FR2734568A1 - Nouveaux variants de l'apolipoproteine - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des variants de l'apolipoprotéine A-l humaine comprenant une cystéine en position 151, les acides nucléiques correspondants et les vecteurs les contenant. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant ces éléments et leur utilisation, notamment en thérapie génique.

Description

La présente invention concerne un nouveau variant de l'apolipoprotéine A-l. Elle concerne aussi tout acide nucléique codant pour ce nouveau variant. Elle concerne également l'utilisation de ces protéine ou acides nucléiques dans un but thérapeutique. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau variant de l'apolipoprotéine A-l comportant notamment une mutation en position 151.

L'apolipoprotéine A-l (apoA-l) est le constituant majeur des lipoprotéines de haute densité (HDL), qui sont des complexes macromoléculaires composés de cholestérol, phospholipides et de triglycérides. L'apoA-l est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la forme d'une préproprotéine de 267 résidus, ayant une masse moléculaire de 28.000 daltons. La forme prépro de l'apoA-I est synthétisée chez l'homme à la fois par le foie et l'intestin. Cette forme de protéine est ensuite clivée en proprotéine qui est sécrétée dans le plasma.

Dans le compartiment vasculaire, la proapoA-l est alors transformée en protéine mature (243 acides aminés) par action d'une protéase calcium dépendante. L'apoA-l a un rôle de structure et un rôle actif dans le métabolisme des lipoprotéines: I'apoA-l est notamment un cofacteur de la lécithine cholestérol acyitransférase (LCAT), responsable de l'estérification du cholestérol plasmatique.

Le niveau de cholestérol contenu dans la fraction HDL et la concentration plasmatique de l'apoA-I sont des facteurs de risque négatifs pour le développement de l'athérosclérose chez l'homme. Les études épidémiologiques ont en effet démontré une corrélation inverse entre les concentrations de cholestérol HDL et d'apoA-l et l'incidence des maladies cardio-vasculaires (E. G. Miller et al. Lancet, 1977:965-968). En revanche, une longévité serait associée avec un taux de cholestérol HDL élevé.

Récemment, le rôle protecteur de l'apoA-I a été démontré dans un modèle de souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-l humaine (Rubin et al. Nature). De même, l'infusion des HDL chez le lapin induit une régression des lésions (Badimon et al. J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990). Differents mécanismes ont été proposés pour expliquer l'effect protecteur des HDL, et notamment un rôle des HDL dans le transport inverse du cholestérol (Fruchart et al. Circulation, 87: 22-27, 1993) et une action antiioxydant des
HDL (Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354-364,1994)).

Le gène codant pour l'apoA-I a été cloné et séquencé (Sharpe et al.,
Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Ce gène, d'une longueur de 1863 pb, comprend 4 exons et 3 introns. L'ADNc codant pour l'apoA-I a également été décrit (Law et al., PNAS 81 (1984) 66). Cet ADNc comprend 840 pb (Cf SEQ
ID n" 1). Outre la forme sauvage de l'apoA-I, différents variants naturels ont été décrits dans l'art antérieur, dont les différences par rapport à la protéine sauvage sont données dans le tableau ci-après.

<tb>

<SEP> Variant: <SEP> Mutation <SEP> Variant <SEP> Mutation
<tb> <SEP> Milano <SEP> Arg173Cys <SEP> Norway <SEP> Glu136Lys <SEP>
<tb> <SEP> Marburg <SEP> Lys107 <SEP> Prol <SEP> 65Arg
<tb> Munster2B <SEP> Ala158Glu <SEP> Pro3His
<tb> <SEP> Giessen <SEP> Pro143Arg <SEP> Argl <SEP> OLeu <SEP>
<tb> Munster3A <SEP> Asp1 <SEP> 03Asn <SEP> Gly26Arg <SEP>
<tb> Munster3B <SEP> Pro4Arg <SEP> Asp89Glu
<tb> Munster3C <SEP> Pro3Arg <SEP> Lysl07Met <SEP>
<tb> Munster3D <SEP> Asp213Gly <SEP> Glu139Gly
<tb> <SEP> Munster4 <SEP> Glu <SEP> 198Lys <SEP> Glu147Val
<tb> <SEP> Yame <SEP> Aspî <SEP> 3Tyr <SEP> Alal <SEP> 58Glu <SEP>
<tb> <SEP> Asp2î3Gly <SEP> Glu169Gln
<tb> <SEP> Ar <SEP> 177His <SEP>
<tb>
La présente invention découle de la mise en évidence d'une nouvelle série de variants de l'apolipoprotéine A-l. Cette série de variant présente en particulier une substitution du résidu arginine en position 151 par un résidu cystéine. Le variant d'apoA-I selon l'invention présente des propriétés thérapeutiques remarquables. En particulier, il possède des propriétés de protection anti-athérogène particulièrement importantes. Ainsi, dans une situation de niveaux extrêmement bas de cholestérol dans la fraction HDL, associée à une hypertriglycéridémie, la présence de ce variant prévient le développement de toute athérosclérose, témoignant d'un rôle protecteur très puissant, spécifique à cette apoA-l mutée.En outre, la présence d'une cystéine sur l'apoA-I selon l'invention entraîne la formation de dimères et d'autres complexes reliés par un pont disulfure. Cette apoA-l se retrouve sous forme libre dans le plasma, liée en dimère à elle-même ou associée avec l'apolipoprotéine A-ll qui est une autre protéine importante associée au
HDL et qui possède aussi une cystéine dans sa séquence. Par ailleurs, la perte de la charge liée à larginine en position 151 entraîne la visualisation de ce mutant par électroisofocalisation des protéines plasmatiques suivi d'une révélation immunologique de l'apoA-I.

Compte tenu de ses propriétés anti-athérogènes particulièrement remarquables, cette nouvelle protéine selon l'invention offre un avantage thérapeutique important dans le traitement et la prévention des pathologies cardiovasculaires.

Un premier objet de l'invention concerne donc une série de variants de l'apolipoprotéine A-l humaine comprenant une cystéine en position 151.

La séquence d'acides aminés de l'apoA-I de référence est décrite dans la littérature (Cf Law précitée). Cette séquence, incluant la région prepro (résidus 1 à 24), est présentée sur la séquence SEQ ID n" 1. Une caractéristique des variants selon l'invention réside donc dans la présence d'une cystéine en position 151 de l'apoA-I mature (correspondant à la position 175 sur la séquence SEQ ID n" 1), en substitution de larginine présente dans la séquence de référence. Un variant préféré selon l'invention comprend la séquence peptidique SEQ ID n" 2, et, encore plus préférentiellement, la séquence peptidique comprise entre les résidus 68 à 267 de la séquence SEQ ID n" 1, le résidu 175 étant substitué par une cystéine.

Les variants selon l'invention sont représentés notamment par l'apoA-I tgv, c'est-à-dire une apoA-l présentant une cystéine en position 151 par rapport à l'apoA-I native. Les variants selon l'invention peuvent également porter d'autres modifications structurales par rapport à l'apolipoprotéine A-l de référence, et notamment d'autres mutations, délétions et/ou additions. Selon un mode particulier, les variants de l'invention comprennent également d'autres mutations conduisant au remplacement de résidus par des cystéines. Ainsi, un autre variant particulier combine les mutation présentes dans le variant apoA-l tgv et apoA-l milano.D'autres mutations peuvent également être présentes affectant des résidus ne modifiant pas de manière significative les propriétés de l'apoA-I. L'activité de ces variants peut être vérifiée notamment par un test d'efflux du cholestérol.

Les variants selon l'invention peuvent être obtenus de différentes façons. Ils peuvent tout d'abord être synthétisés chimiquement, grace aux techniques de l'homme du métier utilisant des synthétiseurs de peptides. Ils peuvent également être obtenus à partir de l'apoA-I de référence, par mutation(s). Avantageusement, il s'agit de protéines recombinantes, c'est-àdire obtenues par expression dans un hôte cellulaire d'un acide nucléique correspondant comme décrit plus loin.

Comme indiqué plus haut, les variants selon l'invention peuvent se trouver sous forme monomérique ou sous forme de dimère. La présence d'une cystéine au moins dans la séquence des variants de l'invention permet en effet la réalisation de dimères par liaison disulfure. II peut s'agir d'homodimères, c'est à dire de dimères comprenant deux variants selon l'invention (exemple : diApoA-l tgv); ou d'hétérodimères, c'est à dire de dimères comprenant un variant selon l'invention et une autre molécule possèdant une cystéine libre (exemple :ApoA-l tgv:ApoAll).

Un autre objet de l'invention réside dans un acide nucléique codant pour un variant d'apolipoprotéine A-l tel que défini ci-avant. L'acide nucléique de la présente invention peut être un acide désoxyribonucléique (ADN) ou un acide ribonucléique (ARN). Parmi les ADN, il peut s'agir d'un ADN complémentaire (ADNc), d'un ADN génomique (ADNg), d'une séquence hybride ou d'une séquence synthétique ou semi-synthétique. Il peut en outre s'agir d'un acide nucléique modifié chimiquement, par exemple en vue d'augmenter sa résistance aux nucléases, sa pénétration ou son ciblage cellulaires, son efficacité thérapeutique, etc. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, synthétique, etc.Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.

Avantageusement, l'acide nucléique est un ADNc ou un ADNg.

Préférentiellement, l'acide nucléique selon l'invention comprend la séquence SEQ ID n" 2. Encore plus préférentiellement, il comprend la séquence SEQ ID n" 10.

L'acide nucléique selon l'invention comprend avantageusement une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir de la région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène de l'apoA-I ou d'un variant de l'ApoA-I lorsque celleci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. II peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT,
PGK, vimentine, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, etc) de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoîque, etc).De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.

Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de l'apoA-I, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.

L'acide nucléique selon l'invention peut être utilisé pour produire les variants d'ApoA-l recombinants par expression dans une cellule hôte recombinée, ou directement comme médicament dans des applications de thérapie génique ou cellulaire.

Pour la production de variants recombinants selon l'invention, l'acide nucléique est avantageusement incorporé à un vecteur plasmidique ou viral, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Ce vecteur est ensuite utilisé pour transfecter ou infecter une population cellulaire choisie. Les cellules transfectées ou infectées ainsi obtenues sont alors cultivées dans des conditions permettant l'expression de l'acide nucléique, et le variant d'apoA-l recombinant selon l'invention est isolé. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des variants de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons.En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia,
Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces. Le variant ainsi isolé peut être ensuite conditionné en vue de son utilisation thérapeutique.

Selon un mode particulièrement intéressant, l'acide nucléique selon l'invention est utilisé directement à titre de médicament, dans des applications de thérapie génique ou cellulaire. A cet égard, il peut être utilisé tel quel, par injection au niveau du site à traiter ou incubation avec des cellules en vue de leur administration. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier.

Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.

Selon un mode particulier, la présente invention concerne donc un vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant.

Différents types de vecteurs peuvent être utilisés. II peut s'agir de vecteurs viraux ou non viraux.

Dans un mode préféré, le vecteur de l'invention est un vecteur viral.

L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. II est ainsi possible d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus les virus adéno associés ou encore le virus de la vaccine. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection.

S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.

Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Maul, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus
CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.

Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.

D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région
E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649,
W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode particulièrement préféré, on utilise dans le cadre de la présente invention un adénovirus recombinant présentant une délétion de tout ou partie des régions El et E4. Ce type de vecteur offre en effet des propriétés de sécurité particulièrement avantageuses.

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al.,
Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre l'acide nucléique ou la cassette de l'invention. La recombinaison homologue se produit après cotransfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J.Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). D'autres lignées ont été décrites dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697.

Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. II comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus.Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.

L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par cotransfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant l'acide nucléique ou la cassette de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques (voir notamment W095/06743).

Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242,
EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick,
BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.

Pour construire des rétrovirus recombinants comportant l'acide nucléique ou la cassette de l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et l'acide nucléique ou la cassette est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env.De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée
PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée
GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes codant pour des apolipoprotéines. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.

A cet égard, l'invention concerne préférentiellement un adénovirus recombinant défectif comprenant, inséré dans son génome, un ADN codant pour un variant de l'apolipoprotéine A-l tel que défini ci-avant.

Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant la séquence codant pour le variant de l'ApoA-I, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12 (US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour un variant de l'ApoA-I selon l'invention.

Selon un autre aspect de l'invention, le vecteur utilisé est un vecteur chimique. Le vecteur selon l'invention peut en effet être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.

Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.

Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et
DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) et différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc).Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit.

L'invention concerne également toute cellule modifiée génétiquement par insertion d'un acide nucléique codant pour un variant de l'apolipoprotéine A-l tel que défini précédemment. Il s'agit avantageusement de cellules mammifères, susceptibles d'être administrées ou implantées in vivo. II peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, épithéliales, gliales, etc. Les cellules sont préférentiellement d'origine humaine. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit de cellules autologues, c'est-à-dire prélevée à partir d'un patient, modifiées ex vivo par un acide nucléique selon l'invention en vue de leur conférer des propriétés thérapeutiques, puis réadministrées au patient.

Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'insertion de l'acide nucléique de l'invention (au moyen d'un vecteur viral ou chimique), ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047,
EP 456640).

Les cellules en culture peuvent en particulier être infectées par les virus recombinants de l'invention pour leur conférer la capacité de produire un variant de l'apoA-I biologiquement actif. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré,
I'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. II est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché.Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro.

Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.

Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères génétiquement modifiées par insertion d'un acide nucléique tel que défini ci-avant, et une matrice extracellulaire.

Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108. Les cellules peuvent également être des cellules productrices de virus recombinants contenant inséré dans leur génome un acide nucléique tel que défini ciavant.

Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.

Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type I.

Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou biocompatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique (corail, os, collagène, etc).

Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de l'organisme. En particulier, l'implantation peut être effectuée au niveau de la cavité péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région suspubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du variant d'apoA-l dans l'organisme:
Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulables, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.

En raison des propriétés anti-athérogènes particulièrement remarquables des variants de l'invention, les acides nucléiques constituent ainsi un nouveau médicament dans le traitement et la prévention des pathologies cardiovascu laires (athérosclérose, resténose, etc).

L'invention concerne à cet effet tout composition pharmaceutique comprenant un variant de l'apolipoprotéine A-l et/ou un acide nucléique et/ou un vecteur et/ou une cellule génétiquement modifiée tels que décrits ciavant.

La présente invention offre ainsi un nouveau moyen pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, 'angor, la mort subite, la resténose, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires. Plus généralement, cette approche offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de l'apolipoprotéine A-l peut être corrigé.

La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Exemples
Exemple 1 - Mise en évidence d'un variant ApoAl
Le variant ApoA-l tgv a été identifié et isolé à partir d'un patient sélectionné en raison de son bilan lipidique particulier. Plus précisément, le patient présentait le bilan lipidique suivant (nature du prélévement: sérum).

Normales
Cholestérol total 4.59 mmol/l 4.54-6.97
Triglycérides 2.82 mmol/l 0.74-1.71
HDL-cholestérol 0.25 mmol/l 0.88-1.60
LDL-cholestérol 3.06 mmol/l 2.79-4.85
Apolipoprotéine A-l 0.50 g/l 1.20-2.15
Apolipoprotéine B 1.38 g/l 0.55-1.30
Phenotype apoE: 3/3
De manière inattendue, ce patient ne présentait aucun signe d'athérosclérose malgré une concentration d'HDL extrêmement faible et une hypertriglycéridémie. Ceci a conduit les demandeurs à rechercher l'origine de cette protection.

Isolement des HDL contenant I'aDoA-l tgv à partir du Dlasma.

Après une nuit à jeun, du sang est prélevé chez les sujets portant le gène de I'apoA-l tgv. Le plasma est préparé par centrifugation lente du sang à 4"C (2000 g, 30 minutes). Les lipoprotéines de haute densité sont préparées par ultracentrifugation séquentielle à la densité de 1.063-1.21 g/ml (Havel, J. Clin. Invest. 34: 1345-54, 1955). La fraction contenant les
HDL est ensuite dialysée contre du tampon Tris-HCI 10 mM, azide de sodium 0,01 %, au pH 7,4.

Mise en évidence des dimères d'apoA-I tgv.

La fraction HDL dialysée est délipidée dans un mélange diethylether/ ethanol (3/1, v/v) et la contrentration de protéines est estimée par la méthode de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951). Les protéines de la fration HDL subissent une migration sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS en condition non réductrice. Cette migration permet de mettre en évidence la taille des differentes protéines des HDL du patient. Outre la présence des protéines correspondantes aux apoA-l et apoA-ll de tailles normales, cette analyse révèle la présence de protéines de plus hauts poids moléculaires correspondant à des dimères d'apoA-I et des complexes apoA-I et apoA-II. La présence des apoA-l et apoA-II dans ces complexes a été vérifiée par une révélation immunologique spécifique.

Mise en évidence de la différence de charge de l'apoA-I mutée
La détection de l'apoA-I mutée directement à partir du plasma a été réalisée selon le protocole suivant (Menzel, H. J., and Utermann, G.,
Electroforesis, 7: 492-495, 1986): vingt microlitres de plasma sont délipidés toute une nuit avec le mélange éthanol/ether et resuspendu dans un tampon de dépot. Un aliquot de 5 1ll subit une électrophorèse sur un gel de focusing isoelectrique (pH 4-6,5, Pharmolyte), et les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nylon. Les bandes correspondantes à
I'apoA-l sont détectées par une réaction immunologique à l'aide d'anticorps anti-apoA-l humaine.

La détection de l'apoA-I mutée peut se faire aussi à partir des protéines HDL. La fraction HDL dialysée est délipidée dans un mélange diethylether/ ethanol (3/1, v/v) et la contrentration de protéines est estimée par la méthode de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951).

Environ 100 pg de protéines subissent une électrophorèse sur un gel de focusing isoelectrique (pH 4-6,5, Pharmolyte), et les protéines sont ensuite révélées par coloration au bleu de Coomassie. Cette technique permet de mettre en évidence que les isoformes les plus importantes des apoA-l du patient ayant la mutation sont déplacées vers l'anode, ce qui correspond à une différence de charge de -1 par rapport à la charge d'apoA-l normale.

Exemple 2 - Identification du gène et de la mutation
L'ADN génomique du patient a été isolé du sang total selon la technique de Madisen et al. (Amer. J. Med. Genet, 27: 379-390, 1987). Le gène de l'apoA-I a ensuite été amplifié par la technique de PCR. A cet effet, les réactions d'amplification ont été réalisées sur 1 pg d'ADN génomique purifié introduit dans le mélange suivant:
- 10 ,ul de tampon 10X (100 mM Tris-HCI pH 8,3; 500 mM KCI; 15 mM
MgCl2; 0,1 % (w/v) gélatine)
- 10 pI de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2mM
- 20 pmol de chaque amorce
- 2,5 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer)
- qsp 100 lli H20.

Les amorces utilisées pour l'amplification sont les suivantes: Sq5490: 5'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3' (SEQ ID n" 3)
Sq5491 : 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3' (SEQ ID n" 4)
Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3' (SEQ ID n" 5)
Sq5493 : 5'-CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3' (SEQ ID n" 6)
Les amorces Sq5490 et Sq5491 amplifient un fragment de 508 pb correspondant aux exons 2 et 3 du gène de I'apoA-l et les amorces Sq5492 et Sq5493 amplifient un fragment de 664 pb correspondant à I'exon 4 de ce gène.

Les produits d'amplification (deux fragments PCR de 508 et 664 pb) ont ensuite été séquencés. Pour cela, une première méthode à été utilisée, consistant à séquencer directement en utilisant le kit de séquençage de fragments PCR (Amersham). Les amorces utilisées pour le séquençage sont les amorces PCR, mais il peut également s'agir d'amorces internes aux fragments (Cf amorces S4, S6 et S8 ci-dessous).

Une deuxième technique de séquençage a également été mise en oeuvre qui a consisté à cloner les fragments PCR dans un vecteur M13 mp28. L'ADN double brin du M13 a été clivé par EcoRV puis déphosphorylé.

les fragment PCR ont été traités à la Klenow, phosphorylés et ligués au vecteur M13. Les plages blanches ont ensuite été prélevées et l'ADN simple brin amplifié puis purifié sur le Catalyst (Applied Biosystem) a été séquencé par une amorce -20 fluorescente (Kit PRISM dye primer et protocole n" 401386, Applied Biosystem) ou par des amorces internes aux fragments après orientations de ceux-ci.La technique des didéoxynucléotides fluorescent est alors utilisée (Kit DyeDeoxyTerminator et protocole n" 401388, Applied Biosystem) S8 5' -TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG- 3' (SEQ ID n" 7)
S4 5' -CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG- 3' (SEQ ID n" 8)
S6 5' -GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT- 3' (SEQ ID n" 9)
Les séquences issues de plusieurs clones ont ensuite été compilées et comparées à la séquence de l'ApoAI. La séquence des acides aminé 148 à 154 de l'ApoAI mature est donnée ci dessous (correspondant aux résidus 172-178 sur la séquence SEQ ID n" 1).

ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala
151
Une mutation C- > T en premiere base du codon codant pour l'aa 151 qui code alors pour une cystéine (cf séquence SEQ ID n" 2 ci-dessous) a été retrouvée dans une partie des clones séquencés. Cette mutation est donc présente à l'état hétérozygote chez le patient sélectionné.

ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala
151
L'ensemble du cDNA codant pour le variant apoA-l tgv selon l'invention a été séquencé. Une partie de cette séquence est présentée sur la SEQ ID n" 10.

Exemple 3 - Construction d'un vecteur adénoviral pour l'expression de l'ApoAI mutée
Un ADNc codant pour un variant selon l'invention contenant la mutation Arg - > Cys en position 151 de l'ApoAI mature est obtenu par PCR.

Les amorces Almî : ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (SEQ ID n" 11), Alm2 : ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC
CTC (SEQ ID n" 12), Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC
GCC CAT (SEQ ID n" 13) et Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT
GTT GAG CTT (SEQ ID n" 14) sont utilisées. les amorces Alm1 et Alm4 introduisent respectivement des sites Clal en 5' et Sall en 3' de l'ADNc tandis que les amorces Alm2 et Alm3 qui sont complémentaires introduisent la mutation. Des reactions PCR avec les couples d'amorces AIM1-Alm2 et
Alm3-Alm4 sont d'abord pratiqués sur un ADNc de l'ApoAI non muté.Les fragments issus de ces PCR sont ensuite réintroduits dans une troisième
PCR en présence des amorces Alm1 et Alm4, ce qui génére un fragment de 822pb qui est ensuite cloné dans pCRII (Invitrogen) pour vérification de sa séquence. Le fragment Clal /Sall qui contient l'ADNc muté est ensuite introduit par les même sites de restriction dans le vecteur navette pXL-RSV
LPL qui contient l'ADNc de la LPL sous contrôle d'un promoteur LTR-RSV et avec un site de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine, ensubstitution de l'ADNc de la LPL (FR9406759). Tout autre vecteur navette peut bien évidemment être utilisé. Le vecteur résultant est ensuite linéarisé et cotransfecté dans 293 pour l'obtention d'adénovirus recombinants. Les adénovirus ainsi obtenus peuvent être amplifiés sur plages, purifiés (notamment par chlorure de césium) puis conservés congelés, par exemple dans du glycérol. Pour leur utilisation thérapeutique, ils peuvent être associés à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable. II peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection intraveineuse. Préférentiellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 1010 pfu/ml peuvent également être utilisées.Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées.

Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
(B) RUE:
(C) VILLE:
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR DE LILLE
(B) RUE:
(C) VILLE:
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL:
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveaux variants de l'apolipoprotéine A-I.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 14
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version &num;1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 842 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..842
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "human apo AI cDNA"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG CTC TTC CTG ACG GGG AGC 48
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser
1 5 10 15
CAG GCT CGG CAT TTC TGG CAG CAA GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC TGG 96 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp
20 25 30
GAT CGA GTG AAG GAC CTG GCC ACT GTG TAC GTG GAT GTG CTC AAA GAC 144
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp
35 40 45
AGC GGC AGA GAC TAT GTG TCC CAG TTT GAA GGC TCC GCC TTG GGA AAA 192
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys
50 55 60
CAG CTA AAC CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC 240 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr
65 70 75 80
TTC AGC AAG CTG CGC GAA CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG 288
Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp
85 90 95
GAT AAC CTG GAA AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG ATG AGC AAG 336
Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys
100 105 110
GAT CTG GAG GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC TTC 384
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe
115 120 125
CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG AAG GTG GAG 432 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu
130 135 140
CCG CTG CGC GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG 480
Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160
CTG CAA GAG AAG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC CGC GCG 528
Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala
165 170 175
CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC 576
Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp
180 185 190
GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG AAC 624
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
195 200 205
GGC GGC GCC AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG 672
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
210 215 220
AGC ACG CTC AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA 720
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240
GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC TTC CTG AGC GCT 768
Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala
245 250 255
CTC GAG GAG TAC ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA GGCGCCCGCC 814
Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *
260 265
GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA 842
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..21
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "variant apo AI cDNA"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC 21
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS: /product= Sq5490
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5491
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 4:
TTCAACATCA TCCCACAGGC CTCT 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5492
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CTGATAGGCT GGGGCGCTGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5493
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 6:
CGCCTCACTG GGTGTTGAGC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TGGGATCGAG TGAAGGACCT G 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S4
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 8:
CGCCAGAAGC TGCACCAGCT G 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S6
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
GCGCTGGCGC AGCTCGTCGC T 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 603 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..603
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 10:
CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC TTC AGC AAG 48
Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys
1 5 10 15
CTG CGC GAA CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG GAT AAC CTG 96
Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu
20 25 30
GAA AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG ATG AGC AAG GAT CTG GAG 144
Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu
35 40 45
GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC TTC CAG AAG AAG 192
Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys
50 55 60
TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG AAG GTG GAG CCG CTG CGC 240
Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg
65 70 75 80
GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG CTG CAA GAG 288
Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu
85 90 95
AAG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT 336
Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His
100 105 110
GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC GAG CTG CGC 384
Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg
115 120 125
CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG AAC GGC GGC GCC 432 Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala
130 135 140
AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG AGC ACG CTC 480
Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu 145 150 155 160
AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA GGC CTG CTG 528
Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu
165 170 175
CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC TTC CTG AGC GCT CTC GAG GAG 576
Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu
180 185 190
TAC ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA 603
Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *
195 200
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 11:
ATCGATACCG CCATGAAAGC TGCGGTGCTG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
ATGGGCGCGC GCGCAGTCGC GCATCTCCTC 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm3
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
GAGGAGATGC GCGACTGCGC GCGCGCCCAT 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm4
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
GTCGACGGCG CCTCACTGGG TGTTGAGCTT 30

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Variant de l'apolipoprotéine A-l humaine comprenant une cystéine en position 151.

2. Variant selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence peptidique SEQ ID n" 2.

3. Variant selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit de l'apoA-I tgv.

4. Variant selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une protéine recombinante.

5. Variant selon l'une des revendications 1 à 4 sous forme de dimère.

6. Variant selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un homodimère.

7. Acide nucléique codant pour un variant d'apolipoprotéine A-l selon l'une des revendications précédentes.

8. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc.

9. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNg.

10. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ARN.

11. Acide nucléique selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléique SEQ ID n" 2.

12. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 7 à 11.

13. Vecteur selon la revendication 1 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.

14. Vecteur selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur chimique.

15. Adénovirus recombinant défectif comprenant, inséré dans son génome, un ADN codant pour un variant de l'apolipoprotéine A-l selon la revendication 1.

16. Cellule modifiée génétiquement par insertion d'un acide nucléique selon la revendication 7.

17. Implant comprenant des cellules de mammifères génétiquement modifiées par insertion d'un acide nucléique selon la revendication 7 et une matrice extracellulaire.

18. Composition pharmaceutique comprenant un variant de l'apolipoprotéine A-l selon l'une des revendications 1 à 6, et/ou un acide nucléique selon la revendication 7, et/ou un vecteur selon la revendication 12 et/ou une cellule génétiquement modifiée selon la revendication 16.