SK156397A3 - Novel variants of apolipoprotein a-i and a pharmaceutical composition containing same - Google Patents

Novel variants of apolipoprotein a-i and a pharmaceutical composition containing same Download PDF

Info

Publication number
SK156397A3
SK156397A3 SK1563-97A SK156397A SK156397A3 SK 156397 A3 SK156397 A3 SK 156397A3 SK 156397 A SK156397 A SK 156397A SK 156397 A3 SK156397 A3 SK 156397A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
apoa
nucleic acid
vector
variant
leu
Prior art date
Application number
SK1563-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerd Assmann
Patrick Benoit
Eric Bruckert
Patrice Denefle
Nicolas Duverger
Jean-Charles Fruchart
Gerald Luc
Gerard Turpin
Harald Funke
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Pasteur Institut
Univ Paris Curie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa, Pasteur Institut, Univ Paris Curie filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of SK156397A3 publication Critical patent/SK156397A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Varianty apolipoproteínu A-I a farmaceutická kompozícia, ktorá ich obsahuje . .
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka nových variantov apolipoproteínu
I
A-I. Týka sa tiež všetkých nukleových kyselín kódujúcich tieto nové varianty. Vynález sa týka najmä použitia týchto proteínov alebo nukleových kyselín v terapii. Týka sa tiež nových variantov apolipoproteínu A-I obsahujúcich najmä mutáciu v polohe 151.
Doterajší stav techniky
Apolipoproteín A-I (apoA-I) je predovšetkým zložený z lipoproteínov z vysokou hustotou (HDL), ktoré sú makromolekulárnymi komplexmi obsahujúcimi cholesterol, fosfolipidy a triglyceridy. Apolipoproteín A-I je proteín zložený z 243 aminokyselín, syntetizovaný vo ‘forme preproteínu s 267 rezíduí, majúci molekulovú hmotnosť 28 000 daltonov. Forma prepro apoA-I je syntetizovaná u človeka zároveň pečeňou a črevom. Táto forma proteínu je potom štiepená na preproteín, ktorý je sekretovaný do plazmy. Vo vaskulárnej sústave je proapoA-I transformovaný na konečný proteín (243 aminokyselín) činnosťou proteázy, ktorá je závislá na vápniku. Apolipoproteín A-I má štruktúrnu a aktívnu úlohu v metabolizme lipoproteínov: apoA-I je najmä kofaktor lecitíncholesterolacyltransferázy (LCAT), zodpovednej za esterifikáciu plazmidového cholesterolu.
Hladina cholesterolu obsiahnutého vo frakcii HDL a plazmatická koncentrácia apoA-I sú nebezpečnými negatívnymi faktormi vo vývoji aterosklerózy u človeka. Epidemiologické štúdie majú v skutočnosti ukázať koreláciu inverzie medzi koncentráciou cholesterolu HDL a apoA-I a výskytom kardiovaskulárnych ochorení (E. G. Miller et al., Lancet, 1977: 965 - 968). Oproti tomu dlhovekosť bude spájaná s vysokou, hladinou cholesterolu HDL. Nedávno bola na modeli transgénnej myši exprimujúcej ľudský apoA-I dokázaná ochranná úloha apoA-I (Rubín et al., Náture). Infúzia HDL u králikov indukuje regresiu porúch (Badimon et al., J. Clin. Invest. 85, 1990, 1234 1241). Boli navrhnuté rôzne mechanizmy na vysvetlenie vplyvu protektora HDL a tiež úlohy HDL v inverznom transporte cholesterolu (Frichart et al., Circulation, 87) 1993, 22 - 27) a činnosti antioxidantu HDL (Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354 -
364, 1994).
« Bol klonovaný a sekvenovaný gén kódujúci apoA- I (Sharpe et
f? al., Nucleic Acids res., 12 ( 9) , 1984, 3917) . Tento gén s dĺžkou
•ŕ- 1863 bp, obsahuje 4 exóny a 3 intróny. Bola tiež opísaná cDNA
kódujúca apoA-I (Law et al., P.N.A.S. 81, 1984, 66 ) . Táto cDNA
obsahuje 840 bp (viď SEQ ID č . 1) . Okrem štandardnej formy apoA-I
boli opísané rôzne prírodné varianty, ktorých rozdiely vzhladom k štandardnému v prírode sa vyskytujúcemu proteínu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
Variant Mutácia Variant Mutácia
Miláno Argl73Cys Norway Glul36Lys
Marburg Lysl07 Prol65Arg
Munster2B Alal58Glu Pro3His
Giessen Prol43Arg ArglOLeu
Munster3A AsplO3Asn Gly2 6Arg
Munster3B Pro4Arg Asp89Glu
Munster3C Pro3Arg LyslO7Met
Munster3D Asp213Gly Glul39Gly
Munster4 Glul98Lys Glul47Val
Yame Aspl3Tyr Alal58Glu
Asp213Gly Glul69Gln
Argl77His
Podstata vynálezu
Predložený vynález vyplýva z preukázania novej série variantov apolipoproteinu A-I. Táto séria variantov predstavuje najmä substitúciu rezídua arginínu v polohe 151 rezíduom cysteínu. Variant apoA-I podľa predloženého vynálezu ponúka jedinečné terapeutické vlastnosti. Má obzvlášť dôležité vlastnosti ochrany '· anti-aterogénu. V situácii extrémne nízkej hladiny cholesterolu vo frakcii HDL, spojenej s hypertriglyceridémiou, prítomnosť tohto variantu zabraňuje vývinu aterosklerózy, tak dokazuje svoju veľmi silnú ochrannú úlohu, špecifickú pre tento mutovaný apoA-I. Prítomnosť cysteínu na apoA-I podľa vynálezu spôsobuje tvorbu dimérov a ďalších komplexov tvorených disulfidickým mostíkom. Tento apoA-I sa nachádza vo voľnej forme v plazme, viazaný v diméry alebo viazaný s apolipoproteínom A-II, ktorý je ďalším dôležitým proteínom spojeným s HDL, a ktorý má tiež cysteín vo svojej sekvencií. Inak strata náboja arginínu viazaného v polohe 151 spôsobuje viditeľnosť tohto mutanta elekroizofokusáciou plazmatických proteínov imunologického objavu apoA-I.
Tieto . nové proteíny podľa vynálezu ponúkajú dôležitú terapeutickú výhodu v liečbe a v prevencii kardiovaskulárnych ochorení.
Prvý predmet vynálezu sa týka série variantov ľudského apolipoproteinu A-I obsahujúceho cysteín v polohe 151. Sekvencia aminokyselín štandardného apolipoproteinu A-I je opísaná v odbornej literatúre (viď Law Préciteé). Táto sekvencia, zahŕňajúca oblasť prepro (rezíduá 1 až 24) je reprezentovaná sekvenciou SEQ ID č.l. Charakteristika variantov podľa vynálezu vychádza teda z prítomnosti cysteínu v polohe 151 konečného apoA-I (zodpovedajúci polohe 175 v sekvencií SEQ ID č. 1) v náhrade arginínu prítomného v sekvencií štandardu. Uprednostňovaný variant obsahuje peptidovú sekvenciu SEQ ID č. 2, najmä pótoŕti péptídôvú sekvenciu obsiahnutú medzi rezíduami 68 až 267 sekvencie SEQ ID č. 1,. .rezíduum 175 je nahradené cysteínom.
Varianty pódia vynálezu sú reprezentované najmä apoA-I Paris, čiže apoA-I, ktorý má v polohe 151 cysteín vzhľadom k natívnemu apoA-I. Varianty !podla vynálezu môžu niesť ďalšiu štruktúrnu modifikáciu vzhľadom k štandardnému apolipoproteínu A-I, najmä iné mutácie, delécie alebo/a adície. Varianty podlá vynálezu zahŕňajú • tiež ďalšie mutácie vedúce k náhrade jednotlivých rezíduí cysteínom. Iný variant kombinuje prítomné mutácie vo variante apoAI Paris a apoA-I milano. Môžu tiež byť prítomné iné mutácie, ktoré
K* však nemodifikujú významným spôsobom vlastnosti apoA-I. Aktivita týchto variantov môže byť overená najmä testom na cholesterol.
Varianty podľa vynálezu môžu byť získané rôznymi spôsobmi. Môžu byť predovšetkým chemicky syntetizované vďaka technikám odborníkmi používänými na syntézu peptidov. Môžu byť tiež získané od štandardného apoA-I mutáciou alebo mutáciami. S výhodou ide o rekombinantné proteíny, získané expresiou zodpovedajúcej nukleovej kyseliny do hostitelskej bunky, ako je opísané ďalej.
Ako je naznačené vyššie, varianty podľa vynálezu sa môžu , nachádzať vo forme monomérov alebo vo forme dimérov. Prítomnosť cysteínu aspoň v sekvencií variantov vynálezu dovoľuje •ľ v skutočnosti tvorbu dimérov disulfidickou väzbou. Môže ísť o -* homodiméry, t.j. diméry zodpovedajúce dvom variantom podľa vynálezu (napr. diapoA-I Paris), alebo heterodiméry t.j. diméry obsahujúce variant podľa vynálezu a inú molekulu, ktorá má voľný cysteín (napr. apoA-I Paris: apoA-II).
Iný predmet vynálezu spočíva v nukleovej kyseline kódujúcej variant apolipoproteínu A-I, ktorý je skôr definovaný. Nukleová '' δ’'’ kyselina predloženého vynálezu môže byť kyselina deoxyribonukleová (DNA) alebo kyselina ribonukleová (RNA). V množine deoxyribonukleových kyselín môže ísť o komplementárnu DNA (cDNA), genómovú DNA (gDNA), o hybridné sekvencie alebo syntetické sekvencie alebo semisyntetické sekvencie. Môže ďalej ísť o nukleovú kyselinu modifikovanú chemicky, napr. z.pohľadu .zvýšenia svojej rezistencie k nukleázam, z pohľadu zvýšenia svojej penetrácie alebo svojho bunkového zacielenia, z pohľadu zvýšenia svojho terapeutického účinku atd’.· Tieto nukleové kyseliny môžu 'byť pôvodu humánneho, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, syntetického atď. Môžu byť získané všetkými odborníkmi známymi technikami, najmä triedením bánk, chemickou syntézou alebo enzymatickou syntézou sekvencií získaných triedením bánk.
Výhodnou nukleovou kyselinou je cDNA alebo gDNA.
Nukleová kyselina podľa vynálezu obsahuje sekvenciu SEQ ID č.
1 2. Ešte výhodnejšie ide o sekvenciu SEQ ID č. 10.
Nukleová kyselina podľa vynálezu výhodne obsahuje oblasť promótora funkčnej transkripcie v bunke alebo cieľovom organizme, rovnako ako oblasť umiestnenú na 3'konci, ktorá špecifikuje terminačný signál transkripcie a miesto polyadenylácie. Spoločne tieto elementy tvoria kazetu expresie. Môže ísť o oblasť promótora prirodzene zodpovednú za expresiu génu apolipoproteínu A-I alebo varianty apoA-I, keď je táto schopná fungovať v bunke alebo v určitom organizme. Môže tiež ísť o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedných za expresiu ďalších proteínov, dokonca i syntetických) . Môže ísť o sekvencie promótora génov eukaryotických alebo vírusových. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov vzniknutých z genómu cieľovej bunky. Spomedzi promótorov eukaryotov sa môžu používať všetky promótory alebo odvodené sekvencie stimulujúce alebo potláčajúce transkripciu génu, špecifickým = 6 spôsobom alebo nešpecifickým, induktívne alebo neinduktívne, silno alebo slabo. Môže ísť o promótory, (napr. promótor génov HPRT, PGK, vimentín, a-aktín, tubulín atď.) , promótory terapeutických génov (napr. promótor génov MDR, CFTR, Fasteur VII atď.), tkanivovo špecifické promótory (promótor génu pyruvát-kinázy, vilín, črevného proteínu väzby mastných kyselín, a-aktín hladkého svalu atď.) alebo promótory zodpovedné za stimuláciu (receptor steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej atď.). Môže ísť o sekvenciu promótorov vzniknutých z genómu vírusu, napr. ide o promótor génov E1A a MLP adenovírusov, vzápätí vyvinutý promótor CMV, promótor LTR RSV atď. Tieto oblasti promótorov môžu byť modifikované adíciou aktívnych sekvencií, regulačných sekvencií alebo sekvencií, ktoré dovoľujú expresiu tkanivovo špecifickú alebo sekvenciu majoritnú.
Nukleové kyseliny môžu tiež obsahovať signálnu sekvenciu, riadiacu syntetizovaný produkt do sekrečných ciest cieľovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť prírodná signálna sekvencia apolipoproteínu apoA-I, ale môže tiež ísť o všetky ďalšie funkčné signály sekvencie, alebo umelú signálnu sekvenciu.
Nukleová kyselina podľa vynálezu môže byť použitá na tvorbu rekombinantých variantov ApoA-I expresiou do hostiteľskej rekombinovanej bunky alebo priamo ako medikament v aplikácii génovej terapie alebo bunkovej terapie.
Na tvorbu rekombinantných variantov podlá vynálezu, nukleová kyselina je s výhodou inkorporovaná do plazmidového vektora alebo vírusového vektora, ktorý môže byť v autonómnej replikácii alebo integratívny. Tento vektor je potom použitý na transfekciu alebo infekciu vybranej bunkovej populácie. Takto získané transfekované bunky alebo bunky infikované sú kultivované za podmienok dovoľujúce expresiu nukleovej kyseliny a variant rekombinantného apoA-I podlá vynálezu je potom izolovaný. Použité hostiteľské bunky na produkciu variantov vynálezu rekombinantným spôsobom sú ako eukaryotické, tak prokaryotické. Medzi hostiteľskými eukaryotickými organizmami, ktoré vyhovujú sa môžu citovať zvieracie bunky, kvasinky, huby. Ak ide o kvasinky, môžu sa citovať rody Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces alebo Hansenula. Ak ide o zvieracie bunky môžu sa citovať COS, CHO, CI27, NIH-3T3 atď. Ak ide o huby, môžu sa citovať s výhodou Aspergillus ssp. alebo Trichoderma ssp. Ako hostiteľské prokaryotické bunky sa prednostne môžu použiť nasledujúce baktérie: Escherichia coli, Bacillus alebo Streptomyces. Variant takto izolovaný môže byť potom upravený z pohľadu svojho terapeutického použitia.
Nukleová kyselina podľa vynálezu je použitá priamo v názve medikamentu, v aplikáciách génovej terapie alebo terapie bunkovej. Z tohto pohľadu môže byť aplikovaná injekciou na úrovni miesta na ošetrenie alebo inkubáciou s bunkami vzhľadom k jej podávaniu. Bolo opísané, že nukleové kyseliny nus môžu penetrovať do buniek bez špeciálneho vektora. Aj napriek tomu sa uprednostňuj é, .v rámci predloženého vynálezu, použitie aplikovaných vektorov, dovoľujúcich vylepšenie (i) účinnosti bunkovej penetrácie, (ii) zacielenia, (iii) stability extra- a intracelulárnej.
Predložený vynález sa tak týka vektorov obsahujúcich nukleovú kyselinu, takú aká je definovaná vyššie.
Môžu sa použiť rôzne typy vektorov. Môže ísť o vírusové alebo nevírusové vektory.
Podľa vynálezu sa uprednostňuje vektor vírusový.
Použitie vírusových vektorov spočíva na prirodzených vlastnostiach transfekcie vírusov. Je tiež možné použiť adenovírusy, herpetické vírusy, retrovírusy, vírusy adenoasociováné alebo vírusy kiahní. Tieto vektory sa javia účinné z hľadiska transfekcie.
Ide najmä o adenovirusy, rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti boli charakterizované. Medzi týmito sérotypmi sa s výhodou používajú v rámci predloženého vynálezu ľudské adenovirusy typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5) alebo .adenovirusy zvieracieho pôvodu (viď prihláška vynálezu WO 94/26914) . Medzi adenovírusmi zvieracieho pôvodu . použiteľné v rámci predloženého vynálezu sa môžu citovať adenovirusy psieho, hovädzieho, myšacieho (napríklad: Mavl, Beard et al., Virology 75, 1990, 81), ovčieho, prasačieho, vtáčieho, opičieho (napríklad: SAV) pôvodu. Ak ide o adenovírus zvieracieho pôvodu, prednostne sa uvádza psí adenovírus, najmä adenovírus CAV2 (napr. kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR800)). V rámci vynálezu sa s výhodou používajú adenovirusy ľudského alebo psieho pôvodu alebo ich zmes.
Defektný adenovírus podľa vynálezu obsahuje ITR, sekvenciu· dovoľujúcu enkapsidáciu a nukleovú kyselinu. V genóme adenovírusu predloženého vynálezu, oblasť E1 je nefunkčná. Skúmanému vírusovému génu môže byť vrátená funkčnosť všetkými, odborníkmi známymi technikami, najmä úplným odstránením, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v skúmanom géne alebo skúmaných génoch. Takéto modifikácie môžu byť získané in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napr. prostredníctvom techník genetického odboru alebo úpravou prostredníctvom mutagénnych činiteľov. Môžu byť modifikované ďalšie oblasti, najmä oblasť E3 ( WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) aL5 (WO 95/02697) . V oblasti predloženého vynálezu sa s výhodou prednostne používa rekombinantný adenovírus predstavujúci deléciu celej alebo časti oblasti E1 a E4. Tento typ vektora ponúka výhodné bezpečnostné vlastnosti.
Defektné rekombinantné adenovírusy podlá vynálezu môžu byť pripravené všetkými, odborníkmi známymi technikami (Levrero et. al., Gene 101, 1991, 195, EP 185 573, Graham, EMBO J., 3, 1984,
2917). Môžu byť pripravené rekombináciou homológov medzi adenovírusmi a plazmidmi nesúcimi medzi iným aminokyselinu alebo kazetu podľa vynálezu. Rekombinantný homológ sa tvorí po >
kotransfekcii spomínaných adenovírusov a plazmidu v línii vhodných buniek. Použitá línia buniek musí predovšetkým (i) byť transformovatelná .spomínanými elementmi a (ii) obsahovať .sekvencie schopné komplementovať časť genómu defektných adenovírusov, najmä vo forme integrovanej, aby sa vyhla nebezpečenstvu rekombinácie. Ako príklad sa môže spomenúť línia ľudskej embryonálnej obličky 293 (Graham et. al., J. Gen. Virol. 36, 1977, 59), ktorá obsahuje najmä ľavú časť genómu.adenovírusu Ad5 (12 %) , včlenenú do svojho genómu. Bola opísaná ďalšia línia v prihláške vynálezu č. WO 94/26914 a WO 95/02697.
Adenovírusy, ktoré sú multiplety, sú získané a čistené podľa klasických technik molekulárnej biológie, ako je ilustrované v príkladoch.
Vírusy adenoasociované (AAV) , ide o vírusy DNA, s relatívne redukovanou velkosťou, ktoré sa integrujú do genómu buniek, ktoré infikujú stabilným spôsobom a na špecifickom mieste. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez indukcie vplyvu na rast, morfológiu alebo bunkovú diferenciáciu. Inak sa nezdá, že by boli zahrnuté v patológiách u ludí. Genóm AAV bol klonovaný, sekvenovaný a charakterizovaný. Zahŕňa okolo 4700 báz a obsahuje na každom konci opakovanú zmenenú oblasť (ITR) so 145 bázami, ktoré majú pre vírus replikačný pôvod. Zvyšok genómu je rozdelený na dve oblasti nesúce funkcie enkapsidácie: ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rep implikovaný vo vírusovej replikácii a expresii vírusových génov a pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci proteíny kapsidácie vírusu.
Použitie vektorov odvodených od AAV na transfer génov in vitro a in vivo bolo opísané v odbornej literatúre (viď najmä WO 91/18088, WO 93/09239, US 4, 797, 368, US 5, 139, 949, EP 488 528) . Tieto prihlášky vynálezov opisujú rôzne konštrukcie odvodené od AAV, v ktorých gény rep alebo/a cap sú deletované a nahradené požadovaným génom a ich použitie na prenos spomínaného požadovaného génu in vitro (na bunkách v kultúre) alebo in vivo (priamo v organizme). Rekombinantné defektné AAV podlá vynálezu môžu byť pripravené kotransfekciou v línii infikovaných buniek pomocnými ľudskými vírusmi (napr. adenovírusy), plazmidom, obsahujúcim nukleovú kyselinu alebo kazetu vynálezu ohraničenú dvoma opakovanými inverznými oblasťami (ITR) AAV a plazmidom, nesúcim gény enkapsidácie (gény rep a cap) AAV. Rekombinantné AAV produkty sú potom čistené klasickými technikami (viď najmä WO 95/06743).
Čo sa týka vírusov herpesu a retrovírusov, konštrukcia rekombinantných vektorov bola široko opísaná v odbornej literatúre: viď najmä Breakfield et al., New Biologist 3, 1991, 203, EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7, 1985, 235, McCormick, Biotechnology 3, 1985, 689 atď. Retrovírusy sú integratívne vírusy, selektívne infikujúce bunky pri delení. Tvoria tak požadované vektory pre rakovinovú aplikáciu. Génom retrovírusu zahŕňa najmä dva LTR, jednu sekvenciu enkapsidácie a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov, gény gag, pol a env sú všeobecné deletované sčasti alebo úplne a nahradené sekvenciou požadovanej heterológnej nukleovej kyseliny. Tieto vektory môžu byť realizované od rôznych typov retrovírusov, takých ako sú najmä MoMuLV („Murine Moloney Leukémia Vírus, ešte pomenovaný MoMLV), MSV („Murine Moloney Sarcoma Virus), HaSV („Harvey Sarcoma Virus), SNV („Spleen Necrosis Virus), RSV (Rous Sarcoma Virus) alebo Friendov vírus.
Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov obsahujúcich nukleovú kyselinu alebo kazetu podľa vynálezu, je konštruovaný plazmid obsahujúci najmä LTR, sekvenciu enkapsidácie a nukleovú kyselinu alebo kazeta, potom sú použité na transfekciu línie buniek nazývanej enkapsidácia, schopnej priniesť v nedostačujúcich retrovírusových funkciách do plazmidu. Všeobecné línie enkapsidácie sú tak schopné exprimovať gény gag, pol a env. Niekoľko takýchto enkapsidačných línií bolo opísaných v skorších odboroch, najmä línia PA 317 (US 4, 861, 719), línia PsiCRIP ( WO 90/02806) a línia GP+envAm-12 (WO 89/07150). Rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity rovnako ako rozsiahlu enkapsidačnú sekvenciu obsahujúcu časť génu gag (Bender et al., J. Virol. 61, 1987, 1639). Rekombinantné retrovírusy sú potom čistené klasickými technikami.
Na uvedenie predloženého vynálezu sa výhodne používajú adenovírusy alebo rekombinantné defektné petrovírusy. Tieto vektory majú v skutočnosti vlastnosti obzvlášť zaujímavé na prenos génov kódujúcich apolipoproteíny. Adenovirálne vektory podľa vynálezu sú zvlášť výhodné na priame podávanie in vivo čistej suspenzie alebo na transformáciu ex vivo buniek najmä autológnu z pohľadu ich implantácie. Adenovírusové vektory podľa vynálezu majú ďalšie dôležité vlastnosti, najmä majú veľmi vysokú infekčnú schopnosť, dovoľujúcu realizovať infekciu zo slabých objemov vírusovej suspenzie.
Z tohto pohľadu vynález sa týka predovšetkým rekombinantných defektných adenovírusov obsahujúcich DNA kódujúcu taký variant apolipoproteínu A-I, ktorý je vyššie definovaný, vložený do svojho genómu.
Obzvlášť výhodne na uskutočnenie vynálezu sa používa línia, ktorá produkuje rettovírusové vektory obsahujúce sekvenciu kódujúcu variant ApoA-I na implantáciu in vivo. Na tento účel sú použiteľné línie, najmä bunky PA317 (US 4, 861, 719), PsiCRIP ( WO 90/02806) a GP+envAm-12 (US 5, 278, 056), modifikované na umožnenie produkcie retrovirusov obsahujúcich nukleovú sekvenciu kódujúcu variant ApoA.1 podľa vynálezu.
Podľa ďalšieho aspektu vynálezu použitý vektor je vektorom chemickým. Vektor podlá vynálezu môže naozaj byť nevirusovým agensom schopným podporovať transfer a expresiu nukleových kyselín v bunkách eukaryotických. Chemické vektory alebo biochemické predstavujú zaujímavú alternatívu prirodzeným vírusom, obzvlášť z výhodných dôvodov, bezpečnosti a prípadnej neprítomnosti teoretickej limity, čo sa týka veľkosti transfekovanej DNA.
Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie, zahustiť nukleovú kyselinu na transfekciu a podporiť svoju bunkovú fixáciu rovnako ako svoj prechod cez plazmidovú membránu, v prípade potreby cez dve nukleové membrány. Potlačením polyaniónovej povahy nukleových kyselín majú nevírusové vektory celkový náboj polykatiónový.
Medzi vyvinutými syntetickými vektormi sú najvýhodnejšie katiónové polyméry typu polylyzínu (LKLK)n, (LKLK)n, polyetylénimín a DEAE dextrán alebo katiónové lipidy alebo lipofektanty. Majú schopnosť kondenzovať DNA a podporovať svoju väzbu s bunkovou membránou. Medzi naposledy menovanými sa môžu citovať lipopolyamíny (lipofekamín, transfektam atď.) a rôzne katiónové lipidy alebo lipidy neutrálne (DOTMA, DOGS, DOPE atď.). Bol vyvinutý koncept bunkovej transfekcie, riadený receptorom, ktorý využíva princíp kondenzácie DNA pomocou katiónového polyméru riadiaceho fixáciu komplexu k membráne vďaka chemickému spojeniu medzi katiónovým polymérom a ligandom receptora membrány, ktorý je prítomný na povrchu typu bunky a ktorý sa chce štiepiť. Bol tiež opísaný bunkový receptor transferínu, inzulínu alebo receptor asialoglykopretínov hepatocytov.
Vynález sa týka najmä všetkých geneticky modifikovaných buniek inzerciou nukleovej kyseliny kódujúcej variant apolipoproteínu A-I tak, ako je už skôr definované. S výhodou ide o cicavčie bunky, ktoré sú schopné podávania alebo implantovania in vivo. Môže ísť najmä o fibroblasty, myoblasty, hepatocyty, keratinocyty, endotelové bunky, epitelové bunky atď. Bunky sú prednostne pôvodu ľudského. Výhodne ide o autológne bunky, ide o bunky odobraté od pacienta, modifikované ex vivo nukleovou kyselinou podľa vynálezu z pohľadu udelenia ich terapeutických vlastností, potom sú znova podávané pacientovi.
Bunky podlá vynálezu môžu byť tkanivami primárnych buniek. Môžu byť odoberané všetkými, odborníkmi známymi technikami, potom vložené' do kultúry za podmienok, ktoré dovolujú i'ch proliferáciu. Ide najmä o fibroblasty, môžu byť ľahko získané z biopsií napr. podľa techniky opísanej Hamem (Methods Celí. Biol. 21a, 1980, 255). Tieto bunky môžu byť použité priamo na inzerciu nukleovej kyseliny vynálezu (prostredníctvom vírusového alebo chemického vektora) alebo konzervované napr. zmrazením na zariadenie autológnych bánk z pohľadu ďalšieho použitia. Bunky podľa vynálezu môžu byť sekundárnymi bunkami získanými napr. z vopred určených bánk (viď napr. EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Bunky v kultúre môžu byť infikované najmä rekombinantými vírusmi podľa vynálezu na porovnanie ich schopnosti produkovať biologicky aktívny variant apoA-I. Infekcia je uskutočňovaná in vitro, podľa odborníkmi známych techník. Najmä podľa typu použitých buniek a počtu kópií vírusov požadovanou bunkou, odborník môže prispôsobiť multiplicitu infekcie a prípadne počet realizovaných cyklov infekcie. Očakáva sa, že tieto etapy musia byť uskutočnené za prijateľných sterilných podmienok, až sú bunky pripravené na podávanie in vivo. Dávky použitého rekombinantného vírusu na infekciu buniek môžu byť prispôsobené odborníkom podľa cieľa skúmania. Podmienky už skôr opísané na podávanie in vivo môžu byť aplikované na infekciu in vitro. Na infekciu retrovírusmi je možné použiť najmä spoločnú kultiváciu buniek, ktoré chceme infikovať s bunkami produkujúcimi rekombinanté retrovírusy podľa vynálezu. Toto dovoľuje obísť čistenie retrovírusov.
Ďalší predmet vynálezu sa týka implantátu obsahujúceho cicavčie bunky geneticky modifikované inzerciou nukleovej kyseliny, ako je skôr definované a extracelulárnej matrice. Implantáty podľa vynálezu obsahujú 105 až 1O10 buniek. Ešte výhodnejšie sú implantáty, ktoré obsahujú 106 až 10® buniek. Bunky môžu byť najmä bunkami, ktoré produkujú rekombinantné vírusy obsahujúce inzertovanú vo svojom genóme nukleovú kyselinu, ktorá je už skôr definovaná. 'i
I · · *
V implantátoch vynálezu, extracelulárna matrica obsahuje želatinujúcu látku a prípadne podklad dovolujúci bunkové zakotvenie .
Na prípravu implantátov podlá vynálezu môžu byť použité rôzne typy želatinóznych látok. Tieto látky sú použité na inklúziu buniek do matrice majúce gélovú konštitúciu a na uprednostnenie zakotvenia buniek na podklad v prípade potreby. Môžu tak byť použité rôzne činidlá bunkovej adhézie, ako sú látky želatinózne, napr. kolagén, želatína, glykozaminoglykán, fibronektín, lektín atď. Výhodne sa používa v rámci predloženého vynálezu kolagén. Môže ísť o kolagén pôvodu ľudského, hovädzieho alebo myšieho. Výhodne sa používa kolagén typu I.
Ako je už skôr spomenuté, kompozícia podlá vynálezu výhodne obsahuje podklad umožňujúci zakotvenie buniek. Termín ukotvenie opisuje všetky formy biologických alebo/a chemických alebo/a fyzikálnych interakcií podnecujúcich adhéziu alebo/a fixáciu buniek na podklad. Inak bunky môžu buď byť pokryté použitým podkladom alebo môžu penetrovať k internému podkladu alebo sa môžu vyskytnúť obe možnosti. V rámci vynálezu sa s výhodou dáva prednosť použitiu pevného podkladu netoxického alebo/a biokompatibilného. Môžu sa používať najmä vlákna polytetrafluoroetylénu (PTFE) alebo podklad pôvodu biologického (koral, kosť, kolagén, atď.).
Implantáty podľa vynálezu môžu byť implantátmi z rôznych miest organizmu. Najmä to môžu byť implantáty uskutočňované na úrovni peritoneálnej kavity, v podkožnom tkanive (oblasť suprapubická, oblasť bedrovej jamky alebo oblasť slabinová) v orgáne, svale, nádore, systéme nervového centra, alebo tiež pod sliznicou. Implantáty podľa vynálezu sú výhodné najmä v tom zmysle, že dovoľujú riadiť uvoľnenie variantu ApoA-I z organizmu. Toto je predovšetkým určené· multiplicitou infekcie a počtom implantovaných buniek. Uvoľnenie môže byť riadené buď odobratím implantátu, ktorý zastavuje definitívne liečenie alebo použitím systémov regulovateľnej expresie dovoľujúce indukovať alebo potlačiť expresiu terapeutického génu.
Nukleové kyseliny vytvárajú tak nový medikament v liečení a v prevencii kardiovaskulárnych patológií (ateroskleróza, restenóza atď.) z dôvodu antiaterogénnych vlastností variantov vynálezu.
Vynález sa tiež týka všetkých farmaceutických kompozícií obsahujúcich variant apoA-I alebo/a nukleové kyseliny alebo/a vektor alebo/a geneticky modifikované bunky, ako je skôr opísané.
Predložený vynález tak ponúka nový prostriedok na liečbu alebo prevenciu patológií spojených s dislipopróteinémiou najmä v oblasti chorôb kardiovaskulárnych ako je infarkt myokardu, náhla smrť, restenóza, kardiálna dekompenzácia a príhody cerebrovaskulárne. Všeobecne tieto prístupy ponúkajú prostredníctvom terapeutického zákroku veľkú nádej v každom prípade, kde deficit genetického .usporiadania alebo metabolizmu apolipoproteinu A-I môže byť opravený.
Nasledujúce príklady bližšie ilustrujú vynález bez toho, aby v akomkoľvek smere obmedzovali jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Reštrikčná mapa plazmidu pXL2116
Obrázok 2: Konštrukcia fága M13 nesúceho exón 4 pacienta
Obrázok 3: Konštrukcia vektora nesúceho mutovaný PXL2116
Obrázok 4: Štúdia turbidimetrie v závislosti na teplote
4a: turbidimetrické spojenie rôznych ApoA-I a DPMH v neprítomnosti GndHCI štandard, rekombinanté, -ý-- plazmatický,
-□- Paris)
4b: turbidimetrické spojenie ApoA-I a DPMC v prítomnosti
GndHCI (-- štandard, rekombinanté, -<- plazmatický,
Paris)
4c: turbidimetrické spojenie ApoA-I a DPMC (-v neprítomnosti GndHCI, v prítomnosti GndHCI (0,5 M))
4d: turbidimetrické spojenie rekombinantného ApoA-I a DPMC (-- v neprítomnosti GndHCI, v prítomnosti GndHCI (0,5 M))
I
4e: turbidimetrické' spojenie plazmatického ApoÄ-I a DPMC (-v neprítomnosti GndHCI, v prítomnosti GndHCI (0,5 M))
4f: vplyv GndHCI (0,5 M) na spojenie ApoA-I/DPMC (-v neprítomnosti GndHCI, v prítomnosti GndHCI (0,5 M))
Obrázok 5: Relatívna fluorescencia frakcií Superosy 6 PG (-POPC/AIParis, POPC/AI rekombinantný, POPC/AI plazmatický)
Obrázok 6: 6a: Fluorescencia tryptofánu a koncentrácia vo fosfolipidoch pre komplex POPC/AI Paris (-- relatívna fluorescencia, -□- fosfolipidy)
6b: Fluorescencia tryptofánu a koncentrácia vo fosfolipidoch pre komplex POPC/AI rekombinantný (-- relatívna fluorescencia, -□- fosfolipidy)
SUBSTITUTE SHEET
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Dôkaz variantu ApoAI
Variant ApoA-I Paris bol identifikovaný a izolovaný od pacienta vzhľadom k jeho vlastnej lipidovej bilancii. Pacient predstavuje nasledujúcu lipidovú bilanciu (povaha odberu: sérum).
normálny
cholesterol 4.59 mmol/1 4,54-6, 97
triglyceridy 2,82 mmmol 0.74-1.71
HDL-cholesterol 0,25 mmo1/1 0,88-1,6
LDL-cholesterol 3,06 mmo1/1 2,79-4,85
apoliproteín A-I 0,5 g/1 1,20-2,15
apoliproteín B 1,38 g/1 0, 55-1,3
fenotyp apoE: 3/3
Neočakávane tento pacient nevykázal žiadnu známku aterosklerózy napriek extrémne slabej koncentrácii HDL, ani hypertriglyceridémiu. Toto vedie predkladatela k hľadaniu pôvodu tejto ochrany.
Izolácia HDL obsahujúceho ApoA-I Paris z plazmy
Nalačno (po noci) bola odobratá krv zo subjektov nesúcich gén apoA-I Paris. Plazma bola pripravená pomalou centrifugáciou krvi pri teplote 4°C (2000 g, počas 30 minút). Lipoproteíny s vysokou hustotou boli pripravené sekvenčnou ultracentrifugáciou s hustotou 1,063 - 1,21 g/ml (Havel, J. Clin. Invest. 34, 1345 - 54, 1995). Frakcie obsahujúce HDL bola potom dialyzovaná proti pufru Tris-HCl (10 mM), s pridaním 0,01 % azidu sodného, pH 7,4,
Dôkaz diméru apoA-I Páriš
Z frakcie HDL sa odstránili lipidy v zmesi dietyléter/etanol (3/1, obj./obj.), koncentrácia proteínu bola stanovená Lowryho metódou (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 - 275, 1951) . Proteíny frakcie HDL boli podrobené migrácii na polyakrylamidovom géle v prítomnosti SDS za neredukčných podmienok. Táto migrácia dovoľuje dokázať rôzne veľkosti proteínov HDL pacienta. Okrem toho prítomné proteíny zodpovedajú ApoA-I a ApoA-II normálnej veľkosti, táto analýza tiež odhaľuje prítomnosť proteínov najvyššej molekulovej hmotnosti zodpovedajúcej dimérom apoA-I a komplexom apoA-I a apoA-II. Prítomnosť apoA-I a apoA-II v týchto komplexoch bola overená špecifickou imunologickou metódou.
Dôkaz rôzneho náboja mutovaného apoA-I
Detekcia mutovaného apoA-I priamo z plazmy bola uskutočnená podľa nasledujúceho protokolu (Menzel, H. J. a Utermann, G., Electroforesis, 7, 492 - 495, 1986) : 20 ml plazmy, z ktorej boli odstránené lipidy cez noc zmesou etanol/éter, bolo rozsuspendovanej v danom pufri. 5 ml alikvotnej časti bolo podrobené elektroforéze na géle nastavovanom izoelektricky (pH 4 - 6,5, Pharmolyte), proteíny boli potom prenesené na nylonovú membránu. Pásy zodpovedajúce apoA-I boli detekované imunologickou reakciou pomocou protilátky ludského anti-apoA-I.
Detekcia mutovaného apoA-I sa môže uskutočňovať tiež z proteínu HDL. Z dialyzovanej frakcie HDL boli odstránené lipidy v zmesi dietyléter/etanol (3/1, obj./obj.) a koncentrácia proteínu bola stanovená Lowryho metódou (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 - 275, 1951). 100 ml proteínov bolo podrobených elektroforéze na géle nastavovanom izoelektricky (pH 4 - 6,5, Pharmolyte) a proteíny boli potom zviditelnené farbením s Coomassie Brilliant Blue. Táto technika dokazuje, že najdôležitejšie izoformy apoA-I pacienta, nositeľa mutácie, boli umiestnené pri anóde, tak ako zodpovedá rozdiel nábojov -1 vzhľadom k náboju normálneho apoA-I.
Príklad 2: Identifikácia génu a mutácie
Genómová DNA pacienta bola izolovaná z krvi podľa Madisenovej techniky (Madisen et al., Amer. J. Med. Genet., 27, 379 - 390, 1987). Gén apoA-I bol potom amplifikovaný technikou PCR. Z tohto hľadiska amplifikačné reakcie boli uskutočnené s 1 mg čistej genómovej DNA vloženej do nasledujúcej zmesi:
- 10 ml pufra 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl, 0,1 % (hmotnosť/obj.) želatíny)
- 10 ml dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2mM
- 2,5 U Taq - polymerázy (Perkin - Elmer)
- qsp 100 ml H2O
Sekvencie použité na amplifikácie sú nasledujúce:
Sq5490: 5' -AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3 ' (SEQ ID Č.3)
Sq5491: 5' -TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT (SEQ ID č.4)
Sq5492: 5' -CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3' (SEQ ID Č.5)
Sq5493: 5' -CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3' (SEQ ID č. 6)
Sekvencie Sq5490 a Sq5491 amplifikujú fragment 508 bp zodpovedajúci exónom 2 a 3 génu apoA-I a nástroje Sq5492 a Sq5493 amplifikujú fragment 664 bp zodpovedajúci exónu 4 tohto génu.
Boli sekvenované produkty amplifikácie (dva fragmenty PCR 508 a 664 bp). Preto bola použitá metóda priamo zahŕňajúca sekvenovanie s použitím súpravy na sekvenovanie fragmentov PCR (Amersham). Sekvencie použité na sekvenovanie sú sekvenciami PCR, ale môže tiež ísť o interné sekvencie fragmentov (porovnaj sekvencie S4, S6 a S8 viď ďalej).
Druhá technika sekvenovania zahŕňa klonovanie fragmentov PCR do vektora M13 mp28. Dvojvláknová DNA vektora M13 bola rozštiepená EcoRV a potom defosforylovaná. Fragment PCR bol upravený Klonowým fragmentom, fosforylovaný a spojený s vektorom M13. Potom boli odobraté biele oblasti a jednovláknová amplifikovaná DNA potom čistená na Catalyst (Applied Biosystem) bola sekvenovaná -20 fluorescenčnou sekvenciou (Súprava PRISM dye primer a protokol č. 401386, Applied Biosystem) alebo internými sekvenciami fragmentov. Bola použitá fluorescenčná technika dideoxynukleotidov (Súprava DyeDeoxyTerminator a protokol č. 401388, Applied Biosystem).
S8 5' -TGG GAT CGA GTG AAG GAT CTG-3' (SEQ ID č.7)
S4 5' -CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG-3' (SEQ ID č.8)
S6 5' -GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT-3' (SEQ ID č.9)
Výsledné sekvencie viacerých klonov boli potom kompilované a porovnané s ApoA-I. Konečná sekvencia aminokyselín 148 až 154 ApoAI je uvedená ďalej (zodpovedá rezíduám 172 až 178 na sekvencií SEQ ID č. 1).
ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala 151
Mutácia C—> T v prvej bázy kodónu kódujúceho aminokyselinu
151, ktorá kóduje cysteín (porovnaj sekvencie SEQ ID č. 2 viď
ďalej) bola opäť nájdená v časti sekvenovaného klonu. Táto mutácia je prítomná v heterozygotnom stave u vybraného pacienta.
Bol sekvenovaný súbor cDNA kódujúci variant apoA-I Paris podľa vynálezu. Časť tejto sekvencie je prítomná v SEQ ID č. 10.
Príklad 3: Konštrukcia vektora plazmidovej expresie (pXL2116mute)
ApoA-I Paris predstavuje mutáciu presne situovanú na sekvencií exónu 4 génu apoA-I pacienta. Stratégia konštrukcie vektora expresie spočíva v substitúcii vektora expresie apoA-I (vektor pXL2116, Obrázok 1) oblastí zodpovedajúcich exónu 4 pochádzajúcich z génu pacienta.
3.1 Použitie exónu 4 pacienta klonovaného v M13
Exón 4 bol produkovaný PCR z DNA buniek pacienta a vložený na úrovni miesta EcoRV polylinkera tága M13mp28 (Obrázok 2).
Je pozorovaná mutagenéza premiestnením fragmentu apoA-I fragmentom pochádzajúcim z M13 nesúcim mutáciu. Na výber sú enzýmy vhodné k dvom vektorom tak, aby vektor, pochádzajúci z pXL2116, vytváral kohézne konce, a na inzerciu z dvojvláknovej M13.
3.2 Výber reštrikčných enzýmov
- Bsu361 má v M13 a v pXL2116 jedinečné miesto reštrikcie proti mutácii
- Digescia BamHI, majúca jedinečné miesto reštrikcie na 3' konci apoA-I, uskutočnená technikou klonovania, majúca miesto reštrikcie v polylinkeri M13, nám dovoľuje:
1) väzbu vektora pochádzajúceho z pXL2116 a inzercie pochádzajúcej z M13
2) inkorporovať fragment polylinkera, ktorý nám bude prospešný na overenie inzercie mutovaného fragmentu, pochádzajúceho z M13, enzýmovou digesciou
Možno poznamenať, že prítomnosť tohto fragmentu polylinkera nealternuje žiadnu sekvenciu kódujúcu apoA-I, keď je situovaný po terminačnom kodóne. .
Polypeptid bohatý na histidín, ktorého nukleotidová sekvencia bola klonovaná na 5' konci apoA-I bude teda tiež syntetizovaný.
3.3 Konštrukcia vektora (Obrázok 3)
Dvojvláknový M13 je natrávený Bsu361/BamHI a produkt digescie nanesený na gél. Takto generovaná inzercia je znovu získaná v dostatočnom množstve a prítomná vo veľkosti 1 Db.
-pXL2116 je natrávený rovnakými enzýmami, ale nečistenými. Natrávenie je uskutočnené Xhol, ktorý rozpozná dve miesta reštrikcie k internému fragmentu Bsu361/BamHI na účel vyhnutia sa religácii produktov natrávenia.
. Defosforylácia, ktorá bola prv skúšaná, poskytla veľmi zlé výsledky na miske a neposkytla žiadny pozitívny kloň z 24 testovaných.
Množstvo vektora a optimálnych vložených informácií (inžertu) i na väzbu bolo odhadnuté na 50 ng vektora na 15 ng vloženej informácie (inzertu).
Kmene DH5a boli transformované s produktmi troch nasledujúcich ligandov:
vektor štiepený Bsu361 a BamHI bez ligázy (negatívna kontrola ligácie)
- produkt štiepenia + ligáza
- produkt štiepenia + inzert + ligáza
Kompetentné bunky boli transformované s pUC19, aby testovali účinnosť transformácie.
Výsledky transformovaných buniek na miske na médiu LB s chloramfenikolom (výber zo základu BL21), ampicilínom (výber zo základu zahŕňajúca plazmid) sú reprodukované ďalej.
Výsledky získané na Petriho miske
transformácia DH5a+ výsledky interpretácia
PUC19 200 klonov dôkaz trasformácie
vektor (+fragment) 0 klenov úplné štiepenie, žiadny plazmid
vektor ( + fragment)· 160 klonov šum pozadia veľmi dôležitý; 1 stratégia dodatočného štiepenia málo účinná
vektor (+fragment) +ligáza + inzert 120 klonov účinok ligázy často stály, bajktérie nie sú povinne transformované so správnou mutovanou sekvenciou
klonov je znova izolovaných z misky 4.
K opakovanej tvorbe pozitívnych klonov (majúcich vložený mutovaný fragment M13)., plazmidová DNA získaná purifikáciou na všetkých 48 klonoch je štiepená enzýmom Ndel.
Ak inzert pochádzajúci z M13 bol dobre vložený, budú na géle dva fragmenty: jeden 4,5 kb a druhý 1 kb.
Ak sa získa iný výsledok ligácie, t.j. iný produkt, získa sa buď viac pruhov alebo jednoducho lineárny plazmid (všeobecný prípad).
Podľa výsledkov na géle klony 7, 8, 13, 16, 26 sa zdajú byť správne. Vyberie sa kloň, ktorý dáva jasný výsledok.
Prítomnosť polylinkera, teda inzertu, je tak overená, ale výsledok ligácie musí byť tiež overený. Je zrejmé, že ligácia je správne uskutočnená, nakolko veľkosť plazmidu je správna, to znamená rovnaká ako je veľkosť pXL2116.
Okrem výsledku veľmi vzácnej mutácie musí byť novo klonovaná sekvencia apoA-I presná.
Kloň 8 tak nesie správne mutovaný plazmid pxl2116.
Príklad 4: Expresia rekombinantných variantov apoA-I
Tento príklad opisuje proces produkcie rekombinantých variantov apoA-I. Tento proces bol uskutočnený v baktérii. Pre tento účel boli použité ďalšie systémy expresie (kvasinky, živočíšne bunky atď.).
4.1 Princíp
Expresia plazmidu uprostred baktérie bola umiestnená pod kontrolou promótora a terminátora T7. Izoprópyl-b-tiogalaktopyranozid (IPTG), indikátor laktózového operónu, indukuje v tomto systéme syntézu RNA-polymerázy T7, ktorá sa potom špecificky fixuje na promótor T7 a spustí transkripciu génu rekombinantného proteínu. RNA polymeráza je zastavená terminátorom T7, vyhne sa tak transkripčnému toku a nepresiahne požadovanú sekvenciu.
Rifampicín je antibiotikum inhibujúce aktivitu endogénnej RNA-polymerázy baktérie E. coli. Inhibuje tak syntézu bakteriálnych proteínov, to znamená proteáz, tých, ktoré limitujú degradáciu požadovaného proteínu a bakteriálnych kontaminujúcich proteínov, takých, ktoré amplifikujú expresiu tohto proteínu.
4.2 Protokol
Základ použitý na expresiu je Escherichia coli BL21 DE3 pLys
S. Plazmidová DNA je introdukovaná dd E. čoli transformáciou podľa klasických techník. Kultúra je konzervovaná vo. forme zmrazenej suspenzie pri teplote -20°C v prítomnosti 25% glycerolu v alikvotných frakciách s objemom 500 ml.
. Inokulum je .iniciované pridaním niekoľkých kvapiek zmrazenej suspenzie do 10.ml média M9 s ampicilínom, potom inkubované cez noc pri teplote 37°C. Inokulum bolo naočkované do .jednolitrových Erlenmayerových baniek, ktoré boli umiestnené na trepačku pri teplote 37°C až do získania DO medzi 0,5 a 1 pri 610 nm. IPTG (Bachem ref Q-1280) je potom pridané v množstve, aby konečná koncentrácia dosahovala hodnoty 1 mM. Po 15 minútach inkubácie pri teplote 37 ’C sa pridá rifampicín (Sigma) v konečnej koncentrácii 100 mg/ml. Potom po jednej hodine kultivácie sa bunky znovu získajú centrifugáciou (15 minút, 800 rpm) a expresia sa overí elektroforézou za denaturačných podmienok na 15% akrylamidovom géle a imunopijakovaním.
Získané výsledky ukazujú, že mutovaný proteín sa exprimuje podľa dobrého expresného pomeru a že je efektívne dokázaný polyklonovanými protilátkami anti-apoA-I.
Príklad 5: Čistenie rekombinantných variantov apoA-I
Tento príklad opisuje účinnú metódu dovoľujúcu čistiť rekombinantné varianty apoA-I podľa vynálezu. Predpokladá sa, že môžu byť použité i ďalšie metódy.
Proteíny, ktoré sú exprimované v cytoplazme baktérie Escherichia coli, sa najprv extrahujú a potom sa uskutoční bunková lýza a nasleduje eliminácia nukleových kyselín.
5.1 Lýza baktérií
Po odstredení buniek bakteriálny sediment je resuspendovaný za mierneho miešania v pufri v prítomnosti proteázových inhibítorov a β-merkaptometanolu, aby prebehla lýza.
β-merkaptometanol je redukčné činidlo štiepiace disulfidické mostíky vytvorené medzi dvoma cysteínmi. Netvorí sa žiadny disulfidický mostík v cytoplazme baktérie Escherichia coli, prítomnosť redukčného činidla sa teraz ukazuje nevyhnutná pre už raz extrahované proteíny. Pridanie β-merkaptometanolu do pufra na lýzu naozaj umožňuje zabrániť tvorbe mostíkov medzi cysteínom bakteriálneho proteínu a cysteínom rekombinantných proteínov.
Bunkový lyzát sa získa 3-krát 5 minút sonifikáciou v mraze (Vibracells sinics materiál, móde pulsed, output control 5) , potom sa scentrifuguje (10000 rpm, 1 hod, 4°C na Beckman J2-21 M/E, rotor JA10) a potom sa môžu eliminovať zvyšky buniek. Množstvo proteínu sa určí zo supernatantu kolorimetrickou metódou podľa Bradforda.
5.2 Precipitácia nukleových kyselín
Precipitácia je realizovaná zo supernatantu lýzy roztokom 10 % streptomycín sulfátu v pomere 10 ml na 10 g proteínov za jemného magnetického miešania počas jednej hodiny a pri teplote 4 °C. Nukleové kyseliny sa eliminujú centrifugáciou pri 10000 rpm (1 hod, 4 °C na Beckman J2-21 M/E, rotor JA10) a koncentrácia proteínu v supernatante sa určí kolorimetrickou metódou.
Z týchto vzniknutých dvoch stupňov sa získa proteínový roztok so známou koncentráciou, v ktorom sú spolu zahrnuté všetky intracelulárne proteíny, medzi ktorými je aj požadovaný proteín. Tieto proteíny boli čistené chromatografickými metódami.
- chromatografia filtráciou na géle
- afinitná chromatografia
5.3 Chromatografia filtráciou na géle 'Cieľom tejto1 etapy je odstránenie EDTA, molekuly interferujúcej s požadovanými podmienkami pre afinitnú chromatografiu. Preto sa používa ako nosič tris-akryl GF 05 (Sepracor). Tento gél dovoľuje separáciu molekúl, ktorých molekulová hmotnosť (MM) je zahrnutá medzi hodnoty 300 až 2500 daltonov, a vylúčenie molekúl, vrátane proteinov, s molekulovou hmotnosťou na hornej hranici, t.j. 2500 daltonov. Tento gél, predstavujúci ďalšiu časť záujmu, má dobrú odolnosť voči tlaku, čo dovoľuje pracovať od začiatku metódy pri zvýšenom tlaku, bez modifikovania metódy. Chromatografia bakteriálneho lyzátu sa realizuje vo fosfátovom pufri pH 8. Proteínová koncentrácia vo vylúčenom objeme sa určí a upraví na 4 mg/ml rozpustením vo fosfátovom pufri pH 8.
Táto etapa môže byť nahradená dialýzou oproti 2 x 10 litrom PBS. Proteínový roztok sa potom nechá v prítomnosti Hecameg 25 mM, tento detergent napomáha nasledujúcej etape čistenia znížením interakcií proteín-proteín.
5.4 Afinitná chromatografia
Princíp
Prítomnosť šiestich po sebe idúcich rezíduí histidínu spojených s rekombinantným proteínom dáva tomuto proteínu afinitu, ktorá je čiastočne zvýšená niklovými iónmi (Ni2+) (15) . Tieto ióny Ni2+ sú fixované k matrici agarózy prostredníctvom kyseliny nitrilooctovej (NTA). Medzi imidazolom histidínu a niklovými iónmi sa tvorí kovochelátová väzba, táto väzba je silnejšia než väzba iónová a slabšia ako väzba kovalentná.
Protokol
Schopnosť fixácie agarózového gélu NiNTA (Qiagen) je 2 mg proteínu na 1 ml gélu. Tento gél je ekvilibrovaný v pufri pH 8 pridaním 25 mM Hecameg. Bakteriálne kontaminujúce proteíny nie sú zachytené pri pH 8, sú eliminované pri pH 6 a požadovaný proteín je získaný pri pH 5. Tieto etapy sú uskutočnené v prítomnosti 25 mM Hecameg.
Eluované frakcie (2 ml) pri pH 5 sú pridané k:
- 60 μΐ 1 M NaOH (neutralizácia)
- 10 μΐ 0,2 M PMSF
- 40 μΐ 0,1 M EDTA
Frakcie sú spojené vzhľadom ku . koncentrácii a čistote eluovaného proteínu. Tieto charakteristiky sa analyzovali elektroforeticky (15 % PAGE-SDS).
El'úciou pri pH 5 sa získajú proteíny s niklom, ktorý je účinný vo väzbe Ni2+-NTA. Je tak nevyhnutné disociovať katión rekombinantného proteínu. Táto etapa je uskutočnená kompetíciou vďaka inkubácii za mierneho miešania na magnetickom miešadle pri teplote 4 °C počas jednej hodiny v prítomnosti 50 mM histidínu.
5.5 Dialýza
Dialýza dovoľuje eliminovať histidín a nikel. Vzorka sa dialyzuje (membrána Spectra/por MWCO 12-14000 daltonov) pri teplote 4 °C počas 5 hodín cez noc oproti 2 x 10 litrom 2 mM pufra PBS EDTA. Nakoniec sa určí množstvo proteínu.
Táto metóda dovoľuje získať protein apoA-I Paríš v čistej forme, najmä bez kontaminovaných proteínov.
Príklad 6: Fyzikálno-chemické vlastnosti apoA-I Paris a normálnych rekombinantých apoA-I.
6.1 Turbidimetrické merania
6.1.1 Turbidimetria ako funkcia teploty
Meranie absorbancie DMPC pri 325 nm v prítomnosti apoA-I je meranie tvorby proteolipidových komplexov s malou veľkosťou. Analýza zmeny teploty medzi 19 - 28 °C nám ukazuje zníženie absorbancie okolo teploty premeny fosfolipidov (23 °C) , čo svedčí o tvorbe komplexov. Obrázok 4 (v prítomnosti alebo neprítomnosti Gdnhdl na vyhnutie sa tvorbe dimérov) ukazuje porovnanie tvorby týchto komplexov s normálnym apoA-I a rekombinantným apoA-I Paris, rovnako tiež natívnym apoA-I. Tieto tri proteíny majú správanie dosť podobné, ale u apoA-I Paris je možné všimnúť si jeho sklon k spojeniu so samým sebou za vzniku dimérov.
6.1.2 Turbidimetria ako funkcia času
Pokles turbidimetrie DMPC po inkubácii apoA-I súvisel s danou teplotou ako funkcia času v prítomnosti alebo neprítomnosti GdnHDL. Teplotná konštanta (l/tl/2, ktorá zodpovedá 50% klesaniu počiatočnej turbidimetrie) je odhadnutá ako funkcia 1/T (teplota v stupňoch Kelvina). Rýchlosť spájania je rýchla pre natívny apoAI, slabšia pre rekombinantný apoA-I, najmä potom, pre apoA-I Paris. Inak pridanie GdnHDL zvyšuje väzbu proteín-lipidy. Tento spôsob je veľmi dôležitý pre rekombinantný apoA-I, najmä pre apoA-I Paris.
6.2 Emisné spektrá fluorescencie tryptofánu
Emisné spektrá fluorescencie tryptofánu v rôznych apoA-I boli merané pri vlnových dĺžkach 300 a 400 nm (excitácia pri 295 nm) . Maximálna emisia je uvedená v Tabuľke 1 pre apoA-I a pre komplexy apoA-I/cholesterol/POPC. Maximálna emisia fluorescencie tryptofánu v rôznych apoA-I a komplexoch sú totožné a naznačujú, že tryptofány sú v rovnakom prostredí v týchto troch proteínoch.
Tabuľka 1
Produkt Maximálna emisia
Al Paris 335
POPC/C/AI Paris 332
rekombinantné Al 334
POPC/C/AI rec 332
Al plazma 336
.POP.C/C/AI plazma. 333 .
6.3 Izolácia a charakteristika komplexov apoA-I/lipidy
Komplexy s apoA-I a POPC boli pripravené chelátovou technikou. Komplexy apoA-I boli separované chromatograficky gélovou filtráciou na kolóne Superose 6PG a ich zloženie sa analyzovalo. Profily gélovej filtrácie sú vyznačené na Obrázku 5. Samotný homogénny pík sa. získal pre komplexy vytvorené s natívnym apoA-I, kým s rekombinantným apoA-I sa pozorovali heterogénne populácie. Voľné apoA-I sa eluujú vo frakciách 20 až 24. Koncentrácia fosfolipidov a fluorescencia frakcií tryptofánov pre rôzne komplexy sú ukázané na Obrázku 6.
Príklad 7: Konštrukcia adenovírusového vektora na expresiu mutovaného ApoA-I cDNA kódujúca variant podľa vynálezu obsahujúca mutáciu Arg Cys v polohe 151 ApoA-I je získaná pomocou PCR.
Použité sekvencie:
Alml: AT C GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (SEQ ID č.11)
Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (SEQ ID Č.12)
Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (SEQ ID Č.13)
Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (SEQ ID Č. 14)
Sekvencie Alml a Alm4 vkladajú Call na 5' a Sali na 3' cDNA, kým sekvencie Alm2 a Alm3, ktoré sú komplementárne vkladajú mutáciu. Reakcia PCR s dvojicami Alml-Alm2 a Alm3-Alm4 je najprv uskutočnená na cDNA nemutovaného ApoA-I. Fragmenty vzniknuté z PCR sa potom znovu vložia do tretej PCR v prítomnosti Alml a Alm4, ktoré vytvárajú fragment 822 pb ktorý je potom klonovaný v pCRII (Invitrogen) na účel· overenia sekvencie. Fragment Clal/Sall, ktorý obsahuje mutovanú cDNA sa potom vloží na rovnaké miesto reštrikcie do vektora pXL-RSV-LPL, ktorý obsahuje cDNA LPL pod kontrolou promótora LTR-RSV a do polyadenylovej polohy bovínneho rastového hormónu, čím sa nahradí cDNA LPL (FR9406759) . Takto sa môže použiť tiež iný vektor. Výsledný vektor je potom uvoľnený a kotransfekovaný do 293 na účel získania rekombinantného adenovírusu. Adenovírusy takto získané môžu byť amplifikované, čistené (najmä chloridom céznym), potom konzervované zmrazením, napr. v glycerole. Na ich terapeutické využitie, môžu byť zmiešané s farmaceutický vhodným vehikulom. Môže ísť najmä o roztoky solí (fosforečnan sodný, fosforečnan disodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý alebo horečnatý atď. Alebo zmesi týchto solí), sterilné, izotonické alebo suché kompozície, najmä lyofilizované, ktoré pridaním, podlá okolností sterilnej vody alebo fyziologického roztoku, poskytujú injikovatelnú konzistenciu. Na použitie na liečbu patológií spojených s dyslipoproteinémiou, rekombinatné defektné adenovírusy podľa vynálezu môžu byť aplikované podľa rôznych spôsobov, najmä vnútrožilovou injekciou. Sú injikované na úrovni vrátnicovej žily. Dávky použitého vírusu na injekciu' môžu byť prispôsobené rôznym parametrom, najmä spôsobu použitého podávania, parametrom týkajúcich sa patológií, alebo tiež a doby skúmaného liečenia. Rekombinantné vírusy podľa vynálezu sú formulované a podávané vo forme dávok obsahujúcich medzi 104 a 1014 pfu/ml. Na AAV a adenovírusy sa môžu použiť dávky od 106 a 1O10 pfu/ml.
Termín pfu („plaque forming unit) zodpovedá infekčnej schopnosti vírusovej suspenzie a určuje infekciu .prispôsobenej bunkovej kultúry meraním počtu infikovaných buniek po 48 hodinách. Techniky určenia titru pfu vírusového roztoku sú dobre opísané v odbornej ' literatúre.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) podávateľ:
(A) Meno: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) Ulica: 20, Raymond ARON (C) Mesto: ANTONY (D) Štát: Francúzsko (E) Smerovacie číslo: 92165 (i) podávateľ:
(A) Meno: UNIVERSITE PIERRE ET MÁRIE CURIE (B) Ulica:
(C) Mesto:
(D) Štát: Francúzsko (E) Smerovacie číslo:
(i) podávateľ:
(A) Meno: INŠTITÚT PASTEUR DE LILLE (B) Ulica:
(C) Mesto:
(D) Štát: Francúzsko (E) Smerovacie číslo:
(ii) názov vynálezu: Varianty apolipoproteínu A-I a farmaceutická kompozícia, ktorá ich obsahuje (iii) počet sekvencií: 14 (iv) spôsob čítania počítačom:
(A) Typ nosiča: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) systém využitia: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 842 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna
(ii) typ molekuly: cDNA
(iii) i hypotetický: Nie
(iv) antimediátorová: Nie
(Vi) pôvod:
(A) organizmus: Homo sapiens
(ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1.. . 842
(C) ďalšie informácie:/produkt=ludská apoA-I cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.l:
ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG CTC TTC CTG ACG GGG
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr .Gly
1 : 5 10 15
AGC CAG GCT CGG CAT TTC TGC CAG CAA GAT GAA CCC CCC CAG 87
Ser Gin Ala Arg His Phe Trp Gin Gin Asp Glu Pro Pro Gin
20 25
AGC CCC TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG GCC ACT GTG TAC GTG 129
Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val
30 35 40
GAT GTG CTC AAA GAC AGC GGC AGA GAC TA.T GTG TCC CAG TTT 171
Asp Val Leu Lys A.sp Ser Gly Arg A.sp Tyr Val Ser Gin Phe
45 50 55
GAA GGC TCC GCC TTG C-GA AAA CAG CTA AAC CTA AAG CTC CTT 213
Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gin Leu Asn Leu Lys Leu Leu
60 65 70
GAC AAC TGG GAC AGC GTC- ACC TCC ACC TTC AGC AAG CTG CGC 255
A.sp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg
80 85
GAA CAC- CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG C-AT AAC CTG 297
Glu Gin Leu Gly Pro Val Thr C-ln Glu Phe Trp Asp Asn Leu
90 95
GAA AAG GAG ACA GAG r*/τ' CTG AGG CAG GAG ATC AGC AAG GAT 339
Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg C-ln Glu Met Ser Lys Asp
100 105 110
CTG GAG GAG GTG AAG GCC AAC- GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC 381
Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gin Pro Tyr Len Asp Asp
115 120 125
TTC CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG 423
Phe Gin Lys Lys Trp Gin Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gin
130 135 140
AAG GTG GAG CCG . CTG CGC GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC 465
Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gin Glu GLy Ala Arg
145 150 155
CAG AAG CTG CAC GAG CTG CA» GAG AAG CTG AGC CCA CTG GGC 507
Gin Lys Leu His Glu Leu Gin Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly
160 165
GAG GAG ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC CAT GTG GAC GCC CTG 549
Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu
170 175 180
CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC GAG CTG CGC CAG CGC 591
Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gin Arg
185 190 195
TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG AAC GGC GGC C-CC 633
Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala
200 205 210
AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG AGC 675
Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser
215 220 225
ACG CTC AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC 717
Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg
230 235
CAA GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC TTC 759
Gin Gly Leu Leu Pro Val •Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Pne
240 245 250
CTG AGC GCT CTC GAG GAG TAC ACT AAG AAC- CTC AAC ACC CAG 801
Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr C-ln
255 260 265
cDNA
TGA GGCGCCCGCC GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA 842 *
(2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 párov báz (B) typ: nukleotid (G) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: Nie (iv) antisense: Nie (vi) pôvod:
(A) organizmus: Homo sapiens (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...21 (C) ďalšie informácie:/produkt=Iudská apoA-I (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.2:
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala 15 (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(C) ďalšie informácie:/produkt=Sq5490 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č. 3:
AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.4:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=Sq5491 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č. 4:
TTCAACATCA TCCCACAGGC CTCT (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.5:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 20 párov báz
(B) typ: nukleotid
(C) počet vláken: jedno
(D) konfigurácia: lineárna
(ii) typ molekuly: cDNA
(ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=Sq5492 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.5:
CTGATAGGCT GGGGCGCTGG (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.6:
' (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 20 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=Sq5493 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.6:
CGCCTCACTG GGTGTTGAGC (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.7:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=S8 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.7:
TGGGATCGAG TGAAGGACCT G (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.8: (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=S4 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.8:
CGCCAGAAGC TGCACCAGCT G (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.9:
(i) charakteristika sekvencie: ' (A) dĺžka: 21 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika: i (D) ďalšie informácie:/produkt=S6 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.9:
GCGCTGGCGC AGCTCGTCGC T (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.10:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 603 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (vi) pôvod:
(A) organizmus: Homo sapiens (ix) charakteristika:
(A) meno/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...603 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.10:
CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC TTC 42
Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr The
1 5 10
AGC AAG CTG CGC GAA CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC 84
Ser Lys Leu Arg Glu Gin Leu Gly Pro Val Thr C-ln Glu Phe
15 20 25
TGG C-AT AAC CTG GAA AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG 12 6
Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gin C-lu
30 35 40
ATG AGC AAG GAT CTG GAG GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC 163
Met Ser Lys Asp Leu Glu GLu Val Lys Ala Lys Val Gin Pro
45 50 55
TAC CTG GAC GAC TTC CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAC- ATG GAG 210
Tyr Leu Asp Asp Phe Gin Lys Lys Trp Gin Glu C-lu Met Glu
60 65 70
CTC TAC CGC CAG AAG GTG GAG CCG CTG CGC GCA C-AG CTC CAA 252
Leu Tyr Arg Gin Lys Val Glu Pro Leu A_rg Ala Glu Leu Gin
75 80
GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG CTG CAA GAG AAC- CTC- 294
Glu Gly Ala Arg Gin Lys Leu His Glu Leu Gin Glu Lys Leu
85 90 95
AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT 336
Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His
100 105 110
GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC GAG 373
Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu
115 120 125
CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG 420
Leu Arg C-ln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ara Leu Lys Glu
130 135 140
AAC GGC GGC GCC AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC 462
Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr
145 150
GAG CAT CTG AGC ACG CTC AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC 504
Glu KÍ 5 Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu
155 160 165
GAG GAC CTC CGC CAA C-GC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC 546
Glu Asp Lsc. Arg C-ln Gíy Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe
170 175 180 i
AAG GTC AGC TTC CTG AGC GCT CTC GAG GAG TAC AC.T AAG AAG 588
Lys Val Ser Phe Leu Ser Äla Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys
185 190 195
CTC AAC ACC CAG TGA 603
Leu Asn Thr Gin X
200 (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.11:
(i) charakteristika sekvencie:
1 (A) dĺžka: 30 párov 'báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=alml (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.11:
ATCGATACCG CCATGAAAGC TGCGGTGCTG (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.12: (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 30 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cĎŇÁ (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=alm2 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.12:
ATGGGCGCGC GCGCAGTCGC GCATCTCCTC (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.13:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 30 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=alm3 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.13:
GAGGAGATGC GCGACTGCGC GCGCGCCCAT (2) Informácie pre sekvenciu SEQ ID č.14:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 30 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:
(D) ďalšie informácie:/produkt=alm4 (xi) opis sekvencie: SEQ ID č.14:
GTCGACGGCG CCTCACTGGG TGTTGAGCTT

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Variant ľudského apolipoproteínu A-I obsahujúci cysteín v pozícií 151.
  2. 2. Variant podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptidovú sekvenciu SEQ ID č.2.
  3. 3. Variant podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že variantom je apoA-I Paris.
  4. 4. Variant podľa nároku 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že variantom je rekombinantný protein.
  5. 5. Variant podľa nároku 1 až 4 vo forme diméru.
  6. 6. Variant podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že variantom je homodimér.
  7. 7. Nukleová kyselina kódujúca variant apolipoproteínu A-I podľa jedného z predchádzajúcich nárokov.
  8. 8. Nukleová kyselina podlá nároku 7, vyznačujúca sa t ý m, že nukleovou kyselinou je cDNA.
  9. 9. Nukleová kyselina podlá nároku 7, vyznačujúca sa t ý m, že nukleovou kyselinou je gDNA.
  10. 10. Nukleová kyselina podľa nároku 7, vyznačujúca sa t ý m , že nukleovou kyselinou je RNA.
  11. 11. Nukleová kyselina podľa nároku 7 až 9, vyznačujúca sa t ý m, že obsahuje sekvenciu nukleotidov SEQ ID č.2.
  12. 12. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nárokov 7 až
  13. 13. Vektor podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m, že vektorom je vírusový vektor.
  14. 14. Vektor podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že vektorom je chemický vektor.
  15. 15. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci DNA kódujúci variant apolipoproteínu A-I podľa nároku I, vložený do svojho genómu.
  16. 16. Bunka ,geneticky modifikovaná podľa nároku 7.
    vložením nukleovej kyseliny
  17. 17. Implantát obsahujúci cicavčie bunky geneticky modifikované vložením nukleovej kyseliny podľa nároku 7 a extracelulárnu matricu.
  18. 18. Farmaceutická kompozícia obsahujúca variant apolipoproteínu A-I podľa nárokov 1 až 6 alebo/a nukleovú kyselinu podľa nároku 7 alebo/a vektor podľa nároku 12 alebo/a geneticky modifikovanú bunku podlá nároku 16.
SK1563-97A 1995-05-22 1996-05-20 Novel variants of apolipoprotein a-i and a pharmaceutical composition containing same SK156397A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9506061A FR2734568B1 (fr) 1995-05-22 1995-05-22 Nouveaux variants de l'apolipoproteine
PCT/FR1996/000747 WO1996037608A1 (fr) 1995-05-22 1996-05-20 Nouveaux variants de l'apolipoproteine a-i

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK156397A3 true SK156397A3 (en) 1998-07-08

Family

ID=9479241

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1563-97A SK156397A3 (en) 1995-05-22 1996-05-20 Novel variants of apolipoprotein a-i and a pharmaceutical composition containing same

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0827538A1 (sk)
JP (1) JPH11505712A (sk)
KR (1) KR19990021828A (sk)
AU (1) AU717202B2 (sk)
BR (1) BR9608813A (sk)
CA (1) CA2218759A1 (sk)
CZ (1) CZ291376B6 (sk)
FR (1) FR2734568B1 (sk)
HU (1) HUP9802926A3 (sk)
IL (1) IL118336A0 (sk)
MX (1) MX9708727A (sk)
NO (1) NO975367L (sk)
SK (1) SK156397A3 (sk)
TW (1) TW434260B (sk)
WO (1) WO1996037608A1 (sk)
ZA (1) ZA964097B (sk)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6004925A (en) 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6046166A (en) 1997-09-29 2000-04-04 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6518412B1 (en) 1997-09-29 2003-02-11 Jean-Louis Dasseux Gene therapy approaches to supply apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6037323A (en) 1997-09-29 2000-03-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
AU2001245622A1 (en) * 2000-03-13 2001-09-24 Amgen Inc. Apo-a-i regulation of t-cell signaling
CN1268641C (zh) 2000-11-10 2006-08-09 普罗蒂奥制药公司 载脂蛋白类似物
US8119590B2 (en) 2001-09-28 2012-02-21 Cedars-Sinai Medical Center Prevention and treatment of restenosis by local administration of drug
US7223726B2 (en) * 2002-01-14 2007-05-29 The Regents Of The University Of California Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same
CA2486127C (en) 2002-05-17 2014-03-11 Esperion Therapeutics, Inc. Method of treating dyslipidemic disorders
ES2376875T3 (es) 2003-02-14 2012-03-20 Children's Hospital & Research Center At Oakland Vehículo de administración de fármacos lipofílicos y métodos de utilización del mismo
EP1732383A4 (en) 2004-04-06 2007-05-02 Cedars Sinai Medical Center PREVENTION AND TREATMENT OF VASCULAR DISEASES WITH VIRUS VECTORS ASSOCIATED WITH RECOMBINANT ADENOVIRUS CODING APOLIPOPROTEIN A-I AND APOLIPOPROTEIN A-I MILANO
KR100560102B1 (ko) 2004-06-25 2006-03-13 한국생명공학연구원 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제
WO2006012632A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Xencor, Inc. Apolipoprotein a-1 derivatives with altered immunogenicity
KR100725642B1 (ko) * 2006-01-20 2007-06-07 충남대학교산학협력단 저밀도 지단백질에 대해 항산화성을 갖는 펩타이드
MX2008015337A (es) 2006-06-01 2009-11-26 Inst Cardiologie Montreal Metodo y compuesto para el tratamiento de estenosis valvular.
US8268796B2 (en) 2008-06-27 2012-09-18 Children's Hospital & Research Center At Oakland Lipophilic nucleic acid delivery vehicle and methods of use thereof
CN102239260B (zh) * 2008-10-03 2017-04-12 库尔纳公司 通过抑制针对载脂蛋白‑a1的天然反义转录物治疗载脂蛋白‑a1相关疾病
NZ594516A (en) 2009-02-16 2012-12-21 Cerenis Therapeutics Holding Sa Apolipoprotein a-i mimics
CN105288589A (zh) 2011-02-07 2016-02-03 塞勒尼斯医疗控股公司 脂蛋白复合物及其制备和用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9103701D0 (sv) * 1991-12-13 1991-12-13 Kabi Pharmacia Ab Apolipoprotein
FR2704556B1 (fr) * 1993-04-30 1995-07-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique.

Also Published As

Publication number Publication date
NO975367D0 (no) 1997-11-21
AU717202B2 (en) 2000-03-23
AU5904896A (en) 1996-12-11
WO1996037608A1 (fr) 1996-11-28
HUP9802926A2 (hu) 1999-03-29
BR9608813A (pt) 1999-02-17
HUP9802926A3 (en) 2001-08-28
IL118336A0 (en) 1996-09-12
FR2734568A1 (fr) 1996-11-29
ZA964097B (en) 1996-12-06
NO975367L (no) 1997-11-21
CZ291376B6 (cs) 2003-02-12
EP0827538A1 (fr) 1998-03-11
MX9708727A (es) 1997-12-31
TW434260B (en) 2001-05-16
FR2734568B1 (fr) 1997-06-20
CA2218759A1 (fr) 1996-11-28
CZ367197A3 (cs) 1998-03-18
JPH11505712A (ja) 1999-05-25
KR19990021828A (ko) 1999-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK156397A3 (en) Novel variants of apolipoprotein a-i and a pharmaceutical composition containing same
US6258596B1 (en) Variants of apolipoprotein A-I
EP1049767B1 (en) A transgenic rabbit that expresses a functional human lipoprotein (a)
AU595640B2 (en) Modified c-dna sequence for factor 8c
AU692196B2 (en) Translational enhancer DNA
JP2003530064A (ja) 遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルス−ベクター
CA2224114A1 (en) Synthetic mammalian chromosome and methods for construction
JPH11510389A (ja) 細胞タンパク質の機能を不活性化するためのタンパク質−タンパク質相互作用表面の拡張
CN100357433C (zh) 可用于基因治疗和治疗性筛选的eNOS突变
CN114929735A (zh) 因子viii构建体
AU6228494A (en) Methods for promoting cartilage matrix formation
Lorenzo et al. Protein 4.1 deficiency associated with an altered binding to the spectrin-actin complex of the red cell membrane skeleton.
CA2343099C (en) Role of human kis (hkis) as an inhibitory kinase of the cyclin-dependentkinase inhibitor p27. compositions, methods and uses thereof to control cell proliferation
Schofield et al. Regions of human chromosome 2 (2q32–q35) and mouse chromosome 1 show synteny with the pufferfish genome (Fugu rubripes)
Germain-Lee et al. NVL: a new member of the AAA family of ATPases localized to the nucleus
KR100403893B1 (ko) 글루타메이트 디 카르복실라제(gad) 활성을 암호화하는 재조합바이러스
US6894154B2 (en) hKIS compositions and methods of use
JP3606536B2 (ja) ウイルス複製抑制剤
AU754272B2 (en) Adenoviral transfer vector for the gene transport of a DNA sequence
WO1994028151A1 (en) Gene therapy for haemophilia
CN1413251A (zh) 新的分布在内质网的蛋白质和含有该蛋白质的糖蛋白异常症治疗药、以及用于编码该蛋白质的dna以及含有该dna的治疗糖蛋白异常症的基因治疗药
DE DK et al. TRANSGENES KANINCHEN, DASS EIN FUNKTIONELLES MENSCHLICHES LIPOPROTEIN (A) EXPRIMIERT LAPIN TRANSGENIQUE EXPRIMANT UNE LIPOPROTEINE (A) HUMAINE FONCTIONNELLE
JP2003265176A (ja) ヒト腫瘍壊死因子δおよびε