FI120501B - p53-proteiinin pitoisuuksia säätelevien kalpaiinin aktiivisuuden inhibiittorien käyttö syöpälääkkeiden valmistuksessa - Google Patents

Description

p53-proteiinin pitoisuuksia säätelevien kaipaiinin aktiivi suuden inhibiittorien käyttö syöpälääkkeiden valmistuksessa

Esillä olevan keksinnön kohteena on p:53-proteiinin 5 pitoisuuksia säätelevien yhdisteiden käyttö syövän hoitoon tarkoitettujen farmaseuttisten koostumusten valmistuksessa.:. Keksintö kohdistuu samoin farmaseuttisiin koostumuksiin:, jotka sisältävät mutahoituneita p53-proteiineja spesifisesti hajottamaan kykeneviä nukleiinihappoja.

10 Viimeisten 15 vuoden aikana toteutettu onkogSenxen sekä kasvaimia tukahduttavien geenien tunnusomaisten piirteiden selvittäminen molekyylitasolla on johtanut syövän synty tap ab tumaa valaiseviin uusiin näkökohtiin:. Niinpä naiden geenien säätelyn sekä vastaavien proteiinien toiminnan 15 syvällisemmän tuntemuksen ansiosta uusia hoitavia lähestymistapoja voidaan ottaa: tarkastelun kohteeksi,

Erityisemmin, onkogeenisten ja ankogeenisyyttä vastustavien proteiinien kataboliän selvittäminen on pääasiallinen haaste kamppailussa syövän voittamiseksi siinä suh-20 teessä, että tällöin onkogeenisten proteiinien tapauksessa voidaan saada selville mahdollisuuksia niiden hajoamisen nopeuttamiseksi ja näin ollen niiden vaikutuksen mitätöimiseksi, kasvaimia tukahduttavien proteiinien tapauksessa voidaan estää niiden hajoaminen ja lisätä tällä tavalla niillä ole-25 vaa, lisääntymistä vastustavaa tai kasvaimia vastustavaa vaikutusta, ja mutatoituneiden proteiinien tapauksessa tehostaa niiden antigeenisyyttä suuren histokompatibiliteetti-kompleksin molekyyleillä ja kiihottaa tällä tavalla kasvaimien spesifistä immuunvastetta, ja siinä tapauksessa, et-30 ta onkogeenin tai syöpää vastustavan geenin voimakas ilmentyminen kykenee indusoimaan halutulla tavalla solujen kuolemaa, mahdollisuutena on stabiloida nämä proteiinit apoptoot-tisen tapahtumasarjan laukaisemiseksi.

2

Alun perin p53-proteiini on luokiteltu tuman onko-geeniksi, koska se kykenee transfektiokokeissa pidentämään viljelmänä olevien jyrsijäsolujen elämää sekä toimimaan yhdessä aktivoituneiden onkogeenien kanssa niiden kantajana 5 primääriviljelmänä olevien solujen transformoimiseksi. Näissä ensimmäisissä kokeissa käytetyt geenit olivat muta-toituneita ja ne johtivat erilaisten p53-proteiinien, joiden tunnusomaisena piirteenä oli lisääntynyt toiminta, ilmentymiseen. Tällä hetkellä tiedetään, p53-proteiinin toisit) täiseksi tuntemattomia toimintoja kuitenkaan pois sulkematta, että p53-proteiini on ainakin villissä muodossaan kopi-oitumistekijä, joka säätelee negatiivisesti solun kasvua ja jakautumista, ja joka tietyissä tilanteissa kykenee indusoimaan apoptoosia (Yonish-Rouach et ai. , Nature, 352, 15 345-347, 1991), Koska nämä ominaisuudet ilmenevät rasitus- tilanteessa, jossa solun DNA:n eheys on uhattuna, niin p53-proteiiriin on esitetty toimivan "perimän vartijana”. Muta-toituneiden p53-proteiinien läsnäolo noin 40 %:ssa ihmisen kasvaimia, kaikki tyypit mukaan lukien, vahvistaa tätä hy-20 'po tees ia ja korostaa tämän geenin jmitaät.ioiXlä ölevaa, to dennäköisesti ratkaisevaa: osaa kasvaimien kehittymisessä (yleiskatsauksia on esitetty julkaisuissa Montenarli, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti ja Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).

25 Villityypin p53-proteiini on monimutkaisen säätelyn alainen., joka säätely vaikuttaa sen synteesin ja katabolian säätöön sekä sen sijaintiin solun sisällä ja sen muokkautumiseen luennan jälkeen (katso edellä mainitut yleiskatsaukset) . Villityypin p53-proteiini on äärimmäisen pysymätöntä 30 ja sen puoliintumisaika on muutamia minuutteja. Sitä vastoin tietyillä mutätoituneilla proteiineilla, joita kerääntyy suurina määrinä kasvaimiin, on merkittävästi pitempi puoliintumisaika. Olemassa on vain vähän selvää tietoa p53-proteiinin hajoamisesta. Alalla ei tunneta solun sisäisiä 35 hajoamiskohtia, eikä käytettyjen katäboliäreittien lukumäärää eikä luonnetta eikä niitä peptidiyhdistelmiä, jotka joh- 3 tavat p53:n hajoamiseen. 'Tietojemme mukaan ainoa käytettävissä oleva informaatio on se, että El-entsyymi osallistuu ubikvitiinisykliin tietyissä koeolosuhteissa (Ciechanover et ai,, Proc. Natl. Acad. Soi. USA 88, 139-143, 1991; Chowdary 5 et ai., Molec. Cell. Biol. 14, 1997-2003,: 1994). Lisäksi alalla on osoitettu, että tiettyjä p53“proteiinista saatuja proteolyyttisiä tuotteita voidaan osoittaa antigeenisesti.

Esillä oleva keksintö on saatu tuloksena osittain siitä, että p53“proteiini:t on kyetty osoittamaan kalsiumista 10 riippuvien proteaasien eli kalpaiinien substraateiksi. Keksintö on saatu erityisemmin tuloksena siitä havainnosta, että m-kalpaiini tai μ-kalpaiini hajottaa spesifisesti. p53-proteiineja. Tässä keksinnössä on osoitettu ensimmäisen kerran p53 -proteiinien säätelymekanismi solutasolla:, ja näin 15 ollen aikaan on saatu uusi, erityisen tehokas ja spesifinen lähestymistapa tämän proteiinin pitoisuuden muuntelemiseksi patologisissa tilanteissa kuten erityisesti tiettyjen syöpäsairauksien tapauksessa.

Erityisemmin, esillä olevassa keksinnössä kuvataan 20 sellaisten yhdisteiden käyttöä syövän hoitoon tarkoitettujen farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, jotka muuttavat kalpaiineilla olevaa, p53-proteiineihin kohdistuvaa aktiivisuutta, ja joiden yhdisteiden avulla voidaan joko aktivoida mutatoituneiden p53-protei inien hajoamista 25 niillä olevan, kasvaimien muodostumiseen johtavan vaikutuksen salpaamiseksi ja/tai immunogeenisten peptidien ilmiasun (presentation) parantamiseksi, tai joilla yhdisteillä voidaan stabiloida villityypin p53-proteiini kasvaimissa ilmentyneillä, mutatoituneilla proteiineilla olevan, kas-30 vaimien syntyyn johtavan vaikutuksen tasapainottamiseksi ja/tai kasvainsoiujen apoptoosin indusoimiseksi.

Niinpä esillä olevan keksinnön ensimmäisenä tavoitteena on sellaisen yhdisteen, joka kykenee muuttamaan kalpa-iinin aktiivisuutta, käyttö syöpäsairauksien hoitamiseksi 35 tarkoitetun farmaseuttisen koostumuksen valmistuksessa.

4

Kalpaiinit ov;at kaikkialla esiintyviä entsyymejä, joita on läsnä useimmissa nisäkässoluissa {yleiskatsaus, on löydettävissä julkaisusta Croall et deMartind, Physiol.

Rev., 71, 813-847, 1991). Niitä esiintyy olennaisesti syto-5 plasmassa, mutta ne voivat tunkeutua myös tumaan mitoosin aikana tai tiettyjen kiihottimien vaikutuksesta tapahtuvan tumakuoren tuhoutumisen seurauksena. Kuten edellä on esitetty, kalpaiinien prateolyyttinen aktiivisuus riippuu kalsiumin läsnäolosta.

10 Yhdisteitä, jotka kykenevät muuttamaan kalpaiinin aktiivisuutta esillä, olevan keksinnön mukaisesti, voi olla .monia eri tyyppejä.

Kysymyksessä voivat olla koostumukset, jotka kykenevät inhiboimaan kalpaiinilla olevan, p53-proteiineihin 15 kohdistuvan aktiivisuuden. Nämä yhdisteet ovat erityisen edullisia, koska niiden avulla voidaan estää ainakin osittain villityypin p53-proteiinin hajoaminen. Näiden yhdisteiden avulla voidaan siis stabiloida, solun sisällä villi-tyypin p53-proteiini sekä tasapainottaa mutatoituneiden 20 muotojen vaikutus. Esillä olevan keksinnön puitteissa käyttökelpoisista inhibiittariyhdisteistä voidaan mainita pro-teaasien inhibiittorit (leupeptiini, aprotiniini, PMSF, ) jne.), kalsiumia kelatoivat aineet (EGTA, EDTA, jne.) tai spesifiisemmät inhibiittorit kuten kalpastätiini tai sen mi-25 kä tahansa kappale tai johdannainen. Kaplas tätiini on kalpaiinien tunnettu inhibiittori. Sen sekvenssi on jo kuvattu tekniikan nykytasolla {SEQ ID NO. 1). Esillä olevan keksinnön eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa kasvaimiin siirretään vektori, joka käsittää kalpastatiinia j 30 koodaavan sekvenssin osittain tai kokonaan. Tämä lähestymistapa on erityisen käyttökelpoinen hoidettaessa syöpäsairauksia, joissa esiintyy aina villi p53-alleeli, ja joista esimerkkeinä voidaan mainita paksusuolessa ja keuhkopatkis- j

sa esiintyvät karsinoomat. Esillä olevan keksinnön puit- I

35 teissä voidaan käyttää kalpastatiinin erilaisia kappaleita tai johdannaisia. Nämä kappaleet tai johdannaiset voivat 5 olla mikä tahansa sellainen molekyyli, joka on saatu lähtemällä sekvenssistä SEQ ID NO, 1 ja toteuttamalla siinä yksi tai useampi luonteeltaan geneettinen ja/tai kemiallinen muokkaus siten, että kyky inhiboida kalpaiinin aktiivisuus 5 säilyyy ainakin osittain. Luonteeltaan geneettisellä ja/tai kemiallisella muokkauksella tarkoitetaan mitä tahansa yhden tai useamman nukleotidin mutaatiota, häviämää, korvausta, lisäystä ja/tai muokkausta. Tällaisia muokkauksia voidaan toteuttaa erilaisia tavoitteita silmällä pitäen, ja näistä 10 tavoitteista voidaan mainita erityisesti sellaisten sekvenssien valmistus, jotka sekvenssit kykenevät ilmentymään erityisessä vektorissa tai isännässä, sekvenssin koon pienentäminen helpottamaan soluun tunkeutumista, inhiboivan aktiivisuuden suurentaminen, tai erityisen edullisesti ta-15 män inhibiittorin selektiivisyyden suurentaminen, jonka inhibiittorin vaikutus kohdistuu kalpaiineilla olevaan, villi tyypin p53-proteiinia hajottavaan aktiivisuuteen.

Tällaisia muokkauksia voidaan tehdä esimerkiksi in vitro -mutageneesillä, liittämällä ylimääräisiä elementtejä 20 tai synteettisiä sekvenssejä, tai hävittämällä tai korvaamalla alkuperäisiä elementtejä. Kun edellä määritellyn kaltainen johdannainen on saatu toteutetuksi, sillä oleva, j p53-proteiineihin kohdistuvaa kalpaiinien aktiivisuutta in- j hiboiva aktiivisuus voidaan osoittaa monella tavalla, eri- j 25 tyisesti saattamalla tämä inhibiittori ja p53-proteiinien eri muodot kosketukseen toistensa kanssa, minkä jälkeen saadut hajoamistuotteet ilmaistaan (katso esimerkit 1 - 3).

Selvää on, että tähän tarkoitukseen voidaan myös käyttää mitä tahansa alan asiantuntijalle tuttua tekniikkaa.

30 Esillä olevan keksinnön eräässä erityisessä suori

tusmuodossa käytetään inhibiittorina kokö kalpastatiinia tai sen osaa tai sellaista nukleiinihappoa, joka koodaa kalpastatiinia täydellisesti tai osittain. Erityisemmin, suoritusmuodossa käytetään peptidiä, joka käsittää sekvens-35 s in SEQ id NO. 1 tai sen johdannaisen kokonaan tai osittain . I

6

Mitä tulee erityisemmin näihin johdannaisiin, esimerkkini voidaan mainita sekvenssin SEQ ID NO. 2 mukainen yhdiste, joka vastaa kalpastatiinin kappaletta. Edullisesti käytetään mitä tahänsa sellaista sekvenssistä SEQ; ID NO 1 5 tai 2 saatua johdannaista, joka kykenee inhiboimaan spesifisesti tai ensisijaisesti villityypin p53-proteiinin hajoamista kalpaiinin vaikutuksesta.

Me yhdisteet, jotka kykenevät muuttamaan kalpa-iinilla olevaa, p5'3“proteiineihin kohdistuvaa aktiivisuutta 10 esillä olevan keksinnön mukaisesti, voivat olla myös peräisin kalpaiinista, joka kykenee hajottamaan spesifisesti tai ensisijaisesti mutätoituneita p53-proteiineja. Tällaiset johdannaiset voivat myöskin olla hyvin edullisia, koska ne kykenevät aktivoimaan mu ta to i tune iden p53-proteiinien ha-15 joamlsta niillä olevan, kasvaimen syntyyn johtavan vaikutuksen salpaamiseksi ja./tai immunogeenlsteh peptidien ilmiasun (presentation) parantamiseksi, vaikuttamatta kuitenkaan merkittävällä tavalla villityypin 53-proteiinin pitoisuuteen solussa. Tällaisia johdannaisia voidaan saada läh-20 temällä kalpaiinista muokkaamalla sen rakennetta geneettisesti ja/tai kemiallisesti. Tällä tavalla saatujen johdannaisten kyky hajottaa spesifisesti tai ensisijaisesti muta- I

toituneita p53-proteiineja voidaan osoittaa tämän jälkeen j

esimerkeissä 1 - 3 esitetyllä tavalla. I

25 Tämän keksinnön puitteissa käytetyt muokkaajat ovat edullisesti proteiineja tai polypepidejä tai tällaisia poly-peptidejä tai proteiineja koodaavia nukleiinihapposekvensse-jä. Edullisemmin, nämä muokkäavat yhdisteet ovat proteiineja tai polypeptidejä, jotka inhiboivat spesifisesti kalpaiinil-30 la olevaa, villityypin p53-proteiiniin kohdistuvaa aktiivi- j suutta, tai mahdollisesti muokkautuneita kalpaiinin muotoja, j

mutatoituneiden p53-proteiinien spesifiseksi hajottamiseksi. J

7

Keksintö perustuu erityisen edullisella tavalla mahdollisuuteen ilmentää syöpäsoluissa, joissa on samanaikaisesti läsnä villityypin p53-alleeli sekä mutatoitunut p53-alleeli, nukleiinihapposekvenssejä, j oihin on koodautu-5 nut kalpaiinin inhibiittöreita kuten kalpastatiini tai kal-pastatiinin osa tai mahdollisesti muokkautuneita kalpaiini-en muotoja, mutatoituneiden p53-proteiinien spesifiseksi ha j ottamiseksi

Esillä olevan keksinnön puitteissa käytettyä nukle-10 iinihapposekvenssiä voidaan antaa sellaisenaan paljaana DNA:na patenttihakemuksessa WO 90/11 092 kuvatulla tekniikalla. Sitä voidaan antaa myös kömpieksoidussa, esimerkiksi DEAE-dekstraanin kanssa kompleksbidussa muodossa (Pagano et ai., J. Virol. 1 (1967) 891), tumaproteiinien kanssa (Kane-15 haa et ai., Science 243 (1989) 375), lipidien kanssa (Feigner et ai., PNAS 84 (1987) 7413), liposomeina (Fraley et ai., J. Biol. Chem. 255 (1:980) 10431) jne. Edullisessa tapauksessa keksinnön puitteissa käytetty sekvenssi on vektorin osa. Tällaista vektoria käyttämällä tällaista nukleiinihap-20 poa voidaan todellakin antaa paremmin käsiteltäviin soluihin ja samalla sen pysyvyys näissä soluissa saadaan paremmaksi, jolloin päästään kestävään hoitavaan vaikutukseen. Lisäksi samaan vektoriin voidaan sisällyttää lukuisia nukleiinihap-posekyenssejä, mikä parantaa edelleen käsittelyn tehokkuut-25 ta.

Käytetyn vektorin alkuperä voi vaihdella, kurihan tämä vektori vain kykenee transformoimaan eläinsoluja, edullisesti ihmisessä esiintyviä syöpäsoluja. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetään virusvektoria, joka 30 on voitu valita adenovirus ten, retrovirusten, adenoviruk- seen liittyvien virusten (AAV) tai herpesviruksen joukosta.

Näin ollen, esillä olevan keksinnön kohteena on lisäksi mikä tahansa sellainen yhdistelmä-DNA-tekninen virus, j joka käsittää perimäänsä istutettuna sellaisen nukleiiniha- j 35 pon, johon on koodautuiiut kalpaiinin aktiivisuutta muökkaa- j va yhdiste. Esillä olevan keksinnön puitteissa käytetyt vi- 8 rukset ovat edullisesti epätäydellisiä, toisin sanoen ne eivät kykene replikoituinaan autonomisesti infektoidussa solussa. Yleisesti, esillä olevan keksinnön puitteissa käytettyjen epätäydellisten virusten perimästä puuttuvat siis 5 vähintään ne sekvenssit, jotka ovat välttämättömät tämän viruksen replikoitumiselle infektoidussa solussa. Nämä alueet on joko voitu poistaa (kokonaan tai osittain) tai ne on tehty toimintakyvyttömiksi tai ne on korvattu toisilla sekvensseillä ja erityisesti kalpaiinien muokkaajaa koodaaval-10 la sekvenssillä. Edullista on, että tämän epätäydellisen viruksen perimässä ovat kuitenkin säilyneet ne sekvenssit, jotka ovat välttämättömät virushiukkasten kapseloitumisel-le.

Mitä tulee erityisesti adenovirukseen, erilaisten 15 serotyyppien, joiden rakenne ja ominaisuudet vaihtelevat jonkin verran, tunnusomaiset piirteet on selvitetty. Esillä olevan keksinnön puitteissa näistä serotyypeistä käytetään edullisesti tyyppiä 2 tai 5 olevia ihmisen adenoviruksia j (Ad 2 tai Ad 5) tai eläimestä peräisin olevaa adenovirusta ) 20 (katso FR-patenttihakemus 9 305 954), Esillä olevan keksin- \ nön puitteissa käyttökelpoisiatä eläinperäisistä adenovi- } ruksista voidaan mainita ne adenovirukset, jotka ovat pe- j räisin koirasta, naudasta, hiirestä (esimerkkeinä: Mavl, 1

Beard et ai., Virology 75 (1990) 81), lammas, sika, lintu $ 25 tai apina (esimerkkinä SAV) . Eläinperäinen adenovirus on edullisesti koiran adenovirus, edullisemmin CAV2-adenovirus j [esimerkiksi manhattan-kanta tai A26/61 (ATCG VR-800)]. |

Esillä olevan keksinnön puitteissa käytetään edullisesti j ihmisestä tai koirasta peräisin olevaa adenovirusta tai | 3 0 niiden seoksia. -1

Reksinxion mukaiset epätäydelliset adenovirukset kä- . . .. 3 sittävät edullisesti käänteisen toistuvan alueen (ITR), \ kapseloitumisen mahdollistavan sekvenssin sekä sekvenssin, johon on koodautunut kalpaiinien muokkaaja. Edelleen edul-35 lisemmassa tapauksessa keksinnön mukaisen adenoviruksen perimässä El-geeni ja vähintään jokin geeneistä E2, E4, L1-L5 9 ovat toimintakyvyttömiä. Kyseinen virusgeeni on voitu tehdä toimintakyvyttömäksi millä· tahansa alan asiantuntijalle tutulla tekniikalla·/ erityisesti poistamalla kyseessä olevat geenit täydellisesti tai köryaamälla, hävittämällä osittain 5 tai lisäämällä yksi tai, useampi kyseessä olevaan geeniin tai geeneihin kuuluva emäs, Tällaisia muokkauksia voidaan saada aikaan in vitro {eristetyssä DNA-molekyylissä) tai in s itu,, esimerkiksi käyttämällä apuna geenitekniikkaa tai käsittelemällä mutaatioita: tuottavalla aineella.

10 Esillä olevan keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA- teknisiä epätäydellisiä adenoviruksia voidaan valmistaa millä tahansa alan asiantuntijalle tutulla tekniikalla (Leyrero et ai., Gene 101 (1991) 195, EP-hakemusjulkaisussa 185 573; Graham, EMBQ J. 3 {1984) 2917). Niitä voidaan vai-15 mistaa erityisesti yhdistämällä toisiinsa homologisesti adenovirus ja sellainen plasmidi, joka käsittää mm. kalpa-iinien muokkaajaa koodaavan DNA-sekvenssin. Tämä homologinen yhdistyminen tapahtuu sen jälkeen, kun nämä adenoviruk-set ja plasmidi on transformoitu yhdessä sopivaan solulin-20 jaan. Tämän käytetyn solulinjan täytyy edullisesti olla sellainen, että (i} se voidaan transformoida näillä eleinen- { teillä, ja (ii) sekä käsittää sekvenssejä, jotka voivat j täydentää tämän epätäydellisen adenöviruksen perimän osaa, ja jotka ovat edullisesti yhdentyneessä muodossa uudelleen-25 yhdistymisen vaaran välttämiseksi. Esimerkkinä tällaisesti linjasta voidaan mainita ihmisalkion manuäissQlulinja 293 (Graham et ai., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), joka käsittää erityisesti perimäänsä yhdentyneenä vasemman osan adenovi-ruksen Ad5 perimästä (12 %). Menettelytapoja adenovirukses- | 30 ta peräisin olevien vektoreiden muodostamiseksi on kuvattu samoin FR-patenttihakemuksissa 9 305 954 ja 9 308 596.

Tämän jälkeen monistuneet adenovirukset otetaan ] talteen ja ne puhdistetaan perinteisillä molekyylibiologian j tekniikoilla, kuten esimerkeissä on havainnollistettu.

| 10

Mitä tulee adenoviruksiin liittyviin viruksiin (AAV), kysymyksessä on suhteellisen pienikokoinen dna-virus, joka yhdentyy infektoimiensa solujen perimään pysyvällä ja kohtaspesifisellä tavalla. Ne kykenevät infektoi-5 maan hyvin monia erilaisia soluja vaikuttamatta kuitenkaan millään tavalla solujen kasvuun, morfologiaan tai erilaistumiseen. Lisäksi ne eivät näytä olevan patologisia ihmisessä, AAV.:n perimä on kloonattu, sen sekvenssi on määritetty ja tunnusomaiset piirteet on selvitetty. Se käsittää 10 noin 4 700 emästä ja se käsittää kummassakin päässään noin 145 emäksen pituisen käänteisen toistuvan alueen (ITR), joka. toimii virusreplikaation alkamiskohtana. Perimän loppuosa jakautuu kahteen olennaiseen alueeseen, jotka käsittävät kapseioitumistoimintoja; ja jotka ovat perimän vasen 15 osa, joka sisältää virusreplikaatioon ja virusgeenien ilmentymiseen osallistuvan rep-geenin, sekä perimän oikea osaf joka sisältää viruksen kapseliproteiineja koodaavan cap-geenin.

AÄV-viruksista peräisin olevien vektoreiden käyttö 2 0 geenien siirtämiseksi in vitro ja in vivo on kuvattu kir jallisuudessa (katso esimerkiksi patenttijulkaisu WO 91/ 18 088; ¥0 93/09 239; US-patenttijulkaisussa 4 797 368, US-patenttijulkaisussa 5 139 941, EP-hakemusjulkaisussa 488 528) . Näissä hakemuksissa on kuvattu AAV-viruksista pe-25 räisin olevia erilaisia muodosteita, joissa rep- ja/tai cap-geenit on hävitetty ja korvattu mielenkiinnon kohteena olevalla geenillä, sekä niiden käyttö tämän mielenkiinnon kohteena olevan geenin siirtämiseksi in vitro (viljelmänä Oleviin soluihin) tai in vivo (suoraan organismiin). Nämä 30 keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA-tekniset epätäydelliset AÄV-virukset voidaan valmistää transfektoimalla ihmisestä peräisin olevalla apuviruksella {esimerkiksi adenoviruksella) infektoitu solulinja vielä sellaisella plasmidilla, joka. sisältää kalpaiinien muokkaajaa koodaavan sekvenssin 35 kahden käänteisen, toistuvan alueen. (ITR) reunustamana,: sekä AAV:n kapseloitumiseen osallistuvia geenejä (rep- ja cap- 11 geenit) käsittävällä plasmidilla. Täten muodostetut yhdis-t eImä-DNA-1eknis et AAV-virukset puhdistetaan sitten perinteisillä tekniikoilla.

Mitä tulee herpesviruksiin ja retroviruksiin, yhdis-5 telmä-DNA-teknisten vektoreiden muodostamista on kuvattu laajasti kirjallisuudessa: katso erityisesti Breakfield et ai., New Biologist 3 (1991) 203; EP-hakemusjulkaisu 453 242, EP-hakemusjulkaisu 178 220, Bernstein et ai., Genet, Eng. 7 (1985) 235,- MoCormiek, BioTechnolögy 3 (1985) 689, ja muut 10 vastaavat.

Esillä olevan keksinnön toteuttamista ajatellen erityisen edullista on käyttää epätäydellistä yhdistelmä-DNA-teknistä adenovirusta tai retrovirus ta. Näillä vektoreilla on todellakin erityisen mielenkiintoisia ominaisuuk-15 siä geenien siirtämiseksi kasvainsoluihin.

Keksinnön mukaisissa vektoreissa kalpaiinien muokkaajaa koodaava sekvenssi on sijoitettu edullisesti sellaisten signaalien säätelyn alaisuuteen, jotka signaalit tekevät mahdolliseksi tämän sekvenssin ilmentymisen kas-20 vainsoluissa - Kysymyksessä ovat edullisesti heterologiset. \

ilmentymissigiiäaiit, eli sellaiset signaalit, jotka eroavat muokkaajan ilmentymisestä luonnossa huolehtivista signaa- S

leista. Kysymykseen tulevat erityisesti sellaiset sekvehs- | sit, jotka huolehtivat muiden proteiinien ilmentymisestä, j 25 tai synteettiset sekvenssit. Kysymykseen tulevat erityises ti eukariootti- tai virusperäisten geenien promoottorise-kvenssit. Kysymyksessä voivat olla esimerkiksi sen solun, joka halutaan infektoida, perimästä saadut promoottorise- |

kvenssit. Samoin mahdollisia ovat viruksen, käytetty virus I

30 mukaan lukien, perimästä saadut promoottorisekvenssit. Täs- \ :Sä yhteydessä voidaan mainita esimerkiksi promoottorit ElA, | MLP, CMV, LTR-RSV ja muut vastaävat. Lisäksi näitä ilmentä- :|

missekvenssejä voidaan muokata lisäämällä aktivoivia tai I

sääteleviä tai kudosspesifisen ilmentymisen mahdollistavia j 35 sekvenssejä. Erityisen mielenkiintoista saattaa todellakin olla se, että käytetään spesifisesti tai pääasiassa kas- j 12 vainsoluissa aktiivisia ilraeiitamissignaaleja, mikä tarkoittaa sitä, että tämä DNA-sekvenssi ilmentyy ja tuottaa vaikutuksensa vasta silloin, kun virus on infektoinut tehokkaasti kasvainsolun.

5 Erään erityisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön kohteena on yhdistelmä-DNA-tekninen epätäydellinen virus, joka käsittää kalpaiinien muokkaajaa koodaavan 'DNA-sekvenssin edullisesti LTR - H S V -pr omoo 1.1 o r in ja CMU-prömoot torin joukosta valitun viruspromoottorin säätelyn alaisuudes- 10 sa.

Edelleen eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön kohteena on yhdistelmä-^NÄ-tekninen epätäydellinen virus, joka käsittää kalpaiinien muokkaajaa: koodaavan DNA-sekvenssiii sellaisen promoottorin säätelyn, alaisuudessa, 15 joka promoottori tekee mahdolliseksi voimakkaan ilmentymi sen kasvainsoluissa.

Ilmentymistä pidetään voimakkaana oheisessa keksinnössä, kun ilmentyminen on erinomaista kasvainsoluissa, \ vaikka muun tyyppisissä soluissa todettaisiinkin vähäistä \ 20 ilmentymistä* \

Esillä olevan keksinnön kohteena on samoin mikä ta- j \ hansa sellainen farmaseuttinen koostumus, joka käsittää yh- | den tai useamman edellä kuvatun kaltaisen yhdistelmä-DNA- \ teknisen epätäydellisen viruksen. Nämä farmaseuttiset koos- ! 25 turnukset on voitu tehdä muotoon, jota voidaan käyttää pai- \ kailisesti tai antaa suun kautta, ruuansulatuskanavan ulkopuolisesta nenän kautta, laskimon sisäisesti, lihaksen sisäisesti , ihon alaisesti, silmän kautta, ihon läpi tai j muulla vastaavalla tavalla. Keksinnön mukaiset farmaseutti- \ i 30 set koostumukset sisältävät edullisesti farmaseuttisesti hyväksyttävää kuljetinta injektoitavaa valmistetta varten, erityisesti sellaista valmistetta varten, jota voidaan injektoida suoraan potilaan kasvaimeen. Kysymyksessä voivat olla erityisesti steriilit ja isotoniset liuokset tai kui- ] 35 vat koostumukset, erityisesti lyofilisöidut koostumukset,, j joista saadaan injektoitavia liuoksia lisäämällä niihin ta- \ ] 13 pauksesta riippuen steriiliä vettä tai fysiologista seerumia. Suora injektio potilaassa esiintyvään kasvaimeen on edullista, koska tällä tavalla hoitava vaikutus voidaan keskittää sairaaseen kudokseen.

5 Tämän yhdi s te liriä-DNA·» teknisen epätäydellisen viruk sen ne annokset, joita käytetään injektiossa, voidaan valita eri parametreistä riippuen ja erityisesti riippuen vi-rusvektorista, käytetystä antamistavasta, kyseessä olevasta patologisesta tilasta sekä vielä hoidon tavoitellusta kes-10 tosta. Yleisesti, keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNÄ-tekni-sistä adenoviruksista muodostetaan sellaisia valmisteita, joita voidaan antaa 104 - lO14 pfu/ffili edullisesti 1Q6 - 10±0 pfu/ml sisältävinä annoksina. Käsite pfu ("plakkeja muodostava yksikkö1') kuvaa virus liuoksen infektiokykyä ja se mää-15 ritetään infektoimalla sopiva soluviljelmä ja määrittämällä yleensä 48 tonnin kuluttua infektoituneista soluista muodostuneiden läiskien lukumäärä. Tekniikoita virusliuoksen pfu-tiitterin määrittämiseksi on kuvattu laajasti kirjallisuudessa. Mitä tulee retrovirukseen, keksinnön mukaiset 20 koostunnukset voivat käsittää suoraan tuottajasoluja niiden istut taffiis eks i.

Esillä olevan keksinnön avulla voidaan käsitellä erityisesti sellaisia syöpäsairauksia, joissa todetaan mu-tatoituneita p53-muötöja. Erityisemmin, esillä olevaa kek-25 sintöä voidaan käyttää erityisen edullisesti sellaisten syöpäsairauksien hoitamiseksi, joissa syöpäsairauksissa on läsnä villityypin p53-alleeleja sekä mutatoituneita p53-alleeleja. Tällaisia syöpämuotoja ovat erityisesti paksusuolen ja peräsuolen syövät, rintasyövät, keuhkosyövät, ma- ! 30 hasyövät, ruokatorven syövät, B-lymfoomat, munasarjan syövät, virtsarakon syövät ja muut vastaavat.

Keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraayillä esimerkeillä;, joilla pyritään havainnollistamaan keksintöä: sitä rajoittamatta.

14

Kuvioiden selitys

Kuvio 1 esitys siitä, miten kalpaiini säätelee p53-proteiinia. Reaktio toteutetaan 30 μί:η lopullisessa tilavuudessa, jossa 1 on peräisin luentaseoksesta. ura 1; TO; 5 ura 2: 30 minuuttia olosuhteissa, joissa on läsnä 1 mM kalsiumia + 20 ug/ml kalpaiinia; ura 4: 30 minuuttia olosuhteissa, joissa on läsnä 1 mM kalsiumia + 20 ug/ml kalpaiinia + 0,5 mg/ml kalpaatätiinia; ura. 5: 30 minuuttia olosuhteissa, joissa on läsnä 1 mM kalsiumia + 20 μ g/'ml kalpaii-10 nia + 10 mM EGTA; ura 6: PBS; ura 7: PBS -f- kalsium; ura 8 : BBS + kalpastätiini.

Molekyylibiologian yleisiä tekniikoita

Molekyylibiologiassa perinteisesti käytetyt menetelmät, joista mainittakoon plasmidi-DNÄ:n preparatiivinen 15 eristäminen, plasmidi-DNA:n sentrifugointi kesiuinkloridi-graäientin avulla, elektroforeesi agaroosi- tai akryyliami-digeeleillä, DMA-kappaleiden puhdistus sähköeluutiolla, proteiinien uutto fenolilla tai fenolin ja kloroformin \ seoksella, DNA:n .saostus suolaisessa väliaineessa etanolil- j 20 la tai isppropanolillä, tfansformöinti Escherichia coli- | bakteeriin, sekä muut vastaavat, ovat hyvin tuttuja alan | , . , , , , , . i asiantuntijalle ja niitä on kuvattu laajasti kirjailisuu- s dessa [Maniatis T. et ai,, "Molecular Cloning, a Laboratory j

Manual1', Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, j 25 N.Y,, 1982; Ausubel F.M. et al. (toimittajat) , "Current j

Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New

York, 1987].

pBR322- ja pUC-tyyppiset plasmidit sekä ,Ml3-sarjan j faagit ovat kaupallista alkuperää (Bethesda Research Labo- | 30 ratories). ]

Ligatointia varten DNA-kappaleet voidaan erottaa il kokonsa perusteella elektroforeettisesti käyttäen agaroosi-tai akryyliamidigeelejä, ne voidaan uuttaa fenolilla tai fenolin ja kloroformin seoksella, ne voidaan saostaa enano-35 lilla ja, sitten niitä voidaan inkuboida T4--£aagin DNA- j 15 ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa toimittajan suositusten mukaisesti,

Irtonaiset 5'-päät voidaan täyttää E, coli:sta saadun DNA-polymeraasih I Klenow-kappaleella (Biolabs) toimit-5 tajän kuvaamalla tavalla. Irralliset 3'-päät tuhotaan T4-faagin DNA-polymeraasin (Biplabsj läsnä ollessa, valmistajan. suosituksia noudattaen. Irralliset 5’-päät tuhotaan käsittelemällä Sl-nukleaasilla.

Synteettisillä oiigodeoksinukleotädeillä in vitro 10 ohjattu mutageneesi voidaan toteuttaa Taylor:in et ai. ke hittämällä menetelmällä [Nucleic Acids Res. 1_3 (1985) 8749-8764] käyttäen yhtiön Amershäm markkinoimaa reagenssipakka-usta.

DNA-kappaleiden entsymaattinen monistaminen niin-15 kutsutulla polymeraasin katalysoimalla ketjureaktiolla [PCR; Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki, R.K. et ai.. Science 230 (1985) 1350-1354; Mullas, K.B. ja Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] voidaan toteuttaa "DNA. thermal cycler,,-tekniikalla (Perkin Elmer Cetus) val-20 mistajan esittämällä tavalla.

Nukleotidisekvenssit voidaan varmistaa Sanger*in et ai. kehittämällä menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467] käyttäen yhtiön Amershäm markkinoimaa reägenssipakkausta.

25 Esimerkki 1 Tässä esimerkissä osoitetaan, että m-kalpaiinin lisääminen kaniinin retikulosyyteistä (nuorista punasoluista) saatuun hajotteeseen johtaa villityypin p53-proteiinin seka tiettyjen mutatoituneiden muotojen hajoamiseen. Tämä esi-30 merkki osoittaa samoin, että kalpaiinin inhibiittorit kykenevät inhiboimaan p53m hajoamista ja näin ollen muuttamaan tämän proteiinin aktiivisuutta.

1.1. Hajoamisen osoitus: Hiiren ja ihmisen villi-tyypin p53~proteiineja sekä erilaisia mutatoituneita p53-35 proteiineja (ihmisproteiineja C273, H273, ΗΓ75, 1247) il mennettiin kaniinin retikulosyyttien hajotteessa. Täten 16 saadut proteiinit vastustavat kaikkea hajotusta, jopa kalsiumin suurten pitoisuuksien läsnä ollessa. Naudan nt-kal-paiinin (Sigma) lisääminen r e t iku1osyy11 i en hajohteeseen kalsiumin läsnä ollessa johti näiden juuri syntetisoitunei-5 den proteiinien nopeaan häviämiseen ja proteolyyttisten, eiektroforeettisesti erottuvien kappaleiden ilmaantumiseen.

Muiden proteiinien kuten dihydrofolaattireduktaasin tai glyseraldehydi-3-fosfaathi-dehydrogenaasin kyky vas tustaa hajoamista näissä samoissa koeolosuhteissa osoittaa tämän 10 substraatin spesifisyyden tässä reaktiossa, 1.2. Kalpaiinin iiihlbiittoreiden käyttö p53-proteiinien pitoisuuden muuttamiseksi: Edellä olevassa esimerkissä 1.1 on osoitettu, että m-kalpaiinin lisäys johti p53~ proteiinien hajoamiseen. Tässä esimerkissä reaktioseokseen 15 lisättiin m-kalpaiinin lisäksi muita eri komponentteja, joiden kyky inhiboida kalpaiinin aktiivisuutta haluttiin selvittää. Saadut tulokset osoittavat, että kalsiumia kela-toivan aineen (EGTA) sekä kalpaiinien spesifisen peptidi-inhibiittorin (joka on saatu fysiologisesta inhibiittorista 20 eli kalpastatiinista; Mäki et ai,, J. Biol, Chem., 254, 18866-18869, 1989) lisääminen kykenee inhiboimaan ulkopuolisella kalpaiinilla indusoitua p53-proteiinien hajoamista.

Esimerkki 2

Edellisessä esimerkissä on osoitettu, että ulkopuo-25 lisen (’’eksogeenisen"): kalpaiinin lisääminen p53-proteiinieii liuokseen johtaa niiden hajoamiseen. Tämä esimerkki osoittaa, että sytopläsmisissa uutteissa läsnä olevat endogeeni-set kalpaiinit voivat johtaa villi tyypin p53-proteiinin sekä tiettyjen mutatoituneiden muotojen hajoamiseen. Tämä esi-30 merkki osoittaa samoin, että kalpaiinien inhibiittorit kykenevät inhiboimaan endogeenisen kalpaiinin läsnä ollessa p53:n hajoamista ja siis muuttamaan tämän proteiinin aktiivisuutta.

2.1. Hajoaminen endogeenisten kalpaiinien vaikutuk-35 sesta: Hiiren ja ihmisen villityypin p53^proteiineja sekä \ erilaisia mutatoituneita muotoja (vrt, esimerkki 1) iIrnen- | 17 nettiin kaniinin retikulosyyttien hajotteessa, minkä jälkeen niitä inkubo.it iin ihmisen lymfoblastoidisoiujen Daudi tai Jurkat sytoplasmasta saatujen uutteiden läsnä ollessa. Syto-plasmauutteet valmistettiin seuraavalla tavalla: soluja 5 {talletettu kantakokoelmaan ATCG) viljeltiin DMEM-alustässä, jota oli täydennetty 10 % sikiövasikan seerumia. Sitten solut otettiin talteen, ne pestiin PBS-puskurilla ja niitä in~ kuboitiin 5 minuuttia hypötonisessa hajotuspuskurissa, joka ei sisältänyt pinta-aktiivista ainetta (HEPES 20 rnM pH 7,5; 10 KQäc 10 rnM; MgOAo 1, 5 inM, 2 ml 5 x 10B solua kohden) . Hajotus vietiin loppuun käyttäen Dounce-homogenisaattoria, minkä jälkeen sitä tarkasteltiin mikroskoopilla. Sitten tumat poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 2 000 x g 5 minuutin ajan ja supernatantteja sentrifugoitiin nopeudella 10 000 g 15 1 tunnin ajan {Beckman SW60) . Sitten nämä sytoplasmauutteet jaettiin erillisiksi näytteiksi, joiden pitoisuus oli 5 - 12 mg/ml.

Kun retikulosyyttien hajotetta inkuboitiin sytoplasmasta saatujen uutteiden läsnä ollessa ilman kalsiumia, 20 niin minkäänlaista hajoamista ei todettu. Sitä vastoin, kalsiumin läsnä ollessa todettiin p53-proteiinien hyvin nopea hajoaminen, joka johti proteolyyttisten tuotteiden esimerkissä 1 saadun kaltaiseen tunnusomaiseen profiiliin. Tämä koe: osoittaa hyvin, että endogeeniset kalpaiinit hajot-25 tavat p53-proteiineja.

2.2. Kalpaiinin inhibiittoreiden käyttö p53-proteiinien pitoisuuden muuttamiseksi: Kalsiumin kelatointi EGTA:lla sekä koko proteaasi-inhibiittoreiden joukon (leu-peptiinin, aprotiniinin, soijapavun trypsiini-inhibiittorin 30 ja PMSF:n) ja erityisesti kalpas ta t i inipeptidin käyttö osoittavat, että näiden proteiinien hajoaminen riippuu sy-toplasmauutteessa läsnä olevista kalpaiineista, ja että erilaisia yhdisteitä, jotka kykenevät muuttamaan kalpaiini-en aktiivisuutta, voidaan käyttää p53-proteiinin pitoisuu-35 den säätelemiseksi.

18

Esimerkki 3 Tämä esimerkki osoittaa, että hiiren ja ihmisen villityypin p53-proteiinit ovat sytopiasmauutteissa läsnä olevien kalpaiinien suoria substraatteja.

5 Esimerkit 1 ja 2 osoittavat:, että kaipadin.it: voivat johtaa p53:n hajoamiseen monimutkaisissa reaktioseoksissa.

Näissä kokeissa ei kuitenkaan pois suljeta sitä, että käytetyissä olosuhteissa kalpaiinit aktivoivat sekundäärisiä- pro-teaaseja, jotka juuri todella vaikuttavat p53-proteiiniin.

10 Tässä esimerkissä toteutetaan seuraava köe: (1} kaniinin re-tikulosyyttien hajotteessa juuri syntetisoituja hiiren ja ihmisen villityypin p53-proteiineja inkuboitiin 30 minuuttia Daudi-solujen sytoplasmasta saadun uutteen läsnä ollessa sekä kalsiumin läsnä ollessa kalpaiinien aktivoimiseksi esi-15 merkissä 2 kuvatulla tavalla, (2) sitten reaktioseokseen lisättiin p53-proteiinia ja reaktion annettiin jatkua 30 minuuttia kalpaiineille edullisissa olosuhteissa (samoissa reaktio-olosuhteissä) tai epäedullisissa olosuhteissa (lisätty joko EGTA:tä kalsiumin kelatoimiseksi täi kalpaa täti inipep-20 tidiä). Kalsiumin läsnä ollessa juuri lisätty p53-proteiini hajoaa täydellisesti, mikä osoittaa, että proteaasi on aktiivista koko kokeen ajan- Kun sitä vastoin kalpaiinit inhiboidaan läsnä olevalla EGTÄ:lla tai merkittäväxnmällä tavalla kalpastatiinipeptidillä, niin tällöin juuri lisätty p53-25 proteiini ei hajoa. Tämä viimeksi mainittu havainto sulkee siis pois sen mahdollisuuden, että kokeen ensimmäisessä osassa kalpaiinit Olisivat johtaneet siihen,, että jokin toinen proteaasi olisi aiheuttanut p53:n hajoamisen (kuvio 1). !

Esimerkki 4 30 Tässä esimerkissä kuvataan sellaisen yhdistelmä- DNA'-teknis en adenovir uksen muodostamihen, joka virus käsittää kalpastatiinia koodaavan nukleiinihapposekvenssin. Tämä adenovirus muodostetaan yhdistämällä toisiinsa homologises-ti epätäydellinen adenovirus Ad-dll324 sekä piasmidi, joka 35 käsittää sekvenssin SEQ ID NO. 1 RSV-promoottorin säätelyn alaisuudessa.

19 4.1. Plamidin SEQ ID £30. 1 muodostaminen Tämä plasmidi SEQ ID NO. 1 käsittää kalpastatiinia koodaavan sekvenssin LTR-RSV-promoo11arin säätelyn alaisuudessa sekä homologisen yhdistämisen sallivia alueita 5 adenoviruksesta. Se muodostetaan istuttamalla sekvenssi SEQ ID NO. 1 plasmidi in pAd. RSVSgal. Tämä plasmidi pAd. RSVEGal sisältää suunnassa 5' --> 3' - PvuII-kappaleen, joka vastaa adenoviruksen Ad5 vasenta päätä, käsittäen: ITR-sekvenssin, replikaation aika- 10 miskohdan, kapselointisignaalit ja ElA-monistajan; - β-galaktosidaasia koodaavan geenin RSV- (Rous-sarkoomavirus) -promoottorin säätelyn alaisuudessa, - toisen kappaleen Ad5~adenoviruksen perimästä, joka kappale tekee mahdolliseksi plasmidin pAd.RSVSGal ja 15 adenoviruksen dl324 välisen homologisen yhdistämisen. Plasmidi pÄd.RSVfiGal on kuvattu julkaisussa Stratford-Perricaudet et ai., J, Olin, Invest. 90 {1992) 626.

4.2. Yhdistelmä-DNA-teknisen adenoviruksen muodostaminen 20 Kohdassa 4.1 kuvattu vektori tehdään lineaariseksi ja se transfektoidean auttajasoluihin (soluiinja 293) yhdessä erään epätäydellisen adenovirusvektorin kanssa, jonka mukana saadaan trans-asemaan adenoviruksen El-alueisiin (ElA ja EllB) koodautuneet toiminnot.

25 Tarkemmin esittäen, tämä yhdistelmä-dna-tekninen adenovirus saadaan yhdistämällä in vivo homologisesti adenövirusmutantti Ad-di1324 (Thimmappaya et ai., Cell 31 (1982) 543) sekä esimerkissä 4.1. kuvattu vektori seuraavalla; tavalla, menettelemällä: plasmidi SEQ ID NO. 1 ja entsyy- 30 millä Clal lineaariseksi tehty adenovirus Ad-dll324 trans-fektoidaan yhdessä solulinjaan 293 kalsiumfosfaatin läsnä ollessa niiden homologiseksi yhdistämiseksi. Tällä tavalla saadut yhdistelmä-DNA-tekniset adenovirukset valikoidaan plakkipuhdistuksella Eristämisen jälkeen tämä yhdis.telmä- 35 DNA-teknisen adenoviruksen DNA monistetaan, solulinjassa 293, minkä seurauksena saadaan viljelmän supernatantti, joka si- t i 2 0 sältää tätä. puhdistamatonta epätäydellistä yhdistelmä-DNÄ-teknistä adenovirusta noin 1010 pfu/ml olevana tiitterinä.

Virushiukkaset puhdistetaan sentrifugoimalla kee-siumkloridigradientin avulla tunnettujen tekniikoiden mukai-5 sesti (katso erityisesti Graham et ai., Virology 52 (1973) 456) . Saatua adenovirusta voidaan säilyttää -80 DC:ssä. 20 % glyserolissa.

21

Sekvenssi1istaus il) yleisiä tietoja: (ij Hakija: (A) Nimi: Rhone-Poulenc Rorer S.A.

(B) Katuosoite: 20, avenue Raymond Aron (C) Kaupunki: Antony (E) Maa: Ranska (F) Postinumero: 92165 (ii) Keksinnön nimitys; Menetellä: syövän hoitamiseksi p53-proteiinia sääte1emä11ä (lii) Sekvenssien lukumäärä: 2 (iv) Tietokoneella luettava muoto: (A) Kantaja: Nauha (B) Tietokone: IBM PC-yhteensopiva

(C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS

(D) Ohjelma: Patentin Release #1,0, vers io 1.30 (ΟΞΒ) (2) Sekvenssiin SEQ ID NO. 1 liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: (A) Pituus: 2 085 emäsparia

Tyyppi: nukleotidi (C) Juosteiden lukumäärä: kaksi (D) Rakenne: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA (lii) Hypoteettinen: ei (iv) Vas tasuuntainen: ei {vi) Alkuperä: (A) Organismi: Homo sapiens (ix) Erityisiä piirteitä:

(A) Nimi/avain; CDS

(B) Sijainti: 1. . .2085 (D) Lisätietoja: /tuote= "ihmisen kalpastätiini1' (xi) Sekvenssin SEQ ID NO. 1 kuvaus:

ATG GAA GSft CCft CAT CTT CCT AAC AAG AAA AAA CAC ΛΑΑ AAA CAG GCT 4B

Hat Glu Gly Siro Hia Leu Pro Aan Lys Lys Xys His lys Lys Gin Ala 1 5 10 15 GTA ΑΛΑ ACA GAA CCT GAG AAG ASG TCA CAG TCA ACC AAG CTG TCP GTG 96

Vai Lys Thr Glu Pro Glu Lys Lys Ser Gin Ser Thr Lys Leu Ser Vai 20 25 30 GST CAT SAG A AA AAA TCC CAA GAA GGA AAG CCA AAA GAA CAC AGA GAG 144

Vai His Glu Lys Lys Sar Gin Glu Gly Lys Pro Lys Glu His Thr GlU

35 .....40 45 CCA AAA AGC CTA CCC AAG CAG GCA TCA GAT ACA GGÄ AGT AAC GAT GCT I92

Pro Lys Ber Leu Pro Lys Gin Ala Bar Asp Thr Gly Ser Asn Asp Ala 22

50 55 SO

CAC AM? AAA AAA GCA GOT TCC AGA TCA GCT GAA CAG CAG CCA TCA GAG 240

His Asn Lys Lys Ala Val: Ser Arg Ser Ala Glu Gin Gin Pro Ser Giu 65 70 75 SO

AAA TCA ACA GAA CCA AAG ACT AAA CCA CAA GAC ATG ATT TCT GCT GGT 288

Lys Ser Thr Glu Pro Lvs Thr Lys Pro Gin Asp Met lie Sar Ala Gly 85 90 35 GGA GAG AST GTT GCT GGT ÄTC ACT GCA ATA TCT GGC AAG CCG GGT GAC 336

Gly Glu Ser Val Ala Gly lie Thr Ala lie Ser Gly Lys Pro Gly Asp 100 105 110 AAG AAA AAA GAk AAG AAA TCA TTA ACC CCA GCT GTG CCA GOT GAA TCT 384

Lys Lys Lys Glu Lys Lys Ser Leu Thr Pro Ala Val Pro Val Glu Ser 115 12Q 125 AAA CCG GAT AAA CCA TCG GGA AAG TCA GGC ATG GAT GCT GCT TTG GAT 432

Lys Pro Asp Lys Pro Ser Gly Lys Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp 130 135 140

GAC OTA ATA GAT ACT TTA GGA GGA GCT GAA GAA ACT GAA GAA GAA AAT 48Q

Asp Leu lie Asp Thr Leu Gly Gly Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asn 145 150 155 160 ACA ACG TAT ACT GGA CCA GAA GOT TCA GAT CCA ATG AGT TCC ACC TAC 528

Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr 165 170 175 ATA GAG GAA TTG GGT AAA AGA GAA GTC ACA ATT CCT CCA AAA TAT AGG 576 lie Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu Val Thr lie Pro Pro Lys Tyr Arg 1B0 185 190 GAA CTA TTG GCT AAA AAG SAA GGG ATG ACA GGG CCT GCT GCA GAG TCT 624

Glu Leu Leu Ala Lvs Lys Glu Gly Tie Thr Gly Pro Pro Ala Asp Ser 195 200 205 TCA AAA CCC ATA GGG CCA GAT GAT GCT ATA GAC GCC TTG TCA TGT GAC 672

Ser Lys Pro lie Gly Pro Asp Asp Ala He Asp Ala Leu Ser Ser Asp 210 215 220 TTC ACC TGT GGG TCG CCT ACA GCT GCT GGA AAG AAA ACT GAA AAA GAG 720

Phe Thr Cys Gly Ser Pro Thr Ala Ala Gly Lys Lys Thr Glu Lys Glu

225 230 235 24Q

GAA TCT ÄGÄ GAA GOT OTA AAA GCT CAG TCA GCA GGG ACA GTC AGA AGT 768

Glu Ser Thr Glu Val Leu Lys Ala Gin Ser Ala Gly Thr Val Arg Ser 245 250 255 GCT GCT CCA CCC CAA GAG AAG AAA AGA AAG GTG GAG AAG GAT ACA ATG Blfi

Ala Ala Pro Pro Gin Glu Lys Lys Arg Lys Val Glu Lys Asp Thr Met 260 265 270 AST GAT CAA GCA CTC GAG GCT CTG TCG: GCT TCA GTG GGC ACC CGG GAA 864

Ser Asp Gin Ala Leu Glu Ala Leu Ser Ala Ser Leu Gly Thr Arg Gin 275 280 285 GCA GAA CCT GAG CTC GAC CTC CGC TCA ATT AAG GAA GTC GAT GAG GCA :512

Ala Glu Pro Glu Leu Asp Leu Arg Ser Ile Lys Glu Vai Asp GIU Ala 290 295 300 AAA GCT AAA GAA GAA AAA CTA GAG AAG OTT GGT GAG GAT GAT GAA ACA 960 23

Lys Ala Lys Glu GXu Lys Leu Glu Lys Cys Gly Glu Asp Asp Glu Thr 305 310 315 320

ATC GCA TCI1 GAG TAG AGA TTA AAA CCA GCC ACG GAT AAA GAT GGA AAA 10OB

lie Pro Ser Glu Tyr Arg Leu Lys Pro Ala Thr Asp Lys Asp Gly Lys 325 330 335 CCA CTA TTG CCA GAG CCT GAA GÄA AAA CCC AAG CCT CGG AGT GAA TCA 1056

Pro Leu Leu Pro Glu Pro Glu Glu Lys Pro Lys Pro Arg Ser Glu Set 340 345 350 GAA CTC ATT GAT GAA CTT TCA GAA GAT TTT GAC CGG TCT GAA TGT AAA 1104

Glu Leu Tie Asp Glu. Lau Ser Glu Asp Phe Asp Arg Ser Glu Cys Lys 355 360 365 GAG AAA CCA TCT AAG CCA ACT GAA AAG ACA GAA GAA TCT AAG GCC GCT 1152

Glu Lys Pro Ser Lys Pro Thr Glu Lys Thr Glu Glu Ser Lys Ala Ala 370 375 3B0 GCT CCA GCT CCT GTG TCG GAG GCT GTG TCT CGG ACC TCC ATG TGT AGT 1200

Ala Pro Ala Pro Vai Ser Glu Ala Val Ser Arg Thr Ser Met Cys Ser 385 390 ' 395 400 ATA GAG TCA GCA CCC CCT GAG CCG GCT ACC TTG AAG GGC ACA GTG CCA 1248 lie Gin Ser Ala Pro Pro Glu Pro Ala Thr Leu Lys Gly Thr Val Pro 405 410 415 GAT GAT GCT GTA GAA GCC TTG GCT GAT AGC CTG GGG AAA AAG GAA GCA 1296

Asp Asp Ala Vai Glu Ala LSU Ala Asp Ser Leu Gly Lys Lys Glu Ala 420 425 430 GAT CCA GAA GAT GGA. AAA CCT GTG ATS GAT AAA GTC AAG GAG AAG GCC 1344

Asp Pro Glu Asp Gly Lys Pro Vai Het Asp Lys Val Lys Glu Lys Ala 435 440 445 AAA GAA GAA GAC CGT GAA AAG CTT GGT GAA AAA GM GAA ACA ATT CCT 13:92

Lys Glu Glu Asp Arg Glu Lys Lau Gly Glu Lys Glu Glu Thr lie Pro 450 455 460 CCT GAT TAT AGA TTA GAA GAG GTC AAG GAT AAA GAT GGA AAG CCA CTC 1440

Pro Asp Tyr Arg Leu Glu Glu Val Lys Asp Lys Asp Gly Lys Pro Leu 465 470 475 4B0 CTG CCA AAA GAG TCT AAG GAA CAG CTT CCA CCC ATG AGT GAA GAC TTC I486

Leu Pro Lys Glu Ser Lys Glu Gin Leu PrO Pro Met Ser Glu Asp Phe 485 490 495 CTT CTG GAT GCT TTG TCT GAG GAC TTC TCT GGT CCA CAA AÄT GCT TCA 1535

Leu Leu Asp Ala Leti Bar Glu Asp Phe Ser Glv Pro Gin Asn Ala Ser 500 505 510 TCT CTT AAA TTT GAA GAT GCT AAA CTT GCT GCT GCC ATC TCT GAA GTG 1584

Ser Leu Lys Phe Glu Asp Ala I.-ys Leu Ala Ala Ala lie Ser Glu Val 515 520 525 | GTT TCC CAA ACC CCA GCT TCA ACG ACC CAA GCT GGA GCC CCA CCC CGT 1632

Val Sex Gin Thr Pro Ala Ser Thr Thr Gin Ala Gly Ala Pro Pro Arg 530 535 540 GAT ACC TCG CAG AGT GAC AAA GAC CTC GAT GAT GCC TTG GAT AAA CTC; 1680

Asp Thr Ser Gin Ser Asp Lys Asp Leu Asp Asp Ala Leu Asp Lys Leu 545 550 555 560 24 TCT (SAC ACT CTA GGA CAA AGS CAG CCT GAC CCA GAT GAG AAC AAA CCA 172«

Ser Asp Sar Leu Gly Gin Arg Gin Fro Asp Pro Asp Glu Asn Lys Pro 565 570 575 ATG GGA GAT AAA GTA AAG GAA AAA GCT AAA GOT GAA CAT AGA GAC AAG 1776

Het Gly Asp Lys Val Lys Glu Lys Ala Lys Ala Glu His Arg Asp Lys 580 535 590 CTT GGA GAA AGA GAT GAC ACT ATC CCA CCT GAA TAG AGA CAT CTC CTG 1324

Leu Gly Glu Arg Asp Asp Thr lie Pro Pro Glu Tyr Arg His Leu Leu

595 ,600 60S

GAT GAT AAT GGA CAG GAC AAA CCA GTG AAG CCA CCT ACA AAG AAA TCA 1872

Asp Asp Asm Gly Gin Asp Lys Pro Val Lys Pro Pro Thr Lys Lys Ser 610 515 620 GAG GAT TCA AAG AAA CCT GCA GAT GAC CAA GAC CCC ATT GAT GCT CTC 1920

Glu Asp Ser Lys Lys Pro Ala Asp Asp Gin Asp Pro lie Asp Ala Leu 625 630 635 640 TCA GGA GAT CTG GAC AGC TGT CCC TCC ACT ACA GAA ACC TCA CAG AAC 1968

Ser Gly Asp Leu Asp Ser Cys Pro Set Thr Thr Glu Thr Ser Gin Asn 645 650 655 ACA GCA AAG GAT AAG TGC AAG AAG GCT GCT TCC AGC TCC AAA GCA CCT 2016

Thr Ala Lys Asp Lys Cys Lys Lys Ala Ala Ser Ser Ser Lys Ala Pro 660 565 670 AAG AAT GGA GGT AAA GCG AAG GAT TGA GCA AAG ACA ACA GAG SAA ACT 2064

Lys Asn Gly Gly Lys Ala Lys Asp Set Ala Lys Thr Thr Glu Glu Thr 675 680 685 TCC AAG CCA AAA GAT GAC TAA 2085

Ser Lys Pro Lys Asp Asp * 690 695 (2) Sekvenssiin SEQ ID NO, 2 liittyvät tiedot: j (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: j (A) Pituus: 399 emäsparia (B) Tyyppi: nukleotidi (G) Juosteiden lukumäärä: kaksi (Dj Rakenne: lineaarinen

lii')' Molekyylin tyyppi: cDNA

(iii) Hypoteettinen: ei (lv) Vastasuuntainen: ei (vi) Alkuperä: (A) Organismi: Homo sapiens j

(ix) Erityisiä piirteitä: J

(A) Nimi/avain: GDS j (B) Sijainti: 1...2085 25

Cxi). Sekvenssin SEQ ID NO. 3 kuvaus: TCA GGC ATG GAT GCT GCT TTG GAT GAC TTA ATA GAT ACT TTA GGA GGA 48

Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp Asp Leu lie Asp Thr Leu Gly Gly 700 705 710 CCT GAA GAA ACT GAA GAA GAA AAT ACA ACG TAT ACT GGA CCA GAA GTT 96

Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asu Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val 715 720 725 TCA GAT CCA ATG AGT TCC ACC TAG ATA GAG GAA TTG GGT AAA AGA GAA 1 44

Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr lie Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu 730 735 740 GTC ACA ATT CCT CCA AAA TAT AGG GAA CTA TTG GCT AAA AAG GAA GGG 192

Val Thr lie Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu Ala Lys Lvs Glu Gly 745 750 755 ATC ACA GGG CCT CCT GCA GAC TCT TCA AAA CCC ATA GGG CCA GAT GAT 240

He Thr Gly Pro Pro Ala Asp Ser Ser Lys Pro He Gly Pro Asp Asp 750 765 770 775 GCT ATA GAC GCC TTG TCA TCT GAC TTC ACC TGT GGG TCG CCT ACA GCT 288

Ala lie Asp Ala Leu Ser Ser Asp Phe Thr Cys Gly Ser Pro Thr Ala 780 785 790 GCT GGA AAG AAA ACT GAA AAA GAG GAA TCT ACA GAA GTT TTÄ AAA GCT 336

Ala Gly Lys Lys Thr Glu Lys Glu Glu Ser Thr Glu Val Leu Lys Ala 795 800 805 CAG TCA GCA GGG ACA GTG AGA AGT GCT GCT CCA CCC CAA GAG AAG AAA 384

Gin Ser Ala Gly Thr Vai Aro Ser Ala Ala Pro Pro Gin Glu Lys Lys 810 '815 820 AGA AAG GTG GAG AAG 399

Arg Lys Val Glu Lys 825

Claims (12)

1. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että tämä yhdiste on kalpaiinin aktiivisuutta inhiboiva proteiini tai polypeptidi tai tällaista 10 polypeptidiä tai proteiinia koodaava nukleiinihappose-kvenssi. 3. : Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, tun-n e t t "u siitä, että tämä yhdiste on sellainen proteiini tai polypeptidi,. joka inhiboi spesifisesti kalpaiinilla 15 olevaa, villityypin p:53-proteiiniin kohdistuvaa aktiivi suutta, tai tällaista polypeptidiä tai proteiinia koodaava nukle i inihappösekvens si.
2. 4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen käyttö, tunne t t u siitä, että tämä nukleiinihappo on vektorin 2. osa.
3. 5. Pa t en 11 ivaa t imuks en 4 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että tämä nukleiinihappo on adenovirus-ten, retrovirusten ja adenoviruksiin liittyvien virusten joukosta valitun virusvektorin osa.
4. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että nukleiinihappo on liposomi-, lipidi-vektorin osa.
5. 7. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yhdiste on nuk- 30 leiinihappo, johon kalpaatätiini on koodautunut kokonaan tai osittain.
6. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että tämä nukleiinihappo käsittää kokonaan tai osittain sekvenssin SEQ ID NO. 1 tai sen jonkin 35 johdannaisen.
7. 9. Eat eritti vaatimuksen 8 mukainen; käyttö, tunnettu siitä/ että tämä nukleiinihappo on valittu sekvensseistä SEQ ID NO. 1 ja .2.
8. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, t u n -S net t u siitä, että nukleiinihappo on valittu sekvenssien SEQ ID NO. 1 tai 2 sellaisista johdannaisista, joihin koo-dautuneet inhibiittorit ovat spesifisiä villityypin p53-proteiinin hajoamiselle.
9. 11. Farmaseuttinen koostumus, jonka käsittämään 10 nukleiinihappösekvenssiin on koodautunut koko kalpastätiini tai sen osa tai sellainen kalpaiinin johdannainen, joka kykenee hajottamaan spesifisesti mutatoituneita p53-prote-iineja ja joka nukleiinihapposekvenss.i: käsittää sekvenssin nro 1, sekvenssin nro .2 tai niiden osan. IS 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen koostumus, jo ka on valmistettu kasvaimen sisään annettavaan muotoon.