CZ367197A3

CZ367197A3 - Varianty apolipoproteinu A-I a farmaceutická kompozice, která je obsahuje

Info

Publication number: CZ367197A3
Application number: CZ973671A
Authority: CZ
Inventors: Gerd Assmann; Patrick Benoit; Eric Bruckert; Patrice Denefle; Nicolas Duverger; Jean-Charles Fruchart; GéRALD LUC; GéRARD TURPIN; Harald Funke
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.; Institut Pasteur De Lille; Universite Pierre Et Marie Curie
Priority date: 1995-05-22
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 1998-03-18
Also published as: CZ291376B6; CA2218759A1; AU5904896A; HUP9802926A3; FR2734568B1; NO975367L; SK156397A3; NO975367D0; WO1996037608A1; AU717202B2; KR19990021828A; BR9608813A; MX9708727A; IL118336A0; HUP9802926A2; JPH11505712A; EP0827538A1; TW434260B; FR2734568A1; ZA964097B

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových variant apolipoproteinu A-I. Týká se také všech nukleových kyselin kódujících tyto nové varianty. Vynález se týká zejména použití těchto proteinů nebo nukleových kyselin v terapii. Týká se také nových variant apolipoproteinu A-I obsahujících zejména mutaci v poloze 151.

Dosavadní stav techniky

Apolipoprotein A-I (apoA-I) je především složen z lipoproteinů vysoké hustoty (HDL), které jsou makromolekulárními komplexy obsahující cholesterol, fosfolipidy a triglyceridy. Apolipoprotein A-I je protein složený z 243 aminokyselin, syntetizován ve formě proproteinu s 267 rezidui, mající molekulovou hmotnost 28 000 daltonů. Forma prepro apoA-I je syntetizována u člověka zároveň játry a střevem. Tato forma proteinu je pak štěpena na proprotein, který je sekretován do plazmy. Ve vaskulární soustavě je proapoA-I transformován v konečný protein (243 aminokyselin) činností proteázy, která je závislá na vápníku. Apolipoprotein A-I má strukturní a aktivní úlohu v metabolizmu lipoproteinů: apoA-I je zejména kofaktorem lecitincholesterolacyltransferasy (LCAT), odpovědné za esterifikaci plazmidového cholesterolu.

Hladina cholesterolu obsaženého ve frakci HDL a plazmatická koncentrace apoA-I jsou nebezpečnými negativními faktory pro vývoj atherosklerosy u člověka. Epidemiologické studie mají vskutku ukázat korelaci inverze mezi koncentrací cholesterolu HDL a apoA-I a následkem kardiovaskulárních nemocí (E.G. Miller et al. Lancet, 1977: 965-968). Naproti • ·

tomu dlouhověkost bude spojována s vysokou hladinou cholesterolu HDL. Nedávno ochraná úloha apoA-I byla ukázána na modelu transgenní myši exprimující lidský apoA-I (Rubín et al. Nátuře). Infuze HDL u králíků indukuje regresi poruch (Badimon et al. J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990). Byly navrženy různé mechanizmy pro vysvětlení vlivu protektoru HDL a také úlohy HDL v inverzním transportu cholesterolu (Frichart et al. Circulation, 87: 22-27, 1993) a činosti antioxydantu HDL (Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354-364, 1994).

Byl klonován a sekvenován gen kódující apoA-I (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12 (9) (1984) 3917). Tento gen délky 1863 pb, obsahuje 4 exony a 3 introny. Byla také popsána cDNA kódující apoA-I (Law et al., PNAS 81 (1984) 66). Tato cDNA obsahuje 840 pb (viz SEQ ID n°l). Kromě divoké formy apoA-I byly popsány různé přírodní varianty, jejichž rozdíly vzhledem k divokému v přírodě se vyskytujícímu proteinu jsou uvedeny v následující tabulce.

Varianta	Mutace	Varianta	Mutace
Milano	Argl73Cys	Norway	Glul36Lys
Marburg	Lysl07		Prol65Arg
Munster2B	Alal58Glu		Pro3His
Giessen	Prol43Arg		ArglOLeu
Munster3A	Aspl03Asn		Gly26Arg
Munster3B	Pro4Arg		Asp89Glu
Munster3C	Pro3Arg		LyslO7Met
Munster3D	Asp213Gly		Glul39Gly
Munster4	Glul98Lys		Glul47Val
Yame	Aspl3Tyr		Alal58Glu
	Asp213Gly		Glul69Gln
			Argl77His

· ····

Podstata vynálezu

Předložený vynález vyplývá z prokázání nové série variant apolipoproteinu A-I. Tato série variant představuje zvláště substituci rezidua argininu v poloze 151 residuem cysteinu. Varianta apoA-I podle předloženého vynálezu nabízí znamenité terapeutické vlastnosti. Má zvláště důležité vlastnosti chránění anti-aterogenu. V situaci extrémě nízké hladiny cholesterolu ve frakci HDL, spojené s nypertriglyceridemií, přítomnost této varianty zabraňuje vývoji arterosklerosy, tak svědčí o své velmi silné chránící úloze, specifické pro tento mutovaný apoA-I. Přítomnost cysteinu na apoA-I podle vynálezu způsobuje tvorbu dimerů a dalších komplexů tvořených disulfidovým můstkem. Tento apoA-I se nachází ve volné formě v plazmě, vázaný v dimery nebo vázaný s apolipoproteinem A-II, který je dalším důležitým proteinem spojeným s HDL, a který má také cystein ve své sekvenci. Jinak ztráta náboje vázaného argininu v poloze 151 způsobuje viditelnost tohoto mutantu elektroisofokalisací plazmatických proteinů imunologického objevu apoA-I.

Tyto nové proteiny podle vynálezu nabízejí důležitou terapeutickou výhodu v léčení a v prevenci nemocí kardiovaskulárních.

První předmět vynálezu se týká serie variant lidského apolipoproteinu A-I obsahujícího cystein v poloze 151. Sekvence aminokyselin apolipoproteinu A-I standardu je popsána v odborné literatuře (viz Law Précitée). Tato sekvence, zahrnující oblast prepro (rezidua 1 až 24) je představována v sekvenci SEQ ID n°l. Charakteristika variant podle vynálezu vychází tedy z přítomnosti cysteinu v poloze 151 konečného apoA-I (odpovídající poloze 175 v sekvenci SEQ ID n°l) v nahražení argininu přítomného v sekvenci standardu. Upřednostňovaná varianta podle vynálezu obsahuje peptidovou sekvenci SEQ ID n°2, zvláště pak peptidovou sekvenci

obsaženou mezi rezidui 68 až 267 sekvenci SEQ ID n°l, reziduum 175 je nahrazeno cysteinem.

Varianty podle vynálezu jsou reprezentovány zejména apoA-I Paris, může se říci apoA-I, který má v poloze 151 cystein vzhledem k nativnímu apoA-I. Varianty podle vynálezu mohou nést další strukturní modifikace vzhledem k apolipoproteinu A-I standardu, zejména jiné mutace, delece nebo/a adice. Varianty podle vynálezu zahrnují také další mutace vedoucí k nahrazení jednotlivých residuí cysteinem. Jiná varianta kombinuje přítomné mutace ve variantě apoA-I Paris a apoA-I milano. Mohou také být přítomny jiné mutace, které však nemodifikují významným způsobem vlastnosti apoA-I. Aktivita těchto variant může být ověřena zejména testem na cholesterol.

Varianty podle vynálezu mohou být získány různými způsoby. Mohou být především chemicky syntetizovány díky technikám odborníky používajícími pro syntézu peptidů. Mohou být také získány od apoA-I standardu mutací či mutacemi. S výhodou se jedná o rekombinantní proteiny, získané expresí odpovídající nukleové kyseliny do hostitelské buňky, jak je popsáno dále.

Jak je naznačeno výše, varianty podle vynálezu se mohou nacházet ve formě monomerů nebo ve formě dimerů. Přítomnost cysteinu alespoň v sekvenci variant vynálezu dovoluje vskutku tvorbu dimerů disulfidovým vázáním. Může se jednat o homodimery tj. dimery odpovídající dvěma variantám podle vynálezu (např. diapoA-I Paris), nebo heterodimerů tj. dimerů obsahujících variantu podle vynálezu a jinou molekulu, která má volný cystein (např. ApoA-I Paris:ApoAII).

Jiný předmět vynálezu spočívá v nukleové kyselině kódující variantu apolipoproteinu A-I, která je dříve definovaná. Nukleová kyselina předloženého vynálezu může být kyseliny deoxyribonukleová (DNA) nebo kyselina ribonukleová

(RNA). V množině deoxyribonukleových kyselin se může jednat o komplementární DNA (cDNA), genomickou DNA (gDNA), o hybridní sekvence nebo syntetické sekvence nebo semisyntetické sekvence. Může se dále jednat o nukleovou kyselinu modifikovanou chemicky, např. z pohledu zvýšení své rezistence k nukleasam, z pohledu zvýšení své penetrace nebo svého buněčného zacílení, z pohledu zvýšení svého terapeutického účinku atd. Tyto nukleové kyseliny mohou být původu humáního, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, syntetického atd. Mohou být získány všemi odborníky známými technikami, zejména tříděním bank, chemickou syntézou nebo enzymovou sytézou sekvencí získaných tříděním bank.

S výhodou nukleová kyselina je cDNA nebo gDNA.

Nukleová kyselina podle vynálezu obsahuje sekvenci SEQ ID n°2. Ještě výhodněji se jedná o sekvenci SEQ ID n°10.

Nukleová kyselina podle vynálezu s výhodou obsahuje oblast promotoru funkční transkripce v buňce nebo cílovém organizmu, stejně jako oblast umístěnou na 3'konci, která specifikuje terminační signál transkripce a místo polyadenylace. Společně tyto elementy tvoří kazetu exprese. Může se jednat o oblast promotoru přirozeně odpovědnou za expresi genu apolipoproteinu A-I nebo varianty ApoA-I, když je tato schopná fungovat v buňce nebo určitém organizmu. Může se také jednat o oblasti různého původu (odpovědných za expresi dalších proteinů dokonce i syntetických). Může se jednat o sekvence promotoru genů eukariontních nebo virových. Na příklad se může jednat o sekvence promotorů vzniklých z genomu cílové buňky. Mezi promotory eukariontů se mohou používat všechny promotory nebo odvozené sekvence stimulující nebo potlačující transkripci genu, specifickým způsobem nebo nespecifickým, induktivně nebo neinduktivně, silně nebo slabě. Může se jednat o promotory např. (promotor genů HPRT, PGK, vimentin, a-aktin, tubulin atd.) promotory terapeutických genů (např. promotor genů MDR, CFTR, Fasteur

(promotor vazby

VII atd.) tkáňové specifické promotory pyruvátkinasy, vilin, střevního proteinu kyselin, α-aktin hladkého svalu atd.) odpovědné za stimulaci (receptor steroidnich receptor kyseliny retinové atd.). Může se jednat o promotorů vzniklých z genomu viru, např. se jedná o genu mastných nebo promotory hormonů, sekvence promotor genů E1A a MLP adenovirů, záhy vyvynutý promotor CMV, promotor LTR RSV atd. Tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány adicí aktivních sekvencí, regulačních sekvencí nebo sekvencí které dovolují expresi tkáňově specifickou nebo sekvenci majoritní.

Nuklevé kyseliny mohou také obsahovat signální sekvenci, řídící syntetizovaný produkt do sekrečních cest cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvencí apolipoproteinu A-I, ale může se také jednat o všechny další funkční signální sekvence nebo umělou signální sekvenci.

Nukleová kysela podle vynálezu může být použita pro tvorbu rekombinantních variant ApoA-I expresí do hostitelské rekombinované buňky nebo přímo jako medikament v aplikaci genové terapie nebo buněčné terapie.

Pro tvorbu rekombinantních variant podle vynálezu, nukleová kyselina je s výhodou inkorporována do plazmidového vektoru nebo virálního vektoru, který může být v autonomní replikaci nebo integrativní. Tento vektor je pak použit pro transfekci nebo infekci vybrané buněčné populace. Takto získané transfektované buňky nebo buňky infikované jsou kultivovány za podmínek dovolující expresi nukleové kyseliny a varianta rekombinantního apoA-I podle vynálezu je pak izolována. Použité hostitelské buňky pro produkci variant vynálezu rekombinantním způsobem jsou jak eukariontní, tak prokariontní. Mezi hostitelskými eukaryonty, které vyhovují, se mohou citovat zvířecí buňky, kvasinky, houby. Jedná-li se o kvasinky mohou se citovat rody Saccharomyces,

Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces nebo Hansenula. Jedná-li se o zvířecí buňky mohou se citovat buňky COS, CHO, CI27, NIH-3T3 atd. Jedná-li se o houby mohou se citovat s výhodou Aspergillus ssp. nebo Trichoderma ssp. Jako hostitelské prokaryontní buňky se přednostně mohou použít následující bakterie: Escherichia coli, Bacillus nebo Streptomyces. Varianta tak izolovaná může být potom upravená z pohledu svého terapeutického použití.

Nukleová kyselina podle vynálezu je použita přímo v názvu medikamentu, v aplikacích genové terapie nebo terapie buněčné. Z tohoto pohledu může být aplikována injekcí na úrovni místa k ošetření nebo inkubací s buňkami vzhledem k jejímu podávání. Bylo popsáno, že nukleové kyseliny nus mohou penetrovat do buněk bez speciálního vektoru. Nicméně se upřednostňuje, v rámci předloženého vynálezu, použití aplikovaných vektorů, dovolujících vylepšení (i) účinnosti buněčné penetrace, (ii) zacílení, (iii) stability extra- a intracelulární.

Předložený vynález se týká tak vektorů obsahujících nukleovou kyselinu, takovou jaká je definována dříve.

Mohou se použít různé typy vektorů. Může se jednat o virální nebo nevirální vektory.

Podle vynálezu se upřednostňuje vektor virální.

Použití virálních vektorů spočívá na přirozených vlastnostech transfekce virů. Je také možné použít adenoviry, viry oparu, retroviry, viry adenoassociované nebo viry neštovic. Tyto vektory se jeví účinně z hlediska transfekce.

Jedná se zejména o adenoviry, různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti byly charakterizovány. Mezi těmito serotypy se s výhodou používají v rámci předloženého vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz přihláška vynálezu

WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu použitelné v rámci předloženého vynálezu se mohou citovat adenoviry psího, hovězího, myšího (příklad: Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího, opičího (příklad: SAV) původu. Jedná-li se o adenovirus zvířecího původu je přednostně uveden adenovirus psí, zejména adenovirus CAV2 (např. kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci vynálezu se s výhodou používají adenoviry lidského nebo psího původu nebo jejich směs.

Defektivní adenovirus podle vynálezu obsahuje ITR, sekvenci dovolující enkapsidaci a nukleovou kyselinu. V genomu adenoviru předloženého vynálezu, oblast El je nefunkční. Zkoumanému virálnímu genu může být vrácen funkčnost všemi odborníky známými technikami, zejména úplným odstraněním, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více básí ve zkoumaném genu nebo zkoumaných genech. Takové modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, např. prostřednictvím technik genetického oboru nebo úpravou prostřednictvím mutagenních činitelů. Mohou být modifikovány další oblasti , zejména oblast E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). V oblasti předloženého vynálezu se s výhodou přednostně používá rekombinantní adenovirus představující deleci celku nebo části oblasti El a E4. Tento typ vektoru nabízí výhodné bezpečnostní vlastnosti.

Defektivní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny rekombinací homologů mezi adenoviry a plazmidy nesoucí mezi jiným aminokyselinu nebo kazetu podle vynálezu. Rekombinantní homolog se tvoří po kotransfekci jmenovaných adenoviůs a plazmidu v linii vhodných buněk. Použitá linie buněk musí zejména (i) být transformovatelná jmenovanými elementy a (ii) obsahovat ·· ··· · sekvence schopné komplemetnovat část genomu detektivních adenovirů, zejména ve formě integrované, aby se vyhnula nebezpečí rekombinace. Ku příkladu se může zmínit o linii lidské embrionální ledviny 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména včleněnou do svého genomu, levou část genomu adenovirů Ad5 (12%). Byla popsána další linie v přihlášce vynálezu n°WO94/26914 a WO95/02697.

Adenoviry, které jsou multiplety, jsou získány a čištěny podle klasických technik molekulární biologie, jak je ilustrováno v příkladech.

Viry adenoasociované (AAV) jedná se o viry DNA velikosti relativně redukované, které se integrují do genomu buněk, které infektují stabilním způsobem a na specifickém místě. Jsou schopné infektovat široké spektrum buněk, bez indukování vlivu na růst, morfologii nebo buněčnou diferenciaci. Jinak se nezdá, že jsou zahrnuty v patologiích u lidí. Genom AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Zahrnuje okolo 4700 basí a obsahuje na každém konci opakovanou změněnou oblast (ITR) se 145 basemi, které jsou původu replikačního pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě oblasti nesoucí funkce enkapsidace: levou část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný ve virální replikaci a expresi virálních genů a pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující proteiny kapsidace viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro transfer genů in vitro a in vivo bylo popsáno v odborné literatuře (viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve které geny rep nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a jejich použití pro transfer in vitro (na buňkách v kultuře) nebo in vivo (přímo v organizmu) jmenovaného gen zájmu. Rekombinantní defektivní AAV podle vynálezu mohou být připraveny kotransfekcí v linii infektovaných buněk pomocnými lidskými viry (např. adenoviry) ·· ····

plazmidu obsahující nukleovou kyselinu nebo kazetu vynálezu lemovanou dvěma opakovanými inversními oblastmi (ITR) AAV a plazmidu nesoucí geny enkapsidace (geny rep a cap) AAV. Rekombinantní AAV produkty jsou pak čištěny klasickými technikami (viz zejména WO95/06743) .

Co se týče virů oparu a retrovirů, konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v odborné literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atd. Retroviry jsou integrativní viry, selektivně infektující buňky při dělení. Tvoří tak vektory zájmu pro rakovinovou aplikaci. Genom retrovirů zahrnuje zvláště dva LTR, jednu sekvenci enkapsidace a tři kódující oblasti (gag, pol a evn) . V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů, geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány zčásti nebo úplně a nahrazeny sekvencí heterologické nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být realizovány od různých typů retrovirů takových jako jsou zejména MoMuLV (murine moloney leukemia virus, ještě pojmenován MoMLV) MSV (murine moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo Friendův virus.

Pro konstrukci rekombinantních retrovirů obsahujících nukleovou kyselinu nebo kazetu podle vynálezu, je konstruován plazmid obsahující zejména LTR, sekvence enkapsidace a nukleovou kyselinu nebo kazeta, pak jsou použity pro transfekci linie buněk řečené enkapsidace, schopné přinést v nedostačujících retrovirálních funkcích do plazmidu. Všeobecně linie enkapsidace jsou tak schopné exprimovat geny gag, pol a anv. Několik takových enkapsidačních linií bylo popsáno v dřívějších oborech zejména linie PA317 (US4,861,719), linie PsiCRIP (W090/02806) a linie GP+evnAm-12 (W089/07150). Jinak Rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity,

9 9 999 tak jako rozssáhlou enkapsidačni sekvenci obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).

Rekombinantní retroviry jsou pak čištěny klasickými technikami.

Pro uvedení předloženého vynálezu s výhodou se používají adenoviry nebo rekombinantní defektivní retroviry. Tyto vektory mají vskutku vlastnosti zvláště zajímavé pro transfer genů kódujících apolipoproteiny. Adenovirální vektory podle vynálezu jsou zvláště výhodné pro přímé podávání in vivo čisté suspenze nebo pro transformaci ex vivo buněk zejména autologní z pohledu jejich implantace. Adenovirové vektory podle vynálezu mají další důležité vlastnosti zejména mají velmi vysokou infekční schopnost, dovolující realizovat infekci ze slabých objemů virální suspenze.

Z tohoto pohledu vynález se týká především rekombinantních defektivních adenovirů obsahujících DNA kódující variantu apolipoproteinu A-I takového, který je výše definován vloženou do svého genomu.

Zvláště výhodně pro provedení vynálezu se používá linie, která produkuje retrovirální vektory obsahující sekvenci kódující variantu ApoA-I pro implantaci in vivo. Za tím účelem jsou použitelné linie zejména buňky PA317 (US4,861,719), PsiCrip (W090/02806) a GP+evnAm-12 (US5,278,056) , modifikované pro umožnění produkce retrovirů obsahujících nukleovou sekvenci kódující variantu ApoA-I podle vynálezu.

Podle dalšího aspektu vynálezu použitý vektor je vektor chemický. Vektor podle vynálezu může opravdu být nevirálním agentem schopným podporovat transfer a expresi nukleových kyselin v buňkách eukariontních. biochemické představují zajímavou virům zvláště z výhodných důvodů,

Chemické vektory nebo alternativu přirozeným bezpečnosti a případné ·· ···« nepřítomnosti teoretické limity, co se týká velikosti transfektované DNA.

Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce zhustit nukleovou kyselinu k transfekci a podpořit svou buněčnou fixaci stejně jako svůj přechod přes plazmidovou membránu, případě potřeby dvě nukleové membrány. Potlačením polyanionické povahy nukleových kyselin nevirové vektory všechny náboje polykationické.

Mezi vyvinutými syntetickými vektory jsou nejvýhodnější kationické polymery typu polylysinu (LKLK)n, (LKLK)n, polyethylenimin a DEAE dextran nebo kationické lipidy nebo lipofektanty. Mají schopnost kondenzovat DNA a podporovat svou vazbu s buněčnou membránou. Mezi posledně jmenovanými se mohou citovat lipopolyaminy (lipofekamin, transfektam atd.) a různé kationické lipidy nebo lipidy neutrální (DOTMA, DOGS, DOPE atd.). Byl vyvinut koncept buněčné transfekce, řízený receptorem, který využívá princip kondenzace DNA pomocí kationického polymeru řídícího fixaci komplexu k membráně díky chemickému spojení mezi kationickým polymerem a ligandem receptorů membrány, který je přítomný na povrchu typu buňky a který se chce štěpovat. Byl také popsán buněčný receptor transferinu, inzulínu nebo receptor asialoglykoproteinů hepatocytů.

Vynález se týká zejména všech geneticky modifikovaných buněk insercí nukleové kyseliny kódující variantu apolipoproteinu A-I tak, jak je dříve definováno. S výhodou se jedná o savčí buňky, kteé jsou schopné být podávány nebo implantovány in vivo. Může se jednat zejména o fibroblasty, myoblasty, hepatocyty, keratinocyty, endotelové buňky, epitelové buňky atd. Buňky jsou přednostně původu lidského. Výhodně se jedná se o autologní buňky, jedná se o buňky odebrané od pacienta, modifikované ex vivo nukleovou kyselinou podle vynálezu z pohledu udělení jejich • · ··· · terapeutických vlastností, pak jsou znovu podávaný pacientu.

Buňky podle vynálezu mohou být buněk. Mohou být odebírány všemi potom vloženy do kultury zejména o fibroblasty, např. podle techniky

21a (1980) 255). Tyto tkáněmi odborníky za podmínek, primárních známými které technikami, dovolují jejich proliferaci. Jedná se mohou být snadno získány z biopsií popsané Hamem (Methods Cell. Biol.

buňky mohou být použity přímo pro inserci nukleové kyseliny vynálezu (prostřednictvím virálního nebo chemického vektoru) zmražením pro zřízení autologních Buňky podle vynálezu mohou získané např. z předem určených EP 289034, EP 400047, EP 456640).

nebo bank také bank konzervovány např.

z pohledu dalšího použití, být sekundární buňky (viz např.

EP 228458, kultuře viry mohou být zejména podle vynálezu pro jejich biologicky aktivní variantu in vitro typu použitých odborník infikované srovnání apoA-I. známých podle odborníky buněk a počtu kopií může přizpůsobit realizovaných cyklů podle buňkou, a případně počet že tyto etapy musí být provedeny za

Buňky v rekombinantními schopnosti produkovat Infekce je prováděna technik. Zejména virů požadovanou multiplicitu infekce infekce. Očekává se, přijatelných sterilních podmínek až jsou buňky připraveny k podávání in vivo. Dávky použitého rekombinantního viru pro infekci buněk mohou být přizpůsobeny odborníkem podle cíle zkoumání. Podmínky již dříve popsané pro podávání in vivo být aplikovány pro infekci in vitro. Pro infekci zejména možné použít společnou kultivaci buněk, chceme infikovat s buňkami produkujícími retroviry podle vynálezu. Toto dovoluje vyhnout mohou retroviry je které jsou rekombinantní se čištění retrovirů.

Další předmět vynálezu se týká implantátu obsahujícího savčí buňky geneticky modifikované inzercí nukleové kyseliny, jak je dříve definováno a extracelulárni matrice. Implantáty podle vynálezu obsahují 10⁵ až 10¹⁰ buněk. Ještě výhodnější jsou implantáty, které obsahuji 10⁶ až 10⁸ buněk. Buňky mohou být zejména buňkami, které produkuji rekombinantní viry obsahující inzerovanou ve svém genomu nukleovou kyselinu, která je již dříve definovaná.

V implantátech vynálezu, extracelulární matrice obsahuje želatinující látku a případně podklad dovolující buněčné zakotvení.

Pro přípravu implantátů podle vynálezu mohou být použity různé typy želatinujících látek. Tyto látky jsou použity pro inkluzi buněk do matrice mající konstituci gelovou a pro upřednostnění zakotvení buněk na podklad v případě potřeby. Mohou být tak použity různé agenty buněčné adheze jako jsou látky želatinující např. kolagen, želatina, glykosaminoglykan, fibronektin, lektin atd. S výhodou se používá v rámci předloženého vynálezu kolagen. Může se jednat o kolagen původu lidského, hovězího nebo myšího. S výhodou se používá kolagen typu I.

Jak je již dříve naznačeno, kompozice podle vynálezu výhodně obsahuje podklad dovolující kotvení buněk. Termín kotviště popisuje všechny formy biologických nebo/a chemických nebo/a fyzikálních interakcí podněcující adhezi nebo/a fixaci buněk na podklad. Jinak buňky mohou bud’ být pokryty použitým podkladem nebo mohou penetrovat k internímu podkladu nebo se mohou vyskytnou obě možnosti. S výhodou se dává přednost použití v rámci vynálezu pevnému podkladu netoxickému nebo/a biokompatibilnímu. Mohou se používat zejména vlákna polytetrafluoroethylenu (PTFE) nebo podklad původu biologického (korál, kost, kolagen atd.)

Implantáty podle vynálezu mohou být implantáty z různých míst organizmu. Zejména to mohou být implantáty prováděny na úrovni peritoneální kavity, v podkožní tkáni (oblast suprapubická, oblast kyčelní jamky nebo oblast tříselná) v orgánu, svalu, nádoru, systému nervového centra, nebo také pod sliznicí. Implantáty podle vynálezu jsou výhodné zejména v tom smyslu, že dovolují řídit uvolnění varianty apoA-I z organizmu: Toto je především určeno multiplicitou infekce a počtem implantovaných buněk. Uvolnění může být řízeno bod’ odebráním implantátu, který zastavuje definitivně léčení nebo použitím systémů regulovatelné exprese dovolující indukovat nebo potlačit expresi terapeutického genu.

Nukleové kyseliny vytváří tak nový medikament v léčení a prevenci kardiovaskulárních patologií (arherosklerosa, restenosa atd.) z důvodu antiatherogenních vlastností variant vynálezu.

Vynález se také týká všech farmaceutických kompozicí obsahujících variantu apoA-I nebo/a nukleové kyseliny nebo/a vektor nebo/a geneticky modifikované buňky, jak je dříve popsáno.

Předložený vynález nabízí tak nový prostředek pro léčení nebo prevenci patologií spojených s dyslipoproteinémií zejména v oblasti chorob kardiovaskulárních jako je infarkt myokardu, náhlá smrt, restenosa, kardiální dekompenzace a příhody cerebrovaskulární. Obecně tyto přístupy nabízejí prostřednictvím terapeutického zákroku velkou naději pro každý případ kde deficit genetického uspořádání nebo metabolizmu apolipoproteinu A-I může být opraven.

Následující příkladyblíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

• · · ♦ · ·

Seznam obrázků

Obrázek 1: Restrikční mapa plazmidu PXL2116

Obrázek 2: Konstrukce fágu M 13 nesoucího exon 4 pacienta

Obrázek 3: Konstrukce vektoru nesoucího mutovaný PXL2116

Obrázek 4: Studie turbidimetrie v závislosti na teplotě

4a: turbidimetrické spojení různých ApoAI a DPMC v nepřítomnosti GndHCI (--standard, -♦-rekombinantní, -♦-plazmatický, -Π-Paris)

4b: turbidimetrické spojení ApoAI a DPMC v přítomnosti GndHCI (-B-standard, -♦-rekombinantní, -^-plazmatický, -□-Paris)

4c: turbidimetrické spojení ApoAI a DPMC (-- v nepřítomnosti GndHCI, v přítomnosti GndHCI (0,5M))

4d: turbidimetrické spojení	rekombinantní ApoAI	a DPMC
(-- v nepřítomnosti	GndHCI, -	□- v	přítomnosti	GndHCI
(0,5M))
4e: turbidimetrické spojení	plazmatické ApoAI	a DPMC
(-- v nepřítomnosti	GndHCI, -	□- v	přítomnosti	GndHCI
(0,5M))
4f: vliv GndHCI	(0,5M) na	spojení	ApoAI/DPMC	(-- v

nepřítomnosti GndHCI, v přítomnosti GndHCI (0,5M))

Obrázek 5: Relativní fluorescence frakcí Superosy 6 PG (-- POPC/AIParis, -□- POPC/AI rekombinantní, -♦- POPC/AI plazmatický)

Obrázek 6: 6a: Fluorescence tryptofanu a koncentrace ve fosfolipidech pro komplex POPC/AI Paris (-- relativní fluorescence, fosfolipidy)

SUBSTITUTE SHEET • ·Α ·

16si

6b:	Fluorescence tryptofanu a koncentrace ve

fosfolipidech pro komplex POPC/AI rekombinantní (-relativní fluorescence, fosfolipidy)

SUBSTITUTE SHEETj

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1: Prokázání varianty ApoAI

Varianta ApoA-I Paris byla identifikována a izolována od pacienta vzhledem k jeho vlastní lipidické bilanci. Pacient představuje následující lipidickou bilanci (povaha odběru: sérum).

		normální
cholesterol	4.59 mmol/1	4.54-6.97
triglyceridy	2.82 mmol/1	0.74-1.71
HDL-cholesterol	0.25 mmol/1	0.88-1.6
LDL-cholesterol	3.06 mmol/1	2.79-4.85
apolipoprotein A-I	0.5 g/1	1.20-2.15
apolipoprotein B	1.38 g/1	0.55-1.3
fenotyp apoE: 3/3

Neočekávaně tento pacient nevykázal žádnou známku atherosklerosy, navzdory extrémě slabé koncentraci HDL, ani hypertriglyceridemie. Toto vede předkladatele k hledání původu této ochrany.

Izolace HDL obsahujícího apoA-I Paris z plazmy

Nalačno (po noci) byla odebrána krev ze subjektů nesoucích gen apoA-I Paris. Plasma byla připravena pomalou centrifugací krve při teplotě 4°C (2000 g, po dobu 30 minut). Lipoproteiny vysoké density byly připraveny sekvenční ultracentrifugací o hustotě 1.063-1.21 g/ml (Havel, J. Clin. Invest. 34: 1345-54, 1995). Frakce obsahující HDL byla potom dialyzována proti pufru Tris-HCl (lOmM), s přídavkem 0,01% azidu sodného, pH 7,4.

Prokázáni dimeru apoA-I Paris

Z frakce HDL byly odsraněny lipidy ve směsi diethylether/ethanol (3/1, obj./obj.), koncentace proteinu byla stanovena Lowryho metodou (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193: 265-75, 1951). Proteiny frakce HDL se podrobily migraci na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS za neredukčních podmínek. Tato migrace dovoluje prokázat různé velikosti proteinů HDL pacienta. Mimoto přítomné proteiny odpovídají apoA-I a apoA-II normální velikosti, tato analýza také odhaluje přítomnost proteinů nejvyšší molekulové hmotnosti odpovídající dimerům apoA-I a komplexům apoA-I a apoA-II. Přítomnost apoA-I a apoA-II v těchto komplexech byla ověřena specifickou imunologickou metodou.

Prokázání různého náboje mutovaného apoA-I

Detekce mutovaného apoA-I přímo z plazmy byla provedena podle následujícího protokolu (Menzel, H. J., a Utermann, G., Electroforesis, 7: 492-495, 1986): 20 μΐ plasmy, ze které byly odstraněny lipidy přes noc směsí ethanol/ether, bylo resuspendováno v daném pufru. 5 μΐ alikvotní části bylo podrobeno ektroforéze na gelu zaměřené izoelektricky (pH

4-6,5, Pharmolyte), proteiny byly pak přeneseny na nylonovou membránu. Pásy odpovídající apoA-I byly detekovány imunologickou reakcí pomocí protilátky lidského anti-apoA-I.

Detekce mutovaného apoA-I se může provádět také z proteinu HDL. Z dialyzované frakce HDL byly odstraněny lipidy ve směsi diethylether/ethanol (3/1, obj./obj.) a koncentace proteinu byla stanovena Lowryho metodou (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193: 265-75, 1951). 100 pg proteinů bylo podrobeno elektroforéze na gelu izoelektricky zaostřeného (pH 4-6,5, Pharmolyte) a proteiny byly potom odhaleny zbarvením C. modří. Tato technika prokazuje, že nejdůležitější izoformy apoA-I pacienta, nositele mutace, byly umístěny u anody, tak jak odpovídá rozdíl nábojů -1 vzhledem k náboji normálního apoA-1.

Přiklad 2: Identifikace genu a mutace

Genomická DNA pacienta byla izolována z krve podle Madisenovy techniky (Madisen et al., Amer. J. Med. Genet, 27: 379-390, 1987). Gen apoA-I byl pak amplifikován technikou

PCR. V tomto ohledu amplifikačni reakce byly provedeny s 1 μς čisté genomické DNA vložené do následující směsi:

-10 μΐ pufru 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgCi, 0,1% (hmotnost/obj.) želatiny)

-10 μΐ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2 mM

-2,5 U Taqpolymerasy (Perkin-Elmer)

-qsp 100 μΐ H2O

Nástroje použité pro amplifikace jsou následující:

Sq5490: 5'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3'(SEQ ID n°3)

Sq5491: 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3' (SEQ ID n°4 )

Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3' (SEQ ID n°5)

Sq5493: 5'-CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3'(SEQ ID n°6)

Nástroje Sq5490 a Sq5491 amplifikují fragment 508 pb odpovídající exonům 2 a 3 genu apoA-I a nástroje Sq5492 a Sq5493 amplifikují fragment 664 pb odpovídající exonu 4 tohoto genu.

Byly sekvenovány produkty amplifikace (dva fragmenty PCR 508 a 664 pb). Proto byla použita metoda přímo zahrnující sekvenování za použití soupravy pro sekvenování fragmentů PCR (Amersham). Nástroje použité pro sekvenování jsou nástroje PCR, ale může se také jednat o interní nástroje fragmentů (srov. nástroje S4, S6 a S8 viz dále).

Druhá technika sekvenování zahrnuje klonování fragmentů PCR do vektoru M13 mp28. Dvojvláknová DNA vektoru M13 byla rozštěpena EcoRV pak defosforylovaná. Fragment PCR byl • ·· · pojednán Klenowem, fosforylován a spojen s vektorem M13. Potom byly odebrány bílé oblasti a jednovláknová amplifikovaná DNA potom čištěna na Catalyst (Applied Biosystem) byly sekvenována -20 fluorescenčním nástrojem (Souprava PRISM dye primer a protokol n° 401386, Applied Biosystem) nebo interními nástroji fragmentů. Byla použita fluorescenční technika dideoxynukleotidů (Souprava DyeDeoxyTerminator a protokol n° 401388, Applied Biosystem)

S8	5'	-TGG	GAT	CGA	GTG	AAG	GAT	CTG-3'(SEQ	ID	n°7
S4	5'	-CGC	CAG	AAG	CTG	CAC	CAG	CTG-3'(SEQ	ID	n°8
S6	5'	-GCG	CTG	GCG	CAG	CTC	GTC	GCT-3'(SEQ	ID	n°9

Výsledné sekvence více klonů byly pak kompilovány a porovnány s ApoAI. Konečná sekvence aminokyselin 148 až 154 ApoAI je uvedená dále (odpovídá residuím 172-178 na sekvenci SEQ ID n°l) .

ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC

Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala

151

Mutace C->T v první basy kodonu kódujícího aa 151, který kóduje cystein (srov. sekvence SEQ ID n°2 viz dále) byla opět nalezena v části sekvenovaného klonu. Tato mutace je přítomna v heterozygotě u vybraného pacienta.

ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC

Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala

151

Byl sekvenován soubor cDNA kódující variantu apoA-I Paris podle vynálezu. Část této sekvence je přítomna v SEQ ID n°10.

·· ····

Příklad 3: Konstrukce vektoru plazmidové exprese (pXL2116mute)

ApoAI Paris představuje mutaci přesně situovanou na sekvenci exonu 4 genu apoAI pacienta. Strategie konstrukce vektoru exprese spočívá v substituci vektoru exprese apoAI (vektor pXL2116, Obrázek 1) oblastí odpovídající exonu 4 pocházející z genu pacienta.

3.1 Použití exonu 4 pacienta klonovaného v M13

Exon 4 byl produkován PCR z DNA buněk pacienta a inserován na úrovni místa EcoRV polylinkeru fágu M13mp28 (Obrázek 2).

Je pozorovaná mutagenese přemístěním fragmentu apo AI fragmentem pocházejícím z M13 nesoucí mutaci. Zůstane nám tak na výběr enzymy vhodné dvěma vektorům tak, že vytváří kohézní konce pro vektor pocházející z pXL2116 stráveného a pro inzerci pocházející ze dvouvláknové M13.

3.2 Výběr restrikčních enzymů

-Bsu361 má v M13 a v pXL2116 jedinečné místo restrikce proti mutaci.

-Digesce BamHI mající jedinečné místo restrikce na 3'konci apo AI provedená technikou klonování, mající místo restrikce v polylinkeru M13, nám dovoluje:

1) vázání vektoru pocházejícího z pXL2116 a izerce pocházející z M13

2) inkorporovat fragment polylinkeru, který nám bude prospěšný pro ověření enzymovou digescí inzerce mutovaného fragmentu pocházejícího z M13.

Lze poznamenat, že přítomnost tohoto fragmentu polylinkeru nealteruje žádnou sekvenci kódující apo AI, když • · · · · · je situován po terminačním kodonu.

Polypeptid bohatý na histidin, jehož nukleotidové sekvence byla klonována na 5'konci apo AI bude tedy také syntetizován.

3.3 Konstrukce vektoru (Obrázek 3)

-Dvojvláknový M13 je stráven Bsu361/BamHI a produkt digesce položen na gel. Inserce tak generovaná je znovu získaná v dostatečném množství a přítomná ve velikosti IDb.

-pXL2116 je tráven stejnými enzymy, ale nečištěnými.

Trávení je provedeno Xhol, který rozpozná dvě místa restrikce k internímu fragmentu Bsu361/BamHI za účelem vyhnutí se religaci produkrů trávení.

Defosforilace, která byla nejdříve zkoušena poskytla velmi špatné výsledky na misce a neposkytla žádný pozitivní klon ve 24 testovaných.

Množství vektoru a optimálních vložených informací (inzertu) pro vázání bylo odhadnuto na 50 ng vektoru pro 15 ng vložené informace (inzertu).

Kmeny DH5a byly transformovány s produkty třech následujících ligandů:

- vektor trávený Bsu361 a BamHI bez ligasy (negativní kontrola ligace)

- produkt trávení + ligasa

- produkt trávení + inzert + ligasa

Kompetentní buňky byly transformovány s pUC19, aby testovaly účinnost transformace.

Výsledky transformovaných buněk na micse v prostředí LB Chloramfenikolu (výběr ze základu BL21) Ampicillinu (výběr ze základu zahrnující plazmid) jsou reprodukovány dále.

·· ····

Výsledky získané na Petriho misce

transformace DH5a+	výsledky	interpretace
pUC19	200 klonů	důkaz transformace
vektor (+fragment)	0 klonů	úplná digesce, žádný plazmid
vektor (+fragment) +ligasa	160 klonů	šum pozadí velmi důležitý: strategie dodatečného trávení málo účinná
vektor (+fragment) +ligasa +insert	120 klonů	účinek ligasy často stálý, bakterie nejsou povinně transformovány se správnou mutovanou sekvencí

klonů je znovu izolováno z misky 4.

K opakované tvorbě pozitivních klonů (majících vložený mutovaný fragment M13), plazmidová DNA získaná purifikací na všech 48 klonech je trávena enzymem Ndel.

Jestliže inzert pocházející z M13 byl dobře vložen budou na gelu dva fragmenty: jeden 4,5kb a druhý 1 kb.

Jestliže se získá jiný výsledek ligace tzn. jiný produkt, získá se buď více pruhů nebo jednoduše lineární plazmid (všeobecný případ).

Podle výsledků na gelu klony 7, 8, 13, 16, 26 se zdají být správné. Vybere se klon, který dává jasný výsledek.

Přítomnost polylinkeru tedy inzertu je tak ověřena, ale výsledek ligace musí být také ověřen. Je zřejmé, že ligace je správně provedena, jelikož velikost plazmidu je správné, to znamená stejná jako je velikost pXL2116.

Kromě výsledku velmi vzácné mutace musí být sekvence apoAI nově klonovaná přesná.

Klon 8 nese tak správně mutovaný plazmid pxl2116.

·· ····

Příklad 4: Exprese rekombinantních variant apoAI

Tento příklad popisuje proces produkce rekombinantních variant apoAI. Tento proces byl uskutečněn v bakterii. Byly použity další systémy exprese za tímto účelem (kvasinky, zvířecí buňky atd.).

4.1 Princip

Exprese plazmidu uprostřed bakterie byla umístěna pod řízením promotoru a terminátoru T7. Isopropyl-b-thiogalactopyranosid (IPTG), indikátor laktosového operonu, indukuje v tomto systému syntézu RNA-polymerasy T7, která se potom specificky fixuje na promotor T7 a spustí transkripci genu rekombinantního proteinu. RNA-polymerasa je zastavena terminátorem T7, vyhne se tak transkripcionálnimu toku a nepřesáhne sekvenci zájmu.

Rifampicin je antibiotikum inhibující aktivitu RNA-polymarasy endogenu bakterie E. coli. Inhibuje tak syntézu bakteriálních proteinů, to znamená proteas, těch které limitují degradace proteinu zájmu a bakteriálních kontaminantních proteinů, takových, které amplifikuji expresi tohoto proteinu.

4.2 Protokol

Základ použitý pro expresi je Escherichia coli BL21 DE3 pLys S. Plazmidová DNA je introdukována do E. coli transformací podle klasických technik. Kultura je konzervována ve formě zmražené suspenze při teplotě -20°C v

přítomnosti 25% μΐ.	glycerolu v alikvotních frakcích o objemu 500
Inokulum	je iniciováno přídavkem několika kapek

zmražené suspenze do 10 ml prostředí M9 ampicilinu, potom inkubováno přes noc při teplotě 37°C. Jednolitrové Erlenmayerovy baňky jsou zaočkovány inokulem a umístěny na třepačku při teplotě 37°C až do získání DO mezi 0,5 a 1 při 610 nm. IPTG (Bachem ref Q-1280) je pak přidáno v množství, aby finální koncentrace dosahovala hodnoty 1 mM. Po 15 minutách inkubace při teplotě 37°C se přidá rifampicin (Sigma) ve finální koncentraci 100 μα / ml. Potom po jedné hodině kultivace se buňky znovu získají odstřeďováním (15 minut, 800 rpm) a exprese se ověří elektroforeticky za denaturačních podmínek na 15% akrylamidovém gelu imunologicky.

Získané výsledky ukazují, že mutovaný protein se exprimuje podle dobrého expresního poměru, a že je efektivně vyvolán polyklonovanými protilátkami anti-apo AI.

Příklad 5: Čištění rekombinantních variant apoAI

Tento příklad popisuje účinnou metodu dovolující čistit rekombinantní varianty apoAI podle vynálezu. Očekává se, že i další metody mohou být použity.

Proteiny, které jsou exprimovaně v cytoplazmě bakterie Escherichia coli se nejprve extrahují a pak se uskutečnění buněčná lysy a následuje eliminace nukleových kyselin.

5.1 Lysá bakterií

Po odstředění buněk bakteriální usazenina je resuspendována za mírného míchání v pufru pro lysu v přítomnosti proteasových inhibitorů a β-merkaptoethanolu.

β-Merkaptoethanol je reduktor štěpící disulfidové můstky vytvořené mezi dvěma cysteiny. Netvoří se žádný disulfidový můstek v cytoplazmě bakterie Escherichia coli, přítomnost reduktoru se ukazuje tentokrát nezbytná pro jednou ·· ··· · extrahované proteiny. Opravdu přídavek β-merkaptoethanolu do pufru pro lysu dovoluje zabránit tvorbě můstku mezi cysteinem bakteriálního proteinu a cysteinem rekombinantních proteinů.

Buněčná lysá se získá 3krát 5 minut sonifikací v mrazu (Vibracells sinics materiál, mode pulsed, output control 5), pak se odstředí (10000 rpm, 1 hod, 4°C na Beckman J2-21 M/E, rotor JA10) a pak se mohou eliminovat buněčné zbytky. Dávkování proteinu se provádí na plavajícím povrchu kolorimetrickou metodou podle Bradforda.

5.2 Precipitace nukleových kyselin

Precipitace je realizována na plavajícím povrchu lysy roztokem 10% síranu streptomycinu v poměru 10 ml pro 10 g proteinů za jemného magnetického míchání po dobu jedné hodiny a při teplotě 4°C. Nukleové kyseliny se eliminují odstředěním při 10000 rpm (1 hod, 4°C na Beckman J2-21 M/E, rotor JA10) a koncentrace proteinu na plovoucím povrchu se určí kolorimetrickou metodou.

Z těchto vzniklých dvou stupňů se získá proteinový roztok známé koncentrace spojující dohromady intracelulární proteiny, mezi nimi protein zájmu. Tyto proteiny byly čištěny chromatografickými metodami.

- chromatografie filtrací na gelu

- afinitní chromatografie

5.3 Chromatografie filtrací na gelu

Cílem této etapy je čištění EDTA, molekuly interferující s požadovanými podmínkami pro afinitní chromatografii. Proto se používá jako nosič nosič tris-akryl GF 05 (Sepracor). Tento gel dovoluje separaci molekul, jejichž molekulová hmotnost (MM) je zahrnuta mezi hodnoty 300 a 2500 daltonů, a vyloučeni molekul o molekulární hmotnosti horní hranice tj. 2500 daltonů, mezi nimi proteiny. Tento gel představuje další část zájmu mající dobrou odolnost vůči tlaku a to dovoluje pracovat od začátku metody s jeho zvýšením bez modifikování metody. Chromatografie bakteriálního lysantu se realizuje ve fosfátovém pufru pH 8. Proteinová koncentrace v vyloučeném objemu se určí a upravoví na 4 mg / ml rozpuštěním ve fosfátovém pufru pH8.

Tato etapa může být nahrazena dialysou proti 2 x 10 litrům PBS. Proteinový roztok se pak nechá v přítomnosti Hecameg 25 mM, tento detergent napomáhá následující etapě čištění snížením interakcí protein-protein.

5.4 Afinitní chromatografie

Princip

Přítomnost šesti residuí histidinu po sobě jdoucích spojených s rekombinantním proteinem uděluje tomoto proteinu afinitu částečně zvýšenou niklovými ionty (Ni²⁺) (15) . Tyto ionty Ni²⁺ jsou fixovány k matrici agarosy prostřednictvím kyseliny nitriloctové (NTA). Mezi imidazolem histidinu a niklovými ionty se tvoří vazba kovochelatonová, tato vazba je silnější než vazba iontová a slabší než vazba kovalentní.

Protokol

Schopnost fixace agarosového gelu NiNTA (Qiagen) je 2 mg proteinu pro 1 ml gelu. Tento gel je ekvilibrován v pufru pH 8 přidáním 25 mM Hecameg. Bakteriální kontaminované proteiny nejsou zadrženy při pH 8, jsou eliminovány při pH 6 a protein zájmu je získán při pH 5. Tyto etapy jsou provedeny v přítomnosti 25 mM hecameg.

Eluované frakce (2 ml) při pH 5 jsou přidány k:

- 60 μΐ 1M NaOH (neutralizace) ····

- 10 μΐ 0,2 Μ PMSF

- 40 μΐ Ο,ΙΜ EDTA

Frakce jsou spojeny vzhledem ke koncentraci a čistotě eluovaného proteinu. Tyto charakteristiky byly analyzovány elektroforeticky (15% PAGE-SDS).

Elucí při pH 5 se získají proteiny spojené s niklem, který je účinný na vazbě Ni²⁺-NTA. Je tak nezbytné disociovat kationt rekombinantního proteinu. Tato etapa je uskutečněna kompeticí díky inkubaci za mírného magnetického míchání při teplotě 4°C po dobu jedné hodiny v přítomnosti 50 mM histidinu.

5.5 Dialysa

Dialysa dovoluje eliminovat histidin a nikl. Vzorek se dialyzuje (membrána Spectra/por MWCO 12-14000 daltonů) při teplotě 4°C během 5 hodin přes noc proti 2 krát 10 litrům 2 mM pufru PBS EDTA. Dávkováví proteinu se nakonec uskuteční.

Tato metoda dovoluje získat protein apoAI Paris v čisté formě, zejména bez kontaminovaných proteinů.

Příklad 6: Fyzikálně-chemické vlastnosti apoA-I Paris a normálních rekombinantních apoA-I.

6.1 Turbidimetrická měření

6.1.1 Turbidimetrie jako funkce teploty

Měření absorbance DMPC při 325 nm v přítomnosti apoA-I je měření tvorby proteolipidových komplexů malých velikostí.

Analýza změny teploty mezi 19 - 28°C nám ukazuje snížení absorbance okolo teploty přeměny fosfolipidů (23°C) , to svědčí o tvorbě komplexů. Obrázek 4 (v přítomnosti nebo nepřítomnosti Gdnhdl pro vyhnutí se tvorby dimerů) ukazuje srovnání tvorby těchto komplexů s normálním apoA-I a rekombinantním apoA-I Paris, stejně tak nativním apoA-I. Tyto tři proteiny mají chování dost blízké, ale u apoA-I Paris je možno si všimnout sklonu ke spojení s ním samým za vzniku dimerů.

6.1.2 Turbidimetrie jako funkce času

Pokles turbidimetrie DMPC po inkubaci apoA-I byl souvislý s danou teplotou jako funkce času v přítomnosti nebo nepřítomnosti GdnHDL. Teplotní konstanta (l/tl/2 která odpovídá 50% klesání počáteční turbidimetrie) je odhadnuta jako funkce 1/T (teplota ve stupních Kelvina). Rychlost spojování je rychlá pro nativní apoA-I, slabější pro rekombinantní apoA-I, zejména pak pro apoA-I Paris. Jinak přídavek GdnHDL zvyšuje vazbu protein - lipidy. Tento způsob je velmi důležitý pro rekombinantní apoA-I, zejména pro apoA-I Paris.

6.2 Emisní spektra fluorescence tryptofanů

Emisní spektra fluorescence tryptofanů v různých apoA-I byla měřena při vlnových délkách 300 a 400 nm (excitace při 295 nm) . Maximální emise je uvedena v Tabulce 1 pro apoA-I a pro komplexy apoA-I/cholesterol/POPC. Maximální emise fluorescence tryptofanů v různých apoA-I a komplexech jsou totožné a naznačují, že tryptofany jsou ve stejném prostředí vtěchto třech proteinech.

Tabulka 1

Produkt	Maximální emise
AI Paris	335
POPC/C/AI Paris	332
rekombinantní AI	334
POPC/C/AI rec	332
AI plazma	336
POPC/C/AI plazma	333

6.3 Izolace a charakteristika komplexů apoA-I/lipidy

Komplexy s apoA-I a POPC byly připraveny cholátovou technikou. Komplexy byly separovány apoA-I chromatograficky gelovou filtrací na koloně Superose 6PG a jeho složení bylo analyzováno. Profily gelové filtrace jsou vyznačeny na Obrázku 5. Samotný homogení pic je získán pro komplexy vytvořené s nativním apoA-I, zatímco s rekombinantní apoA-I jsou pozorovány heterogení populace. Volné apoA-I se eluují ve frakcích 20 až 24. Koncentrace fosfolipidů a fluorescence tryptofanů frakcemi pro různé komplexy jsou ukázány na Obrázku 6.

Příklad 7: Konstrukce adenovirálního vektoru pro expresi mutovaného ApoAI cDNA kódující variantu podle vynálezu obsahující mutaci Arg - Cys v poloze 151 ApoAI je získána PCR.

Použité nástroje

Alml: ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (SEQ ID n°ll),

Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (SEQ ID n°12),

Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (SEQ ID n°13) a Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (SEQ ID n°14)

Nástroje Alml a Alm4 vkládají Call na 5'a Sáli na 3'cDNA, zatímco nástroje Alm2 a Alm3, které jsou komplementární vkládají mutaci. Reakce PCR a dvojicí nástrojů AIM1-Alm2 a Alm3-Alm4 jsou nejprve provozovány na cDNA nemutováného ApoAI. Fragmenty vzniklé z PCR se pak znovu vloží do třetí PCR v přítomnosti nástrojů Alml a Alm4, které vytvářejí fragment 822pb, který je pak klonován v pCRII (Invitrogen) za účelem ověřeni sekvence. Fragment Clal/Sall, který obsahuje mutovanou cDNA se pak vloží na stejné místo restrikce do vektoru pXL-RSV-LPL, který obsahuje cDNA LPL pod řízením promotoru LTR-RSV a do polyadenylové polohy hormonu dobytčího vývoje, nahražení cDNA LPL (FR9406759). Jiný vektor může být tak použit. Výsledný vektor je pak uvolněn a kotransfektován do 293 za účelem získání rekombinantního adenoviru. Adenoviry takto získané mohou být amplifikovány, čištěny (zejména chloridem cesnatým) potom konzervovány zmrazením, např. v glycerolu. Pro jejich terapeutické použití, mohou být sdruženy do farmaceutického vhodného vehikula. Může se jednat zejména o roztoky solí (fosforečnan sodný, fosforečnan disodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo hořečnatý atd. nebo směsi těchto solí), sterilované, izotonické, nebo suché kompozice, zejména lyofilizované, které přidáním podle okolnosti sterilované vody nebo fyziologického séra, poskytující injektovatelnou konzistenci. Pro použití při léčení patologií spojených s dyslipoproteinémií, rekombinantní defektivní adenoviry podle vynálezu mohou být aplikovány podle různých způsobů zejména injekcí nitrožilně. Jsou injektovány na úrovni vrátnicové žíly. Dávky použitého viru pro injekci mohou být přizpůsobeny různým parametrům zejména způsobu použitého podávaní, parametrům týkajících se patologii nebo také doby zkoumaného léčení. Rekombinantní viry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek obsahují mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml. Pro AAV a adeniviry se mohou použít dávky od 10⁶ až 1O¹⁰ pfu/ml. Termín pfu (plaque forming unit) odpovídá možnosti choroboplodné virové suspenze a je určen infekcí přizpůsobené buněčné kultury a měřením po 48 hodinách počtu infikovaných buněk. Techniky určení velikosti pfu virálního roztoku jsou dobře popsány v odborné literatuře.

Seznam sekvenci (1) Všeobecné informace:

(i) podavatel:

(A) Jméno: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) Ulice: 20, Raymond ARON (C) Město: ANTONY (D) Země: Francie (E) Směrovací číslo: 92165 (i) podavatel:

(A) Jméno: UNIVERSITĚ PIERRE ET MARIE CURIE (B) Ulice:

(C) Město:

(D) Země: Francie (E) Směrovací číslo:

(i) podavatel:

(A) Jméno: INSTITUT PASTEUR DE LILLE (B) Ulice:

(C) Město:

(D) Země: Francie (E) Směrovací číslo:

(ii) název vynálezu: Varianty apolipoproteinu A-I a farmaceutická kompozice, která je obsahuje (iii) počet sekvencí: 14 (iv) způsob luštění počítačem:

• · · ·

(A) Typ nosiče: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 842 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dvě (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (vi) původ:

(A) organismus: Homo sapiens (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...842 (C) další informace:/produkt=lidský apo AI cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:

ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG CTC TTC CTG ACG GGG Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly 15 10 15 • · · · · · • · * · ······ • · · · · · ··· ··· ······· «· ·

AGC

CAG

GCT

CGG

CAT

TTC

TGC

CAG

CAA

GAT

GAA

CCC

CAG

87

Ser

Gin

Ala

Arg

His

Phe

Trp

Gin

Asp

Glu

Pro

Gin

20

25

AGC

CCC

TGG

GAT

CGA

GTG

AAG

GAC

CTG

GCC

ACT

GTG

TAC

GTG

129

Ser

Pro

Trp

Asp

Arg

Val

Lys

Asp

Leu

Ala

Thr

Val

Tyr

Val

30

35

40

GAT

GTG

CTC

AAA

GAC

AGC

GGC

AGA

GAC

TAT

GTG

TCC

CAG

TTT

171

Asp

Val

Leu

Lys

Asp

Ser

Gly

Arg

Asp

Tyr

Val

Ser

Gin

Phe

45

50

55

GAA

GGC

TCC

GCC

TTG

GGA

AAA

CAG

CTA

AAC

CTA

AAG

CTC

CTT

213

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu

Gly

Lys

Gin

Leu

Asn

Leu

Lys

Leu

60

65

70

GAC

AAC

TGG

GAC

AGC

GTG

ACC

TCC

ACC

TTC

AGC

AAG

CTG

CGC

255

Asp

Asn

Trp

Asp

Ser

Val

Thr

Ser

Thr

Phe

Ser

Lys

Leu

Arg

75

80

85

GAA

CAG

CTC

GGC

CCT

GTG

ACC

CAG

GAG

TTC

TGG

GAT

AAC

CTG

297

Glu

Gin

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Gin

Glu

Phe

Trp

Asp

Asn

Leu

90

95

GAA

AAG

GAG

ACA

GAG

GGC

CTG

AGG

CAG

GAG

ATC

AGC

AAG

GAT

339

Glu

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Leu

Arg

Gin

Glu

Met

Ser

Lys

Asp

100

105

110

CTG

GAG

GTG

AAG

GCC

AAG

GTG

CAG

CCC

TAC

CTG

GAC

381

Leu

Glu

Val

Lys

Ala

Lys

Val

Gin

Pro

Tyr

Leu

Asp

115

120

125

TTC

CAG

AAG

TGG

CAG

GAG

ATG

GAG

CTC

TAC

CGC

CAG

423

Phe

Gin

Lys

Trp

Gin

Glu

Met

Glu

Leu

Tyr

Arg

Gin

130

135

140

AAG

GTG

GAG

CCG

CTG

CGC

GCA

GAG

CTC

CAA

GAG

GGC

GCG

CGC

465

Lys

Val

Glu

Pro

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

Glu

GLy

Ala

Arg

145

150

155

CAG

AAG

CTG

CAC

GAG

CTG

CAA

GAG

AAG

CTG

AGC

CCA

CTG

GGC

507

Gin

Lys

Leu

His

Glu

Leu

Gin

Glu

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Gly

160

165

GAG

ATG

CGC

GAC

CGC

GCG

CGC

GCC

CAT

GTG

GAC

GCC

CTG

549

Glu

Met

Arg

Asp

Arg

Ala

Arg

Ala

His

Val

Asp

Ala

Leu

170

175

180

CGC

ACG

CAT

CTG

GCC

CCC

TAC

AGC

GAC

GAG

CTG

CGC

CAG

CGC

591

Arg

Thr

His

Leu

Ala

Pro

Tyr

Ser

Asp

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

185

190

195

TTG

GCC

GCG

CGC

CTT

GAG

GCT

CTC

AAG

GAG

AAC

GGC

GCC

633

Leu

Ala

Arg

Leu

Glu

Ala

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Ala

200

205

210

AGA

CTG

GCC

GAG

TAC

CAC

GCC

AAG

GCC

ACC

GAG

CAT

CTG

AGC

675

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Ala

Thr

Glu

His

Leu

Ser

215

220

225

ACG

CTC

AGC

GAG

AAG

GCC

AAG

CCC

GCG

CTC

GAG

GAC

CTC

CGC

717

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Pro

Ala

Leu

Glu

Asp

Leu

Arg

230

235

CAA

GGC

CTG

CCC

GTG

CTG

GAG

AGC

TTC

AAG

GTC

AGC

TTC

759

Gin

Gly

Leu

Pro

Val

Leu

Glu

Ser

Phe

Lys

Val

Ser

Phe

240

245

250

CTG

AGC

GCT

CTC

GAG

TAC

ACT

AAG

CTC

AAC

ACC

CAG

801

Leu

Ser

Ala

Leu

Glu

Tyr

Thr

Lys

Leu

Asn

Thr

Gin

255

260

265

TGA GGCGCCCGCC GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA

842 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dvě (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE • · ··· · ··· ··· ··♦♦ ·· (iii) antimediátorová: NE (vi) původ:

(A) organismus: Homo sapiens (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...21 (C) další informace:/produkt=lidský apo AI cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:

ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC 21

Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala

5 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(C) další informace:/produkt=Sq5490 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 3:

AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G 21 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=Sq5491 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 4:

TTCAACATCA TCCCACAGGC CTCT (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 20 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=Sq5492 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 5:

CTGATAGGCT GGGGCGCTGG (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 20 párů básí (B) typ: nukleotid •4 4444 (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=Sq5493 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 6:

CGCCTCACTG GGTGTTGAGC 20 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvence:

(D) další informace:/produkt=S8 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 7:

TGGGATCGAG TGAAGGACCT G 21 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární ·· ···· (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=S4 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 8:

CGCCAGAAAGC TGCACCAGCT G 21 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=S6 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 9:

GCGCTGGCGC AGCTCGTCGC T 21 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 10:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 603 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dvě (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původ:

(A) organismus: Homo sapiens (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístěni: 1...603 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 10:

CTA

AAG

CTC

CTT

GAC

AAC

TGG

GAC

AGC

GTG

ACC

TCC

ACC

TTC

42

Leu

Lys

Leu

Asp

Asn

Trp

Asp

Ser

Val

Thr

Ser

Thr

The

1

5

10

AGC

AAG

CTG

CGC

GAA

CAG

CTC

GGC

CCT

GTG

ACC

CAG

GAG

TTC

84

Ser

Lys

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Gin

Glu

Phe

15

20

25

TGG

GAT

AAC

CTG

GAA

AAG

GAG

ACA

GAG

GGC

CTG

AGG

CAG

GAG

126

Trp

Asp

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Leu

Arg

Gin

Glu

30

35

40

ATG

AGC

AAG

GAT

CTG

GAG

GTG

AAG

GCC

AAG

GTG

CAG

CCC

168

Met

Ser

Lys

Asp

Leu

Glu

GLu

Val

Lys

Ala

Lys

Val

Gin

Pro

45

50

55

TAC

CTG

GAC

TTC

CAG

AAG

TGG

CAG

GAG

ATG

GAG

210

Tyr

Leu

Asp

Phe

Gin

Lys

Trp

Gin

Glu

Met

Glu

60

65

70

CTC

TAC

CGC

CAG

AAG

GTG

GAG

CCG

CTG

CGC

GCA

GAG

CTC

CAA

252

Leu

Tyr

Arg

Gin

Lys

Val

Glu

Pro

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

75

80

GAG

GGC

GCG

CGC

CAG

AAG

CTG

CAC

GAG

CTG

CAA

GAG

AAG

CTG

294

Glu

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Leu

His

Glu

Leu

Gin

Glu

Lys

Leu

85

90

95

AGC

CCA

CTG

GGC

GAG

ATG

CGC

GAC

TGC

GCG

CGC

GCC

CAT

336

Ser

Pro

Leu

Gly

Glu

Met

Arg

Asp

Cys

Ala

Arg

Ala

His

100

105

110

GTG

GAC

GCG

CTG

CGC

ACG

CAT

CTG

GCC

CCC

TAC

AGC

GAC

GAG

378

Val

Asp

Ala

Leu

Arg

Thr

His

Leu

Ala

Pro

Tyr

Ser

Asp

Glu

115

120

125

CTG

CGC

CAG

CGC

TTG

GCC

GCG

CGC

CTT

GAG

GCT

CTC

AAG

GAG

420

Leu

Arg

Gin

Arg

Leu

Ala

Arg

Leu

Glu

Ala

Leu

Lys

Glu

130

135

140

AAC

GGC

GCC

AGA

CTG

GCC

GAG

TAC

CAC

GCC

AAG

GCC

ACC

462

Asn

Gly

Ala

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Ala

Thr

145

150

GAG

CAT

CTG

AGC

ACG

CTC

AGC

GAG

AAG

GCC

AAG

CCC

GCG

CTC

504

Glu

His

Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Pro

Ala

Leu

155

160

165

GAG

GAC

CTC

CGC

CAA

GGC

CTG

CCC

GTG

CTG

GAG

AGC

TTC

546

Glu

Asp

Leu

Arg

Gin

Gly

Leu

Pro

Val

Leu

Glu

Ser

Phe

170

175

180

AAG

GTC

AGC

TTC

CTG

AGC

GCT

CTC

GAG

TAC

ACT

AAG

588

Lys

Val

Ser

Phe

Leu

Ser

Ala

Leu

Glu

Tyr

Thr

Lys

185

190

195

CTC

AAC

ACC

CAG

TGA

603

Leu

Asn

Thr

Gin

*

200 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 11:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 30 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=alml (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 11:

ATAGATACCG CCATGAAAGC TGCGGTGCTG (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 12:

(i) charakteristika sekvence:

(D) další informace:/produkt=alm2 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 12:

ATGGGCGCGC GCGCAGTCGC GCATCTCCTC 30 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 13:

(i) charakteristika sekvence:

(D) další informace:/produkt=alm3 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 13:

GAGGAGATGC GCGACTGCGC GCGCGCCCAT 30 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 14:

(i) charakteristika sekvence:

•A AAAA (A) délka: 30 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristika:

(D) další informace:/produkt=alm4 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 14:

GTCGACGGCG CCTCACTGGG TGTTGAGCTT

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Varianta lidského apolipproteinu A-I obsahující cystein v pozici 151.
2. Varianta podle nároku 1 vyznačená tím, že obsahuje peptidovou sekvenci SEQ ID n°2.
3. Varianta podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že se jedná o apoA-I Paris.
4. Varianta podle nároku 1 až 3 vyznačená tím, že se jedná o rekombinantní protein.
5. Varianta podle nároku 1 až 4 ve formě dimeru.
6. Varianta podle nároku 5 vyznačená tím, že se jedná o homodimer.
7. Nukleová kyselina kódující variantu apolipoproteinu A-l podle jednoho z předchozích nároků.
8. Nukleová kyselina podle nároku 7 vyznačená tím, že se jedná o cDNA.
9. Nukleová kyselina podle nároku 7 vyznačená tím, že se jedná o gDNA.
10. Nukleová kyselina podle nároku 7 vyznačená tím, že se jedná o RNA.
11. Nukleová kyselina podle nároku 7 ž 9 vyznačená tím, že obsahuje nukleovou sekvenci SEQ ID n°2.
12. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároků 7 až 11.
13. Vektor odle nároku 11 vyznačený tím, že se jedná o virální vektor.
14. Vektor odle nároku 11 vyznačený tím, že se jedná o chemický vektor.
15. Defektní rekombinantní adenovirus obsahující DNA kódující variantu apolipoproteinu A-I podle nároku 1, vloženou do svého genomu.
16. Buňka geneticky modifikovaná kyseliny podle nároku 7.

vložením nukleové

16. Implantát obsahující savčí buňky geneticky modifikované vložením nukleové kyseliny podle nároku 7 a extracelulární matrici.
17. Farmaceutická kompozice obsahující variantu apolipoproteinu A-I podle nároků 1 až 6 nebo/a nukleovou kyselinu podle nároku 7 nebo/a vektor podle nároku 12 nebo/a geneticky modifikovanou buňku podle nároku 16.