата буд Бех Же жі Жов бух цуз Чаї дев « й 16 Ще 275 з - Жис Тйе Тих ОЇу цем оавр. веб дай о бту вго, Ав РН СІВ бує Ат ШЛЕ ха вхо Ато цею Бебг реко КЕР АБО Ята дор те Маї Ар Мах ТА нів що 195 Чо: 05 Й -І п «іх фре Тк ге Сту Беї ко Су Ам Бав тте БІУ ІМЯ ЗІБ ПИ РЕ

Фо 253 5 ' - 829 г ! Ж щи в СУ г що чай бію нав Уа аяр ті ух вже дев сім бцУ тих вне сій ро Б1У с Я а "вза 250

Жуж ней піЄ ШІ сії Кїя їіє йге Уа) Я1е Ала біз Агу Б1у теп у 59 й дав: 5 255 ко "дев уві Мер о бен Був Сух Бех Мі бів Ат б8Е ее Ні Ше: ВИК ще. 55 що бо цк о зявишяня іє тр бет їз Цей АБИ БІБ Ши два РЕО Бех Шув Аза: ук жу Су в ав вав; б5 бяп йку бує кв йий цей сСіу тує ств ліва дев фу Уві ка Аіа їв: о ши: ЗіБ 320 1 їй - ій як по су зв. ПИРЧИНЯ й Жищ шає бек цув нен тут цей Був те дшу бах бідоМес рго Ту Бут.

Шо ОО ядя ла 38: ме вне нів тук бі Чаї бух ІТ Ні бе бек бтбу ТЕ бі Ват СІ т5 З ли . 50 355 "з аб ще. - г іш бек іа Аж Кіа Во ВБе- Не Ше. ршо З Мах Бі ТЕ АШО ЩУК:

Я. ї Яру во «нг тус бат Ше пай тів бук ке ста Мах дер ІТ слу біш ев Бею о),

За5 | зво 98: об "Мей пос бує гай ту тер опув бак дяр-бек тук вне Зак Яр пек Авр. Ф з Щі й 405 ада ся

З. к -- ткр тер бах бах рго біу Ббе Кіа гі Зів Мує Т1е йхя Чаї МУ КЛ о. 425 410 ю

ХУ БТ: ТВЕ бід ух бу Угі іє РВа сує Бак дену 1: Бук Чиї Яех дя жа ін бін паху лови юні де ше « дю ів меш бід Га П1уУ пух йла ВЕБ Аа Чаї Ве ух. рує сує нів ані - г» пут вах те Яйа ле їжя бах су (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо: 14: о ; : . (Ї) Характеристики послідовності: (95) (А) Довжина: 499 амінокислот шу 20 (В) Тип: амінокислотна (С) Ланцюговість: (Че) (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 14:

Ф) іме) 60 б5 -4Б-

Ма де ТЕХ БЕЕ ото: Цеви шує РБе ех Хле ви Май кі демо сую ДМ і Бе 129 М.

Й фне їІїе бів Бед бет АК Шви бій БЕЖ Шеш Цих РЕ ій Веб ББа 8: т5 зх З «Стр вед жи мій бу лів бах би отв Мев Бує тнє реа нів пі Мак то В: й Я тдла ТЕ Мк РВЕ Шей пей бе СПУ СІВ ТВ сляв СІВ шту сує вив тів. во ще Бо, то тт ін ви ній ко ЯЗ Же ви біб бій Сук сім ре дяй дах Бех 55 бо ов во.

Жец Бто- дей ні Має Ті: іє Віє біу тр Бех Чаї дер ху Чаї її - бій да тур їхе Тер бів нев вт кі оВДа дев Бу бех бів Руо Аїд . сч 25 він рив уві кна Уа СЩу ей ау яр тив Ще Тв ббо Кіа Мі бно о лак: 125 125

Жі-е Тут тет Ті Кта Мюї дес ле тнх ВКФ Цей укі Фу це пра Уа 130 аБ | що Ф 30 ів АЛЕ рей ро Ябу фер без сів бін бету Тлі біз Шев бех йку Бтт ІЙ

Низ жах не ей ІШе Му тує бок Без СІМ йїв Ні Чаї беж біу Ре щі пої, йо 115 те «Кін б1у Бек бек їіє бі С1у Тк нія ув тіФ сту йдеш тв тв С1у « - Янка Жор Кій ДІА б1у вго дей Не тв сах Беаш-АЇА ХО; БО Ар: во 15 бу Вей фуо-квоскжи Аз Кляп ТКе Ук) Аво дів Ї1е Ніх Ше» Ве Тбг - в як 18 225 7 й хв бім нів Меб бу без Бех Хаї Ф1у Же ув Бій Веб Ще б1у нів ще й | ше "рує дар ре Тут кто вп Бу бІіу Бек Бе СІВ: ВО СТУ СПуз нів янв

Шо -445 255 55

Зещш ів пай тут кеВ сні тів дів ста нія біу Бе жен лін їЩе ТВ ші Ше: жвБ ато юю стій тк ті муз сСув бек Нів біз Арш бек Чай Ніє Бош Бе їте: яв -: Пи " вх 259 Е 395 зоб б5

Бери г й ї5 29 уз й тнЕ дей пі тух нія ча! вжу бій бін джз йо Бех Був Беж: го ув АЖ баш ня бец аї Жвт Аве Кіа бій бек Бгто бне був Маїс Тух й 340. 545 359 й зва 50 ЗБ5

Фін їни Твхо РЕВ НЕ МеЄ Боб рей пеі б1у тк шує б10 Буж мевооів тУЄ те Руб те ТНт Бай сі ув сіу гі дія зах ля дух Піх Тут і85 ! с сДНШ ков «о

Важ РМА ТА; ІЗ тет їн Дер уві Авр ті бі бів пев Ще Меб Ме с 5 І - о З о ко. дах о Ф й Чаї сід Те тів 16 Рез Тер Бех ню саду об Ат Нав Беж туш 518 кб. 45 со

Уч Бай цує тяж тів ву чні Би вла соки бін тож бів од аку Не к щі с ВИ «55: во. тяг зна Суз ЗБК ПІ ЖЯв ТНЄ Жир ха Бей спе пай Ат вЕО Тв ший йв5 . 5 т во « 47 спі пує пів Бе Чаї пуж бух Сію тів пу бек Муз Жиу Бак йувойху ше щей МВВ з

Тує тліє кн, й - (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 15: с (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 465 амінокислот і (В) Тип: амінокислотна -оУу 70 (С) Ланцюговість: (ОБ) Топологія: лінійна с (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 15: іме) 60 б5 -А7-

тіж спів уаї бує тує біз йхо Беч сіу сух вне шах лев дя бик рЕо

Й я що Ще

Зкр Бех біу ТІф ба бі йсу бго Мен Нів Жів пеб хе хр бек ро то жов вав Маї хевотТне Абу не Бец бей Ту ФБР зай бйш Ав Вже два

Же вне ста Яїа чаї Аза Вів дир Б Бах шах Тте да ту бок аа 8 ' те і 75: й до

Же був Тс Аеп Кк бух Трек джу вне те тів нія су ке тій бо - ВВ а | Б: Й

Жув СУ бін бій дей Ту» реч Азх бяп фаї Сує уз Ани Цей Рна: у щоб зав і ЗІ й лай, б. Ве Маї кої бує 18 суб УВК Сойєр Тк Пут Фіу біу' бах йхо що. 129 ч жив см тн біу тую тнж біл ків Бек бли во її ду т1а Чаї ту ка що 135 зай

Уа Аа Тут Ве У«! 625 Бве Бен бтйа ббг аза Вне ОІу туп бе го Ф зо ща5 . 150. щя5 бо - виє Аж чуаї нія Ма) тіє СТИ Нія сах паб пі дів НЕ А Мах ВУ: со - це їто щля : ю «а аж ву вк ат Тр Ап Зіу Ти жів бу йге ів бБу бу без. ї- що ща не: Той

Авт Ркго Віа бі: Рко був Бе бій сТИ СЕ Вбо бій дей чні дво пей « ю 195 20о зо5 - - дав вко даю дер-кІй пуя рРИЄ Уа ДЕР ХиХх дл ВіЖ Жбу дер пІУ да з Мао - де зов ву вто ті уаї Ро дви гу сту Ве біу Ме: бат Сів Уаї Маї бі Вів: - 225 - вва й 238 240. ти зр Ве Ве рко ва бу Біу Уа: бів Мав Вт біус св був йух о я ва 28о 5 цу . с деп жів цеч дет ба тів МЕ ОАВО БФ АБ СБУ діє Трої вау ог гц дир РНЄ да лін сух йши Нів сви длжш бек бух фун тухж бух Шок ву зво 285 о Н

Які ев бах ів УВІ Акв рко Абр сту Ріє Ата Су БВЄ го Сух Да Вб з БА 85 Коен З як дви тар вна тн КІВ делі мує сую вне ВЕБ бує Вт БВ бій Бі. 305 Зв и сх оф й ше б5 '

5 . й . дяв мах під Ом ул Ве Тут пе Ако Твж ЗТ КЯр дз: Бет Авповве й ще 35 ї зво за зве зе ти БУ Бін ба Бе ах бек гео рН біу й Шуч ОКУ бядобей муж

З зт зво «щи тує спів ті Фе руз біу ТБх Баш рує Бхо Аню бек ТИ ЖІ Важ с: Б зва й 355 я «вай пі ве лем ех Ачю Чаї йвр зх Біу Аяр Бей бів Мес бі Пує що «7 воБ. ко 8. тнє Тбж тку бух йяр вай 4 Жіє Хяб ВЖО Тк Бей ре Аж чаї. ФУ про 85 зо сч та ву уч ші Її ма сій тне дай Мах ЗМУ ув Іа вна дна бНе. з був Баг жЖто бів и Уві Ахе Сів бів Уві Мем шен сТви бно Жно Вер; Ф

Ще я яв " - сук ї !

І - (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 16: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 17 амінокислот « (В) Тип: амінокислотна (С) Ланцюговість: шщ с (ОБ) Топологія: лінійна й (ії) Тип молекули: пептид «» (у) Тип фрагмента: внутрішній (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 16: -5 Ба кв сій ші джу пай сла Аве тляй ей На тує ве то ща. пщ

М Я. о х5 о А е с щує 1 Й в -- з я

Ге (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 17: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 13 пар основ 5Б (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова (Ф) (ОБ) Топологія: лінійна ка (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' во (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 17:

ТТТТТТТТТТ ТА 13 (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 18: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 10 пар основ 65 (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова

(ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 18:

САТСААТСОС 10 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо: 19: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 23 пари основ 70 (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 19:

ТАССАСАТОС АСАСТОТААТ СТО 23 (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 20: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 20 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' сч (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 20:

САТТОТОСТО СССАСТТСТС 20 і) (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 21: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 19 пар основ Ге! зо (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова -- (ОБ) Топологія: лінійна со (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 21: ча

САСАСТССАС ССАСТОАДАС 19 (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 22: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 48 пар основ « (В) Тип: нуклеїнова кислота з с (С) Ланцюговість: одноланцюгова

Й (ОБ) Топологія: лінійна и?» (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (ЇХ) Відмітна ознака: -І (А) Ім'я/ключ: модифікована основа (В) Локалізація: 36 о (0) Інша інформація: /мод.основа - і 2) (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: модифікована основа - (В) Локалізація: 37

Ге) (0) Інша інформація: /мод.основа - і (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: модифікована основа (В) Локалізація: 41 (0) Інша інформація: /мод.основа - і

Ф) (ЇХ) Відмітна ознака: ка (А) Ім'я/ключ: модифікована основа (В) Локалізація: 42 во (0) Інша інформація: /мод.основа - і (ЇХ) Відмітна ознака: (А) ім'я/ключ: модифікована основа (В) Локалізація: 46 (0) Інша інформація: /мод.основа - і 65 (ЇХ) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: модифікована основа -БО0-

(В) Локалізація: 47 (0) Інша інформація: /мод.основа - і (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 22:

СПАСОАСПАС ПАОСОСАСОВО сСТОоСАСтТАСТ АесЗанкоЯа ММОоссММе 48 (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 23: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 28 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 70 (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 23:

САСАСАСАЄЕ ССАСССЗТО АСТАСТАЄС 78 (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 24: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 24 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 24: с

АССАССАТВИ АБАССААдОЄ СБ 24 о (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 25: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 25 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (о) (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна -- (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота со (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 25: й

ССАСТТТСАшШ ССТОАСТІСТ ТАТТС 25 - (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 26: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 21 пара основ « (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова З с (Юр) Топологія: лінійна "» (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота " (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид" (хі)

Опис послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 26: састатосСАС ТСААСОАТЕТ С -і (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 27: сл (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 22 пари основ (95) (В) Тип: нуклеїнова кислота ши 20 (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна іЧе) (ї) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО Ю Мо: 27, (2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 28: о (Ї) Характеристики послідовності: іме) (А) Довжина: 25 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 60 (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 28: 65 шснж вит АСЕ ТОСОЛ СТЕ 025

(2) Дані послідовності ХЕО ІЮО Мо: 29: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 25 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' 70 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 29:

ААСТСТОААА ОССАТОССТо СОСОП 025 (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 30: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 26 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 30:

ТтОААсОТСоО АОТОСЛАСИЗА ТІТОКЕЖ 76 (2) Дані послідовності БЕО ІЮО Мо: 31: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 24 пари основ с (В) Тип: нуклеїнова кислота о (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис. - "олігонуклеотид"' (о) (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 31: -

Ф со ормула винаходу

ІС) 1. Виділений поліпептид, кодований геном, подібним до гена ліпази (ІІ С), де вказаний поліпептид ч- (а) зв'язується з гепарином; (р) має гомологію з ліпопротеїдліпазою і ліпазою печінки людини; і (с) включає каталітичний домен масою 39 кДа сімейства триацилгліцеролліпаз, що має ЗЕО ІЮ МО: 10, « де вказаний поліпептид містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 20.6, ЗБОЮ МО: 8. - с 2. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний каталітичний домен масою 39 кДа сімейства ц триацилгліцеролліпаз має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 10. "» 3. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний виділений поліпептид має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

МО: 8 і уявну молекулярну масу близько 55 кДа. 4. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний виділений поліпептид має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ -І МО: 8 і уявну молекулярну масу близько 68 кДа за результатами електрофорезу в 1096 ДСН-ПААГ. 5. Виділений поліпептид за пп. 1-4, де вказаний поліпептид має активність фосфоліпази А. і-й 6. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний виділений поліпептид має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ о МО: 6 і уявну молекулярну масу близько 40 кДа за результатами електрофорезу в 1096 ДСН-ПААГ. шу 20 7. Виділений поліпептид за пп. 1-6, де вказаний поліпептид походить від людини. 8. Композиція, що містить поліпептид за пп. 1-7 і біологічно сумісний розчин. (Че) 9. Фармацевтична композиція, що містить поліпептид за пп. 1-7 і фармацевтично прийнятний носій. 10. Антигенний фрагмент виділеного поліпептиду за пп. 1-7, що містить послідовність ЗЕО ІО МО: 16. 11. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид за пп. 1-7. 12. Виділена нуклеїнова кислота за п. 11, якою є кКДНК. 13. Виділена нуклеїнова кислота за п. 12, де вказану нуклеотидну послідовність вибирають із групи, що

Ф, включає ЗЕО ІЮ Мо: 5, 7 і 9. ко 14. Виділена нуклеїнова кислота за п. 13, що включає нуклеотиди 252-1754 5ЕО ІЮ МО: 7. 15. Виділена нуклеїнова кислота, яка гібридизується з нуклеїновою кислотою, що має послідовність, вибрану бо з групи, що включає ЗЕО ІЮО МО: 3, 5 і 7 за умов, при яких така гібридизована нуклеїнова кислота здатна витримувати промивання в умовах високої жорсткості: 0,17555, 0,595 ДСН при 6896. 16. Виділена нуклеїнова кислота за п. 15, яка включає 20 нуклеотидів. 17. Виділена нуклеїнова кислота за п. 15, яка є антисмисловою нуклеїновою кислотою. 18. Виділена нуклеїнова кислота за п. 17, де вказана антисмислова послідовність нуклеїнової кислоти 65 оперативно зшита з областю, що регулює експресію гена. 19. Виділена нуклеїнова кислота за п. 15, що гібридизується в умовах високої жорсткості з мішенню,

Claims

вибраною з групи, що складається з нуклеотидів 44-79 БЕО ІЮО МО: З і нуклеотидів 1036-1065 ЗЕО ІЮО МО: 5.

20. Композиція, що містить нуклеїнову кислоту за п. 17 і біологічно сумісний розчин.

21. Фармацевтична композиція, яка містить нуклеїнову кислоту за п. 17 і фармацевтично прийнятний носій.

22. Вектор, що містить виділену нуклеїнову кислоту за пп. 11-14, оперативно зшиту з регуляторною ділянкою.

23. Вектор за п. 22, де вказана регуляторна ділянка отримана з гетерологічного джерела.

24. Вектор за п. 22 або 23, що є вірусним вектором.

25. Вектор за п. 24, що є аденовірусним вектором.

26. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить вектор за пп. 22-25. 70 27. Рекомбінантна клітина за п. 26, де вказаною клітиною є еукаріотична клітина.

28. Рекомбінантна клітина за п. 27, де вказаною клітиною є клітина СО5-7.

29. Композиція, що містить вектор за пп. 22-25 і біологічно сумісний розчин.

30. Фармацевтична композиція, що містить вектор за пп. 22-25 і фармацевтично прийнятний носій.

31. Спосіб одержання поліпептиду за п.1, що передбачає культивування рекомбінантних клітин за пп. 26-28, /5 В умовах, які сприяють експресії вказаного поліпептиду.

32. Поліпептид за п.1, одержаний способом за п. 31.

33. Антитіло, здатне специфічно зв'язуватися з поліпептидом за пп. 1-7 або 32.

34. Антитіло, здатне специфічно зв'язуватися з поліпептидом за п. 5 і нейтралізувати фосфоліпазну активність цього поліпептиду.

35. Антитіло за п. 33 або 34, яке є моноклональним антитілом.

36. Антитіло за п. 33 або 34, яке є поліклональним антитілом.

37. Гібридомна клітина, яка продукує антитіло за п. 35.

38. Композиція, що містить антитіло за пп. 33-36 і біологічно сумісний розчин.

39. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за пп. 33-36 і фармацевтично прийнятний носій. сч

40. Спосіб скринінгу для виявлення агоністів або антагоністів І | б-активності, що передбачає: (а) контактування потенційних агоністів або антагоністівз | о і субстратом і 1 0, і і) (Б) вимірювання здатності потенційних агоністів або антагоністів підсилювати або інгібувати С-активність, де вказаним / І 5 є поліпептид за п. 1.

41. Спосіб ферментативного гідролізу складного ефіру фосфатидилхоліну, що передбачає контактування Ге! зо вказаного складного ефіру фосфатидилхоліну з поліпептидом за пп. 1-5.

42. Спосіб поліпшення ліпідного профілю в сироватці людини або тварини, що має небажаний ліпідний -- профіль, де вказаний спосіб передбачає введення ефективної кількості фармацевтичної композиції за п. 9 або с

21.

43. Спосіб поліпшення ліпідного профілю в сироватці людини або тварини, що має небажаний ліпідний о профіль, де вказаний спосіб передбачає введення ефективної кількості фармацевтичної композиції за п. 39. ї-

44. Виділений поліпептид за п. 1, де вказаний поліпептид походить від кролика.

45. Виділений поліпептид за п. 44, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12.

46. Виділена нуклеїнова кислота, яка кодує поліпептид за п. 45.

47. Нуклеїнова кислота за п. 46, яка має послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: 11. «

48. Трансгенна миша, яка експресує поліпептид за пп. 1-5. з с ;» -І 1 (95) - 50 іЧе) Ф) іме) 60 б5